KR20040102011A - Pna 결합 또는 이의 기능을 가지는 부분을 포함하는나노구조 - Google Patents
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Abstract
펩티드 핵산(PNA)를 포함하는 적어도 한가지 종류의 어셈블리 단위를 포함하여 만들어진 나노구조에 관계한다. PNA 어셈블리 단위에는 한 개 또는 두 개 PNA 결합 원소를 가진다. 또한, PNA 어셈블리 단위에는 구조 원소, 기능 원소 또는 결합 원소를 포함한다. 나노구조는 단계적으로 어셈블리되는 방법에 의해 적절하게 만들 수 있다. 이 방법에서 적어도 한 개의 결합안된 결합 원소를 가지는 나노구조 중간물질이 상이한 다수의 결합 원소를 가지는 어셈블리 단위와 접촉한다. 어셈블리 단위의 결합 원소들은 어느 것도 자체 결합하거나 동일한 어셈블리 단위에 있는 결합 원소와는 결합하지 않는다. 그러나, 어셈블리 단위의 또 다른 결합 원소 중 하나는 나노구조 중간물질의 미-결합된 원소와 상호작용하여, 어셈블리 단위는 나노구조 중간물질에 비-공유적으로 결합하여, 연속 과정에서 이용할 수 있는 새로운 나노구조 중간물질을 만든다. 결합안된 어셈블리 단위를 제거하고, 나노구조를 만드는데 충분한 횟수만큼의 과정을 반복한다. 한 특정 방법에서, 적어도 1회 과정에 있는 상보적인 결합 원소는 PNA 결합 원소이다.
Description
나노구조는 나노메터(1-100㎚)범위의 한 개이상의 특징적인 크기를 가지는 개별 성분으로 된 구조를 말한다. 나노메터 범위의 물리적인 크기를 가지는 성분으로된 구조를 어셈블리하는 경우에 유익한 점에 대해서는 지난 40년간 논의되어왔었다. 이와 같은 구조의 장점들이 처음으로 Feynman(1959, There's Plenty of Room at the Bottom, An Invitation to Enter a New Field of Physics (lecture), December 29,1959, American Physical Society, California Institute of Technology, reprinted in Engineering and Science, February 1960, CaliforniaInstitute of Technology, Pasadena, CA)에 의해 제기되었고, Drexler(1986, Engines of Creation, Garden City, N. Y.: Anchor Press/Doubleday)에 의해 상당히 확장되었다. 이들 과학자들은 매우 작은 특징적인 크기를 가지는 구조를 만들면 상당한 유용성이 있을 것으로 생각하였다. 나노기술의 가능한 응용 부분이 확산되고 있기 때문에, 사회에 기대되는 충격은 상당하다. (e.g., 2000, Nanotechnology Research Directions: IWGNWorkshop Report; Vision for Nanotechnology R & D in the Next Decade; eds. M. C. Roco, R. S. Williams and P. Alivisatos, Kluwer Academic Publishers). 전자 광학 성분; 의료 센서; 신물질; 생체적합성 장치; 나노전자 및 나노회로; 컴퓨터 기술등을 포함한 나노장치의 방대한 응용분야가 있을 것으로 기대된다.
나노구조의 물리적 화학적 기여도는 이것을 구성하는 빌딩 블록에 달려있다. 예를 들면, 이들 빌딩블럭의 크기, 이들이 결합할 때 각도가 나노구조의 성질을 결정하는데 중요한 역학을 하고, 기능 원소가 어디에 자리잡느냐에 따라 달라진다. 나노구조에는 다양한 형태의 물질이 이용될 수 있는 예를 제공하는데, 이용될 수 있는 물질에는 DNA(US Patents Nos. 5,468,851, 5,948, 897 and 6,072, 044; WO 01/00876), 박테리오파아지 T-이븐 꼬리 섬유(US Patents Nos. 5,864, 013 and 5,877, 279 and WO 00/77196), 사람 엘라스틴 및 다른 섬유 단백질상에 모델이되는 자가-배열 펩티드(US Patent No. 5,969, 106), 인위적인 펩티드 인지 서열(US Patent No. 5,712, 366)등이 포함된다. 그럼에도 불구하고, 나노구조의 가망 응용분야를 모두 충족시키는데 요구되는 다양성을 제공할 수 있는 새로운 추가적인 빌딩블럭을 계속적으로 요구된다. 동일한 빌딩블럭을 포함하는 동형 나노구조와 다른 종류의 빌딩블럭과 복합시킨 이형 나노구조에 이용될 수 있는 추가 빌딩블럭을 본 출원에서 제공한다.
발명의 요약
본 발명은 다종 어셈블리 단위로 형성된 나노구조를 제공한다. 일부 경우 예를 들면, 캐핑 단위와 같은 경우를 제외하고, 이들 어셈블리 단위는 상이한 결합 원소 다수로 구성된다. 본 발명의 나노구조에서, 나노구조에는 적어도 한 종의 어셈블리 단위를 포함하는데, 이때 어셈블리 단위에서 적어도 한 개의 결합 도는 구성 원소는 펩티드 핵산으로 구성된다. PNA 어셈블리 단위는 두 개 PNA 결합 원소를 가진다. 또한, PNA 어셈블리 단위에는 다른 구조적, 기능적 그리고 결합 원소를 포함할 수 있다.
본 발명의 나노구조는 단계적 어셈블리 방법(staged assembly method)을 이용하여 적절하게 만들 수 있다. 이 방법에서, 적어도 한 개의 결합안된 결합원소로 구성된 나노구조 중간 물질은 상이한 다수의 결합원소로 구성된 어셈블리 단위와 접촉할 수 있는데; 이때, (i)상이한 다수의 결합원소중 어느 것도 자가 또는 다수 결합원소와는 상호작용하지 않으며; (ii) 나노구조 중개물질의 단일 미결합된 결합원소와 상기 다수 구조의 단일 결합원소는 상보적인 결합 원소이다.
그 결과, 어셈블리 단위는 나노구조 중간물질에 비-공유적으로 결합하여 연속하는 과정에 이용할 수 있는 새로운 나노구조 중간물질을 만든다. 그 다음 미결합된 어셈블리 단위를 제거하고, 나노구조를 만드는데 충분한 횟수만큼 과정을 반복한다. 본 발명의 방법에서 적어도 1회 과정에서 상보적인 결합원소는 PNA로 구성된다.
본 발명은 펩티드 핵산(PNA)을 포함하는 나노구조를 어셈블리하는 방법, 조에서 있는 PNA 어셈블리 단위 용도 및 PNA 어셈블리 단위를 포함하는 나노구조에 관계한다.
도 1는 PNA(펩티드 핵산, 죄측)과 DNA(우측) 구조를 비교하였다. PNA는 음전하를 띄는 당-인산염 기본구조 대산에 중성 펩티드 또는 펩티드 유사 기본구조를 가진다.
도 2(A-B). 두 가지 PNA/올리고펩티드 단위를 이량화시켜 단일 어셈블리 단위를 만들 수 있다. 여기에서는 어셈블리 단위에 대해 두 가지 가능한 모양을 제시한다(도. 19A 및 FIG.19B). PNA 부분은 결합원소 A와 B'를 제공하고, 올리고펩티드 부분은 양단에서 이황화 결합에 의해 안정화되는 두 개의 코일드 코일(coiled coil) 구조 원소를 만든다. 단백질 단편과 같은 것으로 구성된 한 개 또는 그이상의 기능 단위(F)가 어셈블리 단위에 결합될 수 있다. 특정 구체예에서, 어셈블리 단위는 이량체의 내부 또는 중앙 부분에 기능 원소, F로 구성된 무직위 코일드 코일 펩티드를 가질 수 있고(도. 19A), 또는 결합 원소로 구성된 PNA 분자 마주하는 양단에 있는 기능 효소 F로 구성된 무직위 코일드 코일 펩티드를 가질 수 있다(도19B). 이들 각 다이아그램에서 PNA/올리고펩티드의 N-말단은 다이아그램의 죄측으로 C-말단은 우측으로 향하고 있다.
도 3은 도 19A에서 나타내고 있는 단계별 어셈블리 소단위를 형성하는 상휘 합성 단백질 단향체 원소의 순서를 나타내는 다이아그램이다. 상응하는 하위 단위에서 원소들의 순서는 PNA 원소가 C-말단에 있다는 것을 제외하고는 동일하다. 이는 두 개 단위를 배열하고 있는 루이신 지퍼의 나란한 배열을 반영한다. 기능을 가진 서열은 어셈블리 소단위에 기능 원소가 첨가되는 부위를 인코드한다. 글리신이 각 원소를 분리시켜, 원소간에 공간적인 방해를 줄인다. 선 아래에 있는 숫자는 각 효소 잔기의 일반적인 길이를 나타낸다.
도 4. ROP 단백질, 4개 나선 번들의 다이아그램이다.
도 5. 어셈블리 단위의 단계별 어셈블리를 나타낸다. 실제, 단계별 어셈블리에 있는 각 단계는 대규모로 나란한 방식으로 실행한다. 단계1에서, 개시단위는 고형 기질에 고정시킨다. 여기에서 설명하는 본 발명의 구체예에서, 개신 단위는 단일 결합원소이다. 단계 2에서, 제 2 어셈블리 단위가 첨가된다. 제 2 단위는 두 개의 비-상보적인 결합 원소를 가지고 있고, 이 단위는 용액에서 자체 연합되지 않는다. 제 2 어셈블리상에 결합 원소중 하나는 개시 단위에 있는 결합원소에 상보적이다. 비-결합된 어셈블리 단위는 각 단계에서 씻어낸다(나타내지 않음).
배양 후에, 개시 단위에 제 2 어셈블리 단위가 결합하여, 두 개 어셈블리 단위로 구성된 나노구조 중간물질을 만든다. 단계 3에서, 제 3 어셈블리를 첨가한다. 이 단위는 나노구조 중간물질상에 쌍을 이루지 않은 결합원소에만 상보적인 두 개 비-상보 결합 원소를 가진다. 이 단위에도 기능 단위("F3")가 포함된다.
"F4" 기능 원소를 가지는 제4 결합 단위와 "F5" 기능 원소를 가지는 제 5 어셈블리 단위를 단계 4와 5에 단계 2와 3의 것과 정확하게 유사한 방식으로 각각 첨가한다. 각 경우에, 결합 원소들을 선택하여 한번에 한 단위이상 추가되지 않도록 하고, 또한 이는 이미 지정된 위치에 기능 단위를 매우 잘 조절하여 어셈블리되도로록 한다.
도 6. 서브어셈블리로부터 나노구조 생성. 나노구조는 연속하여 서브어셈블리를 첨가하여 만들 수 있는데, 상기 도 2에서 설명한 것과 같이 개별 원소들을 추가하는데 이용된 것과 유사한 단계를 이용한다. 화살표는 커지는 나노구조에 서브어셈블리를 추가한다는 것을 나타낸다.
도 7. 이 다이아그램은 본 발명의 단계적 어셈블리 방법에 따라 나노구조에 단백질 단위 및 무기(inorganic) 원소들을 첨가하는 것을 설명한다. 단계 1에서, 개시 단위가 고형 기질에 결합된다. 단계 2에서, 어셈블리 단위는 개시 단위에 특이적으로 결합되고, 단계 3에서, 추가 어셈블리 단위는 어셈블리로 만들어지고 있는 나노구조에 결합된다. 이와 같은 어셈블리 단위는 특정 무기 원소에 특이적인 조작된(engineered) 결합 부위를 포함한다. 단계 4에서, 무기 원소(빗금친 타원)을 구조에 첨가하고, 조작된 결합 부위에 결합시킨다. 단계 5에서 제 2 형태의 무기 원소에 특이성을 가지도록 조작된 결합 부위를 가지는 또 다른 어셈블리 단위를 첨가하고, 제 2 무기 원소(빗금친 다이아몬드)를 단계 6에서 첨가한다.
도 8은 이중 특이적인 어셈블리 단위와 이차원 나노구조를 만들기 위한 한 개 테트라 특이적 어셈블리를 이용할 수 있는 11 단계 어셈블리를 나타내는 다이아그램이다.
도 9(A-B). 서브어셈블리로써 나노구조 중간물질을 이용하는 단계적으로 생성된 어셈블리의 다이아그램이다. 단계 1-3에서, 나노구조 중간물질이 만들어지고, 두 개 결합 원소들이 캡씌워지고, 고형 기질로부터 나노구조 중간물질이 방출된다. 단계 5에서, 단계3의 나노구조 중간물질을 고유 서브어셈블리인 어셈블리 중간물질(단계 4에서 나타낸 것과 같은, 고형 기질에 부착된)에 첨가된다.
정의: 본 출원에서 사용된 용어는 당분야에 통상적인 의미와 일치된다. 그러나, 동의하지 않는 경우를 대비하여 분명하게 하기 위해, 다음과 같이 정의한다.
어셈블리 단위(Assembly Unit):어셈블리 단위는 구조 원소, 결합 원소, 기능 원소들로 구성된 원자 또는 분자 집합체이다. 바람직하게는 어셈블리 단위는 특이적, 비-공유 상호작용을 통하여 단일 단위로 나노구조에 첨가한다. 어셈블리 단위에는 두 개 이상의 서브-어셈블리 단위를 포함할 수 있다. 어셈블리 단위에는 한 개 이상의 구조 원소를 포함할 수 있고, 나아가 한 개 이상의 기능 원소 및 한 개 이상의 결합 원소를 포함할 수 있다. 어셈블리 단위에 기능 원소를 포함하는 경우에, 기능 원소는 특정 구체예에 따르면 결합 원소 또는 구조 원소내에 부착 또는 결합된다. 이와 같은 구조 원소 및 한 개 또는 다수의 비-상호작용을 하는 결합원소를 포함하는 어셈블리 단위는 특정 구체예에서는 구조적으로 딱딱하고, 잘 정의된 인지 및 결합 성질을 가질 수 있다.
어셈블리 단위, 개시물질(Assembly Unit, Initiator): 개시물질 어셈블리 단위는 본 발명의 단계적으로 생성되는 어셈블리 방법에 따라 형성되는 나노구조에 결합되는 제 1 어셈블리 단위이다. 공유 또는 비-공유 상호작용에 의해 단계별로 생성되는 공정에 제 1 단계로써 고형 기질 또는 다른 매트릭스에 부착될 수 있다. 개시물질 어셈블리 단위는 "개시 단위("initiator unit")로 한다.
버텀 업(Bottom-up): 구조(나노구조)의 버텀업(Bottom-up) 어셈블리는 자가-어셈블리 또는 단계별 어셈블리를 이용하여 서브구조를 결합시켜 구조를 만드는 것이다.
캡핑 단위(Capping Unit): 캡핑 단위는 적어도 한 개 결합원소를 포함하는어셈블리 단위이다. 캡핑 단위가 일단 나노구조에 결합된 후에는 캡핑 단위와 상호작용을 통하여 나노구조내로 추가적인 어셈블리 단위가 결합할 수 없다.
기능 원소(Functional Element): 기능 원소는 원하는 물리적, 화학적 또는 생물학적 성질을 나타내는 부분으로, 나노구조내에 정의된 위치에 특이적인 공유 또는 비-공유 상호작용을 통하여 만들어 질 수 있다. 또는, 기능 원소를 이용하여 원하는 물리적, 화학적 또는 생물학적 성물을 가지는 부분을 부착 부위에 제공한다. 기능을 하는 원소에는 펩티드, 단백질(효소), 단백질 도메인, 소분자, 무기( inorganic) 나노입자, 원자, 원자 덩어리, 자성 나노입자, 광자 나노입자, 전자 나노입자 또는 방사능 활성 분자, 크로포포어, 형광단, 화학발광 분자와 같은 마커등이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다. 이와 같은 기능을 하는 원자들을 교차-연결 선형 1차원 나노구조에 이용하여 2차원 또는 3차원 나노구조를 만든다.
결합 원소(Joining Element): 결합 원소는 단위에 결합 성질을 제공하는 어셈블리 단위의 일부분인데, 예를 들면, 결합 도메인, 합텐, 항원, 펩티드, PNA, DNA, RNA, 아프타머(aptamer), 폴리머 또는 다른 부분 또는 이들의 복합물이 포함되는데, 이들은 다른 결합 원소들과 특이적, 비-공유 상호작용을 할 수 있다.
결합 원소, 상보적: 상보적 결합 원소는 특이적, 비-공유 상호작용을 통하여 서로간에 상호작용할 수 있는 두가지 결합 원소들이다.
결합 원소, 비-상보적: 비-상보적인 결합 원소들은 서로간에 특이적인 상호작용을 하지 않거나 서로간에 특이적인 상호작용 경향이 없는 두 개 결합 원소이다.
결합 쌍: 결합쌍은 두가지 상보적인 결합 원소들을 말한다.
나노물질(Nanomaterial): 나노물질은 나노구조 입자의 결정, 부분 결정 또는 비결정 어셈블리를 구성되는 물질이다.
나노입자(Nanoparticle): 나노입자는 나노메터(1-1000㎚) 범위 직경을 만들기 위해 원자 또는 분자가 서로 결합된 결합체를 말한다. 입자는 동형 또는 이형일 수 있다. 단일 결정 도메인을 포함하는 나노입자를 나노크리스탈(nanocrystals)이라고도 한다.
나노구조(Nanostructure) 또는 나노장치(Nanodevice): 나노구조 또는 나노장치는 구조적, 기능적, 결합 원소와 같은 어셈블리 단위를 포함하는 원자 또는 분자 집합체인데, 원소들은 나노메터 범위의 적어도 한가지 특징적인 길이(크기)를 가지는데, 서로에 대해 어셈블리 단위의 위치는 정의된 기하학에 의해 정해진다. 나노구조 또는 나노장치에는 이에 부착된 기능치환체가 있어 특정 기능성을 제공한다.
나노구조 중간물질(Nanostructure intermediate): 나노구조 중간물질은 추가 어셈블리 단위가 첨가되는 나노구조의 어셈블리하는 동안에 만들어지는 중간 서브구조이다. 최종 단계에서, 중간 생성물 및 나노구조는 동일하다.
비-공유 상호작용, 특이적(Non-covalent Interaction, Specific) : 특이적인 비-공유 상호작용은 예를 들면, 어셈블리 단위와 나노구조 중간 물질간에 일어나는 상호작용을 말한다.
단백질(Protein): 본출원에서, "단백질"은 일반적으로 펩티드, 폴리펩티드, 다수의 아미노산으로 구성된 단백질을 말하고, 임의 최소 아미노산 수를 부여하지는 않는다.
제거(Removing): 비-결합된 어셈블리 단위를 제거는 물리적으로 제거되는 여부에 관계없이 나노구조 생장에 추가적으로 관여할 수 없는 경우에 실시한다.
자가-어셈블리(Self-assembly) : 자가 어셈블리는 순서에 맞는 구조로 원소들이 자발적으로 조직화되는 것을 말한다. 자동 어셈블리라고도 한다.
나노구조의 단계별 어셈블리(Staged Assembly of a Nanostructure): 나노구조의 단계적 어셈블리는 나노구조의 어셈블리 과정을 말하는 것으로, 이때 일련의 어셈블리 단위가 미리-정해진 순서로 첨가되는데, 고형 매트릭스 또는 기질상에 일반적으로 고정된 개시 단위를 시작으로 한다. 각 단계로 나노구조 중간물질이라고도 하는 중간 서브 구조가 만들어지고, 추가 어셈블리 단위가 첨가된다. 어셈블리 단계는 (i) 연결 단계, 즉, 어셈블리 단위가 개시 단위에 연결되어나 또는 다음에 첨가되는 그 다음 어셈블리 단위를 포함하는 용액에 개시 단위 또는 나노구조 중간물질이 부착된 매트릭스 또는 기질을 배양함으로써 나노구조 중간물질에 연결된다; (ii) 제거 단계 또는 세척 단계, 이 단계는 중간 구조 또는 완성된 나노구조로부터 과량의 어셈블리 단위를 제거한다. 단계(i)과 (ii)를 반복하여, 모든 어셈블리 단위가 원하는 모양의 나노구조가 될 때 까지 결합되는 과정으로 형성된 단계적으로 만들어진 어셈블리를 지속한다. 어셈블리 단위는 개시 단위 또는 특이적, 비-공유 결합을 통하여 나노구조 중간 물질에 결합한다. 나노구조 중간물질의 예정된 위치에만 부착될 수 있는 어셈블리 단위의 결합 원소를 선택한다. 어셈블리 단위, 구조 원소, 결합 원소, 기능 원소의 상대적인 위치등에 대한 기하학 및 어셈블리 단위가나노구조로 첨가되는 순서들을 모두 계획하여, 기능 단위가 구조에서 상대적으로 이미 예정된 위치에 가도록 하여, 완전하게 어셈블리된 나노구조가 원하는 기능을 하도록 한다.
스트린젼시(Stringency): 실험 조건의 정도가 안정적인 하이브리드 상호작용을 얻기 위해 두 개 핵산 서열상에 고도의 상보성을 부과한다. 당분야에서는 고도의 중간정도의 스트린젼시 조건이 통상 공지되어 있다. 예를 들면, 고도 스트린젼시 조건의 예는 다음과 같으나, 이에 국한시키지는 않는다. DNA를 포함하는 필터의 선-하이브리드 반응은 완충액(6X SSC, 50mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% Ficoll, 0.02% BSA, 500㎍/㎖ 변성 연어 정자 DNA)에서 65℃, 8시간동안 실시한다. 필터는 100㎍/㎖ 변성 연어 정자 DNA, 5-20X106cpm32P-프로브를 포함하는 선-하이브리드 반응 혼합물에서 48시간동안 65℃에서 하이브리드한다. 용액( 2X SSC, 0.01% PVP, 0.01% Ficoll, 0.01% BSA)에서 37℃ 1시간동안 필터를 세척한다. 그 다음 자가방사선그래프하기 전에 45분간 0.1X SSC로 50℃에서 세척한다. 이용될 수 있는 고도 스트린젼시 조건중 다른 것들은 당분야에 공지되어 있다. 추가 예를 들면, 중간 정도의 스트린젼시 조건은 다음과 같으나, 이에 국한시키지는 않는다; DNA를 포함하는 필터를 용액(6X SSC,5X Denhart 용액, 0.5% SDS, 100㎍/㎖ 변성된 연어 정자 DNA)에서 55℃ 6시간동안 선처리하였다. 동일한 용액에서 하이브리드 반응을 실행하고, 5-20X106cpm32P-프로브를 이용한다. 필터는 하이브리드 반응 혼합물에서 18-20시간동안 55℃에서 배양하고, 용액(1X SSC, 0.1% SDS)에서 60℃에서 30분간 2회 세척하였다. 필터는 블랏 건조시키고, 자가방사능그래프에 노출시킨다. 당분야에는 중간 정도의 스트린젼시에 이용할 수 있는 다른 조건들이 공지되어 있다. 이용할 수 있는 고도 스트린젼시의 다른 조건중 프로브의 경우에 14 내지 70개 뉴클레오티드 길이를 가진 프로브와 용융 온도(TM)은 다음의 식으로 계산할 수 있다;
Tm(℃) =81.5+16.6(log[단가 양이온(molar)])+0.41(% G+C)-(500/N)
이때, N은 프로브의 길이를 나타낸다. 포름아미드를 포함하는 용액에서 하이브리드를 실시하는 경우에, 용융 온도는 다음 식으로 계산한다.
Tm(℃)=81.5+16.6(log[단가 양이온(molar)])+0.41(%G+C)-(0.61% 포름아미드)-(500/N)
이때, N은 프로브의 길이를 나타낸다. 일반적으로 하이브리드 반응은 TM이하 20-25℃( DNA-DNA 하이브리드 경우) 또는 TM이하 10-15℃(RNA-DNA 하이브리드)에서 실행한다.
구조 원소: 구조 원소는 결합 원소간에 구조적 또는 기하학적 연결을 제공하는 어셈블리 단위의 일부분으로 인접하는 어셈블리 단위에 기하학적 연결을 제공한다. 구조 원소들은 나노구조의 일부가 되는 구조적 프레임 워크를 제공한다.
서브어셈블리(Subassembly): 서브어셈블리는 서로 결합된 다중 어셈블리 단위로 구성된 원자 또는 원자 단위로, 전체로 어셈블리 중간물질(가령 나노구조 중간물질)로 통째로 첨가될 수 있다. 본 발명의 많은 구체예에서, 구조 원소들이 어셈블리 단위에 기능 원소들을 지원할 수도 있다.
탑-다운(Top-down): 구조(나노구조)의 탑-다운 어셈블리는 석판술(lithographic techniques)을 이용하여 더 큰 거대 구조를 처리함으로써 나노구조를 만드는 것이다.
PNA 어셈블리 단위
본 발명은 나노구조 생산에 이용할 수 있는 새로운 종류의 어셈블리 단위를 제공한다. "PNA 어셈블리 단위"에는 PNA인 적어도 한 개 결합 또는 기능 원소를 포함한다. 또한, 어셈블리 단위에는 구조 원소 또는 다른 결합 또는 기능 원소를 포함할 수 있다.
PNA 결합 원소
본 발명의 특정 구체예에서, 결합 원소에는 펩티드 핵산(PNA)를 포함하는데, 일반형(도 1)이 임의 숫자로 구성될 수 있다. PNA는 Nielsen et al.(1991, Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide, Science 254: 1497-1500)에 의해 처음으로 설명된 구조적으로 상동성인 DNA로써, 음전하를 띈 당-인산염 골격대신에 중성 펩티드 또는 펩티드-유사 골격을 가진다(도 1).
따라서, PNA는 단백질 또는 올리도펩티드로 볼 수 있는데, 이때 아미노산 측쇄는 DNA의 피리미딘 및 퓨린 염기로 대체된다. DNA 및 RNA에서 볼 수 있는 동일한 질소 염기(가령, 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민)을 PNA에 이용할 수 있다; PNAs 는 Watson-Crick 및 Hoogsteen 염기쌍 형성 규칙에 따라 DNA 및 RNA 분자에 결합할 수 있다. PNAs는 일반적으로 DNA 중합효소, 핵산 결합 단백질 또는 효소(가령, 프로테아제, 뉴클레아제)에 의해 기질로 인지되지는 않는다(다만, 예외적인 경우는 있다 (see, e.g., Lutz et al., 1997, Recognition of uncharged polyamide-linked nucleic acid analogs by DNA polymerasesand reverse transcriptases, J. Am. Chem. Soc. 119: 3177-78). PNAs의 생물학적 성질에 대해서는 상당히 많이 연구되었다(e.g., Nielsen etal., 1992, Peptide nucleic acids (PNA). DNA analogues with a polyamide backbone, In Antisense Research andApplications, Crooke and Lebleu, eds. , CRC Press, pp. 363-72; Nielsen et al., 1993, Peptide nucleic acids (PNAs): potential antisense and anti-gene agents, Anticancer Drug Des. 8(1) : 53-63; Buchardtet al., 1993, Peptide nucleic acids and their potential applications in biotechnology, Trends Biotechnol. 11 (9): 384-86 ; Nielsenet al., 1994, Peptide nucleic acid (PNA). A DNA mimic with a peptide backbone, Bioconjug. Chem. 5(1) : 3-7; Nielsen et al., 1996, Peptide nucleic acid (PNA): A lead for gene therapeutic drugs, in Antisense Therapeutics Vol. 4, Trainor, ed. , SECOM Science Publishers B. V., Leiden, pp. 76-84; Nielsen, 1995, DNA analogues with nonphosphodiester backbones, Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 24: 167-83; Hyrup and Nielsen, 1996, Peptide nucleic acids (PNA): synthesis, properties and potential applications, Bioorg. Med. Chem. 4: 5-23; De Mesmaeker et al., 1995, Backbone modifications in oligonucleotides and peptide nucleic acid systems, Curr. Opin. Struct. Biol. 5: 343-55; Dueholm and Nielsen, 1997, Chemical aspects of peptide nucleicacid, New J. Chem. 21:19-31 ;Knudsen and Nielsen, 1997, Application of PNA in cancer therapy, Anti-Cancer Drug 8: 113-18; Nielsen, 1997, Design of Sequence Specific DNA Binding Ligands, Chemistry 3: 505-08; Corey, 1997, Peptide nucleic acids: expanding the scope of nucleic acid recognition. TrendsBioteclmol.15 (6): 224-29; Nielsen and0rum, 1995, Peptide nucleic acid (PNA) as new biomolecular tools, in Molecular Biology: Current Innovations and Future Trends, Part 2, (Griffin, H. , Ed. ), Horizon Scientific Press, UK, pp. 73-86 ; Nielsen and Haaima, 1997, Peptide Nucleic Acid (PNA). A DNA Mimic with a Pseudopeptide Backbone, Chem. Soc. Rev.: 73-78).
도 1에서 볼 수 있는 것과 같이, PNA에서, 포스포리보즈 골격은 아미드 결합에 의해 연결된 반복 단위 예를 들면, N-(2-아미도에틸)-글리신으로 대체될 수 있다(Egholm et al., 1992, Peptide nucleic acids (PNA), Oligonucleotide analogues with an achiral peptide backbone, J. Am. Chem. Soc. 114:1895-97). 당분야에는 음전하를 띄는 당-인산염 골격에 대해 중성 펩티드 또는 펩티드 유사 골격으로의 PNA 치환에 대해서는 통상적으로 공지되어 있으며, 당업자도 용이하게 인지할 수 있는 부분이다. 변형된 폴리아미드 골격을 가지는 PNAs에 대해서는 다음에서 설명된 바 있다(Hyrup et al.(1994, Structure-Activity studies of the binding modified Peptide Nucleic Acids, Journal of the American Chemical Society 116: 7964-70); Dueholm et al.(1994, Peptide Nucleic Acid (PNA) with a chiral backbone based on alanine, Bioorg. Med. Chem. Lett. 4: 1077-80);Peyman et al. (1996, Phosphonic Esters Nucleic Acids (PHONAs): Oligonucleotide Analogues with an Achiral Phosphonic Acid Ester Backbone, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35:2636-38) ; van der Laan et al. (1996, An approach towards the synthesis of oligomers containing aN-2-hydroxyethyl-aminomethylphosphonate backbone - A novel PNA analogue, Tetrahedron Letters 37: 7857-60); Jordan et al. (1997, Synthesis of new building blocks for peptide nucleic acids containing monomers with variations in the backbone, Bioorg. Med. Chem. Lett. 7: 681-86) ; Goodnow et al. (1997, Oligomer Synthesis and DNA/RNA Recognition Properties of a Novel Oligonucleotide Backbone Analog: Glucopyranosyl Nucleic Amide (GNA), Tetrahedron Lett. 38: 3199-3202); Zhanget al. (1999, Studies on the synthesis and properties of new PNA analogs consisting of L- and D-lysine backbones, Bioorg. Med. Chem. Lett. 9: 2903-08); Stammers et al. (1999, Synthesis of enantiomerically pure backbone alkyl substituted peptide nucleic acidsutilizing the Et-DuPHOS-Rh+ hydrogenation of enamido esters, Tetrahedron Lett., 40, 3325-3328); Puschl et al. (2000, Pyrrolidine PNA: A Novel Conformationally Restricted PNA Analogue, Organic Letters 2: 4161-63); Vilaivanet al. (2000, Synthesis and properties of chiral peptide nucleic acids with a N-aminoethyl-D-proline backbone, Bioorg Med Chem Lett 10 (22): 2541-45); Yu et al., 2001, Synthesis and characterization of a tetranucleotide analogue containing alternatingphosphonate-amide backbone linkages, Bioorg. Med. Chem. 9(1) : 107-19); Fader et al. (2001, Backbone modifications of aromatic peptide nucleic acid (APNA) monomers and their hybridization properties with DNA and RNA, J. Org. Chem. 66: 3372-79).
PNA의 질산 염기는 메틸렌 카르보닐 연결에 의해 중성 골격에 부착된다. PNA는 고도로 전하를 띈 당-인산 골격을 가지고 있지 않기 때문에, 표적 핵산에 PNA 결합이 통상적인 핵산에 결합하는 것보다 더 강하여, 이와 같은 결합이 생성되는 경우에는 염 농도와는 무관하게 된다. PNA를 포함하는 이중 나선의 높은 열안정성에 의해 정량적으로 반영된다.
펩티드 골격이 하전을 띄지 않기 때문에, 두 개 상보적인 PNA 분자 또는 DNA/PNA 하이브리드내에 DNA와 PNA간에 염기쌍은 상응하는 DNA/DNA 하이브리드보다 더 강하다. 상보적인 DNA 또는 RNA에 PNA가 결합은 등가의 핵산 프로브에 결합하는 것보다 더 신속하게 일어난다. PNA에 대한 친화성이 상당히 높기 때문에, 이는 이중 가닥 DNA에 상응하는 가닥을 대치시킨다.(Nielsen et al., 1991, Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine substituted polyamide, Science 254: 1497-1500).
PNAs은 일반적으로 이에 상응하는 DNA 이중나선보다 더 높은 용융 온도를 가지는데, -예를 들면 중간 정도의 염농도(100 mM NaCI)에서 약 1℃정도 높다 (Nielsen et al., 1991, Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide, Science 254: 1497-1500;Peffer etal., 1993, Strand-invasion of duplex DNA by peptide nucleic acid oligomers, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10648-52; Demidov etal., 1995, Kinetics and mechanism of polyamide ("peptide") nucleic acid binding to duplex DNA, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 2637-41). DNA-DNA 이중나선의 열 안정성(Tm으로 나타냄)은 AT 염기쌍에서 2℃, GC 염기쌍에서 4℃를 이용하여 예측할 수 있고, 따라서, 50%GC 함량을 가지는 10 bp DNA 이중나선은 약 30℃ 용융온도를 가지는 것으로 평가할 수 있다. 따라서, 상응하는 PNA는 약 40℃의 용융 온도를 가질 수 있다. 유사하게, 18 잔기의 PNA 이중나선(50% GC)은 약 72℃의 용융 온도를 가진다. 따라서, 본 발명의 특정 구체예에서, PNA 결합 원소는 약 8개 내지 20개 잔기, 약 10개 내지 18개, 또는 약 12개 내지 16개 잔기를 가진다.
다른 구체예에서, 더 적은 잔기를 가지는 PNAs가 PNA의 삼중 나선을 만드는 장점을 이용하여 더 높은 용융 온도를 가지도록 고안할 수 있다. 특정 구체예에서, 세 개 PNA 가닥(두 개 폴리피리미딘, 한 개 폴리퓨린)이 상당히 안정한 구조를 만든다. 이와 같은 구조는 두 개 PNA을 이용하여 추가 안정화시킬 수 있는데, 예를 들면, 한 개 PNA가 글리신 스페이스에 의해 분리된 두 개 폴리피리미딘 PNA를 가지고, 이때 글리신 스페이스는 보통 3개 내지 5개 글리신 잔기를 포함한다. 상응하는 폴리퓨린 PNA와 혼합하는 경우에, 두 개 폴리피리미딘 PNA 단편이 글리신 공간 주변에서 폴드되어, 삼중 나선을 만든다. 동일 분자에 "2개"의 폴리피리미딘 가닥을 가지면, 효과적인 농도 및 삼중 나선 형성 및 강도가 형성된다. 단계별도 생성되는 어셈블리 결합 쌍의 경우에, 결합 쌍의 한 개 결합 원소에는 폴리퓨린 가닥이 포함되고, 결합 쌍의 다른 결합 원소에는 이중-길이 폴리피리미딘 PNA 결합 원소가 된다.
PNAs는 핵산 및 펩티드 합성에 이용되는 유사한 화학법을 이용하여 당분야에 공지된 방법으로 합성할 수 있다. 이와 같은 합성에 이용되는 PNA단령체는 뉴클레오시드 및 아미노산 하이브리드이다. PNA 산물, 서비스(PNA 분자의 맞춤-합성), 기술적인 서포트등은 PerSeptive Biosystems, Inc.(a division of Applied Biosystems, Foster City, CA)에서 구할 수 있다. 시판되는 시약 및 장비를 이용하여, PNA를 합성하거나 또는 PerSeptive Biosystems, Inc와 같은 제조업자로부터 구입할 수 있다. PNA 올리고머는 표준 펩티드 합성 프로토콜을 이용하여 Fmoc 또는 t-Boc 보호된 단량체를 이용하여 수작업으로 합성할 수도 있다. 유사하게, 표준 펩티드 정제 조건을 이용하여 합성 후에 PNA를 정제할 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명에 이용된 PNA는 키메라 PNA 또는 이의 유도체 또는 변형된 것으고, PNA에 대한 참고문헌에서 이와 같은 변이체 모두 PNA에 속함을 이해할 것이다. 키메라 PNA는 염기 부분 또는 펩티드 골격 부분에서 변형이 있는 것으로, 첨부 기 또는 라벨를 포함할 수 있다. 키메라 PNA는 두 개 또는 그 이상의 인접 아미노산 서열에 또는 한 개 또는 그 이상의 아미노산에 공유 결합에 의해 연결된 PNA 서열로 구성된 분자가 될 수 있다.
예를 들면, 키메라 또는 변형된 PNA에는 다음에서 선택된 적어도 한가지 변형된 염기 부분을 포함할 수 있으나, 이에 국한시키지는 않는다; 5-플로오르우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오드우라실, 하이포산틴, 산틴, 4-아세틸시토신, 5-(카르복시하이드록시메틸)우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 디하이드로우라실, 베타-D-갈락코실퀘오신, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸사이토신, N6-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타- D-만노실퀴노신, 5'-메톡시카르복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6- 이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산(v), 위부토옥신(wybutoxosine), 슈도우라실, 퀘노신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산(v), 5-메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-N-2-카르복시프로필) 우라실, (acp3)w, 2,6-디아미노퓨린.
특정 구체예에서, 변형된 또는 키메라 PNA에는 "공통 염기" "3-니트로피롤"(Zhang etal., 2001, Peptide nucleic acid-DNA duplexes containing the universal base 3-nitropyrrole, Methods 23: 132-40)을 포함한다.
원하는 PNA가 합성된 경우에, 고형 기질상에 공지의 방법으로 합성되고 처리된 PNA를 고형 기질에서 떼어내고, 임의 존재하는 보호기를 제거한다. PNA를 당분야에 공지된 방법으로 정제하는데 예를 들면, 추출 및 젤 정제한다. PNA농도 및 순도는 아크릴아미드 겔상에서 분리된 PNA를 검사하거나 분광광도계에서 광학 밀도를 측정하여 결정한다.
본 발명의 특정 구체예에서, 결합 쌍에는 표준 Watson-Crickand/ Hoogsteen염기쌍을 통하여 결합할 수 있는 상보적인 PNA 결합 쌍을 포함한다. PNA 부분이 결합 원소로 작용할 수도 있도, 올리고펩티드, 단백질, 단백질 단편이 작은 구조적 원소를 제공하고, 특정 구체예에서는 구조 원소에 추가적으로 도 19(A-B)에서 설명하는 것과 같은 기능 원소가 포함될 수 있다. 도 19(A, B)에서 볼 수 있는 것과 같이, PNA/올리고펩티드 단위를 이량화시켜, 단일 어셈블리 단위를 만들 수 있다. PNA 일부분이 결합 원소 A 와 B'를 제공할 수도 있도, 올리고펩티드 부분이 두 개의 코일드 코일 구조 원소를 만들 수도 있다.
DNA와 같이, PNA/PNA 분자는 역평행 방식에서 가장 안정하게 결합한다 (Wittung etal., 1994, DNA-like double helix formed by peptide nucleic acid, Nature 368: 561-63). PNA 분자의 경우에, 아미노 말단은 이에 상응하는 DNA서열의 5'말단에 등가이다(도 1). 루이신 지퍼(Leucine zipper) 이량체는 보통 평행한 방식으로 결합한다(아미노 말단이 아미노 말단에 인접)(Harbury etal., 1993, A switch between two-, three-, and four-stranded coiled coils in GCN4 leucine zipper mutants, Science 262: 1401-07). 따라서, 도 2에서 볼 수 있는 어셈블리 단위에 나타낸 모든 분자는 나란한 방향(아미노 말단이 좌측의 5' 단부에, 카르복시 말단이 우측의 3' 단부에)으로 나타나있다.
특정 구체예에서, 어셈블리 단위는 이량체의 내부 또는 중앙(도 2A)에 기능 원소 F를 포함하는 또는 결합 원소로 구성된 반대쪽 양단인 PNA 분자 끝에 기능 원소 F를 포함하는 무작위 코일드 코일 펩티드를 가진다. 두 개 기능 원소가 동일하거나 상이할 수 있다. 어셈블리 단위를 이용하여 단계적으로 어셈블 리가 될 수있도록 하여 비-제어적으로 어셈블리되는 것을 피할 수 있도록 결합 원소를 고안한다. 이와 같은 설명에서, PNA 서열의 적어도 두 개 상보적인 쌍을 이용한다. 결합 쌍간에는 자가-상보적 또는 교차-상보성이 존재하지 않아야 한다.
도 3에서는 도 2에서 나타낸 단계적으로 형성된 어셈블리 서브단위를 만드는 상부 합성 단백질 단량체 원소의 순서를 나타낸다. 상응하는 하부 유닛에 원소들의 순서는 PNA 원소가 C-말단에 있는 것을 제외하고는 동일하다. 이는 두 개 단위를 배열하고 있는 루이신 지퍼의 나란한 배열을 반영한다. 기능을 가진 서열은 어셈블리 소단위에 기능 원소가 첨가되는 부위를 인코드한다. 글리신이 각 원소를 분리시켜, 원소간에 공간적인 방해를 줄인다. 선 아래에 있는 숫자는 각 효소 잔기의 일반적인 길이를 나타낸다.
PNA/올리고펩티드 어셈블리 단위 구조 형성은 당분야에서 단백질 폴딩을 모니터하는데 이용되는 동일한 방법으로 모니터할 수 있다. 예를 들면, 올리고펩티드 부분은 코일드-코일 형성을 예측할 수 있는 스포트웨어 가령, Multicoil(Wolf et al., 1997, MultiCoil: A program for predicting two-and three-stranded coiled coils, Protein Science 6: 1179-89), Paircoil (Berger etal., 1995, Predicting coiled coils by use of pairwise residue correlations, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 8259-63), COILS (Lupas etal., 1991, Predicting coiled coils from protein sequences, Science 252: 1162-64; Lupas, 1996, Prediction and analysis of coiled-coil structures, Meth. Enzymology 266: 513-25) and Macstripe (Lupas etal, 1991, Predicting Coiled Coils from Protein Sequences, Science 252:1162-64)로 맞출 수 있다. 원이색성(circular dichroism, 이하 "CD"로 칭함) 측정과 같은 표준 기술, 예를 들면 CD 스펙트럼을 이용하여 올리고펩티드 폴딩을 모니터할 수 있다. 또한, PNA 결합 원소를 포함하는 결합쌍 형성 모델링은 DNA-DNA 상보 결합쌍 규칙에 따라 할 수 있다. 시판되는 다양한 소프트웨어 패키지 예를 들면, Amplify (University of Wisconsin, Madison WI), Vector NTI (InforMax, Bethesda MD), GCG Wisconsin Package(AccelrysInc., Burlington MA)중 임의의 것을 이용하여도 PNA 결합 쌍을 잘 평가할 수 있다.
PNA/올리고펩티드 어셈블리 단위는 몇 가지 측면에서 다른 타입의 어셈블리 단위(예를 들면, 필린(pilin)-계 면역글로블린-계 어셈블리 단위)와는 상이하다. PNA/올리고펩티드 어셈블리 단위는 생물학적으로 두가지 다른 종류의 하이브리드 즉, PNA와 올리고펩티드의 하이브리드이기 때문에, 생물학적으로 합성되기 보다는 화학적으로 합성된다. 따라서, 이와 같은 PNA을 포함하는 어셈블리 단위의 각 베치의 테스트와 엄격한 품질 조절이 요구된다. 이와 같은 테스트에는 샌드위치 ELISAs 와 단백질/단백질 상호작용에 대한 CD, PNA 원소의 온도 평가, 전체 길이 분자 비율을 결정하기 위한 SDS-PAGE등이 포함된다.
어셈블리 단위의 α나선 올리고펩티드 부분은 구체예에서, 헵타드(heptad)당 약 1 nm 길이이고, 루이신 지퍼 도메인은 어셈블리 단위 작제에서 구조 원소로 이용된다(Harbury et al., 1994, Crystal structure of an isoleucine-zipper trimer, Nature 371: 80-83). 4~6개 heptads(28-42개 아미노산)을 가지는 어셈블리의 구체예에서, 구조 원소는 약 4-6nm 길이를 가진다. PNA 결합 원소는 구조적으로 DNA와 유사하고, 길이가 약 염기당 0.34nm이다. 따라서, 특정 구체예에서, 10-18개 잔기를 가지는 결합 원소는 길이가 약 3~6nm이고, 이와 같은 어셈블리 단위는 길이가 약 7-12nm이다.
PNA/올리고펩티드 어셈블리 단위는 또한 여기에서 설명하는 일반적으로 덜 딱딱한 다른 구체예의 것과는 상이하다. 특정 구체예에서, PNA-펩티드 어셈블리 단위는 루이신 지퍼 구조를 포함한다. 이와 같은 PNA-펩티드 어셈블리 단위는 어느 정도의 유연성을 가지는 알파 나선 부분을 가지는데, 특정 구체예에서, 두 개 또는 3개 나선 번들이 존재해도 분리된 나선 코일정도로 유연하지는 못하다. PNA 부분은 상대적으로 유연성을 가지고, 단계적으로 어셈블리된 본 발명의 방법에 따라 어셈블리된 구조는 단단한 막대보다 유연한 비드 줄에 가깝다. 또한, 특정 구체예에서, 구조 원소에 결합 원소를 연결하는 유연성 도메인(예를 들면, 트리글리신, 테트라글리신 또는 펜타글리신)이 어셈블리 단위에 유연성을 추가시키고, 더 잘 정렬된 구조를 제공한다. 이와 같은 단위들로 구성된 이차원 및 삼차원 나노구조는 자유 단위와 같은 어느 정도의 유연성을 가진다. 그러나, 고형 서포트 또는 매트릭스의 다중 지점에 부착시에, 전체 구조에 장력을 제공하여, 거미줄 또는 그물망에 인장력을 제공하여 뻣뻣하게 하는 방식으로 단단하게 만들 수도 있다.
코일드 코일 구조 원소를 이용하여 어셈블리 단위와 어셈블리 단위에 의해 만들어지는 나노구조의 고안 및 작제시에 유연성을 제공할 수 있다. 일반적으로 상기에서 설명한 것과 같은, 간단한 루이신 지퍼형 코일드 코일은 자체적으로 어셈블리 단위를 유지할 정도로 안정적이지는 않지만, 이황화결합(상기에서 설명)에 의해안정화될 수 있다. Rop 단백질에서 볼 수 있는 4개 나선 번들이 실온에서 일반적으로 안정하고, 필요에 따라 길이를 연장할 수 있어, 어셈블리 단위를 만드는데 필요한 안정성을 제공할 수 있다. 또한, 기능 원소간의 거리 조절은 코일드 코일의 길이를 변경시키거나, 결합 원소와 기능 원소간에 유연성 펩티드 단편을 끼워넣어 조정할 수 있다. 특정 구체예에서, 유연성 나노구조는 건축상의 줄에 있는 비드와 유사하다.
PNA/단백질 어셈블리 분자는 공통적인 기본 구조를 공유하기 때문에, 단일 분자로 합성할 수 있다. 이들을 별도로 합성한 후에, 두 성분을 서로 결합시킬 필요가 없다. PerSeptive Biosystems (division of Applied Biosystems, Framingham MA)에서 시판되는 통상적인, 대비 PNA/단백질 합성을 이용할 수 있다.
각 PNA 결합 원소의 서열은 어셈블리를 정확하게 하는게 결정적이다. 상보적인 염기쌍을 고안하는 것은 당업자에게는 상대적으로 용이하나, 동일한 어셈블리 단위일 수 있는 PNA간에 상보적인 염기쌍이 없다는 것을 확인하는 것이 중요하다. 당업자에 공지된 다양한 DNA 소프트웨어 패키지가 있는데, 이를 이용하여 상보성에 대한 뉴클레오티드 서열 분석을 할 수 있다. 이용 할 수 있는 소프트웨어로는 Amplify(University of Wisconsin, Madison WI), Vector NTI (InforMax, Bethesda MD), GCG Wisconsin Package (Accelrys Inc. , Burlington MA)이 있다. 내부 상보성을 가지는 PNA 단편은 헤어핀 루프를 만들 수 있고, 여기에서 설명하는 방식의 단계적으로 만들어진 어셈블리 방법에 따라 이를 적절하게 피할 수 있다.
하기 표 1은 PNA/단백질 어셈블리 단위에서 결합 원소에 포함되는 예시적인PNA 서열을 나타내며, 이용할 수 있는 서열과 이용할 수 없는 서열을 제공한다. 적절한 구체예에서, PNA 결합쌍의 한 개가 단일 어셈블리 단위에 부착된다. 결합 쌍의 상응하는 부분은 직적접인 상보 서열이고, 또 다른 어셈블리 단위에 부착된다. 표 1에 있는 서열은 아미도에서 카르복시 방향(5'→3')이다.
표 1
PNA/단백질 어셈블리 단위에서 결합 원소로 이용할 수 있는 PNA 서열.
필적할 수 있는 결합 쌍( A...B'와 B...A'의 일반형을 가지는 두 개 어셈블리 단위) ; *는 어셈블리 단위의 나머지를 나타낸다.
도19(A-B)에는 현재 단계적으로 어셈블리되는 방법에 이용할 수 있는 어셈블리 단위를 만드는데 이용할 수 있는 합성 분자의 두 가지 구체예를 나타내는 다이아그램을 포함한다. 도 19(A-B)에서 볼 수 있는 것과 같이, 두 개 PNA/올리고펩티드 단위를 이량화시켜, 단일 어셈블리 단위를 만들 수 있다. 두 가지 가능한 어셈블리 단위는 도 2A 및 2B에 나타내었다. PNA 부분은 결합원소 A와 B'를 제공하고, 올리고펩티드 부분은 양단에서 이황화 결합에 의해 안정화되는 두 개의 코일드 코일 구조 원소(S)를 만든다. 단백질 단편과 같은 것으로 구성된 한 개 또는 그이상의 기능 단위(F)가 어셈블리 단위에 결합될 수 있다. 특정 구체예에서, 어셈블리 단위는 이량체의 내부 또는 중앙 부분에 기능 원소, F로 구성된 무직위 코일드 코일 펩티드를 가질 수 있고(도. 2A), 또는 결합 원소로 구성된 PNA 분자 마주하는양단에 있는 기능 효소 F로 구성된 무직위 코일드 코일 펩티드를 가질 수 있다(도2B).
이 구체예에서, 상응하는 다음 어셈블리 단위(예를 들면, 단계별로 어셈블리하는 동안에 첨가될)에 원소 순서(결합, 구조 및 기능 원소)는 PNA 원소가 C-말단에 있을 수 있다는 것을 제외하고는 동일하다. 이는 루이신 지퍼의 나란한 배열을 반영한다. 글리신은 각 원소를 분리시켜, 원소간에 공간적인 간섭을 감소시킨다.
PNA 기능 원소
또 다른 구체예에서, 펩티드 서열로 구성된 기능 원소("F")는 루이신 지퍼 이량화에 의해 형성되는 어셈블리 단위에 있는 두 가지 위치에 있다. 서열은 PNA에서 펩티드의 양단에 첨가되거나 도 2에서 보는 바와 같이 더 짧은 α나선사시에 삽입시킬 수 있다.
표 2는 몇 가지 기능 원소를 예시한 것이나 이에 국한시키지는 않는다.
표 2
펩티드/PNA 단위에서 기능 원소로 이용될 수 있는 펩티드.
한 구체예에서, 기능 원소는 PNA 단편으로 구성된다. 결합 원소로 사용하기 위해 합성하는 동안에 단량체의 끝에 PNA를 위치시키기 때문에, 염기쌍을 형성할 수 있는 PNA 단편이 합성된 펩티드 소단위 중간에 위치하여 기능 원소로 작용할 수도 있다. 이는 정확하게 분지를 만든 나노구조 또는 구조 원자가 있는 PNA 기능 원소와 염기쌍 상호작용에 의해 정확하게 나노구조에 부착되는 PNA-결합된 결합 원소를 만들 수 있도록 한다. 적절한 구체예에서, 기능 원소, 연결 시스테인 잔기는 일반적으로 이웃하는 구조 또는 결합 원소와 약 2개 내지 5개 글리신 잔기의 펩티드 단편에 의해 떨어져 있어, 단백질/펩티드 도메인이 독립적으로 만들어 질 수 있다.
다른 원소들
본 발명의 다른 구체예에서, 어셈블리 단위는 구조 원소들을 포함한다. 상기에서 설명한 것과 같이, 구조 원소는 루이신 지퍼가 될 수도 있다. 좀더 일반적으로 구조 단위는 특정 구체예에서 단단한 구조(특정 구체예에서는 구조 원소가 단단하지 않을 수도 있다)를 가진다. 구조 원소는 정의된 펩티드 또는 공지의 크기 및 약 50개 이상 2000개 미만의 아미노산으로 구성된 구조로 된 단백질 또는 단백질의 일부 단편이 바람직하다. 자연 발생 펩티드, 단백질, 단백질 단편이 구조가 잘 알려져 있고, 단백질의 다른 면사이에 또는 그 중간에 안정적인 공간 관계를 제공하는 구조를 가진 코어를 가지기 때문에, 펩티드, 단백질, 단백질 단편이 적절하다. 이와 같은 성질로 인하여, 이와 같은 구조 원소는 어셈블리 단위의 결합 원소와 기능 원소간에 미리 고안한 기하학적 관계를 유지할 수 있도록 하고, 결합되는 어셈블리 단위의 공간 및 상대적인 위치도 유지할 수 있도록 한다.
구조 원소로써 단백질을 이용하면 무기 나노입자와 같은 다른 것에 비해 특별한 잇점이 있다. 대부분의 무기 나노 입자는 이형성이기 때문에, 나노구조의 어셈블리에 대해 신통치 않은 구조를 만들 수도 있다. 대부분의 경우에, 각 무기 나노 입자는 상이한 수의 원자, 면과 결정 면사이에 상이한 기하학적 상관관계와 단점 및 불순물등으로 구성될 수 있다. 대조적으로 필적할 정도의 크기 집단의 단백질은 매우 균질하여, 각 단백질은 동일한 수의 아미노산으로 구성되고, 각각은 동일한 방식으로 배열되고, 열 파동 효과를 통하는 경우에만 대부분의 경우에 배열이 상이하다. 결론적으로 서로가 상호작용하도록 고안된 두 개 단백질은 동일한 기하학으로 상호작용을 하여, 예측되는 기하학과 공간적인 배열을 가지는 복합체가 형성된다. 이와 같은 성질은 나노구조의 방대한 나란한 "버텀-업" 어셈블리에서는 필수적이다.
구조 원소를 이용하여 나노구조의 결합 원소 및 기능 원소간에 기하학적인상관관계를 유지할 수 있다. 이와 같은 경우에, 여기에서 설명하는 단계적으로 어셈블리된 방법을 이용하여 나노구조를 만드는데에는 단단한 구조 원소가 적절하다. 이와 같은 견고성은 많은 단백질에는 전형적인 것으로, α나선 및 β 쉬트와 같은 단백질을 구성하는 2차 구조 원소의 성질을 통하여 단백질에 부여된다.
구조 원소들은 삼차 구조를 알고있거나 또는 처음부터 고안할 수 있는 단백질, 단백질 단편, 또는 펩티드 구조에 근거한다. 어셈블리 단위에서 구조 원소로 이용할 수 있는 단백질 또는 단백질 단편의 예로는 항체 도메인, 다이아보디(diabodies), 단일 쇄 항체 가변 도메인, 박테리아 필린(pilin-섬모 구성분)등이 포함되나 이에 국한되지는 않는다.
일부 구체예에서, 구조 원소, 결합 원소, 기능 원소는 글리신 링커에 의해 정확하게 분리될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 결합 원소는 구조 원소의 통합 부분이 되는 펩티드 또는 단백질 단편이 관여하거나 항체의 가변 도메인의 상보성 결정 부위(CDRs)의 한 단부에서 다중 고리를 포함할 수 있다.(Kabat et al., 1983, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U. S. Department of Health and Human Services). CDR은 항체의 가변 도메인의 일체 부분인 결합 원소이다. 가변 도메인은 구조 원소를 나타내고, CDR을 만드는 결합 원소간에 경계(일부 문헌에서는 많은 항체 서열을 비교한다)는 구조적으로 명백하지는 않을 수 있다. 구조 원소와 결합 원소간에 잘 확립된 경계가 항상 있는 것은 아니나, 상대적인 이용성이 잘 확립되기는 했지만, 이들 도메인의 경계는 공간적으로 모호할 수 있다.
본 발명의 구조적 원소에는 결합 원소, 기능 원소, 유연성 도메인(가령, 트리글리신, 테트라글리신, 펜타글리신)에 결합할 수 있도록 변형될 수 있는 자연 발생 단백질의 코어 구조 원소를 포함하여, 유용한 어셈블리 단위를 제공할 수 있다. 결과적으로, 특정 구체예에서, 기존 단백질 구조를 분석하여 단백질의 견고성 구조에 영향을 주지 않으면서 변형시킬 수 있는 단백질의 일부를 확인할 수 있다.
예를 들면, 특정 구체예에서, 단백질 또는 구조 원소의 표면 루프 부분의 아미노산 서열은 단백질의 전반적인 폴링에 거의 영향을 주지 않도록 변형된다. 단백질의 표면 루프의 아미노산 서열은 결합 원소, 기능 원소 또는 유연성 도메인의 추가 아미노산 서열을 단백질 구조의 파괴 가능성을 최소화하면서 삽입될 수 있는 아미노산 부위로 적절하다. 단백질에 있는 표면 고리 위치는 단백질 또는 이의 동사체의 3차 구조를 검사하여 결정할 수 있는데, 3차 구조 원자 배열은 공지 도메인 단백질 시각화 컴퓨터 프로그램 예를 들면, RASMOL (Sayle etal., 1995, RasMol: Biomolecular graphics for all, Trends Biochem. Sci. (TIBS) 20 (9): 374-376; Saqi etal., 1994,PdbMotif-a tool for the automatic identification and display of motifs in protein structures, Comput. Appl.Biosci. 10 (5): 545-46)을 이용할 수 있다. 이와 같은 방식으로, 표면 고리에 포함된 아미노산 및 표면 고리의 상대적인 공간 위치도 결정할 수 있다.
만들게 될 단백질의 3차 구조를 모르고, 이와 근접한 유가체의 구조는 아는 경우(예를 들면, 모든 항체 분자의 경우) 관심 대상 분자 또는 이의 일부분의 아미노산 서열을 3차 구조를 아닌 분자와 나란하게 배열할 수 있다. 비교함으로써( BLAST(Altschul etal., 1997, Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation ofprotein database search programs, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402) 또는 LALIGN을 이용(Huang and Miller, 1991, A time efficient, linear-space local similarity algorithm, Adv. Appl. Math. 12: 337-357), 3차원 구조를 아는 단백질의 표면 고리(β-턴)로 구성된 아미노산에 상응하는 관심 대상이 되는 단백질에 있는 모든 아미노산을 확인할 수 있다. 두 단백질간에 서열 유사성이 큰 부분에서, 이와 같은 확인은 확실성을 부여한다. 가상 고리가 확인되면 본 발명에서 설명하는 방법에 따라 변경시킨 다음, 생성된 구조를 검사하여, 예상 성질을 가지는 지를 결정한다. 고리 확인 과정이 매우 신뢰성 있고, 이와 같은 결정이 3차 구조를 알고 있는 단백질 구조에 근거하였을 경우에도 이와 같은 분석을 실시한다.
루이신 지퍼-형 코일드 코일을 포함하는 구조 원소를 어셈블리 단위에 이용하여, 본 발명의 나노구조를 만들 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명에는 본 발명의 단계적으로 어셈블리시키는 방법을 이용하여 나노구조 작제에 이용하는 루이신 지퍼형 코일드 코일을 포함하는 구조 원소를 포함한다. 루이신 지퍼는 잘 알려진, α-나선 단백질 구조로써(Oas etal., 1994, Springs and hinges: dynamic coiled coils and discontinuities, TIBS 19: 51-54 ; Branden et al., 1999, Introduction to Protein Structure 2nd ed. , Garland Publishing, Inc. , New York) 루이신 지퍼 도메인의 정확한 서열에 따라 이량체, 삼량체, 사령체로 단백질또는 단백질 단량체를 올리고머화시키는데 관계한다(Harbury etal., 1993, A switch between two-, three-, and four- stranded coiled coils in GCN4 leucine zipper mutants, Science 262: 1401-07). 간단하게 설명하기 위해 여기에서는 이령체만을 설명하나, 당업자는 삼량체 및 사량체 단위 또한 여기에서 설명하는 방법에 따라 단계적으로 어셈블리되는 나노구조에서 어셈블리 단위를 작제하는데 이용할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 특정 구체예에서, 삼량체 및 사량체 단위는 특히 적절한 활성을 위해 두 개 이상의 화학 분자를 요구하는 기능 원소 결합에 유익한데, 가령, 금 입자에 결합시키기 위해 두 개 시스테인 부분을 결합시키는 것이다. 루이신-지퍼 도메인의 몇 가지 예를 하기 표 3에서 제공한다.
표 3에서는 표준 루이신 지퍼 및 매우 안정성이 높은 이량화반응 서열을 제공한다. 위쪽 선은 반복 단위를 나타낸다. a 및 d 위치에 있는 잔기는 일반적으로 소수성으로 올리고머 반응을 조절한다. e와 g 위치는 일반적으로 하전을 띄고, 염 다리를 만들어 올리고머 반응을 안정화시킨다.
표 3
표준 루이신 지퍼 및 매우 안정성이 높은 이량화반응 서열
본 발명에서는 많은 자연 발생 루이신 지처를 이용할 수 있는데, 이스트 전사인자 GCN4와 포유류 Fos, Jun, Myc 온코진에서 발견할 수 있는 것들이 포함된다. 루이신 지퍼를 포함하는 추가 단백질 및 다른 코일드 코일-형 올리고머반응 서열은 공지의 단백질 데이터베이스 예를 들면, SWISS-PROT/TrEMBL (Bairoch and Apweiler, 2000, The SWISS-PROT protein sequence database and its supplementTrEMBL in 2000,Nucl. Acids Res. 28: 45-48)을 이용하여 조사하면 확인할 수 있다. 표 4에서는 "코일드 코일" 및 "이량체"를 키워드로 하여 이와 같은 조사 결과를 나타낸 것이다.
표 4에서, 통상적인 유전자 이름이 나열되어 있도, 이들의 SWISS-PROT 접근 번호, 서열 설명 및 서열이 제공된다. SWISS-PROT 접근 번호는 서열 기록에서 유일한 확인자가 된다. 접근 번호를 기록에 제공하고, 문자와 숫자를 복합시켜 나타내는데, 단일 영문자 다음에 5자리 숫자(예를 들면, Q12345) 또는 6개 숫자와 문자 복합(Q1Z2F3)으로 나타낸다. 코일드 코일 서열은 밑줄로 나타내었다.
표 4
코일드 코일 이량체화 반응 서열의 예시
당분야에 공지된 과정을 이용하여 고도의 안정성이 있는 루이신 지퍼를 유도할 수 있다(see, e. g., Newman etal., 2000, A computationally directed screen identifying interacting coiled coils from Saccharomyces cerevisiae, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97,13203-08). 컴퓨터프로그램 가령, PAIRCOIL(Berger etal., 1995, Predicting Coiled Coils by Use of Pairwise Residue Correlations, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 8259-63) 및 MULTICOIL(Wolfet al., 1997, MultiCoil: A program for predicting two-and three-stranded coiled coils, Protein Science 6: 1179-89)을 이용하여 이량체 및 삼량체를 형성하기 위해 어떻게 코일드 코일이 상호작용하는지를 예측할 수 있다.
루이신 지퍼는 7개 잔기 반복 단위로 설명할 수 있다. 루이신 지처에서 유도된 각 헵타드(heptad)에서 7개 아미노산중a와d위치에 있는 잔기는 일반적으로 소수성 아미노산(알라닌, 발린, 페닐알라닌, 메티노닌, 이소루이신, 루이신)이고,e와g위치에 있는 아미노산 잔기는 항상 전하를 띈다(아스파르트산, 글루타민산, 리신, 아르기닌). 소수성a및d잔기의 특정 서열은 염기쌍 두 성분이 서로 상호작용을 하는지를 결정한다. 따라서, 많은 코일드 코일은 이미 공지되어 있고, 컴퓨터 소프트웨어 분석을 이용하여 잠재적인 신규한 코일드 코일을 확인하고, 고안 및 테스트할 수 있다(Newman et al., 2000, A computationally directed screen identifying interacting coiled coils from Saccharomyces cerevisiae, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 13203-08).
헵타드의e와g위치에 있는 잔기는 코일간에 결합을 안정화시키는 염 다리를 만들어 코일드 코일이 서로 얼마나 강하게 결합하는지를 결정한다(Krylov etal., 1998, Interhelical interactions in the leucine zipper coiled coil dimer: pH and salt dependence of coupling energy between charged amino acids, J. Mol. Biol. 279: 959-72). 루이신 지퍼 서열에 근거하여 루이신 지처의 나선내 결합 강도, 특히e와g위치에 대한 예상 공식을 유도하는데 이는 당업자에 공지된 것이다. 이는 특정 어셈블리 단위 작제에 필요한 루이신 지퍼 길이를 결정하는데 이용할 수 있다. 루이신 지퍼에 있는 헵타드 수는 이들 헵타드를 구성하는 분자간에 결합 강도에 영향을 주는데, 일반적으로 약 4개 헵타드면 정상 온도에서 충분하다. 특정 구체예에서, 더 높은 온도(>40℃)에 노출되는 나노구조는 더 긴 코일드 코일로 구성된 어셈블리 단위를 이용하거나 또 다른 방식 예를 들면, 한 개이상의 분자내 이황화 결합을 도입시키는 방식으로 안정화된 오일드 코일로 구성된 어셈블리 단위를 이용하여 작제하였다.
분리된 루이신 지퍼는 일반적으로 단백질 환경 밖에서는 안정된 이량체를 형성하지 못한다(Branden and Tooze 1999, Introduction to Protein Structure, 2nded., Garland Publishing, Inc. New York, p. 37). 따라서, 루이신 지퍼를 형성하는 본 발명의 어셈블리 단위를 안정화시키기 위해, 적절한 구체예에서 측면 시스테인을 삽입하여 이황화결합을 만든다. 일단, 이와 같은 결합이 형성되면, 고안된 어셈블리 단위는 환원제에 노출되지 않는한 안정할 것이다. 따라서, 특정 구체예에서, 시스테인을 루이신 지퍼 끝에 첨가하거나 루이신 지퍼의 α-나선 및 PNA 결합 원소사이에 첨가하여 안정적인 이황화결합을 만든다.
어셈블리 단위에서 시스테인의 정확한 위치는 분자 모델링 소프트웨어 가령, SIBYL(Tripos Inc. , St. Louis, MO), RasMol (Sayle et al., 1995, RasMol: Biomolecular graphics for all, Trends Biochem. Sci. (TIBS) 20 (9): 374-76), 또는 PdbMotif(Saqi etal., 1994,PdbMotif-a tool for the automatic identification and display of motifs in protein structures, Comput. Appl. Biosci. 10 (5): 545-46)를 이용하여 어셈블리 단위 또는 어셈블리 서브단위를 모델링하여 결정할 수 있고, 실제 검사할 수 있다. 두 개 시스테인을 이황화결합으로 전환시키는 것은 당분야에 공지된 것으로 용액에 산화환원 전위를 변경시켜 조절할 수 있다. 산화 조건(산소 존재하에)에서, 황원자가 결합한다. 환원 조건(가령, 디티오트레톨(DTT)와 같은 환원제 첨가)하에서는 두 개 황 원자는 서로 결합하지 않는다.
일반적으로, 두 개 이황화 결합으로 어셈블리 단위의 코일드 코일을 서로 충분히 유지시킬 수 있다. 적절한 구체예에서, 시스테인 잔기는 루이신 지퍼의 양단에 배치되고, 이를 이용하여 어셈블리 단위를 서로 결합시킨다. 그러나, 다른 구체예에서, 시스테인 잔기를 어셈블리 단위내에 임의 도메인 경계에 위치시킨다. 특정 구체예에서, 이와 같이 첨가된 시스테인 잔기가 인접하거나 한 개 이상 적절하게는 2개 내지 5개 글리신 잔기에 인접한다.
루이신 지처에 의해 형성된 이량체 형성은 협동 과정이고, 따라서, 루이신 지퍼 지퍼 길이는 이들 나선간에 결합 안정성에 영향을 준다(Su etal., 1994, Effect of chain length on the formation and stability of synthetic a-helical coiled coils, Biochemistry 33: 15501-10). 3과 4 헵타드간에 온도 안정성이 상당히 증가되나 더 긴 나선의 경우에는 안정성 증가나 적어진다. 본 발명의 특정 구체예에서, 4개 헵타드를 단일 파괴안된 단위 이량화 부분에 이용하고, 기능 서열이 헵타드를 방훼할 경우에 두 개의 3-헵타드 부분이 필요하다(하기 참고).
4개 나선 번들을 포함하는 구조 원소를 본 발명의 나노구조의 어셈블리 단위에 이용할 수 있다. 루이신 지퍼의 고안 및 작제는 어셈블리 단위 구조 원소에 이용할 수 있는 코일드 코일 올리고머화 반응 펩티드중 한 가지 형태를 나타낸다. 또 다른 타입은 4-나선 번들로써, 도 4에서 볼 수 있는 예가 되는데, 이에 국한시키지는 않는다. 어셈블리 단위를 만들기 위해 나선을 연결하는 한가지 이상의 고리 단편(예를 들면, 비-나선 단편)이 있기 때문에, 이와 같은 구조를 "나선-고리-나선" 구조라고 한다. 고리 부분이 기능을 하는 고농도에서 서로 가까이 나선을 유지시켜전반적인 구조 안정에 기여한다. 나선-고리-나선 단백질의 예로는 세균성 Rop 단백질(두개 나선-고리-나선 분자를 포함하는 동종이량체)(Lassalle etal., 1998, Dimer-to-tetramer transformation: loop excision dramatically alters structure and stability of the ROP four alpha-helix bundle protein, J. Mol. Biol. 279 (4): 987-1000); 진핵 사이토크롬 b562(단일 나선-고리-나선-고리-나선-고리-나선 구조로 구성된 단량체 단백질)(Lederer etal.,1981, Improvement of the 2.5A resolution model of cytochrome b562 by redetermining the primary structure and using molecular graphics, J. Mol. Biol. 148 (4): 427-48); Max(Lavigne etal., 1998, Insights into the mechanism of heterodimerization from the 1H-NMR solution structure of the c-Myc-Max heterodimeric leucine zipper, J. Mol. Biol. 281(1) :165-81); MyoD DNA-결합 도메인(Ma et al., 1994, Crystal structure of MyoDbHLH domain-DNA complex: perspectives on DNA recognition and implications for transcriptional activation, Cell 77 (3): 451-59); USF1 및 USF2 DNA-결합 도메인(Ferre-D'Amare etal., 1994, Structure and function of the b/HLH/Z domainofUSF, EMBO J. 13(1) : 180-9; Kurschner etal., 1997,USF2/FIP associates with the b-Zip transcription Factor, c-Maf, via itsbHLH domain and inhibits c-Maf DNA binding activity, Biochem. Biophys. Res. Commun. 231 (2): 333-39); Mit-f 전사인자 DNA-결합 도메인(Rehli etal., 1999, Cloning and characterization of the murine genes forbHLH-ZIP transcription Factors TFEC and TFEB reveal a common gene organization for all MiT subfamily members,Genomics56 (1) : 111- 20)등이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다.
Rop 단백질의 나선 부분과 고리 부분은 Rop 단백질 또는 이의 일부분이 본 발명의 단계적으로 어셈블리되는 방법에서 어셈블리 단위 작제에 이용할 수 있는 구조 원소라는 것을 암시하는 성질을 나타낸다. 한 구체예에서, Munson et al. (1996, What makes a protein a protein? Hydrophobic core designs that specify stability and structural properties, Protein Science 5: 1584-93)의 방법을 이용하여 Rop 단백질의 나선 부분에a및d잔기를 돌연변이시켜, 증가된 그리고 감소된 열 안정성을 모두 가지는 다양한 폴리펩티드를 만든다.
또 다른 구체예에서, Betz et al.(1997, De novo design of native proteins: Characterization of proteins intended to fold into antiparallel, Rop-like, four-helix bundles, Biochemistry 36: 2450-58)의 방법을 이용하여 Rop 단백질에 근거한 합성 55-잔기 단백질을 고안하고, 예상된 역방향으로 나란한 배열의 이량체를 만든다.
Rop 단백질형 4개 나선 번들에 근거한 단계적으로 어셈블리시키기 위한 어셈블리 단위를 합성 단백질 및 올리고펩티드로 작제할 수 있으나, 이에 국한시키지는 않는다(1997, De novo design of native proteins: Characterization of proteins intended to fold into antiparallel, Rop-like, four-helix bundles, Biochemistry 36: 2450-58). Betz 및 DeGrado(1996, Controlling topology and native-like behavior of de novo-designed peptides: design and characterization of antiparallel four-stranded coiled coils, Biochemistry 35:6955-62) 그리고 Betz et al.(1997, De novo design of native proteins: Characterization of proteins intended to fold into antiparallel, Rop-like, four-helix bundles, Biochemistry 36: 2450-58)에서 설명하는 것과 같이, 합성 4개-나선 번들은 다음의 일반형을 가지는 두 개 펩티드로 만들 수 있다:
Ncap-(AaZbZcLdYeZfYg)3-Turn-(XaZbZcLdYeZfYg)3-Ccap-CONH2
이때, a-g 아래첨자는 헵타드 위치를 나타내고,
X는 알라닌 또는 발린을 나타내고;
Y는 글루타민, 아르기닌, 티로신 또는 리신을 나타내고;
Z는 임의 아미노산을 나타내고,
Ncap 및 Ccap은 Richardson and Richardson(1988, Amino acid preferences for specific locations at the ends of alpha helices, Science 240: 1648-52)에서 정의한 것과 같은 알파-나선 끝 잔기를 나타내고;
turns은 3-5개 글리신을 나타낸다.
특정 구체예에서, PNA 서열을 한 개 어셈블리 단위의 아미노 단부에 첨가하고, 다른 어셈블리 단위의 카르복시 단부에 첨가한다. 이로써 분자의 다른 두 개 단부와 고리 부분이 한 개 이상의 기능 원소 삽입에 이용할 수 있도록 남겨진다. 이와 같은 4-나선 번들을 적절하게 폴딩하는 것은 CD 스펙트로스코피, 작제된 어셈블리 단위의 ELISA 분석, 이와 같은 어셈블리 단위에서 작제된 어셈블리 단위 및 나노구조의 전자 현미경 관찰에 의해 확인할 수 있다.
본 발명의 PNA 어셈블리 단위는 결합 또는 기능 원소로써 적어도 한 개 PNA를 포함한다. PNA 어셈블리 단위에서 추가 결합 원소는 어셈블리 단위에 결합 성질을 부여할 수 있는 임의 결합 원소가 되는데 예를 들면, 필린(pilin) 결합 원소, 헵텐(haptens), 항원, 펩티드, PNAs, DNAs, RNAs, 아프타머(aptamers), 폴리머 또는 다른 결합 원소와 특이적 비-공유 상호작용을 할 수 있는 다른 분자 및 이들의 복합물질이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다.
특정 구체예에서, 두 개 이상의 결합 원소를 가지는 어셈블리 단위를 이용하여 나노구조를 만든다. 추가적 결합 원소를 (i) 기능 원소 또는 기능 부분의 첨가 또는 삽입을 위한 부착 점; (ii) 고형 기질에 개시물질에 부착 점; (iii) 서브어셈블리를 위한 부착 점으로 이용할 수 있다.
본 발명에 이용된 PNA 어셈블리 단위에는 기능 원소가 결합되어 있을 수 있다. 이들은 상기에서 설명한 것과 같이 PNA 기능 원소 형태이거나 비-PNA 기능 원소 형태가 될 수 있다. 기능 원소들은 어셈블리 단위에 결합되어 기능 원소간에 또는 그중에 확인된 공간 관계를 제공할 수 있는 방식으로 1차-, 2차-, 3차원 나노구조로 결합될 수 있다. 기능 원소간 그리고 기능 원소중에 확인된 공간적인 상관관계로 인하여 서로 협력해서 개별적으로는 얻을 수 없는 활성 및 성질을 제공하고 또는 구조를 이루지 않은 혼합물 제공된다.
본 발명에서, 기능 원소에는 펩티드, 단백질, 단백질 도메인, 소분자, 무기 나노입자, 원자, 원자 덩어리, 자성 나노입자, 광학 나노입자 또는 전자 나노입자등이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다. 일반적으로는 부탁되는 어셈블리 단위의구조와는 무관한 특정 기능 원소와 연합된 특이적 활성 또는 성질은 매우 다양한 기능에서 선택될 수 있는데, 예를 들면 단백질에 의해 부여되는 생물학적 성질(가령, 전사, 해독, 결합, 변형 또는 촉매 성질)에서 선택될 수 있다. 다른 구체예에서, 화학적, 유기적, 물리적, 광학적, 구조적, 기계적, 컴퓨터, 자성 또는 센서 성질을 어셈블리 단위에 부여하는데 기능기를 이용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 기능 원소에는 금속 또는 산화 금속 나노입자(Argonide Corporation, Sanford, FL; NanoEnergy Corporation, Longmont, CO; Nanophase Technologies Corporation, Romeoville, IL ; Nanotechnologies, Austin, TX; TAL Materials,Inc., Ann Arbor, MI); 금 또는 금-피복된 나노입자(Nanoprobes,Inc., Yaphank, NY; Nanospectra LLC, Houston TX); 면역-접합체(Nanoprobes, Inc. , Yaphank, NY); 비-금속성 나노입자(Nanotechnologies, Austin, TX); 세라믹 나노섬유(Argonide Corporation, Sanford, FL); 플리렌(fullerenes) 또는 나노튜브(탄소 나노튜브)(Materials and Electrochemical Research Corpor- ation, Tucson, AZ; Nanolab, Brighton MA; Nanosys,Inc., Cambridge MA; Carbon Nano- technologies Incorporated, Houston, TX); 나노크리스탈(NanoGram Corporation, Fremont, CA; Quantum Dot Corporation, Hayward CA);실리콘 또는 실리케이트 나노크리스탈 또는 분말(MTI Corporation, Richmond, CA); 나노와어어(Nanosys, Inc. , Cambridge MA); 퀀텀 도트(Quantum Dot Corporation, Hayward CA; Nanosys, Inc. , Cambridge MA)등을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다.
기능 원소에는 임의 당분야에 공지된 감지가능한 표식이 포함될 수 있는데, 예를 들면,32P,35S,3H 및 이와 유사한 종과 같은 방사능 라벨; 발색단; 형광단: 화학발광 분자; 효소 표식등을 포함한다.
본 발명의 특정 구체예에서 기능 원소는 형광단이다. .
라벨로 선택할 수 있는 예시적인 형광단 분자를 하기 표 5에서 제공한다.
표 5
기능 원소로 이용할 수 있는 형광단 부분
4-아세타아미도-4'-이소티오시아나토스틸벤-2,2'디설폰산
아크리딘 및 유도체:
아크리딘
아크리딘 이소사아네이트
5-(2'-아미노에틸)아미노나프탈렌-1-설폰산(EDANS)
4-아미노-N-[3-비닐설포닐)페닐]나프탈리미드-3,5디설포네이트
(Lucifer Yellow VS)-(4-아닐노-1-나프틸)멜레이미드
안트라닐아미드
Brilliant Yellow
코우마린 및 유도체:
코우마린
7-아미노-4-메틸코우마린(AMC, Coumarin 120)
7-아미노-4-트리플로오르메틸코우마린(Coumarin 151)
Cy3
Cy5
시아노신
4',6-디아미니디노-2-페닐인돌(DAPI)
5',5"-디브로모피로갈롤-설폰네프탈렌(Bromopyrogallol Red)
7-디에틸아미노-3-(4'-이소사아나토페닐)-4-메틸코우마린
디에틸렌트리아민 펜타아세테이트
4,4'-디이소티오시아나토디하이드로-스틸벤-2,2'-디설폰산
4,4'-디이소티오사아나토스틸벤-2,2'-디설폰산
5-[디메틸아미노]나프탈렌-1-설포닐 클로라이드(DNS, 단실 클로라이드)
4-(4'-디메틸아미노페닐아조)벤조산(DABCYL)
4-디메틸아미노페닐아조페닐-4'-이소시아네이트(DABITC)
에오신 및 유도체:
에오신
에오신 이소티오시아네이트
에리트로신 및 유도체:
에리트로신 B
에리트로신 이소티오시아네이트
에티디움 플로오르레신 및 유도체:
5-카르복시플로오레신(FAM)
5-(4,6-디클로로트리아진-2-yl)아미노플로로레신(DTAF)
2'7'-디메톡시-4'5'-디클로오르-6-카르복시플로로레신(JOE)
플로오르레신
플로오르레신 이소티오시아네이트
QFITC(XRITC)
플로오레스카민
IR144
IR1446
Malachite Green 이소티오시아네이트
4-메틸움벨리페론
오르소 크레소프탈렌
니트로티로신
파라로사니린
Phenol Red
B-피코에리트린
o-프탈디알레히드
피렌 및 유도체
피렌
피렌 부티레이트
숙시니미딜 1-피렌 부티레이트
Reactive Red 4(CibacronRBrilliant Red 3B-A)
로다민 및 유도체
6-카르복시-X-로다민(ROX)
6-카르복시로다민(R6G)
리사민 로다민 B 설포닐 클로라이드
로다민(Rhod)
로다민 B
로다민 110
로다민 123
로다민 X 이소티오시아네이트
설포로다민 B
설포로다민 101
설포로다민 101의 설포닐 클로라이드 유도체(Texas Red)
N,N,N',N'-테트라메틸-6-카르복시로다민(TAMRA)
테트라메틸 로다민
테트라메틸 로다민 오시티오시아테이트(TRITC)
리보플라빈
로졸산
테르비움 킬레이트 유도체
또다른 실시예에서, 기능 원소는 루미놀(Amersham Biosciences), BOLD APB(Intergen), Lumigen APS(Lumigen) 등과 같은 화학발광 기질이다.
또다른 실시예에서, 기능 원소는 효소이다. 효소는 일부 실시예에서, 효소 알칼린 포스파타제, 양고추냉이 과산화효소, 베타-갈랄토시다제등과 같이 특정 화학반응이 수행될 때 검출가능한 신호를 만들 수 있다.
또다른 실시예에서, 기능 원소는 햅텐(hapten)이나 항원(가령, ras)이다. 또다른 실시예에서, 라벨된 항-디곡시제닌이 결합할 수 있는 디곡시제닌(digoxygenin)이나, 라벨된 아비진 분자 또는 스트렙타비딘이 결합할 수 있는 분자가 기능 원소가 된다.
또다른 실시예에서, 기능 원소는 땅콩 렉틴이나 콩 아글루티닌같은 렉틴(lectin)이다. 또다른 실시예에서, 기능 원소는 슈도모나스 익소탁신(Pseudomonasexotoxin)(Chaudhary etal., 1989, A recombinant immunotoxin consisting of two antibody variable domains fused to Pseudomonasexotoxin, Nature 339 (6223): 394-97). 같은 독소이다.
펩티드, 단백질, 단백질 도메인들은 융합 단백질을 생성하기 위해 당 분야에 잘 알려진 분자 생물학의 기구들을 이용하여 단백질형 어셈블리 단위에 첨가될 수 있는데 이때, 융합단백질에는 기능 원소가 단백질의 N-말단, 단백질의 C-말단에 도입되거나 단백질의 폴딩을 방해하지 않도록 하는 방식으로 단백질 내의 고리에 도입되어 있다. 비-펩티드 기능 원소는 기능 원소에 특이성을 나타내는 펩티드 또는 단백질 부분에 결합되거나 어셈블리 단위의 단백질 부분에 도입되어 어셈블리 단위에 첨가될 수 있다.
특정 실시예에서, 한 개 이상의 기능 원소가 어셈블리 단위에 추가된다. 이 어셈블리 단위는 필린 단백질(pilin protein)을 포함하는 데, 그 위치는 1) 상기 단위의 표면으로 확인되며, 2) 상기 단위와 그 외 다른 필린 함유 어셈블리 단위의 상호작용에 대해 중요하지 않다고 확인되며, 3) 단위 자체의 안정성을 위해 중요하지 않다고 확인된다. 대형 고리(loop) 삽입이 용인되고 여러 재조합 단백질이 안정한 활성 단백질 구조로 성공적으로 폴딩할 수 있도록 발현된다는 것을 보여주었다. 일부 예에서, 이러한 재조합 단백질은 추가적인 유전적 조작없이 설계되고 고안되고 있으며, 그 외 다른 접근법은 서열의 최적 변경을 확인하기 위해 임의화 및 선택 단계를 통합하고 있다(Regan, 1999, Protein redesign, Curr. Opin..Struct. Biol. 9: 494-99). 예를 들어, 재공정이 가능한 한 개의 필린 영역은 서열 gly107-ala108-gly109를 포함하는 papA 상의 표면 고리다. 이 고리는 이형 펩티드가 삽입될 수 있는 위치로 상술한 모든 기준들을 만족시킨다.
또다른 실시예에서, 전체 항체 가변 도메인(가령, 단일-체인 가변 도메인)이 어셈블리 단위에 결합되어(가령, 결합 원소나 구조 원소에 결합되어), 기능 원소에 대한 친화성 표적으로 기능할 수 있다. 본 실시예에서, 전체 항체 가변 도메인이 결합 원소나 구조 원소의 표면 고리에 삽입되는데, 가변 도메인 서열의 각 변에 유연한 부분(가령, 폴리글리신 펩티이드 서열)이 추가되는 것이 바람직하다. 이 폴리글리신 링커는 재조합 융합 단백질의 합성 후 고유 단백질의 폴딩(접힙을 촉진시키는 유연한 스페이서로 기능할 것이다. 항체 도메인은 기능 원소에 대한 결합 특이성에 따라 선택되며, 이는 단백질이나 펩티드, 또는 무기질 물질일 수 있다.
발명의 또다른 실시예에서, 기능 원소는 바람직한 광학적 성질을 가진 퀀텀 도트(반도체 나노결정, 가령, 미국, 캘리포니아 Hayward 소재 Quantum Dot Corporation 사 제품인 QDOT)일 수 있다. 퀀텀 도트는 특정 클래스의 퀀텀 도트에 대한 특이성을 가진 펩티이드를 통해 나노구조에 결합될 수 있다. 당 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려진 바와 같이, 특정 종류의 퀀텀 도트에 대해 친화성 요건을 가진 이러한 펩티드 식별 방법은 당 분야에 잘 알려진 방법을 이용한다. 예를 들어, 이러한 펩티드는 친화성 정제 방법을 이용하여 파아지(phage)-디스플레이 펩티드의 대형 라이브러리로부터 선택된다. 적절한 정제 방법으로는 바이오패닝(Whaley et al., 2000, Selection of peptides with semiconductor binding specificity for directed nanocrystal assembly, Nature 405 (6787): 665-68) 과 친화성 컬럼 클로마토그래피가 있다. 각각의 경우에, 타겟 퀀텀 도트들의 이동성이 제한되고, 재조합 파아지디스플레이 라이브러리가 고착된 퀀텀 도트에 대하여 배양한다. 바이오패닝을 여러 번 실행하고, 퀀텀 도트에 대한 파아지디스플레이 진화성을 표준 방법에 의해 확인하고, 펩티드의 특이성은 표준 ELISA 방법을 이용하여 테스트한다.
일반적으로, 친화성 정제는 여러 친화성 정제 단계를 이용한 반복 과정이다. 친화성 정제는 특정 금속 및 반도체에 대한 친화성을 가진 펩티드를 식별하는 데사용될 수 있다(Belcher, 2001, Evolving Biomolecular Control of Semiconductor and Magnetic Nanostructure, presentation at Nanoscience: UnderlyingPhysical Concepts and Properties, National Academy of Sciences, Washington, D. C. , May 18-20,2001 ; Belcher etal., 2001, Abstracts of Papers, 222nd ACS National Meeting, Chicago, IL, United States, August 26-30,2001, American Chemical Society, Washington, D. C.).
대안으로 파아지-디스플레이 단일 체인 가변 도메인의 라이브러리들을 이용하여, 동일 종류의 선택 과정을 실행하는 것이다. 따라서 일부 실시예에서는, 기능 원소는 결합 원소들을 이용하여 나노구조에 결합되고, 이에 의해, 바람직한 성질을 가진 비-단백질형 나노입자가 나노구조에 부착된다. 이러한 결합 원소는 친화력에 의해 선택된 펩티드로부터, 또는 항체 가변 도메인의 상보성 결정 영역으로부터 도출된다.
나노결정(단일 나노입자)들과 나노입자들의 어셈블리들의 전자적 성질을 비교하는 데 통상적으로 사용되는 전자적 및 광자적 원소들에 대한 통상적인 테스트들은 여기서 소개된 방법과 조성을 이용하여 제작되는 나노구조들의 분석을 위해 사용된다(Murray etal., 2000, Synthesis and characterization of monodisperse nanocrystals and close-packed nanocrystal assemblies, Ann. Rev. Material Science 30:545-610).
일부 실시예에서, 고유하면서도 조정가능한 반도체 나노결정들의 성질들에 의해, 이 물질들을 광전도 나노디바이스 및 발광 다이오드를 포함하는 나노디바이스에 사용하는 것이 바람직하다. 개별 나노구조의 전기적 성질은 측정이 어려워, 이 나노구조들의 성질들의 척도로서 광전도도가 이용된다. 광전도도(photoconductivity)는 반도체 및 유기질 고체의 성질 분석에 사용되는 잘 알려진 현상이다. 광전도도는 절연 유기질 고체에서 분자와 약하게 상호 작용하는 분자들 사이에서 전자를 이동시키는 데 사용되고 있다.
광전류 스펙트럼 응답들이 나노구조의 나노결정들의 흡수 스펙트럼을 매핑하는 데 사용될 수 있고, 개별 나노결정들의 광전류 스펙트럼 응답들에 대해 비교될 수 있다(see, e. g., Murray etal., 2000, Synthesis and characterization of monodisperse nanocrystals and close-packed nanocrystal assemblies, Ann. Rev. Material Science 30: 545-610). 추가적으로, 광학적 및 광형광 스펙트럼이 나노구조의 광학적 성질을 연구하는 데 사용될 수 있다(Murray et al., 2000, Synthesis and characterization of monodisperse nanocrystals and close-packed nanocrystal assemblies, Ann. Rev. Material Science 30: 545-610).
나노결정들 어레이의 형성에 대하여 가해진 제어가 클수록, 생성될 광학적, 전기적, 자기적 현상의 어레이의 폭이 넓어진다. 나노구조 어셈블리에 나노입자들이 3차원의 정확도로 통합되면, 여기서 형성된 고체들의 성질을 3차원적으로 제어하는 것이 가능하며, 따라서, 나노디바이스의 설계에 유용한 이방성 성질들의 호스트를 불러일으킬 수 있다. 이 어셈블리들의 성질을 특성화하는 일상적인 테스트 및 방법들은 당 분야에 잘 알려져 있다(see, e.g., Murray etal., 2000, Synthesis and characterization of monodisperse nanocrystals and close-packednanocrystal assemblies, Ann. Rev. Material Sci. 30: 545-610).
예를 들어, 단백질과 퀀텀 도트의 결합으로 만들어진 바이오센서가 상용화되어 있다(Alivisatos et al., 1996, Organization of'nanocrystal molecules'using DNA, Nature 382: 609-11; Weiss etal., U.S. Patent No. 6,207, 392 entitled"Semiconductor nanocrystal probes for biological applications and process formaking and using such probes, "issued March 27, 2001). 퀀텀 도트를 고도로 발전된 생물학적 분자(가령, 표준 스트랜디드 DNA나 항체 분자)와 결합시키는 능력은 분자의 타겟에 대한 스펙트럼 핑거프린트를 제공한다. 여러 다른 크기의 퀀텀 도트들을 이용함으로서(이들은 각각 다른 스펙트럼 성질들을 가지게 됨), 서로 다른 세부사항을 가진 분자에 결합된 각각이 동시에 여러 가지 성분들을 감지할 수 있다.
금속이나 반도체의 나노결정들과 퀀텀 도트같은 무기질 구조는 조합된 나노구조의 브랜치-말단들로 나노구조의 단계적-어셈블리에 사용될 수 있다. 이러한 무기질 구조가 추가될 경우, 추가적인 그룹들이 부착될 수 없다. 왜냐하면, 이들은 나노구조에 인공적으로 처리된 어떤 결합 부위 세트들에 대한 중간물질 화학구조를 가지기 때문이다. 이는 단계적 어셈블리에 의해 제작되는 나노구조를 생성하기 위해 어셈블리 단위들이 추가되는 시퀀스에 영향을 미친다. 예를 들어, 특정 나노결정이 나노구조에 추가될 경우, 일반적으로, 상기 나노결정 종류를 인식하고 결합하는 결합 원소들로 추가 어셈블리 단위들을 추가하는 것이 바람직하지 않다. 왜냐하면, 나노결정에 대해 이러한 어셈블리 단위들의 위치 설정을 제어하는 것은 일반적으로 가능하지 않기 때문이다. 따라서, 나노결정을 마지막으로 추가해야 하며, 또는, 특정 종류의 나노결정을 결합시키는 모든 어셈블리 단위들이 추가된 후에 나노결정들을 추가하는 것이 바람직하다. 적절한 실시예에서, 나노결정들은 매트릭스에 결합은 되어 있으나 충분히 이격되어 있는 나노구조에 추가되어, 각각의 나노결정들이 단일 나노구조에 결합될 수 있고, 따라서, 나노구조들의 다중 교차-결합을 방지할 수 있다.
한 실시예에서, 본 발명의 단계적 어셈블리 방법에 따라 제작되는 견고한 나노구조는 나노구조 레버 아암의 단부에 한 원소로 부착되는 한 개의 자성 나노입자를 포함한다. 이는 로컬 지가장의 매우 민감한 센서로 작용한다. 자기장의 존재는 자기적 나노입자의 위치를 변화시키는 기능을 하여, 나노구조 레버 아암을 부착된 고체 기질에 대해 구부러지게 한다. 레버 아암의 위치는, 일부 실시예에서, 나노구조 레버 아암을 따르는 다른 위치들에 대해 원소로 부착되는 광학적 나노입자들의 위치 변화를 통해 감지될 수 있다. 이 레버 아암의 움직임 정도는 자기장을 측정함으로서 표현될 수 있다.
다른 실시예에서, 본 발명의 단계적 어셈블리 방법에 따라 제작된 나노구조들은 전용화된 원소들 없이도 바람직한 성질들을 가진다. 이러한 실시예에서, 단계적 어셈블리 과정은 2차원 또는 3차원적 나노구조를 제공하며, 이때, 나노미터 스케일의 정밀하고 미세하게 형성된 구멍들(pores)을 가진다. 이 구멍들은 미세유체 시스템내 입자들을 필터링하는 데 사용될 수 있다. 본 실시예의 추가 특징에서, 나노구조는 나노구조의 분리 성질을 향상시키는 원소들도 포함하고, 이렇게 잘 형성된 구멍들도 포함하도록 형성되어, 분자의 친수성이나 소수성 성질, 또는 전하들에 대해, 그리고 크기를 바탕으로 한 이격을 가능하게 한다. 이러한 나노구조들은 매우 균일한 패킹 물질과 상기 물질에 기초하여 HPLC 분리에 사용될 수 있다. 이러한 원소들의 예는 요망 크로마토그래피 분리용으로 사용되는 pH에서 양이나 음으로 대전된 한 개 이상의 측쇄들을 포함하는 펩티드 서열을, 그리고 소수성이나 친지방성 측쇄를 가진 한 개 이상의 아미노산을 가진 펩티드 서열을 포함한다.
정션(Junctions)들은 실리콘 기반 전자 칩 등의 마이크로전자 회로에서 "스위치 포인트"로 기능할 수 있는 구조물이다. 일부 실시예에서, 다가 항체(multivalent antibody)나 결합 유도체, 또는 그 결합 단편들이 나노구조로 사용되어, 본 발명의 방법을 이용하여 나노구조에 삽입된다. 이 나노구조 정션들을 포함하는 생물전자학적 및 생물연산학적 디바이스의 예로는 퀀텀 셀룰러 오토마타(QCA)가 있다.
나노구조의 단계적 어셈블리
PNA 어셈블리 단위들은 단계적 어셈블리에 의해 나노구조를 형성하도록 조합될 수 있다. 단계적 어셈블리에 의하면, 유기질 및 무기질 부분들이 기설계된 3차원 구조에 정확하고 정밀하게 위치하는, 복합적이고 비-주기적인 다-차원 나노구조들의 대량 병렬 합성이 가능하다. 단계적 어셈블리에서, 일련의 어셈블리 단위들이 개시 단위이나 나노구조 중간매개물에 예정된 순서로 추가된다. 다량의 동일한 개시 물질들이 사용되기 때문에, 그리고 서브단위들이 모든 개시물/중간매개물에 동시에 추가되기 때문에, 단계적 어셈블리는 여러 개의 동일한 나노구조를 대량 병렬방식으로 제작한다. 적절한 실시예에서, 개시물 단위들은 고체 기질에 결합된다. 추가 어셈블리 단위들은 고상 폴리머 합성에 친숙한 과정으로 순차적으로 추가된다. 조합될 때 개시물 단위에 형성되는 조합 어셈블리 단위를 포함하는 나노구조의 중간 스테이지는 나노구조 중간물 또는 단순히 나노구조로 설명된다. 각각의 어셈블리 단위를 조합 진행 중인 나노구조 중간물질에 추가하는 것은 앞서 추가한 어셈블리 단위에 의해 제시되는 결합형 원소의 성질에 따라 좌우되며, 순차적으로 추가되는 어셈블리 단위에 대하여서는 관계가 없다. 따라서, 어셈블리 단위는 조합진행중인 나노구조 중간물에 노출된 결합형 원소들에만 결합될 수 있다. 즉, 추가된 어셈블리 단위는 자체적으로 상호작용하거나 중합되지 않는다.
단일 어셈블리 단위의 결합형 원소들이 비-상보적이고 서로 상호작용하지 않기 때문에, 결합되지 않은 어셈블리 단위들이 이량체나 폴리머를 형성하지 않는다. 추가될 어셈블리 단위들은 중간매개물과의 반응을 완료시키기 위해, 개시물 단위나 나노구조 중간물질에 대해 과량으로 제공되는 것이 바람직하다. 단계적 어셈블리 과정 중 결합되지 않은 어셈블리 단위들을 제거하는 것은 고상 기질에 결합된 개시물을 이용하여 스테이지형 어셈블리를 실행함으로서 촉진된다. 그래서, 결합되지 않은 어셈블리 단위들이 어셈블리 과정의 각 사이클에서 세정되어 없어질 수 있다.
이 기법은 비교적 적은 비-교차 반응, 상보적 결합 쌍들을 이용하여 복합 나노구조의 조합을 제공한다. 몇가지 결합 쌍들만이 필요하다. 왜냐하면, 제한된 수의 결합 원소들만이 어셈블리 과정 중 한 단계에서 어셈블리 중간매개물의 표면에 노출될 것이기 때문이다. 상보 결합 원소들을 가진 어셈블리 단위들이 추가되어,나노구조 중간물에 대해 배양한다. 그래서, 추가된 어셈블리 단위가 어셈블리 사이클 중 나노구조 중간물질에 부착될 수 있다. 과량의 어셈블리 단위들을 씻어내고, 어셈블리 과정의 차후 단계 중 다른 어셈블리 단위들과의 불필요한 상호작용을 방지할 수 있다. 나노구조에서의 각각의 위치는 단계적 어셈블리 과정을 통해 독자적으로 결정될 수 있고, 개별적인 원소들이 어떤 바람직한 위치에 추가될 수 있다. 본 발명에 따른 단계적 어셈블리 방법은 복합 나노구조들의 대량 병렬 제작을 가능하게 하며, 여러 다른 복합 나노구조들이 수직구조 방식으로 선순위 구조로 추가적으로 자체 조합될 수 있다.
도 5는 발명의 단계적 어셈블리 방법을 한 차원으로 표현하는 실시예를 도시한다. 단계 1에서, 개시물 단위가 고체 기질에 고착된다. 단계 2에서, 어셈블리 단위가 개시물에 추가되고, 결과적으로 두 단위로 구성되는 나노구조 중간물이 형성된다. 단일 어셈블리 단위만이 본 단계에서 추가된다. 왜냐하면, 두 번째 어셈블리 단위는 자체적으로 상호작용(즉, 중합화)될 수 없기 때문이다.
개시물 단위 또는 캐핑 단위(capping unit)을 포함한 단계적 어셈블리 중 차후 추가된 어셈블리 단위는, 추가된 기능 원소를 지닐 수 있고, 또는 앞서 추가된 단위로부터 길이가 다른 구조 단위를 포함할 수 있다. 예를 들어 도 5의 단계 3에서, 한 개의 기능 원소를 포함하는 제 3 어셈블리 단위가 추가된다. 단계 4와 5에서, 추가적인 어셈블리 단위들이 추가되며, 이때, 각각의 단위는 원하는 기능 그룹을 가진다. 따라서, 도 5에 도시되는 단계적 어셈블리의 실시예에서, 제 3, 4, 5 어셈블리 단위 각각은 고유한 기능 원소(도면의 어셈블리 단위 상부로부터 튀어나온 기하학적 형태에 의해 표시됨)를 지닌다.
도 5에 도시되는 단계적 어셈블리의 실시예는 단 두 개의 비-교차 반응성, 상보 결합 쌍들을 필요로 한다. 이 구조물의 자체-조합은 단계 5 말미에서 나타나는 바와 같이, 네 개의 비-교차 작용 상보적 결합형 쌍들을 필요로 한다. 이 구조물의 크기가 증가함에 따라, 요구되는 결합 쌍들의 이러한 숫자 측면에서의 비교적 온건함이 점차 커지게 된다. 예를 들어, 도 5에 도시되는 다섯 개의 단계들을 확장함으로서 조합되는 N개 단위들의 선형 구조의 경우, 단계적 어셈블리는 여전히 두 개에 불과한 비-교차 반응 상보적 결합형 쌍들만을 필요로 한다. 반면에, 자체-어셈블리는 N-1개를 필요로 한다.
제작되는 나노구조의 수는 매트릭스에 결합된 개시물의 수에 의해 결정되며, 각각의 1차원 나노구조의 길이는 실행된 어셈블리 주기 수의 함수이다. 한 개 이상의 기능 원소들을 가진 어셈블리 단위가 사용될 경우, 어셈블리의 순서는 각각의 기능 원소들이 다른 기능 원소들에 대해 가지는 상대적 공간 관계를 규정할 것이다.
본 발명의 단계적 어셈블리 방법의 각각의 단계 이후, 과량의 결합되지 않은 어셈블리 단위들이 제거 단계, 가령, 세정 단계에 의해 부착된 나노구조 중간물질로부터 제거된다. 기판에 결합된 나노구조 중간물질은 적절한 용매(가령, 수용액이나 완충액)로 세정될 수 있다. 용매는 상보적 결합 원소의 구체적인 상호작용을 붕괴시키지 않으면서 비-특정 상호작용에 의해 유지되는 서브단위들을 제거할 수 있다. 적절한 용매는 pH, 염 농도, 화학 조성 등에 따라 변할 수 있다.
나노구조 중간물질을 세정하는 데 사용되는 완충액는Current Protocols in Immunology에 기술된 바와 같이 ELISA 프로토콜로 구현되는 세정 단계에 사용되는 완충액일 수 있다(Chapter 2, Antibody Detection and Preparation, Section 2.1"Enzyme-Linked Immunosorbent Assays, "John Wiley & Sons, 2001, Editors John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober, Series Editor: Richard Coico).
일부 실시예에서, 조합된 나노구조는 "캐핑 단위(capping unit)"을 추가함으로서 "캐핑(capped)"된다. 이는 단일 결합 원소를 지니는 어셈블리 단위이다. 더욱이, 개시물 단위가 갈라질 수 있는 결합을 통해 고체 기질에 부착된 경우, 나노구조는 고체 기질로부터 제거되어 분리될 수 있다. 그러나, 일부 실시예에서는 완성된 나노디바이스가 고체 기질에 부착된 상태로 기능적일 것이며, 제거될 필요는 없을 것이다.
어셈블리 단위들을 추가하는 상술한 단계들은 최종 나노구조가 조합될 때까지 반복적인 방식으로 반복될 수 있다. 이후, 개시물 단위 내의 지정된 방출 부분(가령, 프로테아제 부위)에서, 매트릭스로부터 제 1 어셈블리 단위를 고착시킨 결합를 파괴함으로서, 또는, 방출을 위한 지정된 공정(가령, pH 저하)을 이용함으로서, 완성형 나노구조가 방출될 수 있다. 도 2 및 3에 도시되는 단계적 어셈블리의 과정은 단계적 어셈블리용으로 제시된 가장 단순한 실시예 중 하나이다. 또다른 실시예에서, 추가적인 결합 원소들을 구비한 어셈블리 단위들이 한 개 이상의 복합 어셈블리를 생성하는 데 사용될 수 있다. 어셈블리 단위들은 개별적으로 추가될 수 있고, 또는, 서브어셈블리로 추가될 수도 있다(도 6). 그 결과, 원하는 설계 매개변수들을 충족시키도록 서로 공간적으로 분포된 기능 원소들을 가진 최종 나노구조가 완성된다. 본 명세서에 기재된 성분 및 방법들은 이 복합 나노구조를, 또는, 한 개 또는 다수의 나노구조의 스테이지형 어셈블리에 의해 형성되는 복합 나노디바이스를, 더 큰 구조물로 조합하기 위한 어셈블리 수단을 제공한다. 다차원 나노구조의 제작은 추가적 결합형 원소들을 지닌 정확하게 분포된 어셈블리 단위들을 개별적인 1차원 나노구조에 통합함으로서(일례에 불과함) 달성될 수 있다. 이때, 상기 추가적인 결합 원소들은 개별 나노구조들을 함께 부착하기 위한 적절한 교차 결합 물질에 의해 인식되어 결합된다. 일부 적절한 실시예에서, 이러한 교차 결합은 항체일 수도 있고, 결합 파생물일 수도 있으며, 그 결합 조각일 수도 있다.
발명의 단계적 어셈블리 방법의 일부 실시예에서, 개시물 단위는 고체 기질에 고착된다. 이러한 고착은 임의적이지 않다. 단지, 매트릭스나 기질에 개시물 단위의 특정 원소를 결합시키는 것을 포함한다. 단계적 어셈블리 과정은 다음 어셈블리 단위의 부착을 위해 개시물 단위에 방해없는 결합 원소를 필요로 하는 벡터형 공정이다. 개시물 단위를 기질에 임의적으로 결합시키는 것은, 일부 예에서, 다음 어셈블리 단위의 부착을 위해 필요한 결합형 원소의 방해를 야기할 것이다. 따라서, 나노구조가 조합될 개시물 단위의 수를 줄일 수 있다.
본 발명의 단계적 어셈블리 방법의 다른 실시예들에서는, 개시물 단위가 고상 기판에 고착되지 않는다. 이 경우에, 고착되지 않은 개시물 단위에 구성된 나노구조에 대해 제거 단계(가령, 세정 단계)가 실행될 수 있다. 1) 개시물 단위에 자기적 나노입자를 부착시켜서, 자기장을 가함으로서 비-결합 어셈블리 단위으로부터 나노구조 중간물을 분리시킬 수 있다. 2) 원심분리, 침전, 또는 여과에 의해 비결합어셈블리 단위으로부터 대형 나노구조 중간물을 분리시킬 수 있다. 또는 3) 나노구조 중간물이나 조합된 나노구조가 파괴적 처리(가령, 프로테아제 처리나 화학적 저하)에 내성이 클 경우, 비결합 조합 단위들을 선택적으로 파괴시킨다.
단백질들은 우수한 결합 성질을 가지고 있고, 단백질의 분자간 상호작용을 조작하는 기술도 당 분야에 잘 알려져 있다(Hayashi etal., 1995, A single expression system for the display, purification and conjugation of single-chain antibodies, Gene 160(1) : 129-30; Hayden etal., 1997, Antibody engineering, Curr. Opin.. Immunol. 9 (2): 201-12; Jung etal., 1999, Selection for improved protein stability by phage display, J. Mol. Biol.294(1) : 163-80, Viti etal., 2000, Design and use of phage display libraries for the selection of antibodies and enzymes, Methods Enzymol. 326: 480- 505; Winter etal., 1994, Making antibodies by phage display technology, Annu. Rev. Immunol. 12:433-55). 그러나 나노구조의 스테이지형 어셈블리가 특정 인지 성질을 가진 생물학적 분자, 가령, 단백질이나 핵산처럼 생물학적 분자로 주로 구성된 성분들에 굳이 제한될 필요는 없다. 스테이지형 어셈블리에 의해 제작되는 나노구조들의 여러 일부 실시예에서는 무기질 원자나 분자들의 광학적, 자기적, 또는 전기적 성질이 요구될 것이다.
단백질로 구성되지 않은 성분들이 활용되는 본 발명에 따른 실시예도 여러가지 존재할 것이다. 다른 실시예에서는, 유기질 분자 및 무기질 분자들로 구성된 나노구조를 형성하기 위해 단백질이나 핵산의 분자 상호작용 성질을 이용하는 것이 가능할 수 있다.
일부 실시예에서, 발명의 단계적 어셈블리 방법들을 이용하여 나노구조로 조합된 성분들에 무기질 나노입자들이 추가된다. 이는 무기질 입자들에 대한 결합을 위해 특별히 선택된 결합형 원소들을 이용하여 이행될 수 있다. 예를 들어, Whaley 등은 반도체 결합 표면에 특별하게 결합하는 펩티드들을 식별해낸 바 있다(Whaley et al., 2000, Selection of peptides with semiconductor binding specificity for directed nanocrystal assembly, Nature 405: 665-68). 한 실시예에서, 이 펩티드들은 표준 클로닝 기술을 이용하여 여기서 소개된 단백질 성분들에 삽입된다. 단백질 구조물의 단계적 어셈블리는 견고한 3차원 배열로 이 결합 사이트들을 분포시키는 분포 수단을 제공한다.
특정 종류의 무기질 나노입자에 대한 결합 사이트들이 모두 제자리에 위치할 경우, 단백질형 어셈블리 단위들을 추가하는 데 사용된 것과 유사한 단계적 어셈블리의 사이클을 이용하여 무기질 나노입자들이 추가될 수 있다. 이를 달성하기 위해, 나노구조 중간물을 배양하는 용액 조건들을 조정하는 것이 일부 실시예에서 필요할 수 있다. 이에 의해, 무기질 나노입자의 용해도(solubility)를 제공할 수 있다. 무기질 입자가 나노구조 중간물에 추가되면, 무기질 나노입자의 어떤 오염에 내재된 마이크로헤테로성질 때문에, 무기질 입자에 추가적인 단위들을 제어 방식으로 추가하는 것이 불가능할 수 있다. 이 헤테로 성질은 추가적인 상호작용의 형태및 화학성질을 제거 불가능하게 만든다.
도 7은 본 발명의 단계적 어셈블리 방법에 따라 나노구조에 단백질 단위 및 무기질 원소들을 추가하는 도면이다. 단계 1에서, 개시물 단위가 고체 기질에 결합된다. 단계 2에서, 어셈블리 단위가 개시물 단위에 특별히 결합된다. 단계 3에서, 추가적인 어셈블리 단위가 결합 진행 나노구조에 결합된다. 이 어셈블리 단위는 특정 무기질 원소에 대해 특정한 가공 결합 사이트를 포함한다. 단계 4에서, 무기질 원소(양방향 빗금 타원으로 도면에 표시)가 나노구조에 추가되고, 가공 결합 사이트에 의해 결합된다. 단계 5는 제 2 종류의 무기질 원소에 특정하도록 가공된 결합 사이트로 또 다른 어셈블리 단위를 추가하고, 상기 제 2 무기질 원소(빗금 다이아몬드로 도면에 표시)가 단계 6에서 추가된다.
어셈블리 단위들이 추가된 순서는 어셈블리 공정에 사용되는 교차-반응 결합 원소 쌍들의 수를 최소화할 필요성과, 프로덕트 나노구조의 요망 구조 및 활성에 따라 결정된다. 그러므로, 어셈블리의 순서를 결정하는 것은 단계적 어셈블리에 의해 제작될 나노구조의 설계의 일체형 부분이다. 결합 원소들은 요망 나노구조의 단계적 어셈블리를 가능하도록 설계에 의해 선택된다. 결합 원소의 선택이 나노구조에 통합되기 위한 원소에 독립적이기 때문에, 요망 공간 방위로 원소들의 위치설정을 제공하도록, 필요한 원소 및 결합 원소들로 어셈블리 단위를 제작할 수 있도록 결합 원소들이 배치되고 짝지워져야 한다.
예를 들어, 세 개의 결합 쌍을 구성하는 6개의 결합 원소들을 이용하여 설계된, 두 개의 결합 원소들을 포함하는 어셈블리 단위들은 상호작용하지 않는 18쌍의결합 원소들 중 일부를 포함할 수 있다. 결합 원소들의 쌍은 21개까지 가능하지만, 21개 중 3개의 쌍은 서로 상호작용하고(가령, A-A'), 어셈블리 단위에서의 이들의 이용은 서로 동일한 어셈블리 단위들의 자체상관을 이끈다. 아래 설명되는 예에서, 결합 원소들은 A, A', B, B', C, C'로 표시되고, 이때, A와 A', B와 B', C와 C'은 결합 원소들의 상보 쌍(결합 쌍)들이다. 즉, 이들은 서로 특정하게 결합하지만, 나머지 네 결합 원소들과는 결합하지 않는다. 6개의 대표 어셈블리 단위들은 각각 두 개의 결합 원소들을 포함하며, 각각의 결합 원소는 동일하지 않으면서 보완형이 아닌 결합 원소들을 포함한다. 이들이 아래에 도시된다. 본 설명에서, 각각의 어셈블리 단위는 고유 원소를 추가로 포함하며(6개 한 세트 중 하나), F1에서 F6까지로 표현된다. 6개의 어셈블리 단위들이 아래와 같이 표시될 수 있다.
A-F1-B
B'-F2-A'
B'-F3-C'
C-F4-B
B'-F5-A'
A-F6-C'
여기서 공개된 방법들에 따른 스테이지형 어셈블리는 다음의 선형 나노구조를 조합하는 데 사용될 수 있으며, 각각의 어셈블리 단위의 순서 및 상대적 벡터방향은 원소들의 순서에 독립적이다. 심볼 ●는 개시물이 부착된 고체 기질을 표시하며, 더블콜론(::)은 어셈블리 단위들의 특정 상호작용을 표시한다.
본 도해로부터 명백히 드러나는 바와 같이, 다수의 고유 어셈블리 단위들이 소수의 상보적 결합 원소들을 이용하여 만들어질 수 있다. 더욱이, 다수의 고유 복합 나노구조들의 제작에 소수의 상보 결합 원소들만이 필요하다. 왜냐하면, 각각의 단계적 어셈블리 사이클에 한 종류의 어셈블리 단위만이 추가되며, 따라서, 결합 원소들이 완성 나노구조 내 한 어셈블리 단위의 위치를 모호하게 하지 않으면서 반복적으로 사용될 수 있다.
앞서 도시되는 경우 각각에서, 두 개나 세 개의 결합 쌍들만이 사용되었다. 이 구조물의 자체-어셈블리는 7개의 비-교차반응 결합 쌍들의 이용을 필요로 한다. 이 선형 구조물의 수가 N개의 단위에 해당하고 단계적 어셈블리를 이용하여 선형 구조물이 조합될 경우, 이들은 두 개나 세 개의 결합 쌍들만을 필요로 할 것이다. 그러나, 자체-어셈블리의 경우엔, (N-1)개의 비-교차반응, 보완형 결합 쌍들을 필요로 할 것이다.
발명의 또다른 태양에 따르면, 상술한 한 어셈블리 단위의 두 결합 원소의 위치를 상호 교환함으로서, 부착된 원소의 공간 위치 및 방향이 나노구조의 전체 구조 내에서 변경될 것이다. 발명의 본 태양은 여기서 공개되는 바와 같이 나노구조의 스테이지형 어셈블리에 의해 제공되는 설계 유연성의 또다른 태양을 설명한다.
각각의 어셈블리 단위를 개시물이나 나노구조 중간물질에 부착하는 것은 개시물이나 나노구조 중간물질이 지닌 한 개 이상의 비-결합 상보 결합 원소들과 어셈블리 단위의 한 개의 결합 원소들 간의 특정 결합 쌍 상호작용에 의해 중재된다. 여러 실시예에서, 단 한 개의 비결합형 상보 결합 원소만이 개시물이나 나노구조 중간물에 존재할 것이다. 그러나 또다른 실시예에서는 동일한 결합 원소들을 포함하는 어셈블리 중간물 상의 여러 사이트에 여러 동일한 어셈블리 단위들을 추가하는 것이 바람직할 수 있다. 본 실시예의 경우에, 단계적 어셈블리는 어셈블리 단위들의 병렬 추가에 의해 진행되지만, 단일 단위만이 중간물의 한 사이트에 부착될 것이며, 연루된 모든 사이트에서의 어셈블리는 지정된 벡터 방식으로 발생할 것이다.
나노구조의 구조적 통합성은 단계적 어셈블리 과정 전반에 걸쳐 매우 중요하며, 이 어셈블리 단위들은 비-공유적 상호작용에 의해 연결되는 것이 바람직하다. 구체적인 비-공유적 상호작용은 예를 들자면, 어셈블리 단위와 나노구조 중간물간에 발생하는 상호작용이다. 구체적인 상호작용은 전체 단계적 어셈블리 공정에서 상호작용을 안정되게 유지하는 데 충분하도록 어셈블리 단위와 나노구조 중간물간의 복합성에 대한 안정성을 제공하기 위해 적절한 친화성을 나타내야만 한다. 구체적인 비-공유적 상호작용은 적절한 세부사항을 보여야 한다. 그래서, 추가된 어셈블리 단위가 이와 상호 작용하도록 설계된 결합 원소들과만 안정된 상호작용을 형성할 수 있어야 한다. 단계적 어셈블리 과정 중 원소들 사이에서 발생하는 상호작용은 "비가역적"인 것이 바람직하다. 이 요건에 부합하는 결합 상수는 명백하게 규정할 수 없다. 왜냐하면 "비가역적"이라는 것은 "운동학적"개념이고, 결합 상수(binding constant)는 평형 성질을 기반으로 하고 있기 때문이다. 그럼에도 불구하고, 10-7또는 그 이하의 Kd와의 상호작용(전형적인 다이아바디-에피토프(diabody-epitope)의 Kd와 유사하면서도 높은 친화성)은 원하는 시간 상에서 즉, 나노구조의 단계적 어셈블리 중, "비가역적"으로 기능할 것이다.
분자간 상호작용이 나노구조 이용의 시간스케일에서 "비가역적"으로 기능할 필요는 없다. 일부 실시예에서, 본 발명의 단계적 어셈블리 방법에 의해 제작되는 나노구조들은 그후, 화학적 고착(가령, 파라포름알데히드나 글루타르알데히드를 이용한 고착)에 의해 또는 교차 결합에 의해 안정화된다. 두 단백질을 교차 결합하는 가장 대중적인 기법들은 제 2 어셈블리 단위의 티올 그룹에 제 1 어셈블리 단위의 아민 그룹을 간접적으로 연결하는 과정을 포함한다(Handbook of Fluorescent Probes and Research Products, Eighth Edition, Chapter 2, Molecular Probes,Inc. , Eugene, OR; Loster et al., 1997, Analysis of protein aggregates by combination of cross-linking reactions and chromatographic separations, J. Chromatogr. B. Biomed. Sci.Appl. 699 (1-2): 439-61; Phizicky etal., 1995, Protein-protein interactions: methods for detection and analysis, Microbiol. Rev. 59(1) : 94-123).
발명의 일부 실시예에서, 단계적 어셈블리 방법에 의한 나노구조 제작은 어셈블리 단위들 간의 비-공유 상호작용을 이용하여, 비교적 견고한, 그리고 안정한 어셈블리 단위들을 결합하는 과정을 포함한다. 그럼에도 불구하고, 유용한 어셈블리 단위들에 통합되는 결합 원소들은, 안정하고 견고한 결합 쌍들을 형성하기 위해 제 2 결합 원소와의 상호작용 이전에, 무질서할 수 있다. 즉, 안정하거나 견고하지 않을 수 있다. 따라서 발명의 일부 실시예에서는, 개별 적인 어셈블리 단위들이 조합 전에 불안정하고 유연한 도메인을 포함할 수 있으며, 조합 이후, 보다 견고해질 것이다. 선호되는 실시예에서, 본원의 조성과 방법을 이용하여 제작되는 나노구조는 견고한 구조물이다.
발명의 방법에 따르면, 나노구조의 견고성 분석과, 결함의 식별은 전자현미경같이 당 분야에 잘 알려진 방법을 이용하여 실행된다.
또다른 실시예에서, 고체 표면에 직접 완성 나노구조의 한 단부를 부착함으로서, 즉, 유연한 고정물 없이, 구조적 견고성이 테스트될 수 있다. 그후 나노구조의 다른 한 단부는 핵력 현미경(AFM) 팁에 부착된다. 이는 이동가능하다. 움직이려 시도할 때 팁에 힘이 가해진다. 나노구조가 유연할 경우, 나노구조의 편향에 의해 허용되는 팁 움직임과 공급된 힘간의 비례에 가까운 관계가 나타날 것이다. 이와는 대조적으로, 나노구조가 견고할 경우, 견고한 나노구조가 파괴되는 지점까지, 공급힘의 레벨이 증가함에 따라 나노구조의 편향이나 팁 움직임이 거의 없을 것이다. 이 지점에서, 어떤 추가적인 힘이 공급되지 않더라도 핵력 팁의 큰 움직임이 존재할 것이다. 두 단부의 부착 포인트들이 나노구조보다 강하다면, 이 방법은 유용한견고성 측정을 제공할 것이다.
본 발명에 따르면, 나노구조의 각각의 위치는 모든 다른 위치로부터 구분할 수 있다. 왜냐하면, 각각의 어셈블리 단위가 그 이웃과 밀접하게, 구체적으로, 그리고 독자적으로 상호 작용하도록 설계될 수 있기 때문이다. 각각의 어셈블리 단위는 나노구조 내에 그 위치로 구분되는 특성이나 활성을 가질 수 있다. 나노구조 내 각각의 위치는 단계적 어셈블리 과정을 통해, 그리고, 요망 위치에 추가되는 원소나 각각의 어셈블리 단위의 성질을 통해 독자적으로 규정된다. 추가적으로, 본원에서 소개되는 단계적 어셈블리 방법 및 어셈블리 단위들은 제대로 형성된 크기, 형태, 기능의 복합 나노구조의 구성을 위해 대형으로, 대량 병렬 행태로, 그리고 자동화전 제작 공정으로 수정될 수 있다.
본 발명의 방법 및 조성들은 본원에서 이용되는 어셈블리 단위들의 구성에 사용되는 단백질들이 가질 수 있는 정확한 치수, 균일성, 그리고 공간적 형태의 다양성을 특징으로 한다. 더욱이, 아래 설명되는 바와 같이, 본 발명의 방법은, 유전적 공정 기술이 여기서 소개된 발명의 방법에 사용되는 생물학적 물질의 성질을 수정하고 맞추는데 사용될 수 있기 때문에, 그리고 다량의 이러한 물질을 미세 유기구조 형태로 합성하는 데 사용될 수 있기 때문에, 장점을 가진다.
개시물 어셈블리 단위
발명의 단계적 어셈블리 방법에 의해 형성되는 나노구조에 통합된 제 1 어셈블리 단위가 개시물 어셈블리 단위이다. 개시물 어셈블리 단위는 일부 실시예에서, 공유 또는 비-공유 상호작용에 의해 고체 기질이나 그 외 다른 매트릭스에 부착될수 있다. 개시물 어셈블리 단위는 "개시물 단위"이라고도 알려져 있다.
나노구조의 단계적 어셈블리는 선택된 어셈블리 단위를 개시물 단위에 비-공유의 벡터 방식으로 추가함으로서 시작된다. 발명의 방법에 따르면, 어셈블리 단위이, 1) 개시물 단위의 인큐베이션에 의해, 개시물 단위에 추가된다. 일부 실시예에서, 개시물 단위는 추가될 다음 어셈블리 단위를 포함하는 솔루션에서, 매트릭스나 기질에 고착된다. 배양 단계에 이어 2) 제거 단계, 가령 세정 단계가 이어진다. 이 단계에서는 과량의 어셈블리 단위들이 개시물 단위으로부터 제거된다.
어셈블리 단위들은 특정한, 비-공유 결합 형성을 통해 개시물 단위에 결합된다. 다음 어셈블리 단위의 결합 원소들이 선택되어, 개시물 단위의 지정 사이트에만 부착되게 된다. 한 개의 어셈블리 단위만이 제 1 단계 어셈블리 사이클 동안 개시물 단위의 타겟 결합 원소에 추가될 수 있고, 타겟 개시물 단위에 대한 어셈블리 단위의 결합은 벡터 방식이다. 단계적 어셈블리는 나노구조의 요망 설계에 따라 모든 요망 어셈블리 단위들이 나노구조에 통합될 때까지 단계 1, 2를 반복한다.
발명의 단계적 어셈블리 방법의 선호되는 실시예에서, 개시물 단위는 기판에 고착되고, 추가적인 단위들은 고체 상태 폴리머 합성과 유사한 과정으로 순차적으로 추가된다.
개시물 단위는 어셈블리 단위의 카네고리로서, 발명의 어셈블리 단위에 포함되는 것으로 앞서 설명한 여러 구조적, 결합형, 기능적 원소들을 포함할 수 있다. 따라서 개시물 단위는 다음의 분자, 또는 결합 파생물, 또는 그 결합 조각들 중 어느 것도 포함할 수 있다. 그 예로는, 모노클로널 항체, 다중 특이적 항체, Fab나F(ab')2, 조각, 단일-체인 항체 조각(scFv), 이중 특이적, 키메라/이중 특이적 이형이량체 F(ab')2, 다이아바디 또는 다량체 scFv 조각, 세균성 필린 단백질, 루이신 지퍼-형 코일, 4-나선 번들, 펩티드 에피토프, 또는 PNA, 또는 그 외 다른 종류의 어셈블리 단위가 있다.
일부 실시예에서, 발명은 한 개 이상의 결합 원소를 포함하는 개시물 어셈블리 단위를 제공한다. 다른 실시예에서, 발명은 두 개 이상의 결합 원소를 가진 개시물 어셈블리 단위를 제공한다.
개시물 단위는 여러 방식으로 매트릭스에 고착될 수 있다. 고착 방법의 선택은 개시물 단위 종류, 최종 나노구조가 매트릭스로부터 제거되어야 하는 지 여부, 최종 나노구조의 화학 구조 등을 포함한 여러 설계 인자들에 의해 결정될 것이다. 잠재적 고착 방법은, 개시물 에피토프에 대한 항체 결합, His 태그 개시물, 매트릭스 결합 도메인을 지닌 개시물 단위, 항체나 항체-파생 개시물 단위용 항체 결합 단백질(가령, 단백질 A나 단백질 G), 바이오티닐레이티드 개시물의 스트렙타비딘 결합, PNA 고착, 그리고 개시물의 매트릭스에 대한 특이적 공유 결합에 의한 부착 등을 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 개시물 단위는 고체 기질에 고착된다. 개시물 단위는 항체나 항원의 고착을 위해 당 분야에 통상적으로 사용되는 방법들을 이용하여 고체 기질에 고착될 수 있다. 항체나 항원의 고착을 위해 당 분야에 알려진 기술은 수없이 많다. 이 방법들로는, 플라스틱 ELISA 플레이트에 대한 비-특정 흡착, 단백질의 바이오티닐레이션, 그후, 플라스틱 기질에 앞서 흡착된 스트렙타비딘이나 아비딘에 결합함으로서 고착하는 방법이 있다(Sparkset al., 1996, Screening phage-displayed random peptide libraries, in Phage Display of Peptides and Proteins, A Laboratory manual, editors, B. K. Kay, J. Winter and J. McCafferty, Academic Press, San Diego, pp. 227-53). ELISA 미량적정 플레이트에 추가하여, 단백질은 Sepharose(Dedman etal., 1993, Selection of target biological modifiers from a bacteriophage library of random peptides: the identification of novel calmodulin regulatory peptides, J. Biol. Chem. 268; 23025-30)나 상자성 비드(Sparks etal., 1996, Screening phage-displayed random peptide libraries, in Phage Display of Peptides and Proteins, A Laboratory manual, editors, B. K. Kay, J. Winter and J. McCafferty, Academic Press, San Diego, pp. 227-53)같은 다른 고체 지지물에 고착될 수 있다. 사용될 수 있는 추가적인 방법은 알데히드를 함유한 고체 지지물에 아민-함유 생물학적 분자를 환원식 아미노화함으로서 고착을 시킬 수 있다(Hermanson, 1996, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, p. 186). 또한, 어느 단부에 이미도에스테트 그룹을 가진 동종 이가기능성 교차 결합 물질, 디메틸 피멜리미데이트(DMP)(Hermanson, 1996, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, pp. 205-06)를 이용함으로서 고착을 행할 수 있다. 결합 단백질 A를 함유한 불용성 지지물에 항체 분자를 고착화시키는데 이 시약을 사용되고 있다(Schneider etal., 1982, A one-step purification of membrane proteins using a highefficiency immunomatrix, J. Biol. Chem. 257, 10766-69).
특정 실시예에서, 고착된 항원/합텐(hapten)을 인지하고 결합하는 고착 도메인(T)과, 추가적인 어셈블리 단위가 단계적 어셈블리에 순차적으로 추가되는 대응 도메인(A)을 포함하는 다이아바디가 개시물 단위이다. 항체 8F5는 사람의 리노바이러스(rhinovirus)(Serotype 2) 바이러스성 캡시드 단백질 Vp2로부터 도출된 항원 펩티드 VKAETRLNPDLQPTE(SEQ ID NO: 159)에 대한 매개물로서, T 도메인으로 사용된다(Tormo et al., 1994, Crystal structure of a human rhinovirus neutralizing antibody complexed with a peptide derived from viral capsid protein VP2, EMBO J. 13 (10): 2247-56). 도메인은 Diabody Unit 1에 대하여 앞서 설명한 동일한 동일한 리소자임 항-이디오타입 항체(E5.2)이다. 완성된 개시물 어셈블리 단위는 따라서 대응 CDR로 8F5x730.1.4(TxA)를 지닌다. 개시물 단위는 다이아바디를 포함하는 구조적 원소들과 결합 원소들을 특성으로 하기 위해 앞서 설명한 방법을 이용하여 기능적으로 구축된다.
개시물 단위를 고체 지지물 매트릭스에 고착시키기 위해 Factor Xa 시퀀스, IEGR의 N-말단에서, 그리고 Factor Xa 시퀀스와 항원 펩타이드 시퀀스 사이에서, 겹쳐이어지는 짧고 유연한 링커를 통해 리노바이러스 항원 펩타이드가 프로테아제 인지 펩타이드에 융합될 수 있다(Nagai and Thogersen, 1984, Generation of beta-globin by sequence-specific proteolysis of a hybrid protein produced in Escherichia coli, Nature309 (5971): 810-12). 이 융합 펩타이드는 CH-Sepharose 4B(Pharmacia)에 공유 방식으로 링크될 수 있다. 이는 6-탄소 길이 스페이서 아암을 가지면서 주요 아민을 통한 결합을 가능하게 하는 세파로제 파생물이다. 대안으로, 카르복실 그룹을 통한 공유 부착을 위해 사파로제 파생물이 사용될 수 있다. 공유 방식으로 부착된 융합 단백질은 개시물 단위(TxA)의 고착 도메인 "8F5"에 대한 인지 에피토프로 기능할 것이다.
개시물이 고착되면, 추가적인 다이아바디 단위들이 결합 도메인 A'으로붙 한 방향으로 스테이지 어셈블리에서 추가적으로 추가될 수 있다. 단계적 어셈블 리가 완료되면, 나노구조는 지지체 매트릭스에 크로스링크될 수 있고, 또는, 프로테아제 Factor Xa의 추가에 따라 매트릭스로부터 분리된다. 프로테아제는 코밸런트 방식으로 부착된 항원/Factor Xa 융합 펩타이드를 갈라내어, 지지 매트릭스로부터 나노구조를 분리할 것이다. 왜냐하면, 설계에 의해, 설계된 단백질 어셈블리 단위 내에 어떤 Factor Xa 인지 사이트도 존재하지 않기 때문이다.
Factor Xa의 추가를 필요로 하지 않는 고체 지지 매트릭스로부터 펩타이드 융합을 갈라내는 대안의 전략이 또한 구현될 수 있다. 이 방법은 세파로제 매트릭스에 부착되는 갈라지는 스페이서 아암을 이용한다. 이 항원 펩타이드는 페닐-에스테르 연결을 통해 매트릭스에 공유 방식으로 부착된다. 고착된 항체가 개시물 어셈블리 단위를 결합시키면, 개시물 어셈블리 단위는 지지 매트릭스에 고착된 상태를 유지한다. 그후, 개시물 단위/항원 복합체(및 관련 나노구조)가 지지 매트릭스로부터 분리되는 지점인 pH 7.4에서 이미다졸레글리신(imidazoleglycine) 완충액으로 스페이서 아암이 화학적으로 절단된다.
결합 원소들의 특성화 방법
항체-페이지-디스플레이 기술에 의한 결합 원소 상호작용 식별 방법
발명의 일부 실시예에서, 발명의 방법에 사용하기 적합한 결합 원소들이 가려지고, 그들간의 상호작용은 항체-파아지-디스플레이(anitbody-phage-display) 기술을 이용하여 식별된다. 재조합형 항체, 결합 유도체, 또는 그 결합 조각들의 생성을 위한 파아지 디스플레이 기술은 유기질 및 무기질의 다양한 항원의 폭넓은 범위(가령, 단백질, 펩티드, 핵산, 설탕, 반도체 표면 등등)에 대해 결합할 수 있는 단백질을 생성하는 데 사용될 수 있다. 파아지 디스플레이 기술 방법은 당 분야에 잘 알려져 있다(Marks etal., 1991, By-passing immunization: human antibodies from V-gene libraries displayed on phage, J. Mol. Biol. 222: 581-97; Nissimetal., 1994, Antibody fragments from a"single pot"phage display library as immunochemical reagents, EMBO J. 13: 692-98; De Wildt etal., 1996, Characterization of human variable domain antibody fragments against the Ul RNA-associated A protein, selected from a synthetic and patient derived combinatorial V gene library, Eur. J. Immunol. 26: 629-39; De Wildt et al., 1997, A new method for analysis and production of monoclonal antibody fragments originating from single human B-cells, J. Immunol. Methods. 207: 61-67; Willems etal., 1998, Specific detection of myeloma plasma cells using anti-idiotypic single chain antibody fragments selected from a phage display library, Leukemia 12: 1295-1302; van Kuppevelt etal., 1998, Generation and application of type-specific anti-heparin sulfate antibodies using phagedisplay technology, further evidence for heparin sulfate heterogeneity in the kidney, J. Biol. Chem. 273: 12960-66; Hoet etal., 1998, Human monoclonal autoantibody fragments from combinatorial antibody libraries directed to theUlsnRNP associatedU1C protein, epitope mapping, immunolocalization and V-gene usage, Mol. Immunol. 35: 1045-55).
재조합 항체 기술이 하이브리도마 세포로부터 공지된 특수성으로 항체를 분리할 수 있지만, 이것이 특정 mAb들의 신속하게 만들어지지는 않는다. 개별적인 면역화에 이어, 세포 융합에 의해 하이브리도마를 발생시키는 것이 각각의 mAb를 발생시키는 데 필요하다. 이는 시간 소모가 크고 노동집약적인 일이다.
적절한 실시예에서, 항체-파아지-디스플레이 기술은 이와 같은 한계상항을 극복하는 데 사용되어, 관심대상인 특정 항원들을 인지하는 mAb들이 보다 효과적으로 발생될 수 있다(방법에 대해서는 다음을 참고한다 Winter et al., 1994, Making antibodies by phage display technology, Ann. Rev. Immunol. 12: 433-55 ; Hayashi etal., 1995, A single expression system for the display, purification and conjugation of single-chain antibodies, Gene 160(1) : 129-30; McGuinness etal., 1996, Phage diabody repertoires for selection of large numbers of bispecific antibody fragments, Nat. Biotechnol. 14 (9): 1149-54; Jung etal., 1999, Selection for improved protein stability by phage display, J. Mol. Biol. 294(1) : 163-80; Viti et al., 2000, Design and use of phage display libraries for the selection of antibodies and enzymes, Methods Enzymol. 326:480-505). 일반적으로, 항체-파아지-디스플레이 기술에서, VL과 VH유전자의 Fv나 Fab 항체-결합 부분은 사람의 비장이나 사람의 주변 혈액 림프구 세포로부터 도출한 cDNA로부터 적절한 프라이머를 이용하여 PCR 증폭에 의해 "작제"된다. 이 구조된 VL과 VH유전자 레터로리(DNA 서열)은 함께 겹쳐이어져 박테리오파아지의 소량의 피복 단백질(minor coat protein)(가령, M13이나 fd, 또는 그 결합 파생물)에 삽입된다. 따라서, 융합 박테리오파아지 피복 단백질을 생성할 수 있다(Chang etal.,1991, Expression of antibody Fab domains on bacteriophage surfaces. Potential use for antibody selection, J. Immunol. 147 (10): 3610-14; Kipriyanov and Little, 1999, Generation of recombinant antibodies, Mol. Biotechnol. 12 (2): 173-201). 생성된 박테리오파아지는 파아지 게놈에 통합된 항체 VL과 VH를 인코딩하는 유전체 조각의 사본과 파아지 단백질 피복의 외부 표면에 융합되는 기능적 항체를 지닌다.
이 방법들을 이용하여, 관심대상인 특정 항원을 향해 친화도를 가진 박테리오파아지디스 플레이 항체는, 타겟 에피토프나 항원에 디스플레이되는 항체를 지닌 다량의 재조합 박테리오파아지가 결합함으로서 친화력 크로마토그래피에 의해 분리 수 있다. 이는 고체 표면이나 매트릭스에 고착된다. 결합, 결합안된 또는 약하게 결합된 파아지 입자 제거, 그리고 파아지 복제 도출의 반복되는 주기들은 요망하는 VL및 VH유전자 조각을 지닌 박테리오파아지를 상당량 증가시켜 생산한다.
관심대상인 항원들로는 펩티드, 단백질, 이뮤노글로불린 일정 영역, CDR, 그외 다른 분자, 합텐, 소분자, 무기질 입자 및 표면 등이 있다.
정제되면, 링크된 VL과 VH유전자 조각이 당 분야에 잘 알려진 표준 DNA 분자 기술에 의해 박테리오파아지 게놈으로부터 구조될 수 있고, 클로닝되어 표현될 수 있다. 이 방법에 의해 생성되는 항체들의 수는 어떤 타겟 분자를 향해서도 항원성을 위해 스크린될 수 있는 다양한 항체 라이브러리를 생성하도록 최적의 방법을 제공하며, 유전자 레퍼토리의 크기 및 다양성에 직접 상관된다. 항체-파아지-디스플레이 기술에 의해 생성된 mAb는 피코몰 범위에서 나노몰 범위로 항원을 향한 특정 결합을 보여준다(Sheets et al., 1998, Efficient construction of a large nonimmune phage antibody library: the production of high-affinity human single-chain antibodies to protein antigens, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (11): 6157-62).
발명의 방법에 유용한 항체, 결합 파생물, 또는 그 결합 조각은 상술한 구성의 항체나 조각 파아지 디스플레이 라이브러리를 이용하여 선택될 수 있다. 이러한 접근법은, 본 발명의 방법에 사용하기 적합한 항체나 조각들의 식별을 크게 증가시킬 수 있도록, 고도의 복잡도(가령, 109)을 가지는 라이브러리를 효율적으로 스크리닝하는 방법을 제공하는 장점을 가진다.
일부 실시예에서, 발명의 단계적 어셈블리 방법에 사용하기 위한 항체를 생성하기 위해, 이뮤노글로불린 레퍼토리를 클로닝하는 방법이 사용된다. 레퍼토리 클로닝은 항체생성 동물을 필요로 하지 않으면서 어떤 종류의 항체에도 사용될 수있다. 이뮤노글로불린 레퍼토리를 클로닝하는 방법은 당 분야에 레퍼토리 클로닝으로 잘 알려져 있고, 시험관 내에서 전체적으로 실행된다. 일반적으로, 레퍼토리 클로닝을 실행하기 위해, 메신저 RNA(mRNA)가 주변 혈액으로부터 얻은 B 림프구로부터 추출된다. mRNA는 역전사효소 및 표준 프로토콜을 이용하여 cDNA 합성을 위한 템플릿으로 작용한다(see, e. g. , Clinical Gene Analysis and Manipulation, Tools, Techniques and Troubleshooting, Sections IA, IC, IIA, IIB,IIC and IXIA, Editors Janusz A. Z. Jankowski, Julia M. Polak, Cambridge University Press 2001; Sambrook etal., 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Chapters 7,11, 14 and 18, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N. Y.; Ausubel etal., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Chapters 3,4, 11,15 and 24, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, NY). 이뮤노글로불린 cDNA는 dDNA의 이러한 복합 혼합물로부터, 적절한 프라이머를 이용하여, PCR에 의해 특이적으로 증폭된다. 바람직한 결합 성질을 가진 이뮤노글로불린 조각을 만들기 위해, 유전자 인코딩 항체 라이트(L) 및 헤비(H) 체인으로부터 PCR 프로덕트를 얻는다. 이 프로덕트는 파아지미드 벡터(phagemid vector)로 삽입된다. 파아지 피복 단백질과의 융합으로 박테리오파아지 게놈에 통합된 클로닝된 유전자나 유전자 조각은 박테리오파아지의 표면에 실리는 하이브리드 scFv 이뮤노글로불린 분자의 합성을 이끄는 적절한 박테리아 호스트로 표현된다. 따라서, 박테리오파아지 수치는 레퍼토리에 포함된 모든 세부사항과 이뮤노글로분린의 혼합물을 나타낸다.
이러한 개체군으로부터 반복적인 항원 면역흡수 과정과 파아지 증폭에 의해 항원 특이성 면역글로불린을 선택한다. 여러 차례 선별과정을 통하여 관심 대상이 되는 항원에만 남을 것이고, 남은 파아지를 새로운 벡터 및/또는 호스트로 도입하여, 추가 조작을 하거나 용해가능한 형태의 다량으로 파아지-인코드된 단백질로 발현시키는데 이용한다.
항체 파지 디스플레이 라이브러리는 상기 설명된 바와 같이 단계적으로 어셈블리되는 나노구조에 이용하기 위해 어셈블리 단위 작제시에 결합 원소로 이용할 수 있는 항체의 에피토프-결합 부분의 분리, 정제, 및 개량에 이용될 수 있다.
X-RAY 결정학을 이용하여 결합 원소를 특징짓는 방법
많은 경우에, 단백질사이의 분자 인식 혹은 단백질과 펩티드 사이의 분자 인식은 실험적으로 결정될 수 있다. 본 발명의 일면에서, 결합 원소들의 상호 작용을 한정하고 결합쌍을 형성하는데 중요한 상기 단백질-단백질 작용은 당 분야에 흔히 알려진 X-레이 결정학적 방법을 이용하여 확인한다. 이러한 특징은 당 분야의 기술자들이 본 발명의 구성 및 방법에 유용한 결합쌍 상호작용을 인식할 수 있게 한다.
결합 원소의 특이성 및 친화성을 특징짓는 방법
두 개의 상보적 결합 성분들이 특이성으로 상호작용한다는 것을 입증하는 방법은 예를 들어, ELISA 분석, 분석적 한외원심분리(ultracentrifugation), 또는 BIAcore 방법론(1996, Abraham et al, "Determination of binding constants of diabodies directed against prostate-specific antigen using electrochemiluminescence-based immunoassays", J. Mol. Recognit.9(5-6):456-61;
Atwell et al, 1996, Design and expression of a stable bispecific scFv dimer with affinity for both glycophorin and N9 neuraminidase, Mol.Immunal.33(17-18):1301-12; Muller외.1998); A dimeric bispecific miniantibody combines two specificities with avidity, FEBS Lett.432(1-2):45-49), 또는 다른 공지된 유사한 방법 등을 사용하여 이루어질 수 있고, 이들은 분자간 결합 작용의 강도를 입증하고 측정하는데 적합하다.
구조 원소, 결합 원소 및 기능 원소의 고안 및 제작
매우 균질한 재질의 공지 크리스탈 구조에 근거하여 상동성 모델링을 통하여 확인된 결정 구조에서 나타난 것과 같이, 본 발명의 구조 원소, 결합 원소 및 기능 원소들의 고안 및 그 성분들을 포함하는 어셈블리 단위의 디자인은 원하는 결합 작용에서 이들 구조를 분석 및 결정하여 실행할 수 있다. 한 가지 이상의 기능 원소를 포함하는 유용한 어셈블리 단위 고안은 다음의 단계 전부 또는 일부를 포함하나 이에 국한되지 않은 일련의 결정 및 분석이 관련된다.
(ⅰ) 나노 구조의 원하는 전체 기능에 근거하여 결합될 기능 성분들을 선택하고;
(ⅱ) 타겟 기능, 특히 기능 원소들의 상대적 위치 결정에 근거하여 원하는 구조를 선택하며;
(ⅲ) 원하는 나노구조 속으로 결합되는 기능적 나노 입자들에 대하여 특이성을 갖는 펩티드 또는 단백질을 가령, 조합 라이브러리로부터 선택, 식별, 또는 결정을 통해 결합 성분들을 선택하고,
(ⅳ) 양자 도트(quantum dots)와 같은 나노 입자들을 포함하는 기능 원소들 사이의 필수적 분리에 근거하여, 정확한 구조 및 화학량론을 갖는 결합 원소들을 통합하기 위한 위치 및 정확한 치수를 갖는 적절한 단단한 구조를 제공하도록 구조원소들을 선택하며,
(ⅴ) 상기 어셈블리 단위의 구조적 성분 및 결합 성분들의 폴딩(folding)이 붕괴(가령, β-회전에서의 통합으로인해)되지 않도록 상기 단계(ⅲ)로부터 및 상기 단계(ⅳ)에서 선택된 구소 원소와 펩티드나 단백질 결합 원소를 결합시키는 융합 단백질을 디자인하고,
(ⅵ) 상기 나노 구조의 전체 디자인에서 상기 생성된 융합 단백질을 컴퓨터 모델링하고, 기능적 규격에서 필요로하는 구조적 치수들을 최적화하도록 디자인을 정제하며, 또는
(ⅶ) 단계적으로 어셈블리되는 어셈블리 순서를 정한다.
구조적 성분 단백질의 변경에는 단백질의 아미노산 서열의 삽입, 결손, 또는 변형이 있다. 많은 경우, 본래의 단백질에 존재하지 않던 결합 원소들을 추가하기 위하여 삽입 또는 대체 등의 변경이 이루어진다. 삽입 돌연변이가 성공적인가를 결정하는 통상적 시험으로는 원이색성(CD, circular dichroism) 스펙트럼을 사용한다. 생성된 융합 돌연변이 단백질의 CD 스펙트럼은 고유 단백질의 CD와 비교될 수 있다.
만일 상기 삽입된 것이 작으면(가령, 짧은 펩티드), 적절히 폴딩된 삽입 돌연변이체의 스펙트럼은 고유 단백질의 스펙트럼과 매우 유사하게 될 것이다. 만일상기 삽입이 전체적 단백질 영역(가령, 단일 사슬 변수 영역)에서 일어났다면, 상기 융합 단백질의 CD 스펙트럼은 각 소자의 CD 스펙트럼의 합계와 같게 될 것이다(예를 들면, 고유 단백질과 기능 원소를 포함하는 고유 단백질 및 융합 단백질의 것). 융합 단백질의 두 가지 성분이 정확하게 폴딩되었는 지를 검사에 이와 같은 합치 결과를 이용할 수 있다.
선호적으로, 융합 단백질이 성공적으로 만들어졌는지를 테스트한다. 예를 들어, 표적의 모든 부분에 융합 단백질이 결합되는 지를 분석하고, 모든 결합 쌍과 성공적으로 상호작용하는지를 분석한다. 적절한 ELISA 분석; 적어도 한가지 ELISA를 실행하여 나노구조를 만드는데 요구되는 결합쌍 각각에 대해 변형 단백질의 친화성 및 특이성을 테스트한다.
단계적으로 어셈블리하는 방법의 용도 및 이로 인하여 작제된 나노구조.
본 발명의 단계적으로 어셈블리되는 방법 및 어셈블리 단위는 수많은 나노구조를 만드는데 이용할 수 있다. 이와 같은 나노구조의 용도는 명백한데, 예를 들면, 잘 배열된 1차, 2차, 3차원적 섬유, 우리 및 고형물 특히 다른 물질과 연합을 허용하는 특수 부착 부위와 같은 고도의 규칙성을 요하는 부분에 이용될 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명의 단계적으로 어셈블리되는 방법에 의해 직제되는 나노구조는 1차원 구조이다. 예를 들면, 단계적으로 어셈블리된 나노구조를 에어로겔, 종이, 플라스틱, 시멘트등의 다른 물질을 보강하는데 이용할 수 있다. 특정 구체예에서, 단계적으로 어셈블리되어 직제된 나노구조는 긴 1차원적인 섬유 형태로 종이, 시멘트, 플라스틱에 결합되어 제조과정 동안 추가 습식 및 건식 인장 강도를제공할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 나노구조는 확인 및 인지 목적에 이용할 수 있는 패턴을 가진 또는 표식이 된 섬유가 될 수도 있다. 이와 같은 구체예에서, 나노구조에는 형광 염료, 퀀텀 도트, 또는 효소와 같은 기능 원소를 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 특정 나노구조를 위조 방지 표식으로 종이 및 섬유에 심을 수도 있다. 이와 같은 경우에, 간단한 색을 연결한 항체 반응(시판되는 키트이용)을 이용하여 물질의 원료를 증명할 수 있다. 또는 이와 같은 나노구조를 종이 또는 섬유에 결합전 또는 결합 후에 염료, 잉크 또는 다른 물질에 결합시켜 다른 방식으로 이들의 외양 또는 성질을 변형시킬 수 있다.
또 다른 구체예에서, 나노구조는 제조하는 동안에 잉크 또는 염료에 결합시켜 용해도 또는 혼화성을 증가시킬 수 있다.
또 다른 구체예에서, 섬유와 같은 1차원 나노구조에는 원하는 위치에 한 개 이상의 효소 또는 촉매 원소를 보유한다. 나노구조는 효소적 또는 촉매 반응에 지지구조 또는 골격으로 작용하여 효과를 증가시킨다. 이와 같은 구체예에서, 나노구조는 반응 "어셈블리 라인"을 제공하기 위해 원하는 반응 순서에 효소 또는 다른 촉매를 "얹거나" 위치시키는데 이용된다.
또 다른 구체예에서, 섬유와 같은 1차원 나노구조를 어셈블리 지그(jig)로 이용한다. 두 개 또는 그 이상 성분 예를 들면 기능 단위가 나노구조에 결합되어, 공간적인 방향을 제공한다. 성분들이 결합하거나 융합되고, 나노구조로부터 생성된 융합 산물이 방출된다.
또 다른 구체예에서, 나노구조는 정의된 공간을 가지는 나노입자(예를 들면, 열적, 전자 또는 자성을 가지는 금속 또는 다른 입자)를 적하시키는 서포트 또는 프레임으로 이용할 수 있는 1차원, 2차원 또는 3차원 구조가 되고, 이를 나노와이어 또는 나노회로를 만드는데 이용할 수도 있다.
또 다른 구체예에서, 단계적으로 어셈블리되는 본 발명의 방법을 이용하여 정의된 크기 및 모양을 가지는 나노와이어를 작제하기 위해 1차원 나노구조(섬유)의 전극를 적게 플레이팅할 수 있다. 예를 들면 기능 원소로써 금속 입자를 포함하도록 작제할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 기능 원소로써 자성 입자를 포함하는 1차원 나노구조(섬유)를 외부 자장에 배열하여 나노구조안으로 이용되는 유속을 제어한다. 또 다른 구체예에서, 외부 자장을 이용하여 LCD-형 디스플레이에 이용할 수 있는 기능 원소로 광학 부분을 포함하는 나노구조(가령 섬유)을 배열 또는 해체할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 나노구조는 전자 현미경의 정확한 크기를 위한 크기 표준 또는 표식으로 이용할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 단계적으로 어셈블리하는 방법에 의해 직조되는 나노구조는 2차원 또는 3차원 구조이다. 예를 들면, 한 구체예에서, 나노구조는 일정한 구멍 크기를 가지는 그물로써 2차원 체 또는 필터로 사용할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 나노구조는 분자 체 또는 필터로 이용할 수 있는 3차원 6각형 배열로 크기에 의해 입자를 선별적으로 분리하는 정확한 직경의 규칙적인 수직 포어를 제공한다. 이와 같은 필터는 용액의 멸균(예를 들면 미생물 또는 바이러스 제거) 또는 일련의 분자량을 걸러내는 필터로 사용할 수도 있다. 이와 같은 구체예에서, 구조 원소 또는 기능 원소와 같은 구멍의 성분을 변형시켜, 특이적인 표면 성질(가령, 친수성 또는 소수성, 특정 리간드에 결합하는 능력)을 제공할 수 있다. 이와 같은 여과 장치의 장점 중에는 균질하고 선형인 구멍과 매트릭스에 대한 구멍의 비율이 높다는 것이다.
당업자는 여기에서 설명하는 방법 및 어셈블리 단위를 이용하여 다양한 2차원 및 3차원 구조 예를 들면 다각 구조(8각형) 및 삼각형에서 만든 테트라헤드론, 이코사헤드론과 같은 개방 구조, 사각 및 직각에서 만든 상자 또는 큐브(예를 들면 11, 실시예 6에서 설명하는 큐브)를 만들 수 있다. 구조 원소들의 상이한 축상에서 조작할 수 있는 결합 및 기능 원소 형태에 의해서만 구조 범위가 제한된다.
한 구체예에서, 2차원 또는 3차원 나노구조를 이용하여 기능 단위로 광학, 전자, 자장, 촉매 또는 효소 부분을 포함하는 표면 코팅을 작제할 수 있다. 이와 같은 코팅을 광학 코팅에 이용할 수 있다. 이와 같은 광학 코팅을 이용하여 피복된 물질의 흡수성 또는 반사성을 변경시킬 수 있다.
본 발명의 나노구조를 이용하여 작제된 표면 코팅을 전자 코팅으로 이용할 수 있는데, 예를 들면, 정전기 차단 또는 렌즈의 자체-먼지털이 표면(코팅이 광학적으로 깨끗한 경우)으로 이용할 수 있다. 컴퓨터 하드 드라이버의 표면상에 코팅과 같은 자성 코딩으로 이용할 수도 있다.
이와 같은 표면 코팅을 촉매 또는 효소 코팅에 이용할 수 있는데 예를 들면 표면 보호와 같은 것으로 이용할 수 있다. 특정 구체예에서, 코팅은 항-산화제 코팅이다.
또 다른 구체예에서, 나노구조를 이용하여, 기능 원소로써 광학, 전자, 자성, 촉매 부분을 가지는 오픈 프레임워크 또는 골격을 작제할 수 있다. 이와 같은 골격을 이용하여 상기에서 설명한 것과 같은 광학, 전자, 자성, 촉매 또는 효소 부분에 서포트로 이용할 수 있다. 특정 구체예에서, 이와 같은 골격은 분자의 두꺼운 또는 조밀한 코팅을 만들기 위해 배열된 기능 원소들을 포함하거나 원하는 광학, 전자, 자성, 촉매 또는 효소 성질을 가지는 가용성 미크론-크기 입자를 서포트하기 위해 배열된 기능 원소들을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 나노구조는 프레임워크 또는 골격으로 작용하여 그 위에 효소 또는 항체 결합 도메인이 연결되어 고밀도 다가 처리 부위를 제공하여 불용성 효소에 연결되어 용해시키고, 아양한 분자 종을 포집, 보호 또는 운반한다.
또 다른 구체예에서, 나노구조를 이용하여 어드레스로 불러낼 수 있는 위치를 가지는 고밀도 컴퓨터 메모리를 작제할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 나노구조를 이용하여 인위적인 지오라이트(물에서 이온을 흡수할 수 있는 능력을 가진 천연 미네랄(수화 실리케이트)를 만들 수 있는데 이때 나노구조 고안으로 오픈 프레임워크를 통하여 반응물질의 이동을 매우 효율적으로 촉진시킨다.
또 다른 구체예에서, 나노구조를 이용하여 신물질의 기초로 작용할 수 있는 오픈 프레임워크 또는 골격을 만들 수 있는데, 예를 들면, 프레임워크에는 강도, 밀도와 같은 독특한 성질을 보유하고, 다양한 환경에서 안정성 및 입자 포장성을결정한다.
특정 구체예에서, 본 발명의 단계적으로 어셈블리 단위 되는 방법을 이용하여 계산적인 구조 예를 들면, 공간적으로 조직적인 배열을 이루는 퀀텀으로 구성된 컨텀 셀룰라 오토메타(QCA)를 작제할 수 있다. QCA 기술에서, 개별 전가의 위치에 의해 로직 상태가 인코드되고, 볼테이지 수준에 의해서라기 보다는 공간적으로 위치한 퀀텀 도트로 구성된 QCA 셀에 포함된다. 2진 정도 저장에 필수적인 모양에 따라 공간적으로 퀀텀 도트 입자를 배열하는 순서에 단계적인 어셈블리를 실행할 수 있다. 컨텀 도트 셀룰라 오토메타를 위한 QCA 셀의 공간적 배치 및 작제를 위해 단계적인 어셈블리 단위를 이용하여 만들 수 있는 로직 장치의 예를 들면, QCA 와이어, QCA 언버터, 머조리티 게이트(majority gates), 풀 에더(full adders) (Amlani etal., 1999, Digital logic gate using quantum-dot cellular automata, Science 284 (5412): 289-91;Cowburn and Welland, 2000), Room temperature magnetic quantum cellular automata, Science 287 (5457): 1466-68; Orlov etal., 1997, Realization of a Functional Cell for Quantum-Dot Automata, Science 277: 928-32)등이 포함된다.
본 발명은 다음의 실시예를 통하여 설명하나 이에 국한시키지는 않는다.
실시예 1: 단계적 어셈블리를 위한 프로토콜
다음의 단계적으로 어셈블리하는 과정을 도 8에서 설명한다. 생성된 나노구조는 도 8, 단계 11에서 설명한다.
단계적으로 어셈블리되는 단계
과정
단계 1 a) 어셈블리 단위-1 첨가
b) 세척
단계 2 a) 어셈블리 단위-2 첨가
b) 세척
단계 3 a) 단계 1 반복
단계 4 a) 어셈블리 단위-3 첨가
b) 세척
단계 5 a) 단계 1 반복
단계 6 a) 어셈블리 단위-4 첨가
b) 세척
단계 7 a) 단계 2 반복
단계 8 a) 어셈블리 단위-5 첨가
b) 세척
단계 9 a) 단계 1 반복
단계 10 a) 단계 2 반복
단계 11 a) 단계 1 반복
실시예 2 : 거대분자 나노구조 제작
거대분자 어셈블리를 만들기 위해, 본 발명의 단계적으로 어셈블리시키는 방법을 이용하여 두 가지 어셈블리된 나노구조 중간물질을 서로 결합시킨다. 이 실시예는 두 개 나노구조 중간물질에서 거대분자 나노구조를 제작하는 것을 설명한다.
도 9는 도 8에서 설명하는 단계적으로 어셈블리시키는 프로토콜에서 만들어진
단계적 어셈블리단계 | 과정 |
단계 1 | 단락 8에서 설명하는 단계적으로 어셈블리하는 프로토콜의 단계 1-11(실시예 3) |
단계 2 | a) A'캐핑 단위 첨가b) 세척 |
단계 3 | 서포트 매트릭스에서 나노구조 중간물질-1제거 및 분리 |
단계 4 | 단락 8에서 설명하는 단계적으로 어셈블리하는 프로토콜의단계 1-8 실행, 서포트 매트릭스에 부탁된 나노구조중간 물질-2이 남는다 |
단계 5 | a) 나노구조 중간물질-1 첨가b) 세척 |
두가지 나노구조의 단계적 어셈블리 방법을 설명한다. 도 8의 단계 11에는나노구조 중간 물질-1을 설명하고 있다. 다음의 프로토콜은 도 9에서 설명하는 상보적인 결합쌍이 연합되어 두 개 나노구조 중간물질을 첨가하는 것을 설명한다. 생성된 거대분자 나노구조는 도 9, 단계 5에서 설명한다.
실시예 3: 광 분산을 이용하여 편광 분석
이 실시예에서 이용된 것과 같은 다이아보디(diabodies)와 같은 거대분자 단량체의 중합정도는 빛 분산을 이용하여 분석할 수 있다. 광 분산 분광계 가령, DAWN-DSP 분광계(Wyatt TechnologyCorp. , Santa Barbara, CA)와 같은 광 분산 측정으로 평균 무게, 분자량, 입자 크기 모양, 입자-입자 쌍의 상관관계 결정에 대해 정보를 제공한다.
실시예 4: 당 구배 침전(gradient sedimentation)을 이용하여 분자양 결정(중합 정도)
길이가 다른 연결된 다이아보디(diabody)는 구역 한회여과에서 당 구배를 이용하여 상이한 속도로 침전한다. Svedberg 단위에서 중합 및 침전 정도산에 정량적인 상관관계를 계산할 수 있다. 이 방법은 일반적으로 자가-어셈블리 효과를 특징짓고, 새로운 다이아보디 단위를 추가하는 각 단계에서 단계적으로 어셈블리되는 공정을 특징화시키는데 유익하다.
실시예 5: 전자 현미경을 이용한 막대의 모양 및 길이
당 구배 분취 및 SDS-PAGE 분석 후에, 막대를 포함하는 부분적으로 정제된 분취물을 육안으로 볼 수 있다. 적절한 분취 시료를 EM 그리드(grid)에 두고, 착색또는 그림자를 제공하여 이들의 모양을 결정하기 위해 전자현미경을 이용하여 큰 구조를 찾는다.
본 발명은 여기에서 설명하는 특정 구체예에 그 범위를 제한하는 것이 아니며, 또한 전술한 설명으로부터 당업자는 여기에서 설명하는 것에 추가적으로 본 발명의 다양한 변형 가능하다는 것을 인지할 것이다. 이와 같은 변형도 첨부된 청구범위내 본 발명의 범위에 속한다.
여기에서 언급하는 모든 참고 문헌은 전문을 포함하여, 각 개별 공보, 특허 및 특허 출원이 특이적, 개별적으로 명시된 경우에 동일한 정도로 전문을 동일한 목적으로 첨부한다.
임의 공보를 언급한 것은 출원일 이전에 공개된 것으로 본 발명이 선행 발명에 의해 이와 같은 공개가 선행되었다는 것을 인정하는 의도로 해석해서는 안될 것이다.
SEQUENCE LISTING
<110> Hyman, Paul
Goldberg, Edward
<120> Nanostructures Containing PNA Joining and Functional Elements
<130> NANF.P-004
<140> 10/370,685
<141> 2003-02-21
<150> 10/080,608
<151> 2002-02-21
<160> 159
<170> PatentIn version 3.2
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<210> 51
<211> 10
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> PNA complementary joining portion
<400> 51
gtggtttagt 10
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<212> DNA
<213> artificial
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<223> PNA complementary joining portion
<400> 52
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<213> artificial
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<213> artificial
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<213> artificial
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<213> artificial
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gatacaagat 10
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<213> artificial
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<223> sequence unsuitable as PNA binding element
<400> 63
tctgtattgg 10
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<212> DNA
<213> artificial
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<223> sequence unsuitable as PNA binding element
<400> 64
ataacctgac 10
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<212> DNA
<213> artificial
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<223> sequence unsuitable as PNA binding element
<400> 65
gggttttccc 10
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<211> 10
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> sequence unsuitable as PNA binding element
<400> 66
gatcttgatc 10
<210> 67
<211> 14
<212> PRT
<213> human
<400> 67
Ser Gly Phe Asn Ala Asp Tyr Glu Ala Ser Ser Ser Arg Cys
1 5 10
<210> 68
<211> 17
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> epitope for v-jun
<400> 68
Pro Ile Asp Met Glu Ser Gln Glu Arg Ile Lys Ala Glu Arg Lys Arg
1 5 10 15
Met
<210> 69
<211> 10
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> epitope for c-myc
<400> 69
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10
<210> 70
<211> 15
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> epitope for v-H-ras
<400> 70
Glu Glu Tyr Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu
1 5 10 15
<210> 71
<211> 11
<212> PRT
<213> herpes simplex virus
<400> 71
Gln Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Glu Asp
1 5 10
<210> 72
<211> 11
<212> PRT
<213> bacteriophage T7
<400> 72
Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly
1 5 10
<210> 73
<211> 5
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> epitope for beta endorphin
<400> 73
Tyr Gly Gly Phe Leu
1 5
<210> 74
<211> 15
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> biotin analog
<400> 74
Ile Ser Phe Glu Asn Thr Trp Leu Trp His Pro Gln Phe Ser Ser
1 5 10 15
<210> 75
<211> 5
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> biotin analog
<400> 75
Thr Pro His Pro Gln
1 5
<210> 76
<211> 5
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> biotin analog
<400> 76
Met His Pro Met Ala
1 5
<210> 77
<211> 15
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> binds S-protein conjugate
<400> 77
Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp Ser
1 5 10 15
<210> 78
<211> 5
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> binds protein kinase A
<400> 78
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1 5
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<211> 12
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> binds to GaAs
<400> 79
Val Thr Ser Pro Asp Ser Thr Thr Gly Ala Met Ala
1 5 10
<210> 80
<211> 12
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> binds to GaAs
<400> 80
Ala Ala Ser Pro Thr Gln Ser Met Ser Gln Ala Pro
1 5 10
<210> 81
<211> 12
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> binds to GaAs
<400> 81
Ala Gln Asn Pro Ser Asp Asn Asn Thr His Thr His
1 5 10
<210> 82
<211> 12
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> binds to GaAs
<400> 82
Ala Ser Ser Ser Arg Ser His Phe Gly Gln Thr Asp
1 5 10
<210> 83
<211> 12
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> binds to GaAs
<400> 83
Trp Ala His Ala Pro Gln Leu Ala Ser Ser Ser Thr
1 5 10
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<211> 12
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> binds to GaAs
<400> 84
Ala Arg Tyr Asp Leu Ser Ile Pro Ser Ser Glu Ser
1 5 10
<210> 85
<211> 12
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> binds to GaAs
<400> 85
Thr Pro Pro Arg Pro Ile Gln Tyr Asn His Thr Ser
1 5 10
<210> 86
<211> 12
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> binds to GaAs
<400> 86
Ser Ser Leu Gln Leu Pro Glu Asn Ser Phe Pro His
1 5 10
<210> 87
<211> 12
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> binds to GaAs
<400> 87
Gly Thr Leu Ala Asn Gln Gln Ile Phe Leu Ser Ser
1 5 10
<210> 88
<211> 12
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> binds to GaAs
<400> 88
His Gly Asn Pro Leu Pro Met Thr Pro Phe Pro Gly
1 5 10
<210> 89
<211> 12
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> binds to GaAs
<400> 89
Arg Leu Glu Leu Ala Ile Pro Leu Gln Gly Ser Gly
1 5 10
<210> 90
<211> 28
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> leucine zipper sequence
<400> 90
Met Lys Gln Leu Glu Asp Lys Val Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn Tyr
1 5 10 15
His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Leu
20 25
<210> 91
<211> 28
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> leucine zipper sequence
<400> 91
Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu Thr Asp Gln Leu Glu Asp Glu Lys Tyr
1 5 10 15
Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala Asn Leu Leu Lys Glu
20 25
<210> 92
<211> 28
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> leucine zipper sequence
<400> 92
Ala Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln Asn Tyr
1 5 10 15
Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln
20 25
<210> 93
<211> 35
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> leucine zipper sequence
<400> 93
Val Leu Glu Thr Gln His Lys Asn Glu Arg Leu Thr Ala Glu Val Glu
1 5 10 15
Gln Leu Gln Lys Lys Leu Ser Thr Leu Ser Arg Glu Phe Lys Gln Leu
20 25 30
Arg Asn Leu
35
<210> 94
<211> 35
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> leucine zipper sequence
<400> 94
Cys Lys Glu Leu Thr Gly Glu Asn Glu Ala Leu Glu Lys Lys Ala Asp
1 5 10 15
Ser Leu Lys Glu Arg Ile Gln Tyr Leu Ala Lys Glu Ile Glu Glu Val
20 25 30
Lys Asp Leu
35
<210> 95
<211> 33
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> leucine zipper sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (33)..(33)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 95
Cys Gly Gly Val Gln Ala Glu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp
1 5 10 15
Leu Leu Arg Lys Arg Arg Glu Gln Leu Lys His Lys Leu Glu Gln Leu
20 25 30
Xaa
<210> 96
<211> 33
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> leucine zipper sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (33)..(33)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 96
Cys Gly Gly Met Arg Arg Lys Asn Asp Thr His Gln Gln Asp Ile Asp
1 5 10 15
Asp Leu Lys Arg Gln Asn Ala Leu Leu Glu Gln Gln Val Arg Ala Leu
20 25 30
Xaa
<210> 97
<211> 32
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> leucine zipper sequence
<400> 97
Val Lys Ser Leu Glu Asn Arg Val Ala Val Leu Glu Asn Gln Asn Lys
1 5 10 15
Thr Leu Ile Glu Glu Leu Lys Ala Leu Lys Asp Leu Tyr Ser His Lys
20 25 30
<210> 98
<211> 33
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> leucine zipper sequence
<400> 98
Val Val Thr Leu Lys Glu Leu His Ser Ser Thr Thr Leu Glu Asn Asp
1 5 10 15
Gln Leu Arg Gln Lys Val Arg Gln Leu Glu Glu Glu Leu Arg Ile Leu
20 25 30
Lys
<210> 99
<211> 885
<212> PRT
<213> mouse
<400> 99
Met Glu Ile Gly Val Ser Val Ala Glu Cys Lys Ser Val Pro Gly Val
1 5 10 15
Thr Ser Thr Pro His Ser Lys Asp His Ser Ser Pro Phe Tyr Ser Pro
20 25 30
Ser His Asn Gly Leu Leu Ala Asp His His Glu Ser Leu Asp Asn Asp
35 40 45
Val Ala Arg Glu Ile Gln Tyr Leu Asp Glu Val Leu Glu Ala Asn Cys
50 55 60
Cys Asp Ser Ser Val Asp Gly Thr Tyr Asn Gly Ile Ser Ser Pro Glu
65 70 75 80
Pro Gly Ala Ala Ile Leu Val Ser Ser Leu Gly Ser Pro Ala His Ser
85 90 95
Val Thr Glu Ala Glu Pro Thr Glu Lys Ala Ser Gly Arg Gln Val Pro
100 105 110
Pro His Ile Glu Leu Ser Arg Ile Pro Ser Asp Arg Met Ala Glu Gly
115 120 125
Glu Arg Ala Asn Gly His Ser Thr Asp Gln Pro Gln Asp Leu Leu Gly
130 135 140
Asn Ser Leu Gln Ala Pro Ala Ser Pro Ser Ser Ser Thr Ser Ser His
145 150 155 160
Cys Ser Ser Arg Asp Gly Glu Phe Thr Leu Thr Thr Leu Lys Lys Glu
165 170 175
Ala Lys Phe Glu Leu Arg Ala Phe His Glu Asp Lys Lys Pro Ser Lys
180 185 190
Leu Phe Glu Glu Asp Glu Arg Glu Lys Glu Gln Phe Cys Val Arg Lys
195 200 205
Val Arg Pro Ser Glu Glu Met Ile Glu Leu Glu Lys Glu Arg Arg Glu
210 215 220
Leu Ile Arg Ser Gln Ala Val Lys Lys Asn Pro Gly Ile Ala Ala Lys
225 230 235 240
Trp Trp Asn Pro Pro Gln Glu Lys Thr Ile Glu Glu Gln Leu Asp Glu
245 250 255
Glu His Leu Glu Ser His Arg Arg Tyr Lys Glu Arg Lys Glu Lys Arg
260 265 270
Ala Gln Gln Glu Gln Leu Gln Leu Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Leu
275 280 285
Gln Gln Gln Gln Leu Gln Gln Gln Gln Leu Gln Gln Gln Gln Leu Gln
290 295 300
Gln Gln Leu Gln Gln Gln Gln Leu Ser Thr Ser Gln Pro Cys Thr Ala
305 310 315 320
Pro Ala Ala His Lys His Leu Asp Gly Ile Glu His Thr Lys Glu Asp
325 330 335
Val Val Thr Glu Gln Ile Asp Phe Ser Ala Ala Arg Lys Gln Phe Gln
340 345 350
Leu Met Glu Asn Ser Arg Gln Thr Leu Ala Lys Gly Gln Ser Thr Pro
355 360 365
Arg Leu Phe Ser Ile Lys Pro Tyr Tyr Lys Pro Leu Gly Ser Ile His
370 375 380
Ser Asp Lys Pro Pro Thr Ile Leu Arg Pro Ala Thr Val Gly Gly Thr
385 390 395 400
Leu Glu Asp Gly Gly Thr Gln Ala Ala Lys Glu Gln Lys Ala Pro Cys
405 410 415
Val Ser Glu Ser Gln Ser Ala Gly Ala Gly Pro Ala Asn Ala Ala Thr
420 425 430
Gln Gly Lys Glu Gly Pro Tyr Ser Glu Pro Ser Lys Arg Gly Pro Leu
435 440 445
Ser Lys Leu Trp Ala Glu Asp Gly Glu Phe Thr Ser Ala Arg Ala Val
450 455 460
Leu Thr Val Val Lys Asp Glu Asp His Gly Ile Leu Asp Gln Phe Ser
465 470 475 480
Arg Ser Val Asn Val Ser Leu Thr Gln Glu Glu Leu Asp Ser Gly Leu
485 490 495
Asp Glu Leu Ser Val Arg Ser Gln Asp Thr Thr Val Leu Glu Thr Leu
500 505 510
Ser Asn Asp Phe Ser Met Asp Asn Ile Ser Asp Ser Gly Ala Ser Asn
515 520 525
Glu Thr Thr Ser Ala Leu Gln Glu Asn Ser Leu Ala Asp Phe Ser Leu
530 535 540
Pro Gln Thr Pro Gln Thr Asp Asn Pro Ser Glu Gly Arg Glu Gly Val
545 550 555 560
Ser Lys Ser Phe Ser Asp His Gly Phe Tyr Ser Pro Ser Ser Thr Leu
565 570 575
Gly Asp Ser Pro Ser Val Asp Asp Pro Leu Glu Tyr Gln Ala Gly Leu
580 585 590
Leu Val Gln Asn Ala Ile Gln Gln Ala Ile Ala Glu Gln Val Asp Lys
595 600 605
Ala Glu Ala His Thr Ser Lys Glu Gly Ser Glu Gln Gln Glu Pro Glu
610 615 620
Ala Thr Val Glu Glu Ala Gly Ser Gln Thr Pro Gly Ser Glu Lys Pro
625 630 635 640
Gln Gly Met Phe Ala Pro Pro Gln Val Ser Ser Pro Val Gln Glu Lys
645 650 655
Arg Asp Ile Leu Pro Lys Asn Leu Pro Ala Glu Asp Arg Ala Leu Arg
660 665 670
Glu Lys Gly Pro Ser Gln Pro Pro Thr Ala Ala Gln Pro Ser Gly Pro
675 680 685
Val Asn Met Glu Glu Thr Arg Pro Glu Gly Gly Tyr Phe Ser Lys Tyr
690 695 700
Ser Glu Ala Ala Glu Leu Arg Ser Thr Ala Ser Leu Leu Ala Thr Gln
705 710 715 720
Glu Ser Asp Val Met Val Gly Pro Phe Lys Leu Arg Ser Arg Lys Gln
725 730 735
Arg Thr Leu Ser Met Ile Glu Glu Glu Ile Arg Ala Ala Gln Glu Arg
740 745 750
Glu Glu Glu Leu Lys Arg Gln Arg Gln Val Arg Gln Ser Thr Pro Ser
755 760 765
Pro Arg Ala Lys Asn Ala Pro Ser Leu Pro Ser Arg Thr Thr Cys Tyr
770 775 780
Lys Thr Ala Pro Gly Lys Ile Glu Lys Val Lys Pro Pro Pro Ser Pro
785 790 795 800
Thr Thr Glu Gly Pro Ser Leu Gln Pro Asp Leu Ala Pro Glu Glu Ala
805 810 815
Ala Gly Thr Gln Arg Pro Lys Asn Leu Met Gln Thr Leu Met Glu Asp
820 825 830
Tyr Glu Thr His Lys Ser Lys Arg Arg Glu Arg Met Asp Asp Ser Ser
835 840 845
Tyr Thr Ser Lys Leu Leu Ser Cys Lys Val Thr Ser Glu Val Leu Glu
850 855 860
Ala Thr Arg Val Asn Arg Arg Lys Ser Ala Ser Gly Leu Ala Leu Gly
865 870 875 880
Gly Arg Asp Leu Arg
885
<210> 100
<211> 3911
<212> PRT
<213> human
<400> 100
Met Glu Asp Glu Glu Arg Gln Lys Lys Leu Glu Ala Gly Lys Ala Lys
1 5 10 15
Ile Glu Glu Leu Ser Leu Ala Phe Leu Val Arg Gln Leu Ala Gln Phe
20 25 30
Arg Gln Arg Lys Ala Gln Ser Asp Gly Gln Ser Pro Ser Lys Lys Gln
35 40 45
Lys Lys Lys Arg Lys Thr Ser Ser Ser Lys His Asp Val Ser Ala His
50 55 60
His Asp Leu Asn Ile Asp Gln Ser Gln Cys Asn Glu Met Tyr Ile Asn
65 70 75 80
Ser Ser Gln Arg Val Glu Ser Thr Val Ile Pro Glu Ser Thr Ile Met
85 90 95
Arg Thr Leu His Ser Gly Glu Ile Thr Ser His Glu Gln Gly Phe Ser
100 105 110
Val Glu Leu Glu Ser Glu Ile Ser Thr Thr Ala Asp Asp Cys Ser Ser
115 120 125
Glu Val Asn Gly Cys Ser Phe Val Met Arg Thr Gly Lys Pro Thr Asn
130 135 140
Leu Leu Arg Glu Glu Glu Phe Gly Val Asp Asp Ser Tyr Ser Glu Gln
145 150 155 160
Gly Ala Gln Asp Ser Pro Thr His Leu Glu Met Met Glu Ser Glu Leu
165 170 175
Ala Gly Lys Gln His Glu Ile Glu Glu Leu Asn Arg Glu Leu Glu Glu
180 185 190
Met Arg Val Thr Tyr Gly Thr Glu Gly Leu Gln Gln Leu Gln Glu Phe
195 200 205
Glu Ala Ala Ile Lys Gln Arg Asp Gly Ile Ile Thr Gln Leu Thr Ala
210 215 220
Asn Leu Gln Gln Ala Arg Arg Glu Lys Asp Glu Thr Met Arg Glu Phe
225 230 235 240
Leu Glu Leu Thr Glu Gln Ser Gln Lys Leu Gln Ile Gln Phe Gln Gln
245 250 255
Leu Gln Ala Ser Glu Thr Leu Arg Asn Ser Thr His Ser Ser Thr Ala
260 265 270
Ala Asp Leu Leu Gln Ala Lys Gln Gln Ile Leu Thr His Gln Gln Gln
275 280 285
Leu Glu Glu Gln Asp His Leu Leu Glu Asp Tyr Gln Lys Lys Lys Glu
290 295 300
Asp Phe Thr Met Gln Ile Ser Phe Leu Gln Glu Lys Ile Lys Val Tyr
305 310 315 320
Glu Met Glu Gln Asp Lys Lys Val Glu Asn Ser Asn Lys Glu Glu Ile
325 330 335
Gln Glu Lys Glu Thr Ile Ile Glu Glu Leu Asn Thr Lys Ile Ile Glu
340 345 350
Glu Glu Lys Lys Thr Leu Glu Leu Lys Asp Lys Leu Thr Thr Ala Asp
355 360 365
Lys Leu Leu Gly Glu Leu Gln Glu Gln Ile Val Gln Lys Asn Gln Glu
370 375 380
Ile Lys Asn Met Lys Leu Glu Leu Thr Asn Ser Lys Gln Lys Glu Arg
385 390 395 400
Gln Ser Ser Glu Glu Ile Lys Gln Leu Met Gly Thr Val Glu Glu Leu
405 410 415
Gln Lys Arg Asn His Lys Asp Ser Gln Phe Glu Thr Asp Ile Val Gln
420 425 430
Arg Met Glu Gln Glu Thr Gln Arg Lys Leu Glu Gln Leu Arg Ala Glu
435 440 445
Leu Asp Glu Met Tyr Gly Gln Gln Ile Val Gln Met Lys Gln Glu Leu
450 455 460
Ile Arg Gln His Met Ala Gln Met Glu Glu Met Lys Thr Arg His Lys
465 470 475 480
Gly Glu Met Glu Asn Ala Leu Arg Ser Tyr Ser Asn Ile Thr Val Asn
485 490 495
Glu Asp Gln Ile Lys Leu Met Asn Val Ala Ile Asn Glu Leu Asn Ile
500 505 510
Lys Leu Gln Asp Thr Asn Ser Gln Lys Glu Lys Leu Lys Glu Glu Leu
515 520 525
Gly Leu Ile Leu Glu Glu Lys Cys Ala Leu Gln Arg Gln Leu Glu Asp
530 535 540
Leu Val Glu Glu Leu Ser Phe Ser Arg Glu Gln Ile Gln Arg Ala Arg
545 550 555 560
Gln Thr Ile Ala Glu Gln Glu Ser Lys Leu Asn Glu Ala His Lys Ser
565 570 575
Leu Ser Thr Val Glu Asp Leu Lys Ala Glu Ile Val Ser Ala Ser Glu
580 585 590
Ser Arg Lys Glu Leu Glu Leu Lys His Glu Ala Glu Val Thr Asn Tyr
595 600 605
Lys Ile Lys Leu Glu Met Leu Glu Lys Glu Lys Asn Ala Val Leu Asp
610 615 620
Arg Met Ala Glu Ser Gln Glu Ala Glu Leu Glu Arg Leu Arg Thr Gln
625 630 635 640
Leu Leu Phe Ser His Glu Glu Glu Leu Ser Lys Leu Lys Glu Asp Leu
645 650 655
Glu Ile Glu His Arg Ile Asn Ile Glu Lys Leu Lys Asp Asn Leu Gly
660 665 670
Ile His Tyr Lys Gln Gln Ile Asp Gly Leu Gln Asn Glu Met Ser Gln
675 680 685
Lys Ile Glu Thr Met Gln Phe Glu Lys Asp Asn Leu Ile Thr Lys Gln
690 695 700
Asn Gln Leu Ile Leu Glu Ile Ser Lys Leu Lys Asp Leu Gln Gln Ser
705 710 715 720
Leu Val Asn Ser Lys Ser Glu Glu Met Thr Leu Gln Ile Asn Glu Leu
725 730 735
Gln Lys Glu Ile Glu Ile Leu Arg Gln Glu Glu Lys Glu Lys Gly Thr
740 745 750
Leu Glu Gln Glu Val Gln Glu Leu Gln Leu Lys Thr Glu Leu Leu Glu
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Lys Gln Met Lys Glu Lys Glu Asn Asp Leu Gln Glu Lys Phe Ala Gln
770 775 780
Leu Glu Ala Glu Asn Ser Ile Leu Lys Asp Glu Lys Lys Thr Leu Glu
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Asp Met Leu Lys Ile His Thr Pro Val Ser Gln Glu Glu Arg Leu Ile
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Phe Leu Asp Ser Ile Lys Ser Lys Ser Lys Asp Ser Val Trp Glu Lys
820 825 830
Glu Ile Glu Ile Leu Ile Glu Glu Asn Glu Asp Leu Lys Gln Gln Cys
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850 855 860
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885 890 895
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Val Val Glu Lys Asp Thr Thr Glu Leu Met Glu Lys Leu Glu Val Thr
945 950 955 960
Lys Arg Glu Lys Leu Glu Leu Ser Gln Arg Leu Ser Asp Leu Ser Glu
965 970 975
Gln Leu Lys Gln Lys His Gly Glu Ile Ser Phe Leu Asn Glu Glu Val
980 985 990
Lys Ser Leu Lys Gln Glu Lys Glu Gln Val Ser Leu Arg Cys Arg Glu
995 1000 1005
Leu Glu Ile Ile Ile Asn His Asn Arg Ala Glu Asn Val Gln Ser
1010 1015 1020
Cys Asp Thr Gln Val Ser Ser Leu Leu Asp Gly Val Val Thr Met
1025 1030 1035
Thr Ser Arg Gly Ala Glu Gly Ser Val Ser Lys Val Asn Lys Ser
1040 1045 1050
Phe Gly Glu Glu Ser Lys Ile Met Val Glu Asp Lys Val Ser Phe
1055 1060 1065
Glu Asn Met Thr Val Gly Glu Glu Ser Lys Gln Glu Gln Leu Ile
1070 1075 1080
Leu Asp His Leu Pro Ser Val Thr Lys Glu Ser Ser Leu Arg Ala
1085 1090 1095
Thr Gln Pro Ser Glu Asn Asp Lys Leu Gln Lys Glu Leu Asn Val
1100 1105 1110
Leu Lys Ser Glu Gln Asn Asp Leu Arg Leu Gln Met Glu Ala Gln
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Arg Ile Cys Leu Ser Leu Val Tyr Ser Thr His Val Asp Gln Val
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Arg Glu Tyr Met Glu Asn Glu Lys Asp Lys Ala Leu Cys Ser Leu
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Lys Glu Glu Leu Ile Phe Ala Gln Glu Glu Lys Ile Lys Glu Leu
1160 1165 1170
Gln Lys Ile His Gln Leu Glu Leu Gln Thr Met Lys Thr Gln Glu
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Thr Gly Asp Glu Gly Lys Pro Leu His Leu Leu Ile Gly Lys Leu
1190 1195 1200
Gln Lys Ala Val Ser Glu Glu Cys Ser Tyr Phe Leu Gln Thr Leu
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Cys Ser Val Leu Gly Glu Tyr Tyr Thr Pro Ala Leu Lys Cys Glu
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Val Asn Ala Glu Asp Lys Glu Asn Ser Gly Asp Tyr Ile Ser Glu
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1250 1255 1260
Phe Gln Glu Asn Met His Thr Leu Leu Asn Lys Val Thr Glu Glu
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Leu Pro Lys Glu Glu Thr Glu Phe Leu Ser Ile His Ser Gln Met
1310 1315 1320
Thr Asn Leu Glu Asp Ile Asp Val Asn His Lys Ser Lys Leu Ser
1325 1330 1335
Ser Leu Gln Asp Leu Glu Lys Thr Lys Leu Glu Glu Gln Val Gln
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Glu Leu Glu Ser Leu Ile Ser Ser Leu Gln Gln Gln Leu Lys Glu
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Thr Glu Gln Asn Tyr Glu Ala Glu Ile His Cys Leu Gln Lys Arg
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Ser Gly Glu Phe Gly Val Lys Glu Glu Thr Asn Ile Val Lys Leu
1430 1435 1440
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Val Ile Val Ser Met Ser Ile Ala Phe Ala Gln Gln Thr Glu Leu
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Ser Arg Ile Ser Gly Gly Lys Glu Asn Thr Ala Ser Ser Lys Gln
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1550 1555 1560
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1640 1645 1650
Ser Ile Asp Asn Glu Asn Leu Val Ser Glu Arg Glu Arg Val Leu
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Glu Lys Leu Cys Cys Glu Leu Arg Asn Ser Ser Thr Gln Thr Gln
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Tyr Ala Asp Glu Lys Thr Leu Phe Glu Arg Gln Ile Gln Glu Lys
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Thr Asp Ile Ile Asp Arg Leu Glu Gln Glu Leu Leu Cys Ala Ser
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1985 1990 1995
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2000 2005 2010
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2015 2020 2025
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2030 2035 2040
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2450 2455 2460
Asn Val Ala Ile Asp His Leu Ser Lys Asp Lys Pro Glu Leu Glu
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2570 2575 2580
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2585 2590 2595
Gln Asn Leu Asn Gln Leu Arg Glu Asp Glu Leu Gly Ser Asp Ile
2600 2605 2610
Ser Ala Leu Thr Leu Arg Ile Ser Glu Leu Glu Ser Gln Val Val
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Glu Leu Phe His Ser Asn Glu Glu Ser Gly Phe Phe Asn Glu Leu
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Ser Tyr Lys Glu Lys Ala Glu Lys Leu Gln Glu Glu Leu Leu Val
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Lys Ile Glu Lys Met Gln Glu Leu His Ala Ala Glu Ile Leu Asp
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Lys Ala Val Ile Gln Cys Leu Arg Ser Lys Glu Val Phe Gly Phe
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3050 3055 3060
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3080 3085 3090
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Leu Lys Glu Leu Gln Lys Gln Leu Glu Glu Lys His Ser Arg Ile
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Ala Leu Gln Arg Arg Leu Gly Thr Ile Gln Ser Gly Ser Thr Thr
3890 3895 3900
Gln Phe His Ala Gly Met Arg Arg
3905 3910
<210> 101
<211> 1087
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 101
Arg Glu Lys Leu Glu Val Gln Cys Gln Ala Glu Lys Val Arg Asp Asp
1 5 10 15
Leu Gln Lys Gln Val Lys Ala Leu Glu Ile Asp Val Glu Glu Gln Val
20 25 30
Cys Arg Phe Ile Glu Leu Glu Gln Glu Lys Asn Ala Glu Leu Met Asp
35 40 45
Leu Arg Gln Gln Asn Gln Ala Leu Glu Lys Gln Leu Glu Lys Met Arg
50 55 60
Lys Met Asp Leu Arg Gln Gln Asn Gln Ala Leu Glu Lys Gln Leu Glu
65 70 75 80
Lys Met Arg Lys Phe Leu Asp Glu Gln Ala Ile Asp Arg Glu His Glu
85 90 95
Arg Asp Val Phe Gln Gln Glu Ile Gln Lys Leu Glu Gln Gln Leu Lys
100 105 110
Leu Val Pro Arg Phe Gln Pro Ile Ser Glu His Gln Thr Arg Glu Val
115 120 125
Glu Gln Leu Thr Asn His Leu Lys Glu Lys Thr Asp Lys Cys Ser Glu
130 135 140
Leu Leu Leu Ser Lys Glu Gln Leu Gln Arg Asp Val Gln Glu Arg Asn
145 150 155 160
Glu Glu Ile Glu Lys Leu Glu Cys Arg Val Arg Glu Leu Glu Gln Ala
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Leu Leu Ser Val Gln Thr Leu Ser Lys Arg Trp Arg Thr Arg Asn Ser
180 185 190
Phe Gly Ala Val Glu Pro Lys Ala Glu Leu Cys Leu Glu Val Gln Leu
195 200 205
Gln Ala Glu Arg Asp Ala Ile Asp Arg Lys Glu Lys Glu Ile Thr Asn
210 215 220
Leu Glu Glu Gln Leu Glu Gln Phe Arg Glu Glu Leu Glu Asn Lys Asn
225 230 235 240
Glu Glu Val Gln Gln Leu His Met Gln Leu Glu Ile Gln Lys Lys Glu
245 250 255
Ser Thr Thr Arg Leu Gln Glu Leu Glu Gln Glu Asn Lys Leu Phe Lys
260 265 270
Asp Glu Met Glu Lys Leu Gly Phe Ala Ile Lys Glu Ser Asp Ala Val
275 280 285
Ser Pro Gln Asp Gln Gln Val Leu Phe Gly Lys Phe Ala Gln Ile Ile
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His Glu Lys Glu Val Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Gln Ile Ile Lys
305 310 315 320
Leu Gln Gln Gln Leu Lys Ile Thr Thr Asp Asn Lys Val Ile Glu Glu
325 330 335
Lys Asn Glu Leu Ile Arg Asp Leu Glu Ala Gln Ile Glu Cys Leu Met
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Ser Asp Gln Glu Arg Val Arg Lys Asn Arg Glu Glu Glu Ile Glu Gln
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Leu Asn Glu Val Ile Glu Lys Leu Gln Gln Glu Leu Ala Asn Ile Asp
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Ile Ser Phe Leu Glu Asn Asn Leu Glu Gln Leu Thr Lys Val His Lys
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Glu Lys Arg Leu Arg Ala Thr Ala Glu Arg Val Lys Ala Leu Glu Ser
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<213> Caenorhabditis elegans
<400> 107
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<212> PRT
<213> Drosophila melanogaster
<400> 108
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<210> 109
<211> 963
<212> PRT
<213> human
<400> 109
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<212> PRT
<213> Loligo pealei
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Gln Ile Asp Arg Arg Glu Gln Ala Lys Gln Asp Leu Lys Gly Leu Glu
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<211> 963
<212> PRT
<213> human
<400> 111
Met Ala Asp Pro Ala Glu Cys Asn Ile Lys Val Met Cys Arg Phe Arg
1 5 10 15
Pro Leu Asn Glu Ser Glu Val Asn Arg Gly Asp Lys Tyr Val Ala Lys
20 25 30
Phe Gln Gly Glu Asp Thr Val Val Ile Ala Ser Lys Pro Tyr Ala Phe
35 40 45
Asp Arg Val Phe Gln Ser Ser Thr Ser Gln Glu Gln Val Tyr Asn Asp
50 55 60
Cys Ala Lys Lys Ile Val Lys Asp Val Leu Glu Gly Tyr Asn Gly Thr
65 70 75 80
Ile Phe Ala Tyr Gly Gln Thr Ser Ser Gly Lys Thr His Thr Met Glu
85 90 95
Gly Lys Leu His Asp Pro Glu Gly Met Gly Ile Ile Pro Arg Ile Val
100 105 110
Gln Asp Ile Phe Asn Tyr Ile Tyr Ser Met Asp Glu Asn Leu Glu Phe
115 120 125
His Ile Lys Val Ser Tyr Phe Glu Ile Tyr Leu Asp Lys Ile Arg Asp
130 135 140
Leu Leu Asp Val Ser Lys Thr Asn Leu Ser Val His Glu Asp Lys Asn
145 150 155 160
Arg Val Pro Tyr Val Lys Gly Cys Thr Glu Arg Phe Val Cys Ser Pro
165 170 175
Asp Glu Val Met Asp Thr Ile Asp Glu Gly Lys Ser Asn Arg His Val
180 185 190
Ala Val Thr Asn Met Asn Glu His Ser Ser Arg Ser His Ser Ile Phe
195 200 205
Leu Ile Asn Val Lys Gln Glu Asn Thr Gln Thr Glu Gln Lys Leu Ser
210 215 220
Gly Lys Leu Tyr Leu Val Asp Leu Ala Gly Ser Glu Lys Val Ser Lys
225 230 235 240
Thr Gly Ala Glu Gly Ala Val Leu Asp Glu Ala Lys Asn Ile Asn Lys
245 250 255
Ser Leu Ser Ala Leu Gly Asn Val Ile Ser Ala Leu Ala Glu Gly Ser
260 265 270
Thr Tyr Val Pro Tyr Arg Asp Ser Lys Met Thr Arg Ile Leu Gln Asp
275 280 285
Ser Leu Gly Gly Asn Cys Arg Thr Thr Ile Val Ile Cys Cys Ser Pro
290 295 300
Ser Ser Tyr Asn Glu Ser Glu Thr Lys Ser Thr Leu Leu Phe Gly Gln
305 310 315 320
Arg Ala Lys Thr Ile Lys Asn Thr Val Cys Val Asn Val Glu Leu Thr
325 330 335
Ala Glu Gln Trp Lys Lys Lys Tyr Glu Lys Glu Lys Glu Lys Asn Lys
340 345 350
Thr Leu Arg Asn Thr Ile Gln Trp Leu Glu Asn Glu Leu Asn Arg Trp
355 360 365
Arg Asn Gly Glu Thr Val Pro Ile Asp Glu Gln Phe Asp Lys Glu Lys
370 375 380
Ala Asn Leu Glu Ala Phe Thr Ala Asp Lys Asp Ile Ala Ile Thr Ser
385 390 395 400
Asp Lys Gly Ala Ala Ala Val Gly Met Ala Gly Ser Phe Thr Asp Ala
405 410 415
Glu Arg Arg Lys Cys Glu Glu Glu Leu Ala Lys Leu Tyr Lys Gln Leu
420 425 430
Asp Asp Lys Asp Glu Glu Ile Asn Gln Gln Ser Gln Leu Val Glu Lys
435 440 445
Leu Lys Thr Gln Met Leu Asp Gln Glu Glu Leu Leu Ala Ser Thr Arg
450 455 460
Arg Asp Gln Asp Asn Met Gln Ala Glu Leu Asn Arg Leu Gln Ala Glu
465 470 475 480
Asn Asp Ala Ser Lys Glu Glu Val Lys Glu Val Leu Gln Ala Leu Glu
485 490 495
Glu Leu Ala Val Asn Tyr Asp Gln Lys Ser Gln Glu Val Glu Asp Lys
500 505 510
Thr Lys Glu Tyr Glu Leu Leu Thr Asp Glu Phe Asn Gln Lys Ser Ala
515 520 525
Thr Leu Ala Ser Ile Asp Ala Glu Leu Gln Lys Leu Lys Glu Met Thr
530 535 540
Asn His Gln Lys Lys Arg Ala Ala Glu Met Met Ala Ser Leu Leu Lys
545 550 555 560
Asp Leu Ala Glu Ile Gly Ile Ala Val Gly Asn Asn Asp Val Lys Gln
565 570 575
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580 585 590
Tyr Ile Ser Lys Met Lys Ser Glu Val Lys Thr Met Val Lys Arg Cys
595 600 605
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610 615 620
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625 630 635 640
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645 650 655
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675 680 685
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705 710 715 720
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725 730 735
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740 745 750
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755 760 765
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770 775 780
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785 790 795 800
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805 810 815
Val Asp Ser Asp Asp Thr Gly Gly Ser Ala Ala Gln Lys Gln Lys Ile
820 825 830
Ser Phe Leu Glu Asn Asn Leu Glu Gln Leu Thr Lys Val His Lys Gln
835 840 845
Leu Val Arg Asp Asn Ala Asp Leu Arg Cys Glu Leu Pro Lys Leu Glu
850 855 860
Phe Arg Leu Arg Ala Thr Ala Glu Arg Val Lys Ala Leu Glu Ser Ala
865 870 875 880
Leu Lys Glu Ala Lys Glu Asn Ala Ser Arg Asp Arg Lys Arg Tyr Gln
885 890 895
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900 905 910
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915 920 925
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930 935 940
Ser Phe Val Gln Asn Asn Gln Pro Val Gly Leu Arg Gly Gly Gly Gly
945 950 955 960
Lys Gln Ser
<210> 112
<211> 928
<212> PRT
<213> Neurospora crassa
<400> 112
Met Ser Ser Ser Ala Asn Ser Ile Lys Val Val Ala Arg Phe Arg Pro
1 5 10 15
Gln Asn Arg Val Glu Ile Glu Ser Gly Gly Gln Pro Ile Val Thr Phe
20 25 30
Gln Gly Pro Asp Thr Cys Thr Val Asp Ser Lys Glu Ala Gln Gly Ser
35 40 45
Phe Thr Phe Asp Arg Val Phe Asp Met Ser Cys Lys Gln Ser Asp Ile
50 55 60
Phe Asp Phe Ser Ile Lys Pro Thr Val Asp Asp Ile Leu Asn Gly Tyr
65 70 75 80
Asn Gly Thr Val Phe Ala Tyr Gly Gln Thr Gly Ala Gly Lys Ser Tyr
85 90 95
Thr Met Met Gly Thr Ser Ile Asp Asp Pro Asp Gly Arg Gly Val Ile
100 105 110
Pro Arg Ile Val Glu Gln Ile Phe Thr Ser Ile Leu Ser Ser Ala Ala
115 120 125
Asn Ile Glu Tyr Thr Val Arg Val Ser Tyr Met Glu Ile Tyr Met Glu
130 135 140
Arg Ile Arg Asp Leu Leu Ala Pro Gln Asn Asp Asn Leu Pro Val His
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210 215 220
Ser Ala Lys Ser Gly Gln Leu Phe Leu Val Asp Leu Ala Gly Ser Glu
225 230 235 240
Lys Val Gly Lys Thr Gly Ala Ser Gly Gln Thr Leu Glu Glu Ala Lys
245 250 255
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260 265 270
Thr Asp Gly Lys Ser Ser His Val Pro Tyr Arg Asp Ser Lys Leu Thr
275 280 285
Arg Ile Leu Gln Glu Ser Leu Gly Gly Asn Ser Arg Thr Thr Leu Ile
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305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
Thr Ser Ala Val Leu Asp Glu Lys Glu Lys Lys Lys Ala Glu Lys Met
545 550 555 560
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580 585 590
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595 600 605
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675 680 685
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835 840 845
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850 855 860
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865 870 875 880
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885 890 895
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900 905 910
Gln Asn Pro Pro Glu Asn Lys Arg Ser Ser Trp Phe Phe Gln Lys Ser
915 920 925
<210> 113
<211> 1031
<212> PRT
<213> Strongylocentrotus purpuratus
<400> 113
Met Ala Asp Pro Ala Glu Cys Asn Ile Lys Val Val Cys Arg Val Arg
1 5 10 15
Pro Met Asn Ala Thr Glu Gln Asn Thr Ser His Ile Cys Thr Lys Phe
20 25 30
Ile Ser Glu Glu Gln Val Gln Ile Gly Gly Lys Leu Asn Met Phe Asp
35 40 45
Arg Ile Phe Lys Pro Asn Thr Thr Gln Glu Glu Val Tyr Asn Lys Ala
50 55 60
Ala Arg Gln Ile Val Lys Asp Val Leu Asp Gly Tyr Asn Gly Thr Ile
65 70 75 80
Phe Ala Tyr Gly Gln Thr Ser Ser Gly Lys Thr Phe Thr Met Glu Gly
85 90 95
Val Met Gly Asn Pro Gln Tyr Met Gly Ile Ile Pro Arg Ile Val Gln
100 105 110
Asp Ile Phe Asn His Ile Tyr Gln Met Asp Glu Ser Leu Glu Phe His
115 120 125
Ile Lys Val Ser Tyr Phe Glu Ile Tyr Met Asp Arg Ile Arg Asp Leu
130 135 140
Leu Asp Val Ser Lys Thr Asn Leu Ser Val His Glu Asp Lys Asn Arg
145 150 155 160
Val Pro Phe Val Lys Gly Ala Thr Glu Arg Phe Ala Ser Ser Pro Glu
165 170 175
Glu Val Met Asp Val Ile Glu Glu Gly Lys Ser Asn Arg His Ile Ala
180 185 190
Val Thr Asn Met Asn Glu His Ser Ser Arg Ser His Ser Ile Phe Leu
195 200 205
Ile Gln Val Lys Gln Glu Asn Met Glu Thr Lys Lys Lys Leu Ser Gly
210 215 220
Lys Leu Tyr Leu Val Asp Leu Ala Gly Ser Glu Lys Val Ser Lys Thr
225 230 235 240
Gly Ala Glu Gly Thr Val Leu Asp Glu Ala Lys Asn Ile Asn Lys Ser
245 250 255
Leu Ser Ala Leu Gly Asn Val Ile Ser Ala Leu Ala Asp Gly Lys Lys
260 265 270
Ser His Ile Pro Tyr Arg Asp Ser Lys Met Thr Arg Ile Leu Gln Glu
275 280 285
Ser Leu Gly Gly Asn Ala Arg Thr Thr Ile Val Ile Cys Cys Ser Pro
290 295 300
Ser Ser Phe Asn Glu Ser Glu Ser Lys Ser Thr Leu Met Phe Gly Gln
305 310 315 320
Arg Ala Lys Thr Ile Lys Asn Thr Val Thr Val Asn Met Glu Leu Thr
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
Arg Ala Gly Glu Ser Val Pro Val Lys Glu Gln Gly Asn Lys Asn Asp
370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
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625 630 635 640
Arg Glu Thr Glu Gly Lys Lys Arg His Leu Glu Asp Ser Leu Asp Met
645 650 655
Leu Asn Glu Glu Ile Val Lys Leu Arg Ala Ala Glu Glu Ile Arg Leu
660 665 670
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675 680 685
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725 730 735
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740 745 750
Glu Ala Glu Lys Ala Ala Lys Leu Arg Glu Leu Ser Gln Gln Phe Asp
755 760 765
Arg Arg Glu Gln Ala Lys Gln Asp Leu Lys Gly Leu Glu Glu Thr Val
770 775 780
Ala Lys Glu Leu Gln Thr Leu His Asn Leu Arg Lys Leu Phe Val Ser
785 790 795 800
Asp Leu Gln Asn Arg Val Lys Lys Ala Leu Glu Gly Gly Asp Arg Asp
805 810 815
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820 825 830
Glu Asn Asn Leu Glu Gln Leu Thr Lys Val His Lys Gln Leu Val Arg
835 840 845
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850 855 860
Arg Ala Thr Ser Glu Arg Val Lys Ala Leu Glu Met Ser Leu Lys Glu
865 870 875 880
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885 890 895
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900 905 910
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980 985 990
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Ala Arg Ser Lys Ala Arg Asn Asn Thr Pro Gly Lys Ala Pro Leu
1010 1015 1020
Thr Thr Ser Gly Glu Gln Gly Ser
1025 1030
<210> 114
<211> 935
<212> PRT
<213> Syncephalastrum racemosum
<400> 114
Met Ser Gly Asn Asn Ile Lys Val Val Cys Arg Phe Arg Pro Gln Asn
1 5 10 15
Ser Leu Glu Ile Arg Glu Gly Gly Thr Pro Ile Ile Asp Ile Asp Pro
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Glu Gly Thr Gln Leu Glu Leu Lys Gly Lys Glu Phe Lys Gly Asn Phe
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Gly Thr Val Phe Ala Tyr Gly Gln Thr Gly Ser Gly Lys Thr Phe Thr
85 90 95
Met Met Gly Ala Asp Ile Asp Asp Glu Lys Thr Lys Gly Ile Ile Pro
100 105 110
Arg Ile Val Glu Gln Ile Phe Asp Ser Ile Met Ala Ser Pro Ser Asn
115 120 125
Leu Glu Phe Thr Val Lys Val Ser Tyr Met Glu Ile Tyr Met Glu Lys
130 135 140
Val Arg Asp Leu Leu Asn Pro Ser Ser Glu Asn Leu Pro Ile His Glu
145 150 155 160
Asp Lys Thr Lys Gly Val Tyr Val Lys Gly Leu Leu Glu Val Tyr Val
165 170 175
Gly Ser Thr Asp Glu Val Tyr Glu Val Met Arg Arg Gly Ser Asn Asn
180 185 190
Arg Val Val Ala Tyr Thr Asn Met Asn Ala Glu Ser Ser Arg Ser His
195 200 205
Ser Ile Val Met Phe Thr Ile Thr Gln Lys Asn Val Asp Thr Gly Ala
210 215 220
Ala Lys Ser Gly Lys Leu Tyr Leu Val Asp Leu Ala Gly Ser Glu Lys
225 230 235 240
Val Gly Lys Thr Gly Ala Ser Gly Gln Thr Leu Glu Glu Ala Lys Lys
245 250 255
Ile Asn Lys Ser Leu Thr Ala Leu Gly Met Val Ile Asn Ala Leu Thr
260 265 270
Asp Gly Lys Ser Ser His Val Pro Tyr Arg Asp Ser Lys Leu Thr Arg
275 280 285
Ile Leu Gln Glu Ser Leu Gly Gly Asn Ser Arg Thr Thr Leu Ile Ile
290 295 300
Asn Cys Ser Pro Ser Ser Tyr Asn Glu Ala Glu Thr Leu Ser Thr Leu
305 310 315 320
Arg Phe Gly Ala Arg Ala Lys Ser Ile Lys Asn Lys Ala Lys Val Asn
325 330 335
Ala Asp Leu Ser Pro Ala Glu Leu Lys Ala Leu Leu Lys Lys Val Lys
340 345 350
Ser Glu Ala Val Thr Tyr Gln Thr Tyr Ile Ala Ala Leu Glu Gly Glu
355 360 365
Val Asn Val Trp Arg Thr Gly Gly Thr Val Pro Glu Gly Lys Trp Val
370 375 380
Thr Met Asp Lys Val Ser Lys Gly Asp Phe Ala Gly Leu Pro Pro Ala
385 390 395 400
Pro Gly Phe Lys Ser Pro Val Ser Asp Glu Gly Ser Arg Pro Ala Thr
405 410 415
Pro Val Pro Thr Leu Glu Lys Asp Glu Arg Glu Glu Phe Ile Lys Arg
420 425 430
Glu Asn Glu Leu Met Asp Gln Ile Ser Glu Lys Glu Thr Glu Leu Thr
435 440 445
Asn Arg Glu Lys Leu Leu Glu Ser Leu Arg Glu Glu Met Gly Tyr Tyr
450 455 460
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500 505 510
Leu Met Ala Glu Leu Glu Glu Leu Lys Lys Asn Leu Ser Glu Met Arg
515 520 525
Gln Ala His Lys Asp Ala Thr Asp Ser Asp Lys Glu Lys Arg Lys Ala
530 535 540
Glu Lys Met Ala Gln Met Met Ser Gly Phe Asp Pro Ser Gly Ile Leu
545 550 555 560
Asn Asp Lys Glu Arg Gln Ile Arg Asn Ala Leu Ser Lys Leu Asp Gly
565 570 575
Glu Gln Gln Gln Thr Leu Thr Val Glu Asp Leu Val Ser Leu Arg Arg
580 585 590
Glu Leu Ala Glu Ser Lys Met Leu Val Glu Gln His Thr Lys Thr Ile
595 600 605
Ser Asp Leu Ser Ala Asp Lys Asp Ala Met Glu Ala Lys Lys Ile Glu
610 615 620
Leu Glu Gly Arg Leu Gly Ala Leu Glu Lys Glu Tyr Glu Glu Leu Leu
625 630 635 640
Asp Lys Thr Ile Ala Glu Glu Glu Ala Asn Met Gln Asn Ala Asp Val
645 650 655
Asp Asn Leu Ser Ala Leu Lys Thr Lys Leu Glu Ala Gln Tyr Ala Glu
660 665 670
Lys Lys Glu Val Gln Gln Lys Glu Ile Asp Asp Leu Lys Arg Glu Leu
675 680 685
Asp Arg Lys Gln Ser Gly His Glu Lys Leu Ser Ala Ala Met Thr Asp
690 695 700
Leu Arg Ala Ala Asn Asp Gln Leu Gln Ala Ala Leu Ser Glu Gln Pro
705 710 715 720
Phe Gln Ala Pro Gln Asp Asn Ser Asp Met Thr Glu Lys Glu Lys Asp
725 730 735
Ile Glu Arg Thr Arg Lys Ser Met Ala Gln Gln Leu Ala Asp Phe Glu
740 745 750
Val Met Lys Lys Ala Leu Met Arg Asp Leu Gln Asn Arg Cys Glu Lys
755 760 765
Val Val Glu Leu Glu Met Ser Leu Asp Glu Thr Arg Glu Gln Tyr Asn
770 775 780
Asn Val Leu Arg Ala Ser Asn Asn Lys Ala Gln Gln Lys Lys Met Ala
785 790 795 800
Phe Leu Glu Arg Asn Leu Glu Gln Leu Thr Asn Val Gln Lys Gln Leu
805 810 815
Val Glu Gln Asn Ala Ser Leu Lys Lys Glu Val Ala Leu Ala Glu Arg
820 825 830
Lys Leu Ile Ala Arg Asn Glu Arg Ile Gln Ser Leu Glu Thr Leu Leu
835 840 845
His Asn Ala Gln Asp Lys Leu Leu Asn Gln Asn Lys Lys Phe Glu Gln
850 855 860
Gln Leu Ala Thr Val Arg Glu Arg Leu Glu Gln Ala Arg Ser Gln Lys
865 870 875 880
Ser Gln Asn Ser Leu Ala Ala Leu Asn Phe Ser Arg Ile Ala Lys Pro
885 890 895
Leu Arg Gly Asn Gly Ala Ala Ile Asp Asn Gly Ser Asp Asp Gly Ser
900 905 910
Leu Pro Thr Ser Pro Thr Asp Lys Arg Asp Lys Arg Ser Ser Trp Met
915 920 925
Pro Gly Phe Met Asn Ser Arg
930 935
<210> 115
<211> 1032
<212> PRT
<213> human
<400> 115
Met Ala Glu Thr Asn Asn Glu Cys Ser Ile Lys Val Leu Cys Arg Phe
1 5 10 15
Arg Pro Leu Asn Gln Ala Glu Ile Leu Arg Gly Asp Lys Phe Ile Pro
20 25 30
Ile Phe Gln Gly Asp Asp Ser Val Val Ile Gly Gly Lys Pro Tyr Val
35 40 45
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50 55 60
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Ile Lys Leu Gln Gln Ser Glu Gln Met Val Ala Gln Leu Glu Glu Glu
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Asn Lys His Leu Lys Tyr Met Ala Ser Ile Lys Gln Leu Asp Asp Gly
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Thr Gln Ser Asp Thr Lys Thr Ser Val Asp Val Gly Pro Gln Pro Val
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Thr Asn Glu Thr Leu Gln Glu Leu Gly Phe Gly Pro Glu Asp Glu Glu
165 170 175
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Ala Ala Ser Ala Asn Val Gly Tyr Glu Ile Pro Ala Arg Leu Arg Thr
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Ala Val Pro Leu Cys Lys Gln Ala Leu Glu Asp Leu Glu Lys Thr Ser
225 230 235 240
Gly His Asp His Pro Asp Val Ala Thr Met Leu Asn Ile Leu Ala Leu
245 250 255
Val Tyr Arg Asp Gln Asn Lys Tyr Lys Glu Ala Ala Asn Leu Leu Asn
260 265 270
Glu Ala Leu Ser Ile Arg Glu Lys Cys Leu Gly Glu Ser His Pro Ala
275 280 285
Val Ala Ala Thr Leu Asn Asn Leu Ala Val Leu Phe Gly Lys Arg Gly
290 295 300
Lys Phe Lys Asp Ala Glu Pro Leu Cys Lys Arg Ala Leu Glu Ile Arg
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Glu Lys Val Leu Gly Asp Asp His Pro Asp Val Ala Lys Gln Leu Asn
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515 520 525
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<213> Drosophila melanogaster
<400> 120
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65 70 75 80
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115 120 125
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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<213> Loligo pealei
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<400> 122
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Cys Ala Pro Gly Arg His Asp Cys Ala Gln Val Cys Arg Arg Asn Gly
325 330 335
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340 345 350
Lys Lys Thr Cys Ser Ala Val Asp Val Cys Ala Pro Gly Arg His Asp
355 360 365
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<213> human
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145 150 155 160
Met Ser Gly Leu Ala Ile Gln Thr Ala Met Asp Glu Ala Phe Thr Val
165 170 175
Glu Ala Gly Ala Arg Glu Pro Ser Ser Asn Ile Pro Lys Val Ala Ile
180 185 190
Ile Val Thr Asp Gly Arg Pro Gln Asp Gln Val Asn Glu Val Ala Ala
195 200 205
Arg Ala Gln Ala Ser Gly Ile Glu Leu Tyr Ala Val Gly Val Asp Arg
210 215 220
Ala Asp Met Ala Ser Leu Lys Met Met Ala Ser Glu Pro Leu Glu Glu
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245 250 255
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Cys Val Asn Asp Arg Ser Gly Ser Tyr His Cys Glu Cys Tyr Glu Gly
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Cys Gln His Ile Cys Val Ser Asp Gly Ala Ala Ser Tyr His Cys Asp
405 410 415
Cys Tyr Pro Gly Tyr Thr Leu Asn Glu Asp Lys Lys Thr Cys Ser Ala
420 425 430
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<212> PRT
<213> mouse
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Arg Pro Gln Asp Gln Val Asn Glu Val Ala Ala Arg Ala Arg Ala Ser
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Gly Ile Glu Leu Tyr Ala Val Gly Val Asp Arg Ala Asp Met Glu Ser
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Leu Lys Met Met Ala Ser Lys Pro Leu Glu Glu His Val Phe Tyr Val
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Glu Thr Tyr Gly Val Ile Glu Lys Leu Ser Ala Arg Phe Gln Glu Thr
245 250 255
Phe Cys Ala Leu Asp Gln Cys Met Leu Gly Thr His Gln Cys Gln His
260 265 270
Val Cys Val Ser Asp Gly Asp Gly Lys His His Cys Glu Cys Ser Gln
275 280 285
Gly Tyr Thr Leu Asn Ala Asp Gly Lys Thr Cys Ser Ala Ile Asp Lys
290 295 300
Cys Ala Leu Ser Thr His Gly Cys Glu Gln Ile Cys Ile Asn Asp Arg
305 310 315 320
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325 330 335
Asp Arg Arg Thr Cys Ala Ala Leu Asp Lys Cys Ala Ser Gly Thr His
340 345 350
Gly Cys Gln His Ile Cys Val Asn Asp Gly Ala Gly Ser His His Cys
355 360 365
Glu Cys Phe Glu Gly Tyr Thr Leu Asn Ala Asp Lys Lys Thr Cys Ser
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405 410 415
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420 425 430
Ser Leu Ile Ser Ile Glu Asp Ala Cys Gly Cys Gly Ala Thr Leu Ala
435 440 445
Phe Gln Glu Lys Val Ser Ser His Leu Gln Lys Leu Asn Thr Lys Leu
450 455 460
Asp Asn Ile Leu Lys Lys Leu Lys Val Thr Glu Tyr Gly Gln Val His
465 470 475 480
Arg
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<212> PRT
<213> Drosophila melanogaster
<400> 126
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Ser Ser Ser Phe Ser Ser Ser Pro Pro Ser Ser Ser Val Gly Ser Pro
35 40 45
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Gln Phe Val Pro Ser Leu Arg Asp Cys Asn Asp Asp Ile Lys Gln Asp
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<212> PRT
<213> Gallus gallus
<400> 134
Met Asp Ala Ile Lys Lys Lys Met Gln Met Leu Lys Leu Asp Lys Glu
1 5 10 15
Asn Ala Leu Asp Arg Ala Glu Gln Ala Glu Ala Asp Lys Lys Ala Ala
20 25 30
Glu Glu Arg Ser Lys Gln Leu Glu Asp Glu Leu Val Ala Leu Gln Lys
35 40 45
Lys Leu Lys Gly Thr Glu Asp Glu Leu Asp Lys Tyr Ser Glu Ser Leu
50 55 60
Lys Asp Ala Gln Glu Lys Leu Glu Leu Ala Asp Lys Lys Ala Thr Asp
65 70 75 80
Ala Glu Ser Glu Val Ala Ser Leu Asn Arg Arg Ile Gln Leu Val Glu
85 90 95
Glu Glu Leu Asp Arg Ala Gln Glu Arg Leu Ala Thr Ala Leu Gln Lys
100 105 110
Leu Glu Glu Ala Glu Lys Ala Ala Asp Glu Ser Glu Arg Gly Met Lys
115 120 125
Val Ile Glu Asn Arg Ala Gln Lys Asp Glu Glu Lys Met Glu Ile Gln
130 135 140
Glu Ile Gln Leu Lys Glu Ala Lys His Ile Ala Glu Glu Ala Asp Arg
145 150 155 160
Lys Tyr Glu Glu Val Ala Arg Lys Leu Val Ile Ile Glu Gly Asp Leu
165 170 175
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225 230 235 240
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260 265 270
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275 280
<210> 135
<211> 284
<212> PRT
<213> Brachydanio rerio
<400> 135
Met Asp Ala Ile Lys Lys Lys Met Gln Met Leu Lys Leu Asp Lys Glu
1 5 10 15
Asn Ala Leu Asp Arg Ala Glu Gln Ala Glu Thr Asp Lys Lys Ala Ala
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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195 200 205
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210 215 220
Ile Lys Val Leu Thr Asp Lys Leu Lys Glu Ala Glu Thr Arg Ala Glu
225 230 235 240
Phe Ala Glu Arg Ser Val Ala Lys Leu Glu Lys Thr Ile Asp Asp Leu
245 250 255
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260 265 270
Glu Leu Asp His Ala Leu Asn Asp Met Thr Ser Ile
275 280
<210> 136
<211> 284
<212> PRT
<213> Coturnix coturnix japonica
<400> 136
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1 5 10 15
Asn Ala Leu Asp Arg Ala Glu Gln Ala Glu Ala Asp Lys Lys Ala Ala
20 25 30
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35 40 45
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260 265 270
Glu Leu Asp His Ala Leu Asn Asp Met Thr Ser Ile
275 280
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<211> 284
<212> PRT
<213> mouse
<400> 137
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275 280
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<211> 284
<212> PRT
<213> Rana temporaria
<400> 138
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1 5 10 15
Asn Ala Leu Asp Arg Ala Glu Gln Ala Glu Ala Asp Lys Lys Gly Ala
20 25 30
Glu Asp Lys Ser Lys Gln Leu Glu Asp Glu Leu Val Ala Met Gln Lys
35 40 45
Lys Met Lys Gly Thr Glu Asp Glu Leu Asp Lys Tyr Ser Glu Ala Leu
50 55 60
Lys Asp Ala Gln Glu Lys Leu Glu Leu Ala Glu Lys Lys Ala Thr Asp
65 70 75 80
Ala Glu Ala Asp Val Ala Ser Leu Asn Arg Arg Ile Gln Leu Val Glu
85 90 95
Glu Glu Leu Asp Arg Ala Gln Glu Arg Leu Ala Thr Ala Leu Gln Lys
100 105 110
Leu Glu Glu Ala Glu Lys Ala Ala Asp Glu Ser Glu Arg Gly Met Lys
115 120 125
Val Ile Glu Asn Arg Ala Leu Lys Asp Glu Glu Lys Ile Glu Leu Gln
130 135 140
Glu Ile Gln Leu Lys Glu Ala Lys His Ile Ala Glu Glu Ala Asp Arg
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Lys Tyr Glu Glu Val Ala Arg Lys Leu Val Ile Ile Glu Gly Asp Leu
165 170 175
Glu Arg Ala Glu Glu Arg Ala Glu Leu Ser Glu Ser Lys Cys Ala Glu
180 185 190
Leu Glu Glu Glu Leu Lys Thr Val Thr Asn Asn Leu Lys Ser Leu Glu
195 200 205
Ala Gln Ala Glu Lys Tyr Ser Gln Lys Glu Asp Lys Tyr Glu Glu Glu
210 215 220
Ile Lys Val Leu Thr Asp Lys Leu Lys Glu Ala Glu Thr Arg Ala Glu
225 230 235 240
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275 280
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<211> 284
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 139
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Phe Ala Glu Arg Ser Val Thr Lys Leu Glu Lys Ser Ile Asp Asp Leu
245 250 255
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275 280
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<211> 284
<212> PRT
<213> Xenopus laevis
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<211> 284
<212> PRT
<213> Gallus gallus
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275 280
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<211> 284
<212> PRT
<213> human
<400> 142
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Lys Leu Lys Gly Thr Glu Asp Glu Val Glu Lys Tyr Ser Glu Ser Val
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Lys Glu Ala Gln Glu Lys Leu Glu Gln Ala Glu Lys Lys Ala Thr Asp
65 70 75 80
Ala Glu Ala Asp Val Ala Ser Leu Asn Arg Arg Ile Gln Leu Val Glu
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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165 170 175
Glu Arg Ser Glu Glu Arg Ala Glu Val Ala Glu Ser Lys Cys Gly Asp
180 185 190
Leu Glu Glu Glu Leu Lys Ile Val Thr Asn Asn Leu Lys Ser Leu Glu
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210 215 220
Ile Lys Leu Leu Glu Glu Lys Leu Lys Glu Ala Glu Thr Arg Ala Glu
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275 280
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<211> 284
<212> PRT
<213> mouse
<400> 143
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Leu Glu Glu Ala Glu Lys Ala Ala Asp Glu Ser Glu Arg Gly Met Lys
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Glu Arg Ser Glu Glu Arg Ala Glu Val Ala Glu Ser Lys Cys Gly Asp
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Glu Leu Asp Asn Ala Leu Asn Asp Ile Thr Ser Leu
275 280
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<211> 284
<212> PRT
<213> pig
<400> 144
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<400> 145
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<400> 146
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195 200 205
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210 215 220
Ile Lys Val Leu Thr Asp Lys Leu Lys Glu Ala Glu Thr Arg Ala Glu
225 230 235 240
Phe Ala Glu Arg Ser Val Thr Lys Leu Glu Lys Ser Ile Asp Asp Leu
245 250 255
Glu Glu Lys Val Ala His Ala Lys Glu Glu Asn Leu Asn Met His Gln
260 265 270
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<210> 147
<211> 248
<212> PRT
<213> Xenopus laevis
<400> 147
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Arg Ala Gln Glu Arg Leu Ser Thr Ala Leu Gln Lys Leu Glu Glu Ala
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<213> Gallus gallus
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65 70 75 80
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<213> Coturnix coturnix japonica
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<213> human
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<213> Rattus norvegicus
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Ile
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<213> Rattus norvegicus
<400> 156
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Gly Glu Ser Glu Leu Val Thr Ala Ala Lys Thr Thr Asp Val Glu Gly
835 840 845
Arg Leu Ser Ala Leu Leu Gln Glu Thr Lys Glu Leu Lys Asn Glu Ile
850 855 860
Lys Ala Leu Ser Glu Glu Arg Thr Ala Ile Gln Lys Gln Leu Asp Ser
865 870 875 880
Ser Asn Ser Thr Ile Ala Ile Leu Gln Thr Glu Lys Asp Lys Leu Tyr
885 890 895
Leu Glu Val Thr Asp Ser Lys Lys Glu Gln Asp Asp Leu Leu Val Leu
900 905 910
Leu Ala Asp Gln Asp Gln Lys Ile Leu Ser Leu Lys Ser Lys Leu Lys
915 920 925
Asp Leu Gly His Pro Val Glu Glu Glu Asp Glu Ser Gly Asp Gln Glu
930 935 940
Asp Asp Asp Asp Glu Leu Asp Asp Gly Asp Arg Asp Gln Asp Ile
945 950 955
<210> 157
<211> 1139
<212> PRT
<213> Caenorhabditis elegans
<400> 157
Met Ser Tyr Ser Asn Gly Asn Ile Asn Cys Asp Ile Met Pro Thr Ile
1 5 10 15
Ser Glu Asp Gly Val Asp Asn Gly Gly Pro Ile Asp Glu Pro Ser Asp
20 25 30
Arg Asp Asn Ile Glu Gln Leu Met Met Asn Met Leu Glu Asp Arg Asp
35 40 45
Lys Leu Gln Glu Gln Leu Glu Asn Tyr Lys Val Gln Leu Glu Asn Ala
50 55 60
Gly Leu Arg Thr Lys Glu Val Glu Lys Glu Arg Asp Met Met Lys Arg
65 70 75 80
Gln Phe Glu Val His Thr Gln Asn Leu Pro Gln Glu Leu Gln Thr Met
85 90 95
Thr Arg Glu Leu Cys Leu Leu Lys Glu Gln Leu Leu Glu Lys Asp Glu
100 105 110
Glu Ile Val Glu Leu Lys Ala Glu Arg Asn Asn Thr Arg Leu Leu Leu
115 120 125
Glu His Leu Glu Cys Leu Val Ser Arg His Glu Arg Ser Leu Arg Met
130 135 140
Thr Val Met Lys Arg Gln Ala Gln Asn His Ala Gly Val Ser Ser Glu
145 150 155 160
Val Glu Val Leu Lys Ala Leu Lys Ser Leu Phe Glu His His Lys Ala
165 170 175
Leu Asp Glu Lys Val Arg Glu Arg Leu Arg Val Ala Met Glu Arg Val
180 185 190
Ala Thr Leu Glu Glu Glu Leu Ser Thr Lys Gly Asp Glu Asn Ser Ser
195 200 205
Leu Lys Ala Arg Ile Ala Thr Tyr Ala Ala Glu Ala Glu Glu Ala Met
210 215 220
Ala Ser Asn Ala Pro Ile Asn Gly Ser Ile Ser Ser Glu Ser Ala Asn
225 230 235 240
Arg Leu Ile Glu Met Gln Glu Ala Leu Glu Arg Met Lys Thr Glu Leu
245 250 255
Ala Asn Ser Leu Lys Gln Ser Thr Glu Ile Thr Thr Arg Asn Ala Glu
260 265 270
Leu Glu Asp Gln Leu Thr Glu Asp Ala Arg Glu Lys His Ala Ala Gln
275 280 285
Glu Ser Ile Val Arg Leu Lys Asn Gln Ile Cys Glu Leu Asp Ala Gln
290 295 300
Arg Thr Asp Gln Glu Thr Arg Ile Thr Thr Phe Glu Ser Arg Phe Leu
305 310 315 320
Thr Ala Gln Arg Glu Ser Thr Cys Ile Arg Asp Leu Asn Asp Lys Leu
325 330 335
Glu His Gln Leu Ala Asn Lys Asp Ala Ala Val Arg Leu Asn Glu Glu
340 345 350
Lys Val His Ser Leu Gln Glu Arg Leu Glu Leu Ala Glu Lys Gln Leu
355 360 365
Ala Gln Ser Leu Lys Lys Ala Glu Ser Leu Pro Ser Val Glu Ala Glu
370 375 380
Leu Gln Gln Arg Met Glu Ala Leu Thr Ala Ala Glu Gln Lys Ser Val
385 390 395 400
Ser Ala Glu Glu Arg Ile Gln Arg Leu Asp Arg Asn Ile Gln Glu Leu
405 410 415
Ser Ala Glu Leu Glu Arg Ala Val Gln Arg Glu Arg Met Asn Glu Glu
420 425 430
His Ser Gln Arg Leu Ser Ser Thr Val Asp Lys Leu Leu Ser Glu Ser
435 440 445
Asn Asp Arg Leu Gln Leu His Leu Lys Glu Arg Met Gln Ala Leu Asp
450 455 460
Asp Lys Asn Arg Leu Thr Gln Gln Leu Asp Gly Thr Lys Lys Ile Tyr
465 470 475 480
Asp Gln Ala Glu Arg Ile Lys Asp Arg Leu Gln Arg Asp Asn Glu Ser
485 490 495
Leu Arg Gln Glu Ile Glu Ala Leu Arg Gln Gln Leu Tyr Asn Ala Arg
500 505 510
Thr Ala Gln Phe Gln Ser Arg Met His Ala Ile Pro Phe Thr His Ala
515 520 525
Gln Asn Ile Val Gln Gln Gln Pro Gln Ala Ser Ile Ala Gln Gln Ser
530 535 540
Ala Tyr Gln Met Tyr Lys Gln Gln Pro Ala Gln Gln Tyr Gln Thr Val
545 550 555 560
Gly Met Arg Arg Pro Asn Lys Gly Arg Ile Ser Ala Leu Gln Asp Asp
565 570 575
Pro Asn Lys Val Gln Thr Leu Asn Glu Gln Glu Trp Asp Arg Leu Gln
580 585 590
Gln Ala His Val Leu Ala Asn Val Gln Gln Ala Phe Ser Ser Ser Pro
595 600 605
Ser Leu Ala Asp Val Gly Gln Ser Thr Leu Pro Arg Pro Asn Thr Ala
610 615 620
Val Gln His Gln Gln Asp Asp Met Met Asn Ser Gly Met Gly Met Pro
625 630 635 640
Ser Gly Met Gln Gly Gly Met Gln Gly Gly Met Gly Gly Gly Gln Asp
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Ala Gln Met Leu Ala Ser Met Leu Gln Asp Arg Leu Asp Ala Ile Asn
660 665 670
Thr Glu Ile Arg Leu Ile Gln Gln Glu Lys His His Ala Glu Arg Val
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Ile Ser Thr Arg Ser Ser Pro Arg Ala Ser Pro Gln Leu Asp Asn Met
705 710 715 720
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725 730 735
Arg Tyr Asp Ile Tyr Gly Asn Pro Gln Phe Val Asp Asp Arg Met Val
740 745 750
Arg Asp Leu Asp Tyr Glu Pro Arg Arg Gly Tyr Asn Gln Phe Asp Glu
755 760 765
Met Gln Tyr Glu Arg Asp Arg Met Ser Pro Ala Ser Ser Val Ala Ser
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Ser Thr Asp Gly Val Leu Gly Gly Lys Lys Lys Arg Ser Asn Ser Ser
785 790 795 800
Ser Gly Leu Lys Thr Leu Gly Arg Phe Phe Asn Lys Lys Lys Asn Ser
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Ser Gly Thr Glu Gly Asn Gln Lys Ala Asp Tyr Asp Arg Arg Lys Lys
835 840 845
Lys Lys His Glu Leu Leu Glu Glu Ala Met Lys Ala Arg Thr Pro Phe
850 855 860
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865 870 875 880
Gly Met Pro Ala Trp Tyr Val Ala Ala Cys Arg Ala Asn Val Lys Ser
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Gly Ile Ser Asn Pro Leu His Arg Leu Lys Leu Arg Leu Ala Ile Gln
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Thr Leu Ala Phe Gly Asp Met Asn His Glu Tyr Ile Gly Asn Asp Trp
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<210> 158
<211> 950
<212> PRT
<213> Caenorhabditis elegans
<400> 158
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1 5 10 15
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115 120 125
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165 170 175
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595 600 605
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Gln Val Leu Val His Lys Tyr Pro Thr Gly Ala Gly Asp Asn Ser Ser
930 935 940
Phe Glu Ser Ser Asn Val
945 950
<210> 159
<211> 15
<212> PRT
<213> Human rhinovirus 2
<400> 159
Val Lys Ala Glu Thr Arg Leu Asn Pro Asp Leu Gln Pro Thr Glu
1 5 10 15
Claims (21)
- (a) 적어도 한 개의 결합안된 결합원소로 구성된 나노구조 중간 물질은 상이한 다수의 결합원소로 구성된 어셈블리 단위와 접촉할 수 있는데; 이때,(i)상이한 다수의 결합원소중 어느 것도 자가 또는 다수 결합 원소와는 상호작용하지 않으며;(ii) 나노구조 중개물질의 단일 미결합된 결합원소와 상기 다수 구조의 단일 결합원소는 상보적인 결합 원소이고,이때 어셈블리 단위는 나노구조 중간물질에 비-공유적으로 결합되어, 연속 과정에서 이용할 수 있는 새로운 나노구조 중간물질을 형성하고;(b) 미결합된 어셈블리 단위를 제거하고; 그리고(c) (a)와 (b) 단계를 충분한 횟수만큼 반복하여 나노구조를 만들고, 이때 적어도 1회 과정에서 어셈블리 단위는 펩티드 핵산을 포함하는 것으로 구성된 나노구조의 단계적으로 어셈블리하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 나노구조 중간물질은 표면-결합된 개시물질 어셈블리 단위 단위를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서,(d) 적어도 한 개 캡핑 단위로 나노구조를 캡핑하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 적어도 1회 과정에서 이용된 제 1 어셈블리 단위는 펩티드 핵산을 포함하는 제 1 결합 원소에 공유적으로 연결될 적어도 한 개 구조 원소를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 4 항에 있어서, 구조 원소는 제 1 결합 원소와 제 2 결합 원소에 공유적으로 결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 5 항에 있어서, 제 2 결합 원소는 펩티드 핵산인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 4 항에 있어서, 제 1 어셈블리 단위는 안정적인 복합체를 만들기 위해 제 2 구조 원소에 결합된 제 1 구조 원소를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 4 항에 있어서, 어셈블리 단위에는 기능 원소가 추가 포함된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 8 항에 있어서, 기능 원소에는 광활성 분자, 광 나노입자, 무기 이온, 무기 나노입자, 자성 이온, 자성 나노입자, 전자 나노입자, 금속성 나노 입자, 산화금속 나노입자, 금 나노입자, 금-피복된 나노입자, 탄소 나노튜브, 나노크리스탈, 나노와이어, 퀀톰 도트, 펩티드, 단백질 도메인, 효소, 헵텐, 항원, 바이오틴, 이그옥시제닌, 톡신, 방사능활성 라벨, 형광단, 발색단, 화학발광 분자들으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 8 항에 있어서, 기능 원소는 펩티드 핵산 원소를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 적어도 1회 과정에서 이용된 제 1 어셈블리 단위에는 펩티드 핵산을 포함하는 기능 원소 및 결합 원소를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 11 항에 있어서, 기능 원소에는 광활성 분자, 광 나노입자, 무기 이온, 무기 나노입자, 자성 이온, 자성 나노입자, 전자 나노입자, 금속성 나노 입자, 산화 금속 나노입자, 금 나노입자, 금-피복된 나노입자, 탄소 나노튜브, 나노크리스탈, 나노와이어, 퀀톰 도트, 펩티드, 단백질 도메인, 효소, 헵텐, 항원, 바이오틴, 이그옥시제닌, 톡신, 방사능활성 라벨, 형광단, 발색단, 화학발광 분자들로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 11 항에 있어서, 기능 원소에는 펩티드 핵산을 포함하는 것을 특징으로하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 공유 연결에 상보적인 결합 원소의 특이적인 비-공유 상호작용으로 어셈블리후에 전환하는 단계가 추가 포함되고, 이때 연결은 안정적인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 어셈블리 단위에는 안정된 복합체를 만들기 위해 서로 결합되어 있는 다수의 서브-어셈블리 단위를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 상이한 다수의 결합 원소를 포함하는 다양한 종의 어셈블리 단위에서 만들어진 나노구조에 있어서, 어셈블리 단위에는 펩티드 핵산을 포함하는 제 1 어셈블리 단위를 포함하는 것을 특징으로 하는 나노구조.
- 제 16 항에 있어서, 제 1 어셈블리 단위에 펩티드 핵산은 결합원소로 존재하는 것을 특징으로 하는 나노구조.
- 제 17 항에 있어서, 제 1 어셈블리 단위에는 기능 원소가 추가 포함된 것을 특징으로 하는 나노구조.
- 제 18 항에 있어서, 기능 원소에는 광활성 분자, 광 나노입자, 무기 이온,무기 나노입자, 자성 이온, 자성 나노입자, 전자 나노입자, 금속성 나노 입자, 산화 금속 나노입자, 금 나노입자, 금-피복된 나노입자, 탄소 나노튜브, 나노크리스탈, 나노와이어, 퀀톰 도트, 펩티드, 단백질 도메인, 효소, 헵텐, 항원, 바이오틴, 이그옥시제닌, 톡신, 방사능활성 라벨, 형광단, 발색단, 화학발광 분자들로 구성되는 것을 특징으로 하는 나노구조.
- 제 18 항에 있어서, 기능 원소는 펩티드 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 나노구조.
- 제 17 항에 있어서, 제 1 어셈블리 단위에 펩티드 핵산은 기능 원소로 존재하는 것을 특징으로 하는 나노구조.
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