본 발명의 하나의 양태로서, 전달 소포내에 함유된 하기 화학식의 비타민 E계 항암 화합물을 포함하는 조성물을 세포 증식성 질환의 치료가 필요한 개체에게 전달하는 단계를 포함하는, 세포 증식성 질환의 치료방법이 제공된다. 상기 양태의 모든 양상으로서, 비타민 E계 항암 화합물은 β-토코페롤, γ-토코페롤, δ-토코페롤 또는 2,5,7,8-테트라메틸-[2R-(4R,8R,12-트리메틸트리데실)크로만-6-일옥시)아세트산과 같은 토코페롤일 수 있다. 또한, 비타민 E계 항암 화합물은 α-토코트리에놀, β-토코트리에놀, γ-토코트리에놀, δ-토코트리에놀 또는 토코트리에놀이 풍부한 분획과 같은 토코트리에놀이거나, dl-α-토코페롤, dl-α-토코페롤 아세테이트, dl-α-토코페롤 니코티네이트 또는 dl-α-토코페롤 포스페이트와 같은 합성 비타민 E계 화합물일 수 있다.
이러한 양태로서, 전달 소포는 지질, 나노입자, 미세구 또는 니오좀을 포함하는 리포좀일 수 있다. 리포좀내의 적합한 지질의 대표적 예로는 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포콜린이 있다. 바람직한 예는 리포좀중의 비타민 E계 항암 화합물의 최종 농도가 20.0mg/㎖ 미만인 리포좀이다. 비타민 E계 화합물/전달 소포는 에어로졸 분무, 에어로졸 흡입기, 위광영양, 경구 섭취, 연설 젤 캡슐에 의해 경구적으로, 경피 팻치, 피하 주사, 정맥내 주사, 근육내 주사 또는 복강내 주사를 통해 전달될 수 있다. 바람직한 전달 수단은 젯트 분사기를 통한 리포좀 에어로졸이다.
이러한 양태의 양상으로서, 당해 방법은 전달 소포내에 함유된 항암 약물의 제2 조성물을 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 제2 조성물은 비타민 E계 화합물/전달 소포 조성물 다음에 연속해서 또는 이와 함께 투여할 수 있다. 조성물이 함께 투여되는 경우, 비타민 E계 화합물 및 항암 약물은 동일한 전달 소포내에 함유될 수 있다. 항암 약물의 대표적 예로는 9-니트로캄프토테신, 시스플라틴, 파클리탁셀, 독소루비신 또는 셀레콕시브가 있다.
본 발명의 비타민 E계 항암 화합물은 아폽토시스, DNA 합성 정지, 세포 주기 정지 또는 세포 분화를 포함하는 항증식 효과를 나타낸다. 이러한 양태로서, 항증식 효과의 정량적 및/또는 정성적 분석은 바이오마커(biomarker)를 검출함으로써 측정할 수 있다. 바이오마커의 바람직한 예로는 세포 증식 마커 KI-67이 있다. 대안으로, 면역조직화학 검정이 사용될 수 있다.
본 발명의 비타민 E계 화합물 또는 기타 항암 화합물의 전달을 사용하여 신생물 질환 및 비신생물 질환을 치료할 수 있다. 신생물 질환의 대표적 예로는 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암, 방광암, 폐암, 자궁경부암, 유방암, 전립선암, 고환암, 신경교종, 섬유육종, 망막아세포종, 흑색종, 연조직 육종, 골육종, 결장암, 신장의 암종, 췌장암, 기저세포 암종 및 편평세포 암종이 있다. 비신생물 질환의 대표적 예로는 건선, 양성 증식성 피부 질환, 어린선, 유두종, 재협착, 공피증 및 혈관종이 있다.
본 발명의 방법은 선택된 세포가 정상적인 프로그램화된 세포 사멸 또는 아폽토시스를 진행시키지 못함으로 인해 발병하는 비신생물 질환을 치료하는데 사용할 수 있다. 세포가 사멸하지 못함으로 인해 일어나는 질환 및 질병의 대표적 예로는 자가면역질환이 있다. 자가면역질환은 자가 세포, 조직 및 기관의 면역 세포 파괴를 특징으로 한다. 대표적인 자가면역 질환 그룹으로는 자가면역 갑상선염, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 전신성 홍반성 낭창, 포진성 피부염, 소아지방병증 및 류마티스 관절염이 있다. 본 발명은 자가면역에만 국한되지 않으며, 심혈관 플레이크 형성에 관여하는 염증 과정 또는 자외선 조사 유도성 피부 손상과 같은 면역 성분이 연관된 모든 질병들을 포함된다.
본 발명의 방법은 바이러스 감염으로 인해 나타나는 질병 및 질환을 치료하는데 사용할 수 있다. 바이러스 감염으로 인해 발병하는 질환 및 질병의 대표적 예로는 사람 면역결핍 바이러스(HIV)가 있다. 비타민 E계 화합물이 세포내 아폽토시스성 시그날전달 네트워크에 작용하므로, 본 발명의 비타민 E계 항암 화합물을 함유하는 리포좀 에어로졸과 같은 전달 소포는 사이토킨, 바이러스, 세균, 독소, 중금속 등과 같은 임의의 종류의 외인성 세포 시그날의 시그날형질도입(signal transductio)에 영향을 주는 능력을 지닌다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 비타민 E계 항암 화합물을 내부에 함유하는 비타민 E계 항암 화합물 전달용 소포가 제공된다. 이러한 양태의 양상으로서, 소포는 항암 약물을 추가로 포함할 수 있다. 바람직한 양상으로서, 전달 소포는 비타민 E계 항암 화합물 대 지질의 비가 중량을 기준으로 약 1:3인 리포좀이다. 비타민 E계 항암 화합물, 항암 약물, 소포의 종류 및 전달 방법은 상기에서 기술한 바와 같은 것들일 수 있다.
다음의 정의는 본원에서 기술하는 본 발명의 이해를 돕고자 하는 목적으로 제공된다. 구체적으로 정의되지 않는 임의의 용어는 당해 분야에서 용어의 통상적 의미에 따라 해석되어야 한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "에어로졸", "위관영양", "리포좀", "전달 소포" 및 "소포"란 용어는 소포/리포좀 제제용의 상이한 화학적 조성물 및 이러한 제제의 에어로졸 분산 또는 경구 전달을 위한 상이한 방법론을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "개체"란 용어는 동물 및 사람을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 동종 종양 이식편 성장의 "생물학적 억제성" 또는 "억제"란 용어는 부분적 또는 완전한 성장 억제를 포함하고, 종양 세포 증식이나 성장 속도의 감소도 포함하여 의미한다. 본 발명의 조성물의 생물학적 억제성 용량은 조직 배양시 세포 성장, 동물 및 세포 배양물내의 종양 성장을 비정상적으로 증식시키거나 악성인 표적에 대한 시험 성분의 효과를 평가하거나 또는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 임의의 다른 방법을 사용하여 측정할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "전이의 억제"란 용어는 상기 제공된 데이터에서 1차 부위로부터 다른 기관, 구체적으로는 폐로의 종양 세포 이동의 부분적 또는 완전한 억제를 포함한다. 본 발명의 조성물의 생물학적 전이 억제성 용량은 조직 배양시 세포 성장, 동물 및 세포 배양물내의 종양 성장을 비정상적으로 증식시키거나 악성인 표적에 대한 시험 성분의 효과를 평가하거나 또는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 임의의 다른 방법을 사용하여 측정할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "혈관신생(angiogenesis)의 억제"란 용어는 종양 혈관 형성의 완전한 또는 부분적 억제, 또는 종양에게 혈액을 공급하는 혈관의 능력을 보유한 혈액의 감소를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "프로그램화된 세포 사멸 또는 아폽토시스의 유도"란 용어는 기존의 형태학적 및 생화학적 아폽토시스 특성을 나타내는 세포에 의한 부분적 또는 완전한 세포 사멸을 포함한다. 아폽토시스를 유도하는 본 발명의 조성물의 용량은 조직 배양시 세포 성장, 동물 및 세포 배양물내의 종양 성장을비정상적으로 증식시키거나 악성인 표적에 대한 시험 성분의 효과를 평가하거나 또는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 임의의 다른 방법을 사용하여 측정할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, "DNA 합성 정지의 유도"란 세포가 세포 주기의 GO/G1기, S기, G2/M기에서 차단되도록 처리됨으로 인한 성장 정지를 포함한다. DNA 합성 정지를 유도하는 본 발명의 용량은 조직 배양시 세포 성장, 동물 및 세포 배양물내의 종양 성장을 비정상적으로 증식시키거나 악성인 표적에 대한 시험 성분의 효과를 평가하거나 또는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 임의의 다른 방법을 사용하여 측정할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "세포 분화의 유도"란 용어는 세포가 세포 증식이 일어나지 않는 단계에서 세포 분화를 일으키도록 유도되도록 처리됨으로 인한 성장 정지를 포함한다. 세포 분화를 유도하는 본 발명의 조성물의 용량은 조직 배양시 세포 성장, 동물 및 세포 배양물내의 종양 성장을 비정상적으로 증식시키거나 악성인 표적에 대한 시험 성분의 효과를 평가하거나 또는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 임의의 다른 방법을 사용하여 측정할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "α-TEA"에는 RRR-α-토코페롤의 비가수분해성 에테르 유사체인 RRR-α-토코페롤 에테르-연결된 아세트산 유사체, 즉 RRR-α-토코페릴옥시아세트산으로 약칭될 수도 있는 2,5,7,8-테트라메틸-2-R(4R,8R,12-트리메틸트리데실)크로만-6-일옥시 아세트산이 포함된다.
본원에서는 세포 증식성 질환을 천연 또는 합성 비타민 E계 항암 약물과 지질을 포함하는 리포좀 조성물의 에어로졸 전달을 통해 또는 이러한 리포좀 조성물의 위관영양에 의한 전달을 통해 치료하는 방법이 제공된다. 본 발명의 비타민 E계 화합물은 항증식 효과를 나타내며, 이러한 항증식 효과의 대표적 예로는 아폽토시스, DNA 합성 정지, 세포 주기 정지 또는 세포 분화가 있다. 이러한 화합물은 강력한 항전이 효과를 나타내며, 에어로졸 전달 또는 위관영양과 같은 임상적으로 관련된 경로에 의해 투여될 경우에 생체내에서 정상 세포와 조직에 대한 독성을 나타내지 않는다.
임의로, 리포좀 조성물 중의 또는 복강내 주사와 같은 다른 경로를 통해 전달되는 비타민 E계 항암 약물과, 9-니트로캄프토테신(9NC), 독소루비신, 팍시탁솔, 셀레콕시브 또는 시스플라틴을 포함하나 이에 제한되지 않는 제2 항암 약물은 α-TEA와 함께 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, DNA 복제 동안에 DNA 이본쇄로 전환되는 DNA 일본쇄를 파괴하는 토포이소머라제-1 억제제인 9-니트로캄프토테신은 α-TEA와 상이한 세포 치사 기작을 갖는다. 게다가, 9NC는 비통상적 경로, 즉 CD95/Daxx/JNK/미토콘드리아와 함께 공동 상승작용을 할 수 있는 통상적 CD95/CD95리간드(FADD/카스파제 8) 의존적 아폽토시스 경로[참조: 29]를 활성화시킬 수 있다.
천연 토코페롤 및 토코트리에놀의 유도체는 세포 에스테라제에 의해 가수분해될 수 없으며, 비록 이러한 C6 측쇄로 국한된다 해도 바람직하게는 상기 위치에 아세트산 잔기를 갖는다. 강력한 항암 활성에 요구되는 구조적 성분을 충족시키는 바람직한 화합물은 크로만 헤드의 6번 탄소에 있는 페놀성 산소에 에테르 연결에 의해 연결된 아세트산 잔기에 의해 RRR-α-토코페롤과 구별되는 α-TEA이다. VES는 석신산 잔기가 크로만 헤드의 6번 탄소에 있는 페놀에 에스테르 연결에 의해 연결된다는 점에서 α-TEA와 다르다. 모 화합물인 RRR-α-토코페롤의 항산화 특성이 6번 탄소에 있는 -OH 잔기에 기인하기 때문에, α-TEA의 항종양 특성은 항산화 매개성이 아니다.
본 발명은 치료제로서 사용할 수 있다. 본 발명의 방법은 모든 동물을 치료하는데 사용할 수 있다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 방법은 사람에서 유용하다. 일반적으로, 약리학적으로 효과적인 세포 치사 및 항증식 효과를 달성하기 위해서, 리포좀/항암 화합물 조성물을 임의의 치료학적 유효량으로 투여할 수 있다. 투여되는 용량은 개체의 연령, 질환의 임상 시기 및 정도 또는 유전적 소인, 장소, 체중, 동시 치료의 종류(만약 있다면) 및 병리학적 또는 악성 상태의 성질에 따라 좌우된다. 바람직하게는, 용량은 약 0.1mg/kg 내지 약 100mg/kg이다. 당해 분야의 숙련가는 과도한 실험없이 적절한 용량을 용이하게 측정할 수 있을 것이다.
면역약화된 동물, 예를 들어, 누드 마우스에게 이소성 이식되거나 동소성 이식된 사람 종양 세포의 종양 성장 및 전이에 대한 생체내 연구 또는 널리 인식된 동물 모델을 사용한 생체내 연구는 임상 시험을 위한 임상전 데이타를 제공한다. 이러한 동물 모델로 제한됨이 없이, 이러한 생체내 연구는 세포 증식성 질환의 다른 신생물 및 비신생물 모델에 중점을 둘 수 있다. 예를 들어, 전이성 비에스트로겐 반응성 MDA-MB-435 유방암 세포, 66 cl.4 GFP 세포 또는 시스플라틴 내성 cp-70 사람 난소암 세포를 사용할 수 있다.
기도로의 에어로졸 전달 또는 위관영양을 통한 전달과 같은 개체로의 전달을 위한 리포좀 조성물내에서 추가의 신규한 토코페롤, 토코트리에놀, 및 포화 피틸 또는 불포화 이소프레닐 측쇄의 유도체를 갖거나 갖지 않는 기타 크로만 유도체 또는 이의 유사체의 사용이 구체적으로 고려된다. 이들 분자는 크로만 구조의 R1내지 R5위치의 화학적 작용기화 및 피틸 측쇄와 이소프레닐 측쇄의 화학적 작용기화, 특히 토코페롤 및 토코트리에놀에 기초한 화합물의 화학적 작용기화를 포함한다. 추가로, 크로만 환 산소 및 6-하이드록시 그룹의 산소 대신에 헤테로원자 치환체(N 또는 S)를 갖는 화합물이 고려된다.
리포좀 조성물에서 다른 지질이 사용될 수 있는 것으로도 고려된다. 이들 비타민 E계 항암 화합물 또는 기타 항암 화합물을 포함할 수 있으며 치료학적 투여량을 전달할 수 있는 모든 지질이 적합할 것이다. 에어로졸화 또는 위관영양과 같이 상이한 리포좀에 의한 전달 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 리포좀에 의한 전달을 위한 에어로졸화 및 분무 방법 또는 위관영양에 의한 리포좀 투여 방법을 사용할 수 있다.
α-TEA 또는 기타 유도체화된 토코페롤 또는 토코트리에놀은 니오좀, 미세구 또는 나노입자의 제제에서 사용할 수 있으며 치료학적 용량으로서 에어로졸 흡입 또는 에어로졸 분무를 통해 기도로 전달하거나 위관영양, 국소 적용, 피하, 복강내, 정맥내, 근육내 또는 기타 확립된 투여 방법에 의해 투여할 수 있는 것으로 또한 고려된다. 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니나, 경구 전달용 연질 겔 캡슐내의 α-TEA의 리포좀 또는 나노입자 제형이 사람 화학예방에서 이상적으로 적합할 수 있다. 연질 겔 캡슐로서 경구 투여되는 나노입자 제형은 위장관에 보다 오래 체류하여 보다 많이 흡수될 것이다. 게다가, 나노입자 제형은 흡입에 의한 전달에 유용할 수 있다. 리포좀 또는 나노입자 제제는 팻치와 같은 경피 전달 시스템에서 유용할 수 있다.
다음 실시예는 본 발명의 다양한 구체예를 설명하기 위한 것으로서, 어떤 형식으로든지 본 발명을 제한하는 것이 아니다.
실시예 1
2,5,7,8-테트라메틸-(2R-(4R,8R,12-트리메틸트리데실)크로만-6-일옥시)아세트산(α-TEA)의 합성 및 특성화
대규모화 생산을 위해, α-TEA를 다음과 같이 제조하였다. NaH(5.0g, 124.9mmol)을 무수 THF(300㎖) 속에 현탁시키고, 무수 THF 100㎖ 속에 용해된 α-토코페롤(41.3g, 96.1mmol)을 캐뷸라(cabbula)를 통해 첨가하기 전에 아르곤하에 0℃에서 10분 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 아르곤 압력하에 0℃에서 15분 동안 교반한 다음, 에틸 브로모아세테이트(19.26g, 115.3mmol)를 주사기를 통해 첨가하였다. 반응을 TLC(헥산: 에틸 아세테이트=10:1, Rf=0.65)로 모니터링하고 3.5 시간내에 완료하였다. 반응 혼합물을 CH2Cl2150㎖로 희석시키고, 유기 상이 투명해질 때까지 포화 NaCl 용액(150㎖x3)으로 세척하고, 무수 Na2SO4상에서 건조시키고 용매를 감압하에 제거하였다. 조 생성물은 여전히 소량의 유리 α-토코페롤을 함유하였고, 이를 헥산:에틸 아세테이트(30:1 내지 20:1)을 사용하여 실리카 겔에서 컬럼 크로마토그래피로 제거하여 순수한 생성물 α-TEA 에틸 에스테르(41.6g, 84%)를 수득할 수 있었다.
α-TEA 에틸 에스테르(21.0g, 40.7mmol)를 THF 250ml 속에 용해시킨 다음, 10% KOH 75ml(122.1mmol)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 6시간 동안 교반하였다. 반응을 TLC(CHCl3:MEOH:CH3COOH = 97:2.5:0.5, Rf = 0.18)로 모니터링하고, 물100ml로 급냉시킨다. 용액을 1N HCl을 사용하여 pH 3으로 조정하고, 생성물을 CH2Cl2(100ml x 4)로 추출하고 NaCl 포화 용액으로 세척하고 Na2SO4상에서 건조시키고, 용매를 감압하에 제거하여 최종 생성물 α-TEA을 백색 왁스상 고체(18.5g, 93%)로서 수득하였다. 융점: 54-55℃ ; 분자량: 488.8.
실시예 2
쥐 유선 종양 세포주
66 cl.4-GFP 세포는 본래 Balb/cfC3H 마우스의 자발적 유선 종양으로부터 유도되었고 이후에 6-티오구아닌-내성 클론으로서 분리된 마우스 유선 종양 세포주이다[참조: 20, 21]. 계속해서, 상기 세포를 증강된 녹색 형광 단백질(GFP)로 안전하게 형질감염시켰다. 66 cl.4-GFP 세포는 폐로의 100% 미세전이체로서 매우 전이성이다. 당해 연구에서 사용하기 전에, 세포를 미주리 대학 동물 진단 및 조사 연구실(University of Missouri Research Animal Diagnostic and Investigative Laboratory(RADIL) Columbia, MO)로 보냈고, 여기서 상기 세포는 병원체를 함유하지 않는 것으로 증명되었다.
66 cl.4 GFP 세포를 성장 배지: 10% 태내 송아지 혈청(제조원: FBS, Hyclone Lab, Logan, UT), 100㎍/㎖ 스트렙토마이신, 100 IU/ml 페니실린, 1X(vol/vol) 비필수 아미노산, 1X(vol/vol) MEM 비타민, 1.5 mM 나트륨 피루베이트 및 50㎍/㎖ 젠타마이신(제조원: Sigma Chemical Co. , St. Louis, MO)이 보충된 멕코이(McCoy)배지(제조원: Invitrogen Life Taechnologies, Carlsbad, CA.)에서 단층 배양물로서 유지시켰다. 상기 동일한 보충된 멕코이 배지를 사용하여 처리한 결과, FBS 함량이 5%로 감소된 것으로 추측되었다. 배양물은 미코플라스마 오염이 없음을 확인하기 위해 통상적으로 검사하였다.
실시예 3
DAPI-염색된 핵 아폽토시스의 형태학적 평가에 의한 아폽토시스의 측정
아폽토시스를 이미 공개된 방법[참조: 22]를 이용하여 측정하였다. 간략하게 언급하면, 12-웰 플레이트 중의 1×105세포/웰을 밤새 배양하여 부착되도록 하였다. 이어서, 세포를 실험 배지에서 다양한 농도의 α-TEA 및 비타민 E 석시네이트에서 다양한 시간 간격으로 α-TEA, 비타민 E 석시네이트(Sigma) 또는 에탄올 대조군(0.1% 에탄올 F. C. vol/vol)으로 처리하였다. 처리 후, 부유 세포와 스크래핑된-방출된 유착 세포를 350×g에서 5분 동안 원심분리하고, 포스페이트 완충된 식염수(PBS; 137mM NACl, 2.7mM KCl, 10.4mM Na2HP04, 10.5mM KH2PO4; pH 7.2)로 1회 세척하고 100% 메탄올중의 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 디하이드로클로라이드(DAPI, Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) 2 ㎍/㎖으로 37℃에서 15분 동안 염색시켰다.
세포를 487701 필터를 이용한 자이스 ICM 405 형광 현미경으로 400X 배율로 관찰하였다. 핵이 응축된 염색질을 함유하는 세포 또는 단편화된 핵을 나타내는세포를 아폽토시스성인 것으로 스코어를 매겼다. 데이타는 세포군당 아폽토시스성 세포의 비율, 즉 아폽토시스성 세포의 수/계수된 총 세포의 수로서 보고한다. 3가지의 상이한 현미경 시야를 검사하여, 슬라이드당 계수된 최소 600개의 세포에 대한 각 위치에서 200개의 세포가 계수되었다. 아폽토시스 데이터는 독립적으로 수행된 세 실험에 대해 평균±S.D.로 표현한다.
실시예 4
폴리(ADP-리보스)폴리머라제(PARP) 절단 단편의 웨스턴 면역블롯 검출
폴리(ADP-리보스)폴리머라제(PARP) 절단을 아폽토시스를 검출하기 위한 또 다른 방법으로서 분석하였다. 66 cl.4-GFP 세포를 DAPI 검정에 대해 상기한 바와같이 처리하였다. PBS로 세척한 후, 세포를 4℃에서 30분 동안 용해 완충액(1X PBS, 1% Nonidet P-40,0. 5% 나트륨 데옥시콜레이트, 0.1% 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 1㎍/ml 류펩틴, 1㎍/㎖ 아프로티닌, 1mM 디티오트레이톨(DTT), 2mM 나트륨 오르토바나데이트, 10㎍/㎖ 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF)) 속에 현탁시키고, 와동시키고, 20분 동안 15,000×g로 원심분리하여 상청액을 수집하였다. 단백질 농도를 Bio-Rad(Bradford) 단백질 검정(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)을 사용하여 측정하고 샘플(100㎍/레인)을 7.5% SDS-폴리아크릴아미드 겔상에서 환원 조건하에 전기영동시켜 분해시켰다.
단백질을 전영염(electroblotting)에 의해 니트로셀룰로즈 막(0.2μM 포어 Optitran BA-S-지지된 니트로셀루로즈; Schleicher and Schuell, Keene, NH)으로전이시켰다. 전이 후, 막을 실온에서 45분 동안 차단 완충액[25mM Tris-HCl(pH 8.0), 125mM NaCl, 0.5% Tween-20 및 5% 무수 탈지유]으로 차단시켰다. 1차 래빗트 항-사람 폴리(ADP-리보스) 폴리머라제 항체[PARP(H-250), Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA] 1㎍를 이용하여 면역블롯팅을 수행하고, 양고추냉이 퍼옥시다제-접합된 염소 항-래빗트 면역글로불린을 1:3,000 희석율에서 2차 항체로서 사용하였다(Jackson Immunoresearch Laboratory, West Grove, PA). 세척된 블롯으로부터의 양고추냉이 퍼옥시다제-표지된 밴드를 증강된 화학발광(Pierce, Rockford, IL) 및 자가방사선술(Kodak BioMax film; Rochester, NY)로 검출하였다.
실시예 5
콜로니-형성 검정
66 cl.4-GFP 세포를 35×10mm 조직 배양 플레이트(Nunclon, Rochester, NY)당 600개의 세포로 씨딩하고 유착되도록 37℃에서 밤새 방치하였다. 다음날, 성장 배지를 제거하고, α-TEA를 1.25, 2.5, 5 및 10㎍/㎖로 함유하는 처리 배지, 에탄올 대조군(0.1% 에탄올 F. C. vol/vol) 또는 단독 배지(처리되지 않음)로 교체하였다. 처리군은 배지를 교체하지 않고 10일 동안 세포상에 남겨두었다. 10일 후, 배지를 제거하고, 플레이트를 PBS로 3회 세척하였다. 세포를 PBS 중의 1% 메틸렌 블루로 30분 동안 염색하고, 0.5mm를 초과하는 콜로니를 수동으로 계수하였다.
실시예 6
Balb/c 마우스
6주령의 암컷 Balb/cJ 마우스(25gm 체중)을 잭슨 랩(Jackson Labs, Bar Harbor, ME)으로부터 구입하고, 1주일 이상 적응시켰다. 동물은 오스틴 소재의 텍사스 대학의 동물 자원 센터(Animal Resource Center at the University of Texas)에서 74 ±2°F에서 30 내지 70%의 흡도 및 12시간으로 교대되는 광-암 사이클로 사육하였다. 동물은 케이지당 5마리씩 사육하고 물과 표준 사료를 임의로 공급하였다. 텍사스 대학의 동물 사육과 사용 위원회(University of Texas Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 승인된 바와 같이 사람 처리에 대한 지침을 수행하였다.
실시예 7
종양 세포 접종
66 cl.4-GFP 세포를 트립신으로 처리하여 수거하고, 원심분리하고, 보충물을 함유하지 않는 멕코이 배지에 2×105/100㎕ 밀도로 재현탁시켰다. 마우스는 23게이지 바늘을 이용하여 우측에 있는 제4 및 제5 유두 사이의 점 동일 거리에서 서혜부에 주사하였다.
50마리의 마우스를 모든 그룹의 평균 종양 용적이 밀접하게 일치되도록 에어로졸 처리군, 경구 처리군, 경구 대조군 또는 비처리군으로 분류(그룹당 10마리)하였다. 각 그룹은 종양 세포 접종 후 9일째에 시작되는 처리 시작시에 종양 범위가2×2 내지 4×mm이었다. 종양 세포를 주사하지 않은 10마리의 추가 마우스를 17일 동안 에어로졸 또는 경구 α-TEA(각각 5마리)로 처리하고, 처리를 멈추고, 장기간의 안정성을 평가하기 위해 추가로 11개월 동안 관찰하였다. 종양을 캘리퍼스를 사용하여 격일로 측정하고, 용적을 다음 수학식을 사용하여 계산하였다: 용적(mm3) = [넓이(mm) 2×길이(mm)]/2. 체중은 매주 측정하였다.
실시예 8
위관영양에 의한 전달용 땅콩유속에 가용화된 α-TEA의 제조 및 투여
α-TEA를 100% 에탄올(400mg/ml) 속에 용해시킨 다음, 땅콩유(100% 땅콩유; nSpired Natural Foods, San Leandro, CA)와 1:8(v/v) 비로 혼합하였다. 대조 처리는 α-TEA 처리시에 함유된 바와 동일한 양의 에탄올 및 땅콩유로 이루어졌다. 혼합물을 격렬하게 와동시킨 다음, 사용할 때까지 4℃에서 보관하였다. α-TEA/땅콩유 혼합물을 실온이 되도록 하고 위관영양에 의해 1일마다 100㎕/마우스로 투여하였다. 이는 5mg α-TEA/마우스/일의 최종 농도에 상응한다.
실시예 9
2,5,7,8-테트라메틸(2R-(4R,8R,12-트리메틸트리데실)크로만-6-일옥시)아세트산(α-TEA)을 함유하는 리포좀 조성물의 제조
이미 기술된 방법에 의해 1: 3(w/w)의 α-TEA/리포좀 비가 최적인 것으로 실험적으로 측정되었다[참조: 17]. α-TEA/지질 배합물을 제조하기 위해, 성분들을 먼저 실온이 되도록 하였다. 지질 [1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DLPC); Avanti Polar-Lipids, Inc., Alabaster, AL]을 120mg/ml의 농도로 3급-부탄올(Fisher Scientific, Houston, TX) 속에 용해시킨 다음, 초음파 처리하여 청정한 용액을 수득하였다. α-TEA을 40 mg/ml으로 다시 3급-부탄올 속에 용해시키고 모든 고체가 용해될 때까지 와동시켰다. 이어서, 2개의 용액을 동량(v:v)으로 배합하여 목적하는 1:3 α-TEA/리포좀 비를 달성하고, 와류시켜 혼합하고 -80℃에서 1시간 내지 2시간 동안 동결시키고, 필요할 때까지 -20℃에서 보관하기 전에 무수 분말로 밤새 동결건조시켰다. 각각의 처리 바이알은 75mg의 α-TEA를 함유하였다.
실시예 10
2,5,7,8-테트라메틸-(2R-(4R,8R,12-트리메틸트리데실)크로만-6-일옥시)아세트산(α-TEA)을 함유하는 리포좀의 에어로졸화 및 투여
에어로졸을 미리 기술된 바와 같이 마우스에게 투여하였다[참조: 17]. 간략하게 언급하면, 10L/분의 유속을 생성시키는 공기 압착기(Easy Air 15 Air Compressor; (Precision Medical, Northampton, PA)를 AeroTech II 분무기(CIS-US, Inc. Bedford, MA)와 함께 사용하여 에어로졸을 생성시켰다. AeroTech II 분무기로부터 방출된 α-TEA 리포좀 에어로졸의 입자 크기는 Anderson Cascade Impactor에 의해, 기하표준편차가 2.04으로 평균질량중위직경(NMAD)이 2.01㎛인 것으로 측정되었다. 흡입될 경우에 상기 입자의 약 30%가 마우스의 기도에 침착될 것이며나머지 70%는 발산될 것이다[참조: 17].
분무 전에, α-TEA/지질 분말을 실온이 되도록 한 다음, 증류수 3.75ml를 첨가하여 재구성함으로써 20mg/ml α-TEA의 목적하는 최종 농도를 달성한다. 혼합물을 주기적 간격으로 와동시키면서 실온에서 30분 동안 팽윤되도록한 다음, 분무기에 첨가하였다. 상기 α-TEA 제형은 위관영양에 의해 α-TEA 4mg/0.1ml의 수준으로 경구 투여할 수 있다. 마우스를 안전 후드내에 상부가 밀봉된 플라스틱 케이지(7 x 11 x 5 in. )에 넣었다. 일방 압력 방출 벨브를 사용하여 에어로졸을 한쪽 말단의 1cm 아코디언 튜크를 통해 케이지에 도입되고 반대편 말단으로 방출되도록 하였다. 동물을 모든 α-TEA/리포좀이 에어졸화 될 때까지, 약 15분 동안 에어로졸에 노출시켰다.
실시예 11
리포좀내로 혼입된 α-TEA의 특징적 에어로졸
HPLC 분석을 올 글래스 집진장치(All Glass Impinger, Ace Glass Co., Vineland, NJ)내에서 에어로졸로부터 회수된 α-TEA 리포좀에 대해 수행하였다. 전달된 용량 = 농도(㎍/L) x 마우스 분 용적(1-분/kg) x 전달 기간(min) x 추정된 침착된 분획(30%; 17). 상기 수학식에 기초하여, 본 발명자들은 α-TEA 약 36㎍이 각 날마다 각 마우스의 기도에 침착되었을 것으로 추정하였다(316.2㎍ g/L x 1분/kg x 15분 x 0.30 = 1,422.9 ㎍ g/kg/일).
실시예 12
종양에서 α-TEA의 HPLC 분석
종양을 부검 중에 떼어내고 각 종양의 절반을 액체 질소 중에서 급속 냉동시킨 다음, HPLC 분석을 수행할 때까지 -70℃에서 보관하였다. 종양을 균질화시키고 지질을 헥산 추출하여 HPLC 분석용으로 처리하였다. 간략하게 언급하면, 칭량한 종양을 5ml들이 5개 내지 7개의 킴블(Kimble) 고체 유리 비드(4mm), 수중 1ml 1% SDS, 1 내지 2ml 100% 에탄올 및 1ml 헥산과 함께 1회용 원뿔형 바닥 튜브(제조원: Sarstedt, Newton, NC)에 놓았다. 이어서, 샘플을 Crescent Wig-L-Bug(모델 3110B Densply International, Elgin, IL)을 이용하여 각각 1분씩 2회 혼합하였다. 이어서, 샘플을 5분 동안 1,000rpm으로 원심분리하고, 유기 층을 수집하고 수성 층을 헥산과 다시 혼합하고, 와동시키고 원심분리하고, 유기 층을 질소하에 건조시키기 전에 2회 처리하였다. 샘플을 즉시 사용하였다. 토코페롤 에테르 유사체의 역상 HPLC 분석과 형광측정 검출을 문헌[참조: Tirmenstein, M. A. , et al. (23)]에 기술된 바와 같이 수행하였다.
실시예 13
폐 및 림프절 전이
5개의 폐엽내의 전이성 병소를 희생시에 육안으로 계수하였다. 좌측 폐엽과 림프절내의 형광성 녹색 미세전이성 암 세포 콜로니를 20 x 대물렌즈(200 x 배율)가 장착된 니콘 형광 현미경(TE-200)과 상기 현미경과 관련된 Image-Pro Plus (버전 4.1 ; Media Cybernetics, Silver Spring, MD) 소프트웨어를 사용하여 계수하였다. 형광성 병소를 다음의 3가지 크기의 그룹으로 분류하였다: <5㎛, 5 내지 10㎛ 및 >10㎛.
실시예 14
생체내에서 아폽토시스를 검출하기 위한 TUNEL 검정
종양 조직의 탈파라핀화된 절편(5㎛)을 제조업자의 지시에 따라 ApopTag 반응계내 아폽토시스 검출 키트(제조원: Intergen, Purchase, NY)에 공급된 시약을 사용하여 아폽토시스를 평가하는데 사용하였다. 갈색으로 염색된 핵을 아폽토시스에 대해 양성인 것으로 스코어를 매겼으며, 청색으로 염색된 핵을 음성인 것으로 스코어를 매겼다. 16가지 이상의 400X 현미경 시야를 종양당 스코어화하였다. 데이타는 각 그룹으로부터의 3가지 별개의 종양에서 계수된 아폽토시스성 세포 수의 평균±S.E로 표현하였다. 종양 조직의 사진은 1000X 배율로 촬영하였다.
실시예 15
종양 조직에 대한 H&E 염색
종양을 10% 중성 완충된 포르말린으로 고정시키고 표준 조직화학 과정에 따라 파라핀 속에 매봉시켰다. H&E 염색된 5㎛ 두께의 절편을 사용하여 종양의 형태를 검사하였다.
실시예 16
66 cl.4-GFP 세포의 조직학적 평가
쥐 유선 종양 세포는 유사분열 지수가 높은 거의 분화되지 않은 방추 세포 암종으로서 특성화되었다.
실시예 17
통계학적 분석
통계학적 분석은 프리즘 소프트웨어 버전 3.0(제조원: Graphpad, San Diego, CA)을 사용하여 수행하였다. 실험을 위한 동물의 마릿수는 배율 계산으로 결정하였다. 동물 체중 및 종양 용적은 스튜던트 t검정(student t-test)으로 분석하였다.
실시예 18
천연 및 합성 토코페롤, 토코트리에놀 및 유도체의 항암 특성의 평가
balb/c 마우스에게 몸체의 우측에 있는 제4 및 제5 유두 사이의 유선 지방 패드 영역에 200,000 66 cl.4 GFP 세포를 피하 주사하였다. 주사한지 9일 후, 동물을 0.5×0.5 mm 내지 1×2 mm 범위의 유사한 크기의 종양을 갖는 그룹(그룹당 10마리)으로 분류하였다. 동물을 19일 또는 21일 동안 에어로졸 전달에 의해 천연 알파 및 감마 토코페롤, 천연 α-토코트리에놀, 토코트리에놀이 풍부한 분획(TRF; 상기 분획은 약 32% α-토코페롤, 20% 알파 토코트리에놀, 31% 감마 토코트리에놀및 12% 델타-토코트리에놀을 함유한다; 참조: Gould, M. N. (30)), 합성 dl-α-토코페롤 및 합성 유도체 dl-α- 토코페롤 아세테이트의 리포좀 제형으로 처리하였다. 동물에게 1일마다 각 동물에게 각 화합물 36㎍을 전달하는 분무를 통해 각 화합물 75mg을 투여하였다. 동물은 격주로 촉진하였고 용적은 (w2×1)/2로 계산하였다.
RRR-γ-토코페롤 및 dl- α-토코페롤에 대한 데이타만 제시한다(도 2). 에어로졸에 의해 전달되는 dl- α 토코페롤 리포좀 제형은 치료 15일째 및 17일째에 66 cl.4 GFP 세포의 성장을 각각 81% 및 73%까지 현저하게 억제하였다. dl-α- 토코페롤만큼 효과적이지 않다해도, dl-α-토코페롤 아세테이트, RRR-δ-토코페롤, RRR-α-토코트리에놀, 토코트리에놀 풍부 분획(TRF)은 종양 성장을 15일째에 각각 29, 25, 34 및 25%까지 억제하였으며, 17일째에 각각 57, 40, 27 및 40%까지 억제하였다.
에어로졸에 의해 전달되는 RRR-α-토코페롤 및 RRR-γ-토코페롤 리포좀 제제는 종양 성장을 증강시켰다. 종양 용적으로 측정되는, RRR-α-토코페롤에 의한 종양 성장의 증강은 대조군에서의 종양 성장에 비해 현저하게 크진 않았지만, RRR-γ-토코페롤을 투여한 마우스의 종양 용적은 대조 마우스의 종양 용적에 비해 현저하게 컸다(도 2).
표 2에는 이러한 비타민 E 또는 이의 유도체의 리포좀 제형을 사용한 경우에 가시적 폐 전이의 억제율(%)을 제시되어 있다. 상기 데이타는 에어로졸에 의해 전달되는 dl-a-토코페롤 리포좀 제형이 가시적 폐 전이성 병소를 대조군에 비해 현저하게 감소시킴을 보여준다.
가시적 폐 전이
처리 |
동물 |
억제율(%) |
대조군 |
1.7 |
0 |
dl-a-토코페롤 |
0.1 |
94** |
dl-a-토코페롤 아세테이트 |
0.3 |
82 |
RRR-델타-토코페롤 |
0.3 |
82 |
RRR-α-토코페롤 |
1.7 |
0 |
RRR-γ-토코페롤 |
1.15 |
32 |
RRR-α-토코트리에놀 |
0.4 |
77 |
TRF |
1.0 |
41 |
대조군에 비해서 현저하게 증강됨 |
에어로졸에 의해 전달되는 dl-α-토코페롤 리포좀 제형으로 처리된 마우스로부터의 종양 절편의 면역조직화학 분석은 이러한 형태의 비타민 E가 종양 혈관 수를 감소시킴으로써 종양 성장을 51%까지 억제하고, 아폽토시스를 44%까지 유도하며 세포 분화를 33%까지 감소시켰음을 나타낸다. 표 3에는 에어로졸에 의해 전달되는 dl-α-토코페롤 리포좀 제형이 66 cl.4-GFP 종양의 성장을 억제하는 기작이 기재되어 있다.
dl-α-토코페롤 리포좀에 의한 종양 억제 기작
처리 |
CD31 혈관 수/영역 |
TUNEL 양성 아폽토시스성 세포/영역 |
KI67 증식 억제율(%) |
대조군 |
227 |
1.4 |
60 |
dl-α-토코페롤 |
112 |
2.5 |
40 |
감소율(%) |
51% |
--- |
33% |
증가율(%) |
--- |
44% |
--- |
추가로, 이식가능한 동계 마우스 유선암 모델에서 α-TEA의 작용 기작의 분석은 α-TEA가 세포 분화를 감소시키고 아폽토시스를 유도함을 보여준다. 보다 구체적으로는, 면역조직화학으로 검출된 분화 바이오마커 KI-67의 평균 값은 대조군에 비해 56%까지 현저하게 감소되었으며, TUNEL 면역조직화학으로 측정된 평균 아폽토시스 값은 대조군에 비해 30%까지 현저하게 증가되었다(비공개된 데이타). 따라서, 이러한 대용 마커는 α-TEA의 화학예방 효능을 정략적으로 및/또는 정성적으로 측정하기 위한 바이오마커로서 적절한 것으로 고려된다.
실시예 19
VES 및 α-TEA는 생체내 66 cl.4 GFP 세포에서 아폽토시스를 유도한다
이전의 연구는 비타민 E 석시네이트가 유방암을 포함하는 다수의 사람 암 세포주에서 강력한 아폽토시스 유도인자임을 나타낸다. 비교 목적으로, 본 발명자들은 α-TEA 유도된 아폽토시스의 시험관내 분석에 비타민 E 석시네이트를 포함시켰다. balb/c 유선 암 66 cl.4-GFP 세포를 비타민 E 석시네이트 또는 α-TEA로 처리하고, 아폽토시스를 DAPI 염색된 세포의 형태학적 분석을 이용하여 응축된 핵과 단편화된 DNA에 대해 측정하였다.
10㎍/㎖ α-TEA 또는 비타민 E 석시네이트로 3일 동안 처리된 66 cl.4-GFP 세포로부터의 핵은 아폽토시스의 특징인 응축 및 단편화된 DNA를 나타낸 반면, 비처리된 세포로부터의 핵은 이러한 특징들을 나타내지 않았다(도 3A). 3일 동안 2.5, 5, 10 및 20㎍/㎖ α-TEA 또는 비타민 E 석시네이트로 처리된 66 cl.4 GFP 세포는, α-TEA의 경우 5, 6, 34, 및 50% 아폽토시스 및 비타민 E 석시네이트의 경우에는 3, 5, 16 및 34%의 용량 의존적 아폽토시스를 나타냈다(도 2B). 비처리된 VEH 및 ETOH 대조군은 각각 2, 2 및 3%의 아폽토시스 배경 수준을 나타냈다(도 3B).
α-TEA는 시간 의존적 방식으로 아폽토시스를 유도하는 것으로 나타났다. 2 내지 5일 동안 10 ㎍/㎖ α-TEA로 처리된 66 cl.4 GFP 세포는 각각 20, 35, 47, 및 58% 아폽토시스를 나타냈다(도 3C). 아폽토시스의 유도는 66 cl.4-GFP 세포를 5, 10 및 20㎍/ml α-TEA로 48시간 동안 처리한 후에 PARP 절단의 존재로 확인하였다(도 3D). PARP의 84kDa 절단 단편은 10 α-TEA 및 20㎍/㎖ α-TEA 처리 둘다에서 명백한 반면에, 5㎍/㎖ α-TEA로 처리된 세포 또는 비처리된 대조 세포에서는 완전한 PARP 단백질만이 검출되었다(도 3D).
실시예 20
시험관내에서 α-TEA에 의한 아폽토시스 유도
α-TEA가 66 cl.4-GFP 종양 세포 성장을 아폽토시스 유도를 통해 억제함을 보여주는 시험관내 데이타의 견지에서, 각각의 리포좀 α-TEA/에어로졸 처리군 및 에어로졸 대조군으로부터의 3가지 종양을 5㎛ 종양 절편의 TUNEL 염색을 사용하여 아폽토시스에 대해 검사하였다. α-TEA로 처리된 마우스로부터의 종양은 평균 ±S.E가 2.04±0.23 아폽토시스성 세포/시야인 반면에, 에어로졸 대조 마우스로부터의 종양은 평균 ±S.E가 0.67±0.15 아폽토시스성 세포/시야(p < 0.03 ; 도 4A)였다. 리포좀 α-TEA 에어로졸 처리된 마우스 및 대조 처리된 마우스로부터의 종양 절편내의 양성 염색된 아폽토시스성 세포는 도 4B에서 볼 수 있다.
실시예 21
α-TEA는 66 cl.4-GFP 클로날 성장을 억제한다
1.25, 2.5 및 5㎍/㎖에서 α-TEA는 EtOH 대조군과 비교하여 콜로니 형성을 30, 85 및 100%까지 감소시켰다(도 5). 비처리된 대조군(데이타는 제시하지 않음) 및 EtOH 대조군은 각각 평균적으로 146±11 S. D. 및 140±22 S. D. 콜로니었다. 1.25 및 2.5㎍/㎖에서 α-TEA로 처리한 세포들은 평균적으로 각각 98±20 S. D. 및 21±6 S. D. 콜로니였다. 세포를 5㎍/㎖(도 5) 또는 10㎍/㎖에서 α-TEA로 처리한 경우에는 콜로니가 형성되지 않았다.
실시예 22
체중에 미치는 α-TEA 리포좀 에어로졸 처리의 효과
그룹당 10마리의 balb/c 마우스(4개 그룹, 총 40마리 마우스)에 0일째에 상기 기술한 바와 같이 200,000 66 cl.4 GFP 세포를 접종하였다. 종양 접종한지 9일 후, 처리군은 다음과 같이 개시하였다: 에어로졸 처리(TX)= 23일째까지 매일 α-TEA 리포좀(5mg/마우스/일)의 에어로졸 전달. 에어로졸 대조군= 23일째까지 매일 리포좀 조성물만의 에어로졸 전달. 위관영양 처리= 23일째까지 매일 에탄올/땅콩유 중 5mg/마우스의 α-TEA의 위관영양 투여. 위관영양 대조군= 23일째까지 에탄올/땅콩유만을 위관영양 투여. 마우스를 처리 개시(9일째)시에 칭량한 다음, 13일, 16일, 20일 및 23일째에 칭량하였다(도 6). 데이타는 평균 +/-표준편차로서 표현한다. 네 그룹간에 유의적 체중 차이는 없다.
실시예 23
혈청 및 조직 수준에 미치는 α-TEA 리포좀 에어로졸 처리의 효과
8마리의 마우수를 폐 에어로졸 전달을 통해 리포좀 6ml 중의 α-TEA 40mg(5mg/마우스)으로 처리하였다. 마우스는 전달이 완료될 때까지 30분에 걸쳐서 에어로졸을 흡입하였다. 마우스를 처리가 종결된지 0, 2, 6 또는 2시간 후에 희생시켰다. α-TEA의 혈청 및 조직 수준은 HPLC 분석으로 측정한다(도 7). 첫번째 희생(0시간째)시에, α-TEA는 위 조직에서만 발견되었다. α-TEA는 처리 완료 후 2시간째에 희생된 마우스의 혈청 및 위내에 존재한다. α-TEA는 처리 완료 후 6시간째에 간 및 위내에 존재한다. α-TEA는 처리 완료 후 24시간째에 간 및 위내에 존재한다.
실시예 24
종양 중량에 미치는 α-TEA 리포좀 에어로졸의 효과
마우스에게 0일째에 상기한 바와 같이 200,000 66cl.4 GFP 쥐 유선 종양 세포를 주사하였다. 처리는 종양의 크기가 1 내지 3mm에 도달하는 경우, 9일째에 개시한다. α-TEA 리포좀(5mg α-TEA/마우스)의 에어로졸 처리는 16일 동안 매일실행한다(도 8). 데이타는 대조군 및 처리군에 대한 평균 +/- 표준오차(SE)( N=10 마우스)를 나타낸다. 처리 개시 후 25일째, 16일째에 희생시에, 에어로졸 α-TEA 리포좀 처리군의 종양 크기는 단독의 에어로졸 대조군의 종양 크기에 비해 61%가 작다.
실시예 25
리포좀 α-TEA/에어로졸 처리는 balb/c 마우스에서 66 cl.4-GFP 종양 성장을 억제하고 폐 미세전이체를 감소시켰다
balb/c 마우스에게 몸체의 우측에 있는 제4 및 제5 유두 사이의 서혜부에 2×105개 66 cl.4-GFP 세포를 피하 주사하였다. 종양이 2 x 2 내지 4 x 4 mm (종양을 주입한지 9일 후)에 도달한 경우, 마우스를 각 그룹의 평균 종양 용적이 밀접하게 일치되도록 5개의 그룹(그룹 1: 비처리된 대조군, 그룹 2: 리포좀/에어로졸 대조군, 그룹 3: 리포좀 α-TEA 에어로졸 처리군, 그룹 4: 땅콩유/위관영양 대조군, 그룹 5: 땅콩유중 α-TEA/위관영양 처리군; 10마리 마우스/그룹)으로 분류하였다. 매일의 처리는 종양 주사후 9일째에 개시하였다.
리포좀 α-TEA/에어로졸 처리군의 평균 종양 용적은 에어로졸 대조군과 비교하여, 처리 9, 11, 13, 15 및 17일째에 각각 23, 41, 50, 67 및 61%까지 감소되었다(도 9A). 희생시, 폐를 떼어내어 전이성 병소에 대해 육안으로 검사하고 형광에 의한 미세전이체의 분석을 위해 동결시켰다. 가시적 종양이 α-TEA 처리군에서는 나타나지 않은 반면, 비처리된 대조군 및 에어로졸 대조군은 표 4에 제시한 바와같이 각각 3.25±1.7 및 4.25±0.5 가시적 종양/폐 전이를 나타냈다.
니콘 형광 현미경 및 Image-Pro Plus 소프트웨를 사용하여 녹색 형광 미세전이체를 측정할 수 있었으며, 이는 <5㎛, 5 내지 10㎛ 및 >10㎛의 3가지 크기 그룹으로 분류되었다. 이러한 분석은 에어로졸 대조군 및 비처리된 대조군과 비교하여 α-TEA 처리군에서 모든 3가지 크기의 종양 전이가 매우 현저하게 감소되었음을 나타낸다(도 9B). α-TEA 처리군의 미세전이체의 평균 수(11.4±3.5 S. E.; N= 8)는 에어로졸 대조군(60.0±1 5 S. E.; N = 10)과 비교하여 81%까지 감소되었다 (p <0.2). 비처리된 대조군(N = 10)에 비해 에어로졸 그룹의 미세전이체의 수가 감소되었다 해도(60±15.2 S. E. 대 101.7±17.0 S. E.; p <0.9), 이들 두 그룹내에서 마우스 간의 미세전이체 수의 범위가 크기 때문에 차이는 유이적인 것으로 고려되지 않았다(도 9B).
Balb/c 마우스에서 66-cl.4-GFP 유선 암세포 폐 전이
처리 |
가시적 폐 전이를 갖는 동물의 수/그룹b |
가시적 폐 종양 초점/동물b |
처리하지 않음 |
4/10 |
3.25±1.7 |
에어로졸/리포좀 대조군 |
4/10 |
4.25±0.5 |
에어로졸/리포좀/α-TEA |
0/10 |
0 |
a모든 처리군의 각 동물에 대한 모든 5개 폐엽내의 전이성 병소는 희생시에 육안으로 계수되었다.b데이타는 두 대조군에서 4마리의 폐 전이 보유 동물에서 관찰된 가시적 폐 종양 초점의 평균 ±S.D.으로서 표현한다. |
실시예 26
65 cl.4 GFP 종양 성장에 대한 에어로졸화를 통해 전달되는 α-TEA 및 비타민 E 석시네이트(VES) 리포좀의 비교
balb/c 마우스에게 몸체의 우측에 있는 제4 및 제5 유두 사이의 유선 지방 패드 영역에 200,000 66 cl.4 GFP 세포를 피하 주사하였다. 주사한지 9일 후, 동물을 0.5×0.5 mm 내지 1×2 mm 범위의 유사한 크기의 종양을 갖는 그룹(그룹당 10마리)으로 분류하였다. 동물을 21일 동안 주마다 7일 동안 에어로졸을 통해 리포좀 중의 α-TEA, 리포좀 중의 비타민 E 석시네이트 또는 단독의 대조 리포좀으로 처리하였다. 동물에게 1일마다 분무를 통해 75mg 화합물을 투여하여, 각 동물에게 1일마다 화합물 36㎍이 투여되도록 하였다. 동물을 격일로 촉진하였고 용적을 (w2×l)/2로서 계산하였다. α-TEA 리포좀 에어로졸은 15, 17, 19 및 21일째에 종양 성장을 각각 64, 76, 69 및 67%까지 억제하였다(값은 17, 19 및 21째에 α-TEA 및 대조군 간에 통계학적으로 유의적으로 상이하였으며, p는 각각 0.03, 0.048 및 0.03). VES 리포좀 에어로졸은 15, 17, 19 및 21일째에 종양 성장을 각각 76, 76, 69 및 68%까지 감소시켰다(도 10). 값은 17일째 및 21일째에 비타민 E 석시네이트 및 대조군 간에 통계학적으로 유의적으로 상이하였으며, p는 각각 0.029 및 0.029이다).
실시예 27
종양 중량에 미치는 α-TEA의 위관영양 전달의 효과
위관영양에 의한 α-TEA의 전달은 종양 부위에서 66 cl.4 GFP 쥐 유선 종양 세포의 성장을 방지하는데 있어 비효과적이었다(도 11). 각 마우스의 우측에 있는 제4 및 제5 유두 사이에 200,000 66 cl.4 GFP 세포를 주사한 후 9 내지 21일째에 종양의 크기를 측정하였다. 처리는 종양 접종 후 9일째에 개시하였다. 각 그룹은 n=10 +/-SE로 이루어진다. 위관영양 처리군= 에탄올 및 땅콩유(0.1㎖ 용적) 중의 α-TEA 5mg의 처리는 종양 접종 후 9일째에 시작하여 매일 실행하고 21일째까지 지속한다. 위관영양 대조군= 마우스에게 종양 접종 후 9일째에 땅콩유 및 단독의 에탄올(0.1㎖ 용적)을 매일 투여하기 시작하여 21일째까지 지속한다. 데이타(종양 크기)는 9, 11, 13, 15, 17, 19 및 21째에 대한 평균 +/- 표준 오차로서 표현한다. 모든 시점에서 대조군 및 위관영양/α-TEA 처리군 간의 종양 중량에 있어 유의적 차이는 없었다.
실시예 28
위관영양에 의한 α-TEA의 전달은 접종 부위에서 종양 성장을 감소시키지 않았지만, 폐 미세전이체는 감소시켰다
리포좀 α-TEA/에어로졸 처리군과 대조적으로, 5mg/일 마우스의 α-TEA EtOH/땅콩유 제형을 위관영양에 의해 투여한 마우스로부터의 평균 종양 용적은 위관영양 대조군의 평균 종양 용적과 상이하지 않았다( 도 12A). 그러나, 위관영양에 의한 α-TEA의 투여는 폐 종양 미세전이체의 수를 68%까지 감소시켰다. 3가지 크기 그룹화(< 5㎛, 5 내지 10㎛, >10㎛)에 기초한 미세전이체의 수는 위관영양에의해 α-TEA를 투여한 마우스의 경우 6.8±1.5, 11.3±1.8 및 3.1±1.2 S. E.인 반면에, 대조 마우스의 미세전이체는 각각 27.9±9.0, 29.2±6.3 및 8.4±1.5 S. E.이었다(도 12B).
처리군 또는 대조군 중 어떠한 그룹 간에도 평균 체중의 차이는 관찰되지 않았다(데이타는 제시하지 않음). 17일 동안 에어로졸/α-TEA 또는 위관영양으로 처리한 다음 장기간의 효과를 평가하기 위해 11개월 동안 보관한, 종양을 보유하지 않은 마우스는 α-TEA 처리의 어떠한 부작용도 나타내지 않았다.
에어로졸에 의한 α-TEA의 투여가, 위관영양에 의해 투여된 α-TEA가 대조 마우스의 종양 크기와 비교하여 접종 부위에서 종양 크기를 감소시키지 않았다는 점에서 위관영양에 의한 투여보다 우수하였다 해도, α-TEA가 위관영양에 의해 투여된 경우에 대조군에 비해서 폐 미세전이체의 수가 감소되었다는 사실은 중요하다. 이는 α-TEA가 생이용성임을 제시한다. α-TEA가 비가수분해성이고 위관영양에 의해 전달된 경우에 효과적인 항암제인 것으로 예상되기 때문에, 5mg/㎖/일/마우스로 투여된 α-TEA가 소화관을 통한 흡수율이 낮기 때문에 종양 접종 부위에서 종양 성장을 감소시키는데 있어 효과적이지 않았던 것으로 고려된다. 따라서, 낮은 수준의 α-TEA가 확립되는 폐 종양 초점을 방지하는데 있어 효과적일 수 있을 것으로 추가로 고려된다.
실시예 29
66 cl.4 유선 종양의 종양 성장 및 폐 및 림프절 전이의 α-TEA/위관영양,리포좀 α-TEA/위관영양 및 리포좀 α-TEA/에어로졸 억제의 비교
폐 미세전이체를 억제하는데 있어 효과적이다 해도, 위관영양에 의해 투여된 α-TEA/EtOH/땅콩유 제형은 이식가능한 동계 유선 암 동물 모델에서 종양 성장을 억제하지 않았다. 그러나, 위관영양에 의해 1일 2회 6mg α-TEA/일로 경구 투여된 α-TEA/리포좀 제형은 암컷 balb/c 마우스에서 암 성장 뿐만 아니라 66 cl.4 balb/c 유선 종양 세포의 전이를 예방하기 위한 효과적인 전달 방법이다. 위관영양에 의해 전달되는 α-TEA의 리포좀 제형은 70%까지 종양 성장을 억제하였으며 림프절 전이를 59% 및 56%까지 억제하였다. α-TEA 36㎍가 1일마다 마우스의 폐에 침착되는 것으로 추정하였다. α-TEA/리포좀 제형 또는 α-TEA/EtOH/땅콩유 제형이 위관영양에 의해 투여되는 경우에 조직내에 침착된 α-TEA의 양은 알지 못한다. 처리 섭생의 항암 효과의 비교는 하기 표 5에 제시한다.
66 cl.4 BALB/C 유선 종양 세포의 종양 성장 및 전이의 방지에 있어 α-TEA 제형 및 투여방법의 비교
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억제율(%) |
제형 |
전달방법 |
α-TEA 농도(마우스당) |
종양 성장 |
폐 전이 |
림프절 전이 |
리포좀 |
위관영양 |
3mg/2Xd |
70% |
59% |
56% |
리포좀 |
에어로졸 |
5mg/d |
70% |
81% |
94% |
EtOH/땅콩유 |
위관영양 |
5mg/d |
0% |
62% |
시험되지 않음 |
실시예 30
66 cl.4 GFP 종양 성장에 대한 위관영양을 통해 전달되는 α-TEA 및 비타민E 석시네이트 리포좀의 비교
위관영양에 의해 경구 전달되는 α-TEA 리포좀 제형은 balb/c 마우스에게 이식된 쥐 유선 암 세포의 성장을 억제하였다. 위관영양에 의해 전달되는 비타민 E 석시네이트 리포좀 제형은 balb/c 마우스에게 이식된 쥐 유선 암 세포의 성장을 억제하지 않았다. balb/c 마우스에게 몸체의 우측에 있는 제4 및 제5 유두 사이의 유선 지방 패드 영역에 200,000 66 cl.4 GFP 세포를 피하 주사하였다. 주사한지 9일 후, 동물을 0.5×0.5 mm 내지 1×2 mm 범위의 유사한 크기의 종양을 갖는 그룹(그룹당 10마리)으로 분류하였다. 동물을 21일 동안 주마다 7일 동안 1일 2회 경구 위관영양을 통해 리포좀 중의 α-TEA, 리포좀 중의 비타민 E 석시네이트 또는 단독의 대조 리포좀으로 처리하였다. 동물에게 1일마다 화합물 총 6mg을 투여하였다. 동물을 격일로 촉진하였고 용적을 (w2×l)/2로서 계산하였다. α-TEA 리포좀 위관영양은 15, 17, 19 및 21일째에 종양 성장을 각각 85, 85, 80 및 70%까지 억제하였다(값은 15, 17 및 19째에 α-TEA 및 대조군 간에 통계학적으로 유의적으로 상이하였으며, p는 각각 0.03, 0.039 및 0.029이다). VES 리포좀 위관영양은 종양 성장을 감소시키지 않았다(도 13).
실시예 31
리포좀 α-TEA 위관영양 처리는 66 cl.4-GFP 림프절 및 폐 미세전이체를 감소시켰다
balb/c 마우스에게 몸체의 우측에 있는 제4 및 제5 유두 사이의 유선 지방 패드 영역에 200,000 66 cl.4 GFP 세포를 피하 주사하였다. 주사한지 9일 후, 동물을 0.5×0.5 mm 내지 1×2 mm 범위의 유사한 크기의 종양을 갖는 그룹(그룹당 10마리)으로 분류하였다. 동물을 21일 동안 주마다 7일 동안 1일 2회 경구 위관영양을 통해 리포좀 중의 α-TEA, 리포좀 중의 비타민 E 석시네이트 또는 단독의 대조 리포좀으로 처리하였다. 동물에게 1일마다 화합물 총 6mg을 투여하였다. 희생시, 각 마우스의 좌측 폐엽을 급속 동결시키고, 형광 현미경을 통해 GFP를 발현하는 미세전이성 병소를 검출하기 위해 보관하였다.
위관영양을 통해 α-TEA 리포좀 제형을 투여한 동물은 대조군에 비해 미세전이성 폐 병소의 현저한 감소를 나타냈다(각각 21.5/폐 대 52.7/ 폐). 위관영양을 통한 비타민 E 석시네이트 리포좀 제형은 폐 전이에 영향을 미치지 않았다(도 14A). 희생시, 림프절을 수집하고 미세전이성 페 병소를 관찰하였다. 위관영양을 통해 α-TEA를 투여한 동물은 대조군에서의 7.1±1.7 미세전이성 병소에 대해 평균적으로 3.1±0.8 미세전이성 병소를 갖는 림프절을 나타냈다(p=0.036). 위관영양을 통한 비타민 E 석시네이트는 미세전이성 폐 병소를 감소시키는데 효과적이지 않았다(도 14B).
실시예 32
리포좀 α-TEA 위관영양 처리는 생체내에서 MDA-MB-435 유방암 세포의 종양 성장을 감소시켰다
Nu/Nu 비흉선 누드 마우스에게 몸체의 우측에 있는 제4 및 제5 유두 사이의 유선 지방 패드 영역에 1.0×106개의 MDA-MB-435 GFP FL 세포를 피하 주사하였다. 주사한지 8일 후, 동물을 0.5×0.5 mm 내지 1×2 mm 범위의 유사한 크기의 종양을 갖는 그룹(그룹당 10마리)으로 분류하였다. 동물을 21일 동안 주 7일 동안 1일 2회 경구 위관영양을 통해 리포좀 중의 α-TEA 또는 단독의 대조 리포좀으로 처리하였다. 동물은 1일마다 8mg 화합물이 공급된다. 동물을 격일로 촉진하였고 용적을 (w2×l)/2로서 계산하였다. α-TEA 리포좀 위관영양은 27, 29, 31, 33 및 35일째에 종양 성장을 각각 68, 75, 78, 79 및 79%까지 감소시켰다(도 15). 값은 33 및 35일째에 α-TEA 및 대조군 간에 통계학적으로 유의적으로 상이하였다(p는 각각 0.045 및 0.03이다)
실시예 33
에어로졸 리포좀/α-TEA + 9NC 배합물에 의한 balb/c 마우스에서의 66 cl.4-GFP 종양의 종양 성장 및 폐 전이의 억제
6주령의 암컷 balb/c 마우스에게 몸체의 우측에 있는 제4 및 제5 유두 사이의 유선 지방 패드 영역에 200,000 66 클론 4-GFP 유선 종양 세포를 피하 주사하였다. 종양의 크기가 1×1mm에 도달하면, 에어로졸 처리를 개시하였다. 별도로 투여된 및 낮은 수준, 0.403㎍/일의 9-니트로캄프토테신과 함께 투여된 α-TEA는 종양 성장의 강력한 억제제이다. α-TEA + 9-니트로캄프토테신의 에어로졸 전달은 쥐유선 종양 성장을 90%까지 억제한 반면에, 단독의 α-TEA 및 단독의 9-니트로캄프토테신은 종양 성장을 각각 65% 및 58%까지 억제하였다. α-TEA + 9-니트로캄프토테신의 에어로졸 전달은 액와 림프절 및 폐 미세전이성 병소를 87% 및 71%까지 억제한 반면, 에어로졸에 의해 단독으로 투여된 α-TEA 및 9-니트로캄프토테신은 림프절 미세전이성 병소를 94% 및 60%까지 억제하였으며 폐 미세전이성 병소를 71% 및 55%까지 억제하였다. 따라서, 연속적으로 투여된 α-TEA + 9-니트로캄프토테신은 두 약물을 별도로 투여한 경우에 비해 우수하게 종양 성장을 억제하였다. 단독의 α-TEA는 9-니트로캄프토테신과 함께 투여한 경우와 마찬가지로 폐 및 림프절 전이의 억제에 있어 효과적이다. 종양 성장 및 전이의 방지에 있어 α-TEA를 단독으로 투여한 경우 및 9-니트로캄프토테신과 함께 투여한 경우의 데이터 비교는 하기 표 6에 제시한다.
종양 성장 및 전이에 있어 α-TEA를 단독으로 투여한 경우 및 9-니트로캄프토테신(9NC)과 함께 투여한 경우의 비교
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억제율(%) |
제형 |
전달방법 |
분무기내 약물 농도(마우스당) |
종양 성장 |
폐 전이 |
림프절 전이 |
Lip/α-TEA |
에어로졸 |
5mg/d |
65% |
71% |
94% |
Lip/9NC |
에어로졸 |
2㎍/d |
58% |
55% |
60% |
Lip/α-TEA+9-NC |
에어로졸 |
5mg+2㎍/d |
90% |
71% |
87% |
실시예 34
α-TEA는 시스플라틴 내성 cp-70 사람 난소암 세포를 시스플라틴 민감성으로전환시킨다
α-TEA + 시스플라틴의 배합물은 시험관내 및 생체내에서 종양 세포 치사를 증가시킨다. 사람 난소암인 cp-70 세포주는 난소암용 제1선 치료로서 통상적으로 사용되는 백금 약물인 시스플라틴에 내성을 나타낸다. cp-70 아클론은 시험관내에서 70mM까지 수준이 증가되는 시스플라틴에 간헐적으로 노출시킴으로써 A2780 시스플라틴-민감성 세포주로부터 발생시켰다. 세포주 A2780 및 cp-70는 배양물중에서 α-TEA로 처리된 경우, 둘다 아폽토시스를 진행시킨다(도 16A). cp70 사람 난소암 세포를 차선 수준의 시스플라틴(0.625 및 1.25㎍/㎖) 및 α-TEA(10㎍/㎖)으로 처리하면, cp-70 세포에 시스플라틴 민감성이 부여되고, A2780에서 아폽토시스의 수준이 증가되고 cp-70 세포주에서 시스플라틴 민감성이 회복되었다(도 16B). 시스플라틴과 배합된 α-TEA는 생체내에서 cp-70 세포의 성장을 억제하였다. 녹색-형광 단백질(GFP)에 대한 유전자를 바이러스 감염을 통해 cp-70 에서 발현시켜, 상기 세포가 형광을 발하여 이종이식 마우스 모델에서 동시처리 효과를 연구하는데 사용할 수 있도록 하였다. 시스플라틴과 α-TEA의 배합물 처리는 생체내 이종이식 누드 마우스 모델에서 시험하였다. 상기 모델에서, 암컷 누드 마우스에게 제4 및 제5 유두 사이에 1×106세포를 피하 접종하였다. 평균 종양 크기가 1.0mm3에 도달하면, 마우스를 리포좀중 에어로졸을 통해 전달되는 단독의 α-TEA 처리, 3주 동안 주 1회 복강내 주사되는 단독의 시스플라틴(5mg/kg) 처리, 시스플라틴 + α-TEA 처리 또는 에어로졸 대조군(리포좀 단독)을 위해 선별하였다. 데이타는 시스플라틴+ α-TEA가 시스플라틴 내성 cp-70 사람 난소암 세포의 성장을 억제하기 위한 효과적 방법임을 나타낸다(도 16C).
실시예 35
MDA-MB-435-GFP-FL 유방암 세포에 미치는 α-TEA, 메틸셀레노시스테인 및 트랜스-레스베라트롤의 효과
암컷 NU/NU 동종접합 마우스에게 몸체의 우측에 있는 제4 및 제5 유두 사이의 유선 지방 패드 영역에 MDA-MB-435 GFP FL 세포를 피하 주사하였다. 주사한지 9일 후, 동물을 0.5mm×0.5mm 내지 2.0mm×2.0mm 범위의 유사한 크기의 종양을 갖는 10마리의 동물로 이루어진 5개의 그룹으로 분류하였다. 동물에게 수중 3ppm 메틸셀레노시스테인(MSC)을 위관영양에 의해 투여하거나, 리포좀 중의 α-TEA를 에어로졸을 통해 투여하거나, 처음에는 1:1 EtOH: 생리식염수 중의 10mg/체중 kg 트랜스-레스베라트롤(t-RES)투여하고 24일째부터는 6.5% 및 93.5% 네오비(Neobee) 오일 중의 10mg/체중 kg 트랜스-레스베라트롤(t-RES) 투여하였다. 배합군은 상기한 세 화합물 각각으로 처리하고, 대조군은 에어로졸화된 리포좀, 물 100㎕ 및 t-RES 용매 50㎕으로 처리하였다. 동물은 35+ 일수 동안 주 7일 동안 처리하였다. 종양은 격일로 촉진하였고 용적은 수학식 (w2×l)/2을 이용하여 계산하였다.
35일째에, α-TEA 그룹은 대조군으로부터 47.8% 감소율을, MSC 그룹은 47.2% 감소율을, t-RES 그룹은 61.2% 감소율을, 배합군은 19.8% 증가율을 나타냈다(도17). 상기 그룹들은 t-검정을 이용하여 대조군에 대해 통계학적으로 분석하였고, α-TEA, MSC, t-RES 및 배합군에 대한 p 값은 각각 p=0.0487, 0.0347, 0.2221 및 0.6255이었다. 따라서, 개별적으로 시험된 α-TEA 및 MSC 그룹만이 대조군과 유의적으로 상이한 감소된 종양 성장을 제공하였다. 단독으로 처리된 트랜스-레스베라트롤 및 세 화합물의 배합물은 종양 성장을 증가시켰다.
다음 참조문헌들이 본원에서 인용된다:
본 명세서에 언급된 임의의 특허문헌 또는 공보는 발명이 속하는 당해 기술분야의 기술자의 수준을 암시하고 있다. 추가로, 이들 특허문헌 및 공보는 각각의 개별 공보가 별개로 특정하게 참조문헌으로 인용되는 것과 같이 동일한 수준으로 본원 참조로서 인용된다.
당해 기술 분야의 기술자는 본 발명이 본 발명의 고유 특징뿐만 아니라 언급된 목적을 수행하고 잇점 및 최종 목적하는 바를 수득하기 위해 잘 적용될 수 있음을 용이하게 인식할 것이다. 본원에 기술된 방법, 과정, 처리, 분자 및 특정 화합물과 함께 본 발명의 실시예는 바람직한 양태를 대표하는 것으로서 예시적인 것이며 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 청구항의 범위에 의해 한정되는 바와 같은 본 발명의 취지내에 포함되는 변형 및 또 다른 용도가 당해 분야의 기술자에게 인식될 것이다.