KR20040094721A

KR20040094721A - 필린 단백질을 함유하는 나노구조

Info

Publication number: KR20040094721A
Application number: KR10-2004-7013092A
Authority: KR
Inventors: 리 마코우스키
Original assignee: 나노프라미스 인코포레이티드
Priority date: 2002-02-21
Filing date: 2003-02-21
Publication date: 2004-11-10
Also published as: JP2005518455A; CA2477171A1; EP1485128A4; EP1485129A4; DE60311076D1; AU2003215377A1; US20030215903A1; AU2003217644A1; JP2005518456A; AU2003217643A1; WO2003072829A1; US20030198956A1; WO2003072803A2; KR20040102011A; CA2477271A1; CA2477270A1; WO2003072804A3; EP1483408A4; KR20040102012A; WO2003072804A2

Abstract

나노구조는 하나 이상의 결합 원소(joining 원소)가 필린 단백질 또는 결합-유도체 또는 그들의 결합-단편인 어셈블리 단위의 하나 이상의 종을 포함하여 제조된다. 필린-함유 어셈블리 단위는 두개의 필린-유도 결합 원소를 가지며, 구조적 원소, 기능적 원소 또는 양자 모두를 포함할 수 있다, 나노구조는 적절하게는 단계별 어셈블리 방법에 의하여 제조되는데, 여기서 하나 이상의 결합되지 않은 결합 원소를 갖는 나노 구조 중간 물질은 다수의 다른 결합 원소를 갖는 어셈블리 단위와 접촉한다. 어셈블리 단위의 결합 원소의 어느 것도 자체적으로 또는 동일한 어셈블리 단위의 다른 결합 원소와 상호작용할 수 없다. 그러나, 결합 원소의 하나는 나노구조 중간 물질의 결합되지 않은 결합 원소와 상호작용할 수 있으며, 그러므로 어셈블리 단위는 나노구조 중간 물질에 비-공유적으로 결합된다. 결합되지 않은 어셈블리 단위는 제거되고 사이클은 나노구조를 형성하기 위하여 충분한 횟수만큼 반복된다. 하나 이상의 사이클 내의 상보적 결합 원소는 필린 단백질 또는 그들의 결합 유도체 또는 결합 단편을 포함한다.

Description

필린 단백질을 함유하는 나노구조{NANOSTRUCTURES CONTAINIG PILIN PROTEIN}

나노구조는 나노메터(1-100㎚)범위의 한 개이상의 특징적인 크기를 가지는 개별 성분으로 된 구조를 말한다. 나노메터 범위의 물리적인 크기를 가지는 성분으로된 구조를 어셈블리하는 경우에 유익한 점에 대해서는 지난 40년간 논의되어왔었다. 이와 같은 구조의 장점들이 처음으로 Feynman(1959, There's Plenty of Room at the Bottom, An Invitation to Enter a New Field of Physics (lecture), December 29,1959, American Physical Society, California Institute of Technology, reprinted in Engineering and Science, February 1960, CaliforniaInstitute of Technology, Pasadena, CA)에 의해 제기되었고, Drexler(1986, Engines of Creation, Garden City, N. Y.: Anchor Press/Doubleday)에 의해 상당히 확장되었다. 이들 과학자들은 매우 작은 특징적인 크기를 가지는 구조를 만들면 상당한 유용성이 있을 것으로 생각하였다. 나노기술의 가능한 응용 부분이 확산되고 있기 때문에, 사회에 기대되는 충격은 상당하다.(e.g., 2000, Nanotechnology Research Directions: IWGNWorkshop Report; Vision for Nanotechnology R & D in the Next Decade; eds. M. C. Roco, R. S. Williams and P. Alivisatos, Kluwer Academic Publishers). 전자 광학 성분; 의료 센서; 신물질; 생체적합성 장치; 나노전자 및 나노회로; 컴퓨터 기술등을 포함한 나노장치의 방대한 응용분야가 있을 것으로 기대된다.

나노구조의 물리적 화학적 기여도는 이것을 구성하는 빌딩 블록에 달려있다. 예를 들면, 이들 빌딩블럭의 크기, 이들이 결합할 때 각도가 나노구조의 성질을 결정하는데 중요한 역학을 하고, 기능 원소가 어디에 자리잡느냐에 따라 달라진다. 나노구조에는 다양한 형태의 물질이 이용될 수 있는 예를 제공하는데, 이용될 수 있는 물질에는 DNA(US Patents Nos. 5,468,851, 5,948, 897 and 6,072, 044; WO 01/00876), 박테리오파아지 T-이븐 꼬리 섬유(US Patents Nos. 5,864, 013 and 5,877, 279 and WO 00/77196), 사람 엘라스틴 및 다른 섬유 단백질상에 모델이되는 자가-배열 펩티드(US Patent No. 5,969, 106), 인위적인 펩티드 인지 서열(US Patent No. 5,712, 366)등이 포함된다. 그럼에도 불구하고, 나노구조의 가망 응용분야를 모두 충족시키는데 요구되는 다양성을 제공할 수 있는 새로운 추가적인 빌딩블럭을 계속적으로 요구된다. 동일한 빌딩블럭을 포함하는 동형 나노구조와 다른 종류의 빌딩블럭과 복합시킨 이형 나노구조에 이용될 수 있는 추가 빌딩블럭을 본 출원에서 제공한다.

본 발명은 필린(Pilin) 단백질을 함유하는 나노구조의 어셈블리를 위한 방법, 그러한 나노구조의 구성을 위하여 사용되는 필린 단백질 어셈블리 단위, 그리고 필린 단백질 어셈블리 단위를 함유하는 나노구조에 관련된다.

도 1는 P-선모(pilus) 구조의 도식이다. 이 선모는E. coli의 외막에 papH의 N-말단 막 앵커를 통하여 연결되어 있다. 대부분의 선모는 papA의 많은 복제로 제조된다. 이 막대는 papK의 단일 복제에 의하여 종결되며, 이것은 막대 구조와 피브릴룸(fibrillum)으로 불리는 얇은, 이격 구조 사이에 어댑터로서 작용한다. 피브릴룸은 몇몇의 papE의 복제, 그 후의 papF의 단일 복제 그리고 papG의 단일 복제로 구성되며, 구조의 말단 팁(tip)에서 접착 장소(adhesin)로서 작용한다.

도 2 (A-B). 도 2A는 두 필린의 상호작용의 도식이이며, 한 필린의 N-말단 연장(도의 오른쪽 아래에 도시됨)과 다른 필린의 표면의 홈(groove)[도면의 왼쪽 위에 도시됨]과의 밀접한 상호작용을 나타낸다. 필린은 필린으로부터의 긴 N-말단연장의 결합을 통하여 인접 필린의 본체와 상호작용한다. 이것은 현저한 기계적 강도를 갖는 연장된 특이적 상호작용을 제공한다. 도 B는 papE와 papA의 단백질 본체에 접목된 papF의 N-말단 암으로부터 구성된 하이브리드 필린과의 상호작용의 도식이다. 필린의 N-말단 암을 다른 필린의 N-말단 암으로 대체시키는 것은 그것의 결합 특이성을 변화시킨다. 여기서, papA는 N-말단 암을 papF (화살표)의 그것으로 대체시키고, 이제 papA가 papF-papE 상호작용을 안정화하기 위하여 보통 사용되는 상호작용을 사용함으로써 papE와 상호작용하는 것이 가능하도록 한다.

도 3. 하이브리드 필린 소단위의 단계별 어셈블리의 도식이다. 도시된 공정은 실시예 1에서 설명된다. 하이브리드 필린 소단위의 첨가는 도시된 단계에 따라 진행된다. 하이브리드 필린은 하나의 필린의 단백질 본체 (대문자로 표시, 예, A, H, E, K) 그리고 다른 필린의 N-말단 연장(소문자로 표시 예, k, a, f, e)으로 제조된다. ras 에피토프의 배치가 도시된다.

도 4. 어셈블리 단위의 단계별 어셈블리를 나타낸다. 실제, 단계별 어셈블리에 있는 각 단계는 대규모로 나란한 방식으로 실행한다. 단계1에서, 개시단위는 고형 기질에 고정시킨다. 여기에서 설명하는 본 발명의 구체예에서, 개신 단위는 단일 결합원소이다. 단계 2에서, 제 2 어셈블리 단위가 첨가된다. 제 2 단위는 두 개의 비-상보적인 결합 원소를 가지고 있고, 이 단위는 용액에서 자체 연합되지 않는다. 제 2 어셈블리상에 결합 원소중 하나는 개시 단위에 있는 결합원소에 상보적이다. 비-결합된 어셈블리 단위는 각 단계에서 씻어낸다(나타내지 않음).

배양 후에, 개시 단위에 제 2 어셈블리 단위가 결합하여, 두 개 어셈블리 단위로 구성된 나노구조 중간물질을 만든다. 단계 3에서, 제 3 어셈블리를 첨가한다. 이 단위는 나노구조 중간물질상에 쌍을 이루지 않은 결합원소에만 상보적인 두 개비-상보 결합 원소를 가진다. 이 단위에도 기능 단위("F3")가 포함된다.

"F4" 기능 원소를 가지는 제4 결합 단위와 "F5" 기능 원소를 가지는 제 5 어셈블리 단위를 단계 4와 5에 단계 2와 3의 것과 정확하게 유사한 방식으로 각각 첨가한다. 각 경우에, 결합 원소들을 선택하여 한번에 한 단위이상 추가되지 않도록 하고, 또한 이는 이미 지정된 위치에 기능 단위를 매우 잘 조절하여 어셈블리되도로록 한다.

도 5. 서브어셈블리로부터 나노구조 생성. 나노구조는 연속하여 서브어셈블리를 첨가하여 만들 수 있는데, 상기 도 4에서 설명한 것과 같이 개별 원소들을 추가하는데 이용된 것과 유사한 단계를 이용한다. 화살표는 커지는 나노구조에 서브어셈블리를 추가한다는 것을 나타낸다.

도 6. 이 다이아그램은 본 발명의 단계적 어셈블리 방법에 따라 나노구조에 단백질 단위 및 무기(inorganic) 원소들을 첨가하는 것을 설명한다. 단계 1에서, 개시 단위가 고형 기질에 결합된다. 단계 2에서, 어셈블리 단위는 개시 단위에 특이적으로 결합되고, 단계 3에서, 추가 어셈블리 단위는 어셈블리로 만들어지고 있는 나노구조에 결합된다. 이와 같은 어셈블리 단위는 특정 무기 원소에 특이적인 조작된(engineered) 결합 부위를 포함한다. 단계 4에서, 무기 원소(빗금친 타원)을 구조에 첨가하고, 조작된 결합 부위에 결합시킨다. 단계 5에서 제 2 형태의 무기 원소에 특이성을 가지도록 조작된 결합 부위를 가지는 또 다른 어셈블리 단위를 첨가하고, 제 2 무기 원소(빗금친 다이아몬드)를 단계 6에서 첨가한다.

도 7. 이중 특이적인 어셈블리 단위와 이차원 나노구조를 만들기 위한 한 개테트라 특이적 어셈블리를 이용할 수 있는 11 단계 어셈블리를 나타내는 다이아그램이다.

도8 (A-B). 서브어셈블리로써 나노구조 중간물질을 이용하는 단계적으로 생성된 어셈블리의 다이아그램이다. 단계 1-3에서, 나노구조 중간물질이 만들어지고, 두 개 결합 원소들이 캡씌워지고, 고형 기질로부터 나노구조 중간물질이 방출된다. 단계 5에서, 단계3의 나노구조 중간물질을 고유 서브어셈블리인 어셈블리 중간물질(단계 4에서 나타낸 것과 같은, 고형 기질에 부착된)에 첨가된다.

발명의 상세한 설명

정의: 본 출원에서 사용된 용어는 당분야에 통상적인 의미와 일치된다. 그러나, 동의하지 않는 경우를 대비하여 분명하게 하기 위해, 다음과 같이 정의한다.

어셈블리 단위(Assembly Unit):어셈블리 단위는 구조 원소, 결합 원소, 기능 원소들로 구성된 원자 또는 분자 집합체이다. 바람직하게는 어셈블리 단위는 특이적, 비-공유 상호작용을 통하여 단일 단위로 나노구조에 첨가한다. 어셈블리 단위에는 두 개 이상의 서브-어셈블리 단위를 포함할 수 있다. 어셈블리 단위에는 한 개 이상의 구조 원소를 포함할 수 있고, 나아가 한 개 이상의 기능 원소 및 한 개 이상의 결합 원소를 포함할 수 있다. 어셈블리 단위에 기능 원소를 포함하는 경우에, 기능 원소는 특정 구체예에 따르면 결합 원소 또는 구조 원소내에 부착 또는 결합된다. 이와 같은 구조 원소 및 한 개 또는 다수의 비-상호작용을 하는 결합원소를 포함하는 어셈블리 단위는 특정 구체예에서는 구조적으로 딱딱하고, 잘 정의된 인지 및 결합 성질을 가질 수 있다.

어셈블리 단위, 개시 물질(Assembly Unit, Initiator): 개시 물질 어셈블리 단위는 본 발명의 단계적으로 생성되는 어셈블리 방법에 따라 형성되는 나노구조에 결합되는 제 1 어셈블리 단위이다. 공유 또는 비-공유 상호작용에 의해 단계별로 생성되는 공정에 제 1 단계로써 고형 기질 또는 다른 매트릭스에 부착될 수 있다. 개시 물질 어셈블리 단위는 "개시 단위("initiator unit")로 한다.

버텀 업(Bottom-up): 구조(나노구조)의 버텀업(Bottom-up) 어셈블리는 자가-어셈블리 또는 단계별 어셈블리를 이용하여 서브구조를 결합시켜 구조를 만드는 것이다.

캡핑 단위(Capping Unit): 캡핑 단위는 적어도 한 개 결합원소를 포함하는 어셈블리 단위이다. 캡핑 단위가 일단 나노구조에 결합된 후에는 캡핑 단위와 상호작용을 통하여 나노구조내로 추가적인 어셈블리 단위가 결합할 수 없다.

결합 유도체: 특이적 단백질의 유도체, 예를 들면 필린 단백질, 특이적 단백질의 결합 기능을 보유하지만, 기능적으로 동등한 아미노산 잔기가 서열 내에서 침묵 변화(silent change)를 일으키는 잔기로 치환되거나, 또는 (2) 대상이 되는 필린 단백질과 실질적으로 동종의 단백질 또는 펩티드 범위 또는 그것의 결합 단편 (예, 다양한 실시예에서 동일한 크기의 아미노산 서열에 대하여 또는 공지 기술에 의한 컴퓨터 호모로지 프로그램에 의하여 수행된 배열된 서열과 비교하여 적어도 60% 또는 70% 또는 80% 또는 90% 또는 95%의 동일성을 갖는)을 생산하거나, 또는 그것을 엔코딩하는 핵산이 매우 엄격한 또는 중간정도의 엄격한 조건 하에서 대상 단백질를 엔코딩하는 서열과 하이브리다이즈 될 수 있는 1차 서열 (1) 의 변화의결과로서 기본 단백질이 변화된 필린 단백질.

서열 내의 기능적으로 동등한 아미노산 잔기는 아미노산이 속하는 클래스의 다를 멤버로부터 선택될 것이다. 예를 들면, 비극성 (소수성) 아미노산에는 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 그리고 메티오닌이 포함된다. 비극성 중성 아미노산에는 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라진, 그리고 글루타민이 포함된다. 양성 하전된(염기성) 아미노산에는 아르기닌, 라이신 그리고 히스티딘이 포함된다. 음성 하전된(산성) 아미노산에는 아스파르트 산, 그리고 글루탐산이 포함된다.

결합 단편: 펩티드 에피토프 또는 필린 단백질과 같은 분자의 결합 단편은 결합 단편이 유도된 펩티드 에피토프 또는 필린 단백질의 결합 특이성을 나타내는 단편을 의미한다.

제 1 어셈블리 단위, 제 1 원소: 명확하게 하기 위하여, 어셈블리 단위 또는 원소는 때때로 "제 1 " 또는 "제 2"와 같은 표지를 사용하여 지칭된다. 이것은 순수하게 표시를 위한 것이며 어떠한 의미로도 나노구조 내의 어셈블리 단위 또는 원소의 위치를 지칭하는 것이 아니다.

기능적 원소(Functional Element): 기능적 원소는 원하는 물리적, 화학적 또는 생물학적 성질을 나타내는 부분으로, 나노구조내에 정의된 위치에 특이적인 공유 또는 비-공유 상호작용을 통하여 만들어 질 수 있다. 또는, 기능적 원소를 이용하여 원하는 물리적, 화학적 또는 생물학적 성물을 가지는 부분을 부착 부위에 제공한다. 기능을 하는 원소에는 펩티드, 단백질(효소), 단백질 도메인, 소분자, 무기(inorganic) 나노입자, 원자, 원자 덩어리, 자성 나노입자, 광자 나노입자, 전자 나노입자 또는 방사능 활성 분자, 발색단, 형광단, 화학발광 분자와 같은 마커등이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다. 이와 같은 기능을 하는 원자들을 교차-연결 선형 1차원 나노구조에 이용하여 2차원 또는 3차원 나노구조를 만든다.

결합 원소(Joining Element): 결합 원소는 단위에 결합 성질을 제공하는 어셈블리 단위의 일부분인데, 예를 들면, 결합 도메인, 합텐, 항원, 펩티드, PNA, DNA, RNA, 아프타머(aptamer), 폴리머 또는 다른 부분 또는 이들의 복합물이 포함되는데, 이들은 다른 결합 원소들과 특이적, 비-공유 상호작용을 할 수 있다.

결합 원소, 상보적: 상보적 결합 원소는 특이적, 비-공유 상호작용을 통하여 서로간에 상호작용할 수 있는 두가지 결합 원소들이다.

결합 원소, 비-상보적: 비-상보적인 결합 원소들은 서로간에 특이적인 상호작용을 하지 않거나 서로간에 특이적인 상호작용 경향이 없는 두 개 결합 원소이다.

접합 쌍: 결합쌍은 두가지 상보적인 결합 원소들을 말한다.

나노물질(Nanomaterial): 나노물질은 나노구조 입자의 결정, 부분 결정 또는 비결정 어셈블리를 구성되는 물질이다.

나노입자(Nanoparticle): 나노입자는 나노메터(1-1000㎚) 범위 직경을 만들기 위해 원자 또는 분자가 서로 결합된 결합체를 말한다. 입자는 동형 또는 이형일 수 있다. 단일 결정 도메인을 포함하는 나노입자를 나노크리스탈(nanocrystals)이라고도 한다.

나노구조(Nanostructure) 또는 나노장치(Nanodevice): 나노구조 또는 나노장치는 구조적, 기능적, 결합 원소와 같은 어셈블리 단위를 포함하는 원자 또는 분자 집합체인데, 원소들은 나노메터 범위의 적어도 한가지 특징적인 길이(크기)를 가지는데, 서로에 대해 어셈블리 단위의 위치는 정의된 기하학에 의해 정해진다. 나노구조 또는 나노장치에는 이에 부착된 기능치환체가 있어 특정 기능성을 제공한다.

나노구조 중간 물질(Nanostructure intermediate): 나노구조 중간 물질은 추가 어셈블리 단위가 첨가되는 나노구조의 어셈블리하는 동안에 만들어지는 중간 서브구조이다. 최종 단계에서, 중간 생성물 및 나노구조는 동일하다.

비-공유 상호작용, 특이적(Non-covalent Interaction, Specific) : 특이적인 비-공유 상호작용은 예를 들면, 어셈블리 단위와 나노구조 중간 물질간에 일어나는 상호작용을 말한다.

단백질(Protein): 본 출원에서, "단백질"은 일반적으로 펩티드, 폴리펩티드, 다수의 아미노산으로 구성된 단백질을 말하고, 임의 최소 아미노산 수를 부여하지는 않는다.

제거(Removing): 비-결합된 어셈블리 단위를 제거는 물리적으로 제거되는 여부에 관계없이 나노구조 생장에 추가적으로 관여할 수 없는 경우에 실시한다.

자가-어셈블리(Self-assembly) : 자가 어셈블리는 순서에 맞는 구조로 원소들이 자발적으로 조직화되는 것을 말한다. 자동 어셈블리라고도 한다.

나노구조의 단계적 어셈블리(Staged Assembly of a Nanostructure): 나노구조의 단계적 어셈블리는 나노구조의 어셈블리 과정을 말하는 것으로, 이때 일련의어셈블리 단위가 미리-정해진 순서로 첨가되는데, 고형 매트릭스 또는 기질상에 일반적으로 고정된 개시 단위를 시작으로 한다. 각 단계로 나노구조 중간 물질라고도 하는 중간 서브 구조가 만들어지고, 추가 어셈블리 단위가 첨가된다. 어셈블리 단계는 (i) 연결 단계, 즉, 어셈블리 단위가 개시 단위에 연결되어나 또는 다음에 첨가되는 그 다음 어셈블리 단위를 포함하는 용액에 개시 단위 또는 나노구조 중간 물질이 부착된 매트릭스 또는 기질을 배양함으로써 나노구조 중간 물질에 연결된다; (ii) 제거 단계 또는 세척 단계, 이 단계는 중간 구조 또는 완성된 나노구조로부터 과량의 어셈블리 단위를 제거한다. 단계(i)과 (ii)를 반복하여, 모든 어셈블리 단위가 원하는 모양의 나노구조가 될 때 까지 결합되는 과정으로 형성된 단계적으로 만들어진 어셈블리를 지속한다. 어셈블리 단위는 개시 단위 또는 특이적, 비-공유 결합을 통하여 나노구조 중간 물질에 결합한다. 나노구조 중간 물질의 예정된 위치에만 부착될 수 있는 어셈블리 단위의 결합 원소를 선택한다. 어셈블리 단위, 구조 원소, 결합 원소, 기능적 원소의 상대적인 위치 등에 대한 기하학 및 어셈블리 단위가 나노구조로 첨가되는 순서들을 모두 계획하여, 기능 단위가 구조에서 상대적으로 이미 예정된 위치에 가도록 하여, 완전하게 어셈블리된 나노구조가 원하는 기능을 하도록 한다.

구조적 원소: 구조적 원소는 결합 원소 간에 구조적 또는 기하학적 연결을 제공하는 어셈블리 단위의 일부분으로 인접하는 어셈블리 단위에 기하학적 연결을 제공한다. 구조적 원소들은 나노구조의 일부가 되는 구조적 프레임워크를 제공한다.

서브어셈블리(Subassembly): 서브어셈블리는 서로 결합된 다중 어셈블리 단위로 구성된 원자 또는 원자 단위로, 전체로 어셈블리 중간 물질(가령 나노구조 중간 물질)로 통째로 첨가될 수 있다. 본 발명의 많은 구체예에서, 구조적 원소들이 어셈블리 단위에 기능적 원소들을 지원할 수도 있다.

탑-다운(Top-down): 구조(나노구조)의 탑-다운 어셈블리는 석판술(lithographic techniques)을 이용하여 더 큰 거대 구조를 처리함으로써 나노구조를 만드는 것이다.

필린 어셈블리 단위

본원 발명은 나노구조의 제조에 사용될 수 있는 어셈블리 단위의 새로운 클래스를 제공한다. 이들 "필린 어셈블리 단위"는 필린 단백질 또는 그들의 결합 유도체 또는 단편인 하나 이상의 결합 원소를 함유한다. 또한, 이 어셈블리 단위는 구조적 원소 (그 자체로 필린 단백질의 일부가 되는) 그리고/또는 기능적 원소를 포함할 수 있다.

필린는 박테리아 접착 선모(pili)를 제조하는 단백질 단위이다. 박테리아 접착 선모 ("P-pili")는 필린의 중합에 의하여 형성된다. (참조. 예, Bullitt and Makowski, 1995, structural polymorphism of bacterial adhesion pili, Nature 373: 164-67; Bullitt and Makowski, 1998, Bacterial adhesion pili are heterologous assemblies of similar unit, Biophysics J. 74: 623-32). 선모 단위는 생체 밖에서 조립될 수 있다. (참조, 예 , Bullitt etal., 1996, Development of pilus organelle sub-assemblies in vitro depends on chaperone uncapping ofa beta zipper, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 93: 12890-95).

E. coli의 표면에서 발현되는 P-선모는 6.8 nm 직경의 나선 필라멘트이며, 나선 축 둘레를 감는 2.5 nm x 1.5 nm의 타원형을 중앙 공동을 가지며, c선모 표면으로 연장된 방사상의 통로에 연결된다. (Hultgren andNormark, 1991, Biogenesis of the bacterial pilus, Curr. Opin. Genet. Dev. 1: 313-18; Hultgren etal., 1993, pilus and nonpilus bacterial adhesins: assembly and function in cell recognition, Cell 73 (5): 887-901; Bullitt and Makowski, 1995, St polymorphism of bacterial adhesion pili, Nature 373: 164-67). 각각의 선모는 대략 주요한 필린인 PapA의 1000 복제를 포함하며, 하나 또는 몇몇의 복제는 부수적 필린인 PapH,PapK, PapE, PapF, PapG의 것이다. 나선의 PapA-함유 코일 막대 구역에는, 나선의 1회전당 3.29 소단위가 있으며, 소단위당 7.6A 상승한다. (Bullitt and Makowski, 1995, Structural polymorphism of bacterial adhesion pili, Nature 373: 164-167). 선모의 말단 팁의 미세섬유(fibrillae)는 4개의 개별적인 그러나 동종의 필린으로 만들어진다. (도. 1). papA의 말단은 papA 또는 papK의 기부 쪽의 단부와 상호작용할 것이다. papK의 기부 쪽의 말단은 오로지 papA와 상호작용할 것이다 ; 그것의 원부 말단(distal end)은 오직 papE와 상호작용할 것이다. 그리고 이것의 주목할 만 한 구조에 의하여 요구되는 만큼 계속된다. 이러한 특이적 상호작용은 표 1에 요약되어 있다.

표 1

필린-필린 단백질 상호작용

필린 말단 필린과의 상호작용

papA 기부(Proximal) papA 및 papH

papA 원부(Distal) pap A 및 papK

pap H 기부 없음

pap H 원부 papA

papK 기부 papA

papK 원부 papE

papE 기부 papH 및 papE

papE 원부 papE 및 papF

papF 기부 papE

papF 원부 papG

papG 기부 papF

papG 원부 papA,papH, papE,papF,

또는 papG 의 어느 N-말단

연장과도 상호작용하지 않음.

이들 고유의 결합 친화도는 나노구조 및 본원 발명의 방법에서 탐지된다. 필린 단백질 사이의 상호작용은 P-선모에서 인접하는 필린 단백질에 즉시 결합하여선모에 현저한 기계적 강도를 제공하는 신장된 분자간 인터페이스를 생성하는 각 필린 단백질의 N-말단연장에 의하여 중재된다. (Sauer etal., 1999, Strucural basis of chaperone function and pilus biogenesis, Science 285:1058-61 ; Choudhury etal., 1999, X-ray structure of the FimC-FimH chaperone-adhesin complex from uropathogenic Escherichia coli, Science 285: 1061-66). 이 결합의 친화도 및 특이성은 연장된 N-말단 암 그리고 인접 필린 단백질의 홈 사이의 상호작용에 의하여 결정된다. (도 2A). 결과적으로, 하나의 필린의 N-말단 암을 다른 것으로 교체하는 것은 ("하이브리드" 또는 "키메라" 필린 단백질을 형성) 필린 단위의 결합 특이성을 변화시키는 수단을 제공하며, 필린 어셈블리 단위의 설계를 허용한다.

필린은 고도로 동질성이며 그들의 N-말단연장의 C-말단 그리고 필린 본체의 N-말단에 걸치는 구역에서 고도로 동질성이다. 이 구역의 동질성은 하나의 필린의 N-말단 연장과 다른 것의 본체로 제조되는 하이브리드 필린의 설계에 도움을 준다. 하이브리드 필린은 하나의 필린으로 부터의 N-말단연장 및 다른 필린의 본체를 포함하며, 필린의 N-말단과 본체가 이량체 그리고 중합체를 형성하도록 상호작용하지 않는 단계별(단계별) 어셈블리에서 구조적 그리고/또는 결합 원소로서 사용될 것이다. (도 2B). P-선모를 만드는 모든 선모의 서열의 비교는 N-말단연장을 필린 단백질의 본체와 연결하는 구역이 필린들 중에서 고도로 보존되어 있으며 그러므로 이종의 필린 부분을 융합하기위한 위치는 이 동종성에 기초하여 양호하게 정의된다는 것을 나타낸다.

다양한 필린 단백질의 N-말단 연장, 그리고 N-말단 연장이 없는 다양한 필린 단백질 본체의 N-말단 아미노산의 서열 비-제한적인 실시예가 이하의 표 2에 도시된다. 하나의 필린의 N-말단 연장과 다른 필린의 본체를 포함하는 하이브리드 필린은 공지된 통상의 방법에 의하여 발현되고 정제된다. (예, Bullitt and Makowski, 1995, Structural polymorphism of bacterial adhesion pili, Nature 373: 164-67; Bullitt etal., 1996, Development of pilus organelle sub-assemblies in vitro depends on chaperone uncapping of a beta zipper, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 12890-95).

표 2

표 2에 도시된 바와 같이, papA의 N-말단 연장은 처음 20개의 아미노산을 포함한다. 이 연장은 다른 필린에서는 더 길다. PapH는E. coli의 외막에 정박(anchoring)하기 위하여 요구되므로 특히 긴 연장을 갖는다. 결과적으로, 이 긴papH 연장은 본원 발명의 바람직한 실시예에서는 사용되지 않는다. 이것은 필린들 사이에서 N-말단연장의 두 번째 반(half)을 포함하는 구역, 그리고 필린 단백질 본체의 N-말단의 구역의 필린 서열의 보존을 설명하기 위하여 표 2에 포함되었다. N-말단연장의 유사성은 이 연장이 동일한 방법으로 사용되어 동일한 방식으로 기부 쪽의 필린과 상호작용한다는 것을 나타낸다. N-말단연장 서열의 차이는 결합 특이성의 차이를 나타낸다.

필린 어셈블리 단위는 다중의 필린 단백질의 단편을 포함하도록 조립될 수 있다. 여기서 각 필린 단위는 펩티드 에피토프인 결합 원소를 포함한다. 동족의(cognate)항체에 의한 그러한 에피트프의 인식은 결합 원소로서 필린 단백질을 사용하는 한 방법을 제공한다. 바람직하게는, 그러나 하나의 어셈블리의 결합 원소는 전술한 바와 같이, 특정한 다른 필린 단백질에 의하여 인식되고 결합되는 필린 N-말단 펩티드 도메인이다. 필린 N 말단 도메인 및 필린 C-말단 도메인을 포함하는 접합 쌍(joining pair)의 사용은 그러한 어셈블리 단위의 결합 원소는 어셈블리 전에 완전히 엄격한 것이 아니며, 그러므로 결합 전에 유연성(flexible) 단백질-단백질 상호작용을 허용하므로 나노구조의 구성에 선택성을 제공한다. 필린 단백질은 다른 필린 단백질의 가변적인 연장을 인식하고 결합함으로써 본원 발명에 따른 나노구조의 단계별 어셈블리에 사용하기에 적합한 결합 원소로서 작용할 수 있다. 결합 후, N-말단연장은 인접, 동족의 필린 단백질에의 결합을 통하여 굳게 유지되어, 단계별 어셈블리에 필요한 강도를 제공한다. 따라서, 필린 단백질은 동일한 어셈블리 단위에서 결합 원소 그리고 구조적 원소로서 작용할 수 있다.

일반적으로, 필린 단백질 단편은 단편이 필린 단백질의 실질적으로 전부를 포함하지 않는 한, 다른 필린 단백질과 특이적인 타이트한 상호작용을 제공하기에 적합한 구조를 유지하지 않는 경향이 있다. 그러나, 본 발명의 일 실시예에서, 필린의 베타 회전의 하나 또는 그 이상에 몇몇 아미노산이 전체적인 구조, 구조적 강도 또는 인식 속성을 방해함이 없이 교체되거나, 첨가되거나 또는 삭제되어, 기능적 원소의 삽입에 적절한 하나 또는 그 이상의 부위를 제공한다. 기능성(Functionality)는 (i)소단위 표면에 있으며 ; (ii) 소단위의 서로의 상호작용에 중요하지 않으며 그리고 (iii) 소단위 자체의 안정성에 중요하지 않은 것으로 인식되는 위치에 추가된다. 많은 단백질에서, 커다란 루프 삽입은 인용되며, 많은 재설계는 안정한 활성의 구조로 성공적으로 폴드(fold) 되는 단백질을 생산하였다. 일부 재설계는 전적으로 발명자의 선택에 따르는 반면, 다른 일부는 최적의 서열을 발견하기 위한 무작위(randomization) 그리고 선택의 단계에 편입된다. (Regan, 1999, Protein design, Current Opinion in Structural Biology 9: 494-99). 재조작하기 위하여 수정 가능한 구역의 하나는 gly107-alalO8-glylO9로 구성된 papA 상의 표면 루프이다. 이 루프는 이종 펩티드가 성공적으로 삽입될 수 있는 위치에 의하여 만족되는 기준을 충족시킨다. 단백질에서 표면 루프의 위치 결정은 만약 3차원 원자 코디네이션이 사용가능한 경우, 예를 들면, RASMOL과 같은 퍼블릭-도메인 단백질 비주얼라이제이션 컴퓨터 프로그램을 사용하여 단백질 또는 그것의 동종체의 3차원 구조를 조사함으로써 수행된다. (Sayle etal., 1995, RasMol: Biomolecular graphics for all, Trends Biochem. Sci. (TIBS) 20 (9): 374-376;Saqi etal., 1994, PdbMotif--a tool for the automatic identification and display of motifs in protein structures, Comput. Appl. Biosci. 10 (5): 545-46). 이러한 방법으로 아미노산이 표면 루프에 포함되며, 이들 표면 루프의 상대적인 공간적 위치가 결정될 수 있다.

다음은 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 위하여 조작되는 하이브리드 필린 어셈블리 단위의 실시예이나, 이에 한정시키지 않는다:

(i) papK 의 아미노 말단을 갖는 PapH. 표준 방법을 사용하여, papH를 과잉생산(overproduce)하도록 설계된 플라스미드 내에서 papH의 아미노 말단 연을 코딩하는 DNA 서열이 papK의 아미노 말단 연장을 엔코딩하는 DNA 서열로 교체된다. (ii) 첨가된 에피토프와 PapH-papK 하이브리드 : Ras 에피토프 (EEYSAMRDQYMRTGEL; SEQ ID No.: 11, 모노클로날 항체 Y13-259에 의하여 인식됨)를 코딩하는 DNA가 papH의 유전자에 papH의 아미노산 121 및 126을 코팅하는 두 코돈 사이에 삽입된다. (papA의 표면 루프에 대응되는 위치). 단백질의 표면 루프의 위치 결정은 만약 3차원 원자 코디네이션이 사용가능한 경우, 예를 들면, RASMOL과 같은 퍼블릭-도메인 단백질 비주얼라이제이션 컴퓨터 프로그램을 사용하여 단백질 또는 그것의 동종체의 3차원 구조를 조사함으로써 수행된다. (Sayle etal., 1995, RasMol: Biomolecular graphics for all, Trends Biochem. Sci. (TIBS) 20 (9): 374-376; Saqi etal., 1994, PdbMotif--a tool for the automatic identification and display of motifs in protein structures, Comput. Appl. Biosci. 10 (5): 545-46). 이러한 방법으로 아미노산이 표면 루프에 포함되며, 이들 표면 루프의 상대적인 공간적 위치가 결정될 수 있다.

(iii) papA의 아미노 말단과 PapE : 재조합 DNA 기술의 표준 방법을 사용하여, papE를 과잉생산하도록 설계된 플라즈마 내에서 papE의 아미노 말단 연장을 코딩하는 DNA 서열이 papA의 아미노 말단 연장을 엔코딩하는 DNA 서열로 교체된다. (iv) papF의 아미노 말단과 PapK : 재조합 DNA 기술의 표준 방법을 사용하여, papK를 과잉생산하도록 설계된 플라즈마 내에서 papK의 아미노 말단 연장을 코딩하는 DNA 서열이 papF의 아미노 말단 연장을 엔코딩하는 DNA 서열로 교체된다.

(v) papE의 아미노 말단과 PapH : 재조합 DNA 기술의 표준 방법을 사용하여, papH를 과잉생산하도록 설계된 플라즈마 내에서 papH의 아미노 말단 연장을 코딩하는 DNA 서열이 papE의 아미노 말단 연장을 엔코딩하는 DNA 서열로 교체된다.

(vi) 첨가된 에피토프와 PapH-papE 하이브리드 : Ras 에피토프 (EEYSAMRDQYMRTGEL; SEQ ID No.: 11, 모노클로날 항체 Y13-259에 의하여 인식됨)를 코딩하는 DNA가 papH의 유전자에 papH의 아미노산 121 및 126을 코팅하는 두 코돈 사이에 삽입된다. (papA의 표면 루프에 대응되는 위치).

필린 단백질은 공지된 발명에 의하여 발현되고 정제된다. (예 , Bullitt and Makowski, 1995, Structural polymorphism of bacterial adhesion pili, Nature 373: 164-67; Bullittet al., 1996, Development of pilus organelle sub-assemblies in vitro depends on chaperone uncapping of a beta zipper, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 12890-95). 만약 조작될 단백질의 3차원 구조가 공지되어 있지 않으나, 근접한 동종체의 그것이 공지된 경우 (예를 들면, 본질적으로 모든 항체 분자를 위한), 대상 분자의 아미노산 서열, 또는 그것의 일부가 3차원 구조가 공지된 분자의 그것과 정렬될 수 있다. 이 비교 (예를 들면, BLAST (Altschul etal., 1997, Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs, 핵산s Res. 25: 3389-3402) 또는 LALIGN (Huang and Miller, 1991, A time efficient, linear-space local similarity algorithm, Adv. Appl. Math. 12: 337-357)을 사용하여 수행됨)는 3차원 구조가 공지된 단백질에서 표면 루프(베타-turn)을 구성하는 아미노산에 대응되는 대상 단백질의 모든 아미노산을 확인 할 수 있도록 한다. 두 단백질 사이에 높은 서열 유사성이 있는 구역에서, 이러한 확인은 높은 확실성으로 수행된다. 일단 추정되는 루프가 확인되고 여기서 개시된 방법에 의하여 변경되면, 결과물인 구조물은 기대되는 속성을 가지고 있는지 테스트된다. 이 분석은 심지어 예를 들면 공지된 3차 단백질 구조에 기초하여 결정된 것과 같이 매우 믿을 만 한 루프의 확인의 경우에도 수행된다.

본 발명의 일 실시예에서, 어셈블리 단위는 구조적 원소를 포함한다. 전술한 바와 같이, 필린 어셈블리 단위 내의 구조적 원소는 필린 단백질로부터 유래된다. 보다 일반적으로, the 구조적 원소 일반적으로 단단한 구소를 갖는다. (비록 일부 실시예에서는 이하에서와 같이 구조적 원소가 단단하지 않을 수도 있다. ) 구조적 원소는 바람직하게는 알려진 크기와 구조의 정의된 펩티드, 단백질 또는 단백질 단편이다. 이것은 적어도 50개의 아미노산을 포함하며, 일반적으로 2000개 이하의 아미노산을 포함한다. 천연-발생적인 펩티드, 단백질 그리고 단백질 단편은 단백질의 다른 면(faces) 들 중에서 안정적인 공간적 상호관계를 제공하는 구조적 코어를갖는 잘-정의된 구조를 가지므로 펩티드, 단백질 그리고 단백질 단편이 바람직하다. 이들 속성은 미리-설계된 어셈블리 단위의 결합 원소와 기능적 원소 사이의 기하학적 상호관계, 그리고 상대적 위치 그리고 이것이 결합된 어셈블리 단위의 화학양론을 유지하도록 한다.

구조적 원소로서의 단백질의 사용은 무기 나노입자와 같은 다른 선택에 비하여 특별한 장점을 갖는다. 대부분의 무기 나노 입자는 이종성이어서 그들을 나노구조의 어셈블리를 위한 골격(scaffold)에 부적합하도록 한다. 대부분의 각 무기 나노입자는 결점 및 불순물은 물론 면(facets)결정 면 사이에 다른 기하학적 상호관계를 갖는 다른 수의 원자로 제조된다. 이와는 반대로 유사한 크기의 단백질은 매우 균질하고 각각의 단백질은 동일한 수의 아미노산으로 구성되며, 각각은 대략 동일한 방법으로 배열되며, 대부분의 배열의 차이는 오직 열 변동(fluctuations)의 영향에 의한다. 결과적으로, 서로 상호작용하도록 설계된 두 단백질은 항상 동일한 기하학으로 상호작용할 것이며, 그 결과 예측 가능한 기하학 및 화학양론을 갖는 복합체를 형성한다. 이러한 속성은 나노구조의 양적으로 병렬적인 "bottom-up"어셈블리에 필수적이다.

구조적 원소는 나노구조의 결합 원소 및 기능적 원소 사이의 기하학적 상호관계를 유지하기 위하여 사용된다. 그러므로 단단한(rigid) 구조적 원소는 일반적으로 여기서 개시된 단계별 어셈블리 방법을 사용하여 나노 구조를 구성하는 데 바람직하다. 이 단단함은 많은 단백질에서 고유하며 알파-나선 및 베타-시트와 같은 단백질을 만드는 2차 구조적 원소의 속성을 통하여 단백질에 부여된다.

구조적 원소는 3차 구조가 공지된 또는 처음부터 설계된 단백질, 단백질 단편 또는 펩티드의 구조에 기초한다. 어셈블리 단위에서 구조적 원소로서 사용가능한 단백질, 단백질 단편의 예시는 이하에 제한되지 않으나 항체 도메인, 디아바디(diabodies), 단쇄 항체의 다양한 도메인 그리고 박테리아 필린을 포함한다.

일 실시예에서, 구조적 원소, 결합 원소 그리고 기능적 원소는 잘-정의된 예를 들면, 글리신 링커(linkers)에 의하여 분리된 잘-정의된 크기(extent)이다. 다른 실시예에서, 결합 원소는 구조적 원소의 필수 부분인 펩티드 또는 단백질 절편(segments)을 포함하거나, 또는 항체 다양성 도메인의 상보적 결정 구역(CDRs)의 경우에서와 같이 구조적 원소의 한 말단의 다중 루프를 포함한다. (Kabat etal., 1983, sequences of Preoteins of Immunological Interest, U. S. Department of Health and Human Services). CDR은 항체의 다양성 도메인의 필수 부분인 결합 원소이다. 이 다양성 도메인은 구조적 원소를 나타내며 결합 원소를 만드는 구조적 원소와 CDR 사이의 경계는 (비록 많은 항체 서열의 비교에 기초하여 문헌에 잘 정의되어 있으나) 항상 완전히 구조적으로 모호하지는 않을 것이다. 구조적 원소와 결합 원소 사이의 잘 정의된 경계가 항상 존재하는 것은 아니며, 이들 도메인 사이의 경계는, 비록 개별적인 용도에 기초하여 잘 정의되어 있으나, 공간적으로 모호할 수도 있다.

본원 발명의 구조적 원소는 예를 들면 천연-발생 단백질의 코어 구조적 원소를 포함하며, 그것은 그 후 결합 원소, 기능적 원소, 그리고/또는 가변적(flexible) 도메인 [예, 트리-, 테트라- 또는 펜타글리신]을 편입하도록 변형되고, 이로써 우용한 어셈블리 단위를 제공한다. 결과적으로, 일 실시예에서, 존재하는 단백질의 구조가 단백질 또는 단백질 부분의 단단한 구조에 실질적으로 영향을 주지 않고 변형 될 수 있는 단백질 또는 그것의 일부의 구역을 확인하기 위하여 분석된다.

본월 발명의 필린 어셈블리 단위는 결합 원소로서 하나 이상의 필린 또는 결합 유도체 또는 그들의 단편을 포함한다. 필린 어셈블리 단위의 부가적인 결합 원소는 어셈블리 단위에 결합 속성을 부여하는 어떠한 결합 원소 일 수 있으며, 다음에 제한되는 것은 아니나, 필린 결합 원소, 합텐(합텐s), 항원, 펩티드, PNAs, DNAs, RNAs, 아프타머(aptamers), 중합체(polymers) 또는 다른 성분, 또는 다른 결합 원소와 특이적 비-공유 상호작용을 통하여 상호작용할 수 있는 이들의 조합을 포함한다.

일 실시예에서, 둘 이상의 결합 원소를 갖는 어셈블리 단위가 나노 구조를 형성하기 위하여 사용된다. 부가적인 결합 원소가 사용될 수 있다. 예를 들면: (i) 기능적 원소 또는 기능적 성분의 부가 또는 삽입을 위한 부착 지점으로서 (위 표 1 참조); (ii) 고체 기질에 대한 개시 물질(개시 물질)의 부착 지점으로서 ; 또는 (iii) 서브 어셈블리를 위한 부착 지점으로서.

본 발명에 사용된 필린 어셈블리 단위는 또한 기능적 원소를 편입할 수 있다. 기능적 원소는 어셈블리 단위에 편입되며, 기능적 원소 사이에 잘-정의된 공간적 상호관계를 제공하기 위한 방식으로 궁극적으로 일차-, 이차-, 그리고 삼차 나노구조에 편입된다. 이들 기능적 원소 사이에 잘-정의된 공간적 상호관계는 개별적으로 또는 구성되지 않은 혼합물로서는 얻을 수 없는 활성과 속성을 제공하기 위하여 조화를 이루어 작용하도록 한다.

본 발명에서, 기능적 원소에는 펩티드, 단백질, 단백질 도메인, 소분자, 무기 나노입자, 원자, 원자 덩어리, 자성 나노입자, 광학 나노입자 또는 전자 나노입자 등이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다. 일반적으로는 부탁되는 어셈블리 단위의 구조와는 무관한 특정 기능적 원소와 연합된 특이적 활성 또는 성질은 매우 다양한 기능에서 선택될 수 있는데, 예를 들면 단백질에 의해 부여되는 생물학적 성질(가령, 전사, 해독, 결합, 변형 또는 촉매 성질)에서 선택될 수 있다. 다른 구체예에서, 화학적, 유기적, 물리적, 광학적, 구조적, 기계적, 컴퓨터, 자성 또는 센서 성질을 어셈블리 단위에 부여하는데 기능기를 이용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 기능적 원소에는 금속 또는 산화 금속 나노입자(Argonide Corporation, Sanford, FL; NanoEnergy Corporation, Longmont, CO; Nanophase Technologies Corporation, Romeoville, IL ; Nanotechnologies, Austin, TX; TAL Materials,Inc., Ann Arbor, MI); 금 또는 금-피복된 나노입자(Nanoprobes,Inc., Yaphank, NY; Nanospectra LLC, Houston TX); 면역-접합체(Nanoprobes, Inc. , Yaphank, NY); 비-금속성 나노입자(Nanotechnologies, Austin, TX); 세라믹 나노섬유(Argonide Corporation, Sanford, FL); 플리렌(fullerenes) 또는 나노튜브(탄소 나노튜브)(Materials and Electrochemical Research Corporation, Tucson, AZ; Nanolab, Brighton MA; Nanosys,Inc., Cambridge MA; Carbon Nanotechnologies Incorporated, Houston, TX); 나노크리스탈(NanoGram Corporation, Fremont, CA; Quantum Dot Corporation, Hayward CA);실리콘 또는 실리케이트 나노크리스탈 또는 분말(MTI Corporation, Richmond, CA); 나노와어어(Nanosys, Inc. , Cambridge MA); 퀀텀 돗트(Quantum Dot Corporation, Hayward CA; Nanosys, Inc. , Cambridge MA)등을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다.

기능적 원소에는 임의 당분야에 공지된 감지가능한 표식이 포함될 수 있는데, 예를 들면,³²P,³⁵S,³H 및 이와 유사한 종과 같은 방사능 표지; 발색단; 형광단: 화학발광 분자; 효소 표식등을 포함한다.

본 발명의 특정 구체예에서 기능적 원소는 형광단이다. .

표지로 선택할 수 있는 예시적인 형광단 분자를 하기 표 3에서 제공한다.

표 3

기능적 원소 사용할 수 있는 형광 발색단 성분

4-아세타아미도-4'-이소티오시아나토스틸벤-2,2'디설폰산

아크리딘 및 유도체:

아크리딘

아크리딘 이소사아네이트

5-(2'-아미노에틸)아미노나프탈렌-1-설폰산(EDANS)

4-아미노-N-[3-비닐설포닐)페닐]나프탈리미드-3,5디설포네이트

(Lucifer Yellow VS)-(4-아닐노-1-나프틸)멜레이미드

안트라닐아미드

Brilliant Yellow

코우마린 및 유도체:

코우마린

7-아미노-4-메틸코우마린(AMC, Coumarin 120)

7-아미노-4-트리플로오르메틸코우마린(Coumarin 151)

Cy3

Cy5

시아노신

4',6-디아미니디노-2-페닐인돌(DAPI)

5',5"-디브로모피로갈롤-설폰네프탈렌(Bromopyrogallol Red)

7-디에틸아미노-3-(4'-이소사아나토페닐)-4-메틸코우마린

디에틸렌트리아민 펜타아세테이트

4,4'-디이소티오시아나토디하이드로-스틸벤-2,2'-디설폰산

4,4'-디이소티오사아나토스틸벤-2,2'-디설폰산

5-[디메틸아미노]나프탈렌-1-설포닐 클로라이드(DNS, 단실 클로라이드)

4-(4'-디메틸아미노페닐아조)벤조산(DABCYL)

4-디메틸아미노페닐아조페닐-4'-이소시아네이트(DABITC)

에오신 및 유도체:

에오신

에오신 이소티오시아네이트

에리트로신 및 유도체:

에리트로신 B

에리트로신 이소티오시아네이트

에티디움 플로오르레신 및 유도체:

5-카르복시플로오레신(FAM)

5-(4,6-디클로로트리아진-2-yl)아미노플로로레신(DTAF)

2'7'-디메톡시-4'5'-디클로오르-6-카르복시플로로레신(JOE)

플로오르레신

플로오르레신 이소티오시아네이트

QFITC(XRITC)

플로오레스카민

IR144

IR1446

Malachite Green 이소티오시아네이트

4-메틸움벨리페론

오르소 크레소프탈렌

니트로티로신

파라로사니린

Phenol Red

B-피코에리트린

o-프탈디알레히드

피렌 및 유도체 :

피렌

피렌 부티레이트

숙신이미딜 1-피렌 부티레이트

리액티브 레드 4 (Cibacron^®브릴리언트 레드 3B-4)

로다민 및 유도체:

6-카르복시-X-로다민 (ROX)

6-카르복시로다민 (R6G)

리사민 로다민 B 술포닐 클로라이드

로다민 (Rhod)

로다민 B

로다민 110

로다민 123

로다민 X 이소시아네이트

술포로다민 B

술포로다민 101

술포로다민 101의 술포닐 클로라이드유도체 (텍사스 레드)

N, N, N', N'-테트라메틸l-6-카르복시로다민 (TAMRA)

테트라메틸l 로다민

테트라메틸l 로다민 이소시아네이트 (TRITC)

리보플라빈

로솔릭 애시드 테르비움 킬레이트 유도체

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또다른 실시예에서, 기능 원소는 루미놀(Amersham Biosciences), BOLD APB(Intergen), Lumigen APS(Lumigen) 등과 같은 화학발광 기질이다.

또다른 실시예에서, 기능 원소는 효소이다. 효소는 일부 실시예에서, 효소 알칼린 포스파타제, 양고추냉이 과산화효소, 베타-갈랄토시다제등과 같이 특정 화학반응이 수행될 때 검출가능한 신호를 만들 수 있다.

또다른 실시예에서, 기능 원소는 햅텐(hapten)이나 항원(가령, ras)이다. 또다른 실시예에서, 라벨된 항-디곡시제닌이 결합할 수 있는 디곡시제닌(digoxygenin)이나, 라벨된 아비진 분자 또는 스트렙타비딘이 결합할 수 있는 분자가 기능 원소가 된다.

또다른 실시예에서, 기능 원소는 땅콩 렉틴이나 콩 아글루티닌같은 렉틴(lectin)이다. 또다른 실시예에서, 기능 원소는 슈도모나스 익소탁신(Pseudomonasexotoxin)(Chaudhary etal., 1989, A recombinant immunotoxin consisting of two antibody variable domains fused to Pseudomonasexotoxin, Nature 339 (6223):394-97). 같은 독소이다.

펩티드, 단백질, 단백질 도메인들은 융합 단백질을 생성하기 위해 당 분야에 잘 알려진 분자 생물학의 기구들을 이용하여 단백질형 어셈블리 단위에 첨가될 수 있는데 이때, 융합단백질에는 기능 원소가 단백질의 N-말단, 단백질의 C-말단에 도입되거나 단백질의 폴딩을 방해하지 않도록 하는 방식으로 단백질 내의 고리에 도입되어 있다. 비-펩티드 기능 원소는 기능 원소에 특이성을 나타내는 펩티드 또는 단백질 부분에 결합되거나 어셈블리 단위의 단백질 부분에 도입되어 어셈블리 단위에 첨가될 수 있다.

일 실시예에서, 기능적 단위는 어셈블리 단위의 단백질성 부위에 단백질 도메인 또는 펩티드를 접목(splicing)시킴에 의하여 부착된다. 이러한 실시예에서, 결합 특이성 및 어셈블리 단위의 친화도는 어셈블리 단위가 정확하게 폴딩되는 능력에 의존할 것이므로 삽입 부위는 단백질 단위의 폴딩을 방해하지 않도록 선택되어야 한다. 또한, 바람직하게는 삽입이 추가되는 부위는 단백질 단위의 폴딩을 방해하지 않는다. 바람직하게는, 삽입 부위는 단백질의 나머지 부위와 거의 상호작용하지 않는 표면 루프이다. 단백질의 3차원 구조가 공지된 경우, 예를 들면 필린papK의 경우, 그러한 부위는 RasMol (Sayle etal., 1995, RasMol: Biomolecular graphics for all, Trends Biochem. Sci.(TIBS) 20 (9): 374-76)과 같은 컴퓨터 그래픽 프로그램을 사용하여 단백질 구조의 가시적인 조사에 의하여 결정될 것이다. papK의 원자의 3차원 위치의 코디네이트된 결정은 PDB 파일 1PDK에 포함되어 있으며, 이것은 또한 papK와의 복합체인 용해된 결정 구조의 샤페론(chaperone) papD의 3차원 구조를 제공한다. 이 분석에 의하면, 잔기 109-113 (PDB 파일에 따르면 서열 NKGQGE (SEQ ID NO: 12))를 포함하는 표면루프가 존재하며, 이것은 ras 항원과 같은 펩티드의 삽입을 수용하기 위한 높은 잠재력을 가지는 부위를 나타낸다는 것이 명백하다.

일 실시예에서, 하나 이상의 기능적 원소가, (i) 단위의 표면에 존재하고; (ii) 다른 필린-포함 어셈블리 단위와 그 단위의 상호작용에 중요하지 않고; 그리고 (iii) 그 단위 자체의 안정성에 중요하지 않은 것으로 인식되는 부위에 필린 단백질을 포함하는 어셈블리 단위에 첨가된다. 커다란 루프 삽입은 인용되며 많은 재조합 단백질은 성공적으로 안정한, 활성 단백질 구조로 폴드될 수 있다는 것이 나타나 있다. 일부 경우, 그러한 재조합 단백질은 더 이상의 유전적 조작 없이 설계되고 제조되는 반면, 다른 시도에서는 최적의 서열 변형을 확인하기 위하여 무작위화(randomization) 및 선택 단계를 포함한다. (Regan, 1999, Protein redesign, Curr. Opin. Struct. Biol. 9: 494-99). 예를 들면, 재-조작할 수 있는 하나의 필린 구역은 서열gly107-alal08-glyl09를 포함하는 papA상의 표면 루프이다. 이 루프는 이종 펩티드가 삽입되는 위치로서 전술한 기준을 모두 만족시킨다.

또다른 실시예에서, 전체 항체 가변 도메인(가령, 단일-체인 가변 도메인)이 어셈블리 단위에 결합되어(가령, 결합 원소나 구조 원소에 결합되어), 기능 원소에 대한 친화성 표적으로 기능할 수 있다. 본 실시예에서, 전체 항체 가변 도메인이 결합 원소나 구조 원소의 표면 고리에 삽입되는데, 가변 도메인 서열의 각 변에 유연한 부분(가령, 폴리글리신 펩티이드 서열)이 추가되는 것이 바람직하다. 이 폴리글리신 링커는 재조합 융합 단백질의 합성 후 고유 단백질의 폴딩(접힙을 촉진시키는 유연한 스페이서로 기능할 것이다. 항체 도메인은 기능 원소에 대한 결합 특이성에 따라 선택되며, 이는 단백질이나 펩티드, 또는 무기질 물질일 수 있다.

발명의 또다른 실시예에서, 기능 원소는 바람직한 광학적 성질을 가진 퀀텀 도트(반도체 나노결정, 가령, 미국, 캘리포니아 Hayward 소재 Quantum Dot Corporation 사 제품인 QDOT^TM)일 수 있다. 퀀텀 도트는 특정 클래스의 퀀텀 도트에 대한 특이성을 가진 펩티이드를 통해 나노구조에 결합될 수 있다. 당 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려진 바와 같이, 특정 종류의 퀀텀 도트에 대해 친화성 요건을 가진 이러한 펩티드 식별 방법은 당 분야에 잘 알려진 방법을 이용한다. 예를 들어, 이러한 펩티드는 친화성 정제 방법을 이용하여 파아지(phage)-디스플레이 펩티드의 대형 라이브러리로부터 선택된다. 적절한 정제 방법으로는 바이오패닝(Whaley et al., 2000, Selection of peptides with semiconductor binding specificity for directed nanocrystal assembly, Nature 405 (6787): 665-68) 과 친화성 컬럼 클로마토그래피가 있다. 각각의 경우에, 타겟 퀀텀 도트들의 이동성이 제한되고, 재조합 파아지디스플레이 라이브러리가 고착된 퀀텀 도트에 대하여 배양한다. 바이오패닝을 여러 번 실행하고, 퀀텀 도트에 대한 파아지디스플레이 진화성을 표준 방법에 의해 확인하고, 펩티드의 특이성은 표준 ELISA 방법을 이용하여 테스트한다.

일반적으로, 친화성 정제는 여러 친화성 정제 단계를 이용한 반복 과정이다.친화성 정제는 특정 금속 및 반도체에 대한 친화성을 가진 펩티드를 식별하는 데 사용될 수 있다(Belcher, 2001, Evolving Biomolecular Control of Semiconductor and Magnetic Nanostructure, presentation at Nanoscience: UnderlyingPhysical Concepts and Properties, National Academy of Sciences, Washington, D. C. , May 18-20,2001 ; Belcher etal., 2001, Abstracts of Papers, 222nd ACS National Meeting, Chicago, IL, United States, August 26-30,2001, American Chemical Society, Washington, D. C.).

대안으로 파아지-디스플레이 단일 체인 가변 도메인의 라이브러리들을 이용하여, 동일 종류의 선택 과정을 실행하는 것이다. 따라서 일부 실시예에서는, 기능 원소는 결합 원소들을 이용하여 나노구조에 결합되고, 이에 의해, 바람직한 성질을 가진 비-단백질형 나노입자가 나노구조에 부착된다. 이러한 결합 원소는 친화력에 의해 선택된 펩티드로부터, 또는 항체 가변 도메인의 상보성 결정 영역으로부터 도출된다.

나노결정(단일 나노입자)들과 나노입자들의 어셈블리들의 전자적 성질을 비교하는 데 통상적으로 사용되는 전자적 및 광자적 원소들에 대한 통상적인 테스트들은 여기서 소개된 방법과 조성을 이용하여 제작되는 나노구조들의 분석을 위해 사용된다(Murray etal., 2000, Synthesis and characterization of monodisperse nanocrystals and close-packed nanocrystal assemblies, Ann. Rev. Material Science 30:545-610).

일부 실시예에서, 고유하면서도 조정가능한 반도체 나노결정들의 성질들에의해, 이 물질들을 광전도 나노디바이스 및 발광 다이오드를 포함하는 나노디바이스에 사용하는 것이 바람직하다. 개별 나노구조의 전기적 성질은 측정이 어려워, 이 나노구조들의 성질들의 척도로서 광전도도가 이용된다. 광전도도(photoconductivity)는 반도체 및 유기질 고체의 성질 분석에 사용되는 잘 알려진 현상이다. 광전도도는 절연 유기질 고체에서 분자와 약하게 상호 작용하는 분자들 사이에서 전자를 이동시키는 데 사용되고 있다.

광전류 스펙트럼 응답들이 나노구조의 나노결정들의 흡수 스펙트럼을 매핑하는 데 사용될 수 있고, 개별 나노결정들의 광전류 스펙트럼 응답들에 대해 비교될 수 있다(see, e. g., Murray etal., 2000, Synthesis and characterization of monodisperse nanocrystals and close-packed nanocrystal assemblies, Ann. Rev. Material Science 30: 545-610). 추가적으로, 광학적 및 광형광 스펙트럼이 나노구조의 광학적 성질을 연구하는 데 사용될 수 있다(Murray et al., 2000, Synthesis and characterization of monodisperse nanocrystals and close-packed nanocrystal assemblies, Ann. Rev. Material Science 30: 545-610).

나노결정들 어레이의 형성에 대하여 가해진 제어가 클수록, 생성될 광학적, 전기적, 자기적 현상의 어레이의 폭이 넓어진다. 나노구조 어셈블리에 나노입자들이 3차원의 정확도로 통합되면, 여기서 형성된 고체들의 성질을 3차원적으로 제어하는 것이 가능하며, 따라서, 나노디바이스의 설계에 유용한 이방성 성질들의 호스트를 불러일으킬 수 있다. 이 어셈블리들의 성질을 특성화하는 일상적인 테스트 및 방법들은 당 분야에 잘 알려져 있다(see, e.g., Murray etal., 2000, Synthesisand characterization of monodisperse nanocrystals and close-packed nanocrystal assemblies, Ann. Rev. Material Sci. 30: 545-610).

예를 들어, 단백질과 퀀텀 도트의 결합으로 만들어진 바이오센서가 상용화되어 있다(Alivisatos et al., 1996, Organization of'nanocrystal molecules'using DNA, Nature 382: 609-11; Weiss etal., U.S. Patent No. 6,207, 392 entitled"Semiconductor nanocrystal probes for biological applications and process formaking and using such probes, "issued March 27, 2001). 퀀텀 도트를 고도로 발전된 생물학적 분자(가령, 표준 스트랜디드 DNA나 항체 분자)와 결합시키는 능력은 분자의 타겟에 대한 스펙트럼 핑거프린트를 제공한다. 여러 다른 크기의 퀀텀 도트들을 이용함으로서(이들은 각각 다른 스펙트럼 성질들을 가지게 됨), 서로 다른 세부사항을 가진 분자에 결합된 각각이 동시에 여러 가지 성분들을 감지할 수 있다.

금속이나 반도체의 나노결정들과 퀀텀 도트같은 무기질 구조는 조합된 나노구조의 브랜치-말단들로 나노구조의 단계적-어셈블리에 사용될 수 있다. 이러한 무기질 구조가 추가될 경우, 추가적인 그룹들이 부착될 수 없다. 왜냐하면, 이들은 나노구조에 인공적으로 처리된 어떤 결합 부위 세트들에 대한 중간물질 화학구조를 가지기 때문이다. 이는 단계적 어셈블리에 의해 제작되는 나노구조를 생성하기 위해 어셈블리 단위들이 추가되는 시퀀스에 영향을 미친다. 예를 들어, 특정 나노결정이 나노구조에 추가될 경우, 일반적으로, 상기 나노결정 종류를 인식하고 결합하는 결합 원소들로 추가 어셈블리 단위들을 추가하는 것이 바람직하지 않다. 왜냐하면, 나노결정에 대해 이러한 어셈블리 단위들의 위치 설정을 제어하는 것은 일반적으로 가능하지 않기 때문이다. 따라서, 나노결정을 마지막으로 추가해야 하며, 또는, 특정 종류의 나노결정을 결합시키는 모든 어셈블리 단위들이 추가된 후에 나노결정들을 추가하는 것이 바람직하다. 적절한 실시예에서, 나노결정들은 매트릭스에 결합은 되어 있으나 충분히 이격되어 있는 나노구조에 추가되어, 각각의 나노결정들이 단일 나노구조에 결합될 수 있고, 따라서, 나노구조들의 다중 교차-결합을 방지할 수 있다.

한 실시예에서, 본 발명의 단계적 어셈블리 방법에 따라 제작되는 견고한 나노구조는 나노구조 레버 아암의 단부에 한 원소로 부착되는 한 개의 자성 나노입자를 포함한다. 이는 로컬 지가장의 매우 민감한 센서로 작용한다. 자기장의 존재는 자기적 나노입자의 위치를 변화시키는 기능을 하여, 나노구조 레버 아암을 부착된 고체 기질에 대해 구부러지게 한다. 레버 아암의 위치는, 일부 실시예에서, 나노구조 레버 아암을 따르는 다른 위치들에 대해 원소로 부착되는 광학적 나노입자들의 위치 변화를 통해 감지될 수 있다. 이 레버 아암의 움직임 정도는 자기장을 측정함으로서 표현될 수 있다.

다른 실시예에서, 본 발명의 단계적 어셈블리 방법에 따라 제작된 나노구조들은 전용화된 원소들 없이도 바람직한 성질들을 가진다. 이러한 실시예에서, 단계적 어셈블리 과정은 2차원 또는 3차원적 나노구조를 제공하며, 이때, 나노미터 스케일의 정밀하고 미세하게 형성된 구멍들(pores)을 가진다. 이 구멍들은 미세유체 시스템내 입자들을 필터링하는 데 사용될 수 있다. 본 실시예의 추가 특징에서, 나노구조는 나노구조의 분리 성질을 향상시키는 원소들도 포함하고, 이렇게 잘 형성된 구멍들도 포함하도록 형성되어, 분자의 친수성이나 소수성 성질, 또는 전하들에 대해, 그리고 크기를 바탕으로 한 이격을 가능하게 한다. 이러한 나노구조들은 매우 균일한 패킹 물질과 상기 물질에 기초하여 HPLC 분리에 사용될 수 있다. 이러한 원소들의 예는 요망 크로마토그래피 분리용으로 사용되는 pH에서 양이나 음으로 대전된 한 개 이상의 측쇄들을 포함하는 펩티드 서열을, 그리고 소수성이나 친지방성 측쇄를 가진 한 개 이상의 아미노산을 가진 펩티드 서열을 포함한다.

정션(Junctions)들은 실리콘 기반 전자 칩 등의 마이크로전자 회로에서 "스위치 포인트"로 기능할 수 있는 구조물이다. 일부 실시예에서, 다가 항체(multivalent antibody)나 결합 유도체, 또는 그 결합 단편들이 나노구조로 사용되어, 본 발명의 방법을 이용하여 나노구조에 삽입된다. 이 나노구조 정션들을 포함하는 생물전자학적 및 생물연산학적 디바이스의 예로는 퀀텀 셀룰러 오토마타(QCA)가 있다.

나노구조의 단계별 어셈블리

본 발명의 일 실시예에서 섹션 6 (실시예 1)에 개시된 방법을 사용하는 단계별 어셈블리에 의하여 필린 어셈블리 단위가 나노구조를 형성하도록 조립된다. 이 실시예는 또한 도 3에 도시되어 있으며, 형성되는 나노구조 중간 물질을 모식도를 제공한다.

단계별 어셈블리는 복합체의, 비-주기적(non-periodic), 다중-차원의 나노구조의 양적 병렬적 합성을 가능하게 한다. 여기서 유기 및 무기 성분이 정확하고 정밀하게 미리 설계된 3차원 구조물에 배치된다. 단계별 어셈블리에서, 일련의 어셈블리 단위의 시리즈가 개시 물질(initiator) 단위 그리고/또는 나노구조 중간 물질에 주어진 미리-설계된 순서로 추가된다. 동일한 많은 수의 개시 물질이 사용되며, 소단위가 모든 개시 물질/중간 물질에 동시에 제공되기 때문에, 단계별 어셈블리는 다중의 동일한 나노구조를 양적으로 병렬적 방식으로 조립한다. 바람직한 실시예에서, 개시 물질 단위는 고체 기질, 지지체 또는 매트릭스에 결합된다. 부가적인 어셈블리 단위가 절차에서 유사한 고형 상(solid phase) 중합체 합성에 순차적으로 첨가된다. 나노구조의 중간 물질 단계는 조립되는 동안 그리고 개시 물질 단위에 형성된 결합된 어셈블리 단위를 포함하여, 일반적으로 나노구조 중간 물질 또는 단순히, 나노구조로 설명된다. 어셈블리가 수행되는 나노구조 중간 물질에 각 어셈블리 단위를 첨가하는 것은 앞서 첨가된 어셈블리 단위에 의하여 존재하는 결합 원소의 성질에 의존하며 수반되어 첨가되는 어셈블리의 단위와는 독립적이다. 따라서 어셈블리 단위는 오로지 어셈블리가 수행되는 나노구조 중간 물질상에 노출된 결합 원소에만 결합할 수 있다. 즉, 첨가된 어셈블리 단위는 스스로-상호작용하거나 중합하지 않는다.

단일 어셈블리 단위의 결합형 원소들이 비-상보적이고 서로 상호작용하지 않기 때문에, 결합되지 않은 어셈블리 단위들이 이량체나 폴리머를 형성하지 않는다. 추가될 어셈블리 단위들은 중간매개물과의 반응을 완료시키기 위해, 개시 물질 단위나 나노구조 중간물질에 대해 과량으로 제공되는 것이 바람직하다. 단계적 어셈블리 과정 중 결합되지 않은 어셈블리 단위들을 제거하는 것은 고상 기질에 결합된개시 물질을 이용하여 스테이지형 어셈블리를 실행함으로서 촉진된다. 그래서, 결합되지 않은 어셈블리 단위들이 어셈블리 과정의 각 사이클에서 세정되어 없어질 수 있다.

이 기법은 비교적 적은 비-교차 반응, 상보적 결합 쌍들을 이용하여 복합 나노구조의 조합을 제공한다. 몇가지 결합 쌍들만이 필요하다. 왜냐하면, 제한된 수의 결합 원소들만이 어셈블리 과정 중 한 단계에서 어셈블리 중간매개물의 표면에 노출될 것이기 때문이다. 상보 결합 원소들을 가진 어셈블리 단위들이 추가되어, 나노구조 중간물에 대해 배양한다. 그래서, 추가된 어셈블리 단위가 어셈블리 사이클 중 나노구조 중간물질에 부착될 수 있다. 과량의 어셈블리 단위들을 씻어내고, 어셈블리 과정의 차후 단계 중 다른 어셈블리 단위들과의 불필요한 상호작용을 방지할 수 있다. 나노구조에서의 각각의 위치는 단계적 어셈블리 과정을 통해 독자적으로 결정될 수 있고, 개별적인 원소들이 어떤 바람직한 위치에 추가될 수 있다. 본 발명에 따른 단계적 어셈블리 방법은 복합 나노구조들의 대량 병렬 제작을 가능하게 하며, 여러 다른 복합 나노구조들이 수직구조 방식으로 선순위 구조로 추가적으로 자체 조합될 수 있다.

도 4는 발명의 단계적 어셈블리 방법을 한 차원으로 표현하는 실시예를 도시한다. 단계 1에서, 개시 물질 단위가 고체 기질에 고착된다. 단계 2에서, 어셈블리 단위가 개시 물질에 추가되고, 결과적으로 두 단위로 구성되는 나노구조 중간물이 형성된다. 단일 어셈블리 단위만이 본 단계에서 추가된다. 왜냐하면, 두 번째 어셈블리 단위는 자체적으로 상호작용(즉, 중합화)될 수 없기 때문이다.

개시 물질 단위 또는 캐핑 단위(capping unit)을 포함한 단계적 어셈블리 중 차후 추가된 어셈블리 단위는, 추가된 기능 원소를 지닐 수 있고, 또는 앞서 추가된 단위로부터 길이가 다른 구조 단위를 포함할 수 있다. 예를 들어 도 4의 단계 3에서, 한 개의 기능 원소를 포함하는 제 3 어셈블리 단위가 추가된다. 단계 4와 5에서, 추가적인 어셈블리 단위들이 추가되며, 이때, 각각의 단위는 원하는 기능 그룹을 가진다. 따라서, 도 4에 도시되는 단계적 어셈블리의 실시예에서, 제 3, 4, 5 어셈블리 단위 각각은 고유한 기능 원소(도면의 어셈블리 단위 상부로부터 튀어나온 기하학적 형태에 의해 표시됨)를 지닌다.

도 5에 도시되는 단계적 어셈블리의 실시예는 단 두 개의 비-교차 반응성, 상보 결합 쌍들을 필요로 한다. 이 구조물의 자체-조합은 단계 5 말미에서 나타나는 바와 같이, 네 개의 비-교차 작용 상보적 결합형 쌍들을 필요로 한다. 이 구조물의 크기가 증가함에 따라, 요구되는 결합 쌍들의 이러한 숫자 측면에서의 비교적 온건함이 점차 커지게 된다. 예를 들어, 도 5에 도시되는 다섯 개의 단계들을 확장함으로서 조합되는 N개 단위들의 선형 구조의 경우, 단계적 어셈블리는 여전히 두 개에 불과한 비-교차 반응 상보적 결합형 쌍들만을 필요로 한다. 반면에, 자체-어셈블리는 N-1개를 필요로 한다.

제작되는 나노구조의 수는 매트릭스에 결합된 개시 물질의 수에 의해 결정되며, 각각의 1차원 나노구조의 길이는 실행된 어셈블리 주기 수의 함수이다. 한 개 이상의 상이한 기능 원소들을 가진 어셈블리 단위가 사용될 경우, 어셈블리의 순서는 각각의 기능 원소들이 다른 기능 원소들에 대해 가지는 상대적 공간 관계를 규정할 것이다.

본 발명의 단계적 어셈블리 방법의 각각의 단계 이후, 과량의 결합되지 않은 어셈블리 단위들이 제거 단계, 가령, 세정 단계에 의해 부착된 나노구조 중간물질로부터 제거된다. 기판에 결합된 나노구조 중간물질은 적절한 용매(가령, 수용액이나 완충액)로 세정될 수 있다. 용매는 상보적 결합 원소의 구체적인 상호작용을 붕괴시키지 않으면서 비-특정 상호작용에 의해 유지되는 서브단위들을 제거할 수 있다. 적절한 용매는 pH, 염 농도, 화학 조성 등에 따라 변할 수 있다.

나노구조 중간물질을 세정하는 데 사용되는 완충액는Current Protocols in Immunology에 기술된 바와 같이 ELISA 프로토콜로 구현되는 세정 단계에 사용되는 완충액일 수 있다(Chapter 2, Antibody Detection and Preparation, Section 2.1"Enzyme-Linked Immunosorbent Assays, "John Wiley & Sons, 2001, Editors John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober, Series Editor: Richard Coico).

일부 실시예에서, 조합된 나노구조는 "캐핑 단위(capping unit)"을 추가함으로서 "캐핑(capped)"된다. 이는 단일 결합 원소를 지니는 어셈블리 단위이다. 더욱이, 개시 물질 단위가 갈라질 수 있는 결합을 통해 고체 기질에 부착된 경우, 나노구조는 고체 기질로부터 제거되어 분리될 수 있다. 그러나, 일부 실시예에서는 완성된 나노디바이스가 고체 기질에 부착된 상태로 기능적일 것이며, 제거될 필요는 없을 것이다.

어셈블리 단위들을 추가하는 상술한 단계들은 최종 나노구조가 조합될 때까지 반복적인 방식으로 반복될 수 있다. 이후, 개시 물질 단위 내의 지정된 방출 부분(가령, 프로테아제 부위)에서, 매트릭스로부터 제 1 어셈블리 단위를 고착시킨 결합를 파괴함으로서, 또는, 방출을 위한 지정된 공정(가령, pH 저하)을 이용함으로서, 완성형 나노구조가 방출될 수 있다. 도 2 및 3에 도시되는 단계적 어셈블리의 과정은 단계적 어셈블리용으로 제시된 가장 단순한 실시예 중 하나이다. 또다른 실시예에서, 추가적인 결합 원소들을 구비한 어셈블리 단위들이 한 개 이상의 복합 어셈블리를 생성하는 데 사용될 수 있다. 어셈블리 단위들은 개별적으로 추가될 수 있고, 또는, 서브어셈블리로 추가될 수도 있다(도 5). 그 결과, 원하는 설계 매개변수들을 충족시키도록 서로 공간적으로 분포된 기능 원소들을 가진 최종 나노구조가 완성된다. 본 명세서에 기재된 성분 및 방법들은 이 복합 나노구조를, 또는, 한 개 또는 다수의 나노구조의 스테이지형 어셈블리에 의해 형성되는 복합 나노디바이스를, 더 큰 구조물로 조합하기 위한 어셈블리 수단을 제공한다. 다차원 나노구조의 제작은 추가적 결합형 원소들을 지닌 정확하게 분포된 어셈블리 단위들을 개별적인 1차원 나노구조에 통합함으로서 달성될 수 있다. 이때, 상기 추가적인 결합 원소들은 개별 나노구조들을 함께 부착하기 위한 적절한 교차 결합 물질에 의해 인식되어 결합된다. 일부 적절한 실시예에서, 이러한 교차 결합은 항체일 수도 있고, 결합 파생물일 수도 있으며, 그 결합 조각일 수도 있다.

발명의 단계적 어셈블리 방법의 일부 실시예에서, 개시 물질 단위는 고체 기질에 고착된다. 이러한 고착은 임의적이지 않다(예를 들면, 어셈블리 단위의 플라스틱 또는 무작위 바이오티닐화 반응에 단백질을 비-특이적으로 결합시키고, 고정된 스트렙타아비딘에 결합된다). 단지, 매트릭스나 기질에 개시 물질 단위의 특정 원소를 결합시키는 것을 포함한다. 단계적 어셈블리 과정은 다음 어셈블리 단위의 부착을 위해 개시 물질 단위에 방해없는 결합 원소를 필요로 하는 벡터형 공정이다. 개시 물질 단위를 기질에 임의적으로 결합시키는 것은, 일부 예에서, 다음 어셈블리 단위의 부착을 위해 필요한 결합형 원소의 방해를 야기할 것이다. 따라서, 나노구조가 조합될 개시 물질 단위의 수를 줄일 수 있다.

본 발명의 단계적 어셈블리 방법의 다른 실시예들에서는, 개시 물질 단위가 고상 기판에 고착되지 않는다. 이 경우에, 고착되지 않은 개시 물질 단위에 구성된 나노구조에 대해 제거 단계(가령, 세정 단계)가 실행될 수 있다. 1) 개시 물질 단위에 자기적 나노입자를 부착시켜서, 자기장을 가함으로서 비-결합 어셈블리 단위으로부터 나노구조 중간물을 분리시킬 수 있다. 2) 원심분리, 침전, 또는 여과에 의해 비결합어셈블리 단위으로부터 대형 나노구조 중간물을 분리시킬 수 있다. 또는 3) 나노구조 중간물이나 조합된 나노구조가 파괴적 처리(가령, 프로테아제 처리나 화학적 저하)에 내성이 클 경우, 비결합 조합 단위들을 선택적으로 파괴시킨다.

단백질들은 우수한 결합 성질을 가지고 있고, 단백질의 분자간 상호작용을 조작하는 기술도 당 분야에 잘 알려져 있다(Hayashi etal., 1995, A single expression system for the display, purification and conjugation of single-chain antibodies, Gene 160(1) : 129-30; Hayden etal., 1997, Antibody engineering, Curr. Opin.. Immunol. 9 (2): 201-12; Jung etal., 1999, Selection for improved protein stability by phage display, J. Mol. Biol.294(1) : 163-80, Viti etal., 2000, Design and use of phage display libraries for the selection of antibodies and enzymes, Methods Enzymol. 326: 480- 505; Winter etal., 1994, Making antibodies by phage display technology, Annu. Rev. Immunol. 12:433-55). 그러나 나노구조의 스테이지형 어셈블리가 특정 인지 성질을 가진 생물학적 분자, 가령, 단백질이나 핵산처럼 생물학적 분자로 주로 구성된 성분들에 굳이 제한될 필요는 없다. 스테이지형 어셈블리에 의해 제작되는 나노구조들의 여러 일부 실시예에서는 무기질 원자나 분자들의 광학적, 자기적, 또는 전기적 성질이 요구될 것이다.

단백질로 구성되지 않은 성분들이 활용되는 본 발명에 따른 실시예도 여러 가지 존재할 것이다. 다른 실시예에서는, 유기질 분자 및 무기질 분자들로 구성된 나노구조를 형성하기 위해 단백질이나 핵산의 분자 상호작용 성질을 이용하는 것이 가능할 수 있다.

일부 실시예에서, 발명의 단계적 어셈블리 방법들을 이용하여 나노구조로 조합된 성분들에 무기질 나노입자들이 추가된다. 이는 무기질 입자들에 대한 결합을 위해 특별히 선택된 결합형 원소들을 이용하여 이행될 수 있다. 예를 들어, Whaley 등은 반도체 결합 표면에 특별하게 결합하는 펩티드들을 식별해낸 바 있다(Whaley et al., 2000, Selection of peptides with semiconductor binding specificity for directed nanocrystal assembly, Nature 405: 665-68). 한 실시예에서, 이 펩티드들은 표준 클로닝 기술을 이용하여 여기서 소개된 단백질 성분들에 삽입된다. 단백질 구조물의 단계적 어셈블리는 견고한 3차원 배열로 이 결합 사이트들을 분포시키는 분포 수단을 제공한다.

특정 종류의 무기질 나노입자에 대한 결합 사이트들이 모두 제자리에 위치할 경우, 단백질형 어셈블리 단위들을 추가하는 데 사용된 것과 유사한 단계적 어셈블리의 사이클을 이용하여 무기질 나노입자들이 추가될 수 있다. 이를 달성하기 위해, 나노구조 중간물을 배양하는 용액 조건들을 조정하는 것이 일부 실시예에서 필요할 수 있다. 이에 의해, 무기질 나노입자의 용해도(solubility)를 제공할 수 있다. 무기질 입자가 나노구조 중간물에 추가되면, 무기질 나노입자의 어떤 오염에 내재된 마이크로헤테로성질 때문에, 무기질 입자에 추가적인 단위들을 제어 방식으로 추가하는 것이 불가능할 수 있다. 이 헤테로 성질은 추가적인 상호작용의 형태 및 화학성질을 제거 불가능하게 만든다.

도 6은 본 발명의 단계적 어셈블리 방법에 따라 나노구조에 단백질 단위 및 무기질 원소들을 추가하는 도면이다. 단계 1에서, 개시 물질 단위가 고체 기질에 결합된다. 단계 2에서, 어셈블리 단위가 개시 물질 단위에 특별히 결합된다. 단계 3에서, 추가적인 어셈블리 단위가 결합 진행 나노구조에 결합된다. 이 어셈블리 단위는 특정 무기질 원소에 대해 특정한 가공 결합 사이트를 포함한다. 단계 4에서, 무기질 원소(양방향 빗금 타원으로 도면에 표시)가 나노구조에 추가되고, 가공 결합 사이트에 의해 결합된다. 단계 5는 제 2 종류의 무기질 원소에 특정하도록 가공된 결합 사이트로 또 다른 어셈블리 단위를 추가하고, 상기 제 2 무기질 원소(빗금 다이아몬드로 도면에 표시)가 단계 6에서 추가된다.

어셈블리 단위들이 추가된 순서는 어셈블리 공정에 사용되는 교차-반응 결합원소 쌍들의 수를 최소화할 필요성과, 프로덕트 나노구조의 요망 구조 및 활성에 따라 결정된다. 그러므로, 어셈블리의 순서를 결정하는 것은 단계적 어셈블리에 의해 제작될 나노구조의 설계의 일체형 부분이다. 결합 원소들은 요망 나노구조의 단계적 어셈블리를 가능하도록 설계에 의해 선택된다. 결합 원소의 선택이 나노구조에 통합되기 위한 원소에 독립적이기 때문에, 요망 공간 방위로 원소들의 위치설정을 제공하도록, 필요한 원소 및 결합 원소들로 어셈블리 단위를 제작할 수 있도록 결합 원소들이 배치되고 짝지워져야 한다.

예를 들어, 세 개의 결합 쌍을 구성하는 6개의 결합 원소들을 이용하여 설계된, 두 개의 결합 원소들을 포함하는 어셈블리 단위들은 상호작용하지 않는 18쌍의 결합 원소들 중 일부를 포함할 수 있다. 결합 원소들의 쌍은 21개까지 가능하지만, 21개 중 3개의 쌍은 서로 상호작용하고(가령, A-A'), 어셈블리 단위에서의 이들의 이용은 서로 동일한 어셈블리 단위들의 자체상관을 이끈다. 아래 설명되는 예에서, 결합 원소들은 A, A', B, B', C, C'로 표시되고, 이때, A와 A', B와 B', C와 C'은 결합 원소들의 상보 쌍(결합 쌍)들이다. 즉, 이들은 서로 특정하게 결합하지만, 나머지 네 결합 원소들과는 결합하지 않는다. 6개의 대표 어셈블리 단위들은 각각 두 개의 결합 원소들을 포함하며, 각각의 결합 원소는 동일하지 않으면서 보완형이 아닌 결합 원소들을 포함한다. 이들이 아래에 도시된다. 본 설명에서, 각각의 어셈블리 단위는 고유 원소를 추가로 포함하며(6개 한 세트 중 하나), F1에서 F6까지로 표현된다. 6개의 어셈블리 단위들이 아래와 같이 표시될 수 있다.

A-F₁-B

B'-F₂-A'

B'-F₃-C'

C-F₄-B

B'-F₅-A'

A-F₆-C'

여기서 공개된 방법들에 따른 스테이지형 어셈블리는 다음의 선형 나노구조를 조합하는 데 사용될 수 있으며, 각각의 어셈블리 단위의 순서 및 상대적 벡터 방향은 원소들의 순서에 독립적이다. 심볼 ●는 개시 물질이 부착된 고체 기질을 표시하며, 더블콜론(::)은 어셈블리 단위들의 특정 상호작용을 표시한다.

본 도해로부터 명백히 드러나는 바와 같이, 다수의 고유 어셈블리 단위들이 소수의 상보적 결합 원소들을 이용하여 만들어질 수 있다. 더욱이, 다수의 고유 복합 나노구조들의 제작에 소수의 상보 결합 원소들만이 필요하다. 왜냐하면, 각각의 단계적 어셈블리 사이클에 한 종류의 어셈블리 단위만이 추가되며, 따라서, 결합 원소들이 완성 나노구조 내 한 어셈블리 단위의 위치를 모호하게 하지 않으면서 반복적으로 사용될 수 있다.

앞서 도시되는 경우 각각에서, 두 개나 세 개의 결합 쌍들만이 사용되었다. 이 구조물의 자체-어셈블리는 7개의 비-교차반응 결합 쌍들의 이용을 필요로 한다. 이 선형 구조물의 수가 N개의 단위에 해당하고 단계적 어셈블리를 이용하여 선형 구조물이 조합될 경우, 이들은 두 개나 세 개의 결합 쌍들만을 필요로 할 것이다. 그러나, 자체-어셈블리의 경우엔, (N-1)개의 비-교차반응, 보완형 결합 쌍들을 필요로 할 것이다.

발명의 또다른 태양에 따르면, 상술한 한 어셈블리 단위의 두 결합 원소의 위치를 상호 교환함으로서, 부착된 원소의 공간 위치 및 방향이 나노구조의 전체 구조 내에서 변경될 것이다. 발명의 본 태양은 여기서 공개되는 바와 같이 나노구조의 스테이지형 어셈블리에 의해 제공되는 설계 유연성의 또다른 태양을 설명한다.

각각의 어셈블리 단위를 개시 물질이나 나노구조 중간물질에 부착하는 것은 개시 물질이나 나노구조 중간물질이 지닌 한 개 이상의 비-결합 상보 결합 원소들과 어셈블리 단위의 한 개의 결합 원소들 간의 특정 결합 쌍 상호작용에 의해 중재된다. 여러 실시예에서, 단 한 개의 비결합형 상보 결합 원소만이 개시 물질이나 나노구조 중간물에 존재할 것이다. 그러나 또다른 실시예에서는 동일한 결합 원소들을 포함하는 어셈블리 중간물 상의 여러 사이트에 여러 동일한 어셈블리 단위들을 추가하는 것이 바람직할 수 있다. 본 실시예의 경우에, 단계적 어셈블리는 어셈블리 단위들의 병렬 추가에 의해 진행되지만, 단일 단위만이 중간물의 한 사이트에 부착될 것이며, 연루된 모든 사이트에서의 어셈블리는 지정된 벡터 방식으로 발생할 것이다.

나노구조의 구조적 통합성은 단계적 어셈블리 과정 전반에 걸쳐 매우 중요하며, 이 어셈블리 단위들은 비-공유적 상호작용에 의해 연결되는 것이 바람직하다. 구체적인 비-공유적 상호작용은 예를 들자면, 어셈블리 단위와 나노구조 중간물간에 발생하는 상호작용이다. 구체적인 상호작용은 전체 단계적 어셈블리 공정에서 상호작용을 안정되게 유지하는 데 충분하도록 어셈블리 단위와 나노구조 중간물간의 복합성에 대한 안정성을 제공하기 위해 적절한 친화성을 나타내야만 한다. 구체적인 비-공유적 상호작용은 적절한 세부사항을 보여야 한다. 그래서, 추가된 어셈블리 단위가 이와 상호 작용하도록 설계된 결합 원소들과만 안정된 상호작용을 형성할 수 있어야 한다. 단계적 어셈블리 과정 중 원소들 사이에서 발생하는 상호작용은 "비가역적"인 것이 바람직하다. 이 요건에 부합하는 결합 상수는 명백하게 규정할 수 없다. 왜냐하면 "비가역적"이라는 것은 "운동학적"개념이고, 결합 상수(binding constant)는 평형 성질을 기반으로 하고 있기 때문이다. 그럼에도 불구하고, 10^-7또는 그 이하의 Kd와의 상호작용(전형적인 다이아바디-에피토프(diabody-epitope)의 Kd와 유사하면서도 높은 친화성)은 원하는 시간 상에서 즉, 나노구조의 단계적 어셈블리 중, "비가역적"으로 기능할 것이다.

분자간 상호작용이 나노구조 이용의 시간스케일에서 "비가역적"으로 기능할 필요는 없다. 일부 실시예에서, 본 발명의 단계적 어셈블리 방법에 의해 제작되는 나노구조들은 그후, 화학적 고착(가령, 파라포름알데히드나 글루타르알데히드를 이용한 고착)에 의해 또는 교차 결합에 의해 안정화된다. 두 단백질을 교차 결합하는 가장 대중적인 기법들은 제 2 어셈블리 단위의 티올 그룹에 제 1 어셈블리 단위의 아민 그룹을 간접적으로 연결하는 과정을 포함한다(Handbook of Fluorescent Probes and Research Products, Eighth Edition, Chapter 2, Molecular Probes,Inc. , Eugene, OR; Loster et al., 1997, Analysis of protein aggregates by combination of cross-linking reactions and chromatographic separations, J. Chromatogr. B. Biomed. Sci.Appl. 699 (1-2): 439-61; Phizicky etal., 1995, Protein-protein interactions: methods for detection and analysis, Microbiol. Rev. 59(1) : 94-123).

발명의 일부 실시예에서, 단계적 어셈블리 방법에 의한 나노구조 제작은 어셈블리 단위들 간의 비-공유 상호작용을 이용하여, 비교적 견고한, 그리고 안정한 어셈블리 단위들을 결합하는 과정을 포함한다. 그럼에도 불구하고, 유용한 어셈블리 단위들에 통합되는 결합 원소들은, 안정하고 견고한 결합 쌍들을 형성하기 위해 제 2 결합 원소와의 상호작용 이전에, 무질서할 수 있다. 즉, 안정하거나 견고하지 않을 수 있다. 따라서 발명의 일부 실시예에서는, 개별 적인 어셈블리 단위들이 조합 전에 불안정하고 유연한 도메인을 포함할 수 있으며, 조합 이후, 보다 견고해질 것이다. 선호되는 실시예에서, 본원의 조성과 방법을 이용하여 제작되는 나노구조는 견고한 구조물이다.

발명의 방법에 따르면, 나노구조의 견고성 분석과, 결함의 식별은 전자현미경같이 당 분야에 잘 알려진 방법을 이용하여 실행된다.

또다른 실시예에서, 고체 표면에 직접 완성 나노구조의 한 단부를 부착함으로서, 즉, 유연한 고정물 없이, 구조적 견고성이 테스트될 수 있다. 그후 나노구조의 다른 한 단부는 핵력 현미경(AFM) 팁에 부착된다. 이는 이동가능하다. 움직이려 시도할 때 팁에 힘이 가해진다. 나노구조가 유연할 경우, 나노구조의 편향에 의해 허용되는 팁 움직임과 공급된 힘간의 비례에 가까운 관계가 나타날 것이다. 이와는 대조적으로, 나노구조가 견고할 경우, 견고한 나노구조가 파괴되는 지점까지, 공급힘의 레벨이 증가함에 따라 나노구조의 편향이나 팁 움직임이 거의 없을 것이다. 이 지점에서, 어떤 추가적인 힘이 공급되지 않더라도 핵력 팁의 큰 움직임이 존재할 것이다. 두 단부의 부착 포인트들이 나노구조보다 강하다면, 이 방법은 유용한 견고성 측정을 제공할 것이다.

본 발명에 따르면, 나노구조의 각각의 위치는 모든 다른 위치로부터 구분할 수 있다. 왜냐하면, 각각의 어셈블리 단위가 그 이웃과 밀접하게, 구체적으로, 그리고 독자적으로 상호 작용하도록 설계될 수 있기 때문이다. 각각의 어셈블리 단위는 나노구조 내에 그 위치로 구분되는 특성이나 활성을 가질 수 있다. 나노구조 내 각각의 위치는 단계적 어셈블리 과정을 통해, 그리고, 요망 위치에 추가되는 원소나 각각의 어셈블리 단위의 성질을 통해 독자적으로 규정된다. 추가적으로, 본원에서 소개되는 단계적 어셈블리 방법 및 어셈블리 단위들은 제대로 형성된 크기, 형태, 기능의 복합 나노구조의 구성을 위해 대형으로, 대량 병렬 행태로, 그리고 자동화전 제작 공정으로 수정될 수 있다.

본 발명의 방법 및 조성들은 본원에서 이용되는 어셈블리 단위들의 구성에사용되는 단백질들이 가질 수 있는 정확한 치수, 균일성, 그리고 공간적 형태의 다양성을 특징으로 한다. 더욱이, 아래 설명되는 바와 같이, 본 발명의 방법은, 유전적 공정 기술이 여기서 소개된 발명의 방법에 사용되는 생물학적 물질의 성질을 수정하고 맞추는데 사용될 수 있기 때문에, 그리고 다량의 이러한 물질을 미세 유기구조 형태로 합성하는 데 사용될 수 있기 때문에, 장점을 가진다.

본원 발명은 또한 예를 들면, 항체 또는 필린 단백질과 같은 대상 단백질의 단편을 포함하는 어셈블리 단위를 사용하는 나노 구조의 단계별 어셈블리를 위하여 제공된다. 본 발명 일 실시예에서, 대상 단백질의 단편으로 구성되거나 이를 포함하는 단백질은 대상 단백질의 적어도 인접하는 4개의 아미노산으로 구성된다. 다른 실시예에서, 단편은 대상 단백질의 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 35 또는 50개의 인접하는 아미노산으로 구성된다. 다른 실시예에서, 그러한 단편은 35, 100, 200,300 또는 350 아미노산 이하이다.

본원 발명은 또한 융합 단백질을 포함하는 어셈블리 단위를 사용하는 나노 구소의 단계별 어셈블리를 위하여 제공된다. 융합 또는 키메릭 단백질의 제조의 생성물은 원하는 단백질 (예를 들면, IgG), 단편, 아날로그, 또는 이종 단백질 서열 (다른 단백질의)에 펩티드 결합으로 결합된 유도체가 있다. 그러한 키메릭(chimeric) 단백질 생성물은 필요한 아미노산 서열을 엔코딩하는 적절한 핵산 서열을 공지된 방법으로 적절한 해독 프레임(reading frame)에서 결찰하고(ligating) 통상적으로 공지된 방법에 의하여 발현시킴으로써 제조될 수 있다. 다른 방법으로는, 그러한 키메릭 생성물은 예를 들면 펩티드 합성기(synthesizer)에 의하여 단백질 합성 기술로 제조될 것이다.

개시 물질질 어셈블리 단위

발명의 단계적 어셈블리 방법에 의해 형성되는 나노구조에 통합된 제 1 어셈블리 단위가 개시 물질 어셈블리 단위이다. 개시 물질 어셈블리 단위는 일부 실시예에서, 공유 또는 비-공유 상호작용에 의해 고체 기질이나 그 외 다른 매트릭스에 부착될 수 있다. 개시 물질 어셈블리 단위는 "개시 물질 단위"이라고도 알려져 있다.

나노구조의 단계적 어셈블리는 선택된 어셈블리 단위를 개시 물질 단위에 비-공유의 벡터 방식으로 추가함으로서 시작된다. 발명의 방법에 따르면, 어셈블리 단위이, 1) 개시 물질 단위의 인큐베이션에 의해, 개시 물질 단위에 추가된다. 일부 실시예에서, 개시 물질 단위는 추가될 다음 어셈블리 단위를 포함하는 솔루션에서, 매트릭스나 기질에 고착된다. 배양 단계에 이어 2) 제거 단계, 가령 세정 단계가 이어진다. 이 단계에서는 과량의 어셈블리 단위들이 개시 물질 단위으로부터 제거된다.

어셈블리 단위들은 특정한, 비-공유 결합 형성을 통해 개시 물질 단위에 결합된다. 다음 어셈블리 단위의 결합 원소들이 선택되어, 개시 물질 단위의 지정 사이트에만 부착되게 된다. 한 개의 어셈블리 단위만이 제 1 단계 어셈블리 사이클 동안 개시 물질 단위의 타겟 결합 원소에 추가될 수 있고, 타겟 개시 물질 단위에 대한 어셈블리 단위의 결합은 벡터 방식이다. 단계적 어셈블리는 나노구조의 요망 설계에 따라 모든 요망 어셈블리 단위들이 나노구조에 통합될 때까지 단계 1, 2를반복한다.

발명의 단계적 어셈블리 방법의 선호되는 실시예에서, 개시 물질 단위는 기판에 고착되고, 추가적인 단위들은 고체 상태 폴리머 합성과 유사한 과정으로 순차적으로 추가된다.

개시 물질 단위는 어셈블리 단위의 카네고리로서, 발명의 어셈블리 단위에 포함되는 것으로 앞서 설명한 여러 구조적, 결합형, 기능적 원소들을 포함할 수 있다. 따라서 개시 물질 단위는 다음의 분자, 또는 결합 파생물, 또는 그 결합 조각들 중 어느 것도 포함할 수 있다. 그 예로는, 모노클로널 항체, 다중 특이적 항체, Fab나 F(ab')₂, 조각, 단일-체인 항체 조각(scFv), 이중 특이적, 키메라/이중 특이적 이형이량체 F(ab')₂, 다이아바디 또는 다량체 scFv 조각, 세균성 필린 단백질, 루이신 지퍼-형 코일, 4-나선 번들, 펩티드 에피토프, 또는 PNA, 또는 그 외 다른 종류의 어셈블리 단위가 있다.

일부 실시예에서, 발명은 한 개 이상의 결합 원소를 포함하는 개시 물질 어셈블리 단위를 제공한다. 다른 실시예에서, 발명은 두 개 이상의 결합 원소를 가진 개시 물질 어셈블리 단위를 제공한다.

개시 물질 단위는 여러 방식으로 매트릭스에 고착될 수 있다. 고착 방법의 선택은 개시 물질 단위 종류, 최종 나노구조가 매트릭스로부터 제거되어야 하는 지 여부, 최종 나노구조의 화학 구조 등을 포함한 여러 설계 인자들에 의해 결정될 것이다. 잠재적 고착 방법은, 개시 물질 에피토프에 대한 항체 결합, His 태그 개시물질, 매트릭스 결합 도메인을 지닌 개시 물질 단위, 항체나 항체-파생 개시 물질 단위용 항체 결합 단백질(가령, 단백질 A나 단백질 G), 바이오티닐레이티드 개시 물질의 스트렙타비딘 결합, PNA 고착, 그리고 개시 물질의 매트릭스에 대한 특이적 공유 결합에 의한 부착 등을 포함할 수 있다.

일부 실시예에서, 개시 물질 단위는 고체 기질에 고착된다. 개시 물질 단위는 항체나 항원의 고착을 위해 당 분야에 통상적으로 사용되는 방법들을 이용하여 고체 기질에 고착될 수 있다. 항체나 항원의 고착을 위해 당 분야에 알려진 기술은 수없이 많다. 이 방법들로는, 플라스틱 ELISA 플레이트에 대한 비-특정 흡착, 단백질의 바이오티닐레이션, 그후, 플라스틱 기질에 앞서 흡착된 스트렙타비딘이나 아비딘에 결합함으로서 고착하는 방법이 있다(Sparkset al., 1996, Screening phage-displayed random peptide libraries, in Phage Display of Peptides and Proteins, A Laboratory manual, editors, B. K. Kay, J. Winter and J. McCafferty, Academic Press, San Diego, pp. 227-53). ELISA 미량적정 플레이트에 추가하여, 단백질은 Sepharose(Dedman etal., 1993, Selection of target biological modifiers from a bacteriophage library of random peptides: the identification of novel calmodulin regulatory peptides, J. Biol. Chem. 268; 23025-30)나 상자성 비드(Sparks etal., 1996, Screening phage-displayed random peptide libraries, in Phage Display of Peptides and Proteins, A Laboratory manual, editors, B. K. Kay, J. Winter and J. McCafferty, Academic Press, San Diego, pp. 227-53)같은 다른 고체 지지물에 고착될 수 있다. 사용될 수 있는 추가적인 방법은 알데히드를 함유한 고체 지지물에 아민-함유 생물학적 분자를 환원식 아미노화함으로서 고착을 시킬 수 있다(Hermanson, 1996, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, p. 186). 또한, 어느 단부에 이미도에스테트 그룹을 가진 동종 이가기능성 교차 결합 물질, 디메틸 피멜리미데이트(DMP)(Hermanson, 1996, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, pp. 205-06)를 이용함으로서 고착을 행할 수 있다. 결합 단백질 A를 함유한 불용성 지지물에 항체 분자를 고착화시키는데 이 시약을 사용되고 있다(Schneider etal., 1982, A one-step purification of membrane proteins using a high efficiency immunomatrix, J. Biol. Chem. 257, 10766-69).

특정 실시예에서, 고착된 항원/합텐(hapten)을 인지하고 결합하는 고착 도메인(T)과, 추가적인 어셈블리 단위가 단계적 어셈블리에 순차적으로 추가되는 대응 도메인(A)을 포함하는 다이아바디가 개시 물질 단위이다. 항체 8F5는 사람의 리노바이러스(rhinovirus)(Serotype 2) 바이러스성 캡시드 단백질 Vp2로부터 도출된 항원 펩티드 VKAETRLNPDLQPTE(SEQ ID NO: 159)에 대한 매개물로서, T 도메인으로 사용된다(Tormo et al., 1994, Crystal structure of a human rhinovirus neutralizing antibody complexed with a peptide derived from viral capsid protein VP2, EMBO J. 13 (10): 2247-56). 도메인은 Diabody Unit 1에 대하여 앞서 설명한 동일한 동일한 리소자임 항-이디오타입 항체(E5.2)이다. 완성된 개시 물질 어셈블리 단위는 따라서 대응 CDR로 8F5x730.1.4(TxA)를 지닌다. 개시 물질 단위는 다이아바디를 포함하는 구조적 원소들과 결합 원소들을 특성으로 하기 위해 앞서설명한 방법을 이용하여 기능적으로 구축된다.

개시 물질 단위를 고체 지지물 매트릭스에 고착시키기 위해 Factor Xa 시퀀스, IEGR의 N-말단에서, 그리고 Factor Xa 시퀀스와 항원 펩타이드 시퀀스 사이에서, 겹쳐이어지는 짧고 유연한 링커를 통해 리노바이러스 항원 펩타이드가 프로테아제 인지 펩타이드에 융합될 수 있다(Nagai and Thogersen, 1984, Generation of beta-globin by sequence-specific proteolysis of a hybrid protein produced in Escherichia coli, Nature309 (5971): 810-12). 이 융합 펩타이드는 CH-Sepharose 4B(Pharmacia)에 공유 방식으로 링크될 수 있다. 이는 6-탄소 길이 스페이서 아암을 가지면서 주요 아민을 통한 결합을 가능하게 하는 세파로제 파생물이다. 대안으로, 카르복실 그룹을 통한 공유 부착을 위해 사파로제 파생물이 사용될 수 있다. 공유 방식으로 부착된 융합 단백질은 개시 물질 단위(TxA)의 고착 도메인 "8F5"에 대한 인지 에피토프로 기능할 것이다.

개시 물질이 고착되면, 추가적인 다이아바디 단위들이 결합 도메인 A'으로붙 한 방향으로 스테이지 어셈블리에서 추가적으로 추가될 수 있다. 단계적 어셈블 리가 완료되면, 나노구조는 지지체 매트릭스에 크로스링크될 수 있고, 또는, 프로테아제 Factor Xa의 추가에 따라 매트릭스로부터 분리된다. 프로테아제는 코밸런트 방식으로 부착된 항원/Factor Xa 융합 펩타이드를 갈라내어, 지지 매트릭스로부터 나노구조를 분리할 것이다. 왜냐하면, 설계에 의해, 설계된 단백질 어셈블리 단위 내에 어떤 Factor Xa 인지 사이트도 존재하지 않기 때문이다.

Factor Xa의 추가를 필요로 하지 않는 고체 지지 매트릭스로부터 펩타이드융합을 갈라내는 대안의 전략이 또한 구현될 수 있다. 이 방법은 세파로제 매트릭스에 부착되는 갈라지는 스페이서 아암을 이용한다. 이 항원 펩타이드는 페닐-에스테르 연결을 통해 매트릭스에 공유 방식으로 부착된다. 고착된 항체가 개시 물질 어셈블리 단위를 결합시키면, 개시 물질 어셈블리 단위는 지지 매트릭스에 고착된 상태를 유지한다. 그후, 개시 물질 단위/항원 복합체(및 관련 나노구조)가 지지 매트릭스로부터 분리되는 지점인 pH 7.4에서 이미다졸레글리신(imidazoleglycine) 완충액으로 스페이서 아암이 화학적으로 절단된다.

결합 원소들의 특성화 방법

X-RAY 결정학을 이용하여 결합 원소를 특징짓는 방법

많은 경우에, 단백질사이의 분자 인식 혹은 단백질과 펩티드 사이의 분자 인식은 실험적으로 결정될 수 있다. 본 발명의 일면에서, 결합 원소들의 상호 작용을 한정하고 결합쌍을 형성하는데 중요한 상기 단백질-단백질 작용은 당 분야에 흔히 알려진 X-레이 결정학적 방법을 이용하여 확인한다. 이러한 특징은 당 분야의 기술자들이 본 발명의 구성 및 방법에 유용한 결합쌍 상호작용을 인식할 수 있게 한다.

결합 원소의 특이성 및 친화성을 특징짓는 방법

두 개의 상보적 결합 성분들이 특이성으로 상호작용한다는 것을 입증하는 방법은 예를 들어, ELISA 분석, 분석적 한외원심분리(ultracentrifugation), 또는 BIAcore 방법론(1996, Abraham et al, "Determination of binding constants of diabodies directed against prostate-specific antigen using electrochemiluminescence-based immunoassays", J. Mol. Recognit.9(5-6):456-61;

Atwell et al, 1996, Design and expression of a stable bispecific scFv dimer with affinity for both glycophorin and N9 neuraminidase, Mol.Immunal.33(17-18):1301-12; Muller외.1998); A dimeric bispecific miniantibody combines two specificities with avidity, FEBS Lett.432(1-2):45-49), 또는 다른 공지된 유사한 방법 등을 사용하여 이루어질 수 있고, 이들은 분자간 결합 작용의 강도를 입증하고 측정하는데 적합하다.

구조, 결합 및 기능 원소들의 고안 및 제작

본 발명의 구조, 결합 및 기능 원소들의 고안 및 이들을 포함하는 어셈블리 단위의 고안은 원하는 결합 상호작용에 있는 결합 작용에서 이들 구조를 분석 및 결정하여 실행할 수 있다. 필린-필린 복합체의 결정 구조를 이용하여 필린-필린 상호작용 구조 및 모양을 예측할 수 있다. 이들 두 개 필린 단백질 사이에 복합체는 아직 결정화해야하지만, 에너지 계산, 고형-몸체 모델링을 이용하여 다중 필린으로 구성된 복합체 구조를 예측할 수 있다(Sauer et al., 1999, structural basis of chaperone function and pilus biogenesis; Science 285: 1058-1061; Choudhury et al. , 1999, X-ray structure of the FimC-FimH chaperone-adhesin complex from uropathogenic Escherichia coli, Science 285: 1061-1066).

한 가지 이상의 기능 원소를 포함하는 유용한 어셈블리 단위 고안은 다음의 단계 전부 또는 일부를 포함하나 이에 국한되지 않은 일련의 결정 및 분석이 관련된다.

(ⅰ) 나노 구조의 원하는 전체 기능에 근거하여 결합될 기능 성분들을 선택하고;

(ⅱ) 타겟 기능, 특히 기능 원소들의 상대적 위치 결정에 근거하여 원하는 구조를 선택하며;

(ⅲ) 원하는 나노구조 속으로 결합되는 기능적 나노 입자들에 대하여 특이성을 갖는 펩티드 또는 단백질을 가령, 조합 라이브러리로부터 선택, 식별, 또는 결정을 통해 결합 성분들을 선택하고,

(ⅳ) 양자 도트(quantum dots)와 같은 나노 입자들을 포함하는 기능 원소들 사이의 필수적 분리에 근거하여, 정확한 구조 및 화학량론을 갖는 결합 원소들을 통합하기 위한 위치 및 정확한 치수를 갖는 적절한 단단한 구조를 제공하도록 구조원소들을 선택하며,

(ⅴ) 상기 어셈블리 단위의 구조적 성분 및 결합 성분들의 폴딩(folding)이 붕괴(가령, β-회전에서의 통합으로인해)되지 않도록 상기 단계(ⅲ)로부터 및 상기 단계(ⅳ)에서 선택된 구소 원소와 펩티드나 단백질 결합 원소를 결합시키는 융합 단백질을 디자인하고,

(ⅵ) 상기 나노 구조의 전체 디자인에서 상기 생성된 융합 단백질을 컴퓨터 모델링하고, 기능적 규격에서 필요로하는 구조적 치수들을 최적화하도록 디자인을 정제하며, 또는

(ⅶ) 단계적으로 어셈블리되는 어셈블리 순서를 정한다.

구조적 성분 단백질의 변경에는 단백질의 아미노산 서열의 삽입, 결손, 또는 변형이 있다. 많은 경우, 본래의 단백질에 존재하지 않던 결합 원소들을 추가하기위하여 삽입 또는 대체 등의 변경이 이루어진다. 삽입 돌연변이가 성공적인가를 결정하는 통상적 시험으로는 원이색성(CD, circular dichroism) 스펙트럼을 사용한다. 생성된 융합 돌연변이 단백질의 CD 스펙트럼은 고유 단백질의 CD와 비교될 수 있다.

만일 상기 삽입된 것이 작으면(가령, 짧은 펩티드), 적절히 폴딩된 삽입 돌연변이체의 스펙트럼은 고유 단백질의 스펙트럼과 매우 유사하게 될 것이다. 만일 상기 삽입이 전체적 단백질 영역(가령, 단일 사슬 변수 영역)에서 일어났다면, 상기 융합 단백질의 CD 스펙트럼은 각 소자의 CD 스펙트럼의 합계와 같게 될 것이다(예를 들면, 고유 단백질과 기능 원소를 포함하는 고유 단백질 및 융합 단백질의 것). 융합 단백질의 두 가지 성분이 정확하게 폴딩되었는 지를 검사에 이와 같은 합치 결과를 이용할 수 있다.

선호적으로, 융합 단백질이 성공적으로 만들어졌는지를 테스트한다. 예를 들어, 표적의 모든 부분에 융합 단백질이 결합되는 지를 분석하고, 모든 결합 쌍과 성공적으로 상호작용하는지를 분석한다. 적절한 ELISA 분석; 적어도 한가지 ELISA를 실행하여 나노구조를 만드는데 요구되는 결합쌍 각각에 대해 변형 단백질의 친화성 및 특이성을 테스트한다.

단계적으로 어셈블리하는 방법의 용도 및 이로 인하여 작제된 나노구조.

본 발명의 단계적으로 어셈블리되는 방법 및 어셈블리 단위는 수많은 나노구조를 만드는데 이용할 수 있다. 이와 같은 나노구조의 용도는 명백한데, 예를 들면, 잘 배열된 1차, 2차, 3차원적 섬유, 우리 및 고형물 특히 다른 물질과 연합을허용하는 특수 부착 부위와 같은 고도의 규칙성을 요하는 부분에 이용될 수 있다.

특정 구체예에서, 본 발명의 단계적으로 어셈블리되는 방법에 의해 직제되는 나노구조는 1차원 구조이다. 예를 들면, 단계적으로 어셈블리된 나노구조를 에어로겔, 종이, 플라스틱, 시멘트등의 다른 물질을 보강하는데 이용할 수 있다. 특정 구체예에서, 단계적으로 어셈블리되어 직제된 나노구조는 긴 1차원적인 섬유 형태로 종이, 시멘트, 플라스틱에 결합되어 제조과정 동안 추가 습식 및 건식 인장 강도를 제공할 수 있다.

또 다른 구체예에서, 나노구조는 확인 및 인지 목적에 이용할 수 있는 패턴을 가진 또는 표식이 된 섬유가 될 수도 있다. 이와 같은 구체예에서, 나노구조에는 형광 염료, 퀀텀 도트, 또는 효소와 같은 기능 원소를 포함할 수 있다.

또 다른 구체예에서, 특정 나노구조를 위조 방지 표식으로 종이 및 섬유에 심을 수도 있다. 이와 같은 경우에, 간단한 색을 연결한 항체 반응(시판되는 키트이용)을 이용하여 물질의 원료를 증명할 수 있다. 또는 이와 같은 나노구조를 종이 또는 섬유에 결합전 또는 결합 후에 염료, 잉크 또는 다른 물질에 결합시켜 다른 방식으로 이들의 외양 또는 성질을 변형시킬 수 있다.

또 다른 구체예에서, 나노구조는 제조하는 동안에 잉크 또는 염료에 결합시켜 용해도 또는 혼화성을 증가시킬 수 있다.

또 다른 구체예에서, 섬유와 같은 1차원 나노구조에는 원하는 위치에 한 개 이상의 효소 또는 촉매 원소를 보유한다. 나노구조는 효소적 또는 촉매 반응에 지지구조 또는 골격으로 작용하여 효과를 증가시킨다. 이와 같은 구체예에서, 나노구조는 반응 "어셈블리 라인"을 제공하기 위해 원하는 반응 순서에 효소 또는 다른 촉매를 "얹거나" 위치시키는데 이용된다.

또 다른 구체예에서, 섬유와 같은 1차원 나노구조를 어셈블리 지그(jig)로 이용한다. 두 개 또는 그 이상 성분 예를 들면 기능 단위가 나노구조에 결합되어, 공간적인 방향을 제공한다. 성분들이 결합하거나 융합되고, 나노구조로부터 생성된 융합 산물이 방출된다.

또 다른 구체예에서, 나노구조는 정의된 공간을 가지는 나노입자(예를 들면, 열적, 전자 또는 자성을 가지는 금속 또는 다른 입자)를 적하시키는 서포트 또는 프레임으로 이용할 수 있는 1차원, 2차원 또는 3차원 구조가 되고, 이를 나노와이어 또는 나노회로를 만드는데 이용할 수도 있다.

또 다른 구체예에서, 단계적으로 어셈블리되는 본 발명의 방법을 이용하여 정의된 크기 및 모양을 가지는 나노와이어를 작제하기 위해 1차원 나노구조(섬유)의 전극를 적게 플레이팅할 수 있다. 예를 들면 기능 원소로써 금속 입자를 포함하도록 작제할 수 있다.

또 다른 구체예에서, 기능 원소로써 자성 입자를 포함하는 1차원 나노구조(섬유)를 외부 자장에 배열하여 나노구조안으로 이용되는 유속을 제어한다. 또 다른 구체예에서, 외부 자장을 이용하여 LCD-형 디스플레이에 이용할 수 있는 기능 원소로 광학 부분을 포함하는 나노구조(가령 섬유)을 배열 또는 해체할 수 있다.

또 다른 구체예에서, 나노구조는 전자 현미경의 정확한 크기를 위한 크기 표준 또는 표식으로 이용할 수 있다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 단계적으로 어셈블리하는 방법에 의해 직조되는 나노구조는 2차원 또는 3차원 구조이다. 예를 들면, 한 구체예에서, 나노구조는 일정한 구멍 크기를 가지는 그물로써 2차원 체 또는 필터로 사용할 수 있다.

또 다른 구체예에서, 나노구조는 분자 체 또는 필터로 이용할 수 있는 3차원 6각형 배열로 크기에 의해 입자를 선별적으로 분리하는 정확한 직경의 규칙적인 수직 포어를 제공한다. 이와 같은 필터는 용액의 멸균(예를 들면 미생물 또는 바이러스 제거) 또는 일련의 분자량을 걸러내는 필터로 사용할 수도 있다. 이와 같은 구체예에서, 구조 원소 또는 기능 원소와 같은 구멍의 성분을 변형시켜, 특이적인 표면 성질(가령, 친수성 또는 소수성, 특정 리간드에 결합하는 능력)을 제공할 수 있다. 이와 같은 여과 장치의 장점 중에는 균질하고 선형인 구멍과 매트릭스에 대한 구멍의 비율이 높다는 것이다.

당업자는 여기에서 설명하는 방법 및 어셈블리 단위를 이용하여 다양한 2차원 및 3차원 구조 예를 들면 다각 구조(8각형) 및 삼각형에서 만든 테트라헤드론, 이코사헤드론과 같은 개방 구조, 사각 및 직각에서 만든 상자 또는 큐브(예를 들면 11, 실시예 6에서 설명하는 큐브)를 만들 수 있다. 구조 원소들의 상이한 축상에서 조작할 수 있는 결합 및 기능 원소 형태에 의해서만 구조 범위가 제한된다.

한 구체예에서, 2차원 또는 3차원 나노구조를 이용하여 기능 단위로 광학, 전자, 자장, 촉매 또는 효소 부분을 포함하는 표면 코팅을 작제할 수 있다. 이와 같은 코팅을 광학 코팅에 이용할 수 있다. 이와 같은 광학 코팅을 이용하여 피복된 물질의 흡수성 또는 반사성을 변경시킬 수 있다.

본 발명의 나노구조를 이용하여 작제된 표면 코팅을 전자 코팅으로 이용할 수 있는데, 예를 들면, 정전기 차단 또는 렌즈의 자체-먼지털이 표면(코팅이 광학적으로 깨끗한 경우)으로 이용할 수 있다. 컴퓨터 하드 드라이버의 표면상에 코팅과 같은 자성 코딩으로 이용할 수도 있다.

이와 같은 표면 코팅을 촉매 또는 효소 코팅에 이용할 수 있는데 예를 들면 표면 보호와 같은 것으로 이용할 수 있다. 특정 구체예에서, 코팅은 항-산화제 코팅이다.

또 다른 구체예에서, 나노구조를 이용하여, 기능 원소로써 광학, 전자, 자성, 촉매 부분을 가지는 오픈 프레임워크 또는 골격을 작제할 수 있다. 이와 같은 골격을 이용하여 상기에서 설명한 것과 같은 광학, 전자, 자성, 촉매 또는 효소 부분에 서포트로 이용할 수 있다. 특정 구체예에서, 이와 같은 골격은 분자의 두꺼운 또는 조밀한 코팅을 만들기 위해 배열된 기능 원소들을 포함하거나 원하는 광학, 전자, 자성, 촉매 또는 효소 성질을 가지는 가용성 미크론-크기 입자를 서포트하기 위해 배열된 기능 원소들을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 나노구조는 프레임워크 또는 골격으로 작용하여 그 위에 효소 또는 항체 결합 도메인이 연결되어 고밀도 다가 처리 부위를 제공하여 불용성 효소에 연결되어 용해시키고, 아양한 분자 종을 포집, 보호 또는 운반한다.

또 다른 구체예에서, 나노구조를 이용하여 어드레스로 불러낼 수 있는 위치를 가지는 고밀도 컴퓨터 메모리를 작제할 수 있다.

또 다른 구체예에서, 나노구조를 이용하여 인위적인 지오라이트(물에서 이온을 흡수할 수 있는 능력을 가진 천연 미네랄(수화 실리케이트)를 만들 수 있는데 이때 나노구조 고안으로 오픈 프레임워크를 통하여 반응물질의 이동을 매우 효율적으로 촉진시킨다.

또 다른 구체예에서, 나노구조를 이용하여 신물질의 기초로 작용할 수 있는 오픈 프레임워크 또는 골격을 만들 수 있는데, 예를 들면, 프레임워크에는 강도, 밀도와 같은 독특한 성질을 보유하고, 다양한 환경에서 안정성 및 입자 포장성을 결정한다.

특정 구체예에서, 본 발명의 단계적으로 어셈블리 단위 되는 방법을 이용하여 계산적인 구조 예를 들면, 공간적으로 조직적인 배열을 이루는 퀀텀으로 구성된 컨텀 셀룰라 오토메타(QCA)를 작제할 수 있다. QCA 기술에서, 개별 전가의 위치에 의해 로직 상태가 인코드되고, 볼테이지 수준에 의해서라기 보다는 공간적으로 위치한 퀀텀 도트로 구성된 QCA 셀에 포함된다. 2진 정도 저장에 필수적인 모양에 따라 공간적으로 퀀텀 도트 입자를 배열하는 순서에 단계적인 어셈블리를 실행할 수 있다. 퀀텀 도트 셀룰라 오토메타를 위한 QCA 셀의 공간적 배치 및 작제를 위해 단계적인 어셈블리 단위를 이용하여 만들 수 있는 로직 장치의 예를 들면, QCA 와이어, QCA 언버터, 머조리티 게이트(majority gates), 풀 에더(full adders) (Amlani etal., 1999, Digital logic gate using quantum-dot cellular automata, Science 284 (5412): 289-91;Cowburn and Welland, 2000), Room temperature magnetic quantum cellular automata, Science 287 (5457): 1466-68; Orlov etal., 1997, Realization of a Functional Cell for Quantum-Dot Automata, Science 277:928-32)등이 포함된다.

발명의 요약

본원 발명은 어셈블리 단위의 다수의 종으로부터 형성된 나노구조를 제공한다. 캡핑(capping) 단위와 같은 일부 예외는 있으나, 이들 어셈블리 단위는 다수의 다른 결합 원소를 포함한다. 본 발명의 나노구조에서, 나노구조는 하나 이상의 어셈블리 단위의 종을 포함한다. 여기서 하나 이상의 결합 원소는 필린 단백질 또는 그들의 결합 유도체 또는 결합 단편을 포함한다. 필린-함유 어셈블리 단위는 두 개의 필린-유도 결합 원소를 함유할 수 있다. 또한, 필린 함유 어셈블리 단위는 구조적 원소, 기능적 원소 또는 양자 모두를 함유할 수 있다.

본 발명의 나노 구조는 적절하게는 단계적 어셈블리 방법을 사용하여 제조된다. 이 방법에서, 하나 이상의 결합되지 않은 결합 원소를 포함하는 나노구조 중간 물질은 다수의 다른 결합 원소를 포함하는 어셈블리 단위와 접촉된다. 여기서:

(i) 상기 다수의 다른 결합 원소의 어느 결합 원소도 스스로와 또는 상기 복수의 다른 결합 원소와 상호작용하지 않으며, 그리고

(ii) 상기 복수 결합 원소의 단일 결합 원소 그리고 나노구조 중간 물질의 단일의 결합되지 않은 결합 원소는 상보적 결합 원소이다.

그 결과, 어셈블리 단위는 나노구조 중간 물질에 비-공유 결합하여 수반되는 사이클에서 사용되는 새로운 나노구조 중간 물질을 형성하며 ;

(b) 결합되지 않은 어셈블리 단위를 제거하는 단계; 그리고

(c) 단계 (a) 및 (b)를 나노 구조를 형성하기에 충분한 횟수로 반복하는 단계.

본 발명에서, 하나 이상의 사이클 내의 상보적 결합 원소는 필린 단백질 또는 그들의 결합 유도체 또는 결합 단편을 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명의 나노구조의 형성에 유용한 하이브리드 필린 단백질을 제공한다. 하이브리드 필린 단백질은 제 1 필린 단백질 및 제 2 필린 단백질의 필린 단백질 본체(body)의 필린 아미노 말단 연장(extension)을 포함하며 그리고 제 1 필린 단백질의 필린 단백질 본체 및 제 2 필린 단백의 필린 아미노 말단 연장이 부족하다. 여기서 제 1 필린 단백질의 아미노 말단 연장은 제 2 필린 단백질의 필린 단백질 본체에 결합하지 않는다.

이하에서 본 발명을 비-제한적인 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다.

실시예 1: 하이브리드 필린 어셈블리 단위의 단계별 어셈블리

이 실시예에서, 하이브리드 필린 어셈블리 단위가 본 발명의 단계별-어셈블리 방법의 단계를 사용하여 구성된다. 고정된(immobilized) papA 및 전술한 바와 같이 조작된 하이브리드 단백질로, 다섯 개의 필린 단위를 포함하며 각각 어셈블리의 제 2 및 제 5 단위 상에 배치된 두 개의 ras 에피토프를 갖는 필라멘트를 조립하는 것이 가능하다. (도 3).

(1) 제 1 단계에서, PapA 단위가 고체 매트릭스에 공지된 기술을 사용하여 고정된다. 예를 들면, 바이오틴 성분(바이오틴 moiety)이 papA의 아미노 말단에 부가된다. ; 이 papA는 그 후 스트렙타비딘(streptavidin)으로 코팅된 표면의 존재하에서 인큐베이션 된다. 스트렙타비딘과 바이오틴의 매우 강한 상호작용은 papA를 표면에 고정시킬 것이다. 단백질을 고체 표면에 고정시키는 많은 다른 방법이 사용될 수 있으며 이들은 해당 분야의 당업자에게 공지되어 있다.

(2) 제 2 단계에서, ras 에피토프를 나타내는 papH-papK 하이브리드 단백질 용액은 고정된 papA와 인큐베이션된다. papH-papK 하이브리드를 용해시키기 위하여 이것을 샤페론 papD와 복합체를 형성할 것이 요구된다. 인큐베이션 동안, papD는 하이브리드 단백질을 papA에 내려놓도록 고정된 papA와 교환될 것이다. 적절한 인큐베이션 시간 후, 대부분의 경우에서 일반적으로 몇 초에서 몇 분, 그리고 예외적으로 몇 시간동안, 과량은 단백질은 세척된다. 이 단계의 생성물은 고정된 papA 그리고 ras 에피토프와 papH-papK 하이브리드를 포함하는 필린 이량체일 것이다.

(3) 제 3 단계에서, papE-papA 하이브리드 단백질 (가능하게는 papD와의 복합체로)의 용액은 단계 2의 고성된 생성물과 인큐베이션된다. 인큐베이션 후 과량의 단백질은 세척된다. 이 단계의 결과는 고정된 papA, ras 에피토프와의 papH-papK 하이브리드 그리고 하이브리드 papE-papA 단백질을 포함하는 필린 삼량체(trimer)일 것이다. (도 3).

(4) 제 4 단계, papK-papF 하이브리드 단백질의 용액이 전술한 단계 3과 같이 단계 3의 고정된 생성물과 함께 인큐베이션된다. 인큐베이션 후 과량의 단백질은 세척된다. 이 단계는 고정된 papA, ras 에피토프와의 papH-papK 하이브리드, 하이브리드 papE-papA 단백질 그리고 하이브리드 papK-papF 단백질을 포함하는 필린 사량체(tetramer)를 생성한다. (도 3).

(5) 제5 단계에서, 삽입된 ras 에피토프를 갖는 papH-papE 하이브리드 단백질 용액(가능하게는 papD와의 복합체로)이 단계 4의 고정된 생성물과 함께 인큐베이션 된다. 인큐베이션 후 과량의 단백질은 세척된다. 이 단계의 결과는

필린 오량체(pentamer)를 생성할 것이다.

고정된 papA, ras 에피토프로의 papH-papK 하이브리드, 하이브리드 papE-papA 단백질, 하이브리드 papK-papF 단백질 그리고 ras 에피토프로의 papH-papE 하이브리드

(도 17).

단계 2-5에서 사용된 것과 동일한 방식으로 필린 단위를 연속적으로 첨가함으로써 보다 복잡한 구조물을 구성하는 것이 가능하다.

실시예 2: 단계적 어셈블리를 위한 프로토콜

다음의 단계적으로 어셈블리하는 과정을 도 3에서 설명한다. 생성된 나노구조는 도 3, 단계 11에서 설명한다.

단계적으로 어셈블리되는 단계 과정

단계 1 a) 어셈블리 단위-1 첨가

b) 세척

단계 2 a) 어셈블리 단위-2 첨가

b) 세척

단계 3 a) 단계 1 반복

단계 4 a) 어셈블리 단위-3 첨가

b) 세척

단계 5 a) 단계 1 반복

단계 6 a) 어셈블리 단위-4 첨가

b) 세척

단계 7 a) 단계 2 반복

단계 8 a) 어셈블리 단위-5 첨가

b) 세척

단계 9 a) 단계 1 반복

단계 10 a) 단계 2 반복

단계 11 a) 단계 1 반복

실시예 3 : 거대분자 나노구조 제작

거대분자 어셈블리를 만들기 위해, 본 발명의 단계적으로 어셈블리시키는 방법을 이용하여 두 가지 어셈블리된 나노구조 중간물질을 서로 결합시킨다. 이 실시예는 두 개 나노구조 중간물질에서 거대분자 나노구조를 제작하는 것을 설명한다.

도 8는 도 3에서 설명하는 단계적으로 어셈블리시키는 프로토콜에서 만들어진 두가지 나노구조의 단계적 어셈블리 방법을 설명한다. 도 3의 단계 11에는 나노구조 중간 물질-1을 설명하고 있다. 다음의 프로토콜은 도 8에서 설명하는 상보적인 결합쌍이 연합되어 두 개 나노구조 중간물질을 첨가하는 것을 설명한다. 생성된거대분자 나노구조는 도 8, 단계 5에서 설명한다.

단계적 어셈블리단계	과정
단계 1	단락 8에서 설명하는 단계적으로 어셈블리하는 프로토콜의 단계 1-11(실시예 3)
단계 2	a) A'캐핑 단위 첨가b) 세척
단계 3	서포트 매트릭스에서 나노구조 중간물질-1제거 및 분리
단계 4	단락 8에서 설명하는 단계적으로 어셈블리하는 프로토콜의 단계 1-8 실행, 서포트 매트릭스에 부탁된 나노구조중간 물질-2이 남는다
단계 5	a) 나노구조 중간물질-1 첨가b) 세척

실시예 4: 광 분산을 이용하여 편광 분석

이 실시예에서 이용된 것과 같은 다이아보디(diabodies)와 같은 거대분자 단량체의 중합정도는 빛 분산을 이용하여 분석할 수 있다. 광 분산 분광계 가령, DAWN-DSP 분광계(Wyatt TechnologyCorp. , Santa Barbara, CA)와 같은 광 분산 측정으로 평균 무게, 분자량, 입자 크기 모양, 입자-입자 쌍의 상관관계 결정에 대해 정보를 제공한다.

실시예 5: 당 구배 침전(gradient sedimentation)을 이용하여 분자양 결정(중합 정도)

길이가 다른 연결된 다이아보디(diabody)는 구역 한회여과에서 당 구배를 이용하여 상이한 속도로 침전한다. Svedberg 단위에서 중합 및 침전 정도산에 정량적인 상관관계를 계산할 수 있다. 이 방법은 일반적으로 자가-어셈블리 효과를 특징짓고, 새로운 다이아보디 단위를 추가하는 각 단계에서 단계적으로 어셈블리되는 공정을 특징화시키는데 유익하다.

실시예 6: 전자 현미경을 이용한 막대의 모양 및 길이

당 구배 분취 및 SDS-PAGE 분석 후에, 막대를 포함하는 부분적으로 정제된 분취물을 육안으로 볼 수 있다. 적절한 분취 시료를 EM 그리드(grid)에 두고, 착색 또는 그림자를 제공하여 이들의 모양을 결정하기 위해 전자현미경을 이용하여 큰 구조를 찾는다.

본 발명은 여기에서 설명하는 특정 구체예에 그 범위를 제한하는 것이 아니며, 또한 전술한 설명으로부터 당업자는 여기에서 설명하는 것에 추가적으로 본 발명의 다양한 변형 가능하다는 것을 인지할 것이다. 이와 같은 변형도 첨부된 청구범위내 본 발명의 범위에 속한다.

여기에서 언급하는 모든 참고 문헌은 전문을 포함하여, 각 개별 공보, 특허 및 특허 출원이 특이적, 개별적으로 명시된 경우에 동일한 정도로 전문을 동일한 목적으로 첨부한다.

임의 공보를 언급한 것은 출원일 이전에 공개된 것으로 본 발명이 선행 발명에 의해 이와 같은 공개가 선행되었다는 것을 인정하는 의도로 해석해서는 안될 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> Nanoframes, Inc. Makowski, Lee <120> Nanostructures containing pilin proteins <130> NANF.P-002WO <140> PCT/US 03/05340 <141> 2003-02-21 <150> 10/080,608 <151> 2002-02-21 <160> 13 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 18 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 1 Ala Val Pro Gln Gly Gln Gly Lys Val Thr Phe Ser Gly Thr Val Val 1 5 10 15 Asp Ala <210> 2 <211> 53 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 2 Pro Cys Gly Ile Asp Ala Ala Gln Ser Ala Asp Gln Ser Val Asp Phe 1 5 10 15 Gly Gln Ile Ser Lys Val Phe Leu Asp Asn Asp Gly Gln Thr Thr Pro 20 25 30 Lys Ala Phe Asp Ile Lys Leu Val Asn Cys Asp Ile Thr Asn Tyr Lys 35 40 45 Lys Pro Ala Thr Gly 50 <210> 3 <211> 33 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 3 Met Ile Lys Ser Thr Gly Ala Leu Leu Leu Phe Ala Ala Leu Ser Ala 1 5 10 15 Gly Gln Ala Ile Ala Ser Asp Val Ala Phe Arg Gly Asn Leu Leu Asp 20 25 30 Arg <210> 4 <211> 37 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 4 Pro Cys His Val Ser Gly Asp Ser Leu Asn Lys His Val Val Phe Lys 1 5 10 15 Thr Arg Ala Ser Arg Asp Phe Trp Tyr Pro Pro Gly Arg Ser Pro Thr 20 25 30 Glu Ser Phe Val Ile 35 <210> 5 <211> 55 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 5 Met Arg Leu Arg Phe Ser Val Pro Leu Phe Phe Phe Gly Cys Val Phe 1 5 10 15 Val His Gly Val Phe Ala Gly Pro Phe Pro Pro Pro Gly Met Ser Leu 20 25 30 Pro Glu Tyr Trp Gly Glu Glu His Val Trp Trp Asp Gly Arg Ala Ala 35 40 45 Phe His Gly Glu Val Val Arg 50 55 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 6 Pro Ala Cys Thr Leu Ala Met Glu Asp Ala Trp Gln Ile Ile Asp 1 5 10 15 <210> 7 <211> 36 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 7 Met Lys Lys Ile Arg Gly Leu Cys Leu Pro Val Met Leu Gly Ala Val 1 5 10 15 Leu Met Ser Gln His Val His Ala Ala Asp Asn Leu Thr Phe Lys Gly 20 25 30 Lys Leu Ile Ile 35 <210> 8 <211> 34 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 8 Pro Ala Cys Thr Val Thr Lys Ala Glu Val Asp Trp Gly Asn Val Glu 1 5 10 15 Ile Gln Thr Leu Ser Pro Asp Gly Ser Arg His Gln Lys Asp Phe Ser 20 25 30 Val Gly <210> 9 <211> 31 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 9 Met Ala Arg Leu Ser Leu Phe Ile Ser Leu Leu Leu Thr Ser Val Ala 1 5 10 15 Val Leu Ala Asp Val Gln Ile Asn Ile Arg Gly Asn Val Tyr Ile 20 25 30 <210> 10 <211> 39 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 10 Pro Pro Cys Thr Ile Asn Asn Gly Gln Asn Ile Val Val Asp Phe Gly 1 5 10 15 Asn Ile Asn Pro Glu His Val Asp Asn Ser Arg Gly Glu Ile Thr Lys 20 25 30 Thr Ile Ser Ile Ser Cys Thr 35 <210> 11 <211> 16 <212> PRT <213> artificial <220> <223> PapH-papK hybrid with added epitope: DNA coding for a Ras epitope <400> 11 Glu Glu Tyr Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Leu 1 5 10 15 <210> 12 <211> 6 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 12 Asn Lys Gly Gln Gly Glu 1 5 <210> 13 <211> 15 <212> PRT <213> Human rhinovirus <400> 13 Val Lys Ala Glu Thr Arg Leu Asn Pro Asp Leu Gln Pro Thr Glu 1 5 10 15

Claims

다음을 포함하는 나노 구조의 단계별 어셈블리 방법:

(a) 하나 이상의 결합되지 않은 결합 원소를 포함하는 나노구조 중간 물질을 다수의 다른 결합 원소를 포함하는 어셈블리 단위와 접촉시키는 단계, 여기서 :

(i) 상기 다수의 다른 결합 원소의 어느 결합 원소도 스스로와 또는 상기 복수의 다른 결합 원소와 상호작용하지 않으며,

(ii) 상기 복수 결합 원소의 단일 결합 원소 그리고 나노구조 중간 물질의 단일의 결합되지 않은 결합 원소는 상보적 결합 원소이며, 이로써 어셈블리 단위는 나노구조 중간 물질에 비-공유 결합하여 수반되는 사이클에서 사용되는 새로운 나노구조 중간 물질을 형성하며 ;

(b) 결합되지 않은 어셈블리 단위를 제거하는 단계; 그리고

(c) 단계 (a) 및 (b)를 나노 구조를 형성하기에 충분한 횟수로 반복하는 단계, 여기서 하나 이상의 사이클 내의 상보적 결합 원소는 필린 단백질 또는 그들의 결합 유도체 또는 결합 단편을 포함한다.
제 1항에 있어서, 나노구조 중간 물질은 표면-결합된 개시 물질 어셈블리 단위를 포함하는 단계별 어셈블리 방법.
제 1항에 있어서, 부가적인 단계인 (d) 나노구조를 하나 이상의 캡핑 단위로캡핑하는 단계를 더 포함하는 단계별 어셈블리 방법
제 1항에 있어서, 하나 이상의 사이클에서 사용된 제 1 어셈블리 단위는 필린 단백질 또는 그들의 결합 유도체 또는 결합 단편을 포함하는 제 1 결합 원소에 공유적으로 결합된 하나 이상의 구조적 원소를 포함하는 단계별 어셈블리 방법
제 4항에 있어서, 구조적 원소는 제 1 결합 원소 그리고 제 2 결합 원소에 공유 결합된 단계별 어셈블리 방법.
제 5항에 있어서, 제 2 결합 원소 필린 단백질 또는 그들의 결합 유도체 또는 결합 단편을 포함하는 단계별 어셈블리 방법.
제 4항에 있어서, 제 1 어셈블리 단위는 안정한 복합체를 형성하기 위하여 제 2 구조적 원소에 결합된 제 1 구조적 원소를 포함하는 단계별 어셈블리 방법.
제 4항에 있어서, 어셈블리 단위는 기능적 원소를 더 포함하는 단계별 어셈블리 방법.
제 7항에 있어서, 기능적 원소가 광활성 분자(photoactive 분자), 포토닉(photonic) 나노입자, 무기 이온, 무기 나노입자, 자성(magnetic) 이온, 자성 나노입자, 전자 나노입자, 금속성 나노입자, 금속 산화물 나노입자, 금 나노입자, 금-코팅된 나노입자, 탄소 나노튜브, 나노결정, 나노와이어(nanowire), 퀀텀 도트(quantum dot), 펩티드, 단백질, 단백질 도메인, 효소, 합텐(hapten), 항원, 바이오틴, 디곡시게닌(digoxygenin), 렉틴, 톡신, 방사성 표지, 형광발색단, 발색단, 또는 화학발광 분자를 포함하는 단계별 어셈블리 방법.
제 1항에 있어서, 하나 이상의 사이클에 사용된 제 1 어셈블리 단위는 기능적 원소 및 필린 단백질 또는 그들의 결합 유도체 또는 결합 단편을 포함하는 결합 원소를 포함하는 단계별 어셈블리 방법.
제 9항에 있어서, 기능적 원소는 광활성 분자, 포토닉 나노입자, 무기 이온, 무기 나노입자, 자성 이온, 자성 나노입자, 전자 나노입자, 금속성 나노입자, 금속 산화물 나노입자, 금 나노입자, 금-코팅된 나노입자, 탄소 나노튜브, 나노결정, 나노와이어, 퀀텀 도트, 펩티드, 단백질, 단백질 도메인, 효소, 합텐, 항원, 바이오틴, 디곡시게닌, 렉틴, 톡신, 방사성 표지, 형광발색단, 발색단, 또는 화학발광 분자를 포함하는 단계별 어셈블리 방법
제 1항에 있어서, 상보적 결합 원소의 특이성 비-공유 상호작용을 공유 결합으로 전환함으로써, 결합이 안정화되는 포스트(post)-어셈블리 전환 단계를 더 포함하는 단계별 어셈블리 방법.
제 1항에 있어서, 어셈블리 단위는 안정한 복합체를 형성하기 위하여 서로 결합하는 다수의 서브-어셈블리 단위를 포함하는 단계별 어셈블리 방법.
제 1항에 있어서, 하나 이상의 사이클의 결합 원소 필린 단백질이며 SEQ ID NOS:1-10으로 구성된 그룹에서 선택되는 단계별 어셈블리 방법
제 1항에 있어서, 하나 이상의 사이클의 결합 원소는 하이브리드 필린 단백질인 단계별 어셈블리 방법
제 15항에 있어서, 하이브리드 필린 단백질은 SEQ ID NOS:1, 3,5, 7 and 9으로 구성된 그룹에서 선택되는 N-말단 연장 서열을 포함하는 단계별 어셈블리 방법
제 15항에 있어서, 하이브리드 필린 단백질은 SEQ ID NOS: 2,4, 6,8 그리고 10로 구성된 그룹에서 선택되는 필린 단백질 본체 서열을 포함하는 단계별 어셈블리 방법
제 15항에 있어서, 하이브리드 필린 단백질은 제 1 필린 단백질의 필린 아미노 말단연장 그리고 제 2 필린 단백질의 필린 단백질 본체를 포함하며, 제 1 필린 단백질의 필린 단백질 본체와 제 2 필린 단백질의 필린 아미노 말단연장이 없으며,여기서 제 1 필린 단백질의 아미노 말단연장은 제 2 필린 단백질의 필린 단백질 본체와 결합하지 않는 단계별 어셈블리 방법
다수의 다른 결합 원소를 포함하는 어셈블리 단위의 다수의 종으로부터 형성된 나노구조, 여기서 상기 어셈블리 단위는 하나 이상의 어셈블리 단위의 종을 포함하며, 여기서 제 1 결합 원소는 필린 단백질 또는 그들의 결합 유도체 또는 결합 단편을 포함함.
제 19항에 있어서, 제 1 결합 원소는 SEQ ID NOS: 1-10로 구성된 그룹으로부터 선택되는 필린 단백질을 포함하는 나노구조.
제 19항에 있어서, 필린 단백질은 하이브리드 필린 단백질인 나노구조.
제 19항에 있어서, 21, 하이브리드 필린 단백질은 SEQ ID NOS: 1,3, 5,7 그리고 9로 구성된 그룹에서 선택되는 N-말단 연장서열을 포함하는 나노구조.
제 21항에 있어서, 하이브리드 필린 단백질은 SEQ ID NOS: 2,4, 6,8 그리고 10로 구성된 그룹에서 선택되는 필린 단백질 본체 서열을 포함하는 나노구조.
제 21항에 있어서, 하이브리드 필린 단백질은 제 1 필린 단백질의 필린 아미노 말단연장 및 제 2 필린 단백질의 필린 단백질 본체를 포함하며, 제 1 필린 단백질의 필린 단백질 본체 및 제 2 필린 단백질의 필린 아미노 말단연장이 없으며, 여기서 제 1 필린 단백질의 아미노 말단연장은 제 2 필린 단백질의 필린 단백질 본체와 결합하지 않는 나노구조.
제 19항에 있어서, 제 1 어셈블리 단위는 기능적 원소를 더 포함하는 나노구조.
제 25항에 있어서, 기능적 원소는 광활성 분자, 포토닉 나노입자, 무기 이온, 무기 나노입자, 자성 이온, 자성 나노입자, 전자 나노입자, 금속성 나노입자, 금속 산화물 나노입자, 금 나노입자, 금-코팅된 나노입자, 탄소 나노튜브, 나노결정, 나노와이어, 퀀텀 도트, 펩티드, 단백질, 단백질 도메인, 효소, 합텐, 항원, 바이오틴, 디곡시게닌, 렉틴, 톡신, 방사성 표지, 형광발색단, 발색단, 또는 화학발광 분자를 포함하는 나노구조.
제 19항에 있어서, 제 1 어셈블리 단위는 구조적 원소를 더 포함하는 나노구조.
제 27항에 있어서, 제 1 어셈블리 단위는 기능적 원소를 더 포함하는 나노구조.
제 28항에 있어서, 기능적 원소는 광활성 분자, 포토닉 나노입자, 무기 이온, 무기 나노입자, 자성 이온, 자성 나노입자, 전자 나노입자, 금속성 나노입자, 금속 산화물 나노입자, 금 나노입자, 금-코팅된 나노입자, 탄소 나노튜브, 나노결정, 나노와이어, 퀀텀 도트, 펩티드, 단백질, 단백질 도메인, 효소, 합텐, 항원, 바이오틴, 디곡시게닌, 렉틴, 톡신, 방사성 표지, 형광발색단, 발색단, 또는 화학발광 분자. 나노구조.
하이브리드 필린 단백질은 제 1 필린 단백질의 필린 아미노 말단연장 및 제 2 필린 단백질의 필린 단백질 본체를 포함하며, 제 1 필린 단백질의 필린 단백질 본체 및 제 2 필린 단백질의 필린 아미노 말단연장이 없으며, 여기서 제 1 필린 단백질의 아미노 말단연장은 제 2 필린 단백질의 필린 단백질 본체와 결합하지 않는 하이브리드 필린 단백질.
제 30항에 있어서, 광활성 분자, 포토닉 나노입자, 무기 이온, 무기 나노입자, 자성 이온, 자성 나노입자, 전자 나노입자, 금속성 나노입자, 금속 산화물 나노입자, 금 나노입자, 금-코팅된 나노입자, 탄소 나노튜브, 나노결정, 나노와이어, 퀀텀 도트, 펩티드, 단백질, 단백질 도메인, 효소, 합텐, 항원, 바이오틴, 디곡시게닌, 렉틴, 톡신, 방사성 표지, 형광발색단, 발색단, 그리고 화학발광 분자로 구성된 그룹에서 선택되는 기능적 원소를 더 포함하는 하이브리드 필린 단백질.
제 30항에 있어서, 하이브리드 필린 단백질은 SEQ ID NOS: 1,3, 5,7 그리고 9로 구성되는 그룹에서 선택되는 N-말단연장 서열을 포함하는 하이브리드 필린 단백질.
제 32항에 있어서, 하이브리드 필린 단백질은 SEQ ID NOS: 2,4, 6,8 그리고 10으로 구성된 그룹에서 선택되는 필린 단백질 본체 서열을 포함하는 하이브리드 필린 단백질.
제 30항에 있어서, 하이브리드 필린 단백질은 SEQ ID NOS: 2,4, 6,8 그리고 10으로 구성되는 그룹에서 선택되는 필린 단백질 본체 서열을 포함하는 하이브리드 필린 단백질.