KR20040099258A - 케모카인 수용체와 관련된 질병 및 증상의 검출 및 치료용조성물 및 방법 - Google Patents

케모카인 수용체와 관련된 질병 및 증상의 검출 및 치료용조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 케모카인 수용체의 제1 토폴로지에 특이적으로 결합하고/하거나 이 제1 토폴로지를 조절하지만, 제2 토폴로지에는 특이적으로 결합하지 않고/않거나 이 제2 토폴로지를 조절하지 않는 제제를 동정하는 방법을 제공한다. 이러한 제제는 특정 케모카인 수용체 토폴로지와 관련된 질병 또는 증상의 치료제로서 유용하다. 뿐만 아니라, 상기 제제는 케모카인 수용체의 특정 토폴로지를 검출하여, 질병 또는 질병의 소인을 진단하는데 유용하다. 더욱이, 상기 제제는 케모카인 수용체의 특정 토폴로지를 발현하는 세포를 동정 및 분리하는데 유용하다.

Description

케모카인 수용체와 관련된 질병 및 증상의 검출 및 치료용 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR DETECTING AND TREATING DISEASES AND CONDITIONS RELATED TO CHEMOKINE RECEPTORS}
케모카인은 염증 발생시 생성되어 백혈구의 보충을 조절하는 작은 시토킨 군을 구성한다[Baggiolini, M. et al., Adv.Immunol. 55: 97-179(1994) ; Springer, T. A., Annu. Rev. Physiol. 57: 827-872 (1995); and Schall, T. J. and K. B. Bacon,Curr.Opin. Immunol. 6: 865-873 (1994)]. 케모카인은 혈중 형성된 (적혈구를 제외한) 백혈구를 포함하는 성분 예컨대, 호중구, 단핵구, 대식 세포, 호산구, 호염기구, 비만 세포 및 림프구 예컨대, T 세포 및 B 세포의 주화성을 선택적으로 유발할 수 있다. 주화성을 자극함과 더불어, 백혈구 활성화와 관련된 반응 세포내케모카인에 의하여 다른 변화 예를 들어, 세포 모양의 변화, 세포내 유리 칼슘 이온(Ca2+) 농도의 일시적 증가, 과립 세포외배출, 인테그린 상승조절, 생활성 지질(예를 들어, 류코트리엔)의 형성 및 호흡기 방출도 선택적으로 유도될 수 있다. 그러므로, 케모카인은 조기에 염증 반응을 유발시켜, 감염 또는 염증 부위에서 염증 매개체 방출을 일으키고, 주화성 및 일혈을 유발시킨다.
케모카인의 2개의 하위군 즉, CXC 및 CC 케모카인은 4개의 보존된 시스테인 잔기들중 처음 2개의 배열에 의하여 구별되는데, 이들 잔기는 하나의 아미노산[CXC 케모카인인 SDF-1, IL-8, IP-10, MIG, PF4, ENA-78, GCP-2, GROα,GROβ, GROγ, NAP-2, NAP-4에서와 같이]에 의하여 분리되거나 또는 잔기들이 서로 인접하여[CC 케모카인인 MIP-1α, MIP-1β, RANTES, MCP-1, MCP-2, MCP-3, I-309에서와 같이] 존재한다. 대부분의 CXC 케모카인은 호중구 백혈구를 끌어당긴다. 예를 들어, 상기 CXC 케모카인 인터루킨 8(IL-8), 혈소판 인자 4(PF4) 및 호중구-활성화 펩티드 2(NAP-2)는 호중구의 잠재적인 주화인자이자 활성인자이다. 상기 CXC 케모카인의 일원인 MIG(감마 인터페론에 의하여 유도된 모노카인) 및 IP-10(유도성 인터페론-γ, 10 kDa 단백질)은 활성화된 말초 혈액 림프구의 주화성을 유도하는데 특히 활성이다. CC 케모카인은 일반적으로 선택성이 떨어지고 다양한 유형의 백혈구 세포 예컨대, 단핵구, 호산구, 호염기구, T-림프구 및 자연 살생 세포를 끌어당긴다. CC 케모카인 예컨대, 인간 단핵구 주화성 단백질 1-3(MCP-1, MCP-2 및 MCP-3), RANTES(Regulated on Activation, Normal T Expressed and Secreted), 및 대식세포 염증성 단백질 1α 및 1β(MIP-1α및 MIP-1β)는 단핵구 또는 림프구의 주화인자및 활성인자인 것으로 알려져 있으나, 호중구에 대한 주화인자는 아닌 것으로 파악된다.
CC 및 CXC 케모카인은 7개의 경막성 G 단백질-커플링된 수용체의 상위 군에 속하는 수용체들을 통하여 작용한다[Murphy, P. M. , Pharmacol Rev. 52: 145-176 (2000)]. 이러한 G 단백질-커플링된 수용체의 군은 7개의 경막성 영역을 포함하는 통합 막 단백질의 거대 군을 포함한다. 상기 수용체는 예를 들어, 세포내 매개체의 생성에 의하여 GTP를 결합시킬 수 있고 커플링된 수용체로부터의 신호 전달을 매개할 수 있는 이종 삼량체 조절 단백질인 G 단백질과 커플링된다.
일반적으로, 케모카인 및 케모카인 수용체의 상호작용은, 하나의 케모카인이 다수의 케모카인 수용체와 결합할 수 있고 역으로 하나의 케모카인 수용체가 몇개의 케모카인과 상호작용 할 수 있다는 점에서 우연성을 띤다. 그러나, 이러한 규칙에는 몇가지 예외가 존재하는데; 그중 하나는 SDF-1과 CXCR4는 상호작용을 한다는 것이다[Bleul et al.,J Exp Med, 184 (3): 1101-9 (1996); Oberlin et al., Nature, 382 (6594) :833-5 (1996)]. 원래부터 전-B-세포 성장 자극 인자[Nagasawa et al., Proc Natl Acad Sci USA, 91 (6): 2305-9 (1994)]로 확인된, SDF-1은 CXCR4에 대한 인간의 리간드라고만 보고되어 있다. 상기 SDF-1 유전자는 대체적 스플라이싱에 의하여 2개의 단백질 즉, SDF-1α 및 SDF-1β를 암호화한다. 이러한 2개의 단백질들은 SDF-1β의 카르복시 말단에는 존재하지만 SDF-1α에는 존재하지 않는 4개의 아미노산 잔기를 제외하고는 동일하다.
SDF-1/CXCR4 케모카인/케모카인 수용체 쌍은 정상적인 배 발생 및 일부 질병상태의 중요한 매개체인 것으로 추측된다. CXCR4 및 SDF-1 둘다에 대한 유전자 녹아웃 데이터는 상기 수용체 또는 리간드중 어느 하나가 결실되면 배아에 치명적이라는 것을 증명해준다[Loetscher et al., J Biol Chem, 269(1) : 232-7 (1994); Ma et al., Proc Natl Acad Sci USA, 95 (16): 9448-53 (1998); Zou et al., Nature, 393 (6685): 595-9 (1998)]. 뿐만 아니라, 이러한 리간드/수용체 쌍은 HIV 감염에 있어서 특정한 역할을 담당하고[Bleul et al., Nature, 382 (6594): 829-33 (1996); Deng et al., Nature 381(6584):661-6(1996) ; Feng et al., Science, 272(5263):872-7(1996)], HIV 병인과 관련되어 있다. CXCR4는 세포자살을 유도하며 그 경로는 SDF-1에 의하여 억제될 수 있으므로[Berndt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(21):12556-61(1998)], SDF-1과 CXCR4가 케모카인/케모카인 수용체쌍과 밀접하게 결합되어 있다는 증거를 한층더 뒷받침 해준다.
가장 최근에는, SDF-1과 CXCR4는 유방암의 전이에 중요한 역할을 하는 것으로 추측되고 있다[Muller et al., Nature, 410(6824):50-6(2001)]. 유방암 세포에서는 CXCR4의 발현이 검출되었던 반면에, 전이형 성장을 하는 기관 예컨대, 림프절, 폐, 간 및 골수에서는 SDF-1이 높은 수준으로 동정되었으나, 종양이 검출되지 않았던 다른 기관에서는 검출되지 않았다. 뿐만 아니라, 이러한 전이성 성장은 항-CXCR4를 첨가함으로써 억제될 수 있었으며, 이는 상기 리간드 수용체 쌍이 종양 전이에 있어서 특정한 역할을 담당한다는 가설을 지지해 준다.
상기 CCR1 유전자는 예측 가능한 7개의 경막 토폴로지를 갖는 354개의 아미노산을 포함하는 베타 또는 CC 케모카인 수용체 군의 일원을 암호화한다[Neote, Ket al., Cell 72:415-425(1993)]. 이 수용체의 리간드는 MIP-1α, RANTES, MCP-3 및 MPIF-1을 포함한다. CCR1 수용체는 인간 백혈구상에 광범위하게 발현되어, G 단백질 신호 전달을 매개할 수 있으며, 염증 및 감염이 발생한 부위에 효과기 면역 세포를 보충하는데 중요하다. 인간의 CCR1 단백질은 마우스에서 항원성이며, 특이적 마우스-항인간 CCR1 모노클로날 항체는 광범위하게 사용될 수 있다[R&D Systems, Pharmingen]. 마우스 상동체에 관한 녹아웃 연구는 이 유전자가 염증 반응으로부터 숙주 세포를 보호하고, 바이러스 및 기생체에 대한 감수성을 조절하며, 이식 거부 현상 및 내성에 있어서의 역할에 관하여 제시한다. 이러한 유전자 및 다른 케모카인 수용체 유전자 예를 들어, CCR2, CCR3, CCR5는 인간 염색체 3p21상에 유전자 클러스터를 형성하는 것으로 파악된다[Murphy, P.M., Pharmacol Rev. 52:145-176(2000)].
케모카인 수용체 신호전달 및 리간드에 대한 선택성에 관한 다수의 측면들은 아직 파악되지 않았다. 본 발명은 이러한 측면들과 다른 측면들에 관한 것이다.
발명의 개요
본 발명은 제1 토폴로지를 갖는 케모카인 수용체에는 결합하지만, 제2 토폴로지를 갖는 케모카인 수용체에는 결합하지 않는 제제를 동정하는 방법을 제공한다. 몇몇 측면에서, 본 발명의 방법은 다음의 단계들을 포함한다: ⅰ. 제1 토폴로지를 갖는 케모카인 수용체를 포함하는 제1 세포와, 제2 토폴로지를 갖는 케모카인 수용체를 포함하는 제2 세포를 제공하는 단계; ⅱ. 1,500 달톤 미만의 제제를 케모카인 수용체와 접촉시키는 단계; 및 ⅲ. 케모카인 수용체의 제1 토폴로지에는 결합하지만 제2 토폴로지를 갖는 케모카인 수용체에는 결합하지 않는 제제를 선택하는 단계. 몇몇 측면에서, 이 제제는 600 달톤 미만이다.
몇몇 측면에서, 본 발명의 방법은 세포 기능을 조절하는 제제를 선택하는 단계를 추가로 포함한다. 몇몇 측면에서, 세포 기능은 세포자살, 세포 성장, 세포 증식 및 세포 이동으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
몇몇 측면에서, 본 발명의 방법은 케모카인 수용체의 제1 토폴로지에 리간드가 결합함으로써 유발되는 세포내 신호 전달을 조절하는 제제를 선택하여, 제1 토폴로지는 갖지만, 제2 토폴로지는 갖지 않는 케모카인 수용체에 리간드가 결합함으로써 유발된 세포내 신호전달을 조절하는 제제를 동정하는 단계를 추가로 포함한다. 몇몇 측면에서, 상기 제제는 케모카인 수용체의 제1 토폴로지에 대한 리간드의 결합에 반응하여 세포내 칼슘의 이동을 조절한다.
몇몇 측면에서, 케모카인 수용체는 CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, CX3CR1, CXR1, CCXCKR(CCR11), FPRL1(CCR12), US28, ECRF3, 카포시 육종 관련 헤르페스 바이러스 GPCR, 폭스바이러스 막 결합 G 단백질-커플링된 수용체, D6 및 DARC로 이루어진 군으로부터 선택된다.
몇몇 측면에서, 제1 세포 및 제2 세포는 암세포이다. 몇몇 측면에서, 상기 암세포는 유방암 세포, 난소암 세포, 경부암 세포, 버킷 림프종 세포 및 신경교아종 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 측면에서, 제1 세포 또는 제2 세포로서는 호중구, 단핵구, 대식세포, 호산구, 호염기구, 비만 세포, 수지상 세포, 조혈 줄기 세포, 혈소판 또는 B-세포가 있다. 몇몇 측면에서, 상기 제1 세포 또는 제2 세포는 HIV의 감염을 지원하지 않는다. 몇몇 측면에서, 상기 제1 세포 또는 제2 세포는 T-세포가 아니다.
몇몇 측면에서, 상기 제제는 케모카인 수용체의 천연 리간드와의 결합에 대하여 경쟁적으로 결합하는한다.
몇몇 측면에서, 본 발명의 방법은 동물의 세포 또는 조직 반응을 조절하는 제제를 선택함으로써, 동물에서의 케모카인 수용체-매개성 조직 또는 세포 반응을 조절하는 제제를 동정하는 단계를 추가로 포함한다. 몇몇 측면에서, 세포 또는 조직 반응은 세포의 주화성을 포함한다. 몇몇 측면에서, 상기 주화성 세포는 백혈구이다. 몇몇 측면에서, 백혈구의 주화성은 감소된다. 몇몇 측면에서, 백혈구 주화성은 증가한다. 몇몇 측면에서, 세포 또는 조직 반응은 암의 발생을 포함한다. 몇몇 측면에서, 세포 또는 조직은 암세포를 포함한다. 몇몇 측면에서, 세포 또는 조직 반응은 염증을 포함한다. 몇몇 측면에서, 제제는 암이 발병한 동물에 치료학적으로 충분한 양으로 투여될 때 암을 감소시킨다.
본 발명은 또한 전술한 방법중 임의의 방법에 의하여 동정된 제제를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 나열한 방법에서 동정된 제제가 조직 샘플중 CXCR4와 결합하는지 여부를 측정하는 것을 포함하는 암세포의 동정 방법을 제공하는데, 이 방법에서 제제가 CXCR4에 결합하는 것은 암이 존쟈함을 시사한다.
본 발명은 또한 제1 토폴로지를 갖는 케모카인 수용체에는 결합하지만, 제2 토폴로지를 갖는 케모카인 수용체에는 결합하지 않는 케모카인을 동정하는 방법을 제공한다. 몇몇 측면에서, 본 발명의 방법은 다음의 단계들을 포함한다: ⅰ. 제1 토폴로지를 갖는 케모카인 수용체를 포함하는 제1 세포와, 제2 토폴로지를 갖는 케모카인 수용체를 포함하는 제2 세포를 제공하는 단계; ⅱ. 케모카인과 케모카인 수용체를 접촉시키는 단계; 및 ⅲ. 케모카인 수용체의 제1 토폴로지에 결합하지만 제2 토폴로지를 갖는 케모카인 수용체에는 결합하지 않는 케모카인을 선택하는 단계.
몇몇 측면에서, 케모카인은 케모카인 수용체의 제1 토폴로지에 케모카인이 결합하는 것에 반응하여 세포내 칼슘 이동을 조절한다. 몇몇 측면에서, 케모카인 수용체는 CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, CX3CR1, CXR1, CCXCKR(CCR11), FPRL1(CCR12), FPRL1(CCR12), US28, ECRF3, 카포시 육종 관련 헤르페스 바이러스 GPCR, 폭스바이러스 막 결합 G 단백질-커플링된 수용체, D6 및 DARC로 이루어진 군으로부터 선택된다.
몇몇 측면에서, 제1 세포 또는 제2 세포는 암세포이다. 몇몇 측면에서, 암세포는 유방암 세포, 난소암 세포, 경부암 세포, 버킷 림프종 세포 및 신경교아종 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 측면에서, 제1 세포 또는 제2 세포로서는 호중구, 단핵구, 대식세포, 호산구, 호염기구, 비만 세포, 수지상 세포, 조혈 줄기 세포, 혈소판 또는 B-세포가 있다. 몇몇 측면에서, 상기 제1 세포 또는 제2세포는 HIV의 감염을 지원하지 않는다. 몇몇 측면에서, 상기 제1 세포 또는 제2 세포는 T-세포가 아니다.
몇몇 측면에서, 본 발명의 방법은 동물에서 세포 또는 조직 반응을 조절하는 케모카인을 선택함으로써, 동물에서 케모카인 수용체 매개성 조직 또는 세포 반응을 조절하는 케모카인을 동정하는 단계를 추가로 포함한다. 몇몇 측면에서, 세포 또는 조직 반응은 세포의 주화성을 포함한다. 몇몇 측면에서, 주화성 세포는 백혈구이다. 몇몇 측면에서, 백혈구 주화성은 감소한다. 몇몇 측면에서, 백혈구 주화성은 증가한다. 몇몇 측면에서, 세포 또는 조직 반응은 암의 발생을 포함한다. 몇몇 측면에서, 세포 또는 조직은 암세포를 포함한다. 몇몇 측면에서, 세포 또는 조직 반응은 염증을 포함한다.
본 발명은 또한 제1 토폴로지를 갖는 케모카인 수용체에는 결합하나, 제2 토폴로지를 갖는 케모카인 수용체에는 결합하지 않는 항체를 동정하는 방법을 제공한다. 몇몇 측면에서, 본 발명의 방법은 다음의 단계들을 포함한다: ⅰ. 제1 토폴로지를 갖는 케모카인 수용체를 포함하는 제1 세포와, 제2 토폴로지를 갖는 케모카인 수용체를 포함하는 제2 세포를 제공하는 단계; ⅱ. 항체를 케모카인 수용체에 접촉시키는 단계; 및 ⅲ. 케모카인 수용체의 제1 토폴로지에는 결합하지만, 제2 토폴로지를 갖는 케모카인 수용체에는 결합하지 않는 항체를 선택하는 단계.
몇몇 측면에서, 본 발명의 방법은 세포 기능을 조절하는 항체를 선택하는 것을 추가로 포함한다. 몇몇 측면에서, 세포 기능은 세포자살, 세포 성장, 세포 증식 및 세포 이동으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
몇몇 측면에서, 본 발명의 방법은 케모카인 수용체의 제1 토폴로지에 결합하는 리간드에 의하여 유발되는 세포내 신호 전달을 조절하는 항체를 선택하여, 제1 토폴로지는 갖지만, 제2 토폴로지는 갖지 않는 케모카인 수용체에 리간드가 결합함으로써 유발된 세포내 신호전달을 조절하는 항체를 동정하는 단계를 추가로 포함한다. 몇몇 측면에서, 상기 항체는 케모카인 수용체의 제1 토폴로지에 리간드가 결합함에 따라서 세포내 칼슘의 이동을 조절한다. 몇몇 측면에서, 상기 케모카인 수용체는 CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, CX3CR1, CXR1, CCXCKR(CCR11), FPRL1(CCR12), US28, ECRF3, 카포시 육종 관련 헤르페스 바이러스 GPCR, 폭스바이러스 막 결합 G 단백질-커플링된 수용체, D6 및 DARC로 이루어진 군으로부터 선택된다.
몇몇 측면에서, 제1 세포 또는 제2 세포는 암세포이다. 몇몇 측면에서, 상기 암세포는 유방암 세포, 난소암 세포, 경부암 세포, 버킷 림프종 세포 및 신경교아종 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 측면에서, 제1 세포 또는 제2 세포는 호중구, 단핵구, 대식세포, 호산구, 호염기구, 비만 세포, 수지상 세포, 조혈 줄기 세포, 혈소판 또는 B-세포가 있다. 몇몇 측면에서, 제1 세포 또는 제2 세포는 HIV 감염을 지원하지 않는다. 몇몇 측면에서, 제1 세포 또는 제2 세포는 T-세포가 아니다. 몇몇 측면에서, 항체는 케모카인 수용체의 천연 리간드와의 결합에 대하여 경쟁적으로 결합하는한다.
몇몇 측면에서, 본 발명의 방법은 동물에서 세포 또는 조직 반응을 조절하는 항체를 선택함으로써, 동물에서의 케모카인 수용체 매개성 조직 또는 세포 반응을조절하는 항체를 동정하는 단계를 추가로 포함한다. 몇몇 측면에서, 세포 또는 조직 반응은 세포의 주화성을 포함한다. 몇몇 측면에서, 주화성 세포는 백혈구이다. 몇몇 측면에서, 백혈구 주화성은 감소한다. 몇몇 측면에서, 백혈구 주화성은 증가한다. 몇몇 측면에서, 세포 또는 조직 반응은 암의 발생을 포함한다. 몇몇 측면에서, 세포 또는 조직은 암세포를 포함한다. 몇몇 측면에서, 세포 또는 조직은 염증을 포함한다. 몇몇 측면에서, 항체는 상기 제제가 암이 발병한 동물에 치료학적으로 충분한 양으로 투여될때 암을 감소시킨다.
본 발명은 또한 전술한 방법에 의하여 동정되는 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 나열한 방법에서 동정된 항체가 조직 샘플중 CXCR4에 결합하는지 여부를 측정하는 것을 포함하는 암세포를 동정하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 CXCR4에 항체가 결합하는 것은 암이 존재함을 시사한다.
본 발명은 또한 케모카인 수용체의 신규한 토폴로지를 동정하는 방법을 제공한다. 몇몇 측면에서, 본 발명의 방법은 각각의 세포 유형이 케모카인 수용체를 발현하는, 2 이상의 세포 유형을 제공하는 단계; 2개의 세포 유형상에 존재하는 케모카인 수용체에 결합하는 능력에 대한 복수개의 상이한 케모카인을 테스트하는 단계; 및 제1 세포 유형상의 케모카인 수용체에는 결합하지만, 제2 세포 유형상의 케모카인 수용체에는 결합하지 않는 케모카인을 동정하여, 케모카인 수용체의 신규한 토폴로지를 동정하는 단계를 포함한다.
몇몇 측면에서, 케모카인 수용체는 CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, CX3CR1,CXR1, CCXCKR(CCR11), (CCR12), US28, ECRF3, 카포시 육종 관련 헤르페스바이러스 GPCR, 폭스바이러스 막 결합 G 단백질-커플링된 수용체, D6 및 DARC로 이루어진 군으로부터 선택된다.
몇몇 측면에서, 다수의 상이한 케모카인은 ITAC 및 SDF-1을 포함하며, 제1 세포 유형은 ITAC와 SDF-1이 경쟁적으로 결합하는적으로 결합하는 CXCR4의 토폴로지를 포함하는 제1 세포 유형을 포함하고, 제2 세포 유형은 ITAC와 SDF-1이 경쟁적으로 결합하지 않는 CXCR4의 토폴로지를 포함한다. 몇몇 측면에서, 3개 이상의 세포 유형이 테스트된다. 몇몇 측면에서, 10개 이상의 케모카인이 테스트된다.
몇몇 측면에서, 케모카인은 CL1, XCL2, CX3CL1, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9, CCL10, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27 및 CCL28로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 측면에서, 상기 케모카인은 고형 지지체에 고정된다.
몇몇 측면에서, 테스트 단계는 케모카인이 각각의 세포 유형에서 케모카인 수용체에 결합하는 리간드와 경쟁하는 능력을 측정하는 것을 포함한다. 몇몇 측면에서, 상기 리간드는 표지화된다.
몇몇 측면에서, 1 이상의 세포 유형은 내생 케모카인 수용체를 발현한다. 몇몇 측면에서, 1 이상의 세포 유형은 재조합적으로 발현된 케모카인 수용체를 발현한다. 몇몇 측면에서, 상기 테스트된 세포 유형은 암세포 및 비-암세포를 포함한다.
본 발명은 또한 샘플내 케모카인 수용체의 제1 토폴로지를 검출하는 방법을 제공한다. 몇몇 구체예에서, 본 발명의 방법은 다음의 단계들을 포함한다: 제1 토폴로지에 결합하지만, 제2 토폴로지에는 결합하지 않는 제제와 샘플을 접촉시키는 단계, 및 상기 제제가 샘플에 결합하는지 여부를 검출함으로써, 케모카인 수용체의 제1 토폴로지를 검출하는 단계. 몇몇 구체예에서, 상기 제제는 항체이다. 몇몇 구체예에서, 샘플은 인간으로부터 유래된다. 몇몇 구체예에서, 제제의 결합은 케모카인 수용체와 관련된 질병 또는 증상이 존재하는지 여부를 시사한다. 몇몇 구체예에서, 질병은 유방암, 난소암, 경부암, 버킷 림프종 관련 암 및 신경교아종 관련 암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 구체예에서, 케모카인 수용체는 CXCR4이다. 몇몇 구체예에서, 상기 제제는 유방암 세포, 난소암 세포, 경부암 세포, 버킷 림프종 세포 또는 신경교아종 세포에서 CXCR4와 접촉할때 CXCR4에 특이적으로 결합하지만, 림프구에서 CXCR4와 접촉할때에는 CXCR4와 결합하지 않는다. 몇몇 구체예에서, 유방암 세포는 MCF-7이다. 몇몇 구체예에서, 케모카인 수용체는 CCR1이다. 몇몇 구체예에서, 상기 제제는 미성숙 수지상 세포 또는 호중구에서 CCR1과 결합할때 CCR1에 특이적으로 결합하지만, 단핵구에서 발현된 CCR1과 접촉할때에는 CCR1에 결합하지 않는다.
본 발명은 또한 동물의 케모카인 수용체와 관련된 질병 또는 상태를 치료하는 방법, 전술한 바와 같이 동정된 제제의 치료학적 유효량을 이 제제의 투여가 필요한 동물에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 몇몇 구체예에서, 상기질병은 유방암, 난소암, 경부암, 버킷 림프종 관련 암 및 신경교아종 관련 암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 구체예에서, 상기 제제는 항체를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 상기 제제는 면역독소이다. 몇몇 구체예에서, 상기 동물은 인간이다. 몇몇 구체예에서, 상기 질병은 염증성 질환이다.
본 발명은 또한 케모카인 수용체의 제1 토폴로지에는 특이적이지만, 제2 토폴로지에는 특이적이지 않은 제제와 결합하는 세포를 정제하는 방법을 제공한다. 몇몇 구체예에서, 본 발명의 방법은 다음의 단계들을 포함한다: 세포를 포함하는 샘플과 제1 토폴로지에는 결합하지만, 제2 토폴로지에는 결합하지 않는 제제를 접촉시키는 단계; 상기 제제와 결합하는 세포를 선택하는 단계. 몇몇 구체예에서, 제제는 항체이다. 몇몇 구체예에서, 제제는 제1 토폴로지는 갖지만, 제2 토폴로지는 갖지 않는 리간드이다. 몇몇 구체예에서, 상기 세포는 백혈구이다.
본 발명은 또한 비-바이러스성 병원체가 세포에 결합하는 것을 조절하는 제제를 동정하는 방법을 제공한다. 몇몇 구체예에서, 본 발명의 방법은 다음의 단계들을 포함한다: (ⅰ) 제1 토폴로지를 갖는 케모카인 수용체를 포함하는 제1 세포와, 제2 토폴로지를 갖는 케모카인 수용체를 포함하는 제2 세포를 제공하는 단계; (ⅱ) 케모카인 수용체와 제제를 접촉시키는 단계; 및 (ⅲ) (a) 케모카인 수용체의 제1 토폴로지에는 결합하지만, 제2 토폴로지에는 결합하지 않고, (b) 비-바이러스 병원체가 세포에 결합하는 것을 조절하는 제제를 선택하는 단계. 몇몇 구체예에서, 상기 병원체는 기생체 또는 박테리아이다. 몇몇 구체예에서, 제1 세포는 비-바이러스성 병원체로 감염된다. 몇몇 구체예에서, 케모카인 수용체는 CCR1, CCR2, CCR3,CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, CX3CR1, CXR1, CCXCKR(CCR11), (CCR12), US28, ECRF3, 카포시 육종 관련 헤르페스바이러스 GPCR, 폭스바이러스 막 결합 G 단백질-커플링된 수용체, D6 및 DARC로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명은 또한 MCF-7 세포내 CXCR4에는 특이적으로 결합하지만, 림프구내 CXCR4에는 결합하지 않는 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 호중구내 CCR1에는 특이적으로 결합하지만, 단핵구내 CCR1에는 결합하지 않는 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 생검편에서 암세포를 동정하는 방법을 제공한다. 몇몇 구체예에서, 본 발명의 방법은 I-TAC가 조직 샘플중 CXCR4에 결합하는지 여부를 측정하는 것을 포함하며, 여기서 CXCR4에 I-TAC가 결합하는 것은 암세포가 존재함을 나타내는 것이다. 몇몇 구체예에서, 본 발명의 방법은 조직 생검편을 제공하는 단계; 및 이 조직이 I-TAC에 결합하는 CXCR4의 토폴로지를 포함하는 세포를 포함하는지 여부를 측정하는 단계로서, 여기서 I-TAC에 결합하는 상기 CXCR4의 토폴로지의 존재는 암세포가 존재하는지 여부를 나타낸다. 이러한 구체예중 몇몇에서, I-TAC 결합은 CXCR4 결합 분석법에서 I-TAC가 SDF-1과 경쟁하는지 여부를 테스트함으로써 측정된다. 몇몇 구체예에서, 암세포는 유방암 세포, 난소암 세포, 경부암 세포, 버킷 림프종 세포 및 신경교아종 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명은 또한 I-TAC가 CXCR4에 결합하는지를 검출하는 키트를 제공한다. 몇몇 구체예에서, 상기 키트는 케모카인 I-TAC 및 SDF-1을 포함하는데, 여기서 하나 이상의 케모카인은 표지화되고; 고형 지지체 또는 용기는 케모카인-CXCR4 결합을 측정하기 위한 것이다. 몇몇 구체예에서, 상기 키트는 I-TAC에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 상기 키트는 케모카인 경쟁적 결합 분석법에 사용하기 위한 염 완충액 또는 기타 시약을 포함한다.
본 발명은 또한 제1 토폴로지는 갖지만 제2 토폴로지는 갖지 않는 케모카인 수용체에 바이러스가 결합하는 것을 조절하는 제제를 동정하는 방법을 제공한다. 몇몇 구체예에서, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: (ⅰ) 제1 입체구조의 케모카인 수용체를 포함하는 제1 세포와, 제2 토폴로지를 갖는 케모카인 수용체를 포함하는 제2 세포를 제공하는 단계; (ⅱ) 이 제제와 케모카인 수용체를 접촉시키는 단계; 및 (ⅲ) (a) 케모카인 수용체의 제1 토폴로지에는 결합하지만, 제2 토폴로지에는 결합하지 않고, (b) 케모카인 수용체에 대한 바이러스 결합을 조절하여, 제1 토폴로지를 갖지만 제2 토폴로지는 갖지 않는 케모카인 수용체에 바이러스가 결합하는 것을 조절하는 제제를 동정하는 제제를 선택하는 단계.
몇몇 구체예에서, 바이러스는 레트로바이러스(retrovirus) 및 폭스 바이러스(pox virus)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 구체예에서, 상기 레트로바이러스는 렌티바이러스(lentivirus)이다. 몇몇 구체예에서, 상기 렌티바이러스는 인간 면역결핍증 바이러스이다. 몇몇 구체예에서, 상기 폭스 바이러스는 레포리폭스바이러스(leporipoxvirus)이다. 몇몇 구체예에서, 상기 레포리폭스바이러스는 믹소마 바이러스(myxoma virus)이다.
몇몇 구체예에서, 상기 케모카인 수용체는 CCRl, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5,CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, CX3CR1, CXR1, CCXCKR(CCR11), (CCR12), US28, ECRF3, 카포시 육종-관련 헤르페스바이러스 GPCR, 폭스바이러스 막 결합 G 단백질-커플링된 수용체, D6 및 DARC로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 구체예에서, 제1 세포는 백혈구이다. 몇몇 구체예에서, 백혈구는 T-세포이다. 몇몇 구체예에서, 상기 제제는 케모카인 수용체와의 결합에 대하여 바이러스와 경쟁한다.
본 발명은 또한 제1 토폴로지는 갖지만 제2 토폴로지는 갖지 않는 케모카인 수용체에 결합하는 바이러스에 의한 감염의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 몇몇 구체예에서, 본 발명의 방법은 전술한 바와 같이 동정된 제제의 치료학적 유효량을 이 제제의 투여를 필요로 하는 동물에 투여하는 단계를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 상기 바이러스는 레트로바이러스 및 폭스 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 구체예에서, 상기 레트로바이러스는 렌티바이러스이다. 몇몇 구체예에서, 상기 렌티바이러스는 인간 면역결핍증 바이러스이다. 몇몇 구체예에서, 상기 폭스 바이러스는 레포리폭스바이러스이다. 몇몇 구체예에서, 상기 레포리폭스바이러스는 믹소마 바이러스이다. 몇몇 구체예에서, 상기 동물은 인간이다.
본 발명은 또한 암세포의 세포자살을 유도하는 방법을 제공한다. 몇몇 구체예에서, 본 발명의 방법은 암세포와 SDF-1 길항제를 접촉시키는 것을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 암세포는 유방암 세포, 난소암 세포, 경부암 세포, 버킷 림프종 세포 및 신경교아종 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
정의
"항체"란, 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자들에 의하여 실질적으로 암호화된 폴리펩티드, 또는 이들의 단편을 의미하는 것으로서, 이는 분석물(항원)에 특이적으로 결합하여 인식한다. 인식된 면역글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론 및 뮤 불변부 유전자들 뿐만 아니라, 다수의 면역글로불린 가변부 유전자들을 포함한다. 경쇄는 카파 또는 람다로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로 분류되며, 이는 면역글로불린 군 즉, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 각각 정의한다.
대표적인 면역글로불린(항체)의 구조적 단위는 4량체를 포함한다. 각각의 사량체는 폴리펩티드 사슬의 두개의 동일한 쌍으로 이루어져 있으며, 각 쌍은 하나의 "경쇄"(약 25 kD)와 하나의 "중쇄"(약 50∼70 kD)를 갖는다. 각 사슬의 N-말단은 주로 항원 인식에 관여하는 약 100∼110 개 이상의 아미노산으로 이루어진 가변부를 한정한다. 상기 가변부 경쇄(VL) 및 가변부 중쇄(VH)란, 각각 이와 같은 경쇄 및 중쇄를 의미한다.
항체는 예를 들어, 다양한 펩티다제로 분해되어 생산된 다수의 널리 특성규명된, 또는 원상태의(intact) 면역글로불린으로서 존재한다. 그러므로, 예를 들어, 펩신은 항체의 힌지부에 있는 이황화결합 아래 부분을 분해하여 F(ab)'2즉, 그 자체가 이황화 결합에 의하여 VH-CH1에 결합된 Fab의 이량체를 생산한다. 상기 F(ab)'2는 온화한 조건하에서 환원되어 힌지부중 이황화 결합을 분해하며, 이로써, F(ab)'2이량체는 Fab' 단량체로 전환된다. 상기 Fab' 단량체는 본질적으로 힌지부의 일부를 보유하는 Fab이다[Paul(Ed.)Fundamental Immunology, Third Edition, Raven Press, NY (1993) 참조]. 다양한 항체 단편이 원상태 항체의 분해의 관점에서 정의될때, 당업자는 그러한 단편들이 화학적으로 새로이 합성되거나, 또는 재조합 DNA법을 이용하여 합성될 수 있음을 이해할 것이다. 그러므로, 본원에 있어서, 항체란 용어는 전항체를 변형시켜 제조된 항체 단편, 또는 재조합 DNA법을 이용하여 새로이 합성된 항체 단편(예를 들어, 단일쇄 Fv)을 포함한다.
"세포 또는 조직 반응"이란, 세포 또는 조직의 상태 변화를 의미하는 것으로서, 케모카인 수용체에 케모카인 리간드가 결합함으로써 유도되는 세포 반응을 포함한다. 케모카인 수용체에 의하여 자극될 수 있는 특정 반응으로서는 경막 시그널링, 세포질 시그널링 케스케이드의 활성화, 세포골격 재정렬, 부착, 주화성, 침습, 전이, 시토킨 생성, 유전자 유도, 유전자 억제, 단백질 발현의 유도, 또는 세포 성장 및 분화의 조절 예컨대, 암의 발생을 포함한다.
"케모카인" 또는 "케모카인 리간드"란, 대략 50∼110개의 아미노산으로 이루어져 있으며, 공지의 다른 케모카인과 서열 상동성을 공유하는 작은 단백질을 의미한다[예를 들어, Murphy, P. M.,Pharmacol Rev. 52: 145-176 (2000) 참조]. 케모카인은 1차 아미노산 서열에서 발견되는 시스테인(Cs)의 첫번째 쌍의 상대적 위치에 따라서 분류된다. CXCL 케모카인에서, 시스테인의 첫번째 쌍은 임의의 단일 아미노산에 의하여 분리된다. CCL 케모카인은 인접한 시스테인을 갖는다. CX3CL 케모카인에 있어서, 첫번째 시스테인 쌍은 3개의 아미노산에 의하여 분리된다. CL 케모카인은 상동성 위치에 하나의 시스테인만을 함유한다. 케모카인은 케모카인 수용체에결합하여 이를 활성화시킴으로써 생물학적 기능을 촉진시킬 수 있다.
"케모카인 수용체"란, 케모카인 분자와 특이적으로 상호작용하는 폴리펩티드를 의미한다. 케모카인 수용체는 7개의 경막 도메인을 보유하는 G 단백질 커플링된 수용체이다. 케모카인 수용체는 강산성 N-말단 도메인; 제2 세포외 루프내에서 발견되는 아미노산 서열 DRYLAIVHA(또는 그 서열의 최소한의 변이); 전체적으로 염기 전하를 띠는 제3의 짧은 세포간 루프; 4개의 세포외 도메인의 각각에 존재하는 시스테인 잔기를 비롯한, 7개의 공통된 구조상 특징을 보유한다. 통상적으로, 케모카인 수용체의 전체 크기는 약 340∼370개 아미노산 잔기이다. 예를 들어 문헌[Murphy, P. M.Chemokine Receptors ; Overview, Academic Press 2000; and Loetscher P. andClark-Lewis I. J. Leukocyte Biol. 69: 881 (2001)]을 참조하시오. 대표적인 케모카인 수용체의 예로서는 CC-케모카인 수용체(CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9 및 CCR10 포함), CXC-케모카인 수용체(CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5 및 CXCR6 포함), CX3CR1, CXR1, CCXCKR(OCR11), 바이러스 암호화된 케모카인 수용체, US28, ECRF3, 카포시 육종-관련 헤르페스 바이러스 GPCR, 폭스 바이러스 막결합 G 단백질 커플링된 수용체; D6 및 DARC를 포함한다.
"펩티도모의체" 및 "모의체"란, 케모카인 수용체의 길항제 또는 효능제의 실질적으로 동일한 구조적 및 기능적 특성들을 갖는 합성 화학 화합물을 의미한다. 펩티드 유사체는 제약 산업에서 주형 펩티드의 특성과 유사한 특성을 갖는 비-펩티드 약물로서 통상적으로 사용된다. 이러한 유형의 비-펩티드 화합물을 "펩티드 모의체(peptide mimetics)" 또는 "펩티도모의체(peptidomimetics)"라 칭한다[Fauchere, J.Adv.Drug,Res.15:29(1986); Veber and Freidinger TINS p.392(1985); 및 Evans et al. J.Med.Chem.30:1229(1987), 이들은 모두 본원에 참고문헌으로 인용됨]. 치료학적으로 유효한 펩티드와 구조상 유사한 펩티드 모의체는 동일하거나 또는 보다 강화된 치료 효과 또는 예방 효과를 나타내는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 펩티도모의체는 패러다임 폴리펩티드(즉, 생물학적 또는 약리학적 활성을 갖는 폴리펩티드)와 구조상 유사하나, 예를 들어, -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH-(시스 및 트랜스), -COCH2-, -CH(OH)CH2- 및 -CH2SO-로 이루어진 군으로부터 선택된 결합에 의하여 임의 치환되는 하나 이상의 펩티드 결합을 갖는다. 모의체는 전체가 합성, 비천연 아미노산 유사체이거나, 또는 일부는 천연 펩티드 아미노산이고 일부는 비천연 아미노산 유사체인 키메라 분자이다. 상기 모의체는 또한 이러한 치환이 상기 모의체의 구조 및/또는 활성을 실질적으로 변경시키지 않는한, 천연 아미노산의 보존적 치환을 임의의 양만큼 도입시킬 수 있다. 예를 들어, 모의 조성물은 그것이 케모카인 수용체의 활성 또는 기능을 억제하거나 또는 증가시킬 수 있으면 본 발명의 범위내에 포함된다.
"유전자"란 용어는, 폴리펩티드 사슬을 생성하는데 관여하는 DNA 분절을 의미하며; 이는 암호화 영역의 앞부분 또는 그 뒷부분(리더 및 트레일러) 뿐만 아니라, 각각의 암호화 분절(엑손) 사이에 개재된 서열(인트론)도 포함한다.
핵산 또는 단백질에 사용될 경우 "분리된"이란 용어는, 핵산 또는 단백질에천연의 상태로 결합되는 다른 세포 성분이 본질적으로 없는 상태를 의미한다. 건조상태 또는 수용액 상태로 존재할 수도 있지만, 균질의 상태로 존재하는 것이 바람직하다. 순도 및 균질성은 통상적으로 분석 화학 기법 예컨대, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 측정된다. 제제에 존재하는 대다수의 종류의 단백질은 실질적으로 정제된다. 구체적으로, 분리된 유전자는 유전자에 측접하여 목적 유전자 이외의 단백질을 암호화하는 개방 해독틀로부터 분리된다. "정제된"이란 용어는, 핵산 또는 단백질이 전기영동 겔상에 실질적으로 하나의 밴드로 나타나는 경우를 의미한다. 특히, 이는 핵산 또는 단백질이 85% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상 및 가장 바람직하게는 99% 이상 순수하다는 것을 의미한다.
"리간드"란, 제제 예를 들어, 케모카인 수용체에 결합할 수 있는 기타 분자의 폴리펩티드를 의미한다.
본원에 사용된 "케모카인 토폴로지에 결합하는 제제"란, 고친화도로 결합하는 제제를 의미한다. "고친화도"란, 약리학적으로 관련있는 반응 예를 들어, 약학적으로 관련된 농도(예를 들어, 약 10-5M 이하의 농도)에서 케모카인 수용체에 대하여 천연 케모카인 리간드와 경쟁적으로 결합하는 능력을 유도하기에 충분한 친화도를 의미한다. 예를 들어, 실시예 1과 도 5를 참조하시오. 고친화도의 몇몇 대표적인 제제들은 케모카인 수용체의 토폴로지에 10-6M 이상의 친화도로, 종종 10-7M 또는 10-8M 이상의 친화도로 결합할 것이다. 제제가 10-4M 이하의 농도로 존재할때 천연 수용체 리간드와 경쟁적으로 결합할 수 없는 제제는 본 발명에 있어서 "결합하지 않는" 것으로 간주될 것이다.
"바이러스 결합"이란, 바이러스 입자 또는 바이러스의 일부 예컨대, 바이러스 외피 단백질 또는 이의 단편이 표적 성분 예컨대 단백질(예를 들어, 케모카인 수용체)에 결합하는 능력을 의미한다. 결합 친화도를 측정하기 위한 표준 분석법을 사용하여 결합을 측정할 수 있다. 이러한 분석법으로는 예를 들어, 경쟁적 결합 연구를 포함한다.
"핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드"란 용어는, 단일 사슬 또는 이중 사슬 형태인, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 이들의 중합체를 의미한다. 특별히 한정하지 않는한, 상기 용어는 참고 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고 천연 발생 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다. 달리 언급이 없는한, 특정 핵산 서열은 또한 이의 보존적으로 변형된 변이체(예컨대, 축퇴성 코돈 치환) 및 상보성 서열 뿐만 아니라, 분명히 제시된 서열을 포함함이 분명하다. 특히, 축퇴성 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합된 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 제조함으로써 이루어질 수 있다[Batzer et al., Nucleic Acid Res.19:5081(1991); Ohtsuka et al., J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985); 및 Cassol et al.(1992); Rossolini et al., Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994)]. 핵산이란 용어는 유전자, 유전자에 의하여 암호화되는 cDNA 및 mRNA와 호환적으로 사용된다.
본원에서 호환적으로 사용되는 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"이란 용어는 아미노산 잔기의 중합체를 의미한다. 이 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가이에 상응하는 천연 발생 아미노산의 인공적 화학 모의체인 아미노산 중합체 뿐만 아니라, 천연 발생 아미노산 중합체 및 비천연 발생 아미노산 중합체에 적용되는 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, 상기 용어들은 임의의 길이를 갖는 아미노산 사슬 예를 들어, 전장 단백질(즉, 항원)을 포함하며, 여기서 상기 아미노산 잔기는 공유 펩티드 결합에 의하여 결합된다.
"토폴로지"란, 입체구조를 포함하되 이것에 한정되는 것은 아닌, 분자의 3차원 구조를 의미한다. 하나의 폴리펩티드는 이 폴리펩티드의 아미노산 잔기들이 상이한 구조를 형성할 경우 2개 이상의 토폴로지를 형성할 수 있다. 특정 아미노산 서열은 2개의 토폴로지를 형성할 수 있는 반면에, 당업자들은 2개의 토폴로지가 종종 2개의 상이한 아미노산 서열 예를 들어, 보존적 변화로 인하여 다양한 2개의 서열에 의해 표시될 수도 있음을 이해할 것이다. 또한, 토폴로지가 "제1" 및 "제2"로서 언급될 수 있을 경우, 이는 반드시 폴리펩티드를 2개의 토폴로지로만 한정하는 것은 아니다. 폴리펩티드의 토폴로지는 예를 들어, 황산화, 탈황산화, 미리스틸화, 탈미리스틸화, 글리코실화, 탈글리코실화, 인산화 또는 탈인산화에 의하여 변경될 수 있다. 예를 들어, 케모카인 수용체의 토폴로지는 몇몇 구체예에서, 케모카인 수용체가 발현되는 세포 성분에 의하여 측정된다. 세포-특이적 수용체 토폴로지는 케모카인 수용체들 상호간(이량체 또는 다량체 형성) 또는 다른 세포 표면 단백질과의 상호작용의 결과로서 발생할 수 있다. 또한, 특이적 토폴로지는 기타의 세포-특이적 성분 예컨대, 이종삼량체 G 단백질, 수용체 상호작용 단백질, 세포 신호전달 분자, 또는 막 인지질 환경에 의하여 측정될 수 있다. 케모카인 수용체 토폴로지를조절할 수 있는 세포내 G 단백질 서브유닛으로서는 G 알파, 베타 또는 감마 서브유닛을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 수용체-상호작용 및 조절 단백질은 또한 RAMP, 세포골격 단백질, 어뎁터 단백질, 수용체 키나제 및 기타 막 결합 효소를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
폴리펩티드의 토폴로지는 본원에 기술된 바와 같이, 항체 또는 소분자 예컨대, 길항제 또는 효능제의 수용체 토폴로지에 대한 결합 친화도를 분석함으로써 측정될 수 있다. 특히, 상이한 토폴로지는 예를 들어, 1) 모노클로날 항체 반응성을 비롯한 상이한 항체 반응성; 2) 상이한 리간드 결합 특이성; 3) 상이한 리간드 친화도; 4) 약리학적 구별(즉, 소분자에 결합하는 순차적 능력 및/또는 이 소분자에 의하여 자극되는 순차적 능력); 및 5) 변형된 세포 반응 예를 들어, 리간드 결합에서의 반응에 의하여 동정될 수 있다.
"아미노산"이란 용어는, 천연 발생 아미노산 및 합성 아미노산 뿐만 아니라, 이 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 작용을 하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모의체를 의미한다. 천연 발생 아미노산은 유전자 코드에 의하여 암호화되는 것 뿐만 아니라, 추후에 변형되는 아미노산 예를 들어, 히드록시프롤린, γ- 카르복시글루타메이트 및 O-포스포세린이 있다. 아미노산 유사체란, 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 갖는 화합물 즉, 수소, 카르복시기, 아미노기 및 R 기에 결합된 α탄소를 갖는 화합물을 의미하는 것으로서, 그 예로서는 호모세린, 노르류신, 메티오닌 설폭시드, 메티오닌 메틸 설포늄이 있다. 이러한 유사체들은 변형된 R 기(예를 들어, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 주쇄를 갖지만, 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 갖는다. "아미노산 모의체"란, 아미노산의 일반적인 화학 구조와 상이한 구조를 가지지만, 천연 발생 아미노상과 유사한 방식으로 작용을 하는 화학 화합물을 의미한다.
본원에서 아미노산은 IUPAC-IUB 생화학 명명 협회(Biochemical Nomenclature Commission)에 의하여 추전되는, 일반적으로 알려진 3 문자 표시에 의하거나, 또는 1 문자 표시로서 언급될 수 있다. 이와 유사하게 뉴클레오티드는 그의 일반적으로 허용되는 1 문자 코드로 언급될 수 있다.
"보존적으로 변형된 변이체(conservatively modified variant)"란, 아미노산과 핵산 서열 모두에 적용되는 용어이다. 특정 핵산 서열에 있어서, "보존적으로 변형된 변이체"란, 동일하거나 또는 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 의미하며, 상기 핵산이 아미노산 서열을 암호화하지 않는 경우에는 본질적으로 동일한 서열을 의미한다. 유전자 코드의 축퇴성으로 인하여, 다수의 핵산 서열은 임의의 주어진 단백질을 암호화할 것이다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 암호화한다. 따라서, 알라닌이 코돈에 의하여 특정되는 매 위치에서, 상기 코돈은 암호화된 폴리펩티드를 변형시키지 않고서도 전술한 해당 코돈중 임의의 것으로 변형될 수 있다. 이러한 핵산 변이를 "침묵 변이"리고 하는데, 이는 보존적으로 변형된 변이의 일종이다. 폴리펩티드를 암호화하는 본원의 핵산 서열 모두는 또한 핵산의 가능한 모든 침묵 변이를 나타낸다. 당업자는 핵산중 각 코돈(보통 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG, 및 보통 트립토판에 대한 유일한 코돈인 TGG 제외)은 변형되어 기능적으로 동일한 분자를 형성할 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 각 침묵 변이는 제시된 각 서열을 내포한다.
변형을 통하여 아미노산이 그의 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환될 경우, 아미노산 서열에 대해서 당업자는 암호화된 서열중 단일 아미노산 또는 소량의 아미노산을 변경, 부가 또는 삭제하는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열에 대한 각각의 치환, 결실 또는 부가가 "보존적으로 변형된 변이체"임을 인식할 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당 업계에 널리 공지되어 있다. 그러한 보존적으로 변형된 변이체는 본 발명의 다형성 변이체, 종간 상동체 및 대립유전자들에 부가되어 제외되지 않는다.
서로 보존적으로 치환되는 아미노산을 포함하는 8개의 군들은 각각 다음과 같다:
1) 알라닌(A), 글리신(G);
2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E) ;
3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q);
4) 아르기닌(R), 리신(K) ;
5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V);
6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W);
7) 세린(S), 트레오닌(T); 및
8) 시스테인(C), 메티오닌(M)
[예를 들어, Creighton, Proteins(1984) 참조].
"서열 동일성 비율"은 2개의 최적으로 정렬된 서열들을 비교 윈도우(comparison window)에 대하여 비교함으로써 측정되는데, 여기서 상기 비교 윈도우중 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 2개의 서열의 최적 정렬에 대한 참고 서열(부가 또는 결실이 일어나지 않은 서열)에 비하여 부가 또는 결실(즉, 겝)을 포함할 수 있다. 상기 비율은 양 서열에 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 존재하는 위치의 수를 측정하여 매칭된 위치의 수를 구하고, 매칭된 위치의 수를 비교 윈도우에 존재하는 위치의 총수로 나눈 다음, 그 결과를 100으로 곱하여 서열 동일성의 비율을 구함으로써 계산할 수 있다.
본 명세서중 2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열에 있어서 "동일한" 또는 "동일성" 비율이란 용어는, 수동식 정렬 및 시각적 관찰에 의하거나, 또는 다음과 같은 서열 비교 알고리즘중 하나를 사용하여 측정된 지정 영역, 또는 비교 윈도우에 대한 최대 대응성에 관하여 비교 및 정렬될 때, 동일한(즉, 특정 영역에 대하여 60% 동일성, 임의적으로는 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일성을 나타내는) 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 특정 비율을 갖거나, 동일한 2 이상의 서열 또는 내부 서열을 의미한다. 이후 이러한 서열들은 "실질적으로 동일하다"라고 한다. 이러한 정의는 또한 테스트 서열의 상보성을 의미한다. 임의적으로, 상기 동일성은 길이 약 50개 이상인 뉴클레오티드로 이루어진 영역이나, 더욱 바람직하게는 길이 100∼500개 또는 1000개 이상의 뉴클레오티드로 이루어진 영역에 걸쳐 존재한다.
2 이상의 폴리펩티드 서열에 관한 명세서의 내용중에서 "유사성" 또는 "유사성 비율"이란 용어는, 수동식 정렬 및 시각적 관찰에 의하거나, 또는 다음과 같은 서열 비교 알고리즘중 하나를 사용하여 측정된 지정 영역, 또는 비교 윈도우에 대한 최대 대응성에 관하여 비교 및 정렬될 때, 상기 정의한 바와 같은 8개의 보존적 아미노산 치환과 동일하거나 또는 이와 유사한 아미노산 잔기를 특정 비율로 보유하는 즉, 상기 나열한 케모카인 수용체 예컨대, CXCR4(예를 들어, 서열번호 1 및 PCT WO 01/70768 참조)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 특정 영역 또는 전체 서열에 대하여 60%, 임의적으로는 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 유사한 2 이상의 서열 또는 내부 서열을 의미한다. 이러한 서열은 이후 "실질적으로 유사한" 것으로 칭하여 진다. 임의적으로, 이러한 동일성은 길이 약 50개 이상의 아미노산인 영역, 또는 더욱 바람직하게는 길이 약 100∼500개 아미노산, 또는 1000개 이상의 아미노산인 영역에 대하여 존재한다.
서열 비교에 있어서, 통상적으로 하나의 서열이 테스트 서열과 비교되는 참고 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용할때, 테스트 및 참고 서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요하다면 내부 서열 동등물을 지정해주며, 서열 알고리즘 프로그램의 매개변수를 지정한다. 디폴트 프로그램 매개변수가 사용될 수 있거나, 또는 대체 매개변수가 지정될 수 있다. 이후 서열 비교 알고리즘을 사용하여 이 프로그램 매개변수를 바탕으로 참고 서열에 대한 테스트 서열의 서열 동일성 비율을 계산한다.
본원에 사용된 "비교 윈도우"란, 20∼600 개, 일반적으로는 약 50∼약 200 개, 더욱 일반적으로는 약 100∼약 150개로 이루어진 군으로부터 선택된 다수의 인접 위치중 임의의 것으로 이루어진 분절에 대한 참고 분절을 포함하며, 이때 상기 서열은 두개의 서열들이 임의로 정렬된 후의 인접 위치들과 동일한 수를 갖는 참고서열과 비교될 수 있다. 비교용 서열의 정렬 방법은 당 업계에 널리 공지되어 있다. 비교용 서열의 최적 정렬은 예를 들어, Smith and Waterman (1970) Adv. Appl.Math. 2: 482c의 국소적 상동성 알고리즘, Needleman and Wunsch (1970)J Mol. Biol. 48: 443의 상동성 정렬 알고리즘, Pearson and Lipman(1988) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444의 유사성 검색 방법, 이러한 알고리즘의 컴퓨터화된 기구[GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFAST, Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI], 또는 수동 정렬법 및 시각적 관찰에 의하여 수행될 수 있다[예를 들어, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology(1995)].
서열 동일성 비율 및 서열 유사성 비율을 측정하는데 적당한 알고리즘의 예로서는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이 있는데 이에 관하여는 문헌[Altschul et al.,(1977) Nuc.Acids.Res.25:3389-3402 및 Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-410]에 각각 기술되어 있다. BLAST 분석법을 실행하기 위한 소프트웨어는 National Center for Biotechnology Information(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 통하여 공개적으로 입수 가능하다. 이 알고리즘은, 처음에 데이터베이스 서열중 동일한 길이의 단어와 정렬될때 일부 양의 값인 한계치 스코어 T와 매칭되거나 또는 이를 만족시키는, 의문 서열(query sequence)중 길이 W인 짧은 단어를 동정함으로써 고 스코어링 서열쌍(HSP)을 동정하는 것을 포함한다. T는 이웃하는 단어 스코어 한계치를 의미한다[Altschul et al., 상동]. 이러한 초기의 이웃하는 단어의 히트는 이 히트를 포함하는 더욱 긴 HSP를 찾는 검색 과정을 개시하기 위한 시드(seed)로서 작용한다. 이러한 단어 히트는 누적 정렬 스코어가 증가할 수 있는 한도까지, 각 서열을 따라서 양 방향으로 확장된다. 누적 스코어는 매개변수 M[매칭 잔기쌍에 대한 보상 스코어; 항상 > 0임] 및 N[미스매칭된 잔기에 대한 페널티 스코어; 항상 < 0임]을 이용하여 뉴클레오티드 서열에 대하여 계산된다. 아미노산 서열에 있어서는, 스코어링 매트릭스를 사용하여누적 스코어를 계산한다. 각 방향에서의 단어 히트의 연장은, 누적 정렬 스코어가 얻을 수 있는 그의 최대값과 양 X만큼 떨어질때; 하나 이상의 음의 스코어링 잔기 정렬이 누적됨으로 인하여 누적 스코어가 0 이하가 될때; 또는 서열의 말단부중 어느 하나에 도달할때 정지된다. 상기 BLAST 알고리즘 매개변수 W, T 및 X는 정렬의 정확도와 속도를 결정한다. (뉴클레오티드 서열에 대한) BLASTN 프로그램은 디폴트값으로서 단어 길이(W)가 11, 기대치(E) 10, M=5, N=-4를 사용하며, 상기 양 사슬의 비교용으로 사용된다. 아미노산 서열에 대하여, BLASTP 프로그램은 디폴트값으로서 단어 길이 3, 기대치(E) 10과, BLOSUM62 스코어링 매트릭스를 사용한다[ Henikoff and Henikoff(1989) Proc.Natl.Acad. Sci. USA 89 : 10915, 정렬(B)=50, 기대치(E)=10, M=5, N=-4, 및 양 서열 비교].
BLAST 알고리즘도 두 서열 간의 유사성에 관한 통계적 분석을 수행한다(예를 들어, Karlin and Altschul (1993) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787을 참조하시오). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 한 측정 방법은 최소합 확률법(P(N))인데, 이것은 두 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 간의 매치가 우연히 일어날 확률을 나타낸다. 예를 들어, 핵산은 기준 핵산에 대한 시험 핵산의 비교에서 최고합 확률이 약 0.2 미만, 더 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만일 경우 기준 서열과 유사하다고 본다.
두 핵산 서열 또는 폴리펩티드가 실질적으로 동일하다는 지시는 제1 핵산 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드가 하기하는 바와 같이 제2 핵산 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드에 대한 항체와 면역학적으로 교차 반응하는 것이다. 따라서, 예를 들어, 두 펩티드가 보존적 치환부만 상이할 경우 폴리펩티드는 일반적으로 제2 폴리펩티드와 실질적으로 동일하다. 두 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 또다른 지시는 하기하는 바와 같이 엄격한 조건하에 두 분자 또는 이들의 보체가 하이브리드화하는 것이다. 두 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 또다른 지시는 그 서열을 증폭시키는데 동일한 프라이머를 사용할 수 있다는 것이다.
단백질 또는 폴리펩티드를 언급할 때, "항체에 특이적으로 (또는 선택적으로) 결합한다" 또는 "~와 특이적으로 (또는 선택적으로) 면역반응하는"이란 말은 단백질 및 다른 생물의 이종 군집의 존재하에 그 단백질의 존재를 확정하는 결합 반응을 말한다. 따라서, 지정된 면역 분석 조건하에, 특이화된 항체는 특정 단백질에 결합하고 시료내 존재하는 다른 단백질에는 유의적 양으로 결합하지 않는다. 이러한 조건하에 항체에 대한 특이적 결합은 특정 단백질에 대한 특이성으로 선택되는 항체를 필요로 할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 임의의 폴리뉴클레오티드에 의하여 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 단백질에 대한 항체를 선택하여 다른 단백질이 아닌 그 단백질과 특이적으로 면역 반응하는 항체를 얻을 수 있다. 특정 단백질과 특이적으로 면역 반응하는 항체를 선택하기 위하여 면역 분석 틀을 변형시킬 수 있다. 한 단백질과 특이적으로 면역 반응하는 단클론 항체를 선택하기 위하여는 예를 들어, 유동성 혈구 계측법 및 FACS 분석법 또는 면역조직화학법이 일상적으로 사용된다. 특이적 면역반응성을 측정하기 위하여 사용할 수 있는 면역 분석틀 및 조건의 기재에 대하여는 예를 들어, Harlow and Lane Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, NY (1988)을 참조하시오. 일반적으로, 특이적 또는 선택적 반응은 배경 시그널링 또는 잡음의 2배 이상, 더 일반적으로는 10∼100배 이상일 것이다.
케모카인 수용체 활성의 "억제제", "활성화제" 및 "조절제"는 각각 예를 들어, 리간드, 효능제, 길항제 및 이들의 유사물 및 모방물과 같이 케모카인 수용체 결합 또는 시그널링에 대한 시험관 분석 및 생체 분석을 사용하여 판별된 억제 분자, 활성화 분자 또는 조절 분자를 일컫기 위해 사용된다. 억제제는 예를 들어, 길항제와 같이 부분적으로 또는 전체적으로 자극을 차단하고, 활성을 감소, 억제, 지연시키며 비활성화시키고, 탈감작화하거나 케모카인 수용체의 활성을 하향 조절하기 위하여 예를 들어, 결합하는 제제이다. 활성화제는 예를 들어, 효능제와 같이 케모카인 수용체의 활성을 자극, 증가, 개방, 활성화, 용이화, 활성 증대, 감작화 또는 상향 조절하기 위하여 예를 들어, 결합되는 제제이다. 조절제는 G-단백질이 커플링된 수용체(GPCRs), 키나제 등을 비롯한 수용체, 활성화제 또는 억제제를 결합시키는 단백질과 케모카인 수용체의 상호활성을 예를 들어, 변화시키는 제제를포함한다. 조절제는 자연 발생적인 및 합성 리간드, 길항제, 효능제, 화학적 소분자 등 뿐만 아니라 예를 들어, 활성이 변화된 자연 발생적 케모카인 수용체 리간드의 유전적 개질 형태를 포함한다. 이러한 억제제 및 활성화제에 대한 분석은 예를 들어, 케모카인 수용체를 발현시키는 세포에 추정 조절제 화합물을 가하는 단계 및 상기한 바와 같이 케모카인 수용체 시그널링에 미치는 이의 작용적 효과를 측정하는 단계를 포함한다. 억제 범위를 조사하기 위하여, 잠재적 활성화제, 억제제 또는 조절제로 처리된 케모카인 수용체를 포함하는 시료 또는 분석법을 활성화제, 억제제 또는 조절제가 없는 대조구 시료와 비교한다. (억제제로 처리되지 않은) 대조구 시료를 100%의 상대적 케모카인 수용체 활성치로 한다. 대조구에 대한 케모카인 수용체 활성치가 약 80%, 임의로 5% 또는 25∼0%일 때 케모카인 수용체의 억제가 달성된다. 대조구에 대한 케모카인 수용체 활성치가 110%, 임의로 150%, 임의로 200∼500% 또는 1000∼3000% 더 높을 때 케모카인 수용체의 활성화가 달성된다.
관련 출원에 대한 상호 참조문헌
본 출원은 각각이 그 전체로서 본원에 참고문헌으로 인용된, 2001년 11월 30일에 출원된 미국 특허 출원 일련번호(USSN) 60/338,100, 2001년 11월 30일에 출원된 미국 특허 출원 제60/337,961호, 2002년 9월 16일에 출원된 미국 특허 출원 제10/245,850호 및 2002년 10월 1일에 출원된 유럽 특허 출원 제02256808.3호의 우선권을 주장한다.
도 1은 항체 반응성 그래프이다. 항체 반응성은 잠재적 T 세포 대 유방 종양 세포 수용체 토폴로지 표현형을 예상하고 결정한다. 정상 PBMC 뿐만 아니라 T 세포주, CEM-NKr 및 Jurkat을 항-CXCR4 항체 클론 12G5, 171, 172 및 173으로 스테이닝한다. 유방 종양선, MCF-7, MDA MB-231 및 MDAMB-435s에서의 약한 반응성에 비하여 강한 항체 반응성이 관찰된다. MDA MB-435s는 테스트되는 임의의 클론 MCF-7 및 MDA로는 포지티브 스테이닝을 보이지 않으나 MB-231은 클론 171, 172 및 173(12G5는 아님)으로는 약한 반응성을 나타낸다. 두꺼운 블랙 선은 항-CXCR4 항체이고 얇은 블랙선은 매치되는 동형 대조구이다.
도 2는 상이한 세포형에 대한 개별적 SDF-1 전위 결합 '핑거프린트'를 나타내는 결합 데이터를 도시한다. 90 이상의 개별 바이러스, 인간 및 쥐과 케모카인 및 표지되지 않은 경쟁자로서 케모카인 변종의 포괄 어레이와의 결합 전위 실험에서, 결합 경쟁 프로파일은 (c) MCF-7 상의 방사선 리간드 프로브로서 사용되는125II-TAC 뿐만 아니라 (a) CEM-NKr 및 (b) MCF-7에 대한 방사선 리간드 프로브로서 125I SDF-1α를 사용한다. 방사선 리간드 결합의 억제(%)는 막대 그래프로 도시되어 있으며, SDF-1 및 I-TAC는 CEM-NKr 세포가 아닌 MCF-7 상에서 교차-전위됨을 밝히고 있다. 백색 막대는 잠재적 고 친화도(억제 80% 초과)를, 회색 막대는 잠재적 중 친화도 내지 저 친화도(억제 60∼79%)를, 블랙 막대는 친화도가 거의 없거나 전혀 없음(억제 60% 미만)을 나타낸다. 결과는 3회 측정한 것의 평균이다. 명확성을 기하기 위해 오차 막대는 생략한다.
도 3은 CEM-NKr 및 MCF-7에 대한 리간드 결합 친화도 및 특이성을 비교한 것이다. 도 1에서 판별된 잠재적 고 친화도 리간드를 CEN-NKr(백색 사각형) 및 MCF-7(블랙 사각형)에 대한 용량 반응 경쟁을 위해 선택하였다. 각 경쟁에서125I SDF-1α는 지시되는 바와 같이 표지되지 않은 경쟁자 케모카인과 경쟁한다.
도 4는 MCF-7 세포 상의125II-TAC 결합이 전형적인 CXCR3 결합 상호작용으로 인한 것이 아님을 나타낸다.1251-TAC가 지시된 케모카인과 경쟁하는 능력은 유일의완충액(블랙 사각형), 과량의 MIG(임의의 CXCR3-매개 결합을 억제하기 위함; 백색 삼각형) 또는 과량의 SDF-1α(임의의 CXCR4-매개 결합을 억제하기 위함; 아스테릭스)의 존재하에 조사하였다.
도 5는 경쟁적 결합 데이터를 나타낸다. 두 CXCR4 길항제, CCX0803(블랙 원) 및 CCX7923(백색 원)은 구분되는 세포 유형에서125I SDF-1α와 특이적으로 경쟁하며 교차 경쟁은 관찰되지 않는다. SDF-1α(아스테릭스)는 또한 MCF-7 및 CEM-NKr 상에 결합하는125I SDF-1α의 표지되지 않은 경쟁자로서 포함되었다. CCX0803 및 CCX7923의 화학적 구조는 삽입도에 나타내었다. SDF-1α및 CXCR4 길항제 경쟁의 예상 IC50 값은 첨부된 표에 제공되어 있다.
도 6은 상이한 세포 유형에서 CCR1에 대한 CCR1 특이 항체의 반응성을 나타낸다.
도 7은125MIP-1α결합 데이타를 나타낸다.
도 8은 상이한 세포/리간드 조합체에 대한 세포 이동 데이타를 나타낸다.
도 9는 세포내 Ca2+ 유동화를 나타낸다.
도 10은 항체 반응성 데이타를 나타낸다.
I. 도입
본 발명은 케모카인 수용체가 상이한 세포 유형에서 상이한 토폴로지를 형성한다는 놀라운 발견을 제공한다. 상이한 세포 유형은 상이한 리간드 특이성, 약리학적 특성 및 작용을 가진다. 토폴로지는 단백질(예를 들어, 케모카인 수용체 단백질)의 상태 또는 형태이다. 상이한 토폴로지는 동일한 폴리뉴클레오티드에 의하여 암호화될 수 있고 유사하거나 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 케모카인 수용체의 상이한 토폴로지는 뚜렷한 특성을 가지며 상이한 생물학적 및/또는 병리학적 작용을 중개할 수 있다.
1) 항체 반응성 - 주어진 수용체 유전자에 의하여 암호화된 상이한 토폴로지는 (수용체 폴리펩티드를 나타내는 재조합 단백질에 대한 단클론 항체와 같은) 항체의 패널에 대한 응답으로 상이한 염색 프로파일을 나타낸다. 동일한 케모카인 수용체 유전자가 상이한 세포 유형에서 발현될 경우 상이한 토폴로지가 발생할 수 있다.
2) 리간드 결합 - 주어진 수용체 유전자에 의하여 암호화된 상이한 토폴로지는 이의 리간드 결합 프로파일에서 변화한다(즉, 이들은 별개의 리간드의 상이한 스펙트럼에 결합한다). 또한, 상이한 토폴로지는 상이한 친화도를 갖는 리간드의 스펙트럼내에서 리간드를 결합시킬 수 있다.
3) 약리학적 판별 - 주어진 수용체 유전자에 의하여 암호화되는 상이한 토폴로지는 개별적인 유기 소분자 (또는 소분자의 세트)로 억제되는데, 이들 중 일부는 의학적으로 적당할 수있다.
4) 작용 - 주어진 수용체 유전자 대조구에 의하여 암호화되는 상이한 토폴로지는 상이한 세포적 또는 병리생리학적 맥락에서 상이한 생물학적 작용을 부여한다. 이들은 상이한 세포 환경에서 상이한 리간드 결합 스펙트럼을 가짐으로써작용(예를 들어, 세포 이동)을 상이하게 조절한다. 상이한 토폴로지는 상이한 세포 환경에서 상이한 커플링 및 제2 메신저 시그널링에 의하여 (예를 들어, 상이한 G 단백질에 연결함으로써) 세포 작용을 상이하게 조절한다.
본 발명은 수용체의 제2 토폴로지가 아닌 케모카인 수용체의 한 토폴로지를 특이적으로 결합 및/또는 조절시키는 제제를 판별하는 방법을 제공한다. 이러한 제제는 특정 케모카인 수용체 토폴로지와 관련된 질환 또는 이상에 대한 치료제로서 유용하다. 또한, 이러한 제제는 케모카인 수용체의 특정 토폴로지를 검출함으로써 질환에 대한 예방 또는 질환을 진단하는데 유용하다. 또한, 이러한 제제는 케모카인 수용체의 특정 토폴로지를 발현시키는 세포를 판별하여 분리시키는데 유용하다.
몇몇 구체예에서, 이러한 제제는 케모카인 수용체의 특이적 토폴로지에 대한 바이러스의 결합을 차단하는데 유용하다. 따라서, 이러한 제제는 바이러스 감염을 예방 또는 치료하는데 유용하다.
II. 케모카인 수용체의 토폴로지의 판별
케모카인 수용체의 신규한 토폴로지는 다수의 방법으로 판별할 수 있다. 세포-특이적 토폴로지를 판별하기 위하여, 2 이상의 세포 유형을 준비하여, 항원성, 리간드 결합 또는 기타 케모카인 수용체와 관련된 능력에 대해 스크리닝하였다. 한 세포 유형이 케모카인 수용체의 예상되는 신규한 토폴로지를 발현시키면, 그 세포 유형 상의 토폴로지는 본원에 기재된 바와 같이 더 특징화될 수 있다(예를 들어, 항원성, 리간드 결합, 소분자 친화도, 작용 등). 예에서 알 수 있는 바와 같이, 동일한 수용체의 상이한 리간드 특이성은 상이한 세포들이 수용체의 상이한 토폴로지를 지지함을 나타낸다.
스크리닝된 세포 유형은 크게 변화될 수 있다. 일부 구체예에서는, 특정 케모카인 수용체를 발현시키는 것으로 공지된 세포 유형이 사용될 것이다. 케모카인 수용체의 예에는 예를 들어, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, CX3CR1, CXR1, CCXCKR(CCRl l), (CCR12), US28, ECRF3, Kaposi's Sarcoma-관련 Herpesvirus GPCR, 폭스바이러스 막-결합 G 단백질-커플링된 수용체, D6 및 DARC가 포함된다.
다른 구체예들에서, 한 세포 유형이 한 특정 수용체를 발현시키는가는 처음에 알려져 있지 않다. 또, 상이한 질환 상태(예를 들어, 암 세포)를 나타내는 세포를 스크리닝하여 비교할 수 있다. 일부 구체예에서, 세포는 내인성 케모카인 수용체를 발현시킨다. 다른 구체예들에서, 적어도 일부 세포 유형은 재조합 발현되는 케모카인 수용체를 발현시킨다. 한번에 임의의 수의 세포 유형을 스크리닝할 수 있다. 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 50 또는 100 이상 또는 그 이상의 상이한 세포 유형을 한번에 스크리닝할 수 있다.
일부 구체예들에서, 상이한 세포 유형 상의 케모카인 수용체의 리간드 결합 특성을 비교한다. 이러한 구체예들에서, 리간드는 케모카인 수용체의 1 이상의 토폴로지에 결합하는 임의의 분자일 수 있다. 리간드의 예에는 자연-발생적 케모카인 및 다른 소분자들이 포함된다. 케모카인의 예에는 예를 들어, XCL1, XCL2, CX3CL1, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9,CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6,CCL7, CCL8, CCL9, CCL10, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18,CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, and CCL28이 포함된다. 예를 들어, Zlotnick 등, Imsnufzity 12: 121 (2000)을 참조하시오.
상이한 세포 유형 상에서 스크리닝되는 리간드의 수는 크게 변할 수 있다. 일반적으로, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100 이상의 리간드 결합을 비교한다.
일련의 잠재적 리간드의 결합 특성을 스크리닝하는 한 종래의 방법은 대상이 되는 케모카인 수용체의 알려진 리간드의 결합을 경쟁하는 잠재적 리간드의 능력을 측정하는 단계를 포함한다. 예를 들어, Gosling 등, J. Immunol. 164: 2851-2856 (2000); Dairaghi 등, J. Biol. CZ1em. 274 (31): 21569-21574 (1999)를 참조하시오. 경쟁 분석은 업계에 널리 공지되어 있다. 일반적으로, 알려진 리간드는 (예를 들어, 잠재 경쟁력이 증가된 리간드의 존재하에) 결합차를 측정할 수 있도록 표지된다. 경쟁 분석은 잠재적 경쟁자 리간드의 친화도를 지시한다. 상이한 세포 유형 상에서 발현되는 동일한 수용체에 대한 특정 리간드의 통계적으로 유의적인 친화도 차는 상이한 토폴로지가 상이한 세포 유형 상에 존재함을 지시한다.
본 방법의 일부 구체예들에서, 잠재적 리간드는 고체 지지체에 구속되어 있다. 예를 들어, Gosling 등의 supra를 참조하시오.
III. 단백질 토폴로지에 기초한 특이적 치료약의 개발
케모카인 수용체의 조절제, 즉 효능제 또는 길항제 또는 케모카인 수용체 활성의 제제는 다수의 포유류 질환을 치료하는데 유용하다.
케모카인 수용체의 길항제 또는 기타의 케모카인 수용체 작용의 억제제로 치료할 수 있는 인간 또는 다른 종의 질환 또는 이상에는 알레르기성 호흡기 질환, 이를테면 천식, 알레르기성 비염, 과민성 폐 질환, 과민성 폐렴, 호산성 폐렴(예를 들어, 뢰플러 증후군, 만성 호산성 폐렴), 지연형 과민증, 간질성 폐 질환(ILD)(예를 들어, 특발성 폐 섬유증 또는 류머티스성 관절염과 관련된 ILD, 전신성 루프스 홍반, 교착성 척수염, 전신성 경화증, 쇠그렌 증후근, 다발성근염 또는 피부근염; 전신선 아나필락시 또는 과민 반응, 약물 알레르기(예를 들어, 페니실린, 세팔로스포린에 대하여), 벌레 물림 알레르기; 자가면역 질환, 이를테면 류머티스성 관절염, 건선 관절염, 다발성 경화증, 전신성 루푸스 홍반, 중증근무력증, 청소년기 발병 당뇨병; 사구체신병증, 자가면역 갑상선염, 비세트병; 동종이식 거부 또는 이식편-대-숙주병을 비롯한 이식 거부 반응(예를 들어, 이식에서); 염증성 장 질환, 이를테면 크론병 및 궤양성 대장염; 척추관절증; 경피증; 건선(T-세포 매개 건선) 및 피부염, 습진, 아토피성 피부염, 알레르기성 접촉성 피부염, 두드러기와 같은 염증성 피부병; 혈관염(예를 들어, 괴사성 혈관염, 표피성 혈관염 및 과민성 혈관염); 호산성 근염, 호산성 근막염; 유방암(예를 들어, 유방 선암 및 유선 암종), 신경세포교아종, 신경교종, 림프종(예를 들어, 버키트 림프종), 블랙종, 폐암, 갑상선 암종, 결장암, 간암, 난소암, 자궁경부암, 췌장암, 직장 세포 암종, 판상 세포 암종, 외종양 및 피부암을 비롯한 암이 포함되는 급성 또는 만성 염증성 질환 또는 알레르기성 질환 및 이상이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 바람직하지 않은 염증성반응을 억제시켜야 하는 다른 질환 또는 이상에는 재관류장해, 죽상동맥경화증, 혹종의 혈액 악성 종양, 시토킨-유도독(예를 들어, 패혈증 쇼크, 내독소 쇼크), 다발성근염, 피부근염, 동맥경화증, 자가면역 뇌척수염, 허혈성 환류 이상, 졸증, 뇌 또는 척추 손상 및 화상이 포함되나 이에 한정되지 않는다.
케모카인 수용체의 효능제 또는 다른 케모카인 수용체 작용의 촉진제로 치료할 수 있는 인간 또는 다른 종의 질환 또는 이상에는 면역결핍증후군 환자, 방사선 요법 화학 요법, 자가면역 질환에 대한 요법 또는 기타 약물 요법을 받은 사람에서 관찰되는 면역 억제; 수용체 작용의 선천적 결핍 또는 기타 요인으로 인한 면역 억제; 및 연충 감염, 이를테면 선충(회충); [트리쿠리아시스(Trichuriasis), 엔테로비아시스(Enterobiasis), 아스카리아시스(Ascariasis), 십이지장충, 스트로이이길로이디아시스(Stroiigyloidiasis), 트리키노시스(Trichinosis), 필라리아시스(filariasis)]; 흡충류(흡충)[시스토소미아시스(Schistosomiasis), 클로노르키아시스(Clonorchiasis)], 조충 (촌충) [에키노코코시스(Echinococcosis), 타이니아시사기라타(Taeniasissagiraata), 시스티에소코시스(Cysticercosis)]; 내장충, 내장 유충 이행증[예를 들어, 톡소카라(Toxocara)], 호산성 위장염 [(예를 들어, 아니사키 에스피피(Anisaki spp.), 포카네마 에스피피(Phocanema ssp.)] 및 표피 유층 이행증 [(안실로스토나브라질네제(Ancylostonabraziliense), 안시클로스토마 카니눔(Ancylostoma caninum)]을 비롯한(이에 한정되지 않음) 기생층 질환과 같은 감염성 질환이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 케모카인 수용체의 효능제 또는 다른 케모카인 수용체 작용 촉진제는 또한 백일해(Bordetella pertussis); 콜레라(Vibrio cholerae); 수막염(Neisseria meningitidis); 라임병(Borrelia burgdorferi); 헤모필루스 B(헤모필루스 인플루엔자 B); 폐렴(Streptococcus pneumoniae); 장티푸스(Salmonella typhi), 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae) 및 파상풍(Clostridium tetani)와 같은 세균성 감염을 치료하는데 유용하다. 케모카인 수용체 또는 다른 케모카인 수용체 작용 촉진제는 또한 인플루엔자 바이러스; 헤파티티스 A; 헤파티티스 B; 헤파티티스 C; 홍역; 풍진 바이러스; 유행성이하선염; 폴리오바이러스; 일본 뇌염 바이러스; 로타바이러스; 수두와 같은 바이러스성 감염을 치료하는데 유용하다.
케모카인 수용체의 토폴로지 조절제는 다양한 염증 및 면역 조절 이상 및 질환의 예방 및 치료에 유용하다.
몇몇 상이한 바이러스들은 케모카인 수용체에 결합됨으로써 세포 감염을 개시시키는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, HIV와 같은 레트로바이러스[예를 들어, Locati 등. Annu. Rev. Med. 50:425(1999); Hurok Immunol. Today 20:89(1999); Berson 등, Semin. Immunol. 10:237(1998); 및 Littman 등, Cell 93:677(1998)을 참조하시오] 및 마익소마 바이러스와 같은 폭스 바이러스[예를 들어, Lalani 등 Science 286:1968-1971(1999)를 참조하시오] 둘다 케모카인 수용체를 통하여 세포에 결합된다. 본 발명은 이러한 바이러스 및 다른 바이러스들이 이들의 케모카인 수용체의 특정 토폴로지에 결합하는 것을 방해하는 제제의 판별 방법을 제공한다. 이들 제제는 바이러스성 질환을 예방 및 치료하는 치료 조성물로서 유용하다. 예를 들어, HIV 균주 R5는 케모카인 수용체 CCR에 결합하는 반면 HIV 균주 X4는 CXCR4에결합한다. 폭스 바이러스 마익소마는 수용체 CCR1, CCR5 및 CXCR4에 결합한다. 이들 바이러스가 결합하는 케모카인 수용체의 특정 토폴로지에 결합하는 제제로 환자를 치료하여 이들 바이러스가 세포를 감염시키는 것을 방지함으로써 감염이 예방된다. 본 발명 방법으로 치료될 수 있는 바이러스의 다른 예에는 마우스 유방 종양 바이러스와 같은 포유류 B형 레트로바이러스; 쥐과 백혈병 바이러스와 같은 포유류 C형 레트로바이러스; 메이슨-파이처 원숭이 바이러스와 같은 D형 레트로바이러스; 소의 백혈병 바이러스와 같은 BLV-HTLV 레트로바이러스; 인간 면역 결핍 바이러스 1과 같은 렌티바이러스; 인간 스푸마바이러스와 같은 스푸마바이러스를 비롯한 레트로비리다이 및 파울폭스 바이러스와 같은 아비폭스바이러스; 십폭스 바이러스와 같은 카프리폭스바이러스; 마익소마 바이러스와 같은 레포리폭스바이러스; 스와인폭스 바이러스와 같은 수이폭스바이러스; 물루스쿰 콘타기오숨 바이러스와 같은 몰루스키폭스바이러스 및 야바 원숭이 종양 바이러스와 같은 야타폭스바이러스가 포함되나 이에 한정되지 않는다.
A. 케모카인 수용체의 토폴로지의 조절제를 판별하는 방법
세포, 특히 포유동물 세포, 특히 인간 세포내 케모카인 수용체의 특정 토폴로지의 작용 또는 활성 수준을 조절하는 제제를 판별하는데 다수의 상이한 스크리닝 프로토콜을 사용할 수 있다. 일반적으로, 스크리닝 방법은 예를 들어, 케모카인 수용체에 결합하거나, 억제제가 케모카인 수용체에 결합하는 것을 방해하거나 케모카인 수용체를 활성화시킴으로써 케모카인의 특이적 토폴로지와 상호작용하는 제제를 판별하기 위한 여러 제제를 스크리닝하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서,길항제 또는 효능제는 케모카인 수용체의 오직 하나의 토폴로지의 활성을 조절하며 제2 토폴로지의 활성은 조절하지 않는다. 일부 구체예들에서, 케모카인 수용체 토폴로지는 모두 길항제 또는 효능제에 의하여 조절된다. 일부 구체예들에서, 한 제제는 제2 토폴로지에 대한 제제의 약 1.5, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 300, 500 또는 1000배 이상의 친화도를 갖는 하나의 토폴로지에 결합한다. 일부 구체예에서, 제제는 제2 토폴로지에 대한 제제의 약 0.5, 0.3, 0.2, 0.1, 0.05, 0.01, 0.001배 미만의 친화도를 갖는 하나의 토폴로지에 결합한다.
1.케모카인 수용체 결합 분석
1차 스크리닝은 케모카인 수용체의 토폴로지에 결합할 수 있는 제제를 스크리닝함으로써 수행할 수 있다. 결합 분석은 통상적으로 케모카인 수용체 단백질의 토폴로지를 1 이상의 테스트 제제와 접촉시키는 단계 및 충분한 시간을 두어 단백질 및 테스트 제제가 결합 착체를 형성할 수 있게 하는 단계를 포함한다. 형성되는 임의의 결합 착체는 다수의 임의의 확립된 분석 기법을 사용하여 검출할 수 있다. 단백질 결합 분석에는 면역조직화학 결합 분석, 흘림세포계측법 또는 케모카인 수용체의 토폴로지를 유지하는 기타 분석법이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 이러한 분석에 사용되는 케모카인 수용체는 자연적으로 발현, 클로닝 또는 합성될 수 있다.
결합 분석은 또한 예를 들어, 케모카인 수용체의 특정 토폴로지와 상호작용하는 내인성 단백질을 판별하는데 유용하다. 예를 들어, 토폴로지에 결합하는 항체, 수용체 또는 기타 분자들은 결합 분석에서 확인할 수 있다.
2.세포 및 시약
본 발명의 스크리닝 방법은 시험관내에서의 분석 또는 세포-기준 분석과 같이 수행할 수 있다. 시험관내 분석은 케모카인 수용체가 용액내에 상이한 토폴로지를 형성할 수 있을 경우 수행한다. 세포-기준 분석은 케모카인 수용체가 발현되는 임의의 세포에서 수행할 수 있다.
세포-기준 분석은 제제에 의한 케모카인 수용체 토폴로지의 활성 조절 또는 제제 결합을 위해 스크리닝할 케모카인 수용체를 함유하는 전체 세포 또는 세포 분획을 포함한다. 본 발명에 사용할 수 있는 예시적 세포 유형에는 예를 들어, 백혈구, 이를테면 호중구, 단핵구, 마크로파지, 호산구, 호염기구, 유방 세포 및 림프구, 이를테면 T 세포 및 B 세포, 혈액종, 버키트 림프종, 종양 세포, 내피 세포, 섬유아세포, 심장 세포, 근육 세포, 유방 종양 세포, 자궁암 암종, 자궁 경부 남종, 신경교아세포종, 간 세포, 신장 세포 및 신경 세포를 비롯한 임의의 포유동물 세포와 효모를 비롯한 세균 세포가 포함될 수 있다. 세포는 1차 세포 또는 종양 세포 또는 무한증식성 세포주의 기타 유형일 수 있다. 물론, 케모카인 수용체는 특정 내인성 케모카인 수용체를 함유하지 않는 세포내에서 발현될 수 있다. 일부 구체예들에서, 한 케모카인 수용체 토폴로지는 한 유형의 세포(예를 들어, 유방 종양 세포, 자궁 암종, 자궁 경부 암종, 버키트 림프종, 신경교아세포종 또는 바이러스에 의한 감염을 지원할 수 있는 세포) 상에서 발현되는 반면, 제2 토폴로지는 제2 세포 유형(예를 들어, 비종양 세포 또는 바이러스에 의한 감염을 지원할 수 없는 세포) 상에서 발현된다. 케모카인 수용체는 반드시 두 토폴로지만을 갖는 것은 아니다. 따라서, 한 제제는 임의의 하나의 토폴로지를 조절하거나 이것과 선택적으로 상호작용하는데, 1 이상의 다른 토폴로지를 조절하거나 이에 결합되지 않는 능력에 대해 스크리닝될 수 있다. 마찬가지로, 케모카인 수용체가 2 이상의 토폴로지를 형성할 경우, 제제는 하위 그룹의 토폴로지(예를 들어, 3중 2의 토폴로지)을 조절하거나 결합시키도록 선택될 수 있으나 케모카인 수용체의 토폴로지 모두를 조절시키거나 결합시키지는 않는다.
임의의 케모카인 수용체를 본 발명 방법에 사용할 수 있다. 예시적 케모카인 수용체에는 예를 들어, CC-케모카인 수용체 CCR1-10; CXC-케모카인 수용체, CXCR1-6; CX3CR1; CXR1; CCXCKR(CCR11); (CCR12), 바이러스로 암호화된 케모카인 수용체, US28, ECRF3, Kaposi의 사코마-관련 헤르페스바이러스 GPCR, 폭스바이러스 막-결합 G 단백질-커플링된 수용체; D6 및 DARC가 포함된다.
상기 논의한 바와 같이, 제제는 케모카인 수용체의 토폴로지 모두에 결합하거나 또는 이를 조절하지는 않으나 하위 그룹의 토폴로지에 결합하거나 또는 이를 조절하도록 선택할 수 있다. 예를 들어, 제제는 케모카인 수용체의 제1 토폴로지에 결합하거나 또는 이를 조절하나 제2 세포의 제2 토폴로지에 결합하거나 또는 이를 조절하지 않는 능력에 대해 스크리닝될 수 있다. 일부 구체예들에서, 제1 세포는 종양 세포이나 제2 세포는 비종양 세포 또는 상이한 유형의 종양 세포이다. 예시적 종양 세포에는 예를 들어, 유방암 세포, 난소암 세포, 자궁 경관 암종, 신경교아세포종, 결장암 세포, 췌장암 세포, 골암 세포, 폐암 세포, 고환암 세포, 버키트 림프종 세포 및 백혈병 세포가 포함된다. 유방암 세포에는 예를 들어, MDA MB-231,MCF-7, ZR 75-1 및 DU-4475가 포함된다. 케모카인 수용체(예를 들어, CXCR4)는 증폭성 또는 항증폭성 세포내 시그널링을 조절함으로써 종양 세포의 성장율을 조절할 수 있다. 일부 구체예들에서, 특이적 토폴로지 (또는 하위 그룹 토폴로지)는 암 세포 증식을 자극할 수 있다. 따라서, 케모카인 수용체의 토폴로지(들)을 선택적으로 조절하는 제제는 선택적 항암 치료제로서 유용하다.
하나의 토폴로지(제2 토폴로지는 아님)의 조절제를 스크리닝하는데 사용할 수 있는 기타의 예시적 세포에는 예를 들어, 단핵구, 호중구, 미성숙 수상돌기 세포 및 기타 면역학적 세포(예를 들어, T 세포 및 B 세포)가 포함된다. 이와는 다르게, 상기 나열한 세포 중 둘을 사용하고, 한 세포 유형(제2 세포 유형은 아님)에서 수용체에 결합하는 분자가 선택된다.
3.시그널링 활성
케모카인 수용체의 토폴로지의 시그널링 활성은 다수의 방식으로 측정할 수 있다. 예를 들어, 시그널링은 조절제가 세포 상에서 칼슘 유동화를 유도할 수 있는가를 양적 및 질적으로 측정함으로써 측정할 수 있다. 칼슘 유동화 분석은 예를 들어, Dairaghi 등, J. Biol. Chem. 272 (45): 28206-9 (1997)에 개시되어 있다. 인산화 또는 탈인산화 뿐만 아니라 환형 AMP 또는 이노시톨 포스페이트와 같은 다른 2차 메신저도 또한 모니터링할 수 있다. 예를 들어, Premack 등의 Nature Medicifle 2: 1174-1178 (1996) 및 Bokoch, Blood 86: 1649- 1660 (1995)를 참조하시오.
또한, 신호전달 활성을 측정하기 위해 하류의 분자 수준의 사건 역시 모니터링할 수 있다. 하류 사건은 케모카인 수용체의 자극으로 인해 발생하는 활성 또는 발현을 포함한다. 대표적인 하류 사건은, 예를 들어 세포 또는 조직 반응, 예컨대 임파계조직(예, CXCR5), 심장(예, CXCR4) 또는 기타 조직의 발달, 세포의 변화된 상태(예, 정상 세포에서 암세포 또는 1차 암세포로, 또 전이성 암세포로의 변화)뿐 아니라 박테리아, 원생동물 또는 기타 기생충과 같은 비-바이러스성 병원균에 의한 감염을 포함한다. 본원에서 사용되는 조직 반응은 또한 조직내 염증의 발달을 포함한다. 세포 반응은 유인제(예, 케모카인)에 대한 세포(예, 백혈구)의 주화성 이동 및 유인제(예, 케모카인)에 대한 세포 침윤(예, 침윤성을 가진 종양 세포)을 포함한다. 케모카인 수용체는 또한 혈소판 활성화 및 응집(참고 문헌 예: Abi-Younes S. 등, Circ Res., 86:131-138(1999); Kowalska, M.A. 등, Blood 96:50-57(2000); 및 Clementson, K.J. 등, Blood, 96:4046-4054(2000))뿐 아니라, 아폽토시스의 유도(참고 문헌 예: Berndt C. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:12556-12561(1998))에도 관여하는 것으로 확인되었다.
4.유효성 확인
전술한 스크리닝 방법 중 임의의 방법에 의해 최초로 확인된 제제가 명백한 활성을 보유하는지를 확인하기 위해 추가로 테스트할 수 있다. 바람직하게는 이러한 연구는 적당한 동물 모델을 사용하여 수행한다. 이러한 방법의 기본 형식은 인간에 대한 모델 역할을 하는 동물에게 최초 스크리닝 중에 동정된 선도 화합물을 투여하는 단계 및 그 후 케모카인 수용체가 실제로 조절되는지 및/또는 질환 또는 상태가 개선되는지를 판단하는 단계를 포함한다. 유효성 확인 연구에 사용되는 동물 모델은 일반적으로 임의 종류의 포유동물이다. 적합한 동물의 구체적인 예로는 영장류, 마우스 및 래트가 있으나 이에 국한되는 것은 아니다.
B. 케모카인 수용체와 특이적으로 상호작용하는 제제
케모카인 수용체의 하나 이상의 토폴로지의 조절인자로서 테스트되는 제제는 임의의 작은 화학적 화합물, 또는 생물학적 실체, 예컨대 폴리펩티드, 당, 핵산 또는 지질일 수 있다. 또는, 조절인자는 케모카인 또는 기타 리간드의 유전적 변경 형태일 수 있다. 일반적으로 테스트 화합물은 작은 화합물 분자 및 펩티드이다. 사실상 어떠한 화학적 화합물도 본 발명의 분석에서 잠재적 조절인자 또는 리간드로서 사용될 수 있지만, 가장 흔히 사용되는 화합물은 수성 유기(특히 DMSO 주성분) 용액 중에 용해될 수 있는 화합물이다. 이 분석은 분석 단계를 자동화하고, 임의의 편리한 공급원 유래의 화합물을 분석에 제공함으로써 대형 화합물 라이브러리를 스크리닝하도록 고안된 것으로, 이 분석들은 일반적으로 동시에 수행된다(예를 들어 로봇식 분석에서의 미량적정 플레이트 상의 미량적정 형식으로). 시그마(미주리주 세인트 루이스 소재), 알드리치(미주리주 세인트 루이스 소재), 시그마-알드리치(미주리주 세인트 루이스 소재), 플루카 케미카-바이오케미카 어낼러티카(스위스 부흐스 소재) 등을 비롯하여 화학적 화합물의 다수의 공급업체가 있음을 알 것이다.
몇몇 구체예에서는 이 제제는 분자량이 1,500 달톤 미만이고, 어떤 경우에는 1,000, 800, 600, 500 또는 400 달톤 미만이다. 크기가 비교적 작은 제제가 바람직할 수 있는데, 그 이유는 더 작은 분자일수록 분자량이 더 큰 제제보다 구강 흡수성을 비롯하여 우수한 약력학적 특성과 양립되는 물리화학적 특성을 보유할 가능성이 더 크기 때문이다. 예를 들어, 투과성 및 가용성을 기초로 했을 때 약물로서의 성공 확률이 더 적은 제제는 Lipinski 등에 의하면 다음과 같다: 5개 이상의 H-결합 공여체(OH와 NH의 합으로 나타냄)를 보유하는 제제; 분자량이 500 이상인 제제; LogP가 5 이상인 제제(또는 MLogP가 4.15 이상인 제제); 및/또는 10개 이상의 H-결합 수용체(N과 O의 합으로 나타냄)를 보유하는 제제. 예를 들어 문헌 [Lipinski 등, Adv Drug Delivery Res 23:3-25(1997)]을 참고할 수 있다. 생물학적 수송자에 대한 기질인 화합물 부류는 일반적으로 상기 규정에서 제외된다.
CCX7923(도 5 참고)은 시판되며, 당업계에 공지된 방법에 의해 N-[3-(디메틸아미노)프로필]-N,N-디메틸-1,3-프로판디아민과 브로모메틸-비시클로(2,2,1)헵트-2-엔의 축합반응에 의해 제조할 수 있다. CCX0803(도 5 참고)은 시판되며, 당업계에 공지된 방법에 의해 3-(2-브로모에틸)-5-페닐메톡시-인돌과 2,4,6-트리페닐피리딘의 축합반응에 의해 제조할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Organic Function Group Preparations, 2nd Ed. Vol. 1,(S.R. Sandler & W. Karo 1983); Handbook of Heterocyclic Chemistry(A.R. Katritzky, 1985); Encyclopedia of Chemical Technology, 4th Ed.(J.I. Kroschwitz, 1996)]을 참고할 수 있다.
한 가지 바람직한 구체예에서 고효율 스크리닝 방법은 다수의 잠재적 치료 화합물(잠재적 조절인자 또는 리간드 화합물)을 포함하는 화합물 또는 펩티드의 조합 라이브러리를 제공하는 단계를 포함한다. 그 후 이러한 "조합 화합물 라이브러리" 또는 "리간드 라이브러리"를 본원에서 기재하는 바와 같은 하나 이상의 분석에서 스크리닝하여, 원하는 특징적 활성을 나타내는 라이브러리 구성원(특정 화합물종 또는 그 하위 부류)을 동정한다. 그렇게 동정된 화합물들은 통상적인 "선도 화합물"로서 작용할 수 있거나 또는 그 자체가 잠재적 또는 실제적 치료제로서 사용될 수 있다.
조합 화합물 라이브러리는 반응물과 같은 다수의 화학적 "빌딩 블록"을 조합함으로써 화학적 합성 또는 생물학적 합성에 의해 생성된 다양한 화학적 화합물의 집합체이다. 예를 들어, 폴리펩티드 라이브러리와 같은 선형 조합 화합물 라이브러리는 특정 화합물 길이(즉, 폴리펩티드 화합물에서의 아미노산의 수)에 대하여 모든 가능한 방식으로 화합물 빌딩 블록(아미노산) 세트를 조합하여 형성한다. 수 백만의 화학적 화합물이 그러한 화학적 빌딩 블록의 조합 혼합을 통해 합성될 수 있다.
조합 화합물 라이브러리의 제조 및 스크리닝은 당업자에게 주지된 기술이다. 이러한 조합 화합물 라이브러리는 펩티드 라이브러리(참고 문헌 예: 미국 특허 제5,010,175호, Furka, Int. J. Pept. Prot. Res. 37:487-493(1991) 및 Houghton 등, Nature 354:84-88(1991))를 포함하나 이에 국한되는 것은 아니다. 화학적 다양성 라이브러리를 생성하기 위한 다른 화학작용을 이용할 수도 있다. 이러한 화학작용은 펩토이드(예, PCT 공보 WO 91/19735), 암호화된 펩티드(예, PCT 공보 WO 93/20242), 랜덤 바이오-올리고머(예, PCT 공보 WO 92/00091), 벤조디아제핀(예, 미국 특허 제5,288,514호), 다이버소머(diversomer), 예컨대 히단토인, 벤조디아제핀 및 디펩티드(Hobbs 등, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90:6909-6913(1993)), 비닐 위치 폴리펩티드(Hagihara 등, J. Amer. Chem. Soc. 114:6568(1992)), 글루코스 골격을 가진 비펩티드성 펩티드 모의체(Hirschmann 등, J. Amer. Chem. Soc. 114:9217-9218(1992)), 작은 화합물 라이브러리의 유사한 유기 합성물질(Chen 등, J. Amer. Chem. Soc. 116:2661(1994)), 올리고카바메이트(Cho 등, Science 261:1303(1993)), 및/또는 펩티딜 포스포네이트(Campbell 등, J. Org Chem. 59:658(1994)), 핵산 라이브러리(참고 문헌 예: Ausubel, Berger 및 Sambrook의 상기 문헌), 펩티드 핵산 라이브러리(참고 문헌 예: 미국 특허 제5,539,083호), 항체 라이브러리(참고 문헌 예: Vaughn 등, Nature Biotechnology, 14(3):309-314(1996) 및 PCT/US96/10287), 탄화수소 라이브러리(참고 문헌 예: Liang 등, Science, 274:1520-1522(1996) 및 미국 특허 제5,593,853호), 유기 소분자 라이브러리(참고 문헌 예: 벤조디아제핀, Baum C & EN, Jan 18, page 33(1993); 이소프레노이드, 미국 특허 제5,569,588호; 티아졸리디논 및 메타티아자논, 미국 특허 제5,549,974호; 피롤리딘, 미국 특허 제5,525,735호 및 제5,519,134호; 모르폴리노 화합물, 미국 특허 제5,506,337호; 벤조디아제핀, 제5,288,514호 등)을 포함하며, 이에 국한되는 것은 아니다.
조합 라이브러리의 제조를 위한 장치는 시판된다(참고 예: 켄터기주 루이스빌 소재의 어드밴스드 켐 텍, 357 MPS, 390 MPS, 매릴랜드주 워번 소재의 레이닌, 심포니, 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 어플라이드 바이오시스템즈, 433A, 매릴랜드주 베드포드 소재의 밀리포어, 9050 플러스). 또한, 다수의 조합 라이브러리 자체도 시판된다(참고 예: 뉴저지주 프린스턴 소재의 컴제넥스, 미주리주 세인트 루이스 소재의 트리포스 인코포레이티드, 펜실베이니아주 엑스턴 소재의 3D 파마슈티컬스, 매릴랜드주 컬럼비아 소재의 마텍 바이오사이언시즈 등).
C. 고체상 및 가용성 고효율 분석
본 발명의 고효율 분석에서는 하루에 수 천개에 이르는 상이한 조절인자 또는 리간드를 스크리닝할 수 있다. 구체적으로, 미량적정 플레이트의 각 웰을 선택된 잠재적 조절인자에 대하여 독립적인 분석을 수행하도록 이용할 수 있거나, 또는 농도 또는 항온처리 시간 효과를 관찰할 의도라면, 5∼10개 웰마다 단일 조절인자를 테스트할 수 있다. 따라서, 단일 표준 미량적정 플레이트는 약 100개(예, 96개)의 조절인자를 분석할 수 있다. 1536 웰 플레이트를 사용한다면 단일 플레이트는 약 100∼약 1,500개의 상이한 화합물을 분석할 수 있다. 하루에 여러 개의 상이한 플레이트를 분석하는 것이 가능하며, 본 발명의 통합 시스템을 이용하면 약 6,000∼20,000개에 이르는 상이한 화합물들에 대한 분석 스크리닝을 수행하는 것이 가능하다. 보다 최근에는 반응물 조작을 위한 미세유체법이 개발되었다.
원하는 분자를 공유 결합 또는 비공유 결합(예, 태그를 사용하여)에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 고체상 성분에 결합시킬 수 있다. 태그는 각종 화합물 중 임의 화합물일 수 있다. 일반적으로, 태그에 결합하는 분자(태그 결합제)를 고체 지지체에 고정시키며, 태그가 부착된 소정의 분자(예, 케모카인 수용체)는 태그 또는 태그 결합제의 상호작용에 의해 고체 지지체에 부착된다.
문헌에 충분히 기재된 공지된 분자적 상호작용에 기초하여 다수의 태그 또는 태그 결합제를 사용할 수 있다. 예를 들어, 태그가 천연 결합제, 예를 들어 비오틴, 단백질 A, 또는 단백질 G를 갖는 경우, 이는 적절한 태그 결합제(아비딘, 스트렙타비딘, 뉴트라비딘, 면역글로불린의 Fc 영역 등)와 함께 사용할 수 있다. 비오틴과 같은 천연 결합제를 갖는 분자에 대한 항체 역시 광범위하게 이용되고 있으며, 적절한 태그 결합제이다(참고: SIGMA Immunochemicals 1998 catalogue SIGMA, St. Louis MO).
마찬가지로, 임의의 합텐성 또는 항원성 화합물을 적절한 항체와 함께 사용하여 태그/태그 결합제 쌍을 형성할 수 있다. 수 천개의 특이적 항체가 시판되고 있으며, 그 밖의 다수의 항체는 문헌에 개시되어 있다. 예를 들어, 일반적인 한 가지 구성에서, 태그는 1차 항체이며, 태그 결합제는 1차 항체를 인식하는 2차 항체이다. 항체-항원 상호작용 외에도, 수용체-리간드 상호작용 역시 태그 및 태그 결합제 쌍으로서 적절하며, 예컨대 세포막 수용체의 효능제 및 길항제가 있다(예를 들어, 세포 수용체-리간드 상호작용, 예컨대 트랜스페린, c-kit, 바이러스 수용체 리간드, 사이토카인 수용체, 케모카인 수용체, 인터루킨 수용체, 면역글로불린 수용체 및 항체, 캐드헤린 패밀리, 인테그린 패밀리, 셀렉틴 패밀리 등; 참고 예: Pigott & Power, The Adhesion Molecule Facts Book I(1993)). 마찬가지로, 독소 및 독액, 바이러스성 에피토프, 호르몬(예, 아편제, 스테로이드 등), 세포내 수용체(예, 스테로이드, 갑상선 호르몬, 레티노이드 및 비타민 D를 비롯하여 다양한 작은 리간드의 효과를 매개하는 것; 펩티드), 약물, 렉틴, 당, 핵산(선형 또는 환형 중합체 구조 둘 다), 올리고당, 단백질, 인지질 및 항체는 모두 각종 세포 수용체와 상호작용할 수 있다.
합성 중합체, 예컨대 폴리우레탄, 폴리에스테르, 폴리카보네이트, 폴리우레아, 폴리아미드, 폴리에틸렌이민, 폴리아릴렌 설파이드, 폴리실록산, 폴리이미드 및 폴리아세테이트 역시 적절한 태그 또는 태그 결합제를 형성할 수 있다. 다수의 기타 태그/태그 결합제 쌍 역시 본원에 기술하는 분석 시스템에 사용할 수 있으며, 이는 본 명세서의 개시 내용에 비추어 당업자에게는 명백한 사항이다.
펩티드, 폴리에테르 등과 같은 일반적으로 사용되는 링커 역시 태그로 사용될 수 있으며, 그 예로는 아미노산 길이가 약 5∼200개 사이인 폴리 gly 서열과 같은 폴리펩티드 서열을 들 수 있다. 그러한 가요성 링커는 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 폴리(에틸렌 글리콜) 링커는 알라바마주 헌츠빌 소재의 쉬어워터 폴리머스 인코포레이티드에서 시판한다. 이러한 링커는 선택적으로 아미드 결합, 설프히드릴 결합 또는 헤테로작용성 결합을 가질 수 있다.
태그 결합제는 현재 이용되고 있는 다양한 임의 방법을 이용하여 고체 기재에 고정시킨다. 고체 기재는 통상적으로, 태그 결합제의 일부분과 반응하는 표면에 화학적 기를 고정시키는 화학 반응물에 기재의 전부 또는 일부분을 노출시킴으로써 유도체화 또는 작용기화한다. 예를 들어, 더 긴 사슬 부분에 부착시키기에 적합한기는 아민, 히드록실, 티올 및 카르복실 기를 포함한다. 아미노알킬실란 및 히드록시알킬실란을 유리 표면과 같은 다양한 표면을 작용기화하는 데 이용할 수 있다. 이러한 고체상 생물중합체 어레이의 구축에 대해서는 문헌에 충분히 기재되어 있다(참고 문헌 예: Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154(1963)(예를 들어 펩티드의 고체상 합성에 대해 기재함); Geysen 등, J. Immun. Meth. 102:259-274(1987))(핀 상에서의 고체상 성분의 합성에 대해 기재함); Frank 및 Doring,Tetrahedron 44:6031-6040(1988)(셀룰로스 디스크 상에서의 다양한 펩티드 서열의 합성에 대해 기재함); Fodor 등, Science, 251:767-777(1991); Sheldon 등, Clinical Chemistry 39(4):718-719(1993); 및 Kozal 등, Nature Medicine 2(7):753-759(1996)(전부 고체상 기재에 고정된 생물중합체 어레이에 대하여 기재함). 기재에 태그 결합제를 고정시키기 위한 비화학적 방법은 열, 자외선에 의한 가교 등을 비롯한 그 밖의 통상적인 방법을 포함한다.
본 발명은 케모카인 수용체의 특정 토폴로지의 기능 또는 활성을 조절할 수 있는 화합물을 고효율 형식으로 동정하기 위한 시험관내 분석을 제공한다. 잠재적 조절인자를 포함하지 않는 반응에서 세포의 케모카인 수용체 활성을 측정하는 대조구 반응을 선택적으로 이용할 수 있는데, 왜냐하면 분석이 매우 균일해지기 때문이다. 이러한 선택적 대조군 반응은 적절하며, 분석의 신뢰성을 높인다. 따라서 바람직한 구체예에서 본 발명은 그러한 대조구 반응을 포함한다. 전술한 분석 형식 각각에 있어서 조절인자를 포함하지 않는 "조절인자 없음" 대조구 반응은 결합 활성의 바탕값을 제공하는 것이다.
일부 분석법에서, 분석법의 성분들이 적당하게 작동하도록 양성 콘트롤을 갖는 것이 요망될 것이다. 2 이상의 유형의 양성 콘트롤이 적당하다. 첫째, 케모카인 수용체의 관심 대상의 토폴로지의 공지된 활성화제 또는 리간드는 분석법의 한 샘플과 함께 항온 처리될 수 있고, 케모카인 수용체의 증가된 활성으로부터 생성된 시그널의 초래된 증가는 본 발명의 방법에 따라 결정될 수 있다. 둘째, 케모카인 수용체의 활성에 대한 시그널의 초래된 감소는 유사하게 검출될 수 있다. 또한, 조절제는 케모카인 수용체의 공지된 조절인자의 존재 하에 유발되는 증가 또는 감소를 억제하는 조절인자를 찾기 위해 활성화제 또는 억제제와 조합될 수 있다.
D. 컴퓨터에 기초한 분석법
케모카인 수용체의 활성 또는 기능을 조절하는 화합물에 대한 또 다른 분석법은 컴퓨터 관련 약물 설계를 수반하는데, 사용되어 아미노산 서열에 의해 암호화된 구조적 정보에 기초한 케모카인 수용체의 삼차원 구조를 생성하는 데 컴퓨터 시스템이 사용된다. 입력 아미노산 서열은 컴퓨터 프로그램 내 사전 설정된 알고리듬과 직접, 그리고 활성적으로 상호 작용하여 단백질의 2차, 3차 및 4차 구조 모델을 제공한다. 케모카인 수용체의 오직 한 가지 토폴로지인 결합 파트너 또는 리간드를 비롯하여 케모카인 수용체의 가능한, 또는 공지된 결합 파트너 또는 리간드에 대하여 유사한 분석을 수행할 수 있다. 그 다음, 단백질 구조의 모델을 조사하여, 예컨대 케모카인 수용체를 결합할 수 있는 능력을 가진 구조의 영역을 동정한다. 그 다음, 이러한 영역을 사용하여 케모카인 수용체에 결합된 폴리펩티드를 동정한다.
단백질의 삼차원 구조 모델은 잠재적인 케모카인 수용체 리간드를 암호화하는 10 이상의 아미노산 잔기의 단백질 아미노산 서열 또는 해당 핵산 서열을 컴퓨터 시스템에 입력함으로써 발생된다. 여기서 제공되는 핵산 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열은 단백질의 구조 정보를 암호화하는, 단백질의 1차 서열 또는 부서열을 나타낸다. 아미노산 서열(또는 10 아미노산을 암호화하는 뉴클레오티드 서열)의 10 이상의 잔기는 컴퓨터 시스템으로 컴퓨터 키보드로부터, 한정하는 것은 아니지만 전자 저장 매체(예컨대, 자기 디스켓, 테이프, 카트리지 및 칩), 광학 매체(예컨대, CD ROM), 인터넷 사이트에 의해 분배되는 정보 및 RAM에 의한 것을 포함하는 컴퓨터 판독 가능한 기재로 입력된다. 그 다음, 단백질의 삼차원 구조 모델은 당업자에게 공지된 소프트웨어를 사용하여 아미노산 서열과 컴퓨터 시스템의 상호 작용에 의해 형성된다.
아미노산 서열은 관심 대상의 단백질의 2차, 3차 및 4차 구조를 형성하는 데 필요한 정보를 암호화하는 1차 구조를 나타낸다. 소프트웨어는 구조 모델을 형성하는 1차 서열에 의해 암호화되는 특정 매개변수를 검색한다. 이러한 매개변수는 "에너지 항(terms)"으로 불리우며, 주로 정전 포텐셜, 소수성 포텐셜, 용매 접근 가능한 표면 및 수소 결합을 포함한다. 2차 에너지 항은 반 데르 발스 포텐셜을 포함한다. 생물학적 분자는 축적 양식으로 에너지 항을 최소화하는 구조를 형성한다. 그러므로, 컴퓨터 프로그램은 1차 구조 또는 아미노산 서열에 의해 암호화되는 이러한 항을 이용하여 2차 구조 모델을 생성한다.
그 다음, 2차 구조에 의해 암호화되는 단백질의 3차 구조는 2차 구조의 에너지 항을 토대로 형성된다. 이 시점에서의 사용자는 단백질이 멤브레인 결합되었는지, 또는 가용성인지 여부, 그것의 체내 위치 및 그것의 세포 위치, 예컨대 세포질, 표면 또는 핵과 같은 추가의 변수를 입력할 수 있다. 2차 구조의 에너지 항에 따른 이러한 변수를 사용하여 3차 구조의 모델을 형성한다. 3차 구조의 모델링에서, 컴퓨터 프로그램은 2차 구조의 소수성을 유사한 것과 매칭시키고, 2차 구조의 친수성 면을 유사한 것과 매칭시킨다.
일단 구조가 형성되면, 잠재적인 리간드 결합 영역은 컴퓨터 시스템에 의해동정한다. 잠재적 리간드의 삼차원 구조는 전술한 바와 같은 아미노산 또는 핵산 서열 또는 화합물의 화학식을 입력함으로써 형성된다. 그 다음, 잠재적 리간드의 삼차원 구조는 케모카인 수용체의 것과 비교하여 케모카인 수용체의 결합 부위를 동정한다. 단백질과 리간드 간의 결합 친화도는 리간드가 단백질에 대한 향상된 결합 가능성을 갖는 것을 결정하기 위하여 에너지 항을 사용하여 결정한다.
IV. 케모카인 수용체의 상이한 토폴로지의 검출
분석법을 사용하여 관심 대상의 케모카인 수용체의 상이한 토폴로지를 검출한다. 예를 들면, 면역 분석법을 사용하여 케모카인 수용체의 토폴로지를 정성적 또는 정량적으로 분석한다. 적용 가능한 기술의 일반 개관은 문헌(Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual(1988))에서 찾아볼 수 있다. 대안으로, 케모카인 수용체의 특정 토폴로지에 대한 친화성을 가진 비항체 모델을 사용하여 케모카인 수용체의 토폴로지를 검출할 수도 있다.
리간드 특이성은 토폴로지 간에 상이할 수 있다. 그러므로, 특정 리간드(예컨대, 케모카인)에 결합하는 친화성은 케모카인 수용체의 특정 토폴로지의 존재를 가리킨다. 예를 들면, 도 2에 예시된 바와 같이, 케모카인 I-TAC에 결합하는 CXCR4의 친화성은 CXCR4가 유방암 세포에서 발견되는 토폴로지를 가진다는 것을 가리킨다. 이 방법은 다른 암(예컨대, 난소암, 경부암, 신경교종 아세포종, 버킷 림프종 등)에 대해 유사하게 적용할 수 있다.
A. 표적 단백질에 대한 항체
관심 대상의 단백질 또는 단백질의 특이적인 토폴로지와 특이적으로 반응하는 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 생성하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다(예컨대, Coligan, 상기 참조; 및 Harlow and Lane, 상기 참조; Stites et al., 상기 참조 및 본 명세서에 인용된 참조 문헌; Goding, 상기 참조; 및 Kohler and Milstein Nature, 256: 495-497(1975)). 그러한 기술은 파지 또는 유사한 벡터 내 재조합 항체의 라이브러리로부터 항체를 선택하는 항체 제법을 포함한다(Huse et al., 상기 참조; 및 Ward et al., 상기 참조). 예를 들면, 면역 분석법용 항혈청을 생성하기 위하여, 관심 대상의 단백질 또는 그것의 항원 단편을 본 명세서에 기재된 바와 같이 분리한다. 예를 들면, 재조합 단백질은 형질전환된 세포주에서 생성된다. 마우스, 래트, 기니 피그 또는 토끼의 근친 교배 변종을 표준 보조제, 예컨대 프로인트 보조제 및 표준 면역화 프로토콜을 사용하여 단백질로 면역화시킨다. 다른 선택 사양은 단백질을 발현하는 세포(예컨대, 특정 토폴로지 내) 또는 항원으로서 특정 토폴로지를 포함하는 멤브레인 분획 또는 리포솜을 사용하는 것이다. 예를 들면, CXCR4의 유방암 특이적인 토폴로지를 발현하는 유방암 세포주를 사용하여 토폴로지에 특이적인 항체를 발생시킬 수 있다. 그 다음, 세포, 멤브레인 분획 또는 리포솜에 대하여 발생된 항체는 단백질에 결합하는 능력에 대하여 선택할 수 있다. 이 방법은 단백질의 특정 토폴로지가 특정 세포 유형 내 발현에 의존하는 경우 특히 유용하다.
폴리클로날 혈청을 수집하고, 면역 분석법, 예컨대 고체 지지체 상에 고정화시킨 면역원을 사용하는 고상 면역 분석법에서 면역원에 대하여 적정한다. 역가가 104이상인 폴리클로날 항체를 선택하고, 경쟁적 결합 면역 분석법을 사용하여 케모카인 수용체의 상이한 토폴로지 또는 심지어 다른 동질성 단백질에 대한 교차 반응에 대하여 테스트한다. 보통, 특이적인 모노클로날 및 폴리클로날 항체 및 항혈청은 적어도 약 0.1 mM, 보다 통상적으로 적어도 약 1 μM, 바람직하게는 적어도 약 0.1 μM 이상, 가장 바람직하게는 0.01 μM 이상의 KD로 결합한다.
항체, 예컨대 재조합, 모노클로날 또는 폴리클로날 항체의 제조에 대해서는 당업계에 공지된 많은 기술을 사용할 수 있다(예컨대, Kohler & Milstein, Nature 256: 495-497(1975); Kozbor et al., Immunology Today 4: 72(1983); Cole et al., pp. 77-96 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc.(1985); Coligan, Current Protocols in Immunology(1991); Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual(1988); 및 Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice(2d ed. 1986) 참조). 관심 대상의 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자는 세포로부터 클로닝할 수 있는데, 예를 들면 모노클로날 항체를 암호화하는 유전자는 하이브리도마로부터 클로닝할 수 있고, 재조합 모노클로날 항체를 생성하는 데 사용할 수 있다. 또한, 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자 라이브러리는 하이브리도마 또는 혈장 세포로부터 제조할 수 있다. 중쇄 및 경쇄 유전자 산물의 랜덤 조합은 항원 특이성이 상이한 항체의 대형 풀을 형성한다(예컨대, Kuby, Immunology(3rd ed. 1997) 참조). 단쇄 항체 또는 재조합 항체의 제조를 위한 기술(미국 특허 제4,946,778호, 미국 특허 제4,816,567호)을 채택하여 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체를 생성할 수 있다. 또한, 트랜스게닉 마우스, 또는 다른 유기체, 예컨대 다른 포유류를 사용하여 인간화 또는 인간 항체를 발현시킬 수 있다(예를 들면, 미국 특허 제5,545,807호; 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,661,016호, Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783(1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859(1994); Morrison, Nature 368: 812-13(1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14: 845-51(1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826(1996) 및 Lonberg & Huszer, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93(1995) 참조). 대안으로, 파지 디스폴레이 기술을 사용하여 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 항체 및 헤테로머 Fab 단편을 동정할 수 있다(예를 들면, McCafferty et al., Nature 348: 552-554(1990); Marks et al., Biotechnology 10: 779-783(1992) 참조). 또한, 항체는 이특이적, 즉 두 가지 상이한 항원을 인식할 수 있게 만들 수 있다(예를 들면, WO 93/08829호, Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655-3659(1991); 및 Suresh et al., Methods in Enzymology 121: 210(1986) 참조). 또한, 항체는 헤테로콘쥬게이트, 예컨대 두 개의 공유 연결된 항체 또는 면역독소일 수 있다(예컨대, 미국 특허 제4,676,980호, WO 91/00360호; WO 92/200373호; 및 EP 03089호 참조).
비인간 항체의 인간화 또는 영장류화( 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비인간인 공급원으로부터 여기로 도입된 1 이상의 아미노 잔기를 가진다. 이러한 비인간 아미노산 잔기는 흔히 임포트(import) 잔기로 불리우며, 통상적으로 임포트 가변성 도메인으로부터 취해진다. 본질적으로, 인간화는 설치류 CDR 또는 CDR 서열을 인간 항체의 해당 서열로 치환함으로써 윈터 등의 방법을 따라 수행될 수 있다(예컨대, Jones et al., Nature 321: 522-525(1986);Riechmann et al., Nature 332: 323-327(1988); Verhoeyen et al., Science 239: 1534-1536(1988) 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596(1992) 참조). 따라서, 그러한 인간화 항체는 키메라 항체(미국 특허 제4,816,567호)이며, 여기서 이는 실질적으로 하나 미만의 고유 인간 가변성 도메인이 비인간 종으로부터의 해당 서열로 치환된 것이다. 실제로, 인간화 항체는 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체 내 유사 부위로부터의 잔기로 치환된 인간 항체인 것이 통상적이다.
면역원을 포함하는 본 발명의 다수의 단백질은 관심 대상의 단백질에 특이적 또는 선택적으로 반응성인 항체를 생성하는 데 사용할 수 있다. 재조합 단백질은 모노클로날 또는 폴리클로날 항체의 제조에 바람직한 면역원이다. 또한, 천연 단백질은 순수 또는 비순수 형태로 사용할 수 있다. 또한, 본 명세서에 기재된 단백질 서열을 이용하여 제조된 합성 펩티드는 단백질에 대한 항체의 제조를 위한 면역원으로서 사용할 수 있다. 재조합 단백질은 진핵 세포 또는 원핵 세포 내에서 발현시키고, 대체로 상기 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 그 다음, 생성물은 항체를 생성할 수 있는 동물에 주사한다. 모노클로날 또는 폴리클로날 항체는 단백질을 측정하기 위하여 면역 분석법에 추후 사용하기 위해 발생시킬 수 있다.
폴리클로날 항체의 제조 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 간단히 설명하면, 면역원, 바람직하게는 정제된 단백질을 보조제와 혼합하고, 동물을 면역화시킨다. 동물의 면역원 제제에 대한 면역 반응은 테스트 채혈하고, 케모카인 수용체의 특정 토폴로지에 대한 반응성의 역가를 결정함으로써 모니터한다. 면역원에 대한항원의 적절하게 높은 역가가 얻어질 때, 동물로부터 채혈하고, 항혈청을 제조한다.
단백질에 대해 반응성인 항체를 농축하기 위한 항혈청의 분획화를 필요에 따라 추가로 실시할 수 있다(상기 Harlow 및 Lane의 문헌 참조).
당업자에게 친숙한 각종 방법을 사용하여 모노클로날 항체를 얻을 수 있다. 통상적으로, 목적하는 항원으로 면역화한 동물로부터 얻은 비장 세포를, 보통 골수종 세포와의 융합에 의해 죽지 않게 만든다(Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol. 6:511-519 (1976) 참조). 죽지 않게 하는 별법으로는, 예컨대 엡스타인 바르 바이러스, 종양유전자 또는 레트로바이러스를 이용한 형질전환법 또는 당업계에 공지된 기타 방법 등이 있다. 항원에 대한 목적하는 특이성 및 친화도를 갖는 항체의 생성에 대해 단일 불사 세포로부터 생성된 콜로니를 스크리닝하고, 척추류 숙주의 복강내로의 주사를 비롯한 각종 방법으로 이러한 세포에 의해 생성된 모노클로날 항체의 수율을 증가시킬 수 있다. 또는, 상기 Huse 등의 문헌에 요약된 일반 프로토콜에 따라 인간 B 세포로부터 DNA 라이브러리를 스크리닝하여 모노클로날 항체 또는 이의 결합 단편을 암호화하는 DNA 서열을 분리할 수 있다.
일단 표적 단백질 특이적 항체를 이용할 수 있게 되면, 각종 면역분석 방법으로 단백질을 측정하여 정량 및 정성 결과를 얻을 수 있다. 면역학적 및 면역분석 절차의 검토를 위해서는 일반적으로 상기 Stites의 문헌 참조. 또한, 본 발명의 면역분석은 몇가지 형태 중 임의의 형태로 실시될 수 있으며, 이는 문헌[Maggio Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, Florida (1980); Tijssen, 상기 문헌참조; 및 Harlow and Lane, 상기 문헌 참조]에 집중적으로 검토되어 있다.
인간 샘플 중 표적 단백질을 측정하는 면역분석에서는 단백질(예, 케모카인 수용체의 한 토폴로지) 또는 이의 단편에 대해 생성된 폴리클로날 항혈청을 사용할 수 있다. 이 항혈청은 케모카인 수용체의 다른 토폴로지에 대해서 교차 반응성이 낮은 것으로 선택되고, 그러한 임의의 교차 반응성을 면역흡수로 제거한 다음에 면역분석에 사용한다. 또는, 샘플 중 하나 이상의 케모카인 수용체 토폴로지 또는 심지어 전체 케모카인 수용체 토폴로지를 인식하는 항체를 사용하여, 예컨대 샘플 중 케모카인 수용체의 전체 수준을 결정할 수 있다.
B. 면역학적 결합 분석
바람직한 구체예에서, 다수의 공지된 면역학적 결합 분석 중 임의의 분석법을 이용하여 해당 단백질을 검출 및/또는 정량한다(예컨대 미국 특허 4,366,241호; 4,376,110호; 4,517,288호; 및 4,837,168호 참조). 일반적인 면역분석의 검토를 위해서는 문헌[Asai Methods in Cell Biology Volume 37: Antibodies in Cell Biology, Academic Press,Inc. NY (1993); Stites, 상기 문헌] 참조. 면역학적 결합 분석(또는 면역분석)에서는 통상적으로 피분석물(이 경우 케모카인 수용체 또는 이의 항원성 부분서열의 토폴로지)에 특이적으로 결합하여 흔히 이를 고정하는 "포획제"를 사용한다. 이 포획제는 피분석물에 특이적으로 결합하는 부분이다. 바람직한 구체예에서, 포획제는, 예컨대 케모카인 수용체의 토폴로지에 특이적으로 결합하는 항체이다. 항체(예, 항케모카인 수용체 항체)는 당업자들에게 공지되고 전술한 바와 같은 다수의 방법 중 임의의 방법으로 생성할 수 있다.
또한 면역분석에서는 포획제와 피분석물에 의해 형성된 결합 복합체에 특이적으로 결합하여 표지하는 표지화제가 흔히 이용된다. 표지화제는 그 자체가 항체/피분석물 복합체를 포함하는 부분 중 하나일 수 있다. 대안적으로, 표지화제는 항체/단백질 복합체에 특이적으로 결합하는 제3 부분, 예컨대 또 다른 항체일 수 있다.
바람직한 구체예에서, 표지화제는 표지를 보유한 제2 항체이다. 또는, 제2 항체에는 표지가 결여되어 있을 수 있지만, 제2 항체가 유도된 종의 항체에 특이적인 표지된 제3 항체가 결합되어 있을 수 있다. 제2 항체는, 효소 표지된 스트렙타비딘과 같이 제3의 표지된 분자가 특이적으로 결합할 수 있는 비오틴과 같은 검출가능한 부분으로 변형될 수 있다.
단백질 A 또는 단백질 G와 같이 면역글로불린 불변부에 특이적으로 결합할 수 있는 다른 단백질을 표지화제로 사용할 수 있다. 이들 단백질은 스트렙토코코스 박테리아의 세포벽의 일반적인 구성성분이다. 이들은 각종 종으로부터 유래한 면역글로불린 불변부와 강한 비면역원성 반응성을 나타낸다(일반적으로, Kronval, et al. J. Immunol., 111: 1401-1406 (1973); 및 Akerstrom, et al. J. Immmunol., 135:2589-2542 (1985) 참조).
이 분석에서는 반응물의 각 조합 후에 항온처리 및/또는 세척 단계를 실시해야 할 수도 있다. 항온처리 단계는 약 5초 내지 수 시간, 바람직하게는 약 5분 내지 약 24 시간으로 다양하게 실시할 수 있다. 분석 형식, 피분석물, 용액 부피, 농도 등에 따라서 항온처리 시간이 달라진다. 일반적으로, 분석은 상온에서 실시되지만, 10∼40℃와 같은 온도 범위에서 실시될 수 있다.
1. 비경쟁 분석 형식
조직 샘플로부터 해당 단백질을 검출하는 면역분석은 경쟁적 또는 비경쟁적일 수 있다. 비경쟁적 면역분석은, 포획된 피분석물(예, 단백질)의 양이 직접 측정되는 분석이다. 바람직한 "샌드위치" 분석에서, 예를 들어 포획제(예, 항케모카인 수용체 항체)를 고체 기재에 직접 결합시켜 고정할 수 있다. 그 다음 이들 고정된 항체가 테스트 샘플 중에 존재하는 하나의 토폴로지를 갖는 케모카인 수용체를 포획한다. 따라서 고정된 케모카인 수용체를, 표지를 보유하는 제2 항케모카인 수용체 항체와 같은 표지화제로 결합시킨다. 대안적으로, 제2 항체에는 표지가 없지만, 제2 항체가 유도된 종의 항체에 특이적인 표지된 제3 항체에 의해 결합될 수 있다. 제2 항체는, 효소 표지된 스트렙타비딘과 같이 제3의 표지된 분자가 특이적으로 결합할 수 있는 비오틴과 같은 검출가능한 부분으로 변형될 수 있다.
2. 경쟁 분석 형식
경쟁 분석에서, 샘플 중에 존재하는 표적 단백질(피분석물)의 양은, 포획제(즉, 항케모카인 수용체 항체)로부터 샘플 중에 존재하는 피분석물로 대체된(또는 경쟁된) 첨가된 (외인성) 피분석물(즉, 케모카인 수용체의 해당 토폴로지)의 양을 측정하여 간접적으로 결정한다. 한 경쟁 분석에서, 해당 단백질의 기지량을 샘플에 첨가하고, 샘플을 포획제(이 경우 케모카인 수용체의 한 토폴로지에 특이적으로 결합하는 항체)와 접촉시킨다. 항체에 결합하는 면역원의 양은 샘플 중에 존재하는 면역원의 농도에 반비례한다. 특히 바람직한 구체예에서, 항체는 고체 기재 상에고정된다. 예를 들어, 항체에 결합된 케모카인 수용체의 양은, 케모카인 수용체 단백질/항체 복합체에 존재하는 대상 단백질의 양을 측정하거나, 또는 대안적으로 복합체화되지 않은 남아 있는 단백질의 양을 측정하여 결정할 수 있다. 케모카인 수용체의 양은, 표지된 케모카인 수용체 분자를 제공하여 검출할 수 있다.
경쟁 결합 형식의 면역분석은 교차 반응성 결정을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서 중에 개시된 서열이 암호화하는 단백질을, 해당 단백질을 포함하는 완전한 세포 또는 천연 또는 인공 막에 또는 고체 지지체 위에 고정화할 수 있다. 면역화된 항원에 대한 항혈청의 결합과 경쟁하는 단백질(예, 케모카인 수용체의 제2 형태)을 분석에 첨가한다. 고정된 단백질에 대한 항혈청의 결합과 경쟁하는 상기 단백질의 능력을, 본 명세서에 개시된 임의의 서열이 암호화하는 단백질의 능력과 비교한다. 표준 계산을 이용하여 상기 단백질에 대한 교차 반응성(%)을 계산한다. 상기 개시된 각 단백질과의 교차 반응성이 10% 미만인 항혈청을 선택하여 모은다. 교차 반응하는 항체는, 고려된 단백질, 예컨대 관계가 먼 상동체를 이용하여 면역흡수에 의해 모아진 항혈청으로부터 임의로 제거한다.
3. 표지
이 분석에서 사용된 특정 표지 또는 검출가능한 기는 분석에 사용된 항체의 특이적 결합을 유의적으로 저해하지 않는 한, 본 발명의 중요한 부분은 아니다. 검출가능한 기는 검출가능한 물리적 또는 화학적 성질을 갖는 임의의 물질일 수 있다. 면역분석 분야에서 그러한 검출가능한 표지가 개발되어 있으며, 일반적으로 그러한 방법에 유용한 대부분의 표지를 본 발명에 적용할 수 있다. 따라서, 표지는분광분석, 광화학, 생화학, 면역화학, 전기, 광학 또는 화학 수단으로 검출가능한 임의의 조성물이다. 본 발명에서 유용한 표지는 자기 비드(예, DynabeadsTM), 형광 염료(예, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 텍사스 레드, 로다민 등), 방사성 표지(예,3H,125I,35S,14C, 또는32P), 효소(예, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제 및 ELISA에서 일반적으로 사용되는 것들) 및 발색 표지, 예컨대 콜로이드 골드 또는 착색된 유리 또는 플라스틱(예, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등) 비드 등이 있다.
표지는, 당업계에 공지된 방법에 따라 목적하는 분석 성분에 직접 또는 간접 커플링시킬 수 있다. 전술한 바와 같이, 각종 표지를 사용할 수 있으며, 표지 선택은 필요한 선택도, 화합물과의 접합 용이성, 안정성 조건, 이용가능한 시설 및 처리 설비 등에 따라 달라진다.
간접적인 수단으로 비방사성 표지를 부착하는 경우가 흔히 있다. 이 분자를, 예컨대 효소 또는 형광성 화합물과의 접합에 의해 발신 화합물에 직접 접합시킬 수 있다. 각종 효소 및 형광성 화합물은 본 발명의 방법과 함께 사용할 수 있으며, 당업계에 공지되어 있다(사용할 수 있는 각종 표지화계 또는 발신계의 검토를 위해서는 예컨대 미국 특허 제4,391,904호 참조).
표지 검출 수단은 당업계에 공지되어 있다. 따라서, 예를 들어 표지가 방사성 표지인 경우, 검출 수단으로는 자가방사선사진에서의 사진 필름 또는 신틸레이션 계수기 등이 있다. 표지가 형광 표지인 경우, 이의 검출은 적절한 빛의 파장으로 형광 색소를 여기시키고 생성된 형광을 검출하여 실시할 수 있다. 전하 결합 소자(CCD) 또는 포토멀티플라이어 등과 같은 전자 검출기를 사용하여, 사진 필름에 의해 형광을 육안으로 검출할 수 있다. 마찬가지로, 효소에 대한 적절한 기질을 제공하고 생성된 반응 산물을 검출하여 효소 표지를 검출할 수 있다. 마지막으로, 간단한 발색 표지는 표지와 관련된 색상을 관찰하여 직접 검출할 수 있다. 따라서, 각종 딥스틱 분석에서 접합된 금은 흔히 분홍색을 나타내지만, 각종 접합된 비드는 비드 색상을 나타낸다.
일부 분석 형식에서는 표지된 성분을 사용하지 않아도 된다. 예를 들어, 응집 분석을 이용하여 표적 항체의 존재를 검출할 수 있다. 이 경우, 항원 코팅된 입자는 표적 항체를 포함하는 샘플에 의해 응집된다. 이러한 형식에서는 성분을 표지할 필요가 없으며, 표적 항체의 존재는 단순한 육안 검사만으로 검출된다.
V. 결합제로 세포를 분리하는 방법
케모카인 수용체의 특정 토폴로지에 특이적으로 결합하는 제제를 사용하여, 특정 토폴로지를 갖는 세포군을 분리, 동정 및 검출할 수 있다. 예를 들어, 특정 토폴로지를 발현하는 백혈구 아군 또는 종양 세포를 샘플 중에서 검출할 수 있다. 대안적으로, 특정 토폴로지를 발현하는 세포를, 샘플로부터 토폴로지를 발현하는 세포에 결합하여 이를 정제하는 제제를 사용하여 샘플로부터 분리할 수 있다. 예시적인 세포 분리 방법으로는 친화도 크로마토그래피와, 유세포 분석법 및 형광 활성화된 세포 분류기(FACS)의 사용 등이 있다.
또한, 특정 토폴로지를 나타내는 세포의 검출 및 분리는, (형광 태그, 방사성 또는 기타 표준 단백질 표지법에 의해) 표지되고 세포 분류에 사용되는 토폴로지 특이적 케모카인 리간드를 이용하여 실현할 수 있다. 별법으로, 케모카인 리간드를 고상(유리, 플라스틱, 라텍스 비드 또는 자기 비드) 기재에 "포획제"로서 부착시킬 수 있다. 그러한 고상 포획법은 "패닝"법으로 널리 알려져 있으며, 질병 세포 또는 정상 세포 중 해당 케모카인 수용체의 특정 토폴로지 형태를 발현하는 세포를 분리, 정제 및 추가 농축하는 데 사용될 수 있다.
VI. 조성물, 키트, 일체형 시스템 및 단백질유전체학의 응용
본 발명은 항케모카인 수용체 항체 또는 수용체의 특정 토폴로지를 특이적으로 검출하는 기타 제제를 사용하여 본 명세서에 개시된 분석을 실시하기 위한 조성물, 키트 및 일체형 시스템을 제공한다.
본 발명은 고상 분석에 사용하기 위한 분석용 조성물을 제공한다; 그러한 조성물은, 예컨대 고체 지지체에 고정된 특정 토폴로지의 케모카인 수용체(예컨대, 토폴로지를 유지하는 세포, 막 분획 또는 리포좀의 일부로서[예, Babcok et al., J. Biol. Chem. 276 (42):38433-40 (2001); Mirzabekov et al., Nat. Biotechnol. 18(6): 649-54(2000) 참조])와 표지화 시약을 포함할 수 있다. 각 경우에, 분석 조성물은 또한 하이브리드화에 바람직한 추가의 제제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 고체 지지체는 페트리 평판, 다중 웰 평판 또는 마이크로어레이일 수 있다. 또한, 펩티드 라이브러리의 마이크로어레이를 사용하여 케모카인 수용체의 특정 토폴로지에 특이적으로 결합하는 펩티드 서열을 확인할 수 있다.
또한, 일정 토폴로지의 케모카인 수용체에 특이적으로 결합하는 제제를 분석조성물에 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 케모카인 수용체의 특정 토폴로지에 특이적으로 결합하는 항체를 고체 지지체에 고정할 수 있다. 이들 구체예 중 일부에서, 특정 케모카인 수용체 토폴로지 또는 그 토폴로지를 발현하는 세포의 존재 또는 부재를 검출하는 데 그 제제를 사용한다. 예를 들어, 고체 지지체는 페트리 평판, 다중 웰 평판 또는 마이크로어레이일 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 분석을 실시하기 위한 키트를 제공한다. 키트는 통상적으로 케모카인 수용체의 하나의 토폴로지에 특이적으로 결합하는 제제(예, 항체 또는 다른 작은 분자)와 제제의 존재를 검출하기 위한 표지를 포함한다. 키트는 하나 이상의 케모카인 수용체 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 키트는 상기 언급한 조성물 중 임의의 것을 포함할 수 있으며, 경우에 따라서 케모카인 수용체의 활성 또는 기능에 미치는 효과에 대해 고 처리량 분석법을 실시하기 위한 지시사항, 하나 이상의 용기 또는 구획(예, 프로브, 표지 등을 유지하기 위한 것), 케모카인 수용체의 기능 또는 활성의 제어 조절제, 키트 성분들을 혼합하기 위한 로봇 전기자 등과 같은 추가의 성분을 더 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 키트는 조직 샘플 중 CXCR4가 I-TAC에 결합하는 지 여부를 검출하기 위한 성분을 포함한다. 일부 구체예에서, 키트는, 예컨대 표지 또는 태그된 SDF-1과 표지되지 않은(cold) 경쟁자 I-TAC를 포함하거나, 또는 대안적으로 표지 또는 태그된 I-TAC와 표지되지 않은 경쟁자 SDF-1을 포함한다. 표지 또는 태그된 케모카인은 당업계에 공지된 임의의 방법으로 표지 또는 태그될 수 있다. 일부 구체예에서, 표지된 케모카인을 비오틴 또는 형광 표지로 태그하거나 또는 방사성표지한다. 대안적으로 또는 병행하여, 키트는 I-TAC를 검출하기 위한 항-I-TAC 결합제(예, 항체)를 포함할 수 있다. 또한, 키트는, 온전한 세포 또는 세포 막에서 경쟁 결합 분석을 실시하기 위한 적절한 염 완충제와 기타 시약을 포함할 수 있다. 그러한 시약은, 예컨대 하기 실시예에 개시되어 있다. 일부 측면에서, 키트는 또한 케모카인-CXCR4 결합을 측정하는 리셉터클 또는 고체 지지체(예, 신틸레이션 계수기 또는 자동화된 평판 판독기에 적합한 반응을 위한 평판 형태)를 포함한다. 일부 측면에서, 키트는, 예컨대 본 발명의 방법에서 키트를 사용하기 위한 지시사항을 포함한다.
또한 본 발명은 케모카인 수용체의 활성 또는 기능에 미치는 효과에 대해 유효 조절제를 고처리량으로 스크리닝하기 위한 일체형 시스템을 제공한다. 이 시스템은 통상적으로 공급원으로부터 목적지로 유체를 이송하는 로봇 전자자, 로봇 전자자를 제어하는 컨트롤러, 표지 검출기, 표지 검출을 기록하는 데이타 저장 유닛과, 고정된 핵산 또는 고정화된 부분을 포함하는 기재 또는 반응 혼합물이 있는 웰을 포함하는 미량역가 접시와 같은 분석 성분을 포함한다.
다수의 로봇 유체 수송 시스템이 입수가능하거나, 또는 기존의 성분으로부터 쉽게 만들 수 있다. 예를 들어, Microlab 2200(해밀톤; 미국 네바다주 레노) 피펫팅 스테이션을 사용한 Zymate XP(자이마크 코포레이션; 미국 매사츄세츠주 홉킨톤) 자동화된 로봇을 이용하여 유사 샘플을 96웰 미량역가 평판으로 옮겨 몇가지 유사한 동시 결합 분석을 개시하였다.
카메라 또는 다른 기록 장치(예, 광다이오드 및 데이타 저장 장치)에 의해보이는(그리고 경우에 따라 기록되는) 광학 이미지를, 예컨대 이미지를 디지탈화하고 컴퓨터 상에 그 이미지를 저장 및 분석하여, 본 명세서에 개시된 임의의 구체예에서 임의로 추가 처리한다. 예컨대 PC(Intel x86 또는 펜티엄 칩-호환성 DOS(등록상표), OS2(등록상표) WINDOWS(등록상표), WINDOWS NT(등록상표), WINDOWS95(등록상표), WINDOWS98(등록상표), 또는 WINDOWS2000(등록상표) 계열의 컴퓨터), MACINTOSH(등록상표), 또는 UNIX 계열(예, SUN(등록상표) 워크 스테이션) 컴퓨터를 사용하여 디지탈화된 비디오 또는 디지탈화된 광학 이미지를 디지탈화, 저장 및 분석하기 위한 각종 시판 주변 기기와 소프토웨어를 입수할 수 있다.
종래 시스템 중 하나는 당해 분야에서 공통적으로 사용되는 표본 필드로부터 저온 전하 결합 소자(CCD) 카메라로 빛을 운반한다. CCD 카메라는 화소(픽셀)의 어레이를 포함한다. 표본으로부터 나온 빛은 CCD에서 이미지화된다. 표본 영역에 해당하는 특정 픽셀(예, 생물학적 중합체의 어레이 상의 개별 혼성화 부위)을 샘플링하여 각 위치에 대한 빛의 강도를 판독한다. 복수의 픽셀을 병행 처리하여 속도를 증가시킨다. 본 발명의 장치 및 방법은, 예컨대 형광시야 또는 암시야 현미경 방법에 의해 임의의 샘플을 관찰하는 데 쉽게 이용된다.
VII. 투여 및 약학 조성물
특정 토폴로지의 케모카인 수용체의 조절제(예, 길항제 또는 효능제)를, 생체내 케모카인 수용체 시그널링의 조절을 위해 포유류 피험체에게 직접 투여할 수 있다. 치료할 조직과 최종 접촉하도록 조절제 화합물을 도입하는 데 통상 사용되는 임의의 경로로 투여하며, 투여 경로는 당업계에 공지되어 있다. 하나 이상의 경로를 사용하여 특정 조성물을 투여할 수 있지만, 특정 경로가 다른 경로보다 더욱 빠르고 효과적인 반응을 제공할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적 허용 담체를 포함할 수 있다. 약학적 허용 담체는 부분적으로는 투여될 특정 조성물에 의해서, 그리고 조성물을 투여하는 데 사용되는 특정 방법에 의해서 결정된다. 따라서, 본 발명의 약학 조성물의 적절한 각종 조제예가 있다(예컨대 Remington's Pharmaceutical Sciences, 17thed. 1985)).
단독으로 또는 다른 적절한 성분과 함께, 케모카인 수용체의 발현 또는 활성의 조절제(예, 길항제 또는 효능제)를, 흡입에 의해 투여하고자 하는 에어로졸 제형(즉, "연무형"일 수 있음)으로 제조할 수 있다. 에어로졸 제형을 허용가능한 가압 추진체, 예컨대 디클로로디플루오로메탄, 프로판, 질소 등에 넣을 수 있다.
투여용으로 적합한 제제는, 산화방지제, 완충제, 세균발육저지제 및 제제를 등장성이 되게 하는 용질을 포함할 수 있는 수성 및 비수성 용액, 등장성 멸균 용액과, 현탁제, 가용화제, 증점제, 안정화제 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다. 본 발명의 실시에 있어서, 예컨대 경구, 비강, 국소, 정맥내, 복강내 또는 초내로 조성물을 투여할 수 있다. 앰플 및 병과 같은 1회 또는 다회 밀봉 용기로 화합물의 조제물을 제공할 수 있다. 상기 개시된 바와 같은 종류의 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 용액 및 현탁액을 조제할 수 있다. 조제된 식품 또는 약물의 일부로서 조절제를 투여할 수 있다.
본 발명에서 환자에게 투여되는 투여량은 경시적으로 피험체에서 이로운 반응을 일으키는 데 충분해야 한다. 임의의 환자에 대한 최적 투여량 수준은 사용된 특정 조절제의 효능, 환자의 연령, 체중, 신체 활동 및 식이를 비롯한 각종 인자, 다른 약물과의 가능한 조합 및 특정 질병의 경중에 따라 달라진다. 투여량 크기는 특정 피험체에서 특정 화합물 또는 벡터의 투여가 수반하는 임의의 불리한 부작용의 존재, 특성 및 범위로 결정한다.
투여하고자 하는 조절제의 유효량을 결정하는 데 있어서, 담당의는 조절제의 순환 혈장 농도, 조절제의 독성 및 항조절제 항체의 생성을 평가할 수 있다. 일반적으로, 조절제의 투여량은 전형적인 피험체의 경우 약 1 ng/kg∼10 ㎎/kg이다.
투여를 위해서, 본 발명의 케모카인 수용체 조절제를, 피험체의 전체 건강 상태 및 체중에 적용하는 것과 마찬가지로, 각종 농도에서의 조절제의 부작용과 조절제의 LD50에 의해 결정된 속도로 투여할 수 있다. 투여는 1회 용량 또는 분할 용량으로 실시할 수 있다.
VIII. 특정 토폴로지의 검출 및 질병의 진단
본 발명은 샘플 중 케모카인 수용체의 특정 토폴로지를 검출하는 방법을 제공한다. 단백질에 결합하는 제제를 사용한 검출 방법은 공지되어 있으며, 예컨대 유세포 분석법이 있다. 유세포 분석법을 사용하여, 혼합 세포군 내에서 해당하는 특정 항원을 발현하는 세포를 확인할 수 있다. 간단히 요약하면, 해당 단백질에 특이적인 항체(예컨대, 하나의 토폴로지에서는 특이적이지만 제2 토폴로지에서는 특이적이지 않음)와 세포를 반응시킨다. 항체를 형광 표지하거나(직접 염색법), 또는 표지되지 않은 경우 제1 항체와 반응하는 제2 항체를 형광 태그시킬 수 있다(간접염색법). 그 다음 형광 신호를 검출할 수 있는 기기에 세포를 통과시킨다. 세포를 흡인하고 단일 세포 현탁액으로 만든다. 세포에 결합한 형광 색소 표지된 항체를 여기시키고 이 데이타를 획득하는 레이저로 세포 현탁액을 통과시킨다. 밝게 확인되는 세포(즉, 형광 표지된 항체와 반응하는 세포)는 해당 단백질을 발현하며; 흐리게 나타나는 세포(즉, 형광 표지된 항체와 반응하지 않는 세포)는 해당 단백질을 발현하지 않는다.
본 발명은, 주어진 케모카인 수용체의 어떤 토폴로지가, 예컨대 비제한적인 예로서 유방암, 난소암, 경부암, 아교모세포종, 백혈병 및 버킷 림프종 등의 암뿐 아니라 류마티스성 관절염, 다발성 경화증, 심장 동종이식편 거부반응, 아테롬성경화증, 천식, 사구체신염, 접촉 피부염, 염증성 장 질환, 결장염, 건선, 재관류 손상과 본 명세서 중에 개시된 기타 장애 및 질환을 비롯한 인간 질병의 유발과 연루되어 있는 지를 진단하는 방법을 제공한다. 이들 각 질병에서, 유세포 분석법 또는 특정 에피토프를 포함하는 분자를 검출하는 다른 방법을 사용한 선택적 모노클로날 항체의 패널에 의해 특징지워지는 바와 같이, 진단은 관련된 케모카인 수용체(들)의 특정 토폴로지의 평가를 포함할 수 있다. 실시예를 비롯한 본 명세서에 개시된 바와 같이, 정상 및 질병 세포와 조직은 규명된 항케모카인 수용체 모노클로날 항체 또는 케모카인의 패널에 대한 반응성 패턴차로 구별할 수 있다. 예를 들어, MCF-7 세포에서 발견되는 CXCR4 토폴로지를 특이적으로 검출하여 샘플 중 암 세포를 확인할 수 있다.
또한, 케모카인 수용체 토폴로지 사이의 리간드 결합차를 검출할 수 있으며,이러한 차이를 이용하여 특정 토폴로지를 발현하는 세포를 발견할 수 있다. 리간드는 특정 토폴로지에 대해 특이성을 갖는 작은 분자와 천연 케모카인을 포함할 수 있다. 질병 상태가 특정 세포 유형과 연관된 경우, 그 세포 유형의 검출로 질병 상태를 인지할 수 있다. 예를 들어, 전술한 바와 같이 유방암 세포에서 발현되는 CXCR4의 토폴로지는 케모카인 I-TAC에 특이적으로 결합한다. IL-2 배양된 림프구와 T 세포주에서 CXCR4의 토폴로지는 I-TAC에 결합하지 않는다. 따라서, 세포가 CXCR4를 통해 I-TAC에 결합할 수 있다는 것은 암 세포가 존재함을 나타내는 것이다. 예시적인 방법에서, 조직 생검을 제공하고, 조직이 I-TAC에 결합하는 CXCR4의 토폴로지를 포함하는 세포를 포함하는 지를 결정한다. I-TAC에 결합하는 CXCR4의 토폴로지의 존재는 암 세포의 존재를 나타낸다. I-TAC를 검출함으로써 암 세포를 검출하는 것은, 예컨대 암을 진단하고 나서 (화학요법을 비롯하여) 치료전 또는 치료후에 조직을 평가하고 진단하는 데 유용하다. 암 세포는, 예컨대 유방암 세포, 난소암, 경부암, 버킷 림프종, 아교모세포종 등을 포함할 수 있다.
케모카인의 특정 케모카인 수용체로의 특이적 결합은 당업계에 공지된 임의의 방법으로 검출될 수 있다. 예시적인 방법으로서, 기지의 케모카인 수용체 리간드와 경쟁 실험하여 케모카인 결합을 검출한다. 예를 들어, I-TAC 결합이 CXCR4와의 상호작용에 기인한 것인지를 결정하기 위해, I-TAC 결합이 SDF-1과 같은 기지의 CXCR4 리간드와 경쟁할 수 있는 지를 결정할 수 있다.
케모카인 결합은 조직 샘플(예, 생검)을 사용하여 측정하거나, 또는 (예컨대, 방사성표지된 케모카인 이미지화를 이용하여) 동일계 조직에서 직접 모니터링할 수 있다.
조직 샘플을 이용하여 질병 상태에 연루된 케모카인 수용체 토폴로지가 특성화되면, 환자로부터 얻은 진단 샘플에서 케모카인 수용체 토폴로지를 결정할 수 있다. 그 다음, 케모카인 수용체 토폴로지의 차이를, 그 질병의 임상적 진단에서 마커 또는 구별 특성으로서 이용할 수 있다. 케모카인 수용체 토폴로지 특성을 통해 질병과 현재 임상 상태를 구별하여 진단하는 것은, 케모카인 수용체 매개된 질병에 대한 결과 또는 예후와 상관관계가 있거나 또는 이를 예측할 수 있는 신규한 검출법을 제공한다.
IX. 백신
특히 항체 결합 표현형의 면에서 케모카인 수용체 토폴로지가 구별된다. 항체 결합 표현형은 동일한 수용체의 토폴로지 상에 고유한 에피토프를 공유하고 다른 에피토프는 특정 토폴로지에 대해 고유하다는 것을 제시한다. 동일한 케모카인 수용체의 상이한 토폴로지는 동일한 아미노산 서열을 갖기 때문에, 상이한 토폴로지를 구별하기 위해 고유한 에피토프가 형성된다. 특정 토폴로지의 고유 에피토프는, 고유 에피토프가 병리 유도 세포, 예컨대 종양 세포에서 발현되는 경우에 임상 용도로 이용된다. 이 경우에, 개별 수용체 토폴로지의 공유된 에피토프는 표준 에피토프 맵핑에 의해, 예컨대 수용체 상에서 전체 세포외 도메인에 걸쳐있는 인접 펩티드(에, 약 12량체 내지 약 18량체)를 형성하고, 이들 펩티드에 대한 적절한 "공유된" 항체의 결합을 평가하여 확인된다. 개별 항체 결합 펩티드에 대한 세부 에피토프 맵핑은, 매회 하나의 아미노산 위치를 변화시킨 관련 펩티드군을 생성하여실현할 수 있다. 공유된 에피토프가 확인되면, 수용체의 재조합 형태를 조작하여 공유된 에피토프를 제거한다. 이러한 조작은, 예컨대 공유된 에피토프 부위에서 동일한 수용체를 암호화하는 cDNA의 점 돌연변이유발법으로 또는 수용체의 돌연변이 또는 변형법으로 실시할 수 있다. 하나의 토폴로지(예, 병리 관련 토폴로지)의 고유 에피토프만을 포함하는 돌연변이된 cDNA 또는 암호화된 폴리펩티드는, 병리 유발 세포(예, 종양 세포) 상에서 발현된 수용체 토폴로지에 대해 개체를 예방 또는 치료적으로 예방접종하기 위한 면역원으로서 이용된다. 예를 들어, 일부 구체예에서 MCF-7 세포에서 발견된 CXCR4 토폴로지의 고유 에피토프를 포함하는 항원을 사용하여, 암 세포(예, 유방암 세포, 경부암, 버킷 림프종, 아교모세포종 또는 기타 암 세포)에 대한 면역 반응을 유도한다. 일부 구체예에서, 돌연변이 또는 변형된 cDNA를 적절한 세포 유형, 예컨대 HLA 대응형 세포 유형에 형질감염시켜 그 세포에서 발현시킨다. 돌연변이된 cDNA를 발현하는 세포를 주사(예, 피내, 피하, 근육내, 복강내 등)를 비롯한 각종 방법으로 투여할 수 있다. 대안적으로, 고유 에피토프를 포함하지만 공유된 에피토프는 없는 펩티드를 담체에 접합시켜 백신으로서 사용할 수 있다. 또한, 케모카인 수용체의 특정 토폴로지에 특이적인 에피토프를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 벡터에 삽입하여 유전자 요법에 사용할 수 있다.
당업계에 알려진 바와 같이 면역원을 각종 용액 및 기타 화합물과 조합 또는 혼합할 수 있다. 백신은 주사용의 액체 용액 또는 에멀젼으로서 제조된다. 본 발명의 폴리펩티드를 이와 상용성인 약학적 허용 부형제와 혼합할 수 있다. 부형제는 물, 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 및 이의 조합을 포함할 수 있다. 백신은습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 또는 백신의 효능을 높이는 보강제와 같은 보조 물질을 추가로 포함할 수 있다.
그러한 보강제 또는 제제의 예로는 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 황산칼륨알루미늄(명반), 황산베릴륨, 실리카, 카올린, 탄소, 유중수 에멀젼, 수중유 에멀젼, 무라밀 디펩티드, 박테리아 내독소, 지질 X, 코리네박테리아 파르붐(Corynebacterium parvum)(프로피오노박테리아 액니(Propionobacterium acnes)), 보르데텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis), 폴리리보뉴클레오티드, 알긴산나트륨, 라놀린, 리소렉틴, 비타민 A, 사포닌, 리포좀, 레바미졸, DEAE-덱스트란, 블록킹된 공중합체 또는 다른 합성 보강제 등이 있다. 그러한 보강제는 각종 공급처로부터 시판되는 데, 예를 들어 Merck Adjuvant 65 (머크 앤드 캄파니 인코포레이티드, 미국 뉴저지주 라웨이 소재) 또는 프로인트 불완전 보강제 및 완전 보강제(디프코 래보러터리즈, 미국 미시간주 디트로이트) 등이 있다. 다른 적당한 보강제는 Amphigen(수중유), Alhydrogel(수산화알루미늄), 또는 Amphigen와 Alhydrogel의 혼합물이다. 알루미늄만이 인간 용도로 승인되었다.
면역원과 보강제가 유효량으로 존재하는 한, 이들의 비율을 다양하게 할 수 있다. 예를 들어, 수산화알루미늄은 백신 혼합물(Al2O3기준)의 약 0.5 중량%의 양으로 존재할 수 있다. 제형 기준으로, 면역원의 양은 환자당 약 5∼100 ㎍으로 다양할 수 있다. 바람직한 범위는 제형당 약 20∼약 40 ㎍이다. 적절한 제형 크기는 약 0.5 ㎖이다. 따라서, 근육내 주사를 위한 제형은, 예컨대 0.5% 수산화알루미늄의 혼합물로서 면역원 20 ㎍을 함유하는 0.5 ㎖를 포함한다.
통상적으로, 백신은 면역원의 최종 농도가 0.2∼200 ㎍/㎖을 포함하도록 제형화된다. 제형화 후에, 백신을 멸균 용기에 넣고, 밀봉한 후 저온(예, 4℃)에서 저장하거나, 또는 동결건조할 수 있다. 동결건조는 안정화된 형태로 장기간의 보관을 가능하게 한다.
경구 및 비경구(에, 피하 또는 근육내) 주사를 비롯하여 백신을 투여하기 위한 임의의 통상적인 방법으로 백신을 투여할 수 있다. 치료는 백신을 1회 투여하거나 또는 일정 기간 동안 다회 투여하는 것으로 구성될 수 있다. 본 발명의 면역원을, 표적 세포의 다른 에피토프를 포함하는 화합물 적량과 혼합할 수 있다. 또한, 면역원은 경구 투여용으로 적합한 재조합 백신의 성분일 수 있다.
온전한 수용체 단백질 또는 단편을 사용하는지 여부와 무관하게, 인간과 같은 동물을 면역화하기 위한 통상적 프로토콜이 있다. 피하 주사와 같은 비경구 투여의 경우, 적절한 담체의 예로는 파상풍 톡소이드, 디프테리아 톡소이드, 혈청 알부민 및 칠성장어 또는 키홀 림펫, 헤모시아닌이 있는데, 이들은 최소 유전자 제한을 갖는 접합체를 생성하기 때문에 적합하다. 이들 범용의 담체를 포함하는 접합체는 매우 다른 유전자 세트를 갖는 개체에서 T 세포 클론 활성화제로서 작용할 수 있다.
경구용 제제는, 예컨대 약학 등급의 사카린, 셀룰로스 및 탄산마그네슘 등의 일반적으로 사용된 부형제를 포함할 수 있다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 환제, 캡슐, 서방형 제제 또는 분말의 형태를 가지며, 본 발명의 폴리펩티드를 10∼95% 포함한다.
본 발명의 펩티드는 비경 통로를 통해 투여하기 위해 제형화될 수 있다. 담체가 고체인 비강 투여용으로 적절한 제제는 입도가 예컨대 약 10∼약 500 미크론인 거친 분말을 포함하며, 이러한 분말은 코로 숨을 들이쉬어, 즉 분말 용기를 코에 가까이 유지하여 그 용기로부터 비강 통로를 통해 신속하게 흡입하는 방식으로 투여한다. 담체가 비강 스프레이, 비강 액적으로서 투여하기 위한 액체이거나, 또는 네블라이저로 에어로졸 투여되는 적절한 제형은 활성 성분의 수성 또는 유성 용액을 포함한다. 그러한 각종 투여 방법이 당업계에 공지되어 있다. 비강 투여용 약학 조성물은, 벤질 알콜 또는 기타 적절한 보존제, 생체이용율을 증가시키는 흡수 촉진제, 플루오로카본 및/또는 당업계에 공지된 기타 안정화제 또는 분산제를 이용하여 염수 중의 용액으로서 제조할 수 있다. 비강 투여용 단위 제형은 1개당 활성 성분 7∼3000 ㎎, 바람직하게는 70 ㎎, 가장 바람직하게는 1∼10 ㎎을 포함할 수 있다.
실시예 1
본 실시예는 CXCR4가 상이한 세포에서 다른 토폴로지를 형성한다는 것을 보여준다.
재료 및 방법
시약 및 세포
인간, 바이러스 및 쥐 재조합 케모카인을 지정된 알 앤드 디 시스템즈(미국 미네소타주 미네아폴리스) 및 페프로테크(미국 뉴저지주 록키 힐)로부터 입수하였다.125I-표지된 SDF-1a를 퍼킨 엘머 라이프 사이언시즈 인코포레이티드(미국 매사츄세츠주 보스톤)로부터 구입하고,125I-표지된 I-TAC는 아머샴 파마시아 바이오테크(영국 버킹엄셔)로부터 입수하였다. 유세포 분석과 리간드 결합 경쟁에 사용된 모노클로날 항체는 알 앤드 디 시스템즈(미국 미네소타주 미네아폴리스)로부터 얻었다: 항-CXCR4 클론 12G5, 44708.111 (171), 44716.111 (172), 44717.111 (173), nmIgG2a, 및 nmIgG2b. 2차 항체인 염소 항-마우스 IgG PE 접합체(미국 플로리다주 마이애미 소재의 쿨터 이뮤노테크)를 사용하여 유세포분석에 의해 항체 결합을 검출하였다. 하기 세포주를 미국 모식균 배양 수집소(미국 버지니아주 마나싸스)로부터 얻었다: MCF-7 (선암; 유선), MDA MB-231 (선암; 유선), MDA MB-435s (유관암; 유선), DU 4475 (유선), ZR 75-1 (유관암; 유선) 및 HEK 293 (인간 배 신장). CEM-NKr (급성 림프모구 백혈병: 말초혈; T 림프모구) 세포는 NIH AIDS Research and Reference Reagent 프로그램으로부터 얻었다. 5% CO2/공기 혼합물의 가습 항온기 중에서 37℃하에 10% 태아 소 혈청(FBS)(미국 유타주 로간의 하이클론)으로 보충된 DMEM(미국 버지니아주 헌돈 소재의 미디아테크)에서 세포주를 배양하였다. 인간 말초혈 단핵구(PBMC)는, 건강한 공여자(미국 캘리포니아주 팔로 알토의 스탠포드 혈액 센터)의 백혈구 연층으로부터 Ficoll-Hypaque 밀도 구배로 원심분리하여 얻었다. 분리된 PBMC를, 5% CO2/공기 혼합물의 가습 항온기 중에서 37℃하에 10% FBS로 보충된 RPMI-1640(미국 버지니아주 헌돈 소재의 미디아테크)에서 2.5 ㎍/㎖ 식물적혈구응집소(PHA) (미국 미주리주 세인트루이스 소재의 시그마 케미칼 캄파니) 및lO ng/㎖ 재조합 인간IL-2 (미국 미네소타주 미네아폴리스 소재의 알 앤드 디 시스템즈)로 3일간 활성화시켰다. 활성화 후에, 세포를 세척하고, 10% FBS 및 10 ng/㎖ IL-2를 보충한 RPMI에서 배양하고, 세포가 사용되는 날까지 매 3∼4일마다 공급하였다.
결합 분석
DisplaceMax 방법을 사용하여 MCF-7 및 CEM-NKr 세포 상에서 CXCR4와 케모카인 리간드의 상호작용의 전체 프로파일을 조사하였다. 이 방법에서는 전술한 바와 같은 여과 프로토콜을 사용하여 확장되고, 효능이 최대화된 방사성리간드 결합을 이용한다(Kledal T N, et al. Science 277: 1656-1659 (1997); Dairaghi, et al. J Biol Chem 274:21569-74 (1999); Gosling, J. et al. J Immunol 164:2851-6 (2000)). 이들 분석에서, DisplaceMax는 전술한 프토로콜을 사용하여 제시된 바와 같은125I 방사성표지된 SDF-1α또는 I-TAC를 대체하는 능력에 대하여 110 이상의 별개의 정제된 케모카인에 의한 MCF-7 또는 CEN-NKr 세포의 동시 질문을 사용하였다(Dairaghi, et al. J Biol Chem 274:21569-74 (1999); Gosling, J. et al. J Immnunol 164:2851-6 (2000)). 간단히 요약하면, 케모카인 성분을 세포와 함께 항온배양한 후 결합 배지(25 mM HEPES, 140 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 5 mM MgCl2및 0.2% 소 혈청 알부민, pH 7.1로 조정됨)에서 3 시간 동안 4℃에서 방사성표지된 케모카인(125I SDF-1a 또는125I h I-TAC)을 첨가하였다. 지정된 경우에, 항-CXCR4 항체 또는 아이소타입 대조군을 결합 반응에 포함시켰다. 이들 실험에서는 세포를 4℃에서30분간 지정 농도의 항체와 함께 사전 항온배양한 다음, 방사성 표지된 케모카인을 첨가한다. 지시된 경우 작은 분자를 일부 분석에 포함시켰다. 이들 분석에서는 화합물을 평판에 지정 농도로 첨가한 다음 방사성표지된 케모카인을 첨가하였다. 그 다음 모든 분석을 살짝 교반하면서 3 시간 동안 4℃에서 항온처리하였다. 모든 결합 분석에서의 항온처리 후에, 세포 수거기(팩커드)를 사용하여 반응물을 PEI-처리된 GF/B 유리 필터(팩커드)로 흡인하고, 2회 세척하였다(25 mM HEPES, 500 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 5 mM MgCl2, pH 7.1로 조정됨). 섬광체(MicroScint 10, 팩커드)를 웰에 첨가하고, 팩커드 탑카운트 신틸레이션 계수기에서 필터를 계수하였다. 프리즘(매킨토시용 GraphPad Prism version 3.Oa, GraphPad 소프트웨어)을 사용하여 데이타를 분석 및 플롯하였다.
125 I SDF-1α수용체 결합 측정
전술한 여과계 분석을 이용하여, 4℃에서 30분간 지시한 대로 세포를 1) 완충액 단독, 2) 과량의 SDF-lβ (최종 90 nM) 또는 3) MIG (최종 175 nM)과 함께 사전 항온처리하였다. 항온처리 후에, 진술된 농도로 표지되지 않은 지정 케모카인 경쟁자와125I h I-TAC를 결합 반응에 첨가하였다. 모든 분석물을 전술한 바와 같이 항온처리, 수거 및 분석하였다.
RT PCR
표준 방법을 이용하여 세포로부터 mRNA를 분리하였다. PCR로 CXCR3 및 CXCR4의 발현에 대해 상보성 DNA를 분석하였다. 인터그레이티드 DNA 테크놀러지즈(미국아이오와주의 코랄빌)로부터 특이적 프라이머를 입수하였다. 35 사이클 동안 Hybaid Omn-E(미국 캘리포니아주 사라토가 소재의 이 앤드 케이 사이언티픽 프로덕츠 인코포레이티드)로 특정 PCR 산물을 측정하였다. GAPDH를 대조군으로서 측정하였다.
침입 분석
제조자의 지시에 따라서 침입 분석을 실시하였다. 간단히 요약하면, 0.1% 소 알부민(미국 미주리주 세이트루이스 소재의 시그마 케미칼 캄파니)이 보충된 HBSS(미국 매릴랜드주 게더스버그 소재의 라이프 테크놀러지즈)에서 케모카인을 희석하고, BD BioCoat Matrigel Invasion 챔버(미국 매사츄세츠주 베드포드 소재의 비디 바이오사이언시즈)의 하부 웰에 첨가하였다. matrigel 피복된 삽입체에 MDA MB-231 세포를 첨가하고, 5% CO2/공기 혼합물의 가습 항온기에서 37℃ 하에 22 시간 동안 평판을 항온처리하였다. 항온처리 후에, 삽입체를 새로운 판으로 옮기고, 삽입체 내의 배지를 제거하였다. 면봉을 사용하여 matrigel 플러그를 각 웰로부터 제거하였다. 그 다음 프로토콜 Hema 염색 시스템(미국 뉴저지주 스웨이드보로 소재의 바이오케미칼 사이언시즈 인코포레이티드)을 사용하여 필터를 염색하였다. 40 × 렌즈를 구비한 Nikon Elipse E800 (미국 뉴욕주 멜빌 소재의 니콘 인코포레이티드) 현미경으로 침입 세포를 조사하였다. 세포를 각 필터의 5개 시계에서 계수하였다. 데이타는, 3중으로 테스트된 각 필터로부터 얻은 5개 시계의 평균을 나타낸다.
결과
최근 보고에 따르면, 일부 종양 세포 유형에서 CXCR4 발현이확인되었고(Sehgal, et al., J Surg Oncol 69:99-104(1998); Sehgal, A., et al.. J Surg Oncol 69:239-48 (1998); Burger, et al. Blood 94:3658-67 (1999); Rempel, et al. Clin Cancer Res 6:102-11 (2000); Koshiba, T. et al. Clin Cancer Res 6: 3530-5(2000); Muller, A. et al. Nature 410: 50-6 (2001); Robledo, et al. J Biol Chem 276:45098-45105(2001)), 일부 예에서는 이러한 발현이 유방 종양 세포의 전이와 연관되어 있는 것이 밝혀졌다(Muller, A. et al. Nature 410:50-6 (2001)). 종양 세포에 대한 케모카인 수용체의 역할을 추가로 조사하기 위해서, 몇가지 인간 유방 종양 세포주에서 CXCR4의 발현을 평가하였다. 초기에 유세포 분석법으로 CXCR4 발현 패턴을 평가하였다. 1차 IL-2 배양된 T 림프구와 2개의 T 세포주(즉, CEM-NKr 및 주르카트)를 조사하여 T 세포 표현형의 항-CXCR4 염색을 결정하였다. 3가지 유방 종양 세포주, 즉 MCF-7, MDA MB-231 및 MDA MB-435s를 또한 테스트하였다(도 1a). 테스트된 4가지 항-CXCR4 클론은 모두 T 세포를 염색하였다. 놀랍게도, 유방 종양 세포는 CXCR4를 발현하는 것으로 보고되어 있지만, 널리 사용되는 클론 12G5에서는 유방 종양 세포 상의 어떤 CXCR4도 검출되지 않았다. 유방 종양 세포주 상에서 테스트된 3가지 다른 클론에 의해 약하고 가변적인 반응성이 검출되었다. 또한 이 분석에서 유방 종양 세포주 DU 4475 및 ZR 75-1를 테스트하였으며(데이타는 도시되지 않음), 테스트된 다른 유방 종양 세포와 유사한 항체 염색 프로파일을 갖는 것으로 확인되었다. 따라서, CXCR4에 대한 mAb 패널의 염색 패턴은 2가지 특징적인 유형의 반응성, 즉 "백혈구" CXCR4 표현형(CEM-NKr, 주르카트 및 IL-2 림프구 염색에 의해 예시됨) 및 유방 종양 세포표현형(MCF-7 및 MDA MB-231 유방 종양 세포주 상에서의 약한 염색에 의해 예시됨)을 제시하는 것으로 생각된다.
유방 종양 세포 상에서 가장 널리 사용되는 항CXCR4 mAb, 클론 12G5를 이용할 때 반응성이 일관되게 결여되므로 RT PCR로 이들 세포에서 CXCR4 발현을 조사할 수 있다. IL-2 배양된 림프구와 CXCR4 발현에 대한 양성 대조군으로서 T 세포주, 즉 CEM-NKr 및 주르카트뿐 아니라 유세포 분석에서 테스트된 3가지 유방 종양 세포주로부터 mRNA를 분리하였다. 12G5와의 반응성이 없고 테스트된 다른 항-CXCR4 클론과의 반응성이 가변적이지만, 유방 종양 세포주 MCF-7 및 MDA MB-231은 CXCR4 메시지를 발현하지 않았다. 그러나, MDA MB-435s는 CXCR4 발현에 대해 음성인 것으로 밝혀졌다. 모든 경우에, GAPDH를 대조군으로서 측정하였다. mAb 반응성의 차이가 서열 차이에 기인하여 각종 세포주 상에서 CXCR4의 에피토프 변화를 초래할 수 있는지를 조사하기 위해서, 대표적인 CXCR4+ 유방 종양 세포로서 MCF-7과 대표적인 T 세포로서 CEM-NKr로부터 생성된 PCR 산물을 서열결정하였다. 이들 2 세포주로부터 얻은 서열은 공개된 CXCR4 서열과 동일하였으며, 이는 상이한 CXCR4 항체 프로파일에도 불구하고, 양 세포 유형에서 CXCR4의 유전자 구조와 이에 따른 폴리펩티드 구조가 동일하다는 것을 시사한다.
본 발명자들은 케모카인 리간드의 포괄 어레이에 대한 수용체 결합을 동시에 분석할 수 있는 방법 세트를 보고한 바 있다(Dairaghi, et al. J Biol Chem 274: 21569-74 (1999); Gosling, J. et al. J lmmunol 164:2851-6(2000)). 이러한 방식으로, MCF-7 세포와 비교하여 CEM-NKr 상에서의 CXCR4 결합 프로파일을 규명하였다. CEM-NKr(도 2) 또는 MCF-7 세포(도 2)에의 결합에 대한 신호 케모카인125I SDF-1α을 대체하는 능력에 대해 90 이상의 케모카인 성분을 테스트하였다. 예측한 바와 같이, CEM-NKr 상의125I SDF-1α의 유효 고친화도 경쟁자는 hSDF-1β 및 mSDF-1을 포함하며, hSDF-1α 및 HHV8 vMIP-II는 유효한 중간 정도의 친화도 경쟁을 나타낸다. 이것은 CXCR4에 대한 유일한 비바이러스성 리간드로서 이미 보고된 SDF-1의 결과와 일치한다. MCF-7 세포 상의 경쟁의 전체 패턴은 현저하게 달랐다. 이 세포 유형에서 hI-TAC 및 mI-TAC는 동일한 신호 리간드 SDF-1에 대해 높은 친화도 경쟁을 나타내었다. 이 특이한 결과를 추가로 조사하기 위해서,125I I-TAC를 MCF-7 세포 상에서 신호 리간드로서 테스트하였다(도 2). MCF-7 상에서125I I-TAC를 이용한 고 친화도 치환 프로파일은125I SDF-1α를 사용하여 얻은 프로파일과 동일하였다. 따라서, MCF-7 세포 상에서 I-TAC 및 SDF-1은 동일한 수용체 부위에 대한 결합 및 경쟁에 있어서 구별할 수 없게 작용한다.
I-TAC 및 SDF-1의 결합을 추가로 특성화하기 위해서, CEM-NKr 및 MCF-7 상에서 선택된 유효한 고 친화도 리간드를 이용한 경쟁 결합 실험에서 용량 반응 곡선을 얻었다. DisplaceMax 데이타에 의해 제시되는 바와 같이, I-TAC는 MCF-7에의 결합에 대해125I SDF-1α와 경쟁하지만, CEM-NKr에서는 그렇지 않다(도 3).125I SDF-α와 SDF-1 이소폼인 SDF-1α또는 SDF-1β와의 동족 경쟁은 CEM-NKr 및 MCF-7에서의 완전한 경쟁을 초래한다(도 3). MCF-7 상에서 발현된 수용체에 대한 SDF-1의 친화도는 CEM-NKr 상에서 발현된 수용체에 대한 친화도보다 높다. 따라서, CXCR4의 서열은 양 세포 유형에서 동일하지만, 리간드 결합 특이성 및 친화도는 T 세포 대 유방 종양 세포 상에서 다르다.
CXCR3이 오랫동안 I-TAC에 대한 주요 수용체로서 정립되어 있었기 때문에 MCF-7 세포 상에서 검출된 I-TAC 결합이 CXCR4 매개되는지 또는 CXCR3 매개되는 지를 조사하였다(Cole, K. E. et al. J Exp Med 187: 2009-21. (1998)). 이를 위해서, '고전적' CXCR3 매개된 결합(즉, 보고된 CXCR3 리간드 MIG, I-TAC 및 IP-10의 CXCR3에의 결합)을 억제하여 '고전적' CXCR4 매개된 결합(즉, 보고된 CXCR4 리간드 SDF-1의 CXCR4에의 결합)을 허용하는 조건과 전환 상황에서125I I-TAC 결합을 검사하였다. MCF-7 세포를 배지 단독, 과량의 MIG(~175 nM; CXCR3 매개 결합 억제)를 포함하는 배지 또는 과량의 SDF-1β(~90 nM; CXCR4 매개 결합 억제)를 포함하는 배지와 함께 사전 항온처리하였다. I-TAC는 MCF-7 세포에의 결합에 대해125I I-TAC와 1 nM의 IC50으로 경쟁하였으며(도 4a), 이는 I-TAC가 이들 세포에서 이 수용체에 대한 높은 친화도 리간드임을 확인시켜준다. 유사하게, 먼저 과량의 MIG와 함께 사전 항온처리된 세포는 IC50이 1 nM인 동일한 동족 I-TAC/125I I-TAC 결합 곡선을 제공하였다(도 4). 그러나, 세포를 과량의 SDF-1β로 먼저 사전처리하는 경우, 모든125I I-TAC 결합은 억제되었으며(도 4), 이는 유방 종양 세포에서 관찰된125I I-TAC결합이 CXCR4 매개되는 것임을 제시한다. MCF-7 세포에 대한125I I-TAC 결합은, IP-10이 표지되지 않은 케모카인 경쟁자로서 테스트될 때 억제되지 않았다. 또, 과량의 MIG와 함께 사전 항온처리하면 이러한 결합 프로파일이 나타나지 않았다. 그러나, SDF-1β와 세포를 사전 항온처리하면125I I-TAC 결합이 완전히 억제되었다. CXCR4 리간드 MIG를 표지되지 않은 경쟁자로서 테스트한 경우, 세포에 대한125I I-TAC 결합은 억제되지 않았다(데이타는 도시되지 않음). 도 1에 제시된 DisplaceMax 데이타로부터 예측되는 바와 같이, SDF-1β는 높은 친화도(IC50이 1 nM)로 이들 세포에의 결합에 대해125I I-TAC와 경쟁하였다. 과량의 MIG로 세포를 사전처리하면 SDF-1β/125I I-TAC 경쟁이 일어나지 않았으며, 이는 검출된 결합이 CXCR3이 아니라 CXCR4에 의해 매개된다는 것을 시사한다. 따라서, 다수의 데이타는 MCF-7 상에서 검출된 신규 결합 프로파일이 CXCR3이 아니라 CXCR4(또는 CXCR4 유사 분자)의 작용에 기인하는 것임을 확증하는 것이다.
이러한 가설은 PCR에 의해 추가로 조사되었다. 이전에 사용된 분리된 mRNA(상기 참조)를 사용하여 CXCR3 전사체의 증거를 탐색하였다. IL-2 배양된 림프구는 CXCR3을 발현하지만, 테스트된 다른 세포는 CXCR3을 발현하지 않았다. RT PCR에 의해 CXCR3 발현이 검출되지 않았다는 것은 도 4의 데이타를 뒷받침하는 것이며, 또 MCF-7 세포 상에서 I-TAC 결합이 CXCR3 매개되지 않는다는 것을 시사한다.
CXCR4의 거의 편재하는 발현은 저 분자량 유기 화합물(SMC) 치료로 이 수용체를 표적화하고자 하는 노력에 상당히 방해가 되는 것으로 생각된다. 상이한 세포 유형에서 발현된 동일한 단백질 서열이 (i) 상이한 항체 반응성 표현형; (ii) 변경된 리간드 친화도 및 (iii) 명확히 구별되는 리간드 특이성을 보유한다고 제안한 우리의 결과는, CXCR4의 T 세포 형태가 아니라 CXCR4의 유방 종양 세포 형태에 대한 길항제로서 작용하는 SMC에 대한 조사를 가능하게 한다. 2가지 고 처리량 스크린을 사용하여 SMC(거의 135,000)를 스크리닝하였다. 하나의 스크린은 백혈구 형태를 평가하기 위해 고안하였고 다른 하나는 CXCR4의 유방암 형태를 규명하기 위해 고안하였다. 이들 스크린 결과가 제시하는 바는, 2개 형태에 분명한 약리학적 차이가 가능하다는 것이다(도 5). 예를 들어, CCX0803으로 명명한 소 분자는 MCF-7에의 결합에 대하여125I SDF-1α와 46 nM의 IC50으로 경쟁하지만(도 5), SMC는 CEM-NKr 상에서125I SDF-1α 결합을 전혀 억제하지 않는다(도 5). 대조적으로, 상이한 SMC 길항제인 CCX7923은 106 nM의 IC50으로 CEM-NKr에의125I SDF-1α의 결합을 억제하지만(도 5b), MCF-7 세포상에서의125I SDF-1α의 결합은 억제하지 않는다(도 5a). 이들 2가지 화합물은 유방 종양 세포주 대 백혈구에서 차등 발현되는 CXCR4의 2가지 형태에 대한 리간드의 비상호적 결합 억제의 현저하고 확실한 패턴을 나타낸다. 결론적으로, 동일한 단백질 서열을 발현하는 상이한 세포 유형은 약리학적으로 구별되어, 질병 상태의 단백질(즉, 유방 종양 세포에서의 CXCR4)과 상이한 CXCR4 보유 세포에서 발현되는 동일한 단백질을 구별할 수 있게 된다.
유방암 세포가 다른 비종양 또는 비암성 조직에서 관찰되는 토폴로지와 다른 CXCR4의 토폴로지를 나타낸다는 것을 초기에 결정한 후에, 추가의 연구를 실시하였다. 이들 표현형 결정 연구(항체 반응성, 리간드 결합 프로파일 및 약리학적 차이를 이용함, 본 명세서에 상세하게 설명된 방법 참조)는 다수의 암(또는 종양) 세포 유형이 유방 종양 세포와 초기에 상관관계를 갖는 CXCR4 토폴로지를 나타낸다는 것을 명백하게 입증하였다. 인간 난소암, 인간 경부 선암, 인간 버킷 림프종, 인간 유선암, 인간 유관암, 인간 아교모세포종 및 마우스 유방 종양의 세포를 조사하였으며, 이들은 암 관련 CXCR4 토폴로지를 나타내었다.
마지막으로, 유방 종양 세포에서 발현된 CXCR4는 기능성이다. 침입 분석에서, SDF-1은 세포 칩입을 유도하였다. 따라서, CXCR4는 이들 세포에서만 발현되는 것은 아니지만, 리간드(SDF-1)에 의한 결합은 그 수용체를 통해 신호를 유도하여 세포가 반응하게 할 수 있어서, 세포는 필터를 통해 침입할 수 있게 된다.
종양 및 기타 암은 그 세포 성장 속도가 빠르기 때문에 부분적으로 처리하기가 곤란하다. 이러한 측면에서, 종양은 신속하게 분열하는 조기 배 조직과 일부 성장 특성을 공유하는 것으로 알려져 있다. 어떤 학파는 성체의 종양이 배아 성장 표현형에 대한 '복귀 돌연변이체'를 나타낸다고 제안한다. SDF-1 및 CXCR4 유전자 넉아웃 마우스는 배아 상태로 죽었는데, 이것이 시사하는 바는 리간드 수용체 쌍이 성장 및 발육에 중요한 성분이라는 것이다. 동형접합성 돌연변이체 SDF-1 배의 약 50%는 18.5일의 주산기에 죽었고; 나머지 동형접합성 한배 새끼는 출생 1 시간 내에 죽었다(Kishimoto, et al. Nature 382:635-638 (1996)). 유사하게, 동형접합성CXCR4 넉아웃 마우스의 ~1/3이 E18.5일의 주산기에 죽었다(Ma et al. PNAS 95:9448-9453). 수용체와 리간드 넉아웃에서는 림프구형성 및 조혈 작용의 결함이 관찰되었다. 태아 간은 11일에 마우스에서 조혈작용이 일어나는 주요 부위이며, 출생 1주까지 계속 조혈작용이 일어난다. 이 때문에, 이 구획에서 CXCR4의 암 관련 토폴로지의 발현을 조사하기로 하였다. 본 발명자들은 E17(넉아웃 동물이 죽는 시점에 가까워진 발생점) 및 E13(넛아웃 동물이 죽는 것과 별개이나, 조혈작용이 개시된 후의 발생 시점)에서 야생형 마우스 배에서의 CXCR4 발현을 조사하였다. SDF-1 결합 분석에서, 방사성표지된 인간-SDF-1은 E13 태아 간 세포에 결합하고 SDF 및 I-TAC(마우스 및 인간 단백질)는 결합을 위해 방사성표지된 추적자와 경쟁할 수 있다. SDF-1 수용체에의 I-TAC의 결합으로 예시되는 바와 같은 변경된 리간드 특이성은 처음 암 세포와 관련시킨 CXCR4의 토폴로지의 특징이다. 또한, 암 관련 토폴로지와 상호작용하는 약리제는 CXCR4의 E13 토폴로지에 대한 SDF-1의 결합과 경쟁할 수 있으나, 림프구 길항제는 그렇지 않다. 전술한 바와 같이, 그러한 약리학적 차이는 CXCR4의 상이한 토폴로지를 검출하는 능력의 또 다른 특징이다. 발생 후기에, E17 태아 간 세포는 CXCR4를 발현하지만, 이들 세포는 세포내 칼슘을 이동시켜 SDF-1에 반응한다. '림프구' 토폴로지에 대한 CXCR4 길항제는 이러한 SDF-1 매개된 칼슘 이동을 억제하지만, CXCR4 종양 토폴로지 길항제는 그러한 효과를 나타내지 않는다. 따라서, 이들 데이타는 E13 및 E17에서 야생형 태아 간 세포가 모두 CXCR4를 발현하지만, 배아 E13 및 E17에서 발현되는 CXCR4 토폴로지는 다르다는 것을 제시한다. E13 태아 간 세포에서 발현된 CXCR4 토폴로지는 종양 관련 토폴로지인 반면, E17 태아 간 세포에서 발현된 CXCR4는 림프구 관련 토폴로지이다.
또한, CXCR4의 종양 관련형은 성장 중인 종양 세포에 자극 신호를 제공할 수 있다는 것이 실험 결과 입증되었다. 특징적인 CXCR4의 토폴로지를 갖는 종양 세포는 SDF-1 자극에 반응하여 전사 또는 세포 사이클과 관련된 일부 유전자를 상향 조절시킬 수 있다. 더욱 중요한 것은, 밤새 배양물 중에서 CXCR4의 종양 관련 형태를 발현하는 종양 세포에 혈청이 부족하게 되면, 아포톱시스(세포사)를 진행하기 시작한다는 것이다. SDF-1을 첨가하여 이들 배양물을 보충하면, 미처리된 대조군과 비교하여 아사로부터 세포를 회복시킬 수 있다. 따라서, SDF-1 CXCR4는 항아포톱시스 신호로서 작용한다. 암 세포는 아포톱시스를 진행하는 능력을 상실한 세포로서 특징지워지는 경우가 흔히 있다.
실시예 2
본 실시예는 CCR1이 상이한 세포에서 다른 토폴로지를 형성함을 보여준다.
본 실시예는 또한 상이한 세포 유형에서 자연 발생적인 특정 토폴로지를 형성한다는 것을 보여준다. 본 실시예는 실시예 1을 추가로 확장하여, 상이한 세포 '배경'에서 동일한 유전자 발현이 특정 토폴로지와 성질을 갖는 표면 케모카인 수용체 단백질을 생성할 수 있다는 것을 입증한다. 따라서, 상이한 세포 유형에서의 특정 수용체 토폴로지의 존재는 유전자 차이로 인한 것이 아니라, 유전자 산물(단백질)이 발현되는 세포 유형에 의한 것이다.
CXCR4의 약리 형태의 존재를 지지하는 상기 개시된 데이타 외에, 다른 케모카인 수용체의 유효 약리형태의 존재를 조사하였다. 이 섹션에는 CCR1이 상이한 세포 유형에서 상이한 토폴로지를 나타내는 것을 보여주는 데이타가 제시되어 있다. CXCR4에서와 같이, CCR1은 CCR1이 발현되는 세포 유형에 따라 현저하게 다른 항원성 반응성을 나타낸다. 단일 cDNA 구성물을 내인성 CCR1을 발현하지 않는 상이한 세포 유형으로 형질감염시킨 연구를 기초로, 동일한 CCR1 유전자 서열의 발현이 항원적으로 서로 다르고(모노클로날 항체의 패널과의 반응성에 의해 결정됨) '천연' 세포주와 1차 세포에서 확인되는 토폴로지 프로파일을 부분적으로 반복하는 단백질 생성물을 산출할 수 있다는 것이 입증된다. CXCR4 토폴로지를 이용한 사례에서와 같이, CCR1 토폴로지는 특징적인 항원 반응성을 나타낼 뿐 아니라, 변경된 리간드 결합(특이성 및 친화도 측면에서) 및 변경된 세포 기능(예, Ca2+시그널링 및 이행 성질)을 나타낸다. 따라서, CCR1은 상이한 토폴로지를 나타내는 케모카인 수용체의 또 다른 예로서 작용하여, 상이한 세포 유형에서 발현된 유전자적으로 동일한 서열이 상이한 세포 효과 및 약리 프로파일을 나타내는 능력을 입증하는 추가의 증거를 제공한다.
항체 반응성 표현형:
주어진 수용체 유전자에 적합한 상이하게 발현된 단백질 토폴로지는 상이한 세포 유형에서 항체(예, 수용체 폴리펩티드를 나타내는 재조합 단백질에 대해 유도된 모노클로날 항체) 패널에 반응하여 상이한 염색 프로파일을 나타낼 수 있다. 이것은 케모카인 수용체 CCR1을 이용한 경우이다. 테스트된 모든 세포가 CCR1 수용체를 발현한다는 사실에도 불구하고, 5개의 상이한 모노클로날 항체(클론 1 내지 5로 명명)는 상이한 세포 유형과 다르게 반응한다. 도 6 참조. 예를 들어, 클론 5번 및2번은 형질전환체(HEK-293 및 NSO-CCR1), THP-1 세포(급성 단핵구성 백혈병), 미성숙 수지상 세포(DC) 및 호중구에서 발현된 CCR1을 인식하지만, 단핵구에서 발현된 것은 인식하지 않는다. 클론 4번은 형질전환체 및 THP-1 세포에서 CCR1을 인식하지만, 테스트된 1차 세포(단핵구, 호중구 또는 미성숙 DC)에서는 인식하지 않는다. 따라서, 동일한 단백질(CCR1)에 대해 유도된 항체는 CCR1이 발현되는 세포 유형에 따라 상이한 인식 패턴을 나타낸다.
리간드 결합:
주어진 수용체 유전자가 암호화하는 케모카인 수용체 토폴로지는 리간드 결합 프로파일이 다양할 수 있다. 이들은 상이한 리간드 결합 '핑거프린트'를 가질 수 있다(즉, 이들은 상이한 범위의 특징적인 리간드에 결합한다). 또한, 이들은 상이한 토폴로지에 대해 다른 친화도를 갖는 핑거프린트 내에서 리간드에 결합할 수 있다. 이것은 몇가지 CCR1 리간드를 이용한 경우이다. 인간 CC 케모카인 CCL23, CKβ8 및 CKβ8-1의 2가지 대안적인 스플라이스 형태가 보고된 바 있다. CKβ8은 CCL23의 99 아미노산 형태(아미노산 1-99)이고, 대안적인 스플라이스 변형체 CKβ8-1은 아미노산 1-116으로 구성된다. 양쪽 성숙 형태는 CCR1에 대한 기능성 리간드로 정해졌다. CKβ8(24-99 및 25-99)의 2개의 NH2-말단 절두 변형체가 개시된 바 있고, CCR1 상에서 CKβ8의 성숙 형태보다 휠씬 더 유효한 것으로 밝혀졌다. 여기서, 이들 2가지 CKβ8 형태, 즉 CKβ8(1-99) 및 CKβ8(25-99)과 2가지 다른 CCR1 리간드, 즉 MIP-1α 및 류코탁틴의 생물학적 활성에 초점을 맞추었다. 도 7 참조.예를 들어, HEK193-CCR1 세포상의125I MIP-1α 및 CKβ8(1-99) 경쟁에서 계산된 IC50은 64 nM이다. 그러나, NSO-CCR1 세포 상의 동일한 경쟁에서는 IC50이 3.9 nM로 계산되었다. 따라서, 상이한 세포 유형에서 동일한 단백질(CCR1)에 결합하기 위해 경쟁하는 동일한 케모카인은 매우 다른 결합 특성을 산출한다.
기능:
토폴로지를 기초로 하여, 케모카인 수용체는 상이한 세포 또는 병태생리적 상황에서 상이한 생물학적 기능을 조절하거나 부여한다. 이들 수용체는 상이한 세포 환경에서 상이한 리간드 결합 핑거프린트를 보유하여 기능(예, 세포 이동)을 차등 조절한다. 이들 수용체는 상이한 세포 환경에서 차등 커플링과 제2 메신저 시그널링에 의해(예, 상이한 G 단백질에의 결합 등에 의해) 세포 기능을 차등 조절한다. CCR1 토폴로지는 이러한 현상의 일례를 나타낸다.
예를 들어, 호중구에서 발현된 CCR1에의 리간드(즉, CKβ8(1-99)) 결합은 세포 이동을 유도하지 않는다. 그러나, 동일한 리간드(CKβ8(1-99))는 THP-1 세포, 단핵구 및 미성숙 DC 상에서 CCR1 매개된 세포 이동을 유도할 수 있다. 도 8 참조.
또한, 동일한 CCR1 리간드는 상이한 세포에서 상이한 정도로 Ca2+ 이동 신호를 유도한다. 예를 들어, CCR1 리간드 CKβ8(1-99), CKβ8(25-99), 류코택틴, MIP-1α 및 mMIP-1γ는 HEK293-CCR1, THP-1 및 단핵구에서 Ca2+를 이동시킬 수 있지만, CCR1이 호중구에서 발현된다는 사실에도 불구하고 이들 동일한 리간드는 호중구에서 Ca2+를 이동시키지 않는다. 도 9 참조.
유전자 실체:
소정의 수용체의 토폴로지는 아미노산 서열이 동일하거나 또는 매우 유사한 폴리펩티드 주쇄를 공유한다; 서열은 유전자적으로 동일하다. CCR1 단백질을 암호화하는 cDNA를 2개의 상이한 세포 유형, 즉 HEK293 및 주르카트에 형질감염시켰다. 형질감염체는 유전자적으로 동일한 CCR1을 발현함에도 불구하고 상이한 항체 반응성을 나타내었다. 도 10 참조.
본 명세서 중에 인용된 모든 공개문헌 및 특허 출원은, 각 개별 공개문헌 또는 특허 출원이 구체적 그리고 개별적으로 참고로 인용되었다고 지정된 바와 같은 정도로 참고 인용된다.
전술한 본 발명은 이해를 돕기 위한 예시 및 실시예에 의해 상세히 설명되었지만, 첨부된 특허청구범위의 취지 및 보호범위를 벗어나지 않는 일부 변화 및 변형이 실시될 수 있다는 것은 본 발명의 교시 내용으로부터 당업자에게 자명할 것이다.
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Thr Val Asn Leu Tyr Ser Ser Val Leu Ile Leu Ala 115 120 125 Phe Ile Ser Leu Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Thr Asn Ser 130 135 140 Gln Arg Pro Arg Lys Leu Leu Ala Glu Lys Val Val Tyr Val Gly Val 145 150 155 160 Trp Ile Pro Ala Leu Leu Leu Thr Ile Pro Asp Phe Ile Phe Ala Asn 165 170 175 Val Ser Glu Ala Asp Asp Arg Tyr Ile Cys Asp Arg Phe Tyr Pro Asn 180 185 190 Asp Leu Trp Val Val Val Phe Gln Phe Gln His Ile Met Val Gly Leu 195 200 205 Ile Leu Pro Gly Ile Val Ile Leu Ser Cys Tyr Cys Ile Ile Ile Ser 210 215 220 Lys Leu Ser His Ser Lys Gly His Gln Lys Arg Lys Ala Leu Lys Thr 225 230 235 240 Thr Val Ile Leu Ile Leu Ala Phe Phe Ala Cys Trp Leu Pro Tyr Tyr 245 250 255 Ile Gly Ile Ser Ile Asp Ser Phe Ile Leu Leu Glu Ile Ile Lys Gln 260 265 270 Gly Cys Glu Phe Glu Asn Thr Val His Lys Trp Ile Ser Ile Thr Glu 275 280 285 Ala Leu Ala Phe Phe His Cys Cys Leu Asn Pro Ile Leu Tyr Ala Phe 290 295 300 Leu Gly Ala Lys Phe Lys Thr Ser Ala Gln His Ala Leu Thr Ser Val 305 310 315 320 Ser Arg Gly Ser Ser Leu Lys Ile Leu Ser Lys Gly Lys Arg Gly Gly 325 330 335 His Ser Ser Val Ser Thr Glu Ser Glu Ser Ser Ser Phe His Ser Ser 340 345 350 <210> 2 <211> 355 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CCR1 chemokine receptor <400> 2 Met Glu Thr Pro Asn Thr Thr Glu Asp Tyr Asp Thr Thr Thr Glu Phe 1 5 10 15 Asp Tyr Gly Asp Ala Thr Pro Cys Gln Lys Val Asn Glu Arg Ala Phe 20 25 30 Gly Ala Gln Leu Leu Pro Pro Leu Tyr Ser Leu Val Phe Val Ile Gly 35 40 45 Leu Val Gly Asn Ile Leu Val Val Leu Val Leu Val Gln Tyr Lys Arg 50 55 60 Leu Lys Asn Met Thr Ser Ile Tyr Leu Leu Asn Leu Ala Ile Ser Asp 65 70 75 80 Leu Leu Phe Leu Phe Thr Leu Pro Phe Trp Ile Asp Tyr Lys Leu Lys 85 90 95 Asp Asp Trp Val Phe Gly Asp Ala Met Cys Lys Ile Leu Ser Gly Phe 100 105 110 Tyr Tyr Thr Gly Leu Tyr Ser Glu Ile Phe Phe Ile Ile Leu Leu Thr 115 120 125 Ile Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Val Phe Ala Leu Arg Ala 130 135 140 Arg Thr Val Thr Phe Gly Val Ile Thr Ser Ile Ile Ile Trp Ala Leu 145 150 155 160 Ala Ile Leu Ala Ser Met Pro Gly Leu Tyr Phe Ser Lys Thr Gln Trp 165 170 175 Glu Phe Thr His His Thr Cys Ser Leu His Phe Pro His Glu Ser Leu 180 185 190 Arg Glu Trp Lys Leu Phe Gln Ala Leu Lys Leu Asn Leu Phe Gly Leu 195 200 205 Val Leu Pro Leu Leu Val Met Ile Ile Cys Tyr Thr Gly Ile Ile Lys 210 215 220 Ile Leu Leu Arg Arg Pro Asn Glu Lys Lys Ser Lys Ala Val Arg Leu 225 230 235 240 Ile Phe Val Ile Met Ile Ile Phe Phe Leu Phe Trp Thr Pro Tyr Asn 245 250 255 Leu Thr Ile Leu Ile Ser Val Phe Gln Asp Phe Leu Phe Thr His Glu 260 265 270 Cys Glu Gln Ser Arg His Leu Asp Leu Ala Val Gln Val Thr Glu Val 275 280 285 Ile Ala Tyr Thr His Cys Cys Val Asn Pro Val Ile Tyr Ala Phe Val 290 295 300 Gly Glu Arg Phe Arg Lys Tyr Leu Arg Gln Leu Phe His Arg Arg Val 305 310 315 320 Ala Val His Leu Val Lys Trp Leu Pro Phe Leu Ser Val Asp Arg Leu 325 330 335 Glu Arg Val Ser Ser Thr Ser Pro Ser Thr Gly Glu His Glu Leu Ser 340 345 350 Ala Gly Phe 355 <210> 3 <211> 200 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:poly Gly flexible linker <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(200) <223> Gly at positions 6-200 may be present or absent <400> 3 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 35 40 45 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 50 55 60 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 65 70 75 80 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 85 90 95 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 145 150 155 160 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 165 170 175 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 180 185 190 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 195 200 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:amino acid sequence within second extracellular loop of chemokine receptor <400> 4 Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala 1 5

Claims (66)

  1. ⅰ. 제1 토폴로지를 갖는 케모카인 수용체를 포함하는 제1 세포와, 제2 토폴로지를 갖는 케모카인 수용체를 포함하는 제2 세포를 제공하는 단계;
    ⅱ. 1,500 달톤 미만의 제제와 상기 케모카인 수용체를 접촉시키는 단계; 및
    ⅲ. 케모카인 수용체의 제1 토폴로지에는 결합하지만, 제2 토폴로지를 갖는 케모카인 수용체에는 결합하지 않는 제제를 선택하는 단계
    를 포함하는, 제1 토폴로지를 갖는 케모카인 수용체에 결합하지만, 제2 토폴로지를 갖는 케모카인 수용체에는 결합하지 않는 제제를 동정하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제제는 600 달톤 미만인 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 방법은 세포 기능을 조절하는 제제를 선택하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 세포 기능은 세포자살, 세포 성장, 세포 증식 및 세포 이동으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 방법은 케모카인 수용체의 제1 토폴로지에 리간드가 결합함으로 인하여 유발되는 세포내 시그널링을 조절하는 제제를 선택하여, 제1 토폴로지는 갖지만, 제2 토폴로지는 갖지 않는 케모카인 수용체에 리간드가 결합함으로 인하여 유발되는 세포내 시그널링을 조절하는 제제를 동정하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 케모카인 수용체는 CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, CX3CR1, CXR1, CCXCKR(CCR11), FPRL1(CCR12), US28, ECRF3, 카포시 육종 관련 헤르페스 바이러스 GPCR, 폭스바이러스 막 결합 G 단백질-커플링된 수용체, D6 및 DARC로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 제1 세포 또는 제2 세포는 암세포인 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 암세포는 유방암 세포, 난소암 세포, 경부암 세포, 버킷 림프종 세포 및 신경교아종 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 제1 세포 또는 제2 세포는 호중구, 단핵구, 대식세포, 호산구, 호염기구, 비만 세포, 수지상 세포, 조혈 줄기 세포, 혈소판 또는 B-세포인 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 제1 세포 또는 제2 세포는 HIV 감염을 지원하지 않는것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 제1 세포 또는 제2 세포는 T-세포가 아닌 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 제제는 케모카인 수용체의 천연 리간드와 경쟁적으로 결합하는 것인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 방법은 동물에서의 세포 또는 조직 반응을 조절하는 제제를 선택하여, 동물에서의 케모카인 수용체-매개성 조직 또는 세포 반응을 조절하는 제제를 동정하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 세포 또는 조직 반응은 세포의 주화성을 포함하는 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 주화성 세포는 백혈구인 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 백혈구 주화성은 감소되는 것인 방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 백혈구 주화성은 증가하는 것인 방법.
  18. 제13항에 있어서, 상기 세포 또는 조직 반응은 암의 발생을 포함하는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 세포 또는 조직은 암세포를 포함하는 것인 방법.
  20. 제13항에 있어서, 상기 세포 또는 조직 반응은 염증을 포함하는 것인 방법.
  21. 제19항에 있어서, 상기 제제는 암이 발병한 동물에 치료학적으로 충분한 양의 제제가 투여될때 암을 감소시키는 것인 방법.
  22. 제1 토폴로지를 갖는 케모카인 수용체에는 결합하지만, 제2 토폴로지를 갖는 케모카인 수용체에는 결합하지 않는 제제로서, 상기 제제는 제1항의 방법에 의하여 동정되는 것인 방법.
  23. 제1항의 방법에 의하여 동정된 제제와 조직 샘플을 접촉시켜, 세포의 존부를 측정함으로써 조직 샘플중 케모카인 수용체의 존부를 측정하는 단계를 포함하는, 세포의 존부를 측정하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 세포는 암세포인 것인 방법.
  25. ⅰ. 제1 토폴로지를 갖는 케모카인 수용체를 포함하는 제1 세포와, 제2 토폴로지를 갖는 케모카인 수용체를 포함하는 제2 세포를 제공하는 단계;
    ⅱ. 항체와 상기 케모카인 수용체를 접촉시키는 단계; 및
    ⅲ. 케모카인 수용체의 제1 토폴로지에는 결합하지만, 제2 토폴로지를 갖는 케모카인 수용체에는 결합하지 않는 항체를 선택하는 단계
    를 포함하는, 제1 토폴로지를 갖는 케모카인 수용체에 결합하지만, 제2 토폴로지를 갖는 케모카인 수용체에는 결합하지 않는 항체를 동정하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 방법은 세포 기능을 조절하는 항체를 선택하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 세포 기능은 세포자살, 세포 성장, 세포 증식 및 세포 이동으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  28. 제25항에 있어서, 상기 방법은 케모카인 수용체의 제1 토폴로지에 리간드가 결합함으로 인하여 유발되는 세포내 시그널링을 조절하는 항체를 선택하여, 제1 토폴로지는 갖지만 제2 토폴로지는 갖지 않는 케모카인 수용체에 리간드가 결합함으로 인하여 유발되는 세포내 시그널링을 조절하는 항체를 동정하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  29. 제25항에 있어서, 상기 케모카인 수용체는 CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, CX3CR1, CXR1, CCXCKR(CCR11), FPRL1(CCR12), US28, ECRF3, 카포시 육종 관련 헤르페스 바이러스 GPCR, 폭스바이러스 막 결합 G 단백질-커플링된 수용체, D6 및 DARC로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  30. 제25항에 있어서, 상기 제1 세포 또는 제2 세포는 암세포인 것인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 암세포는 유방암 세포, 난소암 세포, 경부암 세포, 버킷 림프종 세포 및 신경교아종 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  32. 제25항에 있어서, 상기 제1 세포 또는 제2 세포는 호중구, 단핵구, 대식세포, 호산구, 호염기구, 비만 세포, 수지상 세포, 조혈 줄기 세포, 혈소판 또는 B-세포인 것인 방법.
  33. 제25항에 있어서, 상기 제1 세포 또는 제2 세포는 HIV 감염을 지원하지 않는 것인 방법.
  34. 제25항에 있어서, 상기 제1 세포 또는 제2 세포는 T-세포가 아닌 것인 방법.
  35. 제25항에 있어서, 상기 항체는 케모카인 수용체의 천연 리간드와 경쟁적으로 결합하는 것인 방법.
  36. 제25항에 있어서, 상기 방법은 동물에서의 세포 또는 조직 반응을 조절하는 항체를 선택하여, 동물에서의 케모카인 수용체-매개성 조직 또는 세포 반응을 조절하는 항체를 동정하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 세포 또는 조직 반응은 세포의 주화성을 포함하는 것인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 주화성 세포는 백혈구인 것인 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 백혈구 주화성은 감소되는 것인 방법.
  40. 제38항에 있어서, 상기 백혈구 주화성은 증가하는 것인 방법.
  41. 제36항에 있어서, 상기 세포 또는 조직 반응은 암의 발생을 포함하는 것인 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 세포 또는 조직은 암세포를 포함하는 것인 방법.
  43. 제36항에 있어서, 상기 세포 또는 조직 반응은 염증을 포함하는 것인 방법.
  44. 제42항에 있어서, 상기 항체는 암이 발병한 동물에 치료학적으로 충분한 양의 제제가 투여될때 암을 감소시키는 것인 방법.
  45. 제1 토폴로지를 갖는 케모카인 수용체에는 결합하지만, 제2 토폴로지를 갖는 케모카인 수용체에는 결합하지 않는, 제25항의 방법에 의하여 동정되는 항체.
  46. 제25항의 방법에 의하여 동정된 항체와 조직 샘플을 접촉시켜, 세포의 존부를 측정함으로써 조직 샘플중 케모카인 수용체의 존부를 측정하는 단계를 포함하는, 세포의 존부를 측정하는 방법.
  47. 제46항에 있어서, 상기 세포는 암세포인 것인 방법.
  48. 각각이 케모카인 수용체를 발현하는, 두가지 이상의 세포 유형을 제공하는 단계;
    상기 두가지 세포 유형상 케모카인 수용체에 결합하는 능력에 대하여 다수의 상이한 케모카인을 테스트하는 단계; 및
    제1 세포 유형상의 케모카인 수용체에는 결합하지만, 제2 세포 유형상의 케모카인 수용체에는 결합하지 않는 케모카인을 동정하여, 이 케모카인 수용체의 신규한 토폴로지를 동정하는 단계
    를 포함하는, 케모카인 수용체의 신규한 토폴로지를 동정하는 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 케모카인 수용체는 CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, CX3CR1, CXR1, CCXCKR(CCR11), FPRL1(CCR12), US28, ECRF3, 카포시 육종 관련 헤르페스 바이러스 GPCR, 폭스바이러스 막 결합 G 단백질-커플링된 수용체, D6 및 DARC로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  50. 제48항에 있어서, 상기 다수의 상이한 케모카인은 ITAC 및 SDF-1을 포함하고, 상기 제1 세포 유형은 상기 ITAC 및 SDF-1이 경쟁적으로 결합하는 CXCR4의 토폴로지를 포함하며, 상기 제2 세포 유형은 상기 ITAC 및 SDF-1이 경쟁적으로 결합하지 않는 CXCR4의 토폴로지를 포함하는 것인 방법.
  51. 제48항에 있어서, 상기 방법은 3가지 이상의 세포 유형을 테스트하는 것인 방법.
  52. 제48항에 있어서, 상기 방법은 10가지 이상의 케모카인을 테스트하는 것인 방법.
  53. 제48항에 있어서, 상기 케모카인은 CL1, XCL2, CX3CL1, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9, CCL10, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27 및 CCL28로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  54. 제48항에 있어서, 상기 케모카인은 고형 지지체에 고정되는 것인 방법.
  55. 제48항에 있어서, 상기 테스트 단계는 각각의 세포 유형에서 상기 케모카인이 케모카인 수용체에 결합하는 리간드와 경쟁하는 능력을 측정하는 것을 포함하는 것인 방법.
  56. 제55항에 있어서, 상기 리간드는 표지화되는 것인 방법.
  57. 제48항에 있어서, 하나 이상의 상기 세포 유형은 내생 케모카인 수용체를 발현하는 것인 방법.
  58. 제48항에 있어서, 하나 이상의 상기 세포 유형은 재조합적으로 발현된 케모카인 수용체를 발현시키는 것인 방법.
  59. 제48항에 있어서, 상기 테스트된 세포 유형은 암세포 및 비-암세포를 포함하는 것인 방법.
  60. 제1 토폴로지에서는 케모카인에 특이적으로 결합하지만, 제2 토폴로지에서는 결합하지 않는 제제와 샘플을 접촉시키는 단계; 및
    상기 제제가 샘플에 결합하는지 여부를 확인하여, 케모카인 수용체의 제1 토폴로지를 검출하는 단계
    를 포함하는, 샘플내 케모카인 수용체의 제1 토폴로지를 검출하는 방법.
  61. 세포를 포함하는 샘플을 상기 제제와 접촉시키는 단계; 및
    이 제제에 결합하는 세포를 선택하는 단계
    를 포함하는, 케모카인 수용체의 제1 토폴로지에 대하여는 특이적이지만, 제2 토폴로지에 대하여는 특이적이지 않은 제제와 결합하는 세포를 정제하는 방법.
  62. (ⅰ) 제1 토폴로지를 갖는 케모카인 수용체를 포함하는 제1 세포와, 제2 토폴로지를 갖는 케모카인 수용체를 포함하는 제2 세포를 제공하는 단계;
    (ⅱ) 케모카인 수용체와 제제를 접촉시키는 단계; 및
    (ⅲ) (a) 케모카인 수용체의 제1 토폴로지에는 결합하지만, 제2 토폴로지에는 결합하지 않고, (b) 비-바이러스 병원체가 세포에 결합하는 것을 조절하는 제제를 선택하는 단계
    를 포함하는, 비-바이러스 병원체가 세포에 결합하는 것을 조절하는 제제를 동정하는 방법.
  63. 조직 샘플내에서 I-TAC가 CXCR4에 결합하는지 여부를 측정하는 단계를 포함하는, 암세포의 동정 방법으로서, 상기 I-TAC가 CXCR4에 결합하는 것은 암세포의 존재를 나타내는 것인 암세포의 동정 방법.
  64. 제63항에 있어서, 상기 암세포는 유방암 세포, 난소암 세포, 경부암 세포, 버킷 림프종 세포 및 신경교아종 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  65. 하나 이상이 표지된, 케모카인 I-TAC 및 SDF-1; 및
    케모카인-CXCR4 결합을 측정하기 위한 고형 지지체 또는 용기
    를 포함하는, CXCR4에 I-TAC가 결합하는지를 검출하기 위한 키트.
  66. (ⅰ) 제1 입체구조를 갖는 케모카인 수용체를 포함하는 제1 세포와, 제2 토폴로지를 갖는 케모카인 수용체를 포함하는 제2 세포를 제공하는 단계;
    (ⅱ) 케모카인 수용체와 제제를 접촉시키는 단계; 및
    (ⅲ) (a) 케모카인 수용체의 제1 토폴로지에는 결합하지만, 제2 토폴로지에는 결합하지 않고, (b) 바이러스가 케모카인 수용체에 결합하는 것을 조절하는 제제를 선택하여, 제1 토폴로지는 갖지만, 제2 토폴로지는 갖지 않는 케모카인 수용체에 바이러스가 결합하는 것을 조절하는 제제를 동정하는 단계
    를 포함하는, 제1 토폴로지는 갖지만, 제2 토폴로지는 갖지 않는 케모카인 수용체에 바이러스가 결합하는 것을 조절하는 제제를 동정하는 방법.
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