KR20040088511A - 에논 환원 효소 - Google Patents

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KR20040088511A
KR20040088511A KR10-2004-7013037A KR20047013037A KR20040088511A KR 20040088511 A KR20040088511 A KR 20040088511A KR 20047013037 A KR20047013037 A KR 20047013037A KR 20040088511 A KR20040088511 A KR 20040088511A
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candida
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KR10-2004-7013037A
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가타오카미치히코
시미즈사카유
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디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이.
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Abstract

분자량이 61300 ±5000Da이고, 조효소로서 NADPH 및 NADH를 사용하고, pH 7.4에서 최적 온도가 55 내지 60℃이고, 최적 pH가 4.5 내지 8.5이고, α,β-불포화 케톤에 대해 기질 특이성을 가짐을 특징으로 하는 단리된 에논 환원 효소; 미생물로부터 이의 제조방법; 및 상기 환원 효소를 사용하여 케토아이소포론으로부터 레보다이온을 제조하는 방법.

Description

에논 환원 효소{ENONE REDUCTASE}
케토아이소포론으로부터 레보다이온을 제조하는 미생물학적 방법은 예컨대 미국 특허 제 4,156,100 호에 공지되었다.
본 발명의 효소는 에논 환원 효소의 부류에 속하고 효모, 예를 들어칸디다 케피르(Candida kefyr) 또는자이고사카로마이세스 로우씨(Zygosaccharomyces rouxii)로부터 수득될 수 있다.칸디다 케피르로부터 단리된 효소는 NADH 및 NADPH 둘다에 의존성이고 겔 여과 크로마토그래피하에서 61.3kDa의 분자량을 갖는다. 변성 전기영동 조건하에서 45kDa의 하나의 소단위로 구성되고 자외선-가시광선 흡수 분광도가 278, 376 및 460nm에서 피크를 나타낸다.
본 발명은 2,6,6-트라이메틸-2-사이클로헥센-1,4-다이온(이하, "케토아이소포론"으로 지칭됨)으로부터 (6R)-2,2,6-트라이메틸 사이클로헥산-1,4-다이온(이하, "레보다이온"으로 지칭됨)을 제조하는데 관련된 신규한 효소, 및 에논 환원 효소로서 작용하는 상기 효소의 제조방법에 관한 것이다. 레보다이온은 케로테노이드, 예를 들어 제아크산틴의 합성에 중요한 중간 물질이다.
본 발명의 목적은 하기 물리-화학적 특성을 갖는 단리된 에논 환원 효소를 제공하는 것이다:
(a) 분자량: 61,300 ±5,000Da(분자량 45,000 ±5,000을 갖는 하나의 소단위로 구성);
(b) 조효소: NADPH 및 NADH;
(c) 기질 특이성: α,β-불포화 케톤에 대해 활성;
(d) 최적 온도: pH 7.4에서 55 내지 60℃; 및
(e) 최적 pH: 4.5 내지 8.5.
본원에서 사용된 용어 "에논 환원 효소"는 생화학 및 분자 생물학의 국제 단체의 명명학회(NC-IUBMB)에서 제공된 효소 명명법에 따른 카보닐 활성화된 이중 결합의 효소적 환원을 촉매하는 단백질을 포함한다. 이는 또한 상기에 언급된 에논 환원 효소의 활성을 갖는 단백질에 관한 것이고, 이 단백질은 바람직하게는 케토아이소포론의 레보다이온으로의 전환을 촉매한다.
더욱 구체적으로, 본 발명은 상기에 기술된 바와 같은 물리-화학적 특성을 갖는 단백질을 제조할 수 있는 미생물로부터 유래되는 상기 기술된 에논 환원 효소 활성을 갖는 단리된 단백질에 관한 것이다.
본 발명에서 사용되는 미생물은칸디다또는자이고사카로마이세스속에 속하는 미생물을 포함하지만 이에 제한되지 않는 효모로부터 선택되고, 이는 상기에서 정의된 에논 환원 효소를 생산할 수 있다. 이러한 미생물의 기능적인 등가물,계대배양물, 돌연변이체 및 변형체가 또한 본 발명에서 사용될 수 있다.
본 발명의 하나의 양태에서, 미생물은 효모, 바람직하게는칸디다, 더욱 바람직하게는칸디다 케피르,가장 바람직하게는칸디다 케피르(칸디다 마세도니엔시스) IFO 0960 또는 이들의 기능적인 등가물, 계대배양물, 돌연변이체 및 변형체이다. 균주칸디다 케피르(칸디다 마세도니엔시스) IFO 0960은 일본 532-8686 오사카시 요도가와쿠 주소-혼마치 2-초메 17-85 소재의 오사카 발효국(IFO)으로부터 공공연히 이용가능하다.
본원에서 사용된, 미생물 "칸디다 케피르" 또는 "자이고사카로마이세스 로우씨"는 또한 원생동물의 명명의 국제 규약에서 정의된 바와 같이 동일한 물리-화학적 특성을 갖는 이러한 종의 동의어 또는 이명을 포함한다.
본 발명에서 제공되는 에논 환원 효소는 호기적 조건하에서 수생 영양 배지내에 적당한 미생물을 배양하는 단계, 미생물의 세포를 파괴하는 단계, 및 미생물의 파괴된 세포의 세포-유리 추출물로부터 에논 환원 효소를 단리 및 정제하는 단계에 의해 제조될 수 있다.
따라서, 본 발명의 또다른 목적은 상기에서 정의된 바와 같은 물리-화학적 특성을 갖는 에논 환원 효소를 제조하는 방법을 제공하는 것이고, 이 방법은 호기적 조건하에서 수생 영양 배지내에 상기 특성을 갖는 에논 환원 효소를 생산할 수 있는 미생물을 배양하는 단계, 미생물의 세포를 파괴하는 단계 및 이 세포 추출물로부터 에논 환원 효소를 단리 및 정제하는 단계를 포함한다.
에논 환원 효소의 제조방법에 사용되는 미생물은 이미 상기에서 정의된 바와같다. 본 발명의 하나의 양태에서, 에논 환원 효소의 제조에 사용된 미생물은 효모, 바람직하게는칸디다, 더욱 바람직하게는칸디다 케피르, 가장 바람직하게는칸디다 케피르(칸디다 마세도니엔시스) IFO 0960 또는 이들의 기능적인 등가물, 계대배양물, 돌연변이체 및 변형체이다.
본 발명에 의해 제공된 에논 환원 효소는 케토아이소포론으로부터 레보다이온을 제조하기 위한 촉매로서 유용하다. 따라서, 본 발명의 추가의 목적은 케토아이소포론으로부터 레보다이온을 제조하는 방법을 제공하는 것이고, 이 방법은 케토아이소포론을 NADH 또는 NADPH의 존재하에 (i) 상기 물리-화학적 특성을 갖는 에논 환원 효소, (ii) (i)에서 정의된 효소를 생산할 수 있는 미생물의 세포 또는 세포-유리 추출물과 접촉하는 단계 및 각각의 경우에 반응 혼합물로부터 생성된 레보다이온을 단리하는 단계를 포함한다.
하나의 양태에서, 상기 정의된 바와 같은 효소를 생산할 수 있고 레보다이온의 제조에 사용되는 미생물은 효모, 바람직하게는칸디다, 더욱 바람직하게는칸디다 케피르, 가장 바람직하게는칸디다 케피르(칸디다 마세도니엔시스) IFO 0960 또는 이들의 기능적인 등가물, 계대배양물, 돌연변이체 및 변형체이다.
미생물은 탄소원으로서 단당류, 예컨대 글루코스 또는 수크로스, 알콜, 예컨대 에탄올 또는 글리세롤, 지방산, 예컨대 올레산, 스테아르산 또는 이들의 에스터, 또는 오일, 예컨대 포도 씨 오일 또는 콩기름; 질소원으로서 황산 암모늄, 질산 나트륨, 펩톤, 아미노산, 콘 스팁 리쿼, 브란, 효모 추출물 등; 무기 염원으로서 황산 마그네슘, 염화 나트륨, 탄산 칼슘, 인산 일수소 칼륨, 인산 이수소 칼륨등; 및 다른 영양원으로서 맥아 추출물, 밀 추출물 등을 함유하는 영양 배지내에서 배양될 수 있다. 배양은 배지 pH 3 내지 9 및 배양 온도 10 내지 40℃에서 통상 1 내지 7일내에 호기적으로 수행될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 배양 기간이 2 내지 4일내이고, 배지 pH가 5 내지 8이고, 배양 온도는 25 내지 35℃이다.
다음에서, 배양 후 미생물로부터 에논 환원 효소의 단리 및 정제를 위한 양태를 간략하게 기술한다:
(1) 세포를 원심 분리 또는 여과에 의해 액상 배양액으로부터 수확하고;
(2) 수확된 세포를 물, 생리 식염수 또는 적당한 pH를 갖는 완충액으로 세척하고;
(3) 세척된 세포를 완충액중에 현탁시키고 균질화기, 초음파기, 프렌치 압착기 또는 리소자임 처리 등으로 파괴하여 파괴된 세포의 용액을 제공하고;
(4) 파괴된 세포의 세포-유리 추출물로부터 에논 환원 효소를 단리 및 정제한다.
반응은 용매, 예컨대 트리스-HCl 완충액, 인산 완충액 등 중에서 NADH 또는 NADPH의 존재하에 약 4.5 내지 약 8.5의 pH에서 수행될 수 있다. 본 발명의 하나의 양태는 상기에서 정의된 바와 같은 에논 환원 효소 또는 미생물을 사용하여 케토아이소포론으로부터 레보다이온을 제조하는 방법에 관한 것이고, 이때 반응은 4.5 내지 8.5, 바람직하게는 5.0 내지 8.0 범위의 pH에서 수행된다.
본 발명의 추가의 양태는 상기 정의된 바와 같은 에논 환원 효소 또는 미생물을 사용하여 케토아이소포론으로부터 레보다이온을 제조하는 방법에 관한 것이고, 이때 반응 온도는 30 내지 60, 바람직하게는 55 내지 60℃의 범위이다.
pH 및 온도가 각각 5.0 내지 8.0 및 45 내지 60℃로 조정될 때, 반응은 통상 가장 우수한 결과를 산출한다. 바람직하게는, pH가 5.0 내지 8.0의 범위이고, 온도가 55 내지 60℃의 범위이다.
용매중의 케토아이소포론의 농도는 다른 반응 조건에 의존해서 다양할 수 있지만, 일반적으로 1mM 내지 2M, 바람직하게는 10mM 내지 100mM이다.
반응에서, 에논 환원 효소는 또한 고정된 상태로 적당한 담체와 함께 사용될 수 있다. 당해 분야에 일반적으로 공지된 고정화된 효소의 임의의 수단이 사용될 수 있다. 예를 들어, 효소는 하나 이상의 작용기를 갖는 수지의 막, 과립 등에 직접적으로 결합되거나 하나 이상의 작용기, 예를 들어 글루타르알데하이드를 갖는 가교 화합물을 통해 수지에 결합될 수 있다.
본 발명은 상기 기술된 바와 같은 에논 환원 효소 활성을 갖는 효소의 단리에 관한 것일 뿐만 아니라 당해 분야에서 공지된 방법을 사용하여 이러한 효소를 유전자 암호화하는 상응하는 유전자의 클로닝에 관한 것이다. 이러한 클론화된 유전자의 cDNA는 적당한 발현 벡터내로의 도입에 이용될 수 있고, 이어서 숙주 세포, 예를 들어 이. 콜리(E. coli) 또는 효모내로 도입된다. 재조합 단백질은 카로테노이드, 예컨대 액틴올 또는 제아크산틴의 제조에서 중요한 중간 단계인 케토아이소포론을 레보다이온으로 전환하는데 유용하다.
다음에 언급된 실시예에 따라서 제조된 에논 환원 효소의 정제된 시료의 물리-화학적 특성은 다음과 같다:
(1)효소 활성
본 발명의 신규한 에논 환원 효소는 하기 식에 따라 조효소의 존재하에 케토아이소포론의 레보다이온으로의 환원을 촉매한다:
케토아이소포론 + NADH(NADPH) ↔ 레보다이온 + NAD(NADP)
표준 효소 분석을 다음과 같이 수행하였다: 총 부피 1㎖의 기본 반응 혼합물(200㎕의 1M 트리스-HCl 완충액 pH 7.5, 100㎕의 80mM NADH 또는 NADPH, 100㎕의 0.658M 케토아이소포론, 600㎕의 H2O)에 5㎕의 효소 용액을 첨가하고 40℃에서 배양하였다. 효소 활성의 하나의 단위를 1분당 1μmol의 케토아이소포론의 산화를 촉매하는 효소의 양으로 정의하였다. 반응 혼합물을 1㎖의 에틸아세테이트로 추출하여 에틸아세티이트 층에서 레보다이온을 회수하였다. 추출물을 기체 크로마토그래피로 분석하였다[칼럼: 울본(ULBON) HR-20M(신와(Shinwa), 일본) 0.25mmφx 30m, 칼럼 온도: 160℃(일정), 주입 온도: 250℃, 담체 기체: He(약 1㎖/분)]. 단백질 농도를 바이오-라드(Bio-Rad) 단백질 분석 키트(바이오-라드, 미국)를 사용하여 결정하였다.
(2)분자량
단백질의 분자량(MW)을 겔 열과 칼럼 수퍼덱스(Superdex) 200(아머샴 바이오사이언스(Amersham Biosciences) AB, 스웨덴 SE-751 웁살라 84)으로 측정하였다. 효소의 외관 분자량은 분자량 표시자 단백질(보링거 만헤임 바이오케미카(Boehringer Mannheim Biochemica); 독일) 페리틴(분자량: 450,000Da), 카탈레이즈(분자량: 240,000Da), 알도레이즈(분자량: 158,000Da), 소 혈청 알부민(분자량: 68,000Da), 오브알부민(분자량: 45,000Da), 키모트립시노겐(분자량: 25,000Da) 및 시토크롬 c(분자량: 12,500Da)와 비교하여 61,300±5,000Da로 산출되었다. SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)으로 분자량 표시자 단백질(아머샴 바이오사이언스 AB) 포스포릴레이즈 b(분자량: 97,000Da), 소 혈청 알부민(분자량: 66,300Da), 오브알부민(분자량: 42,400Da), 탄소 무수화 효소(분자량: 30,000Da) 및 콩 트립신 저해제(분자량: 20,100Da)와 비교하여 분자량이 45,000±5,000Da를 갖는 단일 밴드를 제공하였다. 이는 효소가 하나의 소단위로 구성됨을 나타낸다.
(3)조효소
케토아이소포론을 레보다이온으로 전환하는 효소에 필요한 조효소를 조사하였다. 결과로서, NADH 및 NADPH가 이 환원 반응에 조효소로서 작용할 수 있는 것으로 나타났다.
(4)기질 특이성
효소의 기질 특이성은, 다양한 기질 용액(반응 혼합물중에 0.05% 최종 농도)을 케토아이소포론 대신 사용하고 반응 온도를 30℃에서 수행한 것을 제외하고, 상기 (1)에서 기술된 동일한 효소 분석 방법을 사용하여 결정하였다. 상이한 기질의 반응 활성(%)은 하기 표 1에서 비교되는데, 가장 우수한 결과는 3-부텐-2-온으로 나타난다.
(5)최적 온도
효소 활성을, 2-사이클로헥센-1-온을 기질로 사용하는 것을 제외하고, 상기 (1)에 기술된 바와 동일한 효소 분석 방법을 사용하여 20 내지 70℃ 온도에서 측정하였다. 하기 표 2에 개괄된 바와 같이, 효소 반응의 최적 온도는 55 내지 60℃이다.
(6)최적 pH
반응 혼합물의 효소 활성과 pH 값 사이의 관계를, 다양한 pH 및 완충액을 사용하고 0.05%(최종 농도) 2-사이클로헥센-1-온을 기질로서 사용한 것을 제외하고, 상기 (1)에서 기술된 바와 동일한 효소 분석 방법을 사용하여 결정하였다. 효소 반응의 최적 pH는 하기 표 3에서 제시된 바와 같이 4.5 내지 8.5이었다.
(7)금속 이온 및 다른 화합물의 효과
효소 활성에 대한 금속 이온 및 다른 화합물의 효과를, 2-사이클로헥센-1-온을 기질로서 사용하고 다양한 금속 및 다른 화합물을 반응 혼합물에 첨가하여 금속의 최종 농도를 1mM로 한 것을 제외하고, 상기 (1)에서 기술된 바와 동일한 효소 분석 방법을 사용하여 조사하였다. Pb 이온 및 트립파노플라빈은 효소 활성을 강력하게 억제하였다. Ag, Hg, Cu, V 및 구아니딘 이온은 효소 활성을 중간정도로 억제하였다. 결과는 하기 표 4에 나타낸다.
(8)정제 과정
에논 환원 효소의 정제는 주로 공지된 정제 방법, 예컨대 침전물, 예를 들어 황산 암모늄, 폴리에틸렌 글라이콜 등의 분류; 이온 교환 크로마토 그래피; 흡수크로마토그래피; 겔-여과 크로마토그래피, 겔 전기영동, 염석 및 투석의 임의의 조합으로 수행될 수 있다.
하기 실시예는 추가로 본 발명을 설명한다.
실시예 1
에논 환원 효소의 제조
달리 언급되지 않는다면 모든 조작을 4℃에서 20mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.0)중에서 수행하였다.
(1)칸디다 케피르(칸디다 마세도니엔시스) IFO 0960의 배양
한천 평판상에서 성장한칸디다 케피르(칸디다 마세도니엔시스) IFO 0960을 시험관중 D-글루코스(5%), 펩톤(0.5%), KH2PO4(0.2%), K2HPO4(0.1%), MgSO4·7H2O(0.02%) 및 효모 추출물(0.1%)로 구성된 배지(pH 6.0) 5㎖에 접종하고 2일동안 28℃에서 배양하였다. 이렇게 제조된 10㎖의 종자 배양물을 용량 2ℓ의 사카구치(Sakaguchi) 플라스크내에서 상기한 바와 동일한 배지 500㎖내로 접종하고 28℃에서 2일동안 배양하였다. 따라서 제조된 10개의 플라스크로부터 5ℓ의 배지를 4℃에서 20분간 8,000rpm으로 원심분리하였다. 총 60.5g의 습성 세포를 수득하였다.
(2) 세포-유리 추출물의 제조
습성 세포(60.5g)를 121㎖의 완충액중에 현탁시키고 2시간동안 구보타 인소네이터(Kubota Insonator) 201 초음파기(구보타(Kubota), 일본)를 사용하여 전력 190W로 초음파 처리하였다. 초음파 처리후, 시료를 10,000rpm에서 20분간 원심분리하였다. 결과로서, 1,550mg의 단백질을 함유하는 139㎖의 세포-유리 추출물을 수득하였다.
(3) 황산 암모늄 침전
이전 단계에서 수득한 세포-유리 추출물(80㎖)을 고체 황산 암모늄으로 분류하였다. 40 내지 80% 분획(78.5㎖)을 5ℓ의 완충액에 대해 4회 투석하고 91㎖의 투석한 용액을 수득하였다.
(4) 다이에틸아미노에틸-세파셀(Sephacel) 칼럼 크로마토그래피
상기에서 제조된 투석한 시료를 다이에틸아미노에틸(DEAE)-세파셀 칼럼(직경 2.5cm 및 높이 14cm; 아머샴 바이오사이언스 AB, 스웨덴)에 적용하고 완충액으로 평형을 맞추었다. 칼럼을 200㎖의 동일한 완충액으로 세척한 후, 효소를 530㎖의 선형 구배의 NaCl(0 내지 0.6M)로 용리하였다. 효소 활성을 0.1M NaCl로 용리하였다.
(5) 페닐-수퍼로스(Superose) HR10/10 칼럼 크로마토그래피
이전 단계로부터 얻은 시료를 최종 농도가 4M이 되도록 NaCl로 보충하였다. 칼럼(직경 1cm x 길이 30cm; 아머샴 바이오사이언스 AB, 스웨덴)을 4M NaCl을 함유하는 완충액으로 평형을 맞추고 상기 시료에 적용하였다. 효소를 160㎖의 선형 구배의 완충액(4 내지 0M NaCl)으로 용리하였다. 효소 활성을 2M NaCl 농도에서 용리하였다.
(6) 수퍼덱스(Superdex) 200 HR10/30 칼럼 크로마토그래피
이전 단계로부터 얻은 시료를 수퍼덱스 200 HR10/30 칼럼(직경 1cm x 길이30cm; 아머샴 바이오사이언스 AB, 스웨덴) 크로마토그래피에 적용하였다. 칼럼을 2M NaCl을 함유하는 완충액으로 평형을 맞추고 전개하였다. 효소 활성을 갖는 분획을 수집하였다. 효소의 정제 단계의 요약을 하기 표 5에 제시한다.
(7) 반응 생성물의 동정
50mM 트리스-HCl(pH 7.5) 완충액중의 10mg/㎖의 케토아이소포론, 0.6mg/㎖의 NADP+, 0.2mg/㎖의 글루코스 탈수소효소(아마노 엔자임(Amano Enzyme), 일본) 및 50mg/㎖의 D-글루코스로 구성된 반응 혼합물(1㎖)을 표 5의 수퍼덱스 200의 분획으로부터 효소의 50밀리 단위로 보충하였다. 28℃에서 24시간동안 배양한 후, 혼합물을 1㎖의 에틸아세테이트로 추출하였다. 추출물을 기체 크로마토그래피로 분석하였다. 생성물을 레보다이온의 표준 시료와 비교하여 레보다이온으로 동정하였다.

Claims (11)

  1. 하기 물리-화학적 특성을 갖는 단리된 에논 환원 효소:
    (a) 분자량: 61,300 ±5,000Da(분자량 45,000 ±5,000을 갖는 하나의 소단위로 구성);
    (b) 조효소: NADPH 및 NADH;
    (c) 기질 특이성: α,β-불포화 케톤에 대해 활성;
    (d) 최적 온도: pH 7.4에서 55 내지 60℃; 및
    (e) 최적 pH: 4.5 내지 8.5.
  2. 제 1 항에 있어서,
    제 1 항에서 정의된 특성을 갖는 에논 환원 효소를 생산할 수 있는 미생물로부터 유래된 에논 환원 효소.
  3. 제 2 항에 있어서,
    미생물이 효모인 에논 환원 효소.
  4. 제 2 항에 있어서,
    미생물이칸디다 케피르(Candida kefyr)(칸디다 마세도니엔시스(Candida macedoniensis)) IFO 0960, 그의 기능적 등가물, 계대배양물, 돌연변이체 또는 변형체인 에논 환원 효소.
  5. 호기적 조건하에 수성 영양 배지내에서 하기 물리-화학적 특성을 갖는 에논 환원 효소를 생산할 수 있는 미생물을 배양하는 단계, 미생물의 세포를 파괴하는 단계, 및 상기 추출물로부터 에논 환원 효소를 단리 및 정제하는 단계를 포함하는, 하기 물리-화학적 특성을 갖는 에논 환원 효소의 제조방법:
    (a) 분자량: 61,300 ±5,000Da(분자량 45,000 ±5,000을 갖는 하나의 소단위로 구성);
    (b) 조효소: NADPH 및 NADH;
    (c) 기질 특이성: α,β-불포화 케톤에 대해 활성;
    (d) 최적 온도: pH 7.4에서 55 내지 60℃; 및
    (e) 최적 pH: 4.5 내지 8.5.
  6. 제 5 항에 있어서,
    미생물이 효모인 방법.
  7. 케토아이소포론을 NADH 또는 NADPH의 존재하에 (i) 하기 물리-화학적 특성을 갖는 에논 환원 효소 또는 (ii) (i)에서 정의된 효소를 생산할 수 있는 미생물의 세포 또는 세포-유리 추출물과 접촉하는 단계 및 반응 혼합물로부터 생성된 레보다이온을 단리하는 단계를 포함하는, 케토아이소포론으로부터 레보다이온을 제조하는 방법:
    (a) 분자량: 61,300 ±5,000Da(분자량 45,000 ±5,000을 갖는 하나의 소단위로 구성);
    (b) 조효소: NADPH 및 NADH;
    (c) 기질 특이성: α,β-불포화 케톤에 대해 활성;
    (d) 최적 온도: pH 7.4에서 55 내지 60℃; 및
    (e) 최적 pH: 4.5 내지 8.5.
  8. 제 7 항에 있어서,
    미생물이 효모인 방법.
  9. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
    반응이 4.5 내지 8.5의 범위의 pH에서 수행되는 방법.
  10. 제 7 항 내지 제 9 항중 어느 한 항에 있어서,
    반응 온도가 30 내지 60℃의 범위인 방법.
  11. 특히 실시예를 참조하여 상기 기술된 바와 실질적으로 같은 발명.
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