KR20040078652A - 관절염 치료약 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항 FGF-8 항체를 유효 성분으로 함유하는 관절염 예방약 또는 치료약, 연골 보호제, 관절 파괴 억제제, 활막 증식 억제제 및 항 FGF-8 항체를 유효 성분으로 함유하는 관절염 진단약, 그리고 그 항체를 사용한 관절염의 판정 방법을 제공한다.

Description

관절염 치료약 {REMEDIES FOR ARTHRITIS}
고령자 사회에서 관절 증상을 호소하는 사람은 확실히 증가하고 있다. 관절 질환의 대표적인 변형성 관절증, 또는 관절 류머티즘 등의 질환의 조기 진단이나 스크리닝, 또는 환자의 예후 판정을 정확하게 하는 것은 대단히 중요하고, 그 치료가 많은 고령자들의 생활의 질을 향상시키게 되겠지만 아직도 충분한 진단이나 치료 방법이 확립되어 있지 않다.
관절 연골은 관절의 가동면을 덮는 소수의 연골 세포와 풍부한 세포외 매트릭스가 많은 조직으로, 혈관이나 신경은 분포되어 있지 않고 주로 관절 내면을 덮는 활막에서 산생되는 활액으로부터 영양을 보급받고 있다. 또한 무혈관일 뿐만 아니라, 혈관망이 풍부한 주위 조직으로부터의 혈관의 침입에 대해 강한 저항성을 나타낸다. 연골 세포는 세포외 매트릭스 합성, 분해의 양면을 복잡하게 제어하고, 세포외 매트릭스의 항상성 유지에 중심적 역할을 담당하고 있다. 사이토카인, 성장 인자 등의 화학적 인자나 하중 부하 등의 역학적 인자는 연골 세포에작용하고, 세포외 매트릭스 합성, 분해의 양자의 밸런스를 변경함으로써, 세포외 매트릭스 대사에 영향을 미친다.
변형성 관절증은 나이가 들거나 기계적 스트레스가 원인이 되어 관절 연골 표면의 붕괴와, 이에 수반되는 관절변연의 새로운 연골의 증식, 관절의 변형, 적합성의 파탄을 초래하고, 또한 관절 활막의 염증으로 진행한다. 변형성 관절염은 관절 연골의 지행 변성으로, 종종 통증과 기능 상실을 특징으로 하는 단일 단절염 질환이다 (Manek M. J. and Lane N. E., Am. Fam. Physician, 61, 1795-1804, 2000).
관절 류머티즘에서는 면역 이상이나 감염증이 원인이 되어 활막에 염증성 세포가 침윤하고, 나아가 혈관 신생에 수반하여 활막 선유아 세포의 증식이 항진되어 판누스라고 불리는 염증성 활막 육아 조직이 형성된다. 판누스가 형성되면 뼈나 연골의 파괴가 진행되어 관절에 불가역적인 장해가 초래된다. 뼈나 연골이 파괴되는 과정에서는 다량으로 존재하는 콜라겐이나 프로테오글리칸 등의 각종 세포외 매트릭스가 분해된다.
변형성 관절증 또는 관절 류머티즘 등의 관절염에서, 활막 염증 및 세포외 매트릭스의 파괴가 관절 연골의 기능 상실로 이어진다.
변형성 관절염과 관절 류머티즘은 병인론적으로 전혀 다른 질환이지만, 관절 연골 파괴 기구에 있어서 많은 공통점을 갖는다. 관절 활액 및 활막ㆍ연골 등의 관절 국소에서 다종류의 매트릭스 메탈로프로테아제가 산생ㆍ분비되고, 관절 국소에 매트릭스 메탈로프로테아제가 과잉되게 검출된다. 매트릭스 메탈로프로테아제는 다종류의 세포외 매트릭스를 분해하기 때문에, 이 점이 관절 파괴의 한 원인으로 되어 있다. 이들 산생은 염증 활막, 매크로퍼지, 호중구 뿐만 아니라 연골 세포로부터도 산생되지만, 그 산생은 동일한 관절 국소에서 산생 분비되는 각종 사이토카인, 활성 산소, 일산화질소, 프로스타그란딘, 성장 인자 등에 의해 조절되고 있다. 이들은 활막 세포, 연골 세포로부터의 매트릭스 메탈로프로테아제의 산생을 유도하여 세포외 매트릭스의 분해를 촉진하는 것도 보고되고 있다.
이들 보고를 통해, 변형성 관절증이나 관절 류머티즘 외에, 자기 항체의 출현과 면역 복합체의 조직 침착에 의한 염증성 조직 상해가 관찰되는 원인 불명의 질환에서, 관절 증상이 높은 비율로 출현하는 전신성 홍반성 루프스, 강직성 관절염, 건선증 환자에게 합병되는 활막 증식을 수반하여 골 파괴로까지 이르는 건선성 관절염, 추간판의 세포외 매트릭스의 파괴가 관찰되는 추간판 질환, 급성 결정성 활막염 (통풍, 위(僞)통풍) 등의 관절염 질환 (히로하타 카즈시 등 편저, 류머티즘학, 도분쇼잉 1989년) 에 있어서, 활막의 증식이나 연골 파괴를 억제함으로써 치료할 수 있다고 생각된다.
종래, 관절 류머티즘의 약물 요법은 주로 관절의 동통 및 염증을 경감하기 위해, 각종 비스테로이드성 항염증약, 프레드니졸론 등의 스테로이드제나 메토트렉세이트를 비롯한 항류머티즘약이 사용되고 있다 (치료, 78, 3553-3558, 난잔도, 1996). 변형성 관절증에서는 동통 및 염증의 제거를 위해 각종 비스테로이드성 항염증약이나 진통제 또는, 관절 주입제 히알루론산 제제 등의 투여가 행해져 왔다. 연골 파괴를 억제하는 히알루론산은 연골 보호제로 사용되고 있다(Creamer P., J. Rheum., 20, 1461-1464, 1993, Arthritis Rheum., 43, 1905-1915, 2000). 또한 이학 요법이나 골절단술, 인공 관절 치환술 등의 수술 요법도 행해지고 있다. 전신성 홍반성 루프스에서는 비스테로이드성 항염증약이나 프레드니졸론 등의 스테로이드제, 강직성 관절염에는 비스테로이드성 항염증약이나 항류머티즘약인 설파살라진, 건선증 환자에게 합병되는 활막 증식을 수반하여 골 파괴로까지 이르는 건선성 관절염에서는 비스테로이드성 항염증약, 항류머티즘약이나 스테로이드의 관절내 주입, 추간판의 세포외 매트릭스의 파괴가 관찰되는 추간판 질환에서는 비스테로이드성 항염증약이나 진통약, 급성 결정성 활막염에서는 비스테로이드성 항염증약이나 콜히친 등이 사용되고 있으나 (히로하타 카즈시 등 편저, 류머티즘학, 도분쇼잉 1989년), 이러한 약물 요법은 대증요법으로, 관절 파괴를 충분히 억제하기는 어렵다.
현재, 관절 류머티즘의 치료에서는 관절 파괴를 조금이라도 예방하고자 하는 적극적인 치료법의 선택이 받아들여지고 있는 추세에 있고, 가급적 빠른 단계에서 관절 류머티즘으로 진단하여 메토트렉세이트를 비롯한 항류머티즘약을 어떻게 하면 적절하게 선택해나갈 것인지가 포인트로 되어 있는데, 충분한 진단법은 아직 없다.
생체내에 존재하는 다양한 성장 인자의 일종인 선유아 세포 증식 인자 (이하, FGF 라고 약기함) 는 혈관 내피 세포에 작용하는 헤파린 결합성 증식 인자로서 알려져 있다. 또한, FTF 패밀리에는 19 종류 이상 있고, FGF-2 (basic FGF) 나 FGF-1 (acidic FGF) 등이 오래전부터 알려져 있다. FGF 수용체는 현재까지 7 종류 발견되었으며, 티로신키나제를 세포내 영역에 코드하고 있다.
FGF-8 은 안드로젠 유도 증식 인자 (AIGF) 로서 성호르몬 의존적 증식을 나타내는 마우스 유암 세포주 SC-3 (Nakamura N. et al., J. Steroid Biochem., 27, 459-464, 1987) 의 배양 상청 중에서 단리된 인자이고, 안드로젠 자극에 의해 유도 산생되고, 오토클라인적으로 SC-3 세포를 증식시키는 증식 인자이다 (Tanaka A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 8928-8932, 1992). FGF-8 은 전립선암의 세포나 섬유아 세포의 증식을 촉진시키는 것이 보고되어 있다 (Tanaka A. et al., FEBS Lett., 363, 226-230, 1995). FGF-8 은 FGF 리셉터-2IIIc, FGF 리셉터-3IIIc, FGF 리셉터-4 의 3 종의 리셉터에 결합하는 것이 보고되어 있다 (Ornitz D. M. et al., J. Biol. Chem., 271, 15292-15297, 1996). 또한 FGF 의 작용에는 신데칸 등의 막형 헤파란 황산 프로테오글리칸과의 결합이 불가결하다. 헤파란 황산과의 결합은 FGF 를 안정적으로 국소에 축적하기 위해서도 필요하다. 염증 등의 조직 개변의 상황에서는 헤파란 황산이 분해됨으로써, 세포외 매트릭스로부터 FGF 가 유리되어 그 활성을 발휘하는 것으로 생각된다. 연골 중에는 FGF-2 와 같은 강한 혈관 신생 인자가 함유되어 있다 (Satoh H. et al., J. Biol. Chem., 273, 12307-12315, 1998). 또한 관절염에서는 활막 세포, 연골 세포 및 침입한 염증 세포가 현저히 높은 레벨의 FGF-1 이나 FGF-2 를 합성하고 (Sano H. et al., J. Cell Biol., 110, 1417-1426, 1990, Remmers E. F., Growth factors, 2, 179-188, 1990), 류머티즘 환자의 관절액 중의 FGF-2 농도는 관절 증상과 상관한다 (Manabe N. et al., Rheumatology, 38, 714-720, 1999). FGF-2 는 변형성 관절증에서의 골극 형성에 관여하고 있다 (Uchino M. el al., Clin. Orthop., 377,119-125, 2000). 이들 보고는 FGF-1 이나 FGF-2 가 관절염에 관여하는 것을 나타내고 있다.
FGF-8 녹아웃 마우스를 사용한 보고에서는 FGF-8 이 관절의 발생 단계에 발현한다고 되어 있는데 (Haraguchi R. et al., Development, 127, 2471-2479, 2000; Lewandoski M. et al., Nat. Genet., 26, 460-463, 2000), FGF-8 의 관절염에 대한 관여는 알려져 있지 않다.
본 발명은 항 FGF-8 항체를 유효 성분으로 함유하는 관절염 예방약 또는 치료약, 관절 파괴 억제제, 연골 보호제, 활막 증식 억제제 및 관절염 진단약, 그리고 그 항체를 사용한 관절염의 판정 방법에 관한 것이다.
도 1 은 토끼 연골 세포의 FGF-8 에 의한 세포외 매트릭스의 분해 작용을 나타내는 도면이다. 종축은 세포외 매트릭스 중에 남은 글리코사미노글리칸의 양을, 횡축은 FGF-8 의 농도 (ng/mL) 를 나타내고 있다. 값은 평균값 ±표준 오차를 의미하고, *** 는 P ＜ 0.001 (무자극군 대비, Dunnett 검정) 을 나타낸다.
도 2 는 토끼 연골 세포의 FGF-8 에 의한 세포외 매트릭스의 분해에 대한 항 FGF-8 중화 항체 KM1334 의 저해 작용을 나타내는 도면이다. 종축은 세포외 매트릭스 중에 남은 글리코사미노글리칸의 양을, 횡축은 KM1334 의 농도 (㎍/mL) 를 나타내고 있다. 값은 평균값 ±표준 오차를 의미하고, ### 는 P ＜ 0.001 (무자극군 대비, Student 의 t-검정) 을 나타내고, ** 는 P ＜ 0.01, *** 는 P ＜ 0.001 (0 군 대비, Dunnett 검정) 을 나타낸다.
도 3 은 토끼 연골 세포의 FGF-8 에 의한 매트릭스 메탈로프로티나제-3 산생의 촉진과 항 FGF-8 중화 항체 KM1334 에 의한 저해 작용을 나타내는 도면이다. 종축은 배양액 중의 매트릭스 메탈로프로티나제-3 의 양 (ng/웰) 을, 횡축은 KM1334 의 농도 (㎍/mL) 를 나타내고 있다. 값은 평균값 ±표준 오차를 의미하고, ## 는 P ＜ 0.01 (무자극군 대비, Aspin-welch 검정) 을 나타내고, *** 는 P ＜ 0.001 (0 군 대비, Dunnett 검정) 을 나타낸다.
도 4 는 토끼 연골 세포의 FGF-8 에 의한 증식의 촉진 작용을 나타내는 도면이다. 종축은 토끼 활막 세포에 수용된 [3H] 티미딘의 방사 활성을, 횡축은 FGF-8 의 농도 (ng/mL) 를 나타내고 있다. 값은 평균값 ±표준 오차를 의미하고, * 는 P ＜ 0.05 (무자극군 대비, steel 검정) 을 나타낸다.
도 5 는 토끼 연골 세포의 FGF-8 에 의한 증식의 촉진에 대한 항 FGF-8 중화 항체 KM1334 의 저해 작용을 나타내는 도면이다. 종축은 토끼 활막 세포에 수용된 [3H] 티미딘의 방사 활성을, 횡축은 KM1334 의 농도 (㎍/mL) 를 나타내고 있다. 값은 평균값 ±표준 오차를 의미하고, ### 는 P ＜ 0.001 (무자극군 대비, Student 의 t-검정) 을 나타내고, *** 는 P ＜ 0.001 (0 군 대비, Dunnett 검정) 을 나타낸다.
도 6 은 인간 활막 세포의 FGF-8 에 의한 증식의 촉진 작용을 나타내는 도면이다. 종축은 인간 활막 세포에 수용된 [3H] 티미딘의 방사 활성을, 횡축은 FGF-8 의 농도 (ng/mL) 를 나타내고 있다. 값은 평균값 ±표준 오차를 의미하고, *** 는 P ＜ 0.001 (무자극군 대비, Dunnett 검정) 을 나타낸다.
도 7 은 인간 활막 세포의 FGF-8 에 의한 증식의 촉진에 대한 항 FGF-8 중화 항체 KM1334 의 저해 작용을 나타내는 도면이다. 종축은 인간 활막 세포에 수용된 [3H] 티미딘의 방사 활성을, 횡축은 KM1334 의 농도 (㎍/mL) 를 나타내고 있다. 값은 평균값 ±표준 오차를 의미하고, ### 는 P ＜ 0.001 (무자극군 대비, Aspin-Welch 검정) 을 나타내고, * 는 P ＜ 0.05 (0 군 대비, steel 검정) 을 나타낸다.
도 8 은 FGF-8 의 주입에 의한 관절의 세포외 매트릭스의 분해를 나타내는 도면이다. 종축은 관절 세정액 중의 글리코사미노글리칸 농도 (㎍/mL) 를 나타내고 있다. 값은 평균값 ±표준 오차를 의미하고, ** 는 P ＜ 0.01 (생리 식염액 주입군 대비, Student 의 t-검정) 을 나타낸다.
도 9 는 FGF-8 의 주입에 의한 관절의 슬개골의 파괴를 나타내는 도면이다. 종축은 슬개골 중량 (㎎) 을 나타내고 있다. 값은 평균값 ±표준 오차를 의미하고, * 는 P ＜ 0.05 (생리 식염액 주입군 대비, Student 의 t-검정) 을 나타낸다.
도 10 은 콜라겐 관절염 발증 마우스에서의 관절염 스코어의 경시 변화에 대한 항 FGF-8 중화 항체 KM1334 의 저해 작용을 나타내는 도면이다. 종축은 관절염 스코어를, 횡축은 콜라겐 초회 감작일로부터의 경과 일수를 나타내고 있다. 값은 평균값 ±표준 오차를 의미하고, * 는 P ＜ 0.05 (생리 식염액 투여군 대비, Wilcoxon 순위합 검정) 를 나타내고, # 는 P ＜ 0.05 (용매 투여군 대비, Wilcoxon 순위합 검정) 를 나타낸다.
도 11 은 면역 보강제 관절염 발증 래트에서의 면역 보강제 비처치 발의 발 용적 증가에 대한 항 FGF-8 중화 항체 K1334 의 저해 작용을 나타내는 도면이다. 종축은 발 용적 (mL) 을 나타낸다. 값은 평균값 ±표준 오차를 의미하고, ### 는 P ＜ 0.001 (미처치군 대비, Aspin-Welch 검정) 를 나타내고, ** 는 P ＜ 0.01 (생리 식염액 투여군 대비, Student 의 t-검정) 를 나타낸다.
도 12 는 면역 보강제 관절염 발증 래트에서의 면역 보강제 비처치 발의 발 용적 증가에 대한 디클로페낙나트륨, 메소트렉세이트, 및 프레드니졸론의 저해 작용을 나타내는 도면이다. 종축은 발 용적 (mL) 을 나타낸다. 값은 평균값 ±표준 오차를 의미하고, ### 는 P ＜ 0.001 (미처치군 대비, Aspin-Welch 검정) 를 나타내고, *** 는 P ＜ 0.001 (용매 투여군 대비, Student 의 t-검정) 를 나타내고, ††는 P ＜ 0.01, †††는 P ＜ 0.001 (용매 투여군 대비, Aspin-Welch 검정) 을 나타낸다.
도 13 은 면역 보강제 관절염 발증 래트 뇨 중의 글로코사미노글리칸량 상승에 대한 항 FGF-8 중화 항체 KM1334 의 저해 작용을 나타내는 도면이다. 종축은 글루코사미노글리칸 농도/크레아티닌 농도비 (㎍/㎎) 를 나타낸다. 값은 평균값 ±표준 오차를 의미하고, ### 는 P ＜ 0.001 (미처치군 대비, Aspin-Welch 검정) 를 나타내고, ** 는 P ＜ 0.01 (생리 식염액 투여군 대비, Student 의 t-검정) 을 나타낸다.
도 14 는 면역 보강제 관절염 발증 래트 뇨 중의 글리코사미노글리칸량 상승에 대한 디클로페낙나트륨, 메소트렉세이트, 및 프레드니졸론의 저해 작용을 나타내는 도면이다. 종축은 글리코사미노글리칸 농도/크레아티닌 농도비 (㎍/㎎) 를 나타낸다. 값은 평균값 ±표준 오차를 의미하고, ## 는 P ＜ 0.01 (미처치군 대비, Aspin-Welch 검정) 를 나타내고, * 는 P ＜ 0.05 (용매 투여군 대비, Student 의 t-검정) 을 나타낸다.
도 15 는 면역 보강제 관절염 발증 래트 뇨 중의 데옥시피리디놀린량 상승에 대한 항 FGF-8 중화 항체 KM1334 의 저해 작용을 나타내는 도면이다. 종축은 데옥시피리디놀린 농도/크레아티닌 농도비 (n㏖/m㏖) 를 나타낸다. 값은 평균값 ±표준 오차를 의미하고, ### 는 P ＜ 0.001 (미처치군 대비, Aspin-Welch 검정) 를 나타내고, * 는 P ＜ 0.05 (용매 투여군 대비, Student 의 t-검정) 을 나타낸다.
도 16 은 면역 보강제 관절염 발증 래트 뇨 중의 데옥시피리디놀린량 상승에 대한 디클로페낙나트륨, 메소트렉세이트, 및 프레드니졸론의 저해 작용을 나타내는도면이다. 종축은 데옥시피리디놀린 농도/크레아티닌 농도비 (n㏖/m㏖) 를 나타낸다. 값은 평균값 ±표준 오차를 의미하고, ### 는 P ＜ 0.001 (미처치군 대비, Student 의 t-검정) 을 나타내고, ** 는 P ＜ 0.01 (용매 투여군 대비, Student 의 t-검정) 을 나타낸다.
도 17 은 면역 보강제 관절염 발증 래트 뇨 중의 히드록시프롤린량 상승에 대한 항 FGF-8 중화 항체 KM1334 의 저해 작용을 나타내는 도면이다. 종축은 히드록시프롤린 농도/크레아티닌 농도비 (㎍/㎎) 를 나타낸다. 값은 평균값 ±표준 오차를 의미하고, ### 는 P ＜ 0.001 (미처치군 대비, Student 의 t-검정) 을 나타낸다.
도 18 은 모노요오드 아세트산 유발 변형성 관절증 모델 래트에서의 관절 연골 파괴에 대한 항 FGF-8 중화 항체 KM1334 의 저해 작용을 나타내는 도면이다. 종축은 관절 세정액 중의 클리코사미노글리칸 농도 (㎍/mL) 를 나타낸다. 값은 평균값 ±표준 오차를 의미하고, ## 는 P ＜ 0.01 (위(僞)수술군 대비, Aspin-Welch 검정) 을 나타내고, * 는 P ＜ 0.05 (생리 식염액 투여군 대비, Aspin-Welch 검정) 를 나타낸다.
도 19 는 플라스미드 pKM1334CH-H5 의 조성 공정을 나타낸 도면이다.
도 20 은 플라스미드 pKM1334CH-L4의 조성 공정을 나타낸 도면이다.
도 21 은 플라스미드 pKANTEX1334 의 조성 공정을 나타낸 도면이다.
도 22 는 항 FGF-8 중화 마우스 항체 KM1334, 항 FGF-8 중화 키메라 KM3034 및 KM3334 의 마우스 유암 세포주 SC-3 세포의 FGF-8 의존성 증식에 대한 중화 활성을 나타낸 도면이다. 횡축이 항체 농도 (㎍/mL), 종축이 FGF-8 만을 첨가한 경우의 증식을 100% 로 한 경우의 상대 증식 (%) 을 나타낸다. ○이 KM1334, □가 KM3034, △ 가 KM3334, ×가 음성 대조인 KM2760 의 활성을 나타낸다.
도 23 은 플라스미드 pKM1334HV0 의 조성 공정을 나타낸 도면이다.
도 24 는 플라스미드 pKANTEX1334HV0LV0 의 조성 공정을 나타낸 도면이다.
도 25 는 항 FGF-8 중화 키메라 항체 KM3334, 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체 HV0LV0, HV0LV6, HV6LV6 의 FGF-8 에 대한 결합 활성을 ELISA 에 의해 측정한 결과를 나타낸 도면이다. 횡축이 항체 농도 (㎍/mL), 종축이 결합 활성 (OD415) 을 나타낸다. △ 가 KM3334, ○가 HV0LV0, □가 HV0LV6, ×가 HV6LV6 의 활성을 나타낸다.
도 26 은 항 FGF-8 중화 키메라 항체 KM3334, 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체 HV0LV0, HV0LV6, HV6LV6 의 FGF-8 에 대한 결합 활성을 BIAcore 2000 에 의해 측정한 결과를 나타낸 도면이다. 횡축이 시간 (초), 종축이 공명 시그널 (RU) 을 나타낸다.
도 27 은 플라스미드 pKM1334LV3-1 의 조성 공정을 나타낸 도면이다.
도 28 은 플라스미드 pKM1334LV4-2 의 조성 공정을 나타낸 도면이다.
도 29 은 플라스미드 pKM1334LV3-2 의 조성 공정을 나타낸 도면이다.
도 30 은 항 FGF-8 중화 키메라 항체 KM3034, 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체 HV0LV0/CHO, HV0LV6/CHO, HV0LV4-1/CHO, HV0LV4-2/CHO, HV0LV3-1/CHO, HV0LV3-2/CHO, HV0LV2-1/CHO, HV0LV2-2/CHO 의 FGF-8 에 대한 결합 활성을 BIAcore 2000 에 의해 측정한 결과를 나타낸 도면이다. 횡축이 시간 (초), 종축이 공명 시그널 (RU) 을 나타낸다.
도 31 은 항 FGF-8 중화 키메라 항체 KM3034, 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체 HV0LV6/CHO, HV0LV4-1/CHO, HV0LV3-1/CHO, HV0LV2-1/CHO 의 마우스 유암 세포주 SC-3 세포의 FGF-8 의존성 증식에 대한 중화 활성을 나타낸 도면이다. 횡축이 항체 농도 (㎍/mL), 종축이 FGF-8 만을 첨가한 경우의 증식을 100% 로 한 경우의 상대 증식 (%) 을 나타낸다. ○가 KM3034, ●가 HV0LV6/CHO, ◇ 가 HV0LV4-1/CHO, △ 가 HV0LV3-1/CHO, □가 HV0LV2-1/CHO, ×가 음성 대조인 KM2760 의 활성을 나타낸다.
도 32 는 플라스미드 pKM1334LV3-3 의 조성 공정을 나타낸 도면이다.
도 33 은 항 FGF-8 중화 키메라 항체 KM3034, 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체 HV0LV6/CHO, HV0LV3-1/CHO, HV0LV4-3/CHO, HV0LV3-3/CHO 의 FGF-8 에 대한 결합 활성을 BIAcore 2000 에 의해 측정한 결과를 나타내는 도면이다. 횡축이 시간 (초), 종축이 공명 시그널 (RU) 을 나타낸다.
도 34 는 항 FGF-8 중화 키메라 항체 KM3034, 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체 HV0LV6/CHO, HV0LV3-1/CHO, HV0LV4-3/CHO, HV0LV3-3/CHO 의 마우스 유암 세포주 SC-3 세포의 FGF-8 의존성 증식에 대한 중화 활성을 나타낸 도면이다. 횡축이 항체 농도 (㎍/mL), 종축이 FGF-8 만을 첨가한 경우의 증식을 100% 로 한 경우의 상대 증식 (%) 을 나타낸다. ○가 KM3034, ●가 HV0LV6/CHO, △ 가 HV0LV3-1/CHO, ▲가 HV0LV4-3/CHO, ■가 HV0LV3-3/CHO, ×가 음성 대조인 KM2760 의 활성을 나타낸다.
본 발명의 목적은 관절염 예방약 또는 치료약, 관절 파괴 억제제, 연골 보호제, 활막 증식 억제제 및 관절염의 진단약, 그리고 관절염의 판정 방법을 제공하는 데 있다.
발명의 개시
본 발명은 이하의 (1) ∼ (51) 을 제공한다.
(1) FGF-8 에 특이적으로 결합하고, FGF-8 의 활성을 저해하는 항체를 유효 성분으로 함유하는 관절염 예방약 또는 치료약.
(2) FGF-8 에 특이적으로 결합하고, FGF-8 의 활성을 저해하는 항체가 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 (1) 기재의 의약.
(3) 모노클로날 항체가, 하이브리도마가 산생하는 항체, 인간화 항체, 및 이들 항체 단편으로부터 선택되는 항체인 (2) 기재의 의약.
(4) 하이브리도마가 하이브리도마 KM1334 (FERM BP-5451) 인 (3) 기재의 의약.
(5) 인간화 항체가 인간형 키메라 항체 또는 인간형 상보성 결정 영역 (CDR) 이식 항체인 (3) 기재의 의약.
(6) 인간형 키메라 항체가, FGF-8 에 특이적으로 결합하고, FGF-8 의 활성을 저해하는 모노클로날 항체의 항체 중쇄 가변 영역 (VH) 및 항체 경쇄 가변 영역 (VL), 그리고 인간 항체의 항체 중쇄 정상 영역 (CH) 및 항체 경쇄 정상 영역 (CL) 으로 이루어지는 인간형 키메라 항체인 (5) 기재의 의약.
(7) 인간형 키메라 항체가 이하의 (a) ∼ (c) 중 어느 하나의 인간형 키메라 항체인 (6) 기재의 의약.
(a) VH 가 서열 번호 5 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 키메라 항체
(b) VL 이 서열 번호 6 으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 키메라 항체
(c) VH 가 서열 번호 5 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL 이 서열 번호 6 으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 키메라 항체
(8) 인간형 키메라 항체가 형질 전환체 KM3034 (FERM BP-7836) 가 생산하는 인간형 키메라 항체인 (7) 기재의 의약.
(9) 인간형 CDR 이식 항체가, FGF-8 에 특이적으로 결합하고, FGF-8 의 활성을 저해하는 모노클로날 항체의 VH 및 VL 의 CDR 그리고 인간 항체의 CH 및 CL 을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체인 (5) 기재의 의약.
(10) 인간형 CDR 이식 항체가, FGF-8 에 특이적으로 결합하고, FGF-8 의 활성을 저해하는 모노클로날 항체의 VH 및 VL 의 CDR, 인간 항체의 VH 및 VL 의 프레임 워크 영역 (FR), 그리고 인간 항체의 CH 및 CL 로 이루어지는 인간형 CDR 이식 항체인 (9) 기재의 의약.
(11) 인간형 CDR 이식 항체가 이하의 (a) ∼ (c) 중 어느 하나의 인간형 CDR 이식 항체인 (9) 또는 (10) 기재의 의약.
(a) VH 의 CDR1, CDR2 및 CDR3 이 각각 서열 번호 7, 8 및 9 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
(b) VL 의 CDR1, CDR2 및 CDR3 이 각각 서열 번호 10, 11 및 12 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
(c) VH 의 CDR1, CDR2 및 CDR3 이 각각 서열 번호 7, 8 및 9 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL 의 CDR1, CDR2 및 CDR3 이 각각 서열 번호 10, 11 및 12 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
(12) 인간형 CDR 이식 항체가 이하의 (a) ∼ (c) 중 어느 하나의 인간형 CDR 이식 항체인 (9) 또는 (10) 기재의 의약.
(a) VH 가 서열 번호 18 로 표시되는 아미노산 서열 중, 12 번째의 Lys, 13 번째의 Lys, 40 번째의 Ala, 41 번째의 Pro, 48 번째의 Met, 68 번째의 Val, 70 번째의 Ile, 74 번째의 Thr, 76 번째의 Thr, 82 번째의 Glu, 84 번째의 Ser, 87 번째의 Arg 및 95 번째의 Tyr 로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
(b) VL 이 서열 번호 19 로 표시되는 아미노산 서열 중, 2 번째의 Ile, 3 번째의 Val, 14 번째의 Thr, 15 번째의 Pro, 50 번째의 Gln, 51 번째의 Leu 및 92 번째의 Tyr 로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
(c) VH 가 서열 번호 18 로 표시되는 아미노산 서열 중, 12 번째의 Lys, 13 번째의 Lys, 40 번째의 Ala, 41 번째의 Pro, 48 번째의 Met, 68 번째의 Val, 70 번째의 Ile, 74 번째의 Thr, 76 번째의 Thr, 82 번째의 Glu, 84 번째의 Ser, 87 번째의 Arg 및 95 번째의 Tyr 로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL 이 서열 번호 19 로 표시되는 아미노산 서열 중, 2 번째의 Ile, 3 번째의 Val, 14 번째의 Thr, 15 번째의 Pro, 50 번째의 Gln, 51 번째의 Leu 및 92 번째의 Tyr 로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
(13) 인간형 CDR 이식 항체가 이하의 (a) ∼ (c) 중 어느 하나의 인간형 CDR 이식 항체인 (9) 또는 (10) 기재의 의약.
(a) VH 가 서열 번호 18 또는 20 으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
(b) VL 이 서열 번호 19, 21, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 50 또는 51 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
(c) VH 가 서열 번호 18 또는 20 으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL 이 서열 번호 19, 21, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 50 또는 51 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
(14) 인간형 CDR 이식 항체가 이하의 (a) ∼ (c) 중 어느 하나의 인간형 CDR 이식 항체인 (13) 기재의 의약.
(a) VH 가 서열 번호 18 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL 이 서열 번호 21 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
(b) VH 가 서열 번호 18 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL 이 서열 번호 44 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
(c) VH 가 서열 번호 18 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL 이 서열 번호 50 으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
(15) 인간형 CDR 이식 항체가 이하의 (a) ∼ (c) 중 어느 하나의 인간형 CDR 이식 항체인 (9) 또는 (10) 기재의 의약.
(a) 형질 전환체 KM8037 (FERM BP-8084) 이 생산하는 인간형 CDR 이식 항체
(b) 형질 전환체 KM8035 (FERM BP-8082) 가 생산하는 인간형 CDR 이식 항체
(c) 형질 전환체 KM8036 (FERM BP-8083) 이 생산하는 인간형 CDR 이식 항체
(16) 항체 단편이 Fab, Fab', F(ab')2, 1 본쇄 항체 (scFv), 2 량체화 가변 영역 (V 영역) 단편 (diabody), 디술피드 안정화 V 영역 단편 (dsFv) 및 CDR 을 포함하는 펩티드로부터 선택되는 항체 단편인 (3) 기재의 의약.
(17) FGF-8 에 특이적으로 결합하는 항체를 유효 성분으로 함유하는 관절염의 진단약.
(18) FGF-8 에 특이적으로 결합하는 항체가 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 (17) 기재의 진단약.
(19) 모노클로날 항체가, 하이브리도마가 산생하는 항체, 인간화 항체, 및 이들 항체 단편으로부터 선택되는 항체인 (18) 기재의 진단약.
(20) 하이브리도마가 하이브리도마 KM1334 (FERM BP-5451) 인 (19) 기재의 진단약.
(21) 인간화 항체가 인간형 키메라 항체 또는 인간형 CDR 이식 항체인 (19) 기재의 진단약.
(22) 인간형 키메라 항체가, FGF-8 에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체의 VH 및 VL, 그리고 인간 항체의 CH 및 CL 로 이루어지는 인간형 키메라 항체인 (21) 기재의 진단약.
(23) 인간형 키메라 항체가 이하의 (a) ∼ (c) 중 어느 하나의 인간형 키메라 항체인 (22) 기재의 진단약.
(a) VH 가 서열 번호 5 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형키메라 항체
(b) VL 이 서열 번호 6 으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 키메라 항체
(c) VH 가 서열 번호 5 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL 이 서열 번호 6 으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 키메라 항체
(24) 인간형 키메라 항체가 형질 전환체 KM3034 (FERM BP-7836) 가 생산하는 인간형 키메라 항체인 (23) 기재의 진단약.
(25) 인간형 CDR 이식 항체가, FGF-8 에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체의 VH 및 VL 의 CDR 그리고 인간 항체의 CH 및 CL 을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체인 (21) 기재의 진단약.
(26) 인간형 CDR 이식 항체가, FGF-8 에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체의 VH 및 VL 의 CDR, 인간 항체의 VH 및 VL 의 FR, 그리고 인간 항체의 CH 및 CL 로 이루어지는 인간형 CDR 이식 항체인 (25) 기재의 진단약.
(27) 인간형 CDR 이식 항체가 이하의 (a) ∼ (c) 중 어느 하나의 인간형 CDR 이식 항체인 (25) 또는 (26) 기재의 진단약.
(a) VH 의 CDR1, CDR2 및 CDR3 이 각각 서열 번호 7, 8 및 9 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
(b) VL 의 CDR1, CDR2 및 CDR3 이 각각 서열 번호 10, 11 및 12 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
(c) VH 의 CDR1, CDR2 및 CDR3 이 각각 서열 번호 7, 8 및 9 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL 의 CDR1, CDR2 및 CDR3 이 각각 서열 번호 10, 11 및 12 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
(28) 인간형 CDR 이식 항체가 이하의 (a) ∼ (c) 중 어느 하나의 인간형 CDR 이식 항체인 (25) 또는 (26) 기재의 진단약.
(a) VH 가 서열 번호 18 로 표시되는 아미노산 서열 중, 12 번째의 Lys, 13 번째의 Lys, 40 번째의 Ala, 41 번째의 Pro, 48 번째의 Met, 68 번째의 Val, 70 번째의 Ile, 74 번째의 Thr, 76 번째의 Thr, 82 번째의 Glu, 84 번째의 Ser, 87 번째의 Arg 및 95 번째의 Tyr 로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
(b) VL 이 서열 번호 19 로 표시되는 아미노산 서열 중, 2 번째의 Ile, 3 번째의 Val, 14 번째의 Thr, 15 번째의 Pro, 50 번째의 Gln, 51 번째의 Leu 및 92 번째의 Tyr 로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
(c) VH 가 서열 번호 18 로 표시되는 아미노산 서열 중, 12 번째의 Lys, 13 번째의 Lys, 40 번째의 Ala, 41 번째의 Pro, 48 번째의 Met, 68 번째의 Val, 70 번째의 Ile, 74 번째의 Thr, 76 번째의 Thr, 82 번째의 Glu, 84 번째의 Ser, 87 번째의 Arg 및 95 번째의 Tyr 로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL 이 서열 번호 19 로 표시되는 아미노산 서열 중, 2 번째의 Ile, 3 번째의 Val, 14 번째의 Thr, 15 번째의 Pro, 50 번째의 Gln, 51 번째의 Leu 및 92 번째의 Tyr 로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
(29) 인간형 CDR 이식 항체가 이하의 (a) ∼ (c) 중 어느 하나의 인간형 CDR 이식 항체인 (25) 또는 (26) 기재의 진단약.
(a) VH 가 서열 번호 18 또는 20 으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
(b) VL 이 서열 번호 19, 21, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 50 또는 51 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
(c) VH 가 서열 번호 18 또는 20 으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL 이 서열 번호 19, 21, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 50 또는 51 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
(30) 인간형 CDR 이식 항체가 이하의 (a) ∼ (c) 중 어느 하나의 인간형 CDR 이식 항체인 (29) 기재의 진단약.
(a) VH 가 서열 번호 18 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL 이 서열 번호 21 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
(b) VH 가 서열 번호 18 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL 이 서열 번호 44 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
(c) VH 가 서열 번호 18 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL 이 서열 번호 50 으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
(31) 인간형 CDR 이식 항체가 이하의 (a) ∼ (c) 중 어느 하나의 인간형 CDR 이식 항체인 (25) 또는 (26) 기재의 진단약.
(a) 형질 전환체 KM8037 (FERM BP-8084) 이 생산하는 인간형 CDR 이식 항체
(b) 형질 전환체 KM8035 (FERM BP-8082) 가 생산하는 인간형 CDR 이식 항체
(c) 형질 전환체 KM8036 (FERM BP-8083) 이 생산하는 인간형 CDR 이식 항체
(32) 항체 단편이 Fab, Fab', F(ab')2, 1 본쇄 항체 (scFv), 2 량체화 V 영역 단편 (diabody), 디술피드 안정화 V 영역 단편 (dsFv) 및 CDR 을 포함하는 펩티드로부터 선택되는 항체 단편인 (19) 기재의 진단약.
(33) FGF-8 에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 시료 중의 FGF-8 을 검출 및/또는 정량하는 것을 특징으로 하는 관절염의 판정 방법.
(34) FGF-8 에 특이적으로 결합하는 항체가 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 (33) 기재의 판정 방법.
(35) 모노클로날 항체가, 하이브리도마가 산생하는 항체, 인간화 항체, 및 이들 항체 단편으로부터 선택되는 항체인 (34) 기재의 판정 방법.
(36) 하이브리도마가 하이브리도마 KM1334 (FERM BP-5451) 인 (35) 기재의판정 방법.
(37) 인간화 항체가 인간형 키메라 항체 또는 인간형 CDR 이식 항체인 (35) 기재의 판정 방법.
(38) 인간형 키메라 항체가, FGF-8 에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체의 VH 및 VL, 그리고 인간 항체의 CH 및 CL 로 이루어지는 인간형 키메라 항체인 (37) 기재의 판정 방법.
(39) 인간형 키메라 항체가 이하의 (a) ∼ (c) 중 어느 하나의 인간형 키메라 항체인 (38) 기재의 판정 방법.
(a) VH 가 서열 번호 5 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 키메라 항체
(b) VL 이 서열 번호 6 으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 키메라 항체
(c) VH 가 서열 번호 5 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL 이 서열 번호 6 으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 키메라 항체
(40) 인간형 키메라 항체가 형질 전환체 KM3034 (FERM BP-7836) 가 생산하는 인간형 키메라 항체인 (39) 기재의 판정 방법.
(41) 인간형 CDR 이식 항체가, FGF-8 에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체의 VH 및 VL 의 CDR 그리고 인간 항체의 CH 및 CL 을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체인 (37) 기재의 판정 방법.
(42) 인간형 CDR 이식 항체가, FGF-8 에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체의 VH 및 VL 의 CDR, 인간 항체의 VH 및 VL 의 FR, 그리고 인간 항체의 CH 및 CL 로 이루어지는 인간형 CDR 이식 항체인 (41) 기재의 판정 방법.
(43) 인간형 CDR 이식 항체가 이하의 (a) ∼ (c) 중 어느 하나의 인간형 CDR 이식 항체인 (41) 또는 (42) 기재의 판정 방법.
(a) VH 의 CDR1, CDR2 및 CDR3 이 각각 서열 번호 7, 8 및 9 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
(b) VL 의 CDR1, CDR2 및 CDR3 이 각각 서열 번호 10, 11 및 12 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
(c) VH 의 CDR1, CDR2 및 CDR3 이 각각 서열 번호 7, 8 및 9 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL 의 CDR1, CDR2 및 CDR3 이 각각 서열 번호 10, 11 및 12 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
(44) 인간형 CDR 이식 항체가 이하의 (a) ∼ (c) 중 어느 하나의 인간형 CDR 이식 항체인 (41) 또는 (42) 기재의 판정 방법.
(a) VH 가 서열 번호 18 로 표시되는 아미노산 서열 중, 12 번째의 Lys, 13 번째의 Lys, 40 번째의 Ala, 41 번째의 Pro, 48 번째의 Met, 68 번째의 Val, 70 번째의 Ile, 74 번째의 Thr, 76 번째의 Thr, 82 번째의 Glu, 84 번째의 Ser, 87 번째의 Arg 및 95 번째의 Tyr 로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
(b) VL 이 서열 번호 19 로 표시되는 아미노산 서열 중, 2 번째의Ile, 3 번째의 Val, 14 번째의 Thr, 15 번째의 Pro, 50 번째의 Gln, 51 번째의 Leu 및 92 번째의 Tyr 로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
(c) VH 가 서열 번호 18 로 표시되는 아미노산 서열 중, 12 번째의 Lys, 13 번째의 Lys, 40 번째의 Ala, 41 번째의 Pro, 48 번째의 Met, 68 번째의 Val, 70 번째의 Ile, 74 번째의 Thr, 76 번째의 Thr, 82 번째의 Glu, 84 번째의 Ser, 87 번째의 Arg 및 95 번째의 Tyr 로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL 이 서열 번호 19 로 표시되는 아미노산 서열 중, 2 번째의 Ile, 3 번째의 Val, 14 번째의 Thr, 15 번째의 Pro, 50 번째의 Gln, 51 번째의 Leu 및 92 번째의 Tyr 로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
(45) 인간형 CDR 이식 항체가 이하의 (a) ∼ (c) 중 어느 하나의 인간형 CDR 이식 항체인 (41) 또는 (42) 기재의 판정 방법.
(a) VH 가 서열 번호 18 또는 20 으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
(b) VL 이 서열 번호 19, 21, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 50 또는 51 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
(c) VH 가 서열 번호 18 또는 20 으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL 이 서열 번호 19, 21, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 50 또는 51 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
(46) 인간형 CDR 이식 항체가 이하의 (a) ∼ (c) 중 어느 하나의 인간형 CDR 이식 항체인 (45) 기재의 판정 방법.
(a) VH 가 서열 번호 18 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL 이 서열 번호 21 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
(b) VH 가 서열 번호 18 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL 이 서열 번호 44 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
(c) VH 가 서열 번호 18 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL 이 서열 번호 50 으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
(47) 인간형 CDR 이식 항체가 이하의 (a) ∼ (c) 중 어느 하나의 인간형 CDR 이식 항체인 (41) 또는 (42) 기재의 판정 방법.
(a) 형질 전환체 KM8037 (FERM BP-8084) 이 생산하는 인간형 CDR 이식 항체
(b) 형질 전환체 KM8035 (FERM BP-8082) 가 생산하는 인간형 CDR 이식 항체
(c) 형질 전환체 KM8036 (FERM BP-8083) 이 생산하는 인간형 CDR 이식 항체
(48) 항체 단편이 Fab, Fab', F(ab')2, 1 본쇄 항체 (scFv), 2 량체화 V 영역 단편 (diabody), 디술피드 안정화 V 영역 단편 (dsFv) 및 CDR 을 포함하는 펩티드로부터 선택되는 항체 단편인 (35) 기재의 판정 방법.
(49) FGF-8 에 특이적으로 결합하고, FGF-8 의 활성을 저해하는 항체를 유효 성분으로 함유하는 관절 파괴 억제제.
(50) FGF-8 에 특이적으로 결합하고, FGF-8 의 활성을 저해하는 항체를 유효 성분으로 함유하는 연골 보호제.
(51) FGF-8 에 특이적으로 결합하고, FGF-8 의 활성을 저해하는 항체를 유효 성분으로 함유하는 활막 증식 억제제.
본 발명의 관절염 예방약 또는 치료약에 사용되는 항체는 FGF-8 에 특이적으로 결합하고, 또한 FGF-8 의 활성을 저해하는 항체 (이하, 항 FGF-8 중화 항체라고도 함) 이면 특별히 한정되지 않고, 예컨대 FGF-8 에 대해 중화 활성을 갖는 항체 및 이 항체 단편 등을 들 수 있다.
본 발명의 관절염 예방약 또는 치료약에 사용되는 항 FGF-8 중화 항체는 FGF-8 에 특이적으로 결합하는 항체 (이하, 항 FGF-8 항체라고도 함) 중에서, FGF-8 의 활성을 저해하는 능력을 갖는 항체를 선택함으로써 얻을 수 있다. FGF-8 의 활성으로는 FGF-8 이 갖는 생물 활성이면 특별히 한정되지 않지만, 구체적으로는 마우스 유암 세포주 SC-3 (Nakamura N. et al., J Steroid Biochem., 27, 459-464, 1987), 마우스 선유아 세포주 NIH/3T3 (ATCC 번호: CRL-1658), 또는 인간 전립선암 세포주 LNCaP (ATCC 번호: CRL-1740) 의 증식을 촉진하는 활성, 활막 세포의 증식을 촉진하는 활성, 연골 세포의 세포외 매트릭스의 분해를 촉진하는 활성, 연골 세포로부터의 매트릭스 메탈로프로티나제-3 의 산생을 촉진하는 활성을 들 수 있다.
항 FGF-8 항체는 공지의 수단 (Harlow E. and Lane D., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, 이하, 안티보디즈 어 래버러토리 매뉴얼이라고 함) 을 이용하여 제조할 수 있다.
본 발명의 관절염 예방약 또는 치료약에서 사용되는 항 FGF-8 중화 항체로는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체 중 어느 것이나 사용할 수 있지만 모노클로날 항체가 바람직하게 사용된다.
모노클로날 항체로는 하이브리도마에 의해 생산되는 항체, 인간화 항체 및 이들 항체의 항체 단편을 들 수 있다.
본 발명의 관절염 예방약 또는 치료약에서 사용되는 하이브리도마에 의해 생산되는 항 FGF-8 중화 모노클로날 항체는 구체적으로는 이하에 기술하는 방법에 의해 제조할 수 있다.
즉, FGF-8 단백질을 항원으로서 조제하고, 그 항원을 면역시킨 동물로부터 항원 특이성을 갖는 형질 세포를 유도하고, 다시 이것과 골수종 세포를 융합시켜 하이브리도마를 조제하고, 이 하이브리도마를 배양하거나 또는 이 하이브리도마 세포를 동물에게 투여하여 이 동물을 복수암화시키고, 이 배양액 또는 복수로부터 FGF-8 에 특이적으로 결합하는 항체를 분리, 정제한다. 얻어진 항체 중에서 FGF-8 의 활성을 저해하는 항체를 선택한다. 이러한 FGF-8 중화 모노클로날 항체로서 일본 공개 특허 공보 평9-271391 호에 기재되어 있는 마우스 IgG1 서브클래스에 속하는 하이브리도마 KM1334 (FERM BP-5451) 가 생산하는 모노클로날 항체 KM1334 를 들 수 있다.
본 발명의 관절염 예방약 또는 치료약에서 사용되는 인간화 항체로는 상기 항 FGF-8 중화 모노클로날 항체를 유전자 재조합 기술을 이용하여 개변한 것을 들 수 있다. 이 항체에서는 항원성이 낮고, 혈중 반감기가 연장된 것이 예방약 또는 치료약으로서 바람직하다.
본 발명의 관절염 예방약 또는 치료약에서 사용되는 인간화 항체는 인간형 키메라 항체 및 인간형 상보성 결정 영역 (complementary determining region; 이하 CDR 이라고 약기한다.) 이식 항체를 포함한다.
인간형 키메라 항체는 인간 이외의 동물의 항체의 중쇄 가변 영역 (이하, 가변 영역을 V 영역, 중쇄 가변 영역을 VH 라고 함) 및 중쇄 V 영역 (이하, VL 이라고 함) 과 인간 항체의 중쇄 정상 영역 (이하, 정상 영역을 C 영역, 중쇄 정상 영역을 CH 라고 함) 및 인간 항체의 경쇄 C 영역 (이하, CL 이라고 함) 으로 이루어지는 항체를 의미한다. 인간 이외의 동물로는 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 등, 하이브리도마를 제작할 수 있으면 특별한 한정없이 사용할 수 있다.
본 발명의 관절염 예방약 또는 치료약에서 사용되는 인간형 키메라 항체는 항 FGF-8 중화 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마로부터 얻어지는 이 항체의 H 쇄 및 L 쇄를 코드하는 cDNA 로부터, VH 및 VL 을 코드하는 DNA 를 취득하고, 인간 항체의 CH 및 CL 을 코드하는 DNA 를 갖는 동물 세포용 발현 벡터에 각각 삽입하여 인간형 키메라 항체 발현 벡터를 구축하고, 동물 세포에 도입함으로써 발현시켜 제조할 수 있다.
인간형 키메라 항체의 CH 로는 인간 이뮤노 글로불린 (hIg) 에 속하면 특별히 한정되지 않지만, hIgG 클래스의 것이 바람직하고, hIgG 클래스에 속하는 γ1, γ2, γ3, τ4 등의 서브클래스 중 어느 것이나 사용할 수 있다. 또한, 인간형 키메라 항체의 CL 로는 hIg 에 속하면 특별히 한정되지 않고 κ클래스 또는 λ클래스의 것을 사용할 수 있다.
FGF-8 에 특이적으로 결합하고 FGF-8 의 활성을 저해하는 인간형 키메라 항체 (이하, 항 FGF-8 중화 키메라라고도 함) 로는 FGF-8 에 특이적으로 결합하고 FGF-8 의 활성을 저해하는 모노클로날 항체의 VH 및 VL 과 인간 항체의 VH 및 CL 로 이루어지는 항 FGF-8 중화 키메라 항체, 바람직하게는 VH 가 서열 번호 5 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 키메라 항체, VL 이 서열 번호 6 으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 키메라 항체, 및 VH 가 서열 번호 5 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL 이 서열 번호 6 으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 키메라 항체를 들 수 있다. 구체적으로는 항체의 VH 가 서열 번호 5 기재의 아미노산 서열, CH 가 인간 γ1 서브클래스의 아미노산 서열로 이루어지고, 항체의 VL 이 서열 번호 6 기재의 아미노산 서열, CL 이 인간 κ클래스의 아미노산 서열로 이루어지는 인간형 키메라 항체 KM3034 및 KM3334 를 들 수 있다.
인간형 키메라 항체는 KM3034 를 생산하는 형질 전환체 KM3034 는 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터 (우편 번호 305-8566 일본국 이바라키켕 츠쿠바시 히가시 1 쵸메 1-1 중앙 제 6) 에 평성 13 년 12 월 26 일자로 FERM BP-7836 으로서 기탁되어 있다.
인간형 CDR 이식 항체는 인간 항체에 인간 이외의 동물의 항체의 VH 및 VL 의 CDR 을 인간 이외의 동물의 항체의 CDR 서열로 각각 치환한 항체를 의미한다.
본 발명의 관절염 예방약 또는 치료약에서 사용되는 인간형 CDR 이식 항체는 인간 이외의 동물의 항 FGF-8 중화 항체의 VH 및 VL 의 CDR 서열로 임의의 인간 항체의 VH 및 VL 의 CDR 서열을 각각 치환한 V 영역을 코드하는 DNA 를 구축하고, 인간 항체의 CH 및 인간 항체의 CL 을 코드하는 유전자를 갖는 동물 세포용 발현 벡터에 각각 삽입하여 인간형 CDR 이식 항체 발현 벡터를 구축하고, 동물 세포에 도입하여 발현시킴으로써 제조할 수 있다.
인간형 CDR 이식 항체의 CH 로는 hIg 에 속하면 특별히 한정되지 않지만, hIgG 클래스의 것이 바람직하고, 또한 hIgG 클래스에 속하는 γ1, γ2, γ3, γ4 등의 서브클래스 중 어느 것이나 사용할 수 있다. 또한, 인간형 CDR 이식 항체의 CL 로는 hIg 에 속하면 특별히 한정되지 않고 κ클래스 또는 λ클래스의 것을 사용할 수 있다.
FGF-8 에 특이적으로 결합하여 FGF-8 의 활성을 저해하는 인간형 CDR 이식 항체 (이하, 항 FGF-8 CDR 이식 항체라고도 함) 로는 FGF-8 에 특이적으로 결합하여 FGF-8 의 활성을 저해하는 모노클로날 항체의 VH 및 VL 의 CDR 그리고 인간 항체의 CH 및 CL 을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체, FGF-8 에 특이적으로 결합하여 FGF-8 의 활성을 저해하는 모노클로날 항체의 VH 및 VL 의 CDR, 인간 항체의 VH 및VL 의 프레임 워크 영역 (이하, FR 이라고 약기함), 그리고 인간 항체의 CH 및 CL 로 이루어지는 인간형 CDR 이식 항체를 들 수 있다. 바람직하게는 (a) VH 의 CDR1, CDR2, CDR3 이 각각 서열 번호 7, 8, 9 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체, (b) VL 의 CDR1, CDR2, CDR3 이 각각 서열 번호 10, 11, 12 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체, (c) VH 의 CDR1, CDR2, CDR3 이 각각 서열 번호 7, 8, 9 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL 의 CDR1, CDR2, CDR3 이 각각 서열 번호 10, 11, 12 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체를 들 수 있고, 보다 바람직하게는 (a) VH 가 서열 번호 18 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체, (b) VL 이 서열 번호 19 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체, (c) VH 가 서열 번호 18 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL 이 서열 번호 19 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체를 들 수 있다. 또한 바람직하게는 (a) VH 가 서열 번호 18 로 표시되는 아미노산 서열 중, 12 번째의 Lys, 13 번째의 Lys, 40 번째의 Ala, 41 번째의 Pro, 48 번째의 Met, 68 번째의 Val, 70 번째의 Ile, 74 번째의 Thr, 76 번째의 Thr, 82 번째의 Glu, 84 번째의 Ser, 87 번째의 Arg 및 95 번째의 Tyr 로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체, (b) VL 이 서열 번호 19 로 표시되는 아미노산 서열 중, 2 번째의 Ile, 3 번째의 Val, 14 번째의 Thr, 15 번째의 Pro, 50 번째의 Gln, 51 번째의 Leu 및 92 번째의 Tyr 로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체, (c) VH 가 서열 번호 18 로 표시되는 아미노산 서열 중, 12 번째의 Lys, 13 번째의 Lys, 40 번째의 Ala, 41 번째의 Pro, 48 번째의 Met, 68 번째의 Val, 70 번째의 Ile, 74 번째의 Thr, 76 번째의 Thr, 82 번째의 Glu, 84 번째의 Ser, 87 번째의 Arg 및 95 번째의 Tyr 로부터 선택된 적어도 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL 이 서열 번호 19 로 표시되는 아미노산 서열 중, 2 번째의 Ile, 3 번째의 Val, 14 번째의 Thr, 15 번째의 Pro, 50 번째의 Gln, 51 번째의 Leu 및 92 번째의 Tyr 로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체를 들 수 있다. 구체적으로는 (a) VH 가 서열 번호 18 또는 20 으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체, (b) VL 이 서열 번호 19, 21, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 50 또는 51 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체, (c) VH 가 서열 번호 18 또는 20 으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL 이 서열 번호 19, 21, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 50 또는 51 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체를 들 수 있고, 바람직하게는 (a) VH 가 서열 번호 18 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL 이 서열 번호 21 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체, (b) VH 가 서열 번호 18 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, VL 이 서열 번호 44 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체, (c) VH 가 서열 번호 18 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, VL 이 서열번호 50 으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체를 들 수 있다. 이러한 인간형 CDR 이식 항체로서, VH 가 서열 번호 18 기재의 아미노산 서열, CH 가 인간 γ1 서브클래스의 아미노산 서열로 이루어지고, VL 이 서열 번호 21 기재의 아미노산 서열, CL 이 인간 κ클래스의 아미노산 서열로 이루어지는 인간형 CDR 이식 항체 HV0LV6, HV0LV6/CHO, VH 가 서열 번호 18 기재의 아미노산 서열, CH 가 인간 γ1 서브클래스의 아미노산 서열로 이루어지고, VL 이 서열 번호 44 기재의 아미노산 서열, CL 이 인간 κ클래스의 아미노산 서열로 이루어지는 인간형 CDR 이식 항체 HV0LV3-1/CHO, VH 가 서열 번호 18 기재의 아미노산 서열, CH 가 인간 γ1 서브클래스의 아미노산 서열로 이루어지고, VL 이 서열 번호 50 기재의 아미노산 서열, CL 이 인간 κ클래스의 아미노산 서열로 이루어지는 인간형 CDR 이식 항체 HV0LV4-3/CHO 를 들 수 있다.
인간형 CDR 이식 항체 HV0LV6 을 생산하는 형질 전환체 KM8037 은 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터 (우편 번호 305-8566 일본국 이바라키켕 츠쿠바시 히가시 1 쵸메 1-1 중앙 제 6) 에 평성 14 년 6 월 20 일자로 FERM BP-8084 로서, 인간형 CDR 이식 항체 HV0LV3-1 을 생산하는 형질 전환체 KM8036 은 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터 (우편 번호 305-8566 일본국 이바라키켕 츠쿠바시 히가시 1 쵸메 1-1 중앙 제 6) 에 평성 14 년 6 월 20 일자로 FERM BP-8083 으로서, 인간형 CDR 이식 항체 HV0LV4-3 을 생산하는 형질 전환체 KM8035 는 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터 (우편 번호 305-8566 일본국 이바라키켕 츠쿠바시 히가시 1 쵸메 1-1 중앙제 6) 에 평성 14 년 6 월 20 일자로 FERM BP-8082 로서, 각각 기탁되어 있다.
본 발명의 관절염 예방약 또는 치료약에서 사용되는 항 FGF-8 중화 항체에는 항체 단편도 포함된다. 항체 단편은 FGF-8 에 특이적으로 결합하여 FGF-8 의 활성을 저해하는 항체 단편인 Fab (fragment of antigen binding 의 약칭), F(ab')2, Fab', 1 본쇄 항체 (single chain Fv; 이하, scFv 라고 함), 2 량체화 V 영역 단편 (diabody), 디술피드 안정화 항체 (disulfide stabilized Fv; 이하, dsFv 라고 함) 및 CDR 을 포함하는 펩티드도 함유한다.
Fab 는 IgG 의 힌지 영역에서 2 개의 H 쇄를 가교하고 있는 2 개의 디술피드 결합의 상부의 펩티드 부분을 효소 파파인으로 분해하여 얻어진 H 쇄의 N 말단측 약 절반과 L 쇄 전체로 구성된 분자량 약 5 만의 항원 결합 활성을 갖는 프래그먼트이다.
F(ab')2는 IgG 의 힌지 영역의 2 개의 디술피드 결합의 하부를 단백질 분해 효소 펩신으로 처리하여 얻어지는 단편 중 (H 쇄의 234 번째의 아미노산 잔기로 단절단됨), Fab 가 힌지 영역의 디술피드 결합을 통해 결합된 것보다 약간 큰 분자량 약 10 만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.
Fab' 는 상기 F(ab')2의 힌지 간의 디술피드 결합을 절단한 분자량 약 5 만의 항원 결합 활성을 갖는 프래그먼트이다.
scFv 는 1 개의 VH 와 1 개의 VL 을 적당한 펩티드 링커 (이하, P 라고 함) 를 사용하여 연결한 VH-P-VL 내지는 VL-P-VH 폴리펩티드이다. 본 발명의 관절염 예방약 또는 치료약에서 사용되는 scFv 에 포함되는 VH 및 VL 은 항 FGF-8 중화 모노클로날 항체이면 특별히 한정되지 않는다.
diabody 는 항원 결합 특이성이 같거나 다른 scFv 가 2 량체를 형성한 항체 단편으로, 같은 항원에 대한 2 가의 항원 결합 활성 또는 다른 항원에 대한 각각 특이적인 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.
dsFv 는 VH 및 VL 중의 각각 1 아미노산 잔기를 시스테인 잔기로 치환한 폴리펩티드를 디술피드 결합을 통해 결합시킨 것을 말한다. 시스테인 잔기로 치환하는 아미노산 잔기는 Reiter 등에 의해 알려진 방법 (Reiter Y. et al., Protein Eng., 7, 697-704, 1994) 에 따라, 항체의 입체 구조 예측에 기초하여 선택할 수 있다. 본 발명의 관절염 예방약 또는 치료약에서 사용되는 dsFv 에 함유되는 VH 또는 VL 은 항 FGF-8 중화 모노클로날 항체이면 특별히 한정되지 않는다.
본 발명의 관절염 예방약 또는 치료약에서 사용되는 CDR 을 포함하는 펩티드는 항 FGF-8 중화 항체의 VH 또는 VL 의 CDR 의 적어도 1 영역 이상을 포함하여 구성된다. 복수의 CDR 을 포함하는 펩티드는 직접 또는 적당한 펩티드 링커를 통해 결합시킴으로써 제조할 수 있다.
이하, 본 발명에서 사용되는 항 FGF-8 중화 항체의 구체적인 제작 방법과 활성 평가 방법, 이 항체를 함유하는 관절염 예방약 또는 치료약, 항 FGF-8 항체를 함유하는 관절염의 진단약, 항 FGF-8 항체를 사용한 관절염의 판정 방법에 대해 설명한다.
1. 항 FGF-8 중화 항체 (폴리클로날 항체, 모노클로날 항체) 의 제작 방법
(1) 항원의 조제
항 FGF-8 중화 항체를 제작하기 위해 필요한 항원으로는 FGF-8 을 산생하는 세포 또는 그 세포 획분, 또는 FGF-8 단백질, 이 단백질의 부분 단편, 이 단백질의 아미노산 서열의 부분 서열을 갖는 펩티드 등을 들 수 있다.
FGF-8 단백질 및 이 단백질의 부분 단편은 FGF-8 을 코드하는 전장 또는 그 부분 단편 DNA (Tanaka A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 8928-8932, 1992, Tanaka A. et al., FEBS Lett., 363, 226-230, 1996) 를 적당한 벡터의 프로모터 하류에 삽입한 재조합체 벡터를 조성하고, 이것을 숙주 세포에 도입함으로써 얻어진 FGF-8 발현 세포를 적당한 배지 중에서 배양함으로써 세포내 또는 배양 상청 중에 그대로 또는 융합 단백질로서 생산할 수 있다. 또한 FGF-8 단백질의 부분 서열을 갖는 펩티드는 펩티드 합성기를 사용하여 제조할 수 있다.
FGF-8 을 코드하는 전장 또는 그 부분 단편 DNA 는 FGF-8 을 발현하고 있는 SC-3 등의 세포로 조제한 cDNA 를 주형으로 한, 폴리메라제 연쇄 반응 [Polymerase Chain Reaction, 이하 PCR 이라고 함; Sambrook J. et al., Molecular Cloning 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, 2001 (이하,「몰레큘러 클로닝 제 3 판」이라고 함), Ausubel F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1987-2001 (이하, 커렌트 프로토콜즈 인 몰레큘러 바이올로지라고 함)] 에 의해 제조할 수 있다.
숙주로는 세균, 효모, 동물 세포, 곤충 세포 등, 목적으로 하는 유전자를 발현할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 세균으로는 에쉐리히어 콜리 (Esherichia coli), 바실루스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 등의 에쉐리히어속, 바실루스속 등의 세균이 예시된다. 효모로는 삭카로미세스 세레비시에 (Saccharomyces cerevisiae), 시조삭카로미세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe) 등이 예시된다. 동물 세포로는 인간의 세포인 나말바 (Namalwa) 세포, 원숭이 세포인 COS 세포, 차이니즈 햄스터 세포인 CHO 세포 등이 예시된다. 곤충 세포로는 Sf9, Sf21 [파민젠 (Farmingen) 사 제조], High Five [인비트로젠 (Invitrogen) 사 제조] 등이 예시된다.
FGF-8 을 코드하는 전장 또는 그 부분 단편 DNA 를 도입하는 벡터로는 이 DNA 를 삽입할 수 있고, 숙주 세포로 발현할 수 있는 것이면 어떤 벡터라도 사용할 수 있다.
세균, 예컨대 에쉐리히어 콜리 (Esherichia coli) 를 숙주로 사용하는 경우의 발현 벡터로는 프로모터, 리보솜 결합 서열, FGF-8 을 코드하는 전장 또는 그 부분 단편 DN, 전사 종결 서열, 경우에 따라서는 프로모터의 제어 서열로 구성되어 있는 것이 바람직하지만, 예컨대 시판중인 pGEX-2T [아마샴 바이오사이언스 (Amersham Biosciences) 사 제조], pET17b [노바젠 (Novagen) 사 제조] 등이 예시된다.
세균에 대한 재조합 벡터의 도입 방법으로는 세균에 DNA 를 도입하는 방법이면 예컨대 칼슘 이온을 사용하는 방법 (Cohen S. N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110-2114, 1972), 프로토플라스트법 (일본 공개 특허 공보 소63-248394) 등 어느 방법이나 이용할 수 있다.
효모를 숙주로 사용하는 경우에는 발현 벡터로서 예컨대 YEp13 (ATTCC37115), YEp24 (ATCC37051), YCp50 (ATCC37419) 등을 사용할 수 있다.
효모에 대한 재조합 벡터의 도입 방법으로는 효모에 DNA 를 도입하는 방법이면 예컨대 일렉트로포레이션법 (Becker D. M. and Guarente L., methods. Enzymol., 194, 182-187, 1991), 스페로플라스트법 (Hinnen A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.. USA, 84, 1929-1933, 1978), 아세트산리튬법 (Ito H. et al., J. Bacteriol., 153, 163-168, 1983) 등 어느 방법이나 이용할 수 있다.
동물 세포를 숙주로 사용하는 경우에는 발현 벡터로서 예컨대 pAGE107 (일본 공개 특허 공보 평3-22979; Miyaji H. et al., Cytotechnology, 3, 133-140, 1990), pAGE103 (Mizukami T. and Itoh S., J. Biochem., 101, 1307-1310, 1987) 등이 사용된다.
프로모터로서 동물 세포 중에서 발현할 수 있는 것이면 어떤 것을 사용해도 되지만, 예컨대 사이토메갈로 바이러스 (CMV) 의 IE (immediate early) 유전자의 프로모터, SV40 또는 메탈로티오네인의 프로모터 등을 들 수 있다. 또한, 인간 CMV 의 IE 유전자의 인핸서를 프로모터와 함께 사용해도 된다.
동물 세포에 대한 재조합 벡터의 도입 방법으로는 동물 세포에 DNA 를 도입하는 방법이면 예컨대 일렉트로포레이션법 (Miyaji H. et al., Cytotechnology, 3, 133-140, 1990), 인산칼슘법 (일본 공개 특허 공보 평2-227075 호), 리포펙션법 (Felgner P. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413-7417, 1987) 등 어느 방법이나 이용할 수 있다.
곤충 세포를 숙주로 사용하는 경우에는 예컨대 커렌트 프로토콜즈 인 몰레큘러 바이올로지, O' Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, Oxford University Press, 1994 등에 기재된 방법에 의해 단백질을 발현할 수 있다. 즉, 이하에 기술하는 재조합 유전자 도입 벡터 및 바큘로 바이러스를 곤충 세포에 공도입하여 곤충 세포 배양 상청 중에 재조합 바이러스를 얻은 후, 다시 재조합 바이러스를 곤충 세포에 감염시켜 단백질 발현 곤충 세포를 취득한다.
유전자 도입 벡터로는 예컨대 pVL1392, pVL1393 (모두 파민젠사 제조], pBlueBac4.5 [인비트로젠사 제조] 등이 예시된다.
바큘로 바이러스로는 예컨대 밤나방과 곤충에게 감염되는 바이러스인 오토그라파 캘리포니카 뉴클리어 폴리헤드로시스 바이러스 (Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) 등을 사용할 수 있다.
재조합 바이러스를 조제하기 위한 곤충 세포에 대한 상기 재조합 유전자 도입 벡터와 상기 바큘로 바이러스의 공도입 방법으로는 예컨대 인산칼슘법 (일본 공개 특허 공보 평2-227075 호), 리포펙션법 (Felgner P. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413-7417, 1987) 등을 이용할 수 있다.
또한 파민젠사 제조의 바큘로 골드 스타터 키트 등을 사용하여 재조합 바큘로 바이러스를 제작한 후, 전술한 Sf9, Sf21 또는 High Five 등의 곤충 세포에 이 재조합 바이러스를 감염시킴으로써 단백질을 생산시킬 수도 있다 (Bio/Technology, 6, 47, 1988).
유전자의 발현 방법으로는 FGF-8 단백질만을 세포내에 발현시키는 것 이외에 분비 생산, 융합 단백질 발현 등이 개발되어 있는데, 어느 방법이나 이용할 수 있다. 예컨대 몰레큘러 클로닝 제 3 판에 기재되어 있는 방법에 준거하여 수행할 수 있다.
이상과 같이 하여 얻어지는 형질 전환체를 배지에 배양하고, 배양물 중에 FGF-8 단백질을 생성 축적시키고, 이 배양물로부터 FGF-8 단백질을 채취함으로써, FGF-8 단백질의 전장 또는 부분 단편을 그대로 또는 융합 단백질로 하여 제조할 수 있다.
형질 전환체를 배지에 배양하는 방법은 숙주의 배양에 사용되는 통상의 방법에 따라 행해진다.
대장균 또는 효모 등의 미생물을 숙주로 하여 얻어진 형질 전환체를 배양하는 배지로는 미생물이 자화될 수 있는 탄소원, 질소원, 무기염류 등을 함유하고, 형질 전환체의 배양을 효율적으로 수행할 수 있는 배지이면 천연 배지, 합성 배지 어느 것이나 사용할 수 있다 (몰레큘러 클로닝 제 3 판). 배양은 통상 진탕 배양 또는 심부 통기 교반 배양 등의 호기적 조건 하, 15 ∼ 40℃ 에서 16 ∼ 96 시간 수행한다. 배양 기간 중, pH 는 3.0 ∼ 9.0 으로 유지한다. pH 의 조정은 무기 또는 유기 산, 알칼리 용액, 우레아, 탄산칼슘, 암모니아 등을 사용하여 수행한다. 배양 중에는 필요에 따라 암피실린이나 테트라사이클린 등의 항생 물질을 배지에 첨가해도 된다.
동물 세포를 숙주로 하여 얻어진 형질 전환체를 배양하는 배지로는 일반적으로 사용되고 있는 RPMI 1640 배지, 이글 (Eagle) 의 MEM 배지 또는 이들 배지에 소 태아 혈청 (이하, FBS 라고 함) 등을 첨가한 배지 등을 사용할 수 있다. 배양은 통상 5% CO2존재 하, 35 ∼ 37℃ 에서 3 ∼ 7 일간 수행하고, 배양 중에는 필요에 따라 카나마이신, 페니실린 등의 항생 물질을 배지에 첨가해도 된다.
곤충 세포를 숙주로 하여 얻어진 형질 전환체를 배양하는 배지로는 일반적으로 사용되고 있는 TNM-FH 배지 (파민젠사 제조), Sf900IISFM (인비트로젠사 제조), EX-CELL400, EX-CELL405 [모두 JRH 바이오사이언시즈 (JRH Biosciences) 사 제조] 등을 사용할 수 있다. 배양은 25 ∼ 30℃ 에서 1 ∼ 4 일간 수행하고, 배양 중에는 필요에 따라 겐타마이신 등의 항생 물질을 배지에 첨가해도 된다.
상기에 있어서, 동물 세포 및 곤충 세포의 배양에 있어서 가능하다면 FGF-8 의 전장 또는 부분 단편을 그대로 또는 융합 단백질의 정제를 쉽게 하기 위해 혈청을 첨가하지 않은 배지를 사용하는 것이 바람직하다.
FGF-8 의 전장 또는 부분 단편을 그대로 또는 융합 단백질로서 숙주 세포 내에 축적된 경우에는 배양 종료 후, 세포를 원심 분리하고, 수계 완충액에 현탁한 후, 초음파법, 프렌치 프레스법 등에 의해 세포를 파쇄하고, 그 원심 분리 상청에 그 단백질을 회수한다.
또한, 세포 내에 불용체를 형성한 경우에는 불용체를 단백질 변성제로 가용화 후, 단백질 변성제를 포함하지 않거나 또는 단백질 변성제의 농도가 단백질이 변성되지 않을 정도로 희박한 용액에 희석, 또는 투석하고, 단백질의 입체 구조를형성시킬 수 있다.
FGF-8 단백질의 전장 또는 부분 단편, 또는 이들 단백질의 융합 단백질이 세포 밖으로 분비된 경우에는 배양 상청 중에 발현 단백질을 회수할 수 있다.
단리 정제에 대해서는 용매 추출, 유기 용매에 의한 분별 침전, 염석, 투석, 원심 분리, 한외 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 아피니티 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 결정화, 전기 영동 등의 분리 조작을 단독 또는 조합하여 수행할 수 있다.
FGF-8 의 아미노산 서열의 부분 서열을 갖는 펩티드는 Fmoc (플루올레닐메틸옥시카르보닐) 법, tBoc (t-부틸옥시카르보닐) 법 등의 화학 합성법에 의해 제조할 수 있다. 또한, 어드밴스트 켐테크 (Advanced ChemTech) 사, 어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems) 사, 프로틴 테크놀로지즈 (Protein Technologies) 사, 시마즈 제작소 등의 펩티드 합성기를 사용해도 제조할 수 있다.
(2) 동물의 면역과 항체 산생 세포의 조제
상기에서 얻어진 이 단백질을 항원으로 하여 동물에게 면역한다. 면역하는 방법으로는 동물의 피하, 정맥 내 또는 복강 내에 항원을 그대로 투여해도 되지만, 항원성이 높은 캐리어 단백질을 항원에 결합시켜 투여하거나, 또는 적당한 면역 보강제 (adjuvant) 와 함께 항원에 투여하는 것이 바람직하다.
캐리어 단백질로는 키홀 림펫 헤모시아닌 (Keyhole limpet hemocyanin), 소 혈청 알부민, 소 티로글로불린 등을 들 수 있고, 면역 보강제로는 프로인트의 완전 면역 보강제 (complete Freund's Adjuvant), 수산화 알루미늄 겔과 백일해균 백신등을 들 수 있다.
면역 동물로는 토끼, 염소, 마우스, 래트, 햄스터 등의 비인간 포유 동물을 들 수 있다.
항원은 1 회째의 투여 후, 1 ∼ 2 주일 마다 3 ∼ 10 회 투여한다. 항원의 투여량은 1 마리당 50 ∼ 100㎍ 이 바람직하다. 각 투여 후, 3 ∼ 7 일째에 면역 동물의 안저 정맥총 또는 꼬리 정맥에서 채취하고, 이 혈청의 항원과의 특이적인 결합성에 대해 하기에 나타내는 바와 같은 효소 면역 측정법 [효소 면역 측정법 제 3 판 의학 서원 1987 년, 안티보디즈 어 래버러토리 매뉴얼 (Chapter 14), Goding J. M., Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1996 (이하, 모노클로날 안티보디즈라고 약기함)] 등에서 확인한다.
효소 면역 측정법은 다음과 같이 하여 수행할 수 있다.
항원 단백질 또는 항원 단백질을 발현한 세포 등을 플레이트에 코트하고 면역 동물로부터 채취한 혈청을 제 1 항체로 하여 반응시킨다. 제 1 항체 반응 후, 플레이트를 세정하여 제 2 항체를 첨가한다. 반응 후, 제 2 항체를 표지한 물질에 따른 검출 반응을 수행하고 항체가를 측정한다.
제 2 항체란 제 1 항체를 인식할 수 있는 항체를 퍼옥시다제 등의 효소나 비오틴 등으로 표지한 것이다. 구체적으로는 면역 동물로 마우스를 사용하였다면 제 2 항체로는 마우스 이뮤노 글로불린을 인식할 수 있는 항체를 사용한다.
그리고, 이 혈청이 충분한 항체가를 나타낸 비인간 포유 동물을 항체 산생 세포의 공급원으로 한다.
항원의 최종 투여 후 3 ∼ 7 일째에, 면역 동물로부터 공지의 방법 (안티보디즈 어 래버러토리 매뉴얼) 에 준거하여 림프구를 적출하고, 림프구와 골수종 세포를 융합시킨다.
폴리클로날 항체는 이 혈청을 분리, 정제함으로써 조제할 수 있다. 이 폴리클로날 항체가 FGF-8 의 활성을 저해하는 중화 활성을 갖고 있는지 여부는 하기 1. (4) 에 기재된 세포 증식 저해 어세이로 조사할 수 있다.
모노클로날 항체는 이 항체 산생 세포와 비인간 포유 동물 유래의 골수종 세포를 융합시켜 하이브리도마를 제작하고, 이 하이브리도마를 배양하거나, 동물에게 투여하여 이 세포를 복수암화시키고, 이 배양약 또는 복수를 분리, 정제함으로써 조제할 수 있다.
항체 산생 세포는 항원 투여된 비인간 포유 동물 비장 세포, 림프절, 말초혈 등으로부터 채취한다.
(3) 골수종 세포의 조제
골수종 세포로는 마우스로부터 얻어진 주화 세포인, 8-아자구아닌 내성 마우스 (BALB/c 유래) 골수종 세포주 P3-X63Ag8-U1 (Kohler G and Milstein C, Eur. J. Immunol., 6, 511-519, 1976), SP2/0-Ag14 (Shulman M. et al., Nature, 276, 269-270, 1978), P3-X63-Ag8653 (Kearney J. F. et al., J. Immunol., 123, 1548-1550, 1979), P3-X63-Ag8 (Kohler G and Milstein C, Nature, 256, 495-497, 1975) 등, 인 비트로 (in vitro) 에서 증식 가능한 골수종 세포이면 특별히 한정되지 않는다. 이들 세포주의 배양 및 계대에 대해서는 공지의 방법 (안티보디즈 어 래버러토리매뉴얼) 에 따라 세포 융합시까지 2 ×107개 이상의 세포수를 확보한다.
(4) 세포 융합과 모노클로날 항체의 선택
상기에서 얻어진 항체 산생 세포와 골수종 세포를 세정한 후, 폴리에틸렌글리콜-1000 (PEG-1000) 등의 세포 응집성 매체를 첨가하여 세포를 융합시키고, 배지 중에 현탁시킨다. 세포의 세정에는 MEM 배지 또는 PBS (1.83g/L Na2HPO4, 0.21g/L KH2PO4, 7.65g/L NaCl, pH 7.2) 등을 사용한다. 또한 융합 세포를 현탁시키는 배지로는 목적하는 융합 세포만을 선택적으로 얻을 수 있도록 HAT 배지 [정상 배지 (1.5m㏖/L 글루타민, 50μ㏖/L 2-메르캅토에탄올, 10g/mL 겐타마이신 및 10% FBS 를 첨가한 RPMI 1640 배지) 에 100μ㏖/L 히폭산틴, 15μ㏖/L 티미딘 및 0.4μ㏖/L 아미노프테린을 첨가한 배지] 를 사용한다.
배양 후, 배양 상청의 일부를 취하고, 하기 효소 면역 측정법에 의해 항원 단백질에 반응하고, 비항원 단백질에 반응하지 않는 샘플을 선택한다. 이어서, 한계 희석법에 의해 클로닝을 수행하고, 효소 면역 측정법에 의해 안정적으로 높은 항체가가 확인된 것을 FGF-8 과 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 산생 하이브리도마주로서 선택한다.
효소 면역 측정법은 1. (2) 에 기재한 것과 동일하게 수행하는데, 제 1 항체로서 하이브리도마 배양 상청 또는 후술하는 방법으로 얻어지는 정제 항체를 사용한다.
모노클로날 항체와 FGF-8 과의 특이적인 결합은 표면 플라즈몬 (Karlsson R.et al., J. Immunol. Methods, 145, 229-240, 1991) 에 의해서도 평가할 수 있다.
항 FGF-8 모노클로날 항체의 구체예로는 일본 공개 특허 공보 평9-271391 호에 기재되어 있는 마우스 IgG1 서브클래스에 속하는 하이브리도마 KM1334 (FERM BP-5451) 가 생산하는 모노클로날 항체 KM1334 를 들 수 있다.
상기에서 선택된 하이브리도마가 생산하는 항 FGF-8 모노클로날 항체가 FGF-8 의 활성을 저해할 수 있는지 여부를 타깃 세포에 마우스 유암 세포주 SC-3 (Nakamura N. et al., J Steroid Biochem., 27, 459-464, 1987), 마우스 선유아 세포주 NIH/3T3 (ATCC 번호: CRL-1658), 또는 인간 전립선 암세포주 LNCaP (ATCC 번호: CRL-1740) 를 사용한 증식 저해 어세이로 조사한다. 방법으로는 타깃 세포를 FGF-8 (1 ∼ 100ng/mL) 또는 테스토스테론을 함유하는 배지에서 배양할 때, 배양 상청 또는 하기 2. (5) 에 따라 정제한 항 FGF-8 모노클로날 항체의 최종 농도가 0.001 ∼ 100㎍/mL 가 되도록 단계 희석하여 배지 중에 첨가한다. 24 ∼ 72 시간 배양 후, MTT [3-(4,5-디메틸-2-티아졸-2-일)-2,5-디페닐-2H-테트라졸륨 브로마이드] 용액, 셀 카운팅 키트 또는 WST-1 키트 등을 사용하여 생세포수를 측정한다. 항 FGF-8 모노클로날 항체를 첨가하지 않은 경우에 비해 항 FGF-8 모노클로날 항체의 농도 의존적으로 생세포수가 감소하는 경우에, 이 항 FGF-8 모노클로날 항체는 FGF-8 의 활성을 저해하는 항 FGF-8 중화 항체인 것을 확인할 수 있다.
또한, 볼튼-헌터법 (Bolton A. E. and Hunter W. M, Biochem. J., 133, 529-539,1973) 등에서125I 표지한 FGF-8 의 상기 세포주로의 결합 측정계를 사용하여항 FGF-8 모노클로날 항체의 FGF-8 의 세포 표면 위의 수용체로의 결합 저해 활성을 측정할 수 있다.
상기 모노클로날 항체 KM1334 는 FGF-8 의 활성을 저해하는 활성을 갖는 항 FGF-8 중화 항체이며, 관절염 예방약 또는 치료약으로서 바람직하다.
(5) 모노클로날 항체의 조제
모노클로날 항체는 하이브리도마 세포를 배양하여 얻어지는 배양액, 또한 프리스탄 (Pristane, 2,6,10,14-테트라메틸펜타데칸) 0.5mL 를 복강 내에 투여하고, 2 주일 사육한 8 ∼ 10 주령의 마우스 또는 누드 마우스에, 모노클로날 항체 산생 하이브리도마 세포를 복강 내 투여하여 복수암화시킨 복수로부터 분리, 정제함으로써 조제할 수 있다.
모노클로날 항체를 분리, 정제하는 방법으로는 원심 분리, 40 ∼ 50% 포화 황산암모늄에 의한 염석, 카프릴산 침전법, DEAE-세파로스 칼럼, 음이온 교환 칼럼, 프로테인 A 또는 G-칼럼 또는 겔 여과 칼럼 등을 사용하는 크로마토그래피 등을 단독 또는 조합하여 수행하는 방법을 들 수 있다. 이 방법에 의해 IgG 또는 IgM 획분을 회수하고, 정제 모노클로날 항체를 취득할 수 있다.
정제 모노클로날 항체의 서브클래스의 결정은 모노클로날 항체 타이핑 키트 등을 사용하여 수행할 수 있다. 단백질량은 롤리법 또는 280㎚ 에서의 흡광도로부터 산출할 수 있다.
항체의 서브클래스란 클래스 내의 아이소 타입을 말하며, 마우스에서는 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, 인간에서는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 를 들 수 있지만,특히 마우스 IgG1, IgG2a, 인간 IgG1 타입은 보체 의존성 세포 상해 활성 및 항체 의존성 세포 상해 활성을 갖고, 치료에 대한 응용상 유용하다.
2. 항 FGF-8 중화 인간화 항체의 제작 방법
(1) 인간화 항체 발현용 벡터의 구축
인간 이외의 동물의 항체로부터 인간화 항체를 제작하기 위해 필요한 인간화 항체 발현용 벡터를 구축한다. 인간화 항체 발현용 벡터란 인간 항체의 C 영역인 CH 및 CL 을 코드하는 유전자가 삽입된 동물 세포용 발현 벡터이고, 동물 세포용 발현 벡터에 인간 항체의 CH 및 CL 을 코드하는 유전자를 각각 삽입함으로써 구축할 수 있다.
인간 항체의 C 영역은 임의의 인간 항체의 CH 및 CL 일 수 있고, 예컨대 인간 항체 γ1 서브클래스의 CH, γ4 서브클래스의 CH, 및 κ클래스의 CL 등을 들 수 있다. 인간 항체의 CH 및 CL 을 코드하는 DNA 로는 엑손과 인트론으로 이루어지는 감염체 DNA 를 사용할 수 있고, 또한 cDNA 를 사용할 수도 있다. 동물 세포용 발현 벡터로는 인간 항체 C 영역을 코드하는 유전자를 삽입하고, 발현할 수 있는 것이면 특별한 한정없이 사용할 수 있다.
예컨대 pAGE107 (일본 공개 특허 공보 평3-22979; Miyaji H. et al., Cytotechnology, 3, 133-140, 1990), pAGE1-3 (Mizukami T. and Itoh S., J. Biochem., 101, 1307-1310, 1987), pHSG274 (Brady G. et al., Gene, 27, 223-232, 1984), pKCR (O'Hare K. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 78, 1527-1531, 1981), pSG1βd2-4 (Miyaji H. et al, Cytotechnology, 173-180, 1990) 등을 들 수있다. 동물 세포용 발현 벡터에 사용하는 프로모터와 인핸서로는 SV40 의 초기 프로모터와 인핸서 (Mizukami T. and Itoh S., J. Biochem., 101, 1307-1310, 1987), 몰로니 마우스 백혈병 바이러스의 LTR 프로모터와 인핸서 (Kuwana Y. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 149, 960-968, 1987), 및 면역 글로불린 H 쇄의 프로모터 (Mason J. O. et al., Cell, 41, 479-487, 1985) 와 인핸서 (Gillies S. D. et al., Cell, 33, 717-728, 1983) 등을 들 수 있다.
인간화 항체 발현용 벡터는 항체 H 쇄, L 쇄가 각각의 벡터 위에 존재하는 타입 또는 동일한 벡터 상에 존재하는 타입 (탠덤형) 중 어느 것이나 사용할 수 있지만, 인간화 항체 발현 벡터의 구축 용이성, 동물 세포에 대한 도입 용이성, 동물 세포 내에서의 항체 H 쇄 및 L 쇄의 발현량이 균형을 이루는 점에서 탠덤형 인간화 항체 발현용 벡터가 바람직하다 (Shitara K. et al., J. Immunol. Methods, 167, 271-278, 1994). 탠덤형 인간화 항체 발현용 벡터로는 pKANTEX93 (WO97/10354), pEE18 (Bentley K. Y. et al., Hybridoma, 17, 559-567, 1998) 등을 들 수 있다.
구축한 인간화 항체 발현용 벡터는 인간형 키메라 항체 및 인간형 CDR 이식 항체의 동물 세포에서의 발현에 사용할 수 있다.
(2) 인간 이외의 동물의 항 FGF-8 중화 항체의 VH 및 VL 을 코드하는 DNA 의 취득
인간 이외의 동물의 항 FGF-8 중화체, 예컨대 마우스 항 FGF-8 중화 모노클로날 항체의 VH 및 VL 을 코드하는 DNA 는 다음과 같이 하여 취득한다.
마우스 항 FGF-8 중화 모노클로날 항체를 산생하는 세포, 예컨대 마우스 FGF-8 중화 항체 산생 하이브리도마 등으로부터 mRNA 를 추출하고, cDNA 를 합성한다. 합성한 cDNA 를 퍼지 또는 플라스미드 등의 벡터에 삽입하고, cDNA 라이브러리를 제작한다. 이 라이브러리로부터 마우스 항체의 C 영역 부분 또는 V 영역 부분을 프로브로서 사용하고, VH 를 코드하는 cDNA 를 갖는 재조합 퍼지 또는 재조합 플라스미드, 및 VL 을 코드하는 cDNA 를 갖는 재조합 퍼지 또는 재조합 플라스미드를 각각 단리한다.
재조합 퍼지 또는 재조합 플라스미드 위의 VH 및 VL 의 전체 염기 서열을 결정하고, 염기 서열로부터 VH 및 VL 의 전체 아미노산 서열을 추정한다.
인간 이외의 동물로는 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 등, 하이브리도마를 제작할 수 있으면 특별한 한정없이 사용할 수 있다. 하이브리도마로부터 전체 RNA 를 조제하는 방법으로는 티오시안산구아니딘-트리플루오로아세트산세슘법 (Okayama H. et al., Methods Enzymol., 154, 3-28, 1987), 또한 전체 RNA 로부터 mRNA 를 제조하는 방법으로는 올리고 (dT) 고정화 셀룰로스 칼럼법 (몰레큘라 클로닝 제 3 판) 등을 들 수 있다. 또한, 하이브리도마로부터 mRNA 를 조제하는 키트로는 패스트트랙 (FastTrack) mRNA 단리 키트 (인비트로젠사 제조), 퀵프렙 (QuickPrep) mRNA 정제 키트 (아마샴 바이오사이언시즈사 제조) 등을 들 수 있다.
cDNA 의 합성 및 cDNA 라이브러리 제작법으로는 상법 (몰레큘러 클로닝 제 3 판; 커렌트 프로토콜즈 인 몰레큘러 바이올로지), 또는 시판중인 키트, 예컨대 cDNA 합성용 수퍼 스크립트 초이스 시스템 (SuperScript Choice System for cDNASynthesis, 인비트로젠사 제조) 이나 ZAP-cDNA 합성 키트 [스트라타진 (STRATAGENE) 사 제조], 타임세이버 (TimeSaver) cDNA 합성 키트 (아마샴 바이오사이언시즈사 제조) 를 사용하는 방법 등을 들 수 있다.
cDNA 라이브러리 제작시, 하이브리도마로부터 추출된 mRNA 를 주형으로 하여 합성한 cDNA 를 삽입하는 벡터는 이 cDNA 를 삽입할 수 있는 벡터이면 어느 것이나 사용할 수 있다. 예컨대 ZAP Express (스트라타진사 제조), pBluescript II SK (＋) (스트라타진사 제조), λZAP II (스트라타진사 제조), λgt10 (스트라타진사 제조), λgt11 (스트라타진사 제조), Lambda BlueMid (Clontech 사 제조), λExCell (아마샴 바이오사이언시즈사 제조), pcD2 (Okayama H. and Berg P., Mol. Cell. Biol., 3, 280-289, 1983) 및 pUC18 (Yanisch-Perron C. et al., Gene, 33, 103-119, 1985) 등의 퍼지 또는 플라스미드 벡터가 사용된다.
퍼지 또는 플라스미드 벡터에 의해 구축되는 cDNA 라이브러리를 도입하는 대장균으로서는 이 cDNA 라이브러리를 도입, 발현 및 유지할 수 있는 것이면 어느 것이나 사용할 수 있다. 예컨대 XL1-Blue MRF' (스트라타진사 제조), C600 (Appleyard R. K. Genetics, 39, 440-452, 1954), Y1088 (Young R. A. and Davis R., Science, 222, 778-782, 1983), Y1090 (Young R. A. and Davis R., Science, 222, 778-782, 1983), NM522 (Gough J. A. and Murray N. E., J. Mol. Biol., 166, 1-19, 1983), K802 (Wood W. B., J. Mol. Biol., 16, 118-133, 1966) 및 JM105 (Yanisch-Perron C. et al., Gene, 33, 103-119, 1985) 등을 사용할 수 있다.
cDNA 라이브러리로부터의 인간 이외의 동물의 항 FGF-8 중화 항체의 VH 및VL 을 코드하는 cDNA 클론의 선택법으로는 아이소 도프 또는 형광 표지한 프로브를 사용한 콜로니 하이브리다이제이션법 또는 프라크 하이브리다이제이션법 (몰레큘러 클로닝 제 3 판) 에 의해 선택할 수 있다. 또한 프라이머를 조제하고, mRNA 로부터 합성한 cDNA 또는 cDNA 라이브러리를 주형으로 하여 PCR 에 의해 VH 및 VL 을 코드하는 cDNA 를 조제할 수도 있다.
상기 방법에 의해 선택된 cDNA 의 염기 서열은 적당한 벡터에 의해 클로닝된 그 cDNA 를 사용하여 디데옥시법 (Sanger F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467, 1977) 에 기초하는 반응을 수행하고, ABI377 (어플라이드 바이오시스템즈사 제조) 등의 DNA 시퀀서를 사용하여 해석함으로써 결정할 수 있다.
(3) 인간 이외의 동물의 항 FGF-8 중화 항체의 VH 및 VL 의 아미노산 서열의 해석과 CDR 의 아미노산 서열의 동정
2. (2) 에서 취득하고, 결정한 cDNA 의 염기 서열로부터 이 cDNA 가 코드하는 VH 및 VL 의 전체 아미노산 서열을 추정하고, 기지의 항체의 VH 및 VL 의 전체 아미노산 서열 (Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991, 이하「시퀀시즈 어브 프로틴즈 어브 이뮤놀로지컬 인터레스트」라고 함) 과 비교함으로써, 취득한 cDNA 가 분비 시그널 서열을 포함하는 항체의 VH 및 VL 의 완전한 아미노산 서열을 코드하고 있는지를 확인할 수 있다. 분비 시그널 서열을 포함하는 항체의 VH 및 VL 의 완전한 아미노산 서열에 관해서는 기지의 항체의 VH 및 VL 의 전체 아미노산 서열 (시퀀시즈 어브 프로틴즈 어브 이뮤놀로지컬 인터레스트) 과 비교함으로써, 분비 시그널 서열의 길이및 N 말단 아미노산 서열을 추정할 수 있고, 또한 이들이 속하는 서브그룹을 알 수 있다.
또한, 임의의 데이터 베이스, 예컨대 SWISS-PROT 나 PIR-Protein 등에 대해 BLAST (Altschul S. F. et al., J. Mol. Biol., 215, 403-410, 1990) 등 상동성 검색 프로그램을 사용하여, 얻어진 VH 및 VL 의 완전한 아미노산 서열의 상동성 검색을 수행하여 서열의 신규성을 검토할 수 있다.
항체의 항원 결합 부위를 형성하는 VH 및 VL 은 서열이 비교적 보존된 4 개의 FR 과 이것들을 연결하는 서열의 변화가 많은 3 개의 CDR (CDR1, CDR2, CDR3) 로 이루어진다 (시퀀시즈 어브 프로틴즈 어브 이뮤놀로지컬 인터레스트). 그리고 VH 및 VL 의 각 CDR 의 아미노산 서열은 기지의 항체의 V 영역의 아미노산 서열 (시퀀시즈 어브 프로틴즈 어브 이뮤놀로지컬 인터레스트) 과 비교함으로써 동정할 수 있다.
(4) 항 FGF-8 중화 키메라 항체 발현 벡터의 구축
2. (1) 로 구축한 인간화 항체 발현용 벡터의 인간 항체의 CH 및 CL 을 코드하는 유전자의 상류에, 인간 이외의 동물의 항 FGF-8 중화 항체의 VH 및 VL 을 코드하는 DNA 를 삽입하고, 항 FGF-8 중화 키메라 항체 발현 벡터를 구축할 수 있다. 예컨대 인간 이외의 동물의 항 FGF-8 중화 항체의 VH 및 VL 을 코드하는 DNA 를 갖는 플라스미드를 주형으로 하고, 항체의 VH 및 VL 을 적당한 제한 효소의 인식 서열과 V 영역을 코드하는 염기 서열로 이루어지는 5' 말단측과 3' 말단측의 프라이머를 사용하여 PCR 법에 의해 증폭하고, 각각의 증폭산물을 pBluescript II SK (－) (스트라타진사 제조) 등의 플라스미드에 클로닝하고, 2. (2) 에 기재된 방법에 의해 염기 서열을 결정하고, 항 FGF-8 중화 항체 VH 및 VL 의 아미노산 서열을 코드하는 DNA 서열을 갖는 플라스미드를 취득한다. 얻어진 플라스미드로부터, 항 FGF-8 중화 항체의 VH 및 VL 의 아미노산 서열을 코드하는 DNA 를 단리하고, 2. (1) 에 기재된 인간화 항체 발현용 벡터의 인간 항체의 CH 및 CL 을 코드하는 유전자의 상류에 이것들이 적당한 형태로 발현하도록 클로닝하고, 항 FGF-8 중화 키메라 항체 발현 벡터를 구축할 수 있다.
(5) 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 V 영역을 코드하는 DNA 의 구축
항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 VH 및 VL 을 코드하는 DNA 는 이하와 같이 하여 구축할 수 있다. 먼저, 인간 이외의 동물의 항 FGF-8 중화 항체의 VH 및 VL 의 CDR 의 아미노산 서열을 이식하는 인간 항체의 VH 및 VL 의 FR 의 아미노산 서열을 선택한다. 인간 항체의 VH 및 VL 의 FR 의 아미노산 서열로서는 인간 항체 유래의 것이면 어느 것이나 사용할 수 있다. 예컨대 Protein Data Bank 등의 데이터 베이스에 등록되어 있는 인간 항체의 VH 및 VL 의 FR 의 아미노산 서열, 인간 항체의 VH 및 VL 의 FR 의 각 서브그룹의 공통 아미노산 서열 (시퀀시즈 어브 프로틴즈 어브 이뮤놀로지컬 인터레스트) 등을 들 수 있지만, 이들 중에서도 충분한 활성을 갖는 인간형 CDR 이식 항체를 제작하기 위해서는 인간 이외의 동물의 항 FGF-8 중화 항체의 VH 및 VL 의 FR 의 아미노산 서열과 될 수 있는 한 높은 상동성, 바람직하게는 60% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 선택하는 것이 바람직하다.
다음으로, 선택한 인간 항체의 VL 및 VL 의 FR 의 아미노산 서열에 목적하는 인간 이외의 동물의 항 FGF-8 중화 항체의 VH 및 VL 의 CDR 의 아미노산 서열을 이식하고, 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 VH 및 VL 의 아미노산 서열을 설계한다. 설계한 아미노산 서열을 항체의 유전자의 염기 서열에 나타나는 코돈의 사용 빈도 (시퀀시즈 어브 프로틴즈 어브 이뮤놀로지컬 인터레스트) 를 고려하여 염기 서열로 변환시켜 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 VH 및 VL 의 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열을 설계한다. 설계한 염기 서열에 기초하여 100 ∼ 150 염기의 길이로 이루어지는 수개의 합성 DNA 를 합성하고, 이들을 사용하여 PCR 법을 수행한다. 이 경우, PCR 에서의 반응 효율 및 합성 가능한 DNA 의 길이로부터, VH, VL 모두 4 개의 합성 DNA 를 설계하는 것이 바람직하다. 또한 양단에 위치하는 합성 DNA 의 5' 말단에 적당한 제한 효소의 인식 서열을 도입함으로써, 2. (1) 에서 구축한 인간화 항체 발현용 벡터에 쉽게 클로닝할 수 있다. PCR 반응 후, 증폭 산물을 pBluescript SK (－) (스트라타진사 제조) 등의 플라스미드 벡터에 클로닝하고, 2. (2) 에 기재된 방법에 따라 염기 서열을 결정하고, 원하는 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 VH 및 VL 의 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열을 갖는 플라스미드를 취득한다.
(6) 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 VH 및 VL 의 아미노산 서열의 개변
인간형 CDR 이식 항체는 목적하는 인간 이외의 동물의 항체의 VH 및 VL 의 CDR 만을 인간 항체의 VH 및 VL 의 FR 에, 이식한 것만으로는 그 항원 결합 활성은 본래의 인간 이외의 동물의 항체의 활성에 비해 저하되는 것이 알려져 있다(Tempest P. R. et al., Bio/technology, 9, 266-271, 1991). 그 원인은 본래의 인간 이외의 동물의 항체의 VH 및 VL 에서는 CDR 뿐만 아니라, FR 의 몇개의 아미노산 잔기가 직접적 또는 간접적으로 항원 결합 활성에 관여하고 있고, 이들 아미노산 잔기가 CDR 의 이식에 수반하여 인간 항체의 VH 및 VL 의 FR 이 다른 아미노산 잔기로 변화되기 때문인 것으로 생각된다. 이 문제를 해결하기 위해, 인간형 CDR 이식 항체에서는 인간 항체의 VH 및 VL 의 FR 의 아미노산 서열 중에서, 직접 항원과의 결합에 관여하고 있는 아미노산 잔기나 CDR 의 아미노산 잔기와 상호 작용하거나, 항체의 입체 구조를 유지하고, 간접적으로 항원과의 결합에 관여하고 있는 아미노산 잔기를 동정하고, 이들을 본래의 인간 이외의 동물의 항체에 발견되는 아미노산 잔기로 개변하여 저하된 항원 결합 활성을 상승시키는 방법이 수행되고 있다 (Tempest P. R. et al., Bio/technology, 9, 266-271, 1991). 인간형 CDR 이식 항체의 제작에 있어서는 이들 항원 결합 활성에 관한 FR 의 아미노산 잔기를 얼마나 효율적으로 동정하는지가 가장 중요한 점이고, 따라서 X 선 결정 해석 (Bernstein F. C. et al., J. Mol. Biol., 112, 535-542, 1977) 또는 컴퓨터 모델링 (Tempest P. R. et al., Protein Engineering, 7, 1501-1507, 1994) 등에 의한 항체의 입체 구조의 구축 및 해석이 수행되고 있다. 이들 항체의 입체 구조의 정보는 인간형 CDR 이식 항체의 제작에 많은 유익한 정보를 가져다 주었으나, 그 한편 모든 항체에 적응 가능한 인간형 CDR 이식 항체의 제작법은 아직 확립되어 있지 않아 현상태로는 각각의 항체에 대해 수종의 개변체를 제작하고, 각각의 항원 결합 활성과의 상관을 검토하는 등의 각종 시행 착오가 필요하다.
인간 항체의 VH 및 VL 의 FR 의 아미노산 잔기의 개변은 개변용 합성 DNA 를 프라이머로 사용하여 PCR 법을 수행함으로써 달성할 수 있다. PCR 후의 증폭 산물에 대해 2. (2) 에 기재된 방법에 의해 그 염기 서열을 결정하고, 목적하는 개변이 실시된 것을 확인하여 목적하는 변이가 도입된 DNA 를 함유하는 벡터 (이하, 아미노산 서열 개변 벡터라고 함) 를 취득한다.
또한, 좁은 영역의 아미노산 서열의 개변이면 20 ∼ 35 염기로 이루어지는 변이 도입 프라이머를 사용한 PCR 변이 도입법에 의해 수행할 수 있다. 구체적으로는 개변 후의 아미노산 잔기를 코드하는 DNA 서열을 포함하는 20 ∼ 35 염기로 이루어지는 센스 변이 프라이머 및 안티센스 변이 프라이머를 합성하고, 개변할 VH 및 VL 의 아미노산 서열을 코드하는 DNA 를 포함하는 플라스미드를 주형으로 하여 2 단계의 PCR 을 수행한다. 최종 증폭 단편을 적당한 벡터에 서브클로닝한 후, 그 염기 서열을 결정하고 목적하는 변이가 도입된 DNA 를 포함하는 아미노산 서열 개변 벡터를 취득한다.
(7) 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체 발현 벡터의 구축
2. (1) 에 기재된 인간화 항체 발현용 벡터의 인간 항체의 CH 및 CL 을 코드하는 DNA 의 상류에 2. (5) 및 (6) 에서 구축한 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 VH 및 VL 을 코드하는 DNA 를 삽입하여 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체 발현 벡터를 구축할 수 있다. 예컨대 2. (5) 및 (6) 에서 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 VH 및 VL 을 구축할 때에 사용하는 합성 DNA 중, 양단에 위치하는 합성 DNA 의 5' 말단에 적당한 제한 효소의 인식 서열을 도입함으로써, 2. (1) 에 기재된 인간화 항체 발현용 벡터의 인간 항체의 CH 및 CL 을 코드하는 DNA 의 상류에 이들이 적절한 형태로 발현하도록 클로닝할 수 있다.
(8) 인간화 항체의 일과성 발현 및 활성 평가
제작한 다종류의 인간화 항체의 항원 결합 활성을 효율적으로 평가하기 위해, 2. (4) 에 기재된 항 FGF-8 중화 키메라 항체 발현 벡터, 2. (7) 에 기재된 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체 발현용 벡터, 또는 이들을 개변한 발현 벡터를 사용하여 인간화 항체의 일과성 발현을 수행할 수 있다. 발현 벡터를 도입하는 숙주 세포로는 인간화 항체를 발현할 수 있는 숙주 세포이면 어느 세포나 사용할 수 있지만, 그 발현량의 높은 점에서 COS-7 세포 (ATCC 번호: CRL-1651) 가 일반적으로 사용된다 (Warr G. W. et al., Methods in Nucleic Acids Research, CRC Press, 283, 1990). COS-7 세포에 대한 발현 벡터의 도입법으로는 DEAE 덱스트란법 (Warr G. W. et al., Methods in Nucleic Acids Research, CRC press, 283, 1990), 리포펙션법 (Felgner P. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413-7417, 1987) 등을 들 수 있다.
발현 벡터의 도입 후, 배양 상청 중의 인간화 항체의 발현량 및 항원 결합 활성은 제 1 항체로서 배양 상청을, 제 2 항체로서 표지한 항 인간 이뮤노 글로불린 항체를 사용한 1. (2) 에 기재된 효소 면역 측정법 등에 의해 측정할 수 있다. 또한 FGF-8 의 활성을 저해하는 중화 활성을 유지하고 있는지 여부를 1. (4) 에 기재된 세포 증식 저해 어세이로 확인할 수 있다.
(9) 인간화 항체의 안정 발현 및 활성 평가
2. (4) 에 기재된 항 FGF-8 키메라 항체 발현 벡터 또는 2. (7) 에 기재된 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체 발현 벡터를 적당한 숙주 세포에 도입함으로써 인간화 항체를 안정적으로 생산하는 형질 전환체를 얻을 수 있다.
숙주 세포에 대한 발현 벡터의 도입법으로는 일렉트로포레이션법 (일본 공개 특허 공보 평2-257891; Miyaji H. et al., Cytotechnology, 3, 133-140, 1990) 등을 들 수 있다.
항 FGF-8 중화 키메라 항체 발현 벡터 또는 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체 발현 벡터를 도입하는 숙주 세포로는 인간화 항체를 발현시킬 수 있는 숙주 세포이면 어느 세포나 사용할 수 있다. 예컨대 마우스 SP2/O-Ag14 세포 (ATCC 번호: CRL-1581), 마우스 P3X63-Ag8.653 세포 (ATCC 번호: CRL-1580), 디히드로 엽산 환원 효소 (이하, DHFR 이라고 함) 유전자가 결손된 CHO 세포이다. CHO/DG44 세포 (Urlaub G. and Chasin L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216-4220 1980), 래트 YB2/3HL. P2. G11. 16Ag. 20 세포 (ATCC 번호: CRL-1662, 이하 YB2/0 세포라고 함) 등을 들 수 있다.
발현 벡터의 도입 후, 인간화 항체를 안정적으로 생산하는 형질 전환체는 G418 (G418 sulfate; 시그마 알드리치사 제조) 등의 약제를 포함하는 동물 세포 배양용 배지에서 배양함으로써 선택할 수 있다 (Shitara K. et al., J. Immunol. Methods, 167, 271-278, 1994). 동물 세포 배양용 배지로서는 RPMI 1640 배지 (닛스이 제약사 제조), GIT 배지 (닛폰 제약사 제조), EX-CELL302 배지 (JRH 바이오사이언시즈사 제조), IMDM 배지 (인비트로젠사 제조), 하이브리도마 SFM 배지 (인비트로젠사 제조), 또는 이들 배지에 FBS 등의 각종 첨가물을 첨가한 배지 등을 사용할 수 있다. 얻어진 형질 전환체를 배지 중에서 배양함으로써 배양 상청 중에 인간화 항체를 발현 축적시킬 수 있다. 배양 상청 중의 인간화 항체의 발현량 및 항원 결합 활성은 상기 1. (4) 에 기재된 ELISA 등에 의해 측정할 수 있다. 또한, 형질 전환체는 DHFR 유전자 증폭계 등을 이용하여 인간화 항체의 생산량을 상상시킬 수 있다 (Shitara K. et al, J. Immunol. Methods, 167, 271-278, 1994).
인간화 항체는 형질 전환체의 배양 상청으로부터 프로틴 A 칼럼을 사용하여 정제할 수 있다 (안티보디즈 어 래버러토리 매뉴얼, chapter 8; 모노클로날 안티보디즈). 또한 그밖에 통상의 단백질에서 사용되는 정제 방법을 사용할 수 있다. 예컨대 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피 및 한외 여과 등을 조합하여 수행하고, 정제할 수 있다. 정제한 인간화 항체의 H 쇄, L 쇄 또는 항체 분자 전체의 분자량은 폴리아크릴아미드겔 전기 영동 (SDS-PAGE; Laemmli U. K., Nature, 227, 680-685, 1970) 이나 웨스턴 블롯팅법 (안티보디즈 어 래버러토리 매뉴얼, chapter 12; 모노클로날 안티보디즈) 등으로 측정한다.
정제한 인간화 항체의 항원 결합 활성은 제 1 항체로서 정제 인간화 항체를, 제 2 항체로서 표지한 항 인간 이뮤노 글로불린 항체를 사용한 상기 1. (2) 에 기재된 효소 면역 측정법, 표면 플라즈몬 공명 (Karlsson R. et al., J. Immunol. Methods, 145, 229-240, 1991) 등에 의해 측정할 수 있다. 또한, FGF-8 의 활성을 저해하는 중화 활성을 유지하고 있는지 여부를 1. (4) 에 기재된 세포 증식저해 어세이로 확인할 수 있다.
3. 항체 단편의 제작
항체 단편은 1. 및 2. 에 기재된 항 FGF-8 중화 모노클로날 항체, 항 FGF-8 중화 인간화 항체를 본래의 유전자 공학적 수법 또는 단백질 화학적 수법에 의해 제작할 수 있다. 항체 단편으로는 Fab, F(ab')2, Fab', scFv, diabody, dsFv, CDR 을 포함하는 펩티드 등을 들 수 있다.
(1) Fab 의 제작
Fab 는 항 FGF-8 중화 항체를 단백질 분해 효소 파파인으로 처리함으로써 제작할 수 있다. 파파인의 처리 후에는 본래의 항체가 프로틴 A 결합성을 갖는 IgG 서브클래스이면 프로틴 A 칼럼에 통과시킴으로써 IgG 분자나 Fc 단편과 분리하여 균일한 Fab 로서 회수할 수 있다 (모노클로날 안티보디즈). 프로틴 A 결합성을 갖지 않는 IgG 서브클래스의 항체의 경우에는 이온 교환 크로마토그래피에 의해, Fab 는 저염농도로 용출되는 획분 중에 회수할 수 있다 (모노클로날 안티보디즈). 또한, Fab 는 대장균을 사용하여 유전자 공학적으로 제작할 수도 있다. 예컨대 2. (2), (5) 및 (6) 에 기재된 항체의 V 영역을 코드하는 DNA 를 Fab 발현용 벡터에 클로닝하고, Fab 발현 벡터를 제작할 수 있다. Fab 발현용 벡터로는 Fab 용 DNA 를 삽입 발현할 수 있는 것이면 어느 것이나 사용할 수 있다. 예컨대 pIT106 (Better M. et al., Science, 240, 1041-1043, 1988) 등을 들 수 있다. Fab 발현 벡터를 적당한 대장균에 도입하고, 봉입체 또는 페리플라즈마층에 Fab 를생성 축적시킬 수 있다. 봉입체로부터는, 통상 단백질에서 사용되는 리폴딩법에 의해 활성이 있는 Fab 로 할 수 있고, 또한 페리플라즈마층에 발현시킨 경우에는 배양 상청 중에 활성을 갖는 Fab 가 누출된다. 리폴딩 후 또는 배양 상청으로부터는, 항원을 결합시킨 칼럼을 사용함으로써, 균일한 Fab 를 정제할 수 있다 (Borrebeck K., Antibody Engineering: A Practical Guide, Oxford University Press, 1991).
(2) F(ab')2의 제작
F(ab')2는 항 FGF-8 중화 항체를 단백질 분해 효소 펩신으로 처리함으로써 제작할 수 있다. 펩신의 처리 후에는 Fab 와 동일한 정제 조작에 의해 균일한 F(ab')2로서 회수할 수 있다 (모노클로날 안티보디즈). 또한 3. (3) 에 기재된 Fab' 를 N,N'-o-페닐렌디말레이미드나 비스말레이미드헥산 등과 같은 말레이미드로 처리하고, 티오에테르 결합시키는 방법이나, 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산) 으로 처리하고, 디술피드 결합시키는 방법에 의해서도 제작할 수 있다 (McCafferty J. et al., Antibody Engineering: A Practical Approach, IRL Press, 1996).
(3) Fab' 의 제작
Fab' 는 3. (2) 에 기재된 F(ab')2를 디티오트레이톨 등의 환원제로 처리하여 얻을 수 있다. 또한, Fab' 는 대장균을 사용하여 유전자 공학적으로 제작할 수도 있다. 예컨대 2. (2), (5) 및 (6) 에 기재된 항체의 V 영역을 코드하는 DNA 를, Fab' 발현용 벡터에 클로닝하고, Fab' 발현 벡터를 제작할 수 있다.Fab' 발현 벡터로는 2. (2), (5) 및 (6) 에 기재된 항체의 V 영역을 코드하는 DNA 를 삽입 발현할 수 있는 것이면 어느 것이나 사용할 수 있다. 예컨대 pAK19 (Carter P. et al., Bio/technology, 10, 163-167, 1992) 등을 들 수 있다. Fab' 발현 벡터를 적당한 대장균에 도입하고, 봉입체 또는 페리플라즈마층에 Fab' 를 생성 축적시킬 수 있다. 봉입체로부터는, 통상 단백질에서 사용되는 리폴딩법에 의해 활성이 있는 Fab' 로 할 수 있고, 또한 페리플라즈마층에 발현시킨 경우에는 리조팀에 의한 부분 소화, 침투압 쇼크, 소니케이션 등의 처리에 의해 균을 파쇄하고, 균체 외로 회수시킬 수 있다. 리폴딩 후 또는 균의 파쇄액으로부터는, 프로틴 G 칼럼 등을 사용함으로써, 균일한 Fab' 를 정제할 수 있다 (MacCafferty J. et al., Antibody Engineering: A Practical Approach, IRL Press, 1996).
(4) scFv 의 제작
scFv 는 유전자 공학적으로 퍼지 또는 대장균을 사용하여 제작할 수 있다. 예컨대 2. (2), (5) 및 (6) 에 기재된 항체의 VH 및 VL 을 코드하는 DNA 를 12 잔기 이상의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 링커를 코드하는 DNA 를 통해 연결하고, scFV 를 코드하는 DNA 를 제작한다. 폴리펩티드 링커는 그 부가가 VH, VL 항원으로의 결합에 대해 방해하지 않도록 최적화하는 것이 중요하고, 예컨대 Pantoliano 등에 의해 나타난 것 (Pantoliano M. W. et al., Biochemistry, 30, 10117-10125, 1991) 또는 그것을 가변한 것을 사용할 수 있다.
제작한 DNA 를 scFv 발현용 벡터에 클로닝하고, scFv 발현 벡터를 제작할 수있다. scFv 발현 벡터로는 scFv 의 DNA 를 삽입 발현할 수 있는 것이면 어느 것이나 사용할 수 있다.
예컨대 pCANTAB5E (아마샴 바이오사이언시즈사 제조), Phfa (Lah M. et al., Hum. Antibodies Hybridomas, 5, 48-56, 1994) 등을 들 수 있다. scFv 발현 벡터를 적당한 대장균에 도입하고, 헬퍼 퍼지를 감염시킴으로써, 퍼지 표면에 scFv 가 퍼지 표면 단백질과 융합한 형태로 발현하는 퍼지를 얻을 수 있다. 또, scFv 발현 벡터를 도입한 대장균의 봉입체 또는 페리플라즈마층에 scFv 를 생성 축적시킬 수 있다. 봉입체로부터는, 통상 단백질에서 사용되는 리폴딩법에 의해 활성이 있는 scFv 로 할 수 있고, 또한 페리플라즈마층에 발현시킨 경우에는 리조팀에 의한 부분 소화, 침투압 쇼크, 소니케이션 등의 처리에 의해 균을 파쇄하고, 균체 외로 회수시킬 수 있다. 리폴딩 후 또는 균의 파쇄액으로부터는, 양이온 교환 크로마토그래피 등을 사용함으로써, 균일한 scFv 를 정제할 수 있다 (MaCafferty J. et al., Antibody Engineering: A Practical Approach, IRL Press, 1996).
(5) diabody 의 제작
diabody 는 상기 scFv 를 제작할 때의 폴리펩티드 링커를 3 ∼ 10 잔기 정도로 함으로써 제작할 수 있다. 1 종류의 항체의 HV 및 VL 을 사용한 경우에는 2 가의 diabody 를 2 종류의 항체의 VH 및 VL 을 사용한 경우에는 2 특이성을 갖는 diabody 를 제작할 수 있다 (Le Gall F. et al., FEBS Lett., 453, 164-168, 1999, Courage C. et al., Int. J. Cancer, 77, 763-768, 1998).
(6) dsFv 의 제작
dsFv 는 대장균을 사용하여 유전자 공학적으로 제작할 수도 있다. 먼저, 2. (2), (5) 및 (6) 에 기재된 항체의 VH 및 VL 을 코드하는 DNA 의 적당한 위치에 변이를 도입하고, 코드하는 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환된 DNA 를 제작한다. 아미노산 잔기의 시스테인 잔기로의 개변은 2. (6) 의 PCR 을 사용한 변이 도입법에 의해 수행할 수 있다. 제작한 각 DNA 를 dsFv 발현용 벡터에 클로닝하고, VH 및 VL 의 발현 벡터를 제작할 수 있다. dsFv 발현용 벡터로는 dsFv 용 DNA 를 삽입 실현할 수 있는 것이면 어느 것이나 사용할 수 있다. 예컨대 pUL19 (Reiter Y. et al., Protein Eng., 7, 697-704, 1994) 등을 들 수 있다. VH 및 VL 의 발현 벡터를 적당한 대장균에 도입하고, 봉입체 또는 페리플라즈마층에 VH 및 VL 을 생성 축적시킬 수 있다. 봉입체 또는 페리플라즈마층으로부터 VH 및 VL 을 얻고, 혼합하고, 통상 단백질에서 사용되는 리폴딩법에 의해 디술피드 결합을 형성시키고, 활성이 있는 dsFv 로 할 수 있다. 리폴딩 후에는 이온 교환 크로마토그래피 및 겔 여과 등에 의해 더욱 정제할 수 있다 (Reiter Y. et al., Protein Eng., 7, 697-704, 1994).
(7) CDR 을 포함하는 펩티드의 제작
CDR 을 포함하는 펩티드는 Fmoc 법 또는 tBoc 법 등의 화학 합성법에 의해 제작할 수 있다. 또한 CDR 을 포함하는 펩티드를 코드하는 DNA 를 제작하고, 제작한 DNA 를 적당한 발현용 벡터에 클로닝하고, CDR 펩티드 발현 벡터를 제작할 수 있다. 발현용 벡터로는 CDR 을 포함하는 펩티드를 코드하는 DNA 를 삽입 발현할 수 있는 것이면 어느 것이나 사용할 수 있다. 예컨대 pLEX (인비트로젠사 제조), pAX4a＋ [모비텍 (MoBiTec) 사 제조] 등을 들 수 있다. 발현 벡터를 적당한 대장균에 도입하고, 봉입체 또는 페리플라즈마층에 CDR 을 포함하는 펩티드를 생성 축적시킬 수 있다. 봉입체 또는 페리플라즈마층으로부터 CDR 을 포함하는 펩티드를 얻고, 이온 교환 크로마토그래피 및 겔 여과 등에 의해 정제할 수 있다 (Reiter Y. et al., Protein Eng., 7, 697-704, 1994).
(8) 활성 평가
상기 항체 단편의 항원 결합 활성은 항체 단편을 제 1 항체로서 사용한 상기 1. (2) 에 기재된 효소 면역 측정법, 표면 플라즈몬 공명 (Karlsson R. et al., J. Immunol. Methods, 145, 229-240, 1991) 등에 의해 측정할 수 있다. 또한 FGF-8 의 활성을 저해하는 중화 활성을 유지하고 있는지 여부를 1. (4) 에 기재된 세포 증식 저해 어세이로 확인할 수 있다.
4. 본 발명의 예방약 및 치료약
항 FGF-8 중화 항체는 활막이나 연골의 세포 및 조직 위의 FGF-8 과 결합하고, FGF-8 에 의해 유도되는 연골의 세포외 매트릭스의 분해를 억제하고, 연골의 파괴를 억제하는 능력을 갖기 때문에 연골 보호제가 된다. 또한 이 항체는 FGF-8 에 의해 유도되는 활막 세포의 증식을 억제하는 능력을 갖기 때문에 활막 세포의 증식 억제제가 된다. 관절의 파괴는 연골의 파괴나 활막 세포의 증식을 수반하므로, 이 항체는 활막 세포의 증식 및 연골의 파괴를 억제함으로써 관절의 파괴의 억제제가 된다. 관절염은 관절의 파괴를 동반하는 질환이므로, 이 항체는 관절의 파괴를 억제함으로써 관절염 치료약 및 예방약이 된다. 관절염으로는 변형성 관절증이나 관절 류머티즘, 전신성 홍반성 루프스, 강직성 관절염, 건선성 관절염, 추간판 질환, 급성 결정성 활막염 (통풍, 위통풍 포함) 등을 들 수 있다.
인간화 항체는 인간 이외의 동물의 모노클로날 항체와 비교하여 인간 항체의 아미노산 서열에 유래하는 부분이 대부분이므로, 인간체내에서 높은 효과를 나타내고 또한 면역원성이 낮고, 그 효과가 장기에 걸쳐 지속되는 것이 기대되므로, 예방약 및 치료약으로서 바람직하다.
항 FGF-8 중화 항체를 함유하는 의약은 치료약으로서 단독으로 투여할 수도 있기는 하나, 통상은 약리학적으로 허용되는 하나 또는 그 이상의 담체와 함께 혼합하고, 제제학의 기술 분야에서 잘 알려져 있는 임의의 방법에 의해 제조한 의약 제제로서 제공하는 것이 바람직하다.
투여 경로는 치료시에 가장 효과적인 것을 사용하는 것이 바람직하고, 경구 투여, 또는 구강내, 기도내, 직장내, 피하, 근육내, 관절내, 및 정맥내 등의 비경구 투여를 들 수 있고, 항체 또는 펩티드 제제의 경우, 바람직하게는 관절내 및 정맥내 투여를 들 수 있다.
투여 형태로는 분무제, 캡슐제, 정제, 과립제, 시럽제, 유제, 좌제, 주사제, 연고, 테이프제 등을 들 수 있다.
경구 투여에 적당한 제제로는 유제, 시럽제, 캡슐제, 정제, 산제, 과립제 등을 들 수 있다.
유제 및 시럽제와 같은 액체 조제물은 물, 자당, 소르비톨, 과당 등의 당류, 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 등의 글리콜류, 참기름, 올리브유, 대두유 등의 오일류, p-히드록시벤조산에스테르류 등의 방부제, 스트로베리 후레바, 페파민트 등의 후레바류 등을 첨가제로 사용하여 제조할 수 있다.
캡슐제, 정제, 산제, 과립제 등은 유당, 포도당, 자당, 만니톨 등의 부형제, 전분, 알긴산나트륨 등의 붕괴제, 스테아르산마그네슘, 탤크 등의 활택제, 폴리비닐알코올, 히드록시프로필셀룰로스, 젤라틴 등의 결합제, 지방산에스테르 등의 계면활성제, 글리세린 등의 가소제 등을 첨가제로 사용하여 제조할 수 있다.
비경구 투여에 적당한 제제로는 주사제, 좌제, 분무제 등을 들 수 있다. 주사제는 염 용액, 포도당 용액, 또는 양자의 혼합물로 이루어지는 담체 등을 사용하여 조제된다.
좌제는 카카오지, 수소화 지방 또는 카르복실산 등의 담체를 사용하여 조제된다.
또한 분무제는 이 항체 또는 펩티드 자체, 내지는 수용자의 구강 및 기도 점막을 자극하지 않고 또한 이 항체는 펩티드를 미세한 입자로서 분산시켜 쉽게 흡수시키게 하는 담체 등을 사용하여 조제된다.
담체로서 구체적으로는 유당, 글리세린 등이 예시된다. 이 항체 또는 펩티드 및 사용하는 담체의 성질에 따라, 에어러졸, 드라이 파우더 등의 제제가 가능하다. 또한, 이들 비경구제에서도 경구제에서 첨가제로서 예시한 성분을 첨가할 수도 있다.
투여량 또는 투여 회수는 목적으로 하는 치료 효과, 투여 방법, 치료 기간, 연령, 체중 등에 따라 달라지지만, 통상 성인 1 일당 10㎍/㎏ ∼ 20㎎/㎏ 이다.
항체 FGF-8 중화 항체가 연골의 세포외 매트릭스의 분해를 억제하는 것, 및 활막 세포의 증식을 억제하는 것은 이하 (1) 및 (2) 에 나타내는 인 비트로에서의 어세이계를 사용하여 확인할 수 있다. 또한, 관절염 치료약 및 예방약이 되는 것은 이하 (3) 에 나타내는 관절염 병태 모델 동물에게 이 항체를 투여하고, 그 관절염 증상을 경감할 수 있는지 여부에 따라서도 평가할 수 있다.
(1) FGF-8 에 의한 연골 파괴에 대한 저해 활성
연골의 파괴는 연골 세포나 연골 기관을 사용한 연골의 세포외 매트릭스의 분해, 연골 세포 및 활막 세포로부터의 파괴 인자의 산생의 증가를 지표로 한 어세이에 의해, 연골 파괴의 진전에 의한 연골 하골의 파괴는 골 흡수량을 지표로 한 어세이에 의해 각각 평가할 수 있다.
(a) 연골의 세포외 매트랙스의 분해
연골 파괴 작용은 초대 배양으로 한 토끼 관절 연골 세포를 FGF-8 존재 하에서 FGF-8 중화 항체를 첨가한 경우와 첨가하지 않은 경우로 배양하고, 배양 후에 플레이트에 잔존하는 세포외 매트릭스의 양을 측정함으로써 평가할 수 있다. 세포외 매트릭스의 양은 파파인 처리에 의해 유리되어 온 글리코사미노글리칸의 양으로서 측정한다. FGF-8 에 의해 유도되는 세포외 매트릭스의 감소가 항 FGF-8 중화 항체의 첨가에 의해 저해되는 경우, 이 항체는 연골 파괴의 억제 작용을 갖는 것을 생각된다.
연골 파괴 작용은 Price 등의 방법 (Price J. S. et al., Arthritis Rheum., 42, 137-147, 1999) 에 따라 초대 배양한 소 비중격 연골 기관을 FGF-8 존재 하에서 FGF-8 중화 항체를 첨가한 경우와 첨가하지 않은 경우로 배양하고, 배양 후의 연골 기관 중의 세포외 매트릭스의 양을 측정하는 것에 의해서도 평가할 수 있다. FGF-8 에 의해 유도되는 세포외 매트릭스의 감소가 항 FGF-8 중화 항체의 첨가에 의해 저해되는 경우, 이 항체는 연골 파괴의 억제 작용을 갖는 것으로 생각된다. 세포외 매트릭스의 양은 배양 후의 기관을 파파인 처리하고, 유리되어 온 글리코사미노글리칸의 양을 디메틸메틸렌 블루법 (Chandrasekhar S. et al., Anal. Biochem. 161 103-108, 1987) 에 의해 측정할지 또는 콜라겐의 양을 토쿄 위생 연보, 36, 277, 1985 에 따라 히드록시프롤린 농도로서 측정하는 것에 의해 측정할 수 있다.
(b) 연골 파괴에 관여하는 인자의 산생
연골 파괴에 관여하는 인자로는 프로스타그란딘 E2, 매트릭스 메탈로프로티나제-3, 일산화질소를 들 수 있다. 또끼 관절 연골 세포 또는 토끼 활막 세포를 FGF-8 존재 하에서 항 FGF-8 중화 항체를 첨가한 경우와 첨가하지 않은 경우로 배양하고, 이들 인자의 그 세포로부터의 산생량으로서 배양 상청의 프로스타그란딘 E2, 매트릭스 메탈로프로티나제-3 또는 일산화질소를 측정한다. FGF-8 에 의해 촉진되는 프로스타그란딘 E2, 매트릭스 메탈로프로티나제-3 또는 일산화질소의 산생이 항 FGF-8 중화 항체의 첨가에 의해 저해되는 경우, 이 항체는 연골 파괴의 억제작용을 갖는 것으로 생각된다.
프로스타그란딘 E2는 프로스타그란딘 E2EIA 시스템 (아마샴 바이오사이언시즈사 제조) 에 의해, 매트릭스 메탈로프로티나제-3 은 토끼 매트릭스 메탈로프로티나제-3 ELISA 시스템 (아마샴 바이오사이언시즈사 제조) 에 의해, 일산화질소는 Griess 시약을 사용하는 방법 (Green L. C. et al., Anal. Biochem. 126, 131-138, 1982) 에 의해 측정할 수 있다.
(c) 골 흡수
골 흡수는 Kusano 등의 방법 (Kusano K., et al., Endocrinology, 139, 1338-1345, 1998) 에 따라, 마우스 두개관을 FGF-8 존재 하에서 FGF-8 중화 항체를 첨가한 경우와 첨가하지 않은 경우로 배양하고, 배양 상청 중의 칼슘 농도 또는 히드록시프롤린 농도를 측정하는 것에 의해 평가할 수 있다. FGF-8 에 의해 촉진되는 골 흡수가 항 FGF-8 중화 항체의 첨가에 의해 저해되는 경우, 이 항체는 연골 파괴의 억제 작용을 갖는 것으로 생각된다. 배양 상청의 칼슘 농도는 칼슘 C-테스트 와코 (와코쥰야쿠 공업사 제조) 를 사용하여 측정할 수 있다. 또한 배양 상청 중의 히드록시프롤린 농도는 토쿄 위생 연보, 36, 277, 1985 에 따라 측정할 수 있다.
(2) 활막 세포의 증식 억제 작용
활막 세포의 증식은 인간이나 토끼의 활막 세포를 FGF-8 존재 하에서 항 FGF-8 중화 항체를 첨가한 경우와 첨가하지 않은 경우로 배양하고, [3H] 티미딘 수용량의 측정에 의해 평가할 수 있다. FGF-8 에 의해 촉진되는 [3H] 티미딘 수용량이 항 FGF-8 중화 항체의 첨가에 의해 저해되는 경우, 이 항체는 활막 세포의 증식 억제 작용을 갖는 것으로 생각된다.
(3) 관절염 병태 모델 동물을 사용한 인 비보에서의 평가
하기 관절염 병태 모델을 사용하여 FGF-8 또는 항 FGF-8 중화 항체의 관절 파괴에 대한 효과를 평가할 수 있다. 관절염 병태 모델 동물에게 항 FGF-8 중화 항체를 투여하고, 이 모델 동물의 관절염의 증상이 경감하는 경우에 관절염 치료약이나 예방약으로 사용할 수 있는 것으로 생각된다.
관절 류머티즘에 유사한 병태를 나타내는 모델 동물로서 주로 발 관절에 관절염이 자연 발증하는 MRL-lpr/lpr 마우스 (Hang. L. et al., J. Exp. Med., 155, 1690-1701, 1982, 닛폰 찰스 리버로부터 구입 가능), 결핵 사균을 면역시켜 유도되는 래트 면역 보강제 관절염 모델 (Pearson CM. et al., Arth. Rheum., 5, 654-658, 1962, Taurog J. D. et al., Cell. Immunol., 75, 271-282, 1983, Bendele A. et al., J. Rheumatol., 26, 1225-1229, 1999), 관절에 많은 II 형 콜라겐을 면역 보강제와 함께 면역시켜 발증시키는 마우스 콜라겐 관절염 모델 (Stuart J. M. et al., Annu. Rev. Immunol., 2, 199-218, 1984, Kamada H. et al., Jpn. J. Pharmacol, 70, 169-175, 1996) 등을 들 수 있다. 이들 모델 동물은 관절 류머티즘과 유사한 병태를 나타내고, 관절염 치료약의 평가에 널리 사용되고 있다.
래트 면역 보강제 관절염 모델을 사용하는 경우에는 면역 보강제 처치 발 (급성 염증에 이어서 만성 염증이 일어나는 2상성의 염증 반응이 일어남) 및 면역 보강제 비처치 발 (감작 1 주일경부터 만성 염증이 일어남) 각각에 대해 경시적으로 뒷다리 족척 부종 용적을 측정한다. 또한 좌우 뒷다리의 연 X 선 촬영을 수행하고, 골 파괴 및 관절의 변형에 대해 평가한다. 또한, 뇨 중의 글리코사미노글리칸량을 측정함으로써, 전신에서의 연골 파괴에 대해 뇨 중의 데옥시피리디놀린량 또는 히드록시프롤린량을 측정함으로써, 전신에서의 골 파괴에 대해 각각 평가한다. 뇨 중의 글리코사미노글리칸량은 디메틸메틸렌 블루법 (Chandrasekhar A. et al., Anal. Biochem. 161 103-108, 1987) 에 의해 뇨 중의 데옥시피리디놀린량은 오스테오링크스「DPD」스미토모 제약사 제조) 을 사용하여, 뇨 중의 히드록시프롤린량은 이케다 등의 방법 (이케다 싱고 등, 토쿄 위연 연보. 36 277-282, 1985) 에 따라 각각 측정할 수 있다. 또한 전신의 염증 반응의 지표로서 혈청 중 무코단백 농도를 아스프로 GP (오오츠카 제약) 을 사용하여 혈청 중의 일산화질소 농도를 Tracey 등의 방법 (Tracey W. R., et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 272, 1011-1015, 1995) 에 따라 각각 측정한다.
마우스 콜라겐 관절염 모델을 사용하는 경우에는 체중과 전체 다리의 관절염 스코어의 경시 변화, 혈청 중 항 콜라겐 항체가를 측정한다. 또한 해부 후, 관절부의 병리 조직학적 검토를 행한다. 관절염 스코어는 다리 하나에 0 ∼ 4 점, 전체 다리 최고 16 점의 스코어링에 의해 평가한다. 스코어의 기준은 0: 정상, 1: 약한 홍반이 관찰됨, 2: 약한 종창(腫腸)과 홍반이 관찰됨, 3 강한 종창과 홍반이 관찰되고, 만지면 따뜻한 느낌이 있음, 4: 발가락의 변형을 수반하는 아주 분명한 종창이 관찰된다.
변형성 관절증 모델로서 개, 토끼 등의 대동물을 사용하여 무릎 반월상 연골의 절제나 인대의 절리에 의해 관절에 동요성을 발생시켜 만성적인 관절의 변성을 발생시키는 모델 (이하, 실험적 변형성 관절증 모델이라고 함) 이 많이 사용되고 있다 (이토 류타, 신약 개발을 위한 동물 모델 이용집성, 변형성 관절증, R&D 플래닝, 1985 년, Guingamp C. et al., Arthritis Rheum., 40, 1670-1679, 1997, van der Kraan P. M. et al., Am. J. Pathol., 135, 1001-1014, 1989). 또한, 래트의 무릎 관절 내에 모노요오드아세트산을 주입함으로써, 관절 연골의 세포외 매트릭스인 글리코사미노글리칸의 유리를 촉진하고, 관절 파괴를 야기하는 래트 모노요오드아세트산 유발 변형성 관절증 모델도 변형성 관절증 모델로서 들 수 있다.
토끼 무릎 관절 반원판 부분 절제에 의한 실험적 변형성 관절증 모델은 Colombo 등의 방법 (Colombo C. et al., Arthritis Rhem., 26, 875-886, 1983) 및 키쿠치 등의 방법 (키쿠치 토시유키 등, 관절 외과, 15, 92-98, 1966) 에 의해 제작할 수 있다.
래트 모노요드아세트산 유발 변형성 관절증 모델은 Guingamp 등의 방법 (Guingamp C. et al., Arthritis Rheum., 40, 1670-1679, 1997) 에 기초하여 래트의 무릎 관절 내에 모노요오드아세트산을 주입하여 제작할 수 있다.
이들 변형성 관절증 모델 동물은 일정 기간 후에 무릎 관절 슬개골을 적출하고, 파파인 처리하고, 글리코사미노글리칸의 양을 디메틸메틸렌 블루법 (Chandrasekhar S. et al., Anal. Biochem. 161, 103-108, 1987) 에 의해 측정함으로써 관절 파괴 (세포외 매트릭스의 분해) 를 평가한다. 또한, 무릎 관절의 병리 조직학적 검토를 행한다.
항 FGF-8 중화 항체를 모델 동물에게 투여할 때의 제형 및 투여 경로로는 대상이 되는 모델 동물의 성질이나 중독도에 따라 적절히 선택할 수 있다. 예컨대 이들을 그대로 또는 다른 약리학적으로 허용될 수 있는 담체, 부형제, 희석제 등과 함께 모델 동물에 대해 경구적 또는 비경구적 (복강내, 정맥내, 관절내, 근육내, 피하 투여 등) 에 투여할 수 있다.
항 FGF-8 중화 항체의 배합량 및 투여량은 그 제제의 투여 방법, 투여 형태, 사용 목적, 모델 동물의 구체적 증상, 모델 동물의 체중 등에 따라 개별적으로 결정되고, 특별히 한정되지 않지만, 투여량으로서 1 일당 대략 1㎍/㎏ ∼ 100㎎/㎏ 정도를, 투여 간격으로서 1 일 1 회 정도라도 가능하고, 1 일 2 ∼ 4 회, 또는 그 이상의 회수로 나누어 투여할 수도 있다. 또한, 예컨대 점적 등에 의해 연속적으로 투여할 수도 있다. 관절 등의 국소에 투여하는 경우에는 1 개소에 대략 1pg ∼ 100㎎ 투여한다.
5. 본 발명의 진단약
FGF-8 은 관절에서의 활막 세포의 증식, 연골의 세포외 매트릭스의 파괴를 유도한다. 상기 기술한 항 FGF-8 항체는 FGF-8 과 특이적으로 결합하고, FGF-8 을 검출 및 정량할 수 있으므로, 관절염의 진단약으로서 사용할 수 있다. 진단할 수 있는 관절염으로서는 상기 4. 에 기재된 질환을 들 수 있다. FGF-8 의 검출 및 정량은 하기 6. 에 나타내는 방법으로 수행할 수 있다.
본 발명의 진단약에 사용되는 항 FGF-8 항체로는 FGF-8 에 특이적으로 결합하는 항체이면 어느 것이나 사용할 수 있고, 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체 중 어느 것이나 사용할 수 있지만, 모노클로날 항체가 바람직하게 사용된다.
모노클로날 항체로는 하이브리도마에 의해 생산되는 항체, 인간화 항체 및 이들 항체의 항체 단편을 들 수 있다.
본 발명의 진단약에서 사용되는 항 FGF-8 항체는 상기 항 FGF-8 중화 항체의 제조법과 동일하게 하여 제조할 수 있지만, FGF-8 활성을 저해하지 않는다. 항 FGF-8 중화 항체를 본 발명의 진단약으로서 사용되는 항 FGF-8 항체로서 사용할 수도 있다. 본 발명의 진단약에 사용되는 항 FGF-8 항체의 구체예로는 하이브리도마 KM1334 (FERM BP-5451) 가 생산하는 모노클로날 항체 KM1334, 형질 전환체 KM3034 (FERM BP-7836) 가 생산하는 인간형 키메라 항체 KM3023, 형질 전환체 KM3334 가 생산하는 인간형 키메라 항체 KM3334, 형질 전환체 KM8037 (FERM BP-8084) 이 생산하는 인간형 CDR 이식 항체 HV0LV6, 형질 전환체 KM8034 가 생산하는 인간형 CDR 이식 항체 HV0LV6/CHO, 형질 전환체 KM8036 (FERM BP-8083) 이 생산하는 인간형 CDR 이식 항체 HV0LV3-1/CHO 및 형질 전환체 KM8035 (FERM BP-8082) 가 생산하는 인간형 CDR 이식 항체 HV0LV4-3/CHO 를 들 수 있다.
항 FGF-8 항체를 함유하는 진단약은 하기 6. 에 나타내는 바와 같은 판정 방법에 따라 항원 항체 반응을 수행하기 위한 시약, 이 반응의 검출용 시약을 함유해도 된다. 항원 항체 반응을 수행하기 위한 시약으로는 완충제, 염 등을 들 수 있다. 검출용 시약으로는 항 FGF-8 항체를 인식하는 표지된 2 차 항체, 표지에대응한 기질 등의 통상의 면역학적 검출법에 사용되는 시약을 들 수 있다.
6. 본 발명의 관절염의 판정 방법
본 발명의 판정 방법으로 판정되는 관절염으로는 상기 4. 에 기재된 질환을 들 수 있다. 이들 질환의 환자의 관절에서는 정상인과 비교하여 활막 세포의 증식, 연골의 세포외 매트릭스의 파괴를 유도하는 활성을 갖는 FGF-8 의 양이 증가한 것으로 생각된다.
본 발명의 관절염의 판정 방법으로서는 예컨대 바이오프시 등에 의해 피험자로부터 채취한 관절의 활막이나 연골의 세포 또는 조직 절편, 및 이 세포 또는 조직으로부터 조제한 세포 추출액, 활액 등을 사용하여 세포 또는 조직에 존재하는 FGF-8 을 하기에 기술하는 바와 같이 면역학적으로 검출 및/또는 정량하는 방법을 들 수 있다.
FGF-8 에 대한 항체를 사용하여 관절에 발현된 FGF-8 을 면역학적으로 검출 및/또는 정량하는 방법으로는 형광 항체법, 효소 면역 측정법 (ELISA), 방사성 물질 표지 면역 항체법 (RIA), 면역 조직 염색법, 면역 세포 염색법, 웨스턴 블롯팅법, 면역 침강법, 샌드위치 ELISA 법 (토야마 사쿠지 및 안도 타미에, 단일 클론 항체 실험 매뉴얼, 코단사 사이언티픽, 1987 년, 일본 생화학회, 속 생화학 실험 강좌 5, 면역 생화학 연구법, 토쿄 화학 동인, 1986 년) 등을 이용할 수 있다.
형광 항체법은 문헌 (모노클로날 안티보디즈, 토야마 사쿠지 및 안도 타미에, 단일 클론 항체 실험 매뉴얼, 코단사 사이언티픽, 1987 년) 등에 기재된 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로는 분리된 관절의 세포 또는 조직 등에, 항 FGF-8 항체를 반응시키고, 또한 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC) 또는 피코에리스린 등의 형광 물질로 라벨한 항 이뮤노 글로불린 항체를 반응시킨 후, 형광 색소를 플로 사이토미터로 측정하는 방법이다.
효소 면역 측정법 (ELISA) 은 분리된 관절의 세포 또는 조직, 활액 등에, 항 FGF-8 항체를 반응시키고, 또한 퍼옥시다제, 알칼리포스파타제 등의 효소 표지를 실시한 항 이뮤노 글로불린 항체를 반응시킨 후, 효소 반응에 의해 발색하는 기질을 첨가하여 반응시키고, 발색 색소를 흡광 광도계로 측정하는 방법이다.
방사성 물질 표지 면역 항체법 (RIA) 은 분리된 관절의 세포 또는 조직, 활액 등에 항 FGF-8 항체를 반응시키고, 또한 방사성 동위체 표지를 실시한 항 이뮤노 글로불린 항체를 반응시킨 후, 신틸레이션 카운터 등으로 방사능을 측정하는 방법이다.
면역 세포 염색법, 면역 조직 염색법은 분리된 관절의 세포 또는 조직 등에 항 FGF-8 항체를 반응시키고, 또한 FITC 등의 형광 물질, 퍼옥시다제, 알칼리포스파타제 등의 효소계로 표지를 실시한 항 이뮤노 글로불린 항체를 반응시키고, 효소 표지의 경우에는 효소 반응에 의해 발색하는 기질을 가하여 반응시킨 후, 현미경을 사용하여 관찰하는 방법으로, 문헌 (모노클로날 안티보디즈, 토야마 사쿠지 및 안도 타미에, 단일 클론 항체 실험 매뉴얼, 코단사 사이언티픽, 1987 년) 등에 기재된 방법을 이용하여 수행할 수 있다.
웨스턴 블롯팅은 분리된 관절의 세포 또는 조직, 이들의 파쇄액, 활액 등을 SDS 를 함유하는 샘플용 완충액에 용해시켜 SDS-PAGE 를 수행한 후, 폴리불화비닐리덴 (PVDF) 막에 전사하고, 항 FGF-8 항체를 반응시키고, 퍼옥시다제, 알칼리포스파타제 등의 효소 표지를 실시한 항 이뮤노 글로불린 항체를 반응시킨 후, 효소 반응에 의해 발색 또는 화학 발광하는 기질을 가하여 반응시키고, 밴드로서 검출하는 방법이다.
면역 침강법은 분리된 관절의 세포 또는 조직의 파쇄액, 활액과 비드 등에 고정화한 항 FGF-8 항체를 반응시키고, 원심 등에 의해 비드를 단리한 후, 비드를 SDS 를 포함하는 샘플용 완충액으로 처리하여, 용해시킨 FGF-8 을 웨스턴 블롯팅 등에 의해 검출하는 방법이다.
샌드위치 ELISA 는 에피토프가 각각 다른 2 종류의 항 FGF-8 항체를 사용한 효소 면역 측정법의 일종이다. 한쪽의 항 FGF-8 항체를 플레이트 위에 고정하고, 분리된 관절의 세포 또는 조직, 이들의 파쇄액, 활액을 반응시킨 후, 플레이트 위의 항 FGF-8 항체에 결합한 FGF-8 에 추가로 다른 한쪽의 항 FGF-8 항체를 반응시킨다. 퍼옥시다제, 알칼리포스파타제 등의 효소 표지를 실시한 항 이뮤노 글로불린 항체를 반응시킨 후, 효소 반응에 의해 발색하는 기질을 가하여 반응시키고, 발색 색소를 흡광 광도계로 측정하는 방법이다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
이하에 본 발명의 실시예 및 참고예를 나타낸다.
실시예 1
토끼 연골 세포의 FGF-8 에 의한 세포외 매트릭스의 분해와 항체에 의한 저해
토기 관절 연골 세포는 3 주령의 암컷 뉴질랜드 화이트종 토끼의 양 무릎 및 어깨로부터 타무라 등의 방법 (Tamura T. et al., Eur. J. Pharmacol., 419, 269-274, 2001) 에 따라 분리 배양하였다. 즉 양 무릎 관절 및 양 어깨 관절을 적출하여 골단 연골을 채취하였다. 인산 완충액 생리 식염수로 세정 후, 연골을 가늘게 자르고, 0.4w/v% 액티나제 E 를 함유하는 10vol% FBS 첨가 DMEM (이하, FBS 를 함유하는 DMEM 을 FBS/DMEM 이라고 함) 중에서 37℃ 에서 1 시간, 추가로 0.025w/v% 의 콜라게나제 P 를 함유하는 10vol% FBS/DMEM 중에서 37℃, 5 ∼ 6 시간 처리함으로써 연골 세포를 연골 조직으로부터 분리하여 채취하였다. 채취한 연골 세포를 10vol% FBS/DMEM 에 현탁하고, 100,000 개/mL 이 되도록 조제하였다. 이 연골 세포를 함유하는 배양액을 24 웰 플레이트의 각 웰에 1mL 씩 파종하여 5% CO2-95% air 기상 하, 37℃ 에서 배양하였다. 연골 세포가 컨플루언트에 도달한후, 배양액을 0.5vol% FBS/DMEM 로 치환하여 24 시간 배양하였다. 배양액을 제거하고, 0.5vol% FBS/DMEM (무자극군), 또는 FGF-8 [1, 10 또는 100ng/mL; 페프로테크 (Peprotech) 사 제조] 을 함유하는 0.5vol% FBS/DMEM 을 1mL 첨가하여 48 시간 배양하였다. 항 FGF-8 중화 항체의 작용을 검토할 때에는 FGF-8 (100ng/mL) 을 함유하는 0.5vol% FBS/DMEM (0 군), 또는 FGF-8 (100ng/mL) 과 항 FGF-8 중화 항체 KM1334 (1, 3 또는 10㎍/mL) 을 함유하는 0.5vol% FBS/DMEM 을 1mL 첨가하여 48 시간 배양하였다. 배양액을 제거하고, 플레이트에 남은 세포외 매트릭스 중의 글리코사미노글리칸의 양을 디메틸메틸렌 블루 (DMMB) 법 (Chandrasekhar W. et al., Anal. Biochem. 161, 103-108, 1987) 으로 측정하였다. 즉, 5m㏖/L L-시스테인염산염 일수화물을 첨가하여 활성화한 보존용 파파인 완충액 (0.1㏖/L 아세트산나트륨, 50m㏖/L EDTA, pH5.8) 에 최종 농도가 20㎍/mL 가 되도록 파파인 (시그마 알드리치사 제조) 을 첨가하여 이 액을 상기 연골 세포를 배양한 플레이트의 각 웰에 1mL 씩 첨가하고, 60℃ 에서 하룻밤 소화시켰다. 이 소화액 75μL 에 염산디구아니딘 완충액 (2.88㏖/L 염산구아니딘, 50m㏖/L 아세트산나트륨, pH6.8) 25μL 와 DMMB 용액 200μL 를 첨가하고, 530/590㎚ 의 흡광도를 측정하였다. 스탠더드로서 사용한 콘드로이틴 황산 (고래 연골 유래, 생화학 공업사 제조) 의 흡광도로부터 각 샘플의 글리코사미노글리칸의 농도를 산출하였다. 실험은 각 조건 모두 3 예씩 수행하여 평균값과 표준 오차를 구하였다.
그 결과를 도 1 및 도 2 에 나타낸다. FGF-8 은 100ng/mL 의 농도로 세포외 매트릭스 중의 글리코사미노글리칸 잔존량을 유의하게 저하시켰다 (도 1).
이는 FGF-8 이 연골의 세포외 매트릭스의 분해를 촉진하는 작용을 가짐을 나타낸다. 또한 항 FGF-8 중화 항체 KM1334 는 FGF-8 에 의한 연골의 세포외 매트릭스의 분해 촉진을 3㎍/mL 이상의 항체 농도로 유의하게 억제하였다 (도 2). 따라서, 항 FGF-8 중화 항체의 투여에 의해 관절염에서의 세포외 매트릭스의 분해를 억제할 수 있다.
실시예 2
FGF-8 에 의한 토끼 연골 세포로부터의 매트릭스 메탈로프로티나제-3 의 산생의 촉진과 항체에 의한 저해
토끼 관절 연골 세포는 실시예 1 에 기재된 방법에 따라 분리 배양하였다. 연골 세포가 컨플루언트에 도달한 후, 배양액을 0.5vol% FBS/DMEM 으로 치환하여 24 시간 배양하였다. 배양액을 제거하고, 0.5vol% FBS/DMEM (무자극군), FGF-8 (100ng/mL) 을 함유하는 0.5vol% FBS/DMEM (0 군) 또는 FGF-8 (100ng/mL) 과 항 FGF-8 중화 항체 KM1334 (1, 3 또는 10㎍/mL) 을 함유하는 0.5vol% FBS/DMEM 을 1mL 첨가하여 48 시간 배양하였다. 48 시간 후, 배양액을 회수하고, 배양액 중의 매트릭스 메탈로프로티나제-3 농도를 토끼 매트릭스 메탈로프로티나제-3 ELISA 시스템 (아마샴 바이오사이언시즈사 제조) 을 사용하여 측정하였다. 실험은 각 조건 모두 3 예씩 수행하여 평균값과 표준 오차를 구하였다.
그 결과를 도 3 에 나타낸다. FGF-8 은 100ng/mL 의 농도로 연골 세포로부터의 매트릭스 메탈로프로티나제-3 의 산생을 유의하게 증가시켰다 (무자극군 대 0 군, P ＝ 0.0079). 이는 FGF-8 이 연골 세포로부터의 매트릭스 메탈로프로티나제-3 의 산생 유도를 통해 세포외 매트릭스의 분해를 촉진하는 작용을 가짐을 나타낸다. 또한 항 FGF-8 중화 항체 KM1334 는 FGF-8 에 의한 연골의 세포로부터의 매트릭스 메탈로프로티나제-3 의 산생을 1㎍/mL 이상의 항체 농도로부터 유의하게 억제하였다. 항 FGF-8 중화 항체 KM1334 의 1, 3 또는 10㎍/mL 에서의 억제율은 각각 72, 74, 100% 였다. 따라서, 항 FGF-8 중화 항체의 투여에 의해 연골 세포로부터의 매트릭스 메탈로 프로티나제-3 의 산생이 억제되고, 관절염에서의 세포외 매트릭스의 분해를 억제할 수 있다.
실시예 3
토끼 활막 세포의 FGF-8 에 의한 증식 촉진과 항체에 의한 저해
토끼 활막 세포는 Hamilton 등의 방법 (Hamilton J. A. and Slywka J., J. Immunol. 126, 851-855, 1981) 에 준거하여 채취하였다. 분리한 활막 세포를 10vol% FBS 를 함유하는 RPMI 1640 배지 (이하, FBS 를 함유하는 RPMI 1640 배지를 FBS/RPMI 1640 이라 함) 중에 현탁하고, 10,000 개씩 96 웰의 배양 플레이트에 파종하였다. 24 시간 배양 후, 각 웰의 배양액을 제거하고, 0.2vol% FBS/RPMI 1640 (무자극군), 또는 FGF-8 (1, 10 또는 100ng/mL) 을 함유하는 0.2vol% FBS/RPMI 1640 을 220μL 첨가하였다. 항 FGF-8 중화 항체의 작용을 검토할 때에는 FGF-8 (100ng/mL) 을 함유하는 0.2vol% FBS/RPMI 1640 (0 군), 또는 FGF-8 (100ng/mL) 과 항 FGF-8 중화 항체 KM1334 (0.1, 0.3, 1, 3 또는 10㎍/mL) 을 함유하는 0.2vol% FBS/RPMI 1640 을 각 웰에 200μL 첨가하였다. 48 시간 배양 후,1 웰당 9.25kBq 의 [3H] 티미틴을 첨가하였다. 또한 24 시간 배양하고, 세포 내에 도입된 [3H] 티미틴의 방사 활성을 액체 신틸레이션 카운터 (1205 베타 플레이트, 퍼킨엘마 라이프 사이언스 저팬사 제조) 를 사용하여 측정하였다. 실험은 각 조건 모두 6 예씩 수행하여 평균값과 표준 오차를 구하였다.
그 결과를 도 4 및 도 5 에 나타낸다. FGF-8 은 100ng/mL 의 농도로 토끼 활막 세포로의 [3H] 티미딘의 수용을 유의하게 촉진시켰다 (도 4). 이는 FGF-8 이 토끼 활막 세포의 증식을 촉진하는 작용을 가짐을 나타낸다. 또한 항 FGF-8 중화 항체 KM1334 는 이 FGF-8 의존성의 [3H] 티미딘의 수용의 촉진을 0.3㎍/mL 의 항체 농도로부터 유의하게 억제하였다 (도 5). 따라서, 항 FGF-8 중화 항체의 투여에 의해 관절염에서의 활막의 증식을 억제할 수 있다.
실시예 4
인간 활막 세포의 FGF-8 에 의한 증식의 촉진과 항체에 의한 저해
관절 류머티즘 환자 유래의 인간 활막 세포 (토요보에서 구입) 를 사용하여 실시예 3 과 동일한 실험을 하였다. FGF-8 의 농도는 10, 100 또는 500ng/mL 로 수행하고, 항 FGF-8 중화 항체 KM1334 와 공존시키는 FGF-8 의 농도는 500ng/mL 로 하였다. 실험은 각 조건 모두 6 예씩 수행하여 평균값과 표준 오차를 구하였다.
그 결과를 도 6 및 도 7 에 나타낸다. FGF-8 은 500ng/mL 의 농도로 인간 활막 세포로의 [3H] 티미딘의 수용을 유의하게 촉진시켰다 (도 6). 이는 FGF-8 이 인간 활막 세포의 증식을 촉진하는 작용을 가짐을 나타낸다. 또한, 항 FGF-8 중화 항체 KM1334 는 이 FGF-8 의존성의 [3H] 티미딘의 수용의 촉진을 1㎍/mL 의 항체 농도로부터 유의하게 억제하였다 (도 7). 따라서, 항 FGF-8 중화 항체의 투여에 의해 관절염에서의 활막의 증식을 억제할 수 있다.
실시예 5
항 FGF-8 항체를 사용한 활막의 염색
인간 관절 류머티즘 환자에게서 적출한 활막으로부터, 문헌에 기재된 방법 (Tanaka A. et al., Cancer Res. 58, 2053-2056, 1998) 에 따라 파라핀 절편을 제작하고, 항 FGF-8 항체 KM1334 를 사용하여 조직 면역 염색을 수행하였다. 그 결과, 인간 관절 류머티즘 활막 4 예 중 3 예의 활막 세포에서 FGF-8 이 양성이었다. 따라서, FGF-8 은 인간 활막에 존재하는 것이 확인되었다. 또한, 항 FGF-8 항체를 사용하여 인간 관절 류머티즘의 활막 세포를 검출함으로써, 인간 관절 류머티즘의 판정이 가능함을 알 수 있었다.
실시예 6
FGF-8 의 관절내 주입에 의한 관절염의 유도
FGF-8 을 사용하여 Sprague-Dawley 계 래트 (수컷, 7 주령, 닛폰 찰스 리버사) 에, 다음과 같이 하여 관절염 같은 증상을 유발시켰다. 최종 농도가 1㎎/mL 가 되도록 생리 식염액 (오오츠카 제약 공장사 제조) 을 사용하여 조제한FGF-8 을 래트 무릎 관절 내에 50μL 주입하였다. 또한 생리 식염액을 슬관절 내에 50μL 주입한 군을 마련하였다. 1 군은 3 마리로 하였다. FGF-8 또는 생리 식염액 주입 3 일 후에, Yamada 등의 방법 (Yamada A. et al., Inflamm. Res., 49, 144-146, 2000) 에 따라 무릎 관절포 내를 0.38w/v% 시트르산나트륨 함유의 생리 식염액 30μL 로 세정하고, 세정액을 회수하였다. 이 조작을 10 회 반복하고, 300μL 의 관절 세정액을 회수하였다. 관절 세정액 중의 글리코사미노글리칸량을 실시예 1 에 기재된 DMMB 법으로 측정하였다. 또한, 무릎 관절의 슬개골을 추출하여 실시예 1 에 기재된 방법으로 연골 부분을 파파인으로 소화시키고 경골의 중량을 측정하였다.
그 결과를 도 8 및 도 9 에 나타낸다. 도 8 은 관절 세정액 중의 글리코사미노글리칸의 농도를 나타낸다. FGF-8 의 주입에 의해 관절 세정액 중의 글리코사미노글리칸 농도는 생리 식염액 주입군의 1.9 배로 상승하였다 (P ＝ 0.0034). 이는 FGF-8 의 주입에 의해 관절 연골의 세포외 매트릭스 분해가 항진된 것을 나타낸다. 도 9 는 파파인 소화 후의 슬개골 중량을 나타낸다. FGF-8 의 주입에 의해 슬개골의 중량은 생리 식염액 주입군의 40% 로 저하되었다 (P ＝ 0.0454). 이는 FGF-8 의 주입에 의해 슬개골의 파괴가 항진된 것을 나타낸다. 따라서, FGF-8 은 생체에서 관절 파괴를 유도하여 관절염 같은 증상을 유발시킴을 알 수 있었다.
실시예 7
마우스 콜라겐 관절염 모델에서의 평가
마우스 콜라겐 관절염 모델은 DBA/1J 계 마우스 (수컷, 7 주령, 닛폰 찰스 리버사) 를 사용하여 카마다 등의 방법 (Kamada H. et al., Jpn. J. Pharmacol., 70, 169-175, 1996) 에 준거하여 이하와 같이 하여 제작하였다.
소 연골 유래 II 형 콜라겐 용액 (콜라겐 기술 연수회사 제조) 을 프로인트 완전 면역 보강제 (야트론산 제조) 와 빙랭 하에서 혼화하여 에멀젼을 형성시키고, II 형 콜라겐의 최종 농도가 1.5㎎/mL 가 되도록 조제한 것을 마우스의 꼬리 뿌리 부분 피내에 100μL 주사하여 감작하고, 다시 21 일 후에 동일한 조작으로 추가 면역하였다. 1 군은 10 마리로 하였다. KM1334 투여군에는 항 FGF-8 중화 항체 KM1334 를 생리 식염액 (오오츠카 제약 공장사 제조) 으로 최종 농도 2㎎/mL 가 되도록 용해하고, 상기 마우스 콜라겐 관절염 모델의 초회 감작으로부터 21, 25, 28, 32, 35 및 39 일째에 1 일 1 회 각 개체에 200μL 복강내 투여하였다. 또한 생리 식염액 투여군에는 항 FGF-8 중화 항체 KM1334 용액 대신에 생리 식염액만을 복강내 투여하였다. 또한 양성 대조로서 디클로페낙 투여군에는 비스테로이드성 항염증약인 디클로페낙나트륨 (시그마-알드리치사 제조) 을 0.5w/v% 메틸셀룰로스 용액에 최종 농도 0.3㎎/mL 가 되도록 용해하고, 상기 마우스 콜라겐 관절염 모델의 초회 감작 21 일째로부터 25 일째, 28 일째로부터 32 일째, 및 35 일째로부터 39 일째에 1 일 1 회 체중 100g 당 1mL 경구 투여하였다. 또한 용매 투여군으로서 0.5w/v% 메틸셀룰로스 용액만을 동일하게 경구 투여하였다. 또한 미처리군을 두고, 이것들에는 콜라겐 감작 및 약물 투여를 하지 않았다. 콜라겐 관절염에서의 전체 다리 부종의 경시 변화는 다리 하나에 0 ∼ 4 점, 전체 다리 합계최고 16 점의 스코어링에 의해 평가하였다. 스코어의 기준은 O: 정상, 1: 약한 홍반이 관찰됨, 2: 약한 종창과 홍반이 관찰됨, 3: 강한 종창과 홍반이 관찰됨, 만지면 따뜻한 느낌이 있음, 4: 발가락의 변형을 수반하는 아주 분명한 종창이 관찰됨, 으로 하였다.
그 결과를 도 10 에 나타낸다. 항 FGF-8 중화 항체 KM1334 투여군에서는 42 일째에서 34% (P ＝ 0.0204) 의 유의한 관절염 스코어의 억제가 관찰되고, 그 억제의 정도는 양성 대조의 디클로페낙 투여군과 동일한 정도였다 (도 10). 이는 항 FGF-8 중화 항체의 투여에 의해 관절염을 억제할 수 있음을 나타낸다.
실시예 8
래트 면역 보강제 관절염 모델에서의 평가
래트 면역 보강제 관절염 모델은 Lewis 계 래트 (암컷, 8 주령, 닛폰 찰스 리버사 제조) 를 사용하여 Pearson 등의 방법 (Pearson CM. et al., Arth. Rheum., 5, 654-658, 1962) 에 준거하여 이하와 같이 제작하였다.
Mycobacterium butyricum (디프코사 제조) 을 최종 농도가 6㎎/mL 가 되도록 유동 파라핀 (와코쥰야쿠 공업사 제조) 에 현탁하고, 고압 증기 멸균한 것을, 래트의 우측 족척부 피내에 100μL 주사하여 감작하였다. 1 군은 8 ∼ 10 마리로 하였다. KM1334 투여군에는 항 FGF-8 중화 항체 KM1334 를 생리 식염액으로 최종 농도 2㎎/mL 가 되도록 용해하고, 상기 래트 면역 보강제 관절염 모델의 감작일, 및 감작으로부터 3, 7, 10, 14 및 17 일째로부터 1 일 1 회 각 개체에 체중 100g 당 0.5mL 를 복강내 투여하였다. 또한 생리 식염액 투여군에는 항 FGF-8중화 항체 KM1334 용액 대신에 생리 식염액만을 복강내 투여하였다. 또한 양성 대조로서 디클로페낙 투여군에는 항염증약의 디클로페낙나트륨을 0.5w/v% 메틸셀룰로스 용액에 최종 농도 0.3㎎/mL 가 되도록 용해하고, 면역 보강제 감작일로부터 4 일째, 7 일째로부터 11 일째, 14 일째로부터 18 일째에, 1 일 1 회, 체중 100g 당 1 mL 경구 투여하였다. 메소트렉세이트 투여군에는 대사 길항약인 주사용 메소트렉세이트50㎎ (닛폰 와이스 레다리 주식회사 제조) 을 0.5w/v% 메틸셀룰로스 용액에 최종 농도 0.01㎎/mL 가 되도록 용해하고, 디클로페낙 투여군과 동일하게 투여하였다. 프레드니졸론 투여군에는 스테로이드약인 프레드니졸론 (시그마-알드리치사 제조) 을 0.5w/v% 메틸셀룰로스 용액에 최종 농도 0.3㎎/mL 가 되도록 현탁하고, 디클로페낙 투여군과 동일하게 투여하였다. 또한 용매 투여군으로서 0.5w/v% 메틸셀룰로스 용액만을 동일하게 경구 투여하였다. 또한 미처치군을 두고, 이것들에는 Mycobacterium butyricum 감작 및 약물 투여를 행하지 않았다. 면역 보강제 처치 발 및 비처치 발의 용적은 래트 뒷다리 발 부종 측정 장치 (TK-101, 유니콤사 제조) 를 사용하여 경시적으로 측정하였다.
감작일로부터 21 일째의 측정 결과를 도 11 및 도 12 에 나타낸다. 항 FGF-8 중화 항체 KM1334 투여군에서는 면역 보강제 비처치 발에 있어서, 69% (P ＝ 0.0010) 의 유의한 발 용적 증가의 억제가 관찰되었다 (도 11). 디클로페낙 투여군에서는 45% (P ＜ 0.0001), 메소트렉세이트 투여군에서는 90% (P ＜ 0.0001), 프레드니졸론 투여군에서는 51% (P ＝ 0.0029) 의 유의한 발 용적 증가의 억제가 관찰되었다 (도 12). 즉, 항 FGF-8 중화 항체 KM1334 는 디클로페낙나트륨이나프레드니졸론을 상회하는 부종 억제 작용을 나타내었다.
감작으로부터 20 일째부터 21 일째까지의 24 시간 축뇨를 사용하여 뇨 중의 글리코사미노글리칸, 데옥시피리디놀린, 히드록시프롤린, 및 크레아티닌량을 측정하였다. 뇨 중의 글리코사미노글리칸량은 실시예 1 에 기재된 DMMB 법에 의해 측정하였다. 뇨 중의 히드록시프롤린량은 이케다 등의 방법 (이케다 싱고 등, 토쿄 위연 연보. 36 277-282, 1985) 에 따라 각각 측정하였다. 즉, 뇨 0.8mL 에 아미노산 분석용 염산 (칸토 화학사 제조) 0.8mL 첨가하고, 110℃ 에서 15 시간 가수 분해하였다. 가수 분해한 시료 0.5mL 에 1.2㏖/L 의 수산화나트륨 용액을 2mL 첨가하여 중화시켰다. 중화 처리한 시료 0.5mL 에 이소프로판올을 1mL 첨가하고, Oxidant 용액을 1mL 첨가하여 잘 교반하고, 5 분간 실온에 정치하였다. Oxidant 용액은 아세트산나트륨3수화물 5.7g 시트르산3나트륨2수화물 3.75g, 시트르산1수화물0.602g 을 증류수 약 50mL 에 용해하고, 이소프로판올 38.5mL 첨가하고, 추가로 증류수를 첨가하여 100mL 로 한 아세트산시트르산 완충액과, 증류수를 사용하여 조제한 7w/v% 클로라민 T 용액 (p-톨루엔술폰클로로아미드나트륨3수화물, 와코쥰야쿠 공업사 제조) 을 사용시에 4 : 1 의 비율로 잘 혼화한 것이다. 그 후 Ehrlich 시약을 1mL 첨가하여 잘 교반하고, 항온기에서 60℃, 20 분간 가온하였다. Ehrlich 시약은 p-디메틸아미노벤즈알데히드 (와코쥰야쿠 공업사 제조) 17.6g 을 과염소산 (칸토 화학사 제조) 20.9mL 에 용해하고, 이소프로판올을 첨가하여 100mL 로 한 것이다. 가온 후, 흐르는 물로 냉각시키고, 562㎚ 의 흡광도를 측정하였다. L-히드록시프롤린 (와코쥰야쿠공업사 제조) 의 흡광도로부터작성한 검량선을 사용하여 각 샘플의 히드록시프롤린 농도를 산출하였다. 뇨 중의 데옥시피리디놀린량은 오스테오링크스「DPD」(스미토모 제약사 제조) 를 사용하여 측정하였다. 뇨 중 크레아티닌량은 크레아티닌-테스토 와코 (와코쥰야쿠공업사 제조) 를 사용하여 측정하였다. 개체 간의 뇨 농도의 차를 보정하기 위해, 각 개체 마다 글리코사미노글리칸 농도/크레아티닌 농도, 데옥시피리디놀린 농도/크레아티닌 농도, 또는 히드록시프롤린 농도/크레아티닌 농도의 비를 산출하고, 각각의 지표로 하였다.
그 결과를 도 13 내지 도 17 에 나타낸다. 뇨 중의 클리코사미노글리칸량은 생리식염액 투여군에 있어서, 미처치군의 2.2 배로 상승하였다 (P ＜ 0.0001) (도 13). 이는 관절염의 진전에 수반하여 연골 파괴가 항진되는 것을 나타낸다. 항 FGF-8 중화 항체 KM1334 투여군에서는 뇨 중 클리코사미노글리칸량의 상승에 대해 73% (P ＝ 0.0064) 의 유의한 억제가 관찰되었다 (도 13). 메소트렉세이트 투여군에서는 79% (P ＝ 0.0465) 의 유의한 뇨 중 글리코사미노글리칸량 상승의 억제가 관찰되었다. 유의하지는 않지만, 디클로페낙 투여군에서는 40%, 프레드니졸론 투여군에서는 18% 의 뇨 중 글리코사미노글리칸량의 저하가 관찰되었다 (도 14). 즉, 항 FGF-8 중화 항체 KM1334 는 메소트렉세이트와 동일한 정도의 연골 파괴 억제 작용을 나타냈다.
뇨 중의 데옥시피리디놀린량은 생리 식염액 투여군에 있어서, 미처치군의 1.8 배로 상승하였다 (P ＜ 0.0001) (도 15). 이는 관절염의 진전에 수반하여 골 파괴가 항진되는 것을 나타낸다. 항 FGF-8 중화 항체 KM1334 투여군에서는뇨 중 데옥시피리디놀린량의 상승에 대해, 41% (P ＝ 0.0185) 의 유의한 억제가 관찰되었다. 디클로페낙 투여군에서는 88% (P ＝ 0.0016) 의 유의한 뇨 중 데옥시피리디놀린량 상승의 억제가 관찰되었다. 유의하지는 않지만, 메소트렉세이트 투여군에서는 34%, 프레드니졸론 투여군에서는 38% 의 뇨중 데옥시피리디놀린량의 저하가 관찰되었다 (도 16). 즉, 항 FGF-8 중화 항체 KM1334 는 메소트렉세이트나 프레드니졸론을 상회하는 골 파괴 억제 작용을 나타냈다.
뇨 중의 히드록시프롤린량은 생리 식염액 투여군에 있어서, 미처치군의 1.8 배로 상승하였다 (P ＝ 0.0002) (도 17). 이는 관절염의 진전에 수반하여 골 파괴가 항진되는 것을 나타낸다. 항 FGF-8 중화 항체 KM1334 투여군에서는 뇨 중 히드록시프롤린량의 상승에 대해, 유의하지는 않지만, 48% 의 저하가 관찰되었다.
감작으로부터 21 일째에 면역 보강제 비처처족을 경골 골간부에서 절단하여 채취하고, 10vol% 인산 완충 포르말린 용액으로 고정하였다. 그 후, 연 X 선 발생 장치 SOFRONSRO-M50 (소프론사 제조) 을 사용하여 29kV, 4mA, 2 분간의 조건 하에서 연 X 선 사진을 촬영하였다. 실체 현미경을 사용하여 사진을 관찰하고, 골 파괴를 스코어링하였다. 스코어링은 발뒤꿈치뼈 (1 변을 1 부위로 하고, 합계 5 부위) 의 골 미란의 유무를 관찰하고, 미란 있음 1 점, 없음 0 점으로 하여 다리 하나에 최고 5 점으로 하였다.
그 결과를 표 1 및 표 2 에 나타낸다. 값은 평균값 ±표준 오차를 의미하고, * 는 P ＜ 0.05, ** 는 P ＜ 0.01, *** 는 P ＜ 0.001 (용매 투여군 대비,Wilcoxon 순화합 검정) 을 나타낸다.
투여군 골 파괴 스코어 (억제율)
미처치생리 식염액KM1334 0.0 ±0.04.4 ±0.33.2 ±0.5 --27%
투여군 골 파괴 스코어 (억제율)
미처치용매디클로페낙메소트렉세이트프레드니졸론 0.0 ±0.04.6 ±0.33.1 ±0.6*0.9 ±0.4***1.8 ±0.7** --33%80%61%
항 FGF-8 중화 항체 KM1334 투여군에서는 유의하지는 않지만, 골 파괴 스코어의 27% 저하가 관찰되었으나 (표 1), 디클로페낙 투여군에서는 33% (P ＝ 0.0362), 메소트렉세이트 투여군에서는 80% (P ＝ 0.0006), 프레드니졸론 투여군에서는 61% (P ＝ 0.0032) 골 파괴 스코어의 저하가 관찰되었다 (표 2). 즉, 항 FGF-8 중화 항체 KM1334 는 디클로페낙나트륨과 동일한 정도의 골 파괴 스코어의 저하를 나타냈다.
포르말린 고정한 면역 보강제 비처치 발의 파라핀 절편을 제작하였다. 헤마톡실린/에오신 염색하고, 경골에서 중족골에 걸친 뼈, 관절 및 관절 주위 영역을 조직 병리학적으로 평가하였다. 관절 주위 조직 또는 관절강으로의 혈장 누출을, 다리 하나에 0 ∼ 4 점의 스코어링에 의해 평가하였다. 스코어의 기준은 0: 변화없음, 1: 극히 경도의 변화가 관찰됨, 2: 경도의 변화가 관찰됨, 3: 중등도의 변화가 관찰됨, 4: 중도의 변화가 인정됨, 으로 하였다.
그 결과를 표 3 에 나타낸다. 값은 평균값 ±표준 오차를 의미하고, * 는 P ＜ 0.05, ** 는 P ＜ 0.01 (생리 식염액 투여군 대비, Wilcoxon 순위합 검정) 을 나타낸다.
투여군 병리 스코어
관절 주위로의 혈액 누출 (억제율) 관절강으로의 혈구ㆍ혈장 누출 (억제율)
미처치생리 식염액KM1334 0.0 ±0.03.4 ±0.22.0 ±0.4** --41% 0.0 ±0.02.7 ±0.21.6 ±0.3* 41%
항 FGF-8 중화 항체 KM1334 투여군에서는 관절 주위 조직으로의 혈장 누출의 41% 저하 (P ＝ 0.0022), 및 관절강으로의 혈구 및 혈장 누출의 41% 저하 (P ＝ 0.0156) 가 관찰되었다 (표 3). 따라서, 항 FGF-8 중화 항체의 투여에 의해, 관절염에서의 부종 형성과, 연골 및 골 파괴를 억제할 수 있다.
실시예 9
래트ㆍ모노요오드아세트산 유발 변형성 관절증 모델에서의 평가
래트ㆍ모노요오드아세트산 유발 변형성 관절증 모델은 Spraque-Dawley 계 래트 (수컷, 7 주령, 닛폰 찰스 리버사) 를 사용하여 Guingamp 등의 방법 (Guingamp C, et al., Arthritis Rheum., 40, 1670-1679, 1997) 에 준거하여 이하와 같이 하여 제작하였다.
최종 농도가 10㎎/mL 이 되도록 생리 식염액을 사용하여 조제한 모노요오드아세트산 (시그마-알드리치사 제조) 을 래트의 우측 무릎 관절내에 25μL 주입하였다. 1 군은 10 마리로 하였다. KM1334 투여군에는 항 FGF-8 중화 항체KM1334 를 생리 식염액 (오오츠카 제약 공장사 제조) 으로 최종 농도 4㎎/mL 이 되도록 용해하고, 모노요오드아세트산 주입시에 1 회, 체중 100g 당 0.5mL 을 복강내 투여하였다. 또한 생리 식염액군에는 항체 용액 대신에 생리 식염액만을 복강내 투여하였다. 또한 위(僞)수술군을 두고, 이것들에는 생리 식염액을 무릎 관절내에 주입하고, 약물을 투여하지 않았다. 모노요오드아세트산 주입 3 일 후에, 실시예 6 에 기재된 방법에 따라 관절 세정액을 회수하였다. 관절 세정액 중의 글리코사미노글리칸량을 실시예 1 에 기재된 DMMB 법으로 측정하였다.
그 결과를 도 17 에 나타낸다. 모노요오드아세트산의 주입에 의해 관절 세정액 중의 글리코사미노글리칸 농도는 위수술군의 1.6 배로 상승하였다 (P ＝ 0.0014). 이는 모노요오드아세트산 주입에 의해 관절 연골의 세포외 매트릭스 분해가 항진되는 것을 나타낸다. 이 모노요오드아세트산 주입에 의한 관절 세정액 중의 글리코사미노글리칸 농도의 상승에 대해 항 FGF-8 중화 항체 KM1334 투여군에서는 42% (P ＝ 0.0188) 의 유의한 억제가 관찰되었다. 따라서, 항 FGF-8 중화 항체의 투여에 의해 관절염에서의 관절 연골의 파괴를 억제할 수 있다.
참고예 1
항 FGF-8 중화 키메라 항체의 생산
1. 마우스의 항 FGF-8 중화 항체의 V 영역을 코드하는 cDNA 의 단리와 해석
(1) 마우스의 항 FGF-8 중화 항체 생산 하이브리도마 세포로부터의 mRNA 의 조제
마우스의 항 FGF-8 중화 항체를 생산하는 하이브리도마 KM1334 (FERM BP-5451, 일본 공개 특허 공보 평9-271391) 의 1 ×107세포로부터, mRNA 의 조제 키트인 패스트트랙 mRNA 단리 키트 (인비트로젠사 제조) 를 사용하여 첨부된 사용 설명서에 따라 mRNA 를 약 8㎍ 조제하였다.
(2) 항 FGF-8 중화 마우스 항체의 H 쇄 및 L 쇄 cDNA 라이브러리의 제작
상기 (1) 에서 취득한 KM1334 의 mRNA 의 5㎍ 로부터, 타임세이버 cDNA 합성 키트 (아마샴 바이오사이언시즈사 제조) 를 사용하여 첨부된 사용 설명서에 따라 양단에 EcoRI-NotI 어댑터를 갖는 cDNA 를 합성하였다. 계속하여, λZAPII 클로닝 키트 (스트라타진사 제조) 를 사용하여 cDNA 라이브러리를 제작하였다. 먼저, cDNA 전체량을 20μL 의 멸균수에 용해 후, 아가로스겔 전기 영동에 의해 분획하고, IgG 클래스의 항체의 H 쇄에 대응하는 약 1.5kb 의 cDNA 단편과 κ클래스의 L 쇄에 대응하는 약 1.0kb 의 cDNA 단편을 각각 약 0.1㎍ 회수하였다. 다음으로, 각각의 약 1.5kb 의 cDNA 단편 0.1㎍ 및 약 1.0kb 의 cDNA 단편 0.1㎍ 과, 제한 효소 EcoRI 로 소화 후, 송아지 소장 유래 알칼리포스파타제로 말단을 탈인산화한 λZAPII 벡터 1㎍ 을 첨부된 사용 설명서에 따라 연결하였다.
연결 후의 각각의 반응액 중 4 ㎕ 을 Gigapack II Packaging Extracts Gold (스트라타진사 제조) 를 사용하여 첨부된 사용 설명서에 따라 λ퍼지에 패키징하고, 적당량을 대장균주 XL1-Blue (스트라타진사 제조) 에 감염시켜 KM1334 의 H 쇄 cDNA 라이브러리 및 L 쇄 cDNA 라이브러리로서 각각 약 8.1 ×104개와 5.5 ×104개의 퍼지 클론을 취득하였다. 이어서 각각의 퍼지를 상법 (몰레큘러 클로닝제 3 판) 에 따라 나일론 멤브레인 상에 고정하였다.
(3) 항 FGF-8 중화 마우스 항체의 H 쇄 및 L 쇄의 cDNA 의 클로닝
상기 (2) 에서 제작한 KM1334 의 H 쇄 cDNA 라이브러리 및 L 쇄 cDNA 라이브러리의 나일론 멤브레인을 ECL 직접 핵산 표지 검출 시스템 (ECL Direct Nucleic Acid Labelling and Detection Systems, 아마샴 바이오사이언시즈사 제조) 을 사용하여 첨부된 사용 설명서에 따라 마우스 항체의 C 영역의 cDNA [H 쇄는 마우스 Cγ1 cDNA 를 함유하는 DNA 단편 (French D. L. et al., J. Immunol., 146, 2010-2016, 1991), L 쇄는 마우스 CκcDNA 를 함유하는 DNA 단편 (Hieter P. A. et al., Cell, 22, 197-207, 1980) 을 프로브로 하여 검출하고, 프로브에 강하게 결합된 퍼지 클론을 H 쇄, L 쇄 각 10 클론 취득하였다. 이어서, λZAPII 클로닝 키트 (스트라타진사 제조) 의 사용 설명서에 따라 인 비보 엑시전 (in vivo excision) 에 의해 각 퍼지 클론을 프라스미드로 변환하였다. 이렇게 하여 얻어진 각 플라스미드에 포함되는 cDNA 의 염기 서열을 빅 다이 터미네이터 키트 버전 2 (Big Dye Terminator Kit Ver.2, 어플라이드 바이오 시스템즈사 제조) 및 DNA 시퀀서를 사용하여 결정하였다. 그 결과 cDNA 의 5' 말단에 개시 코돈으로 추정되는 ATG 서열이 존재하는 완전 전체 길이의 기능적인 H 쇄 cDMA 를 함유하는 플라스미드 pKM1334H7-1 및 L 쇄 cDNA 를 함유하는 플라스미드 pKM1334L7-1 을 얻었다.
(4) 항 FGF-8 중화 마우스 항체의 V 영역의 아미노산 서열 해석
서열 번호 1 에 플라스미드 pKM1334H7-1 에 포함되어 있던 VH 의 전체 염기 서열, 서열 번호 2 로 추정된 전체 아미노산 서열, 서열 번호 3 에 플라스미드pKM1334L7-1 에 포함되어 있던 VL 의 전체 염기 서열, 서열 번호 4 에 추정된 전체 아미노산 서열을 각각 나타낸다. 기지의 마우스 항체의 서열 데이터 (시퀀시즈 어브 프로틴즈 어브 이뮤놀로지컬 인터레스트) 와의 비교 및 정제한 항 FGF-8 중화 마우스 항체 KM1334 의 H 쇄 및 L 쇄의 N 말단 아미노산 서열을 프로틴 시퀀서 PPSQ-10 (시마즈 제작소 제조) 을 사용하여 자동 에드만 분해에 의해 해석한 결과와의 비교로부터, 단리한 각각의 cDNA 는 분비 시그널 서열을 포함하는 항 FGF-8 중화 마우스 항체 KM1334 를 코드하는 완전 전체 길이 cDNA 이고, H 쇄에 대해서는 서열 번호 2 에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 19 번째가, L 쇄에 대해서는 서열 번호 4 에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 19 번째가 분비 시그널 서열임이 판명되었다. 또, 분비 시그널 서열을 제외한 VH 및 VL 의 아미노산 서열을 서열 번호 5 및 서열 번호 6 에 각각 나타내었다.
다음으로, 항 FGF-8 중화 마우스 항체 KM1334 의 VH 및 VL 의 아미노산 서열의 신규성에 대해 검토하였다. 서열 해석 시스템으로서 GCG 패키지 [버전 9.1, 제네틱스 컴퓨터 그룹 (Genetics Computer Group) 사 제조] 를 사용하고, 기존의 단백질 아미노산 서열 데이터 베이스 [PIR-Protein (Release 56.0)] 을 BLAST (Altschul S. F. et al., J. Mol. Biol., 215, 403-410, 1990) 에 의해 검색하였다. 그 결과, H 쇄, L 쇄 모두 완전하게 일치하는 서열은 관찰되지 않고, 항 FGF-8 중화 마우스 항체 KM1334 의 VH 및 VL 은 신규한 아미노산 서열인 것이 확인되었다.
또한, 항 FGF-8 중화 마우스 항체 KM1334 의 VH 및 VL 의 CDR 을 기지의 항체의 아미노산 서열과 비교함으로써 동정하였다. 항 FGF-8 중화 마우스 항체 KM1334 의 VH 의 CDR1, CDR2 및 CDR3 의 아미노산 서열을 각각 서열 번호 7, 8, 및 9 에, VL 의 CDR1, CDR2 및 CDR3 의 아미노산 서열을 각각 서열 번호 10, 11 및 12 에 나타내었다.
2. 항 FGF-8 중화 키메라 항체의 동물 세포를 사용한 안정 발현
(1) 항 FGF-8 중화 키메라 항체의 VH 를 코드하는 DNA 를 포함하는 플라스미드 pKM1334CH-H5 의 구축
참고예 1 의 1. (3) 에서 얻어진 플라스미드 pKM1334H7-1 의 50ng 을 주형으로 하고, 서열 번호 13, 14 에 기재된 염기 서열을 각각 갖는 합성 DNA [젠세트 (GENSET) 사 제조] 를 프라이머로서 최종 농도 0.3μmol/L 가 되도록 첨가하고, KOD 플러스 폴리메라제 (토요보세키사 제조) 에 첨부된 사용 설명서에 따라 전체량 50μL 에서 먼저 94℃ 에서 2 분간 가열한 후, 94℃ 15 초간, 57℃ 30 초간, 68℃ 1 분간의 조건에서 30 사이클의 PCR 을 수행하였다. 이 반응액을 정제한 후, 멸균수에 용해하고, 10 단위의 제한 효소 EcoRI (타카라슈조사 제조) 를 사용하여 37℃ 에서 1 시간 반응시켰다. 이 반응액을 아가로스겔 전기 영동에 의해 분획하고, 약 0.48kb 의 EcoRI 단편 (5' 말단측이 EcoRI, 3' 말단측은 평활 말단) 을 약 0.3㎍ 회수하였다.
다음으로, 플라스미드 pBluescript SK (－) 의 3㎍ 에, 10 단위의 제한 효소EcoRI 및 10 단위의 제한 효소EcoRV (타카라슈조사 제조) 를 37℃ 에서 1 시간 반응시켰다. 이 반응액을 아가로스겔 전기 영동에 의해 분획하고, 약 2.95kb 의EcoRI-EcoRV 단편을 약 2㎍ 회수하였다.
다음으로, 상기에서 얻어진 VH 를 코드하는 DNA 의EcoRI 단편 0.1㎍ 과 플라스미드 pBluescript SK (－) 유래의EcoRI-EcoRV 단편 0.1㎍ 을 전체량 10㎕ 의 멸균수에 첨가하고, 라이게이션 하이 (Ligation High, 토요보세키사 제조) 을 사용하여 연결하였다. 이렇게 하여 얻어진 재조합 플라스미드 DNA 용액을 사용하여 대장균 XL1-Blue 주를 형질 전환하고, 도 18 에 나타낸 항 FGF-8 중화 키메라 항체의 VH 를 코드하는 DNA 를 함유하는 플라스미드 pKM1334CH-H5 를 얻었다.
(2) 항 FGF-8 중화 키메라 항체의 VL 을 코드하는 DNA 를 함유하는 플라스미드의 구축
참고예 1 의 1. (3) 에서 얻어진 플라스미드 pKM1334L7-1 의 50ng 를 주형으로 하고, 서열 번호 15, 16 에 기재된 염기 서열을 각각 갖는 합성 DNA (젠세트사 제조) 를 프라이머로서 최종 농도 0.3μmol/L 가 되도록 첨가하고, KOD 플러스 폴리메라제에 첨부된 사용 설명서에 따라 전체량 50μL 에서 먼저 94℃ 에서 2 분간 가열한 후, 94℃ 15 초간, 57℃ 30 초간, 68℃ 1 분간의 조건에서 30 사이클의 PCR 반응을 수행하였다. 이 반응액을 정제한 후, 멸균수에 용해하고, 10 단위의 제한 효소 EcoRI 를 사용하여 37℃ 에서 1 시간 반응시켰다. 이 반응액을 아가로스겔 전기 영동에 의해 분획하고, 약 0.45kb 의 EcoRI 단편 (5' 말단측이 EcoRI, 3' 말단측은 평활 말단) 을 약 0.3㎍ 회수하였다.
다음으로, 상기에서 얻어진 VL 을 코드하는 DNA 의 EcoRI 단편 0.1㎍ 과 플라스미드 pBluescript SK (－) 유래의 EcoRI-EcoRV 단편 0.1㎍ 을 전체량 10㎕ 의멸균수에 첨가하고, 라이게이션 하이를 사용하여 연결하였다. 이렇게 하여 얻어진 재조합 플라스미드 DNA 용액을 사용하여 대장균 XL1-Blue 주를 형질 전환하고, 도 19 에 나타낸 항 FGF-8 중화 키메라 항체의 VL 을 코드하는 DNA 를 함유하는 플라스미드 pKM1334CH-LA 를 얻었다.
(3) 항 FGF-8 중화 키메라 항체 발현 벡터 pKANTEX1334 의 구축
WO97/10354 에 기재된 인간화 항체 발현용 벡터 pKANTEX93 과 참고예 1 의 2. (1) 및 (2) 에서 얻어진 플라스미드 pKM1334CH-H5 및 pKM1334CH-L4 를 사용하여 항 FGF-8 중화 키메라 항체 발현 벡터 pKANTEX1334 를 이하와 같이 하여 구축하였다.
참고예 1 의 2. (1) 에서 얻어진 플라스미드 pKM1334CH-H5 의 3㎍ 에 10 단위의 제한 효소 NotI [뉴 잉글랜드 바이오랩스 (New England Biolabs) 사 제조] 및 10 단위의 제한 효소 ApaI (타카라슈조사 제조) 를 첨가하여 37℃ 에서 1 시간 반응시켰다. 이 반응액을 아가로스겔 전기 영동에 의해 분획하고, 약 0.48kb 의 NotI-ApaI 단편을 약 0.2㎍ 회수하였다.
다음으로, 인간화 항체 발현용 벡터 pKANTEX93 의 3㎍ 에, 10 단위의 제한 효소 ApaI (타카라슈조사 제조) 및 10 단위의 제한 효소 NotI 를 첨가하여 37℃ 에서 1 시간 반응시켰다. 이 반응액을 아가로스겔 전기 영동에 의해 분획하고, 약 12.8kb 의 ApaI-NotI 단편을 약 2㎍ 회수하였다.
다음으로, 상기에서 얻어진 플라스미드 pKM1334CH-H5 유래의 NotI-ApaI 단편 0.1㎍ 과 플라스미드 pKANTEX93 유래의 NotI-ApaI 단편 0.1㎍ 과 전체량 10μL 의멸균수에 첨가하고, 라이게이션 하이를 사용하여 연결하였다. 이렇게 하여 얻어진 재조합 플라스미드 DNA 용액을 사용하여 대장균 XL1-Blue 주를 형질 전환하고, 도 20 에 나타낸 플라스미드 pKANTEX1334H 를 얻었다.
다음으로, 참고예 1, 2. (2) 에서 얻어진 플라스미드 pKM1334CH-L4 의 3㎍ 에, 10 단위의 제한 효소 EcoRI 및 10 단위의 제한 효소 BsiWI (뉴 잉글랜드 바이오랩스사 제조) 를 첨가하여 37℃ 에서 1 시간 반응시켰다. 이 반응액을 아가로스겔 전기 영동에 의해 분획하고, 약 0.45kb 의 EcoRI-BsiWI 단편을 약 0.2㎍ 회수하였다.
다음으로, 상기에서 얻어진 플라스미드 pKANTEX1334H 의 3㎍ 에, 10 단위의 제한 효소 EcoRI 및 제한 효소 BsiWI 를 사용하여 37℃ 에서 1 시간 반응시켰다. 이 반응액을 아가로스겔 전기 영동에 의해 분획하고, 약 13.30kb 의 EcoRI-BsiWI 단편을 약 2㎍ 회수하였다.
다음으로, 상기에서 얻어진 플라스미드 pKM1334CH-L4 유래의 EcoRI-BsiWI 단편 0.1㎍ 과 플라스미드 pKANTEX1334H 유래의 EcoRI-BsiWI 단편 0.1㎍ 을 전체량 10μL 의 멸균수에 첨가하고, 라이게이션 하이를 사용하여 연결하였다. 이렇게 하여 얻어진 재조합 플라스미드 DNA 용액을 사용하여 대장균 XL1-Blue 주를 형질 전환하고, 도 20 에 나타낸 플라스미드 pKANTEX1334 를 얻었다.
얻어진 플라스미드 pKANTEX1334 의 400ng 를 사용하여 빅 다이 터미네이터 키트 버전 2 및 DNA 시퀀서를 사용하여 염기 서열을 해석하였다. 그 결과, 목적하는 DNA 가 클로닝된 플라스미드가 얻어진 것을 확인하였다.
(4) 항 FGF-8 중화 키메라 항체의 CHO/DG44 세포를 사용한 안정 발현
상기 참고예 1 의 2. (3) 에서 얻어진 항 FGF-8 중화 키메라 항체 발현 벡터 pKANTEX1334 를 사용하여 DHFR 유전자 결손 CHO 세포인 CHO/DG44 세포 (Urlaub G. and Chasin L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216-4220, 1980) 를 숙주로 한 항 FGF-8 중화 키메라 항체의 발현을 이하와 같이 수행하였다.
플라스미드 pKANTEX1334 의 10㎍ 을 1.6 ×106세포의 CHO/DG44 세포에 일렉트로포레이션법 (Miyaji H. et al., Cytotechnology, 3, 133-140, 1990) 에 의해 도입 후, 10 ∼ 30mL 의 IMDM-1 ×HT 서플러먼트-dFBS (10) [투석 FBS (이하 dFBS 라고 함) 를 10% 와 1 ×HT 서플러먼트 (인비트로젠사 제조) 를 함유하는 IMDM 배지 (인비트로젠사 제조)] 에 현탁하고, 96 웰 마이크로 타이터 플레이트 (아사히 테크노 글라스사 제조) 에 100μL/웰씩 분주하였다. 5% CO2인큐베이터 내에서 37℃, 24 시간 배양한 후, 배양액을 배지 IMDM-dFBS(10) [HT 서플러먼트를 함유하지 않고 10% dFBS 를 함유하는 IMDM 배지] 과 교환하여 1 ∼ 2 주일 더 배양하였다. 내성 콜로니가 출현하고 컨플루언트로 된 웰로부터 배양 상청을 회수하고, 상청 중의 항 FGF-8 중화 키메라 항체의 항원 결합 활성을 하기 참고예 1 의 2. (6) 에 나타내는 ELISA 에 의해 측정하였다.
배양 상청 중에 항 FGF-8 중화 키메라 항체의 발현이 관찰된 웰의 형질 전환주에 대해서는 24 웰 플레이트에 파종하고, dhfr 유전자 증폭계를 이용하여 항체 발현량을 증가시킬 목적에서, dhfr 의 저해제인 메소트렉세이트 (시그마-알드리치사 제조, 이하 MTX 라고 함) 를 50n㏖/L 함유하는 IMDM-dFBS(10) 에서 2 주일 배양하였다. 추가로 MTX 농도를 200n㏖/L, 500n㏖/L 로 높게 하고, 각각의 단계에서 2 주일씩 배양을 행하여 500n㏖/L MTX 내성을 나타내는 형질 전환주를 유도하였다. 형질 전환주가 웰에 컨플루언트로 된 시점에서 배양 상청 중의 항 FGF-8 중화 키메라 항체의 항원 결합 활성을 참고예 1 의 2. (6) 에 나타내는 ELISA 에 의해 측정하였다. 최종적으로 500n㏖/L 의 MTX 를 함유하는 IMDM-dFBS(10) 배지에서 증식 가능 또한, 항 FGF-8 중화 키메라 항체를 고발현하는 형질 전환주를 얻었다. 얻어진 형질 전환주에 대해서는 한계 희석법에 의한 단일 세포화 (클론화) 를 수행하고, 항 FGF-8 중화 키메라 항체의 발현이 가장 높은 형질 전환 세포 클론을 KM3034 라고 명명하였다. 또, KM3034 는 평성 13 년 12 월 26 일자로 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 위탁 센터 (우편 번호 305-8566 일본국 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1 쵸메 1-1 중앙 제 6) 에 FERM BP-7836 으로서 기탁되어 있다.
(5) 항 FGF-8 중화 키메라 항체의 YB2/0 세포를 사용한 안정 발현
상기 참고예 1 의 2 페이지 (3) 에서 얻어진 항 FGF-8 중화 키메라 항체 발현 벡터 pKANTEX1334 를 사용하여 항 FGF-8 중화 키메라 항체의 래트 하이브리도마 YB2/0 세포 (ATCC No. CRL-1662) 에서의 발현을 이하와 같이 하여 수행하였다.
플라스미드 pKANTEX1334 의 10㎍ 을 4 ×106세포의 YB2/0 세포에 일렉트로포레이션법에 의해 도입 후, 40mL 의 하이브리도마-SFM-FBS(5) [5% FBS (PAA 래버러토리즈사 제조) 를 함유하는 하이브리도마-SFM 배지 (인비트로젠사 제조)] 에 현탁하고, 96 웰 배양용 플레이트 (스미토모 베이크라이트사 제조) 에 200μL/웰씩 분주하였다. 5% CO2인큐베이터 내에서 37℃, 24 시간 배양한 후, G418 을 1㎎/mL 가 되도록 첨가하여 1 ∼ 2 주일 배양하였다. G418 내성을 나타내는 형질 전환주의 콜로니가 출현하고, 증식이 관찰된 웰로부터 배양 상청을 회수하고, 상청 중의 항 FGF-8 중화 키메라 항체의 항원 결합 활성을 참고예 1 의 2. (6) 에 나타내는 ELISA 에 의해 측정하였다.
배양 상청 중에 항 FGF-8 중화 키메라 항체의 발현이 관찰된 웰의 형질 전환주에 대해서는 dhfr 유전자 증폭계를 이용하여 항체 발현량을 증가시킬 목적에서, 1㎎/mL G418 및 50n㏖/L MTX 를 함유하는 하이브리도마-SFM-FBS(5) 배지에 1 ∼ 2 ×105세포/mL 가 되도록 현탁하고, 24 웰 플레이트 [글라이너 (Greiner) 사 제조] 에 1mL 씩 분주하였다. 5% CO2인큐베이터 내에서 37℃ 에서 1 ∼ 2 주일 배양하여 50n㏖/L MTX 내성을 나타내는 형질 전환주를 유도하였다. 형질 전환주의 증식이 관찰된 웰의 배양 상청 중의 항 FGF-8 중화 키메라 항체의 항원 결합 활성을 참고예 1 의 2. (6) 에 나타내는 ELISA 에 의해 측정하였다.
배양 상청 중에 항 FGF-8 중화 키메라 항체의 발현이 관찰된 웰의 형질 전환주에 대해서는 상기와 동일한 방법에 의해 MTX 농도를 상승시키고, 최종 농도가 1㎎/mL 의 G418, 200n㏖/L 의 MTX 를 함유하는 하이브리도마-SFM-FBS(5) 배지에서 증식 가능 또한, 항 FGF-8 중화 키메라 항체를 고발현하는 형질 전환주 5-D 를 얻었다. 얻어진 형질 전환주에 대해 한계 희석법에 의한 클론화를 수행하고, 항 FGF-8 중화 키메라 항체의 발현이 가장 높은 형질 전환 세포주를 얻었다. 얻어진 형질 전환 세포주를 KM3334 로 명명하였다.
(6) ELISA 에 의한 항체의 FGF-8 부분 펩티드에 대한 결합 활성의 측정
항 FGF-8 항체가 반응할 수 있는 인간 FGF-8 의 부분 펩티드로서, 항 FGF-8 중화 마우스 항체 KM1334 (일본 공개 특허 공보 평9-271391 호) 의 항원 펩티드와 동일한 서열인 서열 번호 17 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 합성하였다. 서열 번호 17 은 인간 FGF-8 의 아미노산 서열의 23 ∼ 46 번째의 서열의 C 말단에, 컨쥬게이트 제작을 위해 시스테인 잔기를 부가한 서열이다. 이하, 이 펩티드를 화합물 1 이라 부른다. ELISA 에 사용하기 위해, 이하의 방법으로 소 혈청 알부민 (나카라이테스크사 제조, 이하 BSA 라고 함) 과의 컨쥬게이트 (이하 BSA-화합물 1 이라 함) 를 제작하였다. 즉, 10㎎ 의 BSA 를 함유하는 PBS 900μL 에, 100μL 의 25㎎/mL SMCC[4-(N-말레이미드메틸)시클로헥산-1-카르복실릭 애시드 N-히드록시삭신이미드 에스테르, 시그마-알드리치사 제조] 의 DMSO 용액을 교반하면서 적하하고, 30 분간 천천히 교반하였다. 25mL 의 PBS 로 평형화한 겔여과 칼럼 (NAP-10 칼럼) 에 반응액 1mL 를 올리고, 1.5mL 의 PBS 로 용출시킨 용출액을 BSA-SMCC 용액으로 하였다. 각 획분의 BSA 농도는 280㎚ 의 흡광도로 측정하였다. 다음으로, 1.0㎎ 의 화합물 1 에 200μL DMSO 를 첨가하고, 이어서 800μL PBS 를 첨가하여 완전히 용해시킨 후, 전술한 BSA-SMCC 용액 (BSA 환산 2.5㎎) 을 교반 하에서 첨가하여 실온에서 3 시간 천천히 교반하였다.반응액을 PBS 에 대해 4℃, 하룻밤 투석하고, 최종 농도 0.05% 가 되도록 아지화나트륨을 첨가한 후, 구멍 직경 0.22㎛ 필터로 여과한 용액을 BSA-화합물 1 용액으로 하였다.
96 웰의 ELISA 용 플레이트 (글라이너사 제조) 에, 상기 기술한 바와 같이 조제한 BSA-화합물 1 용액을 0.5 ∼ 1.0㎍/mL 의 농도로 50μL/웰씩 분주하고, 4℃ 에서 하룻밤 방치하여 흡착시켰다. PBS 로 세정 후, 1% BSA 를 함유하는 PBS (이하, BSA-PBS 라고 함) 를 100μL/웰씩 첨가하고, 실온에서 1 시간 반응시켜 잔존하는 활성 기를 블록하였다. 각 웰을 0.05% Tween 을 함유하는 PBS (이하, Tween-PBS 라고 함) 로 세정 후, 형질 전환주의 배양 상청 또는 정제 항체를 50μL/웰씩 첨가하고, 실온에서 1 시간 반응시켰다. 반응 후, 각 웰을 Tween-PBS 로 세정 후, BSA-PBS 로 3000 ∼ 6000 배로 희석한 퍼옥시다제 표지 염소 항 인간 IgG (H&L) 항체 용액 [아메리칸 쿼렉스 (American Qualex) 사 제조] 을 2 차 항체 용액으로 하여 50μL/웰씩 첨가하고, 실온에서 1 시간 반응시켰다. 반응 후의 각 웰을 Tween-PBS 로 세정 후, ABTS 기질액 [0.55g 의 2,2'-아디노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산)암모늄을 1L 의 0.1M 시트르산 완충액 (pH4.2) 에 용해하고, 사용 직전에 30% 과산화수소수를 1μL/mL 의 비율로 첨가한 용액] 을 50μL/웰씩 첨가하여 발색 반응시키고, 5 분 후에 5% SDS 용액을 50μL/웰씩 첨가하여 정지시켰다. 그 후, 415㎚ 의 흡광도를 측정하였다.
3. 항 FGF-8 중화 키메라 항체의 정제
(1) CHO/DG44 세포 유래의 발현 세포의 배양 및 항체의 정제
참고예 1 의 2. (4) 에서 얻어진 항 FGF-8 중화 키메라 항체를 발현하는 형질 전환주 세포 KM3034 를 500n㏖/L MTX 를 함유하는 IMDM-dFBS(10) 배지에 1 ∼ 2 ×105세포/mL 가 되도록 현탁하고, 175㎠ 플라스크 (글라이너사 제조] 에 40mL 씩 분주하였다. 5% CO2인큐베이터 내에서 37℃ 에서 5 ∼ 7 일간 배양하여 컨플루언트에 도달한 시점에서 배양 상청을 제거하고, 20mL 의 PBS 로 세포를 세정하였다. PBS 를 제거하고, 40mL 의 EX-CELL 301 배지 (JRH 바이오사이언시즈사 제조) 를 첨가하고, 5% CO2인큐베이터 내에서 37℃ 에서 7 ∼ 14 일간 배양 후, 배양 상청을 회수하였다. 배양 상청으로부터 프로셉-A [Prosep-A, 미리포아사 제조] 칼럼을 사용하여 첨부된 설명서에 따라 항 FGF-8 중화 키메라 항체를 정제하였다. 얻어진 항 FGF-8 중화 키메라 항체는 KM3034 로 명명하였다.
(2) YB2/0 세포 유래의 발현 세포의 배양 및 항체의 정제
참고예 1 의 2. (5) 에서 얻어진 항 FGF-8 중화 키메라 항체를 발현하는 형질 전환 세포주 KM3334 를 175㎠ 플라스크에서, 200n㏖/L MTX 및 5% 다이고 GF21 (와코쥰야쿠사 제조) 을 함유하는 하이브리도마-SFM 배지를 사용하여 5% CO2인큐베이터 내에서 37℃ 에서 배양하였다. 8 ∼ 10 일간 배양하여 회수한 배양 상청으로부터, 프로셉-A 칼럼을 사용하여 첨부된 설명서에 따라 항 FGF-8 중화 키메라 항체를 정제하였다. 얻어진 항 FGF-8 중화 키메라 항체는 KM3334 라고 명명하였다.
4. 정제한 항 FGF-8 중화 키메라 항체의 해석
참고예 1 의 3. 에서 얻어진 각종 동물 세포에서 발현, 정제한 2 종류의 항 FGF-8 중화 키메라 항체 KM3034 및 KM3334 의 각 4㎍ 을 공지된 방법 (Nature, 227, 680, 1970) 에 따라 SDS-전기 영동에 의해 분자량 및 정제도를 해석하였다. 정제한 각 항 FGF-8 중화 키메라 항체는 모두 비환원 조건 하에서는 분자량이 약 150Kd 의 단일 밴드가, 환원 조건 하에서는 약 50Kd 와 약 25Kd 의 2 개의 밴드가 관찰되었다. 이들의 분자량은 항체의 H 쇄 및 L 쇄의 cDNA 의 염기 서열로부터 추정되는 분자량 (H 쇄: 약 49Kd, L 쇄: 약 23Kd, 분자 전체: 약 144Kd) 과 거의 일치하고, 또한 IgG 형의 항체는 비환원 조건 하에서는 분자량은 약 150Kd 이고, 환원 조건하에서는 분자내의 S-S 결합이 절단되고, 분자량 약 50Kd 의 H 쇄와 약 25Kd 의 L 쇄에 각각 분해된다는 보고 (Antibodies: A Laboratory Mannual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14, 1988; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited, 1996) 와 일치하고, 그럼으로써 항 FGF-8 중화 키메라 항체가 올바른 구조의 항체 분자로서 발현되고, 또한 정제된 것이 확인되었다.
5. 정제한 FGF-8 의 중화 키메라 항체의 중화 활성 평가
정제한 항 FGF-8 중화 키메라 항체의 FGF-8 중화 활성의 평가는 이하에 나타내는 마우스 유암 세포주 SC-3 의 FGF-8 의존성 증식의 억제 효과 (Tanaka A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 8928--8932, 1992) 에 의해 측정하였다. 즉, 활성탄 처리를 한 FBS 를 2% 의 농도로 함유하는 DMEM: Ham's F12 (1 : 1) 배지 [DMEM 배지와 Ham's F12 배지 (인비트로젠사 제조) 를 1: 1 의 비율로 혼합한배지] 에, SC-3 세포를 3.0 ×104세포/mL 의 농도로 현탁하고, 150μL (4.5 ×103세포/웰씩 96 웰 플레이트에 파종하였다. 5% CO2인큐베이터 내에서 37℃, 18 시간 배양 후, 100μL/웰의 시험 배지를 사용하여 배지 교환하였다. 시험 배지는 50ng/mL 의 FGF-8 (R&D 사 제조) 및 각 희석 농도의 항 FGF-8 중화 키메라 항체를, BSA 를 0.1% 함유하는 DMEM: Ham's F12 (1 : 1) 배지에 용해함으로써 제작하였다. 또한, 양성 대조의 항체로서 WO01/64754 에 기재된 인간 케모카인 CCR4 에 대한 키메라 항체 KM2760 을 사용하였다. 5% CO2인큐베이터 내에서 37℃, 48 시간 배양 후, 새로 조제한 시험 배지와 교환하고, 추가로 48 시간 배양하였다. WST-1 시약 (로슈사 제조) 을 10μL/웰씩 첨가하고, 가볍게 교반하여 5% CO2인큐베이터 내에서 37℃, 1 시간 배양 후, 흡광도 (OD450/650) 를 측정하였다. 도 21 에서, 횡축은 첨가한 항체 농도, 종축은 50ng/mL 의 FGF-8 만 첨가했을 때의 증식에 대한 상대 증식 (%) 을 나타낸다. 50ng/mL 의 FGF-8 만 첨가했을 때의 증식에 대한 상대 증식 (%) 은 하기 식에 의해 산출되었다.
(식) FGF-8 첨가시의 증식에 대한 상대 증식 (%) ＝ {(FGF-8 및 항체 첨가시의 흡광도 － FGF-8 및 항체 미첨가시의 흡광도) / (FGF-8 만 첨가했을 때의 흡광도 － FGF-8 및 항체 미첨가시의 흡광도)} ×100
도 21 에 나타낸 바와 같이, 항 FGF-8 중화 마우스 항체 KM1334, 항 FGF-8 중화 키메라 항체 KM3034 및 KM3334 는 모두 동등한 SC-3 세포 증식 저해 활성을나타내고, 키메라 항체화에 의한 중화 활성의 저하는 관찰되지 않았다.
참고예 2
항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 제작
1. 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 VH 및 VL 을 코드하는 DNA 의 구축
(1) 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 VH 및 VL 의 아미노산 서열의 설계
먼저, 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 VH 의 아미노산 서열을 이하와 같이 하여 설계하였다. 참고예 1 의 1 항 (4) 에서 동정한 항 FGF-8 중화 마우스 항체 KM1334 의 VH 의 CDR 의 아미노산 서열을 이식하기 위한 인간 항체의 VH 의 FR 의 아미노산 서열을 선택하였다. 카바트 등은 기존에 알려진 다양한 인간 항체의 VH 를 그 아미노산 서열의 상동성으로부터 3 종류의 서브그룹 (HSG I ∼ III) 으로 분류하고, 또한 이들 각 서브그룹 마다 공통 서열을 보고하고 있다 (시퀀시즈 어브 프로틴즈 어브 이뮤놀로지컬 인터레스트). 이들 공통 서열은 인간에게 있어서 보다 면역원성이 저하될 가능성이 있다고 생각되기 때문에, 이들 공통 서열을 기초로 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 VH 의 아미노산 서열을 설계하도록 하였다. 보다 활성이 높은 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체를 제작하기 위해, 설계시에는 인간 항체의 VH 의 3 종류의 서브 그룹의 공통 서열의 FR 의 아미노산 서열 중, KM1334 의 VH 의 FR 의 아미노산 서열과 가장 높은 상동성을 갖는 FR 의 아미노산 서열을 선택하였다. 표 4 에는 상동성의 검색 결과를 나타냈다. 표 4 에 나타낸 바와 같이, KM1334 의 VH 영역의 FR 의 아미노산 서열은 서브 그룹 I 과 가장 높은 상동성을 갖고 있었다.
인간 항체의 VH 의 각 서브 그룹의 공통 서열의 FR 의 아미노산 서열과 KM1334 의 VH 의 FR 의 아미노산 서열의 상동성
HGS I HSG II HSG III
79.3% 51.7% 59.8%
이상의 결과를 통해, 인간 항체의 VH 의 서브 그룹 I 의 공통 서열의 FR 아미노산 서열의 적절한 위치에 항 FGF-8 중화 마우스 항체 KM1334 의 VH 의 CDR 의 아미노산 서열을 이식하고, 서열 번호 18 에 기재된 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 VH 의 아미노산 서열 HV.0 을 설계하였다.
다음으로, 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 VL 의 아미노산 서열을 이하와 같이 하여 설계하였다. 참고예 1 의 1. (4) 에서 동정한 항 FGF-8 중화 마우스 항체 KM1334 의 VL 의 CDR 의 아미노산 서열을 이식하기 위한 인간 항체의 VL 의 FR 의 아미노산 서열을 선택하였다. 카바트 등은 기존에 알려진 다양한 인간 항체의 VH 를 그 아미노산 서열의 상동성으로부터 4 종류의 서브그룹 (HSG I ∼ IV) 으로 분류하고, 또한 이들 각 서브그룹 마다 공통 서열을 보고하고 있다 (시퀀시즈 어브 프로틴즈 어브 이뮤놀로지컬 인터레스트). 그래서, VH 의 경우와 동일하게 하여 인간 항체의 VL 의 4 종류의 서브 그룹의 공통 서열의 FR 의 아미노산 서열 중, KM1334 의 VL 의 FR 의 아미노산 서열과 가장 높은 상동성을 갖는 FR 의 아미노산 서열을 선택하였다.
표 5 에는 상동성의 검색 결과를 나타냈다. 표 5 에 나타낸 바와 같이,KM1334 의 VL 의 FR 의 아미노산 서열은 서브 그룹 II 와 가장 높은 상동성을 갖고 있었다.
인간 항체의 VL 의 각 서브 그룹의 공통 서열의 FR 의 아미노산 서열과 KM1334 의 VL 의 FR 의 아미노산 서열의 상동성
HSG I HSG II HSG III HSG IV
66.3% 83.8% 66.2% 73.8%
이상의 결과를 통해, 인간 항체의 VL 의 서브 그룹 II 의 공통 서열의 FR 아미노산 서열의 적절한 위치에 항 FGF-8 중화 마우스 항체 KM1334 의 VL 의 CDR 의 아미노산 서열을 이식하고, 서열 번호 19 에 기재된 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 VL 의 아미노산 서열 LV.0 을 설계하였다.
상기에서 설계한 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 VH 의 아미노산 서열 HV.0 및 VL 의 아미노산 서열 LV.0 은 선택한 인간 항체의 FR 의 아미노산 서열에 항 FGF-8 중화 마우스 항체 KM1334 의 CDR 의 아미노산 서열만을 이식한 서열이다. 대부분의 경우, 인간형 CDR 이식 항체에서는 마우스 항체의 CDR 의 아미노산 서열의 이식만으로는 결합 활성이 저하된다. 이를 회피하기 위해 인간 항체와 마우스 항체의 FR 아미노산 서열을 비교하여 상이한 FR 의 아미노산 잔기 중, 결합 활성에 영향을 미치는 것을 판단되는 아미노산 잔기를 CDR 의 아미노산 서열과 함께 이식하는 것이 수행되고 있다. 그래서, 본 참고예에서도 결합 활성에 영향을 미치는 것으로 판단되는 FR 의 아미노산 잔기를 동정하는 것을 검토하였다.
먼저, 상기에서 설계한 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 VH 의 아미노산 서열 HV.0 및 VL 의 아미노산 서열 LV.0 으로 이루어지는 항체 V 영역 (HV0LV0) 의 3 차원 구조를 컴퓨터 모델링 수법을 이용하여 구축하였다. 3 차원 구조 좌표 제작에 관해서는 소프트웨어 AbM [옥스포드 몰레큘러 (Oxford Molecular) 사 제조] 을 3 차원 구조의 표시에 대해서는 소프트웨어 Pro-Explore (옥스포드 몰레큘러사 제조) 또는 RasMol [글락소 (Glaxo) 사 제조] 을 사용하여 각각 첨부된 사용 설명서에 따라 수행하였다. 또한, 항 FGF-8 중화 마우스 항체 KM1334 의 V 영역의 3 차원 구조의 컴퓨터 모델도 동일하게 하여 구축하였다. 또한, HV0LV0 의 VH 및 VL 의 FR 의 아미노산 서열에 있어서, 항 FGF-8 중화 마우스 항체 KM1334 와 다르게 되어 있는 아미노산 잔기에 대해 순차, 항 FGF-8 중화 마우스 항체 KM1334 의 상당하는 위치에 관찰되는 아미노산 잔기로 개변한 아미노산 서열로 이루어지는 개변체의 V 영역 3 차원 구조 모델을 동일하게 하여 구축하고, 항 FGF-8 중화 마우스 항체 KM1334, HV0LV0 및 개변체의 V 영역의 3 차원 구조를 비교하였다. 그 결과, HV0LV0 의 FR 의 아미노산 잔기 중에서 항원 결합 부위의 3 차원 구조를 변화시키고, 항체의 활성에 영향을 미치는 것으로 판단되는 잔기로서 HV.0 에 있어서 12 번째의 Lys, 13 번째의 Lys, 40 번째의 Ala, 41 번째의 Pro, 48 번째의 Met, 68 번째의 Val, 70 번째의 Ile, 74 번째의 Thr, 76 번째의 Thr, 82 번째의 Glu, 87 번째의 Arg, 95 번째의 Tyr 을, LV.0 에 있어서 2 번째의 Ile, 3 번째의 Val, 14 번째의 Thr, 15 번째의 Pro, 50 번째의 Gln, 51 번째의 Leu, 92 번째의 Tyr 을 선택하고, 아미노산을 개변하도록 하였다. 이들 선택한 아미노산 잔기 중, 적어도하나 이상을 마우스 항체 KM1334 에 관찰되는 아미노산 잔기로 개변하고, 다양한 개변을 갖는 인간형 CDR 이식 항체의 VH 및 VL 을 이하와 같이 하여 설계하였다.
구체적으로는 VH 로서는 12 번째의 Lys, 13 번째의 Lys, 40 번째의 Ala, 41 번째의 Pro, 48 번째의 Met, 95 번째의 Tyr 의 6 잔기를 각각 마우스 항체 KM1334 에 관찰되는 아미노산 잔기인 Ala, Arg, Arg, Ser, Ile, Phe 로 개변한 서열 번호 20 에 기재된 아미노산 서열 HV.6 을 설계하였다. VL 로는 2 번째의 Ile, 14 번째의 Thr, 15 번째의 Pro, 50 번째의 Gln, 51 번째의 Leu, 92 번째의 Tyr 의 6 잔기를 각각 마우스 항체 KM1334 에 관찰되는 아미노산 잔기인 Val, Ser, Leu, Lys, Val, Phe 로 개변한 서열 번호 21 에 기재된 아미노산 서열 LV.6 을 설계하였다.
(2) 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 VH 를 코드하는 DNA 의 구축
참고예 2 의 1 항 (1) 에서 설계한 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 VH 아미노산 서열 HV.0 을 코드하는 DNA 를 PCR 을 사용하여 이하와 같이 하여 구축하였다.
먼저, 설계한 아미노산 서열에 항 FGF-8 중화 마우스 항체 KM1334 의 H 쇄의 분비 시그널 서열 (서열 번호 2 의 1 ∼ 19 번째의 아미노산 서열) 을 연결하였다. 다음으로, 얻어진 아미노산 서열을 유전자 코돈으로 변환하였다. 하나의 아미노산 잔기에 대해 복수의 유전자 코돈이 존재하는 경우에는 항체의 유전자의 염기 서열에 관찰되는 사용 빈도 (시퀀시즈 어브 프로틴즈 어브 이뮤놀로지컬 인터레스트) 를 고려하여 대응하는 유전자 코돈을 결정하였다. 결정된 유전자 코돈을 연결하여 완전한 항체 V 영역의 아미노산 서열을 코드하는 DNA 의 염기 서열을 설계하였다. 이 염기 서열의 5' 말단과 3' 말단에 인간화 항체 발현용 벡터에 클로닝하기 위한 제한 효소 인식 서열을 포함하는 서열을 부가하고, 또한 5' 말단에 M13 프라이머 RV (타카라슈조사 제조) 의 서열, 3' 말단에 M13 프라이머 M4 (타카라슈조사 제조) 의 서열과 상보적인 서열을 부가하였다. 설계한 염기 서열 (서열 번호 22) 을 5' 말단측으로부터 141 염기씩, 말단의 20 염기가 중복되도록 4 개로 구획짓고, 각각의 서열의 센스쇄, 안티센스쇄, 센스쇄, 안티센스쇄에 상당하는 서열 번호 23 ∼ 26 에 나타내는 서열로 이루어지는 4 개의 DNA 를 화학 합성하였다 (젠세트사 제조).
KOD 폴리메라제에 첨부된 사용 설명서에 따라 0.1μmol/L 의 각 합성 DNA, 0.5μmol/L 의 M13 프라이머 RV, 0.5μmol/L 의 M13 프라이머 M4 및 2.5 단위의 KOD 폴리메라제 (토요보세키사 제조) 를 사용하여 전체량 50μL 의 PCR 반응액을 조제하고, PCR 을 수행하였다. 반응 조건은 94℃ 에서 5 분간 가열한 후, 94℃ 에서 30 초간, 50℃ 에서 30 초간, 74℃ 에서 60 초간의 사이클을 25 사이클 수행하고, 74℃ 에서 5 분간 더 가열하였다. 이 반응액을 에탄올 침전한 후, 멸균수에 용해하고, 10 단위의 제한 효소 EcoRI 및 10 단위의 제한 효소 SpeI (타카라슈조사 제조) 를 사용하여 37℃ 에서 1 시간 반응시켰다. 이 반응액을 아가로스겔 전기 영동에 의해 분획하고, 약 0.47kb 의 EcoRI-SpeI 단편을 약 0.3㎍ 회수하였다.
다음으로, 3㎍ 의 플라스미드 pBluescript II SK(－) (스트라타진사 제조) 에, 10 단위의 제한 효소 EcoRI 및 10 단위의 제한 효소 SpeI 를 37℃ 에서 1 시간반응시켰다. 이 반응액을 아가로스겔 전기 영동에 의해 분획하고, 약 2.9kb 의 EcoRI-SpeI 단편을 약 2.9㎍ 회수하였다.
다음으로, 상기에서 얻어진 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 VH 를 코드하는 PCR 산물의 EcoRI-SpeI 단편 0.1㎍ 과 플라스미드 pBluescript II SK(－) 의 EcoRI-SpeI 단편 0.1㎍ 을 전체량 10μL 의 멸균수에 첨가하고, 라이게이션 하이를 사용하여 연결하였다. 이렇게 하여 얻어진 재조합 플라스미드 DNA 용액을 사용하여 대장균 DH5α주 (토요보세키사 제조) 를 형질 전환하고, 형질 전환주의 10 개의 클론으로부터 각 플라스미드 DNA 를 조제하고, 빅 다이 터미네이터 키트 버전 2 및 DNA 시퀀서를 사용하여 염기 서열을 해석하였다. 염기 서열을 해석한 결과, 목적하는 염기 서열을 갖는 도 22 에 나타낸 플라스미드 pKM1334HV0 를 얻었다.
또한, 참조예 2 의 1. (1) 에서 설계한 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 VH 의 아미노산 서열 HV.6 을 코드하는 DNA 를, 상기 HV.0 을 코드하는 DNA 와 동일하게 하여 설계하고 (서열 번호 27), 서열 번호 28 ∼ 31 에 나타내는 서열로 이루어지는 4 개의 합성 DNA (젠세트사 제조) 를 사용하여 상기와 동일하게 하여 PCR 에 의해 구축하였다. pKM1334HV0 와 동일한 과정을 취하고, HV.6 을 코드하는 DNA 를 함유하는 플라스미드 pKM1334HV6 을 얻었다.
(3) 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 VL 을 코드하는 DNA 의 구축
참고예 2 의 1. (1) 에서 설계한 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 VL 의 아미노산 서열 LV.0 을 코드하는 DNA 를 HV.0 을 코드하는 DNA 와 동일하게 하여 설계하였다 (서열 번호 32). 단, 합성 DNA 의 설계시, 분비 시그널 서열로는 항FGF-8 중화 마우스 항체 KM1334 의 L 쇄의 분비 시그널 서열 (서열 번호 4 의 1 ∼ 19 번쩨의 아미노산 서열) 을 사용하였다. HV.0 을 코드하는 DNA 와 동일하게 하여 각각 서열 번호 33 ∼ 36 의 서열로 이루어지는 4 개의 합성 DNA (젠세트사 제조) 를 사용한 PCR 에 의해, LV.0 을 코드하는 DNA 를 구축하였다. pKM1334HV0 와 동일한 과정을 취하고, LV.0 을 코드하는 DNA 를 함유하는 플라스미드 pKM1334HV0 를 얻었다.
또한, 참고예 2 의 1. (1) 에서 설계한 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 VL 의 아미노산 서열 LV.6 을 코드하는 DNA 를 LV.0 을 코드하는 DNA 와 동일하게 하여 설계하고 (서열 번호 37), 각각 서열 번호 38 ∼ 41 의 서열로 이루어지는 4 개의 합성 DNA (젠세트사 제조) 를 사용하여 상기와 동일하게 하여 PCR 에 의해 구축하였다. pKM1334HV0 와 동일한 과정을 취하고, LV.6 을 코드하는 DNA 를 함유하는 플라스미드 pKM1334LV6 을 얻었다.
2. 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체 발현 벡터의 구축
WO97/10354 에 기재된 인간화 항체 발현용 벡터 pKANTEX93 과 참고예 2 의 1. (2) 및 (3) 에서 얻어진 플라스미드 pKM1334HV0 및 pKM1334LV0 를 사용하여 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체 발현 벡터 pKANTEX1334HV0LV0 를 이하와 같이 구축하였다.
참고예 2 의 1. (2) 에서 얻어진 플라스미드 pKM1334HV0 의 3㎍ 에, 10 단위의 제한 효소 ApaI 및 10 단위의 제한 효소 NotI (타카라슈조사 제조) 를 사용하여 37℃ 에서 1 시간 반응시켰다. 이 반응액을 아가로스겔 전기 영동에 의해 분획하고, 약 0.47kb 의 ApaI-NotI 단편을 약 0.3㎍ 회수하였다.
다음으로, 인간화 항체 발현용 벡터 pKANTEX93 의 3㎍ 에, 10 단위의 제한 효소 ApaI 및 10 단위의 제한 효소 NotI 를 37℃ 에서 1 시간 반응시켰다. 이 반응액을 아가로스겔 전기 영동에 의해 분획하고, 약 12.8kb 의 ApaI-NotI 단편을 약 2㎍ 회수하였다.
다음으로, 상기에서 얻어진 pKM1334HV0 유래의 NotI-ApaI 단편 0.1㎍ 과 플라스미드 pKANTEX93 유래의 NotI-ApaI 단편 0.1㎍ 을 전체량 10μL 의 멸균수에 첨가하고, 라이게이션 하이를 사용하여 연결하였다. 이렇게 하여 얻어진 재조합 프라스미드 DNA 용액을 사용하여 대장균 DH5α주를 형질 전환하고, 도 23 에 나타낸 플라스미드 pKANTEX1334HV0 를 얻었다.
다음으로, 참고예 2 의 1. (3) 에서 얻어진 플라스미드 pKM1334LV0 의 3㎍ 에, 10 단위의 제한 효소 EcoRI 및 10 단위의 제한 효소 BsiWI 를 37℃ 에서 1 시간 반응시켰다. 이 반응액을 아가로스겔 전기 영동에 의해 분획하고, 약 0.45kb 의 EcoRI-BsiWI 단편을 약 0.3㎍ 회수하였다.
다음으로, 상기에서 얻어진 플라스미드 pKANTEX1334HV0 의 3㎍ 에, 10 단위의 제한 효소 EcoRI 및 제한 효소 BsiWI 를 37℃ 에서 1 시간 반응시켰다. 이 반응액을 아가로스겔 전기 영동에 의해 분획하고, 약 13.30kb 의 EcoRI-BsiWI 단편을 약 2㎍ 회수하였다.
다음으로, 상기에서 얻어진 pKM1334LV0 유래의 EcoRI-BsiWI 단편 0.1㎍ 과 플라스미드 pKANTEX1334HV0 유래의 EcoRI-BsiWI 단편 0.1㎍ 을 전체량 10μL 의 멸균수에 첨가하고, 라이게이션 하이를 사용하여 연결하였다. 이렇게 하여 얻어진 재조합 플라스미드 DNA 용액을 사용하여 대장균 DH5α주를 형질 전환하고, 도 24 에 나타내는 발현 벡터 pKANTEX1334HV0LV0 를 얻었다.
얻어진 플라스미드의 400ng 에 대해 빅 다이 터미네이터 키트 버전 2 및 DNA 시퀀서를 사용하여 염기 서열을 해석한 결과, 목적하는 DNA 가 클로닝된 플라스미드가 얻어진 것을 확인하였다.
또한, 참고예 2 의 1. (2) 에서 얻어진 플라스미드 pKM1334HV0 및 참고예 2 의 1. (3) 에서 얻어진 플라스미드 pKM1334LV6 를 사용하여 상기와 동일한 방법에 의해 발현 벡터 pKANTEX1334HV0LV6 을 구축하였다.
또한, 참고예 2 의 1. (2) 에서 얻어진 플라스미드 pKM1334HV6 및 참고예 2 의 1. (3) 에서 얻어진 플라스미드 pKM1334HV6 을 사용하여 상기와 동일한 방법에 의해 발현 벡터 pKANTEX1334HV6LV6 을 구축하였다.
3. 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 YB2/0 세포를 사용한 안정 발현
참고예 2 의 2. 에서 얻어진 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체 발현 벡터 pKANTEX1334HV0LV0, pKANTEX1334HV0LV6, pKANTEX1334HV6LV6 을 각각 사용하여 각종 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 YB2/0 세포에서의 안정 발현을 상기 참고예 1 의 2. (5) 에 기재된 방법에 따라 수행하였다.
4. 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 정제
참고예 2 의 3. 에서 얻어진 각종 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체를 발현하는 YB2/0 세포 유래의 형질 전환주의 배양 및 상청으로부터의 항 FGF-8 중화 CDR 이식항체의 정제를 상기 참고예 1 의 3. (2) 에 기재된 방법에 따라 수행하였다. pKANTEX1334HV0LV0 를 도입한 형질 전환주 유래의 항체를 HV0LV0, pKANTEX1334HV0LV6 를 도입한 형질 전환주 유래의 항체를 HV0LV6, pKANTEX1334HV6LV6 를 도입한 형질 전환주 유래의 항체를 HV6LV6 으로 각각 명명하였다.
5. 정제한 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 해석
참고예 2 의 4. 에서 얻어진 각종 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 SDS-PAGE 를 상기 참고예 1 의 4. 에 기재된 방법에 따라 수행하였다. 그 결과, 모든 항체가 올바른 구조의 항체 분자로서 발현되고, 또한 정제된 것이 확인되었다.
6. ELISA 에 의한 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 FGF-8 에 대한 결합 활성의 측정
참고예 2 의 4. 에서 얻어진 각종 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 FGF-8 에 대한 결합 활성은 상기 참고예 1 의 2. (6) 에 기재된 ELISA 에 의해 측정하였다. 양성 대조로서 참고예 1 의 3. (2) 에서 얻어진 YB2/0 세포 유래의 항 FGF-8 중화 키메라 항체 KM3334 를 사용하였다. 그 결과를 도 24 에 나타냈다. 도 25 에 나타낸 바와 같이 모든 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체가 KM3334 와 동등한 FGF-8 결합 활성을 나타내고, CDR 이식화에 의한 명확한 결합 활성의 저하는 관찰되지 않았다.
7. 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 FGF-8 에 대한 결합 활성의 측정
참고예 2 의 4. 에서 얻어진 각종 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 FGF-8 에대한 결합 활성을 보다 상세하게 검토하기 위해, BIAcore 2000 [비아코어 (BIACORE) 사 제조] 을 사용하여 각종 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 FGF-8 에 대한 결합 활성을 이하와 같이 하여 측정, 비교하였다. 양성 대조로서, 참고예 1 의 3. (2) 에서 얻어진 YB2/0 세포 유래의 항 FGF-8 중화 키메라 항체 KM3334 를 사용하였다.
이하, 샘플의 희석 및 측정 중의 완충액으로서는 HBS-EP (비아코어사 제조) 를 사용하였다. 먼저, 센서 칩 CM5 (비아코아사 제조) 를 세팅하고, 10m㏖/L 아세트산 완충액 (pH4.0) 을 사용하여 31.25㎍/mL 로 용해한 FGF-8 (R&D 사 제조) 을 아민 커플링법에 의해 센서 센서 칩 표면에 고정화하였다. 공명 시그널 (RU) 을 지표로 한 고정화량은 4498RU 였다.
FGF-8 고정화 플로 셀에 20μL/분의 유속으로, 각종 항체 용액을 60μL 첨가하고, 그 후 3 분간에 걸쳐 해리 반응을 모니터하였다. 해리 반응 후, 20μL 의 10m㏖/L 글리신-염산 용액 (pH 1.5) 을 2 회 연속하여 플로 셀에 첨가하고, 칩표면에 재생시켰다. 이 사이클을 각종 농도 (50-0.068㎍/mL) 의 항체 용액에 대해 수행하고, 각종 농도에서의 센서 그램을 얻었다. 각각의 항체의 센서 그램은 음성 대조로서 GD3 에 대한 키메라 항체 KM871 (Shitara K. et al., Cancer Immunol. Immunother., 36, 373-380, 1993) 을 사용하여 얻어진 센서 그램을 뺌으로써 특이적인 반응의 센서 그램으로 하였다. 도 25 에 50㎍/mL 의 각종 항체의 센서 그램을 나타냈다. 센서 그램을 통해 알 수 있는 바와 같이, 모든 항체가 해리 반응시에 거의 해리가 관찰되지 않아 정확한 해리 속도 정수를 구하기가어려웠다. 그래서, 각종 항체의 결합 활성의 비교는 결합 반응시의 결합 [공명 시그널 (RU)] 의 높이를 비교함으로써 수행하였다. 그 결과, 도 25 에 나타낸 바와 같이, 키메라 항체 KM3334 가 가장 높은 결합 활성을 나타내고, CDR 이식 항체 HV0V6 은 KM3334 와 동등한 높은 결합 반응을 나타냈다. 한편, CDR 이식 항체 HV0LV0 및 HV6LV6 은 KM3334 및 HV0LV6 과 비교하여 약간 낮은 결합 활성을 나타냈다. 이상의 결과는 ELISA 에서는 관찰되지 않았던 항체 간의 결합 활성의 비교가 BIAcore 2000 을 사용함으로써 가능한 것, 그리고 VL 의 FR 의 6 아미노산 잔기의 개변에 의해 CDR 이식 항체의 결합 활성이 키메라 항체와 동등 레벨로 회복하는 것을 나타낸다. 또한, VH 의 FR 의 6 아미노산 잔기에 대해서는 결합 활성의 회복에 대한 효과는 관찰되지 않았다.
키메라 항체 KM3334 와 동등한 높은 결합 반응을 나타낸 YB2/0 세포 유래의 CDR 이식 항체 HV0LV6 을 KM8037 으로 명명하고, 또한 KM8037 을 고발현하는 YB2/0 세포 유래의 형질 전환 세포주도 동일하게 KM8037 로 명명하였다. 형질 전환 세포주 KM8037 은 평성 14 년 6 월 20 일자로 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터 (우편 번호 305-8566 일본국 이바라키켕 츠쿠바시 히가시 1 쵸메 1-1 중앙 제 6) 에 FERM BP-8084 로서 기탁되어 있다.
참고예 3
보다 면역원성이 낮은 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 제작 (1)
참고예 2 의 결과를 통해, VL 의 FR 에 마우스 항체 KM1334 유래의 6 아미노산 잔기의 개변을 갖는 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체 HV0LV6 은 키메라 항체와 동등한 결합 활성을 나타내는 것을 알 수 있었다. 그래서, 추가로 이들 6 잔기의 활성 회복에 대한 효과를 검토하고, 충분한 활성을 갖고, 또한 마우스 항체 유래의 아미노산 잔기가 적고, 보다 면역원성의 저하가 기대되는 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 제작을 이하와 같이 하여 수행하였다.
1. VL 의 아미노산 서열의 설계
상기 6 아미노 잔기에 대해 이하와 같은 개변을 갖는 6 종류의 VL 의 아미노산 서열을 설계하였다. 모두 LV.0 의 아미노산 잔기로부터의 개변을 나타냈다.
VL.4-1 에서는 2 번째의 Ile, 50 번째의 Gln, 51 번째의 Leu, 92 번째의 Tyr 의 4 잔기를 각각 마우스 항체 KM1334 에 관찰되는 아미노산 잔기인 Val, Lys, Val, Phe 로 개변하였다.
LV.4-2 에서는 2 번째의 Ile, 14 번째의 Thr, 15 번째의 Pro, 92 번째의 Tyr 의 4 잔기를 각각 마우스 항체 KM1334 에 관찰되는 아미노산 잔기인 Val, Ser, Leu, Phe 로 개변하였다.
LV.3-1 에서는 2 번째의 Ile, 51 번째의 Leu, 92 번째의 Tyr 의 3 잔기를 각각 마우스 항체 KM1334 에 관찰되는 아미노산 잔기인 Val, Val, Phe 로 개변하였다.
LV.3-2 에서는 14 번째의 Thr, 15 번째의 Pro, 92 번째의 Tyr 의 3 잔기를 각각 마우스 항체 KM1334 에 관찰되는 아미노산 잔기인 Ser, Leu, Phe 로 개변하였다.
LV.2-1 에서는 51 번째의 Leu, 92 번째의 Tyr 의 2 잔기를 각각 마우스 항체KM1334 에 관찰되는 아미노산 잔기인 Val, Phe 로 개변하였다.
LV.2-2 에서는 2 번째의 Ile, 92 번째의 Tyr 의 2 잔기를 각각 마우스 항체 KM1334 에 관찰되는 아미노산 잔기인 Val, Phe 로 개변하였다.
LV.4-1, LV.4-2, LV.3-1, LV.3-2, LV.2-1, LV.2-2 의 아미노산 서열을 각각 서열 번호 42 ∼ 47 에 나타냈다.
2. VL 을 코드하는 DNA 의 구축
참고예 3 의 1. 에서 설계한 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 각종 VL 의 아미노산 서열을 코드하는 DNA 는 이하와 같이 하여 구축하였다.
(1) VL.4-1 을 코드하는 DNA 의 구축
LV.4-1 을 코드하는 DNA 는 각각 서열 번호 38, 34, 40, 41 의 서열로 이루어지는 4 개의 합성 DNA (젠세트사 제조) 를 사용하여 참고예 2 의 1. (3) 에 기재된 방법에 따라 구축하였다. 그 결과, LV-4-1 을 코드하는 DNA 를 함유하는 플라스미드 pKM1334LV4-1 을 얻었다.
(2) LV.3-1 을 코드하는 DNA 의 구축
참고예 2 의 1. (3) 에서 얻어진 플라스미드 pKM1334LV6 의 50ng 를 주형으로 하고, M13 프라이머 RV 및 서열 번호 48 의 염기 서열로 이루어지는 합성 DNA (젠세트사 제조) 를 프라이머로 하여 최종 농도 0.3μmol/L 가 되도록 첨가하고, KOD 폴리메라제에 첨부된 사용 설명서에 따라 전체량 50μL 에서 먼저 94℃ 에서 2 분간 가열한 후, 94℃ 에서 15 초간, 50℃ 에서 30 초간, 68℃ 에서 1 분간의 조건의 사이클로 35 사이클의 PCR 을 수행하였다. 이 반응액을 정제한 후, 멸균수에 용해하고, 10 단위의 제한 효소 KpnI (타카라슈조사 제조) 및 10 단위의 제한 효소 SpeI 를 사용하여 37℃ 에서 1 시간 반응시켰다. 이 반응액을 아가로스겔 전기 영동에 의해 분획하고, 약 0.22kb 의 KpnI-SpeI 단편을 약 0.3㎍ 회수하였다.
다음으로, 참고예 3 의 2. (1) 에서 얻어진 플라스미드 pKM1334LV4-1 의 3㎍ 을 10 단위의 제한 효소 KpnI 를 사용하여 37℃ 에서 1 시간 반응시켰다. 이 반응액을 아가로스겔 전기 영동에 의해 분획하고, 약 0.21kb 의 KpnI 단편을 약 0.2㎍ 회수하였다.
또한, 3㎍ 의 플라스미드 pBluescript II SK(－) 에, 10 단위의 제한 효소 KpnI 및 10 단위의 제한 효소 SpeI 를 37℃ 에서 1 시간 반응시켰다. 이 반응액을 아가로스겔 전기 영동에 의해 분획하고, 약 2.95kb 의 KpnI-SpeI 단편을 약 2㎍ 회수하였다.
상기에서 얻어진 VL DNA 의 KpnI-SpeI 단편 0.1㎍, 플라스미드 pKM1334LV4-1 유래의 KpnI 단편 0.1㎍, 및 플라스미드 pBluescript II SK(－) 유래의 KpnI-SpeI 단편 0.1㎍ 을 전체량 10μL 의 멸균수에 첨가하고 라이게이션 하이를 사용하여 연결하였다. 이렇게 하여 얻어진 재조합 플라스미드 DNA 용액을 사용하여 대장균 DH5α주를 형질 전환하고, 도 26 에 나타낸 LV.3-1 을 코드하는 DNA 를 함유하는 플라스미드 pKM1334LV3-1 을 얻었다.
(3) LV.2-1 을 코드하는 DNA 의 구축
플라스미드 pKM1334LV4-1 대신에 참고예 2 의 1. (3) 에서 얻어진 플라스미드 pKM1334LV0 을 사용하는 것 이외에는 참고예 3 의 2. (1) 에 기재된 방법과 동일한 방법으로, LV.2-1 을 코드하는 DNA 를 함유하는 플라스미드 pKM1334LV2-1 을 얻었다.
(4) LV.2-2 를 코드하는 DNA 의 구축
프라이머로서 서열 번호 48 에 기재된 합성 DNA 대신에 서열 번호 49 에 기재된 합성 DNA 를 사용하는 것 이외에는 참고예 3 의 2. (1) 에 기재된 방법과 동일한 방법으로 LV.2-2 를 코드하는 DNA 를 함유하는 플라스미드 pKM1334LV2-2 를 얻었다.
(5) LV.4-2 를 코드하는 DNA 의 구축
참고예 3 의 2. (4) 에서 얻어진 플라스미드 pKM1334LV2-2 의 3㎍ 를 10 단위의 제한 효소 KpnI 를 사용하여 37℃ 에서 1 시간 반응시켰다. 이 반응액을 아가로스겔 전기 영동에 의해 분획하고, 약 3.16kb 의 KpnI 단편을 약 2㎍ 회수하였다.
다음으로, 참고예 2 의 1. (3) 에서 얻어진 플라스미드 pKM1334LV6 의 3㎍ 를 10 단위의 제한 효소 KpnI 를 사용하여 37℃ 에서 1 시간 반응시켰다. 이 반응액을 아가로스겔 전기 영동에 의해 분획하고, 약 0.21kb 의 KpnI 단편을 약 0.2㎍ 회수하였다.
상기에서 얻어진 플라스미드 pKM1334LV2-2 유래의 KpnI 단편 0.1㎍ 과 플라스미드 pKM1334LV6 유래의 KpnI 단편 0.1㎍ 을 전체량 10㎕ 의 멸균수에 첨가하고, 라이게이션 하이를 사용하여 연결하였다. 이렇게 하여 얻어진 재조합 플라스미드 DNA 용액을 사용하여 대장균 DH5α주를 형질 전환하고, 도 27 에 나타낸 VL.4-2를 코드하는 DNA 를 함유하는 플라스미드 pKM1334LV4-2 를 얻었다.
(6) LV.3-2 를 코드하는 DNA 의 구축
참고예 3 의 2. (5) 에서 얻어진 플라스미드 pKM1334LV4-2 의 3㎍ 에, 10 단위의 제한 효소 Tth111I (타카라슈조사 제조) 및 XmnI (뉴 잉글랜드 바이오랩스사 제조) 을 37℃ 에서 1 시간 반응시켰다. 이 반응액을 아가로스겔 전기 영동에 의해 분획하고, 약 2.24kb 의 Tth111I-XmnI 단편을 약 2㎍ 회수하였다.
다음으로, 참고예 2 의 1. (3) 에서 얻어진 플라스미드 pKM1334LV0 의 3㎍ 에, 10 단위의 제한 효소 Tth111I 및 XmnI 을 37℃ 에서 1 시간 반응시켰다. 이 반응액을 아가로스겔 전기 영동에 의해 분획하고, 약 1.11kb 의 Tth111I-XmnI 단편을 약 1㎍ 회수하였다.
상기에서 얻어진 플라스미드 pKM1334LV4-2 유래의 Tth111I-XmnI 단편 0.1㎍ 과 플라스미드 pKM1334LV0 유래의 Tth111I-XmnI 단편 0.1㎍ 을 전체량 10㎕ 의 멸균수에 첨가하고, 라이게이션 하이를 사용하여 연결하였다. 이렇게 하여 얻어진 재조합 플라스미드 DNA 용액을 사용하여 대장균 DH5α주를 형질 전환하고, 도 28 에 나타낸 LV.3-2 를 코드하는 DNA 를 함유하는 플라스미드 pKM1334LV3-2 를 얻었다.
3. 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체 발현 벡터의 구축
참고예 2.2 에서 얻어진 발현 벡터 pKANTEX1334HV0LV6 의 VL 을 코드하는 DNA 를 함유하는 EcoRI-BsiWI 단편을 참고예 3 의 2. 에서 구축한 각종 VL 을 코드하는 DNA 를 함유하는 EcoRI-BsiWI 단편으로 치환함으로써, 각종 VL 을 코드하는DNA 를 갖는 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체 발현 벡터를 구축하였다. 구체적으로는 pKANTEX1334HV0LV4-1, pKANTEX1334HV0LV4-2, pKANTEX1334HV0LV3-1, pKANTEX1334HV0LV3-2, pKANTEX1334HV0LV2-1, pKANTEX1334HV0LV2-2 의 6 종류를 구축하였다.
4. 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 CHO/DG44 세포를 사용한 안정 발현
참고예 2 의 2. 에서 얻어진 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체 발현 벡터 pKANTEX1334HV0LV0 및 pKANTEX1334HV0LV6, 참고예 3 의 3. 에서 얻어진 각종 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체 발현 벡터를 사용하여 각종 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 CHO/DG44 세포에서의 안정 발현을 상기 참고예 1 의 2. (4) 에 기재된 방법에 따라 수행하였다.
5. 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 정제
참고예 3 의 4 항에서 얻어진 각종 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체를 발현하는 CHO/DG44 세포 유래의 형질 전환주의 배양 및 상청으로부터의 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 정제를 상기 참고예 1 의 3. (1) 에 기재된 방법에 따라 수행하였다.
pKANTEX1334HV0LV0 을 도입한 형질 전환주 유래의 항체를 HV0LV0/CHO,
pKANTEX1334HV0LV6 을 도입한 형질 전환주 유래의 항체를 HV0LV6/CHO,
pKANTEX1334HV0LV4-1 을 도입한 형질 전환주 유래의 항체를 HV0LV4-1/CHO,
pKANTEX1334HV0LV4-2 를 도입한 형질 전환주 유래의 항체를 HV0LV4-2/CHO,
pKANTEX1334HV0LV3-1 을 도입한 형질 전환주 유래의 항체를 HV0LV3-1/CHO,
pKANTEX1334HV0LV3-2 를 도입한 형질 전환주 유래의 항체를 HV0LV3-2/CHO,
pKANTEX1334HV0LV2-1 을 도입한 형질 전환주 유래의 항체를 HV0LV2-1/CHO,
pKANTEX1334HV0LV2-2 를 도입한 형질 전환주 유래의 항체를 HV0LV2-2/CHO 라고 명명하였다.
6. 정제한 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 해석
참고예 3 의 5. 에서 얻어진 각종 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 SDS-PAGE 를 상기 참고예 1 의 4. 에 기재된 방법에 따라 수행하였다. 그 결과, 모든 항체가 올바른 구조의 항체 분자로서 발현되고, 또한 정제된 것이 확인되었다.
7. BIAcore 바이오센서에 의한 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 FGF-8 에 대한 결합 활성의 측정
참고예 3 의 5. 에서 얻어진 각종 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 FGF-8 에 대한 결합 활성을 보다 상세하게 검토하기 위해, BIAcore 2000 을 사용하여 각종 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 FGF-8 에 대한 결합 활성을 FGF-8 의 부분 펩티드인 화합물 1 의 C 말단을 비오틴 표지한 것을 사용하여 이하와 같이 하여 측정, 비교하였다. 양성 대조로서 참고예 1 의 3. (1) 에서 얻어진 CHO/DG44 세포 유래의 항 FGF-8 중화 키메라 항체 KM3034 를 사용하였다.
이하, 샘플의 희석 및 측정 중의 완충액으로서는 HBS-EP 를 사용하였다. 먼저, 센서 칩 SA (비아코어사 제조) 를 세팅하고, 5μL/min 의 유속으로 0.05㎍/mL 에 조제한 C 말단에 비오틴 표지 화합물 1 을 5μL 첨가하였다. 그 후, 5㎕ 의 10m㏖/L 글리신-염산 용액 (pH1.5) 를 2 회 연속하여 첨가하고, 칩 표면을 세정하였다. FGF-8 펩티드의 고정화량은 35RU 였다.
FGF-8 펩티드 고정화 플로 셀에 20μL/분의 유속으로, 각종 항체 용액을 60μL 첨가하고, 그 후 3 분간에 걸쳐 해리 반응을 모니터하였다. 해리 반응 후, 20μL 의 10m㏖/L 글리신-염산 용액 (pH 1.5) 를 2 회 연속하여 플로 셀에 첨가하고, 칩표면에 재생시켰다. 이 사이클을 각종 농도 (50-1.85㎍/mL) 의 항체 용액에 대해 수행하고, 각종 농도에서의 센서 그램을 얻었다. 각각의 항체의 센서 그램은 음성 대조로서 GD3 에 대한 키메라 항체 KM871 을 사용하여 얻어진 센서 그램을 뺌으로써 특이적인 반응의 센서 그램으로 하였다.
도 29 에 16.7㎍/mL 의 각종 항체의 센서 그램을 나타냈다. 센서 그램을 통해 알 수 있는 바와 같이, 모든 항체가 해리 반응시에 거의 해리가 관찰되지 않아 정확한 해리 속도 정수를 구하기가 어려웠다. 그래서, 각종 항체의 결합 활성의 비교는 결합 반응시의 결합 [공명 시그널 (RU)] 의 높이를 비교함으로써 수행하였다.
그 결과, 도 29 에 나타낸 바와 같이 키메라 항체 KM3034 및 HV0LV6/CHO 가 가장 높은 결합 반응을 나타내고, 이어서 HV0LV3-1/CHO, HV0LV4-1/CHO, HV0LV2-1/CHO 가 높은 결합 반응을 나타냈다. 한편, HV0LV3-2/CHO, HV0LV2-2/CHO, HV0LV4-2/CHO 는 낮은 결합 반응을 나타내고, HV0LV0/CHO 는 가장 낮은 결합 반응을 나타냈다. 이들 결과는 참고예 2. 7 에 기재된 YB2/0 세포 유래의 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체를 사용한 결과와 일치하였다.
8. 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 FGF-8 에 대한 중화 활성의 측정
참고예 3 의 7 항에 있어서 FGF-8 에 대한 높은 결합 반응이 확인된 4 종류의 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체 HV0HV0LV6/CHO, HV0LV3-1/CHO, HV0LV4-1/CHO, HV0LV2-1/CHO 의 FGF-8 중화 활성의 평가를 참고예 2 의 5 항에 기재된 방법에 따라 수행하였다. 양성 대조로서 참고예 1 의 3 항 (1) 에서 얻어진 CHO/DG44 세포 유래의 항 FGF-8 중화 키메라 항체 KM3034 를, 음성 대조로서 WO01/64754 에 기재된 인간 케모카인 CCR4 에 대한 키메라 항체 KM2760 을 사용하였다. 그 결과를 도 30 에 나타냈다. 도 31 에 나타낸 바와 같이, HV0LV6/CHO 는 키메라 항체 KM3034 와 동등한 FGF-8 중화 활성을 나타내고, 이어서 HV0LV3-1/CHO 가 높은 FGF-8 중화 활성을 나타냈다. HV0LV4-1/CHO 는 HV0LV3-1/CHO 에 비해 약간 낮은 FGF-8 중화 활성을 나타내고, HV0LV2-1/CHO 의 중화 활성이 가장 낮았다. FGF-8 중화 활성의 강도와 BIAcore 에 의한 결합 반응의 강도는 상관 관계에 있음이 관찰되었다.
참고예 4
보다 면역원성이 낮은 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 제작 (2)
참고예 3 의 결과로부터, LV6 의 6 아미노산 잔기의 개변 중, 51 번째의 개변은 활성 회복에 필수임이 확인되었다. 또한, 2 번째의 개변은 단독 개변에서는 활성 회복에 대한 효과는 작지만 51 번째의 개변과의 조합에 의해 협조적으로 활성 회복에 기여하는 것이 시사되었다. 14 번째, 15 번째의 개변에 대해서도 51 번째의 개변과의 조합에 의해, 협조적으로 활성 회복에 기여하는 것이 시사되었다. 한편 50 번째의 개변의 효과는 작은 것이 시사되었다. 그래서, 2 번째의 개변과 14 번째, 15 번째의 개변 중 어느 것이 활성 회복에 대한 효과가 높은지를 검토하기 위해, 또한 92 번째의 개변 효과를 검토하기 위해 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 제작을 재검토하였다.
1. VL 의 아미노산 서열의 재설계
이하와 같은 개변을 갖는 2 종류의 VL 의 아미노산 서열을 설계하였다. 모두 LV.0 의 아미노산 잔기로부터의 개변을 나타냈다.
LV.4-3 에서는 14 번째의 Thr, 15 번째의 Pro, 51 번째의 Leu, 92 번째의 Tyr 의 4 잔기를 각각 마우스 항체 KM1334 에 관찰되는 아미노산 잔기인 Ser, Leu, Val, Phe 로 개변하였다.
LV.3-3 에서는 14 번째의 Thr, 15 번째의 Pro, 51 번째의 Leu 의 3 잔기를 각각 마우스 항체 KM1334 에 관찰되는 아미노산 잔기인 Ser, Leu, Val 로 개변하였다.
LV.4-3 에서는 아미노산 서열을 서열 번호 50 에, LV.3-3 의 아미노산 서열을 서열 번호 51 에 각각 나타냈다.
2. VL 을 코드하는 DNA 의 구축
참고예 4 의 1. 에서 설계한 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 각종 VL 의 아미노산 서열을 코드하는 DNA 는 이하와 같이 하여 구축하였다.
(1) LV.4-3 을 코드하는 DNA 의 구축
참고예 3 의 2. (5) 에 기재된 방법에 따라 구축하였다. 단, 플라스미드 pKM1334LV2-2 대신에 참고예 3 의 2. (3) 에서 얻어진 플라스미드 pKM1334LV2-1 을 사용하고, 플라스미드 pKM1334LV6 대신에 참고예 3 의 2. (6) 에서 얻어진 플라스미드 pKM1334LV3-2 를 사용하였다. 그 결과 LV.4-3 을 코드하는 DNA 를 포함하는 플라스미드 pKM1334LV4-3 을 얻었다.
(2) LV.3-3 을 코드하는 DNA 의 구축
참고예 4 의 2. (1) 에서 얻어진 플라스미드 pKM1334LV4-3 의 3㎍ 을 10 단위의 제한 효소 BamHI (타카라슈조사 제조) 및 10 단위의 제한 효소 SpeI 를 사용하여 37℃ 에서 1 시간 반응시켰다. 이 반응액을 아가로스겔 전기 영동에 의해 분획하고, 약 3.23kb 의 BamHI-SpeI 단편을 약 2.5㎍ 회수하였다.
다음으로, 참고예 2 의 1. (3) 에서 얻어진 플라스미드 pKM1334LV0 의 3㎍ 을 10 단위의 제한 효소 BamHI 및 10 단위의 제한 효소 SpeI 를 사용하여 37℃ 에서 1 시간 반응시켰다. 이 반응액을 아가로스겔 전기 영동에 의해 분획하고, 약 0.13kb 의 BamHI-SpeI 단편을 약 0.15㎍ 회수하였다.
상기에서 얻어진 플라스미드 pKM1334LV4-3 유래의BamHI-SpeI 단편 0.1㎍ 과 플라스미드 pKM1334LV0 유래의 BamHI-SpeI 단편 0.1㎍ 을 전체량 10㎕ 의 멸균수에 첨가하고, 라이게이션 하이를 사용하여 연결하였다. 이렇게 하여 얻어진 재조합 플라스미드 DNA 용액을 사용하여 대장균 DH5α주를 형질 전환하고, 도 31 에 나타낸 LV.3-3 을 코드하는 DNA 를 함유하는 플라스미드 pKM1334LV3-3 을 얻었다.
3. 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체 발현 벡터의 구축
참고예 2 의 2. 에서 얻어진 발현 벡터 pKANTEX1334HV0LV6 의 VL 을 코드하는 DNA 를 함유하는 EcoRI-BsiWI 단편을 참고예 4 의 2. 에서 구축한 각종 VL 을 코드하는 DNA 를 함유하는 EcoRI-BsiWI 단편으로 치환함으로써, 각종 VL 을 코드하는 DNA 를 갖는 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체 발현 벡터를 구축하였다. 구체적으로는 pKANTEX1334HV0LV4-3, pKANTEX1334HV0LV3-3 의 2 종류를 구축하였다.
4. 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 CHO/DG44 세포를 사용한 안정 발현
참고예 4 의 3. 에서 얻어진 각종 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체 발현 벡터를 사용하여 각종 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 CHO/DG44 세포에서의 안정 발현을 상기 참고예 1 의 2. (4) 에 기재된 방법에 따라 수행하였다.
5. 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 정제
참고예 4 의 4. 에서 얻어진 각종 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체를 발현하는 CHO/DG44 세포 유래의 형질 전환주의 배양 및 상청으로부터의 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 정제를 상기 참고예 1 의 3. (1) 에 기재된 방법에 따라 수행하였다. pKANTEX1334HV0LV4-3 을 도입한 형질 전환주 유래의 항체를 HV0LV4-3/CHO, pKANTEX1334HV0LV3-3 을 도입한 형질 전환주 유래의 항체를 HV0LV3-3/CHO 로 명명하였다.
6. 정제한 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 해석
참고예 4 의 5. 에서 얻어진 각종 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 SDS-PAGE 를 상기 참고예 1 의 4. 에 기재된 방법에 따라 수행하였다. 그 결과, 어느 항체나 올바른 구조의 항체 분자로서 발현되고, 또한 정제된 것이 확인되었다.
7. 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 FGF-8 에 대한 결합 활성의 측정
참고예 3 의 5. 에서 얻어진 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체 HV0LV6/CHO 및 HV0LV3-1/CHO, 참고예 4 의 5. 에서 얻어진 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체 HV0LV4-3/CHO 및 HV0LV3-3/CHO 의 FGF-8 에 대한 결합 활성을 참고예 3 의 7. 에 기재된 방법에 따라 측정하였다. 양성 대조로서 참고예 1 의 3. (1) 에서 얻어진 CHO/DG44 세포 유래의 항 FGF-8 중화 키메라 항체 KM3034 를 사용하였다.
도 32 에 16.7㎍/mL 의 각종 항체의 센서 그램을 나타냈다. 센서 그램을 통해 알 수 있는 바와 같이, 어느 항체나 해리 반응시에 거의 해리가 관찰되지 않아 정확한 해리 속도 정수를 구하기가 어려웠다. 그래서, 각종 항체의 결합 활성의 비교는 결합 반응시의 결합 [공명 시그널 (RU)] 의 높이를 비교함으로써 수행하였다. 그 결과, 도 33 에 나타내는 바와 같이, 키메라 항체 KM3034 가 가장 높은 결합 반응을 나타내고, HV0LV4-3/CHO 는 HV0LV3-1/CHO 보다 높고, HV0LV6/CHO 와 동등한 결합 반응을 나타냈다. HV0LV3-3/CHO 의 결합 반응은 HV0LV3-1/CHO 보다 낮았다. 이상의 결과를 통해, 결합 반응의 높이에 관해서는 2 번째의 개변보다 14 번째, 15 번째의 개변이 보다 협조적으로 작용하는 것, 또한 92 번째의 개변은 활성의 회복에 필수인 것이 시사되었다.
8. 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 FGF-8 에 대한 중화 활성의 측정
참고예 3 의 5. 에서 얻어진 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체 HV0LV6/CHO 및 HV0LV3-1/CHO, 참고예 4 의 5. 에서 얻어진 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체 HV0LV4-3/CHO 및 HV0LV3-3/CHO 의 FGF-8 중화 활성의 평가를 참고예 2 의 5. 에 기재된 방법에 따라 수행하였다. 양성 대조로서 참고예 1 의 3. (1) 에서 얻어진 CHO/DG44 세포 유래의 항 FGF-8 중화 키메라 항체 KM3034 를, 음성 대조로서 WO01/64754 에 기재된 인간 케모카인 CCR4 에 대한 키메라 항체 KM2760 을 사용하였다. 그 결과를 도 33 에 나타냈다. 도 33 에 나타내는 바와 같이 HV0LV6/CHO 및 HV0LV3-1/CHO 는 키메라 항체 KM3034 와 동등한 FGF-8 중화 활성을 나타냈다. 한편, HV0LV4-3/CHO 및 HV0LV3-3/CHO 는 동등한 중화 활성을 나타내고, 그 활성은 키메라 항체 KM3034 에 비해 1/2 정도였다. HVOL3-1/CHO 와 HV0LV4-3/CHO 의 중화 활성은 BIAcore 에서의 결합 반응의 높이와 상관하지 않고, 2 번째의 아미노산 잔기와 14 번째, 15 번째의 아미노산 잔기는 FGF-8 에 대한 결합 활성과 세포에 대한 FGF-8 중화 활성에 있어서 독립된 영향을 미치는 것이 시사되었다.
이상의 각종 평가 결과를 통해, 키메라 항체 KM3034 와 동등한 높은 결합 반응 및 FGF-8 중화 활성을 나타낸 CHO/DG44 세포 유래의 CDR 이식 항체 HV0LV6/CHO 를 KM8034 로 명명하고, 또한 KM8034 를 고발현하는 CHO/DG44 세포 유래의 형질 전환 세포 클론도 동일하게 KM8034 로 명명하였다. 또한, KM8034 와 동등한 높은 결합 반응을 나타낸 CHO/DG44 세포 유래의 CDR 이식 항체 HV0LV4-3/CHO 를 KM8035 로 명명하고, 또한 KM8035 를 고발현하는 CHO/DG44 세포 유래의 형질 전환 세포주도 동일하게 KM8035 로 명명하였다. KM8035 의 VL 의 아미노산 서열 LV.4-3 을 서열 번호 38 에 나타냈다. 또 형질 전환 세포주 KM8035 는 평성 14 년 6 월 20 일자로 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터 (우편 번호 305-8566 일본국 이바라키켕 츠쿠바시 히가시 1 쵸메 1-1 중앙 제 6) 에 FERM BP-8082 로서 기탁되어 있다. 또한, KM8034 와 동등한 높은 FGF-8 중화 활성을 나타낸 CHO/DG44 세포 유래의 CDR 이식 항체 HV0LV3-1/CHO 를 KM8036 으로 명명하였고, 또한 KM8036 을 고발현하는 CHO/DG44 세포 유래의 형질 전환 세포주도 동일하게 KM8036 으로 명명하였다. KM8036 의 VL 의 아미노산 서열 LV.3-1 을 서열 번호 39 에 나타냈다. 또, 형질 전환 세포주 KM8036 은 평성 14 년 6 월 20 일자로 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터 (우편 번호 305-8566 일본국 이바라키켕 츠쿠바시 히가시 1 쵸메 1-1 중앙 제 6) 에 FERM BP-8083 으로서 기탁되어 있다.
항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체 KM8034 는 키메라 항체 KM3034 와 동등한 높은 결합 반응 및 FGF-8 중화 활성을 나타내고, 또한 인간에서의 면역원성이 키메라 항체보다 저하된다는 점에서 키메라 항체보다 높은 치료 효과가 기대된다. 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체 KM8036 및 KM8035 에서는 KM8034 에 비해 결합 활성 및 FGF-8 중화 활성이 약간 저하될 가능성이 있으나, 각각 마우스 항체 KM1334 에 유래하는 V 영역 FR 의 아미노산 잔기가 3 잔기 및 4 잔기로 된다는 점에서 KM8034 보다 더욱 면역원성이 저하되는 것이 기대된다.
본 발명에 의해 항 FGF-8 중화 항체를 유효 성분으로 함유하는, 관절염 예방약 또는 치료약, 연골 보호제, 관절 파괴 억제제, 활막 증식 억제제, 및 항 FGF-8 항체를 유효 성분으로 함유하는 관절염의 진단약 그리고 이 항체를 사용한 관절염의 판정 방법이 제공된다.
[서열 목록]
서열 번호 13 - KM1334 의 VH 의 증폭을 위한 프라이머
서열 번호 14 - KM1334 의 VH 의 증폭을 위한 프라이머
서열 번호 15 - KM1334 의 VL 의 증폭을 위한 프라이머
서열 번호 16 - KM1334 의 VH 의 증폭을 위한 프라이머
서열 번호 17 - C 말단에 시스테인 잔기를 부가한 인간 FGF-8 의 펩티드 (23 ∼ 46 번째의 아미노산 잔기)
서열 번호 18 - 설계된 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 VH 의 아미노산 서열, HV.0
서열 번호 19 - 설계된 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 VL 의 아미노산 서열, LV.0
서열 번호 20 - 설계된 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 VH 의 아미노산 서열, HV.6
서열 번호 21 - 설계된 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 VL 의 아미노산 서열, LV.6
서열 번호 22 - HV.0 을 코드하는 DNA
서열 번호 23 - HV.0 을 코드하는 DNA 의 구축을 위한 합성 DNA
서열 번호 24 - HV.0 을 코드하는 DNA 의 구축을 위한 합성 DNA
서열 번호 25 - HV.0 을 코드하는 DNA 의 구축을 위한 합성 DNA
서열 번호 26 - HV.0 을 코드하는 DNA 의 구축을 위한 합성 DNA
서열 번호 27 - HV.6 을 코드하는 DNA
서열 번호 28 - HV.6 을 코드하는 DNA 의 구축을 위한 합성 DNA
서열 번호 29 - HV.6 을 코드하는 DNA 의 구축을 위한 합성 DNA
서열 번호 30 - HV.6 을 코드하는 DNA 의 구축을 위한 합성 DNA
서열 번호 31 - HV.6 을 코드하는 DNA 의 구축을 위한 합성 DNA
서열 번호 32 - LV.0 을 코드하는 DNA
서열 번호 33 - LV.0 을 코드하는 DNA 의 구축을 위한 합성 DNA
서열 번호 34 - LV.0 을 코드하는 DNA 의 구축을 위한 합성 DNA
서열 번호 35 - LV.0 을 코드하는 DNA 의 구축을 위한 합성 DNA
서열 번호 36 - LV.0 을 코드하는 DNA 의 구축을 위한 합성 DNA
서열 번호 37 - LV.6 을 코드하는 DNA
서열 번호 38 - LV.6 을 코드하는 DNA 의 구축을 위한 합성 DNA
서열 번호 39 - LV.6 을 코드하는 DNA 의 구축을 위한 합성 DNA
서열 번호 40 - LV.6 을 코드하는 DNA 의 구축을 위한 합성 DNA
서열 번호 41 - LV.6 을 코드하는 DNA 의 구축을 위한 합성 DNA
서열 번호 42 - 설계된 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 VL 의 아미노산 서열, LV.4-1
서열 번호 43 - 설계된 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 VL 의 아미노산 서열, LV.4-2
서열 번호 44 - 설계된 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 VL 의 아미노산 서열, LV.3-1
서열 번호 45 - 설계된 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 VL 의 아미노산 서열, LV.3-2
서열 번호 46 - 설계된 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 VL 의 아미노산 서열, LV.2-1
서열 번호 47 - 설계된 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 VL 의 아미노산 서열, LV.2-2
서열 번호 48 - LV.3-1 을 코드하는 DNA 의 구축을 위한 프라이머
서열 번호 49 - LV.2-2 를 코드하는 DNA 의 구축을 위한 프라이머
서열 번호 50 - 설계된 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 VL 의 아미노산 서열, LV.4-3
서열 번호 51 - 설계된 항 FGF-8 중화 CDR 이식 항체의 VL 의 아미노산 서열, LV.3-3
SEQUENCE LISTING <110> KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD <120> Therapeutic agent for arthritis <130> 1442 <150> JP2001-400677 <151> 2001-12-28 <160> 51 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 420 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <223> Inventor: Tamura, Tadafumi; Uchii, Masako; Toshio, Suda Inventor: Ichiro, Miki; Akira, Tanaka <220> <221> source <222> (1)..(420) <223> /organism="Mus musculus" <220> <221> CDS <222> (1)..(420) <220> <221> sig_peptide <222> (1)..(57) <400> 1 atg gaa tgg atc tgg atc ttt ctc ttc ttc ctc tca gga act aca ggt 48 Met Glu Trp Ile Trp Ile Phe Leu Phe Phe Leu Ser Gly Thr Thr Gly 1 5 10 15 gtc tac tcc cag gtt cag ctg cag cag tct gga gct gag gtg gcg agg 96 Val Tyr Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Arg 20 25 30 ccc ggg gct tca gtg aaa ctg tcc tgc aag gct tct ggc tac acc ttc 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 act gac tac tat cta aac tgg gtg aag cag agg tct gga cag ggc ctt 192 Thr Asp Tyr Tyr Leu Asn Trp Val Lys Gln Arg Ser Gly Gln Gly Leu 50 55 60 gag tgg att gga gag att gat cct gga agt gat agt ata tat tat aat 240 Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asp Pro Gly Ser Asp Ser Ile Tyr Tyr Asn 65 70 75 80 gaa aac ttg gag ggc agg gcc aca ctg act gca gac aaa tcc tcc agc 288 Glu Asn Leu Glu Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 aca gcc tac atg cag ctc aac agc ctg aca tct gag gac tct gca gtc 336 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 tat ttc tgt gca aga tat ggg tat tct aga tac gac gta agg ttt gtc 384 Tyr Phe Cys Ala Arg Tyr Gly Tyr Ser Arg Tyr Asp Val Arg Phe Val 115 120 125 tac tgg ggc caa ggg act ctg gtc act gtc tct aca 420 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Thr 130 135 140 <210> 2 <211> 140 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(19) <400> 2 Met Glu Trp Ile Trp Ile Phe Leu Phe Phe Leu Ser Gly Thr Thr Gly 1 5 10 15 Val Tyr Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Arg 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Tyr Leu Asn Trp Val Lys Gln Arg Ser Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asp Pro Gly Ser Asp Ser Ile Tyr Tyr Asn 65 70 75 80 Glu Asn Leu Glu Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Phe Cys Ala Arg Tyr Gly Tyr Ser Arg Tyr Asp Val Arg Phe Val 115 120 125 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Thr 130 135 140 <210> 3 <211> 393 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> source <222> (1)..(393) <223> /organism="Mus musculus" <220> <221> CDS <222> (1)..(393) <220> <221> signal_peptide <222> (1)..(57) <400> 3 atg aag ttg cct gtt agg ctg ttg gtg ctg atg ttc tgg att cct gct 48 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala 1 5 10 15 tcc agg agt gat gtt ttg atg acc caa act cca ctc tcc ctg cct gtc 96 Ser Arg Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val 20 25 30 agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tct agt cag agt ctt 144 Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu 35 40 45 gta cat agt aat gga aga acc tat tta gaa tgg tac ctg cag aaa cct 192 Val His Ser Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro 50 55 60 ggc cag tca cca aag gtc ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga att tct 240 Gly Gln Ser Pro Lys Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser 65 70 75 80 ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggg aca gat ttc aca 288 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 ctc aaa atc agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga gtt tat ttc tgc 336 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys 100 105 110 ttt cag ggt tca cat gtt ccg tac acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg 384 Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 gaa ata aaa 393 Glu Ile Lys 130 <210> 4 <211> 131 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(19) <400> 4 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala 1 5 10 15 Ser Arg Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val 20 25 30 Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu 35 40 45 Val His Ser Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro 50 55 60 Gly Gln Ser Pro Lys Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser 65 70 75 80 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys 100 105 110 Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Ile Lys 130 <210> 5 <211> 121 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Leu Asn Trp Val Lys Gln Arg Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Gly Ser Asp Ser Ile Tyr Tyr Asn Glu Asn Leu 50 55 60 Glu Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Gly Tyr Ser Arg Tyr Asp Val Arg Phe Val Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Thr 115 120 <210> 6 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Asp Tyr Tyr Leu Asn 1 5 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Glu Ile Asp Pro Gly Ser Asp Ser Ile Tyr Tyr Asn Glu Asn Leu Glu 1 5 10 15 Gly <210> 9 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9 Tyr Gly Tyr Ser Arg Tyr Asp Val Arg Phe Val Tyr 1 5 10 <210> 10 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 10 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Glu 1 5 10 15 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 11 Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12 Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr 1 5 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a primer for amplification of KM1334 VH <400> 13 ctgaattcgc ggccgctagt cc 22 <210> 14 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a primer for amplification of KM1334 VH <400> 14 atgggccctt ggtggaggct gtagagacag tgaccagag 39 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a primer for amplification of KM1334 VL <400> 15 ctgaattcgc ggccgctgct gt 22 <210> 16 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a primer for amplification of KM1334 VL <400> 16 atcgtacgtt ttatttccag cttggtcc 28 <210> 17 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> human FGF-8 peptide (amino acis residues 23-46) added an cystein residue at its C-terminus <400> 17 Gln Val Thr Val Gln Ser Ser Pro Asn Phe Thr Gln His Val Arg Glu 1 5 10 15 Gln Ser Leu Val Thr Asp Gln Leu Cys 20 25 <210> 18 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HV.0, a designed amino acid sequence of VH of an anti-FGF-8 CDR-grafted neutralizing antibody <400> 18 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Gly Ser Asp Ser Ile Tyr Tyr Asn Glu Asn Leu 50 55 60 Glu Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Gly Tyr Ser Arg Tyr Asp Val Arg Phe Val Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 19 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> LV.0, a designed amino acid sequence of VL of an anti-FGF-8 CDR-grafted neutralizing antibody <400> 19 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 20 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HV.6, a designed amino acid sequence of VH of an anti-FGF-8 CDR-grafted neutralizing antibody <400> 20 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Leu Asn Trp Val Arg Gln Arg Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Gly Ser Asp Ser Ile Tyr Tyr Asn Glu Asn Leu 50 55 60 Glu Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Gly Tyr Ser Arg Tyr Asp Val Arg Phe Val Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 21 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> LV.6, a designed amino acid sequence of VL of an anti-FGF-8 CDR-grafted neutralizing antibody <400> 21 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 22 <211> 504 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a DNA encoding HV.0 <220> <221> CDS <222> (47)..(466) <220> <221> sig_peptide <222> (47)..(103) <400> 22 caggaaacag ctatgacgaa ttcgcggccg cacactgact ctaacc atg gaa tgg 55 Met Glu Trp atc tgg atc ttt ctc ttc ttc ctc tca gga act aca ggt gtc tac tcc 103 Ile Trp Ile Phe Leu Phe Phe Leu Ser Gly Thr Thr Gly Val Tyr Ser -15 -10 -5 -1 cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag ccc ggg gcc 151 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag gtc tcc tgc aag gct tct gga tac acc ttc act gac tac 199 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 tat cta aac tgg gtg cgg cag gcc ccc gga caa ggg ctt gag tgg atg 247 Tyr Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 gga gag atc gat cct gga agt gat agt ata tat tat aat gaa aac ttg 295 Gly Glu Ile Asp Pro Gly Ser Asp Ser Ile Tyr Tyr Asn Glu Asn Leu 50 55 60 gag ggc aga gtc acg att acc gcg gac aca tcc acg agc aca gcc tac 343 Glu Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gag ctg agc agc ctg aga tct gag gac acg gcc gtg tat tac tgt 391 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg aga tat ggg tat tct aga tac gac gta agg ttt gtc tac tgg ggc 439 Ala Arg Tyr Gly Tyr Ser Arg Tyr Asp Val Arg Phe Val Tyr Trp Gly 100 105 110 cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca gcctccacca agggcccact 486 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 agtcgtgact gggaaaac 504 <210> 23 <211> 141 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a synthetic DNA for construction of a DNA encoding HV.0 <400> 23 caggaaacag ctatgacgaa ttcgcggccg cacactgact ctaaccatgg aatggatctg 60 gatctttctc ttcttcctct caggaactac aggtgtctac tcccaggtgc agctggtgca 120 gtctggggct gaggtgaaga a 141 <210> 24 <211> 141 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a synthetic DNA for construction of a DNA encoding HV.0 <400> 24 aggatcgatc tctcccatcc actcaagccc ttgtccgggg gcctgccgca cccagtttag 60 atagtagtca gtgaaggtgt atccagaagc cttgcaggag accttcactg aggccccggg 120 cttcttcacc tcagccccag a 141 <210> 25 <211> 141 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a synthetic DNA for construction of a DNA encoding HV.0 <400> 25 ggatgggaga gatcgatcct ggaagtgata gtatatatta taatgaaaac ttggagggca 60 gagtcacgat taccgcggac acatccacga gcacagccta catggagctg agcagcctga 120 gatctgagga cacggccgtg t 141 <210> 26 <211> 141 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a synthetic DNA for construction of a DNA encoding HV.0 <400> 26 gttttcccag tcacgactag tgggcccttg gtggaggctg aggagacggt gaccagggtt 60 ccctggcccc agtagacaaa ccttacgtcg tatctagaat acccatatct cgcacagtaa 120 tacacggccg tgtcctcaga t 141 <210> 27 <211> 504 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a DNA encoding HV.6 <220> <221> CDS <222> (47)..(466) <220> <221> sig_peptide <222> (47)..(103) <400> 27 caggaaacag ctatgacgaa ttcgcggccg cacactgact ctaacc atg gaa tgg 55 Met Glu Trp atc tgg atc ttt ctc ttc ttc ctc tca gga act aca ggt gtc tac tcc 103 Ile Trp Ile Phe Leu Phe Phe Leu Ser Gly Thr Thr Gly Val Tyr Ser -15 -10 -5 -1 cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg gcg agg ccc ggg gcc 151 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag gtc tcc tgc aag gct tct gga tac acc ttc act gac tac 199 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 tat cta aac tgg gtg cgg cag agg tct gga caa ggg ctt gag tgg att 247 Tyr Leu Asn Trp Val Arg Gln Arg Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga gag atc gat cct gga agt gat agt ata tat tat aat gaa aac ttg 295 Gly Glu Ile Asp Pro Gly Ser Asp Ser Ile Tyr Tyr Asn Glu Asn Leu 50 55 60 gag ggc aga gtc acg att acc gcg gac aca tcc acg agc aca gcc tac 343 Glu Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gag ctg agc agc ctg aga tct gag gac acg gcc gtg tat ttc tgt 391 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 gcg aga tat ggg tat tct aga tac gac gta agg ttt gtc tac tgg ggc 439 Ala Arg Tyr Gly Tyr Ser Arg Tyr Asp Val Arg Phe Val Tyr Trp Gly 100 105 110 cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca gcctccacca agggcccact 486 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 agtcgtgact gggaaaac 504 <210> 28 <211> 141 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a synthetic DNA for construction of a DNA encoding HV.6 <400> 28 caggaaacag ctatgacgaa ttcgcggccg cacactgact ctaaccatgg aatggatctg 60 gatctttctc ttcttcctct caggaactac aggtgtctac tcccaggtgc agctggtgca 120 gtctggggct gaggtggcga g 141 <210> 29 <211> 141 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a synthetic DNA for construction of a DNA encoding HV.6 <400> 29 aggatcgatc tctccaatcc actcaagccc ttgtccagac ctctgccgca cccagtttag 60 atagtagtca gtgaaggtgt atccagaagc cttgcaggag accttcactg aggccccggg 120 cctcgccacc tcagccccag a 141 <210> 30 <211> 141 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a synthetic DNA for construction of a DNA encoding HV.6 <400> 30 ggattggaga gatcgatcct ggaagtgata gtatatatta taatgaaaac ttggagggca 60 gagtcacgat taccgcggac acatccacga gcacagccta catggagctg agcagcctga 120 gatctgagga cacggccgtg t 141 <210> 31 <211> 141 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a synthetic DNA for construction of a DNA encoding HV.6 <400> 31 gttttcccag tcacgactag tgggcccttg gtggaggctg aggagacggt gaccagggtt 60 ccctggcccc agtagacaaa ccttacgtcg tatctagaat acccatatct cgcacagaaa 120 tacacggccg tgtcctcaga t 141 <210> 32 <211> 459 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a DNA encoding LV.0 <220> <221> CDS <222> (40)..(432) <220> <221> sig_peptide <222> (40)..(96) <400> 32 caggaaacag ctatgacgaa ttcaggttgc ctcctcaaa atg aag ttg cct gtt 54 Met Lys Leu Pro Val -15 agg ctg ttg gtg ctg atg ttc tgg att cct gct tcc agg agt gat atc 102 Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala Ser Arg Ser Asp Ile -10 -5 -1 1 gtg atg act cag tct cca ctc tcc ctg ccc gtc acc cct gga gag ccg 150 Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro 5 10 15 gcc tcc atc tcc tgc aga tct agt cag agt ctt gta cat agt aat gga 198 Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly 20 25 30 aga acc tat tta gaa tgg tac ctg cag aag cca ggc cag tct cca cag 246 Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln 35 40 45 50 ctc ctg atc tat aaa gtt tcc aac cga att tct ggg gtc cca gac agg 294 Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser Gly Val Pro Asp Arg 55 60 65 ttc agt ggc agt gga tcc ggg aca gat ttc aca ctg aaa atc agc agg 342 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg 70 75 80 gtg gag gct gag gac gtc ggg gtt tat tac tgc ttt cag ggt tca cat 390 Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His 85 90 95 gtt ccg tac acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa 432 Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 cgtacgacta gtcgtgactg ggaaaac 459 <210> 33 <211> 130 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a synthetic DNA for construction of a DNA encoding LV.0 <400> 33 caggaaacag ctatgacgaa ttcaggttgc ctcctcaaaa tgaagttgcc tgttaggctg 60 ttggtgctga tgttctggat tcctgcttcc aggagtgata tcgtgatgac tcagtctcca 120 ctctccctgc 130 <210> 34 <211> 130 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a synthetic DNA for construction of a DNA encoding LV.0 <400> 34 agactggcct ggcttctgca ggtaccattc taaataggtt cttccattac tatgtacaag 60 actctgacta gatctgcagg agatggaggc cggctctcca ggggtgacgg gcagggagag 120 tggagactga 130 <210> 35 <211> 130 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a synthetic DNA for construction of a DNA encoding LV.0 <400> 35 tgcagaagcc aggccagtct ccacagctcc tgatctataa agtttccaac cgaatttctg 60 gggtcccaga caggttcagt ggcagtggat ccgggacaga tttcacactg aaaatcagca 120 gggtggaggc 130 <210> 36 <211> 129 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a synthetic DNA for construction of a DNA encoding LV.0 <400> 36 gttttcccag tcacgactag tcgtacgttt gatttccacc ttggtccctt ggccgaacgt 60 gtacggaaca tgtgaaccct gaaagcagta ataaaccccg acgtcctcag cctccaccct 120 gctgatttt 129 <210> 37 <211> 459 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a DNA encoding LV.6 <220> <221> CDS <222> (40)..(432) <220> <221> sig_peptide <222> (40)..(96) <400> 37 caggaaacag ctatgacgaa ttcaggttgc ctcctcaaa atg aag ttg cct gtt 54 Met Lys Leu Pro Val -15 agg ctg ttg gtg ctg atg ttc tgg att cct gct tcc agg agt gat gtt 102 Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala Ser Arg Ser Asp Val -10 -5 -1 1 gtg atg act cag tct cca ctc tcc ctg ccc gtc agt ctt gga gag ccg 150 Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Glu Pro 5 10 15 gcc tcc atc tcc tgc aga tct agt cag agt ctt gta cat agt aat gga 198 Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly 20 25 30 aga acc tat tta gaa tgg tac ctg cag aag cca ggc cag tct cca aag 246 Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys 35 40 45 50 gtc ctg atc tat aaa gtt tcc aac cga att tct ggg gtc cca gac agg 294 Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser Gly Val Pro Asp Arg 55 60 65 ttc agt ggc agt gga tcc ggg aca gat ttc aca ctg aaa atc agc agg 342 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg 70 75 80 gtg gag gct gag gac gtc ggg gtt tat ttc tgc ttt cag ggt tca cat 390 Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Gly Ser His 85 90 95 gtt ccg tac acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa 432 Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 120 125 130 cgtacgacta gtcgtgactg ggaaaac 459 <210> 38 <211> 130 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a synthetic DNA for construction of a DNA encoding LV.6 <400> 38 caggaaacag ctatgacgaa ttcaggttgc ctcctcaaaa tgaagttgcc tgttaggctg 60 ttggtgctga tgttctggat tcctgcttcc aggagtgatg ttgtgatgac tcagtctcca 120 ctctccctgc 130 <210> 39 <211> 130 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a synthetic DNA for construction of a DNA encoding LV.6 <400> 39 agactggcct ggcttctgca ggtaccattc taaataggtt cttccattac tatgtacaag 60 actctgacta gatctgcagg agatggaggc cggctctcca agactgacgg gcagggagag 120 tggagactga 130 <210> 40 <211> 130 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a synthetic DNA for construction of a DNA encoding LV.6 <400> 40 tgcagaagcc aggccagtct ccaaaggtcc tgatctataa agtttccaac cgaatttctg 60 gggtcccaga caggttcagt ggcagtggat ccgggacaga tttcacactg aaaatcagca 120 gggtggaggc 130 <210> 41 <211> 129 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a synthetic DNA for construction of a DNA encoding LV.6 <400> 41 gttttcccag tcacgactag tcgtacgttt gatttccacc ttggtccctt ggccgaacgt 60 gtacggaaca tgtgaaccct gaaagcagaa ataaaccccg acgtcctcag cctccaccct 120 gctgatttt 129 <210> 42 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> LV.4-1, a designed amino acid sequence of VL of an anti-FGF-8 CDR-grafted neutralizing antibody <400> 42 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 43 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LV.4-2, a designed amino acid sequence of VL of an anti-FGF-8 CDR-grafted neutralizing antibody <400> 43 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 44 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> LV.3-1, a designed amino acid sequence of VL of an anti-FGF-8 CDR-grafted neutralizing antibody <400> 44 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 45 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> LV.3-2, a designed amino acid sequence of VL of an anti-FGF-8 CDR-grafted neutralizing antibody <400> 45 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 46 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> LV.2-1, a designed amino acid sequence of VL of an anti-FGF-8 CDR-grafted neutralizing antibody <400> 46 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 47 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> LV.2-2, a designed amino acid sequence of VL of an anti-FGF-8 CDR-grafted neutralizing antibody <400> 47 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 48 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a primer for construction of DNA encoding LV.3-1 <400> 48 atggtacctg cagaagccag gccagtctcc acaggtcct 39 <210> 49 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a primer for construction of DNA encoding LV.2-2 <400> 49 atggtacctg cagaagccag gccagtctcc acagctcct 39 <210> 50 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> LV.4-3, a designed amino acid sequence of VL of an anti-FGF-8 CDR-grafted neutralizing antibody <400> 50 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 51 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> LV.3-3, a designed amino acid sequence of VL of an anti-FGF-8 CDR-grafted neutralizing antibody <400> 51 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110

Claims (51)

  1. FGF-8 에 특이적으로 결합하고, FGF-8 의 활성을 저해하는 항체를 유효 성분으로 함유하는 관절염 예방약 또는 치료약.
  2. 제 1 항에 있어서, FGF-8 에 특이적으로 결합하고, FGF-8 의 활성을 저해하는 항체가 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 의약.
  3. 제 2 항에 있어서, 모노클로날 항체가, 하이브리도마가 산생하는 항체, 인간화 항체, 및 이들 항체 단편으로부터 선택되는 항체인 의약.
  4. 제 3 항에 있어서, 하이브리도마가 하이브리도마 KM1334 (FERM BP-5451) 인 의약.
  5. 제 3 항에 있어서, 인간화 항체가 인간형 키메라 항체 또는 인간형 상보성 결정 영역 (CDR) 이식 항체인 의약.
  6. 제 5 항에 있어서, 인간형 키메라 항체가, FGF-8 에 특이적으로 결합하고, FGF-8 의 활성을 저해하는 모노클로날 항체의 항체 중쇄 가변 영역 (VH) 및 항체 경쇄 가변 영역 (VL), 그리고 인간 항체의 항체 중쇄 정상 영역 (CH) 및 항체 경쇄정상 영역 (CL) 으로 이루어지는 인간형 키메라 항체인 의약.
  7. 제 6 항에 있어서, 인간형 키메라 항체가 이하의 (a) ∼ (c) 중 어느 하나의 인간형 키메라 항체인 의약.
    (a) VH 가 서열 번호 5 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 키메라 항체
    (b) VL 이 서열 번호 6 으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 키메라 항체
    (c) VH 가 서열 번호 5 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL 이 서열 번호 6 으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 키메라 항체
  8. 제 7 항에 있어서, 인간형 키메라 항체가 형질 전환체 KM3034 (FERM BP-7836) 가 생산하는 인간형 키메라 항체인 의약.
  9. 제 5 항에 있어서, 인간형 CDR 이식 항체가, FGF-8 에 특이적으로 결합하고, FGF-8 의 활성을 저해하는 모노클로날 항체의 VH 및 VL 의 CDR 그리고 인간 항체의 CH 및 CL 을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체인 의약.
  10. 제 9 항에 있어서, 인간형 CDR 이식 항체가, FGF-8 에 특이적으로 결합하고, FGF-8 의 활성을 저해하는 모노클로날 항체의 VH 및 VL 의 CDR, 인간 항체의 VH 및VL 의 프레임 워크 영역 (FR), 그리고 인간 항체의 CH 및 CL 로 이루어지는 인간형 CDR 이식 항체인 의약.
  11. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, 인간형 CDR 이식 항체가 이하의 (a) ∼ (c) 중 어느 하나의 인간형 CDR 이식 항체인 의약.
    (a) VH 의 CDR1, CDR2 및 CDR3 이 각각 서열 번호 7, 8 및 9 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
    (b) VL 의 CDR1, CDR2 및 CDR3 이 각각 서열 번호 10, 11 및 12 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
    (c) VH 의 CDR1, CDR2 및 CDR3 이 각각 서열 번호 7, 8 및 9 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL 의 CDR1, CDR2 및 CDR3 이 각각 서열 번호 10, 11 및 12 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
  12. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, 인간형 CDR 이식 항체가 이하의 (a) ∼ (c) 중 어느 하나의 인간형 CDR 이식 항체인 의약.
    (a) VH 가 서열 번호 18 로 표시되는 아미노산 서열 중, 12 번째의 Lys, 13 번째의 Lys, 40 번째의 Ala, 41 번째의 Pro, 48 번째의 Met, 68 번째의 Val, 70 번째의 Ile, 74 번째의 Thr, 76 번째의 Thr, 82 번째의 Glu, 84 번째의 Ser, 87 번째의 Arg 및 95 번째의 Tyr 로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
    (b) VL 이 서열 번호 19 로 표시되는 아미노산 서열 중, 2 번째의 Ile, 3 번째의 Val, 14 번째의 Thr, 15 번째의 Pro, 50 번째의 Gln, 51 번째의 Leu 및 92 번째의 Tyr 로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
    (c) VH 가 서열 번호 18 로 표시되는 아미노산 서열 중, 12 번째의 Lys, 13 번째의 Lys, 40 번째의 Ala, 41 번째의 Pro, 48 번째의 Met, 68 번째의 Val, 70 번째의 Ile, 74 번째의 Thr, 76 번째의 Thr, 82 번째의 Glu, 84 번째의 Ser, 87 번째의 Arg 및 95 번째의 Tyr 로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL 이 서열 번호 19 로 표시되는 아미노산 서열 중, 2 번째의 Ile, 3 번째의 Val, 14 번째의 Thr, 15 번째의 Pro, 50 번째의 Gln, 51 번째의 Leu 및 92 번째의 Tyr 로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
  13. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, 인간형 CDR 이식 항체가 이하의 (a) ∼ (c) 중 어느 하나의 인간형 CDR 이식 항체인 의약.
    (a) VH 가 서열 번호 18 또는 20 으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
    (b) VL 이 서열 번호 19, 21, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 50 또는 51 로표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
    (c) VH 가 서열 번호 18 또는 20 으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL 이 서열 번호 19, 21, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 50 또는 51 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
  14. 제 13 항에 있어서, 인간형 CDR 이식 항체가 이하의 (a) ∼ (c) 중 어느 하나의 인간형 CDR 이식 항체인 의약.
    (a) VH 가 서열 번호 18 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL 이 서열 번호 21 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
    (b) VH 가 서열 번호 18 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL 이 서열 번호 44 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
    (c) VH 가 서열 번호 18 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL 이 서열 번호 50 으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
  15. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, 인간형 CDR 이식 항체가 이하의 (a) ∼ (c) 중 어느 하나의 인간형 CDR 이식 항체인 의약.
    (a) 형질 전환체 KM8037 (FERM BP-8084) 이 생산하는 인간형 CDR 이식 항체
    (b) 형질 전환체 KM8035 (FERM BP-8082) 가 생산하는 인간형 CDR 이식항체
    (c) 형질 전환체 KM8036 (FERM BP-8083) 이 생산하는 인간형 CDR 이식 항체
  16. 제 3 항에 있어서, 항체 단편이 Fab, Fab', F(ab')2, 1 본쇄 항체 (scFv), 2 량체화 가변 영역 (V 영역) 단편 (diabody), 디술피드 안정화 V 영역 단편 (dsFv) 및 CDR 을 포함하는 펩티드로부터 선택되는 항체 단편인 의약.
  17. FGF-8 에 특이적으로 결합하는 항체를 유효 성분으로 함유하는 관절염의 진단약.
  18. 제 17 항에 있어서, FGF-8 에 특이적으로 결합하는 항체가 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 진단약.
  19. 제 18 항에 있어서, 모노클로날 항체가, 하이브리도마가 산생하는 항체, 인간화 항체, 및 이들 항체 단편으로부터 선택되는 항체인 진단약.
  20. 제 19 항에 있어서, 하이브리도마가 하이브리도마 KM1334 (FERM BP-5451) 인 진단약.
  21. 제 19 항에 있어서, 인간화 항체가 인간형 키메라 항체 또는 인간형 CDR 이식 항체인 진단약.
  22. 제 21 항에 있어서, 인간형 키메라 항체가, FGF-8 에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체의 VH 및 VL, 그리고 인간 항체의 CH 및 CL 로 이루어지는 인간형 키메라 항체인 진단약.
  23. 제 22 항에 있어서, 인간형 키메라 항체가 이하의 (a) ∼ (c) 중 어느 하나의 인간형 키메라 항체인 진단약.
    (a) VH 가 서열 번호 5 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 키메라 항체
    (b) VL 이 서열 번호 6 으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 키메라 항체
    (c) VH 가 서열 번호 5 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL 이 서열 번호 6 으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 키메라 항체
  24. 제 23 항에 있어서, 인간형 키메라 항체가 형질 전환체 KM3034 (FERM BP-7836) 가 생산하는 인간형 키메라 항체인 진단약.
  25. 제 21 항에 있어서, 인간형 CDR 이식 항체가, FGF-8 에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체의 VH 및 VL 의 CDR 그리고 인간 항체의 CH 및 CL 을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체인 진단약.
  26. 제 25 항에 있어서, 인간형 CDR 이식 항체가, FGF-8 에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체의 VH 및 VL 의 CDR, 인간 항체의 VH 및 VL 의 FR, 그리고 인간 항체의 CH 및 CL 로 이루어지는 인간형 CDR 이식 항체인 진단약.
  27. 제 25 항 또는 제 26 항에 있어서, 인간형 CDR 이식 항체가 이하의 (a) ∼ (c) 중 어느 하나의 인간형 CDR 이식 항체인 진단약.
    (a) VH 의 CDR1, CDR2 및 CDR3 이 각각 서열 번호 7, 8 및 9 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
    (b) VL 의 CDR1, CDR2 및 CDR3 이 각각 서열 번호 10, 11 및 12 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
    (c) VH 의 CDR1, CDR2 및 CDR3 이 각각 서열 번호 7, 8 및 9 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL 의 CDR1, CDR2 및 CDR3 이 각각 서열 번호 10, 11 및 12 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
  28. 제 25 항 또는 제 26 항에 있어서, 인간형 CDR 이식 항체가 이하의 (a) ∼ (c) 중 어느 하나의 인간형 CDR 이식 항체인 진단약.
    (a) VH 가 서열 번호 18 로 표시되는 아미노산 서열 중, 12 번째의 Lys, 13 번째의 Lys, 40 번째의 Ala, 41 번째의 Pro, 48 번째의 Met, 68 번째의 Val, 70 번째의 Ile, 74 번째의 Thr, 76 번째의 Thr, 82 번째의 Glu, 84 번째의 Ser, 87 번째의 Arg 및 95 번째의 Tyr 로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
    (b) VL 이 서열 번호 19 로 표시되는 아미노산 서열 중, 2 번째의 Ile, 3 번째의 Val, 14 번째의 Thr, 15 번째의 Pro, 50 번째의 Gln, 51 번째의 Leu 및 92 번째의 Tyr 로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
    (c) VH 가 서열 번호 18 로 표시되는 아미노산 서열 중, 12 번째의 Lys, 13 번째의 Lys, 40 번째의 Ala, 41 번째의 Pro, 48 번째의 Met, 68 번째의 Val, 70 번째의 Ile, 74 번째의 Thr, 76 번째의 Thr, 82 번째의 Glu, 84 번째의 Ser, 87 번째의 Arg 및 95 번째의 Tyr 로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL 이 서열 번호 19 로 표시되는 아미노산 서열 중, 2 번째의 Ile, 3 번째의 Val, 14 번째의 Thr, 15 번째의 Pro, 50 번째의 Gln, 51 번째의 Leu 및 92 번째의 Tyr 로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
  29. 제 25 항 또는 제 26 항에 있어서, 인간형 CDR 이식 항체가 이하의 (a) ∼ (c) 중 어느 하나의 인간형 CDR 이식 항체인 진단약.
    (a) VH 가 서열 번호 18 또는 20 으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
    (b) VL 이 서열 번호 19, 21, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 50 또는 51 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
    (c) VH 가 서열 번호 18 또는 20 으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL 이 서열 번호 19, 21, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 50 또는 51 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
  30. 제 29 항에 있어서, 인간형 CDR 이식 항체가 이하의 (a) ∼ (c) 중 어느 하나의 인간형 CDR 이식 항체인 진단약.
    (a) VH 가 서열 번호 18 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL 이 서열 번호 21 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
    (b) VH 가 서열 번호 18 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL 이 서열 번호 44 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
    (c) VH 가 서열 번호 18 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL 이 서열 번호 50 으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
  31. 제 25 항 또는 제 26 항에 있어서, 인간형 CDR 이식 항체가 이하의 (a) ∼ (c) 중 어느 하나의 인간형 CDR 이식 항체인 진단약.
    (a) 형질 전환체 KM8037 (FERM BP-8084) 이 생산하는 인간형 CDR 이식 항체
    (b) 형질 전환체 KM8035 (FERM BP-8082) 가 생산하는 인간형 CDR 이식 항체
    (c) 형질 전환체 KM8036 (FERM BP-8083) 이 생산하는 인간형 CDR 이식 항체
  32. 제 19 항에 있어서, 항체 단편이 Fab, Fab', F(ab')2, 1 본쇄 항체 (scFv), 2 량체화 V 영역 단편 (diabody), 디술피드 안정화 V 영역 단편 (dsFv) 및 CDR 을 포함하는 펩티드로부터 선택되는 항체 단편인 진단약.
  33. FGF-8 에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 시료 중의 FGF-8 을 검출 및/또는 정량하는 것을 특징으로 하는 관절염의 판정 방법.
  34. 제 33 항에 있어서, FGF-8 에 특이적으로 결합하는 항체가 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 판정 방법.
  35. 제 34 항에 있어서, 모노클로날 항체가, 하이브리도마가 산생하는 항체, 인간화 항체, 및 이들 항체 단편으로부터 선택되는 항체인 판정 방법.
  36. 제 35 항에 있어서, 하이브리도마가 하이브리도마 KM1334 (FERM BP-5451) 인 판정 방법.
  37. 제 35 항에 있어서, 인간화 항체가 인간형 키메라 항체 또는 인간형 CDR 이식 항체인 판정 방법.
  38. 제 37 항에 있어서, 인간형 키메라 항체가, FGF-8 에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체의 VH 및 VL, 그리고 인간 항체의 CH 및 CL 로 이루어지는 인간형 키메라 항체인 판정 방법.
  39. 제 38 항에 있어서, 인간형 키메라 항체가 이하의 (a) ∼ (c) 중 어느 하나의 인간형 키메라 항체인 판정 방법.
    (a) VH 가 서열 번호 5 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 키메라 항체
    (b) VL 이 서열 번호 6 으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 키메라 항체
    (c) VH 가 서열 번호 5 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한VL 이 서열 번호 6 으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 키메라 항체
  40. 제 39 항에 있어서, 인간형 키메라 항체가 형질 전환체 KM3034 (FERM BP-7836) 가 생산하는 인간형 키메라 항체인 판정 방법.
  41. 제 37 항에 있어서, 인간형 CDR 이식 항체가, FGF-8 에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체의 VH 및 VL 의 CDR 그리고 인간 항체의 CH 및 CL 을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체인 판정 방법.
  42. 제 41 항에 있어서, 인간형 CDR 이식 항체가, FGF-8 에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체의 VH 및 VL 의 CDR, 인간 항체의 VH 및 VL 의 FR, 그리고 인간 항체의 CH 및 CL 로 이루어지는 인간형 CDR 이식 항체인 판정 방법.
  43. 제 41 항 또는 제 42 항에 있어서, 인간형 CDR 이식 항체가 이하의 (a) ∼ (c) 중 어느 하나의 인간형 CDR 이식 항체인 판정 방법.
    (a) VH 의 CDR1, CDR2 및 CDR3 이 각각 서열 번호 7, 8 및 9 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
    (b) VL 의 CDR1, CDR2 및 CDR3 이 각각 서열 번호 10, 11 및 12 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
    (c) VH 의 CDR1, CDR2 및 CDR3 이 각각 서열 번호 7, 8 및 9 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL 의 CDR1, CDR2 및 CDR3 이 각각 서열 번호 10, 11 및 12 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
  44. 제 41 항 또는 제 42 항에 있어서, 인간형 CDR 이식 항체가 이하의 (a) ∼ (c) 중 어느 하나의 인간형 CDR 이식 항체인 판정 방법.
    (a) VH 가 서열 번호 18 로 표시되는 아미노산 서열 중, 12 번째의 Lys, 13 번째의 Lys, 40 번째의 Ala, 41 번째의 Pro, 48 번째의 Met, 68 번째의 Val, 70 번째의 Ile, 74 번째의 Thr, 76 번째의 Thr, 82 번째의 Glu, 84 번째의 Ser, 87 번째의 Arg 및 95 번째의 Tyr 로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
    (b) VL 이 서열 번호 19 로 표시되는 아미노산 서열 중, 2 번째의 Ile, 3 번째의 Val, 14 번째의 Thr, 15 번째의 Pro, 50 번째의 Gln, 51 번째의 Leu 및 92 번째의 Tyr 로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
    (c) VH 가 서열 번호 18 로 표시되는 아미노산 서열 중, 12 번째의 Lys, 13 번째의 Lys, 40 번째의 Ala, 41 번째의 Pro, 48 번째의 Met, 68 번째의 Val, 70 번째의 Ile, 74 번째의 Thr, 76 번째의 Thr, 82 번째의 Glu, 84 번째의 Ser, 87 번째의 Arg 및 95 번째의 Tyr 로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL 이 서열 번호 19 로 표시되는 아미노산 서열 중, 2 번째의 Ile, 3 번째의 Val, 14 번째의 Thr, 15 번째의 Pro, 50 번째의 Gln, 51 번째의 Leu 및 92 번째의 Tyr 로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
  45. 제 41 항 또는 제 42 항에 있어서, 인간형 CDR 이식 항체가 이하의 (a) ∼ (c) 중 어느 하나의 인간형 CDR 이식 항체인 판정 방법.
    (a) VH 가 서열 번호 18 또는 20 으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
    (b) VL 이 서열 번호 19, 21, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 50 또는 51 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
    (c) VH 가 서열 번호 18 또는 20 으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL 이 서열 번호 19, 21, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 50 또는 51 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
  46. 제 45 항에 있어서, 인간형 CDR 이식 항체가 이하의 (a) ∼ (c) 중 어느 하나의 인간형 CDR 이식 항체인 판정 방법.
    (a) VH 가 서열 번호 18 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL 이 서열 번호 21 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
    (b) VH 가 서열 번호 18 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한VL 이 서열 번호 44 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
    (c) VH 가 서열 번호 18 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VL 이 서열 번호 50 으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 CDR 이식 항체
  47. 제 41 항 또는 제 42 항에 있어서, 인간형 CDR 이식 항체가 이하의 (a) ∼ (c) 중 어느 하나의 인간형 CDR 이식 항체인 판정 방법.
    (a) 형질 전환체 KM8037 (FERM BP-8084) 이 생산하는 인간형 CDR 이식 항체
    (b) 형질 전환체 KM8035 (FERM BP-8082) 가 생산하는 인간형 CDR 이식 항체
    (c) 형질 전환체 KM8036 (FERM BP-8083) 이 생산하는 인간형 CDR 이식 항체
  48. 제 35 항에 있어서, 항체 단편이 Fab, Fab', F(ab')2, 1 본쇄 항체 (scFv), 2 량체화 V 영역 단편 (diabody), 디술피드 안정화 V 영역 단편 (dsFv) 및 CDR 을 포함하는 펩티드로부터 선택되는 항체 단편인 판정 방법.
  49. FGF-8 에 특이적으로 결합하고, FGF-8 의 활성을 저해하는 항체를 유효 성분으로 함유하는 관절 파괴 억제제.
  50. FGF-8 에 특이적으로 결합하고, FGF-8 의 활성을 저해하는 항체를 유효 성분으로 함유하는 연골 보호제.
  51. FGF-8 에 특이적으로 결합하고, FGF-8 의 활성을 저해하는 항체를 유효 성분으로 함유하는 활막 증식 억제제.
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