CN107849123A - 抗替代性轻链抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明关注抗替代性轻链抗体和其用途。确切地说，本发明关注抗VpreB1抗体和其用途。

Description

抗替代性轻链抗体
背景技术
由B淋巴细胞产生的抗体(Ig)分子由重(H)链和轻(L)链构建。H链和L链氨基端结构域的氨基酸序列是可变的(VH和VL)，尤其在形成抗原组合位点的三个高变区(CDR1、CDR2、CDR3)处是可变的。H链与L链的组装通过L链恒定区(CL)与重链第一恒定(CH1)区之间的二硫键和通过VH与VL域之间的非共价相互作用得到稳定化。
在人类和许多动物(如小鼠)中，编码抗体H链和L链的基因通过对编码V区部分的基因片段进行逐步体细胞重排来加以组装。B淋巴细胞发育的各个阶段的特征在于Ig基因基因座的重排状态(参见例如梅尔彻斯(Melchers),F.和罗林克(Rolink),A.,《B淋巴细胞发育和生物学(B-Lymphocyte Development and Biology)》,保罗(Paul),W.E.编,1999,利平科特(Lippincott),费城(Philadelphia))。
已经在骨髓中鉴别出B细胞的前驱体(前B细胞)，所述鉴别通过其产生一组称作VpreB(1-3)和λ5的基因代替完全发育的轻链和共表达μ重链来进行。
人类VpreB1(CAG30495)的主要同功异型物是145aa长的多肽(SEQ ID NO:1)。其具有Ig V结构域样结构，但缺乏典型V结构域的最后一个β链(β7)，并且具有与任何其它蛋白质都不展示序列同源性的羧基末端。VpreB2具有若干种同功异型物，包括142个氨基酸的小鼠VpreB2多肽(P13373；SEQ ID NO:2)和171个氨基酸长的小鼠VpreB2序列剪接变异体(CAA019641SEQ ID NO:3)。VpreB1和VpreB2序列已经公开于EP 0 269 127和美国专利第5,182,205号；柯林斯(Collins)等人,《基因组生物学(Genome Biol.)》5(10):R84(2004)；和Hollins等人,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》86(14):5552-5556(1989)。人类VpreB3的主要同功异型物(SEQ ID NO:4)是123aa长的蛋白质(CAG30496)，其公开于柯林斯等人,《基因组生物学》5(10):R84(2004)中。
VpreB(1-3)与另一种蛋白质λ5非共价缔合。人类λ5是209个氨基酸的多肽(CAA01962；SEQ ID NO:7)，其携带与抗体轻链具有强同源性的Ig C结构域样结构，并且朝向其氨基末端，携带两个功能上相异的区，其中的一个展示与Vλ结构域β7链的强同源性。人类λ5样蛋白质具有213个氨基酸(NP_064455；SEQ ID NO:8)并且展示与抗体λ轻链恒定区的约84％序列一致性。
对于其它细节，参见以下综述论文：乌山(Karasuyama)等人,《免疫学进展(Adv.Immunol.)》63:1-41(1996)；梅尔彻斯等人,《今日免疫学(Immunology Today)》14:60-68(1993)；和梅尔彻斯,《美国国家科学院院刊》96:2571-2573(1999)。
VpreB和λ5多肽一起形成非共价缔合的Ig轻链样结构，其被称作替代性轻链或伪轻链。在早期preB细胞的表面上，替代性轻链以二硫键连接到与膜结合的与信号转导子CD79a/CD79b杂二聚体缔合的Igμ重链以形成B细胞受体样结构，即所谓的前B细胞受体(前BCR)。
替代性抗体是基于前B细胞受体(前BCR)，其在抗体谱系的正常发育期间产生。不同于抗体，前BCR是由一个抗体重链与两个替代性轻链组分VpreB和λ5配对组成的三聚体。VpreB和λ5两者都由未经历基因重排并且在V(D)J重组开始之前在早期前B细胞中表达的基因编码。前BCR在结构上与成熟免疫球蛋白的不同之处在于其由一个重链和两个非共价缔合蛋白质(VpreB和λ5)组成，即，与抗体中的两个组分相对，所述前BCR具有三个组分。此外，尽管VpreB与抗体的VλIg结构域同源并且λ5与Cλ结构域同源，其各自具有非标准肽延伸：VpreB1在其C端具有额外21个残基；λ5在其N端具有50个氨基酸延伸。
已经利用κ样替代性轻链(κ样SLC)鉴别出κ样B细胞受体(κ样BCR)(弗朗西斯(Frances)等人,《欧洲分子生物学杂志(EMBO J)》13:5937-43(1994)；汤普森(Thompson)等人,《免疫遗传学(Immunogenetics)》48:305-11(1998)；兰赫尔(Rangel)等人,《生物化学杂志(J Biol Chem)》280:17807-14(2005))。
兰赫尔等人,《生物化学杂志》280(18):17807-17814(2005)报告作为未经重排Vκ基因产物的Vκ样蛋白质的鉴别和分子表征，其最终与先前由汤普森等人,《免疫遗传学》48:305-311(1998)所报告的cDNA序列一致。然而，弗朗西斯等人,《欧洲分子生物学杂志》13:5937-43(1994)报告具有与B细胞前驱体表面处μ重链缔合的能力的经过重排的生殖系JCk的鉴别和表征，由此提供对用于B细胞发育的λ5路径的替代方案。
已经提出κ样和λ样前BCR共同起作用以促进轻链重排并且确保B细胞祖细胞成熟。对于综述，参见麦凯勒(McKeller)和马丁内斯-瓦尔迪兹(Martinez-Valdez)《免疫学研讨会(Seminars in Immunology)》18:4043(2006)。
替代性抗体的设计和生产的其它细节提供于许(Xu)等人,《美国国家科学院院刊》2008,105(31):10756-61中；2008年10月2日出版的PCT公开WO 2008/118970中，2008年7月11日提交的美国临时申请第61/134,929号，和许等人,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol)》2010,397,352-360，其全部公开内容都以引用的方式明确并入本文中。
已经描述基于丝状噬菌体的组合抗体文库的多样性可以通过打乱重链和轻链基因(康(Kang)等人,《美国国家科学院院刊》,88:11120-11123,(1991))或通过用易错聚合酶链反应(PCR)将无规突变引入到文库中(格拉姆(Gram)等人,《美国国家科学院院刊》,89:3576-3580,(1992))来增加。使用所定义的构架作为产生抗体文库的基础已经由巴巴斯(Barbas)等人,《美国国家科学院院刊》89:4457-4461(1992)(对CD3-H3进行随机化)；巴巴斯等人,《基因(Gene)》137:57-62(2003)(对VκCDR3进行延伸随机化)；和小鸟游(Hayanashi)等人,《生物技术(Biotechniques)》17:310(1994)(通过重叠延伸和PCR同时对抗体CDR区进行突变诱发)描述。其它人报告CDR-H3文库与单一VL基因(尼西姆(Nissim)等人,《欧洲分子生物学杂志》13:692-698(1994))、有限组的VL基因(德·克鲁伊夫(DeKruif)等人,《分子生物学杂志》248:97-105(1995))；或随机的VL基因谱系(格里菲思(Griffiths)等人,《欧洲分子生物学杂志》13:3245-3260(1994))的组合。
还参见美国专利第5,667,988号；第6,096,551号；第7,067,284号，其描述用于使用通用或随机免疫球蛋白轻链产生抗体文库的方法。
纳皮克(Knappik)等人,《分子生物学杂志》296:57-86(2000)描述不同的用于设计和构筑人类抗体文库的概念，其指定为HuCAL(人类组合抗体文库)。此方法是基于发现在免疫反应期间频繁使用的人类VH和VL子家族中的每一个都由一个共同构架表示，产生七个用于重链的HuCAL共同基因和七个用于轻链的HuCAL共同基因，其得到49种可能组合。所有基因都在考虑密码子使用、促进蛋白质聚集的不利残基以及侧接所有CDR的独特和通用限制位点的情况下通过全合成制造。所述方法引起产生含有可以按需要转化成不同抗体形式的CDR的模块化抗体基因。HuCAL抗体文库的设计和合成描述于美国专利第6,300,064号；第6,696,248号；第6,706,484号；和第6,828,422号中。
不同合成物抗体文库的构筑描述于美国专利第8,131,480号中。
发明内容
本发明关注抗替代性轻链(Surrogate Light Chain，SLC)抗体和其用途。
在一个方面，本发明提供能够特异性结合于替代性轻链(SLC)的经过分离的抗体或其抗原结合片段。在一个实施例中，抗体或抗原结合片段特异性结合于SLC的VpreB子单元。在另一个实施例中，VpreB子单元是SEQ ID NO:1的人类VpreB1。在另一个实施例中，VpreB子单元是SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的小鼠VpreB2。在又另一个实施例中，VpreB子单元是SEQ ID NO:4的人类VpreB3。在另一个实施例中，抗体或抗原结合片段特异性结合于SLC的λ5子单元。在另一个实施例中，λ5子单元是SEQ ID NO:7的人类λ5。在又另一个实施例中，λ5子单元是SEQ ID NO:9的人类λ5dTail。
在一个实施例中，本发明提供一种抗体或抗原结合片段，其包含选自由SEQ IDNO:36到51组成的群组的轻链可变区序列。在另一个实施例中，抗体或抗原结合片段包含选自由SEQ ID NO:52到67组成的群组的重链可变区序列。在又另一个实施例中，包含选自由SEQ ID NO:36到51组成的群组的轻链可变区序列的抗体或抗原结合片段进一步包含选自由SEQ ID NO:52到67组成的群组的重链可变区序列。在另一个实施例中，抗原结合片段选自由以下组成的群组：Fab、Fab'、F(ab')2、scFv和(scFv)2片段。
在另一方面，本发明提供含有本文所描述的抗体或抗原结合片段的组合物。在一些实施例中，组合物是诊断组合物。
在另一个方面，本发明提供用于诊断自身免疫性疾病的方法。在一个实施例中，所述方法用于在个体中诊断类风湿性关节炎。在另一个实施例中，所述个体是人类患者。在另一个实施例中，所述方法包含使来自个体的生物样品与特异性结合于人类替代性轻链(SLC)的抗体接触，和测定SLC表达水平。
在又另一方面，本发明提供用于诊断白血病的方法。在一个实施例中，白血病与异常SLC表达相关联。在另一个实施例中，所述方法包含使来自所述个体的生物样品与特异性结合于人类替代性轻链(SLC)的抗体接触，和测定SLC的表达水平。
附图说明
图1展示SEQ ID NO:1的人类VpreB1氨基酸序列(天然前导序列加有下划线)；SEQID NO:2和3的小鼠VpreB2序列；SEQ ID NO:4的人类VpreB3样序列，并且呈「三聚体」形式的截短VpreB1序列的序列展示为SEQ ID NO:5；和SEQ ID NO:6的人类VpreB1氨基酸序列(鼠类Igκ前导序列加有下划线)。加下划线指示VpreB氨基酸序列内的前导序列。
图2展示SEQ ID NO:7的人类λ5序列；SEQ ID NO:8的人类λ5样序列；「三聚体」中称为「λ5dTail」的截短λ5序列的序列(SEQ ID NO:9)；和具有鼠类Igκ前导序列的SEQ ID NO:10的人类λ5dTail序列。加下划线指示λ5氨基酸序列内的前导序列。
图3展示作为SEQ ID NO:35的人类VpreB1-λ5嵌合氨基酸序列(鼠类Igκ前导序列加有下划线)。
图4A和4B展示(A)SEQ ID NO:11的人类Vκ样核苷酸序列和所编码蛋白质的氨基酸序列(AJ004956；SEQ ID NO:12)(天然前导序列加有下划线)，和(B)可能来自所有Vκ家族的Vκ样蛋白质的预测成熟氨基酸序列，其与AJ004956Vκ样原型序列(SEQ ID NO:12)比对各自携带不同长度的延伸(SEQ ID NO:13-24)。
图5A-C展示(A)SEQ ID NO:25的人类JCκ核苷酸序列和所编码蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO:26)(与预测成熟JCk蛋白质相比的独特序列加有双下划线，并且潜在前导裂解序列加有单下划线)，(B)来自残余κJ恒定区重排的预测JCκ样氨基酸序列(J1-J5Cκ)(SEQID NO:27-31)，和(C)JCκ工程化并且分泌经过优化的变异体，包括其中附接鼠类Igκ前导序列加有下划线的JCκ(SEQ ID NO:32)，其中仅附接鼠类Igκ前导序列加有下划线的重组JCκ(SEQ ID NO:33)，和其中附接鼠类Igκ前导序列加有下划线的预测经过加工的JCκ(SEQ IDNO:34)。
图6展示抗人VpreB1Fab蛋白质的轻链序列(SEQ ID NO:36-51)。
图7展示抗人VpreB1Fab蛋白质的重链序列(VH)(SEQ ID NO:52-67)。
图8说明用于抗人VpreB1IgG1(2460B04IgG1)的表征方法的概述。
图9展现抗VpreB1抗体(2460B04IgG1)检测50％血清中HGF结合的2片式替代性抗体。
图10展现抗VpreB1抗体(2460B04IgG1)检测50％血清中HGF结合的3片式替代性抗体。
图11展现抗VpreB1抗体(2460B04IgG1)捕捉50％血清中的2片式替代性抗体。
图12展现抗VpreB1抗体(2460B04IgG1)捕捉50％血清中的3片式替代性抗体。
图13A-D展现用作检测试剂的抗VpreB1mAb(2460B04IgG1)不结合于含有人类VLORF的IgG。
图14A-C展现抗VpreB1mAb不能捕捉含VL的IgG(448C12-HC)。
图15A-C展现抗VpreB1mAb不能捕捉含VL的IgG(2547C02HC)
图16A-C展现抗VpreB1mAb不能捕捉含VL的IgG(2211A01_N56H-HC)。
图17展示免疫前血清样品的PK血清ELISA结果。
图18展示SL-541_αHGF在5分钟到96小时时间点内的PK血清ELISA结果。
图19展示SL-541_αHGF SgG在168小时到672小时时间点内的PK血清ELISA结果。
图20展示SL-656_αHGF SgG在5分钟到96小时时间点内的PK血清ELISA结果。
图21展示SL-656_αHGF SgG在168小时到672小时时间点内的PK血清ELISA结果。
图22展示双特异性替代性抗体的PK特性。
具体实施方式
A.定义
除非另外定义，否则本文所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的一般技术人员通常所理解相同的含义。辛格尔顿(Singleton)等人,《微生物学和分子生物学词典(Dictionary of Microbiology and Molecular Biology)》第2版,约翰·威利父子出版公司(J.Wiley&Sons)(纽约州纽约(New York,NY)1994)向所属领域的技术人员提供在本申请中所用许多术语的一般指导。
所属领域的技术人员将认识到类似或等效于本文所描述的那些方法和材料的许多方法和材料，其可以用于本发明的实践中。实际上，本发明决不限制于所描述的方法和材料。为了本发明的目的，下文定义以下术语。
在整个本申请中，除非另外明确陈述，否则单数的使用包括复数。
在本申请中，除非另外明确陈述，否则使用“或”包括“和/或”。
此外，术语“包括(include/including/included)”不具限制性。
在本发明的情形下，术语“抗体”(Ab)用于指来自来源于V(D)J基因重组的传统重组重链和也来源于VJ基因重组的传统重组轻链的天然抗体或其片段。
“天然抗体”是由两个相同轻(L)链和两个相同重(H)链组成的约150,000道尔顿的杂四聚糖蛋白(glycoprotein)。每条轻链都通过共价二硫键连接到重链，而在不同免疫球蛋白同种型的重链之间二硫键的数目不同。每条重链和轻链还具有规则间隔的链内二硫桥。每条重链都在一端具有可变域(VH)，后接多个恒定域。每条轻链都在一端具有可变域(VL)并且在其另一端具有恒定域；轻链的恒定域与重链的第一恒定域对齐，并且轻链可变域与重链可变域对齐。人们认为是特定氨基酸残基形成了轻链与重链可变域之间的界面，科西亚(Clothia)等人，《分子生物学杂志》186:651(1985)；诺瓦特尼(Novotny)和哈伯(Haber),《美国国家科学院院刊》82:4592(1985)。
关于抗体链的术语“可变”用于指抗体链部分在抗体之间序列广泛不同并且参与每一特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。此类可变性集中于轻链和重链可变域两者中称作高变区的三个区段。可变域的更高度保守部分称作构架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR(分别为FR1、FR2、FR3和FR4)，大部分采用由三个高变区连接的β-折叠构形，所述高变区形成环连接，并且在一些情况下，形成β-折叠结构的一部分。每条链中的高变区通过FR非常接近地保持在一起，并且与另一条链的高变区一起促使形成抗体的抗原结合位点(参见卡巴特(Kabat)等人,《免疫学感兴趣的蛋白质的序列(Sequences ofProteins of Immunological Interest)》,第5版马里兰州贝塞斯达的美国国家卫生研究院的公共卫生署(Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.)(1991),第647-669页)。恒定域不直接涉及抗体与抗原的结合，但展现各种效应子功能，如抗体参与抗体依赖性细胞毒性。
当本文使用时，术语“高变区”是指引起抗原结合的抗体氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(即，轻链可变域中的残基30-36(L1)、46-55(L2)和86-96(L3)以及重链可变域中的30-35(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)；麦克卡伦(MacCallum)等人,《分子生物学杂志(J Mol Biol.)》262(5):732-45(1996)。
术语「构架区」是指所属领域中公认的存在于更具相异性的CDR区之间的抗体可变区部分。此类构架区通常称为构架1到4(FR1、FR2、FR3和FR4)，并且提供用于在三维空间中固定重链或轻链抗体可变区中所发现三个CDR的骨架以使得所述CDR可以形成抗原结合表面。
取决于其重链的恒定域的氨基酸序列，可以将抗体分配成不同类别。存在五种主要抗体类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些抗体中的若干类可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。在一个优选实施例中，在构筑本发明的免疫粘附素中所用的免疫球蛋白序列来自IgG免疫球蛋白重链结构域。对于人类免疫粘附素，使用人类IgG1和IgG3免疫球蛋白序列是优选的。使用IgG1的主要优点是IgG1免疫粘附素可以在固定化蛋白A上高效地得到纯化。然而，当挑选用于特定免疫粘附素构筑的Ig融合搭配物时，应考虑其它结构和功能特性。举例来说，IgG3铰链更长并且更具柔性，以使得其可以提供当与IgG1融合时可能不正确地折叠或起作用的更大“粘附素”结构域。另一个考虑可以是价数；IgG免疫粘附素是二价均二聚体，然而如IgA和IgM的Ig亚型可以分别产生基本Ig均二聚体单元的二聚或五聚结构。对于设计用于体内应用的VEGF受体样结构域/免疫球蛋白嵌合体，由Fc区指定的药物动力学特性和效应子功能也是重要的。尽管IgG1、IgG2和IgG4的体内半衰期都是21天，其在使补体系统活化时的相对效力不同。此外，各种免疫球蛋白具有变化数目的异型同型。
对应于不同免疫球蛋白类别的重链恒定域分别称作α、δ、ε、γ和μ。
来自任何脊椎动物物种的抗体的“轻链”都可以基于其恒定域的氨基酸序列而分配成两种明显不同的类型(称为κ和λ)之一。对本文抗体轻链的任何提及都包括κ和λ轻链两者。
“抗体片段”包含全长抗体的一部分，一般是其抗原结合或可变域。抗体片段的实例包括(但不限于)Fab、Fab'、F(ab')2、scFv和(scFv)2片段。
如本文所用，术语“抗体结合区”是指免疫球蛋白或抗体可变区中能够结合抗原的一个或多个部分。通常，抗体结合区是例如抗体轻链(VL)(或其可变区)、抗体重链(VH)(或其可变区)、重链Fd区、组合的抗体轻链和重链(或其可变区)，如Fab、F(ab')2、单一结构域或单链抗体(scFv)或全长抗体，例如IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型)、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM抗体。
如本文所用，术语“表位”是指具有至少约3到5、优选地至少约5到10或至少约5到15个氨基酸、并且通常不超过约500或约1,000个氨基酸的序列，其定义单独或作为更大序列的一部分结合于响应于此类序列而产生的抗体。表位不限于序列与其所来源于的母体蛋白质部分相同的多肽。实际上，病毒基因组处于持续变化的状态，并且展现在分离株之间相对高的可变性程度。因此，术语“表位”涵盖与天然序列相同的序列以及对天然序列的修饰，如缺失、取代和/或插入。一般来说，此类修饰本质上是保守性的，，但也涵盖非保守性修饰。术语具体包括“模拟表位”，即，不与连续线性天然序列相同或不必在天然蛋白质中出现但在功能上模拟天然蛋白质上表位的序列。术语“表位”具体包括线性和构象表位。
术语“替代性轻链多肽”或“SLC多肽”在本文中用于指VpreB多肽、λ5多肽、Vκ样多肽、JCκ多肽或其变异体。
术语“非替代性轻链分子”或“非SLC分子”在本文中用于指不是SLC多肽的分子。非SLC分子可以是多肽，如细胞因子或抗体片段。
术语“VpreB”在本文中以最广泛意义使用，并且是指任何天然序列或变异型VpreB多肽，具体包括(但不限于)SEQ ID NO:1的人类VpreB1、SEQ ID NO:2和3的小鼠VpreB2、SEQID NO:4的人类VpreB3样序列、SEQ ID NO:5的人类VpreB dT、SEQ ID NO:6的人类VpreB1氨基酸序列和同功异型物(包括剪接变异体和通过翻译后修饰形成的变异体)、其其它哺乳动物同源物以及此类天然序列多肽的变异体。(图1)
术语“λ5”在本文中以最广泛意义使用，并且是指任何天然序列或变异型λ5多肽，具体包括(但不限于)SEQ ID NO:7的人类λ5、SEQ ID NO:8的人类λ5样蛋白质、展示为SEQID NO:9和10的人类λ5dT和其同功异型物(包括剪接变异体和通过翻译后修饰形成的变异体)、其其它哺乳动物同源物以及此类天然序列多肽的变异体。(图2)
λ样替代性抗体的具体实例包括其中VpreB序列(如VpreB1、VpreB2或VpreB3序列，包括天然序列片段和变异体)结合于λ5序列(包括天然序列片段和变异体)的多肽。这种类型的代表性融合物提供于2008年10月2日公开的PCT公开WO2008/118970中，其全部公开内容都以引用的方式明确并入本文中。与异源性前导序列的融合物的实例说明于图3中(SEQID NO:35)。
术语“变异型VpreB多肽”和“VpreB多肽变异体”可互换地使用，并且在本文中定义为在一个或多个氨基酸位置处由于氨基酸修饰而与天然序列VpreB多肽不同的多肽。如本文所定义的“变异型VpreB多肽”将与天然抗体λ或κ轻链序列或其片段不同。“变异型VpreB多肽”将优选地保留与天然序列VpreB多肽的至少约65％或至少约70％或至少约75％或至少约80％或至少约85％或至少约90％或至少约95％或至少约98％序列一致性。在另一个优选实施例中，“变异型VpreB多肽”的氨基酸序列将与天然抗体λ或κ轻链序列小于95％或小于90％或小于85％或小于80％或小于75％或小于70％或小于65％或小于60％一致。变异型VpreB多肽具体包括(但不限于)其中VpreB序列C端处的非Ig样独特尾部部分或完全地被去除的VpreB多肽。
术语“变异型λ5多肽”和“λ5多肽变异体”可互换地使用，并且在本文中定义为在一个或多个氨基酸位置处由于氨基酸修饰而与天然序列λ5多肽不同的多肽。如本文所定义的“变异型λ5多肽”将与天然抗体λ或κ轻链序列或其片段不同。“变异型λ5多肽”将优选地保留与天然序列λ5多肽的至少约65％或至少约70％或至少约75％或至少约80％或至少约85％或至少约90％或至少约95％或至少约98％序列一致性。在另一个优选实施例中，“变异型λ5多肽”的氨基酸序列将与天然抗体λ或κ轻链序列小于95％或小于90％或小于85％或小于80％或小于75％或小于70％或小于65％或小于60％一致。变异型λ5多肽具体包括(但不限于)其中λ5序列N端处的独特尾部部分或完全地被去除的λ5多肽。
术语“变异型Vκ样多肽”和“Vκ样多肽变异体”可互换地使用，并且在本文中定义为在一个或多个氨基酸位置处由于氨基酸修饰而与天然序列Vκ样多肽不同的多肽。如本文所定义的“变异型Vκ样多肽”将与天然抗体λ或κ轻链序列或其片段不同。(图4)“变异型Vκ样多肽”将优选地保留与天然序列Vκ样多肽的至少约65％或至少约70％或至少约75％或至少约80％或至少约85％或至少约90％或至少约95％或至少约98％序列一致性。在另一个优选实施例中，“变异型Vκ样多肽”的氨基酸序列将与天然抗体λ或κ轻链序列小于95％或小于90％或小于85％或小于80％或小于75％或小于70％或小于65％或小于60％一致。变异型Vκ样多肽具体包括(但不限于)其中Vκ样序列C端处的非Ig样独特尾部部分或完全地被去除的Vκ样多肽。
术语“变异型JCκ多肽”和“JCκ多肽变异体”可互换地使用，并且在本文中定义为在一个或多个氨基酸位置处由于氨基酸修饰而与天然序列JCκ多肽不同的多肽。
(图5)如本文所定义的“变异型JCκ多肽”将与天然抗体λ或κ轻链序列或其片段不同。“变异型JCκ多肽”将优选地保留与天然序列JCκ多肽的至少约65％或至少约70％或至少约75％或至少约80％或至少约85％或至少约90％或至少约95％或至少约98％序列一致性。在另一个优选实施例中，“变异型JCκ多肽”的氨基酸序列将与天然抗体λ或κ轻链序列小于95％或小于90％或小于85％或小于80％或小于75％或小于70％或小于65％或小于60％一致。变异型JCκ多肽具体包括(但不限于)其中JCκ序列N端处的独特尾部部分或完全地被去除的JCκ多肽。
氨基酸序列一致性百分比可以使用序列比较程序NCBI-BLAST2来测定(阿尔丘尔(Altschul)等人,《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》25:3389-3402(1997))。NCBI-BLAST2序列比较程序可以从http://www.ncbi.nlm.nih.gov下载或以其它方式获自马里兰州贝塞斯达的美国国家卫生研究院。NCBI-BLAST2使用若干搜索参数，其中所有那些搜索参数都设定为默认值，包括例如，无屏蔽＝是，链＝所有，预期出现＝10，最小低复杂性长度＝15/5，多程e值＝0.01，多程常数＝25，最终间隙比对衰减＝25，并且评分矩阵＝BLOSUM62。
术语“VpreB序列”在本文中用于指如上文所定义的“VpreB”的序列或其片段。
术语“λ5序列”在本文中用于指如上文所定义的“λ5”的序列或其片段。
术语“Vκ样序列”在本文中用于指如上文所定义的“Vκ样”序列或其片段。
术语“JCκ序列”在本文中用于指如上文所定义的“JCκ”的序列或其片段。
如本文所用，术语“λ样替代性轻链”是指通过VpreB和λ5蛋白质的非共价缔合形成的二聚体。
如本文所用，术语“κ样替代性轻链”是指通过Vκ样和JCκ蛋白质的非共价缔合形成的二聚体。
如本文所定义，术语“λ样替代性轻链序列”意味着包含如上文所定义“VpreB序列”和/或“λ5序列”的任何多肽序列。如本文所定义，“λ样替代性轻链序列”具体包括(但不限于)SEQ ID NO 1的人类VpreB1序列、SEQ ID NO:2和3的小鼠VpreB2序列以及SEQ ID NO:4的人类VpreB3序列、展示为SEQ ID NO:5的人类VpreB dT；以及SEQ ID NO:6的人类VpreB1氨基酸序列和其各种同功异型物(包括剪接变异体和通过翻译后修饰形成的变异体)、其在其它哺乳动物物种中的同源物以及其片段和变异体。术语“λ样替代性轻链序列”另外包括(但不限于)SEQ ID NO:7的人类λ5序列、SEQ ID NO:8的人类λ5样序列、展示为SEQ ID NO:9的人类λ5dTail、SEQ ID NO:10的人类λ5dTail序列和其同功异型物(包括剪接变异体和通过翻译后修饰形成的变异体)、其在其它哺乳动物物种中的同源物以及其片段和变异体。术语“λ样替代性轻链序列”另外包括包含如上文所定义VpreB和λ5序列两者的序列。
如本文所定义，术语“κ样替代性轻链序列”意味着包含如上文所定义“Vκ样序列”和/或“JCκ”的任何多肽序列。如本文所定义，“κ样替代性轻链序列”具体包括(但不限于)SEQ ID NO:12-24中任一个的人类Vκ样序列和其各种同功异型物(包括剪接变异体和通过翻译后修饰形成的变异体)、其在其它哺乳动物物种中的同源物以及其片段和变异体。术语“κ样替代性轻链序列”另外包括(但不限于)SEQ ID NO:12-24中任一个的人类Vκ样序列、SEQ ID NO:25-35中任一个的人类JCκ序列和其同功异型物(包括剪接变异体和通过翻译后修饰形成的变异体)、其在其它哺乳动物物种中的同源物以及其片段和变异体。术语“κ样替代性轻链序列”另外包括包含如上文所定义Vκ样和JCκ序列两者的序列。
术语“替代性轻链构筑体”以最广泛意义使用，并且包括任何和所有额外异源性组分，包括结合于替代性轻链序列的异源性氨基酸序列、核酸和其它分子，其中“结合”定义于下文中。
“替代性轻链构筑体”在本文中还称为“SurrobodyTM”或“替代性抗体”，并且两个术语可互换地使用。某些SurrobodyTMλ样替代性轻链构筑体公开于许等人,《美国国家科学院院刊》2008,105(31):10756-61和2008年10月2日公开的PCT公开WO 2008/118970中。还涵盖如美国专利公开第2010-0062950号和许等人,《分子生物学杂志》2010,397,352-360中所描述的κ样替代性轻链构筑体，其全部公开内容都以引用的方式明确并入本文中。
在本发明多肽的情形下，相对于第一氨基酸序列的术语“异源性氨基酸序列”用于指不与第一氨基酸序列天然相关联(至少在呈其存在于本文替代性轻链构筑体中时的形式的情况下不与第一氨基酸序列天然相关联)的氨基酸序列。因此，相对于VpreB、λ5、Vκ样或JCκ的“异源性氨基酸序列”是在其天然环境中不与天然VpreB、λ5、Vκ样或JCκ相关联的任何氨基酸序列。这些包括(但不限于)i)与和VpreB一起在发育中的B细胞上形成替代性轻链的那些λ5序列不同的λ5序列，如氨基酸序列变异体，例如截短和/或衍生的λ5序列；ii)与和λ5一起在发育中的B细胞上形成替代性轻链的那些VpreB序列不同的VpreB序列，如氨基酸序列变异体，例如截短和/或衍生的VpreB序列，iii)与和JCκ一起在发育中的B细胞上形成κ样替代性轻链的Vκ样序列不同的那些Vκ样序列，如氨基酸序列变异体，例如截短和/或衍生的Vκ样序列；以及iv)与和Vκ样一起在发育中的B细胞上形成κ样替代性轻链的那些JCκ序列不同的JCκ序列，如氨基酸序列变异体，例如截短和/或衍生的JCκ序列。
相对于VpreB或λ5的“异源性氨基酸序列”还包括与相对应的VpreB或λ5(包括天然序列VpreB或λ5)共价缔合(例如与其融合)的VpreB或λ5序列，这是因为在其天然环境中，VpreB和λ5序列不彼此共价缔合(例如融合)。类似地，相对于Vκ样或JCκ的“异源性氨基酸序列”还包括与相对应的Vκ样或JCκ(包括天然序列Vκ样或JCκ)共价缔合(例如与其融合)的Vκ样或JCκ序列，这是因为在其天然环境中，Vκ样和JCκ序列不彼此共价缔合(例如融合)。异源性氨基酸序列还包括(但不限于)抗体序列，包括抗体以及其重链序列和片段，如抗体轻链和重链可变区序列以及抗体轻链和重链恒定区序列。
术语“结合(conjugate/conjugated/conjugation)”是指任何和所有形式的共价或非共价连接，并且包括(但不限于)直接遗传或化学融合、经由连接子或交联剂偶合和非共价缔合，例如经由范德华力或通过使用亮氨酸拉链。
术语“柔性连接子”在本文中用于指基于其化学结构，预测在其预期情形和环境中未固定于三维空间中的任何连接子。
术语“融合”在本文中用于指不同来源的氨基酸序列通过其编码核苷酸序列的同框组合在一个多肽链中组合。除融合于多肽链一个末端以外，术语“融合”明确地涵盖内部融合，即，将不同来源的序列插入在多肽链内。
如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”都是指通过共价“肽键”连接的氨基酸一级序列。一般来说，肽由几个氨基酸，通常约2到约50个氨基酸组成，并且短于蛋白质。如本文所定义，术语“多肽”涵盖肽和蛋白质。
术语“氨基酸”或“氨基酸残基”通常是指具有其所属领域公认定义的氨基酸，如选自由以下组成的群组的氨基酸：丙氨酸(Ala)；精氨酸(Arg)；天冬酰胺(Asn)；天冬氨酸(Asp)；半胱氨酸(Cys)；谷氨酰胺(Gln)；谷氨酸(Glu)；甘氨酸(Gly)；组氨酸(His)；异亮氨酸(Ile):亮氨酸(Leu)；赖氨酸(Lys)；甲硫氨酸(Met)；苯丙氨酸(Phe)；脯氨酸(Pro)；丝氨酸(Ser)；苏氨酸(Thr)；色氨酸(Trp)；酪氨酸(Tyr)；和缬氨酸(Val)，但可以视需要使用经过修饰、合成或罕见的氨基酸。因此，在37CFR 1.822(b)(4)中列出的经过修饰和不常见的氨基酸具体包括在此定义内，并且以引入的方式明确地并入本文中。氨基酸可以细分成各种亚组。因此，氨基酸可以分组为具有非极性侧链(例如Ala、Cys、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Val)；带负电侧链(例如Asp、Glu)；带正电侧链(例如Arg、His、Lys)；或不带电极性侧链(例如Asn、Cys、Gln、Gly、His、Met、Phe、Ser、Thr、Trp和Tyr)。氨基酸还可以分组为小氨基酸(Gly、Ala)、亲核氨基酸(Ser、His、Thr、Cys)、疏水性氨基酸(Val、Leu、Ile、Met、Pro)、芳香族氨基酸(Phe、Tyr、Trp、Asp、Glu)、酰胺(Asp、Glu)和碱性氨基酸(Lys、Arg)。
术语“多核苷酸”是指如DNA分子和RNA分子和其类似物的核酸(例如，使用核苷酸类似物或使用核酸化学产生的DNA或RNA)。视需要，多核苷酸可以例如使用所属领域公认的核酸化学合成地或使用例如聚合酶酶促地制造，并且必要时经过修饰。典型修饰包括甲基化、生物素化和其它所属领域已知的修饰。另外，核酸分子可以是单链或双链的，并且在需要时连接到可检测部分。
关于参考多肽的术语“变异体”是指与天然多肽相比具有至少一个氨基酸突变或修饰(即，改变)的多肽。通过“氨基酸修饰”产生的变异体可以例如通过在天然氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或以化学方式修饰至少一个氨基酸来产生。
“氨基酸修饰”是指预定氨基酸序列的氨基酸序列变化。例示性修饰包括氨基酸取代、插入和/或缺失。
在指定位置处的“氨基酸修饰”是指指定残基的取代或缺失，或至少一个氨基酸残基在指定残基邻近处的插入。通过插入，“邻近”指定残基意味着在其一个到两个残基内插入。插入可以是指定残基的N端或C端。
“氨基酸取代”是指用另一个不同“置换”氨基酸残基置换预定氨基酸序列中至少一个存在的氨基酸残基。一个或多个置换残基可以是“天然存在的氨基酸残基”(即由遗传密码编码)，并且选自由以下组成的群组：丙氨酸(Ala)；精氨酸(Arg)；天冬酰胺(Asn)；天冬氨酸(Asp)；半胱氨酸(Cys)；谷氨酰胺(Gln)；谷氨酸(Glu)；甘氨酸(Gly)；组氨酸(His)；异亮氨酸(Ile):亮氨酸(Leu)；赖氨酸(Lys)；甲硫氨酸(Met)；苯丙氨酸(Phe)；脯氨酸(Pro)；丝氨酸(Ser)；苏氨酸(Thr)；色氨酸(Trp)；酪氨酸(Tyr)；和缬氨酸(Val)。本文中氨基酸取代的定义还涵盖用一个或多个非天然存在的氨基酸残基取代。
“非天然存在的氨基酸残基”是指除上文所列的那些天然存在的氨基酸残基以外，能够共价结合多肽链中邻近氨基酸残基的残基。非天然存在的氨基酸残基的实例包括正亮氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、高丝氨酸和其它氨基酸残基类似物，如在埃尔曼(Ellman)等人《酶学方法(Meth.Enzym.)》202:301 336(1991)中所描述的那些氨基酸残基。为了产生此类非天然存在的氨基酸残基，可以使用诺伦(Noren)等人《科学(Science)》244:182(1989)和埃尔曼等人,同前文献。简言之，这些程序涉及用非天然存在的氨基酸残基以化学方式使抑制子tRNA活化，后接RNA的体外转录与翻译。
“氨基酸插入”是指将至少一个氨基酸并入到预定氨基酸序列中。虽然插入通常将由插入一个或两个氨基酸残基组成，但本申请涵盖更大“肽插入”，例如插入约三个到约五个或甚至高达约十个氨基酸残基。插入的残基可以是如上文所公开的天然存在或非天然存在的残基。
“氨基酸缺失”是指从预定氨基酸序列去除至少一个氨基酸残基。
除非另外规定，否则术语“突变诱发”是指用于改变多核苷酸或多肽序列的任何所属领域公认的技术。优选的突变诱发类型包括易错PCR突变诱发、饱和突变诱发或其它定点突变诱发。
“定点突变诱发”是所属领域中的技术标准，并且使用代表所需突变的除有限错配以外与待突变诱发的单链噬菌体DNA互补的合成寡核苷酸引物来进行。简言之，合成寡核苷酸用作直接合成与单链噬菌体DNA互补的链的引物，并且将所得双链DNA转化成支持噬菌体的宿主细菌。将经过转化的细菌的培养物接种在顶层琼脂中，从而准许由寄宿有噬菌体的单一细胞形成噬菌斑。理论上，50％的新噬菌斑将含有具有突变形式作为单链的噬菌体；50％将具有原始序列。所关注的噬菌斑通过在准许准确匹配杂交但与原始链的错配足以防止杂交的温度下与激酶化合成引物杂交来选择。接着对与探针杂交的噬菌斑进行选择、测序和培养，并且回收DNA。
术语“载体”用于指能够在细胞中自主复制并且DNA区段(例如基因或多核苷酸)可以可操作地连接到其上以便引起所附接区段复制的rDNA分子。能够引导编码一种或多种多肽的基因表达的载体在本文中称为“表达载体”。术语“控制序列”是指对于在特定宿主生物体中表达可操作地连接的编码序列必要的DNA序列。适合于原核生物的控制序列例如包括启动子(任选地，操纵子序列)和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。载体可以是“质体”，其是指额外DNA区段可以接合到其中的圆形双链DNA环。载体可以是噬菌体载体或病毒载体，其中额外DNA区段可以接合到病毒基因组中。合适的载体能够在其中引入有所述载体的宿主细胞中自主复制，例如具有细菌来源或复制的细菌载体和游离型哺乳动物载体。在引入到宿主细胞中，载体可以整合到宿主细胞基因组(例如非游离型哺乳动物载体)中，并且与宿主基因组一起复制。
核酸在被放在与另一核酸序列的功能关系中时其「可操作地连接」。举例来说，如果前序列或分泌性前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，那么其可操作地连接于多肽的DNA；如果启动子或强化子影响序列的转录，那么其可操作地连接于编码序列；或如果核糖体结合位点经过定位使得其促进翻译，那么其可操作地连接于编码序列。一般来讲，“可操作地连接”意味着所连接的DNA序列是连续的，并且在分泌前导序列的情况下，是连续的并处于阅读相内。然而，增强子不必是连续的。连接通过在适宜的限制位点处接合来实现。如果不存在此类位点，那么根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或连接子。
“噬菌体呈现文库”是表达呈与噬菌体鞘蛋白的融合物形式的克隆蛋白质序列集合的蛋白质表达文库。因此，短语“噬菌体呈现文库”在本文中是指其中噬菌体表达外部(通常异源性)蛋白质的噬菌体集合(例如丝状噬菌体)。外部蛋白质任意与噬菌体所接触的其它部分相互作用(结合)，呈现外部蛋白质的每一噬菌体都是噬菌体呈现文库的“成员”。
术语“丝状噬菌体”是指能够在其表面上呈现异源性多肽的病毒，并且包括(但不限于)f1、fd、Pf1和M13。丝状噬菌体可以含有可选标记物，如四环素(例如“fd-tet”)。各种丝状噬菌体呈现系统是所属领域的技术人员众所周知的(参见例如察赫尔(Zacher)等人《基因(Gene)》9:127-140(1980)；史密斯(Smith)等人《科学》228:1315-1317(1985)；和帕姆利(Parmley)和史密斯《基因》73:305-318(1988))。
术语“淘选”用于指在鉴别和分离携带对标靶具有高亲和力和特异性的化合物(如抗体)的噬菌体中的多轮筛选过程。
“宿主细胞”包括个体细胞或细胞培养物，其可能是或一直是用于对编码本文所描述分子的核酸和/或含有所述核酸的载体进行转化的接受体。在本发明的方法中，宿主细胞可以是真核细胞，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或人类胚胎肾脏(HEK)293细胞。其它合适的宿主细胞是所属领域的技术人员已知的。
B.详细描述
用于进行本发明方法的技术是所属领域中众所周知的，并且描述于标准实验室教科书中，包括例如奥斯贝(Ausubel)等人,《分子生物学现代方案(Current Protocols ofMolecular Biology)》,约翰·威利父子出版公司(John Wiley and Sons)(1997)；《分子克隆：实验指南(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》,第三版,J.萨布鲁克(Sambrook)和D.W.拉塞尔(Russell)编,美国纽约州冷泉港(Cold Spring Harbor,NewYork,USA),冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),2001；奥布赖恩(O'Brian)等人,《苏云金芽孢杆菌分析化学(Analytical Chemistry of BacillusThuringiensis)》希克尔(Hickle)和菲奇(Fitch)编,美国化学学会(Am.Chem.Soc.),1990；《苏云金芽孢杆菌：生物学、生态学和安全性(Bacillus thuringiensis:biology,ecologyand safety)》,T.R.葛莱尔(Glare)和M.奥卡拉甘(O'Callaghan)编,约翰·威利出版公司(John Wiley),2000；《抗体噬菌体呈现，方法和方案(Antibody Phage Display,Methodsand Protocols)》,胡马纳出版社(Humana Press),2001；和《抗体(Antibodies)》,G.苏布拉玛尼安(Subramanian)编,克卢沃学术出版社(Kluwer Academic),2004。突变诱发可以例如使用定点突变诱发来进行(孔克尔(Kunkel)等人,《美国国家科学院院刊》82:488-492(1985))。PCR扩增方法描述于美国专利第4,683,192号、第4,683,202号、第4,800,159号和第4,965,188号中以及若干教科书中，包括《PCR技术：DNA扩增的原理和应用(Principlesand Applications for DNA Amplification)》,H.埃尔里奇(Erlich)编,斯托克顿出版社(Stockton Press),纽约(1989)；和《PCR方案：方法与应用指导(A Guide to Methods andApplications)》,英尼斯(Innis)等人编,学术出版社(Academic Press),加利福尼亚州圣地亚哥(San Diego,Calif)(1990)。
本发明关注针对替代性轻链(SLC)的抗体。抗体可以针对VpreB子单元、λ5子单元或这些抗体中的每一个将特异性结合替代性轻链时的融合接点。
抗SLC抗体可以用于多种应用。一个应用是在药物动力学/药效学研究、免疫组织化学研究中或用于体外诊断使用时检测复杂生物学流体中的含SLC蛋白质。
抗SLC抗体的另一个应用是用于诊断目的。存在所属领域中已知与SLC不存在或不足相关联的多个条件。举例来说，λ5缺陷型小鼠展示B细胞发育的显著减少(北村(Kitamura)D,工藤(Kudo)A,沙尔(Schaal)S,穆勒(Muller)W,梅尔彻斯F,拉杰夫斯基(Rajewsky)K.λ5蛋白质在B细胞发育中的关键作用(A critical role of lambda 5protein in B cell development).《细胞(Cell)》.1992；69(5):823-831)，然而人类λ5基因中的突变导致无γ球蛋白血症(峰岸(Minegishi)Y,库斯坦-史密斯(Coustan-Smith)E,王(Wang)YH,库柏(Cooper)MD,坎帕纳(Campana)D,康利(Conley)ME.人类λ5/14.1基因中的突变导致B细胞不足和无γ球蛋白血症(Mutations in the human lambda5/14.1generesult in B cell deficiency and agammaglobulinemia).《实验医学杂志(J ExpMed.)》1998；187(l):71-77。在人类中，已经鉴别出表达SLC的自反应性B细胞，并且已经展示这些细胞在患有RA的患者的关节中聚积(梅夫里(Meffre)等人,(2000)《自然·免疫学(Nature Immunology)》1,207-213)。因此，SLC可以是用于多反应性细胞和异常前BCR功能的标记物。因此，抗SLC抗体可以是适用于诊断与异常SLC表达和B细胞功能相关联的某些白血病和自身免疫性疾病的试剂。
另外，抗SLC抗体的用途也可以考虑SLC复合物以融合蛋白、非共价杂聚体或以细胞群体形式的纯化。作为研究试剂，抗SLC抗体可以用于评定含SLC复合物的体外生物物理学和功能特征。SLC复合物的量化、亲和力测定、有效或抑制性浓度、免疫沉淀和免疫吸附剂应用是抗SLC抗体重要用途的实例。
本发明的抗体可以例如通过筛选抗体文库，如在美国专利第8,131,480号中所描述的不同抗体文库来获得，在一个优选实施例中，所述抗体使用噬菌体载体来表达不同抗体文库。所述方法一般涉及丝状噬菌体(噬菌粒)表面表达载体系统用于克隆和表达的用途。参见例如康等人,《美国国家科学院院刊》,88:4363-4366(1991)；巴巴斯等人,《美国国家科学院院刊》,88:7978-7982(1991)；迦贝迪(Zebedee)等人,《美国国家科学院院刊》,89:3175-3179(1992)；康等人,《美国国家科学院院刊》,88:11120-11123(1991)；巴巴斯等人,《美国国家科学院院刊》,89:4457-4461(1992)；格拉姆等人,《美国国家科学院院刊》,89:3576-3580(1992)；布林克曼(Brinkman)等人,《免疫法杂志(J.Immunol.Methods)》182:41-50(1995)；艾姆斯(Ames)等人,《免疫法杂志》184:177-186(1995)；凯勒伯夫(Kettleborough)等人,《欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)》24:952-958(1994)；普希克(Persic)等人,《基因》187 9-18(1997)；伯顿(Burton)等人,《免疫学进展(Advances inImmunology)》57:191-280(1994)；以及美国专利第5,698,426号；第5,233,409号；第5,580,717号；第5,427,908号；第5,750,753号；第5,821,047号；第5,403,484号；第5,571,698号；第5,516,637号；第5,780,225号；第5,658,727号；第5,733,743号；第5,837,500号；第5,969,108号；第6,326,155号；第5,885,793号；第6,521,404号；第6,492,160,6,492,123号；第6,489,123号；第6,342,588号；第6,291,650号；第6,225,447号；第6,180,336号；第6,172,197号；第6,140,471号；第5,994,519号；第6,969,108号；第5,871,907号；和第5,858,657号。
载体用于转化重组宿主细胞，其经过培养以允许所引入的噬菌体基因并呈现待表达的蛋白质基因，并且用于待组装和自宿主细胞脱落的噬菌体粒子。接着自宿主细胞培养基采集(收集)脱落的噬菌体粒子，并且针对所期望的抗体结合特性加以筛选。通常，所采集的粒子针对与预先选择的抗原的结合加以“淘选”。收集强结合粒子，并且克隆地分离个别粒子物种，并且针对与抗原的结合加以进一步筛选。选择产生具有所需抗原结合特异性的结合位点的噬菌体。
在以下非限制性实例中进一步描述本发明。
实例
实例1-抗VpreB1 Fab的鉴别
针对人类VpreB-1淘选海路公司(Sea Lane)的专有Fab片段文库持续4轮。通常，在三到四轮淘选之后，通过ELISA针对人类VpreB1分析来自富集的噬菌体集合体的个别克隆体，并且对阳性克隆体进行测序以确定其重链和轻链序列。由这些研究，Fab克隆分析鉴别出16种独特人类VpreB1结合子(表1)。如在表2中进一步表征的，κ和λ轻链两者都鉴别为具有4个不同重链构架。
表1-用于抗人VpreB1的独特阳性克隆体
独特序列e VL VH
2462VpreB1am5E07 VK1_L8 VH3-321
2462VpreB1am5C04 VK1_L8 VH3-323
2462VpreB1am5B09 VK3_A27 VH1-102
2463VpreB1am5B05 VK1_L1 VH1-1e
2463VpreB1am5D07 VK1_L1 VH1-102
2460VpreB1am5D10 VK1_L8 VH3-321
2460VpreB1am5B04 VK1_L8 VH3-321
2462VpreB1am5A07 VK1_L8 VH3-321
2460VpreB1am5E01 VK1_L8 VH1-102
2462VpreB1am5D05 VL2_2a2 VH1-1e
2462VpreB1am5A05 VL3_3m VH1-102
2462VpreB1am5C09 VL2_2a2 VH3-323
2460VpreB1am5F05 VL2_2a2 VH3-323
2462VpreB1am5E08 VL3_3L VH3-323
2462VpreB1am5C05 VL2_2a2 VH3-321
2463VpreB1am5C04 VL2_2a2 VH1-102
表2-抗人VpreB1Fab命中物当中轻链和重链序列的概述
测定特异性抗人VpreB1Fab克隆体的氨基酸序列，并且使用FASTA程序来鉴别和分析可变区序列。如图6中所描绘对抗人VpreB1Fab克隆体的轻链序列(VL)进行比对。在此比对内，可变轻链在残基编号3处开始，并且可变轻链序列转变为恒定轻链(Cκ或Cλ)的时间点由箭头划界。如图7中所描绘，比对抗人VpreB1Fab克隆体的重链序列(VH)。在此比对内，可变重链在残基编号1处开始，并且可变重链和J链序列转变为恒定重链的时间点由箭头划界。
实例2-所选择的抗VpreB1 IgGmAbs的表征
进行ELISA分析以表征个别淘选的对人类VpreB1具有亲和力的噬菌体Fab抗体的SgG结合亲和力、敏感性和血清背景。图8提供对抗人VpreB1IgG1(2460B04IgG1)的表征的概述。SgG蛋白质是指替代性轻链(SLC)构筑体，在本文中也称为“替代性抗体”，并且两个术语可互换地使用。一般来说，2片形式包括一个SLC融合物和一个抗体重链，而3片形式包括两个SLC多肽和一个抗体重链。
检测
为了评定作为检测抗体的抗人VpreB1IgG1(2460B04IgG1)，在ELISA中通过未经标记、生物素标记和DIG标记的抗VpreB1抗体来检测HGF特异性S2gG和S3gG。在检测2片式或3片式替代性抗体的分析中，用HGF(0.1mL，0.001mg/mL)涂布各孔，1％BSA-PBST用作阻断和稀释缓冲液，并且在50％血清中连续稀释S2gG或S3gG。通过生物素化抗VpreB1IgG和HRP结合的抗生蛋白链菌素来检测HGF结合的S2gG或S3gG。如在图9中所展现，抗VpreB1抗体检测50％血清中HGF结合的2片式替代性抗体。类似地，抗VpreB1抗体还检测50％血清中HGF结合的3片式替代性抗体(图10)。检测分析中所用不同SLC构筑体的EC50值提供于下表3中。
表3-未经标记对比经过标记的抗人VpreB1IgG抗体
捕捉
在评定抗VpreB1IgG(2460B04IgG1)的2片式或3片式替代性抗体捕捉的分析中，用抗VpreB1IgG(0.1mL，0.001mg/mL)涂布各孔，1％BSA-PBST用作阻断和稀释缓冲液，并且在50％血清中连续稀释S2gG或S3gG。通过HRP结合的山羊抗E标签Ab检测HGF结合的S2gG。如在图11中所展现，抗VpreB1抗体捕捉50％血清中的2片式替代性抗体。抗VpreB1抗体还捕捉50％血清中的3片式替代性抗体(图12)。
亲和力
抗人VpreB1IgG mAb(2460B04IgG1)对SgG的结合亲和力在ForteBio Octet上通过生物层来加以测试(“八元分析(octet analysis)”)。进行动力学分析，并且表观亲和力报告于表4中。结果指示结合于2片式或3片式替代性球蛋白的次纳摩尔亲和力。
表4-通过Octet测量的抗人VpreB1IgG mAb与SgG的结合亲和力
抗人VpreB1IgG mAb(2460B04IgG1)展现在人类、小鼠或食蟹猕猴(Cynomolgusmonkey)血清存在下的清晰背景。此表明2460B04IgG1抗体将适用于药物动力学(PK)研究。这些结果所表明的进一步应用是作为在人类、小鼠和猴血清中交叉反应性最小(15ng/mL)的检测试剂，作为在人类、小鼠和猴血清中交叉反应性最小的捕捉试剂，和作为含VpreB1文库构筑中富集文库的亲和力抗体。
交叉反应性
通过ELISA检查抗VpreB1mAb(2460B04IgG1)与人类VL的交叉反应性。表5提供对用于检查抗VpreB1mAb交叉反应性的方法的概述。表6标示含有人类VL ORF的IgG的蛋白质序列类似性。
表5-抗VpreB1mAb交叉反应性的表征
表6-人类VL蛋白质序列类似性
当用作检测试剂时，抗VpreB1mAb不结合于含有人类VL ORF的IgG(图13A-D)。同样，当用作捕捉试剂时，抗VpreB1mAb不能捕捉含VL的IgG(448C12-HC)(图14A-C)。抗VpreB1mAb也不能捕捉由2547C02HC(图15A-C)或2211A01N56H-HC(图16A-C)表示的含VL的IgG。因此，似乎不存在与传统轻链蛋白质的交叉反应性。
实例3-替代性抗体在食蟹猕猴中的药物动力学研究
抗VpreB1IgG mAb的效用进一步展现于替代性抗体在食蟹猕猴中的药物动力学(PK)研究中。替代性抗体在食蟹猕猴中的PK概况通过测量半衰期(T1/2)、最大血浆/血清浓度(Cmax)、消除速率常数、AUC0-t(到所观察到的最后一个数据点为止的血浆浓度-时间曲线下面积)和清除率来加以评定。我们还检查由单次注射产生的抗SgG反应。在食蟹猕猴PK研究中所用的替代性抗体测试品标示于表7中。
表7-在食蟹猕猴PK研究中所用的替代性抗体测试品
在PK食蟹猕猴血清中检测标靶特异性替代性抗体
如在图17中所标示，生物学上未经处理的食蟹猕猴用于评估五种SgG测试品。在测试品群组中的每一个中研究三只猴。在五个群组当中，存在总计15只猴，各自称重为3.37-5.67kg，并且对每只猴维持进行健康状况报告。每个群组的平均重量是4.34-4.87kg。静脉内给予单次10mg/mL注射。在至多28天时收集并准备每只猴血清。血清收集的时间点包括短时间间隔(0和5分钟)，中等时间间隔(1、4、8和24小时)和长时间间隔(48小时(2d)、72小时(3d)、96小时(4d)、168小时(7d)、240小时(10d)、336小时(14d)、408小时(17d)、504小时(21d)、576小时(24d)和672小时(28d))。ELISA分析用于检测食蟹猕猴血清中的SgG。每一培养板分析一个PK时间点，并且2mL深孔区块中进行标准品/样品的连续稀释。1:3连续稀释包含800uL 1％BSA-PBST+400uL样品。对HGF结合、PlGF结合和复合物ELISA中的每一个进行一个稀释。
来自5个测试群组中每一个中所有猴的免疫前血清样品对SgG蛋白质保持清洁(图17)。历经5分钟-96小时时间点对SL-541_αHGF SgG搜集的ELISA数据的实例提供于图18中，并且历经168小时-672小时时间点对此SgG结构搜集的数据提供于图19中。历经5分钟-96小时时间点对SL-656_αHGF IgG搜集的ELISA数据的实例提供于图20中，并且历经168小时-672小时时间点对此SgG结构搜集的数据提供于图21中。结果指示测试个体的半衰期在6-10天范围内。这些结果进一步展现VpreB1 IgG mAb(2460B04 IgG1)用于测定治疗性替代性抗体PK特性的效用。PK研究帮助测定潜在治疗药物的分配、代谢和消除。这些数据将提供在研究性治疗产品与核准的治疗剂之间进行历史比较的基础，以及帮助确定产品的最优给药时程和停药期(withdrawal period)。因此，VpreB1 IgG mAb适用于通过确立临床上有效量和实现临床上相关剂量的清除时间两者来确定替代性抗体的恰当给药。
我们还查看双特异性替代性抗体的PK特性，并且发现其与食蟹猕猴中的亲本类似。(图22)向食蟹猕猴的未经处理群组(n＝3)中投与单次静脉内剂量的替代性抗体(10mg/kg)，并且历经28天时段测试其血清。发现双特异性替代性抗体的整体PK特性与单特异性HGF和PIGF替代性抗体极类似。
尽管在前述描述中参考某些实施例说明本发明，但其不如此受限制。实际上，所属领域的技术人员将根据前文描述显而易知除本文所展示和所描述的修改之外的本发明各种修改，并且所述修改处于所附权利要求书的范围内。
本文所引用的所有公开、专利和专利申请出于所有目的都以全文引用的方式并入本文中，其引用程度如同每一个别的公开、专利或专利申请专门并且单独地指示为通过引用如此并入一样。

Claims (16)

1.一种特异性结合于替代性轻链(SLC)的经过分离的抗体或其抗原结合片段。
2.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体特异性结合于所述SLC的VpreB子单元。
3.根据权利要求2所述的抗体或抗原结合片段，其中所述VpreB子单元是SEQ ID NO:1的人类VpreB1。
4.根据权利要求2所述的抗体或抗原结合片段，其中所述VpreB子单元是SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的小鼠VpreB2。
5.根据权利要求2所述的抗体或抗原结合片段，其中所述VpreB子单元是SEQ ID NO:4的人类VpreB3。
6.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体特异性结合于所述SLC的λ5子单元。
7.根据权利要求6所述的抗体或抗原结合片段，其中所述λ5子单元是SEQ ID NO:7的人类λ5。
8.根据权利要求6所述的抗体或抗原结合片段，其中所述λ5子单元是SEQ ID NO:9的人类λ5dTail。
9.根据权利要求3所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包含选自由SEQ ID NO:36到51组成的群组的轻链可变区序列。
10.根据权利要求3所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包含选自由SEQ ID NO:52到67组成的群组的重链可变区序列。
11.根据权利要求9所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包含选自由SEQ ID NO:52到67组成的群组的重链可变区序列。
12.根据权利要求2所述的抗体，其中所述抗原结合片段选自由以下组成的群组：Fab、Fab'、F(ab')2、scFv和(scFv)2片段。
13.一种组合物，其包含根据权利要求1到12中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
14.根据权利要求13所述的组合物，其是诊断组合物。
15.一种用于在人类个体中诊断类风湿性关节炎的方法，其包含使来自所述个体的生物样品与特异性结合于人类替代性轻链(SLC)的抗体接触，和测定SLC表达水平。
16.一种用于诊断与异常SLC表达相关联的白血病或自身免疫性疾病的方法，其包含使来自所述个体的生物样品与特异性结合于人类替代性轻链(SLC)的抗体接触，和测定SLC表达水平。
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