MXPA06004843A - Composiciones y metodos para detectar y tratar enfermedades y condiciones relacionadas con receptores de quemocina - Google Patents

Abstract

Se describen ligandos de CCX-CKR2 y el rol biológico de CCX-CKR2 en cáncer.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA DETECTAR Y TRATAR ENFERMEDADES Y CONDICIONES RELACIONADAS CON RECEPTORES DE QUEMOCINA ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las quimioquinas constituyen una familia de citoquinas pequeñas que se producen en la inflamación y regulan el reclutamiento, activación y proliferación de leucocitos (Baggiolini, M. y colaboradores, Adv. Immunol . 55: 97-179 (1994); Springer, T. A., Annu Rev. Physiol. 57:827-872 (1995); y Schalí, T. J. y K. B. Bacon, Curr. Opin. Immunol . 6:865-873 (1994)). Las quimioquinas son capaces de inducir selectivamente la quimiotaxis de los elementos formados de la sangre (diferentes a los glóbulos rojos) , incluyendo leucocitos tales como neutrófilos, monocitos, macrófagos, eosinófilos, basófilos, células cebadas y linfocitos, incluyendo células T y células B. Además de estimular la quimiotaxis, otros cambios pueden ser selectivamente inducidos por la quimioquinas en células responsivas, incluyendo cambios en la forma de la célula, elevaciones transientes de la concentración de iones de calcio libres intracelulares (Ca2+) , exocitosis de granulo, regulación hacia arriba de la integrina, formación de lipidos bioactivos (por ejemplo, leucotrienos) e interrupción respiratoria, asociada con la activación de leucocito. Asi, las quimioquinas son activadoras tempranas de la respuesta inflamatoria, causando liberación mediadora inflamatoria, quimiotaxis y extravasación a sitios de infección o inflamación. Dos subfamilias de quimioquinas, designadas como quimioquinas CXC y CC, son distinguidas por el arreglo de los primeros dos de los cuatro residuos de cisteina conservados, que son ya sea separados por un aminoácido (como en quimioquinas CXC SDF-1, 1L-8, IP-10, MIG, PF4, ENA-78, GCP-2, GRO-a, GRO-ß, GRO-?, NAP-2, NAP-4, I-TAC) o son residuos adyacentes (como en las quimioquinas CC, MlP-la, MlP-lß, RANTES, MCP-1, MCP-2, MCP-3, 1-309) . La mayoría de las quimioquinas CXC atraen leucocitos de neutrófilo. Por ejemplo, las quimioquinas CXC interieucina 8 (IL-8), factor de plaqueta 4 (PF4) y péptido de activación de neutrófilo 2 (NAP-2) son quimioatraedores y activadores potentes de neutrófilos. Las quimioquinas CXC designadas MIG ( onoquina inducida por gamma interferona) e IP-10 (proteina de 10 kDa inducida por interferona-?) son particularmente activas en inducir la quimiotaxis de linfocitos de la sangre periférica activados. Las quimioquinas CC son- generalmente menos selectivas y pueden atraer una variedad de tipos de células de leucocito, incluyendo monocitos, eosinófilos, basófilos, linfocitos T y células exterminadoras naturales. Las quimioquinas CC tales como las proteínas quimiotácticas de monocito humanas 1-3 (MCP-1, MCP-2 y MCP-3) , RANTES (Regulado en la Activación, Normal T Expresado y Secretado) , y las proteínas inflamatorias de macrófago la y lß (MlP-la y MIP-Iß) se han caracterizado como quimioatraedores y activadores de monocitos o linfocitos, pero no se presenta que sean quimioatraedores para neutrófilos. Las quimioquinas CC y CXC actúan a través de receptores que pertenecen a una superfamilia de siete receptores acoplados a proteína G que abarca la transmembrana (Murphy, P. M., Pharmacol Rev. 52:145-176 (2000)). Esta familia de receptores acoplados de proteína G comprenden un grupo grande de proteínas de membrana integrales, ' que contienen siete regiones que abarcan la transmembrana. Los receptores están acoplados a proteínas G, que son proteínas regulatorias heterotriméricas capaces de enlazar GTP y mediar la transducción de señal de receptores acoplados, por ejemplo, mediante la producción de mediadores intracelulares. Generalmente hablando, las interacciones de quimioquina y receptor de quimioquina tienden a ser promiscuas en que una quimioquina pueden enlazar muchos receptores de quimioquina y a la inversa un solo receptor de quimioquina puede interactuar con varias quimioqüinas . Existen unas cuantas excepciones a esta regla; una de tal excepción ha sido la interacción entre SDF-1 y CXCR4 (Bleul y colaboradores, J Exp Med, 184 (3) : 1101-9 (1996); Oberlin y colaboradores, Nature, 382 (6594) : 833-5 (1996). Originalmente identificado como un factor de estimulación de pre-crecimiento de célula B (Nagasawa y colaboradores, Proc Acad Sci E U A, 91(6):2305-9 (1994)), SDF-1 ha sido el único ligando humano reportado para CXCR4. El gen SDF-1 codifica dos proteínas, designadas SDF-la y SDF-lß, mediante empalme alternativo. Estas dos proteínas son idénticas excepto por los cuatro residuos de aminoácido que están presentes en el carboxi-terminal SDF-lß y ausente de SDF-la. Existen muchos aspectos de señalización y selectividad del receptor de quimioquina para ligandos que no se entendieron previamente. Por ejemplo, hay un número de receptores huérfanos para los cuales no se ha determinado previamente la función. RDC1, por ejemplo, aunque más temprano se piensa que es un receptor para el péptido intestinal vasoactivo (VIP) , es ahora considerado que es un receptor huérfano debido a que su ligando endógeno no se ha identificado. Ver, por ejemplo, Cook y colaboradores, (2) : 149-152 (1992) . La presente invención se dirige a éstos y otros puntos . BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona métodos para identificar un agente que enlaza a CCX-CKR2 sobre una célula. En algunas modalidades, el método comprende poner en contacto una pluralidad de agentes a un polipéptido CCX-CKR2 que comprende un dominio extracelular por lo menos por 95% idéntico a un dominio extracelular de SEQ ID NO: 2, o un fragmento del mismo que enlaza SDF1 o I-TAC; y seleccionar un agente que compite con I-TAC o SDF1 para enlazar al polipéptido CCX-CKR2 o fragmento del mismo, para de esta manera identificar un agente que enlaza CCX-CKR2 sobre una célula. En algunas modalidades, la célula es una célula de cáncer. En algunas modalidades, el método además comprende probar el agente seleccionado para la habilidad para enlazar a, o inhibir el crecimiento de, una célula. En algunas modalidades, la célula es una célula de cáncer. En algunas modalidades, el método además comprende probar el agente seleccionado para la habilidad para alterar la función del riñon. En algunas modalidades, el método además comprende probar el agente seleccionado para la habilidad para alterar el cerebro o la función neuronal. En algunas modalidades, el método además comprende probar el agente seleccionado para la habilidad para cambiar la adhesión celular a las células endoteliales. En algunas modalidades, el agente es de menos 1,500 daltons. En algunas modalidades, el agente es un anticuerpo. En algunas modalidades, el agente es un polipéptido. En algunas modalidades, el polipéptido CCX-CKR2 comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 2. La presente invención también proporciona métodos para determinar la presencia o ausencia de una célula de cáncer. En algunas modalidades, el método comprende poner en contacto una muestra que comprende una célula con un agente que específicamente se enlaza con SEQ ID NO: 2, y detectar el enlace del agente a un polipéptido en la muestra, en donde el enlace del agente a la muestra indica la presencia de una célula de cáncer. En algunas modalidades, el agente es un anticuerpo. En algunas modalidades, el agente es de menos de 1,500 daltons. En algunas modalidades, el agente es un polipéptido. En algunas modalidades, el polipéptido detectado es la SEQ ID NO: 2. En algunas modalidades, la muestra es de un humano. En algunas modalidades, el método se utiliza para el diagnóstico de cáncer en un humano. En algunas modalidades, el método se utiliza para proporcionar un pronóstico de cáncer en un humano. En algunas modalidades, el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer cervical, cáncer de seno, linfoma, glioblastomas, cáncer de próstata y leucemia. En algunas modalidades, el cáncer no es sarcoma de Kaposi, enfermedad de Castleman multicéntrica o linfoma de fusión primaria asociada con SIDA. En algunas modalidades, el anticuerpo compite con SDF1 e I-TAC para el enlace a SEQ ID NO: 2. La presente invención también proporciona métodos para proporcionar una diagnóstico o pronóstico de un individuo que tiene cáncer. En algunas modalidades, el método comprende detectar la presencia o ausencia de la expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido CCX-CKR2 en una célula de un individuo, en donde el polipéptido CCX-CKR2 enlaza SDFl y/o SDF-1 y el polipéptido CCX-CKR2 es por lo menos 95% idéntico a la SEQ ID NO: 2, para de esta manera diagnosticar un cáncer en el individuo. En algunas modalidades, el polipéptido CCX-CKR2 se muestra en la SEQ ID NO: 2. En algunas modalidades, el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer cervical, cáncer de seno, linfoma, glioblastomas, cáncer de próstata y leucemia. En algunas modalidades, el cáncer no es sarcoma de Kaposi, enfermedad de Castleman multicéntrica o linfoma de fusión primaria asociada con SIDA. La presente invención también proporciona anticuerpos que específicamente compiten con SDF-1 e I-TAC para enlazar a SEQ ID NO: 2. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado. La presente invención también proporciona métodos que comprenden poner en contacto una célula con un agente que específicamente enlaza a SEQ ID NO: 2, en donde el agente compite con SDF-1 e I-TAC para el enlace a un polipéptido CCX-CKR2, y en donde la célula expresa un polipéptido CCX-CKR2 que comprende un dominio extracelular por lo menos 95% idéntico a un dominio extracelular de SEQ ID NO: 2, para de esta manera enlazar al agente al polipéptido CCX-CKR2 sobre la célula. En algunas modalidades, el agente es de menos 1,500 daltons. En algunas modalidades, el agente es un anticuerpo. En algunas modalidades, el agente es un polipéptido. En algunas modalidades, el polipéptido CCX-CKR2 es como se muestra en la SEQ ID NO: 2. En algunas modalidades, el agente se identifica por un método que comprende poner en contacto una pluralidad de agentes a un polipéptido CCX-CKR2 que comprende un dominio extracelular por lo menos 95% idéntico a un dominio extracelular de SEQ ID NO: 2, o un fragmento del mismo que enlaza SDFl o 1-TAC; y seleccionar un agente que compite con I-TAC o SDF-1 para el enlace al polipéptido CCX-CKR2 o fragmento del mismo, para de esta manera identificar un agente que se enlaza a una célula de cáncer. La presente invención también proporciona métodos para tratar cáncer en un individuo. En algunas modalidades, los métodos comprenden administrar al individuo una cantidad terapéuticamente efectiva de un polinucleótido que inhibe la expresión de un polinucleótido CCX-CKR2. En algunas modalidades, el polinucleótido CCX-CKR2 codifica la SEQ ID NO: 2. En algunas modalidades, el polinucleótido CCX-CKR2 comprende la SEQ ID N0:1. En algunas modalidades, el polinucleótido administrado inhibe la expresión por la vía de un siRNA. La presente invención también proporciona métodos para tratar cáncer en un individuo. En algunas modalidades, el método comprende administrar al individuo una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente que compite con SDFl e I-TAC para el enlace a SEQ ID NO: 2. En algunas modalidades, el agente es de menos de 1,500 daltons. En algunas modalidades, el agente es un anticuerpo. En algunas modalidades, el agente es un polipéptido. En algunas modalidades, el agente es identificado por un método que comprende poner en contacto con una pluralidad de agentes a un polipéptido CCX-CKR2 que comprende un dominio extracelular por lo menos 95% idéntico a un dominio extracelular de SEQ ID NO: 2 o un fragmento del mismo que enlaza SDFl o I-TAC; y seleccionar un agente que compite con I-TAC o SDF-1 para el enlace al polipéptido CCX-CKR2 o fragmento del mismo, para de esta manera identificar un agente que enlaza una célula de cáncer. En algunas modalidades, el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer cervical, cáncer de seno, linfoma, glioblastomas, cáncer de próstata y leucemia. En algunas modalidades, el cáncer no es sarcoma de Kaposi, enfermedad de Castleman multicéntrica o linfoma de fusión primaria asociada con el SIDA. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las Figuras 1 A-I ilustran los datos de enlace que demuestran una Ampresión dactilar' de enlace de desplazamiento SDF-1 distinto sobre diferentes tipos de células. El perfil de competición de enlace .usando 125ISDF-la con la sonda de radioligando en (a) CEM-NKr (Figuras 1A-C) y (b) MCF-7 (Figuras 1D-F) , así como 125I I-TAC (Figuras 1G-I) usado como la sonda de radioligando en (c) MCF-7, en un experimento de emplazamiento de enlace con un arreglo comprensivo de >90 quimioquinas y variantes de quimioquinas discretas virales, humanas y de murino como competidores en frío. El por ciento de inhibición del enlace de radioligando se muestra como una gráfica de barras y revela que SDF-la e I-TAC son desplazados cruzadamente sobre MCF-7 pero no en las células CEM-NKr. Las barras blancas, alta afinidad potencial (inhibición >80%) ; barras grises, modera a baja afinidad potencial (inhibición entre 60-79%; barras negras, poco o nada de afinidad (inhibición <60%) . Los resultados son la media de tres determinaciones. Las barras de error son omitidas por claridad. La Figura 2 ilustra una comparación de la afinidad de enlace de ligando y la especificidad sobre CEN-NKr y MCF-7. Los ligandos de alta afinidad potenciales, seleccionados, identificados en la Figura 2 se seleccionaron para competición de respuesta de dosis sobre CEN-NKr (cuadros vacíos) y MCF-7 (cuadros llenos) . En cada competición 125I SDF-la está en competición con una quimioquina competidora en frío como es indicado. La Figura 3 ilustra el enlace de 125I I-TAC sobre células MCF-7 no es debido a una interacción de enlace de CXCR3 clásica. La habilidad de 125I-TAC para competir con las quimioquinas indicadas se examinó en la presencia de solución reguladora solamente (cuadros llenos) , MIG en exceso (para inhibir cualquier enlace mediado por CXCR3; triángulos vacíos) , o en exceso SDF-la (asterisco) . La Figura 4 ilustra que el fenotipo de enlace descrito en la presente puede ser recapitulado en una línea de células que no expresa endógenamente este receptor. La línea de células MDA- MB 435s de tumor de seno establemente transfectadas con CCX-CKR2 exhibe el enlace de 125I SDF-la'. Este enlace puede ser competido con el SDF-la e I-TAC en frío. Por comparación las células de tipo silvestre (no transfectadas) no dan una señal de enlace de 1251 SDF-la productiva. La Figura 5 ilustra los datos de enlace competitivos. Dos moléculas pequeñas, CCX0803 (círculos llenos) y CCX7923 (círculos vacíos), compiten específicamente con el 125I SDF-la, sobre tipos de células discretas; no se detecta competición cruzada. SDF-sDF-la (asterisco) también se incluyo como un competidor en frío del enlace de 125I SDF-la sobre ambas MCF-7 y CEM-NKr. Las estructuras químicas de CCX0803 y CCX7923 se muestran en el arreglo. Los valores de IC5o predichos de SDF-la y la competición antagonista de CXCR4 se proporcionan en la tabla acompañante. La Figura 6 ilustra el efecto del tratamiento de las células de carcinoma mamario, que expresan CCX-CKR2, con un antagonista CCX-CKR2 de molécula pequeña comparado con células no tratadas con el antagonista. La Figura 7 ilustra que el antagonista 3451 de CCX-CKR2 ( ver, la Tabla 1, Compuesto No. 49) inhibe la adhesión de células que expresan CCX-CKR2 a una monocapa endotelial vascular. La Figura 8 ilustra que el antagonismo de CCX-CKR2 sobre células de carcinoma mamario reduce el volumen de tumor. DEFINICIONES "Quimioquinas" o "ligando de quimioquina" se refiere a una proteína pequeña compuesta de aproximadamente 50 a 110 aminoácidos y que comparte homología de secuencia con otras quimioquinas conocidas ( ver, por ejemplo, Murphy, P. M., Pharmacol Rev. 52:145-176 (2000)). Las quimioquinas se clasifican de acuerdo con las posiciones relativas del primer par de cisteínas (Cs) encontradas en la secuencia de aminoácidos primaria. En las quimioquinas CXCL, el primer par de cisteínas está separado por cualquier aminoácido individual. Las quimioquinas CCL tienen cisteínas adyacentes. En las quimioquinas CX3CL, el primer par de cisteínas está separado por 3 aminoácidos. Las quimioquinas CL contienen solamente una sola cisteína en la posición homologa. Las quimioquinas puede activar la función biológica mediante el enlace a y la activación a los receptores de quimioquina. Un "receptor de quimioquina" se refiere a un polipéptido que específicamente interactúa con una molécula de quimioquina. Un receptor de quimioquina es típicamente un receptor acoplado a proteína G con siete dominios de transmembrana. Los receptores de quimioquina pueden poseer varias características estructurales comunes incluyendo un dominio N-terminal altamente acídico; la secuencia de aminoácidos DRYLAIVHA (o una variación de menor de esa secuencia) encontrada dentro del segundo circuito extracelular de muchos receptores de quimioquina; un tercer circuito intracelular corto con una carga básica total; un residuo de cisteína con cada uno de los cuatro dominios extracelulares. Típicamente, los receptores de quimioquina tienen un tamaño total de aproximadamente 340-370 residuos de aminoácido. Ver, por ejemplo, revisado en Murphy, P. M. Chemokine Receptors; Overview, Academia Press 2000; Oy Loetscher P. y Clark-Lewis I. J. Leukoci te Biol . 69:881(2001). Los receptores de quimioquina ejemplares incluyen, por ejemplo, receptores CC-quimioquina (incluyendo CCRl, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9 y CCR10) , receptores de CXC-quimioquina (incluyendo CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6 y CCX-CKR2 (por ejemplo, SEQ ID N0:2)), CX3CR1, CXR1, CCXCKR (CCR11) , los receptores de quimioquina viralmente codificados, US28, ECRF3, GPCR de Herpesvirus asociado con Sarcoma de Kaposi (0RF74) , receptores acoplados a la proteína G enlazada a la membrana de Poxvirus; D6 y DARC. Las respuestas definidas que pueden ser estimuladas por los receptores de quimioquina incluyen la señalización de transmembrana, activación de cascadas de señalización citoplásmicas, rearreglo citoesquelético, adhesión, quimiotaxis, invasión, metástasis, producción de citoquina, inducción de gen, represión de gen, inducción de expresión de proteína, o modulación del crecimiento y diferenciación celular, incluyendo el desarrollo de cáncer. "RDC1", designado en la presente como "CCX-CKR2" se refiere a un receptor acoplado a proteína G presupuesto de domino de siete transmembrana (GPCR) . El ortólogo de perro CCX-CKR2 fue originalmente identificado en 1991. Ver, Libert y colaboradores, Science 244:569-572 (1989). La secuencia del perro se describe en Libert y colaboradores, Nuc . Acids Res . 18(7): 1917 (1990). La secuencia del ratón se describe en, por ejemplo, Essen y colaboradores, Iiamunogenetics 47:364-370 (1998) . La secuencia humana se describe en, por ejemplo, Sreedharan y colaboradores, Proc . Nati . Acad. Sci . EUA 88:4986-4990(1991) erróneamente describió la proteína como un receptor del péptido intestinales vasoactivo. "CCX-CKR2" incluye las secuencias que son sustancialmente similares a variantes conservativamente modificadas de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10. Los términos "péptidomimético" y "mimético" se refieren a un compuesto químico sintético que tiene sustancialmente las mismas características estructurales y funcionales de antagonistas o agonistas de un receptor de quimioquina. Los análogos de péptido son comúnmente utilizados en la industria farmacéutica como fármacos no péptido con propiedades análogas aquellos del péptido de plantilla. Estos tipos de compuestos no de péptido son llamados "miméticos de péptido" o "peptidomiméticos" (Fauchere, J. Adv. Drug Res . 15:29 (1986); Veber y Freidinger TINS p. 392(1985); y Evans y colaboradores, J. Med. Chem. 30:1229 (1987), que son incorporadas en la presente por referencia) . Los miméticos de péptido que son estructuralmente similares a los péptidos terapéuticamente útiles pueden ser utilizados para producir un efecto terapéutico o profiláctico equivalente o incrementado. Generalmente, los peptidomiméticos son estructuralmente similares a un polipéptido de paradigma (es decir, un polipéptido que tiene una actividad biológica o farmacológica) , pero tiene uno o más enlaces de péptido opcionalmente reemplazados por un enlace seleccionado del grupo- que consiste de, por ejemplo, -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH- (cis y trans), -C0CH2-, -CH(0H)CH2- y CH2S0-. El mimético puede ser ya sea totalmente compuesto de análogos no naturales, sintéticos de aminoácidos, o, es una molécula quimérica de aminoácidos de péptido parcialmente naturales y análogos no naturales parcialmente de aminoácidos. El mimético también puede incorporar cualquier cantidad de sustituciones conservativas de aminoácido naturales mientras que tales sustituciones no alteren sustancialmente la estructura del mimético y/o actividad. Un mimético puede imitar, por ejemplo, el enlace de SDF-1 o I-TAC o CCX-CKR2. Por ejemplo, una composición mimética que está dentro del alcance de la invención si es capaz de inhibir o incrementar la actividad de función de CCX-CKR2. "Anticuerpo" se ' refiere a un polipéptido sustancialmente codificado por un gen de inmunoglobulina o genes de inmunoglobulina, o fragmentos de los mismos, que específicamente enlazan y reconocen un' analito (antígeno) . Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de región constante kappa, lambda, alfa, gamma, delta, épsilon y mu, así como un sin número de genes de región variable de inmunoglobulina. Las cadenas ligeras se clasifican ya sea como kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon, que a su vez definen las clases de inmunoglobulina, IgGel IgM, IgA, IgD e IgE respectivamente. Una unidad estructural de inmunoglobulina (anticuerpo) ejemplar comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto de dos pares idénticos de cadenas de polipéptido, cada par que tiene una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kD) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kD) . El N-terminal de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables para el reconocimiento de antígenos. Los términos cadena ligera variable (VL) y cadena pesada variable (VH) se refieren a estas cadenas ligera y pesada, respectivamente. Los anticuerpos existen, por ejemplo, como inmunoglobulinas intactas o como un número de fragmentos bien caracterizados producidos por la digestión con varias peptidasas. Así, por ejemplo, la pepsina digiere un anticuerpo por debajo de enlaces de disulfuro en la región impedida para producir F(ab)'2, un dímero de Fab que por sí mismo es una cadena ligera unida a VH-CH1 mediante un enlace de disulfuro. El F(ab)'2 puede ser reducido bajo condiciones moderadas para romper el enlace de disulfuro en la región impedida, para de esta manera convertir el dímero F(ab)A en un monómero Fab' . El monómero Fab' es esencialmente un Fab con parte de la región impedida ( ver, Paul (Ed.) Fundamental Immunology, Tercera Edición, Raven Press, NY (1993) ) . Mientras que varios fragmentos de anticuerpo se definen en términos de la digestión de un anticuerpo intacto, un experto apreciará que tales fragmentos se pueden sintetizar de novo ya sea químicamente o al utilizar la metodología de DNA recombinante. Así, el término "anticuerpo" como se utiliza en la presente, también incluye fragmentos de anticuerpo ya sea producidos por la modificación de anticuerpos completos o aquellos sintetizados de novo utilizando metodologías de DNA recombinante (por ejemplo, Fv de cadena individual) . Anticuerpos "humanizados" se refiere a una molécula que tiene un sitio de enlace de antígeno que sustancialmente derivado de una inmunoglobulina de una especie no humana y estructura de inmunoglobulina restante de la molécula basada en la estructura y/o secuencia de una inmunoglobulina humana. El sitio de enlace de antígeno puede comprender ya sea dominios variables completos fusionados sobre dominios constantes o solamente las regiones de determinación de complementariedad (CDRs) injertados sobre regiones de estructura apropiadas en los dominios variables. Los sitios de enlace de antígeno pueden ser de tipo silvestre o modificados por una o más sustituciones de aminoácido, por ejemplo, modificados para asemejarse a la inmunoglobulina humana más estrechamente . Algunas formas de anticuerpos humanizados conservan todas las secuencias CDR (por ejemplo, un anticuerpo de ratón humanizado que contiene tadas las seis CDRs de los anticuerpos de ratón) . Otras formas de anticuerpos humanizados tienen una o más CDRs (uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis) que son alterados con respecto al anticuerpo original. La frase "específicamente (o selectivamente) enlaza a un anticuerpo" o "específicamente (o selectivamente) inmunoreactivo con", cuando se refiere a una proteína o péptido, se refiere a una reacción de enlace que es determinativa de la presencia de la proteína en la presencia de una población heterogénea de proteínas u otras sustancias biológicas. Así, bajo las condiciones inmunoensayo designadas, los anticuerpos especificados enlazan una proteína particular y no enlazan una cantidad significante de a otras proteínas presentes en la muestra. El enlace específico a un anticuerpo bajo tales condiciones puede requerir que un anticuerpo sea seleccionado por su especificidad para una proteína particular. Por ejemplo, los anticuerpos resaltados contra una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por cualquiera de los polinucleótidos de la invención pueden ser seleccionar para obtener anticuerpos específicamente inmunoreactivos con esa proteína y no con otras proteínas, excepto para variantes polimórficas, por ejemplo, proteínas por lo menos 80%, 85%, 90%, 95% o 99% idénticas a la SEQ ID NO: 2. Una variedad de formatos de inmunoensayo pueden ser utilizados para seleccionar anticuerpos específicamente inmunoreactivos con una protéína particular. Por ejemplo, los inmunoensayos de ELISA de fase sólida, manchados de Western o inmunohistoquímica son rutinariamente utilizados para seleccionar anticuerpos monoclonales específicamente inmunoreactivos con una proteína. Ver, Harlow y Lañe, Antibodies : A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Publications, NY (1988) para una descripción de formatos de inmunoensayo y condiciones que pueden ser utilizadas para determinar la inmunorreactividad específica, típicamente, una reacción específica o selectiva será por lo menos dos veces la señal por ruido de fondo y más típicamente más de 10 a 100 veces el fondo. Un "ligando" se refiere a un agente, por ejemplo, un polipéptido u otra molécula, capaz del enlace a un receptor de quimioquina. Como se utiliza en la presente, "un agente que enlaza a un receptor de quimioquina" se refiere a un agente que enlaza al receptor de quimioquina con una alta afinidad. "Alta afinidad" se refiere a una afinidad suficiente para inducir una respuesta farmacológicamente relevante, por ejemplo, la habilidad para competir significativamente para el enlace con un ligando de quimioquina natural a un receptor de quimioquina en concentraciones farmacéuticamente relevantes (por ejemplo, en concentraciones menores que aproximadamente 10-5 M) . Ver, por ejemplo, Ejemplo 1 y Figura 5. Algunos agentes ejemplares con alta afinidad enlazarán un receptor de quimioquina con una afinidad mayor que 10"6 M y algunas veces mayor que 107 M o 10"8 M. Un agente que no logra competir con el enlace con un ligando receptor natural cuando el agente está en concentraciones menores que 10"14 M será considerado que es "enlace" para los propósitos de la invención. El término "ácido nucleico" o "polinucleótido" se refiere a desoxiríbonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos en forma de ya sea una sola o doble hebra. A menos que se limita específicamente, el término comprende ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales que tienen propiedades de enlace similares como el ácido nucleico de referencia y son metabolizados de una manera similar a los nucleótidos que ocurren de manera natural. A menos que se indique de otra manera, una secuencia de ácido nucleico particular también implícitamente comprende variantes conservativamente modificadas de la misma (por ejemplo, sustituciones de codón degeneradas) y secuencias complementarias así como las secuencias explícitamente indicadas. Específicamente, las sustituciones de codón degeneradas se pueden lograr al generar secuencias en las cuales la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos) están sustituida con base mezclada y/o residuos de deoxiinosina (Batzer y colaboradores, Nucleic Acid Res . 19:5081 (1991); Ohtsuka y colaboradores, J. Biol . Chem. 260:2605-2608 (1985); y Cassol y colaboradores, (1992); Rossolini y colaboradores, Mol . Cell . Probes 8:91-98 (1994)). El término ácido nucleico se utiliza intercambiablemente con el gen, cDNA y mRNA codificado por un gen. Los términos "polipéptido", ??péptido" y "proteína" se utilizan intercambiablemente en la presente para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácido en los cuales uno o más residuos de aminoácido es un mimético químico artificial de un aminoácido que ocurre naturalmente correspondiente, así como polímeros de aminoácidos que ocurren naturalmente y polímeros de aminoácidos que no ocurren naturalmente. Como se utiliza en la presente el término comprende cadenas de aminoácidos de cualquier longitud, incluyendo proteínas de longitud completas) , en decir antígenos) donde los residuos de aminoácidos son enlazados por enlaces de péptido covalentes. El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos que ocurren naturalmente y sintéticos, así como análogos de aminoácido y miméticos de aminoácidos que funcionan de una manera similar a los aminoácidos que ocurren naturalmente. Los aminoácidos que ocurren naturalmente son aquellos codificados por el código genético, así como aquellos aminoácidos que son posteriormente modificados, por ejemplo, hidroxiprolina, ?-carboxiglutamato y O-fosfoserina. Los análogos de aminoácido se refieren a compuestos que tienen la misma estructura química básica como un aminoácido que ocurre de manera natural, es decir, un carbono a que es enlazado a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucina, metionina sulfóxido metionina metil sulfonio. Tales análogos tiene grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o cadenas principales de péptidos modificadas, pero retienen la misma estructura química básica como un aminoácido que ocurre de manera natural. "Miméticos de aminoácido" se refiere a compuestos químicos que tienen estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funciona de una manera similar a un aminoácido que ocurre de manera natural . Los aminoácidos pueden ser referidos en la presente por ya sea sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos o por los símbolos de una letra recomendados por IPUAC-IUB Biochemical Nomenclatura Comisión. Los nucleótidos del mismo modo, pueden ser referidos por sus códigos de una sola letra comúnmente aceptados. "Variantes conservativamente modificadas" aplica a secuencias tanto de aminoácidos como de ácido nucleico. Con respecto a las secuencias de ácido nucleico particulares, "variantes conservativamente modificadas" se refiere aquellos ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o donde el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, a secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, un número de secuencias de ácido nucleico codificará cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU todos codificarán el aminoácido alanina. Así, en cada posición donde una alanina es especificada por un codón, el codón puede ser alterado a cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Tales variaciones de ácido nucleico son "variaciones silenciosas" que son una especie de variaciones conservativamente modificadas. Cada secuencia de ácido nucleico en la presente codifica un polipéptido también describe cada variación silenciosa posible del ácido nucleico . Uno experto reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que es ordinariamente el único codón para metionina y TGG, que es ordinariamente el único codón para triptofano) puede ser modificado para producir una molécula funcionalmente idéntica. Por consiguiente, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un polipéptido está implícita en cada secuencia descrita. En cuanto a secuencias de aminoácidos, un experto reconocerá que sustituciones, supresiones o adiciones individuales a un ácido nucleico, péptido, polipéptido o secuencia de proteína que altera, adiciona o suprime un solo aminoácido o un porcentaje pequeño de aminoácidos en la secuencia codificada es una "variante conservativamente modificada" donde la alteración da por resultado la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustitución conservativas que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. Tales variantes conservativamente modificadas son en adición a y no excluyen las variantes polimórficas, homólogos de interespecies y alelos de la invención. Los siguientes ochos grupos cada uno contiene aminoácidos que son sustituciones conservativas entre sí: 1) Alanina (A), Glicina (G) ; 2) Acido aspártico (D) , Acido glutámico (E) ; 3) Asparagina (N) , Glutamina (Q) ; 4) Arginina (R) , Lisina (K) ; 5) Isoleucina (I), Leucina (L) , Metionina (M) , Valina (V) ; 6) Fenilalanina (F) , Tirosina (Y) , Triptofano (W) ; 7) Serina (S) , Treonina (T) ; y 8) Cisteína (C) , Metionina (M) ( ver, por ejemplo, Creighton, Proteins (1984)). "Porcentaje de identidad de secuencia" se determina al comparar dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia de polinucleótido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, espacio) como es comparado con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones) para la alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula al determinar el número de posiciones en las cuales la base de ácido nucleico idéntico o residuo de aminoácido se presenta en ambas secuencias para producir el número de posiciones igualadas, al dividir el número de posiciones igualadas entre el numero total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicar el resultado por 100 para producir el porcentaje de la identidad de secuencia. Los términos "idéntico" o por ciento de "identidad" en el contexto de dos o más ácidos nucleico o secuencias de polipéptido, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que son las mismas o tienen el porcentaje especificado de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son los mismos (es decir, 60% de identidad, opcionalmente 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% de identidad sobre una región especificada, por ejemplo, de las secuencias de polipéptido completas de la invención o los dominios extracelulares de los polipéptidos de la invención) , cuando se comparan y se alinean para la correspondencia máxima sobre una ventana de comparación, o la región designada como es medido utilizando uno de los siguiente algoritmos de comparación de secuencia o mediante la alineación manual y la inspección visual. Tales secuencias luego se dicen que son "sustancialmente idénticas". Esta definición también se refiere al complemento de una secuencia de prueba. Opcionalmente, la identidad existe sobre una región que es por lo menos aproximadamente 50 nucleótidos en longitud, o más de preferencia sobre una región que es de 100 a 500 o 1000 o más nucleótidos en longitud. El término "similitud" o por ciento de "similitud", en el contexto de dos o más secuencias de polipéptido, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácidos que son ya sea los mismos o similares como se definen en las 8 sustituciones de aminoácidos conservativas definidas en lo anterior (es decir, 60%, opcionalmente 65%, 70%, 75%, 80%, 90% o 95% similar sobre una región especificada o la secuencia completa de un polinucleótido, por ejemplo, de las secuencias de polipéptido completas de la invención tal como CCX-CKR2 (por ejemplo, SEQ ID NO: 2) o los dominios extracelulares de los polipéptidos de la invención, cuando se comparan y se alinean para la correspondencia máxima sobre una ventana de comparación, o la región designada como es medida usando una de las siguientes algoritmos de comparación de secuencia o mediante la alineación manual y la inspección visual. Tales secuencias luego se dicen que son "sustancialmente similares". Opcionalmente, esta identidad existe sobre una región que es por lo menos de aproximadamente 50 aminoácidos en longitud, o más de preferencia sobre una región que es por lo menos aproximadamente 100 a 500 o 1000 o más aminoácidos en longitud. Para comparación de secuencia, típicamente una secuencia actúa como secuencia de referencia, a la cual se comparan las secuencias de prueba. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencia, las secuencias de prueba de referencia se introducen en una computadora, las coordenadas de las subsecuencias se designan, si es necesario, y los parámetros del programa de algoritmo de secuencia son designados. Se pueden utilizar parámetros de programa de error, o parámetros alternativos pueden ser designados. El algoritmo de- comparación de secuencia luego calcula el por ciento de identidades de secuencia para las secuencias de prueba con relación a la secuencia de referencia, basados en los parámetros del programa. Una "ventana de comparación", como se utiliza en la presente, incluye la referencia a un segmento de cualquiera del número de posiciones contiguas seleccionadas del grupo que consiste de, por ejemplo, una secuencia de longitud completa de 20 a 600, aproximadamente 50 a aproximadamente 200 o a aproximadamente 100 a aproximadamente 150 aminoácidos o nucleótidos en los cuales una secuencia puede ser comparada con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que se alinean óptimamente las dos secuencias. Los métodos de alineación de secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica. La alineación óptima de secuencias para comparación se puede conducir, por ejemplo, por el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1970) Adv. Appl . Math . 2:482c, o mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol . Biol . 48:443, mediante la búsqueda para el método de similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Nat ' 1 Acad, Sci EUA 85:2444, mediante implementaciones computarizables de sus algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl) , o mediante la alineación manual y la inspección visual ( ver, por ejemplo, Ausubel y colaboradores, Current Protocols in Molecular Biology (suplemento de 1995) ) . Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar el por ciento de identidad de secuencia y la similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST2.0, que son descritos en Altschul y colaboradores, (1977) Nuc . Acids Res . 25:3389-3402 y Altschul y colaboradores, (1990) J.

Mol . Biol . 215:403-410 respectivamente. El software para analizar los análisis de BLAST están públicamente disponibles a través del Nacional Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo involucra primero identificar pares de secuencias de alto registro (HSPs) al identificar palabras cortas de longitud W en la secuencia interrogante, que ya sea iguala o satisface algún registro T de umbral de valor positivo cuando se alinea con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T es referido como el umbral de registro de palabra cercano (Altschul y colaboradores, supra) . Estos aciertos de palabra cercanos iniciales actúan como inicios para iniciar las búsquedas para encontrar HSPs más largos que los contienen. Los aciertos de palabra se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia en cuanto se puede incrementar el registro de alineación acumulativo. Los registros acumulativos se calculan utilizando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (registro renumerado para un par de residuos de igualación; siempre <0) y N (registro de sanción para registro de desigualación; siempre <0) . Para secuencias de aminoácidos como una matriz de registro se utiliza para calcular el registro acumulativo. La extensión de los aciertos de palabra en cada dirección son interrumpidos cuando: el registro de alineación, acumulativo falla por la cantidad de X de su valor logrado máximo; el registro acumulativo es 0 o más abajo, debido a la acumulación de uno o más alineaciones de residuos de registro negativos; o se alcanza el final de cualquier secuencia. Los registros del algoritmo BLATS W, T y X determina la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) utiliza como errores una longitud de palabras (W) de 11, como una expectativa (E) o 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambas hebras. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza como errores una longitud de palabras de 3, y la expectativa (E) de 10, y la matriz de registro BLOSUM62 ( ver, Henikoff y Henikoff (1989) Proc . Acad. Sci . EUA 89:10915) alineaciones (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambas hebras . El algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias ( ver, por ejemplo, Karlin y Altschul (1993) Proc . Nati . Acad. Sci . EUA 90:5873-5787). Una medición de la similitud proporciona por el algoritmo BLAST es la probabilidad de sumas más pequeñas (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad mediante la cual una igualación de entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos ocurriría por oportunidad. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma es más pequeña en una comparación del ácido nucleico de prueba al ácido nucleico de referencia es de menos de aproximadamente 0.2, más de preferencia menos de 0.01, y mucho más de preferencia de menos de aproximadamente 0.001. Una indicación de que dos secuencias de ácido nucleico o polipéptidos son sustancialmente idénticas es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico es reactivo inmunológicamente cruzado con los anticuerpos resaltados contra el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico, como es descrito enseguida. Así, un polipéptido es de manera típicamente sustancialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, donde los dos péptidos difieren solamente por sustituciones conservativas. Otra indicación de que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es que las dos moléculas o sus . complementos hibridan entre sí y bajo condiciones severas, como es descrito enseguida. Otra indicación de que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es que los mismos cebadores pueden ser utilizados para amplificar la secuencia. 20 "Moduladores" de la actividad de CCX-CKR2 se utilizan para referirse a moléculas que incrementan o disminuyen la actividad de CCX-CKR2 directamente o indirectamente e incluye aquellas moléculas identificadas utilizando ensayos in vitro o in vivo para el enlace o señalización de CCX-CKR2. La actividad de CCX-CKR2 se puede incrementar, por ejemplo, al poner en contacto el polipéptido de CCX-CKR2 con un agonista, y/o en algunos casos, al expresar CCX-CKR2 en una célula. Los agonistas se refieren a moléculas que incrementan la actividad de CCX-CKR2. Los agonistas son agentes que, por ejemplo, enlaza a, y estimulan, incrementan, abren, activan, facilitan, incrementan la activación, sensibilizan o regulan hacia arriba la actividad de CCX-CKR2. Los moduladores pueden competir para el enlace a CCX-CKR2 con ligandos de CCX-CKR2 conocidos tales como SDF-1 e I-TAC y moléculas pequeñas como es descrito en la presente. Los antagonistas se refieren a moléculas que inhiben la actividad CCX-CKR2, por ejemplo, al bloquear el enlace de agonistas tales como I-TAC o SDF-1. Los antagonistas son agentes que, por ejemplo, enlazan a, parcialmente o totalmente bloquean la estimulación, disminuye, previene, retarda la activación, inactivan, desensibilizan, o regulan hacia la actividad de CCX-CKR2. Los moduladores incluyen agentes que, alteran la interacción de CCX-CKR2 con: proteínas que enlazan activadores o inhibidores, receptores, incluyendo receptores acoplados a proteínas G (GPCRs) , quinasas, etc. Los moduladores incluyen versiones genéticamente modificadas de ligandos de receptor de quimioquina que ocurre naturalmente, por ejemplo, con actividad alterada, así como ligandos que ocurren naturalmente y sintéticos, antagonistas, agonistas, moléculas químicas pequeñas, siRNAs y los similares. Los ensayos para inhibidores y activadores incluyen, por ejemplo, la aplicación de compuestos moduladores putativos a una célula que expresa CCX-CKR2 y luego al determinar los efectos funcionales sobre la señalización CCX-CKR2, por ejemplo, la fosforilación o activación ERK1 y ERK2 de miembros de las rutas de transducción de señales ERK1 o ERK2, y/o otros efectos como es descrito en la presente. Las muestras o ensayos que comprenden CCX-CKR2 que se tratan con un activador potencial, inhibidor o modulador se compara con muestras de control sin el inhibidor, activador o modulador para examinar el grado de inhibición. Las muestras de control (no tratadas con inhibidor) son asignadas con un valor de actividad de receptor de quimioquina de 100%. La inhibición de CCX-CKR2 se logra cuando el valor de actividad o expresión de CCX-CKR2 con relación al control es menor que aproximadamente 95%, de manera opcional de aproximadamente 90%, de manera opcional aproximadamente 50% o aproximadamente 25-0%. La activación de CCX-CKR2 se logra cuando el valor de actividad o expresión de CCX-CKR2 con relación al control de por lo menos aproximadamente 105%, aproximadamente 110%, opcionalmente por lo menos aproximadamente 105%, aproximadamente 150%, opcionalmente por lo menos aproximadamente 105%, aproximadamente 200-500%, o por lo menos aproximadamente 105%, aproximadamente 1000-3000% o más alto. "siRNA" se refiere a RNAs de interferencia pequeña, que son capaces de causar interferencia con la expresión y pueden causar el silenciamiento post-transcriptional de genes específicos de células, por ejemplo, células mamíferas (incluyendo células humanas) y en el cuerpo, por ejemplo, cuerpos mamíferos (incluyendo humanos) . El fenómeno de interferencia de RNA es descrito y discutido en, Bass, Nature 411:428-29 (2001); Elbahir y colaboradores, Nature 411:494-98 (2001) y Fire y colaboradores, Nature 391:806-11 (1998); y WO 01/75164, donde los métodos para hacer el RNA de interferencia también son discutidos. Los siRNAs basados en las secuencias y ácidos nucleicos que codifican los productos de gen divulgados en la presente típicamente tienen de menos de 100 pares bases y pueden ser, por ejemplo, de aproximadamente 30 BPS o más cortos, y se pueden hacer mediante procedimientos conocidos en la técnica, incluyendo el uso de hebras de DNA complementarias o procedimientos sintéticos. Los siRNAs son capaces de causar interferencia y pueden causar silenciamiento post-transcriptional de genes específicos en células, por ejemplo, células mamíferas (incluyendo células humanas) y en el cuerpo, por ejemplo, cuerpos mamíferos (incluyendo humanos) . Los siRNAs ejemplares de acuerdo con la invención podían tener hasta 29 bps, 25 bps, 22 bps, 21 bps, 20 bps, 15 bps, 10 bps, 5 bps o cualquier número entero alrededor del mismo o entre los mismos. Las herramientas para diseñar siRNAs inhibitorios óptimos incluyen aquellas disponibles de DNAengine Inc. (Seattle, WA) y de Ambion, Inc. (Austin, TX) . Una técnica de RNAi emplea construcciones genéticas dentro de las cuales las secuencias de sentido antisentido se colocan en regiones flanqueantes a una secuencia de intrón en una orientación de empalme apropiado con sitios de empalme donadores y aceptadores. Alternativamente, las secuencias espadadoras de varias longitudes se pueden emplear para separar regiones auto-complementarias de secuencia en la construcción. Durante el procesamiento del transcripto de construcción de gen, las secuencias de intrón son empalmadas, permitiendo a las secuencias de sentido y anti-sentido, así como las secuencias de unión de empalme, enlazar la formación de RNA de doble hebra. La selección de ribonucleasas luego enlaza y segmenta el RNA de doble hebra, para de esta manera iniciar la cascada de eventos que conducen a la degradación de secuencias de gen de mRNA específicas y el silenciamiento de genes específicos. El término "compuesto" se refiere a una molécula específica e incluye sus enantiómeros, diastereómeros, polimorfos y sales de los mismos. El término "heteroátomo" se refiere a un átomo de nitrógeno, oxígeno o azufre enlazado. El término "sustituido" se refiere a un grupo que está enlazado a una molécula o grupo de origen. Así, un anillo de benceno que tiene un sustituyente de metilo es un benceno sustituido con metilo. De manera similar, un anillo de benceno que tiene 5 sustituyentes de hidrógeno sería un grupo de fenilo no sustituido cuando se enlaza a una molécula de origen. El término "heteroátomo sustituido" se refiere a un grupo donde un heteroátomo está sustituido . El heteroátomo puede ser sustituido con un grupo o átomo, incluyendo, pero limitado a hidrógeno, halógeno, alquilo, alquileno, alquenilo, alquinilo, arilo, amileno, cicloalquilo, cicloalquileno, heteroarilo, heteroarileno, heterociclilo, carbociclo, hidroxi, alcoxi, ariloxi y sulfonilo. Los heteroátomos sustituidos representativos incluyen, a manera de ejemplo, ciclopropil aminilo, isopropil aminilo, y bencil aminilo y fenoxi . El término "alquilo" se refiere a un grupo hidrocarburo saturado monovalente que puede ser lineal o ramificado. A menos que se defina de otra manera, tales grupos alquilo típicamente contienen de 1 a 10 átomos de carbono. Los grupos alquilo representativos incluyen, a manera de ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, isobutilo, ter-butilo, n-pentilo, n-hexilo, n-heptilo, n-octilo, n-nonilo, n-decilo y los similares . El término "alquileno" se refiere a un grupo hidrocarburo saturado divalente que puede ser lineal o ramificado. A menos que se defina de otra manera, tales grupos alquileno típicamente contienen de 1 a 10 átomos de carbono. Los grupos alquileno representativos incluyen, a manera de ejemplo, metileno, etano-1, 2-diilo ("etileno"), propano-1, 2-diilo, propano-1, 3-diilo, butano-1, 4-diilo, pentano-1, 5-diilo y los similares. El término "alquenilo" se refiere a un grupo hidrocarburo insaturado monovalente el cual puede ser lineal o ramificado que tiene por lo menos uno, y típicamente 1, 2 o 3, dobles enlaces de carbono-carbono. A menos que se defina de otra manera, tales grupos alquenilo típicamente contienen de 2 a 10 átomos de carbono. Los grupos alquenilo representativos incluyen, a manera de ejemplo, etenilo, n-propenilo, isopropenilo, n-but-2-enilo, n-hex-3-enilo y los similares . El término "alquinilo" se refiere a un grupo hidrocarburo insaturado monovalente que puede ser lineal o ramificado y que tiene por lo menos uno, y típicamente 1, 2 o 3, triples enlaces de carbono-carbono. A menos que se defina de otra manera, tales grupos alquinilo típicamente contienen de 2 a 10 átomos de carbono. Los grupos alquinilo representativos incluyen, a manera de ejemplo, etinilo, n-propinilo, n-but-2-inilo, n-hex-3-inilo y los similares. El término "arilo" se refiere a un hidrocarburo aromático monovalente que tiene un solo anillo (es decir fenilo) o anillos fusionados (es decir, naftaleno) . A menos que se defina de otra manera, tales grupos arilo típicamente contienen 6 a 10 átomo de carbono en el anillo. Los grupos arilo representativos incluyen, a manera de ejemplo fenilo y naftalen-2-ilo y los similares. El término "arileno" se refiere a un hidrocarburo aromático divalente que tiene un solo anillo (es decir, fenileno) o anillo fusionados (es decir, naftalendiilo) . A menos que se define de otra manera, tales grupos a ileno típicamente contienen de 6 a 10 átomos de carbono en el anillo. Los grupos amileno representativos incluye, a manera de ejemplo 1, 2-fenileno, 1, 3-fenileno, 1, 4-fenileno, 5-diilo, naftalen-2, 7-diilo y los similares. El término "aralquilo" se refiere a un grupo arilo sustituido con alquilo. Los grupos aralquilo representativos incluyen bencilo . El término "cicloalquilo" se refiere a un grupo un hidrocarburo carbocíclico saturado monovalente que tiene un solo anillo o anillos fusionados. A menos que se defina de otra manera, tales grupos cicloalquilo típicamente contienen de 3 a 10 átomos de carbono. Los grupos cicloalquílo representativos incluyen, a manera de ejemplo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciciohexilo y los similares. El término "cicloalquileno" se refiere a un grupo hidrocarburo carbocíclico saturado divalente que tiene un solo anillo o anillos fusionados. A menos que se defina de otra manera, tales grupos cicloalquileno típicamente contienen de 3 a 10 átomos de carbono. Los grupos cicloalquileno representativos incluyen, a manera de ejemplo, ciclopropano-1, 2-diilo, ciclobutilo-1, 2-diilo, ciclobutilo-1,3-diilo, ciclopentilo-1, 2-diilo, ciclopentilo-1, 3-diilo, ciclohexilo-1, 2-diilo, ciclohexilo-1, 3-diilo, ciclohexilo-1,4-diilo y los similares. El término "heteroarilo" se refiere a un grupo aromático monovalente sustituido o no sustituido que tiene un solo anillo o anillos fusionados y que contiene en el anillo por lo menos un heteroátomo (típicamente de 1 a 3 heteroátomos) seleccionados de hidrógeno, oxígeno o azufre. A menos que se defina de otra manera, tales grupos heteroarilo típicamente contienen de 5 a 10 átomos en anillo totales. Los grupos heteroarilo representativos incluyen, a manera de ejemplo, especies monovalentes de pirrol, imidazol, tiazol, oxazol, furano, tiofeno, triazol, pirazol, isoxazol, isotiazol, piridina, pirazina, piridazina, pirimidina, triazina, indol, benzofurano, benzotiofeno, bencimidazol, benztiazol, quinolina, isoquinolina, quinazolina, quinoxalina y los similares, donde el punto de unión es cualquier átomo en el anillo de carbono o nitrógeno disponible. El término "heteroarileno" se refiere a un grupo aromático divalente que tiene un solo anillo o anillos fusionados y que contienen por lo menos un heteroátomo (típicamente de 1 a 3 heteroátomos) seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre en el anillo. A menos que se defina de otra manera, tales grupos heteroarileno típicamente contienen de 5 a 10 átomos en anillo totales. Los grupos heteroarileno representativos incluyen, a manera de ejemplo, especies bivalentes de pirrol, imidazol, tiazol, oxazol, furan tiofeno, triazol, pirazol, isoxazol, isotiazol, piridina, pirazina, piridazina, pirimidina, triazina, indol, benzofurano, benzotiofeno, bencimidazol, benztiazol, quinolina, isoquinolina, quinazolina, quinoxalina y los similares, donde el punto de unión en cualquier átomo en el anillo de carbono o nitrógeno disponibles. Los términos "heterociclilo" o grupo "grupo heterocíclico" se refiere a un grupo saturado o insaturado (no aromático) monovalente, sustituido o no sustituido que tiene un solo anillo o múltiples anillos condensados y que contiene en el anillo por lo menos un heteroátomo (típicamente de 1 a 3 heteroátomos) seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre. A menos que se defina de otra manera, tales grupos heterocíclicos típicamente contienen de 2 a 9 átomos en el anillo totales. Los grupos heterocíclicos representativos incluyen, a manera de ejemplo, especies monovalentes de pirrolidina, morfolina, imidazolidina, pirazolidina, piperidina, 1,4-dioxano, tiomorfolina, piperazina, 3-pirrolina y los similares, donde el punto de unión en cualquier átomo en el anillo de carbono o nitrógeno disponible. El término "carbociclo" se refiere a un anillo aromático o no aromático en el cual cada átomo en el anillo es carbono. Los carbociclos representativos incluyen ciciohexano, ciclohexeno y benceno. Los términos "halo" o "halógeno" se refiere fluoro- (-F) , cloro- (-C1) , bromo- (-Br) y yodo- (-1). El término "hidroxi" o "hidroxilo" se refiere a un grupo -OH. El término "alcoxi" se refiere a un grupo -OR, donde R puede ser un alquilo, un alquileno, cicloalquilo o cicloalquileno sustituido o no sustituido. Los sustituyentes adecuados incluyen halo, ciano, alquilo, amino, hidroxi, alcoxi y amido. Los grupos alcoxi representativos incluyen, a manera de ejemplo, metoxi, etoxi, isopropiloxi y trifluorometoxi . El término "ariloxi" se refiere a un grupo -OR, donde R puede ser un grupo arilo o heteroarilo sustituido o no sustituido. Los grupos ariloxi representativos incluyen fenoxi .

El término "sulfonilo" se refiere a un grupo -S(0)2R, donde R puede ser alquilo, alquileno, alquenilo, alquinilo, arilo, cicloalquilo, cicloalquileno, heteroarilo, heteroarileno, heterocíclico o halógeno. Los grupos sulfonilo representativos incluyen, a manera de ejemplo, sulfonato, sulfamida, sulfonil haluros y dipropilamida sulfonato. El término "condensación" se refiere a una reacción en la cual dos o más moléculas son unidas covalentemente. Del mismo modo, los productos de condensación son los productos formados por la reacción de condensación. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN I. Introducción La presente invención proporciona el descubrimiento de que el receptor huérfano RDC1, referido en la presente como CCX-CKR2, enlaza los ligandos de quimioquina SDFl e I-TAC. Además, la presente invención proporciona el descubrimiento sorprendente del involucramiento del CCX-CKR2 en el cáncer. Así, la invención proporciona métodos para el diagnóstico del cáncer al detectar CCX-CKR2. La invención también proporciona métodos para inhibir el cáncer al administrar un modulador de . CCX-CKR2 a un individuo con cáncer. II. Pol±péptidos y polinucleótidos CCX-CKR2 En numerosas modalidades de la presente invención, los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos CCX-CKR2 de interés serán aislados y clonados utilizando métodos recombinantes. Tales modalidades son utilizadas, por ejemplo, para aislar polinucleótidos CCX-CKR2 (por ejemplo, SEQ ID N0:1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NOY y SEQ ID NO: 9)) para la expresión de proteína o durante la generación de variantes, derivados, casetes de expresión u otras secuencias derivadas de un polipéptido CCX-CKR2 (por ejemplo, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6., NO SEQ ID NO: 8 y SEQ ID N0:10)), para monitorear la expresión del gen CCX-CKR2, para el aislamiento o detección de las secuencias de CCX-CKR2 en diferentes especies, para propósitos de diagnóstico en un paciente, por ejemplo, para detectar mutaciones en CCX-CKR2 o para detectar Xa expresión de ácidos nucleicos CCX-CKR2 o polipéptidos CCX-CKR2. En algunas modalidades, las secuencias que codifican CCX-CKR2 son operablemente enlazadas a un promotor heterólogo. En algunas modalidades, los ácidos nucleicos de la invención son de cualquier mamífero, incluyendo, en particular, por ejemplo, un humano, un ratón, una rata, un perro, etc. En algunos casos, los polipéptidos CCX-CKR2 de la invención comprenden los aminoácidos extracelulares de la secuencia CCX-CKR2 humana (por ejemplo de, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 10)) mientras que otros residuos son ya sea alterados o ausentes. En otras modalidades, los polipéptidos CCX-CKR2 comprenden fragmentos de enlace de ligando CCX-CKR2. Por ejemplo, en algunos casos, los fragmentos se enlazan I-TAC y/o SDFl . La estructura de siete receptores de trans-membrana (de los cuales CCX-CKR2 es uno) son bien conocidos para aquellos expertos en la técnica y por lo tanto los dominios de trans-membrana puede ser fácilmente determinados. Por ejemplo, los algoritmos de hidrofobicidad fácilmente disponibles pueden ser encontrados internet en la Base de Datos del receptor Acoplado a Proteína G (GPCRDB) , por ejemplo, http: //www. gpcr. org. /7tm/seq/DR/RDCl_HUMAN. TABDR.html o http: //www.gpcr.org/7tm/seq/vis/swac/P25106.html. Esta invención depende de las técnicas de rutina en el campo de la genética recombinante. Los textos básicos que divulgan los métodos generales para el uso en esta invención incluyen Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3- edición 2001) ; Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990) ; y Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel y colaboradores, eds., 1994) ) . Los cebadores apropiados y sondas para identificar los genes que codifican CCX-CKR2 de tejidos mamíferos se pueden derivar de las secuencias proporcionadas en la presente (por ejemplo, SEQ ID NO:l) para un revisión general de PCR, ver, Innis y colaboradores, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego (1990) . III. Desarrollo de Terapéuticas Específicas Las moléculas que enlazan al CCX-CKR2, incluyendo moduladores de la función de CCX-CKR2 es decir agonistas o antagonistas o agentes de actividad de CCX-CKR2, son útiles para tratar un número de enfermedades mamíferas, incluyendo el cáncer. Las enfermedades o condiciones de humanos u otras especies que pueden ser tratadas con antagonistas de un receptor de quimioquina u otros inhibidores de la función de quimioquina, incluyen, pero no están limitados a, por ejemplo, carcinomas, gliomas, mesoteliomas, melanomas, linfomas, leucemias, adenocarcinomas, cáncer de seno, cáncer ovárico, cáncer cervical, glioblastoma, leucemia, linfoma, cáncer de próstata y linfoma de Burkitt, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón de célula no pequeña, cáncer de pulmón de célula pequeña, cáncer del esófago, cáncer del estómago, cáncer pancreático, cáncer hepatobiliar, cáncer de la vesícula biliar, cáncer del intestino delgado, cáncer rectal, cáncer del riñon, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer penil, cáncer de la uretral, cáncer testicular, cáncer cervical, cáncer vaginal, cáncer uterino, cáncer ovárico, cáncer de tiroides, cáncer de paratiroides, cáncer adrenal, cáncer endocrino pancreático, cáncer carcinoide, cáncer óseo, cáncer de la piel, retinoblastomas, linfoma de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin (ver, CÁNCER: PRINCIPIES AND PRACTICE (DeVita, V. T. y colaboradores, eds 1997) para cánceres adicionales) ; así como la disfunción cerebral y neuronal, tal como la enfermedad de Alzheimer y esclerosis múltiple; disfunción del riñon; artritis reumatoide; rechazo del injerto cardiaco; aterosclerosis; asma; glomerulonefritis; dermatitis de contacto; enfermedad de intestino inflamatorio; colitis; psoriasis; lesión de reperfusión; así como otros desórdenes y enfermedades descritas en la presente. Alternativamente, un agonista de CCX-CKR2 se puede utilizar para tratar la enfermedad, por ejemplo, en la disfunción renal, cerebral o neuronal así como en casos donde la movilización de las células madre es terapéutica. A. Métodos para Identificar Moduladores de Receptores de ?Zuimioquina Un número de diferentes protocolos de clasificación se pueden utilizar para identificar agentes que modulan el nivel de actividad o función de CCX-CKR2 en células, particularmente en células mamíferas, y especialmente en células humanas. En términos generales, los métodos de clasificación involucran la clasificación de una pluralidad de agentes para identificar un agente que interactúa con CCX-CKR2 (o' un dominio extracelular del mismo), por ejemplo, mediante el enlace a CCX-CKR2, la prevención de un ligando (por ejemplo, I-TAC y/o SDFl) del enlace CCX-CKR2 o la activación CCX-CKR2. En algunas modalidades, el agente enlaza CCX-CKR2 con por lo menos aproximadamente 1.5, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 500 o 1000 veces la afinidad del agente para otra proteína. 1. Ensayos de Enlace del Receptor de Quimioquina En algunas modalidades, los moduladores de CCX-CKR2 se identifican al clasificar moléculas que compiten con un ligando de CCX-CKR2 tal como SDFl o I-TAC. Aquellos expertos en la técnica reconocerán que existen un número de maneras para realizar análisis de competición. En algunas modalidades, las muestras con CCX-CKR2 se preincuban con un ligando CCX-CKR2 marcado y luego se pone contacto con una molécula competidora potencial. La alteración (por ejemplo, una disminución) de la cantidad del ligando enlazado a CCX-CKR2 indica que la molécula es un modulador de CCX-CKR2 potencial. Las clasificaciones preliminares se pueden conducir al clasificar agentes capaces de enlazar a un CCX-CKR2, como por lo menos algunos de los agentes así identificados son probablemente modeladores del receptor de quimioquina. Los ensayos de enlace usualmente involucran poner en contacto CCX-CKR2 con uno o más agentes de prueba y permitir el tiempo suficiente para que la proteína y los agentes de prueba formen un complejo de enlace. Cualquiera de los complejos de enlace formados pueden ser detectados utilizando cualquier de un número de técnicas analíticas establecidas. Los ensayos de enlace de proteína incluyen, pero no están limitados a, ensayos de enlace inmunohistoquímico, citometría a reflujo, enlace de radioligando, enlace de ligando marcado con europio, enlace de ligando marcado con biotina y otros ensayos que mantienen la conformación de CCX-CKR2. El receptor de quimioquina utilizado en tales ensayos puede ser naturalmente expresado, clonado o sintetizado. Por ejemplo, al poner en contacto CCX-CKR2 con un agonista potencial y al medir la actividad de CCX-CKR2, es posible identificar aquellas moléculas que estimulan la actividad CCX-CKR2. 2. Células y Reactivos Los métodos de clasificación de la invención se pueden realizar como ensayos in vitro o basados en células. Los ensayos in vi tro se realizan por ejemplo, utilizando fracciones de membrana o células completas que comprenden CCX-CKR2. Los ensayos basados en células se pueden realizar en cualquiera de las células en las cuales se expresa CCX-CKR2. Los ensayos basados en células involucran células completas o fracciones de células que contienen CCX-CKR2 para clasificar el enlace o modulación del agente de actividad de CCX-CKR2 por el agente. Los tipos de células ejemplares que pueden ser utilizados de acuerdo con los métodos de la invención incluyen, por ejemplo, cualquiera de las células mamíferas incluyendo leucocitos tales como neutrófilos, monocitos, macrófagos, eosinófilos, basófilos, células cebadas y linfocitos, tales como células T y células B, leucemias, linfomas de Burkitt, células de tumor, células endoteliales, fibroblastos, células cardiacas, células musculares, células de tumor de seno, carcinomas de cáncer ovárico, carcinomas cervicales, glioblastomas, células de hígado, células de riñon y células neuronales, así como células fúngales, incluyendo levadura. Las células pueden ser células primarias o células de tumor u otros tipos de líneas de células inmortales. Por supuesto, CCX-CKR2 se puede expresar en células que no expresan una reacción endógena de CCX-CKR2. En algunos casos, los fragmentos de CCX-CKR2, así como fusiones de proteína, pueden ser utilizados para la clasificación. Cuando las moléculas que compiten para el enlace con ligandos de CCX-CKR2 se desean, los fragmentos de CCX-CKR2 utilizados son fragmentos capaces de enlace de los ligandos (por ejemplo, capaz de enlazar I-TAC o SDFl) . Alternativamente, cualquier fragmento de CCX-CKR2 se puede utilizar como un objetivo para identificar moléculas que enlazan CCX-CKR2. Los fragmentos de CCX-CKR2 pueden incluir cualquier fragmento de, por ejemplo, por lo menos 20, 30, 40, 50 aminoácidos hasta una proteína que contiene todos excepto un aminoácido de CCX-CKR2. Típicamente, los fragmentos de enlace de ligando comprenderán regiones de transmembrana y/o la mayoría o todos los dominios extracelulares de CCX-CKR2. 3. Actividad de señalización En algunas modalidades, la señalización activada por la activación CCX-CKR2 es utilizada para identificar moduladores de CCX-CKR2. La actividad de señalización de receptores de quimioquina se puede determinar de muchas maneras. Por ejemplo, la señalización se puede determinar al detectar la adhesión de la célula mediada por el receptor de quimioquina. Las interacciones entre quimioquinas y receptores de quimioquina pueden conducir a la adhesión rápida a través de la modificación de la afinidad y la avidez de integrina. Ver, por ejemplo, Laudanna, Immunological Reviews 186:37-46 (2002) . La señalización también se puede medir al determinar, cualitativamente y cuantitativamente, mensajeros secundarios, tal como AMP cíclicos o fosfatos de inositol, así como eventos de fosforilación o desfosforilación también pueden ser monitoreados. Ver, por ejemplo, Premack y colaboradores, Nature Medicine 2:1174-1178 (1996) y Bokoch, Blood 86:1649-1660 (1995). Los ejemplos proporcionan resultados que demuestran que la actividad de CCX-CKR2 es mediada por la ruta de MAPK, específicamente CCX-CKR2 promueve la fosforilación de las proteínas de MAPK ERK1 y ERK2. Una secuencia nativa ejemplar ERK1 se proporciona en el Acceso de GenBank No. de Acceso p27361, una secuencia nativa ejemplar ERK2 se proporciona en el Acceso de GenBank No. p28482. Así, algunos ensayos se designan para detectar una señal en la . ruta de MAPK. El término "señal" como se utiliza con respecto a la ruta de MAPK se refiere a un componente que es parte de la ruta y/o alguna actividad o manifestación asociada con la ruta. El componente puede ser cualquier molécula (por ejemplo, una proteína) involucrada (por ejemplo, producida, utilizada o modificada) en la ruta de transducción de señal de MAPK. La señal en algunos casos es la detección de la fosforilación de la proteína MAPK tal como ERK1 o ERK2. Otras - señales que pueden ser detectadas incluyen los componentes que se forman y/o utilizan corriente- abajo de la fosforilación de ERK1 o ERK2, así como actividades asociadas con la formación y utilización de estos componentes. Algunos ensayos pueden ser conducidos para detectar componentes que se forman y/o utilizan corriente arriba de la fosforilación de ERK1 o ERK2, asi como actividades asociadas con la producción o utilización de tales componentes corriente arriba. Coo se indica en lo anterior, en el caso de ERK1 o ERK2, los componentes corriente arriba incluyen, por ejemplo, Ras, MKKK (por ejemplo, c-Raf1, B-Raf y A-Raf) y un MKK (por ejemplo, MKKl y MKK2) . Los componentes corriente abajo incluyen, por ejemplo, la proteína p90RSK, c-JUN, c-FOS, CREB y STAT. Así, cada uno de estos componentes puede ser detectado en ciertos ensayos y/o la modificación (por ejemplo, fosforilación) de estos componentes. Además, el perfilamiento de expresión de gen y la secreción de proteína también podrían ser detectados . Algunos de los ensayos de clasificación que se proporcionan involucran la detección de la fosforilación de ERK1 y/o ERK2. La fosforilación de esas proteínas es ligando (por ejemplo, SDFl, ITAC) dependiente. Así, los ensayos y ciertos métodos de clasificación se conducen en la presencia de ITAC o SDFl para promover la fosforilación de ERK1 y ERK2. Cuando los ensayos se conducen con ITAC y SDFl, el ensayo puede ser simplificado utilizando células que no expresan CXCR3 o CXCR4 por las razones descritas en lo anterior. La determinación de sí ERK1 o ERK2 se ha fosforilado puede ser realizado utilizando varios procedimientos. Una opción es lisar las células después de que se han incubado con un ligando de CCX-CKR2 y un agente de prueba. El lisado resultante luego puede ser analizado mediante el manchado de Western al someter a la electroforesis el lisado para separar proteínas sobre un gel y luego al sondear el gen con anticuerpos que específicamente enlazan a la forma fosforilada de ERK1 o ERK2. Tales anticuerpos están disponibles de Cell Signaling Technologies MA. La cantidad total de ERK1 o ERK2 presente opcionalmente puede ser determinado utilizando anticuerpos que específicamente enlazan las formas tanto fosforiladas como no fosforiladas de ERK1 y ERK2. Los detalles adicionales que consideran éste procedimiento se exponen en los ejemplos. Otra opción que es adecuada para la clasificación de alto rendimiento es utilizar un método de ELISA utilizando anticuerpos que específicamente enlazan las formas fosforiladas de ERK1 y ERK2. Los equipos para realizar tales ensayos en formatos de alto rendimiento también están disponibles de Cell Signaling Technologies of Beverly, MA (ver, por ejemplo, PathScan™ Phospho-p44/42 MAPK (T202/Y204) Sandwich ELISA Kit) . Las técnicas de manchado de Western y ELISA podrían ser utilizadas para detectar la presencia de proteínas que son componentes de la ruta de MAPK corriente abajo de la fosforilación de ERK1 y ERK2 utilizando anticuerpos que específicamente reconocen los componentes que están involucrados en la ruta. Por ejemplo, la fosforilación de p90RSK se puede estimar utilizando los anticuerpos específicos de fósforo comercialmente disponibles análogos a la detección de Western de ERK2 fosforilado o ERK2. Además, otros eventos corriente abajo de la activación CCX-CKR2 también se pueden monitorear para determinar la actividad de señalización. Los eventos corriente abajo incluyen aquellas actividades o manifestaciones que ocurren como un resultado de la estimulación de un receptor de quimioquina. Los eventos corriente abajo ejemplares incluyen, por ejemplo, el estado cambiado de una célula (por ejemplo, de normal a célula de cáncer o de célula de cáncer a célula no cancerosa) . Las respuestas de célula incluyen la adhesión de de células (por ejemplo, a células endoteliales) . Los clasificados de señalización establecidas involucradas en la angiogénesis (por ejemplo, la señalización mediada por VEGF) también puede ser monitoreada para efectos • causados por moduladores de CCX-CKR2. Los ensayos de membrana corioalantoica (CAM) por ejemplo, se puede utilizar para analizar los efectos sobre la angiogénesis o, por ejemplo, el ensayo de Miles para estudiar los efectos sobre la permeabilidad vascular. En otro ejemplo, la supervivencia celular se puede medir como un suplente para la actividad de CCX-CKR2. Como es descrito en mayor detalle en los ejemplos, la expresión de CCX-CR2 da por resultado la supervivencia de la célula prolongada de células que expresan CCX-CR2 cultivadas en condiciones de bajo contenido de suero como es comparado con las células que no expresan CCX-CR2 cultivadas bajo las mismas condiciones. Así, el antagonismo de CCX-CR2 se espera que reduzca la supervivencia celular, mientras que la activación (por ejemplo, por la vía de agonistas) se espera que incremente la supervivencia de célula. Consecuentemente, la supervivencia de la célula y la apoptosis puede servir como una lectura para la actividad de CCX-CR2. Una amplia variedad de ensayos de muerte celular y apoptosis se pueden incorporar en métodos de clasificación para identificar moduladores de CCX-CR2. En general, los ensayos de este tipo típicamente involucran someter una población de células a condiciones que inducen muerte celular o apoptosis, usualmente tanto en la presencia como la ausencia de un compuesto de prueba que es el modulador potencial de la muerte celular o apoptosis. Un ensayo luego se conduce con las células, o un extracto del mismo, para estimar que efecto el agente de prueba tiene sobre la muerte celular o la apoptosis al comparar el grado de muerte celular o apoptosis en la presencia y la ausencia del agente de prueba. En lugar de analizar la muerte celular o la apoptosis, el tipo opuesto de ensayo puede ser realizado, específicamente el análisis de la supervivencia celular, así como actividades relacionadas tal como el crecimiento celular y la proliferación celular. Sin considerar el tipo particular de ensayo, algunos ensayos se conducen en la presencia de un ligando que activa CCX-CR2 tal como I-TAC o SDF-1. Una variedad de diferentes parámetros que son característicos de la muerte celular y apoptosis se pueden analizar en los presentes métodos de clasificación. Ejemplos de tales parámetros incluyen, pero están limitados a, al monitoreo de activación de las rutas celulares para respuestas toxicológicas por el gen o análisis de expresión de proteína, fragmentación de DNA, cambios en la composición de membranas celulares, permeabilidad de la membrana, activación de componentes de receptores de muerte o las rutas de señalización corriente abajo (por ejemplo, caspasas), respuestas de estrés genérico, activación B NF-kappa y respuestas a mitógenos. En vista de la función que CCX-CKR2 desempeña en la reducción de la apoptosis, otro procedimiento es analizar lo opuesto de la apoptosis y la muerte celular, específicamente para conducir clasificaciones en las cuales se detecta la supervivencia celular o la proliferación celular. La supervivencia celular puede ser detectada, por ejemplo, al monitorear la duración de tiempo que la célula permanece viable, la duración de tiempo que un cierto porcentaje de células originales permanecen vivas, o un incremento en el número de células. Estos parámetros pueden ser monitoreados visualmente utilizando técnicas establecidas. Otro ensayo para estimar la apoptosis involucra la marcación de células con Annexin V (conjugado a tinte Alexa Fluor (r) 488) y Yoduro de Propidio (pi) (Molecular Probes, Eugene Oregon) . Pl, un tinte de enlace de ácido nucleico fluorescente rojo, es impermeable a tanto las células vivas como apoptóticas. Pl solamente marca las células necróticas al teñir ajustadamente a las ácidos nucleicos en la célula. Annexin V toma ventaja del hecho de que las células apoptóticas translocalizan la fosfatidilserina (PS) a la superficie externa de la célula. Annexin V es un anticoagulante humano con alta afinidad para (PS) . En las células apoptóticas, pero no células vivas, expresan PS sobre su superficie externa. Annexin V (marcado con tinta Alexa Fluor (r) 488) marca estas células con fluorescencia verde. Las células luego se analizan en un clasificador de células activado por fluorescencia (FACS) para estimar la fluorescencia en los canales rojo y verde: células apoptóticas (Annexin positivo, Pl negativo) fluorescen solamente en el canal verde; las células vivas (Annexin negativo, Pl negativo) exhiben baja fluorescencia en ambos de los canales rojo y verde; y las células necróticas o muertas (Annexin postivo, Pl positivo) son fuertemente positivas en ambos de los canales rojo y verde. Otros métodos de clasificación están basados en la observación de que la expresión de ciertas proteínas regulatorias es inducida por la presencia o activación de CCX-CR2. La detección de tales proteínas así puede ser utilizada para determinar indirectamente la actividad de CCX-CR2. Como es descrito en mayor detalle en los ejemplos enseguida, una serie de investigaciones de ELISA se condujeron para comparar la concentración relativa de varias proteínas secretadas en el medio de cultivo de células para las células transfectadas con CCX-CR2 y células no transfectadas. A través de estos estudios se determinó que CCX-CR2 induce la producción de un número de diversas proteínas regulatorias, incluyendo factores de crecimiento, quimioquinas, metaloproteinasas e inhibidores de metaloproteinasas. Así, algunos de los métodos de clasificación que se proporcionan involucran determinar si un agente de prueba modula la producción de ciertos factores, de crecimiento, quimioquinas, metaloproteinasas e inhibidores de metaloproteinasas por CCX-CR2. En algunos casos, los ensayos se conducen con células (o extractos de los mismos) que se han cultivado bajo condiciones de suero limitado ya que esto se encontró que incrementa la producción de las proteínas inducidas por CCX-CR2 (ver los ejemplos) . Las siguientes proteínas son ejemplos de diversas clases de proteínas que se detectaron, así como proteínas específicas dentro de cada clase: (1) factores de crecimiento (por ejemplo, GM-CSF) ; (2) quimioquinas (por ejemplo, RANTES, MCP-1) ; (3) metaloproteinasa (por ejemplo, M P3-1) ; y (4) inhibidor de metaloproteinasa (por ejemplo, TIMP-19. Se espera que otras proteínas en estas diversas clases también pueden ser detectadas. Estas proteínas particulares pueden ser detectadas utilizando un método de detección inmunológicos estándares que son conocidos en la técnica. Un procedimiento que es adecuado para el uso en un formato de alto rendimiento, por ejemplo, son ELISAs que se conducen en placas de multi-cavidades. Un equipo de ELISA para detectar TIMP-1 es disponible de DakoCytomation (Código de Producto No. EL513) . Ejemplos adicionales de proveedores de anticuerpos que específicamente enlazan las proteínas listadas en lo anterior proporcionan en los ejemplos enseguida. Las proteínas tales como las metaloproteinasas que son enzimas también pueden ser detectadas mediante ensayos enzimáticos conocidos. En otras modalidades, los moduladores potenciales de CCX-CK2 se prueban para' su habilidad para modular la adhesión celular. La adhesión celular de tumor a monocapas de células endoteliales se han estudiado como un modelo de invasión metastático ( ver, por ejemplo, Blood and Zetter, 1032,89-119 (1990). Estas, monocapas de células endoteliales imitan la vasculatura linfática y pueden ser estimuladas con varias citoquinas y factores de crecimiento (por ejemplo, TNFalfa e IL-lbeta) . Las células que expresan CCX-CKR2 se pueden evaluar para la habilidad para adherirse a esta monocapa en ambos ensayos de adición estáticos así como ensayos donde células están bajo condiciones de flujo para imitar la fuerza de la vasculatura in vivo . Adicionalmente, los ensayos para evaluar la adhesión también pueden ser realizados in vivo ( ver, por ejemplo, von Andrian, U. H. Microcirculation . 3(3):287-300 (1996)). 4. Validación Los agentes que son inicialmente identificados por cualquiera de los métodos de clasificación anteriores se pueden probar adicionalmente para validar la actividad aparente. De preferencia tales estudios se conducen con modelos de animales adecuados. El formato básico de tales métodos involucra la administración de un compuesto de guía identificado durante una clasificación inicial a un animal que sirve como un modelo de animal para humanos y luego determinar si la enfermedad (por ejemplo, cáncer) es de hecho modulada y/o la enfermedad o condición es aminorada. Los modelos de animales utilizados en los estudios de validación generalmente son mamíferos de cualquier clase. Ejemplos específicos de animales adecuados incluyen, pero no están limitados a, primates, ratones, ratas y pez cebra. B. Agentes que interactúan con CCX-CKR2 Los moduladores de CCX-CKR2 (por ejemplo, antagonistas o agonistas) pueden incluir, por ejemplo, anticuerpos (incluyendo monoclonales, humanizados u otros tipos de proteínas de enlace que son conocidas en la técnica) , moléculas orgánicas pequeñas, siRNAs, polipéptidos CCX-CKR2 o variantes de los mismos, quimioquinas (incluyendo pero no limitados SDF-1 y/o I-TAC) miméticos de quimioquina, polipéptidos de quimioquina, etc. Los agentes probados como moduladores de CCX-CKR2 pueden ser cualquier compuesto químico pequeño, o una entidad biológica, tal como un polipéptido, azúcar, ácido nucleico o lípido. Alternativamente, los moduladores pueden ser versiones genéticamente alteradas, ' o versiones peptidomiméticas, de una quimioquina u otro ligando. Típicamente, los compuestos de prueba serán moléculas químicas pequeñas y péptidos. Esencialmente cualquier compuesto químico puede ser utilizado como un modulador o ligando potencial en los ensayos de la invención, aunque más frecuentemente los compuestos que pueden ser disueltos en soluciones acuosas orgánicas (especialmente basadas en DMSO son utilizados) . Los ensayos se designan para clasificar librerías químicas grandes al automatizar las etapas de ensayo al proporcionar compuestos de cualquier fuente conveniente a los ensayos, que son típicamente corridas en paralelo (por ejemplo, formatos de microtítulo en placas microtítulo en ensayos robóticos) . Será apreciado que existen muchos proveedores de compuestos químicos, incluyendo Sigma (St. Louis, MO) , Aldrich (St. Louis, MO) , Sigma Aldrich (St. Louis, MO) , Fluka Chemika-Biochemica Analytika (Buchs, Suiza) y los similares. En algunas modalidades, los agentes tienen un peso molecular de menos de 1,500 daltons, y en unos casos menos de 1,000, 800, 600, 500 o 400 daltons. El tamaño relativamente pequeño de los agentes puede ser deseable debido a que moléculas más pequeñas tienen una más alta probabilidad de tener propiedades fisioquímicas compatibles con buenas características farmacocinéticas, incluyendo la absorción oral de los agentes con más alto peso molecular. Por ejemplo, los agentes menos probables para ser exitosos como fármacos basados en la permeabilidad y solubilidad se describieron por Lipinski y colaboradores, como sigue: que tienen más de 5 donadores de enlace H (expresado como la suma de OHs y NHs) ; que tiene un peso molecular sobre 500; tener un LogP arriba 5 (o MLogP arriba de 4.15); y/o que tiene más de 10 receptores de H-enlace (expresado como la suma de Ns y Os) . Ver, por ejemplo, Lipinski y colaboradores, Adv Drug Delivery Res 23:3-25 (1997). Las clases de compuestos que son substratos para transportadores biológicos son típicamente excepciones a la regla. En una modalidad, los métodos de clasificación de alto rendimiento involucran proporcionar una librería química o de péptido combinatoria que contiene un gran número de compuestos terapéuticos potenciales (modular potencial o compuestos de) . Tales "librerías químicas combinatorias" o "librerías de ligando" luego se clasifican uno o más ensayos, como es descrito en la presente, para identificar aquellos miembros de la librería (particularmente especies químicas o subclases) que exhiben una actividad característica deseada. Los compuestos así identificados pueden servir como " compuestos de guía" convencionales o por sí mismos pueden ser utilizados como terapéuticos potenciales o actuales. Una librería química combinatoria es una colección de diversos compuestos químicos generados ya sea por síntesis química o síntesis biológica, al combinar un número de "bloques de construcción" químicos. Por ejemplo, una librería química combinatoria lineal tal como una librería de polipéptido se forma al combinar un conjunto de bloques de construcción químicos (aminoácidos) en cada manera posible para una longitud de compuesto dada (es decir, el número de aminoácidos en un compuesto de polipéptido) . Millones de compuestos químicos pueden ser sintetizados a través de tal mezclado combinatorio o de bloques de construcción químicos. La preparación y clasificación de librerías químicas combinatorias es bien conocido para aquellos expertos en la técnica. Tales librerías químicas combinatorias incluyen, pero no están limitadas a, librerías de péptido ( ver, por ejemplo, la patente norteamericana 5,010,175, Furia, Int . J. Pept . Prot . Res 37:487-493 (1991) y Houghton y colaboradores, Nature 354:84-88 (1991)). Otras sustancias químicas para generar librerías de diversidad químicas también pueden ser utilizadas. Tales sustancias químicas incluyen, pero no están limitadas a: peptoides (por ejemplo, Publicación de PCT No. WO 91/19735) péptidos codificados (por ejemplo, Publicación de PCT No. WO 93/20242) , bio-oligómero aleatorios (por ejemplo, Publicación de PCT No. WO 92/00091), ' benzodiazepinas (por ejemplo, patente norteamericana No. 5,288,514), diversómeros tales como hidantoinas, benzodiazepinas y dipéptidos (Hobbs y colaboradores, Proc. Nat . Acad. Sci . EUA 90:6909-6913 (1993) ) , polipéptidos vinílogos (Hagihara y colaboradores, J.

AMER. Chem. Soc . 114:6568 (1992)), peptidomiméticos no peptidales con escalafón de glucosa (Hirschmann y colaboradores, J. Amer. Chem. Soc . 114:9217-9218 (1992)), síntesis orgánica de análogos de librerías de compuestos pequeñas (Chen y colaboradores, J. Amer. Chem. Soc. 116:2661 (1994) ) , oligocarbamatos (Cho y colaboradores, Sciense 261:1303 (1993)), y/o peptidil fosfonatos (Campbell y colaboradores, J. Org. Chem. 59:658 (1994)), librerías de ácido nucleico ( ver Ausubel, Berger y Sambrook, all supra) , librerías de ácido nucleico de péptido ( ver, por ejemplo, patente norteamericana No. 5,539,083), librerías de anticuerpo ( ver, por ejemplo, Vaughn y colaboradores, Nature Biotecnology, 14 (3) : 309-314 (1996) y PCT/US96/10287) , librerías de carbohidrato, ( ver, por ejemplo, Liang y colaboradores, Science, 274:1520-1522 (1996) y patente norteamericana No. 5,593,853), librerías de moléculas orgánicas pequeñas ( ver, por ejemplo, benzodiazepinas, Baum C&EN, Enero 18, página 33 (1993) ; isoprenoides, patente norteamericana No. 5,569,588; tiazolidinonas y metatiazanonas, patente norteamericana No. 5,549,974; pirrolidinas, patentes norteamericanas Nos. 5,525,735 y 5,519,134; compuestos morfolino, patente norteamericana No. 5,506,337; benzodiazepinas, 5,288,514 y los similares). Los dispositivos para la preparación de librerías combinatorias son comercialmente disponibles ( ver, por ejemplo, 357 MPS, 390 MPS, Advance Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, MA, 433A Applied Biosystems, Foster City, CA, 9050 Plus, Millipore, Bedford, MA) . Además, numerosas librerías combinatorias son por sí mismas comercialmente disponibles ( ver, por ejemplo, ComGenex, Princeton, N.J., Tripos, St . Louis, MO, 3D Pharmaceutical, Exton, PA, Martek Biosciences, Colombia, MD, etc.). CCX7923 ( ver la Figura 4) es comercialmente disponible y se puede hacer mediante la condensación de N-[3- (dimetilamino) propil] -N,N-dimetil-l, 3-propanodiamina con bromometil-biciclo (2, 2, 1) hept-2-eno por métodos conocidos en la técnica. CCX0803 ( ver la Figura 4) es comercialmente disponible y se puede hacer mediante la condensación de 3- (2-bromoetil) -5-fenilmetoxi-indol y 2, 4, 6-trifenilpiridina por métodos bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Organic Function Group Preparations, 2- Edición Volumen 1, (S.R. Sandler & W. Karo 1983); Handbook of Heterociclic Chemistry (A. R. Katritzky, 1985) ; Encyclopedia of Chemical Technology, 4- Edición (J. Kroschwitz, 1996) . En una modalidad, los compuestos activos (es decir, moduladores de CCX-CKR2) de la presente invención tienen la estructura general (I) : donde m es un número entero de 1 a 5 y cada Y que sustituye el anillo de bencilo es independientemente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido con halo, alquileno, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalquileno, halógeno, heterocíclico, arilo, arileno, heteroarilo, heteroarileno, hidroxi, alcoxi y ariloxi, n es 0, 1, 2 o 3; A es -CH- o -N-; R1 y R2 son cada uno independientemente alquilo o hidrógeno, o Z en combinación con R1 y R2 forman un anillo de 5 o 6- miembros que comprenden por lo menos un nitrógeno y que opcionalmente comprende uno o más heteroátomos adicionales, donde el anillo de 5-6 miembros está opcionalmente e independientemente sustituido con una o más porciones seleccionadas del grupo que consiste de alquilo, alquenilo, fenilo, bencilo, sulfonilo y heteroátomo sustituido; R3, R4 y R5 son cada uno independientemente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo, halo-alquilo sustituido, alquileno, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalquileno, heterocíclico, arilo, arileno, heteroarilo, heteroarileno, hidroxi, alcoxi y ariloxi; y Rs es alquilo o hidrógeno; con la condición de que si Z es nitrógeno y R1 y R2 junto con Z forman un grupo morfolinilo, entonces n es 3, y por lo menos uno y por lo menos uno de R3, R4 y R5 es hidroxi, alcoxi o ariloxi; con la condición de que si n=l, Z es carbono y R1 y R2 está combinación no es -CH2CH2NCH2CH2-; o con la condición de que R1 junto con R2 es -CH(CH3) (CH2) -entonces Z es -CH-; o con la condición de que si R5 es t-butilo entonces R3 es hidrógeno; o con la condición de que si R4 y R5 conjuntamente forman un anillo de 5 miembros, entonces por lo menos uno de los átomos unidos al anillo de fenilo es carbono. Ver, la Patente Provisional Norteamericana No. 60/434,912 presentada el 20 de Diciembre del 2002 y la Solicitud de Patente Provisional Norteamericana No. 60/516,151, presentada el 20 de Diciembre del 2003. El enlace ondulado que conecta la olefina al anillo de fenilo sustituido significa que el anillo puede ser ya sea cis o trans a R6. En una modalidad preferida, n es 1, 2 o 3. En otra modalidad preferida, n es 2 o 3. En una modalidad preferida adicional, n es 3. En otra modalidad, los compuestos preferidos tienen la estructura general (I), donde es R6 es hidrógeno. En una modalidad adicional, los compuestos preferidos tienen la estructura general (I), donde R6 es metilo. En otra modalidad, los compuestos preferidos tienen la estructura general (I) , donde R3, R4 y R5 son independientemente hidrógeno, hidroxi, alquilo, alcoxi, ariloxi y alquilo sustituido con halo. Más de preferencia, R3, R4 y R5 son independientemente alcoxi o hidrógeno. En otra modalidad, los compuestos preferidos tienen la estructura general (I) , donde R4 es hidrógeno y R3 y R5 son alcoxi (-OR) , incluyendo grupos trifluoroalcoxi tales como trifluorometoxi y (-OCH2CF3) . En una modalidad adicional, R3 es hidrógeno y R4 y R5 son alcoxi. Cualquiera de estas modalidades, el grupo alcoxi puede ser metoxi (-OCH3) o etoxi (-OCH2CH3) .

En otra modalidad, los compuestos preferidos tienen la estructura general (I) , donde R4 y R5 conjuntamente forman un anillo heterocíclico, arilo o heteroarilo. En otra modalidad preferida, R3 es hidrógeno y R4 y R5 conjuntamente son -0(CH2)30-, - (CH) 4- o -N(CH)2N-. En otra modalidad, los compuestos preferidos tienen la estructura general (I) , donde Z es nitrógeno y Z en combinación con R1 y R2 forman un grupo heteroarilo o heterocíclico. En una modalidad preferida, los compuestos tienen la estructura general (I)m, Z es CH y Z en combinación con R1 y R2 forman un grupo heteroarilo o heterocíclico. Los compuestos más preferibles tienen la estructura general (I) , donde es CH y Z en combinación con R1 y R2 forman un grupo heterocíclico que contiene nitrógeno. En una modalidad adicional, Z en combinación con R1 y R2 forman un grupo morfolinilo, pirrolidinilo, piperidinilo o piperazinilo sustituido o no sustituido. Los sustituyentes preferidos para el grupo heteroarilo o heterocíclico incluyen alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo, alcoxi, hidroxi, heteroátomos y haluros. En una modalidad especialmente preferida, el grupos heteroarilo o heterocíclico es sustituido con bencilo, fenilo, metilo, etilo, ciciohexilo, metoxi-metilo (-CH2OCH3) o ciclohexil-metilo (-CH2 (C6Hn) ) .

En una modalidad, un compuesto preferido tiene la estructura general (I) , donde Z en combinación con R1 y R2 es un grupo que pirrolidinilo sustituido con alquilo o metoxi-metilo; un grupo piperidinilo sustituido con bencilo, fenilo, metilo, etilo o heteroátomos sustituidos; o un grupo piperazinilo sustituido con bencilo, fenilo o sulfonilo. Los grupos heteroátomos sustituidos especialmente preferidos incluyen alcoxi, aminilo, aminil cicloalquilo, aminil alquilo, aminil ciclopropilo, aminil isopropilo, aminil bencilo y fenoxi. De preferencia, el heteroátomo sustituido está en la posición 3 del anillo piperidinilo. En otro aspecto, los compuestos preferidos tienen la estructura general (I) , donde Z en combinación con R1 y R2 es Los compuestos preferidos que tienen la estructura general (I) también pueden tener Z como un átomo de nitrógeno, tener R1 y R2 cada uno como grupos alquilo o metilo, o tener R1 y R2 conjuntamente formando -C(C(0)N(CH3)2) (CH2)3-. En otra modalidad, Z en combinación con R1 y R2 forman un anillo de 5 miembros que incluyen nitrógeno y que incluye opcionalmente uno o más heteroátomos adicionales. En esta modalidad, n es de preferencia 1 y Z es de preferencia -CH- . En una modalidad especialmente preferida de este tipo, Z en combinación con R1 y R2 es donde R7 es de preferencia hidrógeno, alquilo, arilo o aralquilo. En otra modalidad preferida R7 puede ser un bencilo halogenado o grupo fenilo. En una modalidad adicional, R7 es de preferencia hidrógeno, metilo, etilo, bencilo o para- fluoro-fenilo. En otra modalidad, los compuestos activos de la presente invención tienen la estructura general (II) : donde m es un número entero de 1 a 5; cada Y que sustituye el anillo de bencilo está independientemente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido con halo, alquileno, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalquileno, halógeno, heterocíclico, arileno, heteroarilo, heteroarileno, hidroxi y alcoxi; n es 1, 2 o 3; y R3, R4 y R5 son cada uno independientemente seleccionados del que consiste de hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido por halo, alquileno, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalquileno, heterocíclico, arilo, arileno, heteroarilo, heteroarileno, hidroxi, alcoxi y ariloxi. Como en la estructura (I) anterior, el enlace ondulado que conecta la olefina al anillo de fenilo sustituido significa que el anillo puede ser ya sea cis o trans .

En otra modalidad, los compuestos preferidos pueden tener la estructura general (II), donde n es 3. En otra modalidad, los compuestos preferidos pueden tener la estructura general (II), donde R3, R4 y R5 son sustituidos como es descrito para la estructura (I) anterior. Actualmente, los compuestos especialmente preferidos tienen la estructura general (II) , donde R3, R4 y R5 son alcoxi o metoxi . Mientras que muchas rutas sintéticas conocidas para aquellos expertos ordinarios en la técnica pueden ser utilizadas para sintetizar los compuestos activos de la presente invención, un método de síntesis general se da enseguida en el Esquema I .

Esquema I En el esquema I, el aldehido (2) se somete a una reacción de condensación con la amina primaria (3) por la vía de la aminación reductora. Las aminas primarias adecuadas son comercialmente disponibles de Aldrich, Milwaukee, Wl, por ejemplo, o se pueden sintetizar mediante rutas químicas conocidas para aquellos de habilidad ordinaria en la técnica. La reacción de afinación se puede llevar a cabo con agente de reducción en cualquier solvente adecuado, incluyendo, pero no limitado a tetrahidrofurano (THF) , diclorometano o metanol para formar intermediario (4) . Los agentes de reducción adecuados para la reacción de condensación incluyen, pero no están limitados a, cianoborohidruro de sodio (como es descrito en Mattson y colaboradores, J. Org. Chem. 1990, 55, 2552 y Barney y colaboradores, Tetrahedron Lett. 1990, 31, 5547); triacetoxiborohidruro de sodio (como es descrito en 7?bdel-Magid y colaboradores, Tetrahedron Lett . 31:5595 (1990) ) ; borohidruro de sodio (como descrito en Gribble; Nutaitis Synthesis . 709 (1987) ) ; pentacarbonilo de hierro y KOH alcohólico (como es descrito en Watabane y colaboradores, Tetrahedron Lett . 1879 (1974) ) ; y BH3-piridina (como es descrito en Welter y colaboradores, J. Chem. Soc . Perkin. Trnas. 1:717 (1984) ) . La transformación del intermediario (4) al compuesto (5) se puede llevar a cabo en cualquier solvente adecuado, tal como tetrahidrofurano o diclorometano, con un cloruro de acilo adecuadamente sustituido en la .presencia de una base. Las bases de amina terciaria son preferidas. Las especialmente preferidas incluyen trietilamina y base de Hunnings . Alternativamente, la transformación del intermediario (4) al compuesto (5) también se puede obtener con un reactivo de acoplamiento adecuado, tal como l-etil-3- (3-dimetilbutilpropil) carbodiimida o Diciclohexil-carbodiimida (como es descrito en B. Neises y W. Steglich, Angew. Chem. Int . Ed. Engl . 17:522 (1978)), en la presencia de un catalizador, tal como 4-N,N-dimetilamino-piridina, o en la presencia de hidroxibenzotriazol (como es descrito en K. Synth . Commun. 7:251). Para demostrar que los compuestos descritos en lo anterior son antagonistas útiles para las quimioquinas SDF-1 e I-TAC, los compuestos se clasificaron in vi tro para determinar su habilidad para desplazar SDF-1 e I-TAC del receptor CCX-CKR2 en múltiples concentraciones. Los compuestos se combinaron con células de glándula mamaria que expresan los sitios del receptor de CCX-CKR2 en la presencia de la quimioquina SDF-1 marcada con 125I y/o la quimioquina I-TAC 125I . La habilidad de los compuestos para desplazar la SDF-1 e I-TAC marcada de los sitios de receptor de CCX-CKR2 en múltiples concentraciones luego se determinó con el proceso de clasificación. Los compuestos que se consideraron antagonistas de SDF-1 e I-TAC efectivos fueron capaces de desplazar por lo menos 50% de la quimioquina SDF-1 y/o I-TAC del receptor de CCX-CKR2 en concentraciones en o por debajo de 1.1 micromolar (µM) y más de preferencia en concentraciones en o por debajo de 300 nanomolar (nM) . En algunos casos, es deseable que los compuestos puedan desplazar por lo menos 50% del SDF-1 y/o I-TAC del receptor de CCX-CKR2 en concentraciones en o por debajo de 200 nM. Compuestos ejemplares que satisfacen estos criterios se reproducen en la Tabla I enseguida. TABLA I C. Ensayos de Alto Rendimiento en Fase Sólida y Solubles En los ensayos de alto rendimiento de la invención, es posible clasificar hasta varios miles de diferentes moduladores o ligandos en un solo día. En particular, cada cavidad de una placa microtítulo puede ser utilizada para correr un ensayo separado contra un modulador potencial seleccionado, o, si la concentración o los efectos del tiempo de incubación van a ser observados, cada 5-10 cavidades pueden probar un solo modulador. Así, una sola placa microtítulo estándar puede analizar aproximadamente 100 (por ejemplo 96) moduladores. Si se utilizan placas de 1536 cavidades, entonces una sola placa puede fácilmente analizar de aproximadamente 100 a aproximadamente 1500 diferentes compuestos. Es posible analizar varias placas diferentes por día; son posibles clasificaciones de ensayo por hasta aproximadamente 6,000-20,000 compuestos diferentes utilizando los sistemas integrados de la invención. Más recientemente, se han desarrollado procedimientos microfluídicos para la manipulación de reactivos. La invención proporciona ensayos in vitro para identificar, en un formato de alto rendimiento, compuestos que pueden modular la función o actividad de CCX-CKR2. Las reacciones de control que miden la actividad de CCX-CKR2 de la célula en una reacción que no incluye un modulador potencial son opcionales, ya que los ensayos son altamente uniformes. Tales reacciones de control opcionales, sin embargo, incrementan la confiabilidad del ensayo. En algunos ensayos será deseable tener controles positivos para asegurar que los componentes de los ensayos están trabajando de manera apropiada. Por lo -menos dos tipos de controles positivos son apropiados. Primero, un activador o ligando conocido de CCX-CKR2 puede ser incubado con una muestra del ensayo, y el incremento resultante en la señal que resulta de una actividad incrementada de CCX-CKR2 (por ejemplo, como es determinado de acuerdo con los métodos en la presente) . Segundo, un inhibidor o antagonista de CCX-CKR2 puede ser adicionado, y la disminución resultante en la señal para la actividad del receptor de quimioquina puede ser similarmente detectado. Será apreciado que los moduladores también se pueden combinar con activadores o inhibidores para encontrar moduladores que inhiben el incremento o disminución que es de otra manera causada por la presencia del modulador conocido de CCX-CKR2. IV. Expresión de CCS-CKR2 en un sujeto En algunas modalidades, CCX-CKR2 se expresa en un sujeto, para de esta manera incrementar la expresión de CCX-CKR2. Alternativamente, los polinucleótidos inhibitorios, incluyendo, por ejemplo, siRNA o secuencias de antisentido, se pueden expresar in vitro o in vivo para inhibir la expresión de CCX-CKR2. En algunos casos, un polinucleótido que codifica CCX-CKR2 se introduce en una célula in vitro y las células subsecuentemente se introducen en un sujeto. En algunos de estos casos, las células primero son aisladas del sujeto y luego reintroducidas en el sujeto después de que se introduce el polinucleótido. En otras modalidades, los polinucleótidos que codifican CCX-CKR2 se introducen directamente en la células en el sujeto in vivo . En algunos casos, los polipéptidos que codifican CCX-CKR2 se introducen en las células de: (i) un tejido de interés, (ii) células exógenas introducidas en el tejido, o (iii) células cercanas que no están dentro del tejido. En algunas modalidades, los polinucleótidos de la invención se introducen en células endoteliales. El tejido con el cual las células endoteliales están asociadas es cualquier tejido en el cual se desea aumentar la migración o expansión de los endotelios . Los métodos de transferencia de gen de base viral y no viral convencionales pueden ser utilizados para introducir ácidos nucleicos que codifican polipéptidos diseñados de la invención en células mamíferas o tejidos objetivos. Tales métodos se pueden utilizar para administrar ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de la invención (por ejemplo, CCX-CKR2) a células in vitro. En algunas modalidades, los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de la invención se administran para usos de terapia génica in vivo o ex vivo. Los sistemas de suministro de vector no viral incluyen los plásmidos de DNA, ácido nucleico desnudo y ácido nucleico formado en complejo con un vehículo de suministro tal como un liposoma. Los sistemas de suministro de vector viral incluyen virus de DNA y RNA, que tienen genomas ya sea episomales o integrados después del suministro de la célula. Para una revisión de procedimiento de terapia génica, ver Anderson, KscienceK 256:808-813 (1992); Nabel & Felgner, TIBTECH 11:211-217 (1993; Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnolpgy 6 (10) : 1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer & Perricaudet, Bri tish Medical Bulletin 51(1): 31-44 (1995) ; Hadada y colaboradores, in Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Bóhm (eds) (1995) ; y Yu y colaboradores, gene Therapy 1:13-26 (1994). Los métodos de suministro no viral de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos diseñados de la invención incluyen lipofección, microinyección, biolística, virosomas, liposomas, inmunoliposomas, policación o conjugados de lípido: ácido nucleico, DNA desnudo, viriones artificiales y captación aumentada por el agente de DNA. La lipofección es descrita en por ejemplo, las patentes norteamericanas 5,049,386, US 4,946,787; y US 4,897,355) y los reactivos de lipofección son vendidos comercialmente (por ejemplo, Transfectam™ y Lipofectin™) . Los lípidos catiónicos y neutros son adecuados para la lipofección de reconocimiento de receptor eficiente de polinucleótidos incluyen aquellos de Fergner, WO 91/17424, WO 91/16024. El suministro puede ser a células (administración ex vivo) o tejidos objetivo (administración in vivo) . La preparación de complejos de lípido: ácido nucleico, incluyendo liposomas dirigidos tales como complejos de inmunolípido, es bien conocida para un experto en la técnica (ver, por ejemplo, Cristal, Science 270:404-410 (1995); Baléese y colaboradores, Cáncer Gene Ther. 2:291-297 (1995); Behr y colaboradores, Bioconj ugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy y colaboradores, Bioconj ugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao y colaboradores, Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad y colaboradores, Cáncer Res . 52:4817-4820 (1992); patentes norteamericanas Nos. 4,186,183, 4,217,344, 4,235,871, 4,261,975, 4,485,054, 4,501,728, 4,774,085, 4,837,028 y 4,946,787) . El uso de sistemas basados en RNA o DNA viral para el suministro de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos diseñados de la invención toma ventaja de los procesos altamente evolucionados para dirigir un virus a células específicas en el cuerpo y transportar la carga viral al núcleo. Los vectores virales pueden ser administrados directamente a pacientes (in vivo) o se pueden utilizar para tratar células in vitro y las células modificadas se administran a los pacientes (ex vivo) . Los sistemas de base viral convencionales para el suministro de polipéptido de la invención podrían incluir vectores de virus retroviral, lentivirus, adenoviral, adenoasociados y de herpes simple para la transferencia génica. Los vectores virales son actualmente el método más eficiente y versátil de transferencia génica en células y tejidos objetivo. La integración en el genoma hospedero es posible con los métodos de transferencia de gen de virus retrovirus, lentivirus y adenoasociados, dando por resultado frecuentemente la expresión a largo plazo del transgen insertado. Adicionalmente, altas eficiencias de transducción se han observado en muchos diferentes tipos de células y tejidos objetivo. El tropismo de un retrovirus puede ser alterado al incorporar proteínas de envoltura foráneas, expandiendo la población objetivo potencial de las células objetivo. Los vectores lentivirales son vectores retrovirales que son capaces de transducir o infectar células no divisorias y típicamente producir altos títulos virales. La selección de un sistema de transferencia de gen retroviral por lo tanto dependería del tejido objetivo. Los vectores retrovirales están comprendidos de repeticiones terminales largas de acción cis con capacidad de empaquetamiento para hasta 6-10 kb de la secuencia foránea. Las LTRs de acción cis mínima son suficientes para la replicación y empaquetamiento de los vectores, que luego se utilizan para integrar el gen terapéutico en la célula objetivo para proporcionar la expresión de transgen permanente. Los vectores retrovirales ampliamente utilizados incluyen aquellos basados en el virus de leucemia de murino (MuLV) , virus de leucemia de simio gibón (GaLV) , virus de Inmunodeficiencia de Simio (SIV) , virus de inmunodeficiencia humana (HIV) y combinaciones de los mismos (ver, por ejemplo, Buchscher y colaboradores, J. Virol . 66:2731-2739 (1992); Johann y colaboradores, J. Virol . 66:1635-1640 (1992); Som erfelt y colaboradores, Virol . 176:58-59 (1990); Wilson y colaboradores, J. Virol 63:2374-2378 (1989); Miller y colaboradores, J. Virol . 65:2220-2224 (1991); PCT/US94/05700) . En aplicaciones donde la expresión transiente de los polipéptidos de la invención es preferida, típicamente se utilizan sistemas de base adenoviral. Los vectores de base adenoviral son capaces de muy alta eficiencia de transducción en muchos tipos de células y no requieren división de la célula. Con tales vectores, se han obtenido alto título y niveles de expresión. Este vector puede ser producido en grandes cantidades en un sistema relativamente simple. Los vectores de virus adenoasociados ("AAV") también se utilizan para transducir células con ácidos nucleicos objetivo, por ejemplo, en la producción in vivo de ácidos nucleicos y péptidos y para los procedimientos de terapia génica in vivo y ex vivo (ver, por ejemplo, West y colaboradores, Virology 160:38-47 (1987); patente norteamericana No. 4,797,368; WO 93/24641; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Myzyczka, J. Clin . Invest . 94:1351(1994)). La construcción de vectores AAV recombinantes son descritos en un número de publicaciones, incluyendo la patente norteamericana No. 5,173,414; Tratschin y colaboradores, Mol . Cell . Biol . 5:3251-3260 (1985); Tratschi, y colaboradores, Mol . Cell . Biol . . 4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984); y Sa ulski y colaboradores, J. Virol . 63:03822-3828 (1989) . pLASN y MFG-S son ejemplos de vectores retrovirales que se han utilizado en experimentos clínicos (Dunbar y colaboradores, Blood 85:3048-305 (1995); Kohn y colaboradoradores, Nat . Med. 1:1017-102 (1995); Malech y colaboradores, PNAS 94:22 12133-12138 (1997)). PA317/pLAS? fue el primer vector terapéutico utilizado en un experimento de terapia génica. (Blaese y colaboradores, Science 270:475- 480 (1995) ) . Las eficiencias de transducción de 50% o más grande se han observado para vectores empacados de MFG-S (Ellem y colaboradores, Immunol Immunother. 44(1): 10-20 (1997); Dranoff y colaboradores, Hum. Gene Ther. 1:111-2 (1997) . Los vectores de virus adenoasociado recombinante (rAAV) son una alternativa prometedora de sistemas de suministro de genes basado en el virus tipo 2 adenoasociado de parvovirus defectuoso y no patogénico. Todos los vectores son derivados de un plásmido que retiene solamente el AAV de 145 bp repeticiones terminales invertidas que flanquean el cásete de expresión de transgen. La transferencia de gen eficiente y el suministro de transgen estable debido a la integración en los genomas de la célula transducida son factores claves para este sistema de vector (Wagner y colaboradores, Lancet 351:9117 1702-3 (1998), Kearns y colaboradores, Gene Ther. 9:748-55 (1996)). Los vectores adenovirales recombinantes deficientes de replicación (Ad) se pueden diseñar tal que un transgen reemplaza los genes Ad Ela, Elb y E3; subsecuentemente el vector defector de replicación se propaga en las células 293 humanas que suministran la función del gen suprimido en trans. Los vectores Ad pueden transducir múltiples tipos de tejidos in vivo, incluyendo células diferenciadas, no divisorias tales como aquellas encontradas en los tejidos del hígado, riñon y sistema muscular. Los vectores Ad convencionales tienen una capacidad portadora grande. Un ejemplo de uso de un vector Ad en un experimento clínico involucró la terapia de polinucleótido para la inmunización antitumoral con inyección intramuscular (Sterman y colaboradores, Hum. Gene Ther. 7:1083-9 (1998)). Ejemplos adicionales del uso de vectores de adenovirus para la transferencia génica en experimentos clínicos incluyen Rosenecker y colaboradores, Infection 24:1 5-10 (1996); Sterman y colaboradores, Hum. Gene Ther. 9:7 1083-1089 (1998); Welsh y colaboradores, Hum. Gene Ther. 2:205-18 (1995); Alvarez y colaboradores, Hum. Gene Ther. 5:597-613 (1997); Topf y colaboradores, Gene Ther. 5:507-513 (1998); Sterman y colaboradores, Hum. Gene Ther. 7:1083-1089 (1998). Las células de empaquetamiento se utilizan para formar partículas de virus que son capaces de infectar una célula hospedera. Tales células incluyen las células 293, que empacan adenovirus, y las células ?2 o células PA317 que empacan retrovirus. Los vectores virales utilizados en la terapia génica son usualmente generados por la línea de células productoras que empaca un vector de ácido nucleico en una partícula viral. Los vectores típicamente contiene las secuencias virales mínimas requeridas para el empaque y la integración subsecuente en un hospedero, otras secuencias virales que son reemplazadas por un cásete de expresión para la proteína que es expresada. Las funciones virales ausentes son suministradas en trans mediante la línea de célula de empaque. Por ejemplo, los vectores AAV utilizados en la terapia génica de manera típica solamente poseen secuencias ITR a partir del genoma de AAV que son requeridos para el empaque y la integración en el genoma hospedero . El DNA viral es empacado en una línea de células, que contiene un plásmido ayudante que codifica los otros genes AAV, específicamente rep y cap, pero que carece de secuencias ITR. La línea de célula también es infectada con adenovirus como un ayudante. El virus ayudante promueve la replicación del vector AAV y la expresión de genes AAV a partir del plásmido ayudante. El plásmido ayudante no es empacado en cantidades significantes debido a una carencia de secuencias de ITR. La contaminación con adenovirus puede ser reducida mediante, por ejemplo, tratamiento térmico al cual el adenovirus es más sensible que AAV. En muchas aplicaciones de terapia génica, es deseable que el vector de terapia génica sea suministrado con un alto grado de especificidad a un tipo de tejido particular. Un vector viral típicamente es modificado para tener especificidad para un tipo de célula dado al expresar un ligando como una proteína de fusión con una proteína de recubrimiento viral sobre la superficie externa del virus. El ligando es seleccionado para tener afinidad para un receptor conocido que está presente en el tipo de célula de interés. Por ejemplo, Han y colaboradores, PNAS 92:9747-9751 (1995), reportó que el virus de leucemia de murino Moloney puede ser modificado para expresar heregulina humana fusionada gp70, y el virus recombinante infecta ciertas células de cáncer de seno humano que expresa el receptor de factor de crecimiento epidérmico humano. Este principio puede ser extendido a otros pares de virus que expresa una proteína de fusión de ligando y la célula objetivo que expresa un receptor. Por ejemplo, el fago filamentoso puede ser diseñado para exhibir fragmentos de anticuerpo (por ejemplo FAB o Fv) que tiene afinidad de enlace específica para virtualmente cualquier receptor celular seleccionado. Aunque la descripción anterior aplica principalmente a vectores virales, los mismos principios pueden ser aplicados a vectores no virales. Tales vectores pueden ser diseñados para contener secuencias de captación específicas aunque para favorecer la captación por células objetivo específicas. Los vectores de terapia génica pueden ser suministrados in vivo mediante la administración a un paciente individual, típicamente mediante administración sistémica (por ejemplo, infusión intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subdérmica o intracraneal) o aplicación tópica, como es descrito enseguida. Alternativamente, los vectores pueden ser suministrados a células ex vivo, tal como células explantadas de un paciente individual (por ejemplo, linfocitos, aspirados de médula ósea, biopsia de tejidos) o células madre hematopoyéticas donadoras universales, seguido por la reimplantación de las células en un paciente, usualmente después de la selección para células que han incorporado el vector. La transfección de células ex vivo para el diagnóstico, investigación o para la terapia génica (por ejemplo, por la vía de la re-infusión de las células transfectadas en el organismo hospedero) es bien conocida para aquellos expertos en la técnica. En una modalidad preferida, las células se aislan del organismo objetivo, se transfectan con ácido nucleico (gen o cDNA) que codifica un polipéptido de la invención, y se reinfusionan nuevamente en el organismo objetivo (por ejemplo, paciente) . Varios tipos de células adecuados para la transfección ex vivo son bien conocidos para aquellos expertos en la técnica (ver, por ejemplo, Freshney y colaboradores, Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique (3rd ed. 1994) ) y las referencias citadas en las mismas para una discusión de cómo aislar y cultivar células a partir de los pacientes) . En una modalidad, las células madre se utilizan en procedimientos ex vivo para la transfección celular y la terapia génica. La ventaja de utilizar .células madre es que ellas pueden ser diferenciadas en otros tipos de célula in vitro o pueden ser introducidas en un mamífero (tal como el donador de las células) donde se injertarán en la médula ósea. Los métodos para diferenciar las células CD34+ in vitro en tipos de células inmunes clínicamente importantes utilizando citoquinas tal como una GM-CSF, IFN-? y TNF-a son conocidos (ver Inaba y colaboradores, J. Exp. Med. 176:1693-1702 (1992) ) . Las células madre se aislan para la transducción y diferenciación utilizando métodos conocidos. Por ejemplo, las células madre se aislan de las células de la médula ósea al extender las células de médula ósea con anticuerpos que enlazan células indeseadas, tales como CD4+ y CD8+ (células T) , CD45+ (células panB) , GR-1 (granulocitos) e Iad (células que presentan antígeno diferenciadas) (ver Inaba y colaboradores, J. Exp. Med. 176:1693-1702 (1992)). Los vectores (por ejemplo, retrovirus, adenovirus, liposomas, etc.) que contiene ácido nucleico terapéutico también se pueden administrar directamente en el organismo para la transducción de células in vivo. Alternativamente, el DNA desnudo puede ser administrado. La administración y mediante cualquiera de la ruta normalmente utilizada para introducir una molécula de contacto final o las células de la sangre o de tejido. Los métodos adecuados de administración de tales ácidos nucleicos están disponibles y bien conocidos para aquellos expertos en la técnica, y aunque más de una ruta puede ser utilizada para administrar una composición particular, como una ruta particular frecuentemente puede proporcionar una reacción más inmediata y más efectiva que otra ruta.

Los portadores farmacéuticamente aceptables son determinados en parte por la composición particular que es administrada, así como por el método particular utilizado para administrar la composición. Por consiguiente, hay una amplia variedad de formulaciones adecuadas de composiciones farmacéuticas de la presente invención, como es descrito enseguida (ver, por ejemplo, Remington' s Pharmaceutical Sciences, 17 th ed. , 1989) . V. Diagnosis y Prognosis La presente invención proporciona métodos para detectar una célula de cáncer, incluyendo métodos para proporcionar una prognosis o diagnosis de cáncer. Como es demostrado en la presente, CCX-CKR2 se expresa en casi cada célula de cáncer probada hasta la fecha, mientras que la expresión normal (no de cáncer) de CCX-CKR2 se presenta que es limitada al riñon y algunas células del cerebro así como en ciertas etapas de desarrollo del hígado fetal. Por lo tanto, la expresión de CCX-CKR2 en una célula, y en particular, en una célula no fetal y/o una célula diferente a una célula del riñon o del cerebro, indica la presencia probable de una célula de cáncer. En algunos casos, las muestras que contienen células que expresan CCX-CKR2 se confirman para la presencia de células de cáncer utilizando otros métodos conocidos en la técnica. De acuerdo con todavía otro aspecto de la invención, se proporcionan métodos para seleccionar un curso de tratamiento de un sujeto que tiene o que se sospecha de tener cáncer. Los métodos incluyen obtener del sujeto una muestra biológica, poner en contacto la muestra con anticuerpos o fragmentos que enlazan antígeno de la misma que enlaza específicamente a CCX-CKR2, detectar la presencia o ausencia del enlace de anticuerpo y seleccionar un curso de tratamiento apropiado para el cáncer del sujeto. En algunas modalidades, el tratamiento es administrando antagonistas de CCX-CKR2 al sujeto. Los métodos de detección utilizando agentes que enlazan una proteína son bien conocidos e incluyen, por ejemplo, varios inmunoensayos, citometría de flujo, etc. Usando la citometría de flujo, las células que expresan un antígeno específico de interés dentro de una población mezclada de células pueden ser identificadas. Brevemente, las células se permiten reaccionar con un anticuerpo específico para la proteína de interés (por ejemplo, CCX-CKR2) . El anticuerpo puede ser ya sea marcado fluorescentemente (método directo de manchado) , o si no es marcado, un segundo anticuerpo que reacciona con el primero puede ser marcado fluorescentemente (método indirecto de manchado) . Las células luego se pasan a través de un instrumento que puede detectar la señal fluorescente. Las células son aspiradas y hechas en una suspensión de células individual. Esta suspensión de célula se pasa por un láser que excita el anticuerpo marcado con fluorocromo que ahora enlaza las células y adquiere estos datos. Las células que se encuentren que son brillantes (es decir, reaccionan con el anticuerpo fluorescentemente marcado) expresan la proteína de interés; las células que son opacas (es decir no reaccionan con el anticuerpo fluorescentemente marcado) no expresan la proteína de interés . La presente invención proporciona métodos para diagnosticar enfermedades humanas incluyendo, pero no limitadas a cáncer, por ejemplo carcinomas, gliomas, mesoteliomas, melanomas, linfomas, leucemias, adenocarcinomas, cáncer de seno, cáncer ovárico, cáncer cervical, gliobastoma, leucemia, linfoma, cáncer de próstata, y linforma de Butkitt, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de colon, cáncer colorectal, cáncer de pulmón de célula no pequeña, cáncer de pulmón de célula pequeña, cáncer del esófago, cáncer del estómago, cáncer pancreático, cáncer hepatobiliar, cáncer de la vesícula biliar, cáncer del intestino delgado, cáncer rectal, cáncer de riñon, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer penil, cáncer de la uretra, cáncer testicular, cáncer cervical, cáncer vaginal, cáncer uterino, cáncer ovárico, cáncer de tiroides, cáncer de paratiroides, cáncer adrenal, cáncer endocrino pancreático, cáncer carcinoide, cáncer ósea, cáncer de la piel, retinoblastomas, linfoma de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin (ver, CÁNCER : PRINCIPLES AND PRACTICE (DeVita, V.T. y colaboradores. Eds. 1997) para cánceres adicionales); así como disfunción del cerebro y neuronal, tal como la enfermedad de Alzheimer y esclerosis múltiples; disfunción del riñon; artritis reumatoide; rechazo del injerto cardiaco, ateroesclerosis; asma; glomerulonefritis; dermatitis por contacto; enfermedad de intestino inflamatorio; colitis; psoriasis; lesión por reperfusiones; como otros desórdenes y enfermedades descritos en la presente. En algunas modalidades, el sujeto no tiene sarcoma de Kaposi, enfermedad de Castleman' s multicéntrica o linforma de efusión primaria asociada con SIDA. Como es proporcionado en la presente, incluyendo en los ejemplos, las células y tejidos normales y enfermos pueden ser distinguidos en base a la reactividad a un anticuerpo monoclonal anti-CCX-CKR2 o SDF-1 y I-TAC. Por ejemplo, las células de cáncer se detectan al detectar en una célula un receptor de quimioquina para el cual SDF-la y I-TAC compiten para el enlace. Además, la diferencia en el enlace de ligando entre los resultados de quimioquina puede ser detectado y tales diferencias pueden ser utilizadas para detectar células que expresan CCX-CKR2. Por ejemplo, ningún otro receptor de quimioquina tiene tanto SDFl como I-TAC como ligandos. El enlace de quimioquina puede ser determinado utilizando muestras de tejido (por ejemplo, biopsias) o puede ser monitoreada directamente en un tejido in situ (por ejemplo, utilizando la formación de imagen con quimioquina radiomarcada) . Los inmunoensayos también pueden ser utilizados para analizar cualitativamente o cuantitativamente CCX-CKR2.

Una revisión general de la tecnología aplicable se puede encontrar en Harlow & Lañe, Antibodies : A Laboratory Manual (1988) . Alternativamente, las moléculas no de anticuerpo con afinidad para CCX-CKR2 también se pueden utilizar para detectar el receptor. Los métodos para producir anticuerpos policlonales o monoclonales que reaccionan específicamente con una proteína de interés son conocidos para aquellos expertos en la técnica (ver, por ejemplo, Coligan, Current Protocols in Immunology (1991) ; Harlow & Lañe, Antibodies, A Laboratory Manual (1988); Goding, Monoclonal Antibodies : Principies and Practice (2d ed. 1986); y Kohler y Milstein Nature, 256:495-497 (1975) ) . Tales técnicas incluyen la preparación de anticuerpos mediante la selección de anticuerpos a partir de librerías de anticuerpos recombinantes en vectores fago o similares. Por ejemplo, con el fin de producir antisuero para el uso en un inmunoensayo, la proteína de interés o un fragmento antigénico de la misma, se aisla como es descrito en la presente. Por ejemplo, una proteína recombinante se produce en una línea de células transformada. Una raza endogámica de ratones, ratas, conejillos de indias o conejos se inmunizan con la proteína utilizando un adyuvante estándar, tal como el adyuvante de Freund y un protocolo de inmunización estándar. Alternativamente, un péptido sintético derivado de las secuencias divulgadas en la presente y conjugado a una proteína portadora se puede utilizar como un inmunógeno. Una opción adicional es utilizar una célula que expresa proteína o una fracción de membrana o liposoma que comprende CCX-CKR2 o un fragmento de la misma como un antígeno. Los anticuerpos resaltados contra la célula, fracción de membrana o liposoma luego pueden ser seleccionadas por su habilidad para enlazar a la proteína. Los sueros policlonales son recolectados y titulados contra el inmunógeno en un inmunoensayo, por ejemplo, un inmunoensayo de fase sólida con el inmunógeno inmovilizado sobre un soporte sólido. Los antisueros policlonales con un título de 104 o más grandes son seleccionados y probados para su reactividad cruzada contra proteínas diferentes y algunas veces homologas, utilizando un inmunoensayo de enlace competitivo. Los anticuerpos monoclonales y policlonales específicos y antisueros usualmente enlazarán con un KD de por lo menos aproximadamente 0.1 mM, más usualmente por lo menos aproximadamente 1 µM, de preferencia por lo menos aproximadamente 0.1 µM o mejor y mucho más de preferencia, 0.01 µM o mejor a CCX-CKR2. Para la preparación de anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos recombinantes, monoclonales o policlonales, se pueden utilizar muchas técnicas conocidas en el arte (ver, por ejemplo, Kohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975); Kozbor y colaboradores, Immunology Today 4:72 (1983); Colé y colaboradores, pp. 77-96 in Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985) ; Coligan, Current Protocols in Immunology (1991) ; Harlow & La e, Antibodies, A Laboratory Manual (1988) ; y Goding, Monoclonal Antibodies : Principies and Practice (2d ed. 1986)). Los- genes que codifican las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo de interés pueden ser clonados a partir de una célula, por ejemplo, los genes que codifican un anticuerpo monoclonal pueden ser clonados de un hibridoma y utilizados para producir un anticuerpo monoclonal recombinante. Las librerías de genes que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpos monoclonales también se pueden hacer a partir del hibridoma o células de plasma. Las combinaciones aleatorias de los productos de gen de cadena pesada y ligera generan una gran acumulación de anticuerpos con diferente especificidad antigénica (ver, por ejemplo, Kuby, Immunology (3rd ed. 1997) ) . Las técnicas para la producción de anticuerpo de cadena individual de anticuerpos recombinantes (patente norteamericana 4,946,778, patente norteamericana No. 4,816,567) se pueden adaptar para producir anticuerpos a los polipéptidos de esta invención. También, los ratones transgénicos, u otros organismos tales como otros mamíferos, pueden ser utilizados para expresar anticuerpos humanizados o humanos (ver, por ejemplo, patentes norteamericanas Nos. ,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; ,661,016; Marks y colaboradores, Bio/Technology 10:779-783 (1992); Lonberg y colaboradores, Nature 368:856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-13 (1994); Fishwild y colaboradores, Nature Biotechnology 14:845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996); y Lonberg & Huszar, Jntern. .Rev. Immunol . 13:65-93 (1995)). Alternativamente, la tecnología de exhibición de fago se puede utilizar para identificar anticuerpos y fragmentos Fab heteroméricos que específicamente enlazan antígenos seleccionados (ver, por ejemplo, McCafferty y colaboradores, Nature 348; 552-554 (1990); Marks y colaboradores, Biotechnology 10:779-783 (1992) ) . Los anticuerpos también se pueden hacer biespecíficos, es decir, capaces de reconocer dos diferentes antígenos (ver, por ejemplo, WO 93/08829, Traunecker y colaboradores, EMBO J. 10:3655-3659 (1991); y Suresh y colaboradores, Methods in Enzymology 121:210 (1986)). Los anticuerpos también pueden ser heteroconjugados, por ejemplo, dos anticuerpos covalentemente unidos, o inmunotoxinas (ver, por ejemplo, la patente norteamericana No. 4, 676,980, WO 91/00360; WO 92/200373; y EP 03089) . Los métodos para humanizar o primatizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en la técnica. Tales anticuerpos son útiles para aplicaciones tanto de detección como terapéuticas. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácido introducidos en éste a partir de una fuente que no es humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos frecuentemente son referidos como residuos de importación, que son típicamente tomados de un dominio variable de importación. La humanización puede ser esencialmente realizadas siguiendo el método de Winter y colaboradores (ver, por ejemplo, Jones y colaboradores, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann y colaboradores, Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen y colaboradores, Science 239:1534-1536 (1988) y Presta, Curr. Op. Struct . Biol . 2:593-596 (1992)), al sustituir secuencias de CDRs o CDR de roedor por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, tales anticuerpos humanizados son anticuerpos quiméricos (patente norteamericana No. 4,816,567), en donde sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto sea sustituido por las secuencia correspondientes de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los cuales algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos de FR son sustituidos por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedor. VI. Métodos de Tratamiento, Administración y Composiciones Farmacéuticas . Los moduladores de CCX-CKR2 (por ejemplo, antagonistas o agonistas) se puede administrar directamente al sujeto mamífero para la modulación de la señalización del receptor de quimioquina in vivo . En algunas modalidades, los moduladores compiten con SDFl y/o I-TAC para el enlace a CCX-CKR2. La modulación de CCX-CKR2 puede incluir, por ejemplo, anticuerpos (incluyendo monoclonales, humanizados u otros tipos de proteínas de enlace que son conocidas en la técnica) moléculas orgánicas pequeñas, siRNAs, etc. En algunas modalidades, los moduladores de CCX-CKR2 se administran a un sujeto que tiene cáncer. En algunos casos, los moduladores de CCX-CKR2 se administran para tratar cáncer, por ejemplo, carcinomas, gliomas, mesoteliomas, melanomas, linfomas, leucemias, adenocarcinomas, cáncer de seno, cáncer ovárico, cáncer cervical, glioblastoma, leucemia, linfoma, cáncer de próstata, linfoma de Burkitt, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de colon, cáncer colorectal, cáncer de pulmón de célula no pequeña, cáncer de pulmón de célula pequeña, cáncer del esófago, cáncer del estómago, cáncer pancreático, cáncer hepatobiliar, cáncer de la vesícula biliar, cáncer del intestino delgado, cáncer rectal, cáncer del riñon, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer penil, cáncer de la uretra, cáncer testicular, cáncer cervical, cáncer vaginal, cáncer uterino, cáncer ovárico, cáncer de tiroides, cáncer de paratiroides, cáncer adrenal, cáncer endocrino pancreático, cáncer carcinoide, cáncer óseo, cáncer de la piel retinoblastomas, linfoma de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin (ver, C NCER: PRINCIPLES AND PRACTICE (DeVita, V.T. y colaboradores, eds. 1997) para cánceres adicionales); así como disfunción del cerebro y neuronal, tal como la enfermedad de Alzheimer y esclerosis múltiple; disfunción del riñon; artritis reumtoide; rechazo del injerto cardiaco; ateroesclerosis; asma; glomerulonefritis; dermatitis de contacto; enfermedad de intestino inflamatorio; colitis, psoriasis; lesión por reperfusión; así como otros desórdenes y enfermedades descritos en la presente. En algunas modalidades, el sujeto no tiene sarcoma de Kaposi, enfermedad de Castleman multicéntrica o linfoma de efusión primaria asociada con el SIDA. Puesto que CCX-CKR2 es frecuentemente expresado en células de cáncer pero no en células no de cáncer, es típicamente deseable administrar antagonista de CCX-CKR2 para trtar sujetos que tienen cáncer. En algunos casos, los moduladores tienen un peso molecular de menos de 1,500 daltons, y en algunos casos de menos de 1,000,800,600,500, o 400 daltons.

La administración de los moduladores puede ser mediante cualquiera de las rutas normalmente utilizadas para introducir un compuesto modulador en contacto final con el tejido que es tratado y es bien conocido para aquellos expertos en la técnica. Aunque más de una ruta puede ser utilizada para administrar una composición particular, una ruta particular frecuentemente puede proporcionar una reacción más inmediata y más efectiva que otra ruta. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender un portador farmacéuticamente aceptable. Los portadores farmacéuticamente aceptables son determinados en parte mediante la composición particular que es administrada, así como el método particular utilizado para administrar la composición. Por consiguiente, hay una amplia variedad de formulaciones adecuadas de composiciones farmacéuticas de la presente invención (ver, por ejemplo, Remington ' s Pharmaceutical Sciences, 17th ed. 1985) ) . Los moduladores (por ejemplo, agonistas o antagonistas) de la expresión o actividad de CCX-CKR2, solos o en combinación con otros componentes adecuados, se pueden hacer en formulaciones en aerosol (es decir, pueden ser "nebulizados") para ser administrados por la vía de inhalación. Las formulaciones en aerosol se pueden colocar en propelentes aceptables presurizados, tales como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno y los similares.

Las formulaciones adecuadas para administración incluyen soluciones acuosas y no acuosas, soluciones estériles isotónicas, que pueden contener antioxidantes, soluciones reguladoras, bacteriostaticos y solutos que transforman la solución isotónica, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizantes, agentes de espesamiento, estabilizantes y conservadores. En la práctica de esta invención, las composiciones se pueden administrar, por ejemplo, oralmente, nasalmente, tópicamente, intravenosamente, intraperitonealmente o intratecalmente. Las formulaciones de compuestos se pueden proporcionar en recipientes sellados de dosis unitaria o dosis múltiples, tales como ampolletas y frasquitos. Las soluciones y suspensiones se pueden preparar a partir de polvos estériles, granulos y tabletas de la clase previamente descrita. Los moduladores también se pueden administrar^ como parte de un alimento preparado o fármaco . En algunas modalidades, los moduladores de CCX-CKR2 de la presente invención se pueden administrar en combinación con otros agentes terapéuticos apropiados, incluyendo, por ejemplo, agentes quimioterapéuticos, radiación, etc. La selección de los agentes apropiados para el uso en la terapia de combinación se puede hacer por uno de habilidad ordinaria en la técnica, de acuerdo con los principios farmacéuticos convencionales. La combinación de agentes terapéuticos puede actuar sinergísticamente para efectuar el tratamiento o la prevención de los diversos desórdenes tales como, por ejemplo, cáncer, disfunción de riñon, disfunción del cerebro o disfunción neuronal. Utilizando este procedimiento, se puede lograr eficacia terapéutica con dosificaciones menores de cada agente, reduciendo de esta manera potencial para efectos secundarios adversos. La dosis administrada a un paciente, en el contexto de la presente invención debe ser suficiente para efectuar una respuesta benéfica en el sujeto a través del tiempo (por ejemplo, para reducir el tamaño del tumor o la carga de tumor) . El nivel de dosis óptimo para cualquier paciente dependerá de una variedad de factores incluyendo la eficacia del modulador específico empleado, edad, el peso del cuerpo, la actividad física y la dieta del paciente, en una combinación posible con otros fármacos, y en la severidad de una enfermedad particular. El tamaño de la dosis también será administrado mediante la existencia, naturaleza y grado de cualquiera de los efectos secundarios adversos que acompañan a la administración de un compuesto o vector particular en un sujeto particular. En la determinación de la cantidad efectiva del modulador que es administrada un médico puede valuar los niveles en el plasma circulantes del modulador, la toxicidad al modulador y la producción de anticuerpos antimodulador. En general, la dosis equivalente de un modulador es de aproximadamente 1 ng/kg a 10 mg/kg para un sujeto típico. Para la administración, los moduladores del receptor de quimioquina de la presente invención se pueden administrar a una proporción determinada por LD-50 del modulador, y los efectos secundarios del modulador en varias concentraciones, como es aplicado a la masa y la salud global del sujeto. La administración se puede realizar por la vía de dosis individuales o divididas. VII. COMPOSICIONES, EQUIPOS, SISTEMAS INTEGRADOS Y APLICACIONES PROTEOMICAS La invención proporciona composiciones, equipos y sistemas integrados para practicar los ensayos descritos en la presente utilizando anticuerpos anti-CCX-CKR2 u otros agentes que específicamente detectan CCX-CKR2. La invención proporciona composiciones de ensayo para el uso en ensayos o fase sólida; tales composiciones pueden incluir, por ejemplo, un polipéptido CCX-CKR2 (incluyendo, por ejemplo, como parte de una célula, fracciones de membrana o liposomas (ver, por ejemplo, Babcok y colaboradores, J. Biol . Chem. 276 (42) : 38433-40 (2001); Mirzabekov y colaboradores, Nat . Biotechnol . 18(6):649-54 (2000) ) inmovilizados sobre un soporte sólido, y un reactivo de marcación. En cada caso, las composiciones de ensayo también pueden incluir reactivos adicionales que son deseables para la hibridación. Por ejemplo, el soporte sólido puede ser, por ejemplo, una placa de petri, placa de múltiples cavidades o microarreglo. Además, los microarreglos de librerías de péptido se pueden utilizar para identificar secuencias de péptido que específicamente enlazan CCX-CKR2. Los agentes que específicamente enlazan a CCX-CKR2 pueden ser incluidos en las composiciones de ensayo. Por ejemplo, un anticuerpo que específicamente enlaza CCX-CKR2 puede ser inmovilizado sobre un soporte sólido. En algunas de estas modalidades, el agente se utiliza para detectar en la presencia o ausencia de CCX-CKR2 o células que expresan CCX-CKR2. Por ejemplo, el soporte sólido puede ser una placa de petri, placa de cavidades múltiples o microarreglo. La invención también proporciona equipos para llevar a cabo los ensayos de la invención. Los equipos típicamente incluyen un agente (por ejemplo, un anticuerpo u otra molécula pequeña) que específicamente enlaza a CCX-CKR2 y una marca para detectar la presencia del agente. Los equipos pueden incluir uno o más polipéptidos del receptor de quimioquina. Los equipos pueden incluir cualquiera de las composiciones mencionadas en lo anterior, y opcionalmente además incluyen componentes adicionales tales como instrucciones para practicar un método de alto rendimiento de análisis para un efecto en la actividad o función de los receptores de quimioquina, uno o más contenedores o compartimientos (por ejemplo, para contener la sonda, marcas, o los similares) un modulador de control de la función o actividad de los receptores de quimioquina, una armadura robótica para mezclar los componentes del equipo o los similares . En algunas modalidades, los equipos comprenden SDFl y/o I-TAC. En algunas modalidades, los equipos comprenden SDF-1 marcado o etiquetado e I-TAC competidor en frío o alternativamente-, un I-TAC marcado o etiquetado y SDF-1 competidor en frío . La quimioquina marcada o etiquetada puede ser marcada o etiquetada y de cualquier manera conocida para aquellos expertos en la técnica. En algunas modalidades, la quimioquina marcada es radiomarcada o etiquetada con biotina o una marca fluorescente. Alternativamente, o además, el equipo puede contener un reactivo de enlace anti-I-TAC (por ejemplo, un anticuerpo) para la detección de I-TAC. Los equipos también pueden contener las soluciones reguladoras de sal apropiadas y otros reactivos para realizar un ensayo de . enlace competitivo, por ejemplo, sobre células intactas o membranas de células. Tales reactivos son descritos en, por ejemplo, los ejemplos enseguida. En algunos aspectos, los equipos también comprenden un soporte sólido o receptáculo para medir el enlace de ligando a CCX-CKR2 (por ejemplo, en un formato de placa para reacciones compatibles con contadores de centelleo o lectores de placa automatizada) . En algunos aspectos, los equipos comprenden instrucciones para la utilización de los equipos, por ejemplo, en los métodos de la invención. La invención también proporciona sistemas integrados para la clasificación de alto rendimiento de moduladores potenciales para un efecto sobre la actividad o función de los moduladores de CCX-CKR2 potenciales. Los sistemas típicamente incluyen una armadura robótica que transfieren fluidos de una fuente a un destino, un controlador que controla la armadura robótica, un detector de marca como una unidad de almacenamiento de datos que registran la detección de marca, y un componente de ensayo tal como un plato microtítulo que comprende una cavidad que tiene una mezcla de reacción a un sustrato que comprende un ácido nucleico fijado o porción de inmovilización. Las imágenes ópticas visualizadas (y opcionalmente, grabadas) por una cámara u otro dispositivo de grabación (por ejemplo, un fotodiodo y dispositivo de almacenamiento de datos) son de manera opcional además procesada en cualquiera de las modalidades en la presente, por ejemplo, al digitalizar la imagen y al almacenar y al analizar en la imagen sobre una computadora. Una variedad de equipo periférico comercialmente disponible y software está disponible para digitalizar, almacenar y analizar un video digitalizado o imagen óptica digitalizada. EJEMPLOS Ej emplo 1 : Este ejemplo muestra que SDF-1 e I-TAC compiten para el enlace a un nuevo receptor de quimioquina. Materiales y Métodos Reactivos y Células . Quimioquinas recombinantes humanas, virales y de murino se obtuvieron de R&D Systems (Minneapolis, MN) y PeproTech (Rocky Hill, NJ) donde es indicado. SDF-la marcado con 125I se adquirió de PerkinElmer Life Sciences, Inc. (Boston, MA) e I-TAC marcado con 125I se obtuvo de Amersham Pharmacia Biotech (Buckinghamshire, UK) . Los anticuerpos monoclonales utilizados en la citometría de flujo y la competición de enlace de ligando fueron de R&D Systems (Minneapolis, MN) : clones anti-CXCR4 12G5, 44708.111 (171), 44716.111 (172), 44717.111 (173), nmIgG2a y nmIgG2b.

El anticuerpo secundario, conjugado de PE IgG antiratón de cabra (Coulter Immunotech, Miami, FL) , se utilizó para detectar el enlace de anticuerpo mediante la citometría de flujo. Las siguientes células se obtuvieron del American Type Culture Collection (Manassas, VA) :MCF-7 (adenocarcinoma; glándula mamaria) ; MDA MB-231 (adenocarcinoma; glándula mamaria) , MDA MB-435s (carcinoma ductal; glándula mamaria) , DU 4475 (glándula mamaria), ZR 75-1 (carcinoma ductal;' glándula mamaria) , HEK 293 (riñon embriónico humano) , HUV-EC-C (vena umbilical humana; endotelio vascular; normal) . Las células CEM-NKr (leucemia linfoblástica aguda, sangre periférica; linfoblasto T) se obtuvieron del NIH AIDS Research and Reference Reagent Program. Las líneas de células se cultivaron en DMEM (Mediatech, Rendón, VA) suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) (HyClone Logan, UT) a 37 °C en una incubadora humidificada en una mezcla de C02 al 5%/aire. Las células mononucleares de sangre periférica humanas (PBMC). se obtuvieron de linfas cuajadas de donadores sanos (Stanford Blood Center, Palo Alto, CA) mediante la centrifugación en gradientes de densidad de Ficoll-Hypaque. Las PBMC aisladas se activaron con 2.5 ug/ml de fitohemaglutinina (PHA) (Sigma Chemical Company, St . Louis, MO) y 10 ng/ml de IL-2 humana recombinante (R&D Systems, Minneapolis, MN) por 3 días en RPMI-1640 (Mediatech, Rendón, VA) suplementado con FBS al 10% a 37 °C en una incubadora humidificada en una mezcla de C02 al 5%/aire. Después de la activación, las células se lavaron y se cultivaron RPMI suplementado con FBS al 10% y 10 ng/ml de IL-2 que se renovó cada 3-4 días hasta el día en que se utilizaron las células. Análisis de enlace . Los inventores emplearon su técnica, "DisplaceMax™" para examinar el perfil global de la interacción de ligando de quimioquina con el receptor de SDFl en células MCF-7 y CEM-NKr. Esta tecnología emplea el enlace de radioligando de eficiencia maximizada, expandido utilizando protocolos de filtración como es descrito previamente (Dairaghi y colaboradores, J. Biol . Chem 273:21569-74 (1999); Gosling, J. y colaboradores J. Immunol 164:2851-6 2000). En estos ensayos, DisplaceMax™ empleó la interrogación simultánea de células MCF-7 o CEM-NKr, como es indicado, por >110 quimioquinas purificadas distintas en la habilidad para desplazar SDF-la o I-TAC, radiomarcado con 125I, como es indicado, utilizando el protocolo descrito (Dairahi, y colaboradores, J Biol . Chem 274:21569-74 (1999); Gosling, J. y colaboradores J Immunol 164:2851-6 (2000)).

Brevemente, los elementos de quimioquina se incubaron con células seguido por la adición de quimioqina radiomarcada (125I SDF-la o 125I h I-TAC) durante 3 h a 4°C en el siguiente medio de enlace (HEPES 25 mM, NaCl 140 mM, CaCl2 1 mM, MgCl2 5 mM y albúmina de suero bovino al 0.2%, ajustado a pH 7.1). Moléculas pequeñas incluyeron en algunos ensayos, donde es indicado. En estos ensayos el compuesto se adicionó a la placa a la concentración indicada seguido por la adición de quimioquina radiomarcada. Todos los ensayos luego se incubaron durante 3 h a 4°C con leve agitación. Después de la incubación en todos los ensayos de enlace, las reacciones se aspiraron sobre filtros de vidrio GF/B tratado con PEÍ (Packard) utilizando un recolector de células (Packard) y se lavaron dos veces (HEPES 25 mM, NaCl 50 mM, CaCl2 1 mM, MgCA 5 mM, ajustado a pH 7.1). El agente centelleante (MicroScint 10, Packard) se adicionó a las cavidades, y los filtros se contaron en un contador de centelleo Packard Topcount. Los datos se analizaron y se graficaron utilizando Prism (GraphPad Prism versión 3.0a para Macintosh, GraphPad Software) . Determinación del Enlace de Receptor 125I SDF-la. Utilizando el ensayo basado en filtración descrito en lo anterior, las células se preincubaron con ya sea 1) solución reguladora sola, 2) SDF-lß en exceso (90 nM final) o 3) MIG (175 nM final) como es indicado por 30 min a 4°C. Después de esta incubación, el competidor de quimioquina en frío indicado en concentraciones establecidas y 125Ih I-TAC se adicionaron a reacciones de enlace. Todos los ensayos luego se incubaron, se recolectaron y se analizaron como es descrito en lo anterior. RT PCR. mRNA se aisló de células utilizando técnicas estándares. El DNA complementario se analizó para la expresión de CXCR3 y CXCR4 mediante PCR. Los cebadores específicos se obtuvieron de Integrated DNA technologies (Coraville, IA) . Los productos de PCR específicos se midieron por medio de ún Hybaid Omn-E (E&K Scientific Products, Inc., Saratoga, CA) durante 35 ciclos. GAPDH se midió como un control . Ensayo de Adhesión . Células HUVEC se cultivaron durante la noche en platinas tratadas con cultivo de tejido en la presencia de TNFa (25 ng/ml) y IFN? (50 ng/ml) . Al siguiente día las células NSO transfectadas con CCX-CKR2 así como los controles de tipo silvestre se marcaron con calceína-AM. Las células marcadas con calceína luego se colocaron en placas sobre la monocapa endotelial en la presencia o ausencia del antagonista CCX-CKR2 (CCS3451) . Las platinas se incubaron a 37 °C durante 40 minutos seguido por el lavado con PBS para remover células no adherentes. Las células NSO adherentes se visualizaron mediante la microscopía fluorescente. Las células tratadas con el compuesto o vehículo se contaron a simple vista a partir de tres campos de visión (fov) y se graficaron. Resultados Reportes recientes han identificado la expresión de CXCR4 en varios tipos de células de tumor (Sehgal, y colaboradores, J Surg Oncol 69:99-104 (1998); Sehgal, A., y colaboradores, J. Surg Oncol 69:239-48 (1998); Burger y colaboradores Blood 94:3658-67 (1999), Rempel y colaboradores, Clin Cáncer Res 6:102-11 (2000); Koshiba, T. y colaboradores, Clin Cáncer Res 6:3530-5 (2000); Muller, A. y colaboradores Nature 410:50-6 (2001); Robledo y colaboradores, J Biol . Chem 276:45098-45105 (2001)) y en un enlace de ejemplo de esta expresión con la metástasis de célula de tumor de seno (Muller, A. y colaboradores, Nature 410:50-6 (2001). Para investigar adicionalmente la función de los receptores de quimioquina sobre células de tumor los inventores llevaron a cabo la evaluación de la expresión de CSCR4 en varias líneas de células de tumor de seno humano. Inicialmente el patrón de expresión de CXCR4 se evaluó . mediante citometría de flujo. Los linfocitos T cultivados con IL-2 primarios y dos líneas de células T, CEM-NKr y Jurkat, se examinaron para determinar el fenotipo de la célula T del manchado anti-CXCR4. Tres líneas de células de tumor de seno, MCF-7, MDA MB-231 y MDA MB-435s, también se probaron. Todos 0 los cuatro clones anti-CXCR4 probados mancharon las células T. De manera sorprendente, mientras que las células de tumor de seno se reportan que expresan CXCR4, el clon 12G5 ampliamente utilizado no detectó ningún CXCR4 sobre las células de tumor de seno. La reactividad débil y variable s.e 5 detectó con los otros tres clones probados sobre las células de tumor de seno. Las líneas de célula de tumor de seño DU 4475 y ZR 75-1 también se probaron en este ensayo (datos no mostrados) y se encontraron que tienen perfiles de manchado de anticuerpo similares a las otras células de tumor de seno 0 probadas. Así, los patrones de manchado de panel mAb para CSCR4 se considera que sugiere dos tipos distintos de reactividad: un fenotipo CXCR4 de "leucocito" (ejemplificado por CEM-NKr, Jurkat y manchado de linfocito IL-2) y un fenotipo de célula de tumor de seno (ejemplificado por el 5 manchado débil sobre la línea de células de tumor de seno MCF-7 y MDA MB-231) . La falta consistente de reactividad utilizando el clon 12G5 anti CXCR4 mAb ampliamente empleado, sobre células de tumor de seno condujo a los inventores a examinar la expresión de CXCR4 en estas células mediante RT PCR. El mRNA se aisló de las tres líneas de tumor de seno probadas en citometría de flujo así como los linfocitos cultivados con IL-2 y las líneas de células T, CEM-NKr y Jurkat, como controles positivos para la expresión CXCR4. A pesar de la falta de reactividad con 12G5 y la reactividad variable con los otros clones anti-CXCR4 probados, las líneas de células de tumor de seno, MCF-7 y MDA MB-231, expresaron el mensaje de CXCR4; sin embargo, MDA MB-435s se encontró que es negativo para la expresión CXCR4. Todos los casos GAPDH se midió como un control. Para examinar si las diferencias en la reactividad de mAb puede ser debido a las diferencias de secuencia dando por resultado de esta manera variaciones de epítope en CXCR4 sobre varias líneas de células, los inventores luego secuenciaron los productos de PCR generados de MCF-7, como una célula de tumor de seno CXCR4+ representativa y CEM-NKr, como una célula T representativa. Las secuencias de estas dos líneas de células son idénticas a las secuencia CXCR4 publicadas sugiriendo que a pesar de los diferentes perfiles de anticuerpo CXCR4, la genética y de esta manera la estructura de polipéptido de CXCR4 en ambos tipos de células fue idéntica. Los inventores han reportado previamente un conjunto de técnicas mediante el cual el enlace de receptor a un arreglo comprensivo de ligandos de quimioquina puede ser simultáneamente estimado (Dairaghi y colaboradores J. Biol . Chem 274:21569-74 (1999); Gosling J y colaboradores J Immunol 164:2851-6 (2000)). De esta manera los inventores sondearon el perfil de enlace CXCR4 en CEM-NKr como es comparado con las células MCF-7. Mayor que 90 elementos de quimioquina se probaron para la habilidad para desplazar la quimioquina de señal, 125I SDF-la, para el enlace CEM-NKr (Figura 1) o células MCF-7 (Figura 1) . Como es esperado, los competidores de alta afinidad potenciales de 125I SDF-la en CEM-NKr incluyen hSDF-lß y mSDF-1, mientras que hSDF-la y HHV8 vMIP-II exhiben competición de afinidad moderada potencial. Esto es consistente con todos los resultados previamente reportados de SDF-1 como el único ligando no viral de CXCR4. Sin embargo, el patrón total de competición en las células MCF-7 fue marcadamente diferentes. En este tipo de célula l-TAC y ml-TAC demostraron competición de alta afinidad para el mismo ligando de señal SDF-1. Para investigar adicionalmente resultado inusual 125I I-TAC se probó como el ligando de señal en las células MCF-7 (Figura 1) . El perfil de desplazamiento de alta afinidad utilizando 125I I-TAC sobre MCF-7 fue idéntico al perfil obtenido utilizando 125í SDF-la. Así, en las células MCF-7 I-TAC y SDF-1 se comportan indistinguiblemente en el enlace y compiten por el mismo sitio receptor. Para caracterizar adicionalmente el enlace de I-TAC y SDF-1, se obtuvieron curvas de dosis respuesta en experimentos de enlace de competición con ligandos de alta afinidad potenciales seleccionados sobre CEM-NKr y MCF-7. Como es sugerido por los datos de DisplaceMax™, I-TAC compite con 125I y SDF-la para en enlace a MCF-7, pero no CEM-NKr (Figura 2) . La competición homologa de 125ISDF-la con ya sea la isoforma SDF-1, SDF-la o SDF-lß, dio por resultado la competición completa sobre CEM-NKr y MCF-7 (Figura 2) . Notablemente, la afinidad de SDF-1 para el receptor expresado en MCF-7 es más alta que aquella en CEM-NKr. Así, mientras que la secuencia de CXCR4 es idéntica en ambos tipos de células la especificidad de enlace de ligando en la afinidad difieren en las células T contra las células de tumor de seno. Los investigadores enseguida investigaron si el enlace de I-TAC detectado en células MCF-7 podría ser mediado por CXCR3 puesto que CXCR3 se ha establecido por largo tiempo como el receptor principal para I-TAC (Colé, K.E. y colaboradores, J Exp Med 187:2009-21. (1998)). Con este fin, el enlace de 125I I-TAC se examinó bajo condiciones que exhibirían el enlace mediado por CXCR3 Ylásico' (es decir el enlace de los ligandos de CXCR3 reportados MIG, I-TAC e IP-10 a CXCR3) permitiendo de esta manera el enlace mediado por CXCR4 Ylásico' (es decir, el enlace del ligando CXCR4 reportado SDF-1 a CXCR4) así como la situación inversa. Las células MCF-7 se preincubaron con ya sea el medio solo, medio que contiene MIG (~175 nM; para inhibir el enlace mediado por CXCR3) o medio que contiene SDF-lß en exceso (~90 nM; para inhibir el enlace mediado por CXCR4. I-TAC compitió con 1?5I I-TAC para el enlace a las células MCF-7 o un IC50 de InM (Figura 3) confirmando que es un ligando de alta afinidad para este receptor sobre estas células. De manera similar, las células primero preincubadas con MIG en exceso luego fueron capaces de dar la misma curva de enlace de I-TAC 125I I-TAC homologa nuevamente con una IC50 de 1 nM (Figura 3) . Sin embargo, cuando las células primero se pretrataron con SDF-lß en exceso fue el enlace de 125I I-TAC fue inhibido (Figura 3) sugiriendo que el enlace 125I I-TAC observado sobre las células de tumor de seno es mediado por el receptor SDFl expresado sobre estas células. De manera similar, el enlace de 125I-TAC a las células MCF-7 no fue inhibido cuando IP-10 se probó como el competidor de quimioquina en frío. Nuevamente la preincubación con MIG en exceso no efectuó este perfil de enlace; sin embargo la preincubación de la células con SDF-lß completamente inhibió el enlace de lz5I I-TAC. Cuando el ligando de CXCR3 MIG se probó como el enlace de 125I I-TAC de competidor en frío a la célula no fue inhibido (Figura 3) . Como es esperado de los datos de DisplaceMax™ representados en la Figura 1, SDF-lß compitió con 1 5I I-TAC para el enlace de estas células con alta afinidad (IC50 de 1 nM) . La preincubación de células con MIG en exceso no efectuó la competición de SDF-lß/125I I-TAC, sugiriendo nuevamente el enlace detectado que no es mediado por CXCR3. Esta hipótesis se examinó adicionalmente mediante PCR. mRNA aislado utilizado previamente (descrito en lo anterior) se utilizó para sondear la evidencia de transcriptos de CXCR3. Mientras que, los linfocitos cultivados con IL-2 expresaron CXCR3; ninguna otra célula probada expresó CXCR3. La falta de expresión de CXCR3 detectada mediante RT PCR sustenta los datos de la Figura 3, nuevamente sugiriendo que el enlace de I-TAC sobre células MCF-7 no es mediado por CXCR3. La reactividad de anticuerpo anti-CXCR4 alterada así como la especificidad de afinidad de enlace de ligando alteradas condujo a los inventores a considerar que este receptor no fue CXCR4 clásico. Existen unos cuantos receptores de quimioquina ^huérfano' que han sido identificados, pero para los cuales el ligando de quimioquina no ha sido identificado. Los inventores consideraron varios receptores huérfanos. Un receptor de tal clase es llamado RDC1 (referido en la presente como CCX-CKR2) . Cuando la secuencia de proteína para RDC1 es transfectada en MDA MB 435s (una línea de células que no expresan endógenamente CSCR4, CXCR3 o CCX-CKR2) el fenotipo de enlace de radioligando marcado es recapitulado (Figura 4) . CCX-CKR2 expresado en MDA MB 435s enlaza a SDF-1 radiomarcado. Este enlace es competido por los competidores en frío SDF-1 e I-TAC. En el esfuerzo para dirigir este receptor con la terapéutica de compuesto orgánico de peso molecular pequeño (SMC) , los inventores clasificaron moléculas pequeñas (casi 135,000) utilizando dos clasificaciones de alto rendimiento: uno diseñado para estimar el fenotipo de enlace de SDF-1 de leucocito mediato por CXCR4 y uno para sondear el fenotipo de enlace de SDF-1 de cáncer de seno mediado por CCX-CKR2. Los resultados de esas clasificaciones indicaron que la discriminación farmacológica clara de los dos fenotipos de enlace fue posible (Figura 5) . Por ejemplo, la molécula pequeña designada CCX0803 compite con 125I SDF-la para el enlace MCF-7 con una IC50 de 46 nM (Figura 5) , sin embargo, esta molécula pequeña no inhibe el enlace de 125I SDF-la en CEM-NKr en todo (Figura 5) . En contraste, un antagonista de molécula pequeña" diferente, CCS7923, inhibe el enlace de 1"5I SDF-la a CEM-NKr una IC50 de 106 nM (Figura 5) , pero no inhibe el enlace de 125I SDF-la sobre las células MCF-7 (Figura 5) . Estos dos compuestos revelan el patrón marcado y no ambiguo de la inhibición de enlace no recíproca de ligando a los dos receptores (líneas de tumor de seno contra leucocitos) . Después de determinar inicialmente que las células de cáncer de seno exhiben una afinidad de enlace para SDF-1 que es distinto de aquel observado sobre otro tejido no de tumor o no canceroso se realizaron estudios adicionales. Estos estudios de fenotipo (utilizando la reactividad de anticuerpo, el perfil de enlace ' de ligando y la discriminación farmacológica, ver métodos detallados en la presente) , han mostrado claramente que muchos tipos de células de cáncer (o tumor) también exhiben la afinidad de enlace (por ejemplo, reactividad anticuerpo, enlace de ligando y discriminación farmacológica) inicialmente correlacionadas con células de tumor de seno y de esta manera la expresión de CCX-CKR2. La siguientes células de tumor se examinaron y exhibieron la afinidad de enlace correlacionada con el cáncer: carcinoma ovárico humano, adenocarcinoma cervical humano, linfoma de Burkitt humano, adenocarcinoma mamario humano, carcinoma ductal mamario humano, glioblastoma humano y tumor mamario de ratón. Los tumores y otros cánceres son difíciles de tratar en parte debido a su velocidad rápida de crecimiento de célula. En este aspecto, los tumores se conocen que comparten algo de características de crecimiento con tejidos embriónicos tempranos rápidamente divisorios. Una escuela de enseñanza sugiere que los tumores en el adulto pueden representar Aevertidores' a un fenotipo de crecimiento embriónico. Ambos de los ratones inactivados genéticos SDF-1 y CXCR4 son embriónicos letales, sugiriendo que este par de receptor de ligando es un componente crítico del crecimiento del desarrollo. Aproximadamente 50% de embriones SDF-1 mutantes homocigotos murieron perinatalmente por 18.5; las carnadas homocigotas restantes murieron dentro de 1 h de nacimiento (Kishimoto, y colaboradores, Nature 382:635-638 (1996) ) . De manera similar, ~l/3 de los ratones inactivados CXCR4 homocigotos murieron perinatalmente en E18.5 (Ma, y colaboradores, proc . Nati . Acad. Sci . USA 95:9448-9453 (1998) . En ambos de los defectos de inactivación de receptor y de ligando se observaron defectos de linfopoyesis y mielopoyesis'. El hígado fetal es el mayor sitio de hematopoyesis en el ratón en el día 11 y continua como tal hasta la primera semana post-natal. Con este fin los inventores decidieron examinar la expresión de CCX-CKR2 en este compartimiento. Los inventores examinaron la expresión CCX-CKR2 en embriones de ratón de tipo silvestre E17 (un punto en desarrollo cercano al tiempo en que mueren los animales inactivados) E13 (un punto en el desarrollo distinto del tiempo en que los animales inactivados murieron, todavía después de que comienza la hematopoyesis) .

En ensayos de enlace de SDF-1, SDF-1 humano radiomarcado enlaza las células del hígado fetales E13 y ambos SDF e I-TAC (proteínas de ratón y humana) son capaces de competir con el trazador radiomarcado para el enlace. Esta especificidad de ligando alterada como es ejemplificada por enlace de I-TAC al receptor SDF-1 es una marca de contraste del fenotipo de enlace que los inventores primero correlacionaron con las células de cáncer y ahora han demostrado que CCX-CKR2. Además, los antagonistas de CCX-CKR2 son capaces de competir con el enlace SDF-1 en el hígado fetal E13; sin embargo los antagonistas de CXCR4 no compiten. Después en el desarrollo, las células de hígado fetal en E17 expresan CXCR4 y estas células responden a SDF-1 al movilizar el calcio intracelular. Los antagonistas de CXCR4 inhiben esta movilización de calcio mediada por SDF-1 sin embargo, los antagonistas CCX-CKR2 no tiene efecto. Así, estos datos sugieren que las células de hígado fetal de tipo silvestre en E13 y E17 ambas expresan CXCR4, sin embargo, CCX-CKR2 es expresado temprano (Eli) pero no en puntos del tiempo posteriores (E15) . Aunque los estudios de enlace en los modelos de ratones embriónicos se correlacionan bien con datos de estudios humanos, los experimentos preliminares utilizando ratones que tienen una interrupción dirigida del gen CKR4 sugieren que los perfiles de enlace de SDF-1 e I-TAC observados en el día embriónico 13 (E13) de la células de hígado fetal están sin cambio. Esto proporciona evidencia adicional de que el gen que codifica el polipéptido con la afinidad de enlace de SDF-1 relacionado con cáncer no es CXCR4. Los experimentos también demuestran que el receptor de CCX-CKR2 puede proporcionar una señal estimulatoria para el crecimiento de células de tumor. Las células de tumor pueden regular hacia arriba ciertos genes involucrados en el ciclo celular o la transcripción en respuesta a estimulación de SDF-1. Más importantemente, si las células de tumor son apartadas del suero en el cultivo durante la noche y ellas comienzan a ir a través de la apoptosis (muerte celular) . Cuando SDF-1 se adiciona para suplementar estos cultivos las células son capaces de recuperarse de la inanición, como es comparado con los controles no tratados. Así SDF-1 por lo tanto sirve como una señal antiapoptótica. Las células de cáncer frecuentemente se caracterizan como células que han perdido la habilidad para someterse a la apoptosis. 20. Ejemplo 2: Este ejemplo demuestra que el fenotipo de enlace relacionado con el cáncer discutido en el Ejemplo 1 es mediado por CCX-CKR2 (previamente conocido como el receptor huérfano RDC1) . 25 En general CCS-CKR2 es preferencialmente expresado en células transformadas. Como es mostrado en la Tabla 1 (columna izquierda) , una variedad de diferentes células de cáncer se probaron positivas para la expresión de CCX-CKR2.

En contraste, células más normales (no de tumor) no expresaron CCX-CKR2. Ver, la Tabla 1 (columna derecha). Tabla 1 CCX-CKR2 positivo CCX-CKR2 negativo Carcinoma Mamario Humano (MCF- PBMC humano normal 7, MDA MB 361) Glioblastoma humano (T98G) Leucemia de célula T humano (M0LT4, Jurkat, CEM-NKr) Carcinoma de Próstata humano Células endoteliales no (LN Cap) estimuladas Linfoma de célula B humano Timo de ratón (Raji, IM9) Carcinoma Ovárico humano Pulmón de ratón (HeLa) Carcinoma de Pulmón humano Bazo de ratón (A549) Carcinoma Mamario de ratón Corazón de ratón (4T1) Células Epiteliales PBL de ratón Pancreáticas de rtón, SV40 transformado (SVR) Linforma de célula B de ratón Hígado de ratón (BCL1) Riñon normal de ratón* Médula ósea adulta total de ratón Ratón normal Médula ósea adulta negativa de Cerebro* linaje de ratón Hígado fetal de ratón (Eli Hígado fetal de ratón (E15 hasta E13) hasta el nacimiento) Células endoteliales activadas * la expresión en estos órganos es débil como es determinado por la señal de enlace de radioligando No obstante, se presenta que es una función para CCX-CKR2 en algunas células normales. El receptor CCX-CKR2 se expresa por un período de tiempo en el desarrollo fetal. CCX-CKR2 después en el hígado fetal de ratón por el 11° día de embriogénesis (Eli) , pero por E15 no es detectado por más tiempo (como es determinado por el enlace de SDFl radiomarcado y el desplazamiento de I-TAC) así como los transcriptos de CCX-CKR2 detectados por el análisis de Northern. En el ratón adulto este se expresa en riñon normal. Por comparación en la expresión de riñon, hay una expresión menor en el cerebro normal. Debido a que el examen se hace un homogenado de cerebro completo esta baja señal en el ensayo de enlace de radioligando es consistente con una población pequeña de' células en el cerebro que expresa CCX-CKR2. Para reforzar adicionalmente la evidencia de que la función de CCX-CKR2 en el cáncer, los inventores demostraron que el crecimiento de la célula de cáncer puede ser inhibida al antagonizar CCX-CKR2 en las células de cáncer. El antagonismo de CCX-CKR2 expresado en un carcinoma mamario mediante un antagonista de CCX-CKR2 inhibió la proliferación celular in vitro. Las células tratadas in vitro exhibieron crecimiento celular reducido a través del tiempo como es comparado con los controles no tratados. Ver, la Figura 6. CCX-CKR2 también está involucrado en la adhesión. La migración de leucocitos involucra varias etapas que incluyen la adición de células y la inmigración subsecuente a un tejido dado. La adhesión estática in vitro analiza el modelo de este evento. Las monocapas de células endoteliales basculadas son cultivadas sobre una superficie. Las células que expresan CCX-CKR2 luego son marcadas con un tinte fluorescente para la visualización. Cuando las células de CCX-CKR2 se dejan adherir a la superficie endotelial mucho más células que expresan CCX-CKR2 se unen a la capa endotelial que lo hacen las células de control de CCX-CKR2. Además, la adición de un antagonista de CCX-CKR2 inhibe la adhesión como es comparado con un control tratado con vehículo. Ver, la Figura 7. La evidencia in vivo además sustenta una función para CCX-CKR2 en el crecimiento del tumor. Los tumores se forman cuando las células de linfoma de célula B humana, que expresan CCX-CKR2, son inyectadas en ratones inmunodeficientes . El tratamiento de estos ratones con antagonista de CCX-CKR2 inhibió la formación de tumor vascularizado. En un estudio de tal clase, uno de 17 ratones tratados con un antagonista de CCX-CKR2 desarrolló un tumor vascularizado, encapsulado mientras que 11 de 17 ratones en el grupo tratado con vehículo desarrollaron tumores vascularizados encapsulados. Estos datos sugieren que CCX-CKR2 puede estar involucrado en la habilidad de un tumor para diferenciar y establecer un lecho vascular y proporciona evidencia de que el antagonismo de CCX-CKR2 es una terapia de cáncer útil. El efecto del antagonismo de CCX-CKR2 también se probó en un modelo de cáncer de seno . En un modelo de crecimiento de tumor de seno, los ratones inmunodeficientes se inyectaron con un carcinoma mamario humano. Las mediciones de tumor se hicieron 3 veces a la semana y los volúmenes se graficaron. Los ratones que se trataron con un antagonista de CCX-CKR2 exhibieron volumen de tumor reducido como es comparado con el grupo de control de vehículo, que demuestra que CCX-CKR2 tiene una función en el crecimiento del tumor. Ver, la Figura 8. Ejemplo 3 Este ejemplo demuestra que CCX-CKR2 promueve la supervivencia celular al reducir la apoptosis.

Las interacciones entre quimioquinas y receptores de quimioquinas son típicamente estimadas al medir la movilización de calcio intracelular y la quimiotaxis. Sin embargo, CCX-CKR2 no produjo una movilización de calcio transiente o causa que las células migren en respuesta a sus ligandos CXCL12 o CXCL11. Las células que expresan CCX-CKR2 sin embargo exhiben adición incrementada a las monocapas de célula endoteliales activadas. Además, bajo condiciones de baja suplementación de sueros de medios de cultivo (es decir, 1% en lugar del 10% regular) , la recuperación de células adherentes vivas después de tres días fue mucho más grande para los transfectantes CCX-CKR2-MDA MB 435s (designado CCX-CKR2 435s) contra las células WT no transfectadas (WT 435s) . Consistente con esta observación, la frecuencia de células muertas recuperadas en el sobrenadante recolectada de estos cultivos fue mucho más grande 'para WT contra los transfectantes CCX-CKR2. Este efecto podría ser visualizado fluorescentemente utilizando el tinte de intercalación de DNA 7AAD (7 aminoactinomicina D) . Los transfectantes CCX-CKR2-435s o. células 435s de tipo silvestre se cultivaron en diferentes concentraciones de suero, luego se recolectaron y se incubaron con 7AAD (1 ug/ml en DMSO-) durante 15-30 minutos a temperatura ambiente. El análisis FACS reveló mucho más células muertas/apoptóticas (es decir, 77?AD-positivo) en células 435s de tipo silvestre contra los transfectantes CCX-CKR2-435s. Los inventores ahora han extendido estos descubrimientos en una serie de experimentos donde transfectantes de CCX-CKR2 cultivados o células WT no transíectadas se co-mancharon con Annexin y detecta solamente células apoptóticas y yoduro de propidio (Pl) que detecta células muertas pero no células apoptóticas. Este procedimiento fácilmente identifica la proporción de células apoptóticas en una población de células, como es demostrado utilizando agentes conocidos para inducir la apoptosis celular, por ejemplo, camptotecina (CMP), o TNFalfa cicloheximida (CHX) y que proporcionan excelentes controles en estos ensayos. Utilizando este ensayo, los inventores midieron el desarrollo de células apoptóticas a través del tiempo de transfectantes CCX-CKR2-435s o células 435s de tipo silvestre cultivadas ya sea en suero óptimo (10%) o limitativos (1%) . Ambos tipos de células cultivadas en el suero al 10% mostraron excelente viabilidad sobre un periodo de cultivo de 4 días. En contraste, las células WT cultivadas en el suero al 1% mostraron una reducción dramática en las células viables después de 3 y 4 días de cultivo. El co-manchado con Annexin y Pl reveló este desarrollo reflejado de células tanto apoptóticas como muertas. De manera interesante, las células CCX-CKR2-435s cultivadas en el suero al 1% mostraron excelente viabilidad sobre el mismo período de cultivo de 4 días, sugiriendo que la introducción de CCX-CKR2 en estas células protegidas 435s de la apoptósis celular rápida que ocurre bajo condiciones de suplemenntación de suero sub-óptima . Resultados idénticos se obtuvieron en un segundo experimento utilizando el mismo transfectante CCX-CKR2-435s, o además de una población no clonal separada de células 435s transfectadas con CCX-CKR2. Estos últimos resultados indicaron que la propiedad escasa de apoptosis del transfectante clonal inicial resultó de la expresión CCX-CKR2 antes de que una aberración particular de un clon transfectante. Ej emplo 4 Este ejemplo demuestra la fosforilación mediada por CCX-CKR2 de p44/42 MAPK (ERK1 y ERK2) . CCX-CR2 es un receptor inusual de enlace de ligando (por ejemplo, mediante ITAC o SDFl) no da por resultado la movilización de calcio que es típica de muchos receptores de quimioquina. Esto apresuró una evaluación de otras rutas de señalización potenciales, incluyendo una investigación en si la actividad de CCX-CR2 fue mediada a través de la fosforilación de ERK. Experimentos conducidos con lisados de una línea de células MCF7 que expresa CCX-CR2 que fue estimulada con ya sea ITAC o SDFl demostró que hay una fosforilación dependiente del ligando de ERK1 y ERK2 (algunas veces también referida en la literatura como p44/42 MAPK) . ERK1 y ERK2 fosforilados se detectaron mediante el análisis de manchado de Western, con lisados de las líneas de células MCF7 inicialmente sometida a electroforesis para separar proteínas en el lisado. ERK1 fosforilado y ER2 en el gel electroforético se detectaron al sondear con anticuerpos específicos para la forma fosforilada de estas proteínas. Estos anticuerpos son disponibles de Cell Signaling Technologies of Beverly, MA. Experimentos similares se condujeron con células Hela que expresan CCX-CR2. Los mismos resultados se obtuvieron cuando estas células se estimularon con ya sea ITAC o SDFl. Puesto que ITAC y SDFl enlazan a otros receptores de quimioquina, por ejemplo, CXCR3 en el caso de ITAC, y CXCR4 en el caso de SDFl, fue importante considerar la contribución potencial de estos receptores a la fosforilación de ERK inducida por estos ligandos en células MCF7. En análisis fACS de células MCF7 utilizando anticuerpos específicos para CSCR3 o CXCR4 reveló una ausencia completa de estos receptores en las células MCF7. Los controles positivos utilizando líneas de células que expresan CXCR3 o CXCR4 validó que los anticuerpos utilizados en estos experimentos podrían enlazar estos receptores. Estos datos de esta manera indican que los ligandos de enlace tales como ITAC o SDFl a CCX-CR2 causan la señalización intracelular por la vía de una fosforilación de ERK, que probablemente da por resultado la activación de componentes corriente abajo adicionales. El descubrimiento de que CCX-CR2 media la fosforilación de ERK1 y ERK2 indica que CCX-CR2 está asociado con una variedad de procesos biológicos debido a que la fosforilación de ERK se ha demostrado que media la regulación del crecimiento celular y la diferenciación celular. Ej emplo 5 Este ejemplo demuestra que la expresión celular de CCX-CKR2 causa la inducción de numerosas proteínas regulatorias . Como un procedimiento alternativo para investigar los eventos de señalización mediados por CCX-CKR2, los sobrenadantes recolectados de las células MDA MB 435s transfectadas con CCX-CKR2 se compararon con los sobrenadantes recolectados de la célula MDA MB 435s (435s) de tipo silvestre, evaluado mediante ensayos de ELISA específicos para la presencia de una familia grande de proteínas secretadas. Las células 435s que expresan CCX-CKR2 produjeron cantidades sustancialmente más grandes de GM-CSF, RANTES, MCP-1, TIMP-1 y MMP3 que las células 435s de tipo silvestre, especialmente cuando se cultivan bajo condiciones de suero limitativas. De manera interesante, todos estos factores han reportado que están involucrados en el crecimiento, remodelación vascular y la quimiotaxis relacionada con la tumorigénesis . Ellos también pueden estar involucrados en el fenotipo escaso de apoptosis de CCX-CKR2 descrito en lo anterior. Ejemplo 6 Este ejemplo demuestra la inhibición basada en siRNA de CCX-CKR2. Los inventores obtuvieron siRNA SMARTpool™ (Dharmacon) específico para ya sea CXCR4 o CCX-CKR2. El siRNA SMARTpóol™ es una acumulación de cuatro diferentes secuencias de siRNA. Cada una con dirección a una región diferente del mRNA específico. Estas acumulaciones de siRNA se probaron en células HeLa. La expresión CXCR4 se estimó mediante el manchado de 12G5 o 173 Mab y FACS, mientras que la expresión de CCX-CKR2 se midió en un ensayo de enlace utilizando 125I-SDF1. CXCR4 es expresado sobre células HeLa en una conformación que no exhibe enlace de 125I-SDF1 detectable, permitiendo de esta manera la detección de la expresión CCX-CKR2. siRNA SMARTpoll™ CCX-CKR2 (25-100 nm) efectúa inhibición significante (>50%) del enlace de 125I-SDF1, mientras que siRNA SMARTpool™ CXCR4 no lo hizo. Resultados similares se obtuvieron con los transfectantes 293-CCX-CKR2. Además, las siguientes 3 secuencias de siRNA se encontraron cada una para reducir el enlace de SDF-1 cuando se introdujeron en células a una concentración tan baja como 4 nM: siRNA #1: GCCGTTCCCTTCTCCATTATT siRNA #2 GAGCTCACGTGCAAAGTCATT siRNA #3: GACATCAGCTGGCCATGCATT Ejemplo 7 Este ejemplo demuestra la expresión de CCX-CKR2 en el cerebro. CCX-CKR2 se expresa sobre un número grande de líneas de células de tumor, pero unos cuantos tejidos normales. Una excepción a este último patrón se proporcionó por la demostración en los estudios de enlace de las células del cerebro de los ratones de adulto normales expresaron CCX-CKR2. Para extender estas observaciones, estudios de hibridación in situ se realizaron utilizando una sonda específica de CCX-CKR2 para localizar la región de la expresión CCX-CKR2 dentro del cerebro. Muestras de cerebro se recolectaron de ratones adultos normales y se fijaron con PFA 4% en PBS durante la noche a 4°C, seguido por sacarosa al 30% en PBS durante la noche a 4°C. Los tejidos luego se incrustaron en OCT, se cortaron en 20 rebanadas de um, luego se recolectaron en las platinas supercongeladas . Para los estudios de hibridación in situ, las ribosondas antisentido y de sentido se prepararon mediante la transcripción in vitro, respectivamente, con T7 y SP6 RNA Polimerasa utilizando el equipo de marcación de cRNA DIG (Roche) después de la linearización. Las criosecciones de 20 um se fijaron en PFA al 4% fresco, seguido por el tratamiento con proteasa K (2 ug/ml por 20 min a 37°C) . Las platinas se prehibridan a 55°C durante 1 hora, y luego se hibridan a 55°C O/N en recipientes sellados. Las platinas luego se lavan con formamida al 50%, 5x SSC pH 4.5 y SDS al 1% a 65°C seguido por el bloqueo con suero de oveja al 5% durante una hora y la incubación con 1:1000 de anticuerpo anti-DIG en suero de oveja al 1% para O/N a 4°C. Las platinas se lavaron con TBST y se detectaron con NBT/BCIP. Los resultados claramente demuestran la fuerte expresión de CCX-CKR2 mediante la neuronas dentro del cerebelo, hipocampo y corteza. Hay poca o nada de expresión detectable en áreas que contienen células guales tal como los tractos de materia blanca en el cerebelo, y el cuerpo calloso. Las células Purkinje mostraron señal fuertemente positiva de manera uniforme en subconjunto de las células de granulo en la capa de células de granulo interno mostraron señal positiva. Además, la corteza es generalmente muy positiva, y ningunas individuales dentro de la corteza mostraron manchado positivo claro. El hipocampo mostró fuerte señal de CCX-CKR2 en las neuronas del giro dentado y CA1-3. Además, las cortezas sobrepuestas también fueron positivas. Estos datos proporcionan algo de discernimiento que considera la relevancia potencial de CCX-CKR2 a los tumores del cerebro. CCX-CKR2 no se expresa en las células de la zona ventricular, o las células guales, donde los astrocitomas se cree que se originan. En contraste, hay algo de expresión en lo que se presenta que es un subconjunto de células de granulo cerebelar, el tipo de célula de la cual se deriva el meduloblastoma. El perfil de expresión para CCX-CKR2 es muy diferente de aquel observado para el otro receptor de SDF-1 CSCR4 como es descrito por otros. Ejemplo 8 Este ejemplo demuestra la eficacia de un competidor de ligando de CCX-CKR2 en un modelo de semiinjerto de ratón de carcinoma de pulmón. El carcinoma de pulmón es la causa de cáncer principal de muerte en los Estados Unidos. CCX-CKR2 se expresa en el carcinoma de pulmón así como en el endotelio activado. Los efectos de la administración de un competidor de ligando de CCX-CKR2, un compuesto de la serie 700, en un modelo de semiinjerto de carcinoma de pulmón fue evaluado. El estudio de semiinjerto de carcinoma de pulmón, fragmentos de tumor A549 (30-40 mg) se implantaron en el espacio subcutáneo en ratones desnudos. Los tumores se permitieron desarrollar hasta aproximadamente 150 mg en tamaño (entre 100 y 200 mg) junto en el cual los ratones se enrolaron en el estudio y se comenzó el tratamiento. Los ratones se trataron con el competidor de ligando CCX-CKR2 (25 mpk; administración se, QID) o el control de vehículo. Melphalan se incluyó como el control positivo (9 mpk/dosis, administración ip, Q4Dx3) . Los tumores se midieron dos veces a la semana con un calibrador en dos dimensiones y se convirtió a masa de tumor utilizando la fórmula para un elipsoide prolato (a x b2/2), donde a es la dimensión más larga y b es la dimensión más corta, y asumiendo la densidad unitaria (1 mm3- 1 mg) . Los pesos del cuerpo también se midieron dos veces a la semana para estimar cualquiera de los efectos adversos de la dosificación de compuesto. La actividad antitumoral se estimó mediante el retardo en crecimiento del tumor del grupo tratado en comparación al grupo de control tratado por vehículo. Los ratones que reciben el competidor exhibieron carga de tumor reducida comparada con el grupo tratado por vehículo. Esta diferencia en el volumen de tumor fue estadísticamente significante entre estos grupos y representa una reducción de 32% en el volumen de tumor promedio. Melphalan también redujo el volumen de tumor con una reducción del 60% en el volumen de tumor promedio. Adicionalmente, el tratamiento diario con el competidor fue bien tolerado en este estudio como es determinado por la ganancia de peso en los animales tratados con el compuesto consistente con aquella de los ratones tratados con vehículo.

Los pesos del tumor se estimaron en el día final del tratamiento con el compuesto (día 49) . Los ratones tratados con el competidor de CCX-CKR2 exhibieron tumores que fueron estadísticamente más pequeños que aquellos en el grupo de control de vehículo. De manera similar, los ratones que reciben Melphalan también tuvieron tumores significativamente más pequeños que el grupo tratado con vehículo . Todas las publicaciones y solicitudes de patentes citadas en esta especificación son incorporadas en la presente por referencia como si cada publicación individual o solicitud de patente fuera específicamente e individualmente indicada que es incorporada por referencia. Aunque la invención anterior se ha descrito en algún detalle a manera de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad de entendimiento, será fácilmente evidente para un experto ordinario en la técnica en vista de las enseñanzas de esta invención, que ciertos cambios y modificaciones se pueden hacer a la misma sin apartarse del espíritu y alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (45)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para identificar un agente que enlaza a CCX-CKR2 sobre una célula, el método caracterizado porque comprende, - poner en contacto una pluralidad de agentes a un polipéptido CCX-CKR2 que comprende un dominio extracelular por lo menos 95% idéntico a un dominio extracelular de la SEQ ID NO: 2, o un fragmento del mismo que enlaza SDFl o I-TAC; y seleccionar un agente que compite con I-TAC o SDFl para el enlace al polipéptido CCX-CKR2 o fragmento del mismo, para de esta manera identificar un agente que enlaza a CCX-CKR2 sobre una célula.
2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la célula es una célula de cáncer.
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende probar el agente seleccionado para la habilidad para enlazar a, o inhibir el crecimiento de, una célula.
4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la célula es una célula de cáncer.
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende probar el agente seleccionado para la habilidad para alterar la función del riñon .
6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende probar el agente seleccionado para la habilidad para alterar la función del cerebro o neuronal .
7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende probar el agente seleccionado para la habilidad para cambiar la lesión celular a las células endoteliales.
8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente es de menos de 1,500 daltons .
9. 9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente es un anticuerpo.
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente es un polipéptido.
11. 11. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido CCX-CKR2 comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 2.
12. 12. Un método para determinar la presencia o ausencia de una célula de cáncer, el método caracterizado porque comprende, poner en contacto una muestra que comprende una célula con un agente que específicamente enlaza con la SEQ ID NO: 2; y detectar el enlace del agente a un polipéptido en la muestra, en donde el enlace del agente a la muestra indica la presencia de una célula de cáncer.
13. 13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el agente es un anticuerpo.
14. 14. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el agente es de menos de 1500 daltons .
15. 15. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el agente es un polipéptido.
16. 16. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el polipéptido detectado es la SEQ ID NO: 2.
17. 17. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la muestra es de un humano.
18. 18. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el método se utiliza para diagnosticar cáncer en un humano.
19. 19. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el método se utiliza para proporcionar una prognosis de cáncer en un humano.
20. 20. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el cáncer es seleccionado del grupo que consiste de cáncer cervical, cáncer de seno, linfoma, glioblastomas, cáncer de próstata y leucemia.
21. 21. El método de conformidad con la reivindicación ' 12, caracterizado porque el cáncer no es sarcoma de Kaposi, enfermedad dé Castleman multicéntrica o linfoma de efusión primaria asociada con SIDA.
22. 22. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el anticuerpo compite con SDFl e I-TAC para el enlace a SEQ ID NO: 2.
23. 23. Un método para proporcionar una diagnosis o prognosis de un individuo que tiene cáncer, el método caracterizado porque comprende detectar la presencia o ausencia de expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido CCX-CKR2 en una célula de un individuo, en donde el polipéptido CCX-CKR2 enlaza a I-TAC y/o SDFl y el polipéptido CCX-CKR2 es por lo menos 95% idéntico a la SEQ ID NO: 2, para de esta manera diagnosticar un cáncer en un individuo .
24. 24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el polipéptido CCX-CKR2 es mostrado en la SEQ ID NO: 2.
25. 25. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el cáncer es seleccionado del grupo que consiste de cáncer cervical, cáncer de seno, linfoma, glioblastomas, cáncer de próstata, y leucemia.
26. 26. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el cáncer no es sarcoma de. Kaposi, enfermedad de Castleman multicéntrica o linfoma de efusión primaria asociada con SIDA.
27. 27. Un anticuerpo, caracterizado porque específicamente compite con SDF-1 e I-TAC para el enlace a SEQ ID NO: 2.
28. 28. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal .
29. 29. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo humanizado.
30. 30. Un método, caracterizado porque comprende, poner en contacto una célula con un agente que específicamente enlaza a SEQ ID NO: 2, en donde el agente compite con SDF-1 e I-TAC para el enlace a un polipéptido CCX-CKR2, en donde la célula expresa un polipéptido CCX-CKR2 que comprende un dominio extracelular por lo menos 95% idéntico a un dominio extracelular de la SEQ ID NO: 2, para de esta manera enlazar el agente al polipéptido CCX-CKR2 sobre la célula.
31. 31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el agente es de menos de 1,500 daltons .
32. 32. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el agente es un anticuerpo.
33. 33. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el agente es un polipéptido.
34. 34. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el polipéptido CCX-CKR2 es como se muestra en la SEQ ID NO: 2.
35. 35. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el agente es identificado por un método que comprende poner en contacto una pluralidad de agentes a un polipéptido CCX-CKR2 comprende un dominio extracelular por lo menos 95% idéntico a un dominio extracelular de la SEQ ID NO: 2, o un fragmento del mismo que enlaza SDFl o I-TAC; y seleccionar un agente que compite con I-TAC o SDF-1 para el enlace al polipéptido CCX-CKR2 o fragmento del mismo, para de esta manera identificar un agente que enlaza una célula de cáncer.
36. 36. Un método para tratar cáncer en un individuo, el método caracterizado porque comprende administrar al individuo una cantidad terapéuticamente efectiva de un polinucleótido que inhibe la expresión de un polinucleótido CCX-CKR2.
37. 37. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el polinucleótido CCX-CKR2 codifica la SEQ ID NO: 2.
38. 38. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el polinucleótido CCX-CKR2 comprende la SEQ ID NO:l.
39. 39. Un método para tratar cáncer en un individuo, el método caracterizado porque comprende administrar al individuo una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente que compite con SDFl e I-TAC para el enlace a SEQ ID NO: 2.
40. 40. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el agente es de menos de 1,500 daltons .
41. 41. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el agente es un anticuerpo.
42. 42. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el agente es un polipéptido.
43. 43. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el agente es identificado por un método que comprende poner en contacto una pluralidad de agentes a un polipéptido CCX-CKR2 que comprende un dominio extracelular por lo menos 95% idéntico a un dominio extracelular de la SEQ ID NO: 2, o un fragmento del mismo que enlaza SDFl o I-TAC; y seleccionar un agente que compite con I-TAC o SDF-1 para el enlace al polipéptido CCX-CKR2 o un fragmento del mismo, para de esta manea identificar un agente que enlaza a una célula de cáncer.
44. 44. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el cáncer es seleccionado del grupo que consiste de cáncer cervical, cáncer de seno, linfoma, glioblastomas, cáncer de próstata y leucemia.
45. 45. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el cáncer no es sarcoma de Kaposi, enfermedad de Castleman multicéntrica o linfoma de efusión primaria asociada con SIDA.