DE19917841A1 - Nanostrukturierung an Oberflächen mittels heterogener Polymere - Google Patents

Abstract

Die Struktutierung von Oberflächen und an Oberflächen wird erfindungsgemäß durch Polymere erzeugt, die durch ihre chemische Zusammensetzung eine wohldefinierte Abfolge erkennbarer Struktureinheiten aufweisen, wie z. B. die typischen Biopolymere Nukleinsäuren und Polypeptide. Das linearisierte Polymer wird an mehreren, mindestens aber zwei, Stellen an die Oberfläche gekoppelt. Spezifische Binder, die spezifisch an spezielle Abfolgen der heterogenen Einheiten des Polymers binden, werden an das Polymer gebunden, sie liegen dann als wohlgeordnete Kette vor und weisen die durch die heterogenen Einheiten des Polymers vorgegebene Ordnung auf.

Description

Die Strukturierung von Oberflächen und an Oberflächen wird erfindungsgemäß durch Polymere erzeugt, die durch ihre chemische Zusammensetzung eine wohldefinierte Abfolge erkennbarer Struktureinheiten aufweisen, wie z. B. die typischen Biopolymere Nukleinsäuren und Polypeptide. Das linearisierte Polymer wird an mehreren, mindestens aber zwei, Stellen an die Oberfläche gekoppelt. Spezifische Binder, die spezifisch an spezielle Abfolgen der heterogenen Einheiten des Polymers binden, werden an das Polymer gebunden, sie liegen dann als wohlgeordnete Kette vor und weisen die durch die heterogenen Einheiten des Polymers vorgegebene Ordnung auf. Die Stützpunkte liegen einige hundert Nanometer bis einige Mikrometer voneinander entfernt, sind also durch Mikrostrukturtechniken erzeugbar. Die durch das Polymer induzierte Ordnung der Sequenzabfolge zwischen den Stützpunkten liegt im molekularen Bereich, also unterhalb weniger Nanometer.

Ein typisches Beispiel sind Nukleinsäuren, deren Einheiten die Nukleotide sind und deren Sequenz eine eindeutige lineare Ordnung aufweist. Über Basenpaarung wird diese Ordnung auf komplementäre Stränge übertragen. Sind diese komplementären Stränge kurz (Oligomere) im Vergleich zum primären Polymer und sind diese Oligomere unterschiedlich gekennzeichnet, bzw. tragen unterschiedliche Funktionalitäten, so wird die primäre Ordnung des Polymers auf die Ordnung der Markierungen bzw. Funktionalitäten übertragen.

Da der molekulare Abstand der primären Einheiten des Polymers im Bereich 0,1 bis 1 nm liegt und die Bindungsbereiche naturgemäß einige Einheiten erfassen müssen, entsteht zwischen den Markierungen ein typischer Abstand in der Größenordnung von 10 nm. Damit ist über das Polymer eine räumlich definierte Struktur erzeugt.

Ausführungsbeispiele

Als Mikrostruktur wird eine Interdigitalelektrode mit einer Periode von 1 µm vorgegeben. Auf den Anoden werden Oligonukleinsäuren mit der Sequenz. . . immobilisiert auf den Kathoden Oligomere mit der Sequenz. . . Die beiden genannten Sequenzen sind komplementär zu den jeweils links und rechts liegenden Bereichen der EcoRI Schnittstelle des Phagen M13. Der Phage M13 wird mittels EcoRI linearisiert. Dazu wird nur ein kurzes Stück im Bereich der Erkennungsstelle hybridisiert, so daß nach dem Schnitt durch das Restriktionsenzym die verbleibenden Doppelstränge sich thermisch auflösen, bzw. durch Erhitzen abgelöst werden. Die linearisierte, einzelsträngige Phagen DNA wird auf die mit den unterschiedlichen Sequenzen beschichteten Elektroden hybridisiert. Zwischen den Polen der Elektroden bilden sich Brücken aus der Phagen-DNA. Diese werden nachgewiesen durch die Hybridisierung markierter Sequenzen aus dem Zwischenbereich. Durch die Anordnung der stegförmigen Elektroden werden in einem Mikroskop (Nahfeld-optisches Rastersondenmikroskop, SNOM, oder konfokales Laserscanningmikroskop) Streifen der Markierung sichtbar.

Abbildungen

Fig. 1 Prinzipdarstellung der Kopplung eines Nukle­ insäurestranges

Fig. 2 Sequenzerkennung am irnobilisierten Nuklein­ säureraster

Fig. 3 Anwendungsvarianten

• a) Nanoimmunoassay
• b) Funktionskopplung einer Transferreaktion
• c) Beispiel eines molekularen Schalters

Fig. 4 Transkription am iznmobilisierten Doppelstrang

Fig. 5 Kopplung eines ringförmigen Nuklein­ säurestranges

Erläuterung der Abbildungen Fig. 1 Prinzipdarstellung der Kopplung eines Nukleinsäurestranges

Dargestellt ist beispielhaft die Kopplung des Polymers über komplementäre Bereiche an den Enden des Polymers. In zwei Bereichen einer Mikrometer-Struktur, die z. B. als Elektroden ausgebildet sein können, sind zwei unterschiedliche Oligonukleotide, A und B, kovalent gekoppelt. Die Abbildung ist nicht Maßstabsgerecht; die Größenordnungen der Abstände sind eingetragen.

Fig. 2 Sequenzerkennung am immobilisierten Nuklein­ säureraster

Die Struktur kann zur Generierung von hochverdichteten Nukleinsäure Arrays eingesetzt werden. Das Nukleinsäurepolymer wird z. B. durch Klonierung erzeugt und enthält spezifische Sequenzen (Targetsequenzen), die gezielt eingebaut wurden, um nach ihnen in Proben zu suchen.

Fig. 3 Anwendungsvarianten a) Nanoimmunoassay

An Oligomere mit einer definierten Sequenz, die zu bestimmten Bereichen des immobilisierten Polymers komplementär sind, sind Antigene oder Haptene gekoppelt. Diese bilden somit das Raster für Immunoassays.

b) Funktionskopplung einer Transferreaktion

Die Oligomere können auch als Anker für funktionelle Moleküle dienen, z. B. Enzyme, die miteinander in Wechselwirkung treten. Durch die räumliche Anordnung wird die Reaktion beschleunigt oder überhaupt erst ermöglicht. Solche Reaktionen können z. B. Transferreaktionen sein.

c) Beispiel eines molekularen Schalters

Eine Transferreaktion wie im Beispiel der Fig. 3b wird durch eine dritte Komponente geschlossen oder unterbrochen, je nachdem ob eine spezifische Bindungsreaktion stattfindet oder nicht.

Fig. 4 Transkription am immobilisierten Doppelstrang

Das immobilisierte Nukleinsäurepolymer kann in weiten Bereichen, mit Ausnahme der Verankerungsbereiche, doppelsträngig gemacht werden. Damit ist es template für Basisprozesse der Molekularbiologie, z. B. der Transkription. Der Transkriptionsapparat wird an die Oberfläche gebunden und kann so an vorherbestimmten Bereichen aktiv werden. Der Doppelstrang kann auch die Basis für Funktionseinheiten sein, die über DNA- bindende Proteine gekoppelt und geordnet werden (z. B. Proteine mit Zinkfingerstruktur). Solche Proteine können rekombinant als Fusionsproteine erzeugt werden, die eine Zinkfingerbindungsdomäne und eine enzymatische Domäne enthalten. Somit können dieselben Funktionen wie in den Beispielen der Fig. 3a und 3b mit einer Proteinkopplung erreicht werden.

Fig. 5 Kopplung eines ringförmigen Nukleinsäure­ stranges

Das Polymer ist hier ein ringförmiges (partiell) einzelsträngiges Plasmid. Damit wird es möglich auch räumliche Strukturen auf Oberflächen in eindeutig vorgegebener Weise zu erzeugen.

Claims (5)

1. Struktur, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Feinordnung im Nanometerbereich aufweist und über punktweise Fixierung eines hochgeordneten Polymers erzeugt wurde.

2. Strukturierung von Oberflächen im Submikrometer- Maßstab dadurch gekennzeichnet, daß ein Polymerstrang mit heterogener Zusammensetzung an mindestens zwei Punkten an der Oberfläche fixiert wird und damit die inhärente molekulare Ordnung des Polymers der Oberfläche aufgeprägt wird.

3. Strukturierung von Oberflächen nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer eine Nukleinsäure, namentlich DNA oder RNA oder gegen enzymatischen Abbau stabilisierte Derivate derselben, oder eine Peptid-Nukleinsäure (PNA) oder ein Derivat daraus oder eine Mischform daraus ist.

4. Strukturierung von Oberflächen nach Anspruch 1 und 2 dadurch gekennzeichnet, daß die Verankerung des Nukleinsäure-Polymers über fixierte Oligomere stattfindet.

5. Strukturierung von Oberflächen nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß das Nukleinsäurepolymer einzel- oder doppelsträngig ist. Für den Fall des Doppelstranges können z. B. Zinkfingerprotein-Erkennungsstellen eingebaut wer­ den und z. B. verschiedene nukleare Rezeptoren aufgereiht werden.