JP4485204B2 - ケモカイン受容体に関連する疾患および状態の検出および治療のための組成物および方法 - Google Patents

ケモカイン受容体に関連する疾患および状態の検出および治療のための組成物および方法 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、2001年11月30日に提出された米国特許出願第（USSN）60／338,100号、2001年11月30日に提出された米国特許出願第60／337,961号、2002年9月16日に提出された米国特許出願第10／245,850号、および2002年10月1日に提出された欧州特許第02256808.3号（これらはそれぞれ、その全体がすべての目的に関して参照として本明細書に明示的に組み入れられる）の優先権を主張する。
発明の背景
ケモカインは、炎症の際に産生されて白血球の動員を調節する、低分子サイトカインのファミリーを構成している（Baggiolini, M.ら、Adv. Immunol. 55: 97-179 (1994)；Springer, T. A., Annu. Rev. Physiol. 57: 827-872 (1995)；ならびにSchall, T. J.およびK. B. Bacon、Curr. Opin. Immunol. 6: 865-873 (1994)）。ケモカインは、好中球、単球、マクロファージ、好酸球、好塩基球、マスト細胞、およびリンパ球（T細胞およびB細胞を含む）などの白血球を含む、生物学的特徴を備えた血液要素（赤血球を除く）の走化性を選択的に誘導することができる。走化性を誘発することに加えて、反応性細胞におけるその他の変化もケモカインによって選択的に誘導可能であり、これには細胞の形状の変化、細胞内遊離カルシウムイオン（Ca２＋）の濃度の一過性上昇、顆粒のエキソサイトーシス、インテグリンのアップレギュレーション、生理活性脂質（例えば、ロイコトリエン）の形成、および白血球活性化に伴う呼吸バーストが含まれる。すなわち、ケモカインは、炎症メディエーターの放出、感染部位または炎症部位への走化性および血管外遊走を引き起こす、炎症反応の初期誘因である。
ケモカインにはCXCケモカインおよびCCケモカインと命名された2つのサブファミリーがあり、これらは、保存的な4つのシステイン残基のうち最初の2つの配置が1つのアミノ酸によって隔てられているか（CXCケモカインであるSDF-1、IL-8、IP-10、MIG、PF4、ENA-78、GCP-2、GROα、GROβ、GROγ、NAP-2、NAP-4のように）、それとも隣接した残基であるか（CCケモカインであるMIP-1α、MIP-1β、RANTES、MCP-1、MCP-2、MCP-3、I-309のように）によって区別される。ほとんどのCXCケモカインは好中性白血球を誘引する。例えば、CXCケモカインであるインターロイキン8（IL-8）、血小板因子4（PF4）、および好中球活性化ペプチド2（NAP-2）は好中球に対する強力な化学誘引物質かつ活性化物質である。MIG（γインターフェロンによって誘導されるモノカイン）およびIP-10（インターフェロン-γにより誘導されうる10kDaタンパク質）と命名されたCXCケモカインは、活性化された末梢血リンパ球の走化性を誘導する活性が特に高い。CCケモカインは一般に選択性が相対的に低く、単球、好酸球、好塩基球、Tリンパ球、およびナチュラルキラー細胞を含む、さまざまな種類の白血球細胞を誘引しうる。ヒト単球走化性タンパク質1〜3（MCP-1、MCP-2、およびMCP-3）、RANTES（Regulated on Activation, Normal T Expressed and Secreted）、ならびにマクロファージ炎症タンパク質1αおよび1β（MIP-1αおよびMIP-1β）などのCCケモカインは、単球またはリンパ球に対する化学誘引物質および活性化物質として特徴づけられているが、好中球に対する化学誘引物質ではないように思われる。
CCケモカインおよびCXCケモカインは、7回膜貫通型Gタンパク質共役受容体のスーパーファミリーに属する受容体を介して作用する（Murphy, P. M., Pharmacol Rev. 52: 145-176 (2000)）。Gタンパク質共役受容体のこのファミリーは、7回膜貫通領域を含む内在性膜タンパク質の大規模な群を構成する。これらの受容体は、GTPと結合して（例えば細胞内メディエーターの産生によって）共役受容体からのシグナル伝達を媒介することができるヘテロ三量体性調節タンパク質であるGタンパク質と共役している。
一般的に言って、ケモカインとケモカイン受容体との相互作用は、1種類のケモカインが数多くのケモカイン受容体と結合可能であり、その反対に単一のケモカイン受容体が複数のケモカインと相互作用しうるという点で、乱交雑性である。この原則に反する例外が少数あり；このような例外の一つは、SDF-1とCXCR4との相互作用である（Bleulら、J Exp Med, 184(3) : 1101-9 (1996)；Oberlinら、Nature, 382(6594) : 833-5 (1996)）。SDF-1は当初、プレB細胞増殖刺激因子として同定され（Nagasawaら、Proc Natl Acad Sci USA, 91(6) : 2305-9 (1994)）、CXCR4に対するリガンドとして報告されている唯一のものである。SDF-1遺伝子は、選択的スプライシングにより、SDF-1αおよびSDF-1βと命名された2種類のタンパク質をコードする。これらの2つのタンパク質は、SDF-1βのカルボキシ末端には存在するがSDF-1αには存在しない4アミノ酸残基を除いて同一である。
SDF-1／CXCR4ケモカイン／ケモカイン受容体の対は、正常胚発生ならびにいくつかの疾病状態の重要なメディエーターであるとみなされている。CXCR4およびSDF-1の両者に関する遺伝子ノックアウトデータから、この受容体またはリガンドのいずれかの欠失は胚にとって致死的であることが判明している（Loetscherら、J Biol Chem, 269(1) : 232-7 (1994)；Maら、Proc Natl Acad Sci USA, 95(16) : 9448-53 (1998)；Zouら、Nature, 393(6685) : 595-9 (1998)）。さらに、このリガンド／受容体の対はHIV感染において役割を果たし（Bleulら、Nature, 382(6594) : 829-33 (1996)；Dengら、Nature, 381(6584) : 661-6 (1996)；Fengら、Science, 272(5263) : 872-7 (1996)）、HIVの発病とも関連づけられている。CXCR4がアポトーシスを誘導することができ、この経路がSDF-1によって阻害されうる（Berndtら、、Proc Natl Acad Sci USA、95(21): 12556-61 (1998)）ということも、SDF-1およびCXCR4が密接な関連のあるケモカイン／ケモカイン受容体の対であるという所見をさらに裏づける。
ごく最近では、SDF-1およびCXCR4は乳癌の転移に役割を果たす可能性があるとみなされている（Mullerら、Nature, 410(6824) : 50-6 (2001)）。CXCR4の発現が乳房腫瘍細胞で検出されており、一方、SDF-1レベルの上昇はリンパ節、肺、肝臓、および骨髄といった転移性増殖臓器では同定されるが、腫瘍が検出されない他の臓器では同定されなかった。さらに、この転移性増殖は抗CXCR4抗体の添加によって阻害可能であり、このことはこのリガンド受容体対が腫瘍転移において役割を果たすという仮説を裏づける。
CCR1遺伝子は、7回膜貫通型形態を有すると予想される355アミノ酸を含む、βケモカイン受容体またはCCケモカイン受容体のファミリーのメンバーの1つをコードする（Neote, Kら、Cell 72: 415-425 (1993)）。この受容体のリガンドにはMIP-1α、RANTES、MCP-3、およびMPIF-1が含まれる。CCR1受容体はヒト白血球上に広く発現され、Gタンパク質性のシグナル伝達を媒介しうる上、炎症および感染の部位へのエフェクター免疫細胞の動員に不可欠である。ヒトCCR1タンパク質（配列番号：2）はマウスにおいて抗原性があり、特異的マウス抗ヒトCCR1モノクローナル抗体は広く入手可能である（R&D Systems, Pharmingen）。マウス相同体のノックアウト試験により、この遺伝子の、炎症反応に対する宿主防御、ウイルスおよび寄生生物に対する感受性の調節における役割、さらには移植後の拒絶反応および寛容における役割が示唆されている。この遺伝子、およびCCR2、CCR3、CCR5を含む他のケモカイン受容体遺伝子は、ヒト染色体3p21上に遺伝子クラスターを形成していることが明らかになっている（Murphy, P. M., Pharmacol Rev. 52: 145-176 (2000)）。
ケモカイン受容体シグナル伝達およびリガンドに対する選択性については、これまで解明されていない側面が数多くある。本発明はこれらの問題および他の問題を取り扱う。
発明の簡単な概要
本発明は、第1のトポロジーを有するケモカイン受容体とは結合するが第2のトポロジーを有するケモカイン受容体とは結合しない作用物質を同定する方法を提供する。いくつかの面において、本方法は以下を含む：i. 第1のトポロジーを有するケモカイン受容体を含む第1の細胞、および第2のトポロジーを有するケモカイン受容体を含む第2の細胞を提供する工程；ii. 1,500ダルトン未満の作用物質をケモカイン受容体と接触させる工程；ならびにiii. ケモカイン受容体の第1のトポロジーとは結合するが第2のトポロジーを有するケモカイン受容体とは結合しない作用物質を選択する工程。いくつかの面において、作用物質は600ダルトン未満である。
いくつかの面において、本方法はさらに、細胞機能を調節する作用物質を選択する工程を含む。いくつかの面において、細胞機能は、アポトーシス、細胞成長、細胞増殖、および細胞移動からなる群より選択される。
いくつかの面において、本方法はさらに、ケモカイン受容体の第1のトポロジーに対するリガンド結合によって誘発される細胞内シグナル伝達を調節する作用物質を選択し、それにより、第1のトポロジーを有するケモカイン受容体へのリガンド結合によっては誘発されるが第2のトポロジーを有するものへの結合によっては誘発されない細胞内シグナル伝達を調節する作用物質を同定することを含む。いくつかの面において、作用物質は、ケモカイン受容体の第1のトポロジーに対するリガンドの結合に反応した細胞内カルシウムの動員を調節する。
いくつかの面において、ケモカイン受容体は、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CX3CR1、CXR1、CCXCKR（CCR11）、FPRL1（CCR12）、US28、ECRF3、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスGPCR、ポックスウイルス膜結合Gタンパク質共役受容体、D6、およびDARCからなる群より選択される。
いくつかの面において、第1の細胞または第2の細胞は癌細胞である。いくつかの面において、癌細胞は、乳癌細胞、卵巣癌細胞、子宮頸癌細胞、バーキットリンパ腫細胞、および膠芽腫細胞からなる群より選択される。いくつかの面において、第1の細胞または第2の細胞は、好中球、単球、マクロファージ、好酸球、好塩基球、マスト細胞、樹状細胞、造血幹細胞、血小板、またはB細胞である。いくつかの面において、第1の細胞または第2の細胞はHIV感染の担体とはならない。いくつかの面において、第1の細胞または第2の細胞はT細胞ではない。
いくつかの面において、作用物質は、ケモカイン受容体の天然リガンドと結合に関して競合する。
いくつかの面において、本方法はさらに、動物における細胞応答または組織応答を調節する作用物質を選択し、それにより、動物におけるケモカイン受容体を介した組織応答または細胞応答を調節する作用物質を同定することを含む。いくつかの面において、細胞応答または組織応答には細胞の走化性が含まれる。いくつかの面において、走化性細胞は白血球である。いくつかの面において、白血球の走化性は低下する。いくつかの面において、白血球の走化性は上昇する。いくつかの面において、細胞応答または組織応答には癌の発生が含まれる。いくつかの面において、細胞または組織には癌細胞が含まれる。いくつかの面において、細胞応答または組織応答には炎症が含まれる。いくつかの面において、作用物質は、癌を有する動物に治療的に十分な量の作用物質が投与された場合に、癌を縮小させる。
本発明はまた、以上に提示した方法のいずれかによって同定される作用物質も提供する。
本発明はまた、癌細胞を同定する方法であって、以上に挙げた方法によって同定された作用物質が組織試料中のCXCR4と結合するか否かを判定する工程を含み、ここで、作用物質のCXCR4との結合によって癌の存在が示されるような方法も提供する。
本発明はまた、第1のトポロジーを有するケモカイン受容体とは結合するが第2のトポロジーを有するケモカイン受容体とは結合しないケモカインを同定する方法も提供する。いくつかの面において、本方法は以下を含む：i. 第1のトポロジーを有するケモカイン受容体を含む第1の細胞、および第2のトポロジーを有するケモカイン受容体を含む第2の細胞を提供する工程；ii. ケモカインをケモカイン受容体と接触させる工程；ならびにiii. ケモカイン受容体の第1のトポロジーとは結合するが第2のトポロジーを有するケモカイン受容体とは結合しないケモカインを選択する工程。
いくつかの面において、ケモカインは、ケモカイン受容体の第1のトポロジーに対するリガンドの結合に反応した細胞内カルシウムの動員を調節する。いくつかの面において、ケモカイン受容体は、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CX3CR1、CXR1、CCXCKR（CCR11）、FPRL1（CCR12）、FPRL1（CCR12）、US28、ECRF3、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスGPCR、ポックスウイルス膜結合Gタンパク質共役受容体、D6、およびDARCからなる群より選択される。
いくつかの面において、第1の細胞または第2の細胞は癌細胞である。いくつかの面において、癌細胞は、乳癌細胞、卵巣癌細胞、子宮頸癌細胞、バーキットリンパ腫細胞、および膠芽腫細胞からなる群より選択される。いくつかの面において、第1の細胞または第2の細胞は、好中球、単球、マクロファージ、好酸球、好塩基球、マスト細胞、樹状細胞、造血幹細胞、血小板、またはB細胞である。いくつかの面において、第1の細胞または第2の細胞はHIV感染の担体とはならない。いくつかの面において、第1の細胞または第2の細胞はT細胞ではない。
いくつかの面において、本方法はさらに、動物における細胞応答または組織応答を調節するケモカインを選択し、それにより、動物におけるケモカイン受容体を介した組織応答または細胞応答を調節するケモカインを同定することを含む。いくつかの面において、細胞応答または組織応答には細胞の走化性が含まれる。いくつかの面において、走化性細胞は白血球である。いくつかの面において、白血球の走化性は低下する。いくつかの面において、白血球の走化性は上昇する。いくつかの面において、細胞応答または組織応答には癌の発生が含まれる。いくつかの面において、細胞または組織には癌細胞が含まれる。いくつかの面において、細胞応答または組織応答には炎症が含まれる。
本発明はまた、第1のトポロジーを有するケモカイン受容体とは結合するが第2のトポロジーを有するケモカイン受容体とは結合しない抗体を同定する方法も提供する。いくつかの面において、本方法は以下を含む：i. 第1のトポロジーを有するケモカイン受容体を含む第1の細胞、および第2のトポロジーを有するケモカイン受容体を含む第2の細胞を提供する工程；ii. 抗体をケモカイン受容体と接触させる工程；ならびにiii. ケモカイン受容体の第1のトポロジーとは結合するが第2のトポロジーを有するケモカイン受容体とは結合しない抗体を選択する工程。
いくつかの面において、本方法はさらに、細胞機能を調節する抗体を選択する工程を含む。いくつかの面において、細胞機能は、アポトーシス、細胞成長、細胞増殖、および細胞移動からなる群より選択される。
いくつかの面において、本方法はさらに、ケモカイン受容体の第1のトポロジーに対するリガンド結合によって誘発される細胞内シグナル伝達を調節する抗体を選択し、それにより、第1のトポロジーを有するケモカイン受容体に対するリガンド結合によっては誘発されるが第2のトポロジーを有するものとの結合によっては誘発されない細胞内シグナル伝達を調節する作用物質を同定することを含む。いくつかの面において、抗体は、ケモカイン受容体の第1のトポロジーに対するリガンドの結合に反応した細胞内カルシウムの動員を調節する。いくつかの面において、ケモカイン受容体は、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CX3CR1、CXR1、CCXCKR（CCR11）、FPRL1（CCR12）、US28、ECRF3、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスGPCR、ポックスウイルス膜結合Gタンパク質共役受容体、D6、およびDARCからなる群より選択される。
いくつかの面において、第1の細胞または第2の細胞は癌細胞である。いくつかの面において、癌細胞は、乳癌細胞、卵巣癌細胞、子宮頸癌細胞、バーキットリンパ腫細胞、および膠芽腫細胞からなる群より選択される。いくつかの面において、第1の細胞または第2の細胞は、好中球、単球、マクロファージ、好酸球、好塩基球、マスト細胞、樹状細胞、造血幹細胞、血小板、またはB細胞である。いくつかの面において、第1の細胞または第2の細胞はHIV感染の担体とはならない。いくつかの面において、第1の細胞または第2の細胞はT細胞ではない。いくつかの面において、抗体はケモカイン受容体の天然リガンドと結合に関して競合する。
いくつかの面において、本方法はさらに、動物における細胞応答または組織応答を調節する抗体を選択し、それにより、動物におけるケモカイン受容体を介した組織応答または細胞応答を調節する抗体を同定することを含む。いくつかの面において、細胞応答または組織応答には細胞の走化性が含まれる。いくつかの面において、走化性細胞は白血球である。いくつかの面において、白血球の走化性は低下する。いくつかの面において、白血球の走化性は上昇する。いくつかの面において、細胞応答または組織応答には癌の発生が含まれる。いくつかの面において、細胞または組織には癌細胞が含まれる。いくつかの面において、細胞応答または組織応答には炎症が含まれる。いくつかの面において、抗体は、癌を有する動物に治療的に十分な量の作用物質が投与された場合に癌を縮小させる。
本発明はまた、以上に提示した方法によって同定される抗体も提供する。
本発明はまた、癌細胞を同定する方法であって、以上に挙げた方法によって同定された抗体が組織試料中のCXCR4と結合するか否かを判定する工程を含み、この際、抗体とCXCR4との結合によって癌の存在が示されるような方法も提供する。
本発明はまた、ケモカイン受容体の新規なトポロジーを同定する方法も提供する。いくつかの面において、本方法は、それぞれの細胞種がケモカイン受容体を発現する、少なくとも2つの細胞種を提供する工程；2つの細胞種上のケモカイン受容体と結合する能力に関して複数の異なるケモカインの試験を行う工程；および、第1の細胞種上のケモカイン受容体とは結合するが第2の細胞種上のケモカイン受容体とは結合しないケモカインを同定し、それによってケモカイン受容体の新規なトポロジーを同定する工程、を含む。
いくつかの面において、ケモカイン受容体は、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CX3CR1、CXR1、CCXCKR（CCR11）、（CCR12）、US28、ECRF3、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスGPCR、ポックスウイルス膜結合Gタンパク質共役受容体、D6、およびDARCからなる群より選択される。
いくつかの面において、複数の異なるケモカインにはITACおよびSDF-1が含まれ、第1の細胞種は、ITACおよびSDF-1がそれに対する結合に関して競合するCXCR4のトポロジーを含み、第2の細胞種は、ITACおよびSDF-1がそれに対する結合に関して競合しないCXCR4のトポロジーを含む。いくつかの面においては、少なくとも3種の細胞種の試験を行う。いくつかの面においては、少なくとも10種のケモカインの試験を行う。
いくつかの面において、ケモカインは、CL1、XCL2、CX3CL1、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、およびCCL28からなる群より選択される。いくつかの面において、ケモカインは固体支持体に対して係留される。
いくつかの面において、試験の段階は、各細胞種において、ケモカインが、ケモカイン受容体と結合するリガンドと競合する能力を決定することを含む。いくつかの面において、リガンドは標識される。
いくつかの面においては、少なくとも1つの細胞種が内因性ケモカイン受容体を発現する。いくつかの面においては、少なくとも1つの細胞種が、組換え的に発現されるケモカイン受容体を発現する。いくつかの面において、被験細胞種は癌細胞および非癌細胞を含む。
本発明はまた、試料中のケモカイン受容体の第1のトポロジーを検出する方法も提供する。いくつかの態様において、本方法は以下を含む：試料を、第1のトポロジーとは結合するが第2のトポロジーとは結合しない作用物質と接触させる工程、および、作用物質が試料と結合するか否かを検出し、それによってケモカイン受容体の第1のトポロジーを検出する工程。いくつかの態様において、作用物質は抗体である。いくつかの態様において、試料はヒト由来のものである。いくつかの態様において、作用物質の結合は、ケモカイン受容体と関連のある疾患または状態の存在または欠如を示す。いくつかの態様において、疾患は、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、バーキットリンパ腫関連癌、および膠芽腫関連癌からなる群より選択される。いくつかの態様において、ケモカイン受容体はCXCR4である。いくつかの態様において、作用物質は、乳癌細胞、卵巣癌細胞、子宮頸癌細胞、バーキットリンパ腫細胞、または膠芽腫細胞におけるCXCR4と接触した場合にはCXCR4と特異的に結合するが、リンパ球におけるCXCR4と接触した場合にはCXCR4と結合しない。いくつかの態様において、乳癌細胞はMCF-7である。いくつかの態様において、ケモカイン受容体はCCR1である。いくつかの態様において、作用物質は、未熟樹状細胞または好中球におけるCCR1と接触した場合にはCCR1と特異的に結合するが、単球において発現されたCCR1と接触した場合にはCCR1と結合しない。
本発明はまた、動物におけるケモカイン受容体と関連のある疾患または状態を治療する方法であって、上記のようにして同定された作用物質の治療量を、それを必要とする動物に対して投与することを含む方法も提供する。いくつかの態様において、疾患は、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、バーキットリンパ腫関連癌、および膠芽腫関連癌からなる群より選択される。いくつかの態様において、作用物質には抗体が含まれる。いくつかの態様において、作用物質は免疫毒素である。いくつかの態様において、動物はヒトである。いくつかの態様において、疾患は炎症性疾患である。
本発明はまた、ケモカイン受容体の第1のトポロジーに対しては特異的であるが第2のトポロジーに対しては特異的でない作用物質と結合する細胞を精製する方法を提供する。いくつかの態様において、本方法は以下を含む：細胞を含む試料を、第1のトポロジーとは結合するが第2のトポロジーとは結合しない作用物質と接触させる工程；および、作用物質と結合する細胞を選択する工程。いくつかの態様において、作用物質は抗体である。いくつかの態様において、作用物質は、第1のトポロジーのリガンドであるが、第2のトポロジーのリガンドではない。いくつかの態様において、細胞は白血球である。
本発明はまた、非ウイルス性病原体と細胞との結合を調節する作用物質を同定する方法も提供する。いくつかの態様において、本方法は以下を含む：（i）第1のトポロジーを有するケモカイン受容体を含む第1の細胞、および第2のトポロジーを有するケモカイン受容体を含む第2の細胞を提供する工程；（ii）作用物質をケモカイン受容体と接触させる工程；ならびに（iii）（a）ケモカイン受容体の第1のトポロジーとは結合するが第2のトポロジーとは結合しない、かつ（b）非ウイルス性病原体と細胞との結合を調節する作用物質を選択する工程。いくつかの態様において、病原体は寄生生物または細菌である。いくつかの態様において、第1の細胞は非ウイルス性病原体に感染している。いくつかの態様において、ケモカイン受容体は、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CX3CR1、CXR1、CCXCKR（CCR11）、（CCR12）、US28、ECRF3、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスGPCR、ポックスウイルス膜結合Gタンパク質共役受容体、D6、およびDARCからなる群より選択される。
本発明はまた、MCF-7細胞におけるCXCR4とは特異的に結合するが、リンパ球におけるCXCR4とは結合しない抗体も提供する。
本発明はまた、好中球におけるCCR1とは特異的に結合するが、単球におけるCCR1とは結合しない抗体も提供する。
本発明はまた、生検試料中の癌細胞を同定する方法も提供する。いくつかの態様において、本方法は、I-TACが組織試料中のCXCR4と結合するか否かを判定する工程を含み、この際、I-TACとCXCR4との結合によって癌細胞の存在が示される。いくつかの態様において、本方法は、組織生検試料を提供する工程；および、組織が、I-TACと結合するCXCR4のトポロジーを含む細胞を含むか否かを判定する工程を含み、この際、I-TACと結合するCXCR4のトポロジーの存在によって癌細胞の存在が示される。これらの態様のいくつかにおいて、I-TACの結合は、CXCR4結合アッセイ法においてI-TACがSDF-1と競合するか否かを試験することによって判定される。いくつかの態様において、癌細胞は、乳癌細胞、卵巣癌細胞、子宮頸癌細胞、バーキットリンパ腫細胞、および膠芽腫細胞からなる群より選択される。
本発明はまた、CXCR4とのI-TAGの結合を検出するためのキットも提供する。いくつかの態様において、キットは、ケモカインI-TACおよびSDF-1（この際、ケモカインの少なくとも1つは標識されている）；ならびに、ケモカイン-CXCR4結合を測定するための固体支持体または容器を含む。いくつかの態様において、キットは、I-TACと特異的に結合する抗体を含む。いくつかの態様において、キットは、ケモカイン競合結合アッセイ法に用いるための塩緩衝液または他の試薬を含む。
本発明はまた、第1のトポロジーを有するケモカイン受容体に対するウイルス結合を調節するが第2のトポロジーを有するものについては調節しない作用物質を同定する方法も提供する。いくつかの態様において、本方法は以下を含む：（i）第1のコンフォメーションにあるケモカイン受容体を含む第1の細胞、および第2のトポロジーを有するケモカイン受容体を含む第2の細胞を提供する工程；（ii）作用物質をケモカイン受容体と接触させる工程；ならびに（iii）（a）ケモカイン受容体の第1のトポロジーとは結合するが第2のトポロジーとは結合しない、かつ（b）ケモカイン受容体に対するウイルス結合を調節する作用物質を選択し、それにより、第1のトポロジーを有するケモカイン受容体に対するウイルス結合を調節するが第2のトポロジーを有するものについては調節しない作用物質を選択する工程。
いくつかの態様において、ウイルスは、レトロウイルスおよびポックスウイルスからなる群より選択される。いくつかの態様において、レトロウイルスはレンチウイルスである。いくつかの態様において、レンチウイルスはヒト免疫不全ウイルスである。いくつかの態様において、ポックスウイルスはレポリポックスウイルスである。いくつかの態様において、レポリポックスウイルスは粘液腫ウイルスである。
いくつかの態様において、ケモカイン受容体は、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CX3CR1、CXR1、CCXCKR（CCR11）、（CCR12）、US28、ECRF3、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスGPCR、ポックスウイルス膜結合Gタンパク質共役受容体、D6、およびDARCからなる群より選択される。いくつかの態様において、第1の細胞は白血球である。いくつかの態様において、白血球はT細胞である。いくつかの態様において、作用物質は、ケモカイン受容体との結合に関してウイルスと競合する。
本発明はまた、第1のトポロジーを有するケモカイン受容体とは結合するが第2のトポロジーを有するものとは結合しないウイルスによる感染症を治療または予防する方法も提供する。いくつかの態様において、本方法は、上記のようにして同定された作用物質の治療量を、それを必要とする動物に対して投与することを含む。いくつかの態様において、ウイルスは、レトロウイルスおよびポックスウイルスからなる群より選択される。いくつかの態様において、レトロウイルスはレンチウイルスである。いくつかの態様において、レンチウイルスはヒト免疫不全ウイルスである。いくつかの態様において、ポックスウイルスはレポリポックスウイルスである。いくつかの態様において、レポリポックスウイルスは粘液腫ウイルスである。いくつかの態様において、動物はヒトである。
本発明はまた、癌細胞においてアポトーシスを誘導する方法も提供する。いくつかの態様において、本方法は、癌細胞をSDF-1アンタゴニストと接触させる工程を含む。いくつかの態様において、癌細胞は、乳癌細胞、卵巣癌細胞、子宮頸癌細胞、バーキットリンパ腫細胞、および膠芽腫細胞からなる群より選択される。
定義
「抗体」とは、分析物（抗原）と特異的に結合してそれを認識する、1つまたは複数の免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされるポリペプチドまたはその断片のことを指す。一般に認められている免疫グロブリン遺伝子には、κ、λ、α、γ、δ、ε、およびμ定常領域遺伝子のほか、無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖はκまたはλのいずれかに分類される。重鎖はγ、μ、α、δ、またはεに分類され、これによってそれぞれIgG、IgM、IgA、IgD、およびIgEという免疫グロブリンのクラスが規定される。
典型的な免疫グロブリン（抗体）の構造単位は四量体から構成される。各四量体は2つの同一なポリペプチド鎖の対から構成され、それぞれの対は1つの「軽鎖」（約25kDa）および1つの「重鎖」（約50〜70kDa）を有する。各鎖のN末端には、抗原認識の主な原因となる約100〜110またはそれ以上のアミノ酸からなる可変領域が定められている。可変軽鎖（VＬ）および可変重鎖（VＨ）という用語はそれぞれ、これらの軽鎖および重鎖のことを指す。
抗体は、例えば、完全な免疫グロブリン、または種々のペプチダーゼによる消化によって生じる、詳細に特徴づけられている数多くの断片として存在する。すなわち、例えばペプシンは、ヒンジ領域のジスルフィド結合の下方で抗体を切断し、ジスルフィド結合によってVＨ-CＨ1と連結した軽鎖であるFabの二量体、F(ab)'２を生成する。ヒンジ領域のジスルフィド結合を切断するためにF(ab)'２を穏和な条件下で還元し、それによってF(ab)'２二量体をFab'単量体に変換することもできる。Fab'単量体は本質的にはヒンジ領域の一部を伴うFabである（Paul（編）「Fundamental Immunology」第3版、Raven Press, NY (1993)を参照されたい）。さまざまな抗体断片が完全抗体の消化の見地から定義されているが、当業者は、このような断片を化学的または組換えDNA法を用いて新規に合成しうることを理解すると考えられる。このため、本明細書で用いる抗体という用語には、抗体全体の改変によって生じる抗体断片、または組換えDNA法を用いて新規に合成されたもの（例えば、一本鎖Fv）も含まれる。
「細胞応答または組織応答」とは、細胞または組織の状態の変化のことを指し、これにはケモカインリガンドのケモカイン受容体との結合によって誘導される細胞応答が含まれる。ケモカイン受容体によって誘発されうる明確になっている応答には、膜貫通性シグナル伝達、細胞質シグナル伝達カスケードの活性化、細胞骨格再構成、接着、走化性、浸潤、転移、サイトカイン産生、遺伝子誘導、遺伝子抑制、タンパク質発現の誘導、または細胞増殖および分化の変調（癌の発生を含む）が含まれる。
「ケモカイン」または「ケモカインリガンド」とは、約50〜110アミノ酸から構成され、他の既知のケモカインと配列相同性がある低分子タンパク質のことを指す（例えば、Murphy, P.M., Pharmacol Rev. 52: 145-176 (2000)を参照されたい）。ケモカインは、アミノ酸一次配列に存在するシステイン（C）の第1の対の相対位置に従って分類される。CXCLケモカインでは、システインの第1の対は任意の単一のアミノ酸によって区分されている。CCLケモカインではシステインが隣接している。CX3CLケモカインでは、第1のシステイン対は3アミノ酸によって区分されている。CLケモカインは、相同な位置の内部にシステインを1つしか含んでいない。ケモカインは、ケモカイン受容体と結合してそれを活性化することにより、生体機能を誘発することができる。
「ケモカイン受容体」とは、ケモカイン分子と特異的に相互作用するポリペプチドのことを指す。ケモカイン受容体は、7回膜貫通ドメインを備えたGタンパク質共役受容体である。ケモカイン受容体には共通した構造上の特徴がいくつかあり、これには、酸性度の高いN末端ドメイン；第2の細胞外ループに存在するアミノ酸配列DRYLAIVHA（配列番号：4）（またはその配列が少々変化したもの）；全体として塩基性電荷を有する短い第3の細胞内ループ；4つの細胞外ドメインのそれぞれの内部のシステイン残基が含まれる。通常、ケモカイン受容体の全体のサイズは約340〜370アミノ酸残基である。例えば、Murphy, P.M.、「Chemokine Receptors; Overview」、Academic Press 2000；ならびにLoetscher P.およびClark-Lewis I. J. Leukocyte Biol. 69: 881 (2001)における総説を参照されたい。代表的なケモカイン受容体には、例えば、CCケモカイン受容体（CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、およびCCR10を含む）、CXCケモカイン受容体（CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、およびCXCR6を含む）、CX3CR1、CXR1、CCXCKR（CCR11）、ウイルスにコードされたケモカイン受容体であるUS28、ECRF3、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスGPCR、ポックスウイルス膜結合Gタンパク質共役受容体；D6およびDARCが含まれる。
「ペプチド模倣物」および「模倣物」という用語は、ケモカイン受容体のアンタゴニストまたはアゴニストと実質的に同じ構造的および機能的な特徴を有する合成化合物のことを指す。ペプチド類似体は一般に、テンプレートペプチドと類似した特性を備えた非ペプチド薬として製薬産業で用いられている。この種の非ペプチド化合物は「ペプチド模倣物（peptide mimetic）」または「ペプチド模倣物（peptidomimetic）」と呼ばれる（Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15: 29 (1986)；VeberおよびFreidinger、TINS p. 392 (1985)；ならびにEvansら、J. Med. Chem. 30: 1229 (1987)、これらは参照として本明細書に組み入れられる）。治療的に有用なペプチドと構造的に類似しているペプチド模倣物は、同等または向上した治療効果または予防効果を得るために用いることができる。一般に、ペプチド模倣物は模範ポリペプチド（すなわち、生物活性または薬理活性を有するポリペプチド）と構造的に類似しているが、例えばCH2NH-、-CH2S、-CH2-CH2-、-CH=CH-（シスおよびトランス）、-COCH2-、-CH(OH)CH2-、およびCH2SO-などからなる群より選択される連鎖によって随意に置換された1つまたは複数のペプチド連鎖を有する。模倣物は合成性で非天然性のアミノ酸類似体からすべて構成されてもよく、または、一部が天然ペプチドアミノ酸で一部が非天然性のアミノ酸類似体であるキメラ分子であってもよい。模倣物はまた、天然アミノ酸の保存的置換物の任意の量を、このような置換が模倣物の構造および／または活性を実質的に変化させない限り、包含しうる。例えば、模倣性組成物は、それがケモカイン受容体の活性または機能を阻害または増強しうるならば、本発明の範囲に含まれる。
「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖の産生に関与するDNAのセグメントのことを意味する；これには、コード領域（リーダーおよびトレーラー）の前および後の領域、さらには個々のコードセグメント（エクソン）の間の介在配列（イントロン）も含まれる。
「単離された」という用語は、核酸またはタンパク質に適用される場合、核酸またはタンパク質が、天然の状態でそれに付随する他の細胞成分を本質的に含まないことを示す。これは均一な状態にあることが好ましいが、乾燥していても水溶液中にあってもよい。純度および均一性は通常、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学の技法を用いて決定される。調製物中に存在する最も多数を占める種であるタンパク質は、実質的に精製されている。特に、単離された遺伝子は、その遺伝子に隣接して目的の遺伝子以外のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームから分離されている。「精製された」という用語は、核酸またはタンパク質が、電気泳動ゲル中に本質的には1つのバンドを生じることを表す。これは詳細には、核酸またはタンパク質の純度が、少なくとも85％、より好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも99％であることを意味する。
「リガンド」とは、ケモカイン受容体と結合しうる作用物質、例えば、別の分子のポリペプチドのことを指す。
本明細書で用いる場合、「ケモカインのあるトポロジーと結合する作用物質」とは、高い親和性で結合する作用物質のことを指す。「高親和性」とは、薬理的に意味のある応答を誘導するのに十分な親和性、例えば、ケモカイン受容体に対する結合に関して、薬学的に意味のある濃度（例えば、約10−５M未満の濃度）で、天然のケモカインリガンドと競合しうることを指す。例えば、実施例1および図5を参照されたい。高親和性を備えた代表的な作用物質のいくつかは、ケモカイン受容体のあるトポロジーと、10−６Mを上回る親和性で、時には10−７Mまたは10−８Mを上回る親和性で結合すると考えられる。作用物質が10−４M未満の濃度である場合に、天然の受容体リガンドと結合に関して競合することができない作用物質は、本発明の目的に関しては「結合しない」とみなされる。
「ウイルス結合」とは、ウイルス粒子、またはウイルスエンベロープタンパク質もしくはその断片といったウイルスの一部分が、タンパク質（例えば、ケモカイン受容体）などの標的成分と結合する能力のことを指す。結合は、結合親和性を決定するための標準的なアッセイ法を用いて測定することができる。この種のアッセイ法には、例えば、競合結合試験が含まれる。
「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、および、一本鎖または二本鎖の形態にあるそれらの重合体のことを指す。特に限定されない限り、この用語には、参照核酸と同程度の結合特性を有し、天然ヌクレオチドと類似した様式で代謝される、天然ヌクレオチドの既知の類似体が含まれる。別に指示しない限り、個々の核酸配列には、明示的に指定された配列のほかに、保存的に改変されたその変種（例えば、縮重コドン置換物）および相補的配列が暗黙的に含まれる。詳細には、縮重コドン置換は、1つまたは複数の選択した（またはすべての）コドンの第3の位置が、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基によって置換された配列を生じさせることによって行いうる（Batzerら、Nucleic Acids Res. 19: 5081 (1991)；Ohtsukaら、J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985)；およびCassolら(1992)；Rossoliniら、Mol. Cell. Probes 8: 91-98 (1994)）。核酸という用語は、遺伝子、cDNA、および遺伝子によってコードされるmRNAと互換的に用いられる。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書において、アミノ酸残基の重合体を指す目的で互換的に用いられる。これらの用語は、天然アミノ酸重合体および非天然アミノ酸重合体のほか、1つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工的な化学的模倣物であるアミノ酸重合体に対しても適用される。本明細書で用いる場合、これらの用語には、アミノ酸残基が共有ペプチド結合によって連結された、完全長タンパク質（すなわち、抗原）を含む任意の長さのアミノ酸鎖が含まれる。
「トポロジー」とは、コンフォメーションを非制限的に含む、分子の三次元構造を指す。1つのポリペプチドは、ポリペプチドのアミノ酸残基が複数の異なる構造を形成しうる場合、2種類またはそれ以上のトポロジーを形成しうる。ある特定のアミノ酸配列が2つのトポロジーを形成しうる場合、当業者は、この2つのトポロジーを、時には、2つの異なるアミノ酸配列、例えば、保存的変化の点で異なる2つの配列によっても表現しうることを理解すると考えられる。さらに、トポロジーを「第1の」および「第2の」として言及しうる場合、これは必ずしもポリペプチドを2つのトポロジーのみに限定しない。ポリペプチドのトポロジーは、例えば、硫酸化、脱硫酸化、ミリスチル化、脱ミリスチル化、グリコシル化、脱グリコシル化、リン酸化、または脱リン酸化によって改変しうる。例えば、ケモカイン受容体のトポロジーは、いくつかの態様において、ケモカイン受容体が発現される細胞の状況によって決定される。細胞特異的な受容体トポロジーは、ケモカイン受容体の相互同士（二量体または多量体の形成）または他の細胞表面タンパク質との相互作用の結果として生じる。さらに、具体的なトポロジーは、ヘテロ三量体Gタンパク質、受容体相互作用タンパク質、細胞シグナル伝達分子または膜リン脂質環境といった他の細胞特異的要素によって決定されうる。ケモカイン受容体のトポロジーを調節しうる細胞内Gタンパク質サブユニットには、Gα、Gβ、またはGγサブユニットが非制限的に含まれうる。受容体相互作用タンパク質および受容体調節タンパク質には、RAMP、細胞骨格タンパク質、アダプタータンパク質、受容体キナーゼ、および他の膜会合型酵素が同じく非制限的に含まれる。
ポリペプチドのトポロジーは、抗体、またはアンタゴニストもしくはアゴニストといった低分子の、本明細書に記載の受容体トポロジーに対する結合親和性を分析することによって決定しうる。詳細には、種々のトポロジーを、例えば、1）モノクローナル抗体反応性を含む、抗体反応性の違い；2）リガンド結合特異性の違い、3）リガンド親和性の違い、4）薬理学的な区別（すなわち、低分子との結合能力および／または低分子によって賦活される能力の違い）、および5）細胞応答の変化、例えば、リガンド結合に対する応答の変化、によって識別することができる。
「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸および合成アミノ酸のほか、天然のアミノ酸と類似した様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物のことも指す。天然のアミノ酸とは、遺伝暗号によってコードされるもののほか、その後に調節されたアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸、およびO-ホスホセリンなどのアミノ酸もいう。アミノ酸類似体とは、天然のアミノ酸と同じ基本的な化学構造を有する、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびR基と結合したα炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムのことを指す。この種の類似体は、改変されたR基（例えば、ノルロイシン）または改変されたペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同じ基本的な化学構造を保持している。「アミノ酸模倣物」とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが天然アミノ酸と類似した様式で機能する化合物のことを指す。
本明細書ではアミノ酸を、一般的に知られた三文字記号、またはIUPAC-IUBの生化学物質命名委員会（Biochemical Nomenclature Commission）が推奨している一文字記号のいずれかによって参照する。ヌクレオチドも同じく、一般的に認められている一文字記号によって参照する。
「保存的に改変された変種」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。個々の核酸配列に関して、「保存的に改変された変種」とは、同一もしくは本質的に同一なアミノ酸配列をコードする核酸のことを指し、または、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には本質的に同一な配列のことを指す。遺伝暗号の縮重性のために、任意の蛋白質は多数の機能的に同一な核酸によってコードされうる。例えば、コドンGCA、GCC、GCG、およびGCUはすべてアラニンというアミノ酸をコードする。このため、コドンによってアラニンが指定されるあらゆる位置で、コードされるポリペプチドを変化させずに、そのコドンを対応する上記のコドンのいずれかに変化させることができる。このような核酸変形物は「サイレント変形物」であり、保存的に改変された変形物の一種である。何らかのポリペプチドをコードする本明細書のあらゆる核酸配列は、その核酸のあらゆる可能なサイレント変形物についても述べている。当業者は、核酸内の各コドン（通常はメチオニンに対する唯一のコドンであるAUG、および通常はトリプトファンに対する唯一のコドンであるTGGを除く）を改変して、機能的に同一な分子を作製しうることを理解すると考えられる。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各々のサイレント変形物は、記載する各配列に黙示的に含まれる。
アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされる配列中の単一のアミノ酸または少数のアミノ酸が改変、付加、たは除去される、核酸、ペプチド、ポリペプチド、または蛋白質の配列に対する個々の置換物、欠失物、または付加物が、改変によってアミノ酸が化学的に類似したアミノ酸に置換されるような「保存的に改変された変種」であることを理解すると考えられる。機能的に類似したアミノ酸が得られる保存的置換の表も当技術分野で周知である。このような保存的に改変された変種は、本発明の多型変種、種間相同体、および対立遺伝子に加わるものであり、それらが除外されるわけではない。
以下の8つの群はそれぞれ、互いに保存的なアミノ酸を含む：
1）アラニン（A）、グリシン（G）；
2）アスパラギン酸（D）、グルタミン酸（E）；
3）アスパラギン（N）、グルタミン（Q）；
4）アルギニン（R）、リジン（K）；
5）イソロイシン（I）、ロイシン（L）、メチオニン（M）、バリン（V）；
6）フェニルアラニン（F）、チロシン（Y）、トリプトファン（W）；
7）セリン（S）、トレオニン（T）；および
8）システイン（C）、メチオニン（M）
（例えば、Creighton、「Proteins」（1984）を参照されたい）。
「配列一致率」は、最適なアラインメントがなされた2つの配列を比較域（comparison window）にわたって比較することによって決定され、この際、比較域中のポリヌクレオチド配列の一部分は、2つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列（これは付加も欠失も含まない）と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでよい。この率は、両方の配列に同一の核酸塩基または残基が存在する位置の数を決定して一致する位置の数を求め、一致した位置の数を比較域における位置の総数で除算し、その結果に100を掛けて配列一致率を求めることによって算出される。
2つまたはそれ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において、「同一である」または「一致」率という用語は、一定の比較域にわたって、または以下の配列比較アルゴリズムの1つを用いるかもしくは手作業によるアラインメントおよび目視検査によって指定された領域にわたって、最大の対応関係が得られるように比較およびアラインメントを行った場合に、同じである、または同じアミノ酸残基もしくはヌクレオチドが指定された比率である（すなわち、指定された領域にわたって60％の同一性、選択的には65％、70％、75％、80％、85％、90％、または95％の同一性）、2つまたはそれ以上の配列または部分配列のことを指す。このような配列を「実質的に同一である」と言う。この定義は、被験配列の相補物のことも指す。選択的には、同一性は、少なくとも約50ヌクレオチド長の領域にわたって、またはより好ましくは少なくとも100〜500もしくは1000ヌクレオチド長もしくはそれ以上の領域にわたって存在する。
2つまたはそれ以上のポリペプチド配列の文脈において、「類似性」または「類似」率という用語は、一定の比較域にわたって、または以下の配列比較アルゴリズムの1つを用いるかもしくは手作業によるアラインメントおよび目視検査によって指定された領域にわたって、最大の対応関係が得られるように比較およびアラインメントを行った場合に、同じである、または上に定義した8種の保存的アミノ酸置換の定義による類似性のあるアミノ酸残基が指定された比率である（すなわち、ポリヌクレオチドの、例えば上に挙げたCXCR4などのケモカイン受容体をコードするもの（例えば、配列番号：1およびPCT国際公開公報第01／70768号を参照のこと）の、特定の領域または配列全体にわたって60％、選択的には65％、70％、75％、80％、85％、90％、または95％の類似性）、2つまたはそれ以上の配列または部分配列のことを指す。このような配列を「実質的に類似している」と言う。選択的には、この類似性は、少なくとも約50アミノ酸長の領域にわたって、またはより好ましくは少なくとも約100〜500もしくは1000アミノ酸長もしくはそれ以上の領域にわたって存在する。
配列比較に関しては、1つの配列を、被験配列と比較するための参照配列として用いることが一般的である。配列比較アルゴリズムを用いる場合には、被験配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じて部分配列の座標を指定して、配列アルゴリズムプログラムのパラメーターを指定する。デフォールトのプログラムパラメーターを用いることもでき、別のパラメーターを指定することもできる。続いて、プログラムのパラメーターに基づいて、参照配列に対する被験配列の配列一致率または類似率を配列比較アルゴリズムで計算する。
本明細書で用いる「比較域（comparison window）」は、2つの配列の最適なアラインメントを行った後に、ある配列を同じ数の連続した位置を持つ参照配列と比較しうるような、20〜600個、通常は約50〜約200個、より一般的には約100〜約150個からなる群から選択される数の連続した位置のいずれか1つの区域に対する言及を含んでいる。比較のための配列のアラインメントの方法は当技術分野で周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、SmithおよびWaterman (1970) Adv. Appl. Math. 2: 482cの局所的相同性アルゴリズムにより、NeedlemanおよびWunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443の相同性アラインメントアルゴリズムにより、PearsonおよびLipman (1988) Proc. Nat'l. Acad Sci.USA 85: 2444の類似性検索法により、これらのアルゴリズムのコンピュータ・インプリメンテーション（Wisconsin Genetics Software Package（Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI）のGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA）により、または手作業によるアラインメントおよび目視検査によって行うことができる（例えば、Ausubelら、「Current Protocols in Molecular Biology」（1995年補遺）を参照されたい）。
配列一致率および配列類似性の決定のために適したアルゴリズムの一例はBLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムであり、これはそれぞれAltschulら(1977)、Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402およびAltschulら(1990)、J. Mol. Biol. 215: 403-410に記載されている。BLAST解析を行うためのソフトウエアは米国国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）（http://www.ncbi.n1m.nih.gov/）に公開されている。このアルゴリズムでは、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインメントを行った場合に何らかの正値の閾値スコアTと一致する、またはそれを満たす、長さWの短いワードを検索配列中に同定することにより、高スコア配列ペア（HSP）をまず同定する。Tは近隣ワードスコア閾値と呼ばれる（Altschulら、前記）。これらの初期の近隣ワードでのヒットは、それらを含む長いHSPを見いだすための検索を開始する源となる。ワードの検索は、累積アラインメントスコアが増加する限り、各配列の両方向に対して延長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列の場合にはパラメーターM（一致する残基対に関する報酬スコア；常に＞0）およびN（ミスマッチ残基に関するペナルティスコア；常に＜0）を用いて算出する。アミノ酸配列の場合には、累積スコアの算出にスコア行列を用いる。各方向へのワード検索の延長は以下の場合に停止する：累積アラインメントスコアが最大達成値に比べて量X以上低くなった場合：1つもしくは複数の負スコアの残基アラインメントの蓄積のために累積スコアがゼロまたはそれ未満になった場合；または配列のいずれかの端に達した場合。BLASTアルゴリズムのパラメーターであるW、T、およびXはアラインメントの感度および速度を決定する。BLASTNプログラムは（ヌクレオチド配列の場合）、デフォルトとしてワード長（W）11、期待値（E）10、M＝5、N=-4、および両ストランドの比較を用いる。アミノ酸配列の場合、BLASTPプログラムはデフォルトとしてワード長3および期待値（E）10、ならびにBLOSUM62スコア行列（HenikoffおよびHenikoff (1989)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915を参照）のアラインメント（B）50、期待値（E）10、M＝5、N＝-4、および両ストランドの比較を用いる。
BLASTアルゴリズムは、2つの配列の間の類似性に関する統計分析も行う（例えば、KarlinおよびAltschul (1993)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787を参照）。BLASTアルゴリズムによって得られる類似性の指標の1つは最小合計確率（smallest sum probability）（P(N)）であり、これは2つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間の一致が偶然に起こる確率の指標となる。例えば、ある核酸は、被験核酸と参照核酸との比較による最小合計確率が約0.2未満、より好ましくは約0.01未満、最も好ましくは約0.001未満の場合に、参照配列と類似しているとみなされる。
2つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であるという指標の1つは、以下に述べるように、第1の核酸によってコードされるポリペプチドが、第2の核酸によってコードされるポリペプチドに対して産生された抗体と免疫学的に交差反応することである。したがって、例えば、2つのペプチドが保存的置換のみの点で異なる場合、ポリペプチドは一般に第2のポリペプチドと実質的に同一である。2つの核酸配列が実質的に同一であるというもう1つの指標は、以下に述べるように、2つの分子またはその相補物がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。2つの核酸配列が実質的に同一であるというさらにもう1つの指標は、配列の増幅に同じプライマーを用いうることである。
「抗体と特異的に（もしくは選択的に）結合する」または「との特異的な（もしくは選択的な）免疫反応性がある」という語句は、タンパク質またはペプチドについて言及する場合、タンパク質および他の生体物質の不均一な集団の存在下でそのタンパク質の存在を決定づける結合反応のことを指す。すなわち、指示されたイムノアッセイ法条件下で、指定された抗体は試料中に存在するある特定のタンパク質と結合し、他のタンパク質とは有効な量では結合しない。このような条件下での抗体に対する特異的結合には、特定のタンパク質に対する特異性の点から選択された抗体が必要と思われる。例えば、本発明のいずれかのポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質に対して産生された抗体を選択して、そのタンパク質とは特異的に免疫反応し、多型変種を除く他のタンパク質とは反応しない抗体を得ることができる。特定の抗体に対する特異的な免疫反応性のある抗原を選択するためには、さまざまなイムノアッセイ形式を用いうる。例えば、フローサイトメトリーおよびFACS分析または免疫組織化学が、あるタンパク質と特異的に免疫反応するモノクローナル抗体を選択するために日常的に用いられている。特異的免疫反応性の決定に用いうるイムノアッセイ法の形式および条件の記載については、例えば、HarlowおよびLane、「Antibodies, A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Publications, NY (1988)を参照されたい。通常、特異的または選択的な反応は、バックグラウンドの信号または雑音の少なくとも2倍であると考えられ、より一般的にはバックグラウンドの10〜100倍を上回ると考えられる。
ケモカイン受容体の活性の「阻害物質」、「活性化物質」、および「調節物質」は、ケモカイン受容体の結合またはシグナル伝達に関するインビトロおよびインビボでのアッセイ法を用いて同定された、それぞれ阻害性、活性化性、または調節性の分子、例えば、リガンド、アゴニスト、アンタゴニスト、ならびにそれらの相同体および模倣物を指して用いられる。「調節物質」という用語には、阻害物質および活性化物質が含まれる。阻害物質とは、例えば、ケモカイン受容体と結合する、賦活を部分的もしくは完全に阻止する、活性化を軽減する、防止する、遅らせる、不活性化する、脱感作する、またはその活性をダウンレギュレートする作用物質、例えばアンタゴニストのことである。活性化物質とは、例えば、ケモカイン受容体と結合する、それを賦活する、増加させる、開口させる、活性化する、促通する、活性化を増強する、感作する、またはその活性をアップレギュレートする作用物質、例えばアゴニストのことである。調節物質には、例えば、ケモカイン受容体と、活性化物質または阻害物質、受容体（Gタンパク質共役受容体（GPCR）を含む）、キナーゼなどと結合するタンパク質との相互作用を調節する作用物質が含まれる。調節物質には、天然のケモカイン受容体リガンドが遺伝的に改変されたもの、例えば、活性が変化したもののほか、天然リガンドおよび合成リガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、低分子量化学物質などが含まれる。阻害物質および活性化物質に関するこの種のアッセイ法には、例えば、調節性化合物と推定されるものをケモカイン受容体を発現する細胞に対して適用した後に、上記のように、ケモカイン受容体シグナル伝達に対する機能的な影響を判定する工程が含まれる。阻害の程度を検討するには、有望な活性化物質、阻害物質、または調節物質の候補によって処理したケモカイン受容体を含む試料またはアッセイ対象を、阻害物質、活性化物質、または調節物質を含まない対照試料と比較する。対照試料（阻害物質で処理していないもの）をケモカイン受容体の相対活性値100％と指定する。ケモカイン受容体の阻害は、ケモカイン受容体の活性値が対照と比較して約80％、選択的には50％または25〜0％である場合に達成される。ケモカイン受容体の活性化は、ケモカイン受容体の活性値が対照と比較して110％、選択的には150％、選択的には200〜500％または1000〜3000％の高さである場合に達成される。
発明の詳細な説明
I．序論
本発明は、ケモカイン受容体が、異なる細胞種上で異なるトポロジーを形成するという驚くべき発見を提供する。異なる細胞種は、異なるリガンド特異性、薬理学的特徴、および機能を有する。トポロジーとは、タンパク質（例えば、ケモカイン受容体タンパク質）の状態または形態のことである。異なるトポロジーが同一のポリヌクレオチドによってコードされることが可能であり、同様または同一なアミノ酸配列を有することも可能である。ケモカイン受容体の異なるトポロジーは異なる特性を有しており、異なる生物的および／または病的な機能を媒介する可能性がある。
トポロジー間の差異は、例えば、以下の基準の1つまたは複数によって確認しうる：
1）抗体反応性 - 1つの所定の受容体遺伝子によってコードされる複数の異なるトポロジーは、一群の抗体（受容体ポリペプチドに相当する組換えタンパク質に対して産生されたモノクローナル抗体など）に対する反応として異なる染色プロフィールを示す。異なるトポロジーは、同一のケモカイン受容体遺伝子が異なる細胞種において発現された場合に生じうる。
2）リガンド結合 - 1つの所定の受容体遺伝子によってコードされる複数の異なるトポロジーは、リガンド結合プロフィールの点で異なる（すなわち、それらは異なる範囲にわたる別個のリガンドと結合する）。さらに、異なるトポロジーが、その範囲に含まれるリガンドと異なる親和性で結合することもある。
3）薬理学的な区別 - 1つの所定の受容体遺伝子によってコードされる複数の異なるトポロジーは、別個の有機低分子（または低分子のセット）によって阻害され、そのいくつかは医学的に重要な可能性がある。
4）機能 - 1つの所定の受容体遺伝子によってコードされる複数の異なるトポロジーは、異なる細胞性または病態生理学的な状況において、異なる生物的機能を制御または付与する。それらは、異なる細胞状況下で異なるリガンド結合スペクトルを有することにより、機能（例えば、細胞移動）を異なる形で制御する。異なるトポロジーは、異なる細胞状況下での異なる共役および二次メッセンジャー性シグナル伝達により（異なるGタンパク質との結びつきを生じることなどにより）、細胞機能を異なる形で制御する。
本発明は、ケモカイン受容体の1つのトポロジーと特異的に結合する、および／またはそれを調節するが、受容体の第2のトポロジーとはそれらを行わない作用物質を同定するための方法を提供する。このような作用物質は、特定のケモカイン受容体トポロジーと関連のある疾患または状態に対する治療薬として有用である。さらに、これらの作用物質は、ケモカイン受容体の特定のトポロジーを検出し、それによって疾患または疾患に対する素因を診断するために有用である。加えて、これらの作用物質は、ケモカイン受容体の特定のトポロジーを発現する細胞の同定および単離のためにも有用である。
いくつかの態様において、これらの作用物質は、ケモカイン受容体の特定のトポロジーに対するウイルス結合を阻止するために有用である。したがって、これらの作用物質はウイルス感染症の予防または治療のために有用である。
II．ケモカイン受容体のトポロジーの同定
ケモカイン受容体の新規なトポロジーはさまざまな方法によって同定可能である。細胞特異的トポロジーを同定するためには、少なくとも2つの細胞種を用意し、抗原性、リガンド結合、またはケモカイン受容体と関係のあるその他の能力の違いに関してスクリーニングする。ある細胞種が新規なトポロジーと疑われるケモカイン受容体を発現したならば、その細胞種上でのトポロジーを、本明細書に記載する通りにさらに特徴づけることができる（例えば、抗原性、リガンド結合、低分子親和性、機能などに関して）。実施例の項で示すように、同じ受容体のリガンド特異性が異なることは、異なる細胞がトポロジーの異なる受容体を保有していることを示す。
スクリーニングを行う細胞の種類は非常にさまざまでありうる。いくつかの態様においては、特定のケモカイン受容体を発現することが知られた細胞種を用いることが考えられる。例となるケモカイン受容体には、例えば、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CX3CR1、CXR1、CCXCKR（CCR11）、（CCR12）、US28、ECRF3、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスGPCR、ポックスウイルス膜結合Gタンパク質共役受容体、D6、およびDARCが含まれる。
他の態様においては、ある細胞種が特定の受容体を発現するか否かは最初は不明である。さらに、異なる疾患状態を表す細胞（例えば、癌細胞）をスクリーニングして比較することができる。いくつかの態様において、細胞は内因性ケモカイン受容体を発現する。他の態様において、少なくともいくつかの細胞種は組換え的に発現されるケモカイン受容体を発現する。任意の数の細胞種を一度にスクリーニングすることができる。少なくとも約2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、50、もしくは100種、またはより多くの異なる細胞種を一度にスクリーニングすることができる。
いくつかの態様においては、複数の異なる細胞種上のケモカイン受容体のリガンド結合特性を比較する。このような態様において、リガンドは、ケモカイン受容体の少なくとも1つのトポロジーと結合する任意の分子でありうる。例となるリガンドには、天然のケモカインおよびその他の低分子が含まれる。例となるケモカインには、例えば、以下のものが含まれる：XCL1、XCL2、CX3CL1、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、およびCCL28。例えば、Zlotnickら、Immunity 12: 121(2000)を参照されたい。
異なる細胞種に関してスクリーニングするリガンドの数は非常にさまざまでありうる。通常は、少なくとも4、5、6、8、10、15、20、30、40、50、75、100種、またはより多くのリガンドの結合を比較する。
一連のリガンド候補の結合特性をスクリーニングするために好都合な方法の一つは、リガンド候補が、目的のケモカイン受容体の既知のリガンドと、結合に関して競合する能力を測定することを含む。例えば、Goslingら、J. Immunol. 164: 2851-2856 (2000)；Dairaghiら、 J. Biol. Chem. 274(31) : 21569-21574 (1999)を参照されたい。競合アッセイ法は当技術分野で周知である。通常は、結合性の違い（例えば、競合リガンド候補（徐々に量を増加させる）の存在下で）を測定しうるように、既知のリガンドを標識する。競合アッセイ法により、競合リガンド候補の親和性が示される。異なる細胞種上に発現された同じ受容体に対する特定のリガンドの親和性に統計学的な有意差があることは、その異なる細胞種上に異なるトポロジーが存在することを意味する。
本方法のいくつかの態様において、リガンド候補は固体支持体に対して係留される。例えば、Goslingら、前記を参照されたい。
III．タンパク質トポロジーに基づく特異的治療薬の開発
ケモカイン受容体の調節物質、すなわちケモカイン受容体活性に対するアゴニストまたはアンタゴニストまたは作用物質は、哺乳類のさまざまな疾患を治療するのに有用である。
ケモカイン受容体のアンタゴニストまたはケモカイン受容体機能のその他の阻害物質によって治療しうる、ヒトまたは他の種の疾患または状態には、以下のものが非制限的に含まれる：喘息、アレルギー性鼻炎、過敏性肺疾患、過敏性肺臓炎、好酸球性肺炎（例えば、レフラー症候群、慢性好酸球性肺炎）、遅延型過敏症、間質性肺疾患（ILD）（例えば、特発性肺線維症、または関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、強直性脊椎炎、全身性硬化症、シェーグレン症候群、多発性筋炎もしくは皮膚筋炎に伴うILD）などの呼吸器アレルギー疾患が含まれる、急性または慢性の炎症性またはアレルギー性の疾患および状態；全身性アナフィラキシーまたは過敏反応、薬物アレルギー（例えば、ペニシリン、セファロスポリンに対するもの）、虫刺されアレルギー；関節リウマチ、乾癬性関節炎、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、若年発症糖尿病などの自己免疫疾患；糸球体腎炎、自己免疫性甲状腺炎、ベーチェット病；同種移植片拒絶反応または移植片対宿主病を含む、移植片拒絶反応（例えば、移植の際に）；クローン病および潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；脊椎関節症；強皮症；乾癬（T細胞媒介性乾癬を含む）および炎症性皮膚病、例えば皮膚炎、湿疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、蕁麻疹など；血管炎（例えば、壊死性血管炎、皮膚血管炎および過敏性血管炎）；好酸球性筋炎、好酸球性筋膜炎；癌、これには乳癌（例えば、乳腺癌および乳管癌）、膠芽腫、神経膠腫、リンパ腫（例えば、バーキットリンパ腫）、黒色腫、肺癌、甲状腺癌、結腸癌、肝癌、卵巣癌、子宮頸癌、膵癌、腎細胞癌、平滑細胞癌、脳腫瘍、および皮膚癌が含まれる。望ましくない炎症反応を抑制する必要のある他の疾患または状態を治療することもでき、これには非制限的に、再潅流傷害、アテローム性動脈硬化 、ある種の血液悪性腫瘍、サイトカイン誘発毒性（例えば、敗血性ショック、内毒素性ショック）、多発性筋炎、皮膚筋炎、動脈硬化、自己免疫性脳脊髄炎、虚血性逆流障害、脳卒中、脳障害または脊髄障害、および熱傷が含まれる。
ケモカイン受容体のアゴニストまたはケモカイン受容体機能のその他の促進物質によって治療しうるヒトまたは他の種の疾患または状態には、以下のものが非制限的に含まれる：免疫抑制、例えば、免疫不全症候群の個体、免疫抑制の原因となる放射線療法、化学療法、自己免疫疾患に対する療法、またはその他の薬物療法（例えば、コルチコステロイド療法）を受けている個体における免疫抑制など；受容体機能の先天的欠損またはその他の原因による免疫抑制；ならびに、線虫類（round worm）；（鞭虫症、蟯虫症、蛔虫症、鈎虫症、糞線虫症、旋毛虫病、糸状虫感染症）；吸虫類（fluke）（住血吸虫症、肝吸虫症）、条虫類（tape worm）（エキノコックス症、無鉤条虫症、嚢虫症）；内臓寄生虫症、内臓幼虫移行症（例えば、トキソカラ属）、好酸球性胃腸炎（例えば、アニサキス属、フォカネマ（Phocanema）属）、および皮膚幼虫移行症（ブラジル鉤虫、イヌ鉤虫）などの蠕虫感染症を非制限的に含む、寄生虫症などの感染症。ケモカイン受容体のアゴニストまたはケモカイン受容体機能のその他の促進物質は、百日咳（百日咳菌）；コレラ（コレラ菌）；髄膜炎（髄膜炎菌）；ライム病（ライム病ボレリア）；B型インフルエンザ（B型インフルエンザ菌）；肺炎（肺炎球菌）、腸チフス（チフス菌）、ジフテリア（ジフテリア菌）、および破傷風（破傷風菌）などの細菌感染症の治療にも有用である。ケモカイン受容体のアゴニストまたはケモカイン受容体機能のその他の促進物質は、インフルエンザウイルス；A型肝炎；B型肝炎；C型肝炎；麻疹；風疹ウイルス；流行性耳下腺炎、狂犬病；ポリオウイルス；日本脳炎ウイルス；ロタウイルス；水痘などのウイルス感染症の治療にも有用である。
1つのケモカイン受容体の複数のトポロジーに対する調節物質は、したがって、多岐にわたる炎症性および免疫調節性の障害および疾患の予防および治療に有用である。
いくつかの種類のウイルスは、ケモカイン受容体に対する結合によって細胞感染を開始することが知られている。例えば、HIVなどのレトロウイルス（（例えば、Locatiら、Annu. Rev. Med. 50: 425 (1999)；Hurok, Immunol. Today 20: 89 (1999)；Bersonら、Semin. Immunol. 10: 237 (1998)；およびLittmanら、Cell 93: 677 (1998)を参照）および粘液腫ウイルスなどのポックスウイルス（例えば、Lalaniら、Science 286: 1968-1971 (1999)を参照）はいずれも、ケモカイン受容体を介して細胞と結合することが知られている。本発明は、これらのウイルスおよび他のウイルスと、ケモカイン受容体の特定のトポロジーとの結合を妨げる作用物質を同定する方法を提供する。これらの作用物質は、ウイルス性疾患の予防および治療のための治療的組成物として有用である。例えば、HIV R5株はケモカイン受容体CCR5と結合し、一方、HIV X4株はCXCR4と結合する。粘液腫ウイルスは受容体CCR1、CCR5、およびCXCR4と結合する。ウイルスが結合するケモカイン受容体の特定のトポロジーと結合する作用物質を患者に投与することにより、これらのウイルスが細胞を感染させることを防ぎ、それによって感染症を予防することができる。本発明の方法に従って治療しうる他のウイルスの例には、マウス乳房腫瘍ウイルスなどの哺乳類B型レトロウイルス；マウス白血病ウイルスなどの哺乳類C型レトロウイルス；トリ白血病ウイルスなどの鳥類C型レトロウイルス；メーソン・ファイザーサルウイルなどのD型レトロウイルス；ウシ白血病ウイルスなどのBLV-HTLVレトロウイルス；ヒト免疫不全ウイルス1などのレンチウイルス；ヒトスプマウイルスなどのスプマウイルスを含む、レトロウイルス科；さらには、コルドポックスウイルス亜科、例えば、ワクシニアウイルスなどのオルトポックスウイルス；オルフウイルスなどのパラポックスウイルス；鶏痘ウイルスなどのアビポックスウイルス；羊痘ウイルスなどのカプリポックスウイルス；粘液腫ウイルスなどのレポリポックスウイルス；ブタ痘ウイルスなどのスイポックスウイルス；伝染性軟属腫ウイルスなどのモラシポックスウイルス；およびヤバサル腫瘍ウイルスなどのヤタポックスウイルスを含む、ポックスウイルス科が非制限的に含まれる。
A．ケモカイン受容体のトポロジーに対する調節物質を同定する方法
細胞における、特に哺乳動物細胞における、とりわけヒト細胞における、ケモカイン受容体の特定のトポロジーの活性または機能のレベルを調節する作用物質を同定するために、数多くの種類のスクリーニングプロトコールを利用することができる。一般的には、スクリーニング方法は、例えばケモカイン受容体と結合させる工程、阻害物質とケモカイン受容体との結合を妨げる工程、またはケモカイン受容体を活性化することによってケモカインの特定のトポロジーと相互作用する作用物質を同定するために、複数の作用物質をスクリーニングする工程を含む。いくつかの態様において、アンタゴニストまたはアゴニストはケモカイン受容体の1つのトポロジーのみの活性を調節し、第2のトポロジーの活性は調節しない。いくつかの態様において、ケモカイン受容体のすべてのトポロジーがアンタゴニストまたはアゴニストによって調節される。いくつかの態様において、作用物質は1つのトポロジーと、第2のトポロジーに対する作用物質の親和性の少なくとも約1.5、2、3、4、5、10、20、50、100、300、500、または1000倍の親和性で結合する。いくつかの態様において、作用物質は1つのトポロジーと、第2のトポロジーに対する作用物質の親和性の約0.5、0.3、0.2、0.1、0.05、0.01、0.001倍未満の親和性で結合する。
1．ケモカイン受容体の結合アッセイ法
ケモカイン受容体のあるトポロジーと結合しうる作用物質をスクリーニングすることにより、そのようにして同定された作用物質の少なくともいくつかはケモカイン受容体の調節物質である可能性が高いことから、予備的なスクリーニングを行うことができる。結合アッセイ法は通常、ケモカイン受容体タンパク質のあるトポロジーを1つまたは複数の被験作用物質と接触させ、タンパク質および被験作用物質が結合複合体を形成するのに十分な時間をおくことを含む。形成された結合複合体は、確立されたさまざまな分析技法の任意のものを用いて検出することができる。タンパク質結合アッセイ法には、免疫組織化学的結合アッセイ法、フローサイトメトリー、またはケモカイン受容体のトポロジーが保たれるその他のアッセイ法が非制限的に含まれる。この種のアッセイ法に用いるケモカイン受容体は、自然下で発現されるものでもクローニングされたものでも合成されたものでもよい。
結合アッセイ法は、例えば、ケモカイン受容体の特定のトポロジーと相互作用する内因性タンパク質を同定するためにも有用である。例えば、そのトポロジーと結合する抗体、受容体、またはその他の分子を結合アッセイ法で同定することができる。
2．細胞および試薬
本発明のスクリーニング方法は、インビトロアッセイ法または細胞系（cell-based）アッセイ法として行うことができる。インビトロアッセイ法は、ケモカイン受容体が溶液中で複数の異なるトポロジーを形成しうる場合に行われる。細胞系アッセイ法は、ケモカイン受容体が発現される任意の細胞で行いうる。
細胞系アッセイ法では、作用物質の結合、または作用物質によるケモカイン受容体のトポロジーの活性の調節に関するスクリーニングのために、全細胞、またはケモカイン受容体を含む細胞画分を用いる。本発明の方法に従って用いうる細胞種の例には、例えば、白血球、例えば好中球、単球、マクロファージ、好酸球、好塩基球、マスト細胞、およびリンパ球（T細胞およびB細胞など）、白血病細胞、バーキットリンパ腫細胞、腫瘍細胞、内皮細胞、線維芽細胞、心筋細胞、筋細胞、乳房腫瘍細胞、卵巣癌細胞、子宮頸癌細胞、膠芽腫、肝細胞、腎細胞、および神経細胞を含む任意の哺乳動物細胞、さらには酵母を含む真菌細胞が含まれる。細胞は初代細胞でも腫瘍細胞でもよく、またはその他の種類の不死細胞株でもよい。当然ながら、ケモカイン受容体を、特定の内因性ケモカイン受容体を含まない細胞で発現させることができる。いくつかの態様においては、ケモカイン受容体の1つのトポロジーを、1種類の細胞（例えば、乳房腫瘍細胞、卵巣癌細胞、子宮頸癌細胞、バーキットリンパ腫細胞、膠芽腫細胞、またはウイルスによる感染の担体となりうる細胞）上に発現させ、第2のトポロジーを第2の細胞種（例えば、非腫瘍細胞、またはウイルスによる感染の担体とはならない細胞）上に発現させる。ケモカイン受容体は必ずしも2種類のトポロジーのみを有する必要はない。したがって、作用物質を、いずれかの1つのトポロジーとは選択的に相互作用する、またはそれを調節するが、1つまたは複数の他のトポロジーとの結合または調節は行わない能力に関してスクリーニングすることができる。同様に、ケモカイン受容体が2種類を上回るトポロジーを形成する場合には、トポロジーのあるサブセット（例えば、3種類のトポロジーのうち2種類）と結合する、またはそれらを調節するが、ケモカイン受容体のすべてのトポロジーに対する結合または調節は行わない作用物質を選択することができる。
任意のケモカイン受容体を本発明の方法に従って用いることができる。例となるケモカイン受容体には、例えば、CCケモカイン受容体であるCCR1〜10；CXCケモカイン受容体であるCXCR1〜6；CX3CR1；CXR1；CCXCKR（CCR11）；（CCR12）、ウイルスにコードされたケモカイン受容体であるUS28、ECRF3、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスGPCR、ポックスウイルス膜結合Gタンパク質共役受容体；D6；およびDARCが含まれる。
以上に考察した通り、トポロジーのあるサブセットと結合する、またはそれらを調節するが、ケモカイン受容体のすべてのトポロジーに対する結合または調節は行わない作用物質を選択することができる。例えば、作用物質を、ケモカイン受容体の第1のトポロジーと結合する、またはそれを調節するが、第2の細胞の第2のトポロジーのトポロジーに対する結合または調節は行わない能力に関してスクリーニングすることができる。いくつかの態様において、第1の細胞は腫瘍細胞であり、一方、第2の細胞は非腫瘍細胞または異なる種類の腫瘍細胞である。例となる腫瘍細胞には、例えば、乳癌細胞、卵巣癌細胞、子宮頸癌細胞、膠芽腫細胞、結腸癌細胞、膵癌細胞、前立腺癌細胞、肝癌細胞、皮膚癌細胞、脳腫瘍細胞、骨肉腫細胞、肺癌細胞、精巣癌細胞、バーキットリンパ腫細胞、および白血病細胞が含まれる。乳癌細胞には、例えば、MDA MB-231、MCF7、ZR 75-1、およびDU-4475が含まれる。ケモカイン受容体（例えば、CXCR4）は、増殖性または抗増殖性の細胞内シグナルを介することにより、腫瘍細胞の成長速度を調節することができる。いくつかの態様において、特定のトポロジー（またはトポロジーのサブセット）は、癌細胞の増殖を賦活しうる。ケモカイン受容体の1つのトポロジー（または複数のトポロジー）を選択的に調節し、別のものは調節しない作用物質は、このため、選択的な抗癌治療薬として有用である。
1つのトポロジーに対しては調節物質であるが第2のトポロジーに対してはそうでないものに関するスクリーニングに用いうる細胞の他の例には、例えば、単球、好中球、未熟樹状細胞、ならびにT細胞およびB細胞といった他の免疫細胞が含まれる。1つの選択肢としては、上に挙げた細胞種のうち2種類を用い、一方の細胞上の受容体とは結合するが第2の細胞種のものとは結合しない分子を選択する。
3．シグナル伝達活性
ケモカイン受容体のトポロジーのシグナル伝達活性はさまざまなやり方で決定することができる。例えば、調節物質が細胞内のカルシウム動員を誘導しうるか否かを定性的および定量的に決定することにより、シグナル伝達を測定することができる。カルシウム動員アッセイ法は、例えば、Dairaghiら、J. Biol. Chem. 272(45): 28206-9 (1997)に記載されている。サイクリックAMPまたはイノシトールリン酸などのその他の二次メッセンジャー、さらにはリン酸化イベントまたは脱リン酸化イベントを観測することもできる。例えば、Premackら、Nature Medicine 2: 1174-1178 (1996)およびBokoch, Blood 86: 1649-1660 (1995)を参照されたい。
さらに、シグナル伝達活性を決定するために下流の分子イベントを観測することもできる。下流イベントには、ケモカイン受容体の刺激の結果として起こるような活性または徴候が含まれる。例となる下流イベントには、例えば、リンパ系組織（例えば、CXCR5）、心臓（例えば、CXCR4）、または他の組織の発生、細胞の状態の変化（例えば、正常細胞から癌細胞へ、または原発性癌細胞から転移性癌細胞へ）などの細胞応答または組織応答のほか、細菌、原生動物、またはその他の寄生生物などの非ウイルス性病原体による感染が含まれる。本明細書で用いる組織応答には、組織における炎症の発生も含まれる。細胞応答には、細胞（例えば、白血球）の誘引物質（例えば、ケモカイン）への走化性移動、および誘引物質（例えば、ケモカイン）への細胞浸潤（例えば、浸潤性を備えた腫瘍細胞）が含まれる。ケモカイン受容体は、血小板の活性化および凝集（例えば、Abi-Younes S.ら、Circ Res., 86: 131-138 (1999)；Kowalska, M. A.ら、Blood 96: 50-57 (2000)；およびCleinentson, K.J.ら、Blood, 96: 4046-4054 (2000)を参照）のほか、アポトーシスの誘導（例えば、Berndt C.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、95: 12556-12561 (1998)を参照）にも役割を果たすことが明らかになっている。
4．バリデーション
前記のいずれかのスクリーニング方法によって当初同定された作用物質を、明らかな活性のバリデーションを行うためにさらに試験することができる。このような試験は、適した動物モデルを用いて行うことが好ましい。このような方法の基本形式は、初期スクリーニングの際に同定されたリード化合物を、ヒトのモデルとして役立つ動物に投与し、その後に、ケモカイン受容体が実際に調節作用を受けるか、および／または疾患もしくは状態が改善されるかを判定する工程を含む。バリデーション試験に用いられる動物モデルは一般に、何らかの種類の哺乳動物である。適した動物の具体的な例には、霊長動物、マウス、およびラットが非制限的に含まれる。
B．特定のケモカイン受容体と相互作用する作用物質
ケモカイン受容体の少なくとも1つのトポロジーに対する調節物質として試験される作用物質は、ポリペプチド、糖、核酸、または脂質などの任意の低分子化合物または生物的実体でよい。または、調節物質は遺伝的に改変された型のケモカインまたは他のリガンドでもよい。一般に、被験化合物は低分子の化合物およびペプチドであると考えられる。本質的にあらゆる化合物を、本発明のアッセイ法におけるリガンドまたは調節物質の候補として用いることができるが、水性溶液または有機溶液（特にDMSOをベースとするもの）中に溶解しうる化合物を用いることが最も多い。アッセイ法は、アッセイ法の工程を自動化し、任意の好都合な源から化合物をアッセイ法に提供し、一般にはそれを平行して稼働させることにより（例えば、自動化アッセイ法でのマイクロタイタープレート上でのマイクロタイター形式による）、大規模化学ライブラリーをスクリーニングするように設計する。化合物の供給元が、Sigma社（St. Louis, MO）、Aldrich社（St. Louis, MO）、Sigma-Aldrich社（St. Louis, MO）、Fluka Chemika-Biochemica Analytika社（Buchs, Switzerland）などを含め、数多くあることは知られていると考えられる。
いくつかの態様において、作用物質の分子量は1,500ダルトン未満であり、いくつかの場合には1,000、800、600、500、または400ダルトン未満である。比較的サイズの小さい作用物質が望ましいと考えられるが、これは小さい分子の方が分子量の高い分子よりも、作用物質の経口吸収性を含む、優れた薬物動態特性に適合する物理化学特性を有する可能性が高いためである。例えば、透過性および溶解性の点から薬剤として好成績を上げる可能性が低いと考えられる作用物質は、Lipinskiらによって以下の通りに記載されている：水素結合のドナーの数（OHおよびNHの合計として表現）が5つを上回る；分子量が500を上回る；LogPが5を上回る（もしくはMLogPが4.15を上回る）；ならびに／または水素結合のアクセプターの数（NおよびOの合計として表現）が10を上回る。例えば、Lipinskiら、Adv Drug Delivery Res 23: 3-25 (1997)を参照されたい。生物学的輸送体の基質である化合物クラスはこの規則の例外であることが一般的である。
CCX7923（図5参照）は市販されており、当技術分野で知られた方法により、N-[3-(ジメチルアミノ)プロピル]-N,N-ジメチル-1,3-プロパンジアミンとブロモメチル-ビシクロ(2,2,1)ヘプト-2-エンとの縮合によって製造しうる。CCX0803（図5参照）は市販されており、当技術分野で周知の方法により、3-(2-ブロモエチル)-5-フェニルメトキシ-インドールと2,4,6-トリフェニルピリジンとの縮合によって製造しうる。例えば、「Organic Function Group Preparations」第2版、第1巻（S.R. Sandler & W. Karo 1983）；「Handbook of Heterocyclic Chemistry」（A.R. Katritzky, 1985）；「Encyclopedia of chemical Technology」第4版（J.I. Kroschwitz, 1996）を参照されたい。
1つの好ましい態様において、ハイスループットスクリーニング方法は、数多くの治療的化合物の候補（調節物質またはリガンド化合物の候補）を含むコンビナトリアル化学ライブラリーまたはペプチドリガンドライブラリーを提供する工程を含む。続いて、このような「コンビナトリアル化学ライブラリー」または「リガンドライブラリー」を、望ましい特徴的な活性を示すライブラリーのメンバー（特定の化学種またはサブクラス）を同定するために、本明細書に記載するような1つまたは複数のアッセイ法においてスクリーニングする。このようにして同定された化合物は、通常の「リード化合物」として役立ち、またはそれ自体を治療薬の候補もしくは実際の治療薬として用いることができる。
コンビナトリアル化学ライブラリーは、試薬などの多数の化学的「構成単位（building block）」を組み合わせることにより、化学合成または生物的合成によって生成された多様な化合物からなる集成物である。例えば、ポリペプチドライブラリーなどの直鎖状コンビナトリアル化学ライブラリーは、一群の構成化学単位（アミノ酸）を所定の化合物の長さ（すなわち、ポリペプチド化合物におけるアミノ酸の数）に関して考えられるすべてのやり方で組み合わせることによって生成される。構成化学単位のこのようなコンビナトリアル混合により、何百万もの化合物を合成することができる。
コンビナトリアル化学ライブラリーの調製およびスクリーニングは当業者に周知である。このようなコンビナトリアル化学ライブラリーには、ペプチドライブラリー（例えば、米国特許第5,010,175号、Furka, Int. J. Pept. Prot. Res. 37: 487-493 (1991)およびHoughtonら、Nature 354: 84-88 (1991)を参照）が非制限的に含まれる。多様な化学物質ライブラリーを作製するためにその他の化学物質を用いることもできる。このような化学物質には、ぺプトイド（例えば、国際公開公報第91／19735号）、コード化ペプチド（例えば、国際公開公報第93／20242号）、ランダムバイオオリゴマー（例えば、国際公開公報第92／00091号）、ベンゾジアゼピン（例えば、米国特許第5,288,514号）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピン、およびジペプチドなどのディベルソマー（diversomer）（Hobbsら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6909-6913 (1993)）、ビニル性ポリペプチド（Hagiharaら、J. Amer. Chem. Soc. 114: 6568 (1992)）、グルコーススカフォールディングを有する非ペプチド性ペプチド模倣物（Hirschmannら、J. Amer. Chem. Soc. 114: 9217-9218 (1992)）、低分子化合物ライブラリーの類似の有機合成（Chenら、J. Amer. Chem. Soc. 116: 2661 (1994)）、オリゴカルバメート（Choら、Science 261: 1303 (1993)）、および／またはペプチジルホスホネート（Campbellら、J. Org. Chem. 59: 658 (1994)）、核酸ライブラリー（Ausubel、BergerおよびSambrook、いずれも前記、を参照）、ペプチド核酸ライブラリー（例えば、米国特許第5,539,083号を参照）、抗体ライブラリー（例えば、Vaughnら、Nature Biotechnology, 14(3): 309-314 (1996)およびPCT／US96／10287号を参照）、炭水化物ライブラリー（例えば、Liangら、Science, 274: 1520-1522 (1996)および米国特許第5,593,853号を参照）、有機低分子ライブラリー（例えば、ベンゾジアゼピン、Baum C&EN, Jan 18, 33ページ (1993)；イソプレノイド、米国特許第5,569,588号；チアゾリジノンおよびメタチアザノン、米国特許第5,549,974号；ピロリジン、米国特許第5,525,735号および第5,519,134号；モルフィノ化合物、米国特許第5,506,337号；ベンゾジアゼピン、米国特許第5,288,514号などを参照）が非制限的に含まれる。
コンビナトリアルライブラリーの調製用の装置は市販されている（例えば、357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, MA, 433A Applied Biosystems, Foster City, CA, 9050 Plus, Millipore, Bedford, MAを参照）。加えて、数多くのコンビナトリアルライブラリーがそれ自体、市販されている（例えば、ComGenex, Princeton, N.J., Tripos, Inc., St. Louis, MO, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MIDなど）。
C．固相および溶質のハイスループットアッセイ法
本発明のハイスループットアッセイ法では、最大で数千種もの異なる調節物質またはリガンドを1日でスクリーニングすることが可能である。詳細には、マイクロタイタープレートの各ウェルを、選択した調節物質の候補に対して別々のアッセイ法を実行するために用い、または、濃度もしくはインキュベーション時間の影響を観察しようとする場合には、単一の調節物質を試験するためにウェルを5〜10個ずつ用いることができる。このため、1枚の標準的なマイクロタイタープレートで、約100種（例えば、96種）の調節物質をアッセイすることが可能である。1536穴のウェルプレートを用いれば、1枚のプレートで約100〜約1500種の異なる化合物をアッセイすることができる。1日当たり数枚の異なるプレートをアッセイできれば、本発明の統合システムを用いて最大で約6,000〜20,000種類の化合物をアッセイ法でスクリーニングすることが可能である。さらに最近では、試薬操作のための微少流体アプローチが開発されている。
目的の分子を、共有結合またはタグを介した結合などの非共有結合により、直接的または間接的に固体成分に結合させることができる。タグは種々の成分のうち任意のものでよい。一般的には、タグと結合する分子（タグ結合剤）を固体支持体に固定し、タグの付いた目的の分子を、タグとタグ結合剤との相互作用によって固体支持体に付着させる。
文献中に詳細に記載された既知の分子相互作用に基づき、さまざまなタグおよびタグ結合剤のうち任意のものを用いることができる。例えば、ビオチン、プロテインA、またはプロテインGのようにタグが天然の結合剤を有する場合には、それを適切なタグ結合剤（アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラビジン、免疫グロブリンのFc領域など）との結合に用いることができる。ビオチンなどの天然の結合剤を備えた分子に対する抗体も広く入手可能であり、適切なタグ結合剤についても同様である；例えば、SIGMA Immunochemicals 1998年カタログ、SIGMA, St. Louis MOを参照されたい）。
同様に、任意のハプテン性化合物または抗原性化合物を適切な抗体と組み合わせて用い、タグ／タグ結合剤の対を形成させることもできる。数千種もの特異抗体が市販されており、ほかにも多くの抗体が文献中に記載されている。例えば、1つの一般的な構成において、タグは第1の抗体であり、タグ結合剤は第1の抗体を認識する第2の抗体である。抗体-抗原相互作用以外に、細胞膜受容体のアゴニストおよびアンタゴニストなどの受容体-リガンド相互作用もタグおよびタグ結合剤の対として適している（例えば、トランスフェリン、c-kit、ウイルス受容体リガンド、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、インターロイキン受容体、免疫グロブリン受容体および抗体、カドヘリンファミリー、インテグリンファミリー、セレクチンファミリーなどの細胞受容体-リガンド相互作用；例えば、Pigott & power, 「Adhesion Molecule Facts Book 1」(1993)を参照されたい）。同様に、毒素および毒液、ウイルスエピトープ、ホルモン（例えば、オピエート、ステロイドなど）、細胞内受容体（例えば、ステロイド、甲状腺ホルモン、レチノイド、およびビタミンD；ペプチドを含む、種々の低分子リガンドの作用を媒介するもの）、薬剤、レクチン、糖、核酸（直鎖状重合体および環状重合体の両方の形態）、オリゴ糖、タンパク質、リン脂質、および抗体は、いずれも種々の細胞受容体と相互作用しうる。
ポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリウレア、ポリアミド、ポリエチレンイミン、ポリアリールスルフィド、ポリシロキサン、ポリイミド、およびポリアセテートなどの合成重合体も適切なタグまたはタグ結合剤を形成しうる。その他の多くのタグ／タグ結合剤の対も本明細書に記載のアッセイ法に有用であり、これは本開示を吟味することによって当業者には明らかであると考えられる。
ペプチド、ポリエーテルなどの一般的なリンカーもタグとして有用であり、これには約5〜200アミノ酸のポリGly配列などのポリペプチド配列（配列番号：3）が含まれる。このような柔軟性のあるリンカーは当業者に周知である。例えば、ポリ（エチレングリコール）リンカーは、Shearwater Polymers, Inc（Huntsville, Alabama）から販売されている。選択的には、これらのリンカーはアミド結合、スルフヒドリル結合、またはヘテロ官能性結合を有する。
タグ結合剤を、現在用いうる種々の方法のうち任意のものを用いて、固体基質に固定する。固体基質は一般に、タグ結合剤の一部と反応する化学基を表面に固定させる化学試薬に基質の全体または一部を曝露させることにより、誘導体化または官能性付与が行われる。例えば、比較的長い連鎖部分を付着させるのに適した基には、アミン基、ヒドロキシル基、チオール基、およびカルボキシル基が含まれると考えられる。ガラス表面などの種々の表面に官能性を付与するためには、アミノアルキルシランおよびヒドロキシアルキルシランを用いることができる。このような固相バイオポリマーアレイの構築は文献に詳細に記載されている（例えば、Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154(1963)（ペプチドなどの固相合成を記載している）；Geysenら、J. Immun. Meth. 102: 259-274(1987)（ピン上での固相成分の合成を記載している）；FrankおよびDoring、Tetrahedron 44：60316040(1988)（セルロースディスク上での種々のペプチド配列の合成を記載している）；Fodorら、Science, 251: 767-777(1991)；Sheldonら、Clinical Chemistiy 39(4):718-719 (1993)；ならびにKozalら、Nature Medicine 2(7): 753759 (1996)（いずれも固体基質に固定したバイオポリマーのアレイを記載している）を参照されたい。タグ結合剤を基質に固定する非化学的アプローチには、加熱、UV照射による架橋などの他の一般的な方法が含まれる。
本発明は、ケモカイン受容体の特定のトポロジーの機能または活性を調節しうる化合物をハイスループット形式で同定するためのインビトロアッセイ法を提供する。アッセイ系が高度に均一であるため、調節物質の候補を含まない反応における細胞のケモカイン受容体活性を測定する対照反応を随意に選択してもよい。このような随意選択的な対照反応は適切であり、アッセイ法の信頼性を高める。したがって、1つの好ましい態様において、本発明の方法はこのような対照反応を含む。記載するアッセイ形式のそれぞれについて、調節物質を含まない「調節物質なしの」対照反応により、結合活性のバックグラウンドレベルが得られる。
いくつかのアッセイ法においては、アッセイ法の成分が適切に作用していることを確認するための陽性対照を用いることが望ましいと考えられる。少なくとも2種類の陽性対照が適している。第1に、ケモカイン受容体の目的のトポロジーの既知の活性化物質またはリガンドを1つのアッセイ試料とインキュベートし、ケモカイン受容体の活性上昇に起因する結果としての信号の増加を本明細書に記載の方法に従って決定する。第2に、ケモカイン受容体のあるトポロジーに対する既知の阻害物質またはアンタゴニストを添加し、ケモカイン受容体の活性に関する結果としての信号の低下を同様に検出することができる。通常であればケモカイン受容体の既知の調節物質の存在によって引き起こされる上昇または存在を阻害する調節物質を見つけ出すために、調節物質を活性化物質または阻害物質と混ぜ合わせてもよいことは理解されると考えられる。
D．コンピュータを用いるアッセイ法
ケモカイン受容体の活性または機能を調節する化合物に関するさらにもう1つのアッセイ法は、アミノ酸配列にコードされた構造情報に基づいてケモカイン受容体の三次元構造を作成するためにコンピュータシステムを用いる、コンピュータ支援による薬物設計である。入力したアミノ酸配列がコンピュータプログラム内にあらかじめ設定したアルゴリズムと直接かつ能動的に相互作用し、タンパク質の二次、三次、および四次構造モデルが生成される。同様の解析を、ケモカイン受容体の1つのトポロジーのみに対する結合パートナーまたはリガンドを含む、ケモカイン受容体の既知の結合パートナーもしくはリガンドまたはその候補に対して行うこともできる。続いて、結合能を有する構造領域を同定するためにタンパク質構造のモデルを検討する。次にこれらの領域を利用して、タンパク質と結合する化合物を同定する。
タンパク質の三次元構造モデルは、少なくとも10アミノ酸残基のタンパク質アミノ酸配列、またはそれに対応するケモカイン受容体リガンドの候補をコードする核酸配列をコンピュータシステムに入力することによって生成される。本明細書に提供する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列は、タンパク質の構造情報をコードする、タンパク質の一次配列または部分配列である。少なくとも10残基のアミノ酸配列（または10アミノ酸をコードするヌクレオチド配列）を、コンピュータのキーボード、さらには電子記憶媒体（例えば、磁気ディスケット、テープ、カートリッジ、およびチップ）、光メディア（例えば、CD ROM）、インターネットのサイトから配付された情報、およびRAMを非制限的に含む、コンピュータで読み取れる担体から、コンピュータシステムに入力する。続いて、当業者に知られたソフトウエアを用いて、アミノ酸配列とコンピュータシステムとの相互作用により、タンパク質の三次元構造モデルを生成する。
このアミノ酸配列は、目的のタンパク質の二次、三次、および四次構造を生成するために必要な情報をコードする一次構造である。ソフトウエアは、一次配列によってコードされた特定のパラメーターを調べて構造モデルを生成する。これらのパラメーターは「エネルギー項」と呼ばれ、これには主として、静電ポテンシャル、疎水性ポテンシャル、溶媒接触表面、および水素結合が含まれる。二次エネルギー項にはファンデルワールスポテンシャルが含まれる。生体分子はエネルギー項の累積値が最小となるような構造をとる。このため、コンピュータプログラムは、一次構造またはアミノ酸配列によってコードされるこれらの項を用いて二次構造モデルを生成する。
次に、二次構造によってコードされるタンパク質の三次構造が、二次構造のエネルギー項に基づいて生成される。ユーザーはこの時点で、タンパク質が膜結合型または可溶型のいずれであるか、体内でのその位置、およびその細胞内位置、例えば細胞質、表面、または核などの追加変数を入力することができる。これらの変数が二次構造のエネルギー項とともに用いられ、三次構造のモデルが生成される。三次構造のモデル化に際して、コンピュータプログラムは二次構造の疎水性表面同士を一致させるとともに、二次構造の親水性表面同士を一致させる。
ひとたび構造が生成されれば、調節物質の結合領域と考えられる部分がコンピュータシステムによって同定される。調節物質候補の三次元構造は、化合物のアミノ酸配列もしくはヌクレオチド配列または化学式を上記の通りに入力することによって生成される。次に調節物質候補の三次元構造をケモカイン受容体のものと比較して、タンパク質と結合する化合物を同定する。エネルギー項を用いてタンパク質と化合物との間の結合親和性を評価し、タンパク質と結合する確率が高い化合物を決定する。
IV．ケモカイン受容体の複数の異なるトポロジーの検出
目的のケモカイン受容体の複数の異なるトポロジーを検出するためにアッセイ法を用いることができる。例えば、イムノアッセイ法を用いて、ケモカイン受容体のトポロジーを定性的または定量的に分析することができる。適用しうる技術に関する一般的な概説は、Harlow & Lane、「Antibodies：A Laboratoiy Manual」(1988)に記載されている。または、ケモカイン受容体の特定のトポロジーに対する親和性を備えた非抗体分子を、ケモカイン受容体のトポロジーの検出に用いることもできる。
リガンド特異性は複数のトポロジー間で異なると考えられる。このため、特定のリガンド（例えば、ケモカイン）との結合能は、ケモカイン受容体の特定のトポロジーが存在することを意味する。例えば、図2に示したように、CXCR4がケモカインI-TACと結合しうることは、CXCR4が乳癌細胞で認められるトポロジーを有していることを示す。この方法は、他の癌（例えば、卵巣癌、子宮頸癌、神経膠芽腫、バーキットリンパ腫など）の同定にも同様に適用可能である。
A．標的タンパク質に対する抗体
目的のタンパク質またはタンパク質の特定のトポロジーと特異的に反応するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製するための方法は当業者に周知である（例えば、Coligan、前記；ならびにHarlowおよびLane、前記；Stitesら、前記およびそれに引用された参考文献；Goding、前記；ならびにKohlerおよびMilstein、Nature, 256: 495-497 (1975)を参照されたい）。このような技法には、ファージベクターまたは類似のベクターにおける組換え抗体のライブラリーからの抗体の選択による抗体の調製が含まれる（例えば、Huseら、前記；およびWardら、前記を参照のこと）。例えば、イムノアッセイ法に用いるための抗血清を作製するためには、本明細書の記載のように、目的のタンパク質またはその抗原性断片を単離する。例えば、組換えタンパク質を形質転換細胞系において産生させる。マウス、ラット、モルモット、またはウサギの近交系に対して、フロイントアジュバントなどの標準的アジュバントおよび標準的な免疫処置プロトコールを用いてタンパク質の免疫処置を行う。または、本明細書に開示する配列に由来し、担体タンパク質と結合させた合成ペプチドを免疫原として用いることもできる。もう1つの選択肢は、そのタンパク質（例えば、特定のトポロジーのもの）を発現する細胞、または特定のトポロジーを含む膜画分もしくはリポソームを抗原として用いることである。例えば、CXCR4の乳癌特異的なトポロジーを発現する乳癌細胞株を、そのトポロジーに対して特異的な抗体を産生させるために用いることができる。続いて、細胞、膜画分、またはリポソームに対して産生された抗体を、タンパク質との結合に関して選択する。この方法は、タンパク質のその特定のトポロジーが特定の細胞種における発現に依存的である場合に特に有用である。
ポリクローナル血清を収集し、イムノアッセイ法、例えば、固体支持体上に固定した免疫原を用いる固相イムノアッセイ法において、免疫原に対する力価測定を行う。力価が10４またはそれ以上であるポリクローナル抗血清を選択し、競合結合イムノアッセイ法を用いて、ケモカイン受容体の異なるトポロジー、または場合によっては他の相同タンパク質との交差反応性を調べる。特異的なポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は通常、少なくとも約0.1mMのKD、より一般的には少なくとも約1μM、好ましくは少なくとも約0.1μMまたはそれ未満、最も好ましくは0.01μMまたはそれ未満のKDで結合すると考えられる。
抗体、例えば組換え抗体、モノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体の調製には、当技術分野で知られた多くの技法を用いることができる（例えば、Kohler & Milstein, Nature 256: 495-497 (1975)；Kozborら、Immunology Today 4: 72 (1983)；Coleら、pp.77-96、「Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy」、Alan R. Liss, Inc. (1985)；Coligan、「Current Protocols in Immunology」(1991)；Harlow & Lane、「Antibodies, A Laboratory Manual」(1988)；ならびにGoding、「Monoclonal Antibodies: PrinciplesおよびPractice」（第2版、1986）を参照されたい）。目的の抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を細胞からクローニングし、例えば、モノクローナル抗体をコードする遺伝子をハイブリドーマからクローニングして、組換えモノクローナル抗体の作製に用いることができる。モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子ライブラリーをハイブリドーマまたは形質細胞から作製することもできる。重鎖および軽鎖の遺伝子産物のランダムな組み合わせにより、抗原特異性の異なる抗体の大規模プールが生じる（例えば、Kuby, 「Immunology」（第3版、1997）を参照）。一本鎖抗体または組換え抗体の作製のための技法（米国特許第4,946,778号、米国特許第4,816,567号）は、本発明のポリペプチドに対する抗体の作製に応用しうる。また、トランスジェニックマウスまたは他の哺乳動物などの他の生物を、ヒト化抗体またはヒト抗体を発現させるために用いることもできる（例えば, 米国特許第5,545,807号；第5,545,806号；第5,569,825号；第5,625,126号；第5,633,425号；第5,661,016号、Marksら、Bio/Technology 10: 779-783 (1992)；Lonbergら、Nature 368: 856-859 (1994)；Morrison, Nature 368: 812-13 (1994)；Fishwildら、Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996)；およびLonberg & Huszar、Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)を参照されたい）。または、選択した抗原と特異的に結合する抗体およびヘテロメリックFab断片を同定するためにファージディスプレイ技術を用いることもできる（例えば、McCaffertyら、Nature 348: 552-554 (1990)；Marksら、Biotechnology 10: 779-783 (1992)を参照されたい）。抗体を二重特異性のあるもの、すなわち、2つの異なる抗原を認識しうるものとして作製することもできる（例えば、国際公開公報第93／08829号、Trauneckerら、EMBO J. 10: 3655-3659 (1991)；およびSureshら、Methods in Enzymology 121: 210 (1986)を参照のこと）。抗体が、ヘテロ結合物（heteroconjugate）、例えば共有結合した2つの抗体、または免疫毒素であってもよい（例えば、米国特許第4,676,980号、国際公開公報第91／00360号；国際公開公報第92／200373号；および欧州特許第03089号を参照のこと）。
非ヒト抗体のヒト化または霊長類化のための方法は当技術分野で周知である。一般に、ヒト化抗体は、ヒト以外の源から導入された1つまたは複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒト性アミノ酸残基はしばしば移入残基と呼ばれ、これらは移入可変ドメインから採られることが一般的である。ヒト化は、齧歯類のCDRまたはCDR配列をヒト抗体の対応する配列の代わりに用いることにより、本質的にはWinterらの方法に従って行いうる（例えば、Jonesら、Nature 321: 522-525 (1986)；Riechmannら、Nature 332: 323-327 (1988)；Verhoeyenら、Science 239: 1534-1536 (1988)およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992)を参照）。したがって、この種のヒト化抗体は、完全なヒト可変ドメインとはほど遠い箇所が非ヒト種由来の対応する配列によって置換されたキメラ抗体である（米国特許第4,816,567号）。実際には、ヒト化抗体はいくつかのCDR残基、およびおそらくはいくつかのFR残基が、齧歯類抗体における類似部位からの残基によって置換されたヒト抗体であることが一般的である。
免疫原を含むさまざまなタンパク質を、目的のタンパク質と特異的または選択的に反応する抗体の作製に用いることができる。組換えタンパク質は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の作製のために好ましい免疫原である。天然のタンパク質を純粋または不純な状態で用いてもよい。本明細書に記載したタンパク質配列を用いて作製した合成ペプチドを、そのタンパク質に対する抗体の作製のための免疫原として用いることもできる。組換えタンパク質を真核細胞または原核細胞において発現させ、上に一般的に述べた通りに精製することができる。続いて、抗体を産生しうる動物の体内にその生成物を注入する。タンパク質を測定するためのイムノアッセイ法に後で用いるために、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれかを作製してもよい。
ポリクローナル抗体の作製方法は当業者に周知である。簡潔に述べると、免疫原、好ましくは精製タンパク質をアジュバントと混合した上で、動物に免疫処置を行う。検査採血を行い、ケモカイン受容体の特定のトポロジーに対する反応性の力価を測定することにより、免疫原調製物に対する動物の免疫応答を観測する。免疫原に対して適切な高い力価を持つ抗体が得られた時点で、動物から血液を採取し、抗血清を調製する。必要に応じて、タンパク質に反応する抗体を濃縮するために抗血清をさらに分画することもできる（HarlowおよびLane、前記を参照）。
モノクローナル抗体は、当業者によく知られた種々の技法によって入手しうる。通常は、望ましい抗原による免疫処置を受けた動物から得た脾細胞を、一般的には骨髄腫細胞との融合によって不死化させる（KohlerおよびMilstein、Eur. J. Immunol. 6: 511-519 (1976)を参照）。代替的な不死化の方法には、エプスタイン-バーウイルス、癌遺伝子もしくはレトロウイルスによる形質転換、または当技術分野で周知の他の方法が含まれる。単一の不死化細胞から生じたクローンを抗原に対する望ましい特異性および親和性に関してスクリーニングし、このような細胞によって産生されるモノクローナル抗体の収量を、脊椎動物宿主の腹腔内への注射を含む種々の技法によって高めることもできる。または、Huseら、前記に概要が示された一般的なプロトコールに従ってヒトB細胞由来のDNAライブラリーをスクリーニングすることにより、モノクローナル抗体またはその結合性断片をコードするDNA配列を単離することもできる。
標的タンパク質に特異的な抗体がひとたび得られれば、定性的および定量的な結果が得られる種々のイムノアッセイ法によってそのタンパク質を測定することができる。免疫学的手順およびイムノアッセイ法手順の概説については、Stites、前記を参照されたい。さらに、本発明のイムノアッセイ法を、Maggio, 「Enzyme Immunoassay」、CRC Press, Boca Raton, Florida (1980)；Tijssen、前記；ならびにHarlowおよびLane、前記に詳細に概説がなされた複数の方式のうち任意の形式で行うこともできる。
ヒト試料中の標的タンパク質を測定するためのイムノアッセイ法に、そのタンパク質（例えば、ケモカイン受容体の1つのトポロジー）またはその断片に対して産生されたポリクローナル抗血清を用いてもよい。この抗血清はケモカイン受容体の他のトポロジーに対する交差反応性が低くなるように選択し、イムノアッセイ法に用いる前にこの種の交差反応性を免疫吸着によって除去する。または、例えば、試料中のケモカイン受容体の総合レベルを決定するために、試料中のケモカイン受容体の複数または場合によってはすべてのトポロジーを認識する抗体を用いることもできる。
B．免疫学的結合アッセイ法
1つの好ましい態様において、目的のタンパク質は、よく知られたさまざまな免疫学的結合アッセイ法のうち任意のものを用いて検出および／または定量化される（例えば、米国特許第4,366,241号；第4,376,110号；第4,517,288号；および第4,837,168号を参照）。一般的なイムノアッセイ法の概説については、Asai, 「Methods in Cell Biology Volume 37：Antibodies in Cell Biology」、Academic Press, Inc. NY (1993)；Stites、前記を参照されたい。免疫学的結合アッセイ法（またはイムノアッセイ法）には一般に、分析物（この場合にはケモカイン受容体の1つのトポロジーまたはその抗原性部分配列）と特異的に結合し、しばしばそれを固定化する「捕捉剤（capture agent）」が用いられる。捕捉剤は分析物と特異的に結合する部分（moiety）である。1つの好ましい態様において、捕捉剤は、例えば、ケモカイン受容体の1つのトポロジーと特異的に結合する抗体である。抗体（例えば、抗ケモカイン受容体抗体）を、当業者に周知の数多くの手段および上記の手段のうち任意のものを用いて作製してもよい。
イムノアッセイ法には、捕捉剤および分析物によって形成された複合体と特異的に結合し、それを標識する標識剤もしばしば用いられる。標識剤はそれ自体が抗体／抗原複合体を含む部分の1つであってもよい。すなわち、標識剤が抗体／分析物複合体を含む部分の1つであってもよい。または、標識剤が、抗体／タンパク質複合体と特異的に結合する、別の抗体などの第3の部分であってもよい。
1つの好ましい態様において、標識剤は、標識を有する第2の抗体である。または、第2の抗体は標識を有しておらず、その代わりに、第2の抗体の由来となった種の抗体に対して特異的な標識された第3の抗体が結合していてもよい。第2の抗体は、酵素標識ストレプトアビジンなどの第3の標識分子が特異的に結合しうる、ビオチンなどの標識可能な部分によって調節することができる。
免疫グロブリン定常領域と特異的に結合しうるプロテインAまたはプロテインGなどの他のタンパク質を標識剤としても用いてもよい。これらのタンパク質は、連鎖球菌の細胞壁の通常の構成要素である。それらは、さまざまな種に由来する免疫グロブリン定常領域に対して強い非免疫原性反応性を示す（例えば、概論については、Kronvalら、J. Immunol. 111: 1401-1406(1973)；およびAkerstromら、J. Immunol. 135: 2589-2542(1985)を参照）。
アッセイ法全体を通じて、試薬の各々の組み合わせを用いた後には、インキュベーションおよび／または洗浄の工程が必要と思われる。インキュベーションの工程は、約5秒から数時間、好ましくは約5分から約24時間の範囲でさまざまでありうる。インキュベーション時間は、アッセイ形式、分析物、溶液の容積、濃度などに依存すると考えられる。通常、アッセイ法は室温で行うが、10℃〜40℃といった一定範囲の温度で行うこともできる。
1．非競合アッセイ形式
組織試料から目的のタンパク質を検出するためのイムノアッセイ法は競合的でも非競合的でもよい。非競合イムノアッセイ法は、捕捉された分析物（例えば、タンパク質）の量を直接測定するアッセイ法である。例えば、1つの好ましい「サンドイッチ」アッセイ法では、捕捉剤（例えば、抗ケモカイン受容体抗体）を、それを固定化するための固体基質に対して直接結合させることができる。続いて、これらの固定化された抗体は、被験試料中に存在する1つのトポロジーのケモカイン受容体を捕捉する。このようにして固定化されたケモカイン受容体に対して、次に、標識を有する第2の抗ケモカイン受容体抗体などの標識剤を結合させる。または、第2の抗体には標識がなく、その代わりに、第2の抗体の由来となった種の抗体に対して特異的な第3の抗体をそれと結合させてもよい。第2の抗体は、酵素標識ストレプトアビジンなどの第3の標識分子が特異的に結合しうる、ビオチンなどの標識可能な部分によって調節することができる。
2．競合アッセイ形式
競合アッセイ法では、試料中に存在する分析物によって捕捉剤から解離した（競合に敗れた）、添加した（外因性の）分析物（例えば、ケモカイン受容体の目的のトポロジー）の量を測定することにより、試料中に存在する標的タンパク質（分析物）の量を間接的に測定する。1つの競合アッセイ法では、既知の量の目的のタンパク質を試料に添加し、続いて試料を捕捉剤、この場合にはケモカイン受容体の1つのトポロジーと特異的に結合する抗体と接触させる。抗体と結合した免疫原の量は、試料中に存在する免疫原の濃度と反比例する。1つの特に好ましい態様では、抗体を固体基質上に固定化する。例えば、抗体と結合したケモカイン受容体の量は、ケモカイン受容体タンパク質／抗体複合体中に存在する被験タンパク質の量を測定することにより、または、複合体を形成していない残ったタンパク質の量を測定することによって決定しうる。標識したケモカイン受容体分子を用意することにより、ケモカイン受容体の量を検出することもできる。
競合結合形式のイムノアッセイ法を、交差反応性の決定に用いることもできる。例えば、本明細書に記載した配列によってコードされるタンパク質を、固体支持体または無傷細胞、または目的のタンパク質を含む天然もしくは人工的な膜上に固定化することができる。固定化された抗原に対する抗血清の結合と競合するタンパク質（例えば、ケモカイン受容体）をアッセイ系に添加する。上記のタンパク質が、固定化されたタンパク質に対する抗血清の結合と競合する能力を、本明細書に記載したいずれかの配列によってコードされるタンパク質のものと比較する。上記のタンパク質に関する交差反応性の比率を、標準的な計算を用いて算出する。上に挙げた添加したタンパク質のそれぞれとの交差反応性が10％未満であるような抗血清を選択してプールする。交差反応性のある抗体は、選択的には、例えば近縁性の低い相同体といった考慮されたタンパク質による免疫吸着により、プールした抗血清から除去される。
3．標識
アッセイ法に用いる個々の標識または検出可能基は、アッセイ法に用いる抗体の特異的結合に大きな妨げとならない限り、本発明の特に重要な面ではない。検出可能基は、検出可能な物理的または化学的特性を有する任意の物質でありうる。このような検出可能な標識はイムノアッセイ法の分野では十分に開発されており、通常、このような方法に有用なほとんどすべての標識を本発明に適用することができる。すなわち、標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電子的、工学的、または化学的な手段によって検出可能な任意の組成物である。本発明において有用な標識には、磁気ビーズ（例えば、Dynabeads（商標））、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、イソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミンなど）、放射性標識（例えば、３H、１２５I、３５S、１４C、または３２P）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびELISAに一般に用いられる他のもの）、およびコロイド金または着色ガラスまたはプラスチックビーズ（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）などの比色定量用標識が含まれる。
標識を、当技術分野で周知の方法に従って、アッセイ法の望ましい構成要素に直接的または間接的に結合させてもよい。以上に示した通り、非常にさまざまな標識を用いることができ、標識の選択は必要な感度、化合物との結合の容易さ、安定性の必要条件、用いうる装置、および廃棄への対応に依存する。
非放射性標識はしばしば間接的な手段によって結合させる。酵素または蛍光団との結合などにより、分子をシグナル生成化合物と直接結合させることもできる。種々の酵素および蛍光化合物を本発明の方法に用いることができ、これらは当業者に周知である（用いうるさまざまな標識システムまたはシグナル生成システムの概説については、例えば、米国特許第4,391,904号を参照されたい）。
標識の検出手段は当業者に周知である。すなわち、例えば、標識が放射性標識であれば、検出のための手段には、シンチレーションカウンターまたはオートラジオグラフィーの場合の写真フィルムが含まれる。標識が蛍光標識であれば、適切な波長の光で蛍光色素を励起させ、その結果生じた蛍光を検出することによってそれを検出しうる。蛍光は、肉眼的に、写真フィルムにより、電荷結合素子（CCD）または光電子増倍管などの電子検出装置の使用によって検出しうる。同様に、酵素標識は、酵素に対する適切な基質を提供し、その結果得られた反応生成物を検出することにより検出することができる。さらに、単純な比色定量標識は、標識に伴う色を単に観察することによって検出しうる。すなわち、種々の試験紙アッセイ法において、結合した金はしばしば薄赤色に見え、一方、種々の結合ビーズはビーズの色に見える。
いくつかのアッセイ形式には、標識成分を用いる必要がない。例えば、凝集アッセイ法を用いて標識抗体の存在を検出することができる。この場合には、標的抗体を含む試料により、抗原をコーティングした粒子を凝集させる。この形式では、どの成分も標識する必要はなく、単純な肉眼検査によって標的抗体の存在が検出される。
V．結合性物質を有する細胞の単離方法
ケモカイン受容体の特定のトポロジーと特異的に結合する作用物質は、特定のトポロジーを有する細胞集団の単離、同定、および検出のために用いうる。例えば、試料中の、特定のトポロジーを発現する白血球部分集団または腫瘍細胞を検出することができる。または、特定のトポロジーを発現する細胞を、そのトポロジーを発現する細胞と結合してそれを試料から精製するための作用物質を用いて試料から単離することもできる。細胞の単離方法の例には、アフィニティークロマトグラフィー、ならびに細胞数測定および蛍光活性化セルソーター（FACS）の使用が含まれる。
さらに、特定のトポロジーを示す細胞の検出および単離を、標識されて（蛍光タグ、放射能、またはその他の標準的なタンパク質標識法による）細胞選別に用いられるトポロジー特異的ケモカインリガンドを用いて行うこともできる。または、ケモカインリガンドを、「捕捉」剤としての固相（ガラス、プラスチック、ラテックスビーズ、または磁性ビーズ）基質に結合させてもよい。このような固相捕捉方法は「パニング」技術として広く知られており、罹患細胞または正常細胞における、目的のケモカイン受容体の特定のトポロジー形態を発現する細胞の単離、精製、およびさらなる濃縮のために用いることができる。
VI．組成物、キット、統合システム、およびプロテオミクス応用
本発明は、抗ケモカイン受容体抗体、または受容体の特定のトポロジーを特異的に検出するその他の作用物質を用いて、本明細書に記載したアッセイ法を実施するための、組成物、キット、および統合システムを提供する。
本発明は、固相アッセイ法に用いるためのアッセイ法組成物を提供する；このような組成物は、例えば、ケモカイン受容体の特定のトポロジー（例えば、トポロジーを保っている細胞の一部、膜画分、たはリポソームとして（例えば、Babcokら、J. Biol. Chem. 276(42) : 38433-40 (2001)；Mirzabekovら、Nat. Biotechnol. 18(6) : 649-54 (2000)を参照））が固体支持体上に固定化されたもの、および標識試薬を含みうる。それぞれの場合に、アッセイ法組成物は、ハイブリダイゼーションのために望ましい別の試薬も含みうる。例えば、固体支持体は、ペトリ皿、マルチウェルプレート、またはマイクロアレイなどでありうる。さらに、ケモカイン受容体の特定のトポロジーと特異的に結合するペプチド配列を同定するために、ペプチドライブラリーのマイクロアレイを用いることもできる。
ケモカイン受容体のあるトポロジーと特異的に結合する作用物質をアッセイ法組成物に含めることもできる。例えば、ケモカイン受容体の特定のトポロジーと特異的に結合する抗体を固体支持体上に固定化することができる。これらの態様のいくつかにおいて、作用物質は、特定のケモカイン受容体トポロジーまたはそのトポロジーを発現する細胞の有無を検出するために用いられる。例えば、固体支持体はペトリ皿、マルチウェルプレート、またはマイクロアレイでありうる。
本発明はまた、本発明のアッセイ法を行うためのキットも提供する。本キットは一般に、ケモカイン受容体の1つのトポロジーと特異的に結合する作用物質（例えば、抗体またはその他の低分子）および作用物質の存在を検出するための標識を含む。本キットは1つまたは複数のケモカイン受容体ポリペプチドを含みうる。キットは上記の組成物のいずれかを含むことができ、選択的にはさらに、ケモカイン受容体の活性または機能に対する影響に関するハイスループットアッセイ方法を行うための指示書といった別の構成要素、1つまたは複数の容器または区画（例えば、プローブ、標識などを保持するための）、ケモカイン受容体の機能または活性の対照調節物質、キットの成分を混合するためのロボット型アーマチュアなども含む。
いくつかの態様において、キットは、組織試料中のCXCR4がI-TACと結合するか否かを検出するための成分を含む。いくつかの態様において、キットは、例えば、標識もしくはタグ付加がなされたSDF-1および非放射性競合I-TAC、または標識もしくはタグ付加がなされたI-TACおよび非放射性競合SDF-1を含む。標識またはタグ付加がなされたケモカインには、当業者に知られた任意の様式で標識またはタグの付加を行いうる。いくつかの態様において、標識ケモカインはビオチンまたは蛍光性標識による放射標識もしくはタグ付加を受けている。代替的または追加的に、キットは、I-TAC検出用の抗I-TAC結合試薬（例えば、抗体）を含みうる。キットはまた、無傷細胞または細胞膜などに対して競合結合アッセイ法を行うための適切な塩緩衝液および他の試薬も含みうる。この種の試薬は例えば、以下の実施例に記載されている。いくつかの面において、本キットは、ケモカイン-CXCR4結合を測定するための固体支持体または容器も含む（例えば、シンチレーションカウンターまたは自動プレートリーダーとの適合性がある反応用のプレート形式）。いくつかの面において、キットは、キットを例えば本発明の方法に用いるための指示書を含む。
本発明はまた、ケモカイン受容体の活性または機能に対する影響に関する、調節物質候補のハイスループットスクリーニングのための統合システムも提供する。本システムは一般に、液体を源から目的地まで移動させるためのロボット型アーマチュア、ロボット型アーマチュアを制御するための制御装置、標識検出器、標識検出を記録するデータ記憶装置、および、反応混合物を有するウェルを含むマイクロタイターディッシュまたは固定された核酸もしくは固定化部分を含む基質などのアッセイ成分を含む。
さまざまなロボット型液体輸送システムが入手可能であり、または既存の構成部品を用いて容易に製造することもできる。例えば、Microlab 2200（Hamilton；Reno, NV）ピペット操作ステーション（pipetting station）を用いるZymate XP（Zymark Corporation；Hopkinton, MA）自動化ロボットを用いて、並列的な試料を96ウェルマイクロタイタープレートに移し、複数の同時並列的な結合アッセイ法を設定することができる。
カメラまたはその他の記録装置（例えば、光ダイオードおよびデータ記憶装置）によって観測された（および、選択的には記録された）光学画像は、選択的にはさらに、本明細書における態様のいずれかにより、例えば、画像のデジタル化ならびにコンピュータ上での画像の記録および分析などによって処理される。PC（Intel x86またはPentiumチップ互換のDOS（登録商標）、OS2（登録商標）WINDOWS（登録商標）、WINDOWS NT（登録商標）、WINDOWS95（登録商標）、WINDOWS98（登録商標）、またはWINDOWS2000（登録商標）ベースのコンピュータ）、MACINTOSH（登録商標）またはUNIX（登録商標）ベースの（例えば、SUN（登録商標）ワークステーション）コンピュータなどを用いて、デジタル化されたビデオ画像またはデジタル化された光学画像のデジタル化、保存、および分析を行うための、さまざまな市販の周辺機器およびソフトウエアが入手可能である。
従来のシステムの一つは、標本野からの光を、当技術分野で一般的に用いられる、冷却した電荷結合素子（CCD）カメラに伝える。CCDカメラは画像素子（ピクセル）のアレイを含んでいる。標本からの光はCCD上で画像化される。標本の領域（例えば、生体重合体のアレイ上の個々のハイブリダイゼーション部位）に対応する個別のピクセルがサンプリングされ、各位置に関して光強度の読み取り値が得られる。速度を高めるために多数のピクセルが並列的に処理される。本発明の装置および方法は、例えば蛍光顕微鏡法または暗視野顕微鏡法などにより、任意の試料を観測するために容易に用いられる。
VII．投与および薬学的組成物
ケモカイン受容体の特定のトポロジーに対する調節物質（例えば、アンタゴニストまたはアゴニスト）を、インビボでのケモカイン受容体シグナル伝達の調節のために、哺乳動物対象に対して直接投与することができる。投与は、調節性化合物を導入し、治療しようとする組織に最終的に接触させるために通常用いられ、当業者に周知である任意の経路によって行われる。特定の化合物の投与には複数の経路を用いうるが、1つの特定の経路で別の経路よりも即時的かつより効果的な反応が得られることがしばしばである。
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体を含みうる。薬学的に許容される担体は、一部には、投与する個々の組成物、さらには組成物の投与に用いる個々の方法によって決まる。したがって、本発明の薬学的組成物には適した製剤が広範囲にわたって存在する（例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」、第17版、1985）を参照）。
ケモカイン受容体の発現または活性に対する調節物質（例えば、アゴニストまたはアンタゴニスト）は、単独で、または他の適した成分と組み合わせて、吸入によって投与するためのエアロゾル製剤（すなわち、それらは「噴霧」することが可能である）の形にすることができる。エアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの加圧した許容される噴霧剤中に入れることができる。
投与のために適した製剤には、水性および非水性の溶液、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、および製剤を等張化する溶質を含みうる等張滅菌溶液、ならびに懸濁化剤、溶解補助剤、濃稠化剤、安定剤、および保存料を含みうる水性および非水性の滅菌懸濁液が含まれる。本発明の実践に際しては、組成物を例えば経口的、鼻腔内、局所的、静脈内、腹腔内、膀胱内、または髄腔内に投与することができる。化合物の製剤は単位用量または複数回の用量がアンプルまたはバイアルなどの容器内に密封された形式で提供することができる。溶液および懸濁液は、以前に記載された種類の滅菌粉末、顆粒および錠剤から調製することができる。調節物質を調製済みの食品または薬剤の一部として投与することもできる。
患者に投与する用量は、本発明の状況においては、対象において一定期間にわたって有益な反応を生じさせるのに十分である必要がある。用量は、用いる個々の調節物質の有効性および対象の状態、さらには治療の対象となる体重または表面積によって決まると考えられる。また、用量の程度は、個々の対象における特定の化合物またはベクターの投与に伴う何らかの有害な副作用の存在、性質、および程度によっても決まると考えられる。
投与する調節物質の有効量を決定する際に、医師が調節因子の循環血漿中レベル、調節物質の毒性、および抗調節物質抗体の産生を評価してもよい。一般に、調節物質当量としての用量は、一般的な対象の場合、約1ng／kg〜10mg／kgの範囲である。
投与に関しては、本発明の調節物質を、調節物質のLD-50、ならびに化合物の種々の濃度での副作用を対象の体重および全般的健康状態に当てはめることによって決定される速度で投与することができる。投与は単回投与によっても分割投与によっても行える。
VIII．特定トポロジーの検出および疾患の診断
本発明は、試料中のケモカイン受容体の特定のトポロジーを検出する方法を提供する。タンパク質と結合する作用物質を用いる検出方法はよく知られており、これには例えば、フローサイトメトリーが含まれる。フローサイトメトリーを用いると、混合集団内の目的の特定抗原を発現する細胞を同定することができる。簡潔に述べると、細胞を、目的のタンパク質（例えば、1つのトポロジーの状態にあるが第2のトポロジーにはない）に対して特異的な抗体と反応させる。抗体を蛍光標識してもよく（直接的な染色方法）、またはそれを標識しない場合には、第1の抗体と反応する第2の抗体を蛍光標識することもできる（間接的な染色方法）。続いて細胞を、蛍光シグナルの検出が可能な装置に通過させる。細胞を吸引し、単細胞懸濁液を作製する。この細胞懸濁液に、この時点では細胞に結合している蛍光色素標識抗体を励起するレーザーを透過させ、このデータを収集する。輝度の高い（すなわち、蛍光標識抗体と反応する）ことが認められた細胞は目的のタンパク質を発現している；輝度の低い（すなわち、蛍光標識抗体と反応しない）細胞は目的のタンパク質を発現していない。
本発明は、ある1つのケモカイン受容体のどのトポロジーが、例えば乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、膠芽腫、白血病、およびバーキットリンパ腫を含む癌、さらには関節リウマチ、多発性硬化症、心臓同種移植拒絶反応、アテローム性動脈硬化、喘息、糸球体腎炎、接触皮膚炎、炎症性腸疾患、大腸炎、乾癬、再潅流傷害、さらには本明細書に記載する他の障害および疾患を非制限的に含む、ヒト疾患を引き起こすことに関与しているかを診断する方法を提供する。これらの疾患のそれぞれに関して、診断は、フローサイトメトリーまたは特定のエピトープを含む分子を検出する他の方法を用いて一群の選択的モノクローナル抗体によって特徴づけられる、関与するケモカイン受容体の特定のトポロジーの評価を含みうる。実施例を含め、本明細書で提示するように、正常および罹患した細胞および組織を、規定された一群の抗ケモカイン受容体モノクローナル抗体またはケモカインに対する反応性のパターンの違いに基づいて区別することができる。例えば、MCF-7細胞に認められるCXCR4トポロジーを特異的に検出することにより、試料中の癌細胞を検出しうる。
さらに、複数のケモカイン受容体トポロジー間のリガンド結合性の違いを検出することもでき、このような違いを、特定のトポロジーを発現する細胞の検出に用いることもできる。リガンドには、天然ケモカインのほか、特定のトポロジーに対する特異性を備えた低分子が含まれうる。罹患状態が特定の細胞種に随伴する場合には、細胞種の検出によって罹患状態の検出がもたらされる。例えば、本明細書に記載するように、乳癌細胞上に発現されるCXCR4のトポロジーはケモカインI-TACと特異的に結合する。IL-2培養リンパ球およびT細胞系におけるCXCR4のトポロジーはI-TACとは結合しない。したがって、細胞がCXCR4を介してI-TACと結合しうることは癌細胞の存在を示す。1つの例示的な方法では、組織生検試料を用意し、I-TACと結合するCXCR4のトポロジーを含む細胞を組織が含むか否かを判定する。I-TACと結合するCXCR4のトポロジーの存在によって癌細胞の存在が示される。I-TACを検出することによる癌細胞の検出は、例えば、診断のために、ならびに癌の診断後の治療前または治療後（化学療法を含む）に組織を評価するのに有用である。癌細胞には、例えば、乳癌細胞、卵巣癌、子宮頸癌、バーキットリンパ腫、膠芽腫などが含まれうる。
ケモカインと特定のケモカイン受容体との特異的結合は、当業者に知られた任意の方法に従って検出しうる。1つの例示的な方法では、既知のケモカイン受容体リガンドを用いる競合実験でケモカイン結合を検出する。例えば、I-TAC結合がCXCR4との相互作用によるか否かを判定するためには、I-TAC結合がSDF-1などの既知のCXCR4リガンドと競合しうるか否かを判定するとよい。
ケモカインの結合は組織試料（例えば、生検試料）を用いて判定することができ、または、組織の原位置で直接観測することもできる（例えば、放射標識したケモカインの画像化を用いる）。
罹患状態と関連のあるケモカイン受容体トポロジーが組織試料を用いてひとたび特徴づけられれば、患者由来の診断用試料におけるそのケモカイン受容体トポロジーを評価することができる。続いて、ケモカイン受容体トポロジーのそうした違いを、その疾患の臨床診断における鑑別用の特徴またはマーカーとして利用することができる。ケモカイン受容体トポロジーの特徴づけによる疾患および現在の臨床状態の鑑別診断は、ケモカイン受容体を介した疾患の転帰または予後と相関する、またはそれを予測する、新規な検出方法をもたらす。
IX．ワクチン
ケモカイン受容体トポロジーは、特に、抗体結合性表現型の点から区別される。抗体結合性表現型は、同一の受容体の複数のトポロジー上に共通かつ特有のエピトープがあり、一方、他のエピトープが特定のトポロジーに特有であることを示す。同一のケモカイン受容体の複数の異なるトポロジーは同一のアミノ酸配列を有するため、特有なエピトープは異なるトポロジーを区別するように生成される。特定のトポロジーに特有なエピトープはその特有のエピトープが病態を誘発する細胞、例えば腫瘍細胞上に発現される場合には、臨床用途に利用される。これらの場合に、個々の受容体トポロジーに共通するエピトープは、標準的なエピトープマッピングにより、例えば、受容体の細胞外ドメイン全体にわたる連続したペプチド（例えば、約12mer〜約18mer）を作製して、それらのペプチドに対する適切な「共通」抗体の結合を評価することにより、同定される。個々の抗体結合ペプチドに関する微細なエピトープマッピングは、各回毎に1つのアミノ酸位置に変更を加えた類縁ペプチドのファミリーを作製することによって行いうる。共通エピトープが同定されたならば、そのような共通エピトープを除去した組換え型の受容体を作製する。これは例えば、同じ受容体をコードするcDNAの共通エピトープの部位での点変異誘発、または受容体を変異もしくは改変させる他の方法によって行いうる。続いて、1つのトポロジー（例えば、病態関連トポロジー）に特有なエピトープのみを含む変異型のcDNAまたはコードされるポリペプチドを、病態を引き起こす細胞、例えば腫瘍細胞上に発現される受容体トポロジーに対して個体に予防的または治療的なワクチン接種を行うための免疫原として利用する。例えば、いくつかの態様においては、MCF-7細胞に認められるCXCR4トポロジーの特有のエピトープを含む抗原を、癌細胞、例えば、乳癌細胞、子宮頸癌細胞、子宮頸癌細胞、バーキットリンパ腫細胞、膠芽腫細胞、またはその他の癌細胞に対する免疫応答を誘発させるために用いる。いくつかの態様においては、変異型または改変型のcDNAを、適した細胞種、例えばHLAを一致させた細胞種において、その細胞へのトランスフェクションによって発現させる。変異型cDNAを発現する細胞は、注射（例えば、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内など）を含む、種々の様式で投与しうると考えられる。または、特有のエピトープを含むが共通エピトープは含まないペプチドを担体と結合させてワクチンとして用いることも可能と考えられる。さらに、ケモカイン受容体の特定のトポロジーに対して特異的なエピトープをコードするポリヌクレオチドをベクター中に挿入して、遺伝子治療のために用いることもできる。
免疫原は当技術分野で知られたさまざまな溶液および他の化合物と配合または混合することができる。ワクチンは注射剤、液剤、または乳剤として調製しうる。本発明のポリペプチドを、ポリペプチドと適合性のある薬学的に許容される添加剤と混合してもよい。添加剤には水、食塩液、デキストロース、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせが含まれうる。ワクチンがさらに、湿潤剤もしくは乳化剤、pH緩衝剤などの補助物質、またはワクチンの有効性を増強するためのアジュバントを含んでもよい。
このようなアジュバントまたは薬剤の例には、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム（ミョウバン）、硫酸ベリリウム、シリカ、カオリン、炭素、油中水型乳剤、水中油型乳剤、ムラミルジペプチド、細菌内毒素、リピドX、コリネバクテリウム・パルブム(Corynebacterium Parvum)（プロピオノバクテリウム・アクネス(Propionobacterium acnes)）、百日咳菌、ポリリボヌクレオチド、アルギン酸ナトリウム、ラノリン、リゾレシチン、ビタミンA、サポニン、リポソーム、レバミゾール、DEAE-デキストラン、ブロック共重合体、またはその他の合成アジュバントが含まれる。このようなアジュバントはさまざまな販売元から市販されており、例えば、メルクアジュバント65（Merck Adjuvant 65）（Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.）またはフロイント不完全アジュバント、および完全アジュバント（Difco Laboratories, Detroit, Michigan）などがある。その他の適したアジュバントには、Amphigen（水中油型）、Alhydrogel（水酸化アルミニウム）、またはAmphigenとAlhydrogelとの混合物がある。ヒトへの使用が承認されているのはアルミニウムのみである。
免疫原とアジュバントとの比率は、その両者が有効量として存在する限り、広範囲にわたってさまざまでありうる。例えば、水酸化アルミニウムはワクチン混合物の約0.5％の量として存在しうる（Al２O３ベースで）。1回の投与量としては、免疫原の量は患者1人当たりタンパク質約5μg〜約100μgの範囲でありうる。好ましい範囲は投与1回当たり約20μg〜約40μgである。適した投与容量は約0.5mlである。このため、筋肉内注射用の1回の投与量は、例えば、20μgの免疫原が0.5％水酸化アルミニウムと混合されたものを含む0.5mlから構成されると考えられる。
一般に、ワクチンは免疫原を最終濃度0.2〜200μg／mlの範囲で含むように製剤化される。製剤化の後に、ワクチンを滅菌容器に収容した上で密封し、低温、例えば4℃で保存してもよく、またはこれを凍結乾燥してもよい。凍結乾燥により、滅菌形態での長期保存が可能になる。
ワクチンは、経口投与および非経口的（例えば、皮下または筋肉内）注射を含む、ワクチン投与のための任意の慣例的な方法によって投与しうる。処置はワクチンの単回投与でもよく、一定期間にわたる多回投与からなってもよい。本発明の免疫原を、標的細胞の他のエピトープを含む、適切な用量の化合物と配合することができる。また、免疫原が、経口投与に適合しうる組換えワクチンの成分であってもよいと考えられる。
完全な受容体タンパク質または断片のいずれを用いるかに関係なく、ヒトなどの動物に免疫処置を行うには慣例的なプロトコールが存在する。皮下注射などの非経口投与の場合、適した担体は破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、血清アルブミンおよびヤツメウナギヘモシアニン、またはキーホールリンペットヘモシアニンであり、これは、それらにより結果として遺伝的拘束が極めてわずかな結合物が得られるためである。これらの汎用担体を含む結合物は、非常にさまざまな遺伝子セットを有する個体においてT細胞クローンの活性化物質として作用しうる。
経口製剤は、例えば医薬品級のサッカリン、セルロース、および炭酸マグネシウムといった通常用いられる添加剤を含みうる。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性製剤、または粉剤の形態をとり、本発明のポリペプチドを10〜95％の比率で含む。
本発明のペプチドを経鼻的な投与用に製剤化することもできる。担体が固体である、鼻腔内投与のために適した製剤には、粒径が例えば約10〜約500ミクロンである粗末が含まれ、これは鼻吸入を行う様式で、すなわち鼻の近くに保持した粉末容器からの経鼻的な急速吸入によって投与される。担体が液体である場合、例えば鼻噴霧薬、点鼻薬としての投与、またはネブライザーによるエアロゾル投与の場合に適した製剤には、有効成分の水溶液または油性溶液が含まれる。このような投与の種々の様式は当技術分野で周知である。鼻腔投与のための医薬製剤は、ベンジルアルコールもしくはその他の適した保存料、生物学的利用能を高めるための吸収促進剤、フルオロカーボン、および／または当技術分野で知られたその他の可溶化剤もしくは分散剤を用いて、食塩液溶液として調製することができる。鼻腔投与のための単位用量は、単位投薬剤形当たりの有効成分として7〜3000mg、好ましくは70〜mg、最も好ましくは1〜10mgでありうる。
実施例
実施例1
本実施例は、CXCR4が、異なる細胞では異なるトポロジーを形成することを示す。
材料および方法
試薬および細胞
ヒト、ウイルスおよびマウスの組換えケモカインを、指示の通りに、R&D Systems（Minneapolis, MN）およびPeproTech（Rocky Hill, NJ）から入手した。１２５I標識SDF-1αはPerkinElmer Life Sciences, Inc.（Boston, MA）から購入し、１２５I標識I-TACはAmersham Pharmacia Biotech（Buckinghamshire, UK）から入手した。フローサイトメトリーおよびリガンド結合競合に用いたモノクローナル抗体はR&D Systems（Minneapolis, MN）から入手した：抗CXCR4クローン12G5、44708.111（171）、44716.111（172）、44717.111（173）、nmIgG2a、およびnmIgG2b。フローサイトメトリーによる抗体結合の検出には二次抗体、ヤギ抗マウスIgG PE結合物（Coulter Immunotech, Miami, FL）を用いた。以下の細胞株はAmerican Type Culture Collection（Manassas, VA）から入手した：MCF-7（腺癌；乳腺）、MDA MB-231（腺癌；乳腺）、MDA MB-435s（乳管癌；乳腺）、DU 4475（乳腺）、ZR 75-1（乳管癌；乳腺）、およびHEK 293（ヒト胎児腎臓）。CEM-NKr（急性リンパ性白血病；末梢血；Tリンパ芽球）細胞はNIHのAIDS Research and Reference Reagent Programから入手した。細胞株は、5％CO２／空気混合ガスを満たした加湿インキュベーター内で、10％ウシ胎仔血清（FBS）（HyClone Logan, UT）を添加したDMEM（Mediatech, Herndon, VA）中にて37℃で培養した。ヒト末梢血単核細胞（PBMC）は、Ficoll-Hypaque密度勾配下での遠心処理により、健常ドナーのバフィコートから入手した（Stanford Blood Center, Palo Alto, CA）。単離したPBMCを、5％CO２／空気混合ガスを満たした加湿インキュベーター内で、10％FBSを添加した37℃のRPMI-1640（Mediatech、Herndon、VA）中にて、2.5ug／mlフィトヘマグルチニン（PHA）（Sigma Chemical Company, St. Louis, MO）および10ng／ml組換えヒトIL-2（R&D Systems, Minneapolis, MN）により3日間にわたり活性化した。活性化の後に細胞を洗浄し、10％FBSおよび10ng／ml IL-2を添加したRPMI中にて、細胞を用いる日まで3〜4日毎に培地を交換しながら培養した。
結合性解析
本発明者らは、MCF-7細胞およびCEM-NKr細胞上のCXCR4とケモカインリガンドとの相互作用の全体的プロフィールの検討に、独自の技法であるDisplaceMaxを用いた。この技術では、以前に記載したように（Kledal T Nら、Science 277: 1656-1659 (1997)；Dairaghiら、J Biol Chem 274: 21569-74 (1999)；Gosling, J.ら、J Immunol 164: 2851-6 (2000)）、濾過プロトコールを用いる、拡張され、効率が最大限に高められた放射性リガンド結合を利用する。これらのアッセイ法において、DisplaceMaxは、記載したプロトコールを用いて（Dairaghiら、J Biol Chem 274: 21569-74 (1999)；Gosling, J.ら、J Immunol 164: 2851-6 (2000)）、１２５I放射標識したSDF-1αまたはI-TAC（指定の通り）を置換する能力に関して、110種を上回る別個の精製ケモカインによる、MCF-7細胞またはCEM-NKr細胞（指定通り）の同時インタロゲーションを用いる。簡潔に述べると、ケモカイン因子を細胞とともにインキュベートした後に、放射標識ケモカイン（１２５I SDF-1αまたは１２５I h I-TAC）を添加し、以下の結合培地（25mM HEPES、140mM NaCl、1mM CaCl２、5mM MgCl２、および0.2％ウシ血清アルブミン、pH 7.1に調整）中にて4℃で3時間おく。指定した場合には、抗CXCR4抗体またはアイソタイプ対照を結合反応に含める。これらの実験では、放射標識ケモカインの添加の前に、細胞を指定濃度の抗体とともに4℃で30分間プレインキュベートした。指定したいくつかのアッセイ法には低分子を含めた。これらのアッセイ法では、化合物を指定濃度でプレートに添加し、その後に放射標識ケモカインを添加した。続いて全アッセイ物を静かに攪拌しながら4℃で3時間インキュベータした。すべての結合アッセイ法において、インキュベーションの後に、反応物を吸引し、細胞収集装置（Packard）を用いてPEI処理GF／Bガラスフィルター（Packard）上に収集した上で2回洗った（25mM HEPES、500mM NaCl、1mM CaCl２、5mM MgCl２、pH 7.1に調整）。シンチラント（MicroScint 10, Packard）をウェルに添加し、フィルターをPackard Topcountシンチレーションカウンターでカウントした。データの解析およびプロットには、Prism（GraphPad Prismバージョン3.0a、マッキントッシュ用、GraphPad Software）を用いた。
１２５I SDF-1α受容体結合性の決定
上記の濾過利用アッセイ法を用いて、細胞を1）緩衝液のみ、2）過剰量のSDF-1β（最終90nM）、または3）MIG（最終175nM）のいずれかと指定の通りに4℃で30分間プレインキュベートした。このインキュベーション後に、指定した規定濃度の非放射性ケモカイン競合物質および１２５I h I-TACを結合反応物に添加した。続いて上記の通りにすべてのアッセイ物をインキュベートし、収集した上で分析した。
RT PCR
標準的な技法を用いてmRNAを細胞から単離した。PCRにより、CXCR3およびCXCR4の発現に関して相補的DNAを分析した。特異的プライマーはIntegrated DNA Technologies（Coralville, IA）から入手した。35サイクルの間の特異的PCR産物をHybaid Omn-E（E&K Scientific Products, Inc., Saratoga, CA）によって測定した。GAPDHを対照として測定した。
浸潤アッセイ法
浸潤アッセイ法は製造者の指示に従って行った。簡潔に述べると、ケモカインを、0.1％ウシアルブミン（Sigma Chemical Company, St. Louis, MO）を添加したHBSS（Life Technologies, Gaithersburg, MD）中に希釈した上で、BD BioCoatマトリゲル（Matrigel）浸潤チャンバー（BD Biosciences, Bedford, MA）の下方のウェルに添加した。MDA MB-231細胞をマトリゲルをコーティングしたインサートに添加し、プレートを、5％CO２／空気混合ガスを満たした加湿インキュベーター内で37℃にて22時間インキュベートした。このインキュベーション後に、インサートを新たなプレートに移し、インサート内の培地を除去した。各ウェルから綿棒を用いてマトリゲルプラグを採取した。続いて、フィルターをプロトコールHema染色システム（Biochemical Sciences, Inc., Swedesboro, NJ）を用いて染色した。浸潤細胞を、40倍レンズを装着したNikon Elipse E800（Nikon, Inc., Melville, NY）顕微鏡を用いて観察した。細胞を各フィルターにつき5つずつの視野で算定した。データは3回ずつ試験した各フィルターの5つの視野の平均を表す。
結果
最近の報告で、いくつかの腫瘍細胞種上でのCXCR4発現が同定されており（Sehgalら、J Surg Oncol 69: 99-104 (1998)；Sehgal, A.ら、J Surg Oncol 69: 239-48 (1998)；Burgerら、Blood 94: 3658-67 (1999)；Rempelら、Clin Cancer Res 6: 102-11 (2000)；Koshiba, T.ら、Clin Cancer Res 6: 3530-5 (2000)；Muller, A.ら、Nature 410: 50-6 (2001)；Robledoら、J Biol Chem 276: 45098-45105 (2001)）、その一例ではこの発現が乳房腫瘍細胞の転移と関連づけられている（Muller, A.ら、Nature 410: 50-6 (2001)）。腫瘍細胞表面のケモカイン受容体の役割をさらに検討するために、本発明者らはいくつかのヒト乳房腫瘍細胞株上でのCXCR4の発現の評価に着手した。最初に、CXCR4発現パターンをフローサイトメトリーによって評価した。抗CXCR4染色のT細胞性表現型を決定するために、初代IL-2培養Tリンパ球、ならびにCEM-NKrおよびジャーカットという2つのT細胞系を検討した。3種の乳房腫瘍細胞株MCF7、MDA MB-231、およびMDA MB-435sも検討した（図1,a）。検討した4種の抗CXCR4クローンはすべてT細胞を染色した。驚いたことに、乳房腫瘍細胞はCXCR4を発現すると報告されているが、広く用いられているクローン12G5では乳房腫瘍細胞上にCXCR4が検出されなかった。検討した他の3種のクローンでは乳房腫瘍細胞上に弱くかつ程度の異なる反応性が検出された。乳房腫瘍細胞株DU 4475およびZR 75-1もこのアッセイ法で検討したところ（非提示データ）、検討した他の乳房腫瘍細胞類似の抗体染色プロフィールが見いだされた。このため、CXCR4に対する一群のmAbの染色パターンからは、「白血球」性CXCR4表現型（CEM-NKr、ジャーカット、およびIL-2リンパ球の染色に代表される）および乳房腫瘍細胞性表現型（MCF-7およびMDA MB-231乳房腫瘍細胞株上での弱い染色に代表される）という異なる2種類の反応性が示唆されるように思われる。
最も広く用いられている抗CXCR4mAbであるクローン12G5を用いた場合に乳房腫瘍細胞上での反応性が常に認められなかったことから、本発明者らはRT PCRによってこれらの細胞におけるCXCR4発現を検討した。フローサイトメトリーで調べた3種の乳房腫瘍株のほか、CXCR4発現に関する陽性対照としてのIL-2培養リンパ球ならびにT細胞系CEM-NKrおよびジャーカットからmRNAを単離した。12G5では反応性がなく、検討した他の抗CXCR4クローンではさまざまな程度の反応性が得られたものの、乳房腫瘍細胞株MCF7およびMDA MB231はCXCR4 mRNAを発現した；しかし、MDA MB-435sはCXCR4発現に関して陰性であることが判明した。いずれの場合にもGAPDHを対照として測定した。mAb反応性の違いが、配列に違いがあり、そのために種々の細胞系でCXCR4におけるエピトープの差異が生じているためか否かを検討するために、本発明者らは次に、代表的なCXCR4+乳房腫瘍細胞としてのMCF-7および代表的なT細胞としてのCEM-NKrから得られたPCR産物の配列を決定した。これらの2つの細胞系から得られた配列は発表されているCXCR4配列と同一であり、このことは、CXCR4抗体プロフィールは異なるものの、この2つの細胞種におけるCXCR4の遺伝子構造、すなわちポリペプチド構造が同一であることを示唆する。
本発明者らは、広範囲にわたる一群のケモカインリガンドに対する受容体結合を同時に評価しうる一連の技法を以前に報告している（Dairaghiら、J Biol Chem 274: 21569-74 (1999)；Gosling, J.ら、J Immunol 164: 2851-6 (2000)）。本発明者らはこの手法によってCEM-NKr上でのCXCR4結合プロフィールを調べ、MCF-7細胞と比較した。90種を上回るケモカイン因子を、CEM-NKr細胞（図2）またはMCF-7細胞（図2）に対する結合に関して指標ケモカイン１２５I SDF-1αを置換する能力について調べた。予想された通り、CEM-NKr上での１２５I SDF-1αの高親和性競合物質の候補にはhSDF-1βおよびmSDF-1が含まれ、一方、hSDF-1αおよびHHV8 vMIP-IIは中等度の親和性競合と考えられるものを示した。これは、CXCR4に対する唯一の非ウイルス性リガンドであるという、SDF-1についてこれまでに報告されたすべての結果と一致する。しかし、MCF-7細胞上での競合の全体的パターンは著しく異なっていた。この細胞種では、hI-TACおよびmI-TACは同じ指標リガンドSDF-1に対して高親和性競合を示した。この特異な結果についてさらに検討するために、１２５I I-TACをMCF-7細胞上での指標リガンドとして調べた（図2）。MCF-7上で１２５I I-TACを用いた高親和性置換プロフィールは１２５I SDF-1αを用いて得られたプロフィールと同一であった。すなわち、MCF-7細胞上でI-TACおよびSDF-1は結合の点で区別なく振る舞い、同じ受容体部位に対して競合する。
I-TACおよびSDF-1の結合の特徴をさらに明らかにするために、CEM-NKrおよびMCF-7に対して選択した高親和性リガンド候補を用いる競合結合実験で用量反応曲線を作成した。DisplaceMaxのデータによって示唆された通り、I-TACはMCF-7に対する結合については１２５I SDF-1αと競合したが、CEM-NKrに対してはそうでなかった（図3）。１２５I SDF-1αと、SDF-1アイソフォームSDF-1αまたはSDF-1βのいずれかとの同族性競合は、CEM-NKrおよびMCF-7上での完全競合をもたらした（図3）。注目すべきことに、MCF-7上に発現された受容体に対するSDF-1の親和性はCEM-NKr上のものに対するよりも高かった。すなわち、CXCR4の配列はこの2つの細胞種で同一であるが、リガンド結合特異性および親和性はT細胞と乳房腫瘍細胞では異なる。
CXCR3はI-TACの主な受容体であることが以前から確立されているため（Cole, K. E.ら、J Exp Med 187: 2009-21. (1998)）、本発明者らは次に、MCF-7細胞上で検出されるI-TAC結合がCXCR4を介するか、それともCXCR3を介するかを検討した。この目的のために、「古典的な」CXCR3を介した結合（すなわち、報告されているCXCR3リガンドMIG、I-TAC、およびIP-10とCXCR3との結合）が阻害され、そのために「古典的な」CXCR4を介した結合（すなわち、報告されているCXCR4リガンドSDF-1とCXCR4との結合）が許容されると考えられる条件下、ならびにその反対の状況下で、１２５I I-TACの結合について検討した。MCF-7細胞を、培地のみ、過剰量のMIG（〜175nM；CXCR3を介した結合を阻害するため）を含む培地中、または過剰量のSDF-1β（〜90nM；CXCR4を介した結合を阻害するため）を含む培地中のいずれかでプレインキュベートした。I-TACはMCF-7細胞との結合に関して１２５I I-TACと競合し、IC50は1nMであり（図4, a）、このことから、これがこれらの細胞上のこの受容体に対する高親和性リガンドであることが裏づけられた。同様に、過剰量のMIGと最初にプレインキュベートした細胞からも同じ同族性I-TAC／１２５I I-TAC結合曲線が得られ、この場合もIC50は1nMであった（図4）。しかし、細胞を最初に過剰量のSDF-1βとプレインキュベートした場合には、すべての１２５I I-TAC結合が阻害され（図4）、このことから、乳房腫瘍細胞で観察された１２５I I-TAC結合はCXCR4を介することが示唆された。IP-10を非放射性ケモカイン競合物質として検討した場合には、MCF-7細胞に対する１２５I I-TAC結合は阻害されなかった。この場合も、過剰量のMIGとのプレインキュベーションはこの結合プロフィールに影響を及ぼさなかった；しかし、細胞をSDF-1βとプレインキュベートすると１２５I I-TAC結合は完全に阻害された。CXCR3リガンドであるMIGを非放射性競合物質として検討した場合には、細胞に対する１２５I I-TAC結合は阻害されなかった（非提示データ）。図1に示したDisplaceMaxデータから予想された通り、SDF-1βはこれらの細胞に対する結合に関して１２５I I-TACと競合し、高親和性であった（IC50が1nM）。細胞の過剰量のMIGとのプレインキュベーションはSDF-1β／１２５I I-TACの競合に影響を及ぼさず、このことからも、検出された結合がCXCR4を介しており、CXCR3は介しないことが示唆された。すなわち、以上の豊富なデータは、MCF-7細胞上で検出された新規な結合プロフィールがCXCR4（またはCXCR4様の分子）の作用に起因し、CXCR3には起因しないことを強く示唆する。
この仮説をPCRによってさらに検証した。以前に用いた単離mRNA（上記を参照）を、CXCR3転写物の証拠に関するプローブとして用いた。IL-2培養リンパ球はCXCR3を発現したが、検討した他の細胞はいずれもCXCR3を発現しなかった。RT PCRによってCXCR3発現が検出されなかったことは図4のデータを裏づけるものであり、これもMCF-7細胞上でのI-TAC結合がCXCR3を介していないことを示唆している。
CXCR4がほぼ遍在的に発現されることは、この受容体に対して低分子量有機化合物（SMC）治療薬によるターゲティングを行う取り組みの重大な障害になると考えられる。本発明者らの結果が、異なる細胞種で発現される同一のタンパク質配列が（i）異なる抗体反応性表現型；（ii）変化したリガンド親和性；および（iii）別個のリガンド特異性を有することを示唆することから、本発明者らは、乳房腫瘍細胞型のCXCR4に対してはアンタゴニストとして作用するが、T細胞型のCXCR4に対してはそうでないと思われるSMCを検索した。本発明者らは、2種類のハイスループットスクリーニングを用いてSMC（ほぼ135,000種）のスクリーニングを行った：一方は白血球型を評価し、一方は乳癌型のCXCR4を検索するためにデザインされたものである。これらのスクリーニングの結果、2つの型の明確な薬理学的識別が可能であることが示された（図5）。例えば、CCX0803と命名された低分子はMCF-7との結合に関して１２５I SDF-1αと競合し、IC50は46nMであるが（図5）、このSMCはCEM-NKr上での１２５I SDF-1α結合は全く阻害しない（図5）。これに対して、異なるSMCアンタゴニストであるCCX7923はCEM-NKrに対する１２５I SDF-1αの結合をIC50 106nMで阻害するが（図5, b）、MCF-7細胞上の１２５I SDF-1α結合は阻害しない（図5, a）。これらの2つの化合物は、乳房腫瘍株と白血球上で差異を伴って発現される2つの型のCXCR4に対するリガンドの顕著かつ明白な非相互結合阻害パターンを明らかに示している。以上より、同一のタンパク質配列を発現する複数の異なる細胞種が薬理学的に異なり、罹患状態にあるタンパク質（すなわち、乳房腫瘍細胞上のCXCR4）を、異なるCXCR4保有細胞上に発現される同じタンパク質と識別しうる可能性があると結論づけられた。
乳癌細胞が他の非腫瘍組織または非癌性組織に認められるトポロジーとは異なるCXCR4のトポロジーを示すことをまず明らかにした後に、さらなる試験に着手した。これらの表現型判定試験（抗体反応性、リガンド結合プロフィール、および薬理学的識別を用いる。本明細書に記載の方法を参照のこと）により、多くの癌（または腫瘍）細胞種も、乳房腫瘍細胞と当初相関づけられたCXCR4トポロジーを示すことが明らかに示された。以下の腫瘍細胞を検討したところ、癌と相関するCXCR4トポロジーを示した：ヒト卵巣癌、ヒト子宮頸部腺癌、ヒトバーキットリンパ腫、ヒト乳腺癌、ヒト乳管癌、ヒト膠芽腫、およびマウス乳房腫瘍。
さらに、乳房腫瘍細胞上に発現されるCXCR4は機能性である。浸潤アッセイ法において、SDF-1は細胞浸潤を誘導した。したがって、CXCR4はこれらの細胞で発現されるだけでなく、リガンド（SDF-1）の結合によってこの受容体を介したシグナルを誘導し、細胞がフィルターに浸潤しうるような細胞応答を引き起こすこともできる。
腫瘍およびその他の癌は治療が困難であり、これは一部には細胞増殖の速度が急速なためである。この点に関して、腫瘍は、急速に分裂する初期胚組織と共通する増殖特性をいくつか有することが知られている。ある学派は、成体における腫瘍は胚の増殖表現型への「復帰変異体」ではないかと推測している。SDF-1およびCXCR4の遺伝子ノックアウトマウスはいずれも胚致死性であり、このことはこのリガンド受容体の対が成長および発生の必須の要素であることを示唆する。ホモ接合性変異型SDF-1胚の約50％は18.5までに周産期死亡する；残りのホモ接合性同腹仔は生後1時間以内に死亡する（Kishimotoら、Nature 382: 635-638 (1996)）。同様に、ホモ接合性CXCR4ノックアウトマウスの約3分の1はE18.5の時点で周産期死亡する（Maら、PNAS 95: 9448-9453 (1998)）。受容体ノックアウト体およびリガンドノックアウト体のいずれにもリンパ球新生および骨髄造血の欠陥が観察された。胎仔肝臓は11日齢マウスにおける主な造血部位であり、生後第1週までそれが続く。このため、本発明者らは、癌と相関するCXCR4のトポロジーのこの区画における発現を検討することとした。本発明者らは、E17（ノックアウト動物が死亡する時点に近い発生時期）およびE13（ノックアウト動物が死亡する時点とは異なるものの、造血は開始した後の発生時期）の野生型マウス胚でのCXCR4発現を検討した。SDF-1結合アッセイ法において、放射標識したヒト-SDF-1はE13胎仔肝細胞と結合し、SDFおよびI-TAC（マウスタンパク質およびヒトタンパク質）はいずれもこの放射標識トレーサーと結合に関して競合可能であった。SDF-1受容体に対するI-TAC結合に代表されるこの変化したリガンド特異性は、本発明者らが最初に癌細胞と関連づけたCXCR4のトポロジーの顕著な特徴である。さらに、癌と関連するトポロジーと相互作用する薬物はCXCR4のE13トポロジーに対するSDF-1結合と競合可能であったが、リンパ球アンタゴニストはそうでなかった。上述の通り、このような薬理学的な違いは、CXCR4の異なるトポロジーを検出しうることのもう1つの特徴である。発生のその後の段階にあるE17胎仔肝細胞もCXCR4を発現するが、これらの細胞は細胞内カルシウムを動員することによってSDF-1に対して応答する。この「リンパ球」性トポロジーに対するCXCR4アンタゴニストは、SDF-1を介したこのカルシウム動員を阻害するが、CXCR4の腫瘍トポロジーに対するアンタゴニストにはこの作用はない。したがって、これらのデータは、E13およびE17の時点の野生型胎仔肝細胞はいずれもCXCR4を発現するが、胚齢E13およびE17の時点で発現されるCXCR4トポロジーは異なることを示唆する。E13胎仔肝細胞で発現されるCXCR4トポロジーは腫瘍と相関するトポロジーであるが、E17胎仔肝細胞で発現されるCXCR4はリンパ球と相関するトポロジーである。
これらの実験は、腫瘍相関型のCXCR4が増殖中の腫瘍細胞に対して刺激シグナルを付与しうることも示している。CXCR4の特異なトポロジーを有する腫瘍細胞は、SDF-1刺激に応答して、細胞周期または転写に関与するある種の遺伝子をアップレギュレートすることができる。さらに重要なことに、腫瘍相関型のCXCR4を発現する腫瘍細胞を血清除去下で一晩培養したところ、それらはアポトーシス（細胞死）への移行を開始した。SDF-1をこれらの培養物に添加した場合には、細胞は非投与対照に比して飢餓状態からの回復が可能である。すなわち、SDF-1 CXCR4は抗アポトーシスシグナルとして作用する。癌細胞はしばしば、アポトーシスを起こす能力を失った細胞として特徴づけられている。
実施例2
本実施例は、CCR1が、異なる細胞では異なるトポロジーを形成することを示す。
本実施例では、CCR1も同じく、異なる細胞において複数の異なる天然型トポロジーを形成することを示す。本実施例では実施例1をさらに拡張し、異なる細胞「背景」下にある同一の遺伝子の発現により、異なるトポロジーおよび特性を有する表面ケモカイン受容体タンパク質が生じうることを示す。すなわち、異なる細胞種上に異なる受容体トポロジーが存在することは、遺伝子の違いの結果ではなく、遺伝子産物（タンパク質）が発現される細胞種の違いの結果である。
CXCR4のファーマコモルフ（pharmacomorph）の存在を裏づける上記のデータに加えて、他のケモカイン受容体のファーマコモルフと考えられるものの存在についても検討した。本セクションでは、異なる細胞種ではCCR1が異なるトポロジーを呈することを示すデータを提示する。CXCR4の場合と同じく、CCR1は、CCR1が発現される細胞種に応じて著しく異なる抗原反応性を示す。内因性CCR1を発現しないさまざまな細胞種に単一のcDNA構築物を導入した試験に基づき、ここでは、同一のCCR1遺伝子配列の発現によって、互いに抗原的に異なり（一群のモノクローナル抗体との反応性による評価で）、「天然の」細胞系および初代細胞に認められるトポロジープロフィールを一部再利用したタンパク質産物が生じることを示す。CXCR4トポロジーの場合と同じく、CCR1トポロジーは別個の抗原反応性を示すだけでなく、変化したリガンド結合性（特異性および親和性の両方の点で）および変化した細胞機能（例えば、Ca２＋シグナル伝達および移動特性）も示す。したがって、CCR1は複数の異なるトポロジーを呈するケモカイン受容体のもう1つの例であり、異なる細胞種で発現された遺伝的に同一の配列が、異なる細胞作用および薬理学的プロフィールを示しうることを示す、さらなる例となる。
抗体反応性表現型：
ある1つの受容体遺伝子によって採用される、発現タンパク質の複数の異なるトポロジーは、一群の抗体（受容体ポリペプチドに相当する組換えタンパク質に対して産生されたモノクローナル抗体など）に対する反応として異なる染色プロフィールを示す可能性がある。ケモカイン受容体CCR1の場合がそうである。5種類のモノクローナル抗体（クローン番号1〜5と命名）は、すべての被験細胞がCCR1受容体を発現するという事実にもかかわらず、異なる細胞種では異なる反応を示す。図6を参照。例えば、クローン番号5および番号2は、トランスフェクト体（HEK-293およびNSO-CCR1）、THP-1細胞（急性単球性白血病）、未熟樹状細胞（DC）、および好中球上に発現されたCCR1を認識するが、単球のものは認識しない。クローン番号4は、トランスフェクト体およびTHP-1細胞上のCCR1を認識するが、検討した初代細胞（単球、好中球、および未熟DC）のものは認識しない。このように、同一のタンパク質（CCR1）を標的とする抗体は、CCR1が発現される細胞種に応じて異なる認識パターンを示す。
リガンド結合：
ある1つの受容体遺伝子によってコードされる複数のケモカイン受容体トポロジーは、リガンド結合プロフィールの点で異なる可能性がある。それらは異なるリガンド結合「フィンガープリント」を有すると思われる（すなわち、それらは異なる範囲にわたる別個のリガンドと結合する）。さらに、それらはそのフィンガープリントに含まれるリガンドと、異なるトポロジーでは異なる親和性で結合すると思われる。いくつかのCCR1リガンドの場合がそうである。ヒトCCケモカインCCL23の2つの選択的スプライシング形態であるCKβ8およびCKβ8-1が報告されている。CKβ8はCCL23の99アミノ酸形態（アミノ酸1〜99）であり、一方、そのスプライス変種であるCKβ8-1はアミノ酸1〜116からなる。この2つの成熟形態はいずれもCCR1の機能性リガンドとされている。CKβ8の2種類のNH2末端切断変種（24-99および25-99）が記載されており、これらはCCR1上のCKβ8の成熟形態よりもはるかに効力が強いことが示されている。本発明者らはここで、これらのCKβ8形態の2つであるCKβ8（1-99）およびCKβ8（25-99）、さらには別の2つのCCR1リガンドであるMIP-1αおよびロイコタクチンの生物活性に注目した。図7参照。例えば、HEK293-CCR1細胞上での１２５I MIP-1αとCKβ8（1-99）との競合では、算出されたIC50は64nMである。しかし、NSO-CCR1細胞上でのこの同じ競合では、算出されたIC50は3.9nMである。このように、異なる細胞種上の同一のタンパク質（CCR1）に対する結合に関して競合する同じ複数のケモカインにより、非常に異なる結合特性が生じる。
機能：
そのトポロジーに基づき、ケモカイン受容体は、異なる細胞性または病態生理学的な状況において異なる生物的機能を制御または付与する。それらは、異なる細胞状況下で異なるリガンド結合スペクトルを有することにより、機能（例えば、細胞移動）を異なる形で制御する。それらは、異なる細胞状況下での異なる共役および二次メッセンジャー性シグナル伝達により（異なるGタンパク質との結びつきを生じることなどにより）、細胞機能を異なる形で制御する。CCR1の複数のトポロジーはこの現象の一例を示す。
例えば、好中球上に発現されたCCR1に対するリガンド（すなわちCKβ8（1-99））の結合は細胞移動を誘導しない。しかし、同じリガンド（CKβ8（1-99））は、THP-1細胞、単球、および未熟DCに対してはCCR1を介した細胞移動を誘導しうる。図8参照。
その上、同じ複数のCCR1リガンドが、異なる細胞では異なる程度でCa２＋動員シグナルを誘導する。例えば、CCR1リガンドであるCKβ8（1-99）、CKβ8（25-99）、ロイコタクチン、MIP-1α、およびmMIP-1γは、HEK293-CCR1、THP-1、および単球ではCa２＋を動員することができる；しかし、好中球では、CCR1がこの細胞で発現されるという事実にもかかわらず、これらの同じリガンドはCa２＋を動員しない。図9参照。
遺伝的同一性：
ある1つの受容体の複数のトポロジーは、アミノ酸配列の点で同一または極めて類似した共通のポリペプチド骨格を有する；これらの配列は遺伝的には同一である。CCR1タンパク質をコードするcDNAを、HEK293およびジャーカットという2種類の細胞にトランスフェクトした。これらのトランスフェクト体は、遺伝的に同一なCCR1を発現するという事実にもかかわらず、異なる抗体反応性を示した。図10参照。
本明細書中に引用したすべての刊行物および特許出願は、それぞれの個々の刊行物または特許出願が参照として組み込まれるように詳細かつ個別に示されている場合と同程度に参照として本明細書に組み込まれる。
理解を容易にする目的で、上記の本発明を図面および実施例によってある程度詳細に説明してきたが、本発明の教示に鑑みて、添付する特許請求の範囲の精神または範囲を逸脱することなく、ある種の変更または修正を加えうることは当業者には容易に明らかになると考えられる。
配列表
配列番号：1 CXCR4のアミノ酸配列
Figure 0004485204
配列番号：1 CCR1のアミノ酸配列
Figure 0004485204
抗体反応性のグラフを示している。抗体反応性は、受容体トポロジーの表現型がT細胞性または乳房腫瘍細胞性のいずれの可能性があるかを予測するとともに規定する。T細胞系であるCEM-NKrおよびジャーカット、さらには正常PBMCを抗CXCR4抗体クローン12G5、171、172、および173によって染色した。乳房腫瘍株MCF-7、MDA MB-231、およびMDA MB-435sに対する反応性が弱いことに比して、強い抗体反応性が示されている。MDA MB-435sはいずれの被験クローンによっても陽性染色を示さず、一方MCF-7およびMDA MB-231はクローン171、172、および173とは弱い反応性を示しが、12G5とは反応を示さなかった。太い黒線は抗CXCR4抗体であり、細い黒線はアイソタイプを一致させた対照である。 種々の細胞種に関するSDF-1置換結合「フィンガープリント」が異なることを示した結合データを示している。ウイルス、ヒト、およびマウスの90種を上回るケモカインおよびケモカイン変種を非放射性競合物質として用いる結合置換実験において、（a）CEM-NKrおよび（b）MCF-7に対して１２５I SDF-1αを放射性リガンドとして用いた場合、さらには（c）MCF-7に対して１２５I I-TACを放射性リガンドプローブとして用いた場合の結合競合プロフィール。放射性リガンド結合の阻害率が棒グラフとして示され、MCF-7細胞ではSDF-1αおよびI-TACが交差置換されるが（cross-displace）CEM-NKr細胞では交差置換されないことを明らかにしている。白のバーは高親和性と考えられるもの（阻害率＞80％）；グレーのバーは親和性が中等度ないし低いと考えられるもの（阻害率60〜79％）；黒のバーは親和性がほとんどまたは全くないもの（阻害率＜60％）。結果は3回の測定の平均である。わかりやすいようにエラーバーは除外した。 CEM-NKrおよびMCF-7に対するリガンド結合の親和性および特異性の比較を示している。図1で同定した選択した高親和性リガンドの候補を、CEN-NKr（□）およびMCF-7（■）に対する用量反応競合のために選択した。それぞれの競合では、１２５I SDF-1αを、指定した非放射性競合ケモカインと競合させている。 MCF-7細胞上での１２５I I-TAC結合が古典的なCXCR3結合性相互作用に起因しないことを示している。１２５I I-TACが指定したケモカインと競合する能力を、緩衝液のみ（■）、過剰量のMIG（CXCR3を介した結合をすべて阻害するため；△）、または過剰量のSDF-1α（CXCR4を介した結合をすべて阻害するため；＊）の存在下で検討した。 競合結合データを示している。2種類のCXCR4アンタゴニスト、CCX0803（●）、およびCCX7923（○）は、別個の細胞種上で１２５I SDF-1αと特異的に競合し；交差的な競合は検出されない。SDF-1α（＊）も、MCF-7およびCEM-NKrの両方に対する１２５I SDF-1α結合の非放射性競合物として含めた。CCX0803およびCCX7923の化学構造は挿入図に示されている。SDF-1αおよびCXCR4アンタゴニスト競合について推定されるIC50値を添付の表に提示している。 さまざまな細胞種上のCCR1に対するCCR1特異抗体の反応性を示している。 １２５I MIP-1αの結合データを示している。 さまざまな細胞／リガンドの組み合わせに関する細胞移動データを示している。 細胞内Ca２＋の動員を示している。 抗体反応性のデータを示している。
配列表
Figure 0004485204

Claims (24)

  1. ケモカイン受容体CCR1の第1のトポロジーとは結合するがケモカイン受容体CCR1の第2のトポロジーとは結合しない作用物質をスクリーニングする方法であって、以下を含む方法：
    i) 第1のトポロジーを有するケモカイン受容体CCR1を含む第1の細胞、および第2のトポロジーを有するケモカイン受容体CCR1を含む第2の細胞を、1500ダルトン未満である作用物質と、該ケモカイン受容体において接触させる工程；ならびに
    ii) ケモカイン受容体CCR1の第1のトポロジーとは結合するが第2のトポロジーを有するケモカイン受容体CCR1とは結合しない作用物質を選択する工程。
  2. 作用物質が600ダルトン未満である、請求項１記載の方法。
  3. ケモカイン受容体CCR1の第1のトポロジーとは結合するがケモカイン受容体CCR1の第2のトポロジーとは結合しない抗体をスクリーニングする方法であって、以下を含む方法：
    i) 第1のトポロジーを有するケモカイン受容体CCR1を含む第1の細胞、および第2のトポロジーを有するケモカイン受容体CCR1を含む第2の細胞を、抗体と、該ケモカイン受容体において接触させる工程；ならびに
    ii) ケモカイン受容体CCR1の第1のトポロジーとは結合するが第2のトポロジーを有するケモカイン受容体CCR1とは結合しない抗体を選択する工程。
  4. ケモカイン受容体CCR1の第1のトポロジーに対するリガンド結合によって誘発される細胞内シグナル伝達を調節する作用物質を選択する工程をさらに含み、それによって第1のトポロジーを有するケモカイン受容体へのリガンド結合によっては誘発されるが第2のトポロジーを有するものへの結合によっては誘発されない細胞内シグナル伝達を調節する作用物質を同定する、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
  5. 作用物質が、ケモカイン受容体CCR1の第1のトポロジーに対するリガンドの結合に反応した細胞内カルシウムの動員を調節する、請求項４記載の方法。
  6. 第1の細胞または第2の細胞が、以下からなる群より選択される、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法：
    (i) 癌細胞；
    (ii) 乳癌細胞；
    (iii) 好中球；
    (iv) 単球；
    (v) マクロファージ；
    (vi) 好酸球；
    (vii) 好塩基球；
    (viii) マスト細胞；
    (ix) B細胞；
    (x) HIV感染の担体にならない細胞；および
    (xi) T細胞ではない細胞。
  7. 第1の細胞または第2の細胞が癌細胞である、請求項６記載の方法。
  8. 第1の細胞または第2の細胞が白血病癌細胞、好中球、単球、および樹状細胞より選択される、請求項６記載の方法。
  9. 結合に関して、作用物質がケモカイン受容体CCR1の天然リガンドと競合する、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
  10. 動物におけるケモカイン受容体CCR1を介した細胞応答または組織応答を調節する作用物質をインビトロで選択する工程をさらに含み、それにより動物におけるケモカイン受容体CCR1を介した組織応答または細胞応答を調節する作用物質を同定する、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
  11. 細胞応答または組織応答が、細胞の走化性を含む、請求項１０記載の方法。
  12. 走化性細胞が白血球である、請求項１１記載の方法。
  13. 白血球の走化性が低下する、請求項１１記載の方法。
  14. 白血球の走化性が上昇する、請求項１１記載の方法。
  15. 細胞応答または組織応答が炎症を含む、請求項１０記載の方法。
  16. ケモカイン受容体CCR1の新規なトポロジーをスクリーニングする方法であって、以下を含む方法：
    i) それぞれの細胞種がケモカイン受容体CCR1を発現する、少なくとも第1の細胞種および第2の細胞種を提供する工程；
    ii) 2つの細胞種上のケモカイン受容体CCR1と結合する能力に関して複数の異なるケモカインの試験を行う工程；および
    iii) 第1の細胞種上のケモカイン受容体CCR1とは結合するが第2の細胞種上のケモカイン受容体CCR1とは結合しないケモカインを同定することにより、ケモカイン受容体CCR1の新規なトポロジーを同定する工程。
  17. 少なくとも３種の細胞種の試験を行う、請求項１６記載の方法。
  18. 少なくとも１０種のケモカインの試験を行う、請求項１６、または１７記載の方法。
  19. ケモカインが、CL1、XCL2、CX3CL1、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、およびCCL28からなる群より選択される、請求項１６〜１８のいずれか一項記載の方法。
  20. ケモカインが固体支持体に対して係留されている、請求項１６〜１９のいずれか一項記載の方法。
  21. 試験の段階が、各細胞種における、ケモカインがケモカイン受容体CCR1と結合するリガンドと競合する能力を決定する工程を含む、請求項１６〜２０のいずれか一項記載の方法。
  22. リガンドが標識されている、請求項２１記載の方法。
  23. 少なくとも１つの細胞種が、内因性ケモカイン受容体CCR1を発現する、請求項１６〜２２のいずれか一項記載の方法。
  24. 少なくとも１つの細胞種が、組換え的に発現されるケモカイン受容体CCR1を発現する、請求項１６〜２３のいずれか一項記載の方法。
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