CN100515497C - 脂质体输送以维生素e为基础的化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种治疗细胞增殖性疾病的方法，通过将包含在递送囊泡中的一种组合物递送给需要这种治疗的个体，该组合物含有以维生素E为基础的抗癌化合物，此抗癌化合物具有的结构式中R’是氢或羧酸；R2和R3是氢或R4；R4是甲基；R5是烷基。还提供含这些化合物的囊泡。

Description

脂质体输送以维生素E为基础的化合物
发明的背景
参照相关专利申请
此非临时专利申请要求2002年10月15日提交但现已注销的美国临时专利申请序列号60/416,602、2002年8月29日提交但现已注销的美国专利序列号60/406,807和2001年12月19日提交但现已注销的美国专利序列号60/342,156的优先权利。
发明领域
本发明涉及药物学和癌症治疗领域。本发明更具体说涉及递送维生素E为基础的脂质体制品，作为治疗和防治癌症的有效方法。
相关领域描述
导致生存(存活)和导致死亡(凋亡)的调节控制很复杂，包括多种胞内信号传递途径和多种相互作用的基因产物的调控。癌细胞可能表现为促进细胞增殖的基因和其产物表达的增高，从而使癌细胞数量增加。除了导致-生命基的因表达增高外，癌细胞能下调控制-死亡信号的基因和其产物，从而导致威胁生命的癌细胞积聚和转移增加。不受调控的细胞增殖加以死亡诱导信号途径的抑制赋予了癌细胞生长和存活的优势。
细胞数量是否增加不取决于负作用和正作用生长调节基因产物表达的平衡、及功能性细胞死亡信号途径的存在与否。负作用生长调节基因的作用是阻断(停滞)细胞于细胞周期中；而正作用生长调节基因则刺激细胞在细胞周期中前进。参与细胞凋亡的基因可以是前凋亡或抗凋亡基因，它们之间的动态平衡确定了细胞是活还是死亡。
存在多种病理性细胞增殖情况，对此需要新的治疗策略和制剂来提供效益。这些病理情况可发生于几乎所有能够异常性增殖或对细胞死亡信号产生异常反应的细胞类型中。显示病理或异常性生长和死亡特征的细胞类型有成纤维细胞、血管内皮细胞和上皮细胞。因此，需要新的方法来治疗个体的所有或几乎所有器官和组织系统中的局部性或扩散性病理情况。
大部分癌症随着时间的推移都经历过遗传性损伤和渐进变化并最终可能变为高度转移性而难以治疗，无论它们是男性特异的如前列腺或睾丸，或是女性特异如的乳房、卵巢或子宫颈，或它们是否影响男性和女性的相同器官如肝、皮肤或肺。手术去除局部癌证明仅在癌瘤没有扩散超原发病灶时有效。一旦癌扩散到其它组织和器官，手术方法必须加上其它更特异的根除疾病或恶性细胞的方法才有效。大部分治疗疾病或恶性细胞的常用补充方法如化疗或放疗的作用不止局限于肿瘤细胞，虽然它们对恶性细胞有更高比例的破坏作用，但常一定程度地影响到正常细胞。
一些天然维生素E化合物和一些维生素E的衍生物已用作前细胞凋亡和DNA合成抑制剂，因而是强抗癌剂。维生素E在结构上包括苯并二氢吡喃醇头部和烷基侧链。维生素E有8个主要的天然形式：alpha(α)、beta(β)、gamma(γ)和delta(δ)生育酚以及α、β、γ和δ生育三烯甘油酯(生育三烯甘油酯)。生育酚与生育三烯甘油酯的区别在于它们有饱和植基侧链而不是未饱和的异戊二烯基侧链。四种形式的生育酚和生育三烯甘油酯的区别在于苯并二氢吡喃醇头上甲基数量(α有3个，β和γ有2个，δ有1个)，如表1所示。
表1
生育酚和生育三烯甘油酯的一般结构
    R<sup>1</sup>     R<sup>2</sup>     R<sup>3</sup>
  alpha(α)     CH<sub>3</sub>     CH<sub>3</sub>     CH<sub>3</sub>
  beta(β)     CH<sub>3</sub>     H     CH<sub>3</sub>
  gamma(γ)     H     CH<sub>3</sub>     CH<sub>3</sub>
  delta(δ)     H     H     CH<sub>3</sub>
Figure C0282791400051
Figure C0282791400061
一些研究描述了RRR-α-琥珀酸生育酚(琥珀酸维生素E；VES)的强抗肿瘤活性，它是RRR-α-生育酚的可水解性酯衍生物。Prasad和Edwards-Prasad第一个描述了琥珀酸维生素E而不是维生素E其它形式具有诱导小鼠黑素瘤B-16细胞形态改变和抑制生长的能力，并提出琥珀酸维生素E可能是一种有用的肿瘤治疗剂(1)。另外的研究证明琥珀酸维生素E是多种各类上皮性癌细胞，包括乳房、前列腺、肺和结肠以及体外造血淋巴样白血病和淋巴瘤细胞生长年的强抑制剂(2-7)。
最近的研究证明琥珀酸维生素E腹膜内(i.p.)给予时在动物异种移植和同种异体移植模型中具有抗肿瘤活性(8-11)，提示其可能的治疗潜能。腹膜内(i.p.)或口服(p.o.)给予琥珀酸维生素E已显示对小鼠致癌物质[苯并芘]-诱导的前胃癌发生有抑制作用，提示能作为一种抗致癌制剂(12)。研究证明琥珀酸维生素E可通过阻断DNA合成、诱导细胞分化和诱导细胞凋亡来浓度-和时间-依赖性抑制癌细胞生长(5、6、10、13-15，未发表数据)。
抑制细胞增殖包括：部分通过MAP激酶MEK1和ERK1介导的G0/G1细胞周期阻断，以及上调关键性细胞周期调节蛋白p21(waf1/cip1)(30)。诱导分化的特征是：形态变化、β酪蛋白信使增加、乳脂表达、细胞角蛋白18蛋白升高和Her2/neu蛋白下调(13)。分化部分通过活化MEK1、ERK1/2和磷酸化c-Jun蛋白而介导(13、14)。RRR-α-琥珀酸生育酚能调节多种细胞凋亡信号，尤其值得注意的是它能将Fas/Fas配基不反应的肿瘤细胞转变成Fas/Fas配基反应性，和能将转化生长因子-β(TGF-α)不反应的肿瘤细胞转变成TGF-α反应性，使这两个途径恢复会聚于JNK/c-Jun，接着使Bax蛋白转位到线粒体，诱导线粒体渗透转换，然后细胞色素c释放到细胞质中，活化胱冬酶9和3，切割多(ADP-核糖)聚合酶(PARP)以及引起细胞凋亡(15、29、31)。
琥珀酸维生素E值得注意的不仅是它能诱导对肿瘤细胞生长的抑制作用，而且是它对正常细胞和组织没有毒性(2-7、11)。使用不可水解的琥珀酸维生素E衍生物显示它是完整的化合物且其二种切割产物任一种(即RRR-α-生育酚或琥珀酸)均具有抗增殖作用(4)。因此，认为此种维生素E衍生物的抗增殖作用并非是由于其抗氧化剂性质而致。
RRR-α-琥珀酸生育酚(VES)是RRR-α-生育酚的一种衍生物，其结构上酯键修饰苯并二氢吡喃头部的6位含琥珀酰部分而不是羟基部分。这种RRR-α-生育酚的酯键相连琥珀酸部分，是维生素E影响生物作用的最强形式，此生物作用包括触发细胞凋亡和抑制DNA合成。此种维生素E形式能诱导肿瘤细胞凋亡，而对正常细胞没有凋亡诱导作用。维生素E的琥珀酸形式可作为完整的有效抗癌剂；然而，细胞和组织中的酯酶能切割该琥珀酸部分，从而将RRR-α-生育酚的琥珀酸形式转变成游离的RRR-α-生育酚，使此化合物作为抗癌剂无效。RRR-α-生育酚显示在上皮或免疫来源的细胞中既不抗增殖也无前细胞凋亡活性。
构建以RRR-α-生育酚或RRR-α-生育三烯甘油酯为基础的化合物，是经酯键在α-生育酚或α-生育三烯甘油酯的苯并二氢吡喃醇头部第一个环的C6位进行修饰，而提供具强抗癌性质的化合物。据报导在没有细胞酯酶的细胞中这种化合物在细胞培养中以及体内可保持完整。在美国专利6,417,223中，市场上购买的纯化形式RRR-α-生育酚可用作合成维生素E类似物的起始原料。对RRR-α-生育酚分子的以下三部分进行了修饰：苯并二氢吡喃头部酚环的6位碳；苯并二氢吡喃头部，包括酚和杂环；或植基尾部。在RRR-α-生育酚中，酚环的6位碳具有抗氧化剂活性的关键性羟基(-OH)部分。
根据在多种人类癌细胞而不是正常人细胞中诱导细胞凋亡的能力筛选类似物并对类似物作结构功能分析，表明以生育酚为基础的类似物从H-键供体到植基尾梢的总长度为
Figure C0282791400071
尾梢本身长度具有完全甲基化的闭合酚环、饱和的闭合杂环和经醚键附着于酚环6位碳的不可水解性的乙酸部分，表现出最强的抗癌活性(图1)。
通过口服、饮食、管饲、皮下、腹膜内、局部、静脉内、肌肉内、呼吸道等递送治疗剂的方法，对药物水平和组织分布有重要影响。美国专利号6,090,407证明抗癌药物紫衫醇和喜树碱可加入到脂质体中经喷雾递送给个体的呼吸道。通过脂质体吸入给予这些抗癌药物是一种比肌肉内注射或口服更快和更有效的递送方式。
与通过肌肉内注射递送9-硝基喜树碱相比，采用脂质体气雾剂递送植物生物碱9-硝基喜树碱在免疫缺陷性裸鼠中是抑制人乳房癌(28)、结肠癌和肺癌异种移植物生长的较好方法。气雾剂脂质体方法递送30分钟后，肺、肝和脑中的9-硝基喜树碱水平分别为310ng/g、192ng/g和61ng/g；而肌肉内递送30分钟后，肺、肝和脑中9-硝基喜树碱水平分别为2-4ng/g、136ng/g和0。此外，此递送方法似乎对小鼠抗黑素瘤和骨肉瘤的肺转移高度有效(18)。很重要的是气雾剂递送药物显示效率增加且能很好的被人耐受(19)。因此，气雾剂脂质体递送药物的方法可有效地获得更高水平和更大的组织分布。
另外，本发明者认识到需要更有效的脂质体递送维生素E为基础的抗癌药物的方法，以提供更长的药物持留、更高的药物浓度、全身毒性减小和剂量需求降低。因此，现有技术缺乏有效方法用脂质体将维生素E为基础的抗癌药递送给个体。特别需要气雾性脂质体递送或通过管给予维生素E为基础的抗癌药物的脂质体组合物。本发明实现了本领域长期存在的此种需要和期望。
发明概述
在本发明的一个实施方案中，提供一种治疗细胞增殖性疾病的方法，包括步骤：将包含在递送囊泡中的含维生素E抗癌化合物的组合物递送给需要这种治疗的个体，其中所述化合物具有如下结构式
Figure C0282791400081
其中R1是氢或羧酸；R2和R3是氢或R4；R4是甲基；R5是烷基或烯烃基。
在本发明的另一个实施方案中，提供一种囊泡用于递送本文所述以维生素E为基础的抗癌化合物。
本发明的其它和更多方面、特征、益处和优点可从以下本发明用于说明的目前较佳实施方案的描述中明了。
附图的简要说明
为获得并能够详细了解本发明上述的特征、优点和目标以及将会明白的其它内容，简要概括了本发明的更特定描述，可参考本文一些附图中所示的实施方案。这些图形成了此说明书的一部分。然而要指出的是，这些附图阐述了本发明的较佳实施方案但不应认为是限制本发明的范围。
图1是以R，R，R-α-生育酚为基础的类似物模型，描述强抗癌活性所需的结构要素。C6的R1基团侧链的长度必须使该分子的总长度不超过
Figure C0282791400082
图2比较了天然α-和γ-生育酚、天然α-生育三烯甘油酯、生育三烯甘油酯富集组分(TRF)、合成的生育酚和合成的生酚衍生物对66 cl.4 GFP乳房肿瘤细胞的抗癌效果。
图3A-D描述了α-TEA诱导的细胞凋亡。图3A：66 cl.4 GFP鼠乳腺细胞用10μg/ml α-TEA或琥珀酸维生素E(阳性对照)治疗或不治疗并培养3天。收集细胞，用荧光DNA-结合染料DAPI标记，核用Zeiss ICM 405荧光显微镜(x400)、487701滤片检查细胞。有凝缩染色质的细胞核或片段化核评为细胞凋亡。数据代表多次实验结果。图3B/3C：分析DAPI染色细胞的核，显示α-TEA以浓度-和时间-依赖方式诱导了细胞凋亡。数据表示为三次实验的平均数±S.D.。图3D：α-TEA通过切割多(ADP-核糖)聚合酶(PARP)切割诱导细胞凋亡的另一证据。66 cl.4细胞用5、10或20μg/ml α-TEA治疗48小时，细胞裂解物通过蛋白质印迹分析PARP切割产物(p84)。数据代表3次单独实验的结果。
图4A和图4B描述α-TEA诱导了66 cl.4细胞的体内凋亡。α-TEA诱导的细胞凋亡用5μm肿瘤切片测定，切片获得自脂质体α-TEA/气雾剂治疗和脂质体气雾剂对照组动物(N＝4)。凋亡细胞用ApopTag原位凋亡检测试剂盒(Intergen，Purchase，NY)测定。图4A比较脂质体α-TEA气雾剂和气雾剂治疗的对照中凋亡细胞核的数量。图4B描述脂质体α-TEA气雾剂和对照治疗小鼠肿瘤切片中阳性染色的凋亡细胞。
图5描述α-TEA抑制了66 cl.4-GFP克隆生长。用1.25、2.5和5μg/ml α-TEA治疗66 cl.4-GFP细胞(以600个细胞/组织培养平板上培养)10天，抑制了集落形成。细胞用亚甲蓝染色并计数治疗组和对照组中的细胞集落数量。
图6描述移植66 cl.4 GFP鼠乳腺肿瘤细胞并用气雾剂递送脂质体/α-TEA组合物治疗的balb/c小鼠体重。从移植后第9天起监测动物的体重。
图7描述脂质体/α-TEA 1气雾剂治疗结束后0、2、6或24小时balb/c小鼠中α-TEA的血清和组织水平。
图8描述小鼠移植66 cl.4 GFP鼠乳腺肿瘤细胞并用气雾剂递送脂质体/α-TEA治疗的balb/c小鼠的肿瘤重量。从移植后第9天起监测肿瘤重量。
图9A和图9B描述用脂质体气雾剂α-TEA抑制肿瘤的生长和微转移。图9A：将66 cl.4-GFP细胞以2×105/小鼠，注射到腹股沟区第4和第5个乳头间等距离的点中。接种肿瘤9天后，不治疗(10只/组)或每天用脂质体α-TEA/气雾剂或单独用气雾剂治疗小鼠17天。2天间隔测定肿瘤体积/小鼠。肿瘤体积(mm3)表示为平均数±S.E.。图9B：尸检时，脂质体α-TEA/气雾剂(8只小鼠)、单独气雾剂(10只小鼠)和未治疗小鼠(10只小鼠)的左肺中荧光微转移灶数目用Nikon荧光显微镜(TE-200；200X)确定，采用图象Pro-Plus软件确定微转移灶大小。数据表示为平均数±S.E.。
图10描述通过气雾递送脂质体α-TEA和脂质体琥珀酸维生素E(VES)，抑制了66 cl.4 GFP乳腺肿瘤细胞的肿瘤生长。
图11描述移植66 cl.4 GFP鼠乳腺肿瘤细胞并经管饲递送脂质体/α-TEA治疗的balb/c小鼠的肿瘤重量。从移植后第9天监测肿瘤重量。图11与图8的区别仅在于小鼠每天用花生油配的5mgα-TEA管饲或每天仅接受花生油治疗，仅治疗13天。
图12A和图12B描述通过管饲给予α-TEA不能抑制接种部位的肿瘤生长，但能抑制肺部微转移。肿瘤体积和微转移数据的测定如图9A和图9B所述。
图13描述通过管饲递送脂质体α-TEA和脂质体琥珀酸维生素E(VES)，抑制了66 cl.4 GFP乳腺肿瘤细胞的肿瘤生长。
图14A和图14B描述通过管饲递送脂质体α-TEA和脂质体琥珀酸维生素E(VES)，抑制了66 cl.4 GFP乳腺肿瘤细胞的肺转移(图14A)和淋巴结转移(图14B)。
图15描述经管饲递送脂质体α-TEA抑制了MDA-MB-435乳癌细胞的肿瘤生长。
图16A-16C描述α-TEA或α-TEA/顺氯氨铂组合，对A2780顺氯氨铂-敏感的细胞系和顺氯氨铂-不敏感的cp-70人卵巢癌细胞的凋亡作用。图16A：α-TEA体外对A2780和cp-70人卵巢癌细胞系的凋亡效果。图16B：α-TEA恢复了cp-70体外对顺氯氨铂的敏感性。图16C：α-TEA和顺氯氨铂组合，体内对A2780和cp-70的生长抑制效果。体内数据显示α-TEA能将cp-70顺氯氨铂抗性细胞转变成顺氯氨铂敏感性，α-TEA加顺氯氨铂的组合能减少裸鼠中cp-70卵巢细胞异种移植物的生长。
图17描述α-TEA、甲基硒代半胱氨酸和反式白藜芦醇体内对MDA-MB-435 GFPFL乳癌肿瘤生长的作用。
发明详述
在本发明的一个实施方案中，提供一种治疗细胞增殖性疾病的方法，包括步骤：将包含在递送囊泡中的含维生素E抗癌化合物的组合物递送给需要这种治疗的个体，其中所述化合物具有如下结构式：
Figure C0282791400111
其中R1是氢或羧酸；R2和R3是氢或R4；R4是甲基；R5是烷基或烯烃基。在此实施方案的所有方面中，以维生素E为基础的抗癌化合物可以是生育酚如β-生育酚、γ-生育酚或2，5，7，8-四甲基-(2R-(4R，8R，12-三甲基十三烷基)苯并二氢吡喃-6-位氧)乙酸。另外，以维生素E为基础的抗癌化合物可以是生育三烯甘油酯如α-生育三烯甘油酯、β-生育三烯甘油酯、γ-生育三烯甘油酯、δ-生育三烯甘油酯或生育三烯甘油酯富集组分、或者以维生素E为基础的合成化合物如dl-α-生育酚、dl-α-乙酸生育酚、dl-α-烟酸生育酚或dl-α-磷酸生育酚。
在此实施方案中，递送囊泡可以是含脂质的脂质体、纳米微粒、微球体或非离子表面活性剂微囊(niosome)。脂质体中适当脂类的代表例子是1，2-二月桂基-sn-甘油-3-磷酸胆碱。较佳例子是脂质体中维生素E为基础的抗癌化合物终浓度不大于20.0mg/ml的脂质体。维生素E为基础的化合物/递送囊泡可经气雾剂雾化、气雾剂吸入器、管饲、口服摄取、口服软胶囊、皮肤贴片、皮下注射、静脉内注射、肌肉内注射或腹膜内注射递送。优选的递送方式是经喷射喷雾器的脂质体气雾剂。
在此实施方案的一个方面，所述方法可进一步包括给予包含在递送囊泡中的第二种抗癌药组合物的步骤。该第二种组合物可与维生素E为基础的化合物/递送囊泡组合物组合或依次给药。当组合给予该组合物时，可将维生素E为基础的化合物和抗癌药物包含在同一递送囊泡中。抗癌药物的代表例子是9-硝基喜树碱、顺氯氨铂、紫衫醇、多柔比星(doxirubicin)或塞来昔布。
本发明维生素E为基础的抗癌化合物所表现的抗增殖作用，包括细胞凋亡、DNA合成停滞、细胞周期停滞或细胞分化。在此实施方案中，定量和/或定性分析抗增殖效果可通过检测生物标记来确定。生物标记的较佳例子是细胞增殖标记KI-67。另外，可采用免疫组化试验。
递送本发明以维生素E为基础或其它抗癌化合物可用于治疗肿瘤疾病和非肿瘤疾病。肿瘤疾病的代表例子是卵巢癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、膀胱癌、肺癌、子宫颈癌、乳癌、前列腺癌、睾丸癌、神经胶质瘤、纤维肉瘤、视网膜神经胶质瘤、黑色素瘤、软组织肉瘤、骨肉瘤、结肠癌、肾癌、胰腺癌、基底细胞癌和鳞状细胞癌。非肿瘤疾病的代表例子选自牛皮癣、良性增生皮肤病、鱼鳞癣、乳头状瘤、视网膜病变(restinosis)、硬皮病和血管瘤、粘膜白斑病。
本发明方法可用于治疗由于所选细胞不能经历正常程序性细胞死亡或凋亡而发生的非肿瘤性疾病，。由于细胞不能死亡而发生的疾病和紊乱的代表例子是自身免疫性疾病。自身免疫疾病的特征是免疫细胞破坏自身细胞、组织和器官。自身免疫性疾病的代表包括自身免疫甲状腺炎、多发性硬化、重症肌无力、系统性红斑性狼疮、疱疹样皮炎、腹腔疾病和类风湿关节炎。本发明不限于自身免疫，但包括所有具免疫组分如参与心血管斑块形成或紫外线辐射诱导的皮肤损伤炎症过程的免疫组分紊乱性疾病。
本发明的方法可用于治疗由于病毒感染而发生的紊乱和疾病。由于病毒感染而发生的疾病和紊乱的代表例子是人免疫缺陷病毒(HIV)。因为维生素E为基础的化合物作用于胞内细胞凋亡信号网络，含本发明维生素E为基础的抗癌化合物的递送囊泡如脂质体气雾剂，能影响任何类型的细胞外部信号，如细胞因子、病毒、细菌、毒素、重金属等的信号转导。
在本发明的另一个实施方案中，提供递送其中含有维生素E为基础的抗癌化合物的囊泡。在此实施方案的一个方面，该囊泡还可含抗癌药物。在一个优选方面，该递送囊泡是脂质体，维生素E为基础的抗癌化合物与脂质的比例约为1∶3wt∶wt。维生素E为基础的抗癌化合物、抗癌药物、囊泡的类型和递送方法同以所述。
给出下列定义目的是促进理解本文所述发明。非特别定义的任何术语应按照本领域术语的共同含意来解释。
如本文所述，术语“气雾剂”、“管饲”、“脂质体”、“递送囊泡”和“囊泡”应包括用于囊泡/脂质体制品的不同化学组合物和气雾剂散布或口服递送这些制品的不同方法。
如本文所述，术语“个体”应指动物和人。
如本文所述，术语“生物抑制”或“抑制”同源肿瘤移植物生长，应包括部分或全部生长抑制，也包括肿瘤细胞的增殖或生长速度降低。本发明组合物的生物抑制剂量，可通过评估测试物质对组织培养中靶细胞恶性程度或异常增殖性细胞生长的作用，对动物中肿瘤的生长和细胞培养物的作用，或本领域普通技术人员已知的其它方法来确定。
如本文所述，术语“抑制转移”应包括部分或全部抑制肿瘤细胞从原发部位迁移到其它器官，特定是上面所提供数据中的肺部。本发明组合物的生物转移抑制剂量，可通过评估测试物质对组织培养中靶细胞恶性程度或异常增殖性细胞生长的作用，对动物中肿瘤的生长和细胞培养物的作用，或本领域普通技术人员已知的其它方法来确定。
如本文所述，术语“抑制血管生成”应包括部分或全部抑制肿瘤血管形成或降低血管携带血向肿瘤供血的能力。
如本文所述，术语“诱导程序性细胞死亡或凋亡”应包括部分或全部的细胞死亡，细胞显示出已确定的凋亡形态和生化特征。诱导细胞凋亡的本发明组合物剂量，可通过评估测试物质对组织培养中靶细胞恶性或异常增殖性细胞生长的作用、对动物中肿瘤的生长和细胞培养物的作用或本领域普通技术人员已知的其它方法来确定。
如本文所述，术语“诱导DNA合成停滞”应包括由于受处理细胞被阻断在GO/G1、S或G2/M细胞周期阶段所引起的生长停滞。诱导DNA合成停滞的本发明组合物剂量，可通过评估测试物质对组织培养中靶细胞恶性程度或异常增殖性细胞生长的作用，对动物中肿瘤的生长和细胞培养物的作用或本领域普通技术人员已知的其它方法来确定。
如本文所述，术语“诱导细胞分化”应包括由于受处理细胞被诱导而发生细胞分化，如已确定的分化形态和生化特征所定义的生长停滞，此阶段中不发生细胞增殖。诱导细胞分化的本发明组合物剂量，可通过评估测试物质对组织培养中靶细胞恶性程度或异常增殖性细胞生长的作用，对动物中肿瘤的生长和细胞培养物的作用或本领域普通技术人员已知的方法来确定。
如本文所述，“α-TEA”包括RRR-α-生育酚醚键相连的乙酸类似物，它是RRR-α-生育酚的不可水解性的醚类似物，即2，5，7，8-四甲基-2R-(4R，8R，12-三甲基十三烷基)苯并二氢吡喃-6-基氧代)乙酸，也可缩写为RRR-α-tocopheryloxy乙酸。
本文提供经气雾剂递送脂质体组合物或经管饲递送脂质体组合物治疗细胞增殖疾病的方法，该组合物包含天然或合成的维生素E为基础的抗癌药物和脂类。本发明的维生素E为基础的化合物表现出抗增殖作用；这些抗增殖作用的代表例子是细胞凋亡、DNA合成停滞、细胞周期停滞或细胞分化。当通过临床相关途径如气雾剂递送或管饲给药时，这些化合物表现出强抗转移作用且对体内正常细胞和组织表现无毒性。
任选的，维生素E为基础的抗癌药物和脂质体组合物中的第二种抗癌药物例如但不限于9-硝基喜树碱(9NC)、阿霉素、paxitaxol、塞来昔布或顺氯氨铂，或可经另一种途径如腹膜内注射给药，可与α-TEA组合或依次给药。例如，9-硝基喜树碱杀伤细胞的机制不同于α-TEA，α-硝基喜树碱作用为拓扑异构酶-1抑制剂，能引起DNA单链断裂，而在DNA复制中转变成DNA双链断裂。此外，9NC能活化传统的CD95/CD95配基(FADD/胱冬酶8)依赖性凋亡途径(29)，此途径能与非传统途径即CD95/Daxx/JNK/线粒体协同。这增强了细胞杀伤。
本发明这些维生素E为基础的化合物包括天然或合成的生育酚或生育三烯甘油酯及其衍生物，它们在苯并二氢吡喃结构的R1位置和植基或异戊二烯基侧链的R5位置具有能基团。优选R1是羧酸如乙酸。一般，合成这些化合物可用本领域标准方法通过RRR-α-生育酚与适当的溴链烷酸反应而完成。
天然生育酚或生育三烯甘油酯衍生物是细胞酯酶水解的，虽然不限于C6侧链，但优选在此位置具有乙酸部分。能实现强抗癌活性所需结构组成的优选化合物是α-TEA，它与RRR-α-生育酚的区别在于乙酸部分通过醚键与苯并二氢吡喃头部6位碳的酚氧基相连。VES与α-TEA的区别在于琥珀酸部分通过酯键与苯并二氢吡喃头部6位碳的酚基相连。由于6位碳-OH部分的亲代化合物RRR-α-生育酚的抗氧化性质，α-TEA的抗肿瘤性质不是抗氧化剂所介导的。
本发明可用作治疗剂。本发明方法可用于治疗任何动物。本发明方法最优选用于人。一般，为获得药理有效的细胞杀伤和抗增殖效果，脂质体/抗癌化合物组合物可以任何治疗有效剂量给予。给药剂量取决于个体年龄、疾病的临床阶段程和或遗传倾向、位置、体重、同时治疗的种类以及病理或恶性情况(如果有)。剂量优选从约0.1mg/kg到约100mg/kg。本领域普通技术人员无需过多实验而能容易地确定适当剂量。
体内研究异位或同位移植到免疫缺陷和动物如裸鼠中的人肿瘤的生长和肿瘤细胞的转移，，或采用熟知的动物模型作体内研究，为临床试验提供了临床前数据。不限于这些动物模型，也可将体内研究注意力集中于其它细胞增殖性疾病的致瘤或非致瘤模型。例如，可采用转移性雌激素不反应的MDA-MB-435乳癌细胞、66 cl.4GFP细胞或顺氯氨铂抗性cp-70人卵巢癌细胞。
特别考虑在脂质体组合物中使用其它新的生育酚、生育三烯甘油酯和其它苯并二氢吡喃衍生物，含有或没有饱和植基或不饱和异戊二烯基侧链或其类似物，递送给个体如通过气雾剂递送到呼吸道或经管饲递送。这些分子包括苯并二氢吡喃结构的R1-R5位的化学功能基团、植基和异戊二烯基侧链的的化学功能基团，特别是以生育酚和生育三烯甘油酯为基础的化合物。另外，考虑以杂原子取代(N或S)苯并二氢吡喃环氧和6-羟基氧的化合物。
利用烷化化学反应，可合成大量有不同R1基团的化合物，特别是当X是氧时。烷化后，进一步化学修饰R1基团能合成广泛范围的新化合物。R1取代物可以是烷基、链烯基、炔基、芳基、杂芳基、羧酸、羧酸盐、酰胺盐、酯、硫代酰胺、硫羟酸、硫羟酸酯、糖类、烷氧基-相连的糖类、胺、磺酸盐、硫酸盐、磷酸盐、醇、醚和腈。
溴化苯并二氢吡喃基团的苄甲基提供了可产生R2、R3和R4基团变体的中间产物。R2和R3的取代物可以是氢或基它R4的取代物，如甲基、苄基羧酸、苄基羧酸盐、苄基酰胺、苄基酯、糖类和胺。也可改变R5基团，如烷基、链烯基、炔基、芳基、杂芳基、羧基、酰胺和酯，特别是当从市场购买的6-羟基-2，5，7，8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸起始时。
当发生氮杂原子取代苯并二氢吡喃环氧的氮时，此氮可用R6取代，R6是氢或甲基。X变化为氧以外的基团可用钯化学反应(当X＝CH2时)和亲核芳族取代(当X＝N或S时)来完成，氧与生育酚和生育三烯甘油酯中的x相同。其它苯并二氢吡喃结构的可能修饰，包括3-4位置的不饱和和环收缩而产生5-二呋喃环。
也考虑其它脂类能用于此脂质体组合物中。任何可加入这些维生素E为基础的抗癌化合物或其它抗癌化合物并递送治疗剂量的脂类都是适合的。可采用不同的脂质体递送方法，如经气雾化或可采用管饲。例如，可采用用于脂质体递送的气雾化和雾化方法或通过管饲给予脂质体的方法。
同样考虑可采用α-TEA或其它衍生的生育酚和生育三烯甘油酯来制备niosome、微球体或纳米颗粒并以治疗剂量通过气雾吸入或气雾雾化递送到呼吸道或通过管饲给药、局部应用、皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内注射或其它已建立的给药方法。例如但不限于在口服递送的软胶囊中装有α-TEA的脂质体或纳米颗粒制剂，可理想的适合于人的化学预防。纳米颗粒制剂作为软胶囊口服给予，能提供在消化道中更长的滞留且也许吸收更高。此外，纳米颗粒制剂可用于通过吸入递送。脂质体或纳米颗粒制品于用于透皮递送送系统如贴片中。
给出下列例子用于阐述发明的不同实施方案且不意味以任何方式限制本发明。
实施例1
2，5，7，8-四甲基-(2R-(4R，8R，12-三甲基十三烷基)苯并二氢吡喃-6-基氧代) 乙酸(α-TEA)的合成和特征鉴定
对于规模化生产，α-TEA如下制备。将NaH(5.0g，124.9mmol)悬浮于干THF(300ml)中并在氩气下0℃搅拌10分钟，然后经cabbula加入溶于100ml干THF中的α-生育酚(41.3g，96.1mmol)。此混合物在氩气压力下0℃搅拌15分钟，随后经注射器加入溴乙酸乙酯(19.26g，115.3mmol)。用TLC(己烷∶乙酸乙酯＝10∶1，Rf＝0.65)监测此方法在3.5小时中完成。反应混合物用150ml CH2Cl2稀释，用饱和NaCl溶液洗涤(150ml×3)直到有机相澄清，在无水Na2SO4上干燥，减压去除溶剂。粗产物仍含有少量游离α-生育酚，可用己烷∶乙酸乙酯(30∶1到20∶1)通过硅胶柱层析去除，产生α-TEA乙酸乙酯的纯产物。
将α-TEA乙酸乙酯(21.0g，40.7mmol)溶于250ml THF，随后加入75ml10％KOH(122.1mmol)室温搅拌混合物6小时。用TLC(CH3Cl3∶MeOH∶CH3COOH＝97∶2.5∶0.5，Rf＝0.18)监测此反应并用100ml水淬灭。溶液用1N HCl调至pH3并用CH2Cl2提取(100ml×4)产物，用饱和NaCl溶液洗涤，在Na2SO4上干燥，减压去除溶剂，产生白色蜡状固体的α-TEA终产物(18.5g，93％)。熔点：54-55℃；分子量：488.8。
实施例2
小鼠乳房肿瘤细胞系
66 cl.4-GFP细胞是一种小鼠乳房肿瘤细胞系，最初衍生自Balb/cfC3H小鼠的自发性乳房肿瘤，后分离成为6-硫代鸟嘌呤-抗性克隆(20，21)。随后，这些细胞用增强的绿色荧光蛋白(GFP)稳定转染。66 cl.4-GFP细胞是高度转移性细胞，100％微转移到肺。用于这些研究前，将细胞送至University of Missouri ResearchAnimal Diagnostic and Investigative Laboratory(RADIL；Columbia，MO)，在那里它们被鉴定为没有病原体。
将66 cl.4 GFP细胞以单层培养物维持于生长培养基中：McCoy培养基(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)，添加10％胎牛血清(FBS，HycloneLab，Logan，UT)、100μg/ml链霉素、100IU/ml青霉素、1X(体积/体积)非必须氨基酸、1X(体积/体积)MEM维生素、1.5mM丙酮酸钠和50μg/ml庆大霉素(SigmaChemical Co.，St Louis，MO)。处理采用相同的McCoy添加培养基，除了FBS含量减少到5％。常规检测培养物以确定没有支原体污染。
实施例3
通过形态评估DAPI-染色的核来测定细胞凋亡
细胞凋亡采用前已发表的方法(22)来测定。简言之，过夜培养12孔板中的1×105个细胞/孔以使细胞附着。次日，细胞用实验培养基配的α-TEA、琥珀酸维生素E(Sigma)或乙醇对照(0.1％乙醇F.C.体积/体积)治疗，用不同浓度α-TEA、琥珀酸维生素E治疗不同时间间隔。治疗后，通过350Xg离心5分钟沉淀悬浮细胞和脱落的粘附细胞，用磷酸缓冲盐水(PBS；137mM NaCl、2.7mM KCL、10.4mM Na2HPO4、10.5mM KH2PO4；pH7.2)洗一次，用溶于100％甲醇的2μg/ml 4’，6-二氨基-2-苯基吲哚二氢氯化物(DAPI，Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)37℃染色15分钟。
细胞用Zeiss ICM 405荧光显微镜放大400X观察，使用487701滤片。细胞中含凝缩染色质的细胞核或表现出片段化核的细胞被评为细胞凋亡。数据报造为每细胞群中凋亡细胞的百分比，即计算凋亡细胞数除以细胞总数。检查了显微镜3个不同的视野，每个位置计数200个细胞，每张载玻片最少计数600个细胞。细胞凋亡数据表示为三次单独进行的实验的平均数±S.D.。
实施例4
蛋白质印迹检测多(ADP-核糖)聚合酶(PARP)切割片段
分析多(ADP-核糖)聚合酶切割片段可作为检测细胞凋亡的另一种方法。如上所述处理66 cl.4-GFP细胞用于DAPI测试。PBS洗涤后，将细胞4℃悬浮于裂解缓冲液(1X PBS、1％诺乃洗涤剂P-40、0.5％脱氧胆酸钠、0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)、1μg/ml高抑酶肽、1μg/ml抑蛋白酶肽、1mM二硫苏糖醇(DTT)、2mM原钒酸钠、10μg/ml苯甲基硫酰氟(PMSF))中30分钟，涡旋振荡，15,000Xg离心20分钟收集上清液。蛋白质浓度用Bio-Rad(Bradford)蛋白试验(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)测定，样品(100μg/泳道)在还原条件下在7.5％SDS-聚丙烯酰胺胶上电泳分辨。
将蛋白质电印迹到硝化纤维膜上(0.2μM孔Optitran BA-S-支持的硝化纤维；Schleicher and Schuell，Keene，NH)。转移后，用封闭缓冲液[25mM Tris-HCl(pH8.0)、125mM NaCl、0.5％吐温-20和5％脱脂奶粉]室温封闭膜45分钟。免疫印迹用1μg兔抗人多(ADP-核糖)聚合酶一抗[PARP(H-250)，Santa CruzBiotechnology，Santa Cruz，CA]进行，辣根过氧化物酶-偶联的山羊抗兔免疫球蛋白以1∶3,000稀释用作二抗(Jackson Immunoresearch Laboratory，West Grove，PA)。蛋白质印迹中辣根过氧化物酶标记的条带通过增强化学发光(Pierce，Rockford，IL)和放射自显影(Kodak BioMax film；Rochester，NY)检测。
实施例5
细胞集落-形成试验
接种66 cl.4-GFP细胞每张35×10mm组织培养平板(Nunclon，Rochester，NY)接种600个细胞并在37℃过夜贴壁。第二天，去除生长培养基，用治疗培养基、乙醇对照(0.1％乙醇F.C.体积/体积)或单独培养基(未治疗)取代，治疗培养基含1.25、2.5、5和10μg/ml的α-TEA。治疗细胞10天，不改变培养基。10天后，去除培养基，平板用PBS洗三次。细胞用1％亚甲蓝PBS液染色30分钟，手工计数＞0.5mm的集落。
实施例6
Balb/c小鼠
6周龄雌性Balb/cJ小鼠(25gm体重)购自Jackson Labs(Bar Harbor，ME)并使其适应新环境至少1周。动物饲养于Austin的得克萨斯大学动物资源中心，温度74±2°F，湿度30-70％，12小时交替亮-暗循环。动物以5只/笼饲养并随意给予水和标准实验室鼠食。遵循得克萨斯大学动物护理和使用制度委员会认可的人性化治疗动物指南。
实施例7
肿瘤细胞接种
66 cl.4-GFP细胞通过胰蛋白酶收集、离心、重悬浮于McCoy培养基中，该培养基不含密度为2×105/100μl的添加物。用23号针头在右侧腹股沟区域第4和第5个乳头间等距离的点给小鼠注射。
安排50只小鼠(每组10只)作为气雾剂治疗化、气雾剂对照组、口服治疗组、口服对照组或不治疗组，所有组的平均肿瘤体积密切匹配。治疗开始时各组的肿瘤范围为2×2至4×4mm，在接种肿瘤细胞后9天开始治疗。另外10只不注射肿瘤细胞的小鼠用气雾剂或口服α-TEA(各5只)治疗17天，取消治疗并再观察11个月以评估长期安全性。每隔一天用卡钳测量肿瘤大小，用以下公式计算体积：体积(mm3)＝[宽度(mm)2×长度(mm)]/2。每周测定体重一次。
实施例8
制备溶于花生油的α-TEA并通过管饲递送给药
将α-TEA溶于100％乙醇(400mg/ml)，随后以1∶8(v/v)比例与花生油(100％花生油；nSpired Natural Foods，San Leandro，CA)混合。对照用α-TEA治疗中所含的等量乙醇和花生油处理。剧烈涡旋振荡混合物，然后4℃保存直到使用。将α-TEA/花生油混合物置于室温并通过管饲每天给予100μl。这对应于5mgα-TEA/小鼠/天的终浓度。
实施例9
制备含2，5，7，8-四甲基-(2R-(4R，8R，12-三甲基十三烷基)苯并二氢吡喃-6- 基氧代)乙酸(α-TEA)的脂质体组合物
通过上述方法(17)根据经验确定α-TEA/脂质体的比例为1∶3最佳。为制备α-TEA/脂质体组合，将诸成分首先置于室温。将脂类[1，2-二月桂基-sn-甘油-3-胆碱磷酸(DLPC)；Avanti Polar-Lipids，Inc.，Alabaster，Al]以120mg/ml浓度溶于叔丁醇中(Fisher Scientific，Houston，TX)，随后超声波治疗以获得澄清溶液。40mg/ml的α-TEA也溶于叔丁醇并涡旋振荡直到所有固体溶解。然后后2种溶液等量(v∶v)混合以达到1∶3α-TEA/脂质体的理想比例，涡旋混合，-80℃冷冻1-2小时，过夜冻干成干粉，接着-20℃保存直到使用。各治疗小瓶含75mg的α-TEA。
实施例10
雾化含2，5，7，8-四甲基-(2R-(4R，8R，12-三甲基十三烷基)苯并二氢吡喃-6- 基氧代)乙酸(α-TEA)的脂质体并给药
将如上所述气雾剂给予小鼠(17)。简言之，空气压缩机(Easy Air 15空气压缩机；(Precision Medical，Northampton，PA)产生10L/分钟气流，与AeroTech II喷雾器(CIS-US，Inc.Bedford，MA)一起使用以产生气雾。释放自AeroTech II喷雾器的α-TEA脂质体气雾颗粒大小通过Anderson级联碰撞器测定为2.01μm的中位质量空气动力学直径(NMAD)，几何标准偏差为2.04。吸入时约30％的这些颗粒沉积到小鼠呼吸道中而剩余的70％被呼出(17)。
雾化前，将α-TEA/脂质体粉末置于室温，然后加入3.75ml蒸馏水重建获得20mg/ml的2-FEA所需终浓度。通过定期倒置和涡旋振荡使该混合物室温膨胀30分钟，然后将其加入喷雾器中。此α-TEA制剂可通过管饲以4mgα-TEA/0.1ml口服给药。小鼠置于塑料笼(7×11×5)英寸中，安全罩中有一密封顶。气雾剂经1cm折叠管在一端进入且在另一端释放，使用单方向压力释放阀。使动物暴露于气雾剂直到所有α-TEA/脂质体被雾化，约15分钟。
实施例11
脂质体中加入α-TEA的气雾剂特征
对从全玻璃撞击器(Ace Glass Co.，Vineland，NJ)中的气雾中回收的α-TEA脂质体，进行HPLC分析。递送剂量＝浓度(μg/L)×小鼠分钟体积(1-分钟/kg)×递送持续时间(分钟)×估计沉积组分(30％；17)。根据此公式，我们估计每天约有36μg的α-TEA沉积于每只小鼠的呼吸道中(316.2μg g/L×1分钟/kg×15分钟×0.30＝1,422.9μg g/kg/天。
实施例12
HPLC分析肿瘤中的α-TEA
在尸检中取出肿瘤，各肿瘤一半在液氮中快速冷冻，然后-70℃保存直到进行HPLC分析。通过匀浆化和己烷提取脂类来加工肿瘤作HPLC分析。简言之，称重的肿瘤与5-7Kimble固体玻璃珠(4mm)、1ml 1％SDS水溶液、1-2ml 100％乙醇和1ml己烷一起置于5ml一次性锥形底试管(Sarstedt，Newton，NC)中。然后用新月形Wig-L-Bug(型号3110B，Densply International，Elgin，IL)混合样品2次，每次1分钟。接着以1,000rpm离心样品5分钟，收集有机层，水相再与己烷混合，涡旋，离心，加工2次，然后有机层在氮气下干燥。立即跑样。进行反相HPLC分析和荧光计检测生育酚醚类似物，如Tirmenstein，M.A.，等.所述(23)。
实施例13
肺和淋巴结转移
在处死时目测计数5个肺叶中的转移病灶。计数左肺叶和淋巴结中绿色荧光的微转移癌细胞集落，用20x物镜(200x放大)的Nikon荧光显微镜(TE-200)和显微镜相关的Image-Pro-Plus(版本4.1；Media.Cybernetics，Silver Spring，MD)软件。将荧光病灶分成三组大小：＜5μm，5-10μm和＞10μm。
实施例14
体内检测细胞凋亡的TUNEL试验
采用肿瘤组织的脱蜡切片(5μm)评估细胞凋亡，根据厂商说明使用ApopTag原位细胞凋亡检测试剂盒(Intergen，Purchase，NY)中提供的试剂。核染成褐色评为凋亡阳性，核染成蓝色评为阴性。每个肿瘤至少评价16个400X显微镜视野。数据表示为平均数±S.E.，计算各组3个分离肿瘤中的凋亡细胞数。拍摄1000X放大的肿瘤组织图片。
实施例15
H&E染色肿瘤组织
肿瘤用10％中性缓冲福尔马林固定，根据标准组织学方法包埋于石蜡中。H&E染色5μm厚切片，用于检测肿瘤形态。
实施例16
组织学评估66 cl.4-GFP细胞
小鼠乳房肿瘤细胞特征是纺锤状细胞癌，分化差，有丝分裂指数高。
实施例17
统计分析
统计分析用Prism软件版本3.0(Graphpad，San Diego，CA)进行。用于实验的动物数通过能率计算确定。动物体重和肿瘤体积用student t-检验分析。
实施例18
评估天然和合成的生育酚、生育三烯甘油酯和衍生物的抗癌性能
Balb/c小鼠用200,000个66 cl.4 GFP细胞在身体右侧第4和第5个乳头间的乳腺脂肪垫区域中皮下注射。注射后9天，动物分组(10只动物每组)，比较肿瘤大小范围从0.5×0.5mm至1×2mm。动物用各种脂质体制剂通过气雾剂递送治疗19或21天，各制剂分别含天然α和γ生育酚、天然α-生育三烯甘油酯、生育三烯甘油酯富集组分(TRF；此组分含约32％α-生育酚、20％α生育三烯甘油酯、31％γ生育三烯甘油酯和12％δ-生育三烯甘油酯；Gould，M.N.(30))、合成的dl-α-生育酚和合成衍生物dl-α-乙酸生育酚。经雾化每天给予动物75mg各化合物，每天递送36μg各化合物。每隔一天触诊动物，计算体积为(w2×1)/2。
仅显示RRR-γ-生育酚和dl-α-生育酚的数据(图2)。通过气雾剂递送的dl-α-生育酚脂质体制剂显著地抑制了66 cl.4 GFP细胞生长，分别在治疗15和17天时抑制81％和73％。虽然不如dl-α-生育酚有效，但dl-α-乙酸生育酚、RRR-δ-生育酚、RRR-α-生育三烯甘油酯、生育三烯甘油酯富集组分和(TRF)分别在15天抑制了29、25、34和25％的肿瘤生长，在17天抑制了57、40、27和40％的肿瘤生长。
通过气雾剂递送的RRR-α-生育酚和RRR-γ-生育三烯甘油酯脂质体制品提高了肿瘤生长。肿瘤生长提高由肿瘤体积确定，RRR-α-生育酚的肿瘤生长不显著大于对照的肿瘤生长；然而接受RRR-γ-生育酚的小鼠肿瘤体积显著高于对照小鼠的肿瘤体积(图2)。
表2描述用这些含维生素E或其衍生物的脂质体制剂抑制可见的肺转移的百分比。这些数据显示通过气雾剂递送的dl-α-生育酚脂质体制剂与对照相比，显著减少可见的肺转移病损的数量。
表2
**与对照相比显著提高
免疫组化分析气雾递送dl-α-生育酚脂质体制剂治疗小鼠的肿瘤切片，显示此形式维生素E通过减少51％肿瘤血管数，诱导44％细胞凋亡，减少33％细胞增殖而抑制肿瘤生长。表3列出机制，气雾递送的dl-α-生育酚脂质体制剂抑制了66cl.4-GFP肿瘤的生长。
表3
Figure C0282791400231
此外，分析α-TEA在可移植的同源小鼠乳癌模型中的作用机制，显示α-TEA能降低细胞增殖并诱导细胞凋亡。更具体说与对照相比，免疫化学检测的增殖性生物标记KI-67平均值显著降低了56％，TUNEL免疫组化测定的细胞凋亡平均值显著提高了30％(数据未发表)。因此，认为这些替代标记可当地作为生物标记用于定量和/或定性测定α-TEA的化学预防效果。
实施例19
VES和α-TEA体外诱导66 cl.4 GFP细胞凋亡
前面的研究表明琥珀酸维生素E在许多人癌细胞系包括乳癌中是一种强凋亡诱导剂。为了比较目的，我们将琥珀酸维生素E包括在α-TEA诱导细胞凋亡的体外分析中。Balb/c乳癌66 cl.4 GFP细胞用琥珀酸维生素E或α-TEA治疗，通过形态分析DAPI染色细胞的凝缩核和片段化DNA评估细胞凋亡。
66 cl.4 GFP细胞用10μg/mlα-TEA或琥珀酸维生素E治疗3天，其细胞核呈现出凋亡特征性的凝缩和片段化DNA；而不治疗细胞的核不呈现这些特征(图3A)。66 cl.4 GFP细胞用2.5、5、10和20μg/ml的α-TEA或琥珀酸维生素E治疗3天，呈现剂量依赖性细胞凋亡，α-TEA的凋亡率为5、6、34和50％，琥珀酸维生素E的凋亡率为3、5、16和34％(图2B)。不治疗、VEH和EtOH对照分别呈现为2、2和3％的凋亡背景水平(图3B)。
α-TEA显示能诱导时间-依赖方式的细胞凋亡。10μg/mlα-TEA治疗2-5天的66 cl.4 GFP细胞分别显示有20、35、47和58％的细胞凋亡(图3C)。用5、10和20μg/ml的α-TEA治疗66 cl.4-GFP细胞48小时后，通过存在PARP切割片段来证实诱导了细胞凋亡，(图3D)。84kDa的PARP切割片段在10和20μg/mlα-TEA治疗中明显；而用5μg/mlα-TEA治疗的细胞或不治疗的对照细胞中仅检测到完整的PARP蛋白(图3D)。
实施例20
α-TEA体外诱导细胞凋亡
鉴于体外数据显示α-TEA能通过诱导细胞凋亡而抑制66 cl.4-GFP肿瘤细胞的生长，检测了各脂质体α-TEA/气雾剂治疗和气雾剂对照组中3个肿瘤的细胞凋亡，用TUNEL染色5微米肿瘤切片。用α-TEA治疗的小鼠肿瘤平均数±S.E.为2.04±0.23凋亡细胞/视野；而气雾剂对照小鼠的肿瘤平均数±S.E.为0.67±0.15凋亡细胞/视野(p＜0.03；图4A)。脂质体α-TEA气雾剂和对照治疗小鼠的肿瘤切片中阳性染色凋亡细胞可参见图4B。
实施例21
α-TEA抑制66 cl.4-GFP克隆生长
与EtOH对照相比，1.25、2.5和5μg/ml的α-TEA了减少30、85和100％集落形成(图5)。未治疗(数据未显示)和EtOH对照分别有平均146±11S.D.和140±22S.D.个集落。用1.25和2.5μg/ml的α-TEA治疗的细胞分别有平均98±20S.D.和21±6S.D.个集落。当细胞用5(图5)或10μg/mlα-TEA治疗时，没有集落形成。
实施例22
α-TEA脂质体气雾剂治疗对体重的影响
10/组(4组，总共40只)的Balb/c小鼠如所述用200,000个66 cl.4 GFP细胞在第0天接种。肿瘤接种后9天，开始治疗各组：气雾剂治疗(TX)＝气雾剂递送α-TEA脂质体(5mg/小鼠)/每天，直到第23天。气雾剂对照＝每天仅气雾剂递送脂质体组合物，直到第23天。管饲治疗＝每天以5mg/小鼠管饲给予乙醇/花生油中的α-TEA，直到第23天。管饲对照＝仅管饲给予乙醇/花生油，直到第23天。小鼠在治疗开始(第9天)和之后的13、16、20及23天称重(图6)。数据表示为平均数+/-标准偏差。4组中没有显著的体重差异。
实施例23
α-TEA脂质体气雾剂治疗对血清和组织水平的作用
8只小鼠经肺部气雾剂递送含40mgα-TEA(5mg/小鼠)的6ml脂质体进行治疗。小鼠吸入气雾剂30分钟以上，直到递送完成。治疗结束后0、2、6或24小时处死小鼠。用HPLC分析测定(图7)α-TEA的血清和组织水平。在刚处死时(时间0)，α-TEA仅发现于胃组织中。治疗完成2小时后，α-TEA存在于处死小鼠的血清和胃中。在治疗完成6小时后，α-TEA存在于肝和胃中。治疗完成24小时后，α-TEA存在于肝和胃中。
实施例24
α-TEA脂质体气雾剂治疗对肿瘤重量的作用
如上所述用200,000个66 cl.4 GFP鼠乳房肿瘤细胞在第0天给小鼠注射。当肿瘤大小达到1-3mm第9天开始治疗。每天给予α-TEA脂质体气雾剂治疗(5mgα-TEA/小鼠)，16天(图8)。数据表示为平均数+/-标准误差(SE)，对照和治疗组N＝10只小鼠。第25天即治疗开始后16天处死时，气雾剂α-TEA脂质体治疗组的肿瘤大小比只用气雾剂的对照组小61％。
实施例25
脂质体α-TEA/气雾剂治疗抑制了Balb/c小鼠中的66 cl.4-GFP肿瘤生长并减 少了肺微转移
Balb/c小鼠用2×105个66 cl.4-GFP细胞在身体右侧第4和第5个乳头间的腹股沟区注射s.c.。当肿瘤大小达到2×2至4×4mm(肿瘤注射后9天)时，将小鼠分成5组(组1：不作治疗的对照，组2：脂质体/气雾剂对照，组3：脂质体α-TEA气雾剂治疗，组4：花生油/管饲对照，组5：溶于花生油的α-TEA/管饲治疗)，10只小鼠/组，各组的平均肿瘤体积密切匹配。注射肿瘤后9天开始每天治疗。
脂质体α-TEA/气雾剂治疗组的平均肿瘤体积与气雾剂对照相比，在治疗9、11、13、15和17天时分别减少23、41、50、67和61％(图9A)。处死时取出肺，肉眼检查转移病损和冷冻作荧光微转移分析。α-TEA治疗组中没有可见的肿瘤；而不治疗和气雾剂对照组分别显示有3.25±1.7和4.25±0.5个可见肿瘤/显示肺转移的动物，如表4所示。
使用Nikon荧光显微镜和Image-Pro-Plus软件可测量到大小＜5μm、5-10μm和＞10μm的三组中的绿色荧光微转移。此分析显示与气雾剂和不治疗对照相比，α-TEA治疗组中所有三种大小的肿瘤转移显著减少(图9B)。与气雾剂对照(60.0±15S.E.；N＝10)相比，α-TEA治疗组(11.4±3.5S.E.；N＝8)中微转移的平均数减少了81％(p＜0.2)。尽管气雾剂对照组的微转移平均数比不治疗对照(N＝10)减少(60±15.2S.E.与101.7±17.0S.E.；p＜0.9)，由于这2组中小鼠的微转移数范围大，故不认为此差异有显著意义(图9B)。
表4
Figure C0282791400261
a处死时肉眼计数所有治疗组中各动物全部5个肺叶中的转移病损数。
b数据表示为2个对照组中4只携带肺转移动物中观察到的可见肺肿瘤病灶平均数±S.D.。
实施例26
雾化递送α-TEA和琥珀酸维生素E(VES)脂质体对66 cl.4 GFP肿瘤生长的比 较
给Balb/c小鼠身体右侧第4和第5个乳头间的乳房脂肪垫区域皮下注射200,000个66 cl.4 GFP细胞。注射后9天，将动物按可比较的肿瘤大小范围从0.5×0.5mm至1×2mm分组(10只动物每组)。用脂质体α-TEA、脂质体琥珀酸维生素E或单用脂质体对照经气雾剂治疗小鼠每周7天，共21天。经雾化每天给予动物75mg化合物，从而各动物每天接受36μg化合物。每隔一天触诊动物，肿瘤体积计算为(w2×1)/2。α-TEA脂质体气雾剂分别在15、17、19和21天减少了64、76、69和67％的肿瘤生长(α-TEA和对照之间在17、19和21天时的值统计学差异显著，p分别＝0.03、0.048和0.03)。VES脂质体气雾剂在15、17、19和21天分别减少了76、79、69和68％的肿瘤生长(图10)。琥珀酸维生素E和对照之间在17和21天的值统计学差异显著，p分别＝0.029和0.029。
实施例27
管饲递送α-TEA对肿瘤重量的影响
通过管饲递送α-TEA对防止接种部位66 cl.4 GFP鼠乳癌细胞生长无效(图11)。在各小鼠右侧第4和第5个乳头间注射200,000个66 cl.4 GFP细胞后9-21天，测定肿瘤大小。肿瘤接种后9天开始治疗。各组由n＝10+/-SE组成。管饲治疗＝肿瘤接种后9天开始每天给予溶于乙醇和花生油(0.1ml体积)中的5mgα-TEA治疗，持续直到21天。管饲对照＝小鼠仅接受乙醇和花生油(0.1ml体积)/每天，肿瘤接种后9天开始并持续到21天。数据(肿瘤大小)描述为9、11、13、15、17、19和21天的平均数+/-标准误差。对照和管饲/α-TEA治组之间在所有时间点的肿瘤重量没有显著差异。
实施例28
管饲递送α-TEA不减少接种部位的肿瘤生长但减少肺微转移
与脂质体α-TEA/气雾剂治疗相反，经管饲接受5mg/天/小鼠α-TEA EtOH/花生油制剂的小鼠平均肿瘤体积，与管饲对照的平均肿瘤体积无差异(图12A)。然而，经管饲给予α-TEA减少了68％的肺肿瘤微转移数目。根据三个肿瘤大小(＜5μm、5-10μm和＞10μm)分组，经管饲给予α-TEA的小鼠微转移数目为6.8±1.5、11.3±1.8和3.1±1.2S.E.；而对照小鼠的微转移分别为27.9±9.0、29.2±6.3和8.4±1.5S.E.(图12B)。
治疗或对照组中没有观察到平均体重差异(数据未显示)。非肿瘤携带小鼠用气雾剂/α-TEA治疗或管饲17天，然后保持11个月以评估长期效果，α-TEA治疗没有显示出任何不良作用。
虽然气雾给予α-TEA优于管饲给予在于与对照小鼠的肿瘤大小相比，管饲给予α-TEA不能减少接种部位的肿瘤大小，但令人感兴趣的是管饲给予α-TEA时肺微转移数目比照减少。这提示α-TEA是可生物利用的。由于α-TEA不能水解且预计管饲递送时它应是有效的抗肿瘤制剂，故考虑以5mg/天/小鼠给予α-TEA对于减少肿瘤接种部位的肿瘤大小无效是因为消化道吸收低。因此，进一步预期低水平的α-TEA可有效防止肺肿瘤病灶的建立。
实施例29
比较α-TEA/管饲、脂质体α-TEA/管饲和脂质体α-TEA/气雾剂对66 cl.4乳 房肿瘤的肿瘤生长和肺及淋巴结转移的抑制
虽然抑制肺微转移有效，但通过管饲给予α-TEA/EtOH/花生油制剂不能抑制可移植的同源乳癌动物模型中的肿瘤生长。α-TEA/脂质体制剂以6mgα-TEA/天每天2次通过管饲口服给予是一种防止雌性Balb/c小鼠中66 cl.4 Balb/c鼠乳房肿瘤细胞的癌生长以及转移的有效递送方法。管饲递送α-TEA的脂质体制剂抑制了70％的肿瘤生长且抑制了59％、56％的肺和淋巴结转移。当α-TEA/脂质体制品经管饲给药时，估计每天有36μg的α-TEA沉积于小鼠的肺中。当α-TEA/脂质体或α-TEA/EtOH/花生油制剂经管饲给予时，沉积于组织中的α-TEA量不知道。治疗方案的抗肿瘤效果比较见表5。
表5
Figure C0282791400281
实施例30
管饲递送的α-TEA和琥珀酸维生素E脂质体对66 cl.4 GFP肿瘤生长作用的 比较
管饲口服递送的α-TEA脂质体制剂，抑制了移植到Balb/c小鼠的鼠乳癌细胞的生长。而管饲口服递送的琥珀酸维生素E脂质体制剂不抑制移植到Balb/c小鼠的鼠乳癌细胞的生长。给Balb/c小鼠身体右侧第4和第5个乳头间的乳房脂肪垫区域皮下注射20万个66cl.4GFP细胞。注射后9天，将动物按可比较肿瘤大小范围从0.5×0.5mm至1×2mm分组(10只动物每组)。用分组(10只动物每组)α-TEA脂质体、琥珀酸维生素E脂质体或单用脂质体对照管饲口服治疗，每天2次，每周7天，共21天。每天给予动物总共6mg化合物。隔天触诊动物一次，按(W2×1)2计算肿瘤体积。2-TEA脂质体管饲在15、17和19天的测定值差异有统计学意义(分别为P＝0.03，0.039和0.029)。而VES脂质体管饲不降低肿瘤生长(图13)。
实施例31
脂质体α-TEA管饲治疗减少了66 cl.4-GFP的淋巴结和肺微转移
在Balblc小鼠身体右侧第4和第5乳头之间的乳房脂肪垫区域中皮下注射20万个66 cl.4GFP细胞。注射后第9天，按可比较的肿瘤大小范围0.5×0.5mm至1×2mm，将动物分成数组(每组10只小鼠)。经饲口服用α-TGA脂质体、维生素E琥珀酸盐脂质体，或单用脂质体作对照，治疗小鼠，每天二次，每周7天，共21天。小鼠每天共给予6mg化合物。处死时，迅速冷冻各小鼠的左肺叶并保存用于荧光显微镜检测表达GFP的微转移病损。与对照相比，经管饲给予α-TEA脂质体制剂的动物显示肺部微转移病损显著降低(分别为21.5/肺与52.7/肺)。而管饲琥珀酸维生素E脂质体制剂对肺转移没有效果(图14A)。处死时收集淋巴结并观察微转移肺病损。管饲给予α-TEA的动物显示淋巴结平均有3.1±0.8个微转移病损，而对照组为7.1±1.7个微转移病损(p＝0.036)。管饲琥珀酸维生素E对减少微转移肺病损无效(图14B)。
实施例32
脂质体α-TEA管饲治疗减少了MDA-MB-435乳癌细胞的体外肿瘤生长
在Nu/Nu无胸腺裸鼠身体右侧第4和第5个乳头间的乳房脂肪垫区域皮下注射1.0×106个MDA-MB-435 GFP FL细胞。注射后8天，按可比较的肿瘤大小范围0.5×0.5mm至2×2mm将动物分组(10只动物每组)。动物用α-TEA脂质体或单独用脂质体对照经管饲口服治疗，每天2次，每周7天，共21天。每天给予动物总共8mg化合物。每隔一天触诊动物，肿瘤体积计算为(w2×1)/2。α-TEA脂质体管饲分别在27、29、31、33和35天减少了68、75、78、79和79％的肿瘤生长(图15)。α-TEA和对照之间在33和35天的值统计学差异显著(p分别＝0.045和0.033)。
实施例33
气雾剂脂质体/α-TEA+9NC组合抑制Balb/c小鼠中66 cl.4-GFP肿瘤的肿瘤 生长和肺转移
在6周龄雌性Balb/c小鼠右侧第4和第5个乳头间皮下注射200,000个66克隆4-GFP乳房肿瘤细胞。当肿瘤达到1×1毫米大小时，开始气雾剂治疗。单用α-TEA和gn 0.403μg/天低水平的肿瘤生长强抑制剂组合给予9-硝基喜树碱α-TEA。气雾剂递送α-TEA+9-硝基喜树碱抑制了90％的乳房肿瘤生长，而单用α-TEA和9-硝基喜树碱分别抑制了65％和58％的肿瘤生长。气雾剂递送α-TEA+9-硝基喜树碱抑制87％和71％的腋淋巴结和肺微转移病损；而通过气雾剂单独给予的α-TEA和9-硝基喜树碱分别抑制了94％和60％的淋巴结微转移病损，和抑制了71％和55％的肺微转移。因此，连续给予α-TEA+9-硝基喜树碱对肿瘤生长的抑制好于单独给予2种药物。单用α-TEA如α-TEA和9-硝基喜树碱组合给药一样有效地抑制了肺和淋巴结转移。单独和组合9-硝基喜树碱给予α-TEA防止肿瘤生长和转移的比较数据示表6。
表6
Figure C0282791400301
实施例34
α-TEA使顺氯氨铂抗性的Cp-70人卵巢癌细胞转变为顺氯氨铂敏感
α-TEA+顺氯氨铂的组合提高了体外和体内对肿瘤细胞的杀伤。人卵巢癌cp-70细胞系显示顺氯氨铂抗性，顺氯氨铂是常用于治疗卵巢肿瘤的第一线铂类药物。cp-70亚克隆体外产生自A2780顺氯氨铂敏感细胞系，通过间断性暴露于水平递增的顺氯氨铂直到70mM。当在培养中用α-TEA治疗时，细胞系A2780和cp-70都发生细胞凋亡(图16A)。用次最佳水平的顺氯氨铂(0.625和1.25μg/ml)和α-TEA(10μg/ml)治疗cp-70人卵巢癌细胞，恢复了cp-70细胞对顺氯氨铂的敏感性，提高了A2780中的细胞凋亡水平并恢复cp-70细胞系对顺氯氨铂的敏感性(图16B)。α-TEA结合顺氯氨铂抑制体内cp-70细胞生长。绿色荧光蛋白(GFP)基因经病毒感染而在cp-70细胞中表达，因此这些细胞会发光并可用于研究异种移植小鼠模型中的协同治疗效果。在体内异种移植裸鼠模型中测试了顺氯氨铂和α-TEA的组合治疗效果。此模型中，在雌性裸鼠第4和第5个乳头间皮下接种1×106个细胞。当平均肿瘤大小达到1.0mm3时，选择小鼠用α-TEA单独、脂质体气雾剂递送、顺氯氨铂单独(5mg/kg)I.P.注射，每周一次共3周、顺氯氨铂+α-TEA或气雾剂对照(仅脂质体)治疗。数据显示α-TEA+顺氯氨铂是抑制顺氯氨铂抗性的cp-70人卵巢癌细胞生长的有效方法(图16C)。
实施例35
α-TEA、甲基硒代半胱氨酸和反式白藜芦醇对MDA-MB-435-GFP-FL乳癌细胞的 作用
在雌性NU/NU纯合小鼠身体右侧第4和第5个乳头间的乳房脂肪垫区域皮下注射一百万个MDA-MB-435 GFP FL细胞。注射后9天，按可比较的肿瘤大小范围0.5mm×0.5mm到2.0×2.0mm将动物分成5组每组10只动物。动物管饲含3ppm甲基硒代半胱氨酸(MSC)的水溶液、脂质体α-TEA气雾剂、或管饲10mg/kg b.w.反式白藜芦醇(t-RES)，最初为1∶1的EtOH∶生理盐水溶液，第24天开始为6.5％EtOH和93.5％Neobee油溶液。组合物动物用上面三种化合物之一治疗，对照组用气雾剂脂质体、100μl水和50μl t-RES溶剂治疗，每周7天共35+天。每隔一天触诊肿瘤，体积用公式(w2×1)/2计算。
在35天，α-TEA治疗组显示比对照减少47.8％，MSC组减少47.2％，t-RES组增加61.2％，组合组增加19.8％(图17)。用t-检验统计分析务组和对照，α-TEA、MSC、t-RES和组合组的p值分别＝0.0487、0.0347、0.2221和0.6255。因此，分开测试的单用α-TEA和MSC组减少了肿瘤生长，与对照显著不同。单用反式白藜芦醇治疗和三种化合物的组合提高了肿瘤生长。
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本说明书提及的任何专利或出版物表明了本发明所涉及领域技术人员的水平。此外，这些专利和出版物以相同程度纳入本文供参考，好像各单独出版物特定和分别纳入供参考。
本领域技术人员容易理解本发明很适合完成所述的目标和获得所述结果及优点以及其它固有内容。提供的实施例以及本文所述的方法、过程、治疗、分子和特定化合物是较佳实施方案的代表，但不限制本发明的范围。本领域技术人员对其进行的变化和其它用途包括在本发明的思路内和权力要求所定义的范围内。

Claims (18)

1.包含在递送囊泡中的组合物在制备用于治疗细胞增殖性疾病的药物中的应用，所述递送囊泡是含脂类的脂质体，所述细胞增殖性疾病为肿瘤疾病，所述组合物包括维生素E为基础的抗癌化合物，所述化合物具有以下结构式
Figure C028279140002C1
其中，R1是羧酸基团；R2和R3是氢或R4；R4是甲基；R5是烷基或烯烃基；或
所述维生素E为基础的抗癌化合物是生育三烯甘油酯。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述组合物还含有抗癌药物。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抗癌药物是9-硝基喜树碱、顺氯氨铂、紫衫醇、多柔比星或塞来昔布。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述维生素E为基础的抗癌化合物是2，5，7，8-四甲基-(2R-(4R，8R，12-三甲基十三烷基)苯并二氢吡喃-6-位氧)乙酸。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述生育三烯甘油酯选自α-生育三烯甘油酯、β-生育三烯甘油酯、γ-生育三烯甘油酯、δ-生育三烯甘油酯。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述组合物是以通过气雾剂雾化、气雾剂吸入器、管饲、口服摄取、口服软胶囊、透皮贴片、皮下注射、静脉内注射、肌肉内注射或腹膜内注射给予的形式存在。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述组合物是以通过喷射喷雾器给予的形式存在。
8.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述脂类是1，2-二月桂基-sn-甘油-3-磷酸胆碱。
9.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述脂质体中所述以维生素E为基础的抗癌化合物的终浓度不大于20.0mg/ml。
10.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤疾病选自卵巢癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、膀胱癌、肺癌、乳癌、睾丸癌、前列腺癌、神经胶质瘤、纤维肉瘤、视网膜神经胶质瘤、黑色素瘤、软组织肉瘤、骨肉瘤、白血病、结肠癌、肾癌、胰腺癌、基底细胞癌和鳞状细胞癌。
11.一种递送以维生素E为基础的抗癌化合物的囊泡，所述囊泡是含脂类的脂质体，其特征在于，所述化合物具有以下结构式
其中，R1是羧酸基团；R2和R3是氢或R4；R4是甲基；R5是烷基或烯烃基，或所述化合物是α-生育三烯甘油酯、β-生育三烯甘油酯、γ-生育三烯甘油酯、或δ-生育三烯甘油酯。
12.如权利要求11所述的囊泡，其特征在于，所述脂类是1，2-二月桂基-sn-甘油-3-磷酸胆碱。
13.如权利要求11所述的囊泡，其中，以维生素E为基础的抗癌化合物与脂类的比例为1∶3wt∶wt。
14.如权利要求11所述的囊泡，其特征在于，所述维生素E为基础的抗癌化合物是2，5，7，8-四甲基-(2R-(4R，8R，12-三甲基十三烷基)苯并二氢吡喃-6-位氧)乙酸。。
15.如权利要求11所述的囊泡，它还包含抗癌药物。
16.如权利要求15所述的囊泡，其特征在于，所述抗癌药物是9-硝基喜树碱、顺氯氨铂、紫衫醇、多柔比星或塞来昔布。
17.如权利要求11所述的囊泡，其特征在于，所述囊泡以通过气雾剂雾化、气雾剂吸入器、管饲、口服摄取、口服软胶囊、透皮贴片、皮下注射、静脉内注射、肌肉内注射或腹膜内注射递送所述以维生素E为基础的化合物的形式存在。
18.如权利要求17所述的囊泡，其特征在于，所述囊泡以通过射喷雾器雾化递送所述以维生素E为基础的化合物的形式存在。
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