KR101149115B1 - 혈관신생을 조절하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 혈관신생을 조절하는 방법 및 조성물을 제공한다.

Description

혈관신생을 조절하기 위한 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR MODULATING ANGIOGENESIS}

본 특허 출원은 2004년 2월 3일에 출원된 미국 가출원 제60/541,849호; 2004년 8월 4일에 출원된 미국 가출원 제60/598,958호; 및 2004년 11월 8일에 출원된 미국 가출원 제60/626,195호의 우선권을 주장하며, 모두 본원에 참조 인용된다.

혈관신생은 새로운 혈관이 형성되는 기본 과정이며 다양한 정상 신체 활동(예, 생식, 발생 및 상처 회복)에 필수적이다. 상기 과정이 완전히 이해되지는 않지만, 모세 혈관의 주요 세포인 내피 세포의 성장을 자극 및 억제하는 분자들의 복잡한 상호작용에 관련되는 것으로 생각된다. 정상 상태 하에서, 이들 분자는 수 주 또는 일부 경우에는 수십 년 동안 지속될 수 있는 연장된 기간 동안 정지 상태(즉, 모세관 성장이 없는 상태)로 미소혈관계를 유지하는 것으로 보인다. 하지만, 상처 회복 동안과 같이 필요할 경우, 이들 동일한 세포는 5일 이내에 신속한 증식과 턴오버를 일으킬 수 있다.

혈관신생이 정상 상태 하에서 고도로 조절되는 과정임에도 불구하고, 많은 질환("혈관신생 질환")이 지속적인 비조절된 혈관신생에 의해 유도된다. 달리 말하면, 비조절된 혈관신생은 직접 특정 질환을 야기하거나 기존의 병리 상태를 악화시 킬 수 있다. 고형 종양의 성장 및 전이는 혈관신생-의존적이다(Folkman, 1986, J. Cancer Res. 46: 467-473; Folkman, J Nat. Cancer Inst. 82: 4-6 (1989); Folkman et al., "Tumor Angiogenesis," Chapter 10, pp. 206-32, in THE MOLECULAR BASIS OF CANCER, Mendelsohn et al., eds. (1995)).

종양-보유 동물에서 약물로 사용될 때, 혈관신생의 천연 억제제는 소형 종양의 성장을 방지할 수 있다(O'Reilly et al., Cell 79: 315-328 (1994)). 사실, 일부 프로토콜에서, 그러한 억제제의 사용은 치료 중단 후에도 종양 퇴행 및 휴면을 야기한다(O'Reilly et al., Cell 88: 277-285 (1997)). 더욱이, 일부 종양에 혈관신생의 억제제를 공급하면 다른 치료 요법(예, 화학요법)에 대한 그들의 반응을 강화시킬 수 있다(예, Teischer et al., Int. J. Cancer 57: 920-925 (1994) 참조).

혈관신생은 또한 예를 들어, 문헌 [Folkman et al., Science 235: 442-447 (1987)]에 개시된 대로, 상처 치유, 배 발생, 월경 주기 및 염증과 같은 다양한 생물학적 과정 및 암, 당뇨병성 망막병증 및 류마티스 관절염과 같은 다양한 질환의 발병에서 중요한 역할을 한다. 안구 신혈관형성은 실명의 가장 흔한 원인이며 약 20가지의 안 질환의 병리를 일으킨다. 관절염과 같은 일부 기존의 병태에서는, 새로 형성된 모세 혈관이 관절에 침입하여 연골을 파괴한다. 당뇨병에서는, 망막에서 형성된 새로운 모세관이 유리액에 침입하여 출혈 및 실명을 야기한다.

한편, 일부 환경에서는 신혈관생성을 촉진하는 것이 유익할 수 있다. 예를 들어, 혈관신생의 촉진은 다양한 생리학적 과정, 및 상처, 골절 및 화상의 치유, 염증성 질환, 심장 허혈 및 말초 혈관 질환 및 심근경색과 같은 혈관생성의 증가를 필요로 하는 질환의 치료를 가속화하는 것을 도울 수 있다. 혈관신생의 억제는 혈관생성의 증가가 상기 질환의 진행에 기여하는, 암, 당뇨병성 망막병증 및 류마티스 관절염과 같은 질환의 치료를 도울 수 있다.

따라서, 혈관신생의 조작은 혈관신생에 관련된 다양한 병태 또는 질환을 치료하거나 방지하기 위한 치료적 접근을 나타낸다.

발명의 개요

본 발명은 환자의 혈관신생을 조절하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 CCX-CKR2 활성을 조절하는 제제를 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 제제는 리간드의 CCX-CKR2에의 결합을 조절한다. 일부 구체예에서, 리간드는 SDF-1 및 I-TAC로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 환자는 혈관신생의 증가 또는 감소를 필요로 한다.

일부 구체예에서, 상기 방법은 CCX-CKR2 활성을 촉진시켜, 혈관신생을 촉진한다. 일부 구체예에서, 상기 제제는 혈관신생을 촉진하는 제2 제제와 함께 투여된다.

일부 구체예에서, 상기 제제는 CCX-CKR2 아고니스트(agonist)이다. 일부 구체예에서, 아고니스트는 1,500 달톤보다 작은 질량을 가지는 폴리펩티드, 항체 및 제제로부터 선택된다. 일부 구체예에서, CCX-CKR2 활성은 환자의 세포에서 재조합 CCX-CKR2를 발현시킴으로써 촉진된다. 일부 구체예에서, 세포는 내피 세포이다.

일부 구체예에서, CCX-CKR2 활성은 환자에 I-TAC를 투여함으로써 촉진된다.

일부 구체예에서, I-TAC은 환자에게 국소 투여된다.

일부 구체예에서, 상기 환자는 혈관생성의 증가를 필요로 한다. 일부 구체예에서, 환자는 상처, 골절, 화상, 염증성 질환, 심장 질환, 재협착, 심장 허혈, 말초 혈관 질환, 심근 경색, 발작, 불임, 건선 또는 피부경화증을 가진다.

일부 구체예에서, 환자는 상처를 가지며 제제를 상기 상처에 도포하여 상처 치유를 증진시킨다. 일부 구체예에서, 상기 제제는 CCX-CKR2 활성을 억제한다. 일부 구체예에서, 상기 제제는 CCX-CKR2 활성을 증진한다.

일부 구체예에서, 상기 방법은 CCX-CKR2 활성을 감소시켜 혈관신생을 감소시킨다. 일부 구체예에서, 상기 제제는 CCX-CKR2의 발현을 억제하는 폴리뉴클레오티드이다. 일부 구체예에서, 상기 제제는 1,500 달톤보다 작은 질량을 가지는 폴리펩티드, 항체 및 제제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 안타고니스트(antagonist)이다. 일부 구체예에서, 상기 제제는 CCX-CKR2 의 발현을 억제하는 폴리뉴클레오티드이다. 일부 구체예에서, 상기 제제는 제2 항혈관신생제와 함께 투여된다.

일부 구체예에서, 상기 제제는 CCX-CKR2 안타고니스트이다. 일부 구체예에서, 안타고니스트는 1,500 달톤보다 작은 질량을 가지는 폴리펩티드, 항체 및 제제 중에서 선택된다.

일부 구체예에서, 환자는 암을 앓는다. 일부 구체예에서, 환자는 고형 종양을 가지며 상기 제제는 종양을 표적으로 하거나 종양에 전달된다.

일부 구체예에서, 소정량의 화학치료제 또는 방사선을 상기 제제와 함께 환자에게 투여된다. 일부 구체예에서, 상기 양은 화학치료제 또는 방사선을 단독 투여하는 경우에는 효과미달(sub-therapeutic)이다.

일부 구체예에서, 환자는 암을 앓지 않는다.

일부 구체예에서, 혈관신생은 눈, 피부, 관절, 난소 조직 또는 자궁 내막 조직 중에서 선택된 조직에서 감소된다. 일부 구체예에서, 상기 제제는 피임제로 사용된다.

일부 구체예에서, 환자는 관절염을 앓고, 상기 제제는 환자의 관절염 증상을 감소시키는 데 효과적인 양으로 투여된다.

본 발명은 또한 CCX-CKR2 활성을 감소시키는 제제와 함께 화학치료제의 소정량을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 일부 구체예에서, 상기 양은 화학치료제를 단독 투여하는 경우에는 효과미달이다.

본 발명은 또한 CCX-CKR2 활성을 증가시키는 제제 및 혈관신생을 촉진하는 제2 제제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 CCX-CKR2 활성을 감소시키는 제제 및 혈관신생을 감소시키는 제2 제제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 CCX-CKR2 활성을 감소시키는 제제 및 제2 항관절염제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

정의

본원에서 "CCX-CKR2"로 불리는 "RDC1"은 G-단백질 결합된 수용체(GPCR)로 추정되는 7-경막 도메인을 말한다. CCX-CKR2 개 오르소로그(dog ortholog)는 1991년에 처음으로 확인되었다. Libert et al. Science 244: 569-572 (1989) 참고. 상기 개 서열은 Libert et al., Nuc. Acids Res. 18 (7): 1917 (1990)에 개시된다. 마우스 서열은 예를 들어, Heesen et al., Immunogenetics 47: 364-370 (1998)에 개시된다. 인간 서열은 예를 들어, Sreedharan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4986-4990 (1991)에 개시되며, 여기서는 상기 단백질을 혈관작용성 장 펩티드의 수용체로 잘못 개시하였다. "CCX-CKR2"는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9 또는 서열 번호 10과 실질적으로 유사하거나 또는 이들의 보존적으로 변형된 변이체인 서열을 포함한다.

"환자(subject)"는 사람, 마우스, 래트, 개 또는 다른 포유류를 비롯한 동물을 말한다.

"화학치료제"는 개체에 투여될 때 암세포의 성장의 억제, 지연 또는 중지를 야기하기에 충분하거나, 또는 암세포에서 세포독성 효과를 생산하기에 충분한 제제를 말한다. 따라서, "화학치료적 유효량"은 개체에 투여될 때 암세포의 성장을 억제, 지연 또는 중지하기에 충분하거나 암세포에서 세포독성 효과를 생산하기에 충분한 화학치료제의 양을 말한다. "효과미달(sub-therapeutic)의 양"은 암세포의 성장을 억제, 지연 또는 중지하기에 충분한 양보다 적은 양, 또는 암세포에서 세포독성 효과를 생산하기에 충분한 양보다 적은 양의 화학치료제의 양을 말한다.

"항체"는 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자들에 의해 실질적으로 암호화되는 폴리펩티드, 또는 분석물(analyte)(항원)에 특이적으로 결합하고 이를 인식하는 그 단편을 말한다. 확인된 면역글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 입실론 및 뮤 불변 영역 유전자, 및 수많은 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 경쇄는 카파 또는 람다로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 입실론으로 분류되며, 이들은 다시 각각 면역글로불린 분류 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 정의한다.

예시적인 면역글로불린(항체) 구조 단위는 사량체를 포함한다. 각 사량체는 두 개의 동일한 쌍의 폴리펩티드 쇄로 구성되며, 각 쌍은 하나의 "경"쇄(약 25 kD) 및 하나의 "중"쇄(약 50-70 kD)를 가진다. 각 쇄의 N-말단은 항원 인식을 주로 담당하는 약 100 내지 110 또는 그 이상의 아미노산의 가변 영역을 정의한다. 용어 가변 경쇄(V_L) 및 가변 중쇄(V_H)는 각각 이들 경쇄 및 중쇄를 말한다.

항체는 예를 들어, 본래의 면역글로불린으로 존재 하거나, 또는 다양한 펩티다제로 분해하여 생산된 잘 규명된 수많은 단편으로 존재한다. 따라서, 예를 들어, 펩신은 힌지 영역 내의 이황화 결합 아래에서 항체를 분해하여, 이황화 결합에 의해 V_H-C_H1에 연결된 경쇄인, Fab의 이량체인 F(ab)'₂를 생산한다. F(ab)'₂는 부드러운(mild) 조건 하에서 환원되어 힌지 영역 내의 이황화 결합을 절단하여 F(ab)'₂ 이량체를 Fab' 단량체로 전환시킬 수 있다. Fab' 단량체는 본질적으로는 힌지 영역의 일부를 가진 Fab이다(Paul (Ed.) Fundamental Immunology, Third Edition, Raven Press, NY (1993) 참고). 다양한 항체 단편이 본래 항체의 분해 면에서 정의되는 한편, 당업자는 그러한 단편이 화학적으로 또는 재조합 DNA 방법을 이용하여 드 노보(de novo)로 합성될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 본원에서 이용될 때 용어 "항체"는 또한 전체 항체의 변형에 의해 생산되거나 재조합 DNA 방법을 이용하여 드 노보로 합성된(예, 단일쇄 Fv) 항체 단편을 포함한다.

"인간화된" 항체는 실질적으로 비-인간 종으로부터의 면역글로불린에서 유래한 항원 결합 부위 및 인간 면역글로불린의 구조 및/또는 서열에 기초한 분자의 나머지 면역글로불린 구조를 가지는 분자를 말한다. 항원 결합 부위는 불변 도메인 상에 융합된 완전한 가변 도메인 또는 가변 도메인 내의 적절한 골격 영역에 이식된 상보성 결정 영역(CDR)만을 포함할 수 있다. 항원 결합 부위는 야생형이거나 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 변형될 수 있으며, 예를 들어 인간 면역글로불린과 더욱 유사하도록 변형될 수 있다. 인간화된 항체의 일부 형태는 모든 CDR 서열을 보존한다(예를 들어, 마우스 항체로부터의 여섯 개의 CDR 모두를 함유한 인간화된 마우스 항체). 다른 형태의 인간화된 항체는 원래 항체에 대하여 변화된 하나 이상의 CDR(1,2,3,4,5,6)을 가진다.

단백질 또는 펩티드를 말할 때, "항체에 특이적으로(또는 선택적으로) 결합" 또는 "~ 와 특이적으로(또는 선택적으로) 면역반응성인"은 단백질 및 다른 생물학의 이종성 집단의 존재 하에서 단백질의 존재를 결정하는 결합 반응을 말한다. 따라서, 지정된 면역분석 조건 하에서, 특정 항체는 특정 단백질에 결합하며 샘플 내에 존재 하는 다른 단백질에는 유의한 양으로 결합하지 않는다. 그러한 조건 하에서 항체에의 특이적 결합은 특정 단백질에 대한 그 특이성에 대해 선택되는 항체를 필요로 할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 가지는 단백질에 대해 생성된 항체는, 그 단백질과 특 이적으로 면역반응성이며, 서열 번호 2와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 단백질과 같은 다형성 변이체를 제외한 다른 단백질과는 면역반응성이 아닌 항체를 얻기 위해 선택될 수 있다. 다양한 면역분석 포맷을 이용하여 특정 단백질과 특이적으로 면역반응성인 항체를 선택할 수 있다. 예를 들어, 고체상 ELISA 면역분석, 웨스턴 블롯 또는 면역조직화학을 이용하여 단백질과 특이적으로 면역반응하는 모노클로날 항체를 선택한다. 특이적 면역반응성을 결정하기 위하여 이용될 수 있는 조건 및 면역분석 포맷의 설명을 위해 Harlow and Lane Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, NY (1988)을 참고한다. 일반적으로, 특이적 또는 선택적 반응은 배경 시그널 또는 노이즈의 적어도 2배일 것이며 보다 일반적으로는 배경의 10 내지 100배일 것이다.

"리간드"는 수용체에 결합할 수 있는 제제(예, 폴리펩티드 또는 다른 분자)를 말한다.

본원에서 사용될 때, "케모카인 수용체에 결합하는 제제"는 높은 친화성으로 케모카인 수용체에 결합하는 제제를 말한다. "높은 친화성"은 약리학적으로 관련된 반응을 유도하기에 충분한 친화성을 말하며, 예를 들어, 약학적 관련 농도에서(예, 약 10^-5 M 미만의 농도에서) 케모카인 수용체에의 결합을 위해 천연 케모카인 리간드와 크게 경쟁하는 능력을 말한다. 높은 친화성을 가진 일부 예시적인 제제는 10^-6 M 보다 큰, 때로는 10^-7 M , 10^-8 M , 또는 10^-9 M 보다 큰 친화성으로 케모카인 수용 체에 결합할 것이다. 제제가 10^-4 M 미만의 농도로 있을 때 결합을 위해 천연 수용체 리간드와 경쟁하지 못하는 제제는 본 발명의 목적을 위해 "결합하지 않는" 것으로 간주될 것이다.

용어 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 단일 또는 이중 쇄 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 그 중합체를 말한다. 구체적으로 제한되지 않는다면, 상기 용어는 기준 핵산과 유사한 결합 특성을 가지며 천연 발생 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오티드의 공지 유사체를 함유하는 핵산을 포괄한다. 달리 나타내지 않으면, 특정 핵산 서열은 명시된 서열뿐만 아니라 보존적으로 변형된 그 변이체(예, 축퇴 코돈 치환) 및 상보성 서열을 묵시적으로 포함한다. 구체적으로, 축퇴 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 세번째 위치가 혼합된 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 이루어질 수 있다(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985); 및 Cassol et al. (1992); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91-98 (1994)).

용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 나타내기 위해 본원에서 상호교환적으로 이용된다. 상기 용어는 천연 발생 아미노산 중합체 및 비천연 발생 아미노산 중합체뿐만 아니라, 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 천연 발생 아미노산의 인공 화학적 모방체인 아미노산 중합체에 적용된다. 본원에서 이용될 때, 상기 용어는 전장 단백질(즉, 항원)을 비롯한, 임의의 길 이의 아미노산 쇄를 포함하며, 이 때 아미노산 잔기는 공유 펩티드 결합에 의해 연결된다.

용어 "아미노산"은 천연 발생 및 합성 아미노산, 및 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 말한다. 천연 발생 아미노산은 유전자 코드에 의해 암호화되는 것들, 및 나중에 변형되는 아미노산, 예, 히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트 및 O-포스포세린이다. 아미노산 유사체는 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 즉, 수소, 카르복실기, 아미노기 및 R 기에 결합된 α-탄소를 가지는 화합물, 예, 호모세린, 노르루신, 메티오닌 설폭시드, 메티오닌 메틸 설포늄을 말한다. 그러한 유사체는 변형된 R 기(예, 노르루신) 또는 변형된 펩티드 백본을 갖지만, 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 보유한다. "아미노산 모방체"는 아미노산의 일반적인 화학 구조와 상이한 구조를 갖지만 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 화합물을 말한다.

아미노산은 그들의 흔히 알려진 3문자 심볼에 의해, 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회에 의해 추천되는 1문자 심볼에 의해 불릴 수 있다. 유사하게, 뉴클레오티드는 그들의 흔히 허용되는 단문자 코드로 불릴 수 있다.

"서열 동일성의 퍼센티지(%)"는 비교 윈도우 상에 적절히 배열된 두 개의 서열을 비교하여 결정하며, 이 때 비교 윈도우 내의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 적절한 배열을 위하여 기준 서열(추가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 추가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 퍼센티지는 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 두 서열 모두에서 발생하는 위치의 수를 결정하여 매치되는 위치의 수를 얻고, 비교 윈도우 내의 위치의 전체 수에 의해 매치되는 위치의 수를 나누고 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 퍼센티지를 얻는 식으로 계산된다.

둘 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열에서, 용어 "동일한" 또는 퍼센트 "동일성"은 비교 윈도우 상에 최대 일치를 위해 비교 및 배열될 때, 예를 들어, 전체 CCX-CKR2 폴리펩티드의 특정 영역 상에서, 또는 하기의 서열 비교 알고리즘 중 하나를 이용하거나, 또는 수동 배열 및 시각적 관찰에 의해 측정할 때 지정된 영역 상에서, 동일한 둘 이상의 서열 또는 하위서열을 말한다. 선택적으로, 동일성은 적어도 약 50 뉴클레오티드 또는 아미노산 길이인 영역, 더욱 바람직하게는 100 내지 500 또는 1000 또는 그 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산 길이의 영역에 걸쳐 존재한다.

둘 이상의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열에서, 용어 "유사성", 또는 퍼센트 "유사성"은 비교 윈도우 상에 최대 일치를 위해 비교 및 배열될 때, CCX-CKR2 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 특정 영역 또는 전체 서열에서, 또는 하기의 서열 비교 알고리즘 중 하나를 이용하여 또는 수동 배열 및 시각적 관찰에 의해 측정할 때 지정된 영역 상에서, 동일한(즉, 60%, 경우에 따라, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%) 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 특정 퍼센티지를 가지는 둘 이상의 서열 또는 하위서열을 말한다. 경우에 따라, 동일성은 적어도 약 50 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이인 영역, 또는 더욱 바람직하게는 적어도 약 100 내지 500 또는 1000 또는 그 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이 의 영역에 걸쳐 존재한다.

서열 비교를 위하여, 일반적으로 한 서열은 시험 서열이 비교되는 기준 서열로 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 이용할 경우, 시험 및 기준 서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요하면 하위서열 코디네이트를 지정하고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터를 지정한다. 디폴트 프로그램 파라미터를 이용하거나, 다른 파라미터를 지정할 수 있다. 이어서 서열 비교 알고리즘이 프로그램 파라미터에 기초하여, 기준 서열에 대하여 시험 서열을 위한 퍼센트 서열 동일성을 계산한다.

본원에서 이용될 때, "비교 윈도우"는 예를 들어, 전장 서열 또는 20 내지 600, 약 50 내지 약 200, 또는 약 100 내지 약 150 아미노산 또는 뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택된 인접 위치의 수 중 어느 하나의 분절을 말하는 것을 포함하며, 이 때 서열은 두 서열이 적절히 배열된 후 동일한 수의 인접 위치의 기준 서열에 비교될 수 있다. 비교를 위한 서열의 배열 방법이 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 적절한 배열은 예를 들어, Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2: 482c의 국소 상동성 알고리즘에 의해, Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443의 상동성 배열 알고리즘에 의해, Pearson and Lipman (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444의 유사성 조사 방법에 의해, 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 실행에 의해(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group(575 Science Dr., Madison, WI)의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA), 또는 수동 배열 및 시각적 검사에 의해(예, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement)참고) 실시될 수 있다.

퍼센트 서열 동일성과 서열 유사성을 결정하는 데 적합한 알고리즘의 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이며, 이들은 각각 Altschul et al. (1977) Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402, 및 Altschul et al. (1990) J; Mol. Biol. 215: 403-410에 개시된다. BLAST 분석을 실시하기 위한 소프트웨어는 국립 생물공학 정보 센터를 통해 구할 수 있다(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). 이 알고리즘은 먼저 질문 서열에서 길이 W의 짧은 단어들을 확인하여 높은 점수 서열 쌍(HSP)을 확인하는 것에 관련되며, 상기 질문 서열은 데이터베이스 서열 내의 동일한 길이의 단어와 배열될 때 일부 양성 값의 역치 점수 T를 만족하거나 매치된다. T는 이웃 단어 점수 역치로 불린다(상기의 Altschul et al.,). 이들 초기 이웃 단어 히트는 이들을 함유하는 보다 긴 HSP를 찾기 위한 조사를 시작하기 위한 시드로 작용한다. 단어 히트는 축적 배열 점수가 증가될 수 있는 한도까지 각 서열을 따라 양 방향으로 연장된다. 축적 점수는 뉴클레오티드 서열의 경우에는 파라미터 M(한 쌍의 매칭 잔기를 위한 보상 점수; 항상 0보다 큼) 및 N(미스매치 잔기를 위한 패널티 점수; 항상 0보다 작음)을 이용하여 계산된다. 아미노산 서열의 경우, 스코어링 매트릭스를 이용하여 축적 점수를 계산한다. 각 방향에서 단어 히트의 확장은, 축적 배열 점수가 이룰수 있는 그 최대 값으로부터 양 X만큼 떨어질 때; 축적 점수가 하나 이상의 음성-스코어링 잔기 배열의 축적으로 인해 0 이하가 될 때; 또는 어느 서열의 말단에 도달할 때 중단된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X는 배열의 민감성 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열의 경우)은 단어길이(W) 11, 예상치(E) 10, M=5, N=-4 및 두 쇄의 비교를 디폴트로 이용한다. 아미노산 서열의 경 우, BLASTP 프로그램은 단어길이 3, 및 예상치(E) 10, 및 BLOSUM62 스코어링 매트릭스(Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915), 배열(B) 50, 예상치(E) 10, M=5, N=-4, 및 두 쇄의 비교를 디폴트로 이용한다.

BLAST 알고리즘은 또한 두 서열 사이의 유사성의 통계적 분석을 실시한다(예, Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 참고). BLAST 알고리즘에 의해 제공된 유사성의 한 가지 척도는 최소 합 확률(P(N))이며, 이것은 두 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 간의 매치가 우연히 발생할 확률을 나타낸다. 예를 들어, 핵산은 기준 핵산에 시험 핵산을 비교할 때 최소 합 확률이 약 0.2 보다 작으면, 더욱 바람직하게는 약 0.01보다 작으면, 그리고 가장 바람직하게는 약 0.001보다 작으면 기준 서열에 유사한 것으로 간주된다.

두 핵산 서열 또는 폴리펩티드가 실질적으로 동일하다는 것은 후술하는 대로, 첫번째 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드가 두 번째 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드에 대해 생성된 항체와 면역학적으로 교차반응성이라는 것이다. 따라서, 폴리펩티드는 일반적으로 예를 들어, 두 펩티드가 단지 보존적 치환에 의해서만 상이한 경우에 두 번째 폴리펩티드에 실질적으로 동일하다. 두 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 다른 표시는 두 분자 또는 그들의 상보체가 후술하는 대로, 엄격한 조건 하에서 서로 하이브리드하는 것이다. 두 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 또 다른 표시는 동일한 프라이머를 이용하여 서열을 증폭시킬 수 있다는 것이다.

CCX-CKR2 활성의 "조절자(modulator)"를 이용하여 CCX-CKR2 활성을 직접 또는 간접적으로 증가 또는 감소시키며 CCX-CKR2 결합 또는 시그널링을 위한 시험관 내 및 생체내 분석을 이용하여 확인되는 분자를 포함하는 분자를 가리킨다. CCX-CKR2 활성은 예를 들어, CCX-CKR2 폴리펩티드를 아고니스트와 접촉시키거나, 및/또는 일부 경우에는, 세포에서 CCX-CKR2를 발현시킴으로써 증가될 수 있다. 아고니스트는 CCX-CKR2 활성을 증가시키는 분자를 말한다. 아고니스트는 예를 들어, CCX-CKR2에 결합, 자극, 증가, 개방, 활성화, 촉진, 활성화 증진, 민감화 또는 활성을 상향 조절하는 제제이다. 조절자는 CCX-CKR2에의 결합을 위해 SDF-1 및 I-TAC과 같은 공지의 CCX-CKR2 리간드 및 본원에서 개시된 작은 분자와 경쟁할 수 있다.

안타고니스트는 예를 들어, I-TAC 또는 SDF-1과 같은 아고니스트의 결합을 차단함으로써 CCX-CKR2 활성을 억제하는 분자를 말한다. 안타고니스트는 예를 들어, CCX-CKR2에 결합, 부분적으로 또는 완전히 자극을 차단, 감소, 방지, 활성화 지연, 불활성화, 탈민감화, 또는 활성을 하향 조절하는 제제이다. 안타고니스트는 예를 들어 항체 및 작은 유기 분자를 포함한다.

조절자는 예를 들어, CCX-CKR2와 다른 시그널 전달 단백질의 상호작용을 변화시키는 제제를 포함한다. 조절자는 천연 발생 및 합성 리간드, 안타고니스트, 아고니스트, 작은 화학 분자, siRNA 등뿐만 아니라 예를 들어, 변화된 활성을 가진, 천연 발생 케모카인 수용체 리간드의 유전적 변형 버젼을 포함한다. 억제자 및 활성자를 위한 분석은 예를 들어, CCX-CKR2를 발현하는 세포에 추정되는 조절자 화합물을 가하고 이어서 CCX-CKR2 시그널링에 대한 기능적 효과를 결정하거나 리간드(예, SDF-1 또는 I-TAC)가 CCX-CKR2에 결합하는 것에 대한 효과를 결정하는 것을 포함한다. 잠재적인 활성자, 억제자, 또는 조절자로 처리된 CCX-CKR2를 포함하는 샘플 또는 분석을 억제자, 활성자, 또는 조절자가 없는 대조구 샘플과 비교하여 억제 정도를 검사한다. 대조구 샘플(억제자로 미처리)은 100%의 상대적인 케모카인 수용체 활성 값이 주어진다. CCX-CKR2의 억제는 CCX-CKR2 활성 또는 발현 값이 대조구에 비하여 약 95% 미만, 선택적으로 약 90%, 선택적으로 약 80%, 선택적으로 약 50%, 또는 약 25-0% 미만일때 이루어진다. CCX-CKR2의 활성화는 CCX-CKR2 활성 또는 발현 값이 대조구에 비하여 적어도 약 105%, 약 110%, 선택적으로 적어도 약 105%, 약 150%, 선택적으로 적어도 약 105%, 약 200-500%, 또는 적어도 약 105%, 약 1000-3000% 또는 그 이상일 때 이루어진다.

"siRNA"는 유전자 발현의 간섭을 야기할 수 있는 작은 간섭 RNA를 말하며, 세포, 예를 들어, 포유류 세포(인간 세포 포함) 및 신체, 예를 들어, 포유류 신체(인간 포함)에서 특정 유전자의 전사 후 사일런싱을 야기할 수 있다. RNA 간섭 현상은 Bass, Nature 411: 428-29 (2001); Elbahir et al., Nature 411: 494-98 (2001); 및 Fire et al., Nature 391: 806-11 (1998); 및 WO 01/75164호에 개시되며, 간섭 RNA를 만드는 방법 또한 개시된다. siRNA는 일반적으로 이중쇄 RNA 서열을 형성하며, 이 서열은 상동성 전사물의 분해를 야기한다. siRNA의 이중쇄 부분은 예를 들어, 두 개의 별도의 상보성 RNA 서열로부터 또는 헤어핀 구조를 형성하는 하나의 RNA 서열로서 형성될 수 있다. 본원에서 개시된 유전자 생성물을 암호화하는 핵산 및 상기 서열에 기초한 siRNA는 일반적으로 100 미만의 염기쌍을 가지며 예를 들어, 약 30 염기쌍 또는 그보다 짧을 수 있으며, 상보성 DNA 쇄의 이용 또는 합성 방법을 비롯한 공지의 방법에 의해 만들 수 있다. siRNA는 간섭을 야기할 수 있으며 세포, 예를 들어, 포유류 세포(인간 세포 포함) 및 신체, 예를 들어, 포유류 신체(인간 포함)에서 특이적 유전자의 전사 후 사일런싱을 야기할 수 있다. 본 발명에 따른 예시적인 siRNA는 최대 29 염기쌍, 25 염기쌍, 22 염기쌍, 21 염기쌍, 20 염기쌍, 15 염기쌍, 10 염기쌍, 5 염기쌍 또는 그 정도 또는 그 사이의 임의 정수를 가질 수 있다. 적절한 억제성 siRNA를 고안하기 위한 수단은 DNA 엔진 인크.(와싱턴주 시애틀) 및 암비온 인크.(텍사스 오스틴)로부터 구할 수 있는 것을 포함한다.

한 가지 RNAi 기법은 센스 및 안티-센스 서열이 공여체 및 수용체 스플라이싱 부위와 적절한 스플라이싱 배향으로 인트론 서열에 인접한 영역에 위치되는 유전적 구조체를 이용한다. 다르게는, 다양한 길이의 스페이서 서열을 이용하여 구조체내의 서열의 자가-상보성 영역을 분리할 수 있다. 유전자 구조체 전사물의 프로세싱동안, 인트론 서열은 스플라이스에 의해 제거되어, 센스 및 안티-센스 서열 및 스플라이스 연결부 서열이 결합하여 이중쇄 RNA를 형성하도록 한다. 이어서 선택된 리보뉴클레아제가 이중쇄 RNA에 결합하고 절단하여, 특정 mRNA 유전자 서열의 분해 및 특정 유전자의 사일런싱을 야기하는 일련의 사건을 개시한다.

용어 "화합물"은 특정 분자를 가리키며 그 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 다형체 및 염을 포함한다.

본원에서 이용될 때, 용어 "헤테로원자"는 산소(O), 질소(N), 황(S) 및 규소(S)를 포함한다.

용어 "치환된"은 모 분자 또는 기에 결합되는 기를 말한다. 따라서, 메틸 치 환기를 가지는 벤젠 고리는 메틸-치환된 벤젠이다. 유사하게, 5개의 수소 치환기를 가지는 벤젠 고리는 모 분자에 결합될 때 미치환된 페닐기일 것이다.

용어 "치환된 헤테로원자"는 헤테로원자가 치환되는 기를 말한다. 헤테로원자는 수소, 할로겐, 알킬, 알킬렌, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아릴렌, 시클로알킬, 시클로알킬렌, 헤테로아릴, 헤테로아릴렌, 헤테로시클릴, 카르보사이클, 히드록시, 알콕시, 아릴옥시 및 설포닐을 포함하며 이에 한정되지 않는 기 또는 원자로 치환될 수 있다. 대표적인 치환된 헤테로원자는 예를 들어, 시클로프로필 아미닐, 이소프로필 아미닐, 벤질 아미닐 및 페녹시를 포함한다.

용어 "알킬"은 그 자체로서 또는 다른 치환기의 일부로서, 달리 언급되지 않으면, 지정된 수의 탄소 원자를 가지는, 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 라디칼을 의미한다(즉, C_{1 -8}은 1 내지 8 탄소를 의미한다). 알킬 기의 예는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, t-부틸, 이소부틸, sec-부틸, n-펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸 등을 포함한다. 용어 "알케닐"은 하나 이상의 이중 결합을 가지는 불포화 알킬기를 말한다. 유사하게, 용어 "알키닐"은 하나 이상의 삼중 결합을 가지는 불포화 알킬기를 말한다. 그러한 불포화 알킬기의 예는 비닐, 2-프로페닐, 크로틸, 2-이소펜테닐, 2-(부타디에닐), 2,4-펜타디에닐, 3-(1,4-펜타디에닐), 에티닐, 1- 및 3-프로피닐, 3-부티닐, 및 보다 고급의 상동체 및 이성질체를 포함한다. 용어 "시클로알킬"은 표시된 수의 고리 원자를 가지며(예, C_{3 - 6}시클로알킬) 완전히 포화되거나 고리 베르티스(vertice) 사이의 이중 결합을 하나 이하로 가지는 탄화수소 고 리를 말한다. "시클로알킬"은 또한 예를 들어, 비시클로[2.2.1]헵탄, 비시클로[2.2.2]옥탄 등과 같은 비시클릭 및 폴리시클릭 탄화수소 고리를 말하는 것을 의미한다.

용어 "알킬렌"은 그 자체 또는 다른 치환기의 일부로서 -CH₂CH₂CH₂CH₂-에 의해 예시되는 대로, 알칸으로부터 유래된 2가 라디칼을 의미한다. 일반적으로, 알킬(또는 알킬렌)기는 1 내지 24 탄소 원자를 가질 것이며, 10 이하의 탄소 원자를 가지는 기들이 본 발명에서 바람직하다. "저급 알킬" 또는 "저급 알킬렌"은 보다 짧은 쇄 알킬 또는 알킬렌 기이며 대개 4 이하의 탄소 원자를 가진다.

용어 "알케닐"은 선형 또는 분지형이며 적어도 하나 그리고 일반적으로 1,2, 또는 3 탄소-탄소 이중 결합을 가지는 1가 불포화 탄화수소 기를 말한다. 달리 정의되지 않으면, 그러한 알케닐 기는 대개 2 내지 10 탄소 원자를 함유한다. 대표적인 알케닐 기는 예로서 에테닐, n-프로페닐, 이소프로페닐, n-부트-2-에닐, n-헥스-3-에닐 등을 포함한다.

용어 "알키닐"은 선형 또는 분지형이며 적어도 하나 그리고 일반적으로 1,2, 또는 3 탄소-탄소 삼중 결합을 가지는 1가 불포화 탄화수소 기를 말한다. 달리 정의되지 않으면, 그러한 알키닐 기는 대개 2 내지 10 탄소 원자를 함유한다. 대표적인 알키닐 기는 예로서 에티닐, n-프로피닐, n-부트-2-이닐, n-헥스-3-이닐 등을 포함한다.

용어 "아릴"은 달리 언급되지 않으면, 서로 융합되거나 공유 결합되는 단일 고리 또는 다수 고리(최대 3개 고리)일 수 있는 다중불포화된, 대개 방향족의, 탄화수소 기를 의미한다. 용어 "헤테로아릴"은 N, O 및 S로부터 선택되는 1 내지 5개 헤테로원자를 함유하는 아릴 기(또는 고리)를 말하며, 이 때 질소 및 황 원자는 선택적으로는 산화되며, 질소 원자는 선택적으로 사량체화된다. 헤테로아릴 기는 헤테로원자를 통해 또는 탄소 원자를 통해 상기 분자의 나머지에 부착될 수 있다. 아릴 기의 비제한적인 예는 페닐, 나프틸 및 비페닐을 포함하는 한편, 헤테로아릴 기의 비제한적인 예는 1-피롤릴, 2-피롤릴, 3-피롤릴, 1-피라졸릴, 3-피라졸릴, 2-이미다졸릴, 4-이미다졸릴, 피라지닐, 2-옥사졸릴, 4-옥사졸릴, 5-옥사졸릴, 3-이속사졸릴, 4-이속사졸릴, 5-이속사졸릴, 2-티아졸릴, 4-티아졸릴, 5-티아졸릴, 2-푸릴, 3-푸릴, 2-티에닐, 3-티에닐, 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜, 2-피리미딜, 4-피리미딜, 5-벤조티아졸릴, 푸리닐, 2-벤즈이미다졸릴, 벤조피라졸릴, 5-인돌릴, 1-이소퀴놀릴, 5-이소퀴놀릴, 2-퀴녹살리닐, 5-퀴녹살리닐, 3-퀴놀릴 및 6-퀴놀릴을 포함한다. 전술한 아릴 및 헤테로아릴 고리 시스템의 각각을 위한 치환기는 후술하는 허용성 치환기의 그룹으로부터 선택된다.

간단히, 다른 용어와 함께 이용될 때 용어 "아릴"(예, 아릴옥시, 아릴티옥시, 아릴알킬)은 전술한 아릴 및 헤테로아릴 고리 둘다를 포함한다. 따라서, 용어 "아릴알킬"은 아릴 또는 헤테로아릴 기가 알킬 기에 부착된 라디칼(예, 벤질, 페네틸, 피리딜메틸 등)을 포함한다.

용어 "아릴렌"은 단일 고리(즉, 페닐렌) 또는 융합 고리(즉, 나프탈렌디일)를 가지는 2가 방향족 탄화수소를 말한다. 달리 정의되지 않으면, 그러한 아릴렌 기는 대개 6 내지 10 탄소 고리 원자를 함유한다. 대표적인 아릴렌 기는 예로서 1,2-페닐렌, 1,3-페닐렌, 1,4-페닐렌, 나프탈렌-1,5-디일, 나프탈렌-2,7-디일 등을 포함한다.

용어 "아랄킬"은 아릴 치환된 알킬기를 말한다. 대표적인 아랄킬기는 벤질을 포함한다.

용어 "알콕시", "알킬아미노" 및 "알킬티오"(또는 티오알콕시)는 그들의 종래의 의미로 이용되며, 각각 산소 원자, 아미노기, 또는 황 원자를 통해 분자의 나머지에 부착되는 알킬기를 말한다. 추가로, 디알킬아미노기의 경우, 알킬 부분은 동일하거나 상이할 수 있으며 또한 결합되어 질소 원자를 가지는 3-7원 고리를 형성하며 각각이 질소 원자에 부착된다. 따라서, -NR^aR^b로 나타내지는 기는 피페리디닐, 피롤리디닐, 모르폴리닐, 아제티디닐 등을 포함하는 것을 의미한다.

용어 "할로" 또는 "할로겐"은 그 자체로 또는 다른 치환기의 일부로서, 달리 언급되지 않으면, 불소, 염소, 브롬 또는 요오드 원자를 의미한다. 추가로, "할로알킬" 과 같은 용어는 모노할로알킬 및 폴리할로알킬을 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, 용어 "C_{1 - 4}할로알킬"은 트리플루오로메틸, 2,2,2-트리플루오로에틸, 4-클로로부틸, 3-브로모프로필 등을 포함한다.

용어 "시클로알킬"은 단일 고리 또는 융합 고리를 가지는 1가의 포화된 카르보시클릭 탄화수소 기를 말한다. 달리 정의되지 않으면, 그러한 시클로알킬 기는 대개 3 내지 10 탄소 원자를 함유한다. 대표적인 시클로알킬 기는 예로서 시클로프 로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실 등을 포함한다.

용어 "시클로알킬렌"은 단일 고리 또는 융합 고리를 가지는 2가 포화 카르보시클릭 탄화수소 기를 말한다. 달리 정의되지 않으면, 그러한 시클로알킬렌 기는 대개 3 내지 10 탄소 원자를 함유한다. 대표적인 시클로알킬렌 기는 예로서 시클로프로판-1,2-디일, 시클로부틸-1,2-디일, 시클로부틸-1,3-디일, 시클로펜틸-1,2-디일, 시클로펜틸-1,3-디일, 시클로헥실-1,2-디일, 시클로헥실-1,3-디일, 시클로헥실-1,4-디일 등을 포함한다.

용어 "헤테로아릴"은 단일 고리 또는 융합 고리를 가지며, 질소, 산소 또는 황에서 선택된 헤테로원자 적어도 하나(대개 1 내지 3 헤테로원자)를 고리에 함유하는 치환되거나 비치환된 1가 방향족기를 말한다. 달리 정의되지 않으면, 그러한 헤테로아릴기는 대개 5 내지 10개의 전체 고리 원자를 함유한다. 대표적인 헤테로아릴기는 예로서, 피롤, 이미다졸, 티아졸, 옥사졸, 푸란, 티오펜, 트리아졸, 피라졸, 이속사졸, 이소티아졸, 피리딘, 피라진, 피리다진, 피리미딘, 트리아진, 인돌, 벤조푸란, 벤조티오펜, 벤즈이미다졸, 벤즈티아졸, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 퀴나졸린, 퀴녹살린 등의 1가 종을 포함하며, 이 때 부착 점은 임의의 이용가능한 탄소 또는 질소 고리 원자이다.

용어 "헤테로아릴렌"은 단일 고리 또는 융합 고리를 가지며 질소, 산소 또는 황에서 선택된 헤테로원자 적어도 하나(대개 1 내지 3 헤테로원자)를 고리에 함유하는 2가 방향족기를 말한다. 달리 정의되지 않으면, 그러한 헤테로아릴렌기는 대개 5 내지 10개의 전체 고리 원자를 함유한다. 대표적인 헤테로아릴렌기는 예로서, 피롤, 이미다졸, 티아졸, 옥사졸, 푸란, 티오펜, 트리아졸, 피라졸, 이속사졸, 이소티아졸, 피리딘, 피라진, 피리다진, 피리미딘, 트리아진, 인돌, 벤조푸란, 벤조티오펜, 벤즈이미다졸, 벤즈티아졸, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 퀴나졸린, 퀴녹살린 등의 2가 종을 포함하며, 이 때 부착 점은 임의의 이용가능한 탄소 또는 질소 고리 원자이다.

용어 "헤테로시클릴" 또는 "헤테로시클릭기"는 단일 고리 또는 다수의 축합된 고리를 가지며 질소, 산소 또는 황에서 선택된 헤테로원자 적어도 하나(대개 1 내지 3 헤테로원자)를 고리에 함유하는, 치환되거나 비치환된 1가의 포화 또는 불포화(비-방향족) 기를 말한다. 달리 정의되지 않으면, 그러한 헤테로시클릭기는 대개 2 내지 9개의 전체 고리 원자를 함유한다. 대표적인 헤테로시클릭 기는 예로서, 피롤리딘, 모르폴린, 이미다졸리딘, 피라졸리딘, 피페리딘, 1,4-디옥산, 티오모르폴린, 피페라진, 3-피롤린 등의 1가 종을 포함하며, 이 때 부착 점은 임의의 이용가능한 탄소 또는 질소 고리 원자이다.

용어 "카르보사이클"은 고리내의 각 원자가 탄소인 방향족 또는 비방향족 고리를 말한다. 대표적인 카르보사이클은 시클로헥산, 시클로헥센 및 벤젠을 포함한다.

용어 "할로" 또는 "할로겐"은 플루오로-(-F), 클로로-(-Cl), 브로모-(-Br), 및 요오도-(-I)를 말한다.

용어 "히드록시" 또는 "히드록실"은 -OH 기를 말한다.

용어 "알콕시"는 -OR 기를 말하며, 이 때 R은 치환되거나 비치환된 알킬, 알 킬렌, 시클로알킬 또는 시클로알킬렌일 수 있다. 적합한 치환기는 할로, 시아노, 알킬, 아미노, 히드록시, 알콕시 및 아미도를 포함한다. 대표적인 알콕시 기는 예로서, 메톡시, 에톡시, 이소프로필옥시 및 트리플루오로메톡시를 포함한다.

용어 "아릴옥시"는 -OR 기를 말하며, 이 때 R은 치환되거나 비치환된 아릴 또는 헤테로아릴기일 수 있다. 대표적인 아릴옥시기는 페녹시를 포함한다.

용어 "설포닐"은 -S(O)₂- 또는 -S(O)₂R 기를 말하며, 이 때 R은 알킬, 알킬렌, 알케닐, 알키닐, 아릴, 시클로알킬, 시클로알킬렌, 헤테로아릴, 헤테로아릴렌, 헤테로시클릭 또는 할로겐일 수 있다. 대표적인 설포닐기는 예를 들어, 설포네이트, 설폰아미드, 설포닐 할라이드 및 디프로필아미드 설포네이트를 포함한다.

용어 "축합"은 둘 이상의 분자가 공유 결합되는 반응을 말한다. 유사하게, 축합 생성물은 축합 반응에 의해 형성되는 생성물이다.

용어 "헤테로사이클"은 적어도 하나의 황, 질소 또는 산소 헤테로원자를 함유하는 포화되거나 불포화된 비방향족 시클릭기를 말한다. 각 헤테로사이클은 임의의 이용가능한 고리 탄소 또는 헤테로원자에 부착될 수 있다. 각 헤테로사이클은 하나 이상의 고리를 가질 수 있다. 다수 고리가 존재할 경우, 그들은 서로 융합되거나 공유 결합될 수 있다. 각 헤테로사이클은 질소, 산소 또는 황으로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자(대개 1 내지 5 헤테로원자)를 함유해야 한다. 바람직하게는, 이들 기는 0-5 질소 원자, 0-2 황 원자 및 0-2 산소 원자를 함유한다. 더욱 바람직하게는, 이들 기는 0-3 질소 원자, 0-1 황 원자 및 0-1 산소 원자를 함유한 다. 헤테로사이클 기의 비제한적인 예는 피롤리딘, 피페리딘, 이미다졸리딘, 피라졸리딘, 부티로락탐, 발레로락탐, 이미다졸리디논, 히단토인, 디옥솔란, 프탈이미드, 1,4-디옥산, 모르폴린, 티오모르폴린, 티오모르폴린-S,S-디옥시드, 피페라진, 피란, 피리돈, 3-피롤린, 티오피란, 피론, 테트라히드로푸란, 테트라히드로티오펜 등을 포함한다.

상기 용어(예, "알킬", "아릴" 및 "헤테로아릴")은 일부 구체예에서, 나타낸 라디칼의 치환된 형태 및 비치환된 형태 둘 다를 포함할 것이다. 각 타입의 라디칼을 위한 바람직한 치환기가 하기에 제공된다. 간단히, 용어 아릴 및 헤테로아릴은 후술하는 치환되거나 비치환된 버젼을 말하는 한편, 용어 "알킬" 및 관련 지방족 라디칼은 치환된 것으로 표시되지 않으면 비치환된 버젼을 말한다.

알킬 라디칼을 위한 치환기(알킬렌, 알케닐, 알키닐 및 시클로알킬로 종종 불리는 기를 포함)는 0 내지 (2m'+1) 범위의 수로, -할로겐, -OR', -NR'R'', -SR', -SiR'R''R''', -OC(O)R', -C(O)R', -CO₂R', -CONR'R'', -OC(O)NR'R'', -NR''C(O)R', -NR'-C(O)NR''R''', -NR''C(O)₂R', -NH-C(NH₂)=NH, -NR'C(NH₂)=NH, -NH-C(NH₂)=NR', -S(O)R', -S(O)₂R', -S(O)₂NR'R'', -NR'S(O)₂R'', -CN 및 -NO₂로부터 선택된 다양한 기일 수 있으며, 이 때 m'은 그러한 라디칼 내의 탄소 원자의 전체 수이다. R', R'' 및 R'''은 각각 독립적으로 수소, 비치환된 C_{1 - 8}알킬, 비치환된 헤테로알킬, 비치환된 아릴, 1-3 할로겐으로 치환된 아릴, 비치환된 C_{1 - 8}알킬, C_{1 - 8}알콕시 또는 C_{1 - 8} 티오알콕시기, 또는 비치환된 아릴-C_{1 - 4}알킬기를 말한다. R'과 R''이 동일한 질소 원자에 부착될 때, 이들은 질소 원자와 결합되어 3-, 4-, 5-, 6- 또는 7-원 고리를 형성할 수 있다. 예를 들어, -NR'R''은 1-피롤리디닐 및 4-모르폴리닐을 포함한다.

유사하게, 아릴 및 헤테로아릴 기를 위한 치환기는 다양하며 대개 0 내지 방향족 고리 시스템상의 개방 밸런스의 전체 수 범위의 수로, 할로겐, -OR', -OC (O)R', -NR'R", -SR', -R', -CN, -NO₂, -C0₂R', -CONR'R", -C(O)R', -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR"C(O)₂R', -NR'-C(O)NR''R''', -NH-C(NH₂)=NH, -NR'C(NH₂)-NH, -NH-C(NH₂)=NR', -S(O)R', -S(0)₂R', -S(O)₂NR'R'', -NR'S(O)₂R'', -N₃, 퍼플루오로(C₁-C₄)알콕시 및 퍼플루오로(C₁-C₄)알킬로부터 선택되며; 이 때 R', R'' 및 R'''은 각각 독립적으로 수소, C_{1 - 8}알킬, C_{3 - 6}시클로알킬, C_{2 - 8}알케닐, C_{2 - 8}알키닐, 비치환된 아릴 및 헤테로아릴, (비치환된 아릴)-C_{1 - 4}알킬 및 비치환된 아릴옥시-C_{1 - 4}알킬로부터 선택된다. 다른 적합한 치환기는 1-4 탄소 원자의 알킬렌 테터(tether)에 의해 고리 원자에 부착된 상기 아릴 치환기의 각각을 포함한다.

아릴 또는 헤테로아릴 고리의 이웃한 원자 상의 치환기 중 둘은 선택적으로 식 -T-C(O)-(CH₂)_q-U-의 치환기로 대체될 수 있으며, 이 때 T와 U는 독립적으로 -NH-, -O-, -CH₂- 또는 단일 결합이며, q는 0 내지 2의 정수이다. 다르게는, 아릴 또는 헤테로아릴 고리의 이웃한 원자 상의 치환기 중 둘은 선택적으로 식 -A- (CH₂)_r-B-의 치환기로 대체될 수 있으며, 이 때 A와 B는 독립적으로 -CH₂-, -O-, -NH-, -S-, -S (O)-, -S(O)₂-, -S(0)₂NR'- 또는 단일 결합이며, r은 1 내지 3의 정수이다. 그렇게 형성된 새로운 고리의 단일 결합 중 하나는 선택적으로 이중 결합으로 대체될 수 있다. 다르게는, 아릴 또는 헤테로아릴 고리의 이웃한 원자 상의 치환기 중 둘은 선택적으로 식 -(CH₂)_S-X-(CH₂)_t-의 치환기로 대체될 수 있으며, 이 때 s와 t는 독립적으로 0 내지 3의 정수이며, X는 -O-, -NR'-, -S-, -S(O)-, -S(O)₂-, 또는 -S(O)₂NR'-이다. -NR'- 및 -S(O)₂NR'-내의 치환기 R'은 수소 또는 비치환된 C_{1 - 6}알킬로부터 선택된다.

본원에서 이용될 때, 용어 "헤테로원자"는 산소(O), 질소(N), 황(S) 및 규소(Si)를 포함하는 것을 의미한다.

용어 "약학적 허용 염"은 본원에서 개시되는 화합물에서 발견되는 특정 치환기에 따라, 상대적으로 비독성인 산 또는 염기로 제조되는 활성 화합물의 염을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 화합물이 상대적으로 산성인 기능기를 함유할 경우, 순수하거나 적합한 불활성 용매내의 충분한 양의 원하는 염기와 그러한 화합물의 중성 형태를 접촉시켜 염기 첨가 염을 얻을 수 있다. 약학적 허용 무기 염기에서 유래되는 염의 예는 알루미늄, 암모늄, 칼슘, 구리, 제2철, 제1철, 리튬, 마그네슘, 3가 망간, 2가 망간, 칼륨, 나트륨, 아연 등을 포함한다. 약학적 허용 유기염기에서 유래된 염은 치환된 아민, 시클릭 아민, 천연 발생 아민 등을 비롯한 일 차, 이차 및 삼차 아민의 염을 포함하며, 예를 들어, 아르기닌, 베타인, 카페인, 콜린, N,N'-디벤질에틸렌디아민, 디에틸아민, 2-디에틸아미노에탄올, 2-디메틸아미노에탄올, 에탄올아민, 에틸렌디아민, N-에틸모르폴린, N-에틸피페리딘, 글루카민, 글루코사민, 히스티딘, 히드라바민, 이소프로필아민, 리신, 메틸글루카민, 모르폴린, 피페라진, 피페리딘, 폴리아민 수지, 프로케인, 푸린, 테오브로민, 트리에틸아민, 트리메틸아민, 트리프로필아민, 트로메타민 등이 있다. 본 발명의 화합물이 상대적으로 염기성인 기능기를 함유할 경우, 순수하거나 적합한 불활성 용매내의 충분한 양의 원하는 산과 그러한 화합물의 중성 형태를 접촉시켜 산 첨가 염을 얻을 수 있다. 약학적 허용 산 첨가 염의 예는 염산, 브롬산, 질산, 카르본산, 모노히드로젠카르본산, 포스포르산, 모노히드로젠포스포르산, 디히드로젠포스포르산, 황산, 모노히드로젠황산, 요오드화수소산, 또는 인산 등과 같은 무기 산에서 유래한 것들, 및 아세트산, 프로피온산, 이소부티르산, 말론산, 벤조산, 석신산, 수베르산, 푸마르산, 만델산, 프탈산, 벤젠설폰산, p-톨릴설폰산, 시트르산, 타르타르산, 메탄설폰산 등과 같은 상대적으로 비독성인 유기산에서 유래한 염을 포함한다. 알지네이트 등과 같은 아미노산의 염, 및 글루쿠론산 또는 갈락투노르산 등과 같은 유기산의 염 또한 포함된다(예, Berge, S. M., et al, "Pharmaceutical Salts", Journal of Pharmaceutical Science, 1977, 66, 1-19). 본 발명의 일부 특정 화합물은 화합물이 염기 또는 산 첨가 염으로 전환되도록 하는 염기성 및 산성 기능기 둘다를 함유한다.

화합물의 중성 형태는 염과 염기 또는 산을 접촉시키고 종래 방식으로 모 화 합물을 분리함으로써 재생될 수 있다. 화합물의 모 형태는 극성 용매에서의 용해도와 같은 일부 물리적 특성에서 다양한 염 형태와 상이하지만, 염은 본 발명의 목적을 위한 화합물의 모 형태와 등가이다.

염 형태에 더하여, 본 발명은 프로드러그 형태인 화합물을 제공한다. 본원에서 개시된 화합물의 프로드러그는 생리학적 조건 하에서 화학적 변화를 쉽게 일으켜 본 발명의 화합물을 제공하는 화합물이다. 추가로, 프로드러그는 생체외 환경에서 화학적 또는 생화학적 방법에 의해 본 발명의 화합물로 전환될 수 있다. 예를 들어, 프로드러그는 적합한 효소 또는 화학 시약을 가진 경피 패치 저장소에 위치될 때 본 발명의 화합물로 천천히 전환될 수 있다.

본 발명의 일부 화합물은 비용매화 형태 및 수화 형태를 비롯한 용매화 형태로 존재할 수 있다. 일반적으로, 용매화된 형태는 비용매화된 형태와 등가이며 본 발명의 범위내에 포함된다. 본 발명의 일부 화합물은 다수 결정 또는 무정형 형태로 존재할 수 있다. 대개, 모든 물리적 형태는 본 발명에 의해 고려되는 용도를 위해 등가이며 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명의 일부 화합물은 비대칭 탄소 원자(광학 중심) 또는 이중 결합을 보유하며; 라세메이트, 부분입체이성질체, 기하 이성질체, 위치선택이성질체 및 개별 이성질체(예, 별도의 거울상이성질체)는 모두 본 발명의 범위내에 포함된다. 본 발명의 화합물은 또한 그러한 화합물을 구성하는 원자 중 하나 이상에서 원자 동위원소의 비천연 비율을 함유할 수 있다. 예를 들어, 화합물은 예를 들어, 트리튬(³H), 이오딘-125(¹²⁵I) 또는 탄소-14(¹⁴C)와 같은 방사성 동위원소로 방사성표지될 수 있다. 방사성이건 아니건, 본 발명의 화합물의 모든 동위원소 변이체는 본 발명의 범위에 포함된다.

도 1은 시간 함수로서 마우스의 관절 직경을 보여준다. 마우스를 CCX-CKR2 억제제 또는 비히클만으로 처리하였다. *는 P=0.043을 나타낸다(비히클 대(vs.) CCX-CKR2 억제제). **는 P=0.0002를 나타낸다(비히클 대 CCX-CKR2 억제제). ***는 P<0.0001을 나타낸다(비히클 대 CCX-CKR2 억제제).

I. 개요

본 발명은 부분적으로 CCX-CKR2를 조절하는 것이 혈관신생, 상처 치유 및 관절염을 조절한다는 놀라운 발견에 기초한다. 이 발견의 관점에서, 본 발명은 CCX-CKR2를 조절함으로써 환자의 혈관신생 및/또는 상처 치유 및/또는 관절염을 조절하는 방법을 제공한다. 본원에서 보다 상세히 개시된 대로, CCX-CKR2 활성을 조절하는 많은 다른 방법들이 있다.

CCX-CKR2 활성은 예를 들어, 수용체의 활성을 자극하는 아고니스트와 CCX-CKR2를 접촉시켜 상향 조절할 수 있다. 다른 구체예에서는, CCX-CKR2는 환자의 세포에서 발현되고, 선택적으로 CCX-CKR2 아고니스트와 접촉된다. CCX-CKR2 아고니스트의 예는 예를 들어, CCX-CKR2를 활성화시키는 작은 분자와 항체계 분자뿐만 아니라, SDF-1과 I-TAC과 같은 천연 발생 아고니스트를 포함한다.

CCX-CKR2 활성은 예를 들어, CCX-CKR2의 발현을 감소시키거나 또는 안타고니스트와 CCX-CKR2를 접촉시킴으로써 감소될 수 있다. 안타고니스트는 예를 들어, 천연 발생 아고니스트(예, SDF-1 또는 I-TAC)과 경쟁하거나 또는 그들이 CCX-CKR2에 결합하는 것을 방지할 수 있다. 안타고니스트는 작은 유기 분자(예, 본원에서 개시된 것)뿐만 아니라 CCX-CKR2에 결합하는 항체(예, CCX-CKR2에의 결합을 위해 SDF-1 또는 I-TAC과 경쟁하는 것)를 포함하며 이에 한정되지 않는다.

당업자는 CCX-CKR2 활성을 감소시키는 제제가 다른 항혈관신생제 및/또는 화학치료제 또는 방사선 및/또는 다른 항관절염제와 함께 약학 조성물에 배합될 수 있음을 이해할 것이다. 일부 경우에는, 화학치료제 또는 방사성의 양은 항혈관신생제와 조합되지 않고 제공될 경우 효과미달인 양이다. 당업자는 "배합"이 치료의 배합에 관련될 수 있음을 이해할 것이다(즉, 둘 이상의 약이 혼합물로서, 또는 적어도 동시에 또는 적어도 다른 시간에 환자에게 도입되지만 둘 다 동시에 환자의 혈류 내에 있도록 투여될 수 있음).

II . CCX - CKR2 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드

본 발명의 많은 구체예에서, 대상 CCX-CKR2 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 분리하고 재조합 방법을 이용하여 클로닝할 것이다. 그러한 구체예는 예를 들어, 단백질 발현을 위하여 또는 CCX-CKR2 폴리펩티드(예, 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 8 및 서열 번호 10)에서 유래한 변이체, 유도체, 발현 카세트 또는 다른 서열의 생성 동안 CCX-CKR2 폴리뉴클레오티드(예, 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5, 서열 번호 7 및 서열 번호 9)를 분리하기 위하여, 다른 종에서 CCX-CKR2 서열의 분리 또는 검출을 위하여 CCX-CKR2 유전자 발현을 모니터하기 위하여, 예를 들어 CCX-CKR2의 돌연변이를 검출하거나 CCX-CKR2 핵산 또는 CCX-CKR2 폴리펩티드의 발현을 검출하기 위하여 환자에서의 진단 목적을 위하여 이용된다. 일부 구체예에서, CCX-CKR2를 암호화하는 서열은 이종성 프로모터에 작동적으로 연결된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 핵산은 특히 예를 들어, 사람, 마우스, 래트, 개 등을 비롯한 임의의 포유류로부터 얻는다.

일부 경우에, 본 발명의 CCX-CKR2 폴리펩티드는 사람 CCX-CKR2 서열(예, 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 8 및 서열 번호 10)의 세포외 아미노산을 포함하는 반면, 다른 잔기는 변화되거나 존재 하지 않는다. 다른 구체예에서, CCX-CKR2 폴리펩티드는 CCX-CKR2의 리간드-결합 단편을 포함한다. 예를 들어, 일부 경우에는, 단편은 I-TAC 및/또는 SDF-1에 결합한다. 7개의 경막 수용체(그 중 하나가 CCX-CKR2임)의 구조는 공지되어 있으며, 따라서 경막 도메인은 쉽게 결정할 수 있다. 예를 들어, 쉽게 입수할 수 있는 소수성 알고리즘은 G 단백질-결합된 수용체 데이터 베이스(GPCRDB)에서 인터넷에서 찾을 수 있으며, 예를 들어, http://www.gpcr.org/7tm/seq/DR/RDC1_HUMAN.TABDR.html 또는 http://www.gpcr.org/7tm/seq/vis/swac/P25106.html가 있다.

본 발명은 재조합 유전학 분야의 일상적인 기법에 의존한다. 본 발명에 사용되는 일반적인 방법을 개시한 기본 교과서는 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); 및 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., (1994))를 포함한다.

포유류 조직으로부터의 CCX-CKR2를 암호화하는 유전자를 확인하기 위한 적절한 프라이머와 프로브는 본원에서 제공된 서열(예, 서열 번호 1)로부터 유래될 수 있다. PCR의 일반적인 개요를 위해서는, Innis et al. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applicationis, Academic Press, San Diego (1990)를 참고한다.

III . CCX - CKR2 의 조절자

A. 케모카인 수용체의 조절자를 확인하는 방법

많은 상이한 스크리닝 프로토콜을 이용하여 세포에서, 특히 포유류 세포, 그리고 특히 사람 세포에서 CCX-CKR2의 활성 수준 또는 기능을 조절하는 제제를 확인할 수 있다. 일반적인 개념에서, 스크리닝 방법은 예를 들어, CCX-CKR2에 결합시키고, 리간드(예, I-TAC 및/또는 SDF1)가 CCX-CKR2에 결합하거나 CCX-CKR2를 활성화시키는 것을 방지함으로써, CCX-CKR2(또는 그 세포외 도메인)과 상호작용하는 제제를 식별하는 다수의 제제를 스크리닝하는 것에 관련된다. 일부 구체예에서, 제제는 다른 단백질에 대한 상기 제제의 친화성의 적어도 약 1.5, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 300, 500 또는 1000 배의 친화성으로 CCX-CKR2에 결합한다.

1. 케모카인 수용체 결합 분석

일부 구체예에서, CCX-CKR2 조절자는 SDF1 또는 I-TAC과 같은 CCX-CKR2의 리간드와 경쟁하는 분자를 스크리닝함으로써 확인된다. 당업자는 경쟁 분석을 실시하는 방법이 많음을 인식할 것이다. 일부 구체예에서는, CCX-CKR2를 가진 샘플을 표지된 CCX-CKR2 리간드와 예비항온처리하고 이어서 잠재적인 경쟁자 분자와 접촉시킨다. CCX-CKR2에 결합된 리간드의 양의 변화(예, 감소)는 그 분자가 잠재적인 CCX-CKR2 조절자임을 나타낸다.

CCX-CKR2에 결합할 수 있는 제제를 스크리닝함으로써 예비 스크린을 실시할 수 있는데 이는 그렇게 확인된 제제의 적어도 일부는 케모카인 수용체 조절자일 가능성이 있기 때문이다. 결합 분석은 대개 CCX-CKR2를 하나 이상의 시험 제제와 접촉시키고 단백질과 시험 제제가 결합 복합체를 형성하도록 충분한 시간을 허용하는 것을 포함한다. 형성된 임의의 결합 복합체는 많은 확립된 분석 기법을 이용하여 검출할 수 있다. 단백질 결합 분석은 면역조직화학 결합 분석, 유동 혈구계산, 방사성리간드 결합, 유로피움 표지된 리간드 결합, 비오틴 표지된 리간드 결합 또는 CCX-CKR2의 형태를 유지하는 다른 분석을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 그러한 분석에 이용되는 케모카인 수용체는 자연 발현되거나, 클로닝되거나 합성될 수 있다. 결합 분석을 이용하여 아고니스트 또는 안타고니스트를 확인할 수도 있다. 예를 들어, CCX-CKR2를 잠재적인 아고니스트와 접촉시키고 CCX-CKR2 활성을 측정함으로써, CCX-CKR2 활성을 자극하는 분자를 확인할 수 있다.

2. 세포와 시약

본 발명의 스크리닝 방법은 시험관내 또는 세포계 분석으로 실시될 수 있다. 시험관내 분석은 예를 들어, CCX-CKR2를 포함하는 막 분획 또는 전체 세포를 이용하여 실시된다. 세포계 분석은 CCX-CKR2가 발현되는 임의 세포에서 실시될 수 있다.

세포계 분석은 제제 결합 또는 제제에 의한 CCX-CKR2의 활성 조절을 스크린하기 위하여 CCX-CKR2를 함유하는 전체 세포 또는 세포 분획에 관련된다. 본 발명의 방법에 이용될 수 있는 예시적인 세포 타입은 예를 들어, 호중구, 단핵구, 대식세포, 호산구, 호염기구, 비만 세포, 및 T 세포와 B 세포와 같은 림프구와 같은 백혈구, 백혈병, 버키트 림프종, 종양 세포, 내피 세포, 혈관주위세포, 섬유모세포, 심장 세포, 근육 세포, 유방 종양 세포, 난소 암 암종, 자궁 암종, 아교모세포종, 간 세포, 신장 세포, 및 신경 세포와 같은 임의의 포유류 세포, 및 효모를 비롯한 진균 세포를 포함한다. 세포는 일차 세포 또는 종양 세포 또는 다른 타입의 불멸 세포주일 수 있다. 물론, CCX-CKR2는 CCX-CKR2의 내인성 버젼을 발현하지 않는 세포에서 발현될 수 있다.

일부 경우에, 단백질 융합체뿐만 아니라, CCX-CKR2의 단편을 스크리닝에 이용할 수 있다. CCX-CKR2 리간드와 결합을 위해 경쟁하는 분자가 바람직한 경우, 이용되는 CCX-CKR2 단편은 리간드에 결합할 수 있는(예, I-TAC 또는 SDF1에 결합할 수 있는) 단편이다. 다르게는, CCX-CKR2의 임의 단편은 CCX-CKR2에 결합하는 분자를 확인하기 위하여 표적으로 사용될 수 있다. CCX-CKR2 단편은 예를 들어 적어도 20, 30, 40, 50 아미노산의 임의 단편 내지 CCX-CKR2의 하나의 아미노산을 제외한 모두를 함유하는 단백질을 포함할 수 있다. 일반적으로, 리간드-결합 단편은 경막 영역 및/또는 CCX-CKR2의 세포외 도메인의 대부분 또는 모두를 포함할 것이다.

3. 시그널링 또는 부착 활성

일부 구체예에서, CCX-CKR2 활성화에 의해 야기되는 시그널링은 CCX-CKR2 조절자를 확인하기 위하여 이용된다. 케모카인 수용체의 시그널링 활성은 많은 방식으로 결정할 수 있다. 예를 들어, 시그널링은 케모카인 수용체-매개 세포 부착을 검출함으로써 결정할 수 있다. 케모카인과 케모카인 수용체 사이의 상호작용은 인테그린 친화성과 친화력의 변형을 통해 신속한 부착을 야기할 수 있다. 예를 들어, Laudanna, Immunological Reviews 186: 37-46 (2002)를 참고한다.

시그널링은 또한 시클릭 AMP 또는 이노시톨 포스페이트와 같은 2차 메신저를 정성적으로 그리고 정량적으로 결정함으로써 측정할 수 있으며, 인산화 또는 탈인산화 사건 또한 모니터할 수 있다. 예를 들어, Premack, et al. Nature Medicine 2: 1174-1178 (1996) 및 Bokoch, Blood 86: 1649-1660 (1995)를 참고한다.

또한, CCX-CKR2 활성화의 하부의 다른 사건을 또한 모니터하여 시그널링 활성을 결정할 수 있다. 하부 사건들은 케모카인 수용체의 자극의 결과로서 발생하는 활성 또는 확대를 포함한다. 예시적인 하부 사건은 예를 들어, 세포의 상태 변화(예, 정상에서 암 세포로 또는 암세포에서 비암성 세포로)를 포함한다. 세포 반응은 세포의 (예, 내피 세포에의) 부착을 포함한다. 혈관신생에 관련된 확립된 시그널링 캐스캐이드(예, VEGF-매개 시그널링)은 또한 CCX-CKR2 조절자에 의해 야기된 효과에 대해 모니터될 수 있다. 제제가 혈관신생을 촉진하는 능력은 Leung et al. (1989) Science 246: 1306-1309에 개시된 대로, 예를 들어, 병아리 융모막요막에서 평가할 수 있다. 다른 방안은 Rastinejad et al. (1989) Cell 56: 345-355에 개시된 대로, 래트 각막을 이용한 분석을 실시하는 것이다. 다른 분석은 미국 특허 제5,840,693호에 개시된다. 난소 혈관신생 모델을 또한 이용할 수 있다(예, Zimmerman, R. C., et al. (2003) J. Clin. Invest. 112: 659-669; Zimmerman, R. C., et al. (2001) Microvasc. Res. 62: 15-25; 및 Hixenbaugh, E. A., et al. (1993) Anat. Rec. 235: 487-500).

실시예에서 보다 상세히 개시되는 바처럼, CCX-CKR2의 발현은 동일한 조건에서 성장한 CCX-CKR2를 발현하지 않는 세포에 비하여, 저 혈청 조건에서 성장한 CCX-CKR2-발현 세포의 세포 생존을 연장시킨다. 따라서, CCX-CKR2의 안타고니즘은 세포 생존을 감소시키는 것으로 예상되는 한편, 활성화(예, 아고니스트를 통함)는 세포 생존을 증가시키는 것으로 예상된다. 결과적으로, 세포 생존 및 아폽토시스(apoptosis)는 CCX-CKR2 활성을 위한 판독결과로 작용할 수 있다.

광범위한 세포 사멸 및 아폽토시스 분석이 CCX-CKR2의 조절자를 확인하기 위하여 스크리닝 방법에 포함될 수 있다. 일반적으로, 이 타입의 분석은 대개 세포 사멸 또는 아폽토시스의 잠재적 조절자인 시험 화합물의 존재 및 부재하에서, 세포 사멸 또는 아폽토시스를 유도하는 조건에 세포 집단을 노출시키는 것을 포함한다. 이어서 세포 또는 그 추출물을 이용하여 분석을 실시하여 시험 제제의 존재 및 부재하에서 세포 사멸 또는 아폽토시스의 정도를 비교함으로써 세포 사멸 또는 아폽토시스에 대한 시험 제제의 효과를 평가한다. 세포 사멸 또는 아폽토시스에 대해 분석하는 대신, 반대 타입의 분석을 실시할 수 있는 바, 즉, 세포 성장 및 세포 증식과 같은 관련 활성뿐만 아니라 세포 생존에 대해 분석할 수 있다. 구체적인 분석 타입에 관계없이, 일부 분석은 I-TAC 또는 SDF-1과 같은 CCX-CKR2를 활성화시키는 리간드의 존재 하에서 실시된다.

세포 사멸 및 아폽토시스의 특징인 다양한 상이한 파라미터를 본 스크리닝 방법에서 분석할 수 있다. 그러한 파라미터의 예는 유전자 또는 단백질 발현 분석, DNA 단편화, 세포막 조성의 변화, 막 투과성, 사멸-수용체 또는 하부 시그널링 경로의 성분(예, 카스파제)의 활성화, 일반적 스트레스 반응, NF-카파B 활성화 및 미토젠에 대한 반응에 의한 독성 반응을 위한 세포 경로의 활성화 모니터링을 포함하며 이에 한정되지 않는다.

CCX-CKR2가 아폽토시스를 감소시키는 데 있어서 하는 역할면에서, 다른 방법은 아폽토시스 및 세포 사멸의 반대를 분석하는 것으로서, 즉 세포 생존 또는 세포 증식이 검출되는 스크린을 실시하는 것이다. 세포 생존은 예를 들어, 세포가 생존하는 시간의 길이, 원래 세포의 소정의 퍼센티지가 살아있는 시간의 길이, 또는 세포 수의 증가를 모니터링함으로써 검출될 수 있다. 이들 파라미터는 확립된 기술을 이용하여 시각적으로 모니터할 수 있다.

아폽토시스를 평가하기 위한 다른 분석은 아넥신 V(알렉사 플루오르(r)488 염료에 접합됨) 및 프로피듐 이오다이드(PI)(Molecular Probes, Eugene Oregon)으로 세포를 표지하는 것을 포함한다. 적색 형광 핵산-결합 염료인 PI는 살아있는 세포와 아폽토시스 세포에 불투과성이다. PI는 세포 내의 핵산에 단단하게 결합하여 괴사성 세포만을 표지한다. 아넥신 V는 아폽토시스 세포가 포스파티딜세린(PS)을 세포의 외부 표면으로 전좌시키는 사실을 이용한다. 아넥신 V는 PS에 대한 높은 친화성을 가진 인간 항응고제이다. 살아있는 세포가 아닌 아폽토시스 세포는 그들의 외부 표면에서 PS를 발현한다. 아넥신 V(알렉사 플루오르(r)488 염료로 표지됨)는 녹색 형광으로 이들 세포를 표지한다. 이어서 혈광 활성화된 세포 분류기(FACS)에서 세포를 분석하여 적색 및 녹색 채널에서 형광을 평가하며, 아폽토시스 세포(아넥신 양성, PI 음성)는 녹색 채널에서만 형광을 나타내며, 살아있는 세포(아넥신 음성, PI 음성)는 적색 및 녹색 채널에서 낮은 형광을 나타내며, 괴사성 또는 사멸 세포(아넥신 양성, PI 양성)는 적색 및 녹색 채널에서 강한 양성이다.

다른 스크리닝 방법은 일부 조절 단백질의 발현이 CCX-CKR2의 존재 또는 활성화에 의해 유도되는 관찰에 기초한다. 그러한 단백질의 검출은 CCX-CKR2의 활성을 간접적으로 결정하기 위하여 이용될 수 있다. 하기 실시예에서 보다 상세히 개시된 대로, 일련의 ELISA 조사를 실시하여 CCX-CKR2로 형질감염된 세포와 미감염 세포를 위한 세포 배양 배지에서 다양한 분비된 단백질의 상대 농도를 비교하였다. 이들 연구를 통하여 CCX-CKR2가 성장 인자, 케모카인, 메탈로프로테이나제 및 메탈로프로테이나제의 억제자를 비롯한 다양한 조절 단백질의 생산을 야기함을 결정하였다. 따라서, 제공되는 스크리닝 방법의 일부는 시험 제제가 CCX-CKR2에 의한 일부 성장 인자, 케모카인, 메탈로프로테이나제 및 메탈로프로테이나제의 억제자의 생산을 조절하는 지 여부를 결정하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 분석은 한정된 혈청 조건 하에서 성장된 세포(또는 그 추출물)로 실시되며 이는 CCX-CKR2-유도된 단백질의 생산을 증가시키는 것으로 밝혀졌다.

하기 단백질은 검출된 다양한 부류의 단백질의 예 및 각 부류내의 특정 단백질이다: (1) 성장 인자(예, GM-CSF); (2) 케모카인(예, RANTES, MCP-1); (3) 메탈로프로테이나제(예, MMP3); 및 (4) 메탈로프로테이나제의 억제자(예, TIMP-1). 이들 다양한 부류내의 다른 단백질 또한 검출될 수 있다.

이들 구체적 단백질은 공지된 표준 면역학적 검출 방법을 이용하여 검출할 수 있다. 고처리량 포맷에 사용하기에 적합한 한 방법은 예를 들어, 다수웰 플레이트에서 실시되는 ELISA이다. TIMP-1을 검출하기 위한 ELISA 키트는 다코사이토메이션(제품 코드 번호 EL513)에서 구할 수 있다. 전술한 단백질에 특이적으로 결합하는 항체의 공급자의 추가 예는 하기 실시예에 제공된다. 효소인 메탈로프로테이나제와 같은 단백질은 또한 공지의 효소 분석에 의해 검출할 수 있다.

다른 구체예에서, CCX-CK2의 잠재적 조절자는 세포 부착을 조절하는 그들의 능력에 대해 시험된다. 내피 세포 단층에의 종양 세포 부착은 전이성 침입의 모델로서 연구되었다(예, Blood and Zetter, Biovhem. Biophys. Acta, 1032, 89-119 (1990) 참고). 내피 세포의 이들 단층은 림프 혈관구조를 모방하며 다양한 사이토카인 및 성장 인자(예, TNF 알파 및 IL-1베타)로 자극될 수 있다. CCX-CKR2를 발현하는 세포는 정적 부착 분석 및 세포가 생체내 혈관 구조의 힘을 모방하기 위한 유동 조건 하에 있는 분석에서 이 단층에 부착하는 그들의 능력에 대해 평가할 수 있다. 추가로, 부착을 평가하는 분석은 또한 생체내에서 실시될 수 있다(예, von Andrian, U. H. Microcirculation. 3 (3): 287-300 (1996)).

4. 확인

전술한 스크리닝 방법 중 어느 것에 의해 처음에 확인되는 제제는 명백한 활성을 확인하기 위하여 추가로 시험할 수 있다. 바람직하게는 그러한 연구는 적합한 동물 모델로 실시된다. 그러한 방법의 기본 포맷은 초기 스크린 동안 확인된 선도 화합물을 인간을 위한 질환 모델로 작용하는 동물에 투여하고 이어서 질환(예, 암, 심근 경색, 상처 치유, 또는 혈관 신생에 관련된 다른 질환)이 실제로 조절되는지 및/또는 질환 또는 병태가 완화되는지를 결정하는 것을 포함한다. 확인 연구에서 이용되는 동물 모델은 대개 임의의 종류의 포유류이다. 적합한 동물의 구체적 예는 영장류, 마우스, 래트 및 제브라피쉬를 포함하며 이에 한정되지 않는다.

일부 구체예에서, 관절염 동물 모델을 이용하여 CCX-CKR2를 조절하는 제제를 위해 스크린하고/하거나 치료 용도를 확인한다. 예시적인 관절염 동물 모델은 예를 들어, 콜라겐-유도된 관절염(CIA) 동물 모델을 포함한다.

B. CCX-CKR2와 상호작용하는 제제

CCX-CKR2의 조절자(예, 안타고니스트 또는 아고니스트)는 예를 들어, 항체(모노클로날, 인간화 또는 공지의 다른 타입의 결합 단백질), 작은 유기 분자, siRNA, CCX-CKR2 폴리펩티드 또는 그 변이체, 케모카인(SDF-1 및/또는 I-TAC를 포함하지만 한정되지 않음), 케모카인 모방체, 케모카인 폴리펩티드 등을 포함할 수 있다.

CCX-CKR2의 조절자로 시험되는 제제는 폴리펩티드, 당, 핵산 또는 지질과 같은 임의의 작은 화합물 또는 생물학적 실체일 수 있다. 다르게는, 조절자는 케모카인 또는 다른 리간드의 유전자 변형된 버젼, 또는 펩티드모방체 버젼일 수 있다. 일반적으로, 시험 화합물은 작은 화합물 분자 및 펩티드일 것이다. 본질적으로 임의의 화합물은 본 발명의 분석에서 잠재적인 조절자 또는 리간드로 이용될 수 있으나, 수용액 또는 유기(특히, DMSO-계) 용액에 용해될 수 있는 화합물이 이용된다. 분석은 분석 단계를 자동화하고 임의의 편리한 공급원으로부터 분석에 화합물을 제공함으로써 큰 화학 라이브러리를 스크린하도록 설계되며, 대개 여러 분석이 평행하게 실시된다(예, 자동 분석에서 미세적정 플레이트에서 미세적정 포맷으로). 시그마(St. Louis, MO), 알드리치 (St. Louis, MO), 시그마-알드리치 (St. Louis, MO), 플루카 케미카-바이오케미카 어낼리티카(Buchs, Switzerland) 등을 비롯한 많은 화합물 공급사가 있다.

일부 구체예에서, 상기 제제는 1,500 달톤보다 작은 분자량을 가지며, 일부 경우에는 1,000, 800, 600, 500 또는 400 달톤 미만의 분자량을 가진다. 상대적으로 작은 크기의 제제가 바람직할 수 있으며 이는 보다 작은 분자가 분자량이 높은 분자보다 경구 흡수를 비롯한 우수한 약동력학적 특징과 양립할 수 있는 물리화학적 특성을 가질 가능성이 높기 때문이다. 예를 들어, 투과성 및 용해도에 기초할 때 약물로 성공적일 가능성이 적은 제제는 하기와 같이 Lipinski et al.에 의해 개시되었다: 5 개를 초과하는 H-결합 공여체를 가짐(OH와 NH의 합으로 표현됨); 500을 넘는 분자량을 가짐; 5를 넘는 LogP를 가짐(또는 4.15를 넘는 MLogP); 및/또는 10개를 초과하는 H-결합 수용체(N과 O의 합으로 표현됨)를 가짐. 예를 들어, Lipinski et al. Adv Drug Delivery Res 23: 3-25 (1997)를 참고한다. 생물학적 수송자의 기질인 화합물 부류는 대개 규칙에 대해 예외이다.

일부 구체예에서, 고처리량 스크리닝 방법은 많은 잠재적인 치료 화합물(잠재적인 조절자 또는 리간드 화합물)을 함유한 조합 화학 또는 펩티드 라이브러리를 제공하는 것을 포함한다. 그러한 "조합 화학 라이브러리" 또는 "리간드 라이브러리"를 이어서 본원에서 개시된 대로 하나 이상의 분석에서 스크린하여 원하는 특징적인 활성을 나타내는 이들 라이브러리 구성원(구체적인 화학 종 또는 하위부류)을 확인한다. 이렇게 확인된 화합물은 종래의 "선도 화합물"로 작용하거나 그 자체가 잠재적인 또는 실제 치료제로 이용될 수 있다.

조합 화학 라이브러리는 많은 화학 "빌딩 블록"을 배합함으로써, 화학적 합성 또는 생물학적 합성에 의해 생성된 다양한 화학적 화합물의 집합이다. 예를 들어, 폴리펩티드 라이브러리와 같은 선형 조합 화학 라이브러리는 주어진 화합물 길이(즉, 폴리펩티드 화합물 내의 아미노산의 수)에 대해 모든 가능한 방식으로 화학적 빌딩 블록(아미노산) 세트를 배합함으로써 형성된다. 수많은 화학적 화합물을 화학적 빌딩 블록의 그러한 조합 혼합을 통해 합성할 수 있다.

조합 화학 라이브러리의 준비 및 스크리닝은 당업계에 공지되어 있다. 그러한 조합 화학 라이브러리는 펩티드 라이브러리를 포함하며 이에 한정되지 않는다(미국 특허 제5,010,175호, Furka, Vint. J. Pept. Prot. Res. 37: 487-493 (1991) 및 Houghton et al., Nature 354: 84-88 (1991) 참고). 화학적 다양성 라이브러리를 생산하는 다른 화학을 이용할 수 있다. 그러한 화학은 펩토이드(예, PCT 공개 WO 91/19735호), 암호화된 펩티드(예, PCT 공개 WO 93/20242호), 랜덤 바이오-올리고머(예, PCT 공개 WO 92/00091호), 벤조디아제핀(예, 미국 특허 제5,288,514호), 히단토인, 벤조디아제핀 및 디펩티드와 같은 디버소머(diversomer)(Hobbs et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90: 6909-6913 (1993)), 비닐성 폴리펩티드 (Hagihara et al., J. Amer. Chem. Soc. 114: 6568 (1992)),글루코스 스캐폴딩을 가지는 비펩티드성 펩티드모방체(Hirschmann et al., J. Amer. Chem. Soc. 114: 9217-9218 (1992)), 작은 화합물 라이브러리의 유사한 유기 합성(Chen et al., J. Amer. Chem. Soc. 116: 2661 (1994)), 올리고카바메이트 (Cho et al, Science 261: 1303 (1993)), 및/또는 펩티딜 포스포네이트(Campbell et al., J Org. Chem. 59: 658 (1994)), 핵산 라이브러리 (상기한 Ausubel, Berger 및 Sambrook 참고), 펩티드 핵산 라이브러리 (예, 미국 특허 제5,539,083호 참고), 항체 라이브러리(예, Vaughn et al., Nature Biotechnology, 14 (3): 309-314 (1996) 및 PCT/US96/10287호 참고), 탄수화물 라이브러리(예, Liang et al, Science, 274: 1520-1522 (1996) 및 미국 특허 제5,593,853호 참고), 작은 유기 분자 라이브러리(예, 벤조디아제핀, Baum C & EN, Jan 18, page 33 (1993); 이소프레노이드, 미국 특허 제5,569,588호; 티아졸리디논 및 메타티아자논, 미국 특허 제5,549,974호; 피롤리딘, 미국 특허 제5,525,735호 및 제5,519,134호; 모르폴리노 화합물, 미국 특허 제5,506,337호; 벤조디아제핀, 미국 특허 제5,288,514호 등)을 포함하며 이에 한정되지 않는다.

조합 라이브러리의 제조를 위한 장치는 시판된다(예, 357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, MA, 433A Applied Biosystems, Foster City, CA, 9050 Plus, Millipore, Bedford, MA). 또한, 많은 조합 라이브러리 자체가 시판된다(예, ComGenex, Princeton, N. J., Tripos,Inc., St. Louis, MO, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MD 등).

C. 혈관신생의 억제자

CCX-CKR2의 억제자는 예를 들어, 항체 안타고니스트, 펩티드 안타고니스트, siRNA 분자 또는 소분자 안타고니스트를 포함할 수 있다.

항체의 생성은 공지되어 있다. 일부 구체예에서, CCX-CKR2에 특이적인 항체는 그들이 I-TAC 또는 SDF-1과 같은 CCX-CKR2 아고니스트와 경쟁하는 능력에 대해 스크린된다. 항체는 항체 변이체 또는 단편, 단일쇄 항체, 인간화된 또는 인간 항체 등을 비롯한 임의 타입의 면역학적 친화성 제제를 포함한다.

다른 구체예에서, 펩티드 안타고니스트가 제공된다. 펩티드 안타고니스트는 CCX-CKR2와 상호작용하는 펩티드를 식별하기 위한 공지의 디스플레이 기술을 이용하여 쉽게 선택할 수 있다.

다른 구체예에서, siRNA 분자를 이용하여 CCX-CKR2의 발현을 억제한다. 예를 들어, siRNA 서열을 확인하는 방법뿐만 아니라 siRNA 분자의 다양한 조성의 설명을 위해 미국 특허 공개 2004/0019001을 참고한다. 예를 들어, 표적 서열을 표적 서열 내에 함유된, 특정 길이의 모든 단편 또는 하위서열, 예를 들어 23 뉴클레오티드 단편의 리스트로 인실리코에서 분석한다. 바람직한 특징에 대해 그들의 구조를 분석한 후, siRNA 분자를 시험관내, 세포 배양물 또는 동물 모델 시스템에서 스크린하여 가장 활성인 siRNA 분자 또는 표적 RNA 서열 내의 가장 바람직한 표적 부위를 확인한다.

일부 구체예에서, CCX-CKR2의 조절자는 작은 유기 분자이다. 한 구체예에서, 본 발명의 활성 화합물(즉, CCX-CKR2 조절자)은 일반 구조식(I)을 가진다:

상기 식에서,

m은 1 내지 5의 정수이고 벤질 고리를 치환하는 각 Y는 독립적으로 수소, 알킬, 할로 치환된 알킬, 알킬렌, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 시클로알킬렌, 할로겐, 헤테로시클릭, 아릴, 아릴렌, 헤테로아릴, 헤테로아릴렌, 히드록시, 알콕시 및 아릴옥시로 구성되는 군으로부터 선택되며;

n은 0, 1, 2 또는 3 이며;

Z는 -CH- 또는 -N-이며;

R¹과 R²는 각각 독립적으로 알킬 또는 수소이며, 또는 R¹ 및 R²와 함께 Z는 적어도 하나의 질소를 포함하며 선택적으로 하나 이상의 추가의 헤테로원자를 포함하는 5원 또는 6원 고리를 형성하며, 이 때 상기 5원 내지 6원 고리는 알킬, 알케닐, 페닐, 벤질, 설포닐 및 치환된 헤테로원자로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 부로 선택적으로 그리고 독립적으로 치환되며;

R³, R⁴, 및 R⁵는 각각 수소, 알킬, 할로 치환된 알킬, 알킬렌, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 시클로알킬렌, 헤테로시클릭, 아릴, 아릴렌, 헤테로아릴, 헤테로아릴렌, 히드록시, 알콕시 및 아릴옥시로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택되며;

R⁶은 알킬 또는 수소이며,

단, 만일 Z가 질소이고 R¹과 R²가 Z와 함께 모르폴리닐 기를 형성하면, n은 3이고 R³, R⁴ 및 R⁵ 중 적어도 하나는 히드록시, 알콕시 또는 아릴옥시이며, 또는

만일 n=1이면, Z는 탄소이고 R¹과 R²는 -CH₂CH₂NCH₂CH₂-가 아닌 조합이며, 또는

만일 R¹과 R²가 함께 -CH(CH₃)(CH₂)₄-이면, Z는 -CH-이며, 또는

만일 R⁵가 t-부틸이면, R³은 수소이며, 또는

만일 R⁴와 R⁵가 함께 5-원 고리를 형성하면, 페닐 고리에 결합된 원자 중 적어도 하나는 탄소이다.

2002년 12월 20일에 출원된 미국 가출원 제60/434,912호 및 2003년 12월 20일에 출원된 미국 가출원 제60/516,151호를 참고한다.

올레핀을 치환된 페닐 고리에 연결하는 물결 결합은 고리가 R⁶에 대해 시스 또는 트랜스일 수 있음을 강조한다. 바람직한 구체예에서, n은 1,2 또는 3이다. 다른 바람직한 구체예에서, n은 2 또는 3이다. 추가의 바람직한 구체예에서, n은 3이다.

다른 구체예에서, 바람직한 화합물은 일반 구조식 (I)을 가지며, 이 때 R⁶은 수소이다. 추가의 구체예에서, 바람직한 화합물은 일반 구조식(I)을 가지며, 이 때 R⁶은 메틸이다.

다른 구체예에서, 바람직한 화합물은 일반 구조식 (I)을 가지며, 이 때 R³, R⁴ 및 R⁶은 독립적으로 수소, 히드록시, 알킬, 알콕시, 아릴옥시, 및 할로 치환된 알킬이다. 더욱 바람직하게는, R³, R⁴ 및 R⁵는 독립적으로 알콕시 또는 수소이다. 다른 구체예에서, 바람직한 화합물은 일반 구조식 (I)을 가지며, 이 때 R⁴는 수소이고 R³ 및 R⁵는 알콕시(-OR)로서, 트리플루오로메톡시 및 (-OCH₂CF₃)와 같은 트리플루오로알콕시기를 포함한다. 추가 구체예에서, R³은 수소이고 R⁴ 및 R⁵는 알콕시이다. 이들 구체예 중 어느 것에서, 알콕시기는 메톡시(-OCH₃) 또는 에톡시(-OCH₂CH₃)일 수 있다.

다른 구체예에서, 바람직한 화합물은 일반 구조식 (I)을 가지며, 이 때 R⁴와 R⁵는 함께 헤테로시클릭, 아릴 또는 헤테로아릴 고리를 형성한다. 다른 바람직한 구체예에서, R³는 수소이고 R⁴ 및 R⁵는 함께 -O(CH₂)₃0-, -(CH)₄-, 또는 -N(CH)₂N-이다.

다른 구체예에서, 바람직한 화합물은 일반 구조식 (I)을 가지며, 이 때 Z는 질소이고 R¹ 및 R²와 함께 Z는 헤테로아릴 또는 헤테로시클릭 기를 형성한다. 바람직한 구체예에서, 화합물은 일반 구조식 (I)을 가지며, 이 때 Z는 CH이고 R¹ 및 R²와 함께 Z는 헤테로아릴 또는 헤테로시클릭기를 형성한다. 더욱 바람직한 화합물은 일반 구조식 (I)을 가지며, 이 때 Z는 CH이고 R¹ 및 R²와 함께 Z는 질소를 함유한 헤테로시클릭기를 형성한다. 추가 구체예에서, R¹ 및 R²와 함께 Z는 치환되거나 비치환된 모르폴리닐, 피롤리디닐, 피페리디닐 또는 피페라지닐기를 형성한다.

헤테로아릴 또는 헤테로시클릭기를 위한 바람직한 치환기는 알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 아릴, 아랄킬, 헤테로아릴, 알콕시, 히드록시, 헤테로원자, 및 할라이드를 포함한다. 특히 바람직한 구체예에서, 헤테로아릴 또는 헤테로시클릭기는 벤질, 페닐, 메틸, 에틸, 시클로헥실, 메톡시-메틸(-CH₂0CH₃) 또는 시클로헥실-메틸(-CH₂(C₆H₁₁))기로 치환된다.

한 구체예에서, 바람직한 화합물은 일반 구조식 (I)을 가지며, 이 때 R¹ 및 R²와 함께 Z는 알킬- 또는 메톡시-메틸-치환된 피롤리디닐기; 벤질-, 페닐-, 메틸-, 에틸-, 또는 치환된 헤테로원자 치환된 피페리디닐기; 또는 벤질-, 페닐-, 또는 설포닐-치환된 피페라지닐기이다. 특히 바람직한 치환된 헤테로원자기는 알콕시, 아미닐, 시클로알킬 아미닐, 알킬 아미닐, 시클로프로필 아미닐, 이소프로필 아미닐, 벤질 아미닐, 및 페녹시를 포함한다. 바람직하게는, 치환된 헤테로원자는 피페리디닐 고리의 3-위치에 있다.

다른 측면에서, 바람직한 화합물은 일반 구조식 (I)을 가지며, 이 때 R¹ 및 R²와 함께 Z는 하기와 같다:

일반 구조식 (I)을 가지는 바람직한 화합물은 또한 질소 원자로서 Z를 가질 수 있으며, R¹과 R²를 각각 알킬기 또는 메틸기로 가질 수 있으며, 또는 R¹과 R²는 함께 -C(C(O)N(CH₃)₂)(CH₂)₃-를 형성한다.

다른 구체예에서, R¹ 및 R²와 함께 Z는 질소를 포함하며 선택적으로 하나 이상의 추가의 헤테로원자를 포함하는 5-원 고리를 형성한다. 이 구체예에서, n은 바람직하게는 1이며, Z는 바람직하게는 -CH-이다. 특히 바람직한 이 타입의 구체예에서, R¹ 및 R²와 함께 Z는

이며,

이 때, R⁷은 바람직하게는 수소, 알킬, 아릴 또는 아랄킬이다.

다른 바람직한 구체예에서, R⁷은 할로겐화된 벤질 또는 페닐기일 수 있다. 추가의 구체예에서, R⁷은 바람직하게는 수소, 메틸, 에틸, 벤질, 또는 파라-플루오로-페닐이다.

다른 구체예에서, 본 발명의 활성 화합물은 일반 구조식 (II)를 가진다:

이 때, m은 1 내지 5의 정수이며;

벤질 고리를 치환하는 각 Y는 독립적으로 수소, 알킬, 할로 치환된 알킬, 알킬렌, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 시클로알킬렌, 할로겐, 헤테로시클릭, 아릴, 아릴렌, 헤테로아릴, 헤테로아릴렌, 히드록시, 및 알콕시로 구성되는 군으로부터 선택되며;

n은 1, 2 또는 3이며;

R³, R⁴, 및 R⁵는 각각 수소, 알킬, 할로 치환된 알킬, 알킬렌, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 시클로알킬렌, 헤테로시클릭, 아릴, 아릴렌, 헤테로아릴, 헤테로아릴렌, 히드록시, 알콕시 및 아릴옥시로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택된다.

상기 구조 (I)에서처럼, 치환된 페닐 고리에 올레핀을 연결하는 물결 결합은 고리가 시스 또는 트랜스일 수 있음을 강조한다.

다른 구체예에서, 바람직한 화합물은 일반 구조식 (II)를 가질 수 있으며 이 때 n은 3이다. 다른 구체예에서, 바람직한 화합물은 일반 구조식 (II)를 가질 수 있으며, 이 때 R³, R⁴ 및 R⁵는 상기 구조식(I)에 대해 개시된 대로 치환된다. 현재, 특히 바람직한 화합물은 일반 구조식 (II)를 가지며, 이 때 R³, R⁴ 및 R⁵는 알콕시 또는 메톡시이다.

당업계에 공지된 많은 합성 경로를 이용하여 본 발명의 활성 화합물을 합성할 수 있는 한편, 일반 합성 방법은 하기의 반응식 I에 주어진다.

반응식 I에서, 알데히드(2)는 환원성 아민화를 통하여 일차 아민(3)과 축합 반응을 일으킨다. 적합한 일차 아민은 예를 들어, 알드리치(Milwaukee, WI)에서 시판되며, 또는 공지의 화학 경로에 의해 합성될 수 있다.

아민화 반응은 테트라히드로푸란(THF), 디클로로메탄, 또는 메탄올을 비롯한 임의의 적합한 용매에서 환원제로 실시되어 중간체(4)를 형성할 수 있다. 축합 반 응을 위한 적합한 환원제는 소듐 시아노보로하이드라이드(Mattson, et al., J. Org. Chem. 1990, 55, 2552 및 Barney, et al., Tetrahedron Lett. 1990, 31, 5547에 개시됨); 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드(Abdel-Magid, et al., Tetrahedron Lett. 31: 5595 (1990)에 개시됨); 소듐 보로하이드라이드(Gribble; Nutaitis Synthesis. 709 (1987)에 개시됨); 철 펜타카르보닐 및 알콜성 KOH (Watabane, et al., Tetrahedron Lett. 1879 (1974)에 개시됨); 및 BH₃-피리딘 (Pelter, et al., J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1: 717 (1984)에 개시됨)를 포함하며 이에 한정되지 않는다.

중간체(4)에서 화합물(5)로의 전환은 테트라히드로푸란 또는 디클로로메탄과 같은 임의의 적합한 용매에서, 염기 존재 하에서, 적합하게 치환된 아실 클로라이드로 실시될 수 있다. 삼차 아민 염기가 바람직하다. 특히 바람직한 염기는 트리에틸아민과 헌닝 염기를 포함한다.

다르게는, 중간체(4)에서 화합물(5)로의 전환은 또한 1-에틸-3-(3-디메틸부틸프로필) 카보디이미드 또는 디시클로헥실-카보디이미드(B. Neises and W. Steglich, Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 17: 522 (1978)에 개시됨)와 같은 적합한 커플링 제제를 이용하여, 4-N,N-디메틸아미노-피리딘과 같은 촉매의 존재 하 또는 히드록시벤조트리아졸의 존재 하에서(K.Horiki, Synth. Conamura. 7: 251에 개시) 얻어질 수 있다.

한 측면에서, CCX-CKR2의 조절자는 하기 식을 가지는 화합물 및 그 약학적 허용 염 모두이다:

상기에서, 아래첨자 n은 1 내지 3의 정수이며, 기호 R¹은 수소, 할로겐, C_{1 -8}알콕시, C_{1 -8}알킬, C_{1 -8}할로알킬, C_{3 -6}시클로알킬, C_{3 - 6}시클로알콕시, C_{3 -6}시클로알킬 C_{1 -4}알킬 또는 C_{3 -6}시클로알킬 C_{1 -4}알콕시를 나타내며; 기호 R² 및 R³은 각각 C_1-8알킬 및 C_{1 -8}할로알킬로부터 독립적으로 선택되는 구성원이거나, 또는 각각이 부착되어 5 내지 10원 고리를 형성하는 산소 원자와 선택적으로 결합되며, 문자 X는 결합 또는 CH₂를 나타내며; 기호 Ar은 연결된- 또는 융합된 비시클릭 방향족 고리 시스템을 나타내며; 문자 Z는 C_{1 -8}알킬, C_{1 -8}할로알킬, C_{3 -6}시클로알킬, C_{2 -8}알케닐, C_{2 -8}알키닐, -COR^a, -C0₂R^a, -CONR^aR^b, -NR^aCOR^b, -S0₂R^a, -X¹COR^a, -X¹C0₂R^a, -X₁CONR^aR^b, -X¹NR^aCOR^b, -X¹S0₂R^a, -X¹SO₂NR^aR^b, -X¹NR^aR^b, -X¹OR^a 및 -X¹R^a로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 4개의 R⁴ 치환기로 선택적으로 치환된 5-, 6- 또는 7-원 포화 질소 헤테로시클릭 고리를 나타내며, 상기에서 X¹은 C_{1 -4}알킬렌 및 C_{2 -4}알케닐렌으로부터 선택되며, 각 R^a 와 R^b는 독립적으로 수소, C_{1 -8}알킬, C_{1 -8}할로알킬, C_{3 -6}시클로알킬 및 아릴-C_{1 - 4}알킬로부터 선택되며, 상기에서 R⁴ 치환기의 각각의 지방족 부분은

로부터 선택되는 1 내지 3 구성원으로 선택적으로 치환되며, 이 때 각 R^m은 독립적으로 비치환 C_1-6알킬이다.

일부 구체예에서, Z는 하기로부터 선택되며,

상기에서 물결선은 분자의 나머지에 부착되는 지점을 나타낸다.

한 그룹의 구체예에서, Ar은 나프탈렌, 퀴놀린, 벤조티오펜, 이소퀴놀린, 벤조푸란, 인돌, 벤조티아졸, 벤즈이미다졸, 1,4-벤조디옥산, 퀴녹살린 및 나프티리딘으로부터 선택되는 융합된 비시클릭 방향족 고리 시스템이다.

다른 그룹의 구체예에서, Ar은 비페닐(페닐 고리는 화합물의 나머지에의 부착에 대하여 오르소- 메타- 또는 파라-배향으로 연결됨), 5-페닐티아졸릴, 및 5- 또는 6-원 헤테로아릴 부(예, 티아졸릴, 티에닐, 이미다졸릴, 피라졸릴, 푸릴, 옥사졸릴, 피리딜, 피리미디닐, 피라지닐 등)로 치환된 페닐로부터 선택되는 연결된-비시클릭 방향족 고리 시스템이며, 이 때 상기의 각각은 아릴기를 위해 일반적으로 제공되는 것들(상기 참고)로부터 선택되는 1 내지 6 치환기로 선택적으로 치환된다.

일부 구체예에서, 아래첨자 n은 1 또는 2 이다. 다른 구체예에서, 기호 R¹은 수소 또는 C_{1 -8}알콕시를 나타낸다. 또 다른 구체예에서, 기호 R²와 R³은 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, sec-부틸, 이소부틸, tert-부틸, 또는 그들의 C_{1 -4}할로알킬 대응부(예, 트리플루오로메틸, 2,2,2-트리클로로에틸, 3-브로모프로필 등)를 나타낸다.

일부 구체예에서, n은 1 또는 2이며, R¹은 수소 및 C_{1 -8}알콕시로 구성되는 군으로부터 선택되며; 기호 R²와 R³은 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, sec-부틸, 이소부틸, tert-부틸, 및 C_{1 -4}할로알킬로 구성되는 군으로부터 각각 독립적으로 선택되며, X는 CH₂이며, Ar은 나프탈렌, 퀴놀린, 벤조티오펜, 이소퀴놀린, 벤조푸란, 인돌, 벤조티아졸, 벤즈이미다졸, 1,4-벤조디옥산, 퀴녹살린 및 나프티리딘으로 구성되는 군으로부터 선택되는 융합된 비시클릭 방향족 고리 시스템이며, Z는 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 구성원이며:

상기에서 물결선은 화합물의 나머지에 부착되는 지점을 나타내며; R⁴는 C_{1 - 8}알킬, C_{3 -6}시클로알킬, -X¹OR^a 및 -X¹R^a로 구성되는 군으로부터 선택되는 구성원이며, 이 때 X¹은 C_{1 -4}알킬렌 및 C_{2 -4}알케닐렌으로 구성되는 군으로부터 선택되는 구성원이며 R^a는 C_{1 -8}알킬 및 C_{3 -6}시클로알킬로 구성되는 군으로부터 선택된다.

일부 구체예에서, n은 1 또는 2이며; R¹은 수소 및 C_{1 -8} 알콕시로 구성되는 군으로부터 선택되며; R²와 R³은 각각 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, sec-부틸, 이소부틸, tert-부틸 및 C_{1 -4}할로알킬로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택되며; X는 결합이며; Ar은 비페닐, 5-페닐티아졸릴 및 5- 또는 6-원 헤테로아릴 부로 치환된 페닐로 이루어지는 군으로부터 선택되는 치환되거나 비치환된 연결된 비시클릭 방향족 고리 시스템이며; Z는 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 구성원이며:

상기에서 물결선은 화합물의 나머지에 부착되는 지점을 나타내며; R⁴는 C_1-8알킬, C_{3 -6}시클로알킬, -X¹OR^a 및 -X¹R^a로 구성되는 군으로부터 선택되는 구성원이며, 이 때 X¹은 C_{1 -4}알킬렌 및 C_{2 -4}알케닐렌으로 구성되는 군으로부터 선택되는 구성원이며 R^a는 C_{1 -8}알킬 및 C_{3 -6}시클로알킬로 구성되는 군으로부터 선택된다.

전술한 화합물이 SDF-1 및 I-TAC 케모카인을 위한 유용한 안타고니스트임을 증명하기 위하여, 상기 화합물을 시험관내에서 스크린하여 그들이 다수 농도에서 CCX-CKR2 수용체로부터 SDF-1 및 I-TAC를 대체하는 능력을 결정하였다. 상기 화합물을 ¹²⁵I-표지된 SDF-1 및/또는 ¹²⁵I I-TAC 케모카인의 존재 하에서 CCX-CKR2 수용체 부위를 발현하는 유선 세포와 배합시켰다. 상기 화합물이 다수 농도에서 CCX-CKR2 수용체 부위로부터 표지된 SDF-1 또는 I-TAC를 대체하는 능력을 이어서 스크리닝 과정에서 결정하였다.

효과적인 SDF-1 및 I-TAC 안타고니스트로 보이는 화합물은 1.1 마이크로몰(μM) 이하 및 바람직하게는 300 나노몰(nM) 이하의 농도에서 CCX-CKR2 수용체로부 터 SDF-1 및/또는 I-TAC 케모카인의 적어도 50%를 대체할 수 있었다. 일부 경우에, 화합물이 200 nM 이하의 농도에서 CCX-CKR2 수용체로부터 SDF-1 및/또는 I-TAC의 적어도 50%를 대체할 수 있는 것이 바람직하다. 이들 기준을 만족하는 예시적인 화합물은 하기의 표 I 및 II에서 재생산된다. 또한 2004년 9월 29일에 출원된 미국 특허 공개 제2004/0171655호 및 미국 가출원 제60/614,563호를 참고한다.

분자 CCX7923(PCT/US02/38555 참고)은 시판되며 공지의 방법에 의해 N-[3-(디메틸아미노)프로필]-N,N-디메틸-1,3-프로판디아민을 브로모메틸-비시클로(2,2,1)헵트-2-엔과 축합시켜 만들 수 있다. CCX0803(PCT/US02/38555 참고)은 시판되며 공지 방법에 의해 3-(2-브로모에틸)-5-페닐메톡시-인돌과 2,4,6-트리페닐피리딘을 축합시켜 만들 수 있다. 예를 들어, Organic Function Group Preparations, 2nd Ed. *Vol. 1, (S. R. Sandler & W. Karo 1983); Handbook of Heterocyclic Chemistry (A. R. Katritzky, 1985); Encyclopedia of Chemical Technology, 4th Ed. (J. I. Kroschwitz, 1996)를 참고한다. 본 발명의 일부 구체예에서, CCX7923은 CCX-CKR2의 조절자로 포함되지 않는다.

IV . 아고니스트

CCX-CKR2의 아고니스트는 항체, 케모카인 단편, 펩티드 모방체, 및 작은 유기 분자 아고니스트뿐만 아니라 SDF-1 및 I-TAC과 같은 천연 발생 아고니스트를 포함한다. 아고니스트는 본원에서 개시된 대로 표준 라이브러리 스크리닝을 이용하여 CCX-CKR2 활성을 증가시키는 분자를 식별하기 위하여 선택될 수 있다.

V. 환자에서 CCX - CKR2를 발현

일부 구체예에서, CCX-CKR2는 환자에서 발현되어 혈관신생을 촉진한다. 일부 경우에, CCX-CKR2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 시험관내에서 세포 내로 도입하고 세포를 환자에게 도입한다. 이들 경우 중 일부에서, 세포를 먼저 환자로부터 분리하고 이어서 폴리뉴클레오티드를 도입한 후 환자에 재도입한다. 다른 구체예에서는, CCX-CKR2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 직접 생체내에서 환자의 세포 내로 도입한다.

일부 경우에, CCX-CKR2-암호화 폴리펩티드를 (i) 관심 조직, (ii) 조직 내로 도입된 외인성 세포, 또는 (iii) 조직 내에 있지 않은 이웃 세포로부터의 세포 내로 도입한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 내피 세포 내로 도입한다. 내피 세포가 연합된 조직은 내피의 이동 또는 확장을 증진하는 것이 필요한 임의의 조직이다.

유사하게, CCX-CKR2의 발현을 억제하기 위하여 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입할 수 있다. 일반적으로 이들 폴리뉴클레오티드는 CCX-CKR2 전사 또는 RNA 안정성을 억제하도록 고안된 안티센스 또는 siRNA 구조체를 포함할 것이다. 그러한 폴리뉴클레오티드는 CCX-CKR2 폴리뉴클레오티드의 전달과 유사한 수단에 의해 전달될 수 있다.

종래의 바이러스 및 비-바이러스 계 유전자 전달 방법을 이용하여 본 발명의 조작된 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포유류 세포 또는 표적 조직 내로 도입할 수 있다. 그러한 방법을 이용하여 본 발명의 폴리펩티드(예, CCX-CKR2)를 암호화하는 핵산을 시험관내에서 세포에 투여할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 생체내 또는 생체외 유전자 치료 용도를 위해 투여한다. 비-바이러스 벡터 전달 시스템은 DNA 플라스미드, 네이키드(naked) 핵산, 및 리포좀과 같은 전달 비히클과 복합된 핵산을 포함한다. 바이러스 벡터 전달 시스템은 DNA 및 RNA 바이러스를 포함하며, 이들은 세포에 전달된 후 에피좀 또는 통합된 게놈을 가진다. 유전자 치료 과정의 개요를 위하여, Anderson, Science 256: 808-813 (1992); Nabel & Felgner, TIBTECH 11: 211-217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11: 162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11: 167-175 (1993); Miller, Nature 357: 455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6 (10): 1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8: 35-36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1): 31-44 (1995); Haddada et al., in Current Topics in Microbiology and Immmzology Doerfler and Bohm (eds) (1995); 및 Yu et al., Gene Therapy 1: 13-26 (1994)를 참고한다.

본 발명의 조작된 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 비-바이러스 전달 방법은 리포펙션, 미세주입, 입자총법, 비로좀, 리포좀, 면역리포좀, 폴리케이션 또는 지질:핵산 접합체, 네이키드 DNA, 인공 비리온, 및 제제-증진된 DNA 흡수를 포함한다. 리포펙션은 예를 들어, 미국 특허 제5,049,386호, 제4,946,787호 및 제 4,897, 355호에 개시되며 리포펙션 시약은 시판된다(예, Transfectam^TM 및 Lipofectin^TM). 폴리뉴클레오티드의 효율적인 수용체-인식 리포펙션에 적합한 양이온성 및 중성 지질은 Felgner, WO 91/17424호, WO 91/16024호의 것들을 포함한다. 전달은 세포(생체외 투여) 또는 표적 조직(생체내 투여)에일 수 있다.

면역지질 복합체와 같은 표적화된 리포좀을 비롯한 지질:핵산 복합체의 제조는 공지되어 있다(예를 들어, Crystal, Science 270: 404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2: 291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5: 382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5: 647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2: 710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res. 52: 4817-4820 (1992); 미국 특허 제4,186,183호, 4,217,344호, 4,235,871호, 4,261,975호, 4,485,054호, 4,501,728호, 4,774,085호, 4,837,028호, 및 4,946,787호를 참고한다).

본 발명의 조작된 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 전달을 위해 RNA 또는 DNA 바이러스계 시스템을 사용하는 것은 바이러스를 신체내의 특정 세포에 표적화하고 핵으로 바이러스 적재물을 보내는 고도의 발전된 과정을 이용한다. 바이러스 벡터는 직접 환자에게(생체내) 투여되거나 시험관내에서 세포를 치료하기 위해 이용될 수 있으며 변형된 세포를 환자에게(생체외) 투여한다. 본 발명의 폴리펩티드 전달을 위한 종래의 바이러스계 시스템은 유전자 전달을 위한 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연합 및 허피스 심플렉스 바이러스 벡터를 포함한다. 바이러스 벡터는 현재 표적 세포와 조직에서 유전자 전달의 가장 효율적이고 유용한 방법이다. 숙주 게놈 내로의 통합은 레트로바이러스, 렌티바이러스, 및 아데노-연합 바이러스 유전자 전달 방법에서 가능하며, 종종 삽입된 트랜스유전자의 장기 발현을 야기한다. 추가로, 고 형질도입 효율이 많은 상이한 세포 타입 및 표적 조직에서 발견되었다.

레트로바이러스의 트로피즘(tropism)은 외래 외피 단백질을 통합시키고, 표적 세포의 잠재적인 표적 집단을 확장시킴으로써 변형될 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 비-분열 세포를 형질도입 또는 감염시킬 수 있으며 대개 높은 바이러스 역가를 생산하는 레트로바이러스 벡터이다. 따라서, 레트로바이러스 유전자 전달 시스템의 선택은 표적 조직에 의존할 것이다. 레트로바이러스 벡터는 최대 6-10 kb 의 외래 서열에 대한 패키징 능력을 가진 시스-작용성 긴 말단 반복물로 구성된다. 최소의 시스-작용성 LTR은 벡터의 복제 및 패키징에 충분하며, 이어서 이것을 이용하여 치료 유전자를 표적 세포 내로 통합시켜 영구적인 트랜스유전자 발현을 제공한다. 널리 이용되는 레트로바이러스 벡터는 래트 백혈병 바이러스(MuLV), 기본(gibbon) 원숭이 백혈병 바이러스(GaLV), 시미안 면역결핍 바이러스(SIV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 및 그 조합에 기초한 것을 포함한다(예, Buchscher et al., J. Virol. 66: 2731-2739 (1992); Johann et al., J viral 66: 1635-1640 (1992); Sommerfelt et al., Virol. 176: 58-59 (1990); Wilson et al., J. Virol. 63: 2374-2378 (1989); Miller et al., J; Virol. 65: 2220-2224 (1991); PCT/US94/05700호 참고).

본 발명의 폴리펩티드의 일시적 발현이 바람직한 경우, 아데노바이러스계 시스템이 일반적으로 이용된다. 아데노바이러스계 벡터는 많은 세포 타입에서 매우 높은 형질도입 효율을 가질 수 있으며 세포 분열을 필요로 하지 않는다. 그러한 벡터를 이용하여, 높은 역가 및 발현 수준을 얻었다. 이 벡터는 상대적으로 간단한 시스템에서 대량으로 생산될 수 있다. 아데노-연합 바이러스("AAV") 벡터는 또한 예를 들어 핵산 및 펩티드의 시험관내 생산에서, 그리고 생체내 및 생체외 유전자 치료 과정을 위해, 표적 핵산으로 세포를 형질도입하기 위하여 이용된다(예를 들어, West et al., Virology 160: 38-47 (1987); 미국 특허 제4,797,368호; WO 93/24641호; Kotin,Human Gene Therapy 5: 793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94: 1351 (1994) 참고). 재조합 AAV 벡터의 구성은 미국 특허 제5,173, 414호; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5: 3251-3260 (1985); Tratschin, et al., Mol. Cell.Biol. 4: 2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81: 6466-6470 (1984); 및 Samulski et al., J; Virol. 63: 03822-3828 (1989)과 같은 많은 문헌에 개시된다.

pLASN 및 MFG-S는 임상 시험에 이용되었던 레트로바이러스 벡터의 예이다(Dunbar et al., Blood 85: 3048-305 (1995); Kohn et al., Nat. Med. 1: 1017-102 (1995); Malech et al., PNAS 94: 22 12133-12138 (1997)). PA317/pLASN은 유전자 치료 시험에 이용된 첫번째 치료 벡터이다(Blaese et al., Science 270: 475-480 (1995)). 50% 이상의 형질도입 효율이 MFG-S 패키지된 벡터에 대해 관찰되었다(Ellem et al., Immunol Immunother. 44(1): 10-20 (1997); Dranoff et al., Hum. Gene Ther. 1: 111-2 (1997)).

재조합 아데노-연합 바이러스 벡터(rAAV)는 결함이 있는 비병원성 파보바이러스 아데노-연합 타입 2 바이러스에 기초한 전도 있는 대안 유전자 전달 시스템이다. 모든 벡터는 트랜스유전자 발현 카세트에 인접한 AAV 145 bp 역 말단 반복물만을 보유한 플라스미드로부터 유래된다. 형질도입된 세포의 게놈 내로의 통합으로 인한 효율적인 유전자 전달 및 안정한 트랜스유전자 전달이 이 벡터 시스템의 핵심 특징이다(Wagner et al., Lancet 351: 9117 1702-3 (1998), Kearns et al., Gene Tl2er. 9: 748-55 (1996)).

복제-결핍 재조합 아데노바이러스 벡터(Ad)는 트랜스유전자가 Ad E1a, E1b, 및 E3 유전자를 대신하도록 조작될 수 있으며, 이어서 복제 결핍 벡터가 결실된 유전자 기능을 트랜스로 공급하는 사람 293 세포에서 증식된다. Ad 벡터는 생체내에서 간, 신장 및 근육 시스템 조직에서 발견되는 것과 같은 비분열, 분화된 세포를 비롯한 다수 타입의 조직을 형질도입시킬 수 있다. 종래의 Ad 벡터는 큰 운반 용량을 가진다. 임상 시험에서 Ad 벡터의 사용의 예는 근육내 주사를 이용한 항종양 면역화를 위한 폴리뉴클레오티드 치료와 관련되었다(Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7: 1083-9 (1998)). 임상 시험에서 유전자 전달을 위해 아데노바이러스 벡터를 이용하는 추가의 예는 Rosenecker et al., Infection 24: 1 5-10 (1996); Sterman et al., Hum. Gene Ther. 9: 7 1083-1089 (1998); Welsh et al., Hum. Gene Ther. 2: 205-18 (1995); Alvarez et al., Hum. Gene Ther. 5: 597-613 (1997); Topf et al., Gene Ther. 5: 507-513 (1998); Sterman et al., Hum. Gene Ther: 7: 1083-1089 (1998)를 포함한다.

패키징 세포는 숙주 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스 입자를 형성하기 위하여 이용된다. 그러한 세포는 아데노바이러스를 패키지하는 293 세포, 및 레트로바이러스를 패키지하는 ψ2 세포 또는 PA317 세포를 포함한다. 유전자 치료에 이용되는 바이러스 벡터는 대개 핵산 벡터를 바이러스 입자내로 패키지하는 생산자 세포주에 의해 생성된다. 상기 벡터는 대개 패키징 및 후속되는 숙주내로의 통합에 필요한 최소의 바이러스 서열을 함유하며, 다른 바이러스 서열은 발현될 단백질을 위한 발현 카세트에 의해 대체된다. 손실된 바이러스 기능은 패키징 세포주에 의해 트랜스로 공급된다. 예를 들어, 유전자 치료에 이용되는 AAV 벡터는 대개 패키징 및 숙주 게놈 내로의 통합에 필요한, AAV 게놈으로부터의 ITR 서열만을 보유한다. 바이러스 DNA는 다른 AAV 유전자, 즉 rep 및 cap을 암호화하지만 ITR 서열이 없는 헬퍼 플라스미드를 함유하는 세포주에서 패키지된다. 상기 세포주는 또한 헬퍼로서 아데노바이러스로 감염된다. 헬퍼 바이러스는 AAV 벡터의 복제를 촉진하며 헬퍼 플라스미드로부터 AAV 유전자의 발현을 촉진한다. 헬퍼 플라스미드는 ITR 서열의 결핍으로 인해 많은 양으로 패키지되지 않는다. 아데노바이러스에 의한 오염은 예를 들어, AAV보다 아데노바이러스가 더 민감한 열처리에 의해 감소될 수 있다.

많은 유전자 치료 용례에서, 유전자 치료 벡터는 높은 특이성으로 특정 조직 타입에 전달되는 것이 바람직하다. 바이러스 벡터는 대개 리간드를 바이러스 코트 단백질과의 융합 단백질로서 바이러스 외부 표면에 발현시킴으로써 주어진 세포에 대한 특이성을 갖도록 변형된다. 상기 리간드는 관심 세포 타입에 존재 하는 것으로 알려진 수용체에 대해 친화성을 갖도록 선택된다. 예를 들어, Han et al., PNAS 92: 9747-9751 (1995)은 몰로니 래트 백혈병 바이러스가 변형되어 gp70에 융합된 인간 헤레굴린을 발현할 수 있으며, 재조합 바이러스가 인간 상피 성장 인자 수용체를 발현하는 인간 유방암 세포를 감염시킴을 보고하였다. 이 원리는 리간드 융합 단백질을 발현하는 다른 바이러스쌍 및 수용체를 발현하는 표적 세포로 확장될 수 있다. 예를 들어, 필라멘트성 파아지는 사실상 임의의 선택된 세포 수용체에 대해 특이적 결합 친화성을 가지는 항체 단편(예, FAB 또는 Fv)를 디스플레이하도록 조작될 수 있다. 상기 개시내용은 주로 바이러스 벡터에 적용되지만, 동일한 원리가 비바이러스 벡터에 적용될 수 있다. 그러한 벡터는 특정 표적 세포에 의한 흡수에 유리한 것으로 생각되는 특정 흡수 서열을 함유하도록 조작될 수 있다.

유전자 치료 벡터는 대개 전신성 투여(예, 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 또는 두개내 주입) 또는 후술하는 국소 도포에 의해 개별 환자에게 투여되어 생체내로 전달될 수 있다. 다르게는, 벡터는 개인 환자로부터 적출된 세포(예, 림프구, 골수 흡입물, 조직 생검) 또는 유니버셜 공여체 조혈 줄기세포로부터 얻어진 세포와 같은 세포에 엑스 비비로 전달되고, 이어서 벡터를 통합한 세포를 선택한 후 상기 세포를 환자내로 재이식할 수 있다.

진단, 연구, 또는 유전자 치료를 위한 생체외 세포 형질감염(예, 형질감염된 세포의 숙주 유기체내로의 재융합을 통해)이 공지되어 있다. 바람직한 구체예에서, 세포는 개체 유기체로부터 분리되고, 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산(유전자 또는 cDNA)로 형질감염되고, 개체 유기체(예, 환자) 내로 재주입된다. 생체외 형질감염을 위한 적합한 다양한 세포 타입이 공지되어 있다(예를 들어, Freshney et al., Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique (3rd ed. 1994) 및 환자로부터 세포를 분리하고 배양하는 방법에 대해서는 그 안에 인용된 문헌을 참고).

한 구체예에서, 줄기 세포는 세포 형질감염 및 유전자 치료를 위한 생체외 과정에 이용된다. 줄기 세포를 이용하는 이점은 그들이 시험관내에서 다른 세포 타입으로 분화될 수 있거나 또는 포유류(예, 세포의 공여체)로 도입되어 골수에 이식될 수 있다는 것이다. 시험관내에서 CD34+ 세포를 GM-CSF, IFN-γ 및 TNF-α와 같은 사이토카인을 이용하여 임상적으로 중요한 면역 세포 타입으로 분화시키는 방법이 공지되어 있다(Inaba et al., J Exp. Med. 176: 1693-1702 (1992) 참고).

공지 방법을 이용한 형질도입 및 분화를 위해 줄기 세포를 분리한다. 예를 들어, 줄기 세포는 CD4+ 및 CD8+(T 세포), CD45+(panB 세포), GR-1(과립구) 및 Iad(분화된 항원 제시 세포)와 같은 원치 않는 세포에 결합하는 항체를 이용하여 골수 세포를 패닝시켜 골수 세포로부터 분리한다(Inaba et al., J Exp. Med. 176: 1693-1702 (1992) 참고).

치료적 핵산을 함유한 벡터(예, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 리포좀 등)를 또한 생체내에서 세포의 형질도입을 위한 유기체에 직접 투여할 수 있다. 다르게는, 네이키드 DNA를 투여할 수 있다. 투여는 분자를 혈액 또는 조직 세포와 궁극적으로 접촉시키기 위해 도입하는 데 일반적으로 이용되는 경로 중 어느 것에 의해 이루어진다. 그러한 핵산을 투여하는 적합한 방법은 이용가능하며 공지되어 있으며, 하나의 특정 조성물을 투여하기 위하여 둘 이상의 경로를 이용할 수 있지만, 구체적인 경로는 종종 다른 경로보다 즉각적이고 효과적인 반응을 제공할 수 있다.

약학적 허용 담체는 조성물을 투여하기 위해 이용되는 구체적인 방법에 의해서뿐만 아니라 투여될 구체적 조성물에 의해 부분적으로 결정된다. 따라서, 후술하는 바처럼, 본 발명의 약학 조성물의 다양한 적합한 제제가 있다(예, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1989 참고).

VII . 질병 및 질환의 치료

A. 혈관신생의 증가

본 발명은 혈관 신생 증가를 필요로 하는 임의의 환자에서 본원에서 개시된 대로 혈관신생을 증가시키는 것을 고려한다. 혈관신생 증가는 예를 들어, 염증성 질환, 심장 질환, 예, 재협착, 심장 허혈, 심근 경색 및 말초 혈관 질환(예, 당뇨병에서)을 치료하는 것뿐만 아니라 상처, 골절, 및 화상의 치유에 유용할 수 있다. 혈관신생의 증진은 또한 예를 들어, 발작, 불임, 피부경화증의 치료 및 사지, 손가락 및 기관의 미세수술 및 재부착에 유용할 수 있다.

B. 혈관신생의 감소

본 발명은 혈관신생 감소를 필요로 하는 임의의 환자에서 본원에서 개시된 대로, 혈관신생을 감소시키는 것을 고려한다. 예를 들어, CCX-CKR2 활성을 감소시켜 혈관신생을 감소시키는 것은 종양, 특히 고형 종양의 형성, 성장 및/또는 전이를 억제하는 데 유용하다. 종양의 예는 미국 특허 제5,945,403호에 개시된 대로, 암종, 선암종, 림프종, 육종, 및 기타 고형 종양; 백혈병과 같은 혈액성 종양; 종양 전이; 비악성 종양, 예를 들어, 혈관종, 속귀신경집종, 신경섬유종, 트라코마, 및 화농육아종을 포함한다. 일부 경우에는, 혈관신생은 예를 들어, 암종, 신경아교종, 중피종 흑색종, 림프종, 백혈병, 선암종, 유방암, 난소암, 경부암, 아교모세포종, 백혈병, 림프종, 전립선암, 및 버키트 림프종, 두경부암, 결장암, 결장직장암, 비-소세포 폐암, 소세포 폐암, 식도암, 위암, 췌장암, 간쓸개암, 담낭암, 소장암, 직장암, 신장암, 방광암, 전립선암, 음경암, 요도암, 고환암, 경부암, 질암, 자궁암, 난소암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 췌장 내분비암, 카르시노이드암, 골암, 피부암, 망막모세포종, 호킨스 림프종, 비호킨스 림프종을 가지는 환자에서 본 발명의 방법에 따라 감소된다(추가 암에 대해서는 CANCER: PRINCIPLES AND PRACTICE(DeVita, V.T. et al. eds 1997 참고).

원치않는 또는 문제성 혈관신생에 관련된 다른 질환은 류마티스 관절염; 건선; 안구 혈관신생 질환, 예, 당뇨병성 망막병증, 미숙아의 망막병증, 반상 변성, 각막 이식 거부, 신생혈관 녹내장, 수정체뒤 섬유증식, 피부홍조; 오슬러-베버 증후군; 심근 혈관신생; 플라크 혈관생성; 모세혈관확장증; 혈우병 관절; 혈관섬유종; 내피 세포의 과다한 또는 비정상적 자극의 질환, 예, 장 부착, 크론병, 건선, 엑세마(excema), 및 피부경화와 같은 피부 질환, 당뇨병, 당뇨병성 망막병증, 미숙아의 망막병증, 연령-관련 반상 변성, 아테롬성경화증, 피부경화증, 상처 육아 및 비대 흉터, 즉, 흉터종, 및 고양이 긁힘 질환 및 궤양(헬리코박터 파이로리)과 같은 병리학적 결과로서 혈관신생을 가지는 질환을 포함한다. 혈관신생 억제자를 이용하여 부착, 특히 개방 또는 복강경 수술 후 발생하는 것 및 엉덩이 수축과 같은 복강내 또는 골반 부착을 방지하거나 억제할 수 있다. 혈관신생 억제자를 이용하여 유익하게 치료되는 다른 병태는 이식 후 흉터, 간의 경변, 급성 호흡곤란 증후군 후의 폐 섬유증 또는 신생아의 다른 폐 섬유증, 임시 보철기구의 이식, 및 뇌와 경질막 사이의 수술 후 부착의 방지를 포함한다. 자궁내막증, 폴립증, 심장 비대증, 및 비만 또한 혈관신생의 억제에 의해 치료될 수 있다. 이들 질환은 자궁 섬유증, 전립선 비대증, 및 아밀로이드증과 같은 정상 조직의 다른 타입의 크기 또는 성장의 증가와 관련될 수 있다. CCX-CKR2의 조절자를 본원에서 개시된 질환 또는 질병의 임의의 것을 위해 예방학적으로 또는 치료학적으로 이용할 수 있다.

CCX-CKR2 활성을 감소시키는 것은 또한 많은 질환을 효과적으로 치료하기 위해 혈관신생의 방지에 이용될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 혈관신생의 감소는 혈관의 질환(예, 혈관종, 및 아테롬성경화증 플라크 내의 모세관 증식), 근육 질환(예, 심근 혈관신생, 심근 경색 또는 평활근 내의 혈관신생), 관절(예, 관절염, 혈우병 관절 등), 및 혈관신생과 관련된 다른 질환을 위한 치료의 일부로 이용될 수 있다. 혈관신생의 촉진은 또한 다양한 생리학적 과정의 가속 및 상처, 골절 및 화상의 치유, 염증 질환, 심장 허혈, 및 말초 혈관 질환의 치유와 같은 혈관생성 증가를 필요로 하는 질환의 치료를 도울 수 있다.

하기의 실시예에서 개시된 대로, CCX-CKR2의 안타고니스트는 또한 상처 치유를 증가시키기 위해 이용될 수 있다. 본 발명을 특정 작용 기작에 한정시킴없이, CCX-CKR2의 안타고니즘은 내인성 리간드가 보다 낮은 친화성의 수용체에 결합하도록 하여 상처 치유를 증가시키도록 할 수 있다. 예를 들어, SDF-1은 CCX-CKR2 및 CXCR4에 결합하지만, 보다 낮은 친화성으로 CXCR4에 결합한다. 유사하게, I-TAC은 I-TAC이 CCX-CKR2에 결합하는 것보다 낮은 친화성으로 CXCR3에 결합한다. 이들 리간드가 CCX-CKR2에 결합하는 것을 방지함으로써, CCX-CKR2 안타고니스트는 리간드가 다른 수용체에 결합하도록 하여 상처 치유를 증가시킨다. 따라서, CCX-CKR2가 상처 치유를 증가시키는 안타고니즘은 아고니스트를 이용하여 CCX-CKR2 활성을 자극함에 의해 상처 치유를 증가시키는 것과 상이한 기작에 의해 매개될 수 있다.

신혈관형성과 관련된 질환 및 증상을 치료하는 것과 별도로, 혈관신생의 억제는 신혈관형성과 관련된 정상적인 생리학적 병태의 발생을 조절하거나 방지하기 위해 이용될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본 발명 방법은 피임 방법으로 이용될 수 있다. 본 발명에 따라, 난소 또는 자궁내막내에서 CCX-CKR2 활성을 감소시키면 배란, 배 착상, 태반 형성 등과 관련된 신혈관형성을 약화시킬 수 있다.

혈관신생의 조절자는 또 다른 치료 용도를 가진다. 따라서, 본 발명의 CCX-CKR2 조절자를 하기를 위해 이용할 수 있다:

(a) 지방 조직 절제 및 비만 치료. 예를 들어, Kolonin et al., Nature Medicine 10 (6): 625-632 (2004) 참고;

(b) 전자간증의 치료. 예를 들어, Levine et al., N.Engl. J. Med. 350 (7): 672-683 (2004); Maynard, et al., J. Clin. Invest. 111 (5): 649-658 (2003) 참고.

(c) 심장혈관 질환의 치료. 예를 들어, March, et al., Am. J. Physical. Heart Circ.Physiol. 287: H458-H463 (2004); Rehman et al., Circulation 109: 1292-1298 (2004) 참고.

VIII . 투여 및 약학 조성물

본 발명의 약학 조성물은 약학적 허용 담체를 포함할 수 있다. 약학적 허용 담체는 조성물을 투여하기 위해 이용되는 구체적 방법에 의해서뿐만 아니라, 투여될 구체적 조성물에 의해 부분적으로 결정된다. 따라서, 본 발명의 약학 조성물의 다양한 적합한 제제가 있다(예, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. 1985 참고).

투여에 적합한 제제는 항산화제, 완충액, 세균정지제, 및 제제를 등장성이 되게 하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 용액, 등장 멸균 용액, 및 현탁제, 가용화제, 증점제, 안정화제, 및 방부제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다. 본 발명의 실시에서, 조성물은 예를 들어, 경구로, 비강으로, 국소로, 정맥내로, 복강내로, 피하로, 또는 경막 내로 투여될 수 있다. 화합물의 제제는 앰퓰 및 바이알과 같은, 단위 투여량 또는 다중-투여량 밀봉 용기로 제시될 수 있다. 용액 및 현탁액은 전술한 종류의 멸균 분말, 과립, 및 정제로부터 제조될 수 있다. 조절자는 또한 제조된 음식 또는 약의 일부로 투여될 수 있다.

조성물은 예를 들어, 인슐린 또는 화학치료를 특이적 기관 또는 종양에 전달하기 위해 이용되는 타입의 주입 펌프에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 시린지 또는 카테터를 이용하여 직접 종양내로 또는 절개 전 또는 절개 후 일차 종양 부위에서 주사되거나; 또는 일차 종양의 절개 후 전신성으로 주사될 수 있다. 본 발명의 조성물은 필요에 따라 국소로 또는 국부로 투여될 수 있다. 연장된 국소 투여의 경우, 효소를 종양 부위에서 주사된 서방성 임플란트에 투여할 수 있다. 피부 병태의 국소 치료의 경우, 효소 제제는 연고 또는 젤로 피부에 투여될 수 있다.

단독으로 또는 다른 적합한 성분과 함께, CCX-CKR2 의 발현 또는 활성의 조절자(예, 아고니스트 또는 안타고니스트)는 흡입을 통해 투여되는 에어로졸 제제로 만들어질 수 있다(즉, "분사"될 수 있다). 에어로졸 제제는 디클로로디플루오로메탄, 프로판, 질소 등과 같은 가압된 허용성 추진체내에 위치될 수 있다.

일부 경우에, 본 발명의 CCX-CKR2 조절자는 예를 들어, 화학치료제, 방사선 등을 비롯한 다른 적절한 치료제와 함께 투여될 수 있다. 조합 치료에 사용하기에 적절한 제제의 선택은 종래의 약학 원리에 따라 당업자에 의해 만들어질 수 있다. 치료제의 조합은 상승적으로 작용하여 예를 들어, 암, 상처, 신장 장애, 뇌 장애 또는 신경 장애와 같은 다양한 질환의 치료 또는 예방을 일으킬 수 있다. 이 방법을 이용하여, 각 제제의 보다 낮은 투여량으로 치료 효능을 이루고 따라서 해로운 부작용 가능성을 감소시킬 수 있다.

본 발명의 내용에서 환자에게 투여될 투여량은 시간에 따라 환자에서 유익한 반응을 일으키기에 충분해야 한다(예, 종양 크기 또는 종양 로드를 감소). 모든 환자를 위한 적절한 투여 수준은 이용되는 구체적인 조절자의 효능, 환자의 연령, 체중, 물리적 활동, 및 식사를 비롯한 다양한 인자에 의존할 것이며, 다른 약물과의 가능한 조합, 및 구체적 질환의 심각성에 의존할 것이다. 투여량의 크기는 또한 특정 환자에서 구체적 화합물 또는 벡터의 투여에 수반되는 임의의 해로운 부작용의 존재, 특성 및 정도에 의해 결정될 것이다.

투여될 조절자의 유효량을 결정함에 있어서 의사는 조절자의 순환 혈장 수준, 조절자 독성, 및 항조절자 항체의 생산을 평가할 수 있다. 일반적으로, 조절자의 투여량 등가물은 일반적인 환자를 위해 약 1 ng/kg 내지 10 mg/kg이다.

투여의 경우, 본 발명의 케모카인 수용체 조절자는 조절자의 LD-50 및 환자의 무게 및 전체 건강에 적용되는 대로, 다양한 농도에서 조절자의 부작용에 의해 결정된 비율로 투여될 수 있다. 투여는 단일 또는 분할 투여량을 통해 이루어질 수 있다.

IX . 조합 치료

CCX-CKR2의 억제자는 단독으로 또는 하나 이상의 다른 약물과 함께 공급될 수 있다. 가능한 조합 파트너는 예를 들어, 추가의 항혈관신생 인자 및/또는 화학치료제(예, 세포독성제) 또는 방사선, 암 백신, 면역조절제, 항혈관제, 시그널 전달 억제제, 항증식제, 또는 아폽토시스 유도자를 포함할 수 있다.

CCX-CKR2의 억제자는 인테그린 연합을 차단하는 항체 및 펩티드, 메탈로프로테이나제를 억제하는 단백질 및 작은 분자(예, 마르미스타트), 내피 세포 내에서 인산화 캐스캐이드를 차단하는 제제(예, 허바마이신), 혈관신생의 공지 유도자에 대한 주요 음성 수용체, 혈관신생의 유도자에 대한 항체 또는 그들의 활성을 차단하는 다른 화합물(예, 수라민), 또는 다른 수단에 의해 작용하는 다른 화합물(예, 레티노이드, IL-4, 인터페론 등)과 함께 이용될 수 있다. 사실, 그러한 인자는 다른 기작에 의해 혈관신생을 조절할 수 있으므로, 다른 항혈관신생제와 함께 CCX-CKR2의 억제자를 이용하는 것은 원하는 조직 내에서 혈관신생의 보다 강력한(그리고 잠재적으로 상승적인) 억제를 강화할 수 있다.

MMP-2(매트릭스-메탈로프로테이나제 2) 억제제, MMP-9(매트릭스-메탈로프로테이나제 9) 억제제, 및 COX-II(시클로옥시게나제 II) 억제제와 같은 항혈관신생제를 본원에서 개시된 CCX-CKR2의 억제제 및 약학 조성물과 함께 이용할 수 있다. CCX-CKR2의 억제제는 또한 EGFR 항체, EGF 항체, 및 EGFR 억제자인 분자와 같은, EGFR(상피 성장 인자 수용체) 반응을 억제할 수 있는 제제; VEGF 수용체 및 VEGF를 억제할 수 있는 분자와 같은 VEGF(혈관 내피 성장 인자) 억제제; 및 erb2 수용체에 결합하는 유기 분자 또는 항체, 예, HERCEPTIN^TM(Genentech, Inc., South San Francisco, Calif., USA)과 같은 erbB2 수용체 억제제와 같은 시그널 전달 억제제와 함께 이용될 수 있다.

CCX-CKR2 활성을 증가 또는 감소시키는 분자는 또한 혈관신생 및/또는 상처 치유를 촉진하는 약물을 비롯한 다른 약물과 함께 배합될 수 있다. 당업자는 조성물이 혈관신생을 필요로 하는 원하는 부위에 도포될 때 혈관신생 반응을 추가로 강화하고, 및/또는 치유 과정을 가속하고 및/또는 유익하게 변형하는 제제와 같은, 의학수술적으로 유용한 물질 또는 치료제 하나 이상을 포함시킬 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 혈관신생, 회복 및/또는 조직 성장을 추가로 촉진하기 위해, 여러 호르몬, 성장 인자 또는 유사분열 단백질 중 적어도 하나를 조성물에 포함시킬 수 있으며, 예를 들어, 섬유아세포 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 대식세포 유래 성장 인자 등이 있다. 또한, 항균제를 조성물에 포함시킬 수 있으며, 예를 들어, 젠타마이신 설페이트, 또는 에리트로마이신과 같은 항생제가 있다. 다른 의학수술적으로 유용한 제제는 항염증제, 진통제, 마취제, 루비파시엔트, 효소, 항히스타민제 및 염료를 포함할 수 있다.

CCX-CKR2 활성을 감소시키는 분자는 또한 관절염 치료 약물을 비롯한 다른 약물과 배합될 수 있다. 그러한 제제의 예는 항염증성 치료제를 포함한다. 예를 들어, 프레드니솔론 및 메틸프레드니솔론과 같은 글루코코르티코스테로이드가 종종 이용되는 항염증 약물이다. 비스테로이드 항염증 약물(NSAID) 또한 염증을 억제하기 위해 이용된다. NSAID는 염증 부위에서 과량으로 생산되는 프로스타글란딘의 생산에 핵심인 시클로옥시게나제(COX) 효소, COX-1 및 COX-2를 억제한다. 또한, 염증 촉진 사이토카인, 종양 괴사 인자 α(TNFα)는 관절염을 비롯한 다수의 염증 사건과 관련되며, 항-TNF α 치료가 임상적으로 이용되고 있다.

하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위해 제공되며 제한하기 위한 것이 아니다.

실시예 1

SDF-1/CXCR4 케모카인-수용체 쌍은, SDF-1이 다른 수용체를 통해 기능하는 것으로 보고되지 않았으며 CXCR4를 위한 추가의 리간드가 확인되지 않아 오랫동안 배타적인 상호작용을 공유하는 것으로 간주되었다(Zlotnik, A., and Yoshie, O., Immunibty12: 121-127 (2000)에서 리뷰됨). 이것은 두 유전자의 유전적 녹-아 웃(knock-out)이 배의 사멸을 야기한다는 사실에 의해 지지된다(Nagasawa, T. et al. Nature 382,635-638 (1996); Yong-Rui Zou, etal. Natrure 393: 595-599 (1998)).

SDF-1 및 CXCR4 생물학을 평가하기 위한 노력에서, 본 발명자들은 몇몇 다른 세포 타입에서 이 수용체 리간드 쌍을 평가하였다. 처음에는 FACS 분석에 의해 결정된 대로 몇몇 종양 세포 타입에서 수용체 발현을 평가하기 시작했다. 4가지 시판 항체인 클론 12G5, 171, 172 및 173을 다수 세포주에서 시험하였다. 흥미롭게도, 시험된 유방종양 세포주는 CXCR4를 발현하는 것으로 보고되었음에도 불구하고, 본 발명자들이 가진 발현된 CXCR4 메시지는 상이한 세포 타입에서 다르게 반응하였다. 정상 인간 IL-2 배양된 림프구(PBMC)와 함께, 시험된 T 세포주인 CEM-NKr 및 Jurkat는 클론에 대해 모두 반응하였다. 하지만, 두 가지 유방 종양주인 MCF-7 및 MDA MB-231은 널리 이용되는 항-CXCR4 클론 12G5와 반응하지 않고 단지 다른 항체들과 약하게(T 세포에 비하여) 반응하였다. 다른 유방 종양주인 MDA MB 435s를 포함시켰다. 이 세포주는 CXCR4 mRNA를 발현하지 않으며, 예상대로 항체 중 어느 것도 표면상의 CXCR4를 인식하지 않는다. 따라서, MCF-7 및 MDA MB231 세포에서 CXCR4 메시지를 검출하는 능력에도 불구하고, 항-CXCR4 항체는 T 세포에 비교할 때 이들 세포에서 변형된 반응성을 나타냈다.

본 발명자들의 DisplaceMax^TM 기술(Dairaghi DJ, et al, J Biol Chem, 274 (31): 21569-21574 (1999))을 이용하여 리간드 결합 프로파일을 검사하여 이들 세 포에서 SDF-1 수용체 발현을 조사하였다. 시그너쳐 리간드 결합으로서 ¹²⁵I SDF-1α를 이용하여 90가지가 넘는 케모카인 요소로 조사하였다. 예상대로, SDF-1(마우스 및 인간; 인간 형태는 SDF-1α 및 SDF-1β로 불리는 두 가지의 다르게 스플라이스된 단백질 형태를 가짐) 및 HHV8 암호화된 케모카인 vMIP-II만이 CEM-NKr상의 표지된 SDF-1와 결합을 위해 경쟁하였다. 놀랍게도, MCF-7에서의 결합 프로파일은 크게 바뀌었다. SDF-1 및 vMIP-II 가 SDF-1 추적물을 대체할 뿐만 아니라, 이들 세포 상에서, I-TAC(마우스 및 인간)은 SDF-1과 결합을 위해 경쟁하는 능력을 나타냈다. 이어서 이들 유방 종양 세포 상의 추적물로서 표지된 I-TAC를 시험하고 동일한 리간드 시그너쳐를 생산하였다. 유일한 보고된 I-TAC 수용체는 CXCR3이다(Cole KE, et al., J Exp Med. 187 (12): 2009-21 (1998)). 흥미롭게도, 두 가지 다른 보고된 CXCR3 리간드인 MIG와 IP-10은 여기서 표지된 SDF-1을 대체하지 않는다. 따라서, MCF-7 세포에서 발현된 그 수용체에의 SDF-1의 결합은 리간드 특이성 면에서 CEM-NKr상에 발현된 것과 상이하다.

CEM-NKr 및 MCF-7에서 발현된 SDF-1 수용체에 대한 변형된 리간드 결합 프로파일을 고려하여, 두 세포 타입에 대한 리간드의 친화성을 검사하였다. CEM-NKr에서 차가운 SDF-1α 또는 SDF-1β와의 ¹²⁵I SDF-1α의 상동성 경쟁은 낮은 nM 범위의 IC50 값을 야기하였다(각각 1 nM 및 1.5 nM). 하지만, CEM-NKr과 대조적으로, MCF-7 세포는 nM 이하의 SDF-1 수용체 친화성을 나타냈다. 더욱이, I-TAC은 낮은-nM 친화성으로 MCF-7상의 방사성표지된 SDF-1α 결합에 대해 경쟁할 수 있다. 추가로, SDF-1 및 I-TAC이 MCF-7 세포에 발현되고 CEM-NKr에 발현되지 않는 수용체에 특이적으로 결합하는 능력을 억제하는 작은 분자를 개발하였다. CCX700으로 불리며 표 I 및 II에 예시된 이 분자 시리즈는 방사성표지된 SDF-1 및 I-TAC이 낮은 nM 친화성으로 MCF-7 세포에 결합하는 것을 특이적으로 억제한다. 하지만, CEM-NKr 상의 동일한 화합물은 SDF-1의 이들 세포에의 결합에 영향을 미치지 않는다. 더욱이, CXCR4에 결합하는 것으로 문헌에 개시된 화합물(AMD3100)인 홀마크 SDF-1 수용체는 CEM-NKr에의 SDF-1 결합을 억제하지만 SDF-1의 MCF-7 세포에의 결합에는 효과가 없다. 따라서, MCF-7 세포 상에 발현된 SDF-1 수용체는 변화된 리간드 결합 특이성 및 친화성을 나타내며 이 수용체는 CEM-NKr에 발현된 SDF-1 수용체와 약리학적으로 구별된다.

MCF-7과 비교할 때 CEM-NKr상에 발현된 SDF-1 수용체의 상이한 특성을 고려하여, 이 수용체가 CXCR4와 구별되는 유전자일 가능성을 조사하기 시작하였다. 문헌을 조사하고 몇몇 고아(orphan) GPCR을 평가한 후 마침내 새로운 SDF-1 결합 특성을 책임지는 유전자를 확인하였다. CCX-CKR2로 불리는 이 유전자는, CXCR4 또는 CCX-CKR2를 원래 발현하지 않는 세포주(MDA MB 435s)에서 발현될 때, 이전에 검출되었던 홀마크 결합 프로파일을 반복한다. CCX-CKR2 MDA MB 435s 세포에서, ¹²⁵I SDF-1은 결합하며 SDF-1 및 I-TAC은 각각 nM 이하 및 낮은 nM 친화성으로 경쟁한다. 추가로, 본 발명의 CCX-CKR2 안타고니스트 시리즈 CCX700(표 I 및 II에 예시됨)은 이들 세포 상의 결합에 대해 경쟁할 수 있으나, 널리 이용되는 AnorMed로부 터의 CXCR4 안타고니스트는 이들 세포 상의 ¹²⁵I SDF-1 결합에 영향을 주지 않는다. 따라서, CEM-NKr과 비교하여 MCF-7 세포에서 본 발명자들이 검출했던 결합 이상은 CCX-CKR2로 불리는 별도의 유전자로 여기서 확인된 추가의 SDF-1 수용체에 의해 설명된다.

진단으로서 방사성 리간드 결합 분석을 이용하여, CCX-CKR2를 발현하는 다수의 종양 세포 타입을 확인하였다. 이들 세포 타입은 표 3에 열거된다. 흥미롭게도, 이 수용체는 드문 예외를 가지고서 정상 세포보다는 종양 세포에서 우선적으로 발현되는 것으로 나타난다. 정상 세포 공급원으로서 마우스 기관을 이용하여, 정상 성인 신장, 정상 성인 뇌 및 태아 간의 일부 단계를 제외한, 시험된 모든 기관 균질물에서 CCX-CKR2 발현을 검출할 수 없다. 성인 신장 및 뇌에서 발현 수준은 방사성-리간드 결합 시그널에 의해 결정된 대로 낮다. 대조적으로 이 수용체는 배 발생의 11일 내지 13일에 태아 간에서 높이 발현된다. 하지만, E15에서 사라지며 E17에서 검출될 수 없다. 따라서, CCX-CKR2는 발생동안 태아 간에서 우선적으로 발현되며 이어서 다시 종양 세포에서 발현된다.

CCX-CKR2는 종양에서 널리 발현되지만, 정상 세포에서는 발현되지 않음.

CCX - CKR2 양성	CCX - CKR2 음성
인간 유방 암종(MCF-7, MDA MB 361)	정상 인간 PBMC
인간 아교모세포종(T98G)	인간 T 세포 백혈병(MOLT4, Jurkat, CEM-Nk)
인간 전립선 암종(LN Cap)	비자극 내피 세포
인간 B 세포 림프종(Raji, IM9)	마우스 가슴샘
인간 난소 암종(HeLa)	마우스 폐
인간 폐 암종(A549)	마우스 심장
마우스 유방 암종(4T1)	마우스 PBL
마우스 췌장 상피 세포, SV40 형질전환됨(SVR)	마우스 간
마우스 B 세포 림프종(BCL1)	마우스 전체 성인 골수
마우스 정상 신장*	마우스 계통 음성 성인 골수
마우스 정상 뇌*	마우스 태아 간(E15부터 출생까지)
마우스 태아 간(E11 내지 E13)
활성화된 내피 세포
마우스 비장*
* 이들 기관에서의 발현은 방사성리간드 결합 시그널에 의해 결정할 때 약함.

본 발명자들은 또한 CCX-CKR2가 제브라피쉬 모르폴리노 모델에서 혈관신생에 관련됨을 결정하였다(Nasevicius A, and Ekker S.C. Nature Genetics 26: 216-220 (2000); Ekker S. and Larson J.D. Genesis 30: 89-93 (2001)). 제브라피쉬는 초기 발생에서 관련된 유전자의 기능을 평가하기 위해 이용되어 왔다. 인간에서 유전자의 90% 이상이 제브라피쉬에서 동일한 기능을 가진다. 제브라피쉬는 인간 CCX-CKR2 단백질 서열과 59% 동일한 CCX-CKR2의 오르소로그를 가진다. 모르폴리노 기술을 이용하여 제브라피쉬 상동체를 발생중인 배에서 "녹-다운(knock-down)"시켰다. 모르폴리노를 이용하여 CCX-CKR2 유전자를 억제하면 초기 발생을 막으며 대부분의 배가 죽는다. 하지만, 억제제의 투여량의 적정에 의해 CCX-CKR2를 차단하는 효과가 나타나기 시작한다. 흥미롭게도, CCX-CKR2가 억제되는 배에서, 모르펀트(morphant)는 연장을 나타내어 세포가 초기 단계(수정 후 9시간)에서 등 및 복부 영역으로 분할될 수 없음을 제안한다. 발생에서 그 이후에(수정 후 28시간) 제브라피쉬는 등 형성 표현형 및 혈관 결함을 가진다. 수정 후 56시간에, 모르펀트는 심장막 부종을 나타낸다. 결론적으로, 초기 제브라피쉬 발생에서 CCX-CKR2의 억제는 온건한 등형성 표현형 및 극적인 혈관 결함을 야기한다. 발생동안 CCX-CKR2를 갖지 않는 제브라피쉬는 혈관 시스템을 발생시키지 않으며 그들이 혈액을 가질 경우 이 혈액은 순환할 수 없다.

CCX-CKR2를 또한 인간 B 세포 림프종의 이종이식 모델에서 평가하였다. 이 모델에서 면역결핍 마우스를 인간 B 세포 림프종인 NAMALWA로 접종하였다. 마우스에게 CCX700 시리즈로부터의 화합물 또는 비히클 대조구를 매일 제공하였다. 흥미롭게도, 비히클을 제공한 마우스는 우선적으로 크고 캡슐화되고 맥관화된 종양을 발생시킨 반면, CCX700을 제공한 마우스는 종양을 가졌으나 종양은 크게 감소된 맥관화를 가지며 캡슐화되지 않았다. 이 관찰은 CCX-CKR2의 억제제가 종양이 혈관 베드를 발생시키는 능력을 억제한다는 제브라피쉬 연구 결과와 일치한다.

CCX-CKR2의 억제제는 또한 동계의 폐 암종 마우스 모델에서 종양 부피를 감소시키는 데 효과적이었다.

실시예 2

CCX-CKR2를 발현하는 세포가 내피 단층에 부착하는 능력을 시험관내 정적 부착 분석에서 평가하였다. HUVEC 세포(Clontech, CA)를 100,000 세포/웰 밀도로 밤새 24웰 플라스틱 조직 플레이트에 부착시켰다. 이어서 10 ng/ml TNF-알파 + 10 ng/ml IL-1베타를 함유한 배지 또는 배지 단독으로 37 ℃에서 5시간동안 처리하였다. MDA MB 435s(ATCC, VA) 야생형 또는 CCX-CKR2 안정 형질감염 세포를 PBS중의 3 ng/ml 칼세인 AM(Neuroprobes, OR)로 실온에서 30분 동안 로드시켰다. 항온처리 후 세포를 PBS에서 세척하고 200,000 세포/웰의 밀도로 HBSS(행크 완충 염수 용액)에 재현탁시켰다. MDA MB 435s 야생형 또는 CCX-CKR2-발현 세포를 이어서 HUVEC을 함유하는 조직 배양 플레이트에 두벌 웰에 첨가하였다. 플레이트를 15분 동안 37 ℃에서 항온처리하고 HBSS로 두 번 세척하였다.

현미경과 TECAN 다중웰 플레이트 판독기에서의 형광 강도에 의해 부착 세포를 정량하였다. 비자극 HUVEC을 함유한 웰에서는, 극소수의 MDA MB 435s 세포(야생형 또는 CCX-CKR2)가 내피 층에 결합하였다. 하지만, HUVEC 단층이 TNF알파 및 IL-1베타로 자극된 웰에서는, 야생형인 비-CCX-CKR2-발현 세포에 비하여 상당히 더 많은 CCX-CKR2 발현 세포가 단층에 부착하였다. 형광 강도에 의해 정량할 때, 활성화된 HUVEC 단층을 가진, CCX-CKR2-발현 MDA MB 435s 세포를 함유한 웰은 야생형 세포 및 활성화된 HUVEC 단층을 함유한 웰의 4배인 시그널을 생성하였다. 이들 데이터는 CCX-CKR2가 활성화된 내피 단층에의 부착에 관련됨을 증명한다.

실시예 3

이 실시예는 마우스 상처 치유 모델에서 CCX-CKR2 리간드 경쟁자의 효능을 증명한다.

상처 치유는 대개 3 단계로 나뉜다. 염증 단계로 알려진 첫 번째 단계는 지혈 및 염증에 관련된다. 증식 단계로 불리는 다음 단계는 상피화, 혈관신생 및 과립화 조직 형성을 특징으로 한다. 마지막으로 성숙 단계에서 상처는 수축하고 콜라겐이 침착된다. 대개 혈관신생에 영향을 주는 제제가 이 과정에서 효과를 가지는 것은 상처 혈관신생 동안 증식 단계에서이다.

본 발명자들은 전술한 제브라피쉬 연구를 통해 CCX-CKR2를 혈관신생 조절에 연결시켰다. 이들 결과를 고려하여, 상처 치유 모델에서 CCX-CKR2에 특이적인 화합물을 시험하였다.

상처 치유 연구에서, ICR 유래된 웅성 마우스(24 ± 2 g)를 이용하였다. 시험 기간동안, 동물을 개별 우리에서 단독으로 보관하였다. 헥소바비탈(90 mg/kg, IP) 마취하에서, 각 동물의 어깨 및 등 영역을 면도하였다. 예리한 펀치(ID 12 mm)를 가하여 패니큘러스 카르노서스(panniculus carnosus) 및 부착 조직을 포함하는 피부를 제거하였다. CCX-CKR2에의 결합을 위하여 SDF-a와 I-TAC과 경쟁하는 것으로 나타난 시험 화합물(700 시리즈 화합물, 100 ㎍/마우스) 및 비히클(0.5% CMC(카르복시메틸셀룰로오스)/PBS pH 7.4, 20 ㎕/마우스)를 각각 10일동안 하루에 한번씩 피부 손상 후 즉시 국소 투여하였다. 양성 대조구인 A2 아데노신 수용체 아고니스트(CGS-21680, 10 ㎍/마우스)를 또한 시험 과정동안 매일 국소 투여하였다. 투명한 플라스틱 시트상에 남겨진 상처 영역을 1,3,5,7,9 및 11일에 이미지 분석기(Life Science Resources Vista, Version 3.0)을 사용하여 측정하였다. 상처의 폐쇄 퍼센트(%)를 계산하고, 상처가 절반이 폐쇄 되는 시간(CT50)을 결정하여 그래프-패드 프리즘(Graph Pad Software USA)를 이용한 선형 회귀에 의해 분석하였다. 언페어드(unpaired) 스튜던트 테스트를 각 측정 시점에서 처리 군과 비히클 군 사이의 비교를 위하여 적용하였다. 차이는 P<0.05 수준에서 통계적 유의성을 가지는 것으로 간주되었다.

이 모델에서 700 시리즈 화합물을 이용한 처리는 상처 폐쇄를 촉진하였다. 10일동안 100 ㎍/마우스에서 700 시리즈 화합물은 상응하는 비히클 대조구 값에 비하여, CT50을 감소시키면서, 3,5,7,9 및 11일에 상처 폐쇄를 크게 증가시켰다(P<0.05). 본 발명자들은 또한 다른 공지의 SDF-1/CXCL12 수용체에 의한 상처 치유에의 기여를 검사하기 위하여, 공지의 CXCR4 안타고니스트인 AMD3100을 포함시켰다. 비교로서, CXCR4 안타고니스트(100 ㎍/마우스)는 비히클 대조구에 비하여, 상처 폐쇄(%) 즉 CT50의 큰 증가(P<0.05)를 야기하지 않았다. 따라서, AMD3100이 아닌 700 시리즈 화합물이 마우스 피부 상처 분석에서 큰 상처 치유 활성을 나타냈다.

이어서 700 시리즈 화합물의 투여량 범위의 효과를 검사하였다. 700 시리즈 화합물은 상처 폐쇄를 크게 증가시켰으며(비히클 대조구에 비하여) 이 효과는 시험된 모든 투여량에서 존재 하였다. 흥미롭게도, 상처 폐쇄의 증가는 시험된 중간 투여량에서 가장 강하고(100 ㎍ 및 25 ㎍) 최고(250 ㎍) 및 최저(5 ㎍) 투여량에서 보다 약했다. 따라서, 700 시리즈 화합물은 다른 보고된 혈관신생 치료약과 일치하게, 'U-자형' 투여량 반응을 가지는 것으로 나타난다.

혈소판, 호중구, 백혈구, 대식세포, 섬유모세포 및 각질세포와 같은 많은 세포 타입이 상처 치유에 관련되는 한편, 이들 세포 타입 모두에서 CCX-CKR2 발현을 구체적으로 검사하지는 않았다. 확실히 상피는 상처 치유에서 역할을 한다. 본 발명자들은 염증성 사이토카인 TNFα 및 IL-1β가 여러 타입의 일차 내피 세포에서 CCX-CKR2를 상향조절하는 것을 증명하였다. 따라서, 본 발명의 범위를 제한하지 않고, CCX-CKR2 특이적 화합물의 효과가 활성화된 내피 또는 세포 집단에서 결정되어야 할 다른 것에의 작용일 수 있음이 가능하다.

실시예 4

본 실시예는 CCX-CKR2가 아폽토시스를 감소시켜 세포 생존을 촉진함을 증명한다.

케모카인과 케모카인 수용체 사이의 상호작용은 대개 세포 내 칼슘 이동화 및 주화성을 측정하여 평가한다. 하지만, CCX-CKR2는 일시적인 칼슘 이동화를 생산하지 않거나 세포가 그 리간드 CXCL12 또는 CXCL11에 반응하여 이동하도록 야기하지 않는다. 하지만 CCX-CKR2를 발현하는 세포는 활성화된 내피 세포 단층에의 부착 증가를 나타낸다. 더욱이, 배양 배지의 낮은 혈청 보충의 조건(즉, 일반적인 10% 대신 1%)하에서, 3일 후에 생존 부착 세포의 회수는 비형질감염 야생형 세포(WT 435s)에 비하여 CCX-CKR2-MDA MB 435s 형질감염체(CCX-CKR2 435s)에 대하여 더 컸다. 이 관찰과 일치하여, 이들 배양물로부터 수집된 상등액에서 회수된 죽은 세포의 빈도는 CCX-CKR2-형질감염체에 비하여 야생형에 대하여 더 컸다. 이 효과는 DNA 삽입 염료 7AAD(7 아미노액티노마이신 D)를 이용하여 형광적으로 가시화될 수 있다. CCX-CKR2-435s 형질감염체 또는 야생형 435s 세포를 상이한 혈청 농도에서 성장시키고, 수집하고 실온에서 15-30분 동안 7AAD(DMSO중의 1 ㎍/ml)와 항온처리하였다. FACS 분석 결과 CCX-CKR2-435s 형질감염체에 비하여 야생형 435s 세포에서 더 많은 죽은/아폽토시스 세포(즉, 7AAD-양성)이 발견되었다.

본 발명자들은 배양된 CCX-CKR2 형질감염체 또는 비형질감염된 WT 세포를 아폽토시스 세포만 검출하는 아넥신 및 죽은 세포만을 검출하는 프로프리디움 이오다이드(PI)로 동시염색하는 일련의 실험에서 이들 발견을 확장시켰다. 이 방법은 세포 아폽토시스를 유발하는 것으로 알려진 제제, 예, 캠포테신(CMP), 또는 TNF알파 + 시클로헥시미드(CHX)를 이용하여 입증된 대로, 세포 집단에서 아폽토시스 세포의 비율을 쉽게 확인하며, 이 분석에서 우수한 대조구를 제공한다.

이 분석을 이용하여, 적절한(10%) 또는 제한된(1%) 혈청에서 성장한 CCX-CKR2-435s 형질감염체 또는 야생형 435s 세포의 시간에 따른 아폽토시스 세포 발생을 측정하였다. 10% 혈청에서 성장한 두 세포 타입 모두 4일의 배양 기간에 걸쳐 우수한 생존성을 나타냈다. 대조적으로, 1% 혈청에서 성장한 야생형 세포는 3일 및 4일의 배양 후 생존 세포의 극적인 감소를 나타냈다. 아넥신 및 PI를 이용한 동시 염색 결과 이것이 아폽토시스 및 죽은 세포의 발생을 반영함을 밝혔다. 흥미롭게도, 1% 혈청에서 성장한 CCX-CKR2-435s 세포는 동일한 4일 배양 기간동안 우수한 생존능을 나타내어, CCX-CKR2를 435s에 도입함으로써 이들 세포가 적절한 혈청 보충량 미만의 조건 하에서 신속한 세포 아폽토시스를 일으키는 것을 방지함을 제안한다.

동일한 결과는 동일한 CCX-CKR2-435s 형질감염체, 및 추가로 CCX-CKR2로 형질감염된 435s 세포의 별도의 비클론성 집단을 이용한 두 번째 실험에서 얻었다. 이 결과는 초기 클론성 형질감염체의 아폽토시스-할애 특성은 하나의 형질감염체 클론의 절제보다는 CCX-CKR2 발현에서 기인함을 나타냈다.

보충 데이터는 CCX-CKR2의 안타고니스트를 이용하여 얻어졌다. 이들 실험에서, 정상 세포에의 CCX-CKR2 안타고니스트의 첨가는 효과가 없었으나 CCX-CKR2를 발현하는 세포에의 안타고니스트의 첨가는 투여량 의존 방식으로 세포 사멸을 유도하였다.

실시예 5

본 실시예는 CCX-CKR2의 세포 발현이 많은 조절 단백질의 유도를 야기함을 증명한다.

CCX-CKR2-매개 시그널링 사건을 조사하기 위한 대안으로서, CCX-CKR2 형질감염된 MDA MB 435s 세포로부터 수집된 상등액을 야생형 MDA MB 435s(435s) 세포로부터 수집된 상등액에 비교하고, 분비 단백질 패밀리의 존재에 대해 특이적 ELISA 분석에 의해 평가하였다. CCX-CKR2를 발현하는 435s 세포는 야생형 435s 세포보다 상당히 더 많은 양의 GM-CSF, RANTES, MCP-1, TIMP-1 및 MMP3를 생산하였으며, 특히 제한적인 혈청 조건 하에서 성장할 때 그러했다. 흥미롭게도, 모든 이들 인자는 종양생성에 관련된 성장, 혈관 리모델링, 및 주화성에 관련되는 것으로 보고되었었다. 이들은 또한 전술한 CCX-CKR2의 아폽토시스-할애 표현형에 관련될 수 있다.

실시예 6

본 실시예는 CCX-CKR2의 siRNA-계 억제를 증명한다.

본 발명자들은 CXCR4 또는 CCX-CKR2에 대해 특이적인 SMARTpool^TM siRNA(Dharmacon)을 얻었다. SMARTpool^TM siRNA는 네 가지 상이한 siRNA 서열의 집단으로서, 각각은 특정 mRNA의 상이한 영역을 표적화한다. 이들 siRNA 집단을 HeLa 세포에서 시험하였다. CXCR4 발현을 12G5 또는 173 Mab 염색 및 FACS에 의해 평가하는 한편, CCX-CKR2 발현을 ¹²⁵I-SDF1을 이용한 결합 분석에서 측정하였다. CXCR4는 검출가능한 ¹²⁵I-SDF1 결합을 나타내지 않는 형태로 HeLa 세포에서 발현되며, 따라서 CCX-CKR2 발현의 검출을 허용한다. CCX-CKR2 SMARTpool^TM siRNA(25-100 nM)은 ¹²⁵I-SDF1 결합의 상당한(>50%) 억제를 일으키는 한편, CXCR4 SMARTpool^TM siRNA는 그렇지 않았다. 유사한 결과는 293-CCX-CKR2 형질감염체에서 얻어졌다.

또한, 하기 3개의 siRNA 서열(서열 번호 11 내지 13)은 각각 4 nM의 낮은 농도로 세포 내로 도입될 때 SDF-1 결합을 감소시키는 것으로 밝혀졌다:

siRNA #1: GCCGTTCCCTTCTCCATTATT

siRNA #2: GAGCTCACGTGCAAAGTCATT

siRNA #3: GACATCAGCTGGCCATGCATT

마우스 CCX-CKR2 전사물에 기초한, 하기 헤어핀 siRNA(서열 번호 14 내지 18)는 뮤린의 CCX-CKR2 발현의 억제를 통하여 SDF-1 결합을 감소시킨다:

실시예 7

본 실시예는 CCX-CKR2의 억제가 관절염의 효과적인 치료임을 증명한다.

Enbrel^？에 비하여 CCX-CKR2 활성을 억제하는 화합물의 효능을 관절염의 래트 모델에서 결정하였다. 래트는 700 시리즈 CCX-CKR2 결합 분자의 피하 투여가 주어졌다. 발생 타입 II 콜라겐 관절염 래트를 염증(관절 팽윤), 연골 파괴 및 골 흡수의 억제에 대해 모니터하였다.

125-150 g 무게의 자성 루이스 래트를 이용하였다. 제제를 비히클, 즉, 타입 II 콜라겐 및 프로인트 불완전 아쥬반트 내에서 전달하였다. 동물(10/관절염 그룹, 4/정상 대조구 그룹)을 4-5마리/우리로 보관하고 동물 시설에 도착 후 4-8일동안 적응시켰다.

투여는 0일에 개시하고 16일까지 계속하였다. 순응된 동물을 이소플루란으로 마취시키고 콜라겐을 주사했다(D0). 6일째에, 이들을 다시 두 번째 콜라겐 주사를 위해 마취시켰다. 0.01N 아세트산 중의 4 mg/ml 용액을 만들어 콜라겐을 제조하였다. 동 부피의 콜라겐 및 프로인트 불완전 아쥬반트를 손으로 혼합시켜 이 물질의 비드가 물에 놓았을 때 그 형태를 유지할 때까지 유화시켰다. 각 동물에게 등에서 3 부위에서 펴 발라 매번 300 ㎕의 혼합물을 제공하였다.

정상(질환 이전) 우측 및 좌측 발목 관절의 캘리퍼링(calipering)을 9일에 실시하였다. 10-14일에, 관절염이 발병하였다.

래트를 연구의 0, 3, 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 및 17일에 체중을 측정하였으며 발목의 캘리퍼 측정을 9일부터 매일 취하였다. 최종 체중을 17일에 측정하였다. 최종 체중 측정 후, 동물을 투여(17일) 후 약 24시간에 말단 혈청 수집을 위해 마취시키고 이어서 안락사시키고 조직을 수집하였다. 또한 현미경검사를 위하여 프로말린내로 무릎을 수집하였다.

고정액에서 1-2일 후 그리고 탈경화제(decalcifier)에서 4-5일 후에, 발목 관절을 세로길이로 절반으로 절단하고, 무릎을 정면에서 절반으로 절단하고, 처리하고, 묻고, 절개하고 톨루이딘 블루로 염색하였다. 콜라겐 관절 발목 및 무릎에 염증, 파누스 형성 및 골 재흡수에 대하여 하기 기준에 따라 0-5의 점수를 매겼다:

무릎 및 발목 염증

0 = 정상

1 = 관절주위 조직에서 염증 세포의 최소 침윤

2 = 온건한 침윤

3 = 온건한 부종과 온건한 침윤

4 = 주목할만한 부종과 주목할만한 침윤

5 = 심각한 부종과 심각한 침윤

발목 파누스 ( 경족근골 관절에 대한 강조)

0 = 정상

1 = 연골 및 연골밑 뼈에서 파누스의 최소 침윤

2 = 온건한 침윤(가장자리의 경골의 <1/4)

3 = 온건한 침윤(경골의 1/4 내지 1/3이 영향을 받으며, 보다 적은 발목뼈가 영향받음)

4 = 주목할만한 침윤(경골의 1/2-3/4가 영향을 받으며, 보다 적은 발목뼈가 파괴됨)

5 = 심각한 침윤(경골의 3/4가 영향을 받으며, 전체 구조의 심각한 왜곡)

무릎 파누스

0 = 정상

1 = 연골 및 연골밑 뼈에서 파누스의 최소 침윤

2 = 온건한 침윤(경골 또는 대퇴골의 표면 또는 연골밑 영역의 최대 1/4 상에 확장)

3 = 온건한 침윤(경골 또는 대퇴골의 표면 또는 연골밑 영역의 1/4 이상 1/2 이하로 확장)

4 = 주목할만한 침윤(경골 또는 대퇴골의 표면의 1/2-3/4로 확장)

5 = 심각한 침윤(표면의 3/4 이상을 커버)

연골 손상(발목)

0 = 정상

1 = 최소 = 명백한 연골세포 손실 또는 콜라겐 파괴없이 최소 내지 온건한 톨루이딘 블루 염색 손실

2 = 온건 = 국소적인 온건한(표면적) 연골세포 손실 및/또는 콜라겐 파괴 및 표면의 경골 1/4 미만의 완전한 파괴, 보다 적은 발목뼈에서의 온건한 변화와 함께 톨루이딘 블루 염색의 온건한 손실

3 = 중간 = 다수 지점의 중간의(중간 구역까지의 깊이) 연골세포 손실 및/또는 콜라겐 파괴와 함께 톨루이딘 블루 염색의 중간 손실, 경골의 1/4 내지 1/3이 완전한 두께 파괴에 의해 영향을 받음, 보다 적은 발목뼈가 1/2 내지 3/4 깊이까지 영향을 받음

4 = 주목할 정도 = 다수 지점에서의 주목할만한(깊은 구역까지의 깊이) 연골세포 손실 및/또는 콜라겐 파괴와 함께 톨루이딘 블루 염색의 주목할만한 손실, 경골의 1/2-3/4가 완전한 두께 파괴를 가짐, 보다 적은 발목뼈의 파괴

5 = 심각함 = 다수 지점에서의 심각한(타이드 마크까지의 깊이) 연골세포 손실 및/또는 콜라겐 파괴와 함께 톨루이딘 블루 염색의 심각한 확산 손실

연골 손상(무릎, 대퇴 관절돌기에 대한 강조)

0 = 정상

1 = 명백한 연골세포 손실 또는 콜라겐 파괴 없이 최소 내지 온건한 톨루이딘 블루 염색의 손실

2 = 온화 = 국소적인 온건한(표면적) 연골세포 손실 및/또는 콜라겐 파괴 및 톨루이딘 블루 염색의 온건한 손실

3 = 중간 = 다수 지점 내지 확산된 중간(중간 구역까지의 깊이) 연골세포 손실 및/또는 콜라겐 파괴와 함께 톨루이딘 블루 염색의 중간 손실

4 = 주목할만함 = 다수 지점 내지 확산된 주목할만한(깊은 구역까지의 깊이) 연골세포 손실 및/또는 콜라겐 파괴와 함께 톨루이딘 블루 염색의 주목할만한 손실

5 = 심각함 = 대퇴골 및 경골 둘다에서 다수 지점의 심각한(타이드 마크까지 깊이) 연골세포 손실 및/또는 콜라겐 파괴와 함께 톨루이딘 블루 염색의 심각한 확산 손실

뼈 재흡수(발목)

0 = 정상

1 = 최소 = 낮은 확대에서는 쉽게 나타나지 않는 작은 재흡수 영역, 드문 파골세포

2 = 온건함 = 낮은 확대에서는 쉽게 나타나지 않는 보다 많은 영역의 재흡수, 파골세포가 보다 많음, 가장자리의 경골의 1/4 미만이 재흡수됨.

3 = 중간 = 피질에서 전체 두께 결함없이 속질 섬유주 및 피질 뼈의 명백한 재흡수, 일부 속질 섬유주의 손실, 낮은 확대에서 명백한 병변, 더 많은 파골세포, 경골의 1/4 내지 1/3이 영향받음, 보다 적은 발목뼈가 영향받음

4 = 주목할만함 = 피질 뼈에서 전체 두께 결함을 가지며 종종 나머지 피질 표면의 프로파일의 왜곡이 나타나며, 속질 뼈의 주목할만한 손실, 많은 파골세포, 경골의 1/2-3/4가 영향받음, 보다 적은 발목뼈의 파괴

5 = 심각함 = 피질 뼈의 전체 두께 결함, 종종 나머지 피질 표면의 프로파일의 왜곡, 속질 뼈의 주목할만한 손실, 많은 파골세포, 경골의 3/4 이상이 영향받음, 전체 구조의 심각한 왜곡

골 재흡수(무릎)

0 = 정상

1 = 최소 = 낮은 확대에서는 쉽게 나타나지 않는 작은 재흡수 영역, 드문 파골세포

2 = 온건 = 보다 많은 재흡수 영역, 경골 또는 대퇴부 표면(중간 또는 측면)의 1/4에 관련된 연골밑 뼈의 한정적 손실

3 = 중간 = 경골 또는 대퇴부 표면(중간 또는 측면)의 1/4 내지 1/2에 관련된 연골밑 뼈의 명백한 재흡수

4 = 주목할만함 = 경골 또는 대퇴부 표면(중간 또는 측면)의 1/2 이상 내지 3/4에 관련된 연골밑 뼈의 명백한 재흡수

5 = 심각함 = 경골 또는 대퇴부 표면(중간 또는 측면)의 3/4 이상에 관련된 파괴로 인한 전체 관절의 왜곡

발목 관절 직경을 위한 임상 데이터를 투여 곡선 아래 면적(AUC)을 결정하여 분석하였다. AUC의 계산을 위해, 각 래트에 대한 발목 관절의 매일 측정값(캘리퍼 이용)을 마이크로소프트 엑셀에 기록하고 질환 발병 후 처리 일수에서 종결 일 사이의 면적을 계산하였다. 각 그룹을 위한 평균을 결정하고 처리 동물과 정상 동물의 값을 비교하여 관절염 대조구로부터의 억제 퍼센트를 계산하였다. 데이터를 스튜던트 t-테스트에 의해 분석하였다. 각 그룹을 위한 발 중량 및 조직학적 파라미터(평균 ±SE)를 또한 스튜던트 t-테스트를 이용하여 차이에 대해 분석하였다. 발 중량의 퍼센트 억제와 AUC를 하기 식을 이용하여 계산하였다:

% 억제 = A - B/A X 100

A = 질환 대조구 평균 - 정상 평균

B = 처리군 평균 - 정상군 평균

래트를 하기와 같이 처리하였다:

그룹 N 처리, sc bid , 또는 qd 일수 0-16

1 정상 대조구, 비히클 sc qd(2 ml/kg)

2 관절염 + 비히클 sc qd(2 ml/kg)

3 관절염+CCX754 10 mg/kg sc qd

700 시리즈 화합물이 제공된 그룹 내의 동물은 비히클 처리된 그룹에 비교하여 크게 감소된 관절 염증을 나타냈다(P<0.0001). 도 1 참고. 관절염을 일으킨 그룹의 래트는 연구 과정 동안 체중 감소를 나타냈으며 관절염이 없는 래트(정상 대조구) 또는 최소 염증(700 시리즈 처리됨)을 가진 래트는 각각 증가하거나 안정된 체중을 나타냈다.

실시예 8

본 실시예는 N-(S)-(1-시클로헥실메틸-피롤리딘-2-일메틸)-3,4-디메톡시-N-나프탈렌-2-일메틸-벤즈아미드의 제조를 예시한다.

방법 1

단계 1: (S)-2-{[나프탈렌-2- 일메틸 ]-아미노]- 메틸 }- 피롤리딘 -1- 카르복실산 tert-부틸 에스테르

질소하에서, 2-(S)-아미노메틸-피롤리딘-1-카르복실산 tert-부틸 에스테르(반응식 1에 따라 제조됨) 2g(10 mmol)을 50 mL 무수 디클로로메탄에 용해시켰다. 이 용액에 나프탈렌-2-카르브알데히드 2 g(13 mmol) 및 분자체를 첨가하였다. 혼합물을 밤새 교반하였다. 분자체를 여과하고 유기 부분을 농축시켰다. 얻어진 혼합물을 0 ℃에서 냉각된 100 mL 메탄올에 흡수시키고, 소듐 보로하이드라이드 0.75 g(20 mmol)을 첨가하였다. 1 시간 후, 박층 크로마토그래피는 반응 완결을 보여주었다. 이 혼합물에 10 mL의 물을 매우 느리게 첨가하고, 디클로로메탄으로 3회 추출하였으며, 배합된 유기층을 염수로 세척하고, 마그네슘 설페이트에서 건조시키고, 여과하고 농축시켜, 2.76 g의 오렌지 색 오일을 얻었다(정제 안함). C₂₁H₂₈N₂0₂ [M+H]를 위한 LC-MSD, m/z: 341.1. HPLC, C18 칼럼 구배 20-95% 아세토니트릴- 0.1% TFA(7분) 에서 LC 보유 시간: 3.2분

단계 2: 2-(S)-{[(3,4- 디메톡시 - 벤조일 )-나프탈렌-2- 일메틸 -아미노]- 메틸 }-피롤리딘-1-카르복실산 tert -부틸 에스테르

3,4-디메톡시 벤조산 1.04 g(5.72 mmol)을 30 mL 테트라히드로푸란에 용해시키고, 이 혼합물에 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드 1.4 g (6.6 mmol), 트리에틸아민 0.66 g (5.72 mmol)을 첨가하고, 30 분 후에 1-히드록시벤조트리아졸 0.77 g (5.72 mmol)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 한 시간 교반하였다. 이 혼합물에 2-{[나프탈렌-2-일메틸]-아미노-메틸}-피롤리딘-1-카르복실산 tert-부틸 에스테르 1.5 g (4.4 mmol)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 하루 밤 교반시켰다. 포화된 소듐 비카보네이트 50 mL을 첨가하고 에틸 아세테이트 100 mL씩 3회 세척하였다. 배합된 유기층을 마그네슘 설페이트에서 건조시키고, 여과하고, 진공하에서 농축시켰다. 실리카겔 헥산: 1-디클로로메탄: 1에서의 정제 결과 1.1 g의 백색 분말을 얻었다. C₃₀H₃₆N₂0₅ [M+H]를 위한 LC-MSD,m/z: 505.2. HPLC, C18 컬럼 구배 20-95% 아세토니트릴- 0.1% TFA(7분)에서 LC 보유 시간: 5.0 min.

단계 3: (S)-3,4- 디메톡시 -N-나프탈렌- 2일메틸 -N- 피롤리딘 -2- 일메틸 - 벤즈아미드

디클로로메탄 및 트리플루오로아세트산 30%의 혼합물 20 mL에서, 2-[(3,4-디메톡시-벤조일)-나프탈렌-2-일메틸-아미노-메틸}-피롤리딘-1-카르복실산 tert-부틸 에스테르 1.1 g (2.18 mmol)을 용해시켰다. 실온에서 1 시간 후, 소듐 비카보네이트의 포화된 용액을 염기성 pH일 때까지 첨가하고, 상기 혼합물을 디클로로메탄으로 추출하고, 마그네슘 설페이트에서 건조시키고, 여과하고 진공하에서 농축시켜 0.88 g을 얻었다. C₂₅H₂₈N₂0₃ [M+H]를 위한 LC-MSD, m/z: 404.2. HPLC, C 18 컬럼 구배 20-95% 아세토니트릴-0.1% TFA(7분)에서 LC 보유 시간: 1.37 min.

단계 4: N-(S)-(1- 시클로헥스 -3- 에닐메틸 - 피롤리딘 -2- 일메틸 )-3,4- 디메톡시 -N-나프탈렌-2-일메틸-벤즈아미드

3,4-디메톡시-N-나프탈렌-2일메틸-N-(S)-피롤리딘-2-일메틸-벤즈아미드 0.88 g (2.17 mmol)을 20 mL 무수 디클로로메탄에 용해시키고, 이 혼합물에 1,2,3,6-테트라히드로벤즈알데히드 0.26 g (2.39 mmol), 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드 0.68 g (3.25 mmol), 및 분자체를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 밤새 질소하에서 교반하였다. 분자체를 여과하고, 이 혼합물에 포화된 소듐 비카보네이트를 첨가하고, 디클로로메탄으로 3회 추출하였다. 배합된 유기층을 마그네슘 설페이트에서 건조시키고, 여과하고 진공하에서 농축시켰다. 0.8 g 의 오일을 얻고, 이것을 20 내지 90% 아세토니트릴-0.1% TFA의 구배를 가지는 역상 HPLC C18 컬럼을 이용하여 정제하여 0.6 g의 백색 분말을 얻었다. C₃₂H₃₈N₂0₃ [M+H]를 위한 LC-MSD,m/z: 499.4. HPLC, C18 컬럼 구배 20-95% 아세토니트릴- 0.1% TFA(7분)에서 LC 보유 시간: 3.87 min.

단계 5: N-(S)-(1- 시클로헥실메틸 - 피롤리딘 -2- 일메틸 )-3,4- 디메톡시 -N-나프탈렌-2-일메틸-벤즈아미드

N-(S)-(1-시클로헥스-3-에닐메틸-피롤리딘-2-일메틸)-3,4-디메톡시-N-나프탈렌-2-일메틸-벤즈아미드를 5 mL 메탄올에 용해시키고, 이 용액에 탄소 상의 팔라듐 5% 2 mg을 첨가하였다. 이 혼합물을 대기압하에서, 실온에서 수소하에서 교반하였다. 2 시간 후 반응은 완결된다. 촉매를 여과하고, 메탄올을 진공하에서 농축시켜 10 mg의 백색 분말을 얻었다. C₃₂H₄₀N₂0₃ [M+H]를 위한 LC-MSD,m/z: 501.4. HPLC, C18 컬럼 구배 20-95% 아세토니트릴- 0.1% TFA(7분)에서 LC 보유 시간: 4.52 min.

2-(S)-아미노메틸-피롤리딘-1-카르복실산 tert-부틸 에스테르의 제조

방법 2:

단계 1: (S)-(1-시클로헥실메틸-피롤리딘-2-일메틸)-나프탈렌-2-일메틸-아민 (S)-C-(1-시클로헥실메틸-피롤리딘-2-일)-메틸아민(반응식 2에 따라 제조됨) 0.24 g (1 mmol), 및 나프탈렌-2-카르브알데히드 0.19 g (1.2 mmol)를 10 mL 디클로로메탄에 용해시켰다. 이 혼합물에 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드 0.51 g (2 mmol), 및 분자체를 첨가하였다. 상기 반응물을 질소하에서 밤새 교반하였다. 분자체를 여과하고, 3 mL HC1로 세척하고, 산성층을 분말 소듐 비카보네이트로 염기 pH로 전환시키고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 배합된 유기층을 마그네슘 설페이트에서 건조시키고, 여과하고 농축시켜 100 mg의 황색 오일을 얻었다.

단계 2: N-(S)-(1- 시클로헥실메틸 - 피롤리딘 -2- 일메틸 )-3,4- 디메톡시 -N-나프탈렌-2-일메틸-벤즈아미드

1 mL 테트라히드로푸란에서, 3,4-디메톡시 벤조산 40 mg (0.22 mmol), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드 40 mg (0.22 mmol), 1-히드록시벤조트리아졸 20 mg (0.18 mmol), 트리에틸아민 0.03 mL (0.22 mmol) 및 (S)-(1-시클로헥실메틸-피롤리딘-2-일메틸)-나프탈렌-2-일메틸-아민 50 mg (0.15 mmol)로부터 방법 1의 단계 2에 따라 제조하여 72 mg의 백색 분말을 얻었다. C₃₂H₄₀N₂0₃ [M+H]를 위한 LC-MSD, m/z: 501.4. HPLC, C18 컬럼 구배 20-95% 아세토니트릴- 0.1% TFA(7분)에서 LC 보유 시간: 4.2 min.

C-(1-(S)-시클로헥실메틸-피롤리딘-2-일)-메틸아민의 제조

a: 벤질클로로포르메이트, 소듐 카보네이트, THF, 3h, RT

b: 6N HCl, 디옥산, 14 h, RT

c: 시클로헥산 카르복스알데히드, 메탄올, 아세트산, 소듐시아노보로하이드라이드, 0 ℃ 내지 RT

d: 10% Pd/목탄, 메탄올, H₂ 2.5 Kg, 5h

실시예 9

본 실시예는 N-(S)-(1-시클로헥실메틸-피롤리딘-2-일메틸)-3,4-디메톡시-N-퀴놀린-3-일메틸-벤즈아미드의 제조를 예시한다.

단계 1: (S)-(1- 시클로헥실메틸 - 피롤리딘 -2- 일메틸 )-퀴놀린-3- 일메틸 -아민

8 mL 디클로로메탄에서 (S)-C-(1-시클로헥실메틸-피롤리딘-2-일)-메틸아민 0.25 g (1.3 mmol), 퀴놀린-3-카르브알데히드 0.2 g (1.3 mmol), 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드 0.53 g (2.6 mmol), 및 분자체로부터 실시예 8과 유사한 실험 조건에서 40 mg의 화합물을 얻었다.

단계 2: N-(S)-(1- 시클로헥실메틸 - 피롤리딘 -2- 일메틸 )-3,4- 디메톡시 -N-퀴놀린-3- 일메틸 - 벤즈아미드

1 mL 테트라히드로푸란에서 3,4-디메톡시 벤조산 32 mg (0.17 mmol), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드 34 mg (0.17 mmol), 1-히드록시벤조트리아졸 19 mg (0.14 mmol), 트리에틸아민 0.24 mL 및 (S)-(1-시클로헥실메틸-피롤리딘-2-일메틸)-퀴놀린-3-일메틸-아민 40 mg (0.11 mmol)으로부터 실시예 8에 유사한 실험 조건에 따라, 20-80% 아세토니트릴-0.1% TFA의 구배를 가지는 C18 컬럼을 가진 역상 HPLC 정제 후 11 mg 백색 고체를 얻었다. C₃₁H₃₉N₃0₃ [M+H]를 위한 LC-MSD, m/z: 502.2. HPLC, C18 컬럼 구배 20-95% 아세토니트릴- 0.1% TFA(7분)에서 LC 보유 시간: 3.2 min.

실시예 10

본 실시예는 N-벤조푸란-2-일메틸-N-(S)-(1-시클로헥실메틸-피롤리딘-2-일메 틸)-3,4-디메톡시-벤즈아미드의 제조를 예시한다.

단계 1: 2-(S)-{[( 벤조푸란 -2- 일메틸 )-아미노]- 메틸 }- 피롤리딘 -1- 카르복실산 tert-부틸 에스테르

10 mL 디클로로메탄 중의 벤조푸란-2-카르브알데히드 0.15 g (1 mmol), 2-아미노메틸-피롤리딘-1-카르복실산 tert-부틸 에스테르 0.26 g (1.2 mmol), 및 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드 0.43 g (2 mmol)로부터, 실시예 8과 유사한 실험 조건에 따라 0.2 g의 오일( 88% 순수)을 얻었다. .

단계 2: 2-(S)-{[ 벤조푸란 -2- 일메틸 -(3,4- 디메톡시 - 벤조일 )-아미노- 메틸 }- 피 롤리딘-1-카르복실산 tert -부틸 에스테르

3 mL 테트라히드로푸란 중의 3,4,5-트리메톡시 벤조산 72 mg (0.39 mmol), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드 75 mg (0.39 mmol), 1-히드록시벤조트리아졸 45 mg (0.33 mmol), 트리에틸아민 0.05 mL (0.39 mmol), 및 2-(S)-{[(벤조푸란-2-일메틸)-아미노-메틸}-피롤리딘-1-카르복실산 tert-부틸 에스테르 100 mg (0.3 mmol)으로부터 실시예 8과 유사한 실험 조건을 이용하여 생성물을 얻었다. 상기 화합물을 에틸 아세테이트:메탄올 9:1을 이용한 실리카겔 크로마토그래피 용출을 통해 정제하여 백색 유성 화합물 93 mg을 얻었다.

단계 3: N-벤조푸란-2-일메틸-N-(S)-(1-시클로헥실메틸-피롤리딘-2-일메틸)- 3,4- 디메톡시 - 벤즈아미드

1 mL 디클로로메탄중에서, 2-(S)-{[벤조푸란-2-일메틸-(3,4-디메톡시-벤조일)-아미노]-메틸}-피롤리딘-1-카르복실산 tert-부틸 에스테르 110 mg (0.22 mmol), 및 트리플루오로아세트산과 디클로로메탄 17%의 혼합물 1 mL, 탈보호 후 64 mg (0.16 mmol)의 N-벤조푸란-2-일메틸-3,4-디메톡시-N-(S)-피롤리딘-2-일메틸-벤즈아미드, 시클로헥산카르브알데히드 19 mg (0.17 mmol), 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드 68 mg (0.32 mmol) 및 분자체로부터 실시예 8과 유사한 실험 조건에 의해 50 mg의 백색 분말을 얻었다. C₃₀H₃₈N₂0₄ [M+H]를 위한 LC-MSD,m/z: 491.2. HPLC, C18 컬럼 구배 20-95% 아세토니트릴- 0.1% TFA(7분)에서 LC 보유 시간: 3.91 min.

실시예 11

본 실시예는 N-벤조푸란-2-일메틸-N-(S)-(1-시클로헥실메틸-피롤리딘-2-일메틸)-3,4,5-트리메톡시-벤즈아미드의 제조를 예시한다.

단계 1: 2-(S)-{[ 벤조푸란 -2- 일메틸 -(3,4,5- 트리메톡시 - 벤조일 )-아미노]- 메 틸}-피롤리딘-1-카르복실산 tert -부틸 에스테르

2-(S)-{[벤조푸란-2-일메틸]-아미노]-메틸}-피롤리딘-1-카르복실산 tert-부틸 에스테르 0.33 g (0.28 mmol), 3,4,5-트리메톡시-벤조일 클로라이드 65 mg (0.28 mmol) 및 트리에틸아민 0.04 mL (0.28 mmol). 1 시간 후, 포화된 소듐 비카보네이트를 첨가하고 혼합물을 디클로로메탄으로 추출하고, 유기층을 배합하고, 마그네슘 설페이트에서 건조하고, 여과하고, 진공하에서 농축시켰다. 에틸 아세테이트-핵산 5.5-4.5 용출을 이용한 실리카겔 크로마토그래피에서의 정제 결과 100 mg의 연황색 오일을 얻었다.

단계 2: N- 벤조푸란 -2- 일메틸 -N-(S)-(1- 시클로헥실메틸 - 피롤리딘 -2- 일메틸 )-3,4,5- 트리메톡시 - 벤즈아미드

1 mL 디클로로메탄중의 (S)-{[벤조푸란-2-일메틸-(3,4,5-트리메톡시-벤조일)-아미노]-메틸}-피롤리딘-1-카르복실산 tert-부틸 에스테르 0.1 g (0.19 mmol), 0.15 mL (1.9 mmol) 트리플루오로아세트산으로부터, 실시예 10과 유사한 실험 조건을 이용하였다. 탈보호된 아민 0.06 g (0.188 mmol)을 1 mL 중의 시클로헥산카르바알데히드 0.023 g (0.19 mmol), 및 소듐아세톡시보로하이드라이드 0.06 g (0.38 mmol)에 첨가하여 70 mg의 백색 분말을 얻었다. C₃₁H₄₀N₂0₅ [M+H]를 위한 LC-MSD, m/z: 521.2. HPLC, C18 컬럼 구배 20-95% 아세토니트릴- 0.1% TFA(7분)에서 LC 보유 시간: 3.88 min.

실시예 12

본 실시예는 3,4,5-트리메톡시-N-[2-(l-메틸-피롤리딘-2-일)-에틸]-N-나프탈렌-2일메틸-벤즈아미드의 제조를 예시한다.

단계 1: [2-(1- 메틸 - 피롤리딘 -2-일)-에틸]-나프탈렌-2- 일메틸 -아민

10 mL 디클로로메탄중의 2-나프탈렌카르복스알데히드 0.15 g (1 mmol), 2-(1-메틸-피롤리딘-2-일)-에틸아민 0.14 g(1.1 mmol), 및 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드 0.31 g (1.5 mmol)로부터 실시예 8과 유사한 실험 조건을 이용하였다. 조 물질은 110 mg 연황색 오일이다.

단계 2: 3,4,5- 트리메톡시 -N-[2-(1- 메틸 - 피롤리딘 -2-일)-에틸]-N-나프탈렌- 2일메틸 -벤즈아미드

10 mL의 무수 디클로로메탄 중의 [2-(1-메틸-피롤리딘-2-일)-에틸]-나프탈렌-2-일메틸-아민 0.11 g (0.42 mmol), 3,4,5-트리메톡시-벤조일클로라이드 0.11 g (0.51 mmol), 및 트리에틸아민 0.06 g (0.72 mmol)으로부터 실시예 11과 유사한 실험 조건을 이용하였다. 상기 화합물을 20-80% 아세토니트릴-0.1 % TFA의 C18 컬럼 구배의 역상 HPLC를 이용하여 정제하여 180 mg의 순수한 물질을 얻었다. C₂₈HN₃₄N₂0₄ [M+H]를 위한 LC-MSD, m/z: 463.5. HPLC, C18 컬럼 구배 20-95% 아세토니트릴- 0.1% TFA(7분)에서 LC 보유 시간: 3.01 min.

실시예 13

본 실시예는 3,4,5-트리메톡시-N[2-(1-메틸-피롤리딘-2-일)-에틸]-N-나프탈렌-1-일메틸-벤즈아미드의 제조를 예시한다.

단계 1:[2-(1- 메틸 - 피롤리딘 -2-일)-에틸]-나프탈렌-1- 일메틸 -아민

10 mL 디클로로메탄중의 1-나프탈렌카르복스알데히드 0.15 g (1 mmol), 2-(1-메틸-피롤리딘-2-일)-에틸아민 0.14 g (1.1 mmol), 및 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드 0.31 g (1.5 mmol)로부터 실시예 12와 유사한 실험 조건을 이용하였다. 조 물질은 210 mg 투명한 오일이다.

단계 2: 3,4,5- 트리메톡시 -N[2-(1- 메틸 - 피롤리딘 -2-일)-에틸]-N-나프탈렌-1-일메틸-벤즈아미드

15 mL의 무수 디클로로메탄중의 [2-(1-메틸-피롤리딘-2-일)-에틸]-나프탈렌-1-일메틸-아민 0.21 g (0.79 mmol), 3,4,5-트리메톡시-벤조일클로라이드 0.0.21 g (0.95 mmol), 및 트리에틸아민 0.11 g (1.18 mmol)로부터 실시예 12와 유사한 실험 과정을 이용하였다. 20-80% 아세토니트릴-0.1% TFA 구배를 가지는 역상 HPLC C18 컬럼을 이용하여 정제하여 280 mg의 순수한 물질을 얻었다. C₂₈H₃₄N₂0₄ [M+H]를 위한 LC-MSD, m/z: 463.5. HPLC, C18 컬럼 구배 20-95% 아세토니트릴- 0.1% TFA(7분)에서 LC 보유 시간: 3.13 min.

실시예 14

본 실시예는 N-벤조푸란-2-일메틸-3,4,5-트리메톡시-N-[2-(1-메틸-피롤리딘- 2-일)-에틸]-벤즈아미드의 제조를 예시한다.

단계 1: 벤조푸란 - 2일메틸 -[2-(1- 메틸 - 피롤리딘 -2-일)-에틸]-아민

10 mL 디클로로메탄 중의 2-벤조푸란카르복스알데히드 0.14 g (1.1 mmol), 2-(1-메틸-피롤리딘-2-일)-에틸아민 0.14 g (1 mmol), 및 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드 0.31 g (1.5 mmol)으로부터 실시예 12와 유사한 실험 조건을 이용하였다. 실리카 크로마토그래피 및 디클로로메탄-메탄올-암모늄 히드록시드 9-1-0.25를 이용한 용출에 의한 정제에 의해 83 mg의 화합물을 얻었다.

단계 2: N- 벤조푸란 -2- 일메틸 -3,4,5- 트리메톡시 -N-[2-(1- 메틸 - 피롤리딘 -2-일)-에틸]-벤즈아미드

3 mL 테트라히드로푸란중의 3,4,5-트리메톡시 벤조산 0.08 g (0.32 mmol), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 히드로클로라이드 0.060 g (0.38 mmol), 1-히드록시벤조트리아졸 0.05 g (0.38 mmol), 트리에틸아민 0.05 mL (0.38 mmol), 및 벤조푸란-2일메틸-[2-(1-메틸피롤리딘-2-일)-에틸]-아민 0.08g (0.3 mmol)로부터 실시예 8과 유사한 실험 조건을 이용하였다. 20-80% 아세토니트릴-0.1% TFA 구배를 가지는 역상 HPLC C18 컬럼을 이용하여 정제하여 100 mg의 백색 분말을 TFA 염으로 얻었다. C₂₆H₃₂N₂0₅ [M+H]를 위한 LC-MSD, m/z: 453.5. HPLC, C18 컬럼 구배 20-95% 아세토니트릴- 0.1% TFA(7분)에서 LC 보유 시간: 2.73. min.

실시예 15

본 실시예는 N-벤조 [b] 티오펜-2일메틸-3,4,5-트리메톡시-N-[2-(1-메틸-피롤리딘-2-일)-에틸]-벤즈아미드의 제조를 예시한다.

단계 1: 벤조 [b]티오펜-2- 일메틸 -[2-(1- 메틸 - 피롤리딘 -2-일)-에틸]-아민

10 mL 디클로로메탄 중의 벤조[b]티오펜-2-카르브알데히드 0.18 g (1.1 mmol), 2-(1-메틸-피롤리딘-2-일)-에틸아민 0.14 g (1 mmol), 및 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드 0.31 g (1.5 mmol)으로부터 실시예 12와 유사한 실험 조건을 이용하였다. 실리카겔 크로마토그래피와, 디클로로메탄-메탄올-암모늄 히드록시드, 9-1-0.25를 이용한 용출에 의한 정제 결과 73 mg의 화합물을 얻었다.

단계 2: N- 벤조[b]티오펜 -2- 일메틸 -3,4,5- 트리메톡시 -N-[2-(1- 메틸 - 피롤리딘 -2-일)-에틸]-벤즈아미드

3 mL 테트라히드로푸란 중의 3,4,5-디메톡시 벤조산 0.07 g (0.26 mmol), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드 0.05 g (0.31 mmol), 1-히드록시벤조트리아졸 0.04 g (0.3 mmol), 트리에틸아민 0.03 mL (0.31 mmol), 및 벤조[b]티오펜-2-일메틸-[2-(1-메틸-피롤리딘-2-일)-에틸]-아민 0.07 g (0.26 mmol)로부터 실시예 8과 유사한 실험 조건을 이용하였다. 20-80% 아세토니트 릴-0.1% TFA 구배를 가지는 역상 HPLC C18 컬럼을 이용하여 정제하여 50 mg의 흡습성 분말을 TFA 염으로 얻었다. C₂₆H₃₂N₂0₄S [M+H]를 위한 LC-MSD, m/z: 469.5. HPLC, C18 컬럼 구배 20-95% 아세토니트릴- 0.1% TFA(7분)에서 LC 보유 시간: 2.858.

실시예 16

본 실시예는 N-(2,3-디히드로벤조 [1,4]디옥신-6-일메틸)-3,4,5-트리메톡시-N-[2-(1-메틸-피롤리딘-2-일)-에틸]-벤즈아미드의 제조를 예시한다.

단계 1: (2,3- 디히드로 - 벤조[1,4]디옥신 -6- 일메틸 )-[2-(1- 메틸 - 피롤리딘 -2-일)-에틸]-아민

10 mL 디클로로메탄 중의 벤조[b]티오펜-2-카르브알데히드 0.18 g(1.1 mmol), 2-(1-메틸-피롤리딘-2-일)-에틸아민 0.14 g (1 mmol), 및 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드 0.31 g (1.5 mmol)으로부터 실시예 12와 유사한 실험 조건을 이용하였다. 실리카겔 크로마토그래피, 디클로로메탄-메탄올-암모늄 히드록시드 9-1-0.25를 이용한 용출을 이용한 정제에 의해 0.21 g의 화합물을 얻었다.

단계 2: (2,3- 디히드로 - 벤조[1,4]디옥신 -6- 일메틸 )-[2-(1- 메틸 - 피롤리딘 -2-일)-에틸]-아민

5 mL 테트라히드로푸란 중의 3,4,5-디메톡시 벤조산 0.19 g (0.91 mmol), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드 0.14 g (0.91 mmol), 1-히드록시벤조트리아졸 0.12 g (0.91 mmol), 트리에틸아민 0.12 mL (0.91 mmol), 및 (2,3-디히드로-벤조[1,4]디옥신-6-일메틸)-[2-(1-메틸-피롤리딘-2-일)-에틸]-아민 0.21 g (0.76 mmol)로부터 실시예 8과 유사한 실험 조건을 이용하였다. 20-80% 아세토니트릴-0.1% TFA 구배를 가지는 역상 HPLC C18 컬럼을 이용하여 정제하여 150 mg 화합물을 TFA 염으로 얻었다. C₂₆H₃₄N₂0₆ [M+H]를 위한 LC-MSD, m/z: 471.5. HPLC, C18 컬럼 구배 20-95% 아세토니트릴- 0.1% TFA(7분)에서 LC 보유 시간: 1.805.

실시예 17

본 실시예는 3,4,5-트리메톡시-N-[2-(1-메틸-피롤리딘-2일)-N-퀴놀린-3-일메틸-벤즈아미드의 제조를 예시한다.

단계 1: [2-(1- 메틸 - 피롤리딘 -2-일)-에틸-퀴놀린-3- 일메틸 -아민

10 mL 디클로로메탄 중의 퀴놀린-3-카르브알데히드 0.25 g (1.5 mmol), 2-(1-메틸-피롤리딘-2-일)-에틸아민 0.22 g (1.8 mmol), 및 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드 0.31 g (1.5 mmol)로부터 실시예 12와 유사한 실험 조건을 이용하였다.

실리카겔 크로마토그래피, 디클로로메탄-메탄올-암모늄 히드록시드, 9-1-0.25를 이용한 용출을 이용한 정제에 의해 160 mg의 연황색 유성 화합물을 얻었다.

단계 2: 3,4,5-트리메톡시-N-[2-(1-메틸-피롤리딘-2일)-N-퀴놀린-3-일메틸-벤즈아미드

5 mL 테트라히드로푸란 중의 3,4,5-디메톡시 벤조산 0.11 g (0.55 mmol), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 히드로클로라이드 0.10 g (0.55 mmol), 1-히드록시벤조트리아졸 0.05 g (0.40 mmol), 트리에틸아민 0.08 mL (0.55 mmol), 및 2-(1-메틸-피롤리딘-2-일)-에틸-퀴놀린-3-일메틸-아민 0.1 g (0.37 mmol)으로부터 실시예 8과 유사한 실험 조건을 이용하였다. 실리카겔 크로마토그래피와 디클로로메탄-메탄올: 9-1을 이용한 용출을 이용한 정제에 의해 80 mg의 연황색 오일을 얻었다. C₂₇H₃₃N₃0₄ [M+H]를 위한 LC-MSD, m/z: 464.5. HPLC, C18 컬럼 구배 20-95% 아세토니트릴- 0.1% TFA(7분)에서 LC 보유 시간: 1.93 min.

실시예 18

본 실시예는 3,4,5-트리메톡시-N-[2-(1-메틸-피롤리딘-2일)-N-퀴놀린-2-일메틸-벤즈아미드의 제조를 예시한다.

단계 1: [2-(1- 메틸 - 피롤리딘 -2-일)-에틸-퀴놀린-2- 일메틸 -아민

10 mL 디클로로메탄 중의 퀴놀린-2-카르브알데히드 0.25 g (1.5 mmol), 2-(1-메틸-피롤리딘-2-일)-에틸아민 0.22 g (1.8 mmol), 및 소듐 트리아세톡시보로하 이드라이드 0.31 g (1.5 mmol)로부터 실시예 12와 유사한 실험 조건을 이용하였다.

실리카겔 크로마토그래피, 디클로로메탄-메탄올-암모늄 히드록시드, 9-1-0.25을 이용한 용출을 이용한 정제에 의해 0.24 g의 진한 오렌지색 유성 화합물을 얻었다.

단계 2: 3,4,5- 트리메톡시 -N-[2-(1- 메틸 - 피롤리딘 -2일)-N-퀴놀린-2- 일메틸 -벤즈아미드

5 mL 테트라히드로푸란 중의 3,4,5-디메톡시 벤조산 0.11 g (0.55 mmol), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 히드로클로라이드 0.10 g (0.55 mmol), 1-히드록시벤조트리아졸 0.05 g (0.40 mmol), 트리에틸아민 0.08 mL (0.55 mmol), 및 [2-(1-메틸-피롤리딘-2-일)-에틸-퀴놀린-2-일메틸-아민 0.1 g (0.37 mmol)로부터 실시예 8과 유사한 실험 조건을 이용하였다. 실리카겔 크로마토그래피와 디클로로메탄-메탄올: 9-1을 이용한 용출을 이용한 정제에 의해 50 mg 연황색 오일을 얻었다. C₂₇H₃₃N₃0₄ [M+H]를 위한 LC-MSD,m/z: 464.5. HPLC, C18 컬럼 구배 20-95% 아세토니트릴- 0.1% TFA(7분)에서 LC 보유 시간: 0.81.

실시예 19

본 실시예는 N-벤조[b]티오펜-3-일메틸-3,4,5-트리메톡시-N-[2-(1-메틸-피롤리딘-2-일)-에틸]-벤즈아미드의 제조를 예시한다.

단계 1: 벤조[b]티오펜 -3- 일메틸 -[2-(1- 메틸 - 피롤리딘 -2-일)-에틸]-아민

10 mL 디클로로메탄 중의 벤조 [b]티오펜-3-카르브알데히드 0.16 g (1 mmol), 2-(1-메틸-피롤리딘-2-일)-에틸아민 0.14 g (1.1 mmol), 및 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드 0.31 g (1.5 mmol)로부터 실시예 12와 유사한 실험 조건을 이용하였다. 실리카겔 크로마토그래피와 디클로로메탄-메탄올-암모늄 히드록시드, 9-1-0.25를 이용한 용출을 이용한 정제에 의해 140 mg의 화합물을 얻었다.

단계 2: N- 벤조[b]티오펜 -3- 일메틸 -3,4,5- 트리메톡시 -N-[2-(1- 메틸 - 피롤리딘 -2-일)-에틸]-벤즈아미드

3 mL 테트라히드로푸란 중의 3,4,5-디메톡시 벤조산 0.13 g (0.62 mmol), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 히드로클로라이드 0.09 g (0.62 mmol), 1-히드록시벤조트리아졸 0.08 g (0.62 mmol), 트리에틸아민 0.08 mL (0.62 mmol), 및 벤조[b]티오펜-2-일메틸-[2-(1-메틸-피롤리딘-2-일)-에틸]-아민 0.14 g (0.51 mmol)으로부터 실시예 8과 유사한 실험 조건을 이용하였다. 20-80% 아세토니트릴-0.1% TFA 구배를 가지는 역상 HPLC C18 컬럼을 이용하여 정제하여 120 mg의 흡습성 분말을 TFA 염으로 얻었다. C₂₆H₃₂N₂0₄S [M+H]를 위한 LC-MSD, m/z: 469.5. HPLC, C18 컬럼 구배 20-95% 아세토니트릴- 0.1% TFA(7분)에서 LC 보유 시간: 3.07 min.

실시예 20

본 실시예는 N-벤조티아졸-2-일메틸-3,4,5-트리메톡시-N-[2-(1-메틸-피롤리딘-2-일)-에틸]-벤즈아미드의 제조를 예시한다.

단계 1: 벤조 [티아졸-2- 일메틸 -[2-(1- 메틸 - 피롤리딘 -2-일)-에틸]-아민

10 mL 디클로로메탄 중의 벤조티아졸-2-카르브알데히드 0.16 g (1 mmol), 2-(1-메틸-피롤리딘-2-일)-에틸아민 0.14 g (1.1 mmol), 및 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드 0.31 g (1.5 mmol)으로부터 실시예 12와 유사한 실험 조건을 이용하였다. 실리카겔 크로마토그래피, 디클로로메탄-메탄올-암모늄 히드록시드, 9-1-0.25를 이용한 용출을 이용한 정제에 의해 0.15 mg의 화합물을 얻었다.

단계 2: N- 벤조트리아졸 -2- 일메틸 -3,4,5- 트리메톡시 -N-[2-(1- 메틸 - 피롤리딘 -2-일)-에틸]-벤즈아미드

3 mL 테트라히드로푸란 중의 3,4,5-디메톡시 벤조산 0.14 g (0.65 mmol), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 히드로클로라이드 0.1 g (0.65 mmol), 1-히드록시벤조트리아졸 0.08 g (0.65 mmol), 트리에틸아민 0.09 mL (0.65 mmol), 및 벤조트리아졸-2-일메틸-[2-(1-메틸-피롤리딘-2-일)-에틸]-아민 0.15 g (0.54 mmol)로부터 실시예 8과 유사한 실험 조건을 이용하였다. 20-80% 아세토니트 릴-0.1% TFA 구배를 가지는 역상 HPLC C18 컬럼을 이용하여 정제하여 120 mg의 흡습성 분말을 TFA 염으로 얻었다. C₂₅H₃₁N₃0₄S [M+H]를 위한 LC-MSD, m/z: 470.5. HPLC, C18 컬럼 구배 20-95% 아세토니트릴- 0.1% TFA(7분)에서 LC 보유 시간: 2.50.

실시예 21

본 실시예는 3,4,5-트리메톡시-N-(1-메틸-1H-벤조이미다졸-2-일메틸)-N-[2-(1-메틸-피롤리딘-2-일)-에틸]-벤즈아미드의 제조를 예시한다.

단계 1: (1- 메틸 -1H- 벤조이미다졸 -2- 일메틸 )-[2-(1- 메틸 - 피롤리딘 -2-일)-에틸]-아민

10 mL 디클로로메탄 중의 1-메틸-1H-벤조이미다졸-2-카르브알데히드 0.2 g (1.25 mmol), 2-(1-메틸-피롤리딘-2-일)-에틸아민 0.18 g (1.38 mmol), 및 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드 0.39 g (1. 87 mmol)로부터 실시예 12와 유사한 실험 조건을 이용하였다. 워크업 후, 물질을 조악한 상태로 이용하였다.

단계 2: 3,4,5- 트리메톡시 -N-(1- 메틸 -1H-인돌-2- 일메틸 )-N-[2-(1- 메틸 - 피롤리딘 -2-일)-에틸]-벤즈아미드

5 mL의 무수 디클로로메탄 중의 (1-메틸-1H-벤조이미다졸-2-일메틸)-[2-(1- 메틸-피롤리딘-2-일)-에틸]-아민, 3,4,5-트리메톡시-벤조일클로라이드 0.37 g (1.62 mmol), 및 트리에틸아민 0.26 mL (1.87 mmol)으로부터 실시예 12와 유사한 실험 조건을 이용하였다. 20-80% 아세토니트릴-0.1% TFA 구배를 가지는 역상 HPLC C18 컬럼을 이용하여 정제하여 110 mg의 순수한 물질을 얻었다. C₂₆H₃₄N₄0₄ [M+H]를 위한 LC-MSD, m/z: 467.2. HPLC, C18 컬럼 구배 20-95% 아세토니트릴- 0.1% TFA(7분)에서 LC 보유 시간: 0.43 min.

실시예 22

본 실시예는 N-(1H-인돌-2일메틸)-3,4,5-트리메톡시-N-[2-(1-메틸-피롤리딘-2-일)-에틸]-벤즈아미드의 제조를 예시한다.

단계 1:(1 H -인돌- 2일메틸 )-[2-(1- 메틸 - 피롤리딘 -2-일)-에틸]-아민

20 mL 디클로로메탄 중의 1H-인돌-2-카르브알데히드 0.14 g (2 mmol), 2-(1-메틸-피롤리딘-2-일)-에틸아민 0.3 g (2.4 mmol), 및 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드 0.87 g (1.87 mmol)으로부터 실시예 12와 유사한 실험 조건을 이용하였다. 실리카겔 크로마토그래피와 에틸-아세테이트-메탄올암모늄 히드록시드: 9-1-0.1 내지 8-2-0.2 용출을 이용하여 상기 화합물을 정제하여 0.3 g의 연갈색 오일을 얻었다.

단계 2: N-(1 H -인돌- 2일메틸 )-3,4,5- 트리메톡시 -N-[2-(1- 메틸 - 피롤리딘 -2-일)-에틸]-벤즈아미드

5 mL의 무수 디클로로메탄 중의 (1H-인돌-2일메틸)-[2-(1-메틸-피롤리딘-2-일)-에틸]-아민 0.8 g (0.31 mmol), 3,4,5-트리메톡시벤조일클로라이드 0.08 g (0.34 mmol), 및 트리에틸아민 0.06 mL (0.46 mmol)으로부터 실시예 12에 유사한 실험 조건을 이용하였다. 20-70% 아세토니트릴-0.1% TFA 구배를 가지는 역상 HPLC C18 컬럼을 이용하여 정제하여 50 mg의 순수한 물질을 얻었다. C₂₆H₃₃N₃0₄ [M+H]을 위한 LC-MSD,m/z: 452.2. HPLC, C18 컬럼 구배 20-95% 아세토니트릴- 0.1% TFA(7분)에서 LC 보유 시간: 1.99 min.

실시예 23

본 실시예는 N-(1H-인돌-2일메틸)-3,5-디메톡시-N-[2-(1-메틸-피롤리딘-2-일)-에틸]-벤즈아미드의 제조를 예시한다.

1.5 mL의 무수 디클로로메탄 중의 (1H-인돌-2일메틸)-[2-(1-메틸-피롤리딘-2-일)-에틸]-아민 0.1 g (0.38 mmol), 3,5-디메톡시벤조일클로라이드 0.08 g (0.42 mmol), 및 트리에틸아민 0.08 mL (0.57 mmol)으로부터 실시예 12와 유사한 실험 조건을 이용하였다. 20-70% 아세토니트릴-0.1 % TFA의 구배를 가지는 역상 HPLC C18 컬럼을 이용하여 상기 화합물을 정제하여 순수한 물질 50 mg을 얻었다. C₂₅H₃₁N₃0₃ [M+H]를 위한 LC-MSD, m/z: 422.2. HPLC, C18 컬럼 구배 20-95% 아세토니트릴- 0.1% TFA(7분)에서 LC 보유 시간: 2.7 min.

실시예 24

본 실시예는 N-비페닐-3-일-3,4,5-트리메톡시-N-[3-(2-메틸-피페리딘-1-일)-프로필]-벤즈아미드의 제조를 예시한다.

단계 1: 3-(비페닐-3- 일아미노 )-프로피온산 메틸 에스테르

둥근 바닥 플라스크에 3-아미노비페닐 2.6 g (15.3 mmol), 메틸 아크릴레이트 1.5 g (16.9 mmol) 및 쿠프릭 아세테이트 0.1 g를 첨가하고, 반응 혼합물을 90 ℃에서 5 시간동안 교반하고, 추가의 5 당량의 메틸 아크릴레이트 7 g (75 mmol), 및 0.25 g의 쿠프릭 아세테이트를 첨가하고, 반응 혼합물을 추가 5시간동안 가열하였다. 조 생성물을 15%의 에틸 아세테이트 및 페트롤륨 에테르를 이용한 실리카겔 크로마토그래피를 이용하여 정제하여 1.6 g의 오일을 얻었다.

단계 2: 3-(비페닐-3- 일아미노 )-프로피온산

3-(비페닐-3-일아미노)-프로피온산 메틸 에스테르 1.6 g (6.3 mmol)를 8 mL의 물 및 8 mL of 테트라히드로푸란에 흡수시키고, 이 용액에 0.4 g (9.5 mmol)의 리튬 히드록시드를 첨가하고, 반응물을 실온에서 5시간동안 교반하였다. 용매를 혼합물로부터 완전히 제거하고 물 10 mL을 첨가하고 에틸 아세테이트로 세척하였다. 상기 수용액을 1 M HCl로 세척하고, 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 배합된 유기층을 염수로 세척하고, 마그네슘 설페이트로 건조하고 진공에서 농축하여 다음 단계를 위해 조 생성물로 이용되는 산 1.6 g을 얻었다.

단계 3: 3-(비페닐-3- 일아미노 )-1-(2- 메틸 -피페리딘-1-일)-프로판-1-온

25 mL의 디클로로메탄중의 3-(비페닐-3-일아미노)-프로피온산 1.6 g (6.6 mmol), 2-메틸피페리딘 0.78 g (7.9 mmol)의 혼합물에 고체 O-(벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 4.7g (1.3 mmol), 및 트리에틸아민 3.86 mL (27 mmol)을 첨가하고, 실온에서 밤새 두었다. 반응 혼합물을 물로 세척하고, 유기층을 마그네슘 설페이트에서 건조시키고, 여과하고, 진공하에서 농축시켰다. 상기 화합물을 실리카겔 크로마토그래피를 이용하여 정제하고 에틸 아세테이트로 용출시켜 2 g의 물질을 얻었다.

단계 4: 비페닐-3-일-[3-(2- 메틸 -피페리딘-1-일)-프로필]-아민

10 mL의 테트라히드로푸란 중의 3-(비페닐-3-일아미노)-1-(2-메틸-피페리딘-1-일)-프로판-1-온 1 g (3.1 mmol)를 10 mL 건조 테트라히드로푸란 중의 리튬 알루미늄 하이드라이드 0.1 g (3.1 mmol)의 차가운 용액에 적가하였다. 상기 혼합물을 5 시간 동안 교반하고 이어서 소듐 설페이트의 포화 용액으로 급냉시켰다. 상기 화 합물을 클로로포름-메탄올 9:1을 이용한 실리카겔 크로마토그래피에 의해 정제하여 0.2 g의 화합물을 얻었다.

단계 5: N-비페닐-3-일-3,4,5- 트리메톡시 -N-[3-(2- 메틸 -피페리딘-1-일)-프로필]-벤즈아미드

3,4,5-트리메톡시벤조산 0.19 g (0.89 mmol)을 티오닐 클로라이드 0.26 mL (3.5 mmol)에 용해시키고 가드 튜브하에서 3 시간 동안 환류시켰다. 과량의 티오닐 클로라이드를 진공 하에서 제거하였다. 비페닐-3-일-[3-(2-메틸-피페리딘-1-일)-프로필]-아민 0.23 g (0.746 mmol)을 5 mL 디클로로메탄에 흡수시키고, 트리에틸아민 4.1 mL (3 mmol)을 첨가하고, 이어서 상기 혼합물을 냉각시키고 5 mL 디클로로메탄 중의 산 클로라이드를 적가하여 밤새 교반하였다. 용매를 진공하에서 제거하고 화합물을 클로로포름-메탄올 9-1을 이용한 실리카겔 크로마토그래피에 의해 정제하여 40 mg의 화합물을 얻었다. C₃₁H₃₈N₂0₄[M+H]를 위한 LC-MSD, m/z: 503.6. HPLC, C18 컬럼 구배 20-95% 아세토니트릴- 0.1% TFA(7분)에서 LC 보유 시간: 3.96.

실시예 24

본 실시예는 3,4,5-트리메톡시-N-[3-(2-메틸-피페리딘-1-일)-N-나프탈렌-2-일메틸-벤즈아미드의 제조를 예시한다.

단계 1:[3-(2- 메틸 -피페리딘-1-일)-프로필]-나프탈렌-2- 일메틸 -아민

25 mL의 건조 디클로로메탄 중의 2-나프트알데히드 1 g (6.4 mmol), 3-(2-메틸-피페리딘-1-일)-프로필아민 0.99 g (6.4 mmol)에 5 g의 분자체를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 분자체를 여과하고 진공하에서 디클로로메탄을 농축시켰다. 상기 혼합물에 15 mL의 건조 메탄올 및 소듐 보로하이드라이드 0.3 g (8 mmol)를 첨가하고, 30 분 후 반응이 완결되었다. 메탄올을 진공하에서 농축시키고, 클로로포름으로 희석하고, 유기층을 20 mL 물로 2회 세척하고, 염수로 세척하였다. 유기층을 마그네슘 설페이트에서 건조시키고 진공하에서 농축시켰다. 상기 화합물을 클로로포름중의 3.5% 메탄올을 이용한 실리카겔 크로마토그래피 용출을 이용하여 정제하여 0.6 g 오일을 얻었다.

단계 2: 3,4,5- 트리메톡시 -N-[3-(2- 메틸 -피페리딘-1-일)-N-나프탈렌-2- 일메틸 -벤즈아미드

[3-(2-메틸-피페리딘-1-일)-프로필]-나프탈렌-2-일메틸-아민 0.55 g (1.8 mmol), 3,4,5-트리메톡시-벤조산 0.04 g (2.2 mmol), 트리에틸아민 0.02 mL 및 O-(벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 0.18 g(3.6 mmol), 5 mL의 무수 디클로로메탄. 상기 화합물을 클로로포름 중의 2% 메탄올을 이용하여 정제하였다. C₃₀H₃₈N₂0₄[M+H]를 위한 LC-MSD, m/z: 491.6. HPLC, C18 컬럼 구배 20-95% 아세토니트릴- 0.1% TFA(7분)에서 LC 보유 시간: 3.86 min.

실시예 25

본 실시예는 3,4,5-트리메톡시-N-[3-(2-메틸-피페리딘-1-일)-프로필]-N-(5-페닐-티아졸-2-일메틸)-벤즈아미드의 제조를 예시한다.

단계 1:[3-(2- 메틸 -피페리딘-1-일)-프로필]-(5- 페닐 -티아졸- 2일메틸 )-아민

5 mL의 건조 디클로로메탄 중의 5-페닐-티아졸-2-카르브알데히드 0.16 g (1.05 mmol), 3-(2-메틸-피페리딘-1-일)-프로필아민 0.2 g (1.05 mmol)에 실시예 24와 유사한 실험 조건에 따라 2 g의 분자체를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 분자체를 여과하고 진공하에서 디클로로메탄을 농축시켰다. 상기 혼합물에 15 mL의 건조 메탄올 및 소듐 보로하이드라이드 0.04 g (1.155 mmol)를 0 ℃에서 첨가하고 30 분 후 반응이 완결되었다. 반응물을 2 mL 아세톤으로 급냉시키고, 메탄올을 진공하에서 농축시키고, 클로로포름으로 희석하고, 유기 층을 20 mL 물로 2회 세척하고 염수로 세척하였다. 유기층을 마그네슘 설페이트에서 건조시키고, 진공에서 농축하여 0.3 g의 화합물을 얻었다.

단계 2: 3,4,5- 트리메톡시 -N-[3-(2- 메틸 -피페리딘-1-일)-프로필]-N-(5- 페닐 -티아졸-2-일메틸)-벤즈아미드

20 mL의 에틸 아세테이트중의 [3-(2-메틸-피페리딘-1-일)-프로필]-(5-페닐-티아졸-2일메틸)-아민 0.15 g (0.45 mmol), 3,4,5-트리메톡시-벤조산 0.10 g (0.499 mmol), 트리에틸아민 0.15 mL 및 1-프로판포스폰산 시클릭 무수물 (에틸 아 세테이트 중에 50%) 0.34 g (0.54 mmol)으로부터 실시예 24와 유사한 실험 조건을 이용하였다. 상기 화합물을 클로로포름으로 용출하는 중성 알루미나 젤 크로마토그래피를 이용하여 정제하여 120 mg의 물질을 얻었다. C₂₉H₃₇N₃0₄S [M+H]를 위한 LC-MSD, m/z: 524.6. HPLC, C18 컬럼 구배 20-95% 아세토니트릴- 0.1% TFA(7분)에서 LC 보유 시간: 3.54.

실시예 26

본 실시예는 3,4,5-트리메톡시-N-[3-(2-메틸-피페리딘-1-일)-프로필]-N-나프탈렌-2-일-벤즈아미드의 제조를 예시한다.

단계 1: [3-(2- 메틸 -피페리딘-1-일)-프로필]-나프탈렌-2-일 아민

질소 하의 둥근 바닥 플라스크에, 25 mL DME 중의 팔라듐(II) 아세테이트 0.09 g (0.4 mmol), rac-2,2'-비스(디페닐포스피노)-1,1'-바이나프틸 0.53 g (0.8 mmol), 트리포타슘 포스페이트 일염기 0.06 g (29 mmol)를 첨가하고, 이 혼합물에 2-브로모나프탈렌 1.7 g (8.2 mmol), 및 2-메틸-피페리딘-N-프로필아민 4g (25.6 mmol)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 17시간 동안 환류시켰다. 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고 농축시켰다. 상기 화합물을 클로로포름중의 5% 메탄올을 이용한 용출을 이용하는 실리카겔 크로마토그래피를 이용하여 정제하여 0.47 g의 화 합물을 얻었다.

단계 2: 3,4,5- 트리메톡시 -N-[3-(2- 메틸 -피페리딘-1-일)-프로필]-N-나프탈렌-2-일-벤즈아미드

15 mL 클로로포름 중의 3,4,5 트리메톡시 벤조산 0.53 g (2.5 mmol), 티오닐 클로라이드 0.24 mL (3.34 mmol), 트리에틸아민 0.7 mL (5 mmol) 및 [3-(2-메틸-피페리딘-1-일)-프로필]-나프탈렌-2-일 아민 0.47 g (1.67 mmol)로부터 실시예 24와 유사한 실험 조건을 이용하였다. 상기 화합물을 실리카겔 크로마토그래피를 이용하여 정제하여 150 mg의 물질을 얻었다. C₂₉H₃₆N₂0₄ [M+H]를 위한 LC-MSD,m/z: 477.5. HPLC, C18 컬럼 구배 20-95% 아세토니트릴- 0.1% TFA(7분)에서 LC 보유 시간: 3.49.

본 명세서에서 언급된 모든 문헌 및 특허 출원은 각각의 개별 문헌 또는 특허 출원이 구체적으로 그리고 개별적으로 참고로 통합되는 것으로 언급된 것처럼 참고로 본원에 통합된다.

전술한 발명이 이해를 명확히 하기 위하여 예로서 다소 상세히 설명되었지만, 일부 변형 및 변화가 첨부된 청구항의 사상 또는 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있음이 당업자에게 명확할 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> Burns, Jennifer Summers, Bretton Wang, Yu Howard, Maureen Schall, Thomas Miao, Zhenhua ChemoCentryx, Inc. <120> Methods and Compositions for Modulating Angiogenesis <130> 019934-004930PC <140> WO PCT/US05/03521 <141> 2005-02-02 <150> US 60/541,849 <151> 2004-02-03 <150> US 60/598,958 <151> 2004-08-04 <150> US 60/626,195 <151> 2004-11-08 <160> 18 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1089 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> G-protein coupled receptor (GPCR) CCX-CKR2 (RDC1) coding sequence <400> 1 atggatctgc atctcttcga ctactcagag ccagggaact tctcggacat cagctggcca 60 tgcaacagca gcgactgcat cgtggtggac acggtgatgt gtcccaacat gcccaacaaa 120 agcgtcctgc tctacacgct ctccttcatt tacattttca tcttcgtcat cggcatgatt 180 gccaactccg tggtggtctg ggtgaatatc caggccaaga ccacaggcta tgacacgcac 240 tgctacatct tgaacctggc cattgccgac ctgtgggttg tcctcaccat cccagtctgg 300 gtggtcagtc tcgtgcagca caaccagtgg cccatgggcg agctcacgtg caaagtcaca 360 cacctcatct tctccatcaa cctcttcggc agcattttct 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Ser Trp Pro Cys Asn Ser Ser Asp Cys Ile Val Val Asp Thr Val 20 25 30 Met Cys Pro Asn Met Pro Asn Lys Ser Val Leu Leu Tyr Thr Leu Ser 35 40 45 Phe Ile Tyr Ile Phe Ile Phe Val Ile Gly Met Ile Ala Asn Ser Val 50 55 60 Val Val Trp Val Asn Ile Gln Ala Lys Thr Thr Gly Tyr Asp Thr His 65 70 75 80 Cys Tyr Ile Leu Asn Leu Ala Ile Ala Asp Leu Trp Val Val Leu Thr 85 90 95 Ile Pro Val Trp Val Val Ser Leu Val Gln His Asn Gln Trp Pro Met 100 105 110 Gly Glu Leu Thr Cys Lys Val Thr His Leu Ile Phe Ser Ile Asn Leu 115 120 125 Phe Gly Ser Ile Phe Phe Leu Thr Cys Met Ser Val Asp Arg Tyr Leu 130 135 140 Ser Ile Thr Tyr Phe Thr Asn Thr Pro Ser Ser Arg Lys Lys Met Val 145 150 155 160 Arg Arg Val Val Cys Ile Leu Val Trp Leu Leu Ala Phe Cys Val Ser 165 170 175 Leu Pro Asp Thr Tyr Tyr Leu Lys Thr Val Thr Ser Ala Ser Asn Asn 180 185 190 Glu Thr Tyr Cys Arg Ser Phe Tyr Pro Glu His Ser Ile Lys Glu Trp 195 200 205 Leu Ile Gly Met Glu Leu Val Ser Val Val Leu Gly Phe Ala Val Pro 210 215 220 Phe Ser Ile Ile Ala Val Phe Tyr Phe Leu Leu Ala Arg Ala Ile Ser 225 230 235 240 Ala Ser Ser Asp Gln Glu Lys His Ser Ser Arg Lys Ile Ile Phe Ser 245 250 255 Tyr Val Val Val Phe Leu Val Cys Trp Leu Pro Tyr His Val Ala Val 260 265 270 Leu Leu Asp Ile Phe Ser Ile Leu His Tyr Ile Pro Phe Thr Cys Arg 275 280 285 Leu Glu His Ala Leu Phe Thr Ala Leu His Val Thr Gln Cys Leu Ser 290 295 300 Leu Val His Cys Cys Val Asn Pro Val Leu Tyr Ser Phe Ile Asn Arg 305 310 315 320 Asn Tyr Arg Tyr Glu Leu Met Lys Ala Phe Ile Phe Lys Tyr Ser Ala 325 330 335 Lys Thr Gly Leu Thr Lys Leu Ile Asp Ala Ser Arg Val Ser Glu Thr 340 345 350 Glu Tyr Ser Ala Leu Glu Gln Ser Thr Lys 355 360 <210> 3 <211> 1089 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> G-protein coupled receptor (GPCR) CCX-CKR2.2 coding sequence <400> 3 atggatctgc acctcttcga ctacgccgag ccaggcaact tctcggacat cagctggcca 60 tgcaacagca gcgactgcat cgtggtggac acggtgatgt gtcccaacat gcccaacaaa 120 agcgtcctgc tctacacgct ctccttcatt tacattttca tcttcgtcat cggcatgatt 180 gccaactccg tggtggtctg 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sequence <400> 5 atggatctgc atctcttcga ctactcagag ccagggaact tctcggacat cagctggcca 60 tgcaacagca gcgactgcat cgtggtggac acggtgatgt gtcccaacat gcccaacaaa 120 agcgtcctgc tctacacgct ctccttcatt tacattttca tcttcgtcat cggcatgatt 180 gccaactccg tggtggtctg ggtgaatatc caggccaaga ccacaggcta tgacacgcac 240 tgctacatct tgaacctggc cattgccgac ctgtgggttg tcctcaccat cccagtctgg 300 gtggtcagtc tcgtgcagca caaccagtgg cccatgggcg agctcacgtg caaagtcaca 360 cacctcatct tctccatcaa cctcttcggc agcattttct tcctcacgtg catgagcgtg 420 gaccgctacc tctccatcac ctacttcacc aacaccccca gcagcaggaa gaagatggta 480 cgccgtgtcg tctgcatcct ggtgtggctg ctggccttct gcgtgtctct gcctgacacc 540 tactacctga agaccgtcac gtctgcgtcc aacaatgaga cctactgccg gtccttctac 600 cccgagcaca gcatcaagga gtggctgatc ggcatggagc tggtctccgt tgtcttgggc 660 tttgccgttc ccttctccat tgtcgctgtc ttctacttcc tgctggccag agccatctcg 720 gcgtccagtg accaggagaa gcacagcagc cggaagatca tcttctccta cgtggtggtc 780 ttccttgtct gctggttgcc ctaccacgtg gcggtgctgc tggacatctt ctccatcctg 840 cactacatcc ctttcacctg ccggctggag cacgccctct tcacggccct gcatgtcaca 900 cagtgcctgt cgctggtgca ctgctgcgtc aaccctgtcc tctacagctt catcaatcgc 960 aactacaggt acgagctgat gaaggccttc atcttcaagt actcggccaa aacagggctc 1020 accaagctca tcgatgcctc cagagtctca gagacggagt actctgcctt ggagcagagc 1080 accaaatga 1089 <210> 6 <211> 362 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> G-protein coupled receptor (GPCR) CCX-CKR2.3 <400> 6 Met Asp Leu His Leu Phe Asp Tyr Ser Glu Pro Gly Asn Phe Ser Asp 1 5 10 15 Ile Ser Trp Pro Cys Asn Ser Ser Asp Cys Ile Val Val Asp Thr Val 20 25 30 Met Cys Pro Asn Met Pro Asn Lys Ser Val Leu Leu Tyr Thr Leu Ser 35 40 45 Phe Ile Tyr Ile Phe Ile Phe Val Ile Gly Met Ile Ala Asn Ser Val 50 55 60 Val Val Trp Val Asn Ile Gln Ala Lys Thr Thr Gly Tyr Asp Thr His 65 70 75 80 Cys Tyr Ile Leu Asn Leu Ala Ile Ala Asp Leu Trp Val Val Leu Thr 85 90 95 Ile Pro Val Trp Val Val Ser Leu Val Gln His Asn Gln Trp Pro Met 100 105 110 Gly Glu Leu Thr Cys Lys Val Thr His Leu Ile Phe Ser Ile Asn Leu 115 120 125 Phe Gly Ser Ile Phe Phe Leu Thr Cys Met Ser Val Asp Arg Tyr Leu 130 135 140 Ser Ile Thr Tyr Phe Thr Asn Thr Pro Ser Ser Arg Lys Lys Met Val 145 150 155 160 Arg Arg Val Val Cys Ile Leu Val Trp Leu Leu Ala Phe Cys Val Ser 165 170 175 Leu Pro Asp Thr Tyr Tyr Leu Lys Thr Val Thr Ser Ala Ser Asn Asn 180 185 190 Glu Thr Tyr Cys Arg Ser Phe Tyr Pro Glu His Ser Ile Lys Glu Trp 195 200 205 Leu Ile Gly Met Glu Leu Val Ser Val Val Leu Gly Phe Ala Val Pro 210 215 220 Phe Ser Ile Val Ala Val Phe Tyr Phe Leu Leu Ala Arg Ala Ile Ser 225 230 235 240 Ala Ser Ser Asp Gln Glu Lys His Ser Ser Arg Lys Ile Ile Phe Ser 245 250 255 Tyr Val Val Val Phe Leu Val Cys Trp Leu Pro Tyr His Val Ala Val 260 265 270 Leu Leu Asp Ile Phe Ser Ile Leu His Tyr Ile Pro Phe Thr Cys Arg 275 280 285 Leu Glu His Ala Leu Phe Thr Ala Leu His Val Thr Gln Cys Leu Ser 290 295 300 Leu Val His Cys Cys Val Asn Pro Val Leu Tyr Ser Phe Ile Asn Arg 305 310 315 320 Asn Tyr Arg Tyr Glu Leu Met Lys Ala Phe Ile Phe Lys Tyr Ser Ala 325 330 335 Lys Thr Gly Leu Thr Lys Leu Ile Asp Ala Ser Arg Val Ser Glu Thr 340 345 350 Glu Tyr Ser Ala Leu Glu Gln Ser Thr Lys 355 360 <210> 7 <211> 1089 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> G-protein coupled receptor (GPCR) CCX-CKR2.4 coding sequence <400> 7 atggatctgc atctcttcga ctactcagag ccagggaact tctcggacat cagctggcca 60 tgcaacagca gcgactgcat cgtggtggac acggtgatgt gtcccaacat gcccaacaaa 120 agcgtcctgc tctacacgct ctccttcatt tacattttca tcttcgtcat cggcatgatt 180 gccaactccg tggtggtctg ggtgaatatc caggccaaga ccacaggcta tgacacgcac 240 tgctacatct tgaacctggc cattgccgac ctgtgggttg tcctcaccat cccagtctgg 300 gtggtcagtc tcgtgcagca caaccagtgg cccatgggcg agctcacgtg caaagtcaca 360 cacctcatct tctccatcaa cctcttcggc agcattttct tcctcacgtg catgagcgtg 420 gaccgctacc tctccatcac ctacttcacc aacaccccca gcagcaggaa gaagatggta 480 cgccgtgtcg tctgcatcct ggtgtggctg ctggccttct gcgtgtctct gcctgacacc 540 tactacctga agaccgtcac gtctgcgtcc aacaatgaga cctactgccg gtccttctac 600 cccgagcaca gcatcaagga gtggctgatc ggcatggagc tggtctccgt tgtcttgggc 660 tttgccgttc ccttctccat tatcgctgtc ttctacttcc tgctggccag agccatctcg 720 gcgtccagtg accaggagaa gcacagcagc cggaagatca tcttctccta cgtggtggtc 780 ttccttgtct gctggctgcc ctaccacgtg gcggtgctgc tggacatctt ctccatcctg 840 cactacatcc ctttcacctg ccggctggag cacgccctct tcacggccct gcatgtcaca 900 cagtgcctgt cgctggtgca ctgctgcgtc aaccctgtcc tctacagctt catcaatcgc 960 aactacaggt acgagctgat gaaggccttc atcttcaagt actcggccaa aacagggctc 1020 accaagctca tcgatgcctc cagagtctca gagacggagt actctgcctt ggagcagagc 1080 accaaatga 1089 <210> 8 <211> 362 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> G-protein coupled receptor (GPCR) CCX-CKR2.4 <400> 8 Met Asp Leu His Leu Phe Asp Tyr Ser Glu Pro Gly Asn Phe Ser Asp 1 5 10 15 Ile Ser Trp Pro Cys Asn Ser Ser Asp Cys Ile Val Val Asp Thr Val 20 25 30 Met Cys Pro Asn Met Pro Asn Lys Ser Val Leu Leu Tyr Thr Leu Ser 35 40 45 Phe Ile Tyr Ile Phe Ile Phe Val Ile Gly Met Ile Ala Asn Ser Val 50 55 60 Val Val Trp Val Asn Ile Gln Ala Lys Thr Thr Gly Tyr Asp Thr His 65 70 75 80 Cys Tyr Ile Leu Asn Leu Ala Ile Ala Asp Leu Trp Val Val Leu Thr 85 90 95 Ile Pro Val Trp Val Val Ser Leu Val Gln His Asn Gln Trp Pro Met 100 105 110 Gly Glu Leu Thr Cys Lys Val Thr His Leu Ile Phe Ser Ile Asn Leu 115 120 125 Phe Gly Ser Ile Phe Phe Leu Thr Cys Met Ser Val Asp Arg Tyr Leu 130 135 140 Ser Ile Thr Tyr Phe Thr Asn Thr Pro Ser Ser Arg Lys Lys Met Val 145 150 155 160 Arg Arg Val Val Cys Ile Leu Val Trp Leu Leu Ala Phe Cys Val Ser 165 170 175 Leu Pro Asp Thr Tyr Tyr Leu Lys Thr Val Thr Ser Ala Ser Asn Asn 180 185 190 Glu Thr Tyr Cys Arg Ser Phe Tyr Pro Glu His Ser Ile Lys Glu Trp 195 200 205 Leu Ile Gly Met Glu Leu Val Ser Val Val Leu Gly Phe Ala Val Pro 210 215 220 Phe Ser Ile Ile Ala Val Phe Tyr Phe Leu Leu Ala Arg Ala Ile Ser 225 230 235 240 Ala Ser Ser Asp Gln Glu Lys His Ser Ser Arg Lys Ile Ile Phe Ser 245 250 255 Tyr Val Val Val Phe Leu Val Cys Trp Leu Pro Tyr His Val Ala Val 260 265 270 Leu Leu Asp Ile Phe Ser Ile Leu His Tyr Ile Pro Phe Thr Cys Arg 275 280 285 Leu Glu His Ala Leu Phe Thr Ala Leu His Val Thr Gln Cys Leu Ser 290 295 300 Leu Val His Cys Cys Val Asn Pro Val Leu Tyr Ser Phe Ile Asn Arg 305 310 315 320 Asn Tyr Arg Tyr Glu Leu Met Lys Ala Phe Ile Phe Lys Tyr Ser Ala 325 330 335 Lys Thr Gly Leu Thr Lys Leu Ile Asp Ala Ser Arg Val Ser Glu Thr 340 345 350 Glu Tyr Ser Ala Leu Glu Gln Ser Thr Lys 355 360 <210> 9 <211> 1089 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> G-protein coupled receptor (GPCR) CCX-CKR2.5 coding sequence <400> 9 atggatctgc atctcttcga ctactcagag ccagggaact tctcggacat cagctggccg 60 tgcaacagca gcgactgcat cgtggtggac acggtgatgt gtcccaacat gcccaacaaa 120 agcgtcctgc tctacacgct ctccttcatt tacattttca tcttcgtcat cggcatgatt 180 gccaactccg tggtggtctg ggtgaatatc caggccaaga ccacaggcta tgacacgcac 240 tgctacatct tgaacctggc cattgccgac ctgtgggttg tcctcaccat cccagtctgg 300 gtggtcagtc tcgtgcagca caaccagtgg cccatgggcg agctcacgtg caaagtcaca 360 cacctcatct tctccatcaa cctcttcagc agcattttct tcctcacgtg catgagcgtg 420 gaccgctacc tctccatcac ctacttcacc aacaccccca gcagcaggaa gaagatggta 480 cgccgtgtcg tctgcatcct ggtgtggctg ctggccttct gcgtgtctct gcctgacacc 540 tactacctga agaccgtcac gtctgcgtcc aacaatgaga cctactgccg gtccttctac 600 cccgagcaca gcatcaagga gtggctgatc ggcatggagc tggtctccgt tgtcttgggc 660 tttgccgttc ccttctccat tatcgctgtc ttctacttcc tgctggccag agccatctcg 720 gcgtccagtg accaggagaa gcacagcagc cggaagatca tcttctccta cgtggtggtc 780 ttccttgtct gctggttgcc ctaccacgtg gcggtgctgc tggacatctt ctccatcctg 840 cactacatcc ctttcacctg ccggctggag cacgccctct tcacggccct gcatgtcaca 900 cagtgcctgt cgctggtgca ctgctgcgtc aaccctgtcc tctacagctt catcaatcgc 960 aactacaggt acgagctgat gaaggccttc atcttcaagt actcggccaa aacagggctc 1020 accaagctca tcgatgcctc cagagtctca gagacggagt actccgcctt ggagcagagc 1080 accaaatga 1089 <210> 10 <211> 362 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> G-protein coupled receptor (GPCR) CCX-CKR2.5 <400> 10 Met Asp Leu His Leu Phe Asp Tyr Ser Glu Pro Gly Asn Phe Ser Asp 1 5 10 15 Ile Ser Trp Pro Cys Asn Ser Ser Asp Cys Ile Val Val Asp Thr Val 20 25 30 Met Cys Pro Asn Met Pro Asn Lys Ser Val Leu Leu Tyr Thr Leu Ser 35 40 45 Phe Ile Tyr Ile Phe Ile Phe Val Ile Gly Met Ile Ala Asn Ser Val 50 55 60 Val Val Trp Val Asn Ile Gln Ala Lys Thr Thr Gly Tyr Asp Thr His 65 70 75 80 Cys Tyr Ile Leu Asn Leu Ala Ile Ala Asp Leu Trp Val Val Leu Thr 85 90 95 Ile Pro Val Trp Val Val Ser Leu Val Gln His Asn Gln Trp Pro Met 100 105 110 Gly Glu Leu Thr Cys Lys Val Thr His Leu Ile Phe Ser Ile Asn Leu 115 120 125 Phe Ser Ser Ile Phe Phe Leu Thr Cys Met Ser Val Asp Arg Tyr Leu 130 135 140 Ser Ile Thr Tyr Phe Thr Asn Thr Pro Ser Ser Arg Lys Lys Met Val 145 150 155 160 Arg Arg Val Val Cys Ile Leu Val Trp Leu Leu Ala Phe Cys Val Ser 165 170 175 Leu Pro Asp Thr Tyr Tyr Leu Lys Thr Val Thr Ser Ala Ser Asn Asn 180 185 190 Glu Thr Tyr Cys Arg Ser Phe Tyr Pro Glu His Ser Ile Lys Glu Trp 195 200 205 Leu Ile Gly Met Glu Leu Val Ser Val Val Leu Gly Phe Ala Val Pro 210 215 220 Phe Ser Ile Ile Ala Val Phe Tyr Phe Leu Leu Ala Arg Ala Ile Ser 225 230 235 240 Ala Ser Ser Asp Gln Glu Lys His Ser Ser Arg Lys Ile Ile Phe Ser 245 250 255 Tyr Val Val Val Phe Leu Val Cys Trp Leu Pro Tyr His Val Ala Val 260 265 270 Leu Leu Asp Ile Phe Ser Ile Leu His Tyr Ile Pro Phe Thr Cys Arg 275 280 285 Leu Glu His Ala Leu Phe Thr Ala Leu His Val Thr Gln Cys Leu Ser 290 295 300 Leu Val His Cys Cys Val Asn Pro Val Leu Tyr Ser Phe Ile Asn Arg 305 310 315 320 Asn Tyr Arg Tyr Glu Leu Met Lys Ala Phe Ile Phe Lys Tyr Ser Ala 325 330 335 Lys Thr Gly Leu Thr Lys Leu Ile Asp Ala Ser Arg Val Ser Glu Thr 340 345 350 Glu Tyr Ser Ala Leu Glu Gln Ser Thr Lys 355 360 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:small interfering RNA siRNA #1 <400> 11 gccgttccct tctccattat t 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:small interfering RNA siRNA #2 <400> 12 gagctcacgt gcaaagtcat t 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:small interfering RNA siRNA #3 <400> 13 gacatcagct ggccatgcat t 21 <210> 14 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:hairpin small interfering RNA (siRNA) <400> 14 caccgcctaa caagaacgtg cttctcgaaa gaagcacgtt cttgttaggc 50 <210> 15 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:hairpin small interfering RNA (siRNA) <400> 15 caccgggtga atatccaggc taagacgaat cttagcctgg atattcaccc 50 <210> 16 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:hairpin small interfering RNA (siRNA) <400> 16 caccggtcag tctcgtgcag cataacgaat tatgctgcac gagactgacc 50 <210> 17 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:hairpin small interfering RNA (siRNA) <400> 17 caccgcttcc aacaatgaga cctaccgaag taggtctcat tgttggaagc 50 <210> 18 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:hairpin small interfering RNA (siRNA) <400> 18 caccgctgga gaatgtgctc tttaccgaag taaagagcac attctccagc 50

Claims (36)

1. CCX-CKR2에 대한 결합에 대해 SDF-1 또는 I-TAC과 경쟁하는 CCX-CKR2 특이적 항체를 포함하는, 피험체에서 암, 관절염 및 상처로 이루어진 군에서 선택된 질병을 치료하기 위한 약학 조성물로서, 상기 암은 암종 고형 종양, 선암종 고형 종양, 림프종 고형 종양, 육종 고형 종양, 백혈병과 같은 혈액성 종양, 혈관종, 속귀신경집종, 신경섬유종, 트라코마, 화농육아종, 암종, 신경아교종, 중피종, 흑색종, 림프종, 백혈병, 선암종, 난소암, 경부암, 교아종, 전립선암, 버키트 림프종, 두경부암, 결장암, 결장직장암, 비-소세포 폐암, 소세포 폐암, 식도암, 위암, 췌장암, 간쓸개암, 담낭암, 소장암, 직장암, 신장암, 방광암, 음경암, 요도암, 고환암, 질암, 자궁암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 췌장 내분비암, 카르시노이드암, 골암, 피부암, 망막모세포종, 호킨스 림프종, 및 비호킨스 림프종으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 약학 조성물.
2. 제1항에 있어서, 질병이 관절염인 것인 약학 조성물.
3. 제1항에 있어서, 항체가 항염증제 또는 항관절염제와 함께 사용되는 것인 약학 조성물.
4. 제1항에 있어서, 질병이 암인 것인 약학 조성물.
5. 제4항에 있어서, 암은 암종 고형 종양, 선암종 고형 종양, 림프종 고형 종양, 및 육종 고형 종양으로부터 선택되는 것인 약학 조성물.
6. 제1항에 있어서, 질병이 상처인 것인 약학 조성물.
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