KR101184264B1 - 케모카인 수용체와 관련된 질병 및 증상의 검출 및 치료용조성물 및 방법 - Google Patents

케모카인 수용체와 관련된 질병 및 증상의 검출 및 치료용조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 CCX-CKR2의 리간드 및 암에서 CCX-CKR2의 생물학적 역할에 관한 것이다.

Description

케모카인 수용체와 관련된 질병 및 증상의 검출 및 치료용 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR DETECTING AND TREATING DISEASES AND CONDITIONS RELATED TO CHEMOKINE RECEPTORS}
관련 출원에 대한 상호 참조문헌
본 출원은 미국 출원 제 10/698,541호(2003년 10월 30일)의 부분 계속 출원이고, 이는 미국 출원 제 10/452,015호(2003년 5월 30일)의 부분 계속 출원이고, 이는 미국 출원 제 10/245,850호(2002년 9월 16일)의 부분 계속 출원이고, 이는 미국 특허 출원 일련번호 (USSN) 60/338,100호(2001년 11월 30일) 및 USSN 60/337,961(2001년 11월 30일)에 대한 우선권을 주장하고, 이들 각각은 본원에서 그 전문을 모든 목적에 대하여 명시적으로 참고 인용한다. 또한, 본 출원은 미국 가출원 제 U.S. 60/434,912호(2002년 12월 20일)에 대한 우선권을 주장하고, 이는 본원에서 그 전문을 모든 목적에 대하여 명시적으로 참고 인용한다.
케모카인은 염증 발생시 생성되어 백혈구의 보충, 활성화 및 증식을 조절하는 작은 시토카인 군을 구성한다(Baggiolini, M. et al ., Adv . Immunol . 55: 97-179 (1994); Springer, T. A., Annul Rev . Physiol . 57: 827-872 (1995); 및 Schall, T. J. and K. B. Bacon, Curr . Opin . Immunol . 6: 865-873 (1994)). 케모 카인은 혈중 형성된 (적혈구를 제외한) 백혈구를 포함하는 성분 예컨대, 호중구, 단핵구, 대식 세포, 호산구, 호염기구, 비만 세포 및 림프구 예컨대, T 세포 및 B 세포의 주화성을 선택적으로 유발할 수 있다. 주화성을 자극함과 더불어, 백혈구 활성화와 관련된 반응 세포내 케모카인에 의하여 다른 변화 예를 들어, 세포 모양의 변화, 세포내 유리 칼슘 이온(Ca2 +) 농도의 일시적 증가, 과립 세포외배출, 인테그린 상승조절, 생활성 지질(예를 들어, 류코트리엔)의 형성 및 호흡기 방출도 선택적으로 유도될 수 있다. 그러므로, 케모카인은 조기에 염증 반응을 유발시켜, 감염 또는 염증 부위에서 염증 매개체 방출을 일으키고, 주화성 및 일혈을 유발시킨다.
케모카인의 2개의 하위군 즉, CXC 및 CC 케모카인은 4개의 보존된 시스테인 잔기들중 처음 2개의 배열에 의하여 구별되는데, 이들 잔기는 하나의 아미노산[CXC 케모카인인 SDF-1, IL-8, IP-10, MIG, PF4, ENA-78, GCP-2, GROα,GROβ, GROγ, NAP-2, NAP-4, I-TAC에서와 같이]에 의하여 분리되거나 또는 잔기들이 서로 인접하여[CC 케모카인인 MIP-1α, MIP-1β, RANTES, MCP-1, MCP-2, MCP-3, I-309에서와 같이] 존재한다. 대부분의 CXC 케모카인은 호중구 백혈구를 끌어당긴다. 예를 들어, 상기 CXC 케모카인 인터루킨 8(IL-8), 혈소판 인자 4(PF4) 및 호중구-활성화 펩티드 2(NAP-2)는 호중구의 강력한 주화인자이자 활성인자이다. 상기 CXC 케모카인의 일원인 MIG(감마 인터페론에 의하여 유도된 모노카인) 및 IP-10(유도성 인터페론-γ, 10 kDa 단백질)은 활성화된 말초 혈액 림프구의 주화성을 유도하는데 특 히 활성이다. CC 케모카인은 일반적으로 선택성이 떨어지고 다양한 유형의 백혈구 세포 예컨대, 단핵구, 호산구, 호염기구, T-림프구 및 자연 살생 세포를 끌어당긴다. CC 케모카인 예컨대, 인간 단핵구 주화성 단백질 1-3(MCP-1, MCP-2 및 MCP-3), RANTES(Regulated on Activation, Normal T Expressed and Secreted), 및 대식세포 염증성 단백질 1α 및 1β(MIP-1α및 MIP-1β)는 단핵구 또는 림프구의 주화인자 및 활성인자인 것으로 알려져 있으나, 호중구에 대한 주화인자는 아닌 것으로 파악된다.
CC 및 CXC 케모카인은 7개의 경막성 G 단백질-커플링된 수용체의 상위 군에 속하는 수용체들을 통하여 작용한다[Murphy, P. M. , Pharmacol Rev . 52: 145-176 (2000)]. 이러한 G 단백질-커플링된 수용체의 군은 7개의 경막성 영역을 포함하는 통합 막 단백질의 거대 군을 포함한다. 상기 수용체는 예를 들어, 세포내 매개체의 생성에 의하여 GTP를 결합시킬 수 있고 커플링된 수용체로부터의 신호 전달을 매개할 수 있는 이종 삼량체 조절 단백질인 G 단백질과 커플링된다.
일반적으로, 케모카인 및 케모카인 수용체의 상호작용은, 하나의 케모카인이 다수의 케모카인 수용체와 결합할 수 있고 역으로 하나의 케모카인 수용체가 몇개의 케모카인과 상호작용 할 수 있다는 점에서 우연성을 띤다. 그러나, 이러한 규칙에는 몇가지 예외가 존재하는데; 그중 하나는 SDF-1과 CXCR4는 상호작용을 한다는 것이다[Bleul et al .,J Exp Med , 184 (3): 1101-9 (1996); Oberlin et al ., Nature, 382 (6594) :833-5 (1996)]. 원래부터 전-B-세포 성장 자극 인자[Nagasawa et al ., Proc Natl Acad Sci USA , 91 (6): 2305-9 (1994)]로 확인된, SDF-1은 CXCR4에 대한 인간의 리간드라고만 보고되어 있다. 상기 SDF-1 유전자는 대체적 스플라이싱에 의하여 2개의 단백질 즉, SDF-1α 및 SDF-1β를 암호화한다. 이러한 2개의 단백질들은 SDF-1β의 카르복시 말단에는 존재하지만 SDF-1α에는 존재하지 않는 4개의 아미노산 잔기를 제외하고는 동일하다.
케모카인 수용체 신호 전달 및 리간드에 대한 선택성에 대한 다수의 측면은 예전에는 이해하지 못했던 점이다. 예를 들어, 수많은 고아 수용체의 기능에 대하여 아직 파악하지 못했다. 예를 들어, 예전에는 혈관작용 장 펩티드(VIP)에 대한 수용체로서 생각하였던 RDC1은, 이의 내인성 리간드가 동정되지 않았으므로 현재 고아 수용체로서 생각하지 않는다. 예를 들어 문헌[Cook et al ., FEBS Letts . 300(2) :149-152 (1992)]이 참조된다.
본 발명은 이들 및 기타 문제를 다룬다.
발명의 간단한 설명
본 발명은 세포 상의 CCX-CKR2에 결합하는 물질의 선별 방법에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 이 방법은 복수의 물질을 서열 번호 2의 세포외 영역과 적어도 95% 동일한 세포외 영역을 포함하는 CCX-CKR2 폴리펩티드, 또는 이의 SDF-1 또는 I-TAC 결합 단편과 접촉시키고; 상기 CCX-CKR2 폴리펩티드 또는 이의 단편에 결합하기 위해 I-TAC 또는 SDF-1과 경쟁하는 물질을 선별하며, 이에 따라 세포 상의 CCX-CKR2에 결합하는 물질을 선별하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 세포는 암세포이다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 선별된 물질이 세포에 결합하거나 이의 성장을 억제하는 능력을 시험하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 세포는 암세포이다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 선별된 물질이 신장의 기능을 변화시키는 능력을 시험하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 선별된 물질이 뇌 또는 신경세포의 기능을 변화시키는 능력을 시험하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 선별된 물질이 내피 세포에 대한 세포 유착을 변화시키는 능력을 시험하는 것을 추가로 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 물질은 1,500 달톤 미만이다. 일부 구체예에서, 상기 물질은 항체이다. 일부 구체예에서, 상기 물질은 폴리펩티드이다. 일부 구체예에서, 상기 CCX-CKR2 폴리펩티드는 서열 번호 2에서 제시된 서열을 포함한다.
또한, 본 발명은 암세포의 존재 또는 부재를 측정하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 세포를 포함하는 시료를 서열 번호 2에 특이적으로 결합하는 물질과 접촉시키고; 상기 물질이 시료 중의 폴리펩티드와 결합하는 것을 검출하는 것을 포함하며, 이때 시료에 대한 상기 물질의 결합이 암세포의 존재를 지시한다.
일부 구체예에서, 상기 물질은 항체이다. 일부 구체예에서, 상기 물질은 1500 달톤 미만이다. 일부 구체예에서, 상기 물질은 폴리펩티드이다. 일부 구체예에서, 검출된 상기 폴리펩티드는 서열 번호 2이다. 일부 구체예에서, 상기 시료는 인간 유래이다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 인간의 암을 진단하기 위하여 사용한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 인간의 암의 예후를 판단하기 위하여 사용한다. 일부 구체예에서, 상기 암은 자궁경부암, 유방암, 림프종, 교모세포종, 전립선암, 및 백혈병으로 이루어진 군 중에서 선택된다. 일부 구체예에서, 상기 암은 카포시 육종, 다발성 캐슬만씨병 또는 AIDS 관련 일차성 삼출 림프종이 아니다. 일부 구체예에서, 상기 항체는 서열 번호 2에 결합하기 위하여 SDF-1 및 1-TAC와 경쟁한다.
또한, 본 발명은 암에 걸린 개체를 진단 또는 예후 판단하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 개체의 세포 중 CCX-CKR2 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 발현의 존재 또는 부재를 검출하여 이에 따라 개체의 암을 진단하는 것을 포함하고, 이때 상기 CCX-CKR2 폴리펩티드는 I-TAC 및/또는 SDF-1과 결합하고 상기 CCX-CKR2 폴리펩티드는 서열 번호 2와 적어도 95% 동일하다.
일부 구체예에서, CCX-CKR2 폴리펩티드는 서열 번호 2에서 보여진다. 일부 구체예에서, 암은 자궁경부암, 유방암, 림프종, 교모세포종, 전립선암, 및 백혈병으로 이루어진 군 중에서 선택된다. 일부 구체예에서, 상기 암은 카포시 육종, 다발성 캐슬만씨병 또는 AIDS 관련 일차성 삼출 림프종이 아니다.
또한, 본 발명은 서열 번호 2와 결합하기 위하여 SDF-1 및 I-TAC와 특이적으로 경쟁하는 항체를 제공한다. 일부 구체예에서, 상기 항체는 모노클로날 항체이다. 일부 구체예에서, 상기 항체는 인간화 항체이다.
또한, 본 발명은 세포를 서열 번호 2에 특이적으로 결합하는 물질과 접촉시켜, 이에 따라 상기 물질을 세포 상의 CCX-CKR2 폴리펩티드와 결합시키는 것을 포함하고, 이때 상기 물질은 CCX-CKR2 폴리펩티드와 결합하기 위하여 SDF-1 및 I-TAC와 경쟁하고, 이때 상기 세포는 서열 번호 2의 세포외 영역과 적어도 95% 동일한 세포외 영역을 포함하는 CCX-CKR2 폴리펩티드를 발현한다.
일부 구체예에서, 상기 물질은 1,500 달톤 미만이다. 일부 구체예에서, 상기 물질은 항체이다. 일부 구체예에서, 상기 물질은 폴리펩티드이다. 일부 구체예에서, 상기 CCX-CKR2 폴리펩티드는 서열 번호 2에서 보여진다. 일부 구체예에서, 상기 물질은, 복수의 물질을 서열 번호 2의 세포외 영역과 적어도 95% 동일한 세포외 영역을 포함하는 CCX-CKR2 폴리펩티드, 또는 이의 SDF-1 또는 I-TAC 결합 단편과 접촉시키고; 상기 CCK-CKR2 폴리펩티드 또는 이의 단편과 결합하기 위하여 I-TAC 또는 SDF-1과 경쟁하는 물질을 선별하여, 이에 따라 암세포에 결합하는 물질을 선별하는 것을 포함하는 방법에 의해 동정한다.
또한, 본 발명은 개체의 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 개체에게 CCX-CKR2 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제하는 폴리뉴클레오티드의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 CCX-CKR2 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 2를 암호화한다. 일부 구체예에서, 상기 CCX-CKR2 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 1을 포함한다. 일부 구체예에서, 투여된 폴리뉴클레오티드는 siRNA를 통해 발현을 억제한다.
또한, 본 발명은 개체의 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 개체에게 서열 번호 2와 결합하기 위하여 SDF-1 및 I-TAC와 경쟁하는 물질의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 물질은 1,500 달톤 미만이다. 일부 구체예에서, 상기 물질은 항체이다. 일부 구체예에서, 상기 물질은 폴리펩티드이다. 일부 구체예에서, 상기 물질은, 복수의 물질을 서열 번호 2의 세포외 영역과 적어도 95% 동일한 세포외 영역을 포함하는 CCX-CKR2 폴리펩티드, 또는 이의 SDF-1 또는 I-TAC 결합 단편과 접촉시키고; 상기 CCK-CKR2 폴리펩티드 또는 이의 단편과 결합하기 위하여 I-TAC 또는 SDF-1과 경쟁하는 물질을 선별하여, 이에 따라 암세포에 결합하는 물질을 선별하는 것을 포함하는 방법에 의해 동정한다. 일부 구체예에서, 상기 암은 자궁경부암, 유방암, 림프종, 교모세포종, 전립선암, 및 백혈병으로 이루어진 군 중에서 선택된다. 일부 구체예에서, 상기 암은 카포시 육종, 다발성 캐슬만씨병 또는 AIDS 관련 일차성 삼출 림프종이 아니다.
도면의 간단한 설명
도 1A～1I는 상이한 세포형에 대한 개별적 SDF-1 전위 결합 '핑거프린트'를 나타내는 결합 데이터를 도시한다. 90 이상의 개별 바이러스, 인간 및 쥐과 케모카인 및 표지되지 않은 경쟁자로서 케모카인 변종의 포괄 어레이와의 결합 전위 실험에서, 결합 경쟁 프로파일은 (a) CEM-NKr(도 1A～1C) 및 (b) MCF-7(도 1D～1F)에 대한 방사리간드 프로브로서 125I SDF-1α를 사용할뿐 아니라 (c) MCF-7(도 1G～1I)에 대한 방사리간드 프로브로서 125II-TAC를 사용한다 . 방사리간드 결합의 억제(%)는 막대 그래프로 도시되어 있으며, SDF-1α 및 I-TAC는 CEM-NKr 세포가 아닌 MCF-7 상에서 교차-전위됨을 밝히고 있다. 백색 막대는 잠재적 고 친화도(억제 80% 초과)를, 회색 막대는 잠재적 중 친화도 내지 저 친화도(억제 60～79%)를, 흑색 막대는 친화도가 거의 없거나 전혀 없음(억제 60% 미만)을 나타낸다. 결과는 3회 측정한 것의 평균이다. 명확성을 기하기 위해 오차 막대는 생략한다.
도 2는 CEM-NKr 및 MCF-7에 대한 리간드 결합 친화도 및 특이성을 비교한 것이다. 도 2에서 선별된 잠재적 고 친화도 리간드를 CEN-NKr(백색 사각형) 및 MCF-7(흑색 사각형)에 대한 용량 반응 경쟁을 위해 선택하였다. 각 경쟁에서 125I SDF-1α는 지시되는 바와 같이 표지되지 않은 경쟁자 케모카인과 경쟁한다.
도 3은 MCF-7 세포 상의 125II-TAC 결합이 전형적인 CXCR3 결합 상호작용으로 인한 것이 아님을 나타낸다. 1251-TAC가 지시된 케모카인과 경쟁하는 능력은 유일의 완충액(흑색 사각형), 과량의 MIG(임의의 CXCR3-매개 결합을 억제하기 위함; 백색 삼각형) 또는 과량의 SDF-1α(아스테릭스)의 존재하에 조사하였다.
도 4는 본원에서 기재된 결합 표현형이 상기 수용체를 내인적으로 발현하지 않는 세포주에서도 반복될 수 있음을 도시하고 있다. CCX-CKR2 형질감염된 유방암 세포주 MDA MB 435s는 125I SDF-1α와 결합함을 보여준다. 이러한 결합은 표지되지 않은 SDF-1α 및 I-TAC와 비견될 수 있다. 이와 비교시 야생형 세포(형질감염되지 않은) 125I SDF 결합 신호를 생성하지 않는다.
도 5는 경쟁적 결합 데이터를 나타낸다. 두 작은 분자, CCX0803(흑색 원) 및 CCX7923(백색 원)은 구분되는 세포 유형에서 125I SDF-1α와 특이적으로 경쟁하며 교차 경쟁은 관찰되지 않는다. SDF-1α(아스테릭스)는 또한 MCF-7 및 CEM-NKr 상에 결합하는 125I SDF-1α의 표지되지 않은 경쟁자로서 포함되었다. CCX0803 및 CCX7923의 화학적 구조는 삽입도에 나타내었다. SDF-1α및 CXCR4 길항제 경쟁의 예상 IC50 값은 첨부된 표에 제공되어 있다.
도 6은 길항제로 처리하지 않은 세포와 비교시, 작은 분자 CCX-CKR2 길항제로 처리시에 CCX-CKR2를 발현하는 포유동물 암종 세포의 치료 효과를 도시하고 있다.
도 7은 CCX-CKR2 길항제 3451(표 1의 화합물 49 참조)는 CCX-CKR2 발현 세포가 혈관 내피 단층에 부착되는 것을 억제함을 도시하고 있다.
도 8은 포유동물 암종 세포 상의 CCX-CKR2의 길항 작용은 종양 부피를 감소시킴을 도시하고 있다.
정의
"케모카인" 또는 "케모카인 리간드"란, 대략 50～110개의 아미노산으로 이루어져 있으며, 공지의 다른 케모카인과 서열 상동성을 공유하는 작은 단백질을 의미한다[예를 들어, Murphy, P. M., Pharmacol Rev . 52: 145-176 (2000) 참조]. 케모카인은 1차 아미노산 서열에서 발견되는 시스테인(Cs)의 첫번째 쌍의 상대적 위치에 따라서 분류된다. CXCL 케모카인에서, 시스테인의 첫번째 쌍은 임의의 단일 아미노산에 의하여 분리된다. CCL 케모카인은 인접한 시스테인을 갖는다. CX3CL 케모카인에 있어서, 첫번째 시스테인 쌍은 3개의 아미노산에 의하여 분리된다. CL 케모카인은 상동성 위치에 하나의 시스테인만을 함유한다. 케모카인은 케모카인 수용체에 결합하여 이를 활성화시킴으로써 생물학적 기능을 촉진시킬 수 있다.
"케모카인 수용체"란, 케모카인 분자와 특이적으로 상호작용하는 폴리펩티드를 의미한다. 케모카인 수용체는 7개의 경막 도메인을 보유하는 G 단백질 커플링된 수용체이다. 케모카인 수용체는 강산성 N-말단 도메인; 다수의 케모카인 수용체의 제2 세포외 루프내에서 발견되는 아미노산 서열 DRYLAIVHA(또는 그 서열의 최소한의 변이); 전체적으로 염기 전하를 띠는 제3의 짧은 세포간 루프; 4개의 세포외 도메인의 각각에 존재하는 시스테인 잔기를 비롯한, 몇몇 공통된 구조상 특징을 보유한다. 통상적으로, 케모카인 수용체의 전체 크기는 약 340～370개 아미노산 잔기이다 (예를 들어, 문헌[Murphy, P. M. Chemokine Receptors ; Overview, Academic Press 2000]; 및 [Loetscher P. and Clark-Lewis I. J. Leukocyte Biol . 69: 881 (2001)] 참고). 대표적인 케모카인 수용체의 예로서는 CC-케모카인 수용체(CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9 및 CCR10 포함), CXC-케모카인 수용체(CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6 및 CCX-CKR2(예를 들어, 서열 번호 2) 포함), CX3CR1, CXR1, CCXCKR(OCR11), 바이러스 암호화된 케모카인 수용체, US28, ECRF3, 카포시 육종-관련 헤르페스 바이러스 GPCR(ORF 74), 폭스 바이러스 막결합 G 단백질 커플링된 수용체; D6 및 DARC를 포함한다.
케모카인 수용체에 의해 자극될 수 있는 정의된 반응으로는 경막 시그널링, 세포질 시그널링 캐스케이드의 활성화, 세포골격 재배치, 부착, 주화성, 침입, 전이, 시토카인 생성, 유전자 유도, 유전자 발현, 단백질 발현의 유도, 또는 암의 발생을 비롯한 세포 증식 및 분화의 조절을 들 수 있다.
본원에서 "CCX-CKR2"로서 지시되는 "RDC1"란 G-단백질 커플링된 수용체(GPCR)로 생각되는 7개의 경막 도메인이다. CCX-CKR2 도그 오솔로그(ortholog)는 1991년에 최초로 발견되었다 (예를 들어, 문헌[Libert et al . Science 244:569-572(1989)] 참고). 도그 서열은 문헌[Libert et al ., Nuc . Acids Res . 18(7) :1917(1990)]에서 기재되어 있다. 마우스 서열은 예를 들어, 문헌[Heesen et al ., Immunogenetics 47:364-370(1998)]에서 기재되어 있다. 인간 서열은, 예를 들어 문헌[Sreedharan et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . USA88:4986 4990(1991)]에서 기재되어 있고, 여기에서 단백질은 혈관작용 장 펩티드로서 잘못 기재되어 있다. "CCX-CKR2"는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 또는 서열 번호 10과 실질적으로 동일하거나 이의 통상적으로 개질된 변이체인 서열을 포함한다.
"펩티도모의체" 및 "모의체"란, 케모카인 수용체의 길항제 또는 효능제와 실질적으로 동일한 구조적 특성 및 기능적 특성을 갖는 합성 화학 화합물을 의미한다. 펩티드 유사체는 제약 산업에서 주형 펩티드의 특성과 유사한 특성을 갖는 비-펩티드 약물로서 통상적으로 사용된다. 이러한 유형의 비-펩티드 화합물을 "펩티드 모의체(peptide mimetics)" 또는 "펩티도모의체(peptidomimetics)"라 칭한다[Fauchere, J. Adv . Drug , Res . 15:29(1986); Veber and Freidinger TINS p.392(1985); 및 Evans et al . J. Med . Chem . 30:1229(1987), 이들은 모두 본원에 참고문헌으로 인용함]. 치료학적으로 유효한 펩티드와 구조상 유사한 펩티드 모의체는 동일하거나 또는 보다 강화된 치료 효과 또는 예방 효과를 나타내는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 펩티도모의체는 패러다임 폴리펩티드(즉, 생물학적 또는 약리학적 활성을 갖는 폴리펩티드)와 구조상 유사하나, 예를 들어, -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH-(시스 및 트랜스), -COCH2-, -CH(OH)CH2- 및 -CH2SO-로 이루어진 군으로부터 선택된 결합에 의하여 임의 치환되는 하나 이상의 펩티드 결합을 갖는다. 모의체는 전체가 합성, 비천연 아미노산 유사체이거나, 또는 일부는 천연 펩티드 아미노산이고 일부는 비천연 아미노산 유사체인 키메라 분자이다. 상기 모의체는 또한 이러한 치환이 상기 모의체의 구조 및/또는 활성을 실질적으로 변경시키지 않는한, 천연 아미노산의 보존적 치환을 임의의 양만큼 도입시킬 수 있다. 예를 들어, 모의체는 CCX-CKR2에 대한 SDF-1 또는 I-TAC의 결합을 모방할 수 있다. 예를 들어, 모의 조성물은 그것이 CCX-CKR2의 활성 또는 기능을 억제하거나 또는 증가시킬 수 있으면 본 발명의 범위내에 포함된다.
"항체"란, 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자들에 의하여 실질적으로 암호화된 폴리펩티드, 또는 이들의 단편을 의미하는 것으로서, 이는 분석물(항원)에 특이적으로 결합하여 인식한다. 인식된 면역글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론 및 뮤 불변부 유전자들 뿐만 아니라, 다수의 면역글로불린 가변부 유전자들을 포함한다. 경쇄는 카파 또는 람다로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로 분류되며, 이는 면역글로불린 군 즉, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 각각 정의한다.
대표적인 면역글로불린(항체)의 구조적 단위는 4량체를 포함한다. 각각의 사량체는 폴리펩티드 사슬의 두개의 동일한 쌍으로 이루어져 있으며, 각 쌍은 하나의 "경쇄"(약 25 kD)와 하나의 "중쇄"(약 50～70 kD)를 갖는다. 각 사슬의 N-말단은 주로 항원 인식에 관여하는 약 100～110 개 이상의 아미노산으로 이루어진 가변부를 한정한다. 상기 가변부 경쇄(VL) 및 가변부 중쇄(VH)란, 각각 이와 같은 경쇄 및 중쇄를 의미한다.
항체는 예를 들어, 원상태의(intact) 면역글로불린, 또는 다양한 펩티다제로 분해되어 생성된 다수의 널리 특성규명된 단편으로서 존재한다. 그러므로, 예를 들어, 펩신은 항체의 힌지부에 있는 이황화결합 아래 부분을 분해하여 F(ab)'2 즉, 그 자체가 이황화 결합에 의하여 VH-CH1에 결합된 Fab의 이량체를 생산한다. 상기 F(ab)'2는 온화한 조건하에서 환원되어 힌지부중 이황화 결합을 분해하며, 이로써, F(ab)'2 이량체는 Fab' 단량체로 전환된다. 상기 Fab' 단량체는 본질적으로 힌지부의 일부를 보유하는 Fab이다 (문헌[Paul(Ed.)Fundamental Immunology, Third Edition, Raven Press, NY (1993)] 참조). 다양한 항체 단편이 원상태 항체의 분해의 관점에서 정의되는 반면, 당업자는 그러한 단편들이 화학적으로 새로이 합성되거나, 또는 재조합 DNA법을 이용하여 합성될 수 있음을 이해할 것이다. 그러므로, 본원에 있어서, 항체란 용어는 전항체를 변형시켜 제조된 항체 단편, 또는 재조합 DNA법을 이용하여 새로이 합성된 항체 단편(예를 들어, 단일쇄 Fv)도 포함한다.
"인간화" 항체란 인간이 아닌 종 유래의 면역글로불린 및 인간 면역글로불린의 구조 및/또는 서열에 기초한 분자의 나머지 면역글로불린 구조체로부터 실질적으로 유도된 항원 결합 부위를 갖는 분자를 의미한다. 상기 항원 결합 부위는 불변부 상으로 융합된 완전한 가변부 또는 가변부 내의 적절한 기본틀 부위 상으로 그라프트된 상보성 결정 부위(CDRs)를 포함할 수 있다. 항원 결합 부위는 야생형이거나, 예를 들어 인간 면역글로불린과 더 유사하도록 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 개질될 수 있다. 인간화 항체의 모든 형태는 모든 CDR 서열(예를 들어, 마우스 항체로부터의 모든 6개의 CDR을 함유하는 인간화 마우스 항체)을 보존한다. 인간화 항체의 다른 형태는 원래의 항체에 대하여 변형된 하나 이상의 CDR들(1, 2, 3, 4, 5, 6개)을 갖는다.
단백질 또는 폴리펩티드를 언급할 때, "항체에 특이적으로 (또는 선택적으로) 결합한다" 또는 "~와 특이적으로 (또는 선택적으로) 면역반응하는"이란 말은 단백질 및 다른 생물의 이종 군집의 존재하에 그 단백질의 존재를 확정하는 결합 반응을 말한다. 따라서, 지정된 면역 분석 조건하에, 특이화된 항체는 특정 단백질에 결합하고 시료내 존재하는 다른 단백질에는 유의적 양으로 결합하지 않는다. 이러한 조건하에 항체에 대한 특이적 결합은 특정 단백질에 대한 특이성으로 선택되는 항체를 필요로 할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 임의의 폴리뉴클레오티드에 의하여 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 단백질에 대한 항체를 선택하여 다형성 변종을 제외하고는 다른 단백질이 아닌 그 단백질, 예를 들어, 서열 번호 2와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 단백질과 특이적으로 면역 반응하는 항체를 얻을 수 있다. 특정 단백질과 특이적으로 면역 반응하는 항체를 선택하기 위하여 다양한 면역 분석 포맷을 사용할 수 있다. 한 단백질과 특이적으로 면역 반응하는 모노클로날 항체를 선택하기 위하여는 예를 들어, ELISA 면역 분석법, 웨스턴 블롯, 또는 면역조직화학법이 일상적으로 사용된다. 특이적 면역반응성을 측정하기 위하여 사용할 수 있는 면역 분석 포맷 및 조건의 기재에 대하여는 예를 들어, 문헌[Harlow and Lane Antibodies , A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Publications, NY (1988)]을 참고한다. 일반적으로, 특이적 또는 선택적 반응은 배경 시그널 또는 잡음의 2배 이상, 더 일반적으로는 10～100배 이상일 것이다.
"리간드"란 케모카인 수용체와 결합할 수 있는 물질, 예를 들어 폴리펩티드 또는 기타 분자를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "케모카인 수용체와 결합하는 물질"란 고 친화도로 케모카인 수용체와 결합하는 물질을 말한다. "고친화도"란 약리학적으로 적절한 반응을 유도하기에 충분한 친화도, 예를 들어 약리학적으로 적절한 농도(예를 들어, 약 10-5M 미만의 농도)에서 케모카인 수용체에 결합하기 위하여 천연 케모카인 리간드와 유의적으로 경쟁하는 능력을 말한다(예를 들어, 실시예 1 및 도 5 참고). 고 친화도를 갖는 일부 대표적 물질은 10-6M 초과의 친화도, 및 때때로 10-7M 또는 10-8M 초과의 친화도로 케모카인 수용체와 결합할 것이다. 물질의 농도가 10-4M 미만인 경우에 천연 수용체 리간드와 결합하기 위한 경쟁에서 실패한 물질은 본 발명의 목적에 대하여 "결합하지 않는" 것으로 생각할 것이다.
"핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드"란 용어는, 단일 사슬 또는 이중 사슬 형태인, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 이들의 중합체를 의미한다. 특별히 한정하지 않는한, 상기 용어는 참고 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고 천연 발생 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다. 달리 언급이 없는 한, 특정 핵산 서열은 또한 이의 보존적으로 변형된 변이체(예컨대, 축퇴성 코돈 치환) 및 상보성 서열 뿐만 아니라, 분명히 제시된 서열을 포함함이 분명하다. 특히, 축퇴성 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합된 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 제조함으로써 이루어질 수 있다[Batzer et al ., Nucleic Acid Res . 19:5081(1991); Ohtsuka et al ., J. Biol . Chem . 260:2605-2608(1985); 및 Cassol et al .(1992); Rossolini et al ., Mol . Cell . Probes 8:91-98(1994)]. 핵산이란 용어는 유전자, 유전자에 의하여 암호화되는 cDNA 및 mRNA와 호환적으로 사용된다.
본원에서 호환적으로 사용되는 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"이란 용어는 아미노산 잔기의 중합체를 의미한다. 이 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 이에 상응하는 천연 발생 아미노산의 인공적 화학 모의체인 아미노산 중합체 뿐만 아니라, 천연 발생 아미노산 중합체 및 비천연 발생 아미노산 중합체에 적용되는 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, 상기 용어들은 임의의 길이를 갖는 아미노산 사슬 예를 들어, 전장 단백질(즉, 항원)을 포함하며, 여기서 상기 아미노산 잔기는 공유 펩티드 결합에 의하여 결합된다.
"아미노산"이란 용어는, 천연 발생 아미노산 및 합성 아미노산 뿐만 아니라, 이 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 작용을 하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모의체를 의미한다. 천연 발생 아미노산은 유전자 코드에 의하여 암호화되는 것 뿐만 아니라, 추후에 변형되는 아미노산 예를 들어, 히드록시프롤린, γ- 카르복시글루타메이트 및 O-포스포세린이 있다. 아미노산 유사체란, 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 갖는 화합물 즉, 수소, 카르복시기, 아미노기 및 R 기에 결합된 α탄소를 갖는 화합물을 의미하는 것으로서, 그 예로서는 호모세린, 노르류신, 메티오닌 설폭시드, 메티오닌 메틸 설포늄이 있다. 이러한 유사체들은 변형된 R 기(예를 들어, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 주쇄를 갖지만, 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 갖는다. "아미노산 모의체"란, 아미노산의 일반적인 화학 구조와 상이한 구조를 가지지만, 천연 발생 아미노상과 유사한 방식으로 작용을 하는 화학 화합물을 의미한다.
본원에서 아미노산은 IUPAC-IUB 생화학 명명 협회(Biochemical Nomenclature Commission)에 의하여 추천되는, 일반적으로 알려진 3 문자 표시에 의하거나, 또는 1 문자 표시로서 언급될 수 있다. 이와 유사하게 뉴클레오티드는 그의 일반적으로 허용되는 1 문자 코드로 언급될 수 있다.
"보존적으로 변형된 변이체(conservatively modified variant)"란, 아미노산과 핵산 서열 모두에 적용되는 용어이다. 특정 핵산 서열에 있어서, "보존적으로 변형된 변이체"란, 동일하거나 또는 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 의미하며, 상기 핵산이 아미노산 서열을 암호화하지 않는 경우에는 본질적으로 동일한 서열을 의미한다. 유전자 코드의 축퇴성으로 인하여, 다수의 핵산 서열은 임의의 주어진 단백질을 암호화할 것이다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 암호화한다. 따라서, 알라닌이 코돈에 의하여 특정되는 매 위치에서, 상기 코돈은 암호화된 폴리펩티드를 변형시키지 않고서도 전술한 해당 코돈중 임의의 것으로 변형될 수 있다. 이러한 핵산 변이를 "침묵 변이"리고 하는데, 이는 보존적으로 변형된 변이의 일종이다. 폴리펩티드를 암호화하는 본원의 핵산 서열 모두는 또한 핵산의 가능한 모든 침묵 변이를 나타낸다. 당업자는 핵산중 각 코돈(보통 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG, 및 보통 트립토판에 대한 유일한 코돈인 TGG 제외)은 변형되어 기능적으로 동일한 분자를 형성할 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 각 침묵 변이는 제시된 각 서열을 내포한다.
변형을 통하여 아미노산이 그의 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환될 경우, 아미노산 서열에 대해서 당업자는 암호화된 서열중 단일 아미노산 또는 소량의 아미노산을 변경, 부가 또는 삭제하는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열에 대한 각각의 치환, 결실 또는 부가가 "보존적으로 변형된 변이체"임을 인식할 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당 업계에 널리 공지되어 있다. 그러한 보존적으로 변형된 변이체는 본 발명의 다형성 변이체, 종간 상동체 및 대립유전자들에 부가되어 제외되지 않는다.
서로 보존적으로 치환되는 아미노산을 포함하는 8개의 군들은 각각 다음과 같다:
1) 알라닌(A), 글리신(G);
2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E);
3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q);
4) 아르기닌(R), 리신(K);
5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V);
6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W);
7) 세린(S), 트레오닌(T); 및
8) 시스테인(C), 메티오닌(M)
[예를 들어, Creighton, Proteins(1984) 참조].
"서열 동일성 비율"은 2개의 최적으로 정렬된 서열들을 비교 윈도우(comparison window)에 대하여 비교함으로써 측정되는데, 여기서 상기 비교 윈도우중 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 2개의 서열의 최적 정렬에 대한 참고 서열(부가 또는 결실이 일어나지 않은 서열)에 비하여 부가 또는 결실(즉, 겝)을 포함할 수 있다. 상기 비율은 양 서열에 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 존재하는 위치의 수를 측정하여 매칭된 위치의 수를 구하고, 매칭된 위치의 수를 비교 윈도우에 존재하는 위치의 총수로 나눈 다음, 그 결과를 100으로 곱하여 서열 동일성의 비율을 구함으로써 계산할 수 있다.
본 명세서중 2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열에 있어서 "동일한" 또는 "동일성" 비율이란 용어는, 수동식 정렬 및 시각적 관찰에 의하거나, 또는 다음과 같은 서열 비교 알고리즘중 하나를 사용하여 측정된 지정 영역, 또는 비교 윈도우에 대한 최대 대응성에 관하여 비교 및 정렬될 때, 동일한(즉, 예를 들어, 본 발명의 전체 폴리펩티드 서열 또는 본 발명의 폴리펩티드의 세포외 도메인의 특정 영역에 대하여 60% 동일성, 임의적으로는 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일성을 나타내는) 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 특정 비율을 갖거나, 동일한 2 이상의 서열 또는 내부 서열을 의미한다. 이후 이러한 서열들은 "실질적으로 동일하다"라고 한다. 이러한 정의는 또한 테스트 서열의 상보성을 의미한다. 임의적으로, 상기 동일성은 길이 약 50개 이상인 뉴클레오티드로 이루어진 영역이나, 더욱 바람직하게는 길이 100～500개 또는 1000개 이상의 뉴클레오티드로 이루어진 영역에 걸쳐 존재한다.
2 이상의 폴리펩티드 서열에 관한 명세서의 내용중에서 "유사성" 또는 "유사성 비율"이란 용어는, 수동식 정렬 및 시각적 관찰에 의하거나, 또는 다음과 같은 서열 비교 알고리즘중 하나를 사용하여 측정된 지정 영역, 또는 비교 윈도우에 대한 최대 대응성에 관하여 비교 및 정렬될 때, 상기 정의한 바와 같은 8개의 보존적 아미노산 치환과 동일하거나 또는 이와 유사한 아미노산 잔기를 특정 비율로 보유하는 (즉, 예를 들어, 본 발명의 전체 폴리펩티드 서열, 예컨대 CCX-CKR2(서열 번호 2) 또는 본 발명의 폴리펩티드의 세포외 도메인의 폴리뉴클레오티드의 특정 영역 또는 전체 서열에 대하여 60%, 임의적으로는 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 유사한 2 이상의 서열 또는 내부 서열을 의미한다. 이러한 서열은 이후 "실질적으로 유사한" 것으로 칭하여 진다. 임의적으로, 이러한 동일성은 길이 약 50개 이상의 아미노산인 영역, 또는 더욱 바람직하게는 길이 약 100～500개 아미노산, 또는 1000개 이상의 아미노산인 영역에 대하여 존재한다.
서열 비교에 있어서, 통상적으로 하나의 서열이 테스트 서열과 비교되는 참고 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 때, 테스트 및 참고 서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요하다면 내부 서열 동등물을 지정해주며, 서열 알고리즘 프로그램의 매개변수를 지정한다. 디폴트 프로그램 매개변수가 사용될 수 있거나, 또는 대체 매개변수가 지정될 수 있다. 이후 서열 비교 알고리즘을 사용하여 이 프로그램 매개변수를 바탕으로 참고 서열에 대한 테스트 서열의 서열 동일성 비율을 계산한다.
본원에 사용된 "비교 윈도우"란, 전장 서열 또는 20～600 개, 약 50～약 200 개, 또는 약100～약 150개로 이루어진 군으로부터 선택된 다수의 인접 위치중 임의의 것으로 이루어진 분절에 대한 참고 분절을 포함하며, 이때 상기 서열은 두개의 서열들이 임의로 정렬된 후의 인접 위치들과 동일한 수를 갖는 참고서열과 비교될 수 있다. 비교용 서열의 정렬 방법은 당 업계에 널리 공지되어 있다. 비교용 서열의 최적 정렬은 예를 들어, Smith and Waterman (1970) Adv . Appl . Math . 2: 482c의 국소적 상동성 알고리즘, Needleman and Wunsch (1970) J Mol . Biol . 48: 443의 상동성 정렬 알고리즘, Pearson and Lipman(1988) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 85:2444의 유사성 검색 방법, 이러한 알고리즘의 컴퓨터화된 기구[GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFAST, Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI], 또는 수동 정렬법 및 시각적 관찰에 의하여 수행될 수 있다(예를 들어, 문헌[Ausubel et al ., Current Protocols in Molecular Biology(1995 supplement)] 참고).
서열 동일성 비율 및 서열 유사성 비율을 측정하는데 적당한 알고리즘의 예로서는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이 있는데 이에 관하여는 문헌[Altschul et al.,(1977) Nuc . Acids . Res . 25:3389-3402 및 Altschul et al .(1990) J. Mol . Biol. 215:403-410]에 각각 기술되어 있다. BLAST 분석법을 실행하기 위한 소프트웨어는 National Center for Biotechnology Information(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 통하여 공개적으로 입수 가능하다. 이 알고리즘은, 처음에 데이터베이스 서열중 동일한 길이의 단어와 정렬될 때 일부 양의 값인 한계치 스코어 T와 매칭되거나 또는 이를 만족시키는, 의문 서열(query sequence)중 길이 W인 짧은 단어를 동정함으로써 고 스코어링 서열쌍(HSP)을 동정하는 것을 포함한다. T는 이웃하는 단어 스코어 한계치를 의미한다[Altschul et al., 상동]. 이러한 초기의 이웃하는 단어의 히트는 이 히트를 포함하는 더욱 긴 HSP를 찾는 검색 과정을 개시하기 위한 시드(seed)로서 작용한다. 이러한 단어 히트는 누적 정렬 스코어가 증가할 수 있는 한도까지, 각 서열을 따라서 양 방향으로 확장된다. 누적 스코어는 매개변수 M[매칭 잔기쌍에 대한 보상 스코어; 항상 > 0임] 및 N[미스매칭된 잔기에 대한 페널티 스코어; 항상 < 0임]을 이용하여 뉴클레오티드 서열에 대하여 계산된다. 아미노산 서열에 있어서는, 스코어링 매트릭스를 사용하여 누적 스코어를 계산한다. 각 방향에서의 단어 히트의 연장은, 누적 정렬 스코어가 얻을 수 있는 그의 최대값과 양 X만큼 떨어질 때; 하나 이상의 음의 스코어링 잔기 정렬이 누적됨으로 인하여 누적 스코어가 0 이하가 될 때; 또는 서열의 말단부중 어느 하나에 도달할 때 정지된다. 상기 BLAST 알고리즘 매개변수 W, T 및 X는 정렬의 정확도와 속도를 결정한다. (뉴클레오티드 서열에 대한) BLASTN 프로그램은 디폴트값으로서 단어 길이(W)가 11, 기대치(E) 10, M=5, N=-4를 사용하며, 상기 양 사슬의 비교용으로 사용된다. 아미노산 서열에 대하여, BLASTP 프로그램은 디폴트값으로서 단어 길이 3, 기대치(E) 10과, BLOSUM62 스코어링 매트릭스를 사용한다[Henikoff and Henikoff(1989) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 89 : 10915, 정렬(B)=50, 기대치(E)=10, M=5, N=-4, 및 양 서열 비교].
BLAST 알고리즘도 두 서열 간의 유사성에 관한 통계적 분석을 수행한다(예를 들어, 문헌[Karlin and Altschul (1993) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90: 5873-5787] 참고). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 한 측정 방법은 최소합 확률법(P(N))인데, 이것은 두 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 간의 매치가 우연히 일어날 확률을 나타낸다. 예를 들어, 핵산은 기준 핵산에 대한 시험 핵산의 비교에서 최소합 확률이 약 0.2 미만, 더 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만일 경우 기준 서열과 유사하다고 본다.
두 핵산 서열 또는 폴리펩티드가 실질적으로 동일하다는 지시는 제1 핵산 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드가 하기하는 바와 같이 제2 핵산 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드에 대한 항체와 면역학적으로 교차 반응하는 것이다. 따라서, 예를 들어, 두 펩티드가 보존적 치환부만 상이할 경우 폴리펩티드는 일반적으로 제2 폴리펩티드와 실질적으로 동일하다. 두 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 또다른 지시는 하기하는 바와 같이 엄격한 조건하에 두 분자 또는 이들의 보체가 하이브리드화하는 것이다. 두 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 또다른 지시는 그 서열을 증폭시키는데 동일한 프라이머를 사용할 수 있다는 것이다.
CCX-CKR2 활성의 "조절제"는 CCX-CKR2의 활성을 직접적으로 또는 간접적으로 증가시키거나 감소시키는 분자를 말하고, 이는 CCX-CKR2 결합 또는 시그널링에 대한 시험관내 분석 및 생체내 분석을 사용하여 선별한 분자를 포함하는 것이다. CCX-CKR2 활성은, 예를 들어 CCX-CKR2 폴리펩티드를 효능제와 접촉시킴으로써, 및/또는. 일부 경우에서는 세포 내 CCX-CKR2를 발현시킴으로써 증가시킬 수 있다. 효능제는 CCX-CKR2의 활성을 증가시키는 분자를 말한다. 효능제는 CCX-CKR2에 결합하여 이의 활성을 자극, 증가, 개방, 활성화, 용이화, 활성 증대, 감작화 또는 상향 조절하는 물질이다. 조절제는 CCX-CKR2에 결합하기 위하여 공지된 CCX-CKR2 리간드, 예컨대 SDF-1 및 I-TAC 및 본원에서 기재된 작은 분자와 경쟁할 수 있다.
길항제는, 예를 들어 효능제, 예컨대 I-TAC 또는 SDF-2의 결합을 차단함으로써 CCX-CKR2 활성을 억제시키는 분자를 말한다. 효능제는, 예를 들어 CCX-CKR2에 결합하여 이의 활성에 대한 자극의 부분적 또는 전체적 차단, 감소, 방지, 활성화 지연, 불활성화, 탈감작화 또는 하향조절하는 물질이다.
조절제는 G-단백질이 커플링된 수용체(GPCRs), 키나제 등을 비롯한 수용체, 활성화제 또는 억제제와 결합하는 단백질과 CCX-CKR2의 상호활성을 예를 들어, 변화시키는 물질을 포함한다. 조절제는 천연 발생적인 리간드 및 합성 리간드, 길항제, 효능제, 화학적 소분자, siRNA 등 뿐만 아니라 예를 들어, 활성이 변화된 천연 발생적 케모카인 수용체 리간드의 유전적 개질 형태를 포함한다. 이러한 억제제 및 활성화제에 대한 분석은 예를 들어, CCX-CKR2를 발현시키는 세포에 추정 조절제 화합물을 가한 후, CCX-CKR2 시그널링, 예를 들어 ERK1 및/또는 ERK2 인산화 또는 ERK1 또는 ERK2 신호 전달 경로의 성분의 활성화에 대한 이의 작용적 효과 및/또는 본원에서 기재한 다른 효과를 측정하는 것을 포함한다. 억제 범위를 조사하기 위하여, 잠재적 활성화제, 억제제 또는 조절제로 처리된 CCX-CKR2를 포함하는 시료 또는 분석법을 활성화제, 억제제 또는 조절제가 없는 대조구 시료와 비교한다. (억제제로 처리되지 않은) 대조구 시료를 100%의 상대적 케모카인 수용체 활성치로 한다. 대조구에 대한 CCX-CKR2 활성치 또는 발현치가 약 85%, 임의로 약 90%, 임의로 약 80%, 임의로 약 50% 또는 약 25～0%일 때 CCX-CKR2의 억제가 달성된다. 대조구에 대한 CCX-CKR2 활성치 또는 발현치가 적어도 약 105%, 약 110%, 임의로 적어도 약 105%, 약 150%, 임의로 적어도 약 105%, 약 200～500%, 또는 적어도 약 105%, 약 1000～3000% 이상일 때 CCX-CKR2의 활성화가 달성된다.
"siRNA"는 세포, 예를 들어, 포유동물 세포(인간 세포 포함) 및 신체, 예를 들어 포유동물 신체(인간 신체 포함) 중 유전자 발현을 간섭하여 특정 유전자의 전사후 발현 억제를 야기할 수 있는 소간섭 RNA를 말한다. RNA 간섭 현상은 문헌[Bass, Nature 411: 428-29 (2001]]; [Elbahir et al., Nature 411: 494 98 (2001)], 및 [Fire et al., Nature 391: 806-11 (1998)] ; 및 WO 01/75164에서 기재 및 기술되어 있으며, RNA의 간섭 방법도 기술되어 있다. 본원에서 개시된 유전자 산물을 암호화하는 핵산 및 서열 기재의 siRNA는 통상적으로 100개의 염기쌍 미만을 갖고, 예를 들어 30 염기쌍 미만일 수 있으며, 상보적 DNA 가닥의 사용을 포함하는, 선행 기술에서 공지된 접근법 또는 합성 방법에 의해 제조할 수 있다. 상기 siRNA는 세포, 예를 들어, 포유동물 세포(인간 세포 포함) 및 신체, 예를 들어 포유동물 신체(인간 신체 포함) 중 유전자 발현을 간섭하여 특정 유전자의 전사후 발현 억제를 야기할 수 있다. 본 발명에 따른 대표적 siRNA는 29 염기쌍 이하, 25 염기쌍, 22 염기쌍, 21 염기쌍, 20 염기쌍, 15 염기쌍, 10 염기쌍, 5 염기쌍 또는 그 부근 또는 그 사이의 임의의 정수의 염기쌍을 가질 수 있다. 최상의 억제 siRNA의 제조 툴은 DNAengine Inc.(워싱턴주 시에틀) 및 Ambion, Inc.(텍사스주 오스틴)으로부터 구입할 수 있는 것을 포함한다.
RNAi 기술 중 하나는 센스 서열 및 안티센스 서열이 공여자 및 수용자 스플라이싱 부위를 갖는 적절한 스플라이싱 배향으로 인트론 서열에 인접한 영역에 위치한 유전자 구조체를 이용한다. 대안으로, 각종 길이의 스페이서 서열을 사용하여 상기 구조체 중 자가-상보적 영역을 분리할 수 있다. 유전 구조체의 전사 과정에서, 인트론 서열이 스플라이싱에 의해 제거되어, 센스 서열 및 안티센스 서열, 뿐만 아니라 스플라이스 이음부 서열이 형성된 2가닥 RNA에 결합되게 한다. 그 후, 리보뉴클레아제를 선택하여 2가닥 RNA 결합시키고 절단하여 특정 mRNA 유전자 서열의 불활성화 및 특정 유전자의 발현 억제를 개시한다.
"화합물"은 특정 분자 및 이의 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 다형체 및 염을 말한다.
"헤테로원자"는 결합된 질소, 산소, 또는 황 원자를 말한다.
"치환된"은 모 분자 또는 기에 결합된 기를 말한다. 따라서, 메틸 치환기를 갖는 벤젠 고리는 메틸 치환된 벤젠이다. 유사하게, 5개의 수소 치환기를 갖는 벤젠 고리는 모 분자에 결합되는 경우 비치환된 페닐 기일 것이다.
"치환된 헤테로원자"는 헤테로원자가 치환된 기를 말한다. 상기 헤테로원자는 할로겐, 알킬, 알킬렌, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아릴렌, 시클로알킬, 시클로알킬렌, 헤테로아릴, 헤테로아릴렌, 헤테로시클릴, 탄소환, 히드록시, 알콕시, 아릴옥시, 및 술포닐을 포함하지만 이에 국한되지는 않는 원자 또는 기로 치환될 수 있다. 대표적 치환된 헤테로원자의 예로서 시클로프로필 아미닐, 이소프로필 아미닐, 벤질 아미닐, 및 페녹시를 들 수 있다.
"알킬"은 선형 또는 분지형일 수 있는 1가의 포화 탄화수소 기를 말한다. 달리 정의하지 않는 한, 상기 알킬 기는 전형적으로 1 ～ 10개의 탄소 원자를 함유한다. 전형적인 알킬 기의 예로서 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, 이소부틸, tert-부틸, n-펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸, n-노닐, n-데실 등을 들 수 있다.
"알킬렌"은 선형 또는 분지형일 수 있는 2가의 포화 탄화수소 기를 말한다. 달리 정의하지 않는 한, 상기 알킬렌 기는 전형적으로 1 ～ 10개의 탄소 원자를 함유한다. 대표적인 알킬렌 기의 예로서 메틸렌, 에탄-1,2-디일("에틸렌"), 프로판-1,2-디일, 프로판-1,3-디일, 부탄-1,4-디일, 펜탄-1,5-디일 등을 들 수 있다.
"알케닐"은 선형 또는 분지형일 수 있고, 하나 이상, 및 전형적으로는 1, 2 또는 3개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 1가의 불포화 탄화수소 기를 말한다. 달리 정의하지 않는 한, 상기 알케닐 기는 전형적으로 2 ～ 10개의 탄소 원자를 함유한다. 대표적인 알케닐 기의 예로서 에테닐, n-프로페닐, 이소프로페닐, n-부트-2-에닐, n-헥스-3-에닐 등을 들 수 있다.
"알키닐"은 선형 또는 분지형일 수 있고, 하나 이상, 및 전형적으로는 1, 2 또는 3개의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 1가의 불포화 탄화수소 기를 말한다. 달리 정의하지 않는 한, 상기 알키닐 기는 전형적으로 2 ～ 10개의 탄소 원자를 함유한다. 대표적인 알키닐 기의 예로서 에티닐, n-프로피닐, n-부트-2-이닐, n-헥스-3-이닐 등을 들 수 있다.
"아릴"은 단일 고리(즉, 페닐) 또는 융합된 고리(즉, 나프탈렌)을 갖는 1가의 방향족 탄화수소를 말한다. 달리 정의하지 않는 한, 상기 아릴 기는 전형적으로 6 ～ 10개의 탄소 고리 원자를 갖는다. 대표적인 아릴 기의 예로서 페닐 및 나프탈렌-1-일, 나프탈렌-2-일 등을 들 수 있다.
"아릴렌"은 단일 고리(즉, 페닐렌) 또는 융합된 고리(즉, 나프탈렌디일)를 갖는 2가의 방향족 탄화수소를 말한다. 달리 정의하지 않는 한, 상기 아릴렌 기는 6 ～ 10개의 탄소 고리 원자를 함유한다. 대표적인 아릴렌 기의 예로서 1,2-페닐렌, 1,3-페닐렌, 1,4-페닐렌, 나프탈렌-1,5-일, 나프탈렌-2,7-디일 등을 들 수 있다.
"아랄킬"은 아릴 치환된 알킬 기를 말한다. 대표적인 알킬 기로서 벤질을 들 수 있다.
"시클로알킬"은 단일 고리 또는 융합된 고리를 갖는 1가의 포화 탄소환 탄화수소 기를 말한다. 달리 정의하지 않는 한, 상기 시클로알킬 기는 전형적으로 3 ～ 10개의 탄소 원자를 함유한다. 대표적인 시클로알킬 기의 예로서 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실 등을 들 수 있다.
"시클로알킬렌"은 단일 고리 또는 융합된 고리를 갖는 2가의 포화 탄소환 탄화수소 기를 말한다. 달리 정의하지 않는 한, 상기 시클로알킬렌 기는 전형적으로 3 ～ 10개의 탄소 원자를 함유한다. 대표적인 시클로알킬렌 기의 예로서 시클로프로판-1,2-디일, 시클로부틸-1,2-디일, 시클로부틸-1,3-디일, 시클로펜틸-1,2-디일, 시클로펜틸-1,3-디일, 시클로헥실-1,2-디일, 시클로헥실-1,3-디일, 시클로헥실-1,4-디일 등을 들 수 있다.
"헤테로아릴"은 단일 고리 또는 융합된 고리를 갖고 고리 내에 질소, 산소, 또는 황 중에서 선택된 하나 이상의 헤테로원자(전형적으로 1 ～ 3개의 헤테로원자)를 함유하는 치환되거나 비치환된 1가의 방향족 기를 말한다. 달리 정의하지 않는 한, 상기 헤테로아릴 기는 전형적으로 5 ～ 10개의 총 고리 원자를 함유한다. 대표적인 헤테로아릴 기의 예로서 피롤, 이미다졸, 티아졸, 옥사졸, 퓨란, 티오펜, 티아졸, 피라졸, 이속사졸, 이소티아졸, 피리딘, 피라진, 피리다진, 피리미딘, 트리아진, 인돌, 벤조퓨란, 벤조티오펜, 벤즈이미다졸, 벤즈티아졸, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 퀴나졸린, 퀴노옥살린 등의 1가의 종류를 들 수 있고, 결합 위치는 임의의 이용가능한 탄소 또는 질소 고리 원자이다.
"헤테로아릴렌"은 단일한 고리 또는 융합된 고리를 갖고 고리 내에 질소, 산소, 또는 황 중에서 선택된 하나 이상의 헤테로원자(전형적으로 1 ～ 3개의 헤테로원자)를 함유하는 2가의 방향족 기를 말한다. 달리 정의하지 않는 한, 상기 헤테로아릴렌 기는 전형적으로 5 ～ 10개의 총 고리 원자를 함유한다. 전형적인 헤테로아릴렌 기의 예로서 피롤, 이미다졸, 티아졸, 옥사졸, 퓨란, 티오펜, 티아졸, 피라졸, 이속사졸, 이소티아졸, 피리딘, 피라진, 피리다진, 피리미딘, 트리아진, 인돌, 벤조퓨란, 벤조티오펜, 벤즈이미다졸, 벤즈티아졸, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 퀴나졸린, 퀴노옥살린 등의 1가의 종류를 들 수 있고, 결합 위치는 임의의 이용가능한 탄소 또는 질소 고리 원자이다.
"헤테로시클릴" 또는 "헤테로시클릭 기"는 단일한 고리 또는 복수의 융합된 고리를 갖고 고리 내에 질소, 산소, 또는 황 중에서 선택된 하나 이상의 헤테로원자(전형적으로 1 ～ 3개의 헤테로원자)를 함유하는 치환되거나 비치환된 1가의 치환되거나 비치환된(비-방향족) 기를 말한다. 달리 정의하지 않는 한, 상기 헤테로시클릭 기는 전형적으로 2 ～ 9개의 총 고리 원자를 함유한다. 대표적인 헤테로시클릭 기의 예로서 피롤리딘, 모르폴린, 이미다졸리딘, 피라졸리딘, 피페리딘, 1,4-디옥산, 티오모르폴린, 피페라진, 3-피롤린 등을 들 수 있고, 결합 위치는 임의의 이용가능한 탄소 또는 질소 고리 원자이다.
"탄소환"은 고리 내 각 원자가 탄소인 방향족 또는 비-방향족 고리를 말한다. 대표적인 탄소환으로서 시클로헥산, 시클로헥센, 및 벤젠을 들 수 있다.
"할로" 또는 "할로겐"은 플루오로-(-F), 클로로-(-Cl), 브로모-(-Br), 및 요오도-(-I)를 말한다.
"히드록시" 또는 "히드록실"은 -OH 기를 말한다.
"알콕시"는 -OR 기를 말하고, 이때 R은 치환되거나 비치환된 알킬, 알킬렌, 시클로알킬, 또는 시클로알킬렌일 수 있다. 적합한 치환기로서 할로, 시아노, 알킬, 아미노, 히드록시, 알콕시, 및 아미도를 들 수 있다. 대표적인 알콕시기의 예로서 메톡시, 에톡시, 이소프로폭시, 및 트리플루오로메톡시를 들 수 있다.
"아릴옥시"는 -OR 기를 말하고, 이때 R은 치환되거나 비치환된 아릴 또는 헤테로아릴 기이다. 대표적인 아릴옥시 기로서 페녹시를 들 수 있다.
"술포닐"은 -S(O)2- 또는 -S(O)2R 기를 말하고, 이때 R은 알킬, 알킬렌, 알케닐, 알키닐, 아릴, 시클로알킬, 시클로알킬렌, 헤테로아릴, 헤테로아릴렌, 헤테로시클릭, 또는 할로겐일 수 있다. 대표적인 술포닐 기의 예로서 술포네이트, 술폰아미드, 술포닐 할라이드, 및 디프로필아민 술포네이트를 들 수 있다.
"축합"은 2개 이상의 분자가 공유 결합되는 반응을 말한다. 마찬가지로, 축합 산물은 축합 반응에 의해 형성된 산물이다.
발명의 상세한 설명
I. 서론
본 발명은, 본원에서 CCX-CKR2로서 언급되는 고아 수용체 RDC1이 케모카인 리간드 SDF-1 및 I-TAC에 결합한다는 발견을 제공한다. 또한, 본 발명은 CCX-CKR2가 암과 관련되어 있다는 놀라운 발견을 제공한다. 따라서, 본 발명은 CCX-CKR2을 검출함에 의해 암을 진단하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 암에 걸린 환자에게 CCX-CKR2의 조절제를 투여함에 의해 암을 억제하는 방법을 제공한다.
II . CCX - CKR2 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드
본 발명의 수많은 구체예에서, 관심 대상인 CCX-CKR2 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 재조합 방법을 사용하여 단리하고 복제할 것이다. 상기 구체예는 단백질의 발현을 위하여 또는 변이체, 유도체, 발현 카세트의 생성 동안 CCX-CKR2 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5, 서열 번호 7, 및 서열 번호 9) 또는 CCX-CKR2 폴리펩티드(예를 들어, 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 8, 및 서열 번호 10)로부터 유도된 다른 서열를 단리하기 위하여, 상이한 종에서 CCX-CKR2를 단리하거나 검출하기 위해 CCX-CKR2 유전자 발현을 모니터링하기 위하여, 환자의 진단 목적으로, 예를 들어 CCX-CKR2의 돌연변이를 검출하거나 CCX-CKR2 핵산 또는 CCX-CKR2 폴리펩티드의 발현을 검출하기 위하여 사용할 것이다. 일부 구체예에서, CCX-CKR2를 암호화하는 서열은 이종성 프로모터에 효과적으로 결합된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 핵산은, 특히 인간, 생쥐, 쥐, 개 등을 비롯한 임의의 포유동물 유래이다.
일부의 경우에서, 본 발명의 CCX-CKR2 폴리펩티드는 인간 CCX-CKR2 서열(예를 들어, 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 8, 및 서열 번호 10)의 세포외 아미노산을 포함하는 반면, 기타 잔기는 변형되거나 존재하지 않는다. 기타 구체예에서, CCX-CKR2 폴리펩티드는 CCX-CKR2의 리간드 결합 단편을 포함한다. 예를 들어, 일부 경우, 상기 단편은 I-TAC 및/또는 SDF-1에 결합한다. 7개의 경막 수용체(예를 들어, CCX-CKR2)의 구조는 당업자에게 잘 공지되어 있으므로 경막 도메인을 용이하게 결정할 수 있다. 예를 들어, 용이하게 이용가능한 소수성 알고리즘은 인터넷에서 G-단백질 연결 수용체 데이타베이스(GPCRDB), 예를 들어, http://www. gpcr. org/7tm/seq/DR/RDCl_HUMAN.TABDR.html 또는 http://www.gpcr. org/7tm/seq/vis/swac/P25 1 06.html에서 발견할 수 있다.
본 발명은 재조합 유전학 분야의 일반적 기술에 의존한다. 본 발명에서 사용하는 일반적인 방법을 개시하는 기본 문헌으로서 [Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001)]; [Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990)], 및 [Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al ., eds., 1994))]를 들 수 있다.
포유동물 조직으로부터 CCX-CKR2를 암호화하는 유전자를 암호화하는 유전자를 선별하기 위한 적절한 프라이머 및 프로브는 본원에서 제공되는 서열(예를 들어, 서열 번호 1)ㅊ로부터 유도할 수 있다. PCR에 대한 일반적인 개관을 위하여 문헌[Tnnis et al . PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego (1990)]을 참고할 수 있다.
III. 특정 치료제의 개발
CCX-CKR2 기능 조절제를 비롯하여 CCX-CKR2에 결합하는 분자, 즉 CCX-CKR2 활성의 효능제, 길항제 또는 물질은 암을 비롯한 다수의 포유동물의 질병 치료에 유용하다.
케모카인 수용체의 길항제 또는 케모카인 수용체 기능의 기타 억제제에 의해 치료될 수 있는 인간 또는 기타 종의 질병 또는 증상은 암종, 신경아교종, 중피종, 흑색종, 림프종, 백혈병, 샘암종, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 아교모세포종, 백혈병, 전립선암, 및 버킷 림프종, 두경부암, 결장암, 결장직장암, 비소세포암, 소세포암, 식도암, 위암, 췌장암, 간담계암, 쓸개암, 소장암, 직장암, 신장암, 방광암, 전립선암, 음경암, 요도암, 고환암, 자궁경부암, 질암, 자궁암, 난소암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 이자 내분비암, 카르시노이드암, 뼈암, 피부암, 망막세포종, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종(기타 암에 대하여 문헌[CANCER:PRINCTPEES AND PRACTICE (DeVita, V.T. et al. eds 1997] 참고); 뿐만 아미라 뇌 및 신경세포 기능장애, 예컨대 알츠하이머병 및 다발경화증; 신장 기능장애; 류마티스 관절염; 심장 동종이식 거부반응; 죽상경맥동화증; 천식; 사구체신염; 접촉 피부염; 염증성 창자병; 대장염; 건선; 재관류 손상; 뿐만 아니라 기타 장애 및 본원에서 기재된 질병을 포함하지만 이에 국한되는 것은 아니다.
대안으로, CCX-CKR2의 효능제는 질병, 예를 들어 신장, 뇌 또는 신경세포 기능장애를 치료하기 위하여, 뿐만 아니라 줄기 세포 동원으로 치료하는 경우에 사용할 수 있다.
A. 케모카인 수용체의 조절제를 선별하는 방법
수많은 상이한 선별 프로토콜을 사용하여 세포, 특히 포유동물 세포, 및 특히 인간 세포 중 CCX-CKR2의 활성 또는 작용 수준을 조절하는 물질을 선별할 수 있다. 일반적으로, 선별 방법은 복수의 물질을 선별하여, CCX-CKR2와 결합하고, 리간드(예를 들어, I-TAC 및/또는 SDF-1)가 CCX-CKR2와 결합하거나 CCX-CKR2를 활성화하는 것을 막음으로써 CCX-CKR2(또는 이의 세포외 도메인)와 상호작용하는 물질을 선별하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 물질은 또다른 단백질에 대한 물질의 친화도보다 약 1.5, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 300, 500 또는 1000배의 친화도로 CCX-CKR2에 결합한다.
1. 케모카인 수용체 결합의 분석
일부 구체예에서, CCX-CKR2 조절제는 CCX-CKR2의 리간드, 예컨대 SDF-1 또는 I-TAC와 경쟁하는 분자를 선별함에 의해 선별한다. 당업자는 경쟁 분석을 수행하기 위한 다수의 방법이 존재한다는 것을 알 것이다. 일부 구체예에서, CCX-CKR2를 갖는 시료를 표지된 CCX-CKR2 리간드와 함께 예비 항온배양한 후, 잠재적인 경쟁자 분자와 접촉시킨다. CCX-CKR2에 결합된 리간드의 양의 변화(예를 들어, 질병)는 분자가 잠재적인 CCX-CKR2 조절제임을 나타낸다.
CCX-CKR2에 결합할 수 있는 물질을 선별함에 의해 예비 선별을 수행할 수 있고, 이는 이에 따라 선별된 물질 중 적어도 일부가 케모카인 수용체 조절제일 수 있기 때문이다. 결합 분석은 보통 CCX-CKR2를 하나 이상의 시험 물질과 접촉시키고, 단백질 및 시험 물질이 충분한 시간 동안 결합 복합체를 형성하도록 하는 것을 포함한다. 형성된 임의의 결합 복합체는 수많은 확립된 분석 기술 중 임의의 것을 사용하여 검출할 수 있다. 단백질 결합 분석법은 면역조직화학적 결합 분석법, 흐름 세포 측정법, 방사리간드 결합 분석법, 유로퓸 표지된 리간드 결합 분석법, 비오틴 표지된 리간드 결합 분석법 또는 CCX-CKR2의 입체구조를 유지하는 기타 분석법을 포함하지만 이에 국한되는 것은 아니다. 상기 분석에 사용되는 케모카인 수용체는 천연적으로 발현되는 것이거나, 또는 복제 또는 합성할 수 있다. 예를 들어, CCX-CKR2를 잠재적 효능제와 접촉시키고 CCX-CKR2 활성을 측정함에 의해 CCX-CKR2 활성을 자극하는 이들 분자를 선별하는 것이 가능하다.
2. 세포 및 시약
본 발명의 선별 방법은 시험관내 분석 또는 세포 기재 분석으로서 수행할 수 있다. 시험관내 분석은, 예를 들어 CCX-CKR2를 포함하는 막 부분 또는 전체 세포를 사용하여 수행한다. 세포 기재 분석은 CCX-CKR2가 발현되는 임의의 세포 내에서 수행할 수 있다.
세포 기재 분석은 CCX-CKR2에 결합하거나 이의 활성을 조절하는 물질을 선별하기 위하여 CCX-CKR2를 함유하는 전체 세포 또는 세포 부분을 포함한다. 본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있는 대표적인 세포 유형은, 예를 들어 임의의 포유동물 세포, 예컨대 호중구, 단핵구, 대식 제포, 호산구, 호염기구, 비만 세포, 및 T 세포 및 B 세포와 같은 림프구, 백혈병, 버킷 림프종, 종양 세포, 내피 세포, 섬유모세포, 심장 세포, 근육 세포, 유방 종양 세포, 난소암 암종, 자궁경부 암종, 아교모세포종, 간 세포, 신장 세포, 및 신경 세포, 뿐만 아니라 효모를 비롯한 진균 세포를 포함한다. 세포는 1차 세포, 종양 세포 또는 다른 유형의 불멸의 세포주일 수 있다. 물론, CCX-CKR2는 CCX-CKR2의 내인성 형태를 발현하지 않는 세포 내에서 발현될 수 있다.
일부 경우, CCX-CKR2의 단편뿐 아니라 단백질 융합도 선별을 위해 사용할 수 있다. CCX-CKR2 리간드와 결합하기 위해 경쟁하는 분자가 요구되는 경우, 사용된 CCX-CKR2 단편은 리간드와 결합할 수 있는(예를 들어, I-TAC 또는 SDF-1과 결합할 수 있는) 단편이다. 대안으로, CCX-CKR2의 단편은 CCX-CKR2에 결합하는 분자를 선별하기 위한 표적으로서 사용할 수 있다. CCX-CKR2 단편은, 예를 들어 CCX-CKR2의 20, 30, 40, 50개의 아미노산 내지 1개의 아미노산을 제외한 모든 아미노산을 함유하는 단백질의 임의의 단편을 포함할 수 있다. 전형적으로, 리간드 결합 단편은 CCX-CKR2의 경막 영역 및/또는 CCX-CKR2의 세포외 도메인의 대부분 또는 모두를 포함할 것이다.
3. 시그널링 활성
일부 구체예에서, CCX-CKR2 활성에 의해 유발된 시그널링은 CCX-CKR2 조절제를 선별하기 위해 사용한다. 케모카인 수용체의 시그널링 활성은 다수의 방법을 측정할 수 있다. 예를 들어, 시그널링은 케모카인 수용체 매개 세포 부착을 검출함에 의해 측정할 수 있다. 케모카인과 케모카인 수용체 사이의 상호작용은 인테그린 친화도 및 결합력의 조절을 통해 급속한 부착을 야기할 수 있다(예를 들어, 문헌[Laudanna, Immunological Reviews 186:37-46 (2002) 참고).
또한, 시그널링은 메신저, 예컨대 시클릭 AMP 또는 이노시톨 포스페이트를 정량적으로 및 정성적으로 측정함에 의해서 측정할 수 있고, 뿐만 아니라 인산화 또는 탈인산화도 모니터링할 수 있다[예를 들어, 문헌[Premack, et al . Nature Medicine 2: 1174-1178 (1996)] 및 [Bokoch, Blood 86:1649-1660 (1995)] 참고).
실시예는 CCX-CKR2 활성이 MAPK 경로에 의해 매개되고, 구체적으로 CCX-CKR2는 MARK 단백질 ERK1 및 ERK2의 인산화를 촉진한다는 것을 증명하는 결과를 제공한다. 대표적 고유 서열 ERK1은 GenBank Accession No, p27361에서 제공되고; 대표적 고유 서열 ERK2는 GenBank Accession No, p28482에서 제공된다. 따라서, 일부 분석에서는 MAPK 경로에서의 시그널을 검출하도록 고안한다. MAPK 경로에 대해 사용되는 "시그널"이라는 용어는 경로의 일부가 되는 성분 및/또는 경로와 관련된 일부 활성 또는 발현을 말한다. 상기 성분은 MAPK 신호 전달 경로에 포함된(예를 들어, 생성되거나, 사용되거나 개질되는) 임의의 분자일 수 있다. 일부 경우에 있어서 시그널은 MAPK 단백질, 예컨대 EPK1 또는 EPK2의 인산화를 검출하는 것이다. 검출될 수 있는 다른 신호는 ERK1 또는 ERK2의 인산화의 다운스트림에서 형성되고/되거나 사용되는 성분, 뿐만 아니라 이들 성분의 형성 및 사용과 관련된 활성을 포함한다. 일부 분석은 ERK1 또는 ERK2의 인산화의 업스트림에서 형성되고/되거나 사용되는 성분, 뿐만 아니라 상기 업스트림 성분의 생성 또는 사용과 관련된 활성을 검출하기 위하여 수행할 수 있다. 상기 지시한 바와 같이, ERK1 또는 ERK2의 경우, 업스트림 성분은, 예를 들어, Ras, MKKK(예를 들어, c-Raf1, B-Raf, 및 A-Raf) 및 MKK(예를 들어, MKK1 및 MKK2)를 포함한다. 다운스트림 성분은, 예를 들어 단백질 p90RSK, c-JUN, c-FOS CREB 및 STAT를 포함한다. 따라서, 이들 성분 각각은 이들 성분의 특정 분석 및/또는 개질(예를 들어, 인산화)에서 검출될 수 있다. 또한, 유전자 발현 프로파일링 및 단백질 분비도 검출할 수 있다.
제공되는 일부 선별 분석법은 ERK1 및/또는 ERK2의 인산화를 검출하는 것을 포함한다. 이들 단백질의 인산화는 리간드(예를 들어, SDF-1, ITAC)에 의존한다. 따라서, 특정 선별 방법에서의 분석은 ERK1 및 ERK2의 인산화를 촉진하기 위하여 ITAC 또는 SDF-1의 존재 하에 수행한다. ITAC 및 SDF-1과 함께 분석을 수행하는 경우, 이 분석은 상기 기재한 이유로 인하여 CXCR2 또는 CXFR4를 발현하지 않는 세포를 사용하여 단순화할 수 있다.
각종 방법을 사용하여 ERK1 또는 ERK2가 인산화되었는 지를 측정할 수 있다. 한가지 방법은 세포를 CCX-CKR2 리간드 및 시험 물질과 함께 항온배양한 후에 이 세포를 용해시키는 것이다. 그 후, 생성되는 용해물은 그 용해물을 겔 상의 별개의 단백질로 전기영동 분리한 후 그 겔을 ERK1 또는 ERK2의 인산화된 형태에 특이적으로 결합하는 항체와 함께 프로빙함에 의한 웨스턴 블롯에 의해 분석할 수 있다. 상기 항체는 매사추세주, 베벌리의 셀 시그널링 테크날러지로부터 구입가능하다. 존재하는 ERK1 또는 ERK2의 총량은 ERK1 및 ERK2의 인산화된 형태 및 비인산화된 형태 모두에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 임의로 측정할 수 있다. 상기 방법에 대한 추가의 세부 사항은 실시예에서 기재되어 있다. 고효율 스크리닝에 적합한 또다른 접근법은 ERK1 및 ERK2의 인산화된 형태에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하는 ELISA 방법을 사용하는 것이다. 고효율 포맷으로 상기 분석을 수행하기 위한 키트도 매사추세주, 베벌리의 셀 시그널링 테크날러지로부터 구입할 수 있다(예를 들어, PathScan(상표명) Phospho- p44/42 MAPK (T202/Y204) Sandwich ELISA Kit 참고).
유사한 웨스턴 블로팅 및 ELISA 기술을 사용하여 ERK1 및 ERK2의 인산화의 MAPK 경로의 다운스트림의 성분인 단백질의 존재 여부를 검출할 수 있고, 이때 이 경로에 포함되는 성분을 특이적으로 인지할 수 있는 항체를 사용한다. 예를 들어, p90RSK의 인산화는 인산화된 ERK1 또는 ERK2의 웨스턴 검출법과 유사하게, 시판되는 인-특이적 항체를 사용하여 평가할 수 있다.
또한, CCX-CKR2 활성화의 다운스트림에서 발생하는 다른 사건을 모니터링하여 시그널링 활성을 측정할 수도 있다. 다운스트림 사건은 케모카인 수용체의 자극의 결과로서 발생하는 이들 활성 또는 발현을 포함한다. 대표적 다운스트림 사건은, 예를 들어 세포의 하전 상태(예를 들어, 정상 세포에서 암 세포로 또는 암 세포에서 비-암 세포로)를 포함한다. 맥관형성에 수반되는 확립된 시그널링 캐스케이드(예를 들어, VEGF-매개 시그널링)도 CCX-CKR2 조절제에 의해 야기되는 결과에 대해 모니터링할 수 있다. 예를 들어, 융모요막 분석법(CAM)을 사용하여 맥관형성시의 결과를 분석하거나, 예를 들어 마일즈 분석법(Miles assay)을 사용하여 맥관 투과성에 대한 영향을 연구할 수 있다.
또다른 실시예에서, CCX-CKR2 활성 대신 세포 생존을 측정할 수 있다. 실시예에서 더 자세히 기재되어 있는 바와 같이, CCX-CKR2의 발현은 동일한 환경 하에서 증식된, CCX-CKR2을 발현하지 않는 세포와 비교시에 낮은 혈청의 환경에서 증식된, CCX-CKR2을 발현하는 세포의 생존을 연장시킨다. 따라서, CCX-CKR2의 길항 작용은 세포 생존을 감소시킬 것으로 기대되는 반면, 활성(예를 들어, 효능제를 통한)은 세포 생존을 증가시킬 것으로 기재된다. 결과적으로, 세포 생존 및 아폽토시스는 CCX-CKR2 활성에 대한 판독 정보로서 작용할 수 있다.
광범위한 종류의 세포 사멸 분석법 및 아폽토시스 분석법을 CCX-CKR2 조절제를 선별하기 위한 선별 방법으로 도입할 수 있다. 일반적으로, 이러한 유형의 분석은, 보통 세포 사멸 또는 아폽토시스의 잠재적인 조절제인 시험 화합물의 유무 하에 세포 사멸 또는 아폽토시스를 유도하는 조건에 세포군을 노출시키는 것을 포함하는 것이 통상적이다. 그 후, 세포, 또는 이의 추출물과 함께 분석을 수행하여, 시험 물질의 유무 하에 세포 사멸 또는 아폽토시스의 범위를 비교함으로써 이 시험 물질이 세포 사멸 또는 아폽토시스에 어떠한 영향을 미치는지 분석한다. 세포 사멸 또는 아폽토시스에 대하여 분석하는 대신 반대 유형의 분석, 즉 세포 생존에 대하여 분석할 뿐만 아니라 관련 활성, 예컨대 세포 성장 및 세포 증식의 분석을 수행할 수 있다. 분석의 특정 유형에 관계 없이, CCX-CKR2, 예컨대 I-TAC 또는 SDF-1을 활성화시키는 리간드의 존재 하에 일부 분석을 수행한다.
세포 사멸 또는 아폽토시스를 특징짓는 다양한 상이한 매개변수를 본 발명의 선별 방법에 대하여 분석할 수 있다. 상기 매개변수의 비제한적인 예로서, 유전자 또는 단백질 발현 분석에 의한 독성 반응에 대한 세포 경로의 활성의 모니터링, DNA 분절, 세포막 조성의 변화, 막 투과성, 사멸 수용체 또는 다운스트림 시그널링 경로의 성분(예를 들어, 카스파제)의 활성화, 일반적 스트레스 반응, NF-카파 B의 활성화 및 미토겐에 대한 반응을 들 수 있다.
아폽토시스를 감소시키는 데 있어서 CCX-CKR2가 담당하는 역할을 고려한 또다른 방법은 아폽토시스 및 세포 사멸의 반대에 대한 분석, 즉 세포 생존 또는 세포 증식을 검출하는 선별 방법을 수행하는 것이다. 세포 생존은, 예를 들어 세포가 살아있는 시간의 길이, 원래 세포의 특정 백분율이 생존하는 시간의 길이, 또는 세포 수의 증가를 모니터링함으로써 측정할 수 있다. 이들 매개변수는 확립된 기술을 사용하여 시각적으로 모니터링할 수 있다.
아폽토시스를 평가하는 또다른 분석법은 세포를 아넥신 V(알렉사 플루오르(r) 488 안료에 컨쥬게이션됨) 및 요오드화프로피듐(PI)(유진 오레곤, 분자 프로브)로 표지하는 것을 포함한다. 적색 형광의 핵산 결합 안료인 PI는 살아있는 세포 및 아폽토시스 세포 모두에 대해 불투과성이다. PI는 세포 내의 핵산에 단단히 결합함으로써 오로지 괴사 세포만을 표지한다. 아넥신 V는 아폽토시스 세포가 포스파틸세린(PS)을 세포의 외부 표면으로 이전시키는 것을 이용한다. 아넥신 V는 (PS)에 대하여 높은 친화도를 갖는 인간 항응고제이다. 살아있는 세포가 아닌 아폽토시스 세포는 이들의 외부 표면에 PS를 발현한다. 아넥신 V(알렉사 플루오르(r) 488 안료로 표지됨)은 이들 세포를 녹색 형광을 표지한다. 그 후, 형광 활성화 세포 분리기(FACS) 상에서 세포를 분석하여 적색 및 녹색 채널 중 형광을 분석하였고; 아폽토시스 세포(아넥신에 양성, PI에 음성)는 오로지 녹색 채널에서만 형광을 나타내었고; 살아있는 세포(아넥신에 음성, PI에 양성)는 적색 채널 및 녹색 채널 모두에서 낮은 형광을 나타내었으며; 괴사 또는 사멸 세포(아넥신에 양성, PI에 음성)는 적색 및 녹색 채널 모두에서 강한 형광을 나타내었다.
기타 선별 방법은 특정 조절 단백질의 발현이 CCX-CKR2의 존재 또는 활성화에 의해 유도된다는 관측에 기초한 것이다. 따라서, CCX-CKR2의 활성을 간접적으로 측정하기 위하여 상기 단백질의 검출을 사용할 수 있다. 하기의 실시예에서 더 자세하게 기재되어 있는 바와 같이, 일련의 ELISA 검사 방법을 수행하여 세포 배지 중 CCX-CKR2로 형질감염된 세포와 형질감염되지 않은 세포에 있어서 각종 분비된 단백질의 상대적인 농도를 비교한다. 이들 연구를 통하여, CCX-CKR2는 성장 인자, 케모카인, 메탈로프로테이나제 및 메탈로프로테이나제의 억제제를 비롯한 수많은 다양한 조절 단백질의 생성을 유도한다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 제공된 일부 선별 방법은 시험 물질이 CCX-CKR2에 의한 특정 성장 인자, 케모카인, 메탈로프로테이나제 및 메탈로프로테이나제의 억제제의 생성을 조절하는 지를 밝히는 것을 포함한다. 일부 경우에, 상기 분석은 CCX-CKR2 유도된 단백질의 생성을 증가시키는 것으로 밝혀진 제한적인 혈청 조건 하에서 성장한 세포(또는 이의 추출물)를 사용하여 수행한다(실시예 참고).
하기의 단백질은 검출된 각종 종류의 단백질, 뿐만 아니라 각각의 종류에 속하는 특정 단백질의 예이다: (1) 성장 인자(예를 들어, GM-CSF); (2) 케모카인(예를 들어, RANTES, MCP-1); (3) 메탈로프로테이나제(예를 들어, MMP3); 및 (4) 메탈로프로테이나제의 억제제(예를 들어, TIMP-1). 이들 각종 종류에 속하는 기타 단백질도 검출할 수 있을 것으로 예측된다.
이들 특정 단백질은 당업자에게 공지된 표준 면역 검출 방법을 사용하여 검출할 수 있다. 고효율 포맷에서 사용하기에 적합한 하나의 방법은, 예를 들어 복수 웰 플레이트에서 수행되는 ELISA이다. TIMP-1을 검출하기 위한 ELISA 키트는 다코시토메이션(제품 번호 제EL513호)로부터 구입가능하다. 상기 제시된 단백질에 특이적으로 결합하는 항체의 공급자의 추가의 예는 하기에 제시되어 있다. 효소인 메탈로프로테이나제와 같은 단백질은 공지된 효소 분석법에 의해 검출할 수도 있다.
기타 구체예에서, CCX-CKR2의 잠재적 조절제에 대하여 세포 부착을 조절하는 능력을 시험한다. 내피 세포 단층에 대한 종양 세포의 부착은 전이 침윤의 모델로서 연구되어 있다(예를 들어, 문헌[Blood and Zetter, Biovhem. Biophys. Acta, 1032, 89-119 (1990) 참고]. 이들 내피 세포의 단층은 림프 혈관계를 모방하며 각종 시토카인 및 성장 인자(즉, TNF알파 및 IL-베타)에 의해 자극될 수 있다. CCX-CKR2를 발현하는 세포가 상기 단층에 부착하는 능력은 정적 부착 분석뿐 아니라 세포가 생체내 혈관계의 힘을 모방하는 유동 조건 하에 있는 분석 모두에서 평가할 수 있다. 또한, 유착을 평가하기 위한 시험은 생체내에서도 수행할 수 있다(예를 들어, 문헌[von Andrian, U.H. 　Microcirculatiorm . 3(3):287-300 (1996)] 참고).
4. 유효성 확인
전술한 스크리닝 방법 중 임의의 방법에 의해 최초로 확인된 물질이 명백한 활성을 보유하는지를 확인하기 위해 추가로 테스트할 수 있다. 바람직하게는 이러한 연구는 적당한 동물 모델을 사용하여 수행한다. 이러한 방법의 기본 포맷은 인간에 대한 모델 역할을 하는 동물에게 최초 스크리닝 중에 동정된 선도 화합물을 투여하는 단계 및 그 후 질병(예를 들어, 암)이 실제로 조절되는지 및/또는 질병 또는 증상이 개선되는지를 판단하는 단계를 포함한다. 유효성 확인 연구에 사용되는 동물 모델은 일반적으로 임의 종류의 포유동물이다. 적합한 동물의 구체적인 예로는 영장류, 생쥐, 쥐 및 제브라피시(zebrafish)가 있으나 이에 국한되는 것은 아니다.
B. CCX-CKR2와 상호작용하는 물질
CCX-CKR2의 조절제(예를 들어, 길항제 또는 효능제)는, 예를 들어 항체(선행 기술에서 공지된 모노클로날 결합 단백질, 인간화 결합 단백질 또는 기타 유형의 결합 단백질을 포함함), 작은 유기 분자, siRNA, CCX-CKR2 폴리펩티드 또는 이의 변이체, 케모카인(SDF-1 및/또는 I-TAC를 포함하나 이에 국한되지는 않음), 케모카인 모의체, 케모카인 폴리펩티드 등을 들 수 있다.
CCX-CKR2의 조절제로서의 시험 물질은 임의의 작은 화합물, 또는 생물학적 부분, 예컨대 폴리펩티드, 당, 핵산 또는 지질일 수 있다. 대안으로, 조절제는 케모카인 또는 기타 리간드의 유전자 변형 형태, 펩티도모의체 형태일 수 있다. 전형적으로, 시험 화합물은 작은 화학적 분자 및 펩티드일 것이다. 본질적으로 임의의 화합물이 본 발명의 분석에서 잠재적인 조절제 또는 리간드로서 사용될 수 있으나, 대부분 수용액 또는 유기(특히 DMSO계) 용액에 용해될 수 있는 화합물을 사용한다. 분석은 분석 단계를 자동화하고 화합물을 임의의 편리한 공급원으로부터, 통상적으로 동시에 가동되는 분석(예를 들어, 로봇을 사용하는 분석에서 마이크로리터 플레이트 상의 마이크로리터 포맷)으로 제공함에 의해 거대 화학 라이브러리를 스크리닝하도록 고안한다. Sigma (St. Louis, MO), Aldrich (St. Louis, MO), Sigma Aldrich (St. Louis, MO), Fluka Chemika-Biochemica Analytika (Buchs, Switzerland) 등을 비롯한 화합물의 다수의 공급자가 존재한다는 것을 이해할 것이다.
일부 실시양태에서, 물질은 1,500 달톤 미만, 일부 경우에서는 1,000, 800, 600, 500, 또는 400 달톤 미만의 분자량을 갖는다. 작은 분자의 경우 큰 분자량의 물질에 비하여 경구 흡수를 비롯한 양호한 약동학적 특성과 친화성인 생리화학적 특성을 가질 가능성이 높으므로 상대적으로 작은 크기의 물질이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 투과성 및 용해도를 기준으로 약물로서 성공적일 가능성이 적은 물질은 Lipinski 등에 의해 5개 초과의 H-결합 공여자(OH 및 NH의 합으로서 표현함)를 갖고; 500 초과의 분쟈량을 갖고; 5 초과의 LogP(또는 4.15 초과의 MLogP)를 갖고/갖거나; 10개 초과의 H-결합 수용체(N 및 S의 합으로서 표현함)를 갖는 것으로 기재되어 있다. 생물학적 운반체에 대한 기질인 화합물 종류는 통상적으로 이 규칙에 예외이다.
하나의 구체예에서, 고효율 스크리닝 방법은 다수의 잠재적인 치료 화합물(잠재적인 조절제 또는 리간드 화합물)을 함유하는 조합 화학 또는 펩티드 라이브러리를 제공하는 것을 포함한다. 상기 "조합 화학 라이브러리" 또는 "리간드 라이브러리"는 그 후 상기 기술한 바와 같이 하나 이상의 분석에서 스크리닝되어 소정의 특징적 활성을 나타내는 라이브러리 구성원(특히 화학적 종류 또는 하부종류)을 선별한다. 이에 따라, 상기 선별된 화합물은 통상의 "선도 화합물"로서 작용할 수 있거나 이들 자체는 잠재적 치료제 도는 실제 치료제로서 사용할 수 있다.
조합 화학 라이브러리는 다수의 화학적 "빌딩 블록"을 결합시킴으로써, 화학적 합성 또는 생물학적 합성에 의해 생성한 다양한 화합물의 집합이다. 예를 들어, 선형 조합 화학 라이브러리, 예컨대 폴리펩티드 라이브러리는 화학적 빌딩 블록(아미노산)의 세트를 주어진 화합물 길이(즉, 폴리펩티드 화합물 중 아미노산의 수)에 대하여 모든 가능한 방식으로 결합시킴에 의해 형성한다. 상기 화학적 빌딩 블록의 조합식 혼합을 통해 수백만개의 화합물을 합성할 수 있다.
조합식 화학 라이브러리의 제조 및 스크리닝 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 상기 조합식 화학 라이브러리는 펩티드 라이브러리(예를 들어, 미국 특허5,010,175, 문헌[Furka, Inert . J. Pept . Prot . Res . 37:487-493 (1991)] 및 [ Houghton et al., Nature 354:84-88 (1991)]참고)를 포함하지만 이에 국한되는 것은 아니다. 화학적으로 다양한 라이브러리를 생성하는 기타 화학 구조도 사용할 수 있다. 상기 화학 구조는 펩토이드(예를 들어, PCT 공보 WO 91/19735호), 암호화된 펩티드(예를 들어, PCT 공보 WO 93/20242호), 무작위 바이오-올리고머(예를 들어, PCT 공보 WO 92/00091호) , 벤조디아제핀(예를 들어, 미국 특허 제 5,288,514호), 다이버소머(diversomer), 예컨대 히단토인, 벤조디아제핀 및 디펩티드(Hobbs et al., Proc . Nat . Acad . Sci . USA 90:6909-6913 (1993)), 비닐로고스(vinylogous) 폴리펩티드 (Hagihara et al ., J. Amer . Chem . Soc . 114:6568 (1992)), 글루코스 스캐폴딩을 갖는 비펩티드 펩티도모의체(Hirschmann et al ., J. Amer . Chem . Soc . 114:9217-9218 (1992)), 작은 화합물 라이브러리의 유사 유기 합성물(Chen et al ., J. Amer. Chem . Soc . 116:2661 (1994)), 올리고카르메이트(Cho et al ., Science 261:1303 (1993)), 및/또는 펩티딜 포스포네이트(Campbell et al ., J. Org . Chem . 59:658 (1994)), 핵산 라이브러리(문헌[Berger and Sambrook, 모두 상동] 참고), 펩티드 핵산 라이브러리(예를 들어, 미국 특허 5,593,083 참고), 항체 라이브러리(예를 들어, 문헌[Vaughn et al., Nature I Biotechnology, 14(3):309-314 (1996)] 및 PCT/US96/10287 참고), 탄수화물 라이브러리(예를 들어, 문헌[Liang et al ., Science, 274:1520-1522 (1996)] 및 미국 특허 5,593,853 참고), 작은 유기 분자 라이브러리(예를 들어, 벤조디아제핀[Baum C&EN, Jan 18, page 33 (1993)]; 이소프레노이드(미국 특허 5,569,588); 티아졸리디논 및 메타티아자논(미국 특허5,549,974); 피롤리딘(미국 특허 5,525,735 및 5,519,134); 모르폴리노 화합물(미국 특허 5,506,337); 벤조디아제핀(미국 특허 5,288,514 등)을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다.
조합 라이브러리의 제조를 위한 장치는 시판된다(예를 들어, 켄터키주, 루이스빌, 어드밴스드 케미칼 테크날러지의 357 MPS 및 390 MPS; 매사추세주 우번, 레이닌의 심포니; 캘리포니아주, 포스터 시티의 433A 어플라이드 바이오시스템; 매사추세주, 베드포드, 밀리포어의 9050 플러스 참고). 또한, 수많은 조합 라이브러리 자체가 시판된다(예를 들어, 뉴저지주, 프린스톤의 콤제넥스; 미주리주, 세인트 루이스의 트리포스 인코포레이티드; 펜실베니아주, 엑스톤의 3D 파마슈티칼스; 메릴랜드, 콜럼비아의 마르테크 바이오사이언스 등 참고).
CCX7923(예를 들어, 도 4)은 시판되고, 이는 선행 기술에서 공지되어 있는 방법에 의해 N-[3-(디메틸아미노)프로필]-N,N-디메틸-1,3-프로판디아민과 브로모메틸-비시클로(2,2,1)-헵트-2-엔을 축합시킴에 의해 제조할 수 있다. CCX0803(예를 들어, 도 4)는 시판되고, 이는 선행 기술에서 공지되어 있는 방법에 의해 3-(2-브로모에틸)-5-페닐메톡시-인돌과 2,4,6-트리페닐피리딘을 축합시킴에 의해 제조할 수 있다. 예를 들어 문헌 [Organic Function Group Preparations, 2nd Ed. Vol. 1, (S.R. Sandler & W. Karo 1983)]; [Handbook of Heterocyclic Chemistry (A. R. Katritzky, 1985)]; [Encyclopedia of Chemical Technology , 4th Ed. (J.I. Kroschwitz, 1996)]을 참고한다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 활성 화합물(즉, CCX-CKR2 조절제)는 하기 화학식 I을 갖는다:
Figure 112006037737692-pct00001
상기 식에서,
m은 1 ～ 5의 정수이고, 벤질 고리를 치환하는 각각의 Y는 수소, 알킬, 할로 치환된 알킬, 알킬렌, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 시클로알킬렌, 할로겐, 헤테로시클릭, 아릴, 아릴렌, 헤테로아릴, 헤테로아릴렌, 히드록시, 알콕시, 및 아릴옥시로 이루어진 군 중에서 독립적으로 선택되고,
n은 0, 1, 2 또는 3이고;
Z는 -CH- 또는 -N-이고;
R1 및 R2는 각각 독립적으로 알킬 또는 수소이거나,
또는 Z는 R1 및 R2와 함께 하나 이상의 질소를 포함하고 하나 이상의 추가의 헤테로원자를 포함하는 5 또는 6원 고리를 형성하고, 이때 상기 5-6원 고리는 알킬, 알케닐, 페닐, 벤질, 술포닐 및 치환된 헤테로원자로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 부분으로 임의로 및 독립적으로 치환되고,
R3, R4, 및 R5는 각각 수소, 알킬, 할로 치환된 알킬, 알킬렌, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 시클로알킬렌, 헤테로시클릭, 아릴, 아릴렌, 헤테로아릴, 헤테로아릴렌, 히드록시, 알콕시, 및 아릴옥시로 이루어진 군 중에서 독립적으로 선택되 며;
R6는 알킬 또는 수소이고;
단, Z가 질소이고, R1 및 R2는 Z와 함께 모르폴리닐 기를 형성하는 경우, n은 3이고, R3, R4, 및 R5 중 적어도 하나는 히드록시, 알콕시, 또는 아릴옥시이고; 또는
단, n이 1인 경우, Z는 탄소이고, R1 및 R2는 -CH2CH2NCH2CH2-가 아니고; 또는
단, R1과 R2가 함께 -CH(CH3)(CH2)4-인 경우, Z는 -CH-이고; 또는
단, R5가 t-부틸인 경우, R3는 수소이고; 또는
R4 및 R5가 5원 고리를 형성하는 경우, 페닐 고리에 결합된 하나 이상의 원자는 탄소이다. 미국 가출원 제 60/434,912호(2002년 12월 20일) 및 미국 가출원 제 60/516,151호(2003년 12월 20일)이 참고된다.
올레핀을 치환된 페닐 고리에 연결시키는 웨이비(wavy) 결합은 고리가 R6에 대하여 시스 또는 트랜스일 수 있다는 것을 의미한다. 바람직한 구체예에서, n은 1, 2, 또는 3이다. 또다른 바람직한 구체예에서, n은 2 또는 3이다. 추가의 바람직한 구체예에서, n은 3이다.
또다른 구체예에서, 바람직한 화합물은 화학식 I을 갖고, 이때 R6는 수소이 다. 추가의 구체예에서, 바람직한 화합물은 화학식 I을 갖고, 이때 R6는 메틸이다.
또다른 구체예에서, 바람직한 화합물은 화학식 I을 갖고, 이때 R3, R4, 및 R5는 독립적으로 수소, 히드록시, 알킬, 알콕시, 아릴옥시, 및 할로 치환된 알킬이다. 더 바람직하게는, R3, R4, 및 R5는 독립적으로 알콕시 또는 수소이다. 또다른 구체예에서, 바람직한 화합물은 화학식 I을 갖고, 이때 R4는 수소이고, R3 및 R5는 트리플루오로알콕시 기, 예컨대 트리플루오로메톡시 및 (-CH2CF3)를 비롯한 알콕시이다. 추가의 구체예에서, R3는 수소이고, R4 및 R5는 알콕시이다. 상기 두 구체예에서, 알콕시 기는 메톡시(-OCH3) 또는 에톡시(-OCH2CH3)일 수 있다.
또다른 구체예에서, 바람직한 화합물은 화학식 I을 갖고, 이때 R4 및 R5는 함께 헤테로시클릭 고리, 아릴 고리 또는 헤테로아릴 고리를 형성한다. 또다른 바람직한 구체예에서, R3는 수소이고, R4 및 R5는 함께 -O(CH2)3O-, -(CH2)4-, 또는 -N(CH)2N-이다.
또다른 구체예에서, 바람직한 화합물은 화학식 I을 갖고, 이때 Z는 질소이고 Z는 R1 및 R2와 함께 헤테로아릴 또는 헤테로시클릭 기를 형성한다. 바람직한 구체예에서, 화합물은 화학식 I을 갖고, 이때 Z는 CH이고 Z와 R1 및 R2는 헤테로아릴 또 는 헤테로시클릭 기를 형성한다. 더 바람직한 화합물은 화학식 I을 갖고, 이때 Z는 CH이고 Z는 R1 및 R2와 함께 질소를 함유하는 헤테로시클릭 기를 형성한다. 추가의 구체예에서, Z는 R1 및 R2와 함께 치환되거나 비치환된 모르폴리닐, 피롤리디닐, 피페리디닐, 또는 피페라지닐 기를 형성한다.
헤테로아릴 또는 헤테로시클릭 기에 대한 바람직한 치환기로서 알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 아릴, 아랄킬, 헤테로아릴, 알콕시, 히드록시, 헤테로원자 및 할라이드를 들 수 있다. 특히 바람직한 구체예에서, 헤테로아릴 또는 헤테로시클릭 기는 벤질, 페닐, 메틸, 에틸, 시클로헥실, 메톡시-메틸(-CH2OCH3), 또는 시클로헥실-메틸(-CH2(C6H11)) 기로 치환된다.
하나의 구체예에서, 바람직한 화합물은 화학식 I을 갖고, 이때 Z는 R1 및 R2와 함께 알킬- 또는 메톡시-메틸-치환된 피롤리디닐 기; 벤질-, 페닐-, 메틸-, 에틸-, 또는 피페리디닐 기로 치환된 치환된 헤테로원자; 또는 벤질-, 페닐-, 또는 술포닐-치환된 피페라지닐 기이다. 특히 바람직한 치환된 헤테로원자 기로서 알킬, 아미닐, 시클로알킬 아미닐, 알킬 아미닐, 시클로프로필 아미닐, 이소프로필 아미닐, 벤질 아미닐, 및 페녹시를 들 수 있다. 바람직하게는, 치환된 헤테로원자는 피페리디닐 고리의 3 위치에 존재한다.
또다른 구체예에서, 바람직한 화합물은 하기 화학식 I을 갖고, 이때 Z는 R1 및 R2와 함께
Figure 112006037737692-pct00002
이다.
화학식 I을 갖는 바람직한 화합물은 또한 Z를 질소 원자로서 가질 수 있고, R1 및 R2를 각각 알킬 기 또는 메틸 기로서 가질 수 있거나, R1 및 R2는 함께 -C(C(O)N(CH3)2)(CH2)3-를 형성한다.
또다른 구체예에서, Z는 R1 및 R2와 함께 질소를 포함하고 임의로 하나 이상의 추가의 헤테로원자를 포함하는 5월 고리를 형성한다. 상기 구체예에서, n은 1인 것이 바람직하고 Z는 -CH-인 것이 바람직하다. 상기 유형의 특히 바람직한 구체예에서, Z는 R1 및 R2 와 함께
Figure 112006037737692-pct00003
이고, 이때 R7는 바람직하게는 수소, 알킬, 아릴 또는 아랄킬이다.
또다른 바람직한 구체예에서, R7는 할로겐화 벤질 또는 페닐 기이다. 추가의 구체예에서, R7는 바람직하게는 수소, 메틸, 에틸, 벤질, 또는 파라-플루오로-페닐이다.
또다른 구체예에서, 본 발명의 활성 화합물은 하기 화학식 II를 갖는다:
Figure 112006037737692-pct00004
상기 식 중,
m은 1 ～ 5의 정수이고,
벤질 고리를 치환하는 각각의 Y는 수소, 알킬, 할로 치환된 알킬, 알킬렌, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 시클로알킬렌, 할로겐, 헤테로시클릭, 아릴, 아릴렌, 헤테로아릴, 헤테로아릴렌, 히드록시 및 알콕시로 이루어진 군 중에서 독립적으로 선택되고,
n은 0, 1, 2 또는 3이고;
R3, R4, 및 R5는 각각 할로겐, 알킬, 할로 치환된 알킬, 알킬렌, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 시클로알킬렌, 헤테로시클릭, 아릴, 아릴렌, 헤테로아릴, 헤테로아릴렌, 히드록시, 알콕시, 및 아릴옥시로부터 독립적으로 선택된다.
상기 화학식 I에서와 같이, 올레핀을 치환된 페닐 고리에 연결시키는 wavy 결합은 상기 고리가 시스 또는 트랜스일 수 있음을 의미한다.
또다른 구체예에서, 바람직한 화합물은 화학식 II(식 중, n은 3임)를 가질 수 있다. 또다른 구체예에서, 바람직한 화합물은 화학식 II(식 중, R3, R4, 및 R5는 상기 화학식 I에서 기재한 바와 같이 치환됨)를 가질 수 있다. 특히 바람직한 화합물은 화학식 II(식 중, R3, R4, 및 R5는 알콕시 또는 메톡시임)를 가질 수 있다.
당업자에게 공지된 다수의 합성 경로를 사용하여 본 발명의 활성 화합물을 합성할 수 있고, 일반적인 합성 방법은 하기 반응식 I에서 제시되어 있다:
Figure 112006037737692-pct00005
반응식 I에서, 알데히드 (2)는 환원 아미드화를 통해 1차 아민 (3)과 축합 반응시킨다. 적합한 1차 아민은, 예를 들어 위스콘신주 밀우키 알드리크로부터 시판되고, 당업자에게 공지되어 있는 합성 경로에 의해 합성할 수 있다.
아미드화 반응은 테트라히드로퓨란(THF), 디클로로메탄, 또는 메탄올을 포함 하지만 이에 국한되지 않는 임의의 적합한 용매 내에서 환원제와 함께 수행하여 중간체를 형성할 수 있다. 축합 반응을 위한 적합한 환원제의 비제한적인 예로서 시아노보로수소화나트륨(문헌[Mattson, et al ., J. Org . Chem . 1990, 55, 2552] 및 [Barney, et al ., Tetrahedron Lett. 1990, 31, 5547]에서 기재된 바와 같음); 트리아세톡시보로수소화나트륨 (문헌[Abdel-Magid, et al ., Tetrahedron Lett . 31:5595 (1990)]에서 기재된 바와 같음); 보로수소화나트륨 (문헌[Gribble; Nutaitis Synthesis . 709 (1987)]에서 기재된 바와 같음); 펜타카르보닐철(I) 및 알콜계 KOH (문헌[Watabane, et al ., Tetrahedron Lett . 1879; (1974)]에서 기재된 바와 같음); 및 BH3-피리딘 (문헌[Pelter, et al ., J. Chem . Soc ., Perkin Trans . 1:717 (1984)]에서 기재된 바와 같음)을 들 수 있다.
중간체(4)를 화합물(5)로의 변환시키는 반응은 염기의 존재하에 적합한 치환된 염화아실과 함께 적합한 용매, 예컨대 테트라히드로퓨란 또는 디클로로메탄 중에서 수행할 수 있다. 3차 아민 염기가 바람직하다. 특히 바람직한 염기로서 트리에틸아민 및 허닝스(Hunnings) 염기를 들 수 있다.
대안으로, 중간체(4)를 화합물(5)로 변환시키는 반응은 또한 촉매, 예컨대 4,4-디메틸아미노-피리딘의 존재 하에 또는 히드록시벤조트리아졸(문헌[K. Horiki, Synth. Commun . 7:251]에서 기재된 바와 같음)의 존재 하에, 적합한 커플링 시약, 예컨대 1-에틸-3-(3-디메틸부틸프로필)카르보이미드 또는 디시클로헥실-카르보디이미드(문헌[B. Neises and W. Steglich, Angew. Chem ., Int . Ed. Ethel. 17:522 (1978)]에서 기재된 바와 같음)로도 수득할 수 있다.
상기 기재된 화합물이 SDF-1 및 I-TAC 케모카인에 대한 유용한 길항제임을 증명하기 위하여, 상기 화합물을 시험관내 선별하여 이들이 여러 농도에서 CCX-CKR2 수용체로부터 SDF-1 및 I-TAC를 치환하는 능력을 측정한다. 상기 화합물을 125I-표지된 SDF-1 및/또는 125II-TAC 케모카인의 존재 하에 CCX-CKR2 수용체를 발현하는 포유동물의 선세포와 배합한다. 그 후, 상기 화합물이 여러 농도에서 CCX-CKR2 수용체 부위로부터 표지된 SDF-1 또는 I-TAC를 치환하는 능력을 선별 공정에 의해 측정한다.
효과적인 SDF-1 및 I-TAC 길항제로 생각되는 화합물은 1.1 마이크로몰(μM)이하의 농도 및 더 바람직하게는 300 나노몰(nM) 이하의 농도에서 CCX-CKR2 수용체로부터 50% 이상의 SDF-1 및/또는 I-TAC 케모카인을 치환할 수 있었다. 일부 경우, 화합물이 200 nM 이하의 농도에서 CCX-CKR2 수용체로부터 50% 이상의 SDF-1 및/또는 I-TAC를 치환할 수 있는 것이 바람직하다. 상기 기준을 만족시키는 대표적 화합물은 하기 표 1에서 제시되어 있다.
[표 1]
Figure 112006037737692-pct00006
Figure 112006037737692-pct00007
Figure 112006037737692-pct00008
Figure 112006037737692-pct00009
Figure 112006037737692-pct00010
Figure 112006037737692-pct00011
C. 고체상 및 가용성 고효율 분석
본 발명의 고효율 분석에서는 하루에 수 천개에 이르는 상이한 조절제 또는 리간드를 스크리닝할 수 있다. 구체적으로, 미량적정 플레이트의 각 웰을 선택된 잠재적 조절제에 대하여 독립적인 분석을 수행하도록 이용할 수 있거나, 또는 농도 또는 항온배양 시간의 효과를 관찰할 의도라면, 5～10개 웰마다 단일 조절제를 테스트할 수 있다. 따라서, 단일 표준 미량적정 플레이트는 약 100개(예, 96개)의 조절제를 분석할 수 있다. 1536 웰 플레이트를 사용한다면 단일 플레이트는 약 100～약 1,500개의 상이한 화합물을 분석할 수 있다. 하루에 여러 개의 상이한 플레이트를 분석하는 것이 가능하며, 본 발명의 일체형 시스템을 이용하면 약 6,000～20,000개에 이르는 상이한 화합물들에 대한 분석 스크리닝을 수행하는 것이 가능하다. 보다 최근에는 시약 조작을 위한 미세유체법이 개발되었다.
본 발명은 CCX-CKR2의 기능 또는 활성을 조절할 수 있는 화합물을 고속 처리 포맷으로 동정하기 위한 시험관내 분석법을 제공한다. 상기 분석법은 매우 일정하므로, 잠재적 조절제를 포함하지 않는 반응에서의 세포의 CCX-CKR2 활성을 측정하는 대조군 반응은 선택적이다. 그러나, 상기 선택적 대조군 반응은 분석의 신뢰성을 높인다.
일부 분석에서, 분석 성분이 적절하게 작동하는 지를 확인하기 위하여 양성 대조군이 존재하는 것이 바람직할 것이다. 적어도 2가지 유형의 양성 대조군이 적절하다. 첫째로, CCX-CKR2의 공지된 활성제 또는 리간드를 하나의 분석 시료과 함께 항온배양할 수 있고, 그 결과 CCX-CKR2의 증가된 활성(예를 들어, 본원의 방법에 따라 측정시)으로부터 시그널이 증폭된다. 둘째로, CCX-CKR2의 억제제 또는 길항제를 첨가할 수 있고, 그 결과 케모카인 수용체의 활성에 대한 시그널의 감소도 유사하게 관측할 수 있다. 또한, 조절제는 케모카인 수용체의 공지된 조절제의 존재 하에 유발되는 증가 또는 감소를 억제하는 조절제를 찾기 위해 활성화제 또는 억제제와 조합될 수 있다.
IV . 대상체에서 CCX - CKR2 의 발현
일부 구체예에서, CCX-CKR2이 대상체에서 발현되어 이에 따라 CCX-CKR2의 발현을 증가시킨다. 대안으로, 예를 들어 siRNA 또는 안티센스 서열을 비롯한 억제성 폴리뉴클레오티드가 시험관내 또는 생체내에서 발현되어 CCX-CKR2의 발현을 억제할 수 있다. 일부 경우, CCX-CKR2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 시험관내 세포로 도입하고, 이어서 이 세포를 환자에게 도입한다. 이들 경우 중 일부에서, 세포를 먼저 환자로부터 단리시킨 후, 폴리뉴클레오티드를 도입한 후 이를 환자에게 재도입한다. 다른 구체예에서, CCX-CKR2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 생체내 환자의 세포로 직접 도입한다.
일부 경우, CCX-CKR2 암호화 폴리펩티드는 (i) 관심을 가지는 조직, (ii) 조직으로 도입된 외인성 세포, 또는 (ii) 조직 내부에 존재하지 않는 주위 세포로부터 세포 내로 도입한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 내피 세포 내로 도입한다. 내피 세포가 결합될 조직은 내피의 이주 또는 팽창을 증진시키기는 것이 바람직한 임의의 조직이다.
본 발명의 가공된 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포유동물 세포 또는 표적 세포로 도입하기 위하여 통상의 바이러스 및 비 바이러스성 유전자 이동 방법을 사용할 수 있다. 상기 방법은 본 발명의 폴리펩티드(예를 들어, CCX-CKR2)를 암호화하는 핵산을 시험관내 세포에 투여하기 위하여 사용할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 생체내 또는 생체외 유전자 치료 용도 를 위해 투여한다. 비 바이러스성 벡터 전달 시스템은 DNA 플라스미드, 네이키드 핵산, 및 리포솜과 같은 전달 매체와 함께 복합된 핵산을 포함한다. 바이러스 벡터 전달 시스템은, 세포로 전달된 이후 에피솜 또는 통합 유전체를 갖는 DNA 및 RNA 바이러스를 포함한다. 유전자 치료 방법의 재고를 위하여, 예를 들어 문헌 [Science 256:808-813 (1992)]; [Nabel & Feigner, TIBTECH 11:211 217 (1993)]; [Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162- 166 (1993)]; [Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992)]; [Van Brunt, Biotechnology 6(10): 1149-1154 (1988)]; [Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995)]; [Haddada et al ., in Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Bohm (eds) (1995)]; 및 [Yu et al ., Gene Therapy 1:13-26 (1994)]을 참고한다.
본 발명의 가공된 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 비 바이러스 전달 방법은 리포펙션(lipofection), 미세주입, 유전자총, 바이로솜, 리포솜, 면역리포솜, 다중양이온 또는 지질:핵산 콘쥬게이트, 네이키드 DNA, 인공 비리온, 및 DNA의 물질-증강 흡수를 포함한다. 리포펙션은 예를 들어 US 5,049,368; US 4,946,787; 및 US 4,897,355에서 기재되어 있고, 리포펙션 시약은 시판된다(예를 들어, 트랜스펙탐(상표명) 및 리포펙틴(상표명)). 폴리뉴클레오티드의 유효한 수용체-인지 리포펙션에 적합한 양이온성 및 중성 지질은 WO 91/17424, WO91/16024의 Felgner의 지질을 포함한다. 세포(생체외 투여) 또는 표적 조직(생체내 투여)에 전달할 수 있다.
표적 리포솜을 포함하는 지질:핵산 복합체, 예컨대 이뮤노리피드(immunolipid)의 제조 방법은 선행 기술에서 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Crystal, Science 270:404-410 (1995)]; [Blaese et al ., Cancer Gene Ther . 2:291-297 (1995)]; [Behr et al ., Biocorjugate Chew . 5:382- 389 (1994)]; [Remy et al ., Bioconjugate Chem . 5:647 654 (1994)]; [Gao et al ., Gene Therapy 2:710-722 (1995)]; [Ahmad et al ., Cancer Res . 52:4817 4820 (1992)]; 미국 특허 제 4,186,183호, 4,217,344호, 4,235,871호, 4,261,975호, 4,485,054호, 4,501,728호, 및 4,946,787호 참고).
본 발명의 가공된 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 전달을 위한 RNA 또는 DNA 바이러스계 시스템의 용도는 바이러스를 신체의 특정 세포로 표적하고 바이러스 하중을 핵으로 수송하는 매우 발전된 방법을 사용한다. 바이러스 벡터는 대상체에게(생체내) 직접 투여하거나 이것을 사용하여 시험관내 세포를 처리하고 개질된 세포를 환자에게(생체외) 투여할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 전달하기 위한 통상의 바이러스계 시스템으로서 유전자 전달을 위한 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노바이러스 의존 바이러스 및 단순 헤르페스 바이러스의 벡터를 들 수 있다. 바이러스 벡터는 표적 세포 및 조직에서 유전자를 전달하는 현재 가장 효과적이고 다용도의 방법이다. 숙주 유전체에서 레트로바이러스, 렌티바이러스, 및 아데노바이러스 의존 바이러스 유전자 전달 방법과의 통합이 가능하여, 종종 삽입된 형질전환 유전자의 장기간의 발현을 가져온다. 또한, 다수의 상이한 세포 유형 및 표적 조직에서 있어서 형질도입의 효과가 높음이 발견되었다.
레트로바이러스의 친화성은 외래의 외피 단백질을 도입하고, 표적 세포의 잠재적 표적 집단을 확장시킴에 의해 변화시킬 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 비분열 세포의 형질을 전환하거나 이를 감염시킬 수 있는 레트로바이러스 벡터이고, 통상적으로 높은 바이러스 역가를 생성한다. 따라서, 레트로바이러스 유전자 전달 시스템의 선별은 표적 조직에 의존한다. 레트로바이러스 벡터는 6～10 kb 이하의 외래 서열에 대하여 팩키징 수용력을 갖는 시스 작용 긴 말단 반복서열로 구성된다. 최소의 시스-작용 LTR이 벡터의 복제 및 팩키징에 충분하고, 상기 벡터는 그 후 치료 유전자를 표적 세포에 통합하는 데 사용되어 영구적으로 형질전환 유전자가 발현되게 한다. 널리 사용되는 레트로바이러스 벡터로서 소 백혈병 바이러스(MuLV), 긴팔 원숭이 백혈병 바이러스(GaLV), 원숭이 면역결핍 파이러스(SIV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 및 이의 조합물을 들 수 있다(예를 들어, 문헌[Buchscher et al ., J. Virol. 66:2731-2739 (1992); Johann et al ., J. Virol . 66: 1635-1640 (1992)] ; [Sommerfelt et al ., Virol . 176:58-59 (1990)]; [Wilson et al ., J. Virol . 63:2374-2378 (1989)]; [Miller et al ., J. Virol.　65.2220-2224 (1991)]; PCT/US94/05700 참고)
본 발명의 폴리펩티드의 일시적인 발현이 바람직한 경우에 있어서, 아데노바이러스계 시스템을 사용하는 것이 통상적이다. 아데노바이러스계 벡터는 다수의 세포 유형에 있어서 매우 높은 형질전환 효과를 가지고 세포 분열을 필요로 하지 않는다. 상기 벡터에 의해, 높은 발현 역가 및 수준이 달성되어 왔다. 상기 벡터는 상대적으로 단순한 시스템에서 다량으로 생성될 수 있다. 아데노바이러스 의존 바 이러스("AAV") 벡터도, 예를 들어 핵산 및 펩티드의 시험관내 생성에 있어서, 및 생체내 및 생체외 유전자 치료 방법을 위하여 표적 핵산으로 세포를 형절전환하기 위하여 사용한다(예를 들어, 문헌[ West et al ., Virology 160:38-47 (1987)]; 미국 특허 제4,797,368호; WO 93/24641; 문헌[Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994)]; [Muzyczka, J. Clin . Invest . 94.1351 (1994)] 참고). 재조합 AAV 벡터의 구축은 다수의 공보, 예컨대 미국 특허 제5,173,414호; 문헌[Tratschin et al ., Mol . Cell . Biol . 5:3251-3260 (1985)]; [Tratschin, et al ., Mol . Cell . Biol . 4:2072-2081 (1984)]; [Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984)]; 및 [Samulski et al ., J. Virol . 63:03822-3828 (1989)]에서 기재되어 있다.
pLASN 및 MFG-S는 임상 시험에서 사용되어 온 레트로바이러스 벡터의 예이다(Dunbar et al ., Blood 85:3048-305 (1995); Kohn et al ., Nat . Med . 1:1017-102 (1995); Malech et al ., PNAS 94:22 12133-12138 (1997)). PA317/pLASN는 유전자 치료의 시도에서 사용된 최초의 치료 벡터였다(Blaese et al ., Science 270:475-480 (1995)). MFG-S 팩키징된 벡터에 대하여 50% 이상의 형질전환 효율이 관측되었다(Ellem et al ., Immunol Imrmunother . 44(1):10-20 (1997); Dranoff et al ., Hum . Gene Ther . 1:111-2(1997)).
재조합 아데노바이러스 의존 바이러스 벡터(rAAV)는 결손 및 비병원성 파르보바이러스 아데노 의존 타입 2 바이러스 기재의 유망한 대안적 유전자 전달 시스템이다. 모든 벡터는 형질전환 유전자 발현 카세트에 인접한, 오로지 AAV 145 염기쌍만 역위된 말단 반복서열을 보유하는 플라스미드 유래이다. 형질전환된 세포의 유전체로의 통합을 통한 효과적 유전자 전달 및 안정한 형질전환 유전자 전달은 상기 벡터 시스템의 핵심 특성이다(Wagner et al ., Lances 351:9117 1702 3 (1998); Kearns et al ., Gene Ther . 9:748-55 (1996)).
복제 결핍 재조합 아데노바이러스 벡터(Ad)는 형질전환 유전자가 Ad E1a, E1b, 및 E2 유전자를 대체하고; 이어서 복제 결핍 벡터가, 결손된 유전자 기능을 트랜스(in trans)로 공급하는 인간 293 세포에서 증식되도록 조작할 수 있다. Ad 벡터는 분열하지 않는 분화된 세포, 예컨대 간, 신장 및 근육계 조직에서 발견되는 세포를 비롯한 여러 유형의 생채내 조직을 형질전환할 수 있다. 통상의 Ad 벡터는 큰 운반 용량을 갖는다. 임상 시험에 있어서 Ad 벡터의 용도의 예로서 항종양 면역화를 위한 근육내 주사에 의한 폴리뉴클레오티드 치료를 들 수 있다(Sterman et al ., Hum . Gene Iher . 7:1083-9 (1998)). 임상 시험에 있어서 유전자 전달을 위한 아데노바이러스 벡터의 용도의 추가의 예는 문헌[Rosenecker et al ., Infection 24: 1 5-10 (1996)]; [Sterman et al ., Hum . Gene Ther . 9:7 1083 1089(1998)]; [Welsh et al ., Hum . Gene Iher . 2:205-18 (1995)]; [Alvarez et al ., Hum . Gene Ther . 5:597-613 (1997)]; [Topf et al ., Gene Iher . 5:507-513 (1998)]; [Sterman et al ., Hum . Gene Her . 7: 1083-1089 (1998)]에서 기재되어 있다.
팩키징 세포는 숙주 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스 입자를 형성하기 위하여 사용한다. 상기 세포로서 아데노바이러스를 팩키징하는 293 세포, 및 레트로바이러스를 팩키징하는 ψ2 세포 또는 PA317 세포를 들 수 있다. 유전자 치료에서 사용되는 바이러스 벡터는 보통 핵산 벡터를 바이러스 입자로 팩키징하는 생산자 세포주에 의해 생성된다. 상기 벡터는 통상적으로 팩키징 및 숙주로의 잇따른 통합에 필요한 최소 바이러스 서열 및 발현될 단백질에 대한 발현 카세트에 의해 대체될 다른 바이러스 서열을 함유한다. 부족한 바이러스의 기능은 팩키징 세포주에 의해 트랜스로 공급된다. 예를 들어, 유전자 치료에서 사용되는 AAV 벡터는 팩키징 및 숙주 유전체로의 통합에 필요한 AAV 유전체 중에서 오로지 ITR 서열만을 가지는 것이 통상적이다. 바이러스 DNA는 세포주에서 팩키징되고, 상기 세포주는 다른 AAP 유전자, 즉 rep 및 cap를 암호화하는 헬퍼 플라스미드를 함유하지만 ITR 서열이 없다. 또한, 상기 세포주는 헬퍼인 아데노바이러스에 의해 감염된다. 상기 헬퍼 바이러스는 AAV 벡터의 복제 및 헬퍼 플라스미드로부터 AAV 유전자의 발현을 촉진한다. 상기 헬퍼 플라스미드는 ITR 서열의 부재로 인하여 유의한 양으로 팩키징되지 않는다. 아데노바이러스에 의한 오염은, 예를 들어 AAV보다 아데노바이러스가 덜 민감한 열처리에 의해 감소시킬 수 있다.
많은 유전자 치료 용도에 있어서, 유전자 치료 벡터가 특정 조직 유형에 대하여 고도로 특이적으로 전달되는 것이 바람직하다. 바이러스 벡터는 바이러스 외피 단백질을 갖는 융합 단백질로서의 리간드를 바이러스의 외부 표면에 발현함에 의해 주어진 세포 유형에 대한 특이성을 갖도록 개질된다. 상기 리간드는 관심을 갖는 세포 유형 상에 존재하는 것으로 공지된 수용체에 대한 친화도를 갖도록 선택한다. 예를 들어, 문헌[Han et al ., PNAS 92:9747-9751 (1995)]에서, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스는 gp70에 융합된 인간 헤레굴린을 발현하도록 개질될 수 있고, 재조합 바이러스는 인간 표피 성장 인자 수용체를 발현하는 특정 인간 유방암 세포를 감염시킨다고 보고되어 있다. 상기 원리는 리간드 융합 단백질을 발현하는 바이러스의 다른 쌍 및 수용체를 발현하는 표적 세포에도 적용될 수 있다. 예를 들어, 필라멘트형 파지는 실질적으로 모든 선택된 세포 수용체에 대하여 특이적 결합 친화도를 갖는 항체 단편(예를 들어, FAB 또는 Fv)을 나타내도록 조작할 수 있다. 상기의 설명은 주로 바이러스 벡터에 적용되는 반면, 동일한 원리는 비바이러스 벡터에도 적용될 수 있다. 상기 벡터는 특정 표적 세포에 의한 획득을 선호하는 것으로 생각되는 특정 획득 서열을 함유하도록 조작할 수 있다.
유전자 치료 벡터는 통상적으로 전신 투여(예를 들어, 정맥내, 복막내, 근육내, 피하, 또는 두개내 주사)에 의해 또는 상기 기술한 바와 같이 국소 투여에 의해 개별 환자에게 투여함에 의해 생체내 전달할 수 있다. 대안으로, 벡터는 생체외 세포, 예컨대 개별 환자로부터 체외이식된 세포(예를 들어, 림프구, 골수 흡인물, 조직 생검) 또는 보편적 공여자 조혈 줄기 세포에 전달한 후, 보통 벡터가 도입된 세포의 선별 이후에 상기 세포를 환자에게 재이식한다.
진단, 조사, 또는 유전자 치료를 위한 생체외 세포 형질감염(예를 들어, 형질감염된 세포의 숙주 유기체로의 재관주를 통해)는 당업자에게 잘 공지되어 있다. 바람직한 구체예에서, 세포는 대상 유기체로부터 단리되고, 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산(유전자 또는 cDNA)으로 형질감염되며, 대상 유기체(예를 들어, 환자)에게 다시 재관주된다. 생체외 형질감염에 적합한 각종 세포 유형은 당업자에게 잘 공지되어 있고(예를 들어 문헌[Freshney et al ., Culture of Animal Cells , A Manual of Basic Technique (3rd ed. 1994)] 참고), 상기 인용한 문헌에는 환자 로부터 세포를 단리하고 배양하는 방법이 기재되어 있다.
하나의 구체예에서, 줄기 세포는 세포 형질감염 및 유전자 치료를 위한 생체외 방법에서 사용한다. 줄기 세포를 사용하는 이점은 이들이 다른 시험관내 세포 유형으로 분화될 수 있거나, 또는 포유동물(예컨대 세포의 공여자)로 도입되어 골수 내에서 생착될 수 있다는 점이다. 시토카인, 예컨대 GM-CSF, IFN-γ 및 TNF-α를 사용하여 시험관내 CD34+ 세포를 임상적으로 중요한 면역 세포 유형으로 분화시키는 방법은 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Inaba et al ., J. Exp . Med . 176:1693-1702 (1992)] 참고).
줄기 세포는 형질전환 및 분화를 위하여 공지된 방법을 사용하여 단리한다. 예를 들어, 줄기 세포는 골수 세포를 원치않는 세포, 예컨대 CD4+ 및 CD8+(T 세포), CD45+(panB 세포), GR-1(과립구) 및 Iad(분화된 항체 제공 세포)와 결합하는 항체와 함께 패닝함에 의해 골수 세포로부터 단리한다(문헌[Inaba et al ., J. Exp . Med . 176:1693-1702 (1992)] 참고).
벡터(예를 들어, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 리포솜 등) 함유 치료 핵산도 생체내 세포의 형질전환을 위하여 유기체로 직접 투여한다. 대안으로, 네이키드 DNA를 투여한다. 투여는 분자를 혈액 또는 조직 세포와 최종적으로 접촉시키기 위해 통상적으로 사용하는 임의의 경로에 의해 수행한다. 상기 핵산의 투여에 적합한 방법은 당업자에게 이용가능하고 잘 공지되어 있으며, 비록 하나 이상의 경로를 사용하여 특정 조성물을 투여할 수 있으나, 특정 경로가 종종 또다른 경로에 비하여 더 신속하고 더 효과적이다.
약학적 허용 담체는 부분적으로는 투여할 특정 조성물에 의하여 결정할 수 있을 뿐만 아니라 이 조성물의 투여를 위한 특정 방법에 의해 결정할 수 있다. 따라서, 하기 기술한 바와 같이, 본 발명의 약학 조성물에 적합한 광범위한 물질이 존재한다(예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1989)] 참고).
V. 진단 및 예후 판단
본 발명은 암의 진단 또는 예후 판단 방법을 비롯한 암세포의 검출 방법을 제공한다. 본원에서 기재되어 있는 바와 같이, CCX-CKR2는 현재까지 시험된 거의 모든 암세포에서 발현되는 반면, CCX-CKR2의 정상(비-암) 발현은 신장 및 일부 뇌 세포와 태아간의 특정 발달 단계에만 국한되는 것으로 보인다. 따라서, 세포, 특히 비-태아 세포 및/또는 신장 세포 또는 뇌 세포가 아닌 세포 중 CCX-CKR2의 발현은 암세포의 존재 가능성을 지시하는 것이다. 일부 경우, CCX-CKR2 발현 세포를 함유하는 시료에 대하여 선행 기술에서 공지된 기타 방법을 사용하여 암세포의 존재를 확인한다.
본 발명의 또다른 구체예에 따르면, 암에 걸리거나 걸린 것으로 생각되는 환자의 치료 과정의 선별 방법이 제공된다. 상기 방법은 환자로부터 생물학적 시료를 수득하고, 상기 시료를 CCX-CKR2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키고, 항체 결합의 유무를 검출하며, 환자의 암에 적절한 치료 과정을 선별하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 치료는 CCX-CKR2 길항제를 환자에게 투여하는 것이다.
단백질과 결합하는 물질을 사용하는 검출 방법은 잘 공지되어 있고, 예를 들어, 각종 면역분석법, 유세포 측정법 등을 포함한다. 유세포 측정법을 사용하여, 혼합된 세포군 내에서 관심을 가지는 특정 항원을 발현하는 세포를 동정할 수 있다. 간단하게 설명하면, 세포가 관심을 가지는 단백질(예를 들어, CCX-CKR2)에 특이적인 항체와 반응하도록 한다. 항체는 형광 표지하거나(직접 염색법), 또는 표지하지 않는 경우, 제1 항체와 반응하는 제2 항체를 형광 표지한다(간접 염색법). 그 후, 세포는 형광 신호를 검출할 수 있는 도구를 통해 통과시킨다. 세포를 흡입하고 단일 세포 현탁액으로 만든다. 상기 세포 현탁액은, 이제 세포에 결합하는 플루오로크롬 표지된 항체를 여기시키는 레이저를 통해 통과시켜 데이타를 얻는다. 밝게 관측되는 세포(즉, 형광 표지된 항체와 반응하는 세포)는 관심을 가지는 단백질을 발현하고; 어둡게 관측되는 세포(즉, 형광 표지된 항체와 반응하지 않는 세포)는 관심을 가지는 단백질을 발현하지 않는다.
본 발명은 암종, 신경아교종, 중피종, 흑색종, 림프종, 백혈병, 샘암종, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 아교모세포종, 백혈병, 전립선암, 및 버킷 림프종, 두경부암, 결장암, 결장직장암, 비소세포암, 소세포암, 식도암, 위암, 췌장암, 간담계암, 쓸개암, 소장암, 직장암, 신장암, 방광암, 전립선암, 음경암, 요도암, 고환암, 자궁경부암, 질암, 자궁암, 난소암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 이자 내분비암, 카르시노이드암, 뼈암, 피부암, 망막세포종, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종(기타 암에 대하여 문헌[CANCER:PRINCTPEES AND PRACTICE (DeVita, V.T. et al . eds 1997] 참고); 뿐만 아미라 뇌 및 신경세포 기능장애, 예컨대 알츠하이머병 및 다발경화증; 신장 기능장애; 류마티스 관절염; 심장 동종이식 거부반응; 죽상경맥동화증; 천식; 사구체신염; 접촉 피부염; 염증성 창자병; 대장염; 건선; 재관류 손상; 뿐만 아니라 기타 장애 및 본원에서 기재된 질병을 포함하지만 이에 국한되는 것은 아닌 인간 질병의 진단 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 환자는 카포시 육종, 다발성 캐슬만씨병 또는 AIDS 관련 일차성 삼출 림프종을 갖지 않는다. 실시예를 비롯하여 본원에서 기재되어 있는 바와 같이, 정상 세포 및 조직과 질병 세포 및 조직은 항-CCX-CKR2 모노클로날 항체 또는 SDF-1 및 I-TAC에 대한 반응성에 기초하여 구별할 수 있다. 예를 들어, 암세포는 세포 상에서 SDF-1α 및 I-TAC가 그와 결합을 위해 경쟁하는 케모카인 수용체를 검출함에 의해 검출할 수 있다.
또한, 케모카인 수용체 간의 리간드 결합 차이를 검출할 수 있고, 상기 차이에 의해 CCX-CKR2를 발현하는 세포를 검출할 수 있다. 예를 들어, 어떠한 케모카인 수용체도 SDF-1 및 I-TAC 모두를 리간드로서 갖지 않는다. 케모카인 결합은 조직 시료(예를 들어, 생검)을 사용하여 검출하거나, 현장의 조직에서 직접 모니터링할 수 있다(예를 들어, 방사선 표지된 케모카인 이미지화를 사용하여).
또한, 면역분석법은 CCX-CKR2를 정성적으로 또는 정량적으로 분석하기 위하여 사용할 수 있다. 적용가능한 기술에 대한 일반적인 개관은 문헌[Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (1988)]에서 기재되어 있다. 대안으로, CCX-CKR2에 대한 친화도를 갖는 비항체 분자를 사용하여 수용체를 검출할 수 있다.
관심을 가지는 단백질과 특이적으로 반응하는 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체의 제조 방법은 당업자에게 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Coligan, Current Protocols in Immunology (1991)]; [Harlow & Lane, Antibodies , A Laboratory Manual (1988)]; [Goding, Monoclonal Antibodies : Principles and Practice (2d ed. 1986)]; 및 [Kohler and Milstein Nature , 256:495-497 (1975)] 참고). 상기 기술은 파지 또는 유사 벡터인 재조합 항체의 라이브러리로부터 항체를 선별함에 의해 항체를 제조하는 것을 포함한다. 예를 들어, 면역분석에서 사용하기 위한 항혈청을 제조하기 위하여, 관심을 가지는 단백질 또는 이의 항원 단편을 본원에서 기재한 바와 같이 단리한다. 예를 들어, 재조합 단백질을 형질전환된 세포주 내에서 제조한다. 쥐, 생쥐, 기니픽 또는 토끼의 교배 균주를 표준 애주번트, 예컨대 프로인트 애주번트, 및 표준 면역화 프로토콜을 사용하여 단백질로 면역화한다. 대안으로, 본원에서 개시된 서열로부터 유도되고 운반 단백질에 컨쥬게이션된 합성 펩티드를 면역원으로서 사용할 수 있다. 추가의 대안은 CCX-CKR2 또는 이의 단편을 포함하는 단백질 또는 막 단편 또는 리포솜을 발현하는 세포를 항원으로서 사용하는 것이다. 그 후, 세포, 막 단편 또는 리포솜에 대하여 발생한 항체가 단백질과 결합하는 능력에 따라 선별한다.
폴리클로날 혈청을 수집하고, 면역분석법, 예를 들어 고체 지지체 상에 고정된 면역원을 갖는 고체상 면역분석법에서 면역원에 대하여 적정한다. 104 이상의 역가를 갖는 폴리클로날 항혈청을 선별하고, 경쟁적 결합 면역분석법을 사용하여 이들의 상이한, 및 때때로, 유사한 단백질에 대한 교차반응성을 시험한다. 특정 모노클로날 및 폴리클로날 항체 및 항혈청은 보통 약 0.1 mM 이상, 더 통상적으로는 약 1 μM 이상, 바람직하게는 약 0.1 μM 이상, 및 가장 바람직하게는 0.01 μM 이상의 KD로 CCX-CKR2에 결합할 것이다.
항체, 예를 들어, 재조합 항체, 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체의 제조를 위하여, 선행 기술에서 공지된 다수의 기술을 사용할 수 있다.(예를 들어 문헌[Kohler & Milstein, Nature 256:495- 497 (1975)]; [Kozbor et al ., Immunology Today 4: 72 (1983)]; [Cole et al ., pp. 77-96 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985)]; [Coligan, Cuf rent Protocols in Immcuology (1991)]; [Harlow & Lane, Antibodies , A; Laboratory Manual (1988)]; 및 [Goding, Monoclonal Antibodies : Principles and Practice (2d ed. 1986)] 참고). 관심을 가지는 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자는 세포로부터 복제할 수 있고, 예를 들어, 모노클로날 항체를 코딩하는 유전자는 하이브리도마로부터 복제하여 재조합 모노클로날 항체를 생성하기 위하여 사용할 수 있다. 또한, 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자 라이브러리는 하이브리도마 또는 플라스마 세포로부터 제조할 수 있다. 경쇄 및 중쇄 유전자의 무작위 조합물은 상이한 항원 특이성을 갖는 항체의 거대 풀을 생성한다(예를 들어, 문헌[Kuby, Immunology (3rd ed. 1997)] 참고). 단일쇄 항체 또는 재조합 항체의 제조 기술(미국 특허 제4,946,778호, 미국 특허 제4,816,567호)을 변형하여 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체를 제조할 수 있다. 또한, 트랜스제닉 마우스, 또는 기타 유기체, 예컨대 기타 포유동물을 사용하여 인간화 또는 인간 항체를 발현할 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,545,807호; 5,545,806호; 5,569,825호; 5,625,126호; 5,633,425호; 5,661,016호, 문헌[Marks et al., Bio / Technology 10:779-783 (1992)];[Lonberg et al ., Nature 368:856-859 (1994)]; [Morrison, Nature 368:812-13 (1994)]; [Fishwild et al ., Nature Biotechnology 14:845-51 (1996)]; [Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996)]; 및 [Lonberg & Huszar, Intern . Rev .　 Immunol . 13:65-93 (1995)] 참고). 대안으로, 파지 발현 기술을 사용하여 선별된 항원에 특이적으로 결합하는 항체 및 헤테로메릭 Fab 단편을 동정한다(예를 들어, 문헌[McCafferty et al ., Nature 348:552-554 (1990)]; [Marks et al ., Biotechnology 10:779-783 (1992)] 참고). 항체는 또한 이특이적으로 제조할 수 있고, 즉 2개의 상이한 항원을 인지할 수 있다(예를 들어, WO 93/08829, 문헌[Traunecker et al ., EMBO J. 10:3655-3659 (1991)]; 및 [Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986)] 참고). 항체는 헤테로콘쥬게이트, 예를 들어 2개의 공유 결합된 항체, 또는 면역독소일 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제4,676,980; WO 91/00360; WO 92/200373; 및 EP 03089 참고).
비인간 항체의 인간화 또는 영장류화 방법은 선행 기술에서 잘 공지되어 있다. 상기 항체는 검출 용도 및 치료 용도 모두에 유용하다. 일반적으로, 인간화 항체는 비인간 유래의 공급원으로부터 그에 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-인간 아미노 잔기는 종종 유입 가변 도메인으로부터 통상적으로 취하는 유입(import) 잔기로 칭한다. 인간화는 필수적으로 Winter 및 동료의 방법(예를 들어, 문헌[Jones et al ., Nature 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al ., Nature 332:323-327 (1988)]; [Verhoeyen et al ., Science 239: 1534-1536 (1988)] 및 [Presta, Curr . Op . Struct. Biol . 2:593-596 (1992)] 참고)에 따라 인간 항체의 상응하는 서열을 쥐류 CDR 또는 CDR 서열로 대체함에 의해 수행할 수 있다. 따라서, 상기 인간화 항체는 키메라 항체이고(미국 특허 제4,816,567호), 이때 완전한 인간 가변부보다 실질적으로 적은 부위가 비인간 종류의 상응하는 서열에 의해 대체된다. 실제로, 인간화 항체는 통상적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 쥐류의 항체의 유사 부위 유래의 잔기로 치환된 인간 항체이다.
IV . 치료, 투여 방법 및 약학 조성물
CCX-CKR2 조절제(예를 들어, 길항제 또는 효능제)는 생체내 케모카인 수용체 시그널링의 조절을 위해 포유동물 대상체에 직접 투여할 수 있다. 일부 구체예에서, 조절제는 CCX-CKR2와 결합하기 위하여 SDF-1 및/또는 I-TAC,와 경쟁한다. CCX-CKR2의 조절은, 예를 들어 항체(모노클로날 항체, 인간화 항체 또는 선행 기술에서 공지된 기타 유형의 결합 단백질을 포함), 작은 유기 분자, siRNA 등의 조절을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, CCX-CKR2 조절제는 암에 걸린 환자에게 투여한다. 일부 경우, CCX-CKR2 조절제는 암, 예를 들어, 암종, 신경아교종, 중피종, 흑색종, 림프종, 백혈병, 샘암종, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 아교모세포종, 백혈병, 전립선암, 및 버킷 림프종, 두경부암, 결장암, 결장직장암, 비소세포암, 소세포암, 식도암, 위암, 췌장암, 간담계암, 쓸개암, 소장암, 직장암, 신장암, 방광암, 전립선암, 음경암, 요도암, 고환암, 자궁경부암, 질암, 자궁암, 난소암, 갑상선암, 부갑상선 암, 부신암, 이자 내분비암, 카르시노이드암, 뼈암, 피부암, 망막세포종, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종(기타 암에 대하여 문헌[CANCER:PRINCTPEES AND PRACTICE (DeVita, V.T. et al . eds 1997] 참고); 뿐만 아미라 뇌 및 신경세포 기능장애, 예컨대 알츠하이머병 및 다발경화증; 신장 기능장애; 류마티스 관절염; 심장 동종이식 거부반응; 죽상경맥동화증; 천식; 사구체신염; 접촉 피부염; 염증성 창자병; 대장염; 건선; 재관류 손상; 뿐만 아니라 기타 장애 및 본원에서 기재된 질병을 치료하기 위하여 투여한다. 일부 경우에서, 상기 환자는 카포시 육종, 다발성 캐슬만씨병 또는 AIDS 관련 일차성 삼출 림프종을 갖지 않는다. CCX-CKR2는 종종 비암세포가 아닌 암세포에서 발현되므로, CCX-CKR2의 길항제를 암에 걸린 환자에게 투여하는 것이 바람직하다. 일부 경우에서, 조절제는 1,500 달톤 미만의 분자량을 갖고, 일부 경우에서는 1,000, 800, 600, 500, 또는 400 달톤 미만의 분자량을 갖는다.
조절제의 투여는 조절제 화합물을 투여할 조직에 최종적으로 도입시키기 위해 통상적으로 사용되는 임의의 경로에 의해 수행할 수 있고, 이는 당업자에게 잘 공지되어 있다. 하나 이상의 경로를 사용하여 특정 조성물을 투여할 수 있지만, 특정 경로는 종종 또다른 경로보다 더 신속하고 효과적인 반응을 제공할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적 허용 담체를 포함할 수 있다. 약학적 허용 담체는 부분적으로는 투여할 특정 조성물에 의하여 결정할 수 있을 뿐만 아니라 이 조성물의 투여를 위한 특정 방법에 의해 결정할 수 있다. 따라서, 본 발명의 약학 조성물에 적합한 광범위한 물질이 존재한다(예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1989)] 참고).
CCX-CKR2의 발현 또는 활성의 조절제(예를 들어, 효능제 또는 길항제)는 단독으로나 또는 기타 적합한 성분과 함께 에어로졸 물질(즉, 이들은 "분무"가능함)로 제조하여 흡입을 통해 투여할 수 있다. 에어로졸 물질은 허용가능한 가압 분사제, 예컨대 디클로로디플루오로메탄, 프로판, 질소 등 내에 넣을 수 있다.
투여에 적합한 물질로서 수용액 또는 비수용액; 항산화제, 완충제, 정균제, 및 물질에 등장성을 부여하는 용질을 함유할 수 있는 등장성 무균 용액; 및 현탁제, 안정화제, 농후제, 안정화제, 및 보존제를 포함할 수 있는 무균의 수성 및 비수성 무균 현탁액을 들 수 있다. 본 발명의 실시에 있어서, 조성물은, 예를 들어, 경구, 코, 국소, 정맥내, 복막내, 또는 경막내 투여할 수 있다. 화합물 물질은 단위 투여 또는 다중 투여용 봉인 용기, 예컨대 앰플 및 바이알로 제공할 수 있다. 용액 및 현탁액은 무균의 분말, 과립, 및 앞서 기술한 종류의 정제로부터 제조할 수 있다. 조절제는 제조된 음식 또는 약물의 일부로서 투여할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 CCX-CKR2 조절제는 기타 적절한 치료제, 예컨대 화학요법제, 방사선 등과 함께 투여할 수 있다. 조합 치료에서 사용하기에 적절한 물질의 선별은 통상의 약학적 원리에 따라 당업자가 선택할 수 있다. 치료제의 조합은 각종 장애, 예컨대 암, 신장 기능장애, 뇌 기능장애 또는 신경세포 기능장애의 치료 또는 예방에 상승 효과를 나타낼 것이다. 상기 방법을 사용하여, 각 물질의 작은 투여량으로 치료 효과를 달성함으로써 부작용의 가능성을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 문맥에서, 환자에게 투여하는 투여량은 일정 시간에 걸쳐 환자에 게 유익한 반응을 가져오기에(예를 들어, 종양 크기 또는 종양 하중을 감소시키기에) 충분한 양이어야 한다. 임의의 환자에 대한 최적의 투여 수준은 각종 인자, 예컨대 사용하는 특정 조절제의 효능, 나이, 체중, 물리 활성, 및 환자의 식이, 기타 약물과의 가능한 조합, 및 특정 질병의 심각성에 따라 다를 것이다. 또한, 투여 수준은 특정 환자 중 특정 화합물 또는 벡터의 투여에 수반되는 부작용의 유무, 특성, 및 정도에 의해 결정될 것이다.
투여할 조절제의 유효량을 결정하는 데 있어서, 내과 의사는 조절제의 순환되는 혈장 수준, 조절제의 독성, 및 항-조절제 항체의 생성을 평가할 것이다. 일반적으로, 조절제의 투여 등가량은 통상의 환자에 대하여 약 1 ng/kg ～ 10 mg/kg이다.
투여를 위하여, 본 발명의 케모카인 수용체 조절제는 환자의 질량 및 전체 건강에 대하여 사용시에 조절제의 LD-50, 및 각종 농도에서의 조절제의 부작용에 따라 결정한 속도로 투여할 수 있다. 투여는 단일 투여 또는 분할 투여를 통해 수행할 수 있다.
VII . 조성물, 키트 , 일체형 시스템 및 단백질유전체학의 응용
본 발명은 CCX-CKR2 또는 CCX-CKR2를 특이적으로 검출하는 기타 물질을 사용하여 본 명세서에 개시된 분석을 실시하기 위한 조성물, 키트 및 일체형 시스템을 제공한다.
본 발명은 고체상 분석에 사용하기 위한 분석용 조성물을 제공한다; 그러한 조성물은, 예컨대 고체 지지체에 고정된 세포, 막 분획 또는 리포좀의 일부로서의 CCX-CKR2 폴리펩티드[예, Babcok et al ., J. Biol . Chem . 276 (42):38433-40 (2001); Mirzabekov et al ., Nat . Biotechnol . 18(6): 649-54(2000) 참조]), 및 표지화 시약을 포함할 수 있다. 각 경우에, 분석 조성물은 또한 하이브리드화에 바람직한 추가의 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 고체 지지체는 페트리 평판, 다중 웰 평판 또는 마이크로어레이일 수 있다. 또한, 펩티드 라이브러리의 마이크로어레이를 사용하여 CCX-CKR2에 특이적으로 결합하는 펩티드 서열을 확인할 수 있다.
또한, CCX-CKR2에 특이적으로 결합하는 물질을 분석 조성물에 포함시킬 수 있다. 예를 들어, CCX-CKR2에 특이적으로 결합하는 항체를 고체 지지체에 고정할 수 있다. 이들 구체예 중 일부에서, CCX-CKR2 또는 CCX-CKR2를 발현하는 세포의 존재 또는 부재를 검출하는 데 그 물질을 사용한다. 예를 들어, 고체 지지체는 페트리 평판, 다중 웰 평판 또는 마이크로어레이일 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 분석을 실시하기 위한 키트를 제공한다. 키트는 통상적으로 CCX-CKR2에 특이적으로 결합하는 물질(예, 항체 또는 다른 작은 분자)와 물질의 존재를 검출하기 위한 표지를 포함한다. 키트는 하나 이상의 케모카인 수용체 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 키트는 상기 언급한 조성물 중 임의의 것을 포함할 수 있으며, 경우에 따라서 케모카인 수용체의 활성 또는 기능에 미치는 효과에 대해 고효율 분석법을 실시하기 위한 지시사항, 하나 이상의 용기 또는 구획(예, 프로브, 표지 등을 유지하기 위한 것), 케모카인 수용체의 기능 또는 활성의 제어 조절제, 키트 성분들을 혼합하기 위한 로봇 전기자 등과 같은 추가의 성분을 더 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 키트는 SDF-1 및/또는 I-TAC를 포함한다. 일부 구체예에서, 키트는 표지 또는 태그된 SDF-1과 표지되지 않은(cold) 경쟁자 I-TAC를 포함하거나, 또는 대안적으로 표지 또는 태그된 I-TAC와 표지되지 않은 경쟁자 SDF-1을 포함한다. 표지 또는 태그된 케모카인은 당업계에 공지된 임의의 방법으로 표지 또는 태그될 수 있다. 일부 구체예에서, 표지된 케모카인을 비오틴 또는 형광 표지로 태그하거나 또는 방사성표지한다. 대안적으로 또는 병행하여, 키트는 I-TAC를 검출하기 위한 항-I-TAC 결합제(예, 항체)를 포함할 수 있다. 또한, 키트는, 온전한 세포 또는 세포 막에서 경쟁 결합 분석을 실시하기 위한 적절한 염 완충제와 기타 시약을 포함할 수 있다. 그러한 시약은, 예컨대 하기 실시예에 개시되어 있다. 일부 측면에서, 키트는 또한 CCX-CKR2에 대한 리간드 결합을 측정하는 리셉터클 또는 고체 지지체(예, 신틸레이션 계수기 또는 자동화된 평판 판독기에 적합한 반응을 위한 평판 형태)를 포함한다. 일부 측면에서, 키트는, 예컨대 본 발명의 방법에서 키트를 사용하기 위한 지시사항을 포함한다.
또한 본 발명은 잠재적 CCX-CKR2 조절제의 활성 또는 기능에 미치는 효과에 대해 잠재적 조절제를 고처리량으로 스크리닝하기 위한 일체형 시스템을 제공한다. 이 시스템은 통상적으로 공급원으로부터 목적지로 유체를 이송하는 로봇 전자자, 로봇 전자자를 제어하는 컨트롤러, 표지 검출기, 표지 검출을 기록하는 데이타 저장 유닛과, 고정된 핵산 또는 고정화된 부분을 포함하는 기재 또는 반응 혼합물이 있는 웰을 포함하는 미량역가 접시와 같은 분석 성분을 포함한다.
카메라 또는 다른 기록 장치(예, 광다이오드 및 데이타 저장 장치)에 의해 보이는(그리고 경우에 따라 기록되는) 광학 이미지를, 예컨대 이미지를 디지탈화하고 컴퓨터 상에 그 이미지를 저장 및 분석하여, 본 명세서에 개시된 임의의 구체예에서 임의로 추가 처리한다. 디지탈화된 비디오 또는 디지탈화된 광학 이미지를 디지탈화, 저장 및 분석하기 위한 각종 시판 주변 기기와 소프토웨어를 입수할 수 있다.
실시예 1
본 실시예는 SDF-1 및 I-TAC가 새로운 케모카인 수용체에 결합하기 위하여 경쟁한다는 것을 보여준다.
재료 및 방법
시약 및 세포
인간, 바이러스 및 쥐 재조합 케모카인을 지정된 알 앤드 디 시스템즈(미네소타주 미네아폴리스) 및 페프로테크(뉴저지주 록키 힐)로부터 입수하였다. 125I-표지된 SDF-1a를 퍼킨 엘머 라이프 사이언시즈 인코포레이티드(매사츄세츠주 보스톤)로부터 구입하고, 125I-표지된 I-TAC는 아머샴 파마시아 바이오테크(영국 버킹엄셔)로부터 입수하였다. 유세포 분석과 리간드 결합 경쟁에 사용된 모노클로날 항체는 알 앤드 디 시스템즈(미네소타주 미네아폴리스)로부터 얻었다: 항-CXCR4 클론 12G5, 44708.111 (171), 44716.111 (172), 44717.111 (173), nmIgG2a, 및 nmIgG2b. 2차 항체인 염소 항-마우스 IgG PE 접합체(플로리다주 마이애미 소재의 쿨터 이뮤노테크)를 사용하여 유세포분석에 의해 항체 결합을 검출하였다. 하기 세포를 미국 모식균 배양 수집소(버지니아주 마나싸스)로부터 얻었다: MCF-7 (선암; 유선), MDA MB-231 (선암; 유선), MDA MB-435s (유관암; 유선), DU 4475 (유선), ZR 75-1 (유관암; 유선) 및 HEK 293 (인간 배 신장), HUV-EC0-C(인간 배꼽 정맥; 맥관 내피; 정상). CEM-NKr (급성 림프모구 백혈병: 말초혈; T 림프모구) 세포는 NIH AIDS Research and Reference Reagent 프로그램으로부터 얻었다. 5% CO2/공기 혼합물의 가습 항온기 중에서 37℃하에 10% 태아 소 혈청(FBS)(유타주 로간의 하이클론)으로 보충된 DMEM(버지니아주 헌돈 소재의 미디아테크)에서 세포주를 배양하였다. 인간 말초혈 단핵구(PBMC)는, 건강한 공여자(캘리포니아주 팔로 알토의 스탠포드 혈액 센터)의 백혈구 연층으로부터 Ficoll-Hypaque 밀도 구배로 원심분리하여 얻었다. 분리된 PBMC를, 5% CO2/공기 혼합물의 가습 항온기 중에서 37℃하에 10% FBS로 보충된 RPMI-1640(버지니아주 헌돈 소재의 미디아테크)에서 2.5 ㎍/㎖ 식물적혈구응집소(PHA) (미주리주 세인트루이스 소재의 시그마 케미칼 캄파니) 및 lO ng/㎖ 재조합 인간IL-2 (미네소타주 미네아폴리스 소재의 알 앤드 디 시스템즈)로 3일간 활성화시켰다. 활성화 후에, 세포를 세척하고, 10% FBS 및 10 ng/㎖ IL-2를 보충한 RPMI에서 배양하고, 세포가 사용되는 날까지 매 3～4일마다 공급하였다.
결합 분석
"DisplaceMax(상표명)"을 사용하여 케모카인 리간드와 SDF-1 리셉토 론(receptoron) MCF-7 및 CEM-NKr 세포의 상호작용의 전체 프로파일을 조사하였다. 이 방법에서는 전술한 바와 같은 여과 프로토콜을 사용하여 확장되고, 효능이 최대화된 방사리간드 결합을 이용한다(Dairaghi, et al . J Biol Chem 274:21569-74 (1999); Gosling, J. et al . J Immunol 164:2851-6 (2000)). 이들 분석에서, DisplaceMax(상표명)는 전술한 프토로콜을 사용하여 제시된 바와 같은 125I 방사성표지된 SDF-1α또는 I-TAC를 대체하는 능력에 대하여 110 이상의 별개의 정제된 케모카인에 의한 MCF-7 또는 CEN-NKr 세포의 동시 질문을 사용하였다(Dairaghi, et al . J Biol Chem 274:21569-74 (1999); Gosling, J. et al . J Immnunol 164:2851-6 (2000)). 간단히 요약하면, 케모카인 성분을 세포와 함께 항온배양한 후 결합 배지(25 mM HEPES, 140 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 5 mM MgCl2 및 0.2% 소 혈청 알부민, pH 7.1로 조정됨)에서 3 시간 동안 4℃에서 방사성표지된 케모카인(125I SDF-1a 또는 125I h I-TAC)을 첨가하였다. 지시된 경우 작은 분자를 일부 분석에 포함시켰다. 이들 분석에서는 화합물을 평판에 지정 농도로 첨가한 다음 방사성표지된 케모카인을 첨가하였다. 그 다음 모든 분석물을 살짝 교반하면서 3 시간 동안 4℃에서 항온처리하였다. 모든 결합 분석에서 항온처리한 후에, 세포 수거기(팩커드)를 사용하여 반응물을 PEI-처리된 GF/B 유리 필터(팩커드)로 흡인하고, 2회 세척하였다(25 mM HEPES, 500 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 5 mM MgCl2, pH 7.1로 조정됨). 섬광체(MicroScint 10, 팩커드)를 웰에 첨가하고, 팩커드 탑카운트 신틸레이션 계수기 에서 필터를 계수하였다. 프리즘(매킨토시용 GraphPad Prism version 3.Oa, GraphPad 소프트웨어)을 사용하여 데이타를 분석 및 플롯하였다.
125 I SDF -1α수용체 결합 측정
전술한 여과계 분석을 이용하여, 4℃에서 30분간 지시한 대로 세포를 1) 완충액 단독, 2) 과량의 SDF-lβ (최종 90 nM) 또는 3) MIG (최종 175 nM)과 함께 사전 항온처리하였다. 항온처리 후에, 진술된 농도로 표지되지 않은 지정 케모카인 경쟁자와 125I h I-TAC를 결합 반응에 첨가하였다. 모든 분석물을 전술한 바와 같이 항온처리, 수거 및 분석하였다.
RT PCR
표준 방법을 이용하여 세포로부터 mRNA를 분리하였다. PCR로 CXCR3 및 CXCR4의 발현에 대해 상보성 DNA를 분석하였다. 인터그레이티드 DNA 테크놀러지즈(아이오와주의 코랄빌)로부터 특이적 프라이머를 입수하였다. 35 사이클 동안 Hybaid Omn-E(캘리포니아주 사라토가 소재의 이 앤드 케이 사이언티픽 프로덕츠 인코포레이티드)로 특정 PCR 산물을 측정하였다. GAPDH를 대조군으로서 측정하였다.
부착 분석
HUVEC 세포를 TNFα(25 ng/㎖) 및 IFNγ(50 ng/㎖)의 존재 하에 조직 배양 처리된 슬라이드 상에서 밤새 증식시켰다. 그 다음날, NSO 형질감염된 CCX-CKR2 세포뿐 아니라 야생형의 대조군을 칼세인-AM으로 표지하였다. 그 후, 칼세인 표지된 세포를 CCX-CKR2 길항제(CCX3451)의 유무 하에 내피 단층 상에 배양하였다. 슬라이 드를 37℃에서 40분 동안 항온처리한 후 PBS로 세정하여 부착되지 않은 세포를 제거하였다. 부착된 NSO 세포를 형광 현미경검사법에 의해 시각화하였다. 화합물 또는 운반체로 처리된 세포를 3개의 시야각(fov)에서 육안으로 계수하였고 좌표에 표시하였다.
결과
최근 보고에 따르면, 일부 종양 세포 유형에서 CXCR4 발현이 확인되었고(Sehgal, et al ., J Surg Oncol 69:99-104(1998); Sehgal, A., et al . J Surg Oncol 69:239-48 (1998); Burger, et al . Blood 94:3658-67 (1999); Rempel, et al. Clin Cancer Res 6:102-11 (2000); Koshiba, T. et al . Clin Cancer Res 6: 3530-5(2000); Muller, A. et al . Nature 410: 50-6 (2001); Robledo, et al . J Biol Chem 276:45098-45105(2001)), 일부 예에서는 이러한 발현이 유방 종양 세포의 전이와 연관되어 있는 것이 밝혀졌다(Muller, A. et al . Nature 410:50-6 (2001)). 종양 세포에 대한 케모카인 수용체의 역할을 추가로 조사하기 위해서, 몇가지 인간 유방 종양 세포주에서 CXCR4의 발현을 평가하였다. 초기에 유세포 분석법으로 CXCR4 발현 패턴을 평가하였다. 1차 IL-2 배양된 T 림프구와 2개의 T 세포주(즉, CEM-NKr 및 주르카트)를 검사하여 T 세포 표현형의 항-CXCR4 염색을 측정하였다. 3가지 유방 종양 세포주, 즉 MCF-7, MDA MB-231 및 MDA MB-435s를 또한 테스트하였다(도 1a). 테스트된 4가지 항-CXCR4 클론은 모두 T 세포를 염색하였다. 놀랍게도, 유방 종양 세포는 CXCR4를 발현하는 것으로 보고되어 있지만, 널리 사용되는 클론 12G5에서는 유방 종양 세포 상의 어떤 CXCR4도 검출되지 않았다. 유방 종 양 세포주 상에서 테스트된 3가지 다른 클론에 의해 약하고 가변적인 반응성이 검출되었다. 또한 이 분석에서 유방 종양 세포주 DU 4475 및 ZR 75-1를 테스트하였으며(데이타는 도시되지 않음), 테스트된 다른 유방 종양 세포와 유사한 항체 염색 프로파일을 갖는 것으로 확인되었다. 따라서, CXCR4에 대한 mAb 패널의 염색 패턴은 2가지 특징적인 유형의 반응성, 즉 "백혈구" CXCR4 표현형(CEM-NKr, 주르카트 및 IL-2 림프구 염색에 의해 예시됨) 및 유방 종양 세포 표현형(MCF-7 및 MDA MB-231 유방 종양 세포주 상에서의 약한 염색에 의해 예시됨)을 제시하는 것으로 생각된다.
유방 종양 세포 상에서 가장 널리 사용되는 항CXCR4 mAb, 클론 12G5를 이용할 때 반응성이 일관되게 결여되므로 RT PCR로 이들 세포에서 CXCR4 발현을 조사할 수 있다. CXCR4 발현에 대한 양성 대조군으로서의 IL-2 배양된 림프구 및 T 세포주, 즉 CEM-NKr 및 주르카트뿐 아니라 유세포 분석에서 테스트된 3가지 유방 종양 세포주로부터 mRNA를 분리하였다. 12G5와의 반응성이 없고 테스트된 다른 항-CXCR4 클론과의 반응성이 가변적이지만, 유방 종양 세포주 MCF-7 및 MDA MB-231은 CXCR4 메시지를 발현하지 않았다. 그러나, MDA MB-435s는 CXCR4 발현에 대해 음성인 것으로 밝혀졌다. 모든 경우에, GAPDH를 대조군으로서 측정하였다. mAb 반응성의 차이가 서열 차이에 기인하여 각종 세포주 상에서 CXCR4의 에피토프 변화를 초래할 수 있는지를 조사하기 위해서, 대표적인 CXCR4+ 유방 종양 세포로서 MCF-7과 대표적인 T 세포로서 CEM-NKr로부터 생성된 PCR 산물을 서열결정하였다. 이들 2 세포주로부터 얻은 서열은 공개된 CXCR4 서열과 동일하였으며, 이는 상이한 CXCR4 항체 프로 파일에도 불구하고, 양 세포 유형에서 CXCR4의 유전자 구조와 이에 따른 폴리펩티드 구조가 동일하다는 것을 시사한다.
본 발명자들은 케모카인 리간드의 포괄 어레이에 대한 수용체 결합을 동시에 분석할 수 있는 기술 세트를 보고한 바 있다(Dairaghi, et al. J Biol Chem 274: 21569-74 (1999); Gosling, J. et al. J lmmunol 164:2851-6(2000)). 이러한 방식으로, MCF-7 세포와 비교하여 CEM-NKr 상에서의 CXCR4 결합 프로파일을 규명하였다. CEM-NKr(도 1) 또는 MCF-7 세포(도 1)에의 결합에 대한 신호 케모카인 125I SDF-1α을 대체하는 능력에 대해 90 이상의 케모카인 성분을 테스트하였다. 예측한 바와 같이, CEM-NKr 상의 125I SDF-1α의 잠재적 고친화도 경쟁자는 hSDF-1β 및 mSDF-1을 포함하는 반면, hSDF-1α 및 HHV8 vMIP-II는 잠재적 중간 정도의 친화도 경쟁을 나타낸다. 이것은 CXCR4에 대한 유일한 비바이러스성 리간드로서 이미 보고된 SDF-1의 결과와 일치한다. 그러나, MCF-7 세포 상의 경쟁의 전체 패턴은 현저하게 달랐다. 이 세포 유형에서 hI-TAC 및 mI-TAC는 동일한 신호 리간드 SDF-1에 대해 높은 친화도 경쟁을 나타내었다. 이 특이한 결과를 추가로 조사하기 위해서, 125I I-TAC를 MCF-7 세포 상에서 신호 리간드로서 테스트하였다(도 2). MCF-7 상에서 125I I-TAC를 이용한 고 친화도 치환 프로파일은 125I SDF-1α를 사용하여 얻은 프로파일과 동일하였다. 따라서, MCF-7 세포 상에서 I-TAC 및 SDF-1은 동일한 수용체 부위에 대한 결합 및 경쟁에 있어서 구별할 수 없게 작용한다.
I-TAC 및 SDF-1의 결합을 추가로 특성화하기 위해서, CEM-NKr 및 MCF-7 상에서 선택된 잠재적 고 친화도 리간드를 이용한 경쟁 결합 실험에서 용량 반응 곡선을 얻었다. DisplaceMax(상표명) 데이타에 의해 제시되는 바와 같이, I-TAC는 MCF-7에의 결합에 대해 125I SDF-1α와 경쟁하지만, CEM-NKr에서는 그렇지 않다(도 2). 125I SDF-α와 SDF-1 이소폼인 SDF-1α또는 SDF-1β와의 동족 경쟁은 CEM-NKr 및 MCF-7에서의 완전한 경쟁을 초래한다(도 2). 특히, MCF-7 상에서 발현된 수용체에 대한 SDF-1의 친화도는 CEM-NKr 상에서 발현된 수용체에 대한 친화도보다 높다. 따라서, CXCR4의 서열은 양 세포 유형에서 동일하지만, 리간드 결합 특이성 및 친화도는 T 세포 대 유방 종양 세포 상에서 다르다.
CXCR3이 오랫동안 I-TAC에 대한 주요 수용체로서 정립되어 있었기 때문에 MCF-7 세포 상에서 검출된 I-TAC 결합이 CXCR3 매개되는 지를 조사하였다(Cole, K. E. et al . J Exp Med 187: 2009-21. (1998)). 이를 위해서, '고전적' CXCR3 매개된 결합(즉, 보고된 CXCR3 리간드 MIG, I-TAC 및 IP-10의 CXCR3에의 결합)을 억제하여 '고전적' CXCR4 매개된 결합(즉, 보고된 CXCR4 리간드 SDF-1의 CXCR4에의 결합)을 허용하는 조건과 전환 상황에서 125I I-TAC 결합을 검사하였다. MCF-7 세포를 배지 단독, 과량의 MIG(~175 nM; CXCR3 매개 결합 억제)를 포함하는 배지 또는 과량의 SDF-1β(~90 nM; CXCR4 매개 결합 억제)를 포함하는 배지와 함께 사전 항온처리하였다. I-TAC는 MCF-7 세포에의 결합에 대해 125I I-TAC와 1 nM의 IC50으로 경쟁하였 으며(도 3), 이는 I-TAC가 이들 세포에서 이 수용체에 대한 높은 친화도 리간드임을 확인시켜준다. 유사하게, 먼저 과량의 MIG와 함께 사전 항온처리된 세포는 IC50이 1 nM인 동일한 동족 I-TAC/125I I-TAC 결합 곡선을 제공하였다(도 3). 그러나, 세포를 과량의 SDF-1β로 먼저 사전처리하는 경우, 모든 125I I-TAC 결합은 억제되었으며(도 3), 이는 유방 종양 세포에서 관찰된 125I I-TAC 결합이 이들 세포 상에서 발현되는 SDF-1 수용체에 의해 매개되는 것임을 제시한다. MCF-7 세포에 대한 125I I-TAC 결합은, IP-10이 표지되지 않은 케모카인 경쟁자로서 테스트될 때 억제되지 않았다. 또, 과량의 MIG와 함께 사전 항온처리하면 이러한 결합 프로파일이 나타나지 않았다. 그러나, SDF-1β와 세포를 사전 항온처리하면 125I I-TAC 결합이 완전히 억제되었다. CXCR4 리간드 MIG를 표지되지 않은 경쟁자로서 테스트한 경우, 세포에 대한 125I I-TAC 결합은 억제되지 않았다(도 3). 도 1에 제시된 DisplaceMax(상표명) 데이타로부터 예측되는 바와 같이, SDF-1β는 높은 친화도(IC50이 1 nM)로 이들 세포에의 결합에 대해 125I I-TAC와 경쟁하였다. 과량의 MIG로 세포를 사전처리하면 SDF-1β/125I I-TAC 경쟁이 일어나지 않았으며, 이는 검출된 결합이 CXCR3에 의해 매개되지 않는다는 것을 시사한다.
이러한 가설은 PCR에 의해 추가로 조사되었다. 이전에 사용된 분리된 mRNA(상기 참조)를 사용하여 CXCR3 전사체의 증거를 탐색하였다. IL-2 배양된 림프 구는 CXCR3을 발현하지만, 테스트된 다른 세포는 CXCR3을 발현하지 않았다. RT PCR에 의해 CXCR3 발현이 검출되지 않았다는 것은 도 3의 데이타를 뒷받침하는 것이며, 또 MCF-7 세포 상에서 I-TAC 결합이 CXCR3 매개되지 않는다는 것을 시사한다.
항-CXCR4 항체 반응성의 변화, 뿐만 아니라 리간드 결합 특이성 및 친화도의 변화는 상기 수용체가 고전적 CXCR4가 아님을 의미하는 것이다. 몇몇 '고아' 케모카인 수용체가 밝혀져 있는 반면, 이에 대한 케모카인 리간드는 밝혀지지 않았다. 본 발명자들은 몇몇 고아 수용체를 고려하였고, 그 중 하나는 RDC1(본원에서 CCX-CKR2로 언급함)라고 불린다. RDC1에 대한 단백질 서열을 MDA MB 435s(CXCR4, CXCR3 또는 CCX-CKR2를 내인적으로 발현하지 않는 세포주)로 형질감염시키는 경우, 리간드 결합 표현형의 특징이 재현된다(도 4). MDA MB 435s에서 발현된 CCX-CKR2는 방사성표지된 SDF-1에 결합한다. 표지되지 않은 경쟁자 SDF-1 및 I-TAC가 상기 결합을 위해 경쟁한다.
상기 수용체를 분자량이 작은 유기 화합물(SMC) 치료제로 표적하기 위하여, 하나는 CXCR4 매개된 백혈구 SDF-1 결합 표현형을 평가하기 위한 것이고, 다른 하나는 CCX-CKR2 매개된 유방암 SDF-1 결합 표현형을 조사하기 위한 것인 2개의 고효율 스크리닝을 사용하여 작은 분자(거의 135,000)를 스크리닝하였다. 이들 스크리닝의 결과는 상기 2개의 결합 표현형의 뚜렷한 약리학적 구별이 가능하다는 것을 나타낸다(도 5). 예를 들어, CCX0803으로 지시되는 작은 분자는 IC50 수치 46nM 으로 MCF-7에 결합하기 위하여 125I SDF-1α와 경쟁하는 반면, 이들 작은 분자는 CEM- NKr에 대한 125I SDF-1α의 결합을 전혀 억제하지 않는다. 반대로, 상이한 작은 분자 길항제인 CCX7923은 IC50 수치 106nM으로 CEM-NKr에 대한 125I SDF-1α의 결합을 억제하는 반면, MCF-7 세포에 대한 125I SDF-1α의 결합을 억제하지 않는다(도 5). 이들 두 화합물은 두 수용체에 대하여 리간드가 비상호적으로 결합을 억제하는 뚜렷하고 명백한 패턴을 보여주는 것이다(유방암 주 대 백혈구).
유방암 세포가 기타 비-종양 또는 비-암 조직에 대하여 나타내는 것과 구별되는 SDF-1에 대한 결합 친화도를 나타낸다는 것을 측정한 후, 추가의 조사를 하였다. 이들 표현형 조사(항체 반응성, 리간드 결합 프로파일 및 약리학적 차이를 사용, 본원에서 설명된 방법 참고)는, 다수의 암(또는 종양) 세포 유형이 초기에 유방암 세포와 상호관련된 결합 친화도(예를 들어, 항체 반응성, 리간드 결합 및 약리학적 차이)를 나타내고 이에 따라 CCX-CKR2를 발현한다는 것을 명백하게 보여주었다. 하기의 종양 세포를 시험하였고, 암과 관련된 결합 친화도를 나타내었다: 인간 난소 암종, 인간 자궁 경부선암, 인간 버킷 림프종, 인간 유방암종, 인간 유관암종, 인간 아교모세포종, 및 마우스 유암.
종양 및 기타 암은 그 세포 성장 속도가 빠르기 때문에 부분적으로 처리하기가 곤란하다. 이러한 측면에서, 종양은 신속하게 분열하는 조기 배 조직과 일부 성장 특성을 공유하는 것으로 알려져 있다. 어떤 학파는 성체의 종양이 배아 성장 표현형에 대한 '복귀 돌연변이체'를 나타낸다고 제안한다. SDF-1 및 CXCR4 유전자 넉아웃 마우스는 배아 상태로 죽었는데, 이것이 시사하는 바는 리간드 수용체 쌍이 성장 및 발육에 중요한 성분이라는 것이다. 동형접합성 돌연변이체 SDF-1 배의 약 50%는 18.5일의 주산기에 죽었고; 나머지 동형접합성 한배 새끼는 출생 1 시간 내에 죽었다(Kishimoto, et al . Nature 382:635-638 (1996)). 유사하게, 동형접합성 CXCR4 넉아웃 마우스의 ~1/3이 E18.5일의 주산기에 죽었다(Ma, et al . Proc . Natl . Acad. Sci . USA 95:9448-9453). 수용체와 리간드 넉아웃에서는 림프구형성 및 조혈 작용의 결함이 관찰되었다. 태아 간은 11일에 마우스에서 조혈작용이 일어나는 주요 부위이며, 출생 1주까지 계속 조혈작용이 일어난다. 이 때문에, 이 구획에서 CCX-CKR2의 발현을 조사하기로 하였다. 본 발명자들은 E17(넉아웃 동물이 죽는 시점에 가까워진 발생점) 및 E13(넛아웃 동물이 죽는 것과 별개이나, 조혈작용이 개시된 후의 발생 시점)에서 야생형 마우스 배에서의 CCX-CKR2의 발현을 조사하였다.
SDF-1 결합 분석에서, 방사성표지된 인간-SDF-1은 E13 태아 간 세포에 결합하고 SDF 및 I-TAC(마우스 및 인간 단백질)는 결합을 위해 방사성표지된 추적자와 경쟁할 수 있다. SDF-1 수용체에의 I-TAC의 결합으로 예시되는 바와 같은 변경된 리간드 특이성은 처음 암 세포와 관련시켰고 현재 CCX-CKR2로서 입증된 결합 표현형의 특징이다. 또한, CCX-CKR2 길항제는 E13 태아 간에 대한 SDF-1의 결합과 경쟁할 수 있으나, CXCR4 길항제는 그렇지 않다.
발생 후기에, E17 태아 간 세포는 CXCR4를 발현하지만, 이들 세포는 세포내 칼슘을 이동시켜 SDF-1에 반응한다. CXCR4 길항제는 이러한 SDF-1 매개된 칼슘 이동을 억제하지만, CCX-CKR2 길항제는 그러한 효과를 나타내지 않는다. 따라서, 이들 데이타는 E13 및 E17에서 야생형 태아 간 세포가 모두 CXCR4를 발현하지만, CCX-CKR2는 초기(E11)에는 발현되지만 이후의 시점(E15)에서는 발현되지 않는다는 것을 시사한다.
배아 마우스 모델에서의 결합 연구는 인간 연구 데이타와 상호관련되어 있지만, CXCR4 유전자가 표적 파괴된 마우스를 사용하는 예비 시험은 배아 일수 13(E13)의 태아 간 세포에서 관측된 SDF-1 및 I-TAC 결합 프로파일이 변하지 않았음을 나타낸다. 이는 암 관련 SDF-1 결합 친화도를 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자는 CXCR4가 아님을 추가로 증명해주는 것이다.
또한, CCX-CKR2 수용체는 성장 중인 종양 세포에 자극 신호를 제공할 수 있다는 것이 실험 결과 입증되었다. 종양 세포는 SDF-1 자극에 반응하여 전사 또는 세포 사이클과 관련된 특정 유전자를 상향 조절시킬 수 있다. 더욱 중요한 것은, 종양 세포에서 배지 중 밤새 혈청이 부족하게 되면, 아포톱시스(세포사)가 진행되기 시작한다는 것이다. SDF-1을 첨가하여 이들 배양물을 보충하면, 미처리된 대조군과 비교하여 아사로부터 세포를 회복시킬 수 있다. 따라서, SDF-1는 항아포톱시스 신호로서 작용한다. 암 세포는 아포톱시스를 진행하는 능력을 상실한 세포로서 특징지워지는 경우가 흔히 있다.
실시예 2
본 실시예는 실시예 1에서 기재한, 암과 관련된 결합 표현형이 CCX-CKR2(예전에는 고아 수용체 RDC1으로서 공지됨)에 의해 매개된다는 것을 증명한다.
일반적으로, CCX-CKR2는 형질전환된 세포에서 우선적으로 발현된다. 표 1(왼쪽 열)에서 보여지는 바와 같이, 테스트한 각종 상이한 암세포는 CCX-CKR2의 발현 에 대하여 양성이다. 반대로, 대부분의 정상(비-종양) 세포는 CCX-CKR2를 발현하지 않는다(표 1의 오른쪽 열 참고).
[표 1]
CCX-CKR2 양성 CCX-CKR2 음성
인간 유방암종(MCF-7, MDA MB 361)
인간 아교모세포종(T98G)
인간 전립선암종(LN Cap)
인간 B 세포 림프종(Raji, IM9)
인간 난소암종(HeLa)
인간 폐암종(A549)
마우스 유암(4T1)
마우스 췌장 내피 세포, SV 40 형질전환됨(SVR)
마우스 B 세포 림프종(BCL1)
마우스 정상 신장*
마우스 정상 뇌*
마우스 태아 간(E11 ～ E13)
활성화된 내피 세포		 정상 인간 PBMC
인간 T 세포 백혈병(MOLT4, 주르카트, CEM-NKr)
비자극된 내피 세포
마우스 흉션
마우스 폐
마우스 비장
마우스 심장
마우스 PBL
마우스 간
마우스 총 성체 골수
마우스 계통 음성 성체 골수
마우스 태아 간(E15 ～ 출생)
*이들 기관에서의 발현은 방사리간드 결함 신호에 의해 측정시 약함
그러나, CCX-CKR2은 일부 정상 세포에서도 역할을 하는 것으로 보인다. CCX-CKR2 수용체는 태아 발생 기간 동안 발현된다. CCX-CKR2은 배발생(E11) 11일 째까지 마우스 태아 간에서 발혀되지만, E15 무렵에는 더이상 관측되지 않고(방사성표지된 SDF-1 결합 및 I-TAC 치환에 의해 측정시), 뿐만 아니라 노던 분석에 의해 측정시 CCX-CKR2 전사체도 관측되지 않는다. 성체 마우스에서, 이는 정상 신장에서 발현된다. 신장 발현과 비교시, 정상 뇌에서 발현 정도가 낮다. 전체 뇌 호모제네이트를 사용하여 실험을 수행하였으므로, 방사리간드 결합 분석에 있어서 이러한 낮은 신호는 CCX-CKR2를 발현하는 뇌 세포의 수가 작음을 의미한다.
암에 있어서 CCX-CKR2가 하는 역할을 추가로 증명하기 위하여, 암세포 증식 이 암세포 중 CCX-CKR2를 길항함에 의해 억제될 수 있음을 증명하였다. CCX-CKR2 길항제에 의한 유방암종에서 발현되는 CCX-CKR2의 길항 작용은 시험관내 세포 증식을 억제하였다. 시험관내 처리된 세포는 비처리된 대조군과 비교시 시간에 걸쳐 감소된 세포 증식을 나타내었다(도 6 참고).
CCX-CKR2는 부착에도 관련된다. 백혈구 이주는 세포 부착 단계 및 이어서 주어진 조직으로의 이주 단계를 비롯한 여러 단계를 포함한다. 시험관내 정적 부착 분석에 의하여 이러한 결과를 관측할 수 있다. 혈관 내피세포 단층은 표면에서 성장한다. 그 후, CCX-CKR2를 발현하는 세포는 시각화를 위하여 형광 염료로 표지한다. CCX-CKR2 세포가 내피 표면에 부착되도록 하는 경우, CCX-CKR2 세포 대조군과 비교시 더 많은 CCX-CKR2 발현 세포가 내피층에 부착된다. 또한, CCX-CKR2 길항제를 첨가하면 매개체 처리된 대조군과 비교시 부착이 억제된다(도 7 참고).
생체내 증거는 종양 증식에 있어서 CCX-CKR2의 역할을 추가로 지지하여 준다. CCX-CKR2를 발현하는 인간 B 세포 림프종 세포를 면역결핍 마우스에 주사하는 경우, 종양이 형성된다. 이들 마우스를 CCX-CKR2 길항제로 처리하면 혈관신생 종양 형성이 억제된다. 이러한 시험에 있어서, CCX-CKR2 길항제로 처리한 17마리 마우스 중 1마리에서 피막화된 혈관신생 종양이 발생되는 반면, 매개체 처리한 대조군의 17마리 마우스 중 11마리에서 피막화된 혈관신생 종양이 발생되었다. 이들 데이타는 CCX-CKR2는 종양이 분화하고 혈관층을 형성하는 능력에 관련되어 있음을 암시하며 CCX-CKR2의 길항 작용이 암 치료에 유용하다는 증거를 제공하는 것이다.
유방암 모델에 있어서의 CCX-CKR2의 길항작용의 효과도 테스트하였다. 유방 암 성장 모델에서, 면역결핍 마우스에 인간 유방암종을 주사하였다. 1주일에 3회 종양을 측정하였고, 부피를 표에 그렸다. CCX-CKR2 길항제로 처리한 마우스는 매개체 처리한 대고준과 비교시 종양 부피가 감소하였고, 이는 CCX-CKR2가 종양을 성장시키는 역할을 한다는 것을 증명하는 것이다(도 8 참고).
실시예 3
본 실시예는 CCX-CKR2가 아폽토시스를 감소시킴에 의해 세포 생존을 촉진시킴을 증명한다.
케모카인과 케모카인 수용체 사이의 상호작용은 통상적으로 세포내 칼슘 이동 및 주화성을 측정함에 의해 평가한다. 그러나, CCX-CKR2는 일시적 칼슘 이동을 야기하거나 세포가 이의 리간드 CXCL12 또는 CXCL11에 반응하여 이주하게 하지 않는다. 그러나, CCX-CKR2를 발현하는 세포는 활성화된 내피 세포 단층에 대한 유착이 증가된다. 더욱이, 배양 배지의 낮은 혈청 보충 환경 하에서(통상의 10% 대신 1%), 3일 이후 생존한 부착 세포의 회복은 형질감염되지 않은 WT 세포(WT 435s)에 비하여 CCX-CKR2 MDA MB 형질감염체(CCX-CKR2 435s로 지시함)의 경우 훨씬 컸다. 이러한 관측과 일치하게, 이들 배지로부터 수집한 상청액에서 회수한 사멸 세포의 빈도는 CCX-CKR2 형질전환체에 비하여 WT의 경우 훨씬 컸다. 이러한 결과는 DNA 삽입 안료 7AAD(7 아미노액티노마이신 D)를 사용하여 형광으로 시각화할 수 있다. CCX-CKR2-435s 형질전환체 또는 DITODGUDD의 435s 세포를 상이한 혈청 농도에서 성장시킨 후 회수하였고 실온에서 15～30분 동안 7AAD(DMSO 중 1 ㎍/㎖)와 함께 항온배양하였다. FACS 분석 결과 CCX-CKR2-435s 형질전환체에 비하여 야생형의 435s 세 포에 있어서 더 많은 사멸 세포/아폽토시스 세포(즉, 7AAD-양성)가 존재함이 증명되었다.
이러한 결과의 연장선상에서, 본 발명자들은 배양된 CCX-CKR2 형질감염체 또는 형질감염되지 않는 WT 세포를, 오로지 아폽토시스 세포를 검출하는 아넥신, 및 사멸 세포를 검출하나 아폽토시스 세포를 검출하지 않는 요오드화프로프리듐(PI)으로 공동 염색하였다. 이러한 방법에 의해, 세포 아폽토시스를 유도하는 것으로 공지되어 있고, 이들 분석에서 우수한 대조군의 기능을 하는 물질, 예를 들어 캄포테신(CMP), 또는 TNF알파 플러스 시클로헥시미드(CHX)를 사용하여 세포군 중 아폽토시스 세포의 비율을 용이하게 동정한다.
이러한 분석에 의하여, 최적 혈청(10%) 또는 한계 혈청(1%)에서 성장한 CCX-CKR2-435s 형질전환체 또는 야생형 435s 세포 중 시간에 걸쳐 아폽토시스 세포의 발생을 측정하였다. 10% 혈청에서 성장한 상기 세포 유형 모두 4일간의 배양 시간에 걸쳐 우수한 생존력을 보여주었다. 반대로, 1% 혈청에서 성장한 WT 세포는 3일 및 4일의 배양 이후 생존 세포의 급속한 감소를 나타내었다. 아넥신 및 PI에 의한 공동 염색은 이것이 아폽토시스 세포 및 사멸 세포 모두의 발생을 반영한다는 것을 보여준다. 흥미롭게도, 1% 혈청에서 성장한 CCX-CKR2-435s 세포는 4일간의 배양 시간에 걸처 우수한 생존력을 보여주었고, 이는 CCX-CKR2를 435s로 도입하는 것은 이들 세포가 준최적의 혈청 보충 환경 하에서 발생하는 급속한 세포 아폽토시스를 방지한다는 것을 보여주는 것이다.
동일한 CCX-CKR2-435s 형질전환체, 및 이에 부가하여 CCX-CKR2로 형질감염된 435s 세포의 별개의 비복제군을 사용하는 두번째 실험에서도 동일한 결과가 얻어졌다. 이 실험은 초기의 복제 형질전환체에서 아폽토시스가 감소하는 것은 형질전환체 클론의 특정 변이에 의해서보다는 CCX-CKR2 발현에 의해서임을 나타내는 것이다.
실시예 4
본 실시예는 CCX-CKR2가 p44/42 MARK(ERK1 및 ERK2)의 인산화를 매개한다는 것을 증명한다.
CCX-CKR2는, 리간드 결합(예를 들어, ITAC 또는 SDF-1에 의해)이 다수의 케모카인 수용체에 일반적인 칼슘의 이동을 야기하지 않는다는 점에서 독특하다. 이는 CCX-CKR2 활성이 ERK 인산화를 통해 매개되는지를 조사하는 것을 비롯한, 다른 잠재적 시그널링 경로의 평가를 촉구하였다. ITAC 또는 SDF-1에 의해 자극되는, CCX-CKR2를 발현하는 MCF7 세포주로부터의 용해물과 함께 수행한 시험은, ERK1 및 ERK2(문헌에서 종종 p44/42 MAPK로서도 언급됨)의 리간드-의존적 인산화가 존재한다는 것을 증명하였다. 인산화된 ERK1 및 ERK2는 웨스턴 블롯 분석에 의해 검출하며, 이때 MCF7 세포주로부터의 용해물에 대해 초기에 전기영동을 실시하여 용해물 중 단백질을 분리한다. 전기영동 겔 상의 인산화된 ERK1 및 ERK2는 이들 단백질의 인산화 형태에 특이적인 항체로 프로빙함으로써 검출한다. 이들 항체는 매사추세주 베벌리의 셀 시그날링 테크날러지로부터 구입가능하다.
CCX-CKR2를 발현하는 Hela 세포를 사용하여 유사한 실험을 수행하였다. 이들 세포를 ITA 또는 SDF-1으로 자극시 유사한 결과가 수득되었다.
ITAC 및 SDF-1은 다른 케모카인 수용체에도 결합하고, 예를 들어 ITAC의 경우에는 CXCR3에 결합하고, SDF-1의 경우에는 CXCR4에 결합하므로, 이들 수용체가 MCF7 세포 중 이들 리간드에 의해 유도되는 ERK 인산화에 대해 잠재적으로 기여함을 고려하는 것이 중요하다. CXCR3 또는 CXCR4에 특이적인 항체를 사용하는 MCF7 세포의 FACS 분석은 이들 수용체가 MCF7 세포에서 완전히 부재한다는 것을 보여주었다. CXCR3 또는 CXCR4를 발현하는 세포주를 사용하는 양성 대조군은 이들 시험에서 사용된 항체가 이들 수용체에 결합한다는 것을 입증하였다. 따라서, 이들 데이타는 CCX-CKR2에 대한 결합 리간드, 예컨대 ITAC 또는 SDF-1은 ERK의 인산화를 통해 세포내 시그널링을 야기하고, 이는 추가의 다운스트림 성분의 활성화를 야기할 것이다. CCX-CKR2가 ERK1 및 ERK2의 인산화를 매개한다는 발견은, CCX-CKR2가 각종 생물학적 과정에 관련된다는 것을 지시하고, 이는 ERK 인산화가 세포 성장 및 세포 분화의 조절을 매개하는 것으로 증명되었기 때문이다.
실시예 5
본 실시예는 CCX-CKR2의 세포 발현이 다수의 조절 단백질의 유도를 야기한다는 것을 증명하는 것이다.
CCX-CKR2 매개 시그널링 사건을 조사하기 위한 대안적 방법으로서, CCX-CKR2 형질감염된 MDA MB 435s 세포로부터 수집한 상청액을 야생형의 MDA MB 435s(435s) 세포로부터 수집한 상청액과 비교하였고, 특이적 ELISA 분석에 의하여 분비 단백질의 거대 패밀리의 존재 여부에 대하여 평가하였다. CCX-CKR2 발현하는 435s 세포는, 특히 한계 혈청 환경 하에서 성장하는 경우 야생형의 435s 세포보다 실질적으 로 더 많은 양의 GM-CSF, RANTES, MCP-1, TIMP-1, 및 MMP3를 생성하였다. 흥미롭게도, 이들 모든 인자는 종양형성과 관련된 성장, 혈관 리모델링 및 주화성에 관련되어 있는 것으로 보고되어 왔다. 또한, 이들은 상기 기술한 CCX-CKR2의 아폽토시스 부족 표현형에 관련될 수 있다.
실시예 6
본 실시예는 CCX-CKR2가 siRNA에 의해 억제됨을 증명한다.
CXCR4 또는 CCX-CKR2에 특이적인 SMARTpool(상표명) siRNA(파마콘)을 수득하였다. SMARTpool(상표명) siRNA는 4개의 상이한 siRNA 서열의 풀이고, 각각은 명시된 mRAN의 상이한 영역을 표적한다. 이들 siRNA 풀을 HeLa 세포 내에서 시험하였다. CXCR4 발현을 12G5 또는 173 Mab 염색 및 FACS에 의해 평가한 반면, CCX-CKR2 발현은 125I-SDF-1을 사용하는 결합 분석에 의해 측정하였다. CXCR4는 검출가능한 125I-SDF-1 결합을 나타내지 않는 입체구조에서 HeLa 세포 상에서 발현되었고, 이에 따라 CCX-CKR2 발현의 검출을 가능하게 한다. CCX-CKR2 SMARTpool(상표명) siRNA(25 ～ 100 nM)는 125I-SDF-1 결합을 유의하게(≥50%) 억제하는 반면, CXCR4 SMARTpool(상표명) siRNA는 그렇지 않았다. 293 CCX-CKR2 형질전환체에 의해 유사한 결과가 수득되었다.
또한, 하기의 3개의 siRNA 서열 각각은 4 nM의 낮은 농도로 세포 내로 도입하는 경우 SDF-1 의 결합을 감소시키는 것으로 발견되었다.
siRNA #l: GCCGTTCCCTTCTCCATTATT
siRNA #2: GAGCTCACGTGCAAAGTCATT
siRNA #3: GACATCAGCTGGCCATGCATT
실시예 7
본 실시예는 뇌에서 CCX-CKR2가 발현됨을 증명한다.
CCX-CKR2는 다수의 종양 세포주에서 발현되는 반면, 정상 조직에서는 거의 발현되지 않는다. 이러한 패턴에 대한 한 가지 예외는 정상 성체 마우스 유래의 뇌세포가 CCX-CKR2을 발현한다는 결합 연구에서 증명되었다. 이러한 관측의 연장선에서, CCX-CKR2 발현의 영역을 뇌로 제한하기 위한 CCX-CKR2 특이적 프로브를 사용하여 현장 하이브리드화 연구를 수행하였다. 뇌 샘플을 정상 성체 마우스로부터 수집하였고, PBS 중 4% PFA에 의해 4℃에서 밤새 고정한 후, PBS 중 30% 슈크로스에 의해 4℃에서 밤새 고정하였다. 그 후, 조직을 OCT에 삽입하였고 20 ㎛ 슬라이스로 절단한 후 슈퍼프로스트 플러스(superfrost plus) 슬라이드 상에 놓았다. 현장 하이브리드화 연구를 위하여, 안티센스 리보프로브 및 센스 리보프로브를 선형화 이후 DIG cRNA 표지 키트(Roche)를 사용하는 T7 및 SP6 RNA 폴리머라제를 사용하여 각각 시험관내 전사에 의해 제조하였다. 20 ㎛의 동결절편을 새로운 4% PFA에서 고정시킨 후 프로테아제 K(2 ㎛/㎖, 37℃에서 20분 동안)로 처리하였다. 상기 슬라이드를 55℃에서 1시간 동안 예비 하이브리드화한 후 밀봉 용기 내에서 55℃ O/N에서 하이브리드화하였다. 그 후, 슬라이드를 50% 포름아미드, 5 x SSC pH4.5 및 1% SDS로 65℃에서 세정한 후, 5%의 양 혈청으로 1시간 동안 차폐하였고 4℃ O/N에서 1%의 양 혈청 내에서 1:1000 항-디그(Dig) 항체와 함께 항온배양하였다. 슬라이드를 TBST로 세정하였고 NBT/BCIP로 검출하였다.
상기 결과는 소뇌, 해마 및 피질 내의 신경세포에 의한 CCX-CKR2의 강한 발현을 명백하게 증명한다. 신경아교세포, 예컨대 소뇌 중 백색질 관 및 뇌량을 함유하는 영역 중 검출가능한 발현은 거의 없거나 전혀 없다. 심장전도 근육세포는 균일하게 강한 양성 신호을 나타내었고 내부 과립 세포층 중 과립세포의 하부세트는 양성 신호를 나타내었다. 또한, 피질은 일반적으로 상당히 양성이고 피질 내부의 개별 신경세포는 명백한 양성 염색을 나타내었다. 해마는 치아 이랑 및 CA1-3의 신경제포에 있어서 강한 CCX-CKR2 신호를 나타내었다. 또한, 중복 피질도 강한 양성을 나타내었다.
이들 데이타는 뇌 종양에 대한 CCX-CKR2의 잠재적 관련성에 대한 통찰을 제공한다. CCX-CKR2는 심실부 세포, 또는 별아교세포종이 발생하는 것으로 생각되는 아교모세포에서는 발현되지 않는다. 반대로, 속질모세포종이 그로부터 발생되는 세포 유형인 소뇌 과립 세포의 하부세트에서는 일부 발현된다. CCX-CKR2의 발현 프로파일은 기타 SDF-1 수용체 CXCR4에서 보여지는 것과는 매우 상이하다.
실시예 8
본 실시예는 폐 암종의 마우스 이종이식 모델에서 CCX-CKR2 리간드 경쟁자의 효과를 증명한다.
폐 암종은 미국에서 가장 큰 사망 원인이 되는 암이다. CCX-CKR2는 폐 암종뿐 아니라 활성화 내피에서도 발현된다. 폐 암종의 이종이식 모델에서 CCX-CKR2 리간드 경쟁자의 700개의 일련의 화합물의 투여 효과를 평가하였다.
폐 암종 이종이식 연구에서, A549 종양 단편 (30 ～ 40 ㎎)을 누드 마우스의 피하 공간에 이식하였다. 종양은 대략 그 크기가 150 ㎎(100 ～ 200 ㎎)의 크기가 될 때까지 자라게 하였다. 마우스에 CCX-CKR2 리간드 경쟁자(25 mpk; sc 투여, Q1D) 또는 매개체 대조군을 투여하였다. 멜팔란(9 mpk/투여, ip 투여, Q4Dx3)을 양성 대조군으로서 포함시켰다. 종양을 2차원 캘리퍼스로 주당 2회 측정하였고, 편장 타원체에 대한 공식(a x b2/3, a는 더 긴 길이이고, b는 더 짧은 길이이며 단위 밀도(1 mm3 = 1 ㎎)를 가정함)을 사용하여 종양 질량으로 전환시켰다. 또한, 체중을 주당 2회 측정하여 화합물 투여시 임의의 부작용을 평가하였다. 항암 활성은 매개체 처리 대조군과 비교시 처리군의 종양 증식의 지체에 의해 평가하였다.
경쟁자가 투여된 마우스는 매개체 처리군에 비하여 종양 하중이 감소하였다. 이러한 종양 부피의 차이는 이들 군 사이에서 통계적으로 유의하며, 평균 종양 부피에 있어서 32% 감소하였다. 또한, 멜팔란은 60%의 평균 종양 부피 감소율로 종양 부피를 감소시켰다. 또한, 본 연구에 있어서, 경쟁자의 일일 투여는 화합물을 처리한 동물에 있어 체중 증가로써 측정시 잘 용인되었고 이는 매개체 처리군의 체중 증가와 동일하였다.
화합물 처리의 마지막 날(49일째) 종양 중량을 평가하였다. CCX-CKR2 경쟁자로 처리한 마우스는 매개체 대조군의 종양보다 통계적으로 더 작은 종양을 나타내었다. 유사하게, 멜팔란을 투여한 마우스도 매개체 처리군에 비하여 종양이 유의하게 작았다.
본 명세서 중에 인용된 모든 공개문헌 및 특허 출원은, 각 개별 공개문헌 또는 특허 출원이 구체적 그리고 개별적으로 참고로 인용되었다고 지정된 바와 같은 정도로 참고 인용된다.
전술한 본 발명은 이해를 돕기 위한 예시 및 실시예에 의해 상세히 설명되었지만, 첨부된 특허청구범위의 취지 및 보호범위를 벗어나지 않는 일부 변화 및 변형이 실시될 수 있다는 것은 본 발명의 교시 내용으로부터 당업자에게 자명할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Burns, Jennifer M. Summers, Bretton Howard, Maureen C. Schall, Thomas J. 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Ser Ser Arg Lys Ile Ile Phe Ser 245 250 255 Tyr Val Val Val Phe Leu Val Cys Trp Leu Pro Tyr His Val Ala Val 260 265 270 Leu Leu Asp Ile Phe Ser Ile Leu His Tyr Ile Pro Phe Thr Cys Arg 275 280 285 Leu Glu His Ala Leu Phe Thr Ala Leu His Val Thr Gln Cys Leu Ser 290 295 300 Leu Val His Cys Cys Val Asn Pro Val Leu Tyr Ser Phe Ile Asn Arg 305 310 315 320 Asn Tyr Arg Tyr Glu Leu Met Lys Ala Phe Ile Phe Lys Tyr Ser Ala 325 330 335 Lys Thr Gly Leu Thr Lys Leu Ile Asp Ala Ser Arg Val Ser Glu Thr 340 345 350 Glu Tyr Ser Ala Leu Glu Gln Ser Thr Lys 355 360 <210> 3 <211> 1089 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> G-protein coupled receptor (GPCR) CCX-CKR2.2 coding sequence <400> 3 atggatctgc acctcttcga ctacgccgag ccaggcaact tctcggacat cagctggcca 60 tgcaacagca gcgactgcat cgtggtggac acggtgatgt gtcccaacat gcccaacaaa 120 agcgtcctgc tctacacgct ctccttcatt tacattttca tcttcgtcat cggcatgatt 180 gccaactccg tggtggtctg ggtgaatatc caggccaaga ccacaggcta tgacacgcac 240 tgctacatct tgaacctggc cattgccgac 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cgctggtgca ctgctgcgtc aaccctgtcc tctacagctt catcaatcgc 960 aactacaggt acgagctgat gaaggccttc atcttcaagt actcggccaa aacagggctc 1020 accaagctca tcgatgcctc cagagtctca gagacggagt actctgcctt ggagcagagc 1080 accaaatga 1089 <210> 6 <211> 362 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> G-protein coupled receptor (GPCR) CCX-CKR2.3 <400> 6 Met Asp Leu His Leu Phe Asp Tyr Ser Glu Pro Gly Asn Phe Ser Asp 1 5 10 15 Ile Ser Trp Pro Cys Asn Ser Ser Asp Cys Ile Val Val Asp Thr Val 20 25 30 Met Cys Pro Asn Met Pro Asn Lys Ser Val Leu Leu Tyr Thr Leu Ser 35 40 45 Phe Ile Tyr Ile Phe Ile Phe Val Ile Gly Met Ile Ala Asn Ser Val 50 55 60 Val Val Trp Val Asn Ile Gln Ala Lys Thr Thr Gly Tyr Asp Thr His 65 70 75 80 Cys Tyr Ile Leu Asn Leu Ala Ile Ala Asp Leu Trp Val Val Leu Thr 85 90 95 Ile Pro Val Trp Val Val Ser Leu Val Gln His Asn Gln Trp Pro Met 100 105 110 Gly Glu Leu Thr Cys Lys Val Thr His Leu Ile Phe Ser Ile Asn Leu 115 120 125 Phe Gly Ser Ile Phe Phe Leu Thr Cys Met Ser Val Asp Arg Tyr Leu 130 135 140 Ser Ile Thr Tyr Phe Thr Asn Thr Pro Ser Ser Arg Lys Lys Met Val 145 150 155 160 Arg Arg Val Val Cys Ile Leu Val Trp Leu Leu Ala Phe Cys Val Ser 165 170 175 Leu Pro Asp Thr Tyr Tyr Leu Lys Thr Val Thr Ser Ala Ser Asn Asn 180 185 190 Glu Thr Tyr Cys Arg Ser Phe Tyr Pro Glu His Ser Ile Lys Glu Trp 195 200 205 Leu Ile Gly Met Glu Leu Val Ser Val Val Leu Gly Phe Ala Val Pro 210 215 220 Phe Ser Ile Val Ala Val Phe Tyr Phe Leu Leu Ala Arg Ala Ile Ser 225 230 235 240 Ala Ser Ser Asp Gln Glu Lys His Ser Ser Arg Lys Ile Ile Phe Ser 245 250 255 Tyr Val Val Val Phe Leu Val Cys Trp Leu Pro Tyr His Val Ala Val 260 265 270 Leu Leu Asp Ile Phe Ser Ile Leu His Tyr Ile Pro Phe Thr Cys Arg 275 280 285 Leu Glu His Ala Leu Phe Thr Ala Leu His Val Thr Gln Cys Leu Ser 290 295 300 Leu Val His Cys Cys Val Asn Pro Val Leu Tyr Ser Phe Ile Asn Arg 305 310 315 320 Asn Tyr Arg Tyr Glu Leu Met Lys Ala Phe Ile Phe Lys Tyr Ser Ala 325 330 335 Lys Thr Gly Leu Thr Lys Leu Ile Asp Ala Ser Arg Val Ser Glu Thr 340 345 350 Glu Tyr Ser Ala Leu Glu Gln Ser Thr Lys 355 360 <210> 7 <211> 1089 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> G-protein coupled receptor (GPCR) CCX-CKR2.4 coding sequence <400> 7 atggatctgc atctcttcga ctactcagag ccagggaact tctcggacat cagctggcca 60 tgcaacagca gcgactgcat cgtggtggac acggtgatgt gtcccaacat gcccaacaaa 120 agcgtcctgc tctacacgct ctccttcatt tacattttca tcttcgtcat cggcatgatt 180 gccaactccg tggtggtctg ggtgaatatc caggccaaga ccacaggcta tgacacgcac 240 tgctacatct tgaacctggc cattgccgac ctgtgggttg tcctcaccat cccagtctgg 300 gtggtcagtc tcgtgcagca caaccagtgg cccatgggcg agctcacgtg caaagtcaca 360 cacctcatct tctccatcaa cctcttcggc agcattttct tcctcacgtg catgagcgtg 420 gaccgctacc tctccatcac ctacttcacc aacaccccca gcagcaggaa gaagatggta 480 cgccgtgtcg tctgcatcct ggtgtggctg ctggccttct gcgtgtctct gcctgacacc 540 tactacctga agaccgtcac gtctgcgtcc aacaatgaga cctactgccg gtccttctac 600 cccgagcaca gcatcaagga gtggctgatc ggcatggagc tggtctccgt tgtcttgggc 660 tttgccgttc ccttctccat tatcgctgtc ttctacttcc tgctggccag agccatctcg 720 gcgtccagtg accaggagaa gcacagcagc cggaagatca tcttctccta cgtggtggtc 780 ttccttgtct gctggctgcc ctaccacgtg gcggtgctgc tggacatctt ctccatcctg 840 cactacatcc ctttcacctg ccggctggag cacgccctct tcacggccct gcatgtcaca 900 cagtgcctgt cgctggtgca ctgctgcgtc aaccctgtcc tctacagctt catcaatcgc 960 aactacaggt acgagctgat gaaggccttc atcttcaagt actcggccaa aacagggctc 1020 accaagctca tcgatgcctc cagagtctca gagacggagt actctgcctt ggagcagagc 1080 accaaatga 1089 <210> 8 <211> 362 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> G-protein coupled receptor (GPCR) CCX-CKR2.4 <400> 8 Met Asp Leu His Leu Phe Asp Tyr Ser Glu Pro Gly Asn Phe Ser Asp 1 5 10 15 Ile Ser Trp Pro Cys Asn Ser Ser Asp Cys Ile Val Val Asp Thr Val 20 25 30 Met Cys Pro Asn Met Pro Asn Lys Ser Val Leu Leu Tyr Thr Leu Ser 35 40 45 Phe Ile Tyr Ile Phe Ile Phe Val Ile Gly Met Ile Ala Asn Ser Val 50 55 60 Val Val Trp Val Asn Ile Gln Ala Lys Thr Thr Gly Tyr Asp Thr His 65 70 75 80 Cys Tyr Ile Leu Asn Leu Ala Ile Ala Asp Leu Trp Val Val Leu Thr 85 90 95 Ile Pro Val Trp Val Val Ser Leu Val Gln His Asn Gln Trp Pro Met 100 105 110 Gly Glu Leu Thr Cys Lys Val Thr His Leu Ile Phe Ser Ile Asn Leu 115 120 125 Phe Gly Ser Ile Phe Phe Leu Thr Cys Met Ser Val Asp Arg Tyr Leu 130 135 140 Ser Ile Thr Tyr Phe Thr Asn Thr Pro Ser Ser Arg Lys Lys Met Val 145 150 155 160 Arg Arg Val Val Cys Ile Leu Val Trp Leu Leu Ala Phe Cys Val Ser 165 170 175 Leu Pro Asp Thr Tyr Tyr Leu Lys Thr Val Thr Ser Ala Ser Asn Asn 180 185 190 Glu Thr Tyr Cys Arg Ser Phe Tyr Pro Glu His Ser Ile Lys Glu Trp 195 200 205 Leu Ile Gly Met Glu Leu Val Ser Val Val Leu Gly Phe Ala Val Pro 210 215 220 Phe Ser Ile Ile Ala Val Phe Tyr Phe Leu Leu Ala Arg Ala Ile Ser 225 230 235 240 Ala Ser Ser Asp Gln Glu Lys His Ser Ser Arg Lys Ile Ile Phe Ser 245 250 255 Tyr Val Val Val Phe Leu Val Cys Trp Leu Pro Tyr His Val Ala Val 260 265 270 Leu Leu Asp Ile Phe Ser Ile Leu His Tyr Ile Pro Phe Thr Cys Arg 275 280 285 Leu Glu His Ala Leu Phe Thr Ala Leu His Val Thr Gln Cys Leu Ser 290 295 300 Leu Val His Cys Cys Val Asn Pro Val Leu Tyr Ser Phe Ile Asn Arg 305 310 315 320 Asn Tyr Arg Tyr Glu Leu Met Lys Ala Phe Ile Phe Lys Tyr Ser Ala 325 330 335 Lys Thr Gly Leu Thr Lys Leu Ile Asp Ala Ser Arg Val Ser Glu Thr 340 345 350 Glu Tyr Ser Ala Leu Glu Gln Ser Thr Lys 355 360 <210> 9 <211> 1089 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> G-protein coupled receptor (GPCR) CCX-CKR2.5 coding sequence <400> 9 atggatctgc atctcttcga ctactcagag ccagggaact tctcggacat cagctggccg 60 tgcaacagca gcgactgcat cgtggtggac acggtgatgt gtcccaacat gcccaacaaa 120 agcgtcctgc tctacacgct ctccttcatt tacattttca tcttcgtcat cggcatgatt 180 gccaactccg tggtggtctg ggtgaatatc caggccaaga ccacaggcta tgacacgcac 240 tgctacatct tgaacctggc cattgccgac ctgtgggttg tcctcaccat cccagtctgg 300 gtggtcagtc tcgtgcagca caaccagtgg cccatgggcg agctcacgtg caaagtcaca 360 cacctcatct tctccatcaa cctcttcagc agcattttct tcctcacgtg catgagcgtg 420 gaccgctacc tctccatcac ctacttcacc aacaccccca gcagcaggaa gaagatggta 480 cgccgtgtcg tctgcatcct ggtgtggctg ctggccttct gcgtgtctct gcctgacacc 540 tactacctga agaccgtcac gtctgcgtcc aacaatgaga cctactgccg gtccttctac 600 cccgagcaca gcatcaagga gtggctgatc ggcatggagc tggtctccgt tgtcttgggc 660 tttgccgttc ccttctccat tatcgctgtc ttctacttcc tgctggccag agccatctcg 720 gcgtccagtg accaggagaa gcacagcagc cggaagatca tcttctccta cgtggtggtc 780 ttccttgtct gctggttgcc ctaccacgtg gcggtgctgc tggacatctt ctccatcctg 840 cactacatcc ctttcacctg ccggctggag cacgccctct tcacggccct gcatgtcaca 900 cagtgcctgt cgctggtgca ctgctgcgtc aaccctgtcc tctacagctt catcaatcgc 960 aactacaggt acgagctgat gaaggccttc atcttcaagt actcggccaa aacagggctc 1020 accaagctca tcgatgcctc cagagtctca gagacggagt actccgcctt ggagcagagc 1080 accaaatga 1089 <210> 10 <211> 362 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> G-protein coupled receptor (GPCR) CCX-CKR2.5 <400> 10 Met Asp Leu His Leu Phe Asp Tyr Ser Glu Pro Gly Asn Phe Ser Asp 1 5 10 15 Ile Ser Trp Pro Cys Asn Ser Ser Asp Cys Ile Val Val Asp Thr Val 20 25 30 Met Cys Pro Asn Met Pro Asn Lys Ser Val Leu Leu Tyr Thr Leu Ser 35 40 45 Phe Ile Tyr Ile Phe Ile Phe Val Ile Gly Met Ile Ala Asn Ser Val 50 55 60 Val Val Trp Val Asn Ile Gln Ala Lys Thr Thr Gly Tyr Asp Thr His 65 70 75 80 Cys Tyr Ile Leu Asn Leu Ala Ile Ala Asp Leu Trp Val Val Leu Thr 85 90 95 Ile Pro Val Trp Val Val Ser Leu Val Gln His Asn Gln Trp Pro Met 100 105 110 Gly Glu Leu Thr Cys Lys Val Thr His Leu Ile Phe Ser Ile Asn Leu 115 120 125 Phe Ser Ser Ile Phe Phe Leu Thr Cys Met Ser Val Asp Arg Tyr Leu 130 135 140 Ser Ile Thr Tyr Phe Thr Asn Thr Pro Ser Ser Arg Lys Lys Met Val 145 150 155 160 Arg Arg Val Val Cys Ile Leu Val Trp Leu Leu Ala Phe Cys Val Ser 165 170 175 Leu Pro Asp Thr Tyr Tyr Leu Lys Thr Val Thr Ser Ala Ser Asn Asn 180 185 190 Glu Thr Tyr Cys Arg Ser Phe Tyr Pro Glu His Ser Ile Lys Glu Trp 195 200 205 Leu Ile Gly Met Glu Leu Val Ser Val Val Leu Gly Phe Ala Val Pro 210 215 220 Phe Ser Ile Ile Ala Val Phe Tyr Phe Leu Leu Ala Arg Ala Ile Ser 225 230 235 240 Ala Ser Ser Asp Gln Glu Lys His Ser Ser Arg Lys Ile Ile Phe Ser 245 250 255 Tyr Val Val Val Phe Leu Val Cys Trp Leu Pro Tyr His Val Ala Val 260 265 270 Leu Leu Asp Ile Phe Ser Ile Leu His Tyr Ile Pro Phe Thr Cys Arg 275 280 285 Leu Glu His Ala Leu Phe Thr Ala Leu His Val Thr Gln Cys Leu Ser 290 295 300 Leu Val His Cys Cys Val Asn Pro Val Leu Tyr Ser Phe Ile Asn Arg 305 310 315 320 Asn Tyr Arg Tyr Glu Leu Met Lys Ala Phe Ile Phe Lys Tyr Ser Ala 325 330 335 Lys Thr Gly Leu Thr Lys Leu Ile Asp Ala Ser Arg Val Ser Glu Thr 340 345 350 Glu Tyr Ser Ala Leu Glu Gln Ser Thr Lys 355 360 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:chemokine receptor second extracellular loop common structural feature <400> 11 Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala 1 5 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:small interfering RNA siRNA #1 <400> 12 gccgttccct tctccattat t 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:small interfering RNA siRNA #2 <400> 13 gagctcacgt gcaaagtcat t 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:small interfering RNA siRNA #3 <400> 14 gacatcagct ggccatgcat t 21

Claims (45)

  1. 세포 상의 CCX-CKR2에 결합하는 물질을 동정하는 방법으로서,
    복수의 물질을, 서열 번호 2의 세포외 도메인과 적어도 95% 동일한 세포외 도메인을 포함하는 CCX-CKR2 폴리펩티드, 또는 이의 SDF-1 (stromal derived factor 1) 또는 I-TAC (interferon-inducible T-cell alpha chemoattractant) 결합 단편에 접촉시키는 단계; 및
    CCX-CKR2 폴리펩티드 또는 이의 단편에 결합하기 위하여 I-TAC 또는 SDF-1과 경쟁하는 물질을 선별함으로써, 세포 상의 CCX-CKR2에 결합하는 물질을 동정하는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 물질이 1,500 달톤 미만인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 물질이 항체인 방법.
  4. 서열 번호 2의 세포외 도메인과 적어도 95% 동일한 세포외 도메인을 포함하는 CCX-CKR2 폴리펩티드에 결합하기 위하여 SDF-1 및 I-TAC와 특이적으로 경쟁하는 항체.
  5. 암세포의 존재 또는 부재를 판단하는 방법으로서,
    상기 방법은 세포를 포함하는 시료를 제4항의 항체와 접촉시키는 단계; 및
    상기 항체와 상기 시료 중의 폴리펩티드와의 결합을 검출함으로써, 항체와 시료와의 결합이 암세포의 존재를 지시하는 단계
    를 포함하는 방법.
  6. 제4항의 항체와 세포를 시험관 내에서 접촉시키는 단계를 포함하는 방법으로서, 상기 항체는 서열 번호 2의 세포외 도메인과 적어도 95% 동일한 세포외 도메인을 포함하는 CCX-CKR2 폴리펩티드에 결합하기 위하여 SDF-1 및 I-TAC와 경쟁하며, 세포는 CCX-CKR2 폴리펩티드를 발현함으로써, 상기 항체를 세포상의 CCX-CKR2 폴리펩티드에 결합시키는 것인 방법.
  7. 제4항의 항체의 유효량을 포함하는 개체의 암을 치료하기 위한 약학 조성물.
  8. 서열 번호 2에 결합하기 위하여 SDF-1 및 I-TAC와 특이적으로 경쟁하는 항체.
  9. 암세포의 존재 또는 부재를 판단하는 방법으로서,
    상기 방법은 세포를 포함하는 시료를 제8항의 항체와 접촉시키는 단계; 및
    상기 항체와 상기 시료 중의 폴리펩티드와의 결합을 검출함으로써, 항체와 시료와의 결합이 암세포의 존재를 지시하는 단계
    를 포함하는 방법.
  10. 제8항의 항체와 세포를 시험관 내에서 접촉시키는 단계를 포함하는 방법으로서, 상기 항체는 서열 번호 2에 결합하기 위하여 SDF-1 및 I-TAC와 경쟁하며, 세포는 CCX-CKR2 폴리펩티드를 발현함으로써, 상기 항체를 세포상의 CCX-CKR2 폴리펩티드에 결합시키는 것인 방법.
  11. 제8항의 항체의 유효량을 포함하는 개체의 암을 치료하기 위한 약학 조성물.
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