KR100884570B1

KR100884570B1 - 미강 내 토코트리에놀의 대량생산방법 및 이를 이용한 고기능성 토코트리에놀 제제

Info

Publication number: KR100884570B1
Application number: KR1020050018883A
Authority: KR
Inventors: 이영상; 박순량; 김용호; 강창성
Original assignee: 순천향대학교 산학협력단
Priority date: 2005-03-07
Filing date: 2005-03-07
Publication date: 2009-02-18
Also published as: KR20060097348A

Abstract

본 발명은 미강 내 토코트리에놀의 대량생산방법 및 이를 이용한 고기능성 토코트리에놀 제제에 관한 것으로, 벼의 도정율을 조정하여 토코트리에놀의 함량을 최대로 하고, 적절한 미강 원료를 선택하고, 최적의 추출용매와 온도 조건 및 비누화 반응조건을 확립하고, 최종 생산물의 순도와 안정성을 평가함으로써 미강에서 토코트리에놀을 대량생산하는 방법을 제공하는 뛰어난 효과가 있다. 또한, 본 발명은 상기 미강의 최종생산물의 항산화력, 항암 및 고지혈증 억제효과와 독성평가를 통해 미강 최종생산물의 고기능성 토코트리에놀 제제로의 이용가능성을 제공하고 있다. 따라서, 이를 바탕으로 제조된 미강 최종생산물을 이용한 고기능성 토코트리에놀 제제는 기능성식품원료로 이용될 수 있다.

미강, 토코트리에놀, 토코페롤, 항산화력, 항암, 고지혈증 억제효과, 비타민 E

Description

미강 내 토코트리에놀의 대량생산방법 및 이를 이용한 고기능성 토코트리에놀 제제{A method of mass-production tocotrienol in rice bran and bran-based functional foodstuff containing tocotrienol with high content}

도 1은 표준품과 파일럿 스캐일에서 얻어진 미강의 최종생산물의 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다.

도 2는 미강 원료에 따른 회수된 비타민 E의 함량을 나타낸 그래프이다.

도 3은 추출용매별 미강 내 비타민 E 추출효율을 나타낸 그래프이다.

도 4는 알콜류 추출용매별 미강 내 비타민 E 추출효율을 나타낸 그래프이다.

도 5는 원료대비 에탄올 비율에 따른 비타민 E 추출효율을 나타낸 그래프이다.

도 6은 비타민 C 첨가량에 따른 비타민 E 추출효율을 나타낸 그래프이다.

도 7은 비누화 반응에서 시간과 온도 조건에 따른 비타민 E 추출효율을 나타낸 그래프이다.

도 8은 비누화 반응에서 KOH와 NaOH 첨가 시 비타민 E 추출효율을 나타낸 그래프이다.

도 9는 미강의 최종생산물(헥산수집액)의 순도 향상 조건과 관련하여 상온 방치시, 냉장 후 원심분리시, 냉동 후 원심분리시 비타민 E 함량 변이를 나타낸 그 래프이다.

도 10은 상이한 산소 조건에서 미강의 최종생산물의 비타민 E 함량 변이를 나타낸 그래프이다.

도 11은 미강의 최종생산물의 온도에 따른 열안정성 평가를 나타낸 그래프이다.

도 12는 미강 최종생산물 내 토코트리에놀의 항산화 활성을 측정한 그래프이다.

도 13은 미강 최종생산물 내 토코트리에놀 및 토코페롤의 항산화 효소활성을 측정한 그래프이다.

도 14는 미강 최종생산물의 항암성 평가를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 미강 내 토코트리에놀의 대량생산방법 및 이를 이용한 고기능성 토코트리에놀 제제에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 벼 품종별 및 재배조건에 따른 토코트리에놀의 함량 변이를 조사하고, 미강 내 토코트리에놀의 추출, 분리 및 정제를 위한 최적 조건을 조사하고, 미강 최종생산물의 항산화력, 항암성 및 고지혈증 억제효과를 조사함으로써 이를 바탕으로 제조되는 미강추출물을 이용한 고기능성 토코트리에놀 제제를 제공한다.

수도(水稻)는 가장 주요한 한국의 식량자원으로 현재 약 115만ha의 경지에서 연간 526만 톤이 생산되고 있다. 국내에서 생산되는 수도는 일부 떡이나 미과 등의 가공식품의 원료로 사용될 뿐 대부분 취반용으로 이용되는데, 식미를 이유로 영(潁)과 종피(種皮)를 제거하는 도정 과정을 거쳐 백미로 가공하여 이용되고 있다. 현미가 백미에 비해 건강식으로 인정받고 있는 이유는 도정 과정중에 상실되는 미강 층에 존재하는 단백질, 지질, 식이섬유 및 비타민 등 다양한 영양소에 기인한다. 그러나 안타깝게도 연간 60만 톤이나 생산되는 것으로 추정되는 미강은 우수한 식품영양성에도 불구하고 극히 일부가 미강유 제조에 사용될 뿐 대부분 사료용으로, 혹은 농업폐기물로 처리되고 있는 실정이다. 미강 내에는 다양한 기능성 물질이 함유되어있다. 특히 미강에 함유된 비타민 E는 고지혈증 및 동맥경화 개선, 항암작용, 항산화작용 등 생리 활성 효과가 뛰어난 것으로 알려져 있으나 한국인의 경우 일상적인 식품을 통한 섭취가 부족한 영양소이다. 토코트리에놀(Tocotrienol)은 토코페롤(tocopherol)과 같은 비타민 E 계열의 vitamer로서 영양적 가치가 없는 것으로 간주되어왔으나, 최근 항산화, 항암, 고지혈증 개선, 혈당 강하, 동맥경화 완화, 피부 손상 회복 등 다양한 생리 활성 효과면에서 토코페롤보다 월등한 것으로 밝혀진 이래 집중적으로 의약품, 건강보조식품 및 화장품의 소재로 개발되고 있다. 우리 나라는 오랜 수도 재배의 역사와 더불어 다양한 수도 유전자원과 육종 및 재배 기술을 보유하고 있으며 국내 미곡종합처리장(RPC)의 지속적인 건설과 시설 현대화는 부산물인 미강의 지속적이고 안정적인 공급의 큰 기반이 되고 있다. 최근 국내에서는 소비자의 고품질 미곡 선호 경향에 부응하여 향미(香米), 적미(赤米), 유색미(有色米) 및 거대배아미(巨大胚芽米) 등 다양한 기능성 수도 유전자원이 적 극적으로 탐색, 개발, 재배되고 있으나 건강보조식품 또는 의약품으로의 가공 실례는 매우 미흡한 실정으로 현재 활용도가 극히 낮은 도정 부산물로부터 기능성이 우수한 토코페롤 및 토코트리에놀을 추출, 분리하여 고부가가치 식품 및 의약품 소재로 활용함은 국내 미곡 산업의 부가가치 증진에 매우 시급한 과제이다.

따라서, 본 발명의 목적은 벼의 품종과 재배조건에 따른 토코트리에놀의 함량 변이를 조사하여 미강 내 토코트리에놀의 대량생산방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 다른 목적은 미강에서 토코트리에놀의 추출, 분리 및 정제를 위한 최적 조건을 제공하고자 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 미강추출물을 이용한 고기능성 토코트리에놀 제제를 제공하고자 한다.

본 발명의 상기 목적은 벼의 품종과 재배조건에 따른 토코트리에놀의 함량 변이를 조사하고, 미강 내 토코트리에놀을 추출, 분리 및 정제조건을 조사하고, 미강 최종생산물의 항산화력, 항암성 및 고지혈증 억제효과를 조사하고 랫드를 이용하여 독성시험을 실시하여 미강추출물을 이용한 고기능성 토코트리에놀 제제를 제조함으로써 달성하였다.

이하, 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 벼의 품종과 재배조건에 따른 토코트리에놀 함량 변이 조사 단계; 미강 내 토코트리에놀의 추출, 분리 및 정제조건 조사단계; 미강 최종생산물의 생 리활성 및 독성평가 단계; 미강추출물을 이용한 고기능성 토코트리에놀 제제의 제조단계로 구성된다.

이하, 본 발명에 대한 보다 상세한 설명 및 구체적인 제조 과정을 실시예를 통해 설명하고자 한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하고 설명하기 위해 제시된 것으로, 본 발명이 이들 실시예로만 한정되는 것으로 이해해서는 안된다.

[실시예]

실시예 1: 미강 내 토코트리에놀의 대량생산

미강 내 토코트리에놀의 대량생산을 위해 벼 품종별로 그리고 재배조건(질소시비량, 질소수비 시용시기 및 시용량, 벼의 저장기간 및 도정율)에 따라 토코페롤, 토코트리에놀 및 비타민 E의 함량 변이를 조사하였다. 이를 위해 대진, 일품, 다마금, 진품, 화성, 대안, 추청, 중안, 대림, 봉광, 서진, 광안, 고시히카리, 히또메보레, 오대, 흑진주, 안다 및 안성벼 품종을 실험하였다.

그 결과, 총 토코페롤 함량은 서진벼, 화성벼, 추청벼, 중안벼, 흑진주벼에서 많았고, 토코트리에놀 함량은 안다벼에서 많았고, 비타민 E 함량은 안다벼에서 가장 많았다. 또한, 토코페롤, 토코트리에놀 및 비타민 E의 함량에 있어서 질소시비량, 질소수비 시용시기와 시용량 간에 대차가 없었다. 벼를 수확한 후 32개월이 지나도 토코트리에놀의 함량에는 변화가 거의 없어 벼의 저장기간에는 크게 영향을 받지 않았다(미도시됨).

최종적으로, 벼의 도정율에 따른 토코페롤과 토코트리에놀의 함량 변이를 조사하였다. 이를 위해, 2003년 5월 20일 경기도농업기술원 화성 시험포에서 시비량 N-P₂O₅-K₂O=11-4.5-5.7kg/10a, 재식거리 30×4cm로 이앙하여 재배한 벼로 경기도에서 양질미로 재배되고 있는 추청벼, 일품벼 및 고시히카리와 Park et al.(2003)의 결과에서 토코트리에놀 함량이 가장 높았던 초다수성인 안다벼 등 4품종을 수확 정선하여 정밀소형 제현기(FC2K, Otake, Japan)를 이용하여 현미로 조제 후 4.0, 6.4, 8.0, 9.6, 12.0%(w/w) 5수준으로 시험용 소형 도정기(MC-90A, 일본 도쿄)를 이용하여 각 도정율 별로 도정하여 생산된 미강과 쌀(추청벼)을 진공 포장용 PE필름에 넣고 질소 가스로 충진 후 -80℃ 냉동고에 보관하면서 분석 시료로 사용하였다.

미강의 토코페롤, 토코트리에놀 및 비타민 E은 표준분석방법을 통해 분리하였다. 시료 0.5 g을 50mL 원심분리관에 취하여 아스코르브산 0.1g 과 에탄올 5mL를 가하고 80℃의 항온수조에서 10분간 진탕 후 80% KOH용액 0.15mL를 가하여 80℃에서 10분간 비누화(saponification)를 실시한 후 ice bath에 옮겨 신속히 냉각하였다. 증류수 5mL 과 헥산 5mL 를 가하여 잘 혼합 후 원심분리하고 헥산층을 100mL 분액여두에 취하였으며 헥산 5mL 씩 2회 더 추출작업을 반복하여 분액여두에 합하였다. 이 헥산층에 증류수 5mL를 가하여 3회 세척하였고 헥산층을 Na₂SO₄로 탈수시킨 후 질소 가스로 농축하였다. 이 농축 잔사물을 1mL 이소옥탄(isooctane)으로 용해하여 0.2㎛ 나일론 시린지 필터(nylon syringe filter)로 여과한 것을 HPLC 분석시료로 8종류의 이성체 별로 분석하였고, 그들 중 토코트리에놀의 합(T₃)과 토코페롤의 합(T) 및 총 비타민 E 함량(V_E)으로 나타내었다. 토코페롤과 토코트리에놀 분 석을 위한 HPLC(Sykam, S1101, 독일) 조건은 다음과 같다; 컬럼: Zorbax Silica(4.6×250mm), 검출기: Fluorescence detector(excitation 290nm, emission 330nm), 이동상 용매: isooctane/ethyl acetate/acetic acid/2.2-di-methoxypropane=98.5:0.7:0.7:0.1, 이동상 용매 유속: 1.6mL/min, 시료 주입량: 20㎕. 토코트리에놀과 토코페롤의 표준품은 머크사(독일) 제품을 사용하였고 표준품과 파일럿 스캐일(pilot scale)에서 얻어진 최종생산물의 HPLC 크로마토그램은 도 1과 같다. 각 시료는 3회 반복 분석하고 그 결과를 SAS 프로그램으로 통계처리 하였다.

표 1에 나타난 바와 같이, 토코트리에놀 함량은 추청벼에서 도정율은 4.0-8.0%는 차이가 없었으나 그 이상의 도정율에서는 유의하게 감소하였고, 일품벼는 도정율 6.4%에서 가장 높았으나 도정율이 높거나 낮으면 함량이 유의하게 감소되었다. 고시히카리는 도정율 4.0-6.4%에서 높았고 그 이상에서는 함량이 감소하였다. 안다벼는 6.4-9.6%의 도정율에서 높았으며 그 이상 또는 이하에서는 감소하였다. 도정율에 따른 토코트리에놀 함량 변이는 4품종 각각 다른 반응을 보였으나 공통으로 가장 높았던 도정율은 6.4%이었고 추청과 안다는 도정율 8.0%에서도 높은 함량을 보였다.

따라서 비타민 E 함량을 중심으로 볼 때 함량이 높은 점에서 공통되는 도정율은 6.4-9.6%이었다.

품종	도정율(%)	토코페롤	토코트리에놀	비타민 E
추청벼	4.0 6.4 8.0 9.6 12.0	72.3 85.5 117.0 105.5 96.1	224.1 221.5 208.0 189.5 174.2	296.4 307.0 325.0 295.0 270.3
일품벼	4.0 6.4 8.0 9.6 12.0	38.7 53.9 87.5 87.0 90.6	253.6 283.7 252.1 238.5 217.2	292.3 337.6 339.6 325.5 307.6
고시히까리	4.0 6.4 8.0 9.6 12.0	75.7 90.7 121.5 118.1 108.0	271.7 278.9 233.5 232.9 209.6	347.4 369.6 355.0 351.0 317.6
안다벼	4.0 6.4 8.0 9.6 12.0	71.6 82.9 90.9 89.9 80.0	283.3 315.9 313.9 313.4 267.4	354.9 398.8 404.8 403.3 347.4

실시예 2: 미강에서 토코트리에놀의 추출, 분리 및 정제를 위한 최적 조건

미강에서 토코트리에놀의 추출, 분리 및 정제를 위한 최적 조건을 규명하기 위해, 시료는 참여기업인 (주)세림현미로부터 현미유 생산용 미강, 펠렛 및 헥산으로 추출된 원유 등을 현물 출자 받아 사용하였다.

실험예 1: 원료 선정

토코페롤 및 토코트리에놀 추출 효율 면에서 유리한 미강 시료의 가공형태를 알아보기 위해 원료로 사용 가능한 생미강, 펠렛, 미강유 각각 0.5g 씩을 기본 분석 방법에 준하여 HPLC로 분석하여 그 함량을 평가하였다.

도 2에 나타난 바와 같이, 동일 원료 단위 무게를 기준으로 비타민 E의 회수량은 미강유 > 생미강 > 펠렛의 순으로 나타났다. 미강유가 헥산추출 전 형태인 펠렛보다 단위 무게당 추출효율이 높았음은, 미강유의 추출 효율을 15%로 환산하였으나, 실제 그 추출량은 현장의 상황에 따라 다소 변화가 있기 때문인 것으로 사료된다. 또한, 각 원료의 부피를 기준으로 하였을 경우, 생미강 > 펠렛 > 미강유의 순으로 나타났다.

따라서, 경제성을 고려할 때, 생미강 보다는 이를 성형한 펠렛이, 그리고 다시 펠렛을 헥산으로 추출하여 얻은 미강유 등이 가공될수록 토코페롤 및 토코트리에놀 제품 생산에 유리할 것으로 판단되었다.

실험예 2: 추출 용매별 비타민 E의 추출 효율 평가

추출용매별 토코페롤과 토코트리에놀의 추출 효율을 조사하기 위해, 미강 펠렛 10g을 페트로리움 에테르(petroleum ether, PE), 에틸 에테르(EE), 아세톤(AC), 헵텐(HP), 헥산(HX), 이소프로필 알콜(IA) 등 6종류의 용매 100mL를 담은 250mL-플라스크에 넣고 60℃의 다구항온수조에서 4시간동안 환류냉각하면서 추출하였다. 추출 후 감압 여과된 용액을 35-40℃의 항온수조에서 농축하고, 이것을 헥산 5mL에 녹여, 그중 250mL을 취해 기본 분석 방법의 시료로 사용하여 HPLC로 분석하였다. 또한 알콜류가 헥산보다 미강으로부터 비글리세라이드(non-glyceride) 물질 추출 효율이 높다는 보고에 따라, 헥산, 이소프로필 알콜, 에탄올 3개의 용매별로 미강 원료 12g을 용매 20 mL에 넣고 80℃ 수조에서 1시간 동안 추출, 여과 후 진공농축하고, 농축 잔류물에 에탄올 50mL을 가하여 토코페롤과 토코트리에놀을 정량분석하였다.

도 3A에 나타난 바와 같이, PE 사용 시 총 비타민 E 회수율이 가장 높았다. 용매별 비타민 E 회수율은 PE > EE > AC > HP > HX > IA 순으로 낮아졌고, 이를 비율로 나타낼 때 HX:IA:PE:EE:AC:HX = 1.0:0.9:1.3:1.2:1.1:1.0 이었다.

도 3B에 나타난 바와 같이, IA 사용시 총 비타민 E 회수율이 가장 높았으며, 이는 미강유 착유시 보편적으로 사용되는 헥산에 비해 22% 높았다. 용매별 추출 효율은 HX:ET:IA = 1.0:1.1:1.2의 비율이었다. HX과 IA 간 추출 효율이 60℃ 조건에서는 1.0:0.9로 HX가 IA 보다 다소 높았으나 80℃ 조건에서는 1.0:1.2로 IA가 오히려 높게 나타나 토코페롤이나 토코트리에놀 등을 목적으로 알콜류를 사용 시는 추출 온도가 높아야 효율적임을 알 수 있었다.

그러나, 생산 현장에서는 끓는점에 낮은 유기용매을 사용할 경우 가열 추출 시 폭발에 의한 사고위험성이 있고, 용매의 가격도 용매의 선정 시 매우 중요한 요소이다. 따라서 토코페롤 혹은 토코트리에놀을 현재의 미강유 착유 공정에서 생산되는 미강유를 원료로 사용 시는 별도의 추가 비용 없이 현행 사용되는 헥산을 사용함이 가장 현실적이고, 별도의 추출 설비를 갖출 시는 에탄올이나 이소프로필 알콜을 용매로 선정함도 가능할 것으로 판단되었다.

실험예 3: 상온 추출 시 효율 평가

가열 추출 과정 없이 상온에서 토코페롤 및 토코트리에놀 추출시 효율의 변화를 평가하기 위하여 미강 펠렛 10g을 헥산, 이소프로필 알콜 등 6종류의 용매 100mL에 넣고 알루미늄 호일로 빛을 차단한 후, 상온에서 105-110 rpm으로 진탕하면서(shaking) 각각 1시간, 4시간, 12시간, 24시간 등 경과 시간별로 10mL 씩 시료를 채취하였다. 채취된 시료는 35-40℃ 조건에서 감압농축하고, 이를 헥산 1mL에 녹여 그중 250mL를 토코페롤 및 토코트리에놀의 표준분석방법에 따라 분석하였다.

도 4에 나타난 바와 같이, 추출 4시간 이내에서는 헥산이 비타민 E 추출 효율이 가장 높았으나, 4시간을 기점으로 오히려 감소하는 경향을 나타냈다(도 4A). 한편 이소프로필 알콜과 헵텐은 추출 12시간을 기점으로 비타민 E 회수량이 가장 높았고, 그 이후 추출시간을 24시간으로 연장하여도 이소프로필 알콜은 회수량의 증가가 없었던 반면 헵텐은 감소하는 경향을 나타내었다. 이러한 경향은 비타민 E 총량뿐 아니라 비타민 E를 구성하는 각각의 α-토코페롤, α-토코트리에놀, γ-토코트리에놀에서도 유사하였다(도 4B-D).

상기 결과로부터, 이소프로필 알콜 사용 시 별도의 가열없이도 12시간 추출 시 높은 효율로 상온 추출이 가능하며, 헥산을 이용 시 상온 추출의 최적 시간은 4시간 정도임을 알 수 있었다.

실험예 4: 토코트리에놀 추출 최적화를 위한 비누화 조건

토코트리에놀의 추출을 위한 비누화 반응에서 원료대비 에탄올 비율, 비타민 C 첨가량, 비누화 시간과 온도 조건 및 KOH 대체물질 등의 최적 조건을 조사하였다.

실험실시예 4-1: 원료대비 에탄올 비율에 따른 비타민 E 추출 효율 비교

비누화 반응 중 첨가되는 에탄올은 회수가 어려워 제품 생산 비용을 증대시키는 주요한 요인으로 작용한다. 미강에서 토코페롤과 토코트리에놀 추출시 가능한 소량의 에탄올을 첨가함으로써 경제성을 향상코자 실험실 규모 및 파일럿(pilot) 규모에서 원유량과 에탄올양을 달리하여 비타민 E 추출 효율을 비교하였다. 실험실 규모 실험의 경우는 원유 2-5g에 에탄올 6mL를 첨가하여 원유:에탄올의 부피 비율이 각각 2:6, 3:6, 4:6, 5:6이 되도록 조절하였고, 파일럿 규모 실험의 경우는 원유 1kg에 에탄올 12, 15, 18 L의 3수준을 첨가하여 반응을 진행하고 수행 결과 얻어진 최종생산물의 비타민 E 함량을 평가하였다.

파일럿 규모에서의 표준 추출방법은 원유 1.8kg을 200g의 아스코르브산과 에탄올 18L와 혼합 후 80℃에서 18분간 반응시킨 후, 44% KOH 600mL를 넣고 80℃에서 18분간 비누화 과정을 수행하고, 반응이 종료된 혼합물을 0℃의 냉각수가 순환하는 냉각기 코일 속으로 통과시킴으로써 신속히 냉각시킨후 물 18L, 헥산 18L와 혼합, 교반하여 헥산층을 회수하고, 이를 물 18L로 세척한 후 헥산을 농축조에서 증류제거하였다. 농축조내의 추출물 회수를 위해 일정량의 헥산으로 농축조를 세척하여 헥산수집액을 얻고, 이를 실험 목적에 따라 상온, 혹은 저온 보관 후 원심분리, 혹은 감압여과하여 헥산수집여과물과 헥산수집여과액으로 분리하고, 헥산수집여과액을 감압농축하여 1차 농축물을 얻고, 이를 이소옥탄에 용해하여 HPLC로 분석하였다.

도 5에 나타난 바와 같이, 원유 무게 당 회수된 총 비타민 E 함량은 원유량이 증가함에 따라 비타민 E 추출 효율이 감소하였다(도 5A). 또한, 파일럿 규모 실험에서는 단위 원유 무게당 총 비타민 E 회수율은 감소하였다(도 5B). 즉, 오히려 낮은 부피의 에탄올 첨가 시 단위 원유 무게당 비타민 E 회수율이 높음을 알 수 있었다.

실험실시예 4-2: 비타민 C 첨가에 의한 비타민 E 추출 효율 비교

미강 원유로부터 비타민 E 추출 과정중 비타민 E의 산화를 방지하기 위하여 산화억제제인 비타민 C(아스코르브산)를 넣는 바, 첨가되는 비타민 C 함량이 토코페롤과 토코트리에놀의 회수율에 미치는 영향을 평가코자 미강 펠렛 5g을 원료로 0, 1, 2.5, 5, 10 g을 가하여 표준 분석 방법에 준하여 실험을 진행하였다.

도 6에 나타난 바와 같이, 비타민 C을 첨가하지 않을 경우와 비교하여 1g, 2.5g 첨가 시는 각각 약 21%, 20%의 비타민 E 함량의 증가를 가져왔으나, 그 이상의 비타민 C 첨가 경우에는 오히려 수율이 감소함을 알 수 있었다. 상기 결과로부터, 소량의 아스코르브산을 첨가할 경우 분명 추출 공정 중 비타민 E의 파괴를 저해하나, 과도한 투입은 오히려 부적절함을 알 수 있었다.

실험실시예 4-3: 비누화의 시간 및 온도 조건에 따른 추출효율 변화

비누화 과정에서 온도와 시간을 달리하였을 경우 토코페롤과 토코트리에놀의 회수율을 비교코자 2요인 실험 설계법에 준하여 60-90℃에서 각 온도별로 4분-20분간 비누화를 수행하였다.

도 7에 나타난 바와 같이, 반응 시간이 20분인 경우 반응 온도가 80℃에서는 회수율이 가장 높아 회수율은 반응 온도에 크게 영향 받음을 알 수 있었다.

실험실시예 4-4: 비누화 과정 중 KOH 와 NaOH의 비타민 E 추출 효율 비교

비누화 과정에서 첨가되는 KOH을 가격이 저렴한 NaOH로 대체할 경우 비타민 E 추출 효율을 비교코자 표준 분석 방법에 준하되, KOH 과 NaOH를 동량씩 첨가하여 비누화 반응을 수행하고 비타민 E 회수량을 비교 평가하였다.

도 8에 나타난 바와 같이, NaOH 첨가 시 회수된 토코트리에놀과 총 비타민 E 함량은 KOH 보다 증가하였다. 따라서, 비누화를 위한 촉매제로 NaOH가 KOH보다 비타민 E 추출 효율에 효과적이고 또한 경제적임을 알 수 있었다.

실험예 5: 최종생산물의 순도 향상 조건

파일럿 규모로 추출을 수행하여 얻은 헥산수집액은 상온에 방치시 하층의 침전물이 형성된다. 따라서, 헥산수집액을 상온에서 24시간 방치한 후 층분리를 유도하고, 각 층위별 비타민 E 함량을 비교 평가하였다.

도 9A에 나타난 바와 같이, 하층액에는 상층액에 비하여 약 50-60% 수준의 비타민 E 만 함유되어 하층의 고형분에는 토코페롤과 토코트리에놀이 적게 분포하였다. 따라서, 하층의 고형분을 제거함이 최종생산물의 순도 향상에 유리할 것으로 판단되었다.

또한, 헥산수집액의 상온 방치시 형성되는 침전물에는 비타민 E의 함유량이 낮으므로 상기 침전물을 보다 효율적으로 제거코자 헥산수집액을 4℃에 24시간 보관하고 원심분리하여 상징액과, 침전물로 분리 한 후 이소옥탄에 녹여 각각의 토코트리에놀 함량을 평가하였다.

도 9B에 나타난 바와 같이, 저온에서 형성된 침전물에는 매우 낮은 토코트리에놀이 분포하였다. 따라서, 헥산 수집액을 냉장보관하여 보다 효율적으로 최종생산물의 순도를 높일 수 있음을 알 수 있었다.

또한, 헥산수집액에 함유된 침전물을 보다 효과적으로 제거하기 위하여 헥산 수집액을 감압여과하여 얻어진 여과액을 -20℃의 냉동실에 24시간 보관 후 원심분리하여 침전물을 제거한 후 토코페롤 수율을 측정하였다. 냉동 및 원심 분리에 따른 비타민E 회수율 저하는 냉동처리 이전의 헥산수집여과액 중의 비타민 E 함량을 대조로 비교 평가하였다.

도 9C에 나타난 바와 같이, 헥산수집액 50mL 당 4.1g의 침전물의 제거가 가능하였고, 원심분리 후 상징액을 감압농축한 결과 원유 1kg 당 약 607mg의 토코트리에놀이 회수되어 대조구에 비하여 총 비타민 E 회수량 감소가 있었다(6%). 그러나 최종생산물(final product)에 함유된 토코트리에놀의 농도는 냉동-여과 처리가 없었던 대조구 시료를 감압 농축 시 최종생산물은 1,216 mg/g이었음에 비하여 냉동 처리시는 1,283 mg/g로 향상되었다.

상기 결과로부터, 헥산수집액을 24시간 냉동(-20℃)보관 후 여과 시 수율의 큰 저하 없이 다량의 저온침전물을 제거하여 최종생산물의 비타민 E 순도를 향상시킴이 가능함을 알 수 있었다.

실험예 6: 최종생산물의 안정성 평가

최종생산물의 안정성을 평가하기 위해, 상이한 산소 조건에서 안정성과 열 안정성을 조사하였다.

실험실시예 6-1: 상이한 산소 조건에서의 최종 생산물의 안정성 평가

토코페롤과 토코트리에놀은 항산화 물질로 산소의 존재 유무에 따라 그 파괴정도가 상이하므로, 최종생산물의 산소에 대한 안정성을 평가하였다. 우선, 최종생산물을 1:10의 비율로 이소옥탄에 용해한 후, 95℃의 수조에서 14 mL/min의 유속으로 0%, 2%, 8%, 21%(질소 balance) 등 상이한 산소농도의 혼합가스를 불어넣으며 4시간동안 파괴를 유도한 후 토코페롤과 토코트리에놀의 함량을 측정하였다.

도 10에 나타난 바와 같이, 처리전과 비교할 때 토코페롤과 토코트리에놀의 함량의 감소는 없는 것으로 나타났다. 그러나 산소 농도가 증가할수록 비타민 E 성분들의 감소가 발생하므로 산화에 의한 비타민 E 성분의 보존을 위해서는 절대적으로 2% 미만의 산소조건이 유지되어야 함을 알 수 있었다.

실험실시예 6-2: 최종 생산물의 열 안정성을 평가

최종 생산물의 열 안정성을 평가하고자 최종 생산물 1mL를 1.5mL-바이알에 담아 밀봉 후 알루미늄 호일로 빛을 차단하고, 95℃의 항온수조에서 담근 후 비타민 E 함량의 경시적 변화 측정을 위하여 4, 8, 12, 24시간 후 개봉하여 이소옥탄에 희석한 후 HPLC로 비타민 E 함량를 측정하였다.

도 11에 나타난 바와 같이, 24시간 경과 시 토코페롤, 토코트리에놀 및 총 비타민 E 함량이 감소하였다.

실시예 3: 미강추출물의 고기능성 토코트리에놀 제제로의 이용을 위한 생리활성 및 독성평가

미강추출물의 고기능성 토코트리에놀 제제로의 이용을 위한 생리활성을 평가하기 위해 항산화력, 항암성 및 고지혈증 억제효과를 조사하고 독성평가를 실시하였다.

실험예 1: 최종생산물의 항산화력 평가

인간 피부의 섬유아세포(Dempsy)와 간암세포주(SNU-182)를 각각 10%의 우태아혈청, 1mM 글루타민, 100unit/mL 페니실린, 100㎍/mL 스트렙토마이신이 함유된 RMPI1640 배양액에서 5% CO₂를 유지하며 37℃에서 단일층(monolayer)로 배양하였다. 배양하는 동안 컨플루언스(confluency)를 막기 위하여 지름 10cm 배양 플레이트당 5×10⁵-1×10⁶세포수를 유지하며 매 46시간 배양액을 교환하였다. 그 후, 약 5×10⁵ 세포수의 배양 플레이트에 최종생산물의 농도를 변화를 주며 처리하여 일정시간 배양하고 다음과 같은 여러 가지 방법으로 최종생산물의 활성과 기능을 분석하였다.

실험실시예 1-1: DPPH를 이용한 라디칼 소거 활성 측정

최종생산물의 항산화 효과는 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)를 기질로 이용한 라디칼 소거 활성을 측정함으로써 판단하였다. 메탄올로 정용된 최종생산물을 여러 농도로 희석하고 1.5×10^-4M의 DPPH와 동일 비율로 섞고 밀봉하여 약 3초간 강하게 혼합시키다. 혼합액을 25℃에서 20분간 반응시키고 520nm의 파장에서 흡광치를 측정하였다. 라디칼 소거 활성은 흡광수치의 감소로 나타나며, 아래의 수식으로 표시된다.

라디칼 소거 활성(%) = {(OD_대조군 - OD_시료)/OD_대조군}×100

또한, 흡광도를 50% 감소키는 항산화제의 농도를 EC₅₀이라고 표시하였다.

도 12에 나타난 바와 같이, DPPH의 산화현상은 첨가된 DPPH의 농도에 의존적으로 감소하였으며, 낮은 농도에서 매우 높은 항산화력을 가지는 것으로 나타났다.

실험실시예 1-2: 항산화 효소활성 측정

배양된 세포에 여러 농도의 최종생산물을 처리하고 60분간 반응시킨 후 트립신을 처리하여 세포를 수확하고 인산염 완충액(PBS)으로 씻어준 후 라이시스 버퍼(20mM Tris, pH 8.0, 0.5mM EDTA, 0.2M 슈크로우즈)속에서 소니캐이션으로 파괴하였다. 15,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 단백질 추출물을 얻고 항산화 관련 효소활성을 측정하였다.

슈퍼록사이드 디스뮤타아제(Superoxide dismutase(SOD)) 활성은 니트로블루 테트라졸리움(nitroblue tetrazolium(NBT)) 방법을 이용하였다.

글루타티온 페록시다아제(Glutathione peroxidase(GPX)) 분석을 위해, 효소 반응 완충액(100mM 포스페이트, pH7.0, 1mM EDTA, 10mM 글루타티온, 1mM NaN₃, 1 unit 글루타티온 리덕타아제, 1.5mM NADPH)에 0.1 mL의 세포 추출물을 넣고 37℃에서 10분간 반응시킨다. 반응 후 1mM H₂O₂를 첨가하여 340nm의 흡광도를 읽어 NADPH 산화를 측정하였다.

도 13A에 나타난 바와 같이, 최종생산물을 처리하였을 때 SOD의 활성은 섬유아세포와 간암세포주 모두에서 10-25% 가량 증가하는 것으로 나타났으나 그 효과는 크지 않은 것으로 사료된다. SOD 활성은 첨가된 토코트리에놀의 양에 의존적으로 증가하지만 높은 농도의 토코트리에놀의 첨가는 배양되는 세포의 이차적인 변화를 유발시키므로 본 실험에서는 형태적 변화가 가장 미미한 농도에서의 영향을 조사하였다.

도 13B에 나타난 바와 같이, 섬유아세포와 간암세포주 모두 GPX의 활성이 최종생산물에 의하여 증가하였으며 특히 간암세포주의 경우 최대 2배까지 활성이 증가하였다. 상기 결과로부터 최종생산물은 정상세포와 암세포의 항산화 활성을 증가시킴을 알 수 있었다.

실험예 2: 최종생산물의 항암성 평가

국내산 미강에서 추출된 최종생산물(FP)의 항암성 평가를 위하여 MTT 분석을 실시하였다. 간암세포주인 HepG2 세포(1×10⁴cells/웰)를 96웰 플레이트에 seeding하고 다음날 시료 용액이 함유된 RPMI 배지 100㎕를 처리하였다. CO₂ 배양기에서 24시간 배양한 다음 신선한 배지(200㎕)로 치환하고 MTT시약(1mg/mL) 50㎕를 처리하였다. 4시간 후에 배지를 제거하고 DMSO 150㎕를 넣어 생성된 포마잔을 용해하고 ELISA reader 540nm에서 흡광도를 측정하였다.

도 14에 나타난 바와 같이, 처리 농도가 증가함에 따라 암세포의 생장이 억제되어 국내산 미강 추출 토코페롤 및 토코트리에놀은 항암성 효과를 갖는 것으로 나타났으며, 50%의 암세포 억제효과를 나타내는 IC₅₀은 149 ㎍/mL 로 추정되었다.

실험예 3: 최종생산물의 고지혈증 억제효과 평가

최종생산물의 고지혈증 억제효과를 평가하기 위해 3주령의 수컷 BAL B/C 마우스를 기본 식이(BD), 콜레스테롤 식이(CHD), 토코페롤 식이(TPD), 최종생산물 식이(TED)의 4그룹으로 나누었으며, 최종생산물 그룹은 다시 4그룹으로 세분화하여 (TED-1∼TED-4) 농도별 투여를 하였다. 세분화된 모든 군들은 각각 5마리씩 배당하였다. BD군은 샘타코 #31 사료와 물만을 자유롭게 섭취하도록 하였으며, 투여군들은 모든 과정에서 해당 물질을 30일동안 매일 1회 경구 투여를 하고, 사료와 물은 자유 섭취하도록 하였다. 토코페롤과 최종생산물의 혈중 콜레스테롤과 트리아실글리세롤의 농도에 대한 영향을 관찰하기 위해, TPD군과 TED군은 콜레스테롤을 함께 투여하였으며, CHD군에 투여한 동일 농도를 이용하였다(표 2). 또한, BD군을 제외한 모든 군은 미강유를 첨가하여 전체 투여량을 일정하게 유지하였다. 토코페롤은 1,013IU/g의 농도값을 가지는 시그마 제품(T-1539)을 이용하였으며, 콜레스테롤은 정제된 미강유에 26.7mg/mL의 농도로 녹여 사용하였다.

사육한 마우스에서 채혈하여 혈중 콜레스테롤과 트리아실글리세롤, HDL, LDL, 총 단백질 및 알부민의 농도변화와, 아스파테이트 트랜스아미나아제(AST), 알라닌 트랜스미나아제(ALT), 알칼라인 포스파타아제(AP) 및 락테이트 디하이드로게나아제(LDH)의 활성변화를 조사하였다.

	기본 식이	콜레스테롤 (26.7 mg/mL)	토코페롤 (1023 IU/g)	토코트리에놀 (14000 ppm)	미강유
BD	+	-	-	-	-
CHD	+	75	-	-	50
TPD	+	75	0.2	-	49.8
TED-1	+	75	-	1	49
TED-2	+	75	-	5	45
TED-3	+	75	-	10	40
TED-4	+	75	-	50	-

	그룹	개체수	평균값	표준편차	최소값	최대값	던칸그룹	아노바
	그룹	개체수	평균값	표준편차	최소값	최대값	던칸그룹	평균	F	Pr>F
콜레스테롤(mg/dL)	BD	5	152.0	37.61	120	213	A	160.24	0.86	0.542
	CHD	4	144.5	11.47	134	160	A
	TPD	5	169.0	32.54	133	213	A
	TED-1	4	173.8	25.11	142	200	A
	TED-2	4	165.8	22.04	145	194	A
	TED-3	4	172.5	28.41	136	205	A
	TED-4	3	140.3	33.62	118	179	A
트리아실글리세롤(mg/dL)	BD	5	163.8	46.10	106	225	AB	161.62	3.75	0.010
	CHD	4	190.3	4.34	184	194	AB
	TPD	5	205.8	35.09	147	230	AA
	TED-1	4	159.0	54.85	102	220	BC
	TED-2	4	139.0	35.83	100	184	CC
	TED-3	4	187.5	38.44	135	220	AB
	TED-4	3	178.7	46.06	128	218	AB
HDL(mg/dL)	BD	5	95.4	18.06	72	120	AB	101.97	1.75	0.157
	CHD	4	86.3	9.84	75	99	BB
	TPD	5	107.0	16.84	86	123	AB
	TED-1	4	116.0	21.80	85	135	AA
	TED-2	4	102.0	8.44	94	113	AB
	TED-3	4	109.5	9.75	103	124	AB
	TED-4	3	96.7	14.84	84	113	AB
LDL(mg/dL)	BD	5	12.2	3.90	9	19	AB	9.586	1.41	0.255
	CHD	4	9.8	1.71	8	12	AB
	TPD	5	7.6	2.41	5	10	AB
	TED-1	4	6.5	1.91	4	8	AB
	TED-2	4	14.5	12.40	7	33	AA
	TED-3	4	10.3	5.56	5	18	AB
	TED-4	3	5.0	1.0	4	6	BB

표 3에 나타난 바와 같이, 혈중 콜레스테롤의 농도는 동일 군내에서도 개별 변이가 큰 것으로 나타났다. ANOVA 테스트결과 각 군들은 서로 유의하지 않았다(P=0.542). 따라서, 본 실험에서 적용된 군들의 혈중 콜레스테롤 농도의 변화현상은 나타나지 않은 것으로 사료된다.

혈중 트리아실글리세롤의 농도도 동일군내에서 개체간의 변이가 크게 보였지만, ANOVA 테스트결과 각 그룹간 매우 유의한 것으로 나타났다(P=0.010). 따라서, 최종생산물의 섭취는 혈중 트리아실글리세롤을 강하시키며 그 효과가 토코페롤보다 훨씬 큰 것으로 사료된다.

각 그룹별 혈중 HDL의 농도는 ANOVA 테스트결과 낮은 유의성을 보였다 (P=0.157), 그러나 Duncan grouping 시 식이군들은 AA, AB, BB의 3 그룹으로 나뉘어지며 콜레스테롤을 섭취한 CHD군이 BB그룹으로 가장 낮은 평균값을 보였으며, AA그룹인 TED-1군이 가장 높은 농도를 나타내었다. TPD군과 TED-2, TED-3군도 AB그룹으로 BD군이나 CHD군보다 높은 혈중 HDL의 농도를 가지는 것으로 나타나 토코페롤과 최종생산물은 모두 혈중 HDL의 농도를 증가시키는 것으로 여겨진다.

식이군들의 혈중 LDL의 농도는 분석 항목 중 가장 큰 표준편차를 보였으며 ANOVA 테스트결과 군들간 유의하지 않은 것으로 나타났다(P=0.255). 그러나 특히 큰 편차를 보이는 TED-2군과 3군을 제외하면 대상군들은 매우 유의한 수준을 보이고(P<0.02), 토코페롤과 최종생산물이 모두 혈중 LDL 농도의 저하를 유도하는 것으로 판단되며, Duncan grouping을 통하여 최종생산물이 토코페롤 보다 더 큰 효과를 보임을 알 수 있다.

	그룹	개체수	평균값	표준편차	최소값	최대값	던칸그룹	아노바
								평균	F	Pr>F
											AST (IU/L)	CHD	4	542.25	304.09	165.0	813.0	AA	295.5	3.57	0.0548
												TPD	5	212.40	109.44	100.0	356.0	AB
												TED-3	3	148.00	36.39	126.0	190.0	BB
TED-4	2	231.00	15.56	220.0	242.0	AB
AT (IU/L)	CHD	4	54.75	36.57	29.0	109.0	A	42.00	0.77	0.5352
	TPD	5	41.20	14.41	23.0	57.0	A
	TED-3	3	30.00	7.00	22.0	35.0	A
	TED-4	2	36.50	0.71	36.0	37.0	A
AP (IU/L)	CHD	4	84.75	18.66	61.0	102.0	AB	80.29	1.71	0.2276
	TPD	5	77.60	19.09	63.0	99.0	AB
	TED-3	3	96.33	28.15	70.0	126.0	AA
	TED-4	2	54.00	18.38	41.0	67.0	BB
LDH (IU/L)	CHD	4	2579.25	325.30	2120	2851	AA	1964.4	11.17	0.0016
	TPD	5	2118.20	436.81	1636	2834	AB
	TED-3	3	1132.00	229.83	883	1336	CC
	TED-4	2	1599.00	1.41	1598	1600	BC

표 4에 나타난 바와 같이, 혈중 아스파테이트 트랜스미나아제(AST)의 농도는 식이군내 개별 변이가 크게 나타났고, Duncan grouping을 통하여 AA, AB, BB의 3그룹으로 분류되며 토코페롤과 최종생산물 모두 혈중 AST의 활성을 저하시키는 것으로 나타났다. 또한 CHD군과 TPD의 표준편차가 매우 큰 반면 TED군들은 개체변이가 훨씬 작게 나타나 최종생산물이 토코페롤 보다 간 기능의 보호에 더 큰 효과를 가지는 것으로 사료된다.

혈중 알라닌 트랜스미나아제(ALT)의 활성은 식이군내 개체 변이가 크게 나타났으며 ANOVA 테스트결과 각 군들은 유의하지 않았다(P=0.5352). 그러나 TED군들은 매우 낮은 표준편차를 나타내어 최고 활성들이 CHD와 TPD군의 값들보다 모두 낮게 나왔다. 비록 CHD군과 TPD군의 높은 표준편차와 적은 표본수로 인하여 통계적 유의성은 떨어지지만 최종생산물의 섭취가 TED군에서의 혈중 AST와 ALT 활성을 안정되고 낮게 유지하는 결과는 최종생산물의 간기능 회복이나 보호 효과를 증명한다고 할 수 있다.

혈중 알칼라인 포스파타아제(AP)의 활성도 AST와 ALT같이 혈액검사를 통한 간 기능검사의 부분적 지표로 이용된다. ANOVA 테스트결과 유의하지는 않았지만, Duncan grouping으로 AA, AB, BB 3 그룹으로 분류되었다. 그러나 큰 개체 변이로 인하여 각 군들간의 일관된 변화양상은 볼 수 없었다.

혈중 락테이트 디하이드로게나아제(LDH)의 활성은 비지질성 혈액성분 분석에서 그룹간 유의성이 가장 크게 나타났으며(P=0.0016), 4그룹으로 분류되어 TPD군과 TED군의 효과가 뚜렷하게 보였다. 특히, TED군은 그 효과가 TPD군보다 더 크게 나왔으며 CHD군에 비해 최고 60%의 활성 감소를 보였다. 따라서 최종생산물은 간조직 뿐만 아니라 심장이나 뇌 등의 다양한 조직에서 손상을 회복시키거나 기능을 보호하는 효과를 가지는 것으로 판단된다.

한편, 혈중 총 단백질과 알부민은 측정한 모근 군에서 전체적으로 농도의 변화가 나타나지 않아 최종생산물은 이들에게 영향을 미치지 않는 것을 나타났다(미도시됨).

실험예 4: 랫드를 이용한 최종생산물의 독성평가

최종생산물의 랫드를 이용한 단회 경구투여 독성시험은 식품의약품안전청고시 제1999-61호(1999년 12월 22일) '의약품등의 독성시험기준'에 준하여 실시하였다.

시험물질 원액을 8주령의 Sprague Dawley(SD)계통의 특정병원균 부재(SPF) 랫드 암수에 경구투여하며, 투여는 당일 체중을 기준으로 투여량을 계산하여 당일 오전 1회 투여하였다. 시험물질의 투여량은 2,000mg/kg까지를 투여하고 그 아래로 4개의 용량군(250, 500, 1000, 1500 m/kg)을 추가하였다. 대조군으로는 무처치 대조군을 두었다.

그 결과, 전 시험기간 동안 모든 시험군에서 사망동물은 관찰되지 않았다. 따라서 본 시험에서 랫드의 최소치사량은 2,000mg/kg을 상회하는 것으로 판단되었다. 본 시험에서 일반증상의 변화는 관찰되지 않았다. 암수 모두에서 전 시험기간 동안 유의성 있는 체중변화는 관찰되지 않았다. 부검소견에서 시험물질의 투여와 관련된 특기할 만한 변화는 관찰되지 않았다.

실시예 4: 미강추출물을 이용한 고기능성 토코트리에놀 제제의 제조

미강추출물을 이용한 고기능성 토코트리에놀 제제를 제조하기 위해, 미강의 헥산 추출 원유 1.5kg에 에탄올 18L, 아스코르브산 200g, KOH(44%) 900mL를 첨가하고, 80℃, 18분간 비누화 반응을 실시하였다. 냉각된 반응물에 헥산 18L로 2회 분획하고 1회 물세척후 헥산을 증류 제거한 후 얻어진 헥산수집액을 -20℃에서 24시간 저온 처리후 원심분리하여 얻은 상징액을 다시 감압농축하여 헥산을 제거한 후 에탄올을 첨가하고 다시 저온 처리 및 원심분리한 후 에탄올을 감압농축, 제거하여 최종생산물을 얻었다.

최종생산물은 점도가 높은 액체상의 물질로 이를 이용하여 분말 형태의 제품을 생산코자 최종생산물 38g에 흡착용 SiO₂(약전용) 16g 및 산화방지용 아스코르브산(약전용) 5g을 가하고 유발 및 유봉을 이용하여 혼합하여 bulk powder를 생산하였다. 상기 bulk powder를 60℃ 조건에서 24시간동안 진공 건조하여 수분을 제거한 후, 유발과 유봉을 이용하여 곱게 분쇄하였다. 분쇄된 분말 제형의 제품은 캡슐 포장을 위하여 0호 캡슐(약전용)에 캡슐 당 분말 제품 500mg이 함유되도록 수동 캡슐 충진기로 충진하고, 이를 다시 PTP포장기로 1 판당 10개 캡슐이 되도록 PTP 포장을 수행하였다.

상기 실시예와 실험예에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 미강 내 토코트리에놀의 대량생산방법 및 이를 이용한 고기능성 토코트리에놀 제제에 관한 것으로, 벼의 도정율을 조정하여 토코트리에놀의 함량을 최대로 하고, 적절한 미강 원료를 선택하고, 최적의 추출용매와 온도 조건 및 비누화 반응조건을 확립하고, 최종 생산물의 순도와 안정성을 평가함으로써 미강에서 토코트리에놀을 대량생산하는 방법을 제공하는 뛰어난 효과가 있다. 또한, 본 발명은 상기 미강의 최종생산물의 항산화력, 항암 및 고지혈증 억제효과와 독성평가를 통해 미강 최종생산물의 고기능성 토코트리에놀 제제로의 이용가능성을 제공하고 있다. 따라서, 이를 바탕으로 제조된 미강 최종생산물을 이용한 고기능성 토코트리에놀 제제를 제공하는 뛰어난 효과가 있으므로 본 발명은 기능성식품원료산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

미강 내 토코트리에놀의 생산방법에 있어서,

미강의 헥산 추출 원유 1.5kg에 에탄올 18L, 아스코르브산 200g, KOH(44%) 900mL를 첨가하고, 80℃, 18분간 비누화 반응을 실시하는 단계,

냉각된 반응물에 헥산 18L로 2회 분획하고 1회 물세척후 헥산을 증류 제거한 후 얻어진 헥산수집액을 -20℃에서 24시간 저온 처리후 원심분리하여 상징액을 얻는 단계,

상기 상징액을 다시 감압농축하여 헥산을 제거한 후 에탄올을 첨가하고 다시 상기 단계에서의 조건에서 저온 처리 및 원심분리한 후 에탄올을 감압농축, 제거하여 최종생산물을 얻는 단계를 포함함을 특징으로 하는 미강 내 토코트리에놀 대량생산방법.
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