KR20040086425A

KR20040086425A - 레보다이온의 제조방법

Info

Publication number: KR20040086425A
Application number: KR10-2004-7013066A
Authority: KR
Inventors: 시미즈사카유; 와다마사루
Original assignee: 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이.
Priority date: 2002-02-22
Filing date: 2003-02-15
Publication date: 2004-10-08
Also published as: US20050244941A1; CN1639347A; CA2474802A1; EP1476559A2; JP2005517448A; WO2003070959A3; WO2003070959A2; AU2003210285A1

Abstract

본 발명은 분자량이 61,300±5,000Da이고, 보조-인자로서 NADPH 및 NADH를 사용하고, pH 7.4에서 최적 온도가 55 내지 60℃이고, 최적 pH가 4.5 내지 8.5이고, 특히 효모로부터 유도된 α,β-불포화 케톤에 대해 기질 특이성을 가짐을 특징으로 하는 에논 환원효소, 및 케토아이소포란으로부터 레보다이온을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

레보다이온의 제조방법{PROCESS FOR PRODUCING LEVODIONE}

케토아이소포론으로부터 레보다이온을 제조하는 미생물학적 방법은, 예를 들어 미국특허 제 4,156,100 호에 공지된 바 있다.

예기치 못하게도, NADPH 탈수소효소를 촉매로서 사용함으로써 케토아이소포론으로부터 레보다이온이 형성될 수 있음을 발견하였다. 본 발명의 방법에서 촉매로서 사용되는 NADPH 탈수소효소는 일반적으로 고황효소(old yellow enzyme; OYE)로 알려져 있으며, 생화학 및 분자 생물학 국제 연합의 명명 위원회의 효소 명명법(Academic Press), 1992)에 따라 효소 부류 E.C. 1.6.99로 정의되었다.

본 발명은 2,2,2-트라이메틸-2-사이클로헥센-1,4-다이온(이후부터, "케토아이소포론"으로 지칭한다)으로부터 환원된 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오티드 포스페이트(이후부터, "NADPH"라 지칭한다) 탈수소효소에 의해 (6R)-2,2,6-트라이메틸 사이클로헥산-1,4-다이온(이후부터, "레보다이온"으로 지칭한다)을 제조하는 방법에 관한 것이다. 레보다이온은 카로테노이드(예를 들어, 제아크산틴)의 합성의 중요한 중간체이다.

본 발명은 수성 매질 중에서 NADH 또는 NADPH의 존재하에 케토아이소포론을 NADPH 탈수소효소와 접촉시키고, 생성된 레보다이온을 반응 혼합물로부터 단리시킴을 포함하는, 케토아이소포론으로부터 레보다이온을 생성하는 방법에 관한 것이다.

본원에서 사용된 "NADPH 탈수소효소"란 용어는 NADH 또는 NADPH, 예를 들어 생화학 및 분자 생물학 국제 연합의 명명 위원회의 효소 명명법에 따라 E.C. 1.6.99로 분류된 고황효소(OYE)의 존재하에 케토아이소포론을 레보다이온으로 전환시키는 효소 반응을 촉매화시킬 수 있는 단백질을 포함한다.

특히, 본 발명은 상기 반응을 촉매화시키는 NADPH 탈수소효소가 효소 부류 EC 1.6.99로 정의된 OYE인, 케토아이소포론으로부터 레보다이온을 생성하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 방법에서 촉매로서 사용되는 OYE는 속 사카로마이세스(saccharomyces), 자이고사카로마이세스(Zygosaccharomyces), 칸디다(Candida), 글루코노박테르(Gluconobacter), 베넥키아(Beneckea) 또는 비브리오(Vibrio)를 포함하나 이들로써 한정되는 것은 아닌 효소를 제조하기에 적합한 임의의 적절한 미생물로부터 수득되거나 단리될 수 있다. 상기 언급된 미생물은 원핵생물 명명의 국제 규칙에 정의된, 동일한 물리화학적 특성을 갖는 미생물의 동의어 또는 유의어 또한 포함한다.

형질전환된 미생물, 예를 들어 NADPH 탈수소효소를 발현하는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)를 출발 미생물로서 사용할 수도 있다.

본 발명의 하나의 실시양태에서, OYE와 같은 NADPH 탈수소효소를 제조하는데 적합한 미생물은 사카로마이세스 세레비시아, 바람직하게는 문헌[the American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard Manassas, VA20100-2209, U.S.A.]에 기술된 사카로마이세스 세레비시아 S288C(ATCC 204508)이다. 익히 공지된 정제 방법이 효소의 제조에 사용될 수 있다(문헌[Abramovitz, A. S., &Massey. V.,J. Biol. Chem.251, 5321-5326, 1976] 참조).

본 발명의 하나의 실시양태에서는, 케토아이소포론을 레보다이온으로 촉매적으로 분해하기 위해, 예를 들어 NADPH-FMN 옥시도리덕타아제(Oxidoreductase)(상표명)(시그마(Sigma)(미국 소재) 제품)와 같은 시판중인 OYE를 사용할 수 있다.

본 발명에 바람직하게 사용된 OYE는 각각 45.0kDa 및 44.9kDa의 분자량을 갖는 2개의 하위단위, 즉 OYE2 및 OYE3으로 이루어져 있다. 놀랍게도, OYE2 및 OYE3은 NADPH 뿐만 아니라, 본 발명의 반응을 촉매화시키기 위한 보조-인자로서의 NADH로서 사용될 수 있음이 밝혀졌다.

따라서, 본 발명의 추가의 양태는 케토아이소포론을 레보다이온으로 전환시키는 촉매 반응에 사용된 OYE를 사카로마이세스 세레비시아 S288C(ATCC 204508)로부터 유도된 oye2 또는 oye3 유전자을 통해 암호화시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 OYE는 하기 화학식에 따라 보조-인자의 존재하에 케토아이소포론을 레보다이온으로의 환원을 촉매화시킨다:

예를 들어, 반응 혼합물(트리스-HCl 완충액 100㎕(pH 8.0), 80mM NADH 100㎕, 0.13M 케토아이소포론 100㎕ 및 총 부피가 1㎖가 되게 하는 양의 물)에 효소 용액 5㎕를 첨가하고 20 내지 40℃에서 5 내지 300분, 바람직하게는 25℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 반응 혼합물을 유기용매, 예를 들어 에틸 아세테이트, n-헥세인, 톨루엔 또는 n-부틸 아세테이트 1㎖로 추출하여 레보다이온을 유기용매층으로 회수한다. 추출물을 공지된 방법, 예를 들어 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피, 박막 크로마토그래피 또는 종이 크로마토그래피 등으로 분석한다. 기체 크로마토그래피를 사용하는 경우, 하나의 실시양태로서 하기 조건을 적용한다:

컬럼: ULBON HR-20M(신와(Shinwa)(일본 소재) 제품) 0.25mmφ×30m

컬럼 온도: 160℃(일정)

주입기 온도: 250℃

캐리어 기체: He(약 1㎖/분)

이 반응은 트리스-HCl 완충액 및 포스페이트 완충액 등과 같은 용매중에서 NADH 또는 NADPH의 존재하에 약 4.5 내지 약 8.5의 pH에서 수행될 수 있다. 바람직하게는, 5.0 내지 8.0의 pH에서 수행된다.

본 발명은 4.5 내지 8.5의 pH 및 20 내지 40℃의 온도에서 수행되고 OYE의 도움으로 케토아이소포론으로부터 레보다이온이 생성되는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 이 반응은 5.0 내지 8.0의 pH 및 25 내지 35℃의 온도에서 수행된다.

본 발명의 단백질 OYE2 및 OYE3을 암호화하는 유전자는 사카로마이세스 세레비시아와 같은 미생물을 기원으로 하는 유전자 서열 정보를 기본으로 하여 클로닝될 수 있고, 에스케리키아 콜라이와 같은 적절한 호스트 물질로 발현될 수 있다. NADPH 탈수소효소를 발현하는 에스케리키아 콜라이와 같은 재조합 미생물은 익히 공지된 재조합 기술(문헌[Molecular cloning: a Laboratory Manual, 2nd Edition/ Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989] 참조)로 제조될 수 있다.

따라서, 본 발명은 수성 매질 중에서 NADH 또는 NADPH의 존재하에 케토아이소포론을 NADPH 탈수소효소를 발현하는 재조합 미생물 또는 이의 무세포 추출액과 접촉시키고, 이 반응 혼합물로부터 수득된 레보다이온을 단리시킴을 포함하는, 케토아이소포론으로부터 레보다이온을 제조하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는 재조합 미생물은 에스케리키아 콜라이이다.

재조합 미생물에 의해 발현된 NADPH 탈수소효소는 본 발명의 또다른 양태에서 효소 부류 EC 1.6.99에 의해 정의된 OYE이다.

특히, 재조합 미생물의 발현에 사용된 OYE는 사카로마이세스, 자이고사카로마이세스, 칸디다, 글루코노박테르, 베넥키아 및 비브리오로 이루어진 군으로부터 선택된 미생물, 이의 기능성 등가물, 계대배양물, 돌연변이체 및 변형체로부터 유도될 수 있다. 바람직하게는, OYE는 사카로마이세스 세레비시아, 보다 바람직하게는 사카로마이세스 세레비시아 S288C(ATCC 204508)로부터 유도된다. 사카로마이세스 세레비시아 S288C(ATCC 204508)로부터 oye2 또는 oye3에 의해 암호화된 OYE가 가장 바람직하다.

NADPH 탈수소효소를 발현하는 에스케리키아 콜라이와 같은 재조합 미생물을 탄소 공급원으로서 글루코즈 또는 수크로즈와 같은 당류, 에탄올 또는 글리세롤과같은 알콜, 올레산, 스테아르산 또는 이들의 에스테르와 같은 지방산 또는 평지씨유 또는 대두유와 같은 오일; 질소 공급원으로서 암모늄 설페이트, 나트륨 니트레이트, 펩톤, 아미노산, 옥수수 침지수(corn steep liquor), 밀기울 및 효모 추출물 등; 무기 염 공급원으로서 마그네슘 설페이트, 나트륨 클로라이드, 칼슘 카보네이트, 칼륨 모노하이드로젠 포스페이트 및 칼륨 다이하이드로젠 포스페이트 등; 다른 영양분 공급원으로서 맥아 추출액 및 고기 추출액 등을 함유한 영양분 매질에서 배양할 수 있다. 이 배양은 호기성으로 수행되고, 일반적으로 10 내지 40℃의 온도에서 3.0 내지 9.0의 pH의 매질 중에서 1 내지 7일의 기간 동안 수행된다. 바람직하게는, 배양은 2 내지 4일 동안 25 내지 35℃의 배양 온도에서 5.0 내지 8.0의 pH의 매질에서 수행된다.

OYE는 케토아이소포론으로부터의 레보다이온의 생성의 촉매로서 사용된다. 하나의 실시양태에서, 재조합 미생물을 사용한 케토아이소포론으로부터 레보다이온의 생성반응은 트리스-HCl 완충액, 포스페이트 완충액 등과 같은 용매에서 NADH 또는 NADPH의 존재하에 약 4.5 내지 약 8.5의 pH에서 수행될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 반응은 5.0 내지 8.0의 pH에서 수행된다.

상기 반응을 수행하는데 바람직한 온도는 20 내지 40℃이다. pH 및 온도가 각각 5.0 내지 8.0 및 25 내지 35℃로 설정되는 경우, 최상의 반응 결과가 수득된다.

추가의 실시양태에서, 재조합 미생물을 사용하여 레보다이온을 생성하기 위한 반응은 4.5 내지 8.5의 pH 및 20 내지 40℃의 온도에서 수행된다. 바람직하게는, 반응은 5.0 내지 8.0의 pH 및 25 내지 35℃의 온도에서 수행된다.

용매중의 케토아이소포론의 농도는 다른 반응 조건에 따라 변경될 수 있으나, 일반적으로 1mM 내지 2M, 바람직하게는 10mM 내지 100mM이다.

반응에서, OYE는 적절한 캐리어를 사용하는 고정화된 상태로 사용될 수도 있다. 효소를 고정화시키는 수단으로서 당해 분야에 일반적으로 공지된 것이 사용될 수 있다. 예를 들어, 효소는 하나 이상의 작용기를 갖는 수지의 막, 과립 등에 직접 고정되거나, 하나 이상의 작용기를 갖는 연결 화합물, 예를 들어 글루타르알데하이드를 통해 수지에 결합될 수 있다.

반응 후, 물과 혼화되지 않고 레보다이온이 쉽게 용해되는 유기용매, 예를 들어 에틸 아세테이트, n-헥세인, 톨루엔 또는 n-부틸 아세테이트로 추출함으로써 반응 혼합물로부터 레보다이온을 회수할 수 있다. 추출물을 농축하여 레보다이온을 바로 결정화시키거나, 다양한 종류의 크로마토그래피, 예를 들어 박층 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피, 겔 투과 크로마토그래피 또는 고성능 액체 크로마토그래피를 조합하여 레보다이온을 추가로 정제할 수 있다.

하기 실시예를 통해 본 발명을 추가로 설명한다.

실시예 1

사카로마이세스 세레비시아의 게놈 DNA로부터 oye2 및 oye3 유전자의 클로닝

사카로마이세스 세레비시아 S288C(ATCC 204508)의 게놈 DNA를 칼륨 아세테이트 방법을 사용하여 제조하였다. 제조된 게놈 DNA를 주형으로서 사용하여, oye2 및 oye3 유전자 단편을 열 순환기(미국, 퍼킨 엘머(Perkin Elmer) 2400)를 사용하여 2단계 PCR 방법으로 수득하였다. PCR 혼합물(0.02㎖)은 각각 프라이머(5pmol), 각각의 dNTP(0.312mM), 및 파이로베스트 DNA 폴리머라아제 2.5U(다카라 슈조 캄파니 리미티드(Takara Shuzo Co. LTD)(일본 교토 소재) 제품)를 함유한다. 사카로마이세스 세레비시아 S288C(ATCC 204508)의 게놈 DNA 100ng을 제 1 PCR 반응의 주형으로서 사용하였다. 반응 후, 혼합물을 물로 20배 희석시키고, 제 2 PCR 반응의 주형으로서 사용하였다. 제 1 PCR에서는, 98℃에서 10초, 55℃에서 30초, 72℃에서 90초의 주기를 25회 반복하였다. 제 2 PCR에서는, 98℃에서 10초, 51℃에서 30초, 72℃에서 90초의 주기를 25회 반복하였다.

oye2 유전자를 클로닝하기 위해, 프라이머,및를 사용하여 제 1 PCR 반응을 수행하였다. 이 반응을 통해, oye2 유전자를 함유한 DNA 단편(1250bp)을 증폭시켰다. 프라이머,및를 사용하여 제 2 PCR을 수행하였다.

이 반응을 통해, oye2 유전자의 ORF를 함유한 DNA 단편(1200bp)을 증폭시켰다. 이 증폭된 oye2 유전자를 EcoRI 및 PstI로 처리하고, EcoRI 및 PstI로 예비소화된 벡터 pKK223-3(아메르샴 바이오사이언스(Amersham Bioscience)(영국 버킹검셔 소재) 제품)으로 연결하여 플라스미드 pKK223-3/OYE2를 구성하였다. 대장균 DH5α를 연결 혼합물로 형질전환시키고 서열분석을 위해 다수의 클론을 선택하였다. "써모 시쿼나아제 II 다이 터미네이터 사이클 시퀀싱 키트(Thermo Sequenase II dye terminator cycle sequencing kit"(아메르샴 바이오사이언스(영국 버킹검셔 소재) 제품) 및 자동 서열 분석기(ABI 프리즘 377)를 사용하여 각각의 후보 클론의 클로닝된 oye2 유전자의 서열을 결정하였다. 서열 분석기에 사용된 프라이머는 다음과 같았다:

추가 실험을 위해 사카로마이세스 세레비시아 S288C(ATCC 204508)의 공지된 oye2 서열과 완전히 동일한 서열을 보여주는 클론중의 하나를 선택하였다. oye3 유전자를 클로닝하기 위해, 프라이머및를 사용하여 제 1 PCR 반응을 수행하였다.

이 반응을 통해, oye3 유전자를 함유한 DNA 단편(1250bp)를 증폭시켰다. 하기의 프라이머를 사용하여 제 2 PCR을 수행하였다:

이 반응을 통해, oye3 유전자를 함유한 DNA 단편(1200bp)를 증폭시켰다. 이 증폭된 oye3 유전자를 MfeI 및 PstI로 처리하고, EcoRI 및 PstI로 예비소화된 벡터 pKK223-3(아메르샴 바이오사이언스(영국 버킹검셔 소재) 제품)로 연결하여 플라스미드 pKK223-3/OYE3을 구성하였다. 대장균 DH5α를 상기 연결 혼합물로 형질전환시키고 서열 분석을 위해 다수의 클론을 선택하였다. "써모 시퀘나아제 II 다이 터미네이터 사이클 시퀀싱 키트"(아메르샴 바이오사이언스(영국 버킹검셔 소재) 제품) 및 자동 서열 분석기(ABI 프리즘 377)를 사용하여 각각의 후보 클론의 클로닝된 oye3 유전자의 서열을 결정하였다. 서열 분석을 위해 사용된 프라이머는 다음과 같았다:

추가 실험을 위해 사카로마이세스 세레비시아 S288C(ATCC 204508)의 공지된 oye3 서열과 완전히 동일한 서열을 보여주는 클론중의 하나를 선택하였다.

실시예 2

사카로마이세스 세레비시아의 oye2 또는 oye3 유전자를 갖는 대장균 균주의 무세포 추출을 사용한 레보다이온의 제조

상기 실시예 1에서 구성되고 각각 oye2 및 oye3의 완전한 DNA 서열을 포함하는 플라스미드 pKK223-3/OYE2 및 pKK223-3/OYE3을 대장균 JM109에 도입하고, 재조합 균주 JM109[pKK223-3/OYE2] 및 JM109[pKK223-3/OYE3]를 수득하였다.

또한, 균주 JM109[pKK223-3]을 대조군으로서 제조하였다. 이 균주들을 각각 암피실린 0.05mg/㎖ 및 카사미노산 2%(w/v)(디프코 래보러토리스(Difco Laboratories)(미국 소재) 제품)를 함유한 M9 미니멈 배지(2ℓ-사카구치 플라스크 중의 2×500㎖)에 접종하고 37℃에서 배양하였다. 610nm에서의 광학 밀도가 0.4가 되면, 상기 매질에 IPTG(아이소프로필 β-D-싸이오갈락토파이라노사이드)를 첨가하여 농도가 0.01mM이 되게 하고, 추가로 8 내지 10시간 동안 배양을 유지시켰다. 이어서, 박테리아 세포를 원심분리로 수거하였다. 젖은 세포 약 10g을 브로쓰 1ℓ로부터 수득하였다. 세포의 분획(0.7g)을 40mM 트리스-HCl(pH 8.0), 10mM MgCl2, 10mM 다이싸이오트레이톨(DTT), 200mM KCl 및 1mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF)로 구성된 완충액 1.4㎖에 재현탁시키고, 15분 동안 초음파 진동기를 사용하여 세포를 분해시켰다. 원심분리후, 생성된 상층액을 다음의 레보다이온 제조를 위한 무세포 추출액으로서 사용하였다. 단백질 2mg을 함유한 각각의 JM109[pKK223-3/OYE2], JM109[pKK223-3/OYE3] 또는 JM109[pKK223-3]의 세포로부터 수득된 무세포 추출액을 25mM 트리스-HCl(pH 8.0), 66mM NADH 또는 55mM NADPH 및 13mM 케토아이소포론으로 구성된 반응 혼합물 1㎖에 사용하였다. 25℃에서 30분 동안 반응을 수행하였다. 반응 혼합물을 에틸아세테이트 1㎖로 추출하여 레보다이온을 에틸아세테이트층으로 회수하였다. 이 추출액을 기체 크로마토그래피(컬럼: ULBON HR-20M(신와(일본 소재) 제품) 0.25mmφ×30m, 컬럼 온도: 160℃(일정), 주입기 온도: 250℃, 캐리어 기체: He(약 1㎖/분))를 사용하여 분석하였다. 결과를 하기 표 1에 기재한다.

NADH-재순환 시스템을 통해 무세포 추출액의 재조합을 사용하는 또다른 실험에서, 레보다이온의 수율은 95%에 달했다. 이 경우, 단백질 30mg을 함유한 JM109[pKK223-3/OYE2]의 무세포 추출액을 250mM 트리스-HCl(pH 8.0), 0.31mM NAD⁺, 220mM D-글루코즈, 12.5유니트/㎖ 글루코즈 탈수소효소 및 65mM 케토아이소포론으로 구성된 반응 혼합물 25㎖에 사용하였다. 반응을 90분 동안 실온에서 수행하였다. 반응 혼합물의 pH를 7% 암모늄 용액을 사용하여 7.0보다 높게 조절하였다. 그 결과, 레보다이온 9.5g/ℓ(사용된 케토아이소포론의 95%가 전환됨)가 제조되었다. 생성물의 광학 순도는 키랄 모세관 컬럼, BGB-176(BGB 어낼리틱 아게(BGB Analytik AG)(스위스 소재) 제품)을 사용한 기체 크로마토그래피를 통해 94.6%(거울상이성질체 초과; e.e.)로 분석되었다.

실시예 3

사카로마이세스 세레비시아의 oye 유전자를 갖는 대장균 균주의 세포를 사용한 레보다이온의 제조

상기 실시예 2에서 수득된 각각의 균주 JM109[pKK223-3/OYE2] 및 JM109[pKK223-3]를 암피실린 0.05mg/㎖ 및 카사미노산 2%(w/v)(디프코 래보러토리스(미국 소재) 제품)를 함유한 M9 미니멈 배지(튜브중 5㎖)에 접종하고 37℃에서 배양하였다. 610nm에서의 광학 밀도가 0.4가 되면, 상기 매질에 IPTG(아이소프로필 β-D-싸이오갈락토파이라노사이드)를 첨가하여 농도가 0.01mM이 되게 하고, 추가로 8 내지 10시간 동안 배양을 유지시켰다. 이어서, 박테리아 세포를 원심분리로 수거하고 100mM 칼륨 포스페이트 완충액(pH 7.0) 2㎖에 재현탁시켰다. 이 현탁액을 2개의 분획(각각 1㎖)으로 나누고, 0.37mM(최종 농도, 이후부터 "f.c."로 약칭한다) NAD+, 15단위/㎖(f.c.) 글루코즈 탈수소효소를 사용하거나 사용하지 않고 33mM(f.c.) 케토아이소포론 및 280mM(f.c.) D-글루코즈를 첨가하여 반응을 개시하였다. 반응은 30℃에서 밤새 수행하였다. 반응 혼합물을 에틸아세테이트로 추출하여 레보다이온을 에틸아세테이트층으로 회수하였다. 추출액을 상기 실시예 1에서 기술한 바와 같은 기체 크로마토그래피로 분석하였다. 결과를 하기 표 2에 기재한다.

SEQUENCE LISTING<110> DSM IP ASSETS B.V.<120> Process for producing levodione<130> 21147<160> 15 <170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 33<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> primer OYE2-1 <400> 1 cggtccagat atagaataaa tcatcatatt aag 33 <210> 2<211> 29<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> primer OYE2-2 <400> 2 gaaatggtgc tacaaagtac ggttaacac 29 <210> 3<211> 25<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> primer OYE2-3 <400> 3 ttagaagaat tcatgccatt tgtta 25 <210> 4<211> 25<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> primer OYE2-4 <400> 4 agatttctgc agttaatttt tgtcc 25 <210> 5<211> 21<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> primer PKK223-3(+) <400> 5 gacatcataa cggttctggc a 21 <210> 6<211> 21<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> primer PKK223-3(-) <400> 6 ttatcagacc gcttctgcgt t 21 <210> 7<211> 20<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> primer OYE2-5 <400> 7 ggtatctggt ccgaagaaca 20 <210> 8<211> 21<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> primer OYE2-6 <400> 8 gacacgaggt tcaactagat g 21 <210> 9<211> 30<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> primer OYE3-1 <400> 9 gtacgtactt gatatataca acaactgtag 30 <210> 10<211> 28<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> primer OYE3-2 <400> 10 gctgccctat ataaacaaag atcgagtc 28 <210> 11<211> 25<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> primer OYE3-5 <400> 11 ttagaacaat tgatgccatt tgtaa 25 <210> 12<211> 24<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> primer OYE3-4 <400> 12 agatttctgc agtcagttct tgtt 24 <210> 13<211> 21<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> primer PKK223-3(+) <400> 13 gacatcataa cggttctggc a 21 <210> 14<211> 21<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> primer PKK223-3(-) <400> 14 ttatcagacc gcttctgcgt t 21 <210> 15<211> 20<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> primer OYE3-6 <400> 15 gactgtgcat ctgacagagt 20

Claims

수성 매질 중에서 NADH 또는 NADPH의 존재하에 케토아이소포론을 NADPH 탈수소효소와 접촉시키고, 이 반응 혼합물로부터 생성된 레보다이온을 단리시킴을 포함하는, 케토아이소포론으로부터 레보다이온을 제조하는 방법.
제 1 항에 있어서,

NADPH 탈수소효소가 효소 부류 EC 1.6.99에 의해 정의된 고황효소(old yellow enzyme)인 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

효소가 NADPH 탈수소효소의 제조에 적합한 미생물로부터 수득될 수 있는 방법.
제 3 항에 있어서,

미생물이 사카로마이세스(Saccharomyces), 자이고사카로마이세스(Zygosaccharomyces), 칸디다(Candida), 글루코노박테르(Gluconobacter), 베넥키아(Beneckea) 및 비브리오(Vibrio) 속으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
제 3 항 또는 제 4 항에 있어서,

미생물이 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)인 방법.
제 3 항 또는 제 4 항에 있어서,

미생물이 사카로마이세스 세레비시아 S288C(ATCC 204508), 이의 기능성 등가물, 계대배양물, 돌연변이체 또는 변형체인 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

NADPH 탈수소효소가 사카로마이세스 세레비시아 S288C(ATCC 204508)로부터 유도된 oye2 또는 oye3에 의해 암호화된 고황효소인 방법.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,

반응이 20 내지 40℃의 온도 및 4.5 내지 8.5의 pH에서 수행되는 방법.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,

반응이 25 내지 35℃의 온도 및 5.0 내지 8.0의 pH에서 수행되는 방법.
수성 매질 중에서 NADH 또는 NADPH의 존재하에 케토아이소포론을 NADPH 탈수소효소를 발현하는 형질전환된 미생물 또는 이의 무세포 추출액과 접촉시키고, 이 반응 혼합물로부터 수득된 레보다이온을 단리시킴을 포함하는, 케토아이소포론으로부터 레보다이온을 제조하는 방법.
제 10 항에 있어서,

재조합 미생물이 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)인 방법.
제 10 항 또는 제 11 항에 있어서,

NADPH 탈수소효소가 효소 부류 EC 1.6.99에 의해 정의된 고황효소인 방법.
제 10 항에 있어서,

형질전환된 미생물에 의해 발현된 효소가 사카로마이세스, 자이고사카로마이세스, 칸디다, 글루코노박테르, 베넥키아 및 비브리오 속으로 이루어진 군으로부터 선택된 미생물로부터 유도될 수 있는 방법.
제 10 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,

형질전환된 미생물에 의해 발현된 효소가 사카로마이세스 세레비시아, 바람직하게는 사카로마이세스 세레비시아 S288C(ATCC 204508)로부터 유도되는 방법.
제 10 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,

형질전환된 미생물에 의해 발현된 NADPH 탈수소효소가 사카로마이세스 세레비시아 S288C(ATCC 204508)로부터 유도된 oye2 또는 oye3 유전자에 의해 암호화된 고황효소인 방법.
제 10 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,

반응이 20 내지 40℃의 온도 및 4.5 내지 8.5의 pH에서 수행되는 방법.
제 10 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,

반응이 25 내지 35℃의 온도 및 5.0 내지 8.0의 pH에서 수행되는 방법.
특히 실시예를 참조로 하는, 실질적으로 본원에 기술된 발명.