ES2323949T3 - Anticuerpos anti-fgf-8 para tratar la artritis. - Google Patents
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Abstract
Un anticuerpo que se une específicamente a FGF-8 inhibiendo la actividad de FGF-8 para su uso en la prevención o tratamiento de la artritis.
Description
Anticuerpos
anti-FGF-8 para tratar la
artritis.
La presente invención se refiere a un agente
para prevenir o tratar la artritis, un agente para inhibir la
destrucción de la articulación, un agente para proteger el
cartílago, un agente para inhibir el crecimiento de la membrana
sinovial y un agente diagnóstico para la artritis que comprende un
anticuerpo anti-FGF-8 como
ingrediente activo, así como un método para evaluar la artritis
utilizando el anticuerpo.
El número de personas que tienen síntomas de
artropatía ha aumentado seguramente en la sociedad que envejece. Es
muy importante realizar la diagnosis temprana o el escrutinio de
enfermedades tales como la osteoartritis y la artritis reumatoide
como enfermedades articulares típicas o el análisis prognóstico
exacto de los pacientes, y su tratamiento conduce a la mejora de la
calidad de vida de muchas personas mayores. No obstante, todavía no
se han establecido métodos diagnósticos y terapéuticos
satisfactorios.
El cartílago articular es un tejido que
comprende un pequeño número de condrocitos que cubren la superficie
móvil de la articulación y una gran cantidad de matriz extracelular.
Los vasos sanguíneos o los nervios no están distribuidos allí, y
los nutrientes se suministran principalmente desde un fluido
sinovial producido a partir de la membrana sinovial que cubre la
superficie interna de la articulación. Adicionalmente, no sólo es
avascular sino que también muestra una fuerte resistencia a la
invasión de vasos sanguíneos desde los tejidos periféricos ricos en
vasoganglión. Los condrocitos controlan complejamente la síntesis y
la degradación de la matriz extracelular jugando un papel principal
en el mantenimiento de la homeostasis de la matriz extracelular.
Factores químicos tales como las citoquinas y los factores de
crecimiento y factores dinámicos tales como la carga de peso actúan
sobre los condrocitos y cambian el equilibrio de la síntesis y la
degradación de la matriz extracelular influyendo en el metabolismo
de la matriz extracelular.
La osteoartritis está causada por el
envejecimiento o por tensiones mecánicas induciendo de ese modo la
interrupción de la superficie del cartílago articular acompañada de
crecimiento de nuevos cartílagos alrededor de las articulaciones,
deformación de las articulaciones y falta de adaptabilidad y
condiciendo a inflamación de las membranas sinoviales de las
articulaciones. La osteoartritis es una enfermedad monoartrítica con
desnaturalización retardada del cartílago articular, y sus
características son dolores frecuentes y pérdida funcional (Manek M.
J. y Lane N. E., Am. Fam. Physician, 61, 1795-1804,
2000).
En la artritis reumatoide, las células
inflamatorias invaden las membranas sinoviales debido a anomalías
inmunológicas o enfermedades infecciosas, y el crecimiento de
fibroblastos sinoviales progresa de acuerdo con la angiogenesis
formando un tejido de granulación sinovial inflamatorio denominado
pannus. Cuando se forma el pannus, prosigue la destrucción de
huesos o cartílagos ocasionando un trastorno irreversible en las
articulaciones. Durante la destrucción de huesos o cartílagos, se
degradan diversas matrices extracelulares presente en grandes
cantidades, tales como colágeno y proteoglicano.
En enfermedades articulares tales como la
osteoartritis y la artritis reumatoide, la sinovitis y la
destrucción de la matriz extracelular conducen a la pérdida
funcional de cartílagos articulares.
La osteoartritis y la artritis reumatoide son
enfermedades bastante diferentes, pero tienen muchos puntos en
común en el mecanismo de destrucción de cartílago articular. Muchos
tipos de metaloproteasas de la matriz se producen y secretan en el
fluido articular sinovial y porciones articulares tales como la
membrana sinovial y el cartílago, y las metaloproteasas de la
matriz se detectan en exceso en las porciones articulares. Las
metaloproteasas de la matriz degradan muchos tipos de matriz
extracelular, que es una causa de destrucción articular. Se
producen no sólo a partir de membranas sinoviales inflamadas,
macrofagos y neutrófilos sino también a partir de condrocitos. Esta
producción está controlada por diferentes citoquinas producidas o
secretadas en las mismas porciones articulares, aniones
superóxidos, óxido nítrico, prostaglandinas, factores de crecimiento
y similares. Se ha informado de que estos inducen la producción de
metaloproteasas de la matriz a partir de las células sinoviales y
condrocitos promoviendo la degradación de la matriz
extracelular.
A partir de estos informes, se considera que la
osteoartritis y la artritis reumatoide así como enfermedades
artríticas tales como el lupus eritematoso generalizado que es una
enfermedad criptogénica con un trastorno de tejido inflamatorio
causado por la aparición de autoanticuerpos y el depósito en el
tejido de un complejo antígeno-anticuerpo y en la
que la artropatía aparece a un alto ritmo, la artropatía, la
artritis psoriásica que conduce a la destrucción de hueso con
crecimiento de la membrana sinovial complicado en pacientes
psoriásicos, la discopatía en la que se observa la destrucción de
la matriz extracelular en la enfermedad del disco intervertebral y
la sinovitis cristalina aguda (gota, seudogota) (Ryumachi Gaku,
recopilado por Hirohata Kazushi et al., Dobun Shoin, 1989)
se pueden tratar inhibiendo el crecimiento de la membrana sinovial o
la destrucción de cartílagos.
En la farmacoterapia de la artritis reumatoide,
se han utilizado hasta ahora diversos agentes antiinflamatorios no
esteroideos, agentes esteroideos tales como la prednisolona y
agentes antirreumáticos tales como el metotrexato principalmente
para reducir los dolores y la inflamación de las articulaciones
(Chiryo, 78, 3553-3558, Nanzando, 1996). En la
osteoartritis, se han administrado diversos agentes
antiinflamatorios no esteroideos, agentes analgésicos,
preparaciones farmacéuticas de ácido hialurónico como inyección
intraarticular y similares para acabar con los dolores y la
inflamación. El ácido hialurónico que inhibe la destrucción de
cartílagos se ha utilizado como agente para proteger el cartílago
(Creamer P., J. Rheum., 20, 1461-1464, 1993,
Arthritis Rheum., 43, 1905-1915, 2000).
Adicionalmente, se han llevado a cabo terapia física y tratamientos
operatorios tales como la osteotomía y la sustitución por
articulaciones artificiales. Los agentes antiinflamatorios
esteroideos y agentes esteroideos tales como la prednisolona se
utilizan en el lupus eritematoso generalizado, agentes
antiinflamatorios no esteroideos y sulfasalazina como fármaco
antirreumático en la artropatía anquilosante, agentes
antiinflamatorios no esteroideos, fármacos antirreumáticos e
inyecciones intraarticulares esteroideas en la artritis psoriásica
que implica crecimiento complicado de la membrana sinovial en
pacientes psoriásicos y conduce a la destrucción de hueso, agentes
antiinflamatorios no esteroideos y agentes analgésicos en la
enfermedad del disco intervertebral en la que se observa la
destrucción de la matriz extracelular del disco intervertebral, y
agentes antiinflamatorios no esteroideos, colchicina y similares en
la sinovitis cristalina aguda respectivamente (Ryumachi Gaku,
recopilado por Hirohata Kazushi et al., Dobun Shoin, 1989).
No obstante, semejante farmacoterapia es una terapia sintomática, y
a penas inhibe la destrucción de las articulaciones
suficientemente.
En la terapia de la artritis reumatoide, está
siendo aceptada actualmente la elección de la terapia positiva para
prevenir la destrucción de las articulaciones tanto como sea
posible. La característica de esta terapia es que se diagnostica
una enfermedad como artritis reumatoide en la fase más temprana
posible y se seleccionan apropiadamente fármacos antirreumáticos
tales como el metotrexato. No obstante, todavía no se ha ha
proporcionado una diagnosis suficiente.
El factor de crecimiento de fibroblastos (más
adelante abreviado como FGF), uno de los diferentes factores de
crecimiento existentes in vivo, se ha conocido como un factor
de crecimiento de unión a heparina que afecta a las células
endoteliales vasculares. Adicionalmente, la familia de FGF implica
19 tipos o más, y el FGF-2 (FGF básico), el
FGF-1 (FGF ácido) y similares se conocen desde hace
tiempo. Como receptores de FGF, se conocen siete tipos hasta la
fecha, y codifican una tirosina quinasa en la región
intracelular.
El FGF-8 es un factor aislado de
un sobrenadante de cultivo de la línea celular de cáncer de mama de
ratón SC-3 (Nakamura N. et al., J. Steroid
Biochem., 27, 459-464, 1987) que muestra crecimiento
dependiente de hormonas sexuales como factor de crecimiento
inducido por andrógenos (AIGF). Es un factor de crecimiento que es
producido inductivamente mediante estimulación androgénica y
potencia el crecimiento de células SC-3 de una
manera autocrina (Tanaka A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 89, 8928-8932, 1992). Se informa de que el
FGF-8 acelera el crecimiento de las células del
cáncer de próstata o de los fibroblastos (Tanaka A. et al.,
FEBS Lett., 363, 226-230, 1995). Se informa de que
el FGF-8 se une a tres receptores, receptor de FGF
2IIIc, receptor de FGF 3IIIc y receptor de FGF 4 (Ornitz D. M.
et al., J. Biol. Chem., 271, 15292-15297,
1996). Por otra parte, se requiere la unión a proteoglicanos de
heparán sulfato de tipo membrana tales como sindecano para la
función del FGF. La unión al heparán sulfato es necesaria para la
acumulación estable y local de FGF. En la situación de la
remodelación de tejido tal como la inflamación, se considera que el
heparán sulfato se degrada liberando FGF desde la matriz
extracelular mostrando su actividad. Un factor angiogénico fuerte
tal como FGF-2 está incluido en los cartílagos
(Satoh H. et al., J. Biol. Chem., 273,
12307-12315, 1998). En la artritis, las células
sinoviales, los condrocitos y las células inflamatorias invadidas
sintetizan FGF-1 o FGF-2 a un nivel
extremadamente alto (Sano H. et al., J. Cell Biol., 110,
1417-1426, 1990, Remmers E. F., Growth factors, 2,
179-188, 1990), y la concentración de
FGF-2 en el fluido sinovial de pacientes reumáticos
se correlaciona con la artritis (Manabe N. et al.,
Rheumatology, 38, 714-720, 1999). El
FGF-2 está implicado en la formación de osteofitos
en la osteoartritis (Uchino M. et al., Clin. Orthop., 377,
119-125, 2000). Estos informes demuestran que el
FGF-1 o el FGF-2 están implicados en
la artritis.
En el informe en el que se utilizan ratones con
FGF-8 desactivado, el FGF-8 se
expresó en la fase de desarrollo de las articulaciones (Haraguchi
R. et al., Development, 127, 2471-2479, 2000;
Lewandoski M. et al., Nat. Genet., 26,
460-463, 2000). Sin embargo, se desconoce que el
FGF-8 esté implicado en la artritis.
Un objeto de la invención es proporcionar el uso
de un anticuerpo que se une específicamente al FGF-8
inhibiendo la actividad del FGF-8 para la
preparación de una composición farmacéutica para prevenir o tratar
la artritis así como para la preparación de una composición para
diagnosticar la artritis. También se describe en la presente
memoria un agente para prevenir o tratar la artritis, un agente para
inhibir la destrucción de la articulación, un agente para la
protección del cartílago, un agente para inhibir el crecimiento de
la membrana sinovial y un agente diagnóstico para la artritis, así
como un método diagnóstico para la artritis.
La invención proporciona las realizaciones
caracterizadas en las reivindicaciones adjuntas. También se
describen los siguientes apartados (1) a (51).
- (1)
- Un agente para prevenir o tratar la artritis, que comprende, como ingrediente activo, un anticuerpo que se une específicamente al FGF-8 inhibiendo la actividad de FGF-8.
- (2)
- El agente de acuerdo con el apartado (1), donde el anticuerpo que se une específicamente a FGF-8 inhibiendo la actividad de FGF-8 es un anticuerpo monoclonal.
- (3)
- El agente de acuerdo con el apartado (2), donde el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo seleccionado de un anticuerpo producido por un hibridoma, un anticuerpo humanizado y uno de sus fragmentos de anticuerpo.
- (4)
- El agente de acuerdo con el apartado (3), donde el hibridoma es el hibridoma KM1334 (FERM BP-5451).
- (5)
- El agente de acuerdo con el apartado (3), donde el anticuerpo humanizado es un anticuerpo quimérico humano o un anticuerpo injertado a una región determinante de la complementariedad (CDR) humana.
- (6)
- El agente de acuerdo con el apartado (5), donde el anticuerpo quimérico humano comprende una región variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo y una región variable de la cadena ligera (VL) del anticuerpo monoclonal que se une específicamente a FGF-8 inhibiendo la actividad de FGF-8, y una región constante de la cadena pesada (CH) del anticuerpo y una región constante de la cadena ligera (CL) del anticuerpo de un anticuerpo humano.
- (7)
- El agente de acuerdo con el apartado (6), donde el anticuerpo quimérico humano es cualquiera de los siguientes anticuerpos quiméricos humanos (a) a (c),
- 1. {}\hskip0,3cm (a)
- un anticuerpo quimérico humano donde VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 5,
- 2. {}\hskip0,3cm (b)
- un anticuerpo quimérico humano donde VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 6, y
- 3. {}\hskip0,3cm (c)
- un anticuerpo quimérico humano donde VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 5 y VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 6.
- (8)
- El agente de acuerdo con el apartado (7), donde el anticuerpo quimérico humano es un anticuerpo quimérico humano producido por KM3034 transformante (FERM BP-7836).
- (9)
- El agente de acuerdo con el apartado (5), donde el anticuerpo injertado a CDR humana comprende las CDR de VH y VL de un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a FGF-8 inhibiendo la actividad de FGF-8 y CH y CL de un anticuerpo humano.
- (10)
- El agente de acuerdo con el apartado (9), donde el anticuerpo injertado a CDR humana comprende las CDR de VH y VL de un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a FGF-8 inhibiendo la actividad de FGF-8, las regiones marco (FR) de VH y VL de un anticuerpo humano y CH y CL de un anticuerpo humano.
- (11)
- El agente de acuerdo con el apartado (9) o (10), donde el anticuerpo injertado a CDR humana es cualquiera de los siguientes anticuerpos injertados a CDR humanas (a) a (c),
- 1. {}\hskip0,3cm (a)
- un anticuerpo injertado a CDR humana donde CDR1, CDR2 y CDR3 de VH comprenden las secuencias de aminoácidos representadas por los SEQ ID NOS. 7, 8 y 9 respectivamente,
- 2. {}\hskip0,3cm (b)
- un anticuerpo injertado a CDR humana donde CDR1, CDR2 y CDR3 de VL comprenden las secuencias de aminoácidos representadas por los SEQ ID NOS. 10, 11 y 12 respectivamente, y
- 3. {}\hskip0,3cm (c)
- un anticuerpo injertado a CDR humana donde CDR1, CDR2 y CDR3 de VH comprenden las secuencias de aminoácidos representadas por los SEQ ID NOS. 7, 8 y 9 respectivamente y CDR1, CDR2 y CDR3 de VL comprenden las secuencias de aminoácidos representadas por los SEQ ID NOS. 10, 11 y 12 respectivamente.
- (12)
- El agente de acuerdo con el apartado (9) de (10), donde el anticuerpo injertado a CDR humana es cualquiera de los siguientes anticuerpos injertados a CDR humana (a) a (c),
- 1. {}\hskip0,3cm (a)
- un anticuerpo injertado a CDR humana donde VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 18 donde al menos uno o más residuos aminoácido seleccionados entre Lys de la posición 12, Lys de la posición 13, Ala de la posición 40, Pro de la posición 41, Met de la posición 48, Val de la posición 68, Ile de la posición 70, Thr de la posición 74, Thr de la posición 76, Glu de la posición 82, Ser de la posición 84, Arg de la posición 87 y Tyr de la posición 95 se remplazan por otros residuos aminoácido,
- 2. {}\hskip0,3cm (b)
- un anticuerpo injertado a CDR humana donde VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 19 donde al menos uno o más residuos aminoácido seleccionados entre Ile de la posición 2, Val de la posición 3, Thr de la posición 14, Pro at Posición 15, Gln de la posición 50, Leu de la posición 51 y Tyr de la posición 92 se remplazan por otros residuos aminoácido, y
- 3. {}\hskip0,3cm (c)
- un anticuerpo injertado a CDR humana donde VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 18 donde al menos uno o más residuos aminoácido seleccionados entre Lys de la posición 12, Lys de la posición 13, Ala de la posición 40, Pro de la posición 41, Met de la posición 48, Val de la posición 68, Ile de la posición 70, Thr de la posición 74, Thr de la posición 76, Glu de la posición 82, Ser de la posición 84, Arg de la posición 87 y Tyr de la posición 95 se remplazan por otros residuos aminoácido, y VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 19 donde al menos uno o más residuos aminoácido seleccionados entre Ile de la posición 2, Val de la posición 3, Thr de la posición 14, Pro de la posición 15, Gln de la posición 50, Leu de la posición 51 y Tyr de la posición 92 se remplazan por otros residuos aminoácido.
- (13)
- El agente de acuerdo con el apartado (9) o (10), donde el anticuerpo injertado a CDR humana es cualquiera de los siguientes anticuerpos injertados a CDR humana (a) a (c),
- 1. {}\hskip0,3cm (a)
- un anticuerpo injertado a CDR humana donde VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 18 o 20,
- 2. {}\hskip0,3cm (b)
- un anticuerpo injertado a CDR humana donde VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 19, 21, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 50 o 51, y
- 3. {}\hskip0,3cm (c)
- un anticuerpo injertado a CDR humana donde VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 18 o 20 y VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 19, 21, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 50 o 51.
- (14)
- El agente de acuerdo con el apartado (13), donde el anticuerpo injertado a CDR humana es cualquiera de los siguientes anticuerpos injertados a CDR humana (a) a (c),
- 1. {}\hskip0,3cm (a)
- un anticuerpo injertado a CDR humana donde VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 18 y VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 21,
- 2. {}\hskip0,3cm (b)
- un anticuerpo injertado a CDR humana donde VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 18 y VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 44, y
- 3. {}\hskip0,3cm (c)
- un anticuerpo injertado a CDR humana donde VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 18 y VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 50.
- (15)
- El agente de acuerdo con el apartado (9) o (10), donde el anticuerpo injertado a CDR humana es cualquiera de los siguientes anticuerpos injertados a CDR humana (a) a (c),
- 1. {}\hskip0,3cm (a)
- un anticuerpo injertado a CDR humana producido por el transwformante KM8036 (FERM BP-8084),
- 2. {}\hskip0,3cm (b)
- un anticuerpo injertado a CDR humana producido por el transformante KM8035 (FERM BP-8082), y
- 3. {}\hskip0,3cm (c)
- un anticuerpo injertado a CDR humana producido por el transformante KM8036 (FERM BP-8083).
- (16)
- El agente de acuerdo con el apartado (3), donde el fragmento de anticuerpo es un fragmento de anticuerpo seleccionado entre Fab, Fab', F(ab')_{2}, un anticuerpo de cadena sencilla (scFv), un fragmento (anticuerpo biespecífico "fragmento bivalente") de la región variable dímeroizada (región V), un fragmento de la región V estabilizada con disulfuro (dsFv) y un péptido que contiene CDR.
- (17)
- Un agente diagnóstico de la artritis que comprende un anticuerpo que se une específicamente a FGF-8 como ingrediente activo.
- (18)
- El agente diagnóstico de acuerdo con el apartado (17), donde el anticuerpo que se une específicamente a FGF-8 es un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal.
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- (19)
- El agente diagnóstico de acuerdo con el apartado (18), donde el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo seleccionado de un anticuerpo producido por un hibridoma, un anticuerpo humanizado y uno de sus fragmentos de anticuerpo.
- (20)
- El agente diagnóstico de acuerdo con el apartado (19), donde el hibridoma es el hibridoma KM1334 (FERM BP-5451).
- (21)
- El agente diagnóstico de acuerdo con el apartado (19), donde el anticuerpo humanizado es un anticuerpo quimérico humano o un anticuerpo injertado a CDR humana.
- (22)
- El agente diagnóstico de acuerdo con el apartado (21), donde el anticuerpo quimérico humano es un anticuerpo quimérico humano que comprende VH y VL de un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a FGF-8 y CH y CL de un anticuerpo humano.
- (23)
- El agente diagnóstico de acuerdo con el apartado (22), donde el anticuerpo quimérico humano es cualquiera de los siguientes anticuerpos quiméricos humanos (a) a (c),
- 1. {}\hskip0,3cm (a)
- un anticuerpo quimérico humano donde VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 5,
- 2. {}\hskip0,3cm (b)
- un anticuerpo quimérico humano donde VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 6, y
- 3. {}\hskip0,3cm (c)
- un anticuerpo quimérico humano donde VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 5 y VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 6.
- (24)
- El agente diagnóstico de acuerdo con el apartado (23), donde el anticuerpo quimérico humano es un anticuerpo quimérico humano producido por KM3034 transformante (FERM BP-7836).
- (25)
- El agente diagnóstico de acuerdo con el apartado (21), donde el anticuerpo injertado a CDR humana es un anticuerpo injertado a CDR humana que comprende las CDR de VH y VL de un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a FGF-8 y CH y CL de un anticuerpo humano.
- (26)
- El agente diagnóstico de acuerdo con el apartado (25), donde el anticuerpo injertado a CDR humana es un anticuerpo injertado a CDR humana que comprende las CDR de VH y VL de un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a FGF-8, las FR de VH y VL de un anticuerpo humano y CH y CL de un anticuerpo humano.
- (27)
- El agente diagnóstico de acuerdo con el apartado (25) o (26), donde el anticuerpo injertado a CDR humana es cualquiera de los siguientes anticuerpos injertados a CDR humana (a) a (c),
- 1. {}\hskip0,3cm (a)
- un anticuerpo injertado a CDR humana donde CDR1, CDR2 y CDR3 de VH comprenden las secuencias de aminoácidos representadas por los SEQ ID NOS. 7, 8 y 9 respectivamente,
- 2. {}\hskip0,3cm (b)
- un anticuerpo injertado a CDR humana donde CDR1, CDR2 y CDR3 de VL comprenden las secuencias de aminoácidos representadas por los SEQ ID NOS. 10, 11 y 12 respectivamente, y
- 3. {}\hskip0,3cm (c)
- un anticuerpo injertado a CDR humana donde CDR1, CDR2 y CDR3 de VH comprenden las secuencias de aminoácidos representadas por los SEQ ID NOS. 7, 8 y 9 respectivamente, y CDR1, CDR2 y CDR3 de VL comprenden las secuencias de aminoácidos representadas por los SEQ ID NOS. 10, 11 y 12 respectivamente.
- (28)
- El agente diagnóstico de acuerdo con el apartado (25) o (26), donde el anticuerpo injertado a CDR humana es cualquiera de los siguientes anticuerpos injertados a CDR humana (a) a (c),
- 1. {}\hskip0,3cm (a)
- un anticuerpo injertado a CDR humana donde VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 18 donde al menos uno o más residuos aminoácido seleccionados entre Lys de la posición 12, Lys de la posición 13, Ala de la posición 40, Pro de la posición 41, Met de la posición 48, Val de la posición 68, Ile de la posición 70, Thr de la posición 74, Thr de la posición 76, Glu de la posición 82, Ser de la posición 84, Arg de la posición 87 y Tyr de la posición 95 se remplazan por otros residuos aminoácido,
- 2. {}\hskip0,3cm (b)
- un anticuerpo injertado a CDR humana donde VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 19 donde al menos uno o más residuos aminoácido seleccionados entre Ile de la posición 2, Val de la posición 3, Thr de la posición 14, Pro de la posición 15, Gln de la posición 50, Leu de la posición 51 y Tyr de la posición 92 se remplazan por otros residuos aminoácido, y
\global\parskip1.000000\baselineskip
- 3. {}\hskip0,3cm (c)
- un anticuerpo injertado a CDR humana donde VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 18 donde al menos uno o más residuos aminoácido seleccionados entre Lys de la posición 12, Lys de la posición 13, Ala de la posición 40, Pro de la posición 41, Met de la posición 48, Val de la posición 68, Ile de la posición 70, Thr de la posición 74, Thr de la posición 76, Glu de la posición 82, Ser de la posición 84, Arg de la posición 87 y Tyr de la posición 95 se remplazan por otros residuos aminoácido, y VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 19 donde al menos uno o más residuos aminoácido seleccionados entre Ile de la posición 2, Val de la posición 3, Thr de la posición 14, Pro de la posición 15, Gln de la posición 50, Leu de la posición 51 y Tyr de la posición 92 se remplazan por otros residuos aminoácido.
- (29)
- El agente diagnóstico de acuerdo con el apartado (25) o (26), donde el anticuerpo injertado a CDR humana es cualquiera de los siguientes anticuerpos injertados a CDR humana (a) a (c),
- 1. {}\hskip0,3cm (a)
- un anticuerpo injertado a CDR humana donde VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 18 o 20,
- 2. {}\hskip0,3cm (b)
- un anticuerpo injertado a CDR humana donde VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 19, 21, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 50 o 51, y
- 3. {}\hskip0,3cm (c)
- un anticuerpo injertado a CDR humana donde VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 18 o 20 y VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 19, 21, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 50 o 51.
- (30)
- El agente diagnóstico de acuerdo con el apartado (29), donde el anticuerpo injertado a CDR humana es cualquiera de los anticuerpos injertados a CDR humana (a) a (c),
- 1. {}\hskip0,3cm (a)
- un anticuerpo injertado a CDR humana donde VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 18 y VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 21,
- 2. {}\hskip0,3cm (b)
- un anticuerpo injertado a CDR humana donde VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 18 y VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 44, y
- 3. {}\hskip0,3cm (c)
- un anticuerpo injertado a CDR humana donde VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 18 y VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 50.
- (31)
- El agente diagnóstico de acuerdo con el apartado (25) o (26), donde el anticuerpo injertado a CDR humana es cualquiera de los siguientes anticuerpos injertados a CDR humana (a) a (c),
- 1. {}\hskip0,3cm (a)
- un anticuerpo injertado a CDR humana producido por el transwformante KM8036 (FERM BP-8084),
- 2. {}\hskip0,3cm (b)
- un anticuerpo injertado a CDR humana producido por el transformante KM8035 (FERM BP-8082), y
- 3. {}\hskip0,3cm (c)
- un anticuerpo injertado a CDR humana producido por el transformante KM8036 (FERM BP-8083).
- (32)
- El agente diagnóstico de acuerdo con el apartado (19), donde el fragmento de anticuerpo es un fragmento de anticuerpo seleccionado entre Fab, Fab', F(ab')_{2}, un anticuerpo de cadena sencilla (scFv), un fragmento de la región V dímeroizado (fragmento bivalente), un fragmento de la región V estabilizado por disulfuro (dsFv) y un péptido que contiene CDR.
- (33)
- Un método diagnóstico para la artritis, que comprende detectar y/o determinar FGF-8 en una muestra utilizando un anticuerpo que se une específicamente a FGF-8.
- (34)
- El método de diagnóstico de acuerdo con el apartado (33), donde el anticuerpo que se une específicamente a FGF-8 es un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal.
- (35)
- El método de diagnóstico de acuerdo con el apartado (34), donde el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo seleccionado de un anticuerpo producido por un hibridoma, un anticuerpo humanizado y uno de sus fragmentos de anticuerpo.
\newpage
- (36)
- El método de diagnóstico de acuerdo con el apartado (35), donde el hibridoma es el hibridoma KM1334 (FERM BP-5451).
- (37)
- El método de diagnóstico de acuerdo con el apartado (35), donde el anticuerpo humanizado es un anticuerpo quimérico humano o un anticuerpo injertado a CDR humana.
- (38)
- El método de diagnóstico de acuerdo con el apartado (37), donde el anticuerpo quimérico humano es un anticuerpo quimérico humano que comprende VH y VL de un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a FGF-8 y CH y CL de un anticuerpo humano.
- (39)
- El método de diagnóstico de acuerdo con el apartado (38), donde el anticuerpo quimérico humano es cualquiera de los siguientes anticuerpos quiméricos humanos (a) a (c),
- 1. {}\hskip0,3cm (a)
- un anticuerpo quimérico humano donde VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 5,
- 2. {}\hskip0,3cm (b)
- un anticuerpo quimérico humano donde VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 6, y
- 3. {}\hskip0,3cm (c)
- un anticuerpo quimérico humano donde VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 5 y VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 6.
- (40)
- El método de diagnóstico de acuerdo con el apartado (39), donde el anticuerpo quimérico humano es un anticuerpo quimérico humano producido por KM3034 transformante (FERM BP-7836).
- (41)
- El método de diagnóstico de acuerdo con el apartado (37), donde el anticuerpo injertado a CDR humana es un anticuerpo injertado a CDR humana que comprende las CDR de VH y VL de un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a FGF-8 y CH y CL de un anticuerpo humano.
- (42)
- El método de diagnóstico de acuerdo con el apartado (41), donde el anticuerpo injertado a CDR humana es un anticuerpo injertado a CDR humana que comprende las CDR de VH y VL de un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a FGF-8, FRs de VH y VL de un anticuerpo humano y CH y CL de un anticuerpo humano.
- (43)
- El método de diagnóstico de acuerdo con el apartado (41) o (42), donde el anticuerpo injertado a CDR humana es cualquiera de los siguientes anticuerpos injertados a CDR humana (a) a (c),
- 1. {}\hskip0,3cm (a)
- un anticuerpo injertado a CDR humana donde CDR1, CDR2 y CDR3 de VH comprenden las secuencias de aminoácidos representadas por los SEQ ID NOS. 7, 8 y 9 respectivamente,
- 2. {}\hskip0,3cm (b)
- un anticuerpo injertado a CDR humana donde CDR1, CDR2 y CDR3 de VL comprenden las secuencias de aminoácidos representadas por los SEQ ID NOS. 10, 11 y 12 respectivamente, y
- 3. {}\hskip0,3cm (c)
- un anticuerpo injertado a CDR humana donde CDR1, CDR2 y CDR3 de VH comprenden las secuencias de aminoácidos representadas por los SEQ ID NOS. 7, 8 y 9 respectivamente, y CDR1, CDR2 y CDR3 de VL comprenden las secuencias de aminoácidos representadas por los SEQ ID NOS. 10, 11 y 12 respectivamente.
- (44)
- El método de diagnóstico de acuerdo con el apartado (41) o (42), donde el anticuerpo injertado a CDR humana es cualquiera de los siguientes anticuerpos injertados a CDR humana (a) a (c),
- 1. {}\hskip0,3cm (a)
- un anticuerpo injertado a CDR humana donde VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 18 donde al menos uno o más residuos aminoácidos seleccionados entre Lys de la posición 12, Lys de la posición 13, Ala de la posición 40, Pro de la posición 41, Met de la posición 48, Val de la posición 68, Ile de la posición 70, Thr de la posición 74, Thr de la posición 76, Glu de la posición 82, Ser de la posición 84, Arg de la posición 87 y Tyr de la posición 95 se remplazan por otros residuos aminoácido,
- 2. {}\hskip0,3cm (b)
- un anticuerpo injertado a CDR humana donde VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 19 donde al menos uno o más residuos aminoácidos seleccionados entre Ile de la posición 2, Val de la posición 3, Thr de la posición 14, Pro de la posición 15, Gln de la posición 50, Leu de la posición 51 y Tyr de la posición 92 se remplazan por otros residuos aminoácido, y
- 3. {}\hskip0,3cm (c)
- un anticuerpo injertado a CDR humana donde VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 18 donde al menos uno o más residuos aminoácido seleccionados entre Lys de la posición 12, Lys de la posición 13, Ala de la posición 40, Pro de la posición 41, Met de la posición 48, Val de la posición 68, Ile de la posición 70, Thr de la posición 74, Thr de la posición 76, Glu de la posición 82, Ser de la posición 84, Arg de la posición 87 y Tyr de la posición 95 se remplazan por otros residuos aminoácido, y VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 19 donde al menos uno o más residuos aminoácido seleccionados entre Ile de la posición 2, Val de la posición 3, Thr de la posición 14, Pro de la posición 15, Gln de la posición 50, Leu de la posición 51 y Tyr de la posición 92 se remplazan por otros residuos aminoácido.
- (45)
- El método de diagnóstico de acuerdo con el apartado (41) o (42), donde el anticuerpo injertado a CDR humana es cualquiera de los siguientes anticuerpos injertados a CDR humana (a) a (c),
- 1. {}\hskip0,3cm (a)
- un anticuerpo injertado a CDR humana donde VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 18 o 20,
- 2. {}\hskip0,3cm (b)
- un anticuerpo injertado a CDR humana donde VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 19, 21, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 50 o 51, y
- 3. {}\hskip0,3cm (c)
- un anticuerpo injertado a CDR humana donde VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 18 o 20 y VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 19, 21, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 50 o 51.
- (46)
- El método de diagnóstico de acuerdo con el apartado (45), donde el anticuerpo injertado a CDR humana es cualquiera de los siguientes anticuerpos injertados a CDR humana (a) a (c),
- 1. {}\hskip0,3cm (a)
- un anticuerpo injertado a CDR humana donde VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 18 y VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 21,
- 2. {}\hskip0,3cm (b)
- un anticuerpo injertado a CDR humana donde VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 18 y VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 44, y
- 3. {}\hskip0,3cm (c)
- un anticuerpo injertado a CDR humana donde VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 18 y VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 50.
- (47)
- El método de diagnóstico de acuerdo con el apartado (41) o (42), donde el anticuerpo injertado a CDR humana es cualquiera de los siguientes anticuerpos injertados a CDR humana (a) a (c),
- 1. {}\hskip0,3cm (a)
- un anticuerpo injertado a CDR humana producido por el transwformante KM8036 (FERM BP-8084),
- 2. {}\hskip0,3cm (b)
- un anticuerpo injertado a CDR humana producido por el transformante KM8035 (FERM BP-8082), y
- 3. {}\hskip0,3cm (c)
- un anticuerpo injertado a CDR humana producido por el transformante KM8036 (FERM BP-8083).
- (48)
- El método de diagnóstico de acuerdo con el apartado (35), donde el fragmento de anticuerpo es un fragmento de anticuerpo seleccionado entre Fab, Fab', F(ab')_{2}, un anticuerpo de cadena sencilla (scFv), un fragmento de la región V dímeroizado (fragmento bivalente), un fragmento de la región V estabilizado por disulfuro (dsFv) y un péptido que contiene CDR.
- (49)
- Un agente para inhibir a la destrucción de la articulación que comprende, como ingrediente activo, un anticuerpo que se une específicamente a FGF-8 inhibiendo la actividad de FGF-8.
- (50)
- Un agente para proteger el cartílago que comprende, como ingrediente activo, un anticuerpo que se une específicamente a FGF-8 inhibiendo la actividad de FGF-8.
- (51)
- Un agente para inhibir el crecimiento de la membrana sinovial que comprende, como ingrediente activo, un anticuerpo que se une específicamente a FGF-8 inhibiendo la actividad de FGF-8.
El anticuerpo utilizado en el agente o para la
preparación de la composición farmacéutica para prevenir o tratar
la artritis en la presente invención puede ser cualquier anticuerpo
con tal que sea un anticuerpo que se una específicamente a
FGF-8 inhibiendo la actividad de
FGF-8 (más adelante referido también como anticuerpo
neutralizador anti-FGF-8). Los
ejemplos incluyen un anticuerpo que tiene actividad neutralizadora
de FGF-8 y uno de sus fragmentos.
El anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 utilizado en el agente o
para la preparación de la composición farmacéutica para prevenir o
tratar la artritis en la presente invención se puede obtener
seleccionando un anticuerpo capaz de inhibir la actividad de
FGF-8 entre los anticuerpos que se unen
específicamente a FGF-8 (más adelante referido
también como anticuerpos
anti-FGF-8). La actividad de
FGF-8 puede ser cualquiera de las actividades
biológicas que posee FGF-8. Sus ejemplos
específicos pueden incluir una actividad que promueve el crecimiento
de la línea celular de cáncer de mama de ratón SC-3
(Nakamura N. et al., J. Steroid Biochem., 27,
459-464, 1987), la línea celular NIH/3T3 de
fibroblasto de ratón (ATCC No: CRL-1658) o la línea
celular LNCaP de cáncer de próstata humano (ATCC No:
CRL-1740), una actividad que promueve el crecimiento
de las células sinoviales, una actividad que promueve la
degradación de la matriz extracelular de los condrocitos y una
actividad que promueve la producción de
metaloproteinasa-3 de la matriz a partir de los
condrocitos.
Un anticuerpo
anti-FGF-8 se puede producir
mediante el método conocido (Harlow E. y Lane D., Antibodies: A
Laboratory Manual, Cold spring Harbor Laboratory, 1988, más adelante
referido como Antibodies A Laboratory Manual).
Como anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 utilizado en el agente o
para la preparación de la composición farmacéutica para prevenir o
tratar la artritis de la presente invención, se utiliza un
anticuerpo policlonal y un anticuerpo monoclonal. Preferiblemente
se utiliza un anticuerpo monoclonal.
Los ejemplos del anticuerpo monoclonal pueden
incluir un anticuerpo producido por un hibridoma, un anticuerpo
humanizado y uno de sus fragmentos de anticuerpo.
El anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 monoclonal producido por
el hibridoma utilizado en el agente o para la preparación de la
composición farmacéutica para prevenir o tratar la artritis en la
invención se produce específicamente mediante el método
siguiente.
Esto es, se prepara una proteína
FGF-8 como antígeno, y se inducen las células
plasmáticas que tienen especificidad por el antígeno en un animal
inmunizado con este antígeno. Las células plasmáticas se fusionan
adicionalmente con las células de mieloma para preparar hibridomas,
y los hibridomas se cultivan. O las células de hibridoma se
administran a un animal ocasionando la canceración ascítica en el
animal. Los anticuerpos que se unen específicamente a
FGF-8 se separan de la solución de cultivo o del
fluido ascítico, y se purifican. El anticuerpo que inhibe la
actividad de FGF-8 se selecciona entre los
anticuerpos resultantes. El anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 monoclonal incluye el
anticuerpo monoclonal KM1334 producido por el hibridoma KM1334 (FERM
BP-5451) perteneciente a la subclase de IgG1 de
ratón como se describe en la Solicitud de Patente Japonesa No
examinada Núm. 271391/97.
El anticuerpo humanizado utilizado en el agente
o para la preparación de la composición farmacéutica para prevenir
o tratar la artritis de la presente invención incluye el anticuerpo
neutralizador anti-FGF-8 monoclonal
anterior que está modificado mediante tecnología de recombinación
génica. El anticuerpo que tiene poca antigenicidad y una vida media
en sangre prolongada está preferiblemente en el agente de prevención
o tratamiento.
El anticuerpo humanizado utilizado en el agente
o para la preparación de la composición farmacéutica para prevenir
o tratar la artritis de la presente invención incluye un anticuerpo
quimérico humano y un anticuerpo injertado a una región
determinante de la complementariedad humana (más adelante abreviada
como CDR).
El anticuerpo quimérico humano significa un
anticuerpo que comprende la región variable de la cadena pesada del
anticuerpo (la región variable es referida más adelante como región
V y la región variable de la cadena pesada como VH) y la región V
de la cadena ligera (más adelante referida como VL) de un animal no
humano, y la región constante de la cadena pesada del anticuerpo
humano (la región constante es referida más adelante como región C
y región constante de la cadena pesada CH) y la región C de la
cadena ligera del anticuerpo humano (más adelante referida como
CL). En cuanto al animal no humano, se puede utilizar cualquiera de
los animales a partir de los cuales se puede preparar un hibridoma,
tal como ratones, ratas, hámsteres y conejos.
El anticuerpo quimérico humano utilizado en el
agente o para la preparación de la composición farmacéutica para
prevenir o tratar la artritis de la presente invención se puede
preparar obteniendo los ADN que codifican VH y VL a partir de los
ADNc que codifican la cadena H y la cadena L del anticuerpo obtenido
a partir del hibridoma que produce el anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 monoclonal, insertando
individualmente los ADN en un vector para la expresión en células
animales que portan los ADN que codifican CH y CL del anticuerpo
humano para construir un vector de expresión de un anticuerpo
quimérico humano e introducir el vector en la célula animal para su
expresión.
Como CH de los anticuerpos quiméricos humanos,
se puede utilizar cualquier CH de anticuerpos pertenecientes a las
inmunoglobulinas humanas (hIg). El preferible la CH de anticuerpos
pertenecientes a la clase hIgG, y se puede utilizar cualquiera de
las subclases tales como \gamma1, \gamma2, \gamma3 y \gamma4
pertenecientes a la clase de las hIgG. Como CL de los anticuerpos
quiméricos humanos, se puede utilizar cualquier CL de anticuerpos
pertenecientes a hIg, por ejemplo, la clase \kappa o la clase
\lambda.
El anticuerpo quimérico humano que se une
específicamente a FGF-8 inhibiendo la actividad de
FGF-8 (más adelante referido también como
anticuerpo quimérico neutralizador
anti-FGF-8) incluye un anticuerpo
quimérico neutralizador anti-FGF-8
que comprende VH y VL de un anticuerpo monoclonal que se une
específicamente a FGF-8 inhibiendo la actividad de
FGF-8 y CH y CL de un anticuerpo humano. Sus
ejemplos preferibles incluyen un anticuerpo quimérico humano donde
VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID
NO. 5, un anticuerpo quimérico humano donde VL comprende una
secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 6, y un
anticuerpo quimérico humano donde VH comprende una secuencia de
aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 5 y VL comprende una
secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 6. Sus
ejemplos específicos incluyen anticuerpos quiméricos humanos KM3034
y KM3334 donde VH del anticuerpo comprende una secuencia de
aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 5, CH comprende una
secuencia de aminoácidos de la subclase \gamma1 humana, VL del
anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos representada por
el SEQ ID NO. 6 y CL comprende una secuencia de aminoácidos de la
clase \kappa humana.
El transformante KM3034 que produce el
anticuerpo quimérico humano KM3034 se depositó como FERM
BP-7836 en el Depósito de Organismos de Patentes
Internacionales, Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología
Industrial Avanzadas (AIST Tsukuba Centra16,
1-1-1 Higashi, Tsukubashishi
Ibaraki, 305-8566, Japan) el 26 de Diciembre de
2001.
El anticuerpo injertado a CDR humana significa
un anticuerpo preparado remplazando las CDR de VH y VL de un
anticuerpo de un animal no humano con secuencias CDR de un
anticuerpo de un animal no humano respectivamente en un anticuerpo
humano.
El anticuerpo injertado a CDR humana utilizado
en el agente o para la preparación de la composición farmacéutica
para prevenir o tratar la artritis de la presente invención se puede
preparar construyendo los ADN que codifican la región V donde las
secuencias CDR de VH y VL de cualquier anticuerpo humano se
remplazan por secuencias CDR de VH y VL de un anticuerpo
neutralizador anti-FGF-8 de un
animal no humano respectivamente, insertándolas individualmente en
un vector para la expresión en células animales que portan genes que
codifican CH de anticuerpo humano y CL de anticuerpo humano para
construir un vector de expresión del anticuerpo injertado a CDR
humano e introducir el vector en la célula animal para su
expresión.
Como CH de los anticuerpos injertados a CDR
humana, se puede utilizar cualquier CH de anticuerpos pertenecientes
a hIg. Es preferible la CH de los anticuerpos pertenecientes a
clase hIgG, y se puede utilizar cualquiera de las subclases tales
como \gamma1, \gamma2, \gamma3 y \gamma4 pertenecientes a la
clase hIgG. Como CL de los anticuerpos injertados a CDR humana, se
puede utilizar cualquier CL de anticuerpos pertenecientes a hIg,
por ejemplo, la clase \kappa o la clase \lambda.
El anticuerpo injertado a CDR humana que se une
específicamente a FGF-8 inhibiendo la actividad de
FGF-8 (más adelante referido también como
anticuerpo injertado a CDR neutralizador
anti-FGF-8) incluye un anticuerpo
injertado a CDR humana que comprende las CDR de VH y VL de un
anticuerpo monoclonal que se une específicamente a
FGF-8 inhibiendo la actividad de
FGF-8 y CH y CL del anticuerpo humano, y un
anticuerpo injertado a CDR humana que comprende las CDR de VH y VL
de un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a
FGF-8 inhibiendo la actividad de
FGF-8, las regiones marco (más adelante abreviadas
como FR) de VH y VL del anticuerpo humano, y CH y CL del anticuerpo
humano. Sus ejemplos preferibles incluyen (a) un anticuerpo
injertado a CDR humana donde CDR1, CDR2 y CDR3 de VH comprenden las
secuencias de aminoácidos representadas por los SEQ ID NOS. 7, 8 y
9 respectivamente, (b) un anticuerpo injertado a CDR humana donde
CDR1, CDR2 y CDR3 de VL comprenden las secuencias de aminoácidos
representadas por los SEQ ID NOS. 10, 11 y 12 respectivamente y (c)
un anticuerpo injertado a CDR humana donde CDR1, CDR2 y CDR3 de VH
comprenden las secuencias de aminoácidos representadas por los SEQ
ID NOS. 7, 8 y 9 respectivamente y CDR1, CDR2 y CDR3 de VL
comprenden las secuencias de aminoácidos representadas por los SEQ
ID NOS. 10, 11 y 12 respectivamente. Sus ejemplos más preferibles
incluyen (a) un anticuerpo injertado a CDR humana donde VH
comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID
NO. 18, (b) un anticuerpo injertado a CDR humana donde VL comprende
una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 19, y
(c) un anticuerpo injertado a CDR humana donde VH comprende una
secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 18 y VL
comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID
NO. 19. Sus ejemplos muy preferibles incluyen (a) un anticuerpo
injertado a CDR humana donde VH comprende una secuencia de
aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 18 donde al menos uno o
más residuos aminoácido seleccionados entre Lys de la posición 12,
Lys de la posición 13, Ala de la posición 40, Pro de la posición 41,
Met de la posición 48, Val de la posición 68, Ile de la posición
70, Thr de la posición 74, Thr de la posición 76, Glu de la
posición 82, Ser de la posición 84, Arg de la posición 87 y Tyr de
la posición 95 se remplazan por otros residuos aminoácido, (b) un
anticuerpo injertado a CDR humana donde VL comprende una secuencia
de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 19 donde al menos uno
o más residuos aminoácido seleccionados entre Ile de la posición 2,
Val de la posición 3, Thr de la posición 14, Pro de la posición 15,
Gln de la posición 50, Leu de la posición 51 y Tyr de la posición
92 se remplazan por otros residuos aminoácido, y (c) un anticuerpo
injertado a CDR humana donde VH comprende una secuencia de
aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 18 donde al menos uno o
más residuos aminoácido seleccionados entre Lys de la posición 12,
Lys de la posición 13, Ala de la posición 40, Pro de la posición
41, Met de la posición 48, Val de la posición 68, Ile de la posición
70, Thr de la posición 74, Thr de la posición 76, Glu de la
posición 82, Ser de la posición 84, Arg de la posición 87 y Tyr de
la posición 95 se remplazan por otros residuos aminoácido, y VL
comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID
NO. 19 donde al menos uno o más residuos aminoácido seleccionados
entre Ile de la posición 2, Val de la posición 3, Thr de la posición
14, Pro de la posición 15, Gln at Posición 50, Leu de la posición
51 y Tyr de la posición 92 Tyr se remplazan por otros residuos
aminoácido. Sus ejemplos específicos incluyen (a) un anticuerpo
injertado a CDR humana donde VH comprende una secuencia de
aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 18 o 20, (b) un
anticuerpo injertado a CDR humana donde VL comprende una secuencia
de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 19, 21, 42, 43, 44,
45, 46, 47, 50 o 51, y (c) un anticuerpo injertado a CDR humana
donde VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por el
SEQ ID NO. 18 o 20 y VL comprende una secuencia de aminoácidos
representada por el SEQ ID NO. 19, 21, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 50 o
51. Sus ejemplos preferibles incluyen (a) un anticuerpo injertado a
CDR humana donde VH comprende una secuencia de aminoácidos
representada por el SEQ ID NO. 18 y VL comprende una secuencia de
aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 21, (b) un anticuerpo
injertado a CDR humana donde VH comprende una secuencia de
aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 18 y VL comprende una
secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 44, y (c)
un anticuerpo injertado a CDR humana donde VH comprende una
secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 18 y VL
comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID
NO. 50. Los ejemplos de tal anticuerpo injertado a CDR humana
incluyen los anticuerpos injertados a CDR humanas HVOLV6 y
HVOLV6/CHO donde VH comprende una secuencia de aminoácidos
representada por el SEQ ID NO. 18, CH comprende una secuencia de
aminoácidos de la subclase \gamma1 humana, VL comprende una
secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 21 y CL
comprende una secuencia de aminoácidos de la clase \kappa humana,
el anticuerpo injertado a CDR humana HVOLV3-1/CHO
donde VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por el
SEQ ID NO. 18, CH comprende una secuencia de aminoácidos de la
subclase \gamma1 humana, VL comprende una secuencia de
aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 44 y CL comprende una
secuencia de aminoácidos de la clase \kappa humana, y el
anticuerpo injertado a CDR humana HVOLV4-3/CHO donde
VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ
ID NO. 18, CH comprende una secuencia de aminoácidos de la subclase
\gamma1 humana, VL comprende una secuencia de aminoácidos
representada por el SEQ ID NO. 50 y CL comprende una secuencia de
aminoácidos de la clase \kappa humana.
El transformante KM8037 que produce el
anticuerpo injertado a CDR humana HV0LV6 se depositó como FERM
BP-8084 en Despósito de Organismos de Patentes
Internacionales, National Institute of Advanced Industrial Science
and Technology (AIST Tsukuba Central 6,
1-1-1 Higashi, Tsukubashi Ibaraki,
305-8566, Japan) el 20 de Junio de 2002, el
transformante KM8036 que produce el anticuerpo injertado a CDR
humana HV0LV3-1 se depositó como FERM
BP-8083 en el Despósito de Organismos de Patentes
Internacionales, National Institute of Advanced Industrial Science
and Technology (AIST Tsukuba Central 6,
1-1-1 Higashi, Tsukubashi Ibaraki,
305-8566, Japan) el 20 de Junio de 2002, y el
transformante KM8035 que produce el anticuerpo injertado a CDR
humana HV0LV4-3 se depositó como FERM
BP-8082 in Despósito de Organismos de Patentes
Internacionales, National Institute of Advanced Industrial Science
and Technology (AIST Tsukuba Central 6,
1-1-1 Higashi, Tsukubashi Ibaraki,
305-8566, Japan) el 20 de Junio de 2002
respectivamente.
El anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 utilizado en el agente o
para la preparación de la composición farmacéutica para prevenir o
tratar la artritis de la presente invención incluye también un
fragmento de anticuerpo. El fragmento de anticuerpo incluye Fab
(abreviado para fragmento de unión al antígeno),
F(ab')_{2}, Fab', un anticuerpo de cadena sencilla (Fv de
cadena sencilla; más adelante referido como scFv), un fragmento de
la región V dimerizado (fragmento bivalente), un anticuerpo
estabilizado por disulfuro (Fv estabilizado por disulfuro; más
adelante referido como dsFv) y un péptido que contiene CDR.
El Fab es un fragmento que tiene actividad de
unión al antígeno y que comprende aproximadamente la mitad de un
lado N-terminal de la cadena H y la cadena L
completa, siendo obtenido el fragmento digiriendo los radicales
peptídicos superiores de dos enlaces disulfuro que entrecruzan dos
cadenas H en las regiones bisagra de IgG con una enzima papaína que
tiene un peso molecular de aproximadamente 50.000.
El F(ab')_{2} es un fragmento de
anticuerpo obtenido tratando los radicales inferiores de dos enlaces
disulfuro en las regiones bisagra de IgG con la proteinasa pepsina
(que escinde en el resto aminoácido 234º de cadena H) donde Fab es
ligeramente más grande que el unido a través de enlaces disulfuro en
regiones bisagra que tiene un peso molecular de aproximadamente
100.000 y que tiene actividad de unión al antígeno.
El Fab' es un fragmento obtenido escindiendo
enlaces disulfuro entre bisagras de F(ab')_{2} que tiene un
peso molecular de aproximadamente 50.000 y actividad de unión al
antígeno.
El scFv es un polipéptido
VH-P-VL o
VL-P-VH donde una VH y una VL se
conectan con un conector peptídico apropiado (más adelante referido
como P). Como VH y VL incluidas en un scFv utilizado en un agente
para prevenir o tratar la artritis en la invención, se puede
utilizar cualquier VH y VL de anticuerpos monoclonales
neutralizadores anti-FGF-8.
El fragmento bivalente es un fragmento de
anticuerpo donde los scFv que tienen las mismas o diferentes
especificidades de unión al antígeno forman un dímero, y éste es un
fragmento de anticuerpo que tiene actividad de unión al antígeno
divalente para el mismo antígeno o actividades de unión al antígeno
específicas para antígenos diferentes respectivamente.
El dsFv es un fragmento donde los polipéptidos
con un residuo aminoácido de VH y un residuo aminoácido de VL
remplazados por residuos cisteína se unen a través de un enlace
disulfuro. Los residuos aminoácido remplazados por el residuo
cisteína se pueden seleccionar estimando una estructura
tridimensional de un anticuerpo de acuerdo con el método indicado
por Reiter et al. (Reiter Y. et al., Protein Eng., 7,
697-704, 1994). Como VH o VL incluidos en el dsFv
utilizado en el agente o para la preparación de la composición
farmacéutica para prevenir o tratar la artritis de la presente
invención, se puede utilizar cualquier VH y VL de anticuerpos
monoclonales neutralizadores
anti-FGF-8.
El péptido que contiene la CDR utilizado en el
agente o para la preparación de la composición farmacéutica para
prevenir o tratar la artritis de la presente invención comprende al
menos una o más regiones de las CDR de VH y VL del anticuerpo
neutralizador anti-FGF-8. El péptido
que contiene CDR plurales se puede producir uniéndolas directamente
o a través de un conector peptídico apropiado.
Un procedimiento específico para producir el
anticuerpo neutralizador anti-FGF-8
utilizado de la presente invención, un método para evaluar su
actividad, el agente para prevenir o tratar la artritis que
comprende el anticuerpo, el agente diagnóstico de la artritis que
comprende el anticuerpo anti-FGF-8 y
el método para diagnosticar la artritis utilizando el anticuerpo
anti-FGF-8 se describen más
abajo.
Los ejemplos de un antígeno necesario para
producir el anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 incluyen una célula que
produce FGF-8 o su fracción celular, una proteína
FGF-8, un fragmento parcial de la proteína, un
péptido que tiene una secuencia parcial de una secuencia de
aminoácidos de la proteína, y similares.
La proteína FGF-8 y el fragmento
parcial de la proteína se pueden producir tal cual o como una
proteína de fusión intracelularmente o en un sobrenadante de
cultivo construyendo un vector recombinante donde se inserta un
fragmento completo o parcial de ADN que codifica
FGF-8 (Tanaka A. et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 89, 8928-8932, 1992, Tanaka A. et
al., FEBS Lett., 363, 226-230, 1996) aguas abajo
de un promotor de un vector apropiado, introduciendo el vector
recombinante en una célula anfitriona para obtener una célula de
expresión de FGF-8 y cultivando la célula en un
medio apropiado. El péptido que tiene la secuencia parcial de la
proteína FGF-8 se puede preparar utilizando un
sintetizador de péptidos.
El fragmento completo o parcial de ADN que
codifica FGF-8 se puede preparar mediante una
reacción en cadena de la polimerasa [más adelante referida como
PCR; Sambrook J. et al., Molecular Cloning 3^{a} edición,
Cold Spring Harbor Laboratory, 2001 (más adelante referido como
"Molecular Cloning 3^{a} edición"), Ausubel F. M. et
al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &
Sons, 1987-2001 (más adelante referido como Current
Protocols in Molecular Biology) utilizando un ADNc preparado de
células que expresan FGF-8, tales como
SC-3, como
molde.
molde.
Como anfitrión, se puede utilizar cualquiera de
los anfitriones con tal que se pueda expresar allí un gen deseado,
siendo sus ejemplos bacterias, levaduras, células animales, células
de insecto y similares. Los ejemplos de las bacterias incluyen
bacterias pertenecientes al género Escherichia y al género
Bacillus, tales como Escherichia coli y Bacillus
subtilis. Los ejemplos de las levaduras incluyen
Saccharomyces cerevisiae y Schizosaccharomyces pombe.
Los ejemplos de las células animales incluyen una célula Namalwa que
es una célula humana, una célula COS que es una célula de mono, una
célula CHO que es una célula de hámster Chino y similares. Los
ejemplos de las células de insecto incluyen Sf9 y Sf21 (fabricadas
por Pharmingen), High Five (fabricadas por Invitrogen) y
similares.
Como vector en el cual se introduce un fragmento
completo o parcial de ADN que codifica FGF-8, se
puede utilizar cualquiera de los vectores, con tal que el ADN se
pueda incorporar allí y expresar en una célula anfitriona.
Cuando se utiliza una bacteria tal como
Escherichia coli como anfitrión, es preferible el vector de
expresión que comprende un promotor, una secuencia de unión al
ribosoma, un fragmento completo o parcial de ADN que codifica
FGF-8, una secuencia de terminación de la
transcripción y, cuando se requiera, una secuencia de control del
promotor. Sus ejemplos incluyen pGEX-2T asequible
comercialmente (fabricado por Amersham Biosciences) y pET17b
(fabricado por Novagen).
Como método para introducir un vector
recombinante en bacterias, se puede utilizar cualquier método con
tal que se introduzca en las bacterias un ADN, por ejemplo, el
método que utiliza ión calcio (Cohen S. N. et al., Proc.
Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110-2114, 1972) y el
método del protoplasto (Solicitud de Patente Japonesa No examinada
Núm. 248394/88).
Cuando se utilizan levaduras como anfitrión, por
ejemplo, YEp13 (ATCC 37115), YEp24 (ATCC 37051) y YCp50 (ATCC
37419) se utilizan como vector de expresión.
Como método para introducir el vector
recombinante en levaduras, se puede utilizar cualquier método con
tal que un ADN se introduzca en las levaduras. Los ejemplos
incluyen el método de electroporación (Becker D. M. y Guarente L.,
Methods, Enzymol., 194, 182-187, 1991), el método
del esferoplasto (Hinnen A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 84, 1929-1933, 1978), el método con acetato de
litio (ItoH. et al., J. Bacteriol., 153,
163-168, 1983) y similares.
Cuando se utiliza una célula animal como
anfitrión, por ejemplo, pAGE107 (Solicitud de Patente Japonesa No
examinada Núm. 22979/91; Miyaji H. et al., Cytotechnology, 3,
133-140, 1990) y pAGE103 (Mizukami T. y Itoh S., J.
Biochem., 101, 1307-1310, 1987) se utilizan como
vector de expresión.
Se puede utilizar cualquier promotor, con tal
que pueda expresarse en células animales. Los ejemplos incluyen un
promotor génico IE (temprano inmediato) de citomegalovirus (CMV), un
promotor de SV40 o de metalotioneína, y similares. Se puede
utilizar un potenciador del gen IE de CMV humano junto con el
promotor.
Como método para introducir un vector
recombinante en células animales, se puede utilizar cualquiera de
los métodos donde un ADN se introduce en células animales, tales
como el método de electroporación (Miyaji H. et al.,
Cytotechnology, 3, 133-140, 1990), el método del
fosfato de calcio (Solicitud de Patente Japonesa No examinada Núm.
227075/90) y el método de lipofección (Felgner P. L. et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413-7417,
1987).
Cuando se utilizan células de insecto como
anfitrión, se puede expresar una proteína mediante el método
descrito por ejemplo, en Current Protocols in Molecular Biology,
O'Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors: A
Laboratory Manual, Oxford University Press, 1994 o similares. Esto
es, el siguiente vector de introducción de genes recombinantes y el
baculovirus se introducen simultáneamente en células de insecto para
obtener un virus recombinante en el sobrenadante de cultivo de las
células de insecto, y las células de insecto se infectan con el
virus recombinante para obtener las células de insecto de expresión
de la proteína.
Como método de introducción de genes se
utilizan, por ejemplo, pVL1392 y pVL1393 (fabricados ambos por
Pharmingen), pBlueBac4.5 (fabricado por Invitrogen) y
similares.
Como baculovirus, por ejemplo, se utiliza el
virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica,
un virus con el que se infectan insectos de la familia
Noctuidae.
Como método para introducir simultáneamente el
vector de introducción del gen recombinante y el baculovirus para
la preparación del virus recombinante, por ejemplo, se utilizan el
método del fosfato de calcio (Solicitud de Patente Japonesa No
examinada Núm. 227075/90) y el método de lipofección (Felgner P. L.
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84,
7413-7417, 1987) y similares.
Se puede producir una proteína para preparar un
baculovirus recombinante utilizando el Kit Baculo Gold Starter
fabricado por Pharmingen o similares y después infectar células de
insecto tales como Sf9, Sf21, High Five y similares como se ha
mencionado antes con el virus recombinante (Bio/Technology, 6, 47,
1988).
Como método para expresar el gen, se han
desarrollado la producción secretora, la proteína de expresión de
la fusión y similares, además de la expresión intracelular de la
proteína FGF-8 sola, y se puede utilizar cualquiera
de estos métodos. Por ejemplo, la expresión se puede realizar de
acuerdo con el método descrito en Molecular Cloning 3^{a}
edición.
El transformante obtenido de este modo se
cultiva en un medio para formar y acumular la proteína
FGF-8 en el cultivo, y la proteína
FGF-8 se extrae del cultivo, con lo que se puede
producir el fragmento completo o parcial de la proteína
FGF-8 tal cual o como una proteína de fusión.
El método para cultivar el transformante en un
medio se lleva a cabo de acuerdo con método ordinario utilizado en
el cultivo de un anfitrión.
Como medio para cultivar el transformante
obtenido utilizando microorganismos tales como Escherichia
coli o levaduras como anfitrión, se puede utilizar un medio
natural o un medio sintético, con tal que comprenda fuentes de
carbono, fuentes de nitrógeno, sales inorgánicas y similares que
pueden ser asimilables por los microorganismos y se puede llevar a
cabo el cultivo de los transformantes eficazmente (Molecular Cloning
3^{a} edición). El cultivo se lleva a cabo usualmente en
condiciones aerobias tales como cultivo con movimiento oscilatorio
o cultivo de aireación-agitación sumergido de 15 a
40ºC durante 16 a 96 horas. Durante el cultivo, el pH se mantiene
de 3,0 a 9,0. El pH se ajusta con un ácido inorgánico u orgánico,
una solución alcalina, urea, carbonato cálcico, amoníaco o
similares. Si fuera necesario, se pueden añadir antibióticos tales
como ampicilina y tetraciclina al medio durante el cultivo.
Como medio para cultivar el transformante
obtenido utilizando células animales como anfitrión, están
disponibles medio RPMI 1640, medio MEM de Eagle, conteniendo estos
medios suero bovino fetal (más adelante abreviado como FBS) y
similares que se utilizan generalmente. El cultivo se lleva a cabo
usualmente en presencia de CO_{2} al 5% de 35 a 37ºC durante 3 a
7 días. Si fuera necesario, se pueden añadir antibióticos tales como
kanamicina y penicilina al medio durante el cultivo.
Como medio para cultivar el transformante
obtenido utilizando células de insecto como anfitrión, están
disponibles medio TNM-FH (fabricado por
Pharmingen), Sf900IISFM (fabricado por Invitrogen),
EX-CELL400 y EX-CELL405 (fabricados
ambos por JRH Biosciences) y similares que se utilizan generalmente.
El cultivo se lleva a cabo de 25 a 30ºC durante 1 a 4 días. Si
fuera necesario, se pueden añadir al medio antibióticos tales como
gentamicina durante el cultivo.
En el cultivo anterior de las células animales y
las células de insecto, es preferible, si fuera posible, utilizar
un medio sin suero para facilitar la purificación del fragmento
completo o parcial de FGF-8 como tal o como una
proteína de fusión.
Cuando el fragmento completo o parcial de
FGF-8 se acumula en el interior de células
anfitrionas como tal o como una proteína de fusión, la células se
centrifugan una vez completado el cultivo, se suspenden en un
tampón acuoso, y se aplica el método de rotura por ultrasonido, el
método de la prensa French o similares. La proteína se recupera del
sobrenadante obtenido mediante centrifugación.
Asimismo, cuando se forma intracelularmente un
cuerpo no disuelto, se puede formar la estructura tridimensional de
una proteína diluyendo o dializando la solución solubilizada a una
concentración del agente desnaturalizante de la proteína tal que no
desnaturaliza la proteína o sin el agente desnaturalizante de la
proteína, después de solubilizar con un agente desnaturalizante de
la proteína.
Cuando el fragmento completo o parcial de la
proteína FGF-8 o la proteína de fusión de estas
proteínas es secretado extracelularmente, la proteína expresada se
puede recuperar del sobrenadante de cultivo.
El aislamiento y la purificación se pueden
llevar a cabo utilizando procedimientos de separación tales como
extracción con disolvente, precipitación fraccionada con un
disolvente orgánico, precipitación por adición de sal, diálisis,
centrifugación, ultrafiltración, cromatografía de intercambio
iónico, cromatografía de filtración en gel, cromatografía
hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía de fase inversa,
cristalización y electroforesis solos o combinados.
El péptido que tiene una secuencia parcial de la
secuencia de aminoácidos de FGF-8 se puede producir
mediante métodos de síntesis química tales como el método Fmoc
(fluorenilmetiloxicarbonilo) y el método tBoc
(t-butiloxicarbonilo). También se puede producir
utilizando un sintetizador de péptidos de Advanced ChemTech, Applied
Biosystems, Protein Technologies, Shimadzu Corporación y
similares.
Los animales se inmunizan utilizando la proteína
obtenida anteriormente como antígeno. Con respecto al método de
inmunización, el antígeno se puede administrar directamente a los
animales subcutáneamente, intravenosamente o intraperitonealmente.
Es preferible administrar el antígeno combinado con una proteína
portadora que tiene alta inmunogenicidad o administrar el antígeno
junto con un coadyuvante apropiado.
Los ejemplos de la proteína portadora incluyen
hemocianina de lapa ojo de cerradura, seralbúmina bovina,
tiroglobulina bovina y similares. Los ejemplos del coadyuvante
incluyen Coadyuvante Competo de Freund, gel de hidróxido de
aluminio, vacuna de bacterias pertussis y similares.
Los ejemplos de los animales inmunizados
incluyen mamíferos no humanos tales como conejos, cabras, ratones,
ratas y hámsteres.
El antígeno se administra, después de la primera
administración, de 3 a 10 veces cada 1 a 2 semanas. La dosis del
antígeno es preferiblemente de 50 a 100 \mug por animal. La
muestra de sangre se recoge del plexo venoso del fundus del ojo o
de la vena de la cola del animal inmunizado 3 a 7 días después de
cada administración. La capacidad de unión específica con el
antígeno del suero se confirma mediante inmunoanálisis enzimático
[Koso Men-eki Sokuteiho, 3^{a} edición, Igaku
Shoin, 1987, Antibodies A Laboratory Manual (Chapter 14), Goding J.
W., Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press,
1996 (más adelante abreviado como Monoclonal Antibodies] o
similares como se describe a continuación.
El inmunoanálisis enzimático se puede realizar
como sigue.
Una proteína antigénica o células con una
proteína antigénica expresada se aplica como recubrimiento a una
placa, y se hace reaccionar con un suero recolectado de animales
inmunizados como primer anticuerpo. Después de la reacción del
primer anticuerpo, la placa se lava, y a esto se le añade un segundo
anticuerpo. Después de la reacción, se lleva a cabo una reacción de
detección correspondiente a una sustancia marcada con el segundo
anticuerpo, y se mide un título de anticuerpo.
El segundo anticuerpo es un anticuerpo capaz de
reconocer el primer anticuerpo, que está marcado con una enzima tal
como peroxidasa o biotina. Específicalmente, cuando se utiliza un
ratón como animal inmunizado, como segundo anticuerpo se utiliza un
anticuerpo capaz de reconocer la inmunoglobulina de ratón.
Los animales no humanos en los que el suero
muestra un título de anticuerpo suficiente se utilizan como fuente
de suministro de células productoras de anticuerpo.
Al cabo de 3 a 7 días de la administración final
del antígeno, los linfocitos se extraen de los animales inmunizados
para fusionarlos con células de mieloma, de acuerdo con el método
método conocido (Antibodies A Laboratory Manual).
El anticuerpo policlonal se puede preparar
separando y purificando el suero. El que el anticuerpo policlonal
tenga la actividad neutralizadora para inhibir la actividad de
FGF-8 se puede examinar mediante el análisis del
crecimiento celular descrito en el apartado 1. (4) siguiente.
El anticuerpo monoclonal se puede preparar
fusionando las células productoras de anticuerpos con las células
de mieloma derivadas de mamíferos no humanos para producir
hibridomas, cultivando los hibridomas o administrando los
hibridomas a los animales para formar el tumor ascítico de la
células y separando y purificando la solución de cultivo o el
fluido ascítico.
Las células productoras de anticuerpos se pueden
extraer de células de bazo, nódulos lifáticos, sangre perifériac y
similares de los animales no humanos a los que se ha administrado el
antígeno.
Como células de mieloma, se pueden utilizar
cualquiera de las células de mieloma susceptibles de crecimiento
in vitro, tales como líneas celulares de mieloma de ratón
resistentes a 8-azaguanina (derivados de BALB/c)
P3-X63Ag8-U1 (Kohler G y Milstein C,
Eur. J. Immunol., 6, 511-519, 1976),
SP2/0-Ag14 (Shulman M. et al., Nature, 276,
269-270, 1978),
P3-X63-Ag8653 (Kearney J. F. et
al., J. Immunol., 123, 1548-1550, 1979) y
P3-X63-Ag8 (Kohler G y Milstein C,
Nature, 256, 495-497, 1975) que son líneas celulares
establecidas obtenidas de un ratón. Con respecto al cultivo y al
subcultivo de estas líneas celulares, se asegura un número de
células de hasta al menos 2 x 10^{7} células o más hasta la
fusión celular de acuerdo con el método conocido (Antibodies A
Laboratory Manual).
Las células productoras de anticuerpos y las
células de mieloma obtenidas antes se lavan, y a esto se le añade
un medio de agregación celular tal como
polietilenglicol-1000 (PEG-1000)
para fusionar la células. Las células fusionadas se suspenden en un
medio. Las células se lavan utilizando medio MEM, PBS (1,83 g/L de
Na_{2}EPO_{4}, 0,21 g/L de KH_{2}PO_{4}, 7,65 g/L de NaCl,
pH 7,2) o similares. Como medio donde suspender las células
fusionadas, se utiliza medio HAT [medio obtenido añadiendo 100
\mumoles/L de hipoxantina, 15 \mumoles/L de timidina y 0,4
\mumoles/L de aminopterina a un medio normal (medio RPMI 1640
conteniendo 1,5 moles/L de glutamina, 50 \mumoles/L de
2-mercaptoetanol, 10 g/mL de gentamicina y FBS al
10%) para obtener selectivamente las células fusionadas deseadas
solas.
Después del cultivo, se toman muestras de una
parte del sobrenadante de cultivo, y se hacen reaccionar con una
proteína antigénica mediante el siguiente inmunoanálisis enzimático
para seleccionar una muestra que no se hace reaccionar con una
proteína no antigénica. Con posterioridad, se realiza la clonación
mediante el método de dilución limitante, y se selecciona la célula
donde se mide establemente un título de anticuerpo elevado mediante
inmunoanálisis enzimático como la línea celular de hibridoma que
produce el anticuerpo monoclonal que se une específicamente a
FGF-8.
El inmunoanálisis enzimático se realiza como se
describe en el apartado 1. (2) excepto que se utiliza el
sobrenadante de cultivo del hibridoma o un anticuerpo purificado
obtenido mediante un método que se va a describir más adelante como
primer anticuerpo.
La unión específica entre el anticuerpo
monoclonal y FGF-8 se puede evaluar también mediante
resonancia de plasmón superficial (Karlsson R. et al., J.
Immunol. Methods, 145, 229-240, 1991).
Los ejemplos específicos del anticuerpo
monoclonal anti-FGF-8 incluyen el
anticuerpo monoclonal KM1334 producido por el hibridoma KM1334
(FERM BP-5451) perteneciente a subclase de IgG1 de
ratón como se describe en la Solicitud de Patente Japonesa No
examinada Núm. 271391/97.
El que el anticuerpo monoclonal
anti-FGF-8 producido por el
hibridoma seleccionado anteriormente pueda inhibir la actividad de
FGF-8 se examina mediante un análisis de inhibición
del crecimiento utilizando, como célula diana, la línea celular de
cáncer de mama de ratón SC-3 (Nakamura N. et
al., J. Steroid Biochem., 27, 459-464, 1987),
fibroblasto de ratón NIH/3T3 (ATCC No. CRL-1658) o
la línea celular de cáncer prostático humano LNCaP (ATCC No:
CRL-1740). En el método, cuando la célula diana se
cultiva en un medio que contiene FGF-8 (de 1 a 100
ng/mL) o testosterona, el sobrenadante de cultivo o el anticuerpo
monoclonal anti-FGF-8 purificado de
acuerdo con el método descrito en el apartado 2. (5) siguiente se
diluye por etapas hasta una concentración final de 0,001 a 100
\mug/mL, y se añade al medio. Después de cultivar durante 24 a 72
horas, se mide el número de células vivas utilizando una solución
de MTT [bromuro de
3-(4,5-dimetil-2-tiazol-2-il)-2,5-difenil-2H-tetrazolio],
un kit de recuento de células, un kit WST-1 o
similares. Cuando el número de células vivas desciende
dependientemente de la concentración del anticuerpo monoclonal
anti-FGF-8 en comparación con el
caso en el que no se añade el anticuerpo monoclonal
anti-FGF-8, se puede confirmar que
el anticuerpo monoclonal anti-FGF-8
es un anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 que inhibe la actividad
de FGF-8.
La actividad de inhibición de la unión de
FGF-8 al receptor sobre la superficie celular por el
anticuerpo monoclonal anti-FGF-8 se
puede medir mediante el método Bolton-Hunter (Bolton
A. E. y Hunter W. M., Biochem. J., 133, 529-539,
1973) o similares utilizando un sistema para medir la unión de
FGF-8 marcado con I^{125} a la línea celular
anterior.
El anticuerpo monoclonal KM1334 anterior es un
anticuerpo neutralizador anti-FGF-8
que tiene la actividad de inhibir la actividad
FGF-8, y es preferible como agente para prevenir o
tratar la artritis.
Las células de hibridoma que producen el
anticuerpo monoclonal se administran intraperitonealmente a ratones
de 8 a 10 semanas de edad o ratones carentes de sistema inmunitario
alimentados 2 semanas mediante la administración intraperitoneal de
0,5 mL de una solución de cultivo formada cultivando células de
hibridoma o Pristano
(2,6,10,14-tetrametilpentadecano) para ocasionar la
formación de cáncer ascítico, y el anticuerpo monoclonal se puede
preparar separándolo y purificándolo del fluido ascítico
resultante.
Como método para separar y purificar el
anticuerpo monoclonal, se utilizan centrifugación, precipitación por
adición de sal con sulfato de amonio saturado del 40 al 50%, el
método de precipitación con ácido caprílico, cromatografías
utilizando una columna de DEAE-Sefarosa, una columna
de intercambio aniónico, una columna con proteína A o G y una
columna de filtración en gel, y similares solos o combinados. El
anticuerpo monoclonal purificado se puede obtener recuperando la
fracción de IgG o IgM mediante este método.
La subclase del anticuerpo monoclonal purificado
se puede determinar utilizando un kit de tipificación de
anticuerpos monoclonales o similares. La cantidad de la proteína se
puede calcular mediante el método de Lowry o absorbancia a 280
nm.
La subclase del anticuerpo es un isotipo de la
clase. Sus ejemplos incluyen IgG1, IgG2a, IgG2b y IgG3 en ratón, e
IgG1, IgG2, IgG3 y IgG4 en seres humanos. Especialmente los tipos
IgG3 y IgG2a de ratón y el tipo IgG1 humano tienen actividad
citotóxica dependiente del complemento y actividad citotóxica
dependiente del anticuerpo, y son útiles en la aplicación
terapéutica.
Se construye un vector para la expresión de un
anticuerpo humanizado necesario para producir un anticuerpo
humanizado a partir de un anticuerpo de un animal no humano. El
vector para la expresión del anticuerpo humanizado es un vector
para la expresión en células animales que tiene insertados los genes
que codifican CH y CL que son las regiones C de un anticuerpo
humano, y se puede construir insertando los genes que codifican CH y
CL de un anticuerpo humano en un vector para la expresión en
células animales.
Las regiones C del anticuerpo humano pueden ser
CH y CL de cualquier anticuerpo humano. Sus ejemplos incluyen CH de
la subclase \gamma1, CH de la subclase \gamma4 y CL de la clase
\kappa de un anticuerpo humano, y similares. Como ADN que
codifican CH y CL de un anticuerpo humano, se pueden utilizar ADN
cromosómicos que comprenden exones e intrones, y también están
disponibles los ADNc. Como vector para la expresión en células
animales, se puede utilizar cualquiera de los vectores con tal que
los genes que codifican las regiones C de un anticuerpo humano se
puedan insertar y expresar allí.
Sus ejemplos incluyen pAGE107 (Solicitud de
Patente Japonesa No examinada Núm. 22979/91; Miyaji H. et
al., Cytotechnology, 3, 133-140, 1990), pAGE103
(Mizukami T. y Itoh S., J. Biochem., 101, 1307-1310,
1987), pHSG274 (Brady G. et al., Gene, 27,
223-232, 1984), pKCR (O'Hare K. et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA., 78, 1527-1531, 1981),
pSG1\betad2-4 (Miyaji H. et al.,
Cytotechnology, 4, 173-180, 1990) y similares. Los
ejemplos del promotor y del potenciador utilizados en el vector
para la expresión en una célula animal incluyen el promotor inicial
y el potenciador de SV40 (Mizukami T. y Itoh S., J. Biochem., 101,
1307-1310, 1987), el promotor LTR y el potenciador
del virus de la leucemia de ratón de Moloney (Kuwana Y. et
al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 149,
960-968, 1987) y un promotor (Mason J. O. et
al., Cell, 41, 479-487, 1985) y un potenciador
(Gillies S. D. et al., Cell, 33, 717-728,
1983) de la cadena H de la inmunoglobulina, y similares.
Como vector para la expresión del anticuerpo
humanizado, se pueden utilizar un tipo donde la cadena H y la
cadena L del anticuerpo están presentes en diferentes vectores o un
tipo donde están presentes en uno y el mismo vector (tipo tándem).
Es preferible un vector de tipo tándem para la expresión del
anticuerpo humanizado en vista de la facilidad de construcción del
vector de expresión del anticuerpo humanizado, la facilidad de
introducción en las células animales y el equilibrio de la cantidad
de la cadena H y la cadena L del anticuerpo expresado en las
células animales (Shitara K. et al., J. Immunol. Methods,
167, 271-278, 1994). Los ejemplos del vector de
tipo tándem para la expresión del anticuerpo humanizado incluyen
pKANTEX93 (documento WO 97/10354), pEE18 (Bentley K. J. et
al, Hybridoma, 17, 559-567, 1998) y
similares.
El vector construido para la expresión del
anticuerpo humanizado se puede utilizar en la expresión de un
anticuerpo quimérico humano y un anticuerpo injertado a CDR humana
en células animales.
Los ADN que codifican VH y VL de un anticuerpo
neutralizador anti-FGF-8 de un
animal no humano, por ejemplo, un anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 monoclonal de ratón se
obtienen como sigue.
Se extraen los ARNm de las células que produce
un anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 monoclonal de ratón, por
ejemplo, se sintetizan los hibridomas que producen un anticuerpo
neutralizador de FGF-8 de ratón, y se sintetizan
los ADNc. Los ADNc sintetizados se insertan en vectores tales como
fagos o plásmidos para producir una genoteca de ADNc. De esta
genoteca, se aíslan respectivamente un fago recombinante o un
plásmido recombinante que tiene un ADNc que codifica VH y un fago
recombinante o un plásmido recombinante que tiene un ADNc que
codifica VL utilizando un radical de la región C o un radical de la
región V de un anticuerpo de ratón como sonda.
Se determinan las secuencias de nucleótidos
completas de VH y VL en el fago recombinante o el plásmido
recombinante, y las secuencias de aminoácidos completas de VH y VL
se estiman a partir de las secuencias de nucleótidos.
Como animal no humano, se puede utilizar
cualquier animal capaz de producir hibridomas, tal como ratones,
ratas, hámsteres y conejos. El procedimiento para preparar los ARN
totales a partir de los hibridomas incluye el método del tiocianato
de guanidina-trifluoroacetato de cesio (Okayama H.
et al., Methods Enzymol., 154, 3-28, 1987),
y el procedimiento para preparar los ARNm a partir de los ARN
totales incluye el método de inmovilización en columna de celulosa
con oligo (dT) (Molecular Cloning 3^{a} edición) o similares. Los
ejemplos de un kit para preparar los ARNm a partir de los
hibridomas incluyen el Kit de Aislamiento de ARNm FastTrack
(fabricado por Invitrogen), el Kit de Purificación de ARNm
QuickPrep (fabricado por Amersham Biosciences) y similares.
Los ejemplos de un procedimiento para sintetizar
los ADNc y que producen una genoteca de ADNc incluyen el
procedimiento habitual (Molecular Cloning 3^{a} edición; Current
Protocols in Molecular Biology) y el procedimiento que utiliza kits
asequibles comercialmente tales como SuperScript Choice System for
ADNc Synthesis (fabricado por Invitrogen), ZAP-ADNc
Synthesis Kit (fabricado por Stratagene) y TimeSaver ADNc Synthesis
Kit (fabricado por Amersham Biosciences).
Como vector en el que incorporar un ADNc
sintetizado utilizando un ARNm extraído de un hibridoma como molde
en la producción de una genoteca de ADNc, se puede utilizar
cualquiera de los vectores susceptibles de subclonar el ADNc. Sus
ejemplos incluyen vectores de fagos y plásmidos tales como ZAP
Express (fabricado por Stratagene), pBluescript II SK(+) (fabricado
por Stratagene), \lambdaZAPII (fabricado por Stratagene),
\lambdagt10 (fabricado por Stratagene), \lambdagt11 (fabricado
por Stratagene), Lambda BlueMid (fabricado por Clontech),
\lambdaExCell (fabricado por Amersham Biosciences), pcD2 (Okayama
H. y Berg P., Mol. Cell. Biol., 3, 280-289, 1983) y
pUC18 (Yanisch-Perron C. et al., Gene 33,
103-119, 1985).
Como Escherichia coli donde introducir la
genoteca de ADNc construida mediante el vector de fagos o
plasmídico, se puede utilizar cualquier Escherichia coli
capaz de introducir, expresar y mantener la genoteca de ADNc. Sus
ejemplos incluyen XL1-Blue MRF' (fabricado por
Stratagene), C600 (Appleyard R. K. Genetics, 39,
440-452, 1954), Y1088 (Young R. A. y Davis R.,
Science, 222, 778-782, 1983), Y1090 (Young R. A. y
Davis R., Science, 222, 778-782, 1983), NM522
(Gough J. A. y Murray N. E., J. Mol. Biol., 166,
1-19, 1983), K802 (Wood W. B., J. Mol. Biol., 16,
118-133, 1966), JM105
(Yanisch-Perron C. et al., Gene, 33,
103-119, 1985) y similares.
Los clones de ADNc que codifican VH y VL del
anticuerpo neutralizador anti-FGF-8
del animal no humano se pueden seleccionar de la genoteca de ADNc
mediante el método de hibridación de colonias o el método de
hibridación en placa utilizando una sonda isotópica o marcada con
fluorescencia (Molecular Cloning 3^{a} edición). Adicionalmente,
los ADNc que codifican VH y VL se pueden preparar también a través
de PCR utilizando cebadores preparados y utilizando los ADNc o una
genoteca de ADNc sintetizados a partir de los ARNm como molde.
Las secuencias de nucleótidos de los ADNc
seleccionados mediante el método anterior se pueden determinar
mediante la reacción basada en el método didesoxi (Sanger F. et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467,
1977) utilizando los ADNc clonados en un vector apropiado y el
análisis utilizando un Secuenciador de ADN tal como ABI377
(fabricado por Applied Biosystems) o similares.
Las secuencias completas de aminoácidos de VH y
VL codificadas por los ADNc se estiman a partir de las secuencias
de nucleótidos de los ADNc obtenidas y determinadas en el apartado
2. (2), y se puede confirmar si los ADNc resultantes codifican las
secuencias de aminoácidos completas de VH y VL de un anticuerpo que
contiene una secuencia señal secretora en comparación con las
secuencias de aminoácidos completas de VH y VL del anticuerpo
conocido (Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Depot.
Health and Human Services, 1991, más adelante referido como
"Secuencias de Proteínas de Interés Inmunológico"). Con
respecto a las secuencias de aminoácidos completas de VH y VL del
anticuerpo que contiene la secuencia señal secretora, es posible
estimar la longitud de la secuencia señal secretora y la secuencia
de aminoácidos N-terminal y los subgrupos conocidos
a los que pertenecen en comparación con las secuencias de
aminoácidos completas de VH y VL del anticuerpo conocido
(Secuencias de Proteínas de Interés Inmunológico).
La novedad de las secuencias se puede examinar
realizando la búsqueda de homología de secuencias de aminoácidos
completas de VH y VL resultantes utilizando un programa de búsqueda
de homología tal como BLAST (Altschul S. F. et al., J. Mol.
Biol., 215, 403-410, 1990) o similares con respecto
a cualquier base de datos, por ejemplo, SWISS-PROT
o PIR-Protein.
Las VH y VL que forman sitios de unión al
antígeno de un anticuerpo comprenden cuatro FR con secuencias
relativamente conservadas y tres CDR (CDR1, CDR2, CDR3) con
secuencias diversas que se unen a ellas (Secuencias de Proteínas de
Interés Inmunológico). Las secuencias de aminoácidos de las CDR de
VH y VL se pueden identificar comparándolas con las secuencias de
aminoácidos de las regiones V del anticuerpo conocido (Secuencias de
Proteínas de Interés Inmunológico).
El vector de expresión del anticuerpo quimérico
neutralizador anti-FGF-8 se puede
construir insertando los ADN que codifican VH y VL del anticuerpo
neutralizador anti-FGF-8 del animal
no humano aguas arriba de los genes que codifican CH y CL del
anticuerpo humano del vector para la expresión de anticuerpo
humanizado construido en el apartado 2. (1). Por ejemplo, VH y VL
del anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 del animal no humano se
amplifican mediante el método PCR utilizando un plásmido que tiene
los ADN que codifican VH y VL del anticuerpo como molde y cebadores
en el lado terminal 5' y el lado terminal 3', los cebadores que
comprenden las secuencias de reconocimiento de las endonucleasas de
restricción apropiadas y las secuencias de nucleótidos que codifican
las regiones V. Los productos amplificados respectivos se clonan en
un plásmido tal como pBluescript II SK(-) (fabricado por
Stratagene), y las secuencias de nucleótidos se determinan mediante
el método descrito en el apartado 2. (2) para obtener un plásmido
que tiene las secuencias de ADN que codifican las secuencias de
aminoácidos de VH y VL del anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8. Los ADN que codifican
las secuencias de aminoácidos de VH y VL del anticuerpo
neutralizador anti-FGF-8 se aíslan
del plásmido resultante, se clonan aguas arriba de los genes que
codifican CH y CL del anticuerpo humano del vector para la expresión
de anticuerpo humanizado descrito en el apartado 2.(1) de manera
que estos se expresan en la forma apropiada. De esta manera, se
puede construir el vector de expresión del anticuerpo quimérico
neutralizador anti-FGF-8.
Los ADN que codifican VH y VL del anticuerpo
injertado a CDR neutralizador
anti-FGF-8 se pueden construir como
sigue. Primero, se seleccionan las secuencias de aminoácidos de las
FR de VH y VL de un anticuerpo humano sobre las que injertar las
secuencias de aminoácidos de las CDR de VH y VL del anticuerpo
neutralizador anti-FGF-8 del animal
no humano. Como secuencias de aminoácidos de las FR de VH y VL del
anticuerpo humano, se pueden utilizar cualquiera de las secuencias
de aminoácidos derivadas del anticuerpo humano. Sus ejemplos
incluyen las secuencias de aminoácidos de VH y VL del anticuerpo
humano registradas en bases de datos de nucleótidos tales como
Protein Data Bank y secuencias consenso de aminoácidos de subgrupos
de FR de VH y VL del anticuerpo humano (Secuencias de Proteínas de
Interés Inmunológico). Entre estas, es preferible seleccionar
secuencias de aminoácidos que tienen una homología con las
secuencias de aminoácidos de las FR de VH y VL del anticuerpo
neutralizador anti-FGF-8 del animal
no humano tan alta como sea posible, preferiblemente secuencias de
aminoácidos que tienen una homología con éstas de 60% o más para
producir el anticuerpo injertado a CDR humana que tiene suficiente
actividad.
Con posterioridad, las secuencias de aminoácidos
deseadas de las CDR de VH y VL del anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 del animal no humano se
injertan en las secuencias de aminoácidos seleccionadas de las FR de
VH y VL del anticuerpo humano para diseñar las secuencias de
aminoácidos de VH y VL del anticuerpo injertado a CDR neutralizador
anti-FGF-8. Las secuencias de
aminoácidos diseñadas se convierten en secuencias de nucleótidos
considerando la frecuencia de los codones encontrada en las
secuencias de nucleótidos de los genes del anticuerpo (Secuencias
de Proteínas de Interés Inmunológico) para diseñar la secuencia de
nucléotidos que codifican las secuencias de aminoácidos de VH y VL
del anticuerpo injertado a CDR neutralizador
anti-FGF-8. De acuerdo con las
secuencias de nucleótidos diseñadas, se sintetizan varios ADN
sintéticos que tienen una longitud de 100 a 150 bases, y se lleva a
cabo la PCR utilizándolos. En este caso, es preferible diseñar
cuatro ADN sintéticos de cada VH y VL en vista de la eficacia de la
reacción PCR y la longitud de los ADN que se pueden sintetizar.
Adicionalmente, los ADN se pueden clonar fácilmente en el vector
para la expresión del anticuerpo humanizado construido en el
apartado 2. (1) introduciendo las secuencias de reconocimiento de
las endonucleasas de restricción apropiadas en los extremos 5' de
los ADN sintéticos localizados en ambos extremos. Después de la
reacción PCR, los productos amplificados se clonan en un vector
plasmídico tal como pBluescript SK(-) (fabricado por Stratagene), y
las secuencias de nucleótidos se determinan mediante el método
descrito en el apartado 2. (2) para obtener el plásmido que tiene
la secuencia de nucléotidos que codifica las secuencias de
aminoácidos de VH y VL del anticuerpo injertado a CDR neutralizador
anti-FGF-8 deseado.
Se sabe que la actividad de unión al antígeno
del anticuerpo injertado a CDR humana deseado desciende en
comparación con la actividad original del anticuerpo del animal no
humano injertando sólo las CDR de VH y VL del anticuerpo del animal
no humano en las FR de VH y VL del anticuerpo humano (Tempest P. R.
et al., Bio/technology, 9, 266-271, 1991).
Con respecto a su causa, algunos residuos aminoácido no sólo de las
CDR sino también de las FR están implicados en la actividad de
unión al antígeno directamente o indirectamente en VH y VL del
anticuerpo original del animal no humano, y se considera que estos
residuos aminoácido cambian a otros residuos aminoácido de las FR
de VH y VL del anticuerpo humano de acuerdo con el injerto de las
CDR. Con el fin de resolver este problema, en el anticuerpo
injertado a CDR humana, los residuos aminoácido que están implicados
directamente en la unión al antígeno o los residuos aminoácido que
interactúan con los residuos aminoácido de las CDR o mantienen la
estructura tridimensional del antígeno y están implicados
indirectamente en la unión al antígeno se identifican en las
secuencias de aminoácidos de las FR de VH y VL del anticuerpo
humano, y se remplazan por residuos aminoácido encontrados en el
anticuerpo original del animal no humano para aumentar la actividad
de unión al antígeno disminuida (Tempest P. R. et al.,
Bio/technology, 9, 266-271, 1991). En la producción
del anticuerpo injertado a CDR humana, el punto más importante es
cúan eficazmente se identifican los residuos aminoácido de las FR
implicadas en la actividad de unión al antígeno. Para este fin, se
realizan la construcción y el análisis de la estructura
tridimensional del anticuerpo mediante cristalografía de rayos X
(Bernstein F. C. et al., J. Mol. Biol., 112,
535-542, 1977), modelado por ordenador (Tempest P.
R. et al., Protein Engineering, 7,
1501-1507, 1994) o similares. La información de la
estructura tridimensional del anticuerpo obtenido mediante estos
métodos ha proporcionado mucha información útil en la producción del
anticuerpo injertado a CDR humana. Mientras tanto, todavía no se ha
establecido un procedimiento para producir un anticuerpo injertado a
CDR humana que se pueda aplicar a cualquier anticuerpo. En la
actualidad, se requieren varios ensayos de
prueba-error donde se producen diversos tipos de
variantes para los anticuerpos respectivos y se examina la
interrelación de sus actividades de unión al antígeno.
La modificación de los residuos aminoácido de
las FR de VH y VL del anticuerpo humano se puede lograr realizando
el método PCR utilizando ADN sintéticos como cebadores para la
mutagénesis. Con respecto a los productos amplificados después de
la PCR, sus secuencias de nucleótidos se determinan mediante el
método descrito en el apartado 2. (2) para confirmar que se ha
llevado a cabo la modificación deseada, con lo que se obtiene el
vector que comprende los ADN con la modificación deseada
introducida (más adelante referido como vector con la secuencia de
aminoácidos modificada).
La modificación de las secuencias de aminoácidos
en una región estrecha se realiza mediante los métodos de
mutagénesis por PCR utilizando cebadores de mutagénesis que
comprenden de 20 a 35 bases. Específicamente, se sintetizan un
cebador para mutagénesis efector y un cebador para mutagénesis
antisentido que comprenden de 20 a 35 bases y que comprenden una
secuencia de ADN que codifica los residuos aminoácido después de la
modificación, y se realiza la PCR de dos etapas utilizando un
plásmido que comprende los ADN que codifican las secuencias de
aminoácidos de VH y VL que se van a modificar como molde. Después de
subclonar el fragmento amplificado final en un vector apropiado, se
determina su secuencia de nucleótidos para obtener un vector con la
secuencia de aminoácidos modificada que comprende los ADN con la
mutagénesis deseada.
El vector de expresión del anticuerpo injertado
a CDR neutralizador anti-FGF-8 se
puede construir insertando el ADN que codifica VH y VL del
anticuerpo injertado a CDR neutralizador
anti-FGF-8 construido en el apartado
2.(5) y (6) aguas arriba de los ADN que codifican CH y CL del
anticuerpo humano del vector para la expresión de anticuerpo
humanizado descrito en 2.(1). Por ejemplo, las secuencias de
reconocimiento de las endonucleasas de restricción apropiadas se
introducen en los extremos 5' de los ADN sintéticos localizados en
ambos extremos entre los ADN sintéticos utilizados para construir
VH y VL del anticuerpo injertado a CDR neutralizador
anti-FGF-8 en el apartado 2. (5) y
(6), con lo que se puede realizar la clonación de manera que estos
se expresan en una forma apropiada aguas arriba de los ADN que
codifican CH y CL del anticuerpo humano del vector para la
expresión de anticuerpo humanizado descrito en el apartado
2.(1).
Con el fin de evaluar eficazmente la actividad
de unión al antígeno de muchos tipos de los anticuerpos humanizados
producidos, se puede llevar a cabo la expresión transitoria de los
anticuerpos humanizados utilizando el vector de expresión del
anticuerpo quimérico neutralizador
anti-FGF-8 descrito en el apartado
2. (4), el vector de expresión del anticuerpo injertado a CDR
neutralizador anti-FGF-8 descrito en
el apartado 2.(7) o uno de sus vectores de expresión modificados.
Como célula anfitriona donde introducir el vector de expresión, se
puede utilizar cualquiera de las célula anfitrionas capaces de
expresar el anticuerpo humanizado. Generalmente se utiliza la
célula COS-7 (ATCC No: CRL-1651)
debido a su gran cantidad de expresión (Warr G. W. et al.,
Methods in Nucleic Acids Research, CRC Press, 283, 1990). Los
ejemplos del método para introducir el vector de expresión en la
célula COS-7 incluyen el método del
DEAE-dextrano (Warr G. W. et al., Methods in
Nucleic Acids Research, CRC press, 283, 1990) y el método de
lipofección (Felgner P. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 84, 7413-7417, 1987).
Después de la introducción del vector de
expresión, se pueden medir la cantidad de expresión del anticuerpo
humanizado en el sobrenadante de cultivo y su actividad de unión al
antígeno mediante el inmunoanálisis enzimático, como se describe en
1. (2), utilizando el sobrenadante de cultivo como primer anticuerpo
y el anticuerpo anti-inmunoglobulina humana marcado
como segundo anticuerpo, o similares. Adicionalmente, el que se
conserve o no la actividad neutralizadora mediante la cual inhibir
la actividad FGF-8 se puede confirmar mediante
mediante un análisis de inhibición del de crecimiento celular
descrito en el apartado 1. (4).
Se puede obtener un transformante que produce
establemente el anticuerpo humanizado introduciendo el vector de
expresión del anticuerpo quimérico neutralizador
anti-FGF-8 descrito en el apartado
2. (4) o el vector de expresión del anticuerpo injertado a CDR
neutralizador anti-FGF-8 descrito en
el apartado 2. (7) en una célula anfitriona apropiada.
El método para introducir el vector de expresión
en la célula anfitriona incluye el método de electroporación
(Solicitud de Patente Japonesa No examinada Núm. 257891/90; Miyaji
H. et al., Cytotechnology, 3, 133-140,
1990).
Como célula anfitriona donde introducir el
vector de expresión del anticuerpo quimérico neutralizador
anti-FGF-8 o el vector de expresión
del anticuerpo injertado a CDR neutralizador
anti-FGF-8, se puede utilizar
cualquiera de las células anfitrionas capaces de expresar el
anticuerpo humanizado. Sus ejemplos incluyen célula
SP2/0-Ag14 de ratón (ATCC No:
CRL-1581), célula P3X63-Ag8.653 de
ratón (ATCC No: CRL-1580), célula CHO/DG44 (Urlaub
G. y Chain L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77,
4216-4220 1980) que es una célula CHO carente del
gen de la ácido dihidrofólico reductasa (más adelante abreviada
como DHFR), célula YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 de rata (ATCC No:
CRL-1662, más adelante referida como célula YB2/0),
y similares.
El transformante que produce establemente el
anticuerpo humanizado después de la introducción del vector de
expresión se puede seleccionar mediante el cultivo en un medio de
cultivo de células animales que contiene un compuesto tal como G418
(G418 sulfato; fabricado por Sigma-Aldrich) (Shitara
K. et al., J. Immunol. Methods, 167,
271-278, 1994). Como medio de cultivo de células
animales, se pueden utilizar medio RPMI 1640 (fabricado por Nissui
Pharmaceutical), medio GIT (fabricado por Nippon Seiyaku), medio
EX-CELL302 (fabricado por JRH Biosciences), medio
IMDM (fabricado por Invitrogen), medio de
hibridoma-SFM (fabricado por Invitrogen),
conteniendo estos medios aditivos tales como FBS, y similares. El
anticuerpo humanizado se puede expresar y acumular en el
sobrenadante de cultivo cultivando el transformante resultante en el
medio. La cantidad de expresión del anticuerpo humanizado en el
sobrenadante de cultivo y su actividad de unión al antígeno se
pueden medir mediante el ELISA descrito en el apartado 1. (4) o
similares. El transformante puede aumentar la cantidad del
anticuerpo humanizado producido utilizando un sistema de
amplificación del gen DHFR o similares (Shitara K. et al., J.
Immunol. Methods, 167, 271-278, 1994).
El anticuerpo humanizado se puede purificar a
partir del sobrenadante de cultivo del transformante utilizando una
columna con proteína A (Antibodies A Laboratory Manual, cápitulo 8;
Monoclonal Antibodies). Adicionalmente, también está disponible un
método de purificación corriente utilizado en proteínas. Por
ejemplo, se puede purificar mediante una combinación de filtración
en gel, cromatografía de intercambio iónico, ultrafiltración y
similares. Los pesos moleculars de la cadena H, la cadena L y el
peso molecular del anticuerpo completo del anticuerpo humanizado
purificado se miden mediante electroforesis en gel de poliacrilamida
(SDS-PAGE; Laemmli U. K. Nature, 227,
680-685, 1970), el método de transferencia Western
(Antibodies A Laboratory Manual, capítulo 12; Monoclonal
Antibodies) o similares.
La actividad de unión al antígeno del anticuerpo
humanizado purificado se puede medir mediante el inmunoanálisis
enzimático utilizando el anticuerpo humanizado purificado como
primer anticuerpo y el anticuerpo
anti-inmunoglobulinas humanas marcado como segundo
anticuerpo como se describe en el apartado 1. (2) anterior, la
resonancia de plasmón superficial (Karlsson R. et al., J.
Immunol. Methods, 145, 229-240, 1991) o similares.
El que se conserve o no la actividad neutralizadora mediante la
cual se inhibe la actividad FGF-8 se puede confirmar
mediante el análisis de inhibición del crecimiento celular descrito
en el apartado 1. (4).
El fragmento de anticuerpo se puede producir
mediante el método de ingeniería genética o método químico de
proteínas utilizando el anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 monoclonal y el
anticuerpo neutralizador anti-FGF-8
humanizado descrito en los apartados 1. y 2. Los ejemplos del
fragmento de anticuerpo incluyen Fab, F(ab')_{2}, Fab',
scFv, fragmento bivalente, dsFv y péptido que contiene CDR.
El Fab se puede preparar tratando el anticuerpo
neutralizador anti-FGF-8 con una
proteasa, papaína. Después del tratamiento con papaína, el
fragmento se hace pasar a través de una columna con proteína A
cuando el anticuerpo original es un anticuerpo de la subclase IgG
que tiene la actividad de unión a la proteína A, con lo que el
fragmento se puede recuperar como Fab uniforme separándolo de las
moléculas de IgG o fragmentos Fc (Monoclonal Antibodies). En caso
de un anticuerpo de la subclase IgG que no tiene actividad de unión
para la proteína A, Fab se puede recuperar de una fracción eluida a
una concentración de sal baja mediante cromatografía de intercambio
iónico (Monoclonal Antibodies). Adicionalmente, Fab se puede
preparar mediante el método de ingeniería genética utilizando
Escherichia coli. Por ejemplo, se puede construir un vector
de expresión de Fab clonando los ADN que codifican las regiones V
de los anticuerpos descritos en el apartado 2. (2), (5) y (6) en un
vector para la expresión de Fab. Como vector para la expresión de
Fab, se puede utilizar cualquiera de los vectores susceptibles de
inserción y que expresan los ADN para Fab. Sus ejemplos incluyen
pIT106 (Better M. et al., Science, 240,
1041-1043, 1988) y similares. Es posible que el
vector de expresión de Fab se introduzca en Escherichia coli
apropiada y Fab se produzca y acumule en un cuerpo de inclusión o un
espacio periplásmico. Se puede obtener Fab activo del cuerpo de
inclusión mediante el método de replegamiento que se utiliza
comúnmente en proteínas. Cuando Fab se expresa en el espacio
periplásmico, el Fab activo se filtra al sobrenadante de cultivo.
Después del replegamiento o a partir del sobrenadante de cultivo, se
puede purificar Fab uniforme utilizando una columna inmovilizada
con un antígeno (Borrebeck K., Antibody Engineering: A practical
Guide, Oxford University Press, 1991).
El F(ab')_{2} se puede preparar
tratando el anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 con una proteasa,
pepsina. Después del tratamiento con pepsina, el fragmento se puede
recuperar como F(ab')_{2} uniforme mediante el mismo
procedimiento de purificación utilizado en Fab (Monoclonal
Antibodies). Adicionalmente, también se puede preparar mediante un
método donde el Fab' descrito en el apartado 3. (3) se trata con una
maleimida tal como
N,N'-o-fenilendimaleimida o
bismaleimidohexano para formar una unión tioéter o un método donde
éste se trata con 5,5'-ditiobis(ácido
2-nitrobenzoico) para formar un enlace disulfuro
(McCafferty J. et al., Antibody Engineering: A Practical
Approach, IRL Press, 1996).
El Fab' se puede preparar tratando
F(ab')_{2} descrito en el apartado 3. (2) con un agente
reductor tal como ditiotreitol. Adicionalmente, Fab' se puede
preparar también mediante el método de ingeniería genética
utilizando Escherichia coli. Por ejemplo, se puede preparar
un vector de expresión de Fab' clonando los ADN que codifican las
regiones V de los anticuerpos descritos en el apartado 2. (2), (5) y
(6) en un vector para la expresión de Fab'. Como vector para la
expresión de Fab', se puede utilizar cualquiera de los vectores
susceptibles de inserción y que expresan los ADN que codifican las
regiones V de los anticuerpos descritos en el apartado 2. (2), (5)
y (6). Sus ejemplos incluyen pAK19 (Carter P. et al.,
Bio/technology, 10, 163-167, 1992) y similares. Es
posible introducir el vector de expresión de Fab' en la
Escherichia coli apropiada y que Fab' se produzca y acumule
en un cuerpo de inclusión o un espacio periplásmico. El Fab' activo
se puede obtener a partir del cuerpo de inclusión mediante el
método de replegamiento que se utiliza comúnmente en proteínas.
Cuando Fab' se expresa en el espacio periplásmico, las células se
pueden romper mediante un tratamiento tal como digestión parcial
con lisozima, choque osmótico o sonicación y recuperar
extracelularmente. Después del replegamiento o a partir de la
solución celular, se puede purificar Fab' uniforme utilizando una
columna con proteína G o similares (McCafferty J. et al.,
Antibody Engineering: A Practical Approach, IRL Press, 1996).
El scFv se puede preparar mediante el método de
ingeniería genética utilizando fagos o Escherichia coli. Por
ejemplo, los ADN que codifican VH y VL de los anticuerpos descritos
en el apartado 2. (2), (5) y (6) se conectan a través de un ADN que
codifica un conector polipeptídico que comprende una secuencia de
aminoácidos de 12 residuos o más para producir un ADN que codifica
scFv. Es importante que el conector polipeptídico se optimice de
manera que su adición no inhiba la unión de VH y VL a un antígeno.
Por ejemplo, se puede utilizar un conector indicado por Pantoliano
et al. (Pantoliano M. W. et al., Biochemistry, 30,
10117-10125, 1991) o una de sus variantes.
Se puede preparar un vector de expresión de scFv
clonando el ADN producido en un vector para la expresión de scFv.
Como vector para la expresión de scFv, se puede utilizar cualquiera
de los vectores capaces de incorporar y expresar el ADN de scFv.
Sus ejemplos incluyen pCANTAB5E (fabricado por Amersham
Biosciences), Phfa (Lah M. et al., Hum. Antibodies
Hybridomas, 5, 48-56, 1994) y similares. El vector
de expresión de scFv se introduce en la Escherichia coli
apropiada, y se infecta con un fago auxiliar, con lo que se puede
obtener un fago donde scFv se expresa sobre la superficie del fago
fusionándose con la proteína de la superficie del fago.
Adicionalmente, scFv se puede producir y acumular en un cuerpo de
inclusión o un espacio periplásmico de Escherichia coli
donde se ha introducido el vector de expresión de scFv. A partir del
cuerpo de inclusión, se puede formar la forma activa de scFv
mediante el método de replegamiento que se utiliza comúnmente en
proteínas. Cuando se expresa en el espacio periplásmico, las
células se pueden romper mediante tratamientos tales como digestión
parcial con lisozima, choque osmótico o sonicación y recuperar
extracelularmente. Después del replegamiento o a partir de la
solución de células rotas, se puede purificar scFv uniforme
utilizando cromatografía de intercambio catiónico o similares
(McCafferty J. et al., Antibody Engineering: A Practical
Approach, IRL Press, 1996).
El fragmento bivalente se puede preparar de
manera que el conector polipeptídico en la preparación de scFv se
produzca con 3 a 10 residuos. En caso de utilizar VH y VL de un tipo
de anticuerpo, se puede producir un fragmento bivalente divalente.
En caso de utilizar las VH y VL de dos tipos de anticuerpos, se
puede producir un fragmento bivalente que tiene
di-especificidad (Le Gall F. et al., FEBS
Lett., 453, 164-168, 1999, Courage C. et
al., Int. J. Cancer, 77, 763-768, 1998).
El dsFv se puede preparar mediante el método de
ingeniería genética utilizando Escherichia coli. Primero, se
introduce una mutación en los sitios apropiados de los ADN que
codifican VH y VL de los anticuerpos descritos en el apartado 2.
(2), (5) y (6) para producir los ADN donde un residuo aminoácido
codificado se remplaza por cisteína. La modificación de los
residuos aminoácido con el residuo cisteína se puede realizar
mediante el método de mutagénesis utilizando PCR como se describe
en el apartado 2. (6). Los ADN respectivos producidos se clonan en
el vector para la expresión de dsFv para producir el vector de
expresión de VH y VL. Como vector para la expresión de dsFv, se
puede utilizar cualquiera de los vectores susceptibles de inserción
y expresión de los ADN para dsFv. Sus ejemplos incluyen pUL19
(Reiter Y. et al., Protein Eng., 7, 697-704,
1994) y similares. El vector de expresión de VH y VL se introduce
en la Escherichia coli apropiada, y se pueden formar VH y VL
y acumular en un cuerpo de inclusión o un espacio periplásmico. A
partir del cuerpo de inclusión o del espacio periplásmico, se
obtienen VH y VL, y se mezclan. Los enlaces disulfuro se
proporcionan mediante el método de replegamiento que se utiliza
comúnmente en proteínas para formar dsFv activo. Después del
replegamiento, el fragmento se puede purificar adicionalmente
mediante cromatografía de intercambio iónico, filtración en gel o
similares (Reiter Y. et al., Protein Eng., 7,
697-704, 1994).
El péptido que contiene CDR se puede preparar
mediante un método de síntesis química tal como el método Fmoc, el
método tBoc o similares. Se puede preparar un vector de expresión
peptídico que contiene CDR produciendo un ADN que codifica el
péptido que contiene CDR y clonando el ADN resultante en un vector
apropiado para su expresión. Como vector para su expresión, se
puede utilizar cualquiera de los vectores susceptibles de inserción
y expresión del ADN que codifica el péptido que contiene CDR. Sus
ejemplos incluyen pLEX (fabricado por Invitrogen), pAX4a+
(fabricado por MoBiTec) y similares. El vector de expresión se
introduce en la Escherichia coli apropiada, y se puede
producir el péptido que contiene CDR y acumular en un cuerpo de
inclusión o un espacio periplásmico. A partir del cuerpo de
inclusión o del espacio periplásmico, se puede obtener el péptido
que contiene CDR, y purificar mediante cromatografía de intercambio
iónico,
\hbox{filtración en gel o similares (Reiter Y. et
al ., Protein Eng., 7, 697-704,
1994).}
La actividad de unión al antígeno del fragmento
de anticuerpo se puede medir mediante el inmunoanálisis enzimático
utilizando el fragmento de anticuerpo como primer anticuerpo como se
describe en el apartado 1. (2), la resonancia de plasmón
superficial (Karlsson R. et al., J. Immunol. Methods, 145,
229-240, 1991) o similares. Adicionalmente, el que
se conserve o no la actividad neutralizadora por medio de la cual se
inhibe la actividad de FGF-8 se puede confirmar
mediante el análisis de inhibición del crecimiento celular descrito
en el apartado 1. (4).
El anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 se convierte en un agente
protector de cartílago debido a que el anticuerpo tiene una
capacidad tal que se une a FGF-8 en células y
tejidos de la membrana sinovial o el cartílago inhibiendo la
degradación de la matriz extracelular del cartílago inducida por
FGF-8 y la destrucción del cartílago. Puesto que el
anticuerpo tiene la capacidad para inhibir el crecimiento de las
células sinoviales inducido por FGF-8, se convierte
en un agente para inhibir el crecimiento de las células sinoviales.
Puesto que la destrucción de las articulaciones implica la
destrucción del cartílago y el crecimiento de las células
sinoviales, el anticuerpo se convierte en un agente para inhibir la
destrucción de la articulación inhibiendo el crecimiento de las
células sinoviales y la destrucción del cartílago. Puesto que la
artritis es una enfermedad con destrucción de la articulación, el
anticuerpo se convierte en un agente para tratar y prevenir la
artritis inhibiendo la destrucción de la articulación. Los ejemplos
de artritis incluyen osteoartritis, artritis reumatoide, lupus
eritematoso generalizado, artropatía anquilosante, artritis
psoriásica, enfermedad del disco intervertebral, sinovitis
cristalina aguda (gota, pseudogota) y similares.
Puesto que el anticuerpo humanizado comprende la
mayor parte derivada de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo
humano en comparación con el anticuerpo monoclonal del animal no
humano, se espera que muestre el mayor efecto en el cuerpo humano,
la inmunogenicidad sea baja y su efecto se mantenga durante un largo
período de tiempo. De este modo, el anticuerpo humanizado es
preferible como agente de prevención o tratamiento.
El agente que comprende el anticuerpo
neutralizador anti-FGF-8 se puede
administrar como agente de tratamiento solo. No obstante,
usualmente es preferible proporcionar el agente en forma de una
formulación farmacéutica producida mezclando el agente con uno o
más portadores farmacéuticamente aceptables de acuerdo con cualquier
método bien conocido en el campo técnico farmacéutico.
En cuanto a la ruta de administración, es
aconsejable utilizar la ruta más eficaz en el tratamiento. Sus
ejemplos pueden incluir la administración oral y administraciones
parenterales tales como las administraciones intraoral,
intratraqueal, intrarectal, subcutánea, intramuscular,
intraarticular e intravenosa. En el caso de las preparaciones de
anticuerpo o péptido, son preferibles las administraciones
intraarticular e intravenosa.
Los ejemplos de la forma de administración
incluyen pulverizaciones, cápsulas, comprimidos, gránulos, jarabes,
emulsiones, supositorios, inyectables, pomadas, cintas y
similares.
Los ejemplos de las preparaciones apropiada para
la administración oral incluyen emulsiones, jarabes, cápsulas,
comprimidos, polvos, gránulos y similares.
Se pueden producir preparaciones tales como
emulsiones y jarabes utilizando, como aditivos, agua, sacáridos
tales como sacarosa, sorbitol y fructosa, glucoles tales como
polietilenglicol y propilenglicol, aceites tales como aceite de
sésamo, aceite de oliva y aceite de soja, antisépticos tales como
ésteres de ácido p-hidroxibenzoico, y aromas tales
como aroma de fresa y y menta.
Las cápsulas, los comprimidos, los polvos, los
gránulos y similares se pueden producir utilizando, como aditivos,
excipientes tales como lactosa, glucosa, sacarosa y manitol, agentes
disgregantes tales como almidón y alginato sódico, lubricantes
tales como estearato de magnesio y talco, aglutinantes tales como
poli(alcohol vinílico), hidroxipropilcelulosa y gelatina,
tensioactivos tales como ésteres de ácidos grasos, y plastificadores
tales como glicerina.
Los ejemplos de las preparaciones apropiadas
para la administración parenteral incluyen inyectables,
supositorios, pulverizaciones y similares.
Los inyectables se preparan utilizando un
portador que comprende una solución salina, una solución de glucosa
o una mezcla de ambas, y similares.
Los supositorios se preparan utilizando un
portador tal como manteca de cacao, grasa hidrogenada o ácido
carboxílico.
Las pulverizaciones se preparan utilizando el
anticuerpo o el péptido tal cual o combinado con un portador que
facilita la dispersión y absorción del anticuerpo o el péptido en
forma de partículas finas sin estimular la membrana mucosa de la
boca y de las vías respiratorias del receptor.
Los ejemplos específicos del portador incluyen
lactosa, glicerina y similares. Se pueden formar preparaciones
tales como aerosoles y polvo seco dependiendo de las propiedades del
anticuerpo o del péptido y del portador utilizado. Estas
preparaciones parenterales pueden comprender los ingredientes
enumerados como aditivos en las preparaciones orales.
La dosis o el número de administraciones varía
con los efectos terapéuticos deseados, el método de administración,
el período terapéutico, la edad, el peso corporal y similares. Es
usualmente de 10 \mug/kg a 20 mg/kg por día para un adulto.
El que el anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 inhiba la degradación de
la matriz extracelular del cartílago y el crecimiento de las
células sinoviales se puede confirmar utilizando el sistema de
análisis in vitro descrito en los apartados (1) y (2)
siguientes. Adicionalmente, el que el anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 se convierta en el
agente para tratar o prevenir la artritis se puede evaluar
administrando el anticuerpo a animales modelo del estado mórbido de
artritis descrito en el apartado (3) siguiente y examinando si puede
reducir sus síndromes artríticos.
La destrucción de cartílago se puede evaluar
mediante el análisis que indica la degradación de la matriz
extracelular del cartílago utilizando condrocitos u órganos
cartilaginosos y el aumento de producción de factores de destrucción
a partir de condrocitos y células sinoviales, y se puede evaluar la
destrucción del hueso subcondral de acuerdo con el progreso de la
destrucción de cartílago mediante el análisis que indica la cantidad
de resorción ósea respectivamente.
La función de destrucción de cartílago se puede
evaluar cultivando condrocitos articulares de conejo sometidos a
cultivo primario en presencia de FGF-8 en caso de
añadir el anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 y en caso de no añadirlo
y midiendo la cantidad de matriz extracelular que permanece en la
placa después del cultivo. La cantidad de matriz extracelular se
mide en términos de la cantidad de glucosaminoglicano liberado
mediante el tratamiento con papaína. Cuando se inhibe el descenso
de matriz extracelular inducido por FGF-8 mediante
la adición del anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8, se considera que el
anticuerpo tiene la actividad inhibidora de la destrucción de
cartílago.
La función de destrucción de cartílago también
se puede evaluar cultivando el órgano cartilaginoso del tabique
nasal bovino sometido a cultivo primario de acuerdo con el método de
Price et al., (Price J. S. et al., Arthritis Rheum.,
42, 137-147, 1999) en presencia de
FGF-8 en caso de añadir el anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 y en caso de no añadirlo
y midiendo la cantidad de matriz extracelular en el órgano
cartilaginoso después del cultivo. Cuando se inhibe el descenso de
matriz extracelular inducido por FGF-8 mediante la
adición del anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8, se considera que el
anticuerpo tiene la actividad inhibidora de la destrucción de
cartílago. La cantidad de matriz extracelular se mide tratando el
órgano después del cultivo con papaína y midiendo la cantidad de
glucosaminoglicano liberado mediante el método del azul de
dimetileno (Chandrasekhar S. et al., Anal. Biochem. 161
103-108, 1987) o midiendo la cantidad de colágeno en
términos de una concentración de hidroxiprolina de acuerdo con
Tokyo Eisei Nenpo, 36, 277, 1985.
Los ejemplos del factor implicado en la
destrucción de cartílago pueden incluir prostaglandina E_{2},
metaloproteinasa 3 de la matriz y óxido nítrico. Los condrocitos de
la articulación de conejo o las células sinoviales de conejo se
cultivan en presencia de FGF-8 en caso de añadir el
anticuerpo neutralizador anti-FGF-8
y en caso de no añadirlo, y se mide la prostaglandina E_{2}, la
metaloproteinasa 3 de la matriz o el óxido nítrico en el
sobrenadante de cultivo como la cantidad de estos factores
producidos a partir de las células. Cuando se inhibe la producción
de prostaglandina E_{2}, metaloproteinasa 3 de la matriz o óxido
nítrico promovida por FGF-8 mediante la adición del
anticuerpo neutralizador anti-FGF-8,
se considera que el anticuerpo tiene la actividad inhibidora de la
destrucción de cartílago.
La prostaglandina E_{2} se puede medir
mediante el sistema EIA de la prostaglandina E_{2} (fabricado por
Amersham Biosciences), la metaloproteinasa 3 de la matriz se puede
medir mediante el sistema ELISA Rabbit Matrix
Metalloproteinase-3 (fabricado por Amersham
Biosciences) el y óxido nítrico se puede medir mediante el método
que utiliza reactivo de Griess (Green L. C. et al., Anal.
Biochem. 126, 131-138 1982).
La resorción ósea se puede evaluar cultivando la
calvaria de ratón en presencia de FGF-8 en caso de
añadir el anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 y en caso de no añadirlo
de acuerdo con el método de Kusano et al. (Kusano K., et
al., Endocrinology, 139, 1338-1345, 1998) y
midiendo la concentración de calcio o la concentración de
hidroxiprolina en el sobrenadante de cultivo. Cuando se inhibe la
resorción ósea promovida por FGF-8 mediante la
adición del anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8, se considera que el
anticuerpo tiene la actividad inhibidora de la destrucción de
cartílago. La concentración de calcio en el sobrenadante de cultivo
se puede medir mediante Calcium C-Test Wako
(fabricado por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). La
concentración de hidroxiprolina en el sobrenadante de cultivo se
puede medir de acuerdo con Tokyo Eisei Nenpo, 36, 277, 1985.
El crecimiento de las células sinoviales se
puede evaluar cultivando las células sinoviales de ser humano o
conejo en presencia de FGF-8 en caso de añadir el
anticuerpo neutralizador anti-FGF-8
y en caso de no añadirlo y midiendo la cantidad de incorporación de
timidina[H^{3}]. Cuando se inhibe la cantidad de
incorporación de timidina[H^{3}] promovida por
FGF-8 mediante la adición del anticuerpo
neutralizador anti-FGF-8, se
considera que el anticuerpo tiene actividad inhibidora del
crecimiento celular sinovial.
Se puede evaluar el efecto de
FGF-8 o del anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 sobre la destrucción de
la articulación utilizando el siguiente modelo de artritis. El
anticuerpo neutralizador anti-FGF-8
se administra al modelo de artritis. Cuando mejora la artritis en
los animales modelo, se considera que el anticuerpo es utilizable
como agente para tratar o prevenir la artritis.
Los ejemplos de los animales modelo que muestran
síntomas similares a la artritis reumatoide pueden incluir ratón
MRL-lpr/lpr (Hang L. et al., J. Exp. Med.,
155, 1690-1701, 1982, el ratón se puede adquirir de
Japan Charles River) en el que la artritis se desencadena
espontáneamente en la articulación de la pata principalmente,
modelo de artritis con coadyuvante en rata (Pearson CM. et
al., Arthritis Rheum., 5, 654-658, 1962, Taurog
J. D. et al., Cell. Immunol., 75, 271-282,
1983, Bendele A. et al., J. Rheumatol., 26,
1225-1229, 1999) con artritis inducida por
inmunización con bacilos de tuberculosis muertos, modelo de artritis
inducida por colágeno en ratón (Stuart J. M. et al., Annu.
Rev. Immunol., 2, 199-218, 1984, Kamada H. et
al., Jpn. J. Pharmacol., 70, 169-175, 1996) con
artritis inducida por inmunización con colágeno de tipo II
encontrado con frecuencia en articulaciones junto con un
coadyuvante, y similares. Estos animales modelo muestran síntomas
similares a la artritis reumatoide, y se utilizan ampliamente en la
evaluación de los fármacos terapéuticos para la artritis.
Cuando se utiliza el modelo de artritis con
coadyuvante en rata, se miden los volúmenes del edema de la pata
trasera con el paso del tiempo en el pie tratado con coadyuvante (se
produce reacción de inflamación bifásica incluyendo inflamación
aguda y subsiguiente inflamación crónica) y el pie no tratado con
coadyuvante (se produce inflamación crónica en aproximadamente 1
semana desde la sensibilización). Ambas patas traseras se someten a
fotografía de rayos X suaves para evaluar la destrucción de hueso y
la deformación de las articulaciones. Adicionalmente, se evalúa la
destrucción generalizada de cartílago midiendo la cantidad de
glucosaminoglicano en orina, y se evalúa la destrucción
generalizada de hueso midiendo la cantidad de desoxipiridinolina o
la cantidad de hidroxiprolina en orina respectivamente. La cantidad
de glucosaminoglicano en orina se puede medir mediante el método
del azul de dimetilmetileno (Chandrasekhar S. et al., Anal.
Biochem. 161 103-108, 1987), la cantidad de
desoxipiridinolina en orina utilizando Osteolinks "DPD"
(fabricado por Sumitomo Seiyaku K.K.), y la cantidad de
hidroxiprolina en orina mediante el método de Ikeda et al.
(Ikeda Shingo et al., TokyoEikenNenpo, 36
277-282, 1985) respectivamente. Con respecto al
índice de respuesta de inflamación generalizada, se mide la
concentración de mucoproteína en suero utilizando
Aspro-GP (fabricado por Otsuka Seiyaku), y la
concentración de óxido nítrico en suero mediante el método de
Tracey et al. (Tracey W. R., et al., J. Pharmacol.
Exp. Ther., 272, 1011-1015, 1995)
respectivamente.
En caso de utilizar el modelo de artritis
inducida por colágeno en ratón, se miden el cambio de peso corporal
y la puntuación artrítica de todas las extremidades con el paso del
tiempo y el título del anticuerpo anticolágeno en suero.
Adicionalmente, tras la disección, se realiza el examen
histopatológico de la articulación. La artritis se evalúa puntuando
de 0 a 4 en una extremidad y 16 a la más alta en todas las
extermidades. Los criterios de puntuación son; 0: normal, 1: se
observa eritema débil, 2: se observan hinchazón y eritema débiles,
3: se observan hinchazón y eritema fuertes y se siente calor al
tacto, y 4: se observa hinchazón clara con deformación de los
dedos.
Como modelo de osteoartritis, se ha utilizado a
menudo un modelo de un animal grande tal como un perro o un conejo
del cual se suelta la articulación escindiendo el menisco de la
rodilla o separando el ligamento para ocasionar la degeneración
crónica de la articulación (referido más adelante como modelo
experimental de osteoartritis) (Ito Ryuta, Shinyaku Kaihatsu no
tameno Dobutsu Moderu Riyo Shusei, Henkeisei Kansetsusho, R & D
Planning, 1985, Guingamp C. et al., Arthritis Rheum., 40,
1670-1679, 1997, van der Kraan P. M. et al.,
Am. J. Pathol., 135, 1001-1014, 1989).
Adicionalmente, también se enumera como modelo de osteoartritis un
modelo de rata con osteoartritis inducida por ácido monoyodoacético
en el que se inyecta ácido monoyodoacético en la articulación de la
rodilla de la rata para acelerar la liberación de glucosaminoglicano
en forma de una matriz extracelular del cartílago articular e
inducir la destrucción de la articulación.
El modelo experimental de osteoartritis obtenido
mediante escisión parcial del menisco de la articulación de la
rodilla de conejo se puede producir mediante el método de Colombo
et al. (Colombo C. et al., Arthritis Rheum., 26,
875-886, 1983) y el método de Kikuchi et al.
(Kikuchi Sumiyuki et al., Kansetsu Geka, 15,
92-98, 1966).
El modelo en rata de osteoartritis inducida por
ácido monoyodoacético se puede producir inyectando ácido
monoyodoacético en la articulación de la rodilla de la rata de
acuerdo con el método de Guingamp et al. (Guingamp C. et
al., Arthritis Rheum., 40, 1670-1679,
1997).
En los animales modelo de osteoartritis, se
extrae la patela de la articulación de la rodilla después de cierto
período de tiempo, y se trata con papaína, y se mide la cantidad de
glucosaminoglicano mediante el método del azul de dimetilmetileno
(Chandrasekhar S. et al., Anal. Biochem. 161,
103-108, 1987) para evaluar la destrucción de la
articulación (degradación de la matriz extracelular).
Adicionalmente, se realiza el examen histopatológico de la
articulación de la rodilla.
La forma de dosificación y la ruta de
administración al administrar los anticuerpos neutralizadores
anti-FGF-8 a los animales modelo se
puede seleccionar apropiadamente dependiendo de las calidades de los
animales modelo objetivo y de la gravedad. Por ejemplo, se pueden
administrar a los animales modelo oralmente o parenteralmente
(administración intraperitoneal, intravenosa, intraarticular,
intramuscular o subcutánea) como tales o combinados con otros
aditivos farmacéuticamente aceptables tales como portadores,
excipientes y diluyentes.
La cantidad de mezcla y la dosis del anticuerpo
neutralizador anti-FGF-8 se
determinan individualmente dependiendo del método de
administración, la forma de dosificación y el propósito de uso de
las preparaciones, los síntomas específicos del animal modelo, el
peso corporal del animal modelo y similares, y no están
particularmente limitadas. La administración es posible con una
dosis de aproximadamente 1 \mug/kg a 100 mg/kg por día y una vez
al día como intervalo de administración. La administración también
es posible de dos a cuatro veces al día, o más veces al día.
Adicionalmente, también es posible la administración continua a
través de infusión por goteo intravenoso o similares. Cuando el
anticuerpo se administra a partes tales como articulaciones, se
administra en una posición a una dosis de aproximadamente 1 pg a 100
mg.
El FGF-8 induce el crecimiento
de las células sinoviales en las articulaciones y la destrucción de
la matriz extracelular en los cartílagos. El anticuerpo
anti-FGF-8 anterior puede unirse
específicamente a FGF-8 para detectar y determinar
FGF-8. De este modo, se puede utilizar para la
preparación de una composición para la diagnosis de la artritis.
Los ejemplos de la artritis que puede diagnosticarse incluyen las
enfermedades descritas en el apartado 4. anterior. La detección y
la determinación de FGF-8 se puede realizar mediante
el método descrito en el apartado 6. más abajo.
Como anticuerpo
anti-FGF-8 utilizado para la
preparación de una composición para la diagnosis de acuerdo con la
presente invención, se puede utilizar cualquiera de los anticuerpos
que se unen específicamente a FGF-8. Son
utilizables un anticuerpo monoclonal y un anticuerpo policlonal.
Preferiblemente se utiliza un anticuerpo monoclonal.
Los ejemplos del anticuerpo monoclonal incluyen
un anticuerpo producido por un hibridoma, un anticuerpo humanizado
y un fragmento de anticuerpo de estos anticuerpos.
El anticuerpo
anti-FGF-8 utilizado para la
preparación de la composición diagnóstica de la presente invención
se puede producir similarmente mediante el método de producción del
anticuerpo neutralizador anti-FGF-8.
No obstante, no se requiere inhibir la actividad de
FGF-8. El anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 se puede utilizar
también como anticuerpo anti-FGF-8
utilizado para la preparación de la composición diagnóstica de la
presente invención. Los ejemplos específicos del anticuerpo
anti-FGF-8 utilizado para la
preparación de la composición diagnóstica de la presente invención
incluyen el anticuerpo monoclonal KM1334 producido por el hibridoma
KM1334 (FERM BP-545I), el anticuerpo quimérico
humano KM3034 producido por el transformante KM3034 (FERM
BP-7836), el anticuerpo quimérico humano KM3334
producido por el transformante KM3334, el anticuerpo injertado a CDR
humana HV0LV6 producido por el transformante KM8037 (FERM
BP-8084), el anticuerpo injertado a CDR humana
HV0LV6/CHO producido por el transformante KM8034, el anticuerpo
injertado a CDR humana HV0LV3-1/CHO producido por
el transformante KM8036 (FERM BP-8083) y
HV0LV4-3/CHO injertado a CDR humana producido por el
transformante KM8035 (FERM BP-8082).
La composición diagnóstica que comprende el
anticuerpo anti-FGF-8 puede
comprender un reactivo para conducir una reacción
antígeno-anticuerpo de acuerdo con un método de
diagnóstico indicado en el apartado 6. siguiente y un reactivo de
detección de la reacción. Los ejemplos del reactivo para realizar la
reacción antígeno-anticuerpo incluyen soluciones
tampón, sales y similares. Los ejemplos del reactivo de detección
incluyen reactivos utilizados en un método de detección
inmunológica usual, tal un segundo anticuerpo marcado que reconoce
el anticuerpo anti-FGF-8 y un
sustrato correspondiente a una marca.
Los ejemplos de la artritis diagnosticada
mediante el método de diagnóstico descrito en la presente memoria
incluyen las enfermedades enumeradas en el apartado 4. anterior. Se
considera que en las articulaciones de pacientes que sufren estas
enfermedades, la cantidad de FGF-8 que tiene la
actividad de inducción del crecimiento en las células sinoviales y
la destrucción de la matriz extracelular en el cartílago aumenta en
comparación con las personas sanas.
El método para diagnosticar la artritis descrito
en la presente memoria incluye, por ejemplo, un método donde
FGF-8 presente en las células o tejidos se detecta
y/o determina inmunológicalmente como se describe más abajo
utilizando células o secciones de tejido de la membrana sinovial o
de cartílago en la articulación recogida de sujetos mediante
biopsia o similares y el extracto celular o el fluido sinovial
producido de las células o los tejidos.
Como método para detectar inmunológicalmente y/o
determinar el FGF-8 expresado en la articulación
utilizando el anticuerpo
anti-FGF-8, se puede utilizar el
método del anticuerpo fluorescente, el inmunoanálisis enzimático
(ELISA), el radioinmunoanálisis (RIA), el método de tinción
inmunológica de tejidos, el método de tinción de inmunocitos, el
método de transferencia Western, el método de inmunoprecipitación,
el método ELISA sándwich (Tomiyama Sakuji & Ando Tamie,
Tankuron Kotai Jikken Manual, Kodansha Scientific, 1987, Nihon
Seikagaku Kai, Zoku Seikagaku Jikken Koza 5,
Men-eki Seikagaku Kenkyuho, Tokyo Kagaku Dojin,
1986) y similares.
El método del anticuerpo fluorescente se puede
realizar mediante el método descrito en el documento (Monoclonal
Antibodies, Tomiyama Sakuji & Ando Tamie, Tankuron Kotai Jikken
Manual, Kodansha Scientific, 1987) o similares. Especificalmente,
se hace reaccionar una célula o un tejido de una articulación
aislada con el anticuerpo
anti-FGF-8 y adicionalmente con un
anticuerpo anti-inmunoglobulina marcado con una
sustancia fluorescente tal como isotiocianato de fluoresceína
(FITC) o ficoeritrina y el colorante fluorescente se mide después
con un citómetro de flujo.
El inmunoanálisis enzimático (ELISA) es un
método donde células, tejidos, fluidos sinoviales o similares
aislados de una articulación se hacen reaccionar con el anticuerpo
anti-FGF-8 y adicionalmente se hacen
reaccionar con un anticuerpo anti-inmunoglobulina
marcado con una enzima tal como peroxidasa o fosfatasa alcalina, se
añade un sustrato formado por una reacción enzimática para la
reacción, y el colorante desarrollado se mide mediante un
espectrofotómetro.
El radioinmunoanálisis (RIA) es un método donde
células, tejidos, fluidos sinoviales o similares aislados de una
articulación se hacen reaccionar con el anticuerpo
anti-FGF-8 y adicionalmente se hacen
reaccionar con un anticuerpo anti-inmunoglobulina
marcado con un radioisótopo, y después se mide la radiactividad con
un contador de centelleo o similares.
El método de tinción de inmunocitos y el método
de tinción inmunológica de tejidos son métodos donde células,
tejidos, sus soluciones desorganizadas, fluidos sinoviales o
similares aislados de una articulación se hacen reaccionar con el
anticuerpo anti-FGF-8 y
adicionalmente se hacen reaccionar con un anticuerpo
anti-inmunoglobulina marcado con una sustancia
fluorescente tal como FITC, se añade una enzima tal como peroxidasa
o fosfatasa alcalina, o similares y un sustrato desarrollado por
una reacción enzimática para la reacción en caso de marcaje con una
enzima, después de lo cual se realiza la observación con un
microscopio. Esto se puede realizar mediante el método descrito en
un documento (Monoclonal Antibodies, Toyama Sakuji & Ando Tamie,
Tan Kuron Kotai Jikken Manual, Kodansha Scientific, 1987).
La transferencia Western es un método donde
células, tejidos, sus soluciones desorganizadas, fluidos sinoviales
o similares aislados de una articulación se disuelven en una
solución tampón muestra que contiene SDS para realizar la
SDS-PAGE, la muestra resultante se transfiere
después a una película de fluoruro de polivinilideno (PVDF), y se
hace reaccionar con el anticuerpo
anti-FGF-8 y adicionalmente se hace
reaccionar con un anticuerpo anti-inmunoglobulina
marcado con una enzima tal como peroxidasa o fosfatasa alcalina,
después de lo cual el producto de reacción se hace reaccionar con
un sustrato desarrollado por una reacción enzimática o un sustrato
iluminado químicamente y se detecta en forma de bandas.
El método de inmunoprecipitación es un método
donde las células rotas, las soluciones de tejido o un fluido
sinovial aislado de una articulación se hacen reaccionar con el
anticuerpo anti-FGF-8 inmobilizado
sobre las cuentas o similares, las cuentas se aíslan mediante
centrifugación o similares y después se tratan con un tampón de
muestra que comprende SDS, y el FGF-8 disuelto se
detecta mediante transferencia Western o similares.
El ELISA sándwich es uno de los inmunoanálisis
enzimáticos que utilizan dos tipos de anticuerpos
anti-FGF-8 de epítopos diferentes.
Es un método donde uno de los anticuerpos
anti-FGF-8 se inmoviliza sobre una
placa, y se hace reaccionar con células, tejidos, sus soluciones
desorganizadas o los fluidos sinoviales aislados de una
articulación, después de lo cual el FGF-8 unido al
anticuerpo anti-FGF-8 sobre la placa
se hace reaccionar adicionalmente con el otro anticuerpo
anti-FGF-8. La muestra se hace
reaccionar con un anticuerpo anti-inmunoglobulina
marcado con una enzima tal como peroxidasa o fosfatasa alcalina y
adicionalmente con un sustrato desarrollado por una reacción
enzimática, y el colorante formado se mide con un
espectrofotómetro.
La Fig. 1 es una gráfica que muestra una
actividad de degradación de la matriz extracelular de condrocitos
de conejo por FGF-8. La ordenada representa una
cantidad de glucosaminoglicano que permanece en la matriz
extracelular, y la abscisa representa la concentración (ng/mL) de
FGF-8. Los valores representan los valores medios
\pm el error típico, y *** indica P<0,001 (en comparación con
un grupo no estimulado, prueba de Dunnett).
La Fig. 2 es una gráfica que muestra la
actividad inhibidora del anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 KM1334 de la degradación
de la matriz extracelular de condrocitos de conejo con
FGF-8. La ordenada representa una cantidad de
glucosaminoglicano que permanece en la matriz extracelular, y la
abscisa representa la concentración (\mug/mL) de KM1334. Los
valores representan los valores medios \pm el error típico, y
\alm{3} indica P<0,001 (en comparación con un grupo no
estimulado, prueba de la t de Student), ** indica P<0,01 y ***
indica P<0,001 (en comparación con un grupo 0, prueba de
Dunnett).
La Fig. 3 es una gráfica que muestra la
promoción de la producción de metaloproteinasa 3 de la matriz en
condrocitos de conejo con FGF-8 y la actividad
inhibidora del anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 KM1334. La ordenada
representa una cantidad (ng/pocillo) de metaloproteinasa 3 de la
matriz en una solución de cultivo, y la abscisa representa una
concentración (\mug/mL) de KM1334. Los valores representan los
valores medios \pm el error típico, y \alm{2} indica P<0,01
(en comparación con un grupo no estimulado, prueba de
Aspin-Welch) y *** indica P<0,001 (en
comparación con un grupo 0, prueba de Dunnett).
La Fig. 4 es una gráfica que muestra la
actividad de promoción del crecimiento de las células sinoviales de
conejo con FGF-8. La ordenada representa la
radiactividad de la timidina[H^{3}] incorporada a las
células sinoviales de conejo, y la abscisa representa una
concentración (ng/mL) de FGF-8. Los valores
representan los valores medios \pm el error típico, y * indica
P<0,05 (en comparación con un grupo no estimulado, prueba de
Steel).
La Fig. 5 es una gráfica que muestra la
actividad inhibidora del anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 KM1334 de la promoción
de crecimiento de las células sinoviales de conejo con
FGF-8. La ordenada representa radiactividad de la
timidina[H^{3}] incorporada a las células sinoviales de
conejo, y la abscisa representa una concentración (\mug/mL) de
KM1334. Los valores representan los valores medios \pm el error
típico, y \alm{3} indica P<0,001 (en comparación con un grupo
no estimulado, prueba de la t de Student) y *** indica P<0,001
(en comparación con un grupo 0, prueba de Dunnett).
La Fig. 6 es una gráfica que muestra la
actividad de promoción del crecimiento de las células sinoviales
humanas con FGF-8. La ordenada representa la
radiactividad de la timidina[H^{3}] incorporada a las
células sinoviales humanas, y la abscisa representa una
concentración (ng/mL) de FGF-8. Los valores
representan los valores medios \pm el error típico, y *** indica
P<0,001 (en comparación con un grupo no estimulado, prueba de
Dunnett).
La Fig. 7 es una gráfica que muestra la
actividad inhibidora del anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 KM1334 de la promoción
de crecimiento de las células sinoviales humanas con
FGF-8. La ordenada representa la radiactividad de
la timidina[H^{3}] incorporada a las células sinoviales
humanas, y la abscisa representa una concentración (\mug/mL) de
KM1334. Los valores representan los valores medios \pm el error
típico, y \alm{3} indica P<0,001 (en comparación con un grupo
no estimulado, prueba de Aspin-Welch) y * indica
P<0,05 (en comparación con un grupo 0, prueba de Steel).
La Fig. 8 es una gráfica que muestra la
degradación de la matriz extracelular de la articulación mediante
inyección de FGF-8. La ordenada representa una
concentración (\mug/mL) de glucosaminoglicano en un líquido de
lavado de la articulación. Los valores representan los valores
medios \pm el error típico, y ** indica P<0,01 (en comparación
con un grupo inyectado con solución salina, prueba de la t de
Student).
La Fig. 9 es una gráfica que muestra la
destrucción de la patela de la articulación mediante la inyección
de FGF-8. La ordenada representa el peso (mg) de la
patela. Los valores representan los valores medios \pm el error
típico, y * indica P<0,05 (en comparación con un grupo inyectado
con solución salina, prueba de la t de Student).
La Fig. 10 es una gráfica que muestra la
actividad inhibidora del anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 KM1334 para el cambio
con el tiempo de la puntuación artrítica en artritis inducida por
colágeno en ratón. La ordenada representa la puntuación artrítica,
y la abscisa representa los días sucesivos desde el primer día de la
sensibilización con colágeno. Los valores representan los valores
medios \pm el error típico, y * indica P<0,05 (en comparación
con un grupo al que se había administrado solución salina, prueba de
suma de rangos de Wilcoxon) y # indica P<0,05 (en comparación
con un grupo al que se había administrado disolvente, prueba de suma
de rangos de Wilcoxon).
La Fig. 11 es una gráfica que muestra la
actividad inhibidora del anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 KM1334 del aumento de
volumen de la almohadilla de un pie no tratado con coadyuvante en la
artritis por coadyuvante en rata. La ordenada representa el volumen
de la almohadilla del pie (mL). Los valores representan los valores
medios \pm el error típico, y \alm{3} indica P<0,001 (en
comparación con un grupo no tratado, prueba de
Aspin-Welch) y ** indica P<0,01 (en comparación
con un grupo al que se había administrado solución salina, prueba de
la t de Student).
La Fig. 12 es una gráfica que muestra la
actividad inhibidora del diclofenaco sódico, el metotrexato y la
prednisolona del aumento de volumen de la almohadilla del pie no
tratado con coadyuvante en la artritis por coadyuvante en rata. La
ordenada representa el volumen de la almohadilla del pie (mL). Los
valores representan los valores medios \pm el error típico, y
\alm{3} indica P<0,001 (en comparación con un grupo no tratado,
prueba de Aspin-Welch), *** indica P<0,001 (en
comparación con un grupo al que se había administrado disolvente,
prueba de la t de Student), \dagger \dagger indica P<0,01 y
\dagger \dagger \dagger indica P<0,001 (en comparación con
un grupo al que se había administrado disolvente, prueba de
Aspin-Welch).
La Fig. 13 es una gráfica que muestra la
actividad inhibidora del anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 KM1334 del aumento de la
cantidad de glucosaminoglicano en artritis por coaduvante en orina
de rata. La ordenada representa la razón la concentración de
glucosaminoglicano/concentración de creatinina (\mug/mg). Los
valores representan los valores medios \pm el error típico, y
\alm{3} indica P<0,001 (en comparación con un grupo no
tratado, prueba de Aspin-Welch) y ** indica
P<0,01 (en comparación con un grupo al que se había administrado
solución salina, prueba de la t de Student).
La Fig. 14 es una gráfica que muestra la
actividad inhibidora del diclofenaco sódico, el metotrexato y la
prednisolona del aumento de la cantidad de glucosaminoglicano en
artritis por coaduvante en orina de rata. La ordenada representa la
razón de la concentración de glucosaminoglicano/concentración de
creatinina (\mug/mg). Los valores representan los valores medios
\pm el error típico, y \alm{2} indica P<0,01 (en comparación
con un grupo no tratado, prueba de Aspin-Welch) y *
indica P<0,05 (comparado a un grupo al que se había administrado
disolvente, prueba de la t de Student).
La Fig. 15 es una gráfica que muestra la
actividad inhibidora del anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 KM1334 del aumento de la
cantidad de desoxipiridinolina en la artritis por coaduvante en
orina de rata. La ordenada representa la razón de la concentración
de desoxipiridinolina/concentración de creatinina (nmoles/mmol). Los
valores representan los valores medios \pm el error típico, y
\alm{3} indica P<0,001 (en comparación con un grupo no
tratado, prueba de Aspin-Welch) y * indica P<0,05
(en comparación con un grupo al que se había administrado solución
salina, prueba de la t de Student).
La Fig. 16 es una gráfica que muestra la
actividad inhibidora del diclofenaco sódico, el metotrexato y la
prednisolona del aumento en la cantidad de desoxipiridinolina en la
artritis por coaduvante en orina de rata. La ordenada representa la
razón de la concentración de desoxipiridinolina/concentración de
creatinina (nmoles/mmol). Los valores representan los valores
medios \pm el error típico, y \alm{3} indica P<0,001 (en
comparación con un grupo no tratado, prueba de la t de Student) y
** indica P<0,01 (en comparación con un grupo al que se había
administrado disolvente, prueba de la t de Student).
La Fig. 17 es una gráfica que muestra la
actividad inhibidora del anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 KM1334 del aumento de la
cantidad de hidroxiprolina en la artritis por coaduvante en orina de
rata. La ordenada representa la razón de la concentración de
hidroxiprolina/concentración de creatinina (\mug/mg). Los valores
representan los valores medios \pm el error típico, y \alm{3}
indica P<0,001 (en comparación con un grupo no tratado, prueba
de la t de Student).
La Fig. 18 es una gráfica que muestra la
actividad inhibidora del anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 KM1334 de la destrucción
del cartílago articular en el modelo de osteoartritis inducida por
ácido monoyodoacético en ratas. La ordenada representa una
concentración (\mug/mL) de glucosaminoglicano en un líquido de
lavado de la articulación. Los valores representan los valores
medios \pm el error típico, y \alm{2} indica P<0,01 (en
comparación con un grupo operado simuladamente, prueba de
Aspin-Welch) y * indica P<0,05 (en comparación
con un grupo al que se había administrado solución salina, prueba de
Aspin-Welch).
La Fig. 19 es un diagrama de flujo que muestra
la construcción del plásmido pKM1334CH-H5.
La Fig. 20 es un diagrama de flujo que muestra
la construcción del plásmido pKM1334CH-L4.
La Fig. 21 es un diagrama de flujo que muestra
la construcción del plásmido pKANTEX1334.
La Fig. 22 es una gráfica que muestra la
actividad neutralizadora del anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 KM1334 de ratón y los
anticuerpos quiméricos neutralizadores
anti-FGF-8 KM3034 y KM3334 del el
crecimiento dependiente de FGF-8 de la línea
celular SC-3 de cáncer de mama de ratón. La abscisa
representa la concentración de anticuerpo (\mug/mL), y la
ordenada representa el crecimiento relativo (%) cuando el
crecimiento al añadir FGF-8 solo se define como
100%. o la indica actividad de KM1334, \Box la actividad de
KM3034, \Delta la actividad de KM3334 y \times la actividad de
KM2760 como control negativo respectivamente.
La Fig. 23 es un diagrama de flujo que muestra
la construcción del plásmido pKM1334HV0.
La Fig. 24 es un diagrama de flujo que muestra
la construcción del plásmido pKANTEX1334HV0LV0.
La Fig. 25 es una gráfica que muestra los
resultados de la medición de la actividad de unión a
FGF-8 del anticuerpo quimérico neutralizador
anti-FGF-8 KM3334 y de los
anticuerpos injertados a CDR neutralizadores
anti-FGF-8 HV0LV0, HVOLV6 y HV6LV6
mediante ELISA. La abscisa representa la concentración de anticuerpo
(\mug/mL), y la ordenada representa la actividad de unión
(DO_{415}). \Delta indica la actividad de KM3334, o la
actividad de HV0LV0, \Delta la actividad de HVOLV6, y \times la
actividad de HV6LV6.
La Fig. 26 es una gráfica que muestra los
resultados de la medición de la actividad de unión a
FGF-8 del anticuerpo quimérico neutralizador
anti-FGF-8 KM3334 y de los
anticuerpos injertados a CDR neutralizadores
anti-FGF-8 HV0LV0, HVOLV6 y HV6LV6
mediante BIAcore 2000. La abscisa representa el tiempo (sec), y la
ordenada representa una señal de resonancia (RU).
La Fig. 27 es un diagrama de flujo que muestra
la construcción del plásmido pKM1334LV3-1.
La Fig. 28 es un diagrama de flujo que muestra
la construcción del plásmido pKM1334LV4-2.
La Fig. 29 es un diagrama de flujo que muestra
la construcción del plásmido pKM1334LV3-2.
La Fig. 30 es una gráfica que muestra los
resultados de la medición de la actividad de unión a
FGF-8 del anticuerpo quimérico neutralizador
anti-FGF-8 KM3034 y de los
anticuerpos injertados a CDR neutralizadores
anti-FGF-8 HVOLVO/CHO, HV0LV6/CHO,
HV0LV4-1/CHO, HVOLV4-2/CHO,
HV0LV3-1/CHO, HVOLV3-2/CHO,
HV0LV2-1/CHO y HVOLV2-2/CHO
mediante BIAcore 2000. La abscisa representa el tiempo (sec), y la
ordenada representa una señal de resonancia (RU).
La Fig. 31 es una gráfica que muestra la
actividad neutralizadora del anticuerpo quimérico neutralizador
anti-FGF-8 KM3034 y de los
anticuerpos injertados a CDR neutralizadores
anti-FGF-8 HVOLV6/CHO,
HV0LV4-1/CHO, HV0LV3-1/CHO y
HV0LV2-1/CHO del crecimiento dependiente de
FGF-8 de la línea celular SC-3 de
cáncer de mama de ratón. La abscisa representa la concentración de
anticuerpo (\mug/mL), y la ordenada representa el crecimiento
relativo (%) cuando el crecimiento al añadir de
FGF-8 solo se define como 100%. o indica la
actividad de KM3034, \bullet la actividad de HV0LV6/CHO,
\lozenge HV0LV4-1/CHO, \Delta la actividad de
HV0LV3-1/CHO, \Box la actividad de
HV0LV2-1/CHO, y \times la actividad de KM2760 como
control negativo.
La Fig. 32 es un diagrama de flujo que muestra
la construcción del plásmido pKM1334LV3-3.
La Fig. 33 es una gráfica que muestra los
resultados de la medición de la actividad de unión a
FGF-8 del anticuerpo quimérico neutralizador
anti-FGF-8 KM3034 y de los
anticuerpos injertados a CDR neutralizadores
anti-FGF-8 HVOLV6/CHO,
HV0LV3-1/CHO, HVOLV4-3/CHO y
HVOLV3-3/CHO mediante BIAcore 2000. La abscisa
representa el tiempo (sec), y la ordenada representa una señal de
resonancia (RU).
La Fig. 34 es una gráfica que muestra la
actividad neutralizadora del anticuerpo quimérico neutralizador
anti-FGF-8 KM3034 y de los
anticuerpos injertados a CDR neutralizadores
anti-FGF-8 HV0LV6/CHO,
HV0LV3-1/CHO, HV0LV4-3/CHO y
HV0LV3-3/CHO del crecimiento dependiente de
FGF-8 de la línea celular SC-3 de
cáncer de mama de ratón. La abscisa representa la concentración de
anticuerpo (\mug/mL), y la ordenada representa el crecimiento
relativo (%) cuando el crecimiento al añadir de
FGF-8 solo se define como 100%. o indica la
actividad de KM3034, \bullet la actividad de HV0LV6/CHO, \Delta
la actividad de HV0LV3-1/CHO, \blacktriangle la
actividad de HV0LV4-3/CHO, \blacksquare la
actividad de HVOLV3-3/CHO, y \times la actividad
de KM2760 como control negativo.
Los Ejemplos y los Ejemplos de Referencia de la
presente invención se describen más abajo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se aislaron condrocitos articulares de conejo de
rodillas y hombros de conejos hembra New Zealand de color blanco de
tres semanas de edad y se cultivaron de acuerdo con el método de
Tamura et al. (Tamura T. et al., Eur. J. Pharmacol.,
419, 269-274, 2001). Esto es, las articulaciones de
las ambas rodillas y la articulaciones de ambos hombros se aislaron
para recoger los cartílagos epifisiales. Estos cartílagos se lavaron
con una solución salina tamponada con fosfato, después se cortaron
en rebanadas, y se trataron con DMEM que comprendía FBS al 10% en
volumen (DMEM que comprendía FBS es referido más adelante como
FBS/DMEM) que comprendía actinasa E al 0,4% p/v a 37ºC durante 1
hora y adicionalmente con FBS/DMEM al 10% en volumen que comprendía
colagenasa P al 0,025% p/v a 37ºC durante 5 a 6 horas para aislar y
recoger los condrocitos de los tejidos cartilaginosos. Los
condrocitos recogidos se suspendieron en FBS/DMEM al 10% en volumen
y se ajustaron a 100.000 células/mL. La solución de cultivo que
comprendía los condrocitos se inoculó en cada pocillo de una placa
de 24 pocillos en una cantidad de 1 mL, y se cultivó en una fase
gaseosa de 5% CO_{2}-95% aire a 37ºC. Una vez que
los condrocitos llegaron a la confluencia, el medio de cultivo se
remplazó por FBS/DMEM al 0,5% en volumen, seguido del cultivo
durante 24 horas. El medio de cultivo se separó, y se añadieron 1 mL
de FBS/DMEM al 0,5% en volumen (grupo no estimulado) o FBS/DMEM al
0,5% en volumen que comprendía FGF-8 (1, 10 o 100
ng/mL; fabricado por Peprotech), seguido del cultivo durante 48
horas. Cuando se examinó la actividad del anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8, se añadieron 1 mL de
FBS/DMEM al 0,5% en volumen que comprendía FGF-8
(100 ng/mL) (grupo 0) o FBS/DMEM al 0,5% en volumen que comprendía
FGF-8 (100 ng/mL) y anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 KM1334 (1, 3 o 10
\mug/mL), y se cultivaron durante 48 horas. La solución de cultivo
se separó, y la cantidad de glucosaminoglicano de la matriz
extracelular que permanecía sobre la placa se midió mediante el
método del azul de dimetilmetileno (DMMB) (Chandrasekhar S. et
al., Anal. Biochem. 161 103-108, 1987). Esto es,
se añadió papaína (fabricada por Sigma-Aldrich) a
un tampón de almacenamiento de papaína (0,1 moles/L de acetato de
sodio, 50 mmoles/L de EDTA, pH 5,8) activado añadiendo 5 mmoles/L de
monohidrato de hidrocloruro de cisteína a una concentración final
de 20 \mug/ml. A cada pocillo de la placa sobre la que se habían
cultivado los condrocitos se le añadió 1 mL de esta solución, y se
digirió durante la noche a 60ºC. A 75 \muL de esta solución
digerida se le añadieron 25 \muL de un tampón de hidrocloruro de
guanidina (2,88 moles/L de hidrocloruro de guanidina, 50 mmoles/L
de acetato de sodio, pH 6,8) y 200 \muL de una solución de DMMB, y
se midió la absorbancia a 530/590 nm. La concentración de
glucosaminoglicano de cada muestra se calculó a partir de la
absorbancia de sulfato de condroitina (derivado de cartílagos de
ballena, fabricado por Seikagaku Kogyo) utilizado como patrón. Se
realizaron tres experimentos para cada condición y se calcularon los
valores medios y el error típico.
Los resultados se muestran en las Figs. 1 y 2.
El FGF-8 redujo significativamente la cantidad
residual de glucosaminoglicano en la matriz extracelular a la
concentración de 100 ng/mL (Fig. 1).
Esto demuestra que FGF-8 tiene
actividad de promoción de la degradación de la matriz extracelular
del cartílago. Adicionalmente, el anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 KM1334 inhibió
significativamente la promoción de la degradación de la matriz
extracelular del cartílago con FGF-8 a la
concentración de anticuerpo de 3 \mug/mL o más (Fig. 2). Por
consiguiente, se puede suprimir la degradación de la matriz
extracelular en la artritis mediante la administración del
anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se aislaron condrocitos articulares de conejo y
se cultivaron mediante el método descrito en Ejemplo 1. Una vez que
los condrocitos llegaron a la confluencia, la solución de cultivo se
remplazó por FBS/DMEM al 0,5% en volumen, seguido del cultivo
durante 24 horas. La solución de cultivo se separó, y se añadieron 1
mL de FBS/DMEM al 0,5% en volumen (grupo no estimulado), FBS/DMEM
al 0,5% en volumen que comprendía FGF-8 (100 ng/mL)
(grupo 0) o FBS/DMEM al 0,5% en volumen que comprendía
FGF-8 (100 ng/mL) y anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 KM1334 (1, 3 o 10
\mug/mL), seguido del cultivo durante 48 horas. Al cabo de 48
horas, se recuperó el medio de cultivo, se midió la concentración
de metaloproteinasa 3 de la matriz en el medio de cultivo utilizando
un sistema ELISA para la metaloproteinasa 3 de la matriz de conejo
(fabricado por Amersham Biosciences). Se realizaron tres
experimentos para cada condición, y se calcularon los valores medios
y el error típico.
Los resultados se muestran en la Fig. 3. El
FGF-8 aumentó significativamente la producción de
metaloproteinasa 3 de la matriz a partir de los condrocitos a una
concentración de 100 ng/mL (grupo no estimulado con respecto al
grupo 0, P=0,0079). Esto demuestra que el FGF-8
tiene actividad de promoción de la degradación de la matriz
extracelular a través de la inducción productiva de metaloproteinasa
3 de la matriz a partir de los condrocitos. Adicionalmente, el
anticuerpo neutralizador anti-FGF-8
KM1334 inhibió significativamente la producción de metaloproteinasa
3 de la matriz a partir de los condrocitos con FGF-8
a la concentración de anticuerpo de 1 \mug/mL o más. El
porcentaje de inhibición con 1, 3 o 10 \mug/mL de anticuerpo
neutralizador anti-FGF-8 KM1334 fue
72, 74 o 100% respectivamente. Por consiguiente, la administración
del anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 puede inhibir la
producción de metaloproteinasa 3 de la matriz a partir de los
condrocitos y la degradación de la matriz extracelular en la
artritis.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Las células sinoviales de conejo se recogieron
mediante el método de Hamilton et al. (Hamilton J. A. y
Slywka J., J. Immunol. 126, 851-855, 1981). Las
células sinoviales aisladas se suspendieron en medio RPMI 1640 que
comprendía FBS al 10% en volumen (el medio RPMI 1640 que comprendía
FBS es referido más adelante como FBS/RPMI 1640), y se inocularon
10.000 células en cada pocillo de una placa de cultivo de 96
pocillos. Al cabo de 24 horas de cultivo, el medio de cultivo de
cada pocillo se separó, y se añadieron 200 \muL de FBS/RPMI 1640
al 0,2% en volumen (grupo no estimulado) o FBS/RPMI 1640 al 0,2% en
volumen que comprendía FGF-8 (1, 10 o 100 ng/mL).
Cuando se examinó la actividad del anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8, se añadieron a cada
pocillo 200 \muL de FBS/RPMI 1640 al 0,2% en volumen que
comprendía FGF-8 (100 ng/mL) (grupo 0) o FBS/RPMI
1640 al 0,2% en volumen que comprendía FGF-8 (100
ng/mL) y anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 KM1334 (0,1, 0,3, 1, 3 o
10 \mug/ml). Al cabo de 48 horas de cultivo, se añadieron 9,25 kBq
por pocillo de timidina[H^{3}]. El cultivo se realizó
adicionalmente durante 24 horas, y se midió la radiactividad de la
timidina[H^{3}] incorporada a la células utilizando un
contador de centelleo líquido (1205 Beta Plate, fabricado por Perkin
Elmer Life Science Japan). Se realizaron seis experimentos para
cada condición, y se calcularon los valores medios y el error
típico.
Los resultados se muestran en las Figs. 4 y 5.
El FGF-8 promovió significativamente la
incorporación de timidina[H^{3}] a las células sinoviales
de conejo a la concentración de 100 ng/mL (Fig. 4). Esto demuestra
que FGF-8 tiene actividad de promoción del
crecimiento de las células sinoviales de conejo. Adicionalmente, el
anticuerpo neutralizador anti-FGF-8
KM1334 inhibió significativamente la promoción de la incorporación
de timidina[H^{3}] dependiente de FGF-8 a
partir de la concentración de anticuerpo a 0,3 \mug/mL (Fig. 5).
Por consiguiente, la administración del anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 puede inhibir el
crecimiento de la membrana sinovial en la artritis.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Se realizó el mismo experimento que en el
Ejemplo 3 utilizando las células sinoviales humanas derivadas del
paciente con artritis reumatoide (obtenidas de Toyobo). Se utilizó
la concentración de FGF-8 a 10, 100 o 500 ng/mL, y
la concentración de FGF-8 coexistente con el
anticuerpo neutralizador anti-FGF-8
KM1334 se utilizó a 500 ng/mL. Se realizaron seis experimentos para
cada condición, y se calcularon los valores medios y el error
típico.
Los resultados se muestran en las Figs. 6 y 7.
El FGF-8 promovió significativamente la
incorporación de timidina[H^{3}] a las células sinoviales
humanas a la concentración de 500 ng/mL (Fig. 6). Esto demuestra que
FGF-8 tiene actividad de promoción del crecimiento
de las células sinoviales humanas. Adicionalmente, el anticuerpo
neutralizador anti-FGF-8 KM1334
inhibió significativamente la promoción de la incorporación de
timidina[H^{3}] dependiente de FGF-8 a
partir de la concentración de anticuerpo a 1 \mug/mL (Fig. 7). Por
consiguiente, la administración del anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 puede inhibir el
crecimiento de la membrana sinovial en la artritis.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Se prepararon secciones en parafina de una
membrana sinovial extraída de un paciente humano con artritis
reumatoide mediante el método del documento (Tanaka A. et
al., Cancer Res. 58, 2053-2056, 1998), y se
realizó la inmunotinción del tejido utilizando el anticuerpo
anti-FGF-8 KM1334. Como resultado,
las células sinoviales de tres de cuatro membranas sinoviales de
artritis reumatoide humana fueron positivos para
FGF-8. De este modo, se confirmó que
FGF-8 está presente en la membrana sinovial humana.
Adicionalmente, se indicó que la artritis reumatoide humana se
puede diagnosticar detectando las células sinoviales de la artritis
reumatoide humana utilizando el anticuerpo
anti-FGF-8.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Se indujeron fenotipos de tipo artritis en ratas
Sprague-Dawley (macho, 7 semanas de edad, Japan
Charles River) utilizando FGF-8 de la siguiente
manera. Se inyectaron 50 \muL de solución de FGF-8
preparada con solución salina (fabricada por Otsuka Seiyaku Kojo) a
una concentración final de 1 mg/mL en cada articulación de la
rodilla de las ratas. Adicionalmente, también se preparó un grupo al
que se inyectaron 50 \muL de solución salina en la articulación
de la rodilla. Un grupo constaba de 3 ratas. Al cabo de 3 días de la
inyección de FGF-8 o solución salina, se lavó el
interior de la cápsula articular de la rodilla con 30 \muL de
solución salina que comprendía citrato de sodio al 0,38% p/v para
recoger el líquido de lavado, de acuerdo con el método de Yamada
et al (Yamada A. et al., Inflamm. Res., 49,
144-146, 2000). Este procedimiento se repitió diez
veces para recuperar 300 \muL del líquido de lavado de la
articulación. La cantidad de glucosaminoglicano en el líquido de
lavado de la articulación se midió mediante el método DMMB descrito
en el Ejemplo 1. Se aisló la patella de la articulación de la
rodilla, y la porción cartilaginosa se digirió con papaína mediante
el método descrito en Ejemplo 1 para medir el peso del hueso.
Los resultados se muestran en las Figs. 8 y 9.
La Fig. 8 muestra la concentración de glucosaminoglicano en el
líquido de lavado de la articulación. La inyección de
FGF-8 aumentó la concentración de glucosaminoglicano
en el líquido de lavado de la articulación 1,9 veces el del grupo
inyectado con solución salina (P=0,0034). Esto indica que la
inyección de FGF-8 hace progresar la degradación de
la matriz extracelular del cartílago articular. La Fig. 9 muestra
el peso de la patela después de digestión con papaína. La inyección
de FGF-8 redujo el peso de la patela hasta en un
40% con respecto al del grupo inyectado con solución salina
(P=0,0454). Esto demuestra que la inyección de
FGF-8 promueve la destrucción de la patela. Por
consiguiente, se demostró que FGF-8 induce la
destrucción de la articulación in vivo y ocasiona los
fenotipos de tipo artritis.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
El modelo de artritis inducida por colágeno en
ratón se preparó de la siguiente manera de acuerdo con el método de
Kamada et al., (Kamada H. et al., Jpn. J. Pharmacol.,
70, 169-175, 1996) utilizando ratones DBA/1J
(macho, 7 semanas de edad, Japan Charles River).
Una solución de colágeno de tipo II derivado de
cartílago bovino (fabricada por Collagen Gijutsu Kenshu) se mezcló
con un coadyuvante completo de Freund (fabricado por Iatron)
enfriando con hielo para formar una emulsión que se ajustó de
manera que la concentración final del colágeno de tipo II se hizo
1,5 mg/mL. La emulsión se inyectó intradérmicamente en una cantidad
de 100 \muL en la base de la cola del ratón para la
sensibilización. Al cabo de 21 días, se realizó la inmunización
adicional de la misma manera. Un grupo consistió en 10 ratones. El
anticuerpo neutralizador anti-FGF-8
KM1334 se disolvió en una solución salina (fabricada por Otsuka
Seiyaku Kojo) a una concentración final de 2 mg/mL, y la solución
se administró intraperitonealmente a un grupo al que se había
administrado KM1334 a una dosis de 200 \muL para cada ratón una
vez al día los días 21, 25, 28, 32, 35 y 39 desde la
sensibilización inicial del modelo de artritis inducida por colágeno
en ratón. Se administró intraperitonealmente solución salina sola a
un grupo al que se había administrado solución salina en lugar de
la solución de anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 KM1334. Adicionalmente,
se disolvió diclofenaco sódico (fabricado por
Sigma-Aldrich), un fármaco antiinflamatorio no
esteroideo, en una solución de metilcelulosa al 0,5% p/v a una
concentración final de 0,3 mg/mL. La solución se administró
oralmente al grupo al que se había administrado diclofenaco sódico
como control positivo a una dosis de 1 mL por 100 g de peso corporal
una vez al día los días 21 a 25, 28 a 32 y 35 a 39 desde la
sensibilización inicial del modelo de artritis en ratón inducida
por colágeno. En cuanto al grupo al que se había administrado
vehículo, sólo se le administró igualmente oralmente una solución
de metilcelulosa al 0,5% p/v. Adicionalmente, se estableció un grupo
no tratado, y no se le sometió a la sensibilización con colágeno y
a la administración de un agente. El cambio con el tiempo de los
edemas de todas las extermidades en la artritis inducida por
colágeno se evaluó mediante la puntuación de 0 a 4 en cada
extremidad hasta un total de 16 en la puntuación máxima de todas las
extremidades. Los criterios de puntuación fueron los siguientes. 0:
normal, 1: se observa eritema débil, 2: se observan hinchazón y
eritema débiles, 3: se observan hinchazón y erietma fuertes y se
siente calor al tacto, y 4: se observa hinchazón clara con
deformación de dedos.
Los resultados se muestran en la Fig. 10. En el
grupo al que se había administrado el anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 KM1334, se observó la
significativa inhibición del 34% (P=0,0204) de la puntuación
artrítica el día 42, y el grado de inhibición fue el mismo que el
grado de inhibición en el grupo al que se había administrado
diclofenaco sódico como control positivo (Fig. 10). Esto demuestra
que la administración del anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 puede inhibir la
artritis.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
El modelo de artritis por coadyuvante en rata se
realizó de la siguiente manera de acuerdo con el método de Pearson
et al. (Pearson CM. et al., Arthritis Rheum., 5,
654-658, 1962) utilizando ratas Lewis (hembra, 8
semanas de edad, Japan Charles River).
Se suspendió Mycobacterium butyricum
(fabricado por Difco) en parafina líquida (fabricada por Wako Pure
Chemical Industries, Ltd.) a una concentración final de 6 mg/mL, y
se esterilizó con un autoclave. La solución resultante se inyectó
intradérmicamente en la almohadilla de la pata trasera derecha de la
rata en una cantidad de 100 \muL para la sensibilización. Un
grupo constaba de 8 a 10 ratas. El anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 KM1334 se disolvió en
solución salina a una concentración final de 2 mg/mL. La solución se
administró intraperitonealmente a un grupo al que se había
administrado KM1334 una vez al día a una dosis de 0,5 mL por 100 g
de peso corporal para cada rata el día de la sensibilización del
modelo de artritis por coadyuvante en rata y los días 3, 7, 10, 14
y 17 desde la sensibilización. Al grupo al que se había administrado
solución salina, sólo se le administró intraperitonealmente
solución salina en lugar de la solución del anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 KM1334. Adicionalmente,
el diclofenaco sódico, un agente antiinflamatorio, se disolvió en
una solución de metilcelulosa al 0,5% p/v a una concentración final
de 0,3 mg/mL, y la solución se administró oralmente al grupo al que
se había administrado diclofenaco sódico como control positivo una
vez al día a una dosis de 1 mL por 100 g de peso corporal los días
4, 7 a 11 y 14 a 18 desde el día de sensibilización con coadyuvante.
Se disolvieron 50 mg de metotrexato® para su inyección (fabricado
por Wyeth Japan) como antagonista metabólico en una solución de
metilcelulosa al 0,5% p/v a una concentración final de 0,01 mg/mL, y
la solución se administró a un grupo al que se había administrado
metotrexato de la misma manera que en el grupo al que se había
administrado diclofenaco sódico. La prednisolona (fabricada por
Sigma-Aldrich), un agente esteroideo, se suspendió
en una solución de metilcelulosa al 0,5% p/v a una concentración
final de 0,3 mg/mL, y la suspensión se administró a un grupo al que
se había administrado prednisolona de la misma manera que en el
grupo al que se había administrado diclofenaco sódico.
Adicionalmente, se administró oralmente una solución de
metilcelulosa al 0,5% p/v sola a un grupo al que se había
administrado disolvente de la misma manera. Se utilizó un grupo no
tratado, y no se sometió a la sensibilización con Mycobacterium
butyricum y a la administración de un agente. Los volúmenes de
la pata tratada con coadyuvante y de la pata no tratada con
coadyuvante se midieron con el paso del tiempo utilizando un
dispositivo para medir edemas de la pata trasera de rata
(TK-101, fabricado por
Unicom).
Unicom).
Los resultados de la medición el día 21 desde el
día de sensibilización se muestran en las Figs. 11 y 12. En el
grupo al que se había administrado el anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 KM1334, se observó una
significativa inhibición de 69% (P=0,0010) del aumento de volumen
de la pata en la pata no tratada con coadyuvante (Fig. 11). Se
observó una significativa inhibición de 45% (P<0,0001) en el
grupo al que se había administrado diclofenaco sódico, una
signficativa inhibición de 90% (P<0,0001) en el grupo al que se
había administrado metotrexato y una significativa inhibición de
51% (P=0,0029) en el grupo al que se había administrado
prednisolona, respectivamente (Fig. 12). Esto es, el anticuerpo
neutralizador anti-FGF-8 KM1334
mostró una actividad inhibidora del edema superior a la del
diclofenaco sódico y la prednisolona.
Utilizando la orina recogida durante 24 horas el
día 20 y el día 21 después de la sensibilización, se midieron las
cantidades de glucosaminoglicano, desoxipiridinolina, hidroxiprolina
y creatinina en orina. La cantidad de glucosaminoglicano en orina
se midió mediante el método DMMB descrito en Ejemplo 1. La cantidad
de hidroxiprolina en orina se midió mediante el método de Ikeda
et al. (Ikeda Shingo et al., Tokyo Eiken Nenpo, 36
277-282, 1985). Esto es, se añadieron 0,8 mL de
ácido clorhídrico para el análisis de aminoácidos (fabricado por
Kanto Kagaku) a 0,8 mL de orina para la hidrólisis a 110ºC durante
15 horas. A 0,5 mL de las muestras hidrolizadas se les añadieron 2
mL de una solución de 1,2 moles/L de hidróxido de sodio para la
neutralización. Se añadió 1 mL de isopropanol a 0,5 mL de la
muestra neutralizada, y se añadió 1 ml de una solución antioxidante.
La mezcla se agitó bien, y se dejó estar a temperatura ambiente
durante 5 minutos. La solución oxidante se prepara disolviendo 5,7
g de trihidrato de acetato de sodio, 3,75 g de dihidrato de citrato
trisódico y 0,602 g de monohidrato de ácido cítrico en
aproximadamente 50 mL de agua destilada, añadiendo 38,5 mL de
isopropanol, añadiendo adicionalmente agua destilada para ajustar
el volumen a 100 mL y mezclando completamente la solución tampón de
acetato-ácido cítrico resultante con una solución al 7% p/v de
cloramina T (trihidrato de p-toluenosulfonocloramida
sódica, fabricada por Wako Pure Chemical Industries Ltd.) preparada
utilizando agua destilada a una razón de 4:1 para su uso. Después
de eso, se añadió 1 mL de un reactivo de Ehrlich, y la mezcla se
agitó bien, y se calentó a 60ºC durante 20 minutos en una
incubadora. El reactivo de Ehrlich es un reactivo obtenido
disolviendo 17,6 g de p-dimetilaminobenzaldehído
(fabricado por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) en 20,9 mL de
ácido perclórico (fabricado por Kanto Kagaku) y añadiendo
isopropanol para ajustar el volumen a 100 mL. Después de calentar,
el producto se enfrió con agua corriente, y la absorbancia se midió
a 562 nm. La concentración de hidroxiprolina en cada muestra se
calculó utilizando una curva de calibración elaborada a partir de la
absorbancia de L-hidroxiprolina (fabricada por Wako
Pure Chemical Industries, Ltd.). La cantidad de desoxipiridinolina
en orina se midió utilizando Osteolinks "DPD" (fabricado por
Sumitomo Seiyaku). La cantidad de creatinina en orina se midió
utilizando Creatinine-Test Wako (fabricado por Wako
Pure Chemical Industries, Ltd.). Para corregir la diferencia de
concentración en orina entre individuos, se calculó la razón de
concentración de glucosaminoglicano/-concentración de creatinina,
la razón de concentración de desoxipiridinolina/concentración de
creatinina o la razón de concentración de
hidroxiprolina/concentración de creatinina para cada individuo, y
se utilizó como cada
índice.
índice.
Los resultados se muestran en las Figs. 13 a 17.
La cantidad de glucosaminoglicano en orina se incrementó en el
grupo al que se había administrado solución salina hasta 2,2 veces
la del grupo no tratado (P<0,0001) (Fig. 13). Esto demuestra que
continúa el progreso de la destrucción de cartílago de acuerdo con
la artritis. En el grupo al que se había administrado el anticuerpo
neutralizador anti-FGF-8 KM1334, se
observó la significativa inhibición del 73% (P=0,0064) del aumento
de la cantidad de glucosaminoglicano en orina (Fig. 13). En el grupo
al que se había administrado metotrexato, se observó la
significativa inhibición del 79% (P=0,0465) del aumento de la
cantidad de glucosaminoglicano en orina. Se observó un descenso del
40% de la cantidad de glucosaminoglicano en orina en el grupo al
que se había administrado diclofenaco sódico, y se observó un
descenso del 18% de la cantidad de glucosaminoglicano en orina en
el grupo al que se había administrado perdnisolona, aunque no
significativo (Fig. 14). Esto es, el anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 KM1334 mostró la misma
actividad inhibidora de la destrucción de cartílago que el
metotrexato.
La cantidad de desoxipiridinolina en orina se
incrementó hasta 1,8 veces la del grupo no tratado (P<0,0001) en
el grupo al que se había administrado solución salina (Fig. 15).
Esto demuestra que la destrucción de hueso progresa a medida que
prosigue la artritis. En el grupo al que se había administrado
anticuerpo neutralizador anti-FGF-8
KM1334, se observó la significativa inhibición del 41% (P=0,0185)
del aumento de la cantidad de desoxipiridinolina en orina. En el
grupo al que se había administrado diclofenaco sódico, se observó la
significativa inhibición del 88% (P=0,0016) del aumento de la
cantidad de desoxipiridinolina en orina. Se observó un descenso del
34% de la cantidad de desoxipiridinolina en orina en el grupo al que
se había administrado metotrexato, y se observó un descenso del 38%
de la cantidad de desoxipiridinolina en orina en el grupo al que se
había administrado prednisolona, aunque no significativo (Fig. 16).
Esto es, el anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 KM1334 mostró una
actividad inhibidora de la destrucción de hueso por encima del
metotrexato y la predniso-
lona.
lona.
La cantidad de hidroxiprolina en orina se
incrementó hasta 1,8 veces la del grupo no tratado (P=0,0002) en el
grupo al que se había administrado solución salina (Fig. 17). Esto
demuestra que la destrucción de hueso progresa a medida que
prosigue la artritis. En el grupo al que se había administrado el
anticuerpo neutralizador anti-FGF-8
KM1334, se observó un descenso del 48% del aumento de la cantidad de
hidroxiprolina en orina, aunque no significa-
tivo.
tivo.
El día 21 desde la sensibilización, se tomaron
muestras de la pata no tratada con coadyuvante cortando por el eje
de la tibia, y se fijaron con una solución de formalina tamponada
con fosfato al 10% en volumen. Con posterioridad, se fotografiaron
con rayos X suaves en condiciones de 29 kV, 4 mA y 2 minutos
utilizando un generador de rayos X suaves SOFRON
SRO-M50 (fabricado por Sofron). La fotografía se
observó utilizando un microscopio estereoscópico, y se puntuó la
destrucción de hueso. La puntuación se realizó observando la
presencia o ausencia de erosión de hueso del calcáneo (un total de
cinco sitios con un lado definido como un sitio). Cuando se observó
la erosión, ésta se definió como 1; cuando no se observó erosión,
ésta se definió como 0; y la puntuación máxima fue 5 en una
pata.
pata.
Los resultados se muestran en las Tablas 1 y 2.
Los valores medios representan los valores \pm el error típico, y
* indica P<0,05, ** indica P<0,01 y *** indica P<0,001 (en
comparación con un grupo al que se había administrado disolvente,
prueba de suma de rangos de Wilcoxon).
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Se observó una disminución de la puntuación de
destrucción de hueso de 27% en el grupo al que se había administrado
el anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 KM1334, aunque no
significativo (Tabla 1). Con respecto a la puntuación de
destrucción de hueso, se observó un descenso de 33% (P=0,0362) en el
grupo al que se había administrado diclofenaco sódico, un descenso
de 80% (P=0,0006) en el grupo al que se había administrado
metotrexato, y un descenso de 61% (P=0,0032) en el grupo al que se
había administrado prednisolona (Tabla 2). Esto es, el anticuerpo
neutralizador anti-FGF-8 KM1334
mostró el mismo descenso de la puntuación de destrucción de hueso
que el del diclofenaco sódico.
Se prepararon secciones en parafina de la pata
no tratada con coadyuvante fijada con formalina. Las secciones se
sometieron a tinción con hematoxilina/eosina, y se evaluaron
histopatológicamente el hueso, la articulación y la región
alrededor de la articulación desde la tibia hasta el hueso
metatarsiano. La salida de plasma hacia el tejido alrededor de la
articulación o hacia la cavidad articular se evaluó mediante la
puntuación de 0 a 4 en una pata. Los criterios de puntuación fueron
los siguientes. 0: sin cambio, 1: se observa un cambio muy ligero,
2: se observa un cambio ligero, 3: se observa un cambio medio, y 4:
se observa un cambio profundo.
\newpage
Los resultados se muestran en la Tabla 3. Los
valores representan los valores medios \pm el error típico, y *
indica P<0,05, y ** P<0,01 (en comparación con grupo al que se
había administrado solución salina, prueba de suma de rangos de
Wilcoxon).
En el grupo administrado con anticuerpo
neutralizador anti-FGF-8 KM1334, se
observaron un descenso de 41% (P=0,0022) de la salida de plasma al
tejido alrededor de la articulación y un descenso de 41% (P=0,0156)
de la salida de células y plasma sanguíneo a la cavidad articular
(Tabla 3). Por consiguiente, la administración del anticuerpo
neutralizador anti-FGF-8 puede
inhibir la formación de edema en la artritis y la destrucción de
cartílagos y huesos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
9
El modelo de osteoartritis inducido por ácido
monoyodoacético en rata se produjo de la siguiente manera mediante
el método de Guingamp et al. (Guingamp C. et al.,
Arthritis Rheum., 40, 1670-1679, 1997) utilizando
ratas Sprague-Dawley (macho, 7 semanas de edad,
Japan Charles River).
Se inyectó ácido monoyodoacético (fabricado por
Sigma-Aldrich) preparado con solución salina a una
concentración final de 10 mg/mL en la articulación de la rodilla
derecha de la rata en una cantidad de 25 \muL. Un grupo constaba
de 10 ratas. Se disolvió un anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 KM1334 en solución salina
(fabricada por Otsuka Seiyaku Kojo) a una concentración final de 4
mg/mL, y se administró intraperitonealmente la solución de
anticuerpo a una dosis de 0,5 mL por 100 g de peso corporal a un
grupo al que se había administrado KM1334 al mismo tiempo que la
inyección de ácido monoyodoacético. Al grupo de solución salina, se
le administró intraperitonealmente solución salina sola en lugar de
la solución de anticuerpo. Adicionalmente, se dispuso un grupo
operado simuladamente, y se inyectó la solución salina en su
articulación de la rodilla sin la administración del agente. Al cabo
de 3 días de la inyección de ácido monoyodoacético, el líquido de
lavado de la articulación se recuperó mediante el método descrito
en el Ejemplo 6. La cantidad de glucosaminoglicano en el líquido de
lavado de la articulación se midió mediante el método DMMB descrito
en Ejemplo 1.
Los resultados se muestran en la Fig. 18. La
inyección de ácido monoyodoacético aumentó la concentración de
glucosaminoglicano en el líquido de lavado de la articulación hasta
1,6 veces la del grupo operado simuladamente (P=0,0014). Esto
demuestra que la degradación de la matriz extracelular del cartílago
articular progresa mediante la inyección de ácido monoyodoacético.
En el grupo al que se había administrado anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 KM1334, se observó una
significativa inhibición del 42% (P=0,0188) de aumento en
concentración de glucosaminoglicano en el líquido de lavado de la
articulación en la inyección de ácido monoyodoacético. Por
consiguiente, la administración del anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 puede inhibir la
destrucción del cartílago articular en la artritis.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de Referencia
1
Se prepararon aproximadamente 8 \mug de ARNm a
partir de 1 \times 10^{7} células de hibridoma KM1334 (FERM
BP-5451, Solicitud de Patente Japonesa No examinada
Núm. 271391/97) que produce un anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 de ratón utilizando
FastTrack Isolación ARNm Kit (fabricado por Invitrogen), un kit de
preparación de ARNm de acuerdo con el manual adjunto.
Se sintetizaron ADNc que tenían adaptadores
EcoRI-NotI en ambos extremos a partir de 5 \mug de
ARNm de KM1334 obtenidos en (1) antes utilizando TimeSaver ADNc
Synthesis Kit (fabricado por Amersham Biosciences) de acuerdo con
el manual adjunto. Con posterioridad, se produjeron genotecas de
ADNc utilizando \lambdaZAPII Clonación Kit (fabricado por
Stratagene). En primer lugar, se disolvió la cantidad total de los
ADNc en 20 \muL de agua estéril, y la solución se fraccionó
mediante electroforesis en gel de agarosa para recuperar
aproximadamente 0,1 \mug de un fragmento de ADNc de
aproximadamente 1,5 kb correspondiente a la cadena H de un
anticuerpo de la clase IgG y un fragmento de ADNc de
aproximadamente 1,0 kb correspondiente a la cadena L de la clase
\kappa. Después, se ligaron 0,1 \mug del fragmento de ADNc de
aproximadamente 1,5 kb y 0,1 \mug del fragmento de ADNc de
aproximadamente 1,0 kb con 1 \mug del vector \lambdaZAPII cuyo
extremo se desfosforiló con fosfatasa alcalina de intestino de
ternera después de la digestión con la endonucleasa de restricción
EcoRI de acuerdo con el manual adjunto.
Se empaquetaron 4 \mul de cada una de las
soluciones de reacción después de la ligación en fagos \lambda
utilizando Gigapack II Packaging Extracts Gold (fabricado por
Stratagene) de acuerdo con el manual adjunto y la cepa
XL1-Blue de Escherichia coli (fabricada por
Stratagene) se infectó con una cantidad apropiada de las mismas
para obtener aproximadamente 8,1 \times 10^{4} clones de fagos y
aproximadamente 5,5 \times 10^{4} clones de fagos como genoteca
de ADNc de la cadena H y genoteca de ADNc de la cadena L de KM1334.
Con posterioridad, estos fagos se inmovilizaron sobre membranas de
nailon respectivamente mediante un método habitual (Molecular
Cloning 3^{a} edición).
Las membranas de nailon de la genoteca de ADNc
de la cadena H y la genoteca de ADNc de la cadena L de KM1334
producidas en el apartado (2) anterior se detectaron utilizando ECL
Direct Nucleic Acid Labelling and Detection Systems (fabricado por
Amersham Biosciences) de acuerdo con el manual adjunto después de
emplear los ADNc de una región C de un anticuerpo de ratón [un
fragmento de ADN que comprende ADNc C\gamma1 de ratón (French D.
L. et al., J. Immunol., 146, 2010-2016, 1991)
como cadena H y un ADN fragmento que comprende ADNc C\kappa de
ratón (Hieter P. A. et al., Cell, 22,
197-207, 1980) como cadena L] como sondas para
obtener 10 clones de fagos fuertemente unidos a la sonda para cada
una de las cadenas H y las cadenas L. Los clones de fagos
respectivos se convirtieron después en plásmidos mediante escisión
in vivo de acuerdo con el manual del \lambdaZAPII
Clonación Kit (fabricado por Stratagene). La secuencia de
nucleótidos del ADNc comprendido en cada uno de los plásmidos
obtenidos de este modo se determinó utilizando Big Dye Terminator
Kit Ver. 2 (fabricado por Applied Biosystems) y un Secuenciador de
ADN. Como resultado, se obtuvieron el plásmido
pKM1334H7-1 que comprendía el ADNc de la cadena H
funcional completo y el plásmido pKM1334L7-1 que
comprendía el ADNc de la cadena L funcional completo donde estaba
presente la secuencia ATG deducida como codón de iniciación en el
extremo 5' del ADNc.
La secuencia de nucleótidos completa de VH
comprendida en el plásmido pKM1334H7-1 se describe
en el SEQ ID NO. 1, la secuencia de aminoácidos completa deducida
en el SEQ ID NO. 2, la secuencia de nucleótidos completa de VL
comprendida en el plásmido pKM1334L7-1 en el SEQ ID
NO. 3, y la secuencia de aminoácidos completa deducida en el SEQ ID
NO. 4 respectivamente. En comparación con los datos de secuencia del
anticuerpo de ratón conocido (Secuencias de Proteínas de Interés
Inmunológico) y en comparación con los resultados del análisis de
las secuencias de aminoácidos N-terminales de la
cadena H y la cadena L del anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 KM1334 de ratón
purificado a través de degradación de Edman automática utilizando
Protein Sequencer PPSQ-10 (fabricado por Shimadzu
Corporation), cada uno de los ADNc aislados tiene la longitud
completa de los ADNc que codifican el anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 KM1334 de ratón que
comprenden una secuencia señal secretora. Con respecto a la cadena
H, la secuencia 1^{a} a 19^{a} de la secuencia de aminoácidos
descrita en el SEQ ID NO. 2 y con respecto a la cadena L, la
secuencia 1^{a} a 19^{a} de la secuencia de aminoácidos
descrita en el SEQ ID NO. 4 se encontró que eran las secuencias
señal secretoras. Las secuencias de aminoácidos de VH y VL excepto
las secuencias señal secretoras se describieron en el SEQ ID NO. 5 y
SEQ ID NO. 6 respectivamente.
A continuación, se examinó la novedad de las
secuencias de aminoácidos de VH y VL del anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 KM1334 de ratón. Se
investigó la base de datos de las secuencias de aminoácidos de
proteínas existentes [PIR-Protein (Release 56.0)]
mediante BLAST (Altschul S. F. etal., J. Mol. Biol., 215,
403-410, 1990) utilizando GCG Package (Version 9.1,
fabricado por Genetics Computer Group) como sistema de análisis de
la secuencia. Como resultado, no se encontraron secuencias
completamente idénticas con respecto tanto a la cadena H y la
cadena L, y se confirmó que VH y VL del anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 KM1334 de ratón eran las
secuencias de aminoácidos novedosas.
Se identificaron las CDR de VH y VL del
anticuerpo neutralizador anti-FGF-8
KM1334 de ratón en comparación con la secuencia de aminoácidos del
anticuerpo conocido. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y
CDR3 de VH del anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 KM1334 de ratón se
describieron en los SEQ ID NOS. 7, 8 y 9, y las secuencias de
aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de VL del anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 KM1334 de ratón se
describieron en los SEQ ID NOS. 10, 11 y 12 respectivamente.
Utilizando 50 ng del plásmido
pKM1334H7-1 obtenido en el apartado 1.(3) del
Ejemplo de Referencia 1 como molde, se añadieron como cebadores los
ADN sintéticos (fabricado por GENSET) que tenían las secuencias de
nucleótidos descritas en los SEQ ID NOS. 13 y 14 respectivamente
para producir una concentración final de 0,3 \mumoles/L, y se
llevó a cabo la PCR calentando en primer lugar 50 \mul en el
volumen total de la mezcla a 94ºC durante 2 minutos y con
posterioridad 30 ciclos de reacciones a 94ºC durante 15 segundos,
57ºC durante 30 segundos y 68ºC durante 1 minuto como ciclo de
acuerdo con las instrucciones del fabricante adjuntas a la
polimerasa KOD plus (fabricada por TOYOBO). La solución de reacción
se purificó, después se disolvió en agua estéril, y se hizo
reaccionar a 37ºC durante 1 hora utilizando 10 unidades de
endonucleasa de restricción EcoRI (fabricada por Takara
Shuzo). La solución de reacción se fraccionó mediante electroforesis
en gel de agarosa para recuperar aproximadamente 0,3 \mug de un
fragmento EcoRI (el lado terminal 5' es
\hbox{EcoRI, y
el lado terminal 3' es un extremo romo) de aproximadamente 0,48
kb.}
Después, se hicieron reaccionar 3 \mug del
plásmido pBluescript SK(-)con 10 unidades de endonucleasa de
restricción EcoRI y 10 unidades de endonucleasa de
restricción EcoRV (fabricada por Takara Shuzo) a 37ºC durante
1 hora. La solución de reacción se fraccionó mediante
electroforesis en gel de agarosa para recuperar aproximadamente 2
\mug de un fragmento EcoRI-EcoRV de aproximadamente
2,95 kb.
A continuación, se añadieron a agua estéril 0,1
\mug del fragmento EcoRI del ADN que codificaba VH y 0,1
\mug del fragmento EcoRI-EcoRV derivado del plásmido
pBluescript SK(-) obtenido antes en una cantidad total de 10
\mul, y se ligaron utilizando Ligation High (fabricado por
Toyobo). La cepa XL1-Blue de Escherichia
coli se transformó utilizando la solución de ADN del plásmido
recombinante obtenida de este modo para obtener el plásmido
pKM1334CH-H5 que comprendía el ADN que codifica VH
del anticuerpo quimérico neutralizador
anti-FGF-8 como se muestra en la
Fig. 19.
Utilizando 50 ng del plásmido
pKM13347-1 obtenido en el apartado 1.(3) del Ejemplo
de Referencia 1 como molde, se añadieron como cebadores los ADN
sintéticos (fabricados por GENSET) que tenían las secuencias de
nucleótidos descritas en los SEQ ID NOS. 15 y 16 respectivamente
para producir una concentración final de 0,3 \mumoles/L, y se
llevó a cabo la reacción PCR calentando primero 50 \mul en el
volumen total de la mezcla a 94ºC durante 2 minutos y con
posterioridad 30 ciclos de reacciones a 94ºC durante 15 segundos,
57ºC durante 30 segundos y 68ºC durante 1 minuto como ciclo de
acuerdo con las instrucciones del fabricante adjuntas a la
polimerasa KOD plus. La solución de reacción se purificó, después
se disolvió en agua estéril, y se hizo reaccionar a 37ºC durante 1
hora utilizando 10 unidades de endonucleasa de restricción
EcoRI. La solución de reacción se fraccionó mediante
electroforesis en gel de agarosa para recuperar aproximadamente 0,3
\mug de un fragmento EcoRI (el lado terminal 5' es
EcoRI, y el lado terminal 3' es un extremo romo) de
aproximadamente 0,45 kb.
A continuación, se añadieron a agua estéril 0,1
\mug del fragmento EcoRI del ADN que codifica VL y 0,1
\mug del fragmento EcoRI-EcoRV derivado del
plásmido pBluescript SK(-)obtenido antes en una cantidad total de 10
\mul, y se ligaron utilizando Ligation High. La cepa
XL1-Blue de Escherichia coli se transformó
utilizando la solución de ADN del plásmido recombinante obtenida de
este modo para obtener el plásmido pKM1334CH-L4 que
comprendía el ADN que codificaba VL del anticuerpo quimérico
neutralizador anti-FGF-8 como se
muestra en la Fig. 20.
Se construyó un vector de expresión para el
anticuerpo quimérico neutralizador
anti-FGF-8 pKANTEX1334 de la
siguiente manera utilizando el vector pKANTEX93 para la expresión
del anticuerpo humanizado descrito en el documento WO 97/10354 y de
los plásmidos pKM1334CH-H5 y
pKM1334CH-L4 obtenidos en los apartados 2.(1) y (2)
del Ejemplo de Referencia 1.
En primer lugar, se añadieron 10 unidades de la
endonucleasa de restricción NotI (fabricada por New England
Biolabs) y 10 unidades de la endonucleasa de restricción ApaI
(fabricada por Takara Shuzo) a 3 \mug del plásmido
pKM1334CH-H5 obtenido en el apartado 2.(1) del
Ejemplo de Referencia 1, y se realizó una reacción a 37ºC durante 1
hora. La solución de reacción se fraccionó mediante electroforesis
en gel de agarosa para recuperar aproximadamente 0,2 \mug de un
fragmento NotI-ApaI de aproximadamente 0,48 kb.
Después, se añadieron 3 \mug del vector
pKANTEX93 para la expresión del anticuerpo humanizado a 10 unidades
de endonucleasa de restricción ApaI (fabricada por Takara
Shuzo) y 10 unidades de endonucleasa de restricción NotI y
se realizó una reacción a 37ºC durante 1 hora. La solución de
reacción se fraccionó mediante electroforesis en gel de agarosa
para recuperar aproximadamente 2 \mug de un fragmento
ApaI-NotI de aproximadamente 12,8 kb.
A continuación, se añadieron 0,1 \mug del
fragmento NotI-ApaI derivado del plásmido
pKM1334CH-H5 y 0,1 \mug del fragmento
NotI-ApaI derivado del plásmido pKANTEX93 obtenido
antes a agua estéril en una cantidad total de 10 \muL, y se
ligaron utilizando Ligation High. La cepa XL1-Blue
de Escherichia coli se transformó utilizando la solución de
ADN recombinante del plásmido obtenido de este modo para obtener el
plásmido pKANTEX1334H mostrado en la Fig. 21.
Después, se añadieron 10 unidades de la
endonucleasa de restricción EcoRI y 10 unidades de la
endonucleasa de restricción BsiWI (fabricada por New England
BioLabs) a 3 \mug del plásmido pKM1334CH-L4
obtenido en el apartado 2.(2) del Ejemplo de Referencia 1, y se
realizó una reacción a 37ºC durante 1 hora. La solución de reacción
se fraccionó mediante electroforesis en gel de agarosa para
recuperar aproximadamente 0,2 \mug de un fragmento
EcoI-BsiWI de aproximadamente 0,45 kb.
Después, se hicieron reaccionar 3 \mug del
plásmido pKANTEX1334H obtenido anteriormente con 10 unidades de
endonucleasa de restricción EcoRI y 10 unidades de
endonucleasa de restricción BsiWI a 37ºC durante 1 hora. La
solución de reacción se fraccionó mediante electroforesis en gel de
agarosa para recuperar aproximadamente 2 \mug de un fragmento
EcoRI-BsiWI de aproximadamente 13,30 kb.
Después, se añadieron 0,1 \mug del fragmento
EcoRI-BsiWI derivado del plásmido
pKM1334CH-L4 y 0,1 \mug del fragmento
EcoRI-BsiWI derivado del plásmido pKANTEX1334H
obtenido antes a agua estéril en una cantidad total de 10 \muL, y
se ligaron utilizando Ligation High. La cepa
XL1-Blue de Escherichia coli se transformó
utilizando la solución de ADN recombinante del plásmido obtenido de
este modo para obtener el plásmido pKANTEX1334 mostrado en la Fig.
21.
Utilizando 400 ng del plásmido pKANTEX1334
resultante, se realizó el análisis de la secuencia de nucleótidos
utilizando Big Dye Terminator Kit Ver. 2 y un Secuenciador de ADN.
Como resultado, se confirmó que se obtuvo el plásmido con el ADN
deseado clonado.
La expresión del anticuerpo quimérico
neutralizador anti-FGF-8 utilizando
células CHO/DG44 (Urlaub G. y Chasin L. A., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 77, 4216-4220, 1980) careciendo las células CHO
del gen DHFR como anfitrionas se realizó con el vector de expresión
del anticuerpo quimérico neutralizador
anti-FGF-8 pKANTEX1334 obtenido en
el apartado 2.(3) del Ejemplo de Referencia 1 de la siguiente
manera.
Se introdujeron 10 \mug del plásmido
pKANTEX1334 en 1,6 x 10^{6} células CHO/DG44 mediante el método de
electroporación (Miyaji H. et al., Cytotechnology 3,
133-140, 1990), y las células resultantes se
suspendieron después en 10 a 30 mL de IMDM-1 x dFBS
con HT-Supplement (10) [medio IMDM (fabricado por
Invitrogen) que contenía FBS al 10% para Diálisis (más adelante
abreviado como dFBS) y 1 x HT Supplement (fabricado por
Invitrogen)]. La suspensión se dispensó en una placa de
microtitulación de 96 pocillos (fabricada por Asahi Techno Glass)
en una cantidad de 100 \mul/pocillo. Después del cultivo en una
incubadora con 5% de CO_{2} a 37ºC durante 24 horas, la solución
de cultivo se remplazó por medio
IMDM-dFBS(10) (medio IMDM que no contenía HT
Supplement pero contenía dFBS al 10%), y el cultivo se realizó
adicionalmente durante 1 a 2 semanas. El sobrenadante de cultivo se
recuperó de los pocillos donde aparecieron colonias resistentes y se
volvieron confluentes, y se midió la actividad de unión al antígeno
del anticuerpo quimérico neutralizador
anti-FGF-8 en el sobrenadante
mediante el ELISA mostrado en el apartado 2.(6) del Ejemplo de
Referencia 1 siguiente.
Los transformantes del pocillo en el que se
observó la expresión del anticuerpo quimérico neutralizador
anti-FGF-8 en el sobrenadante de
cultivo se inocularon en una placa de 24 pocillos, y se cultivaron
en IMDM-dFBS (10) que contenía 50 nmoles/L de
metotrexato (fabricado por Sigma-Aldrich, más
adelante abreviado como MTX) como inhibidor de dhfr para
incrementar la cantidad de expresión del anticuerpo con un sistema
de amplificación del gen dhfr durante 2 semanas. Adicionalmente, se
incrementó la concentración de MTX a 200 nmoles/L y 500 nmoles/L, y
el cultivo se realizó durante 2 semanas en cada fase para inducir
los transformantes que muestran la resistencia a MTX de 500
nmoles/L. Cuando los transformantes se hicieron confluentes en el
pocillo, la actividad de unión al antígeno del anticuerpo quimérico
neutralizador anti-FGF-8 en el
sobrenadante de cultivo se midió mediante el ELISA descrito en el
apartado 2.(6) del Ejemplo de Referencia 1. Finalmente se obtuvieron
los transformantes susceptibles de crecimiento en medio
IMDM-dFBS(10) que contenía 500 nmoles/L de
MTX y que expresaban sumamente el anticuerpo quimérico
neutralizador anti-FGF-8. Los
transformantes resultantes se elaboraron en una sola célula
(sometida a clonación) mediante el método de dilución limitante, y
el clon transformante que muestra la expresión más alta del
anticuerpo quimérico neutralizador
anti-FGF-8 se denominó KM3034.
KM3034 se depositó como FERM BP-7836 en el
Despósito de Organismos de Patentes Internacionales, Instituto
Nacional de Ciencia y Tecnología Avanzadas (AIST Tsukuba Central 6,
1-1-1 Higashi, Tsukubashi Ibaraki,
305-8566, Japón) el 26 de Diciembre de 2001.
La expresión del anticuerpo quimérico
neutralizador anti-FGF-8 en células
YB2/0 (ATCC No. CRL-1662) de hibridoma de rata se
realizó de la siguiente manera utilizando el vector de expresión del
anticuerpo quimérico neutralizador
anti-FGF-8 pKANTEX1334 obtenido en
el apartado 2.(3) del Ejemplo de Referencia 1 anterior.
Se introdujeron 10 \mug del plásmido
pKANTEX1334 en 4 \times 10^{6} células YB2/0 mediante el método
de electroporación, y las células resultantes se suspendieron
después en 40 mL de
hibridoma-SFM-FBS(5) [medio
hibridoma-SFM (fabricado por Invitrogen) que
contenía FBS al 5% (fabricado por PAA Laboratories). La suspensión
se dispensó a una placa de cultivo de 96 pocillos (fabricada por
Sumitomo Bakelite) en una cantidad de 200 \mul/pocillo. Después
del cultivo en una incubadora con CO_{2} al 5% a 37ºC durante 24
horas, se añadió G418 hasta una concentración de 1 mg/mL, y el
cultivo se realizó durante 1 a 2 semanas. El sobrenadante de
cultivo se recuperó de los pocillos donde aparecían las colonias de
transformantes que mostraban resistencia a G418 y se observó el
crecimiento, y la actividad de unión al antígeno del anticuerpo
quimérico neutralizador anti-FGF-8
en el sobrenadante se midió mediante el ELISA descrito en el
apartado 2.(6) del Ejemplo de Referencia 1.
Los transformantes del pocillo en el que se
observó la expresión del anticuerpo quimérico neutralizador
anti-FGF-8 en el sobrenadante de
cultivo se suspendieron en medio de
hibridoma-SFM-FBS(5) que
contenía 1 mg/mL de G418 y 50 nmoles/L de MTX a una concentración
de 1 a 2 \times 10^{5} células/mL para incrementar la cantidad
de expresión del anticuerpo con un sistema de amplificación del gen
dhfr, y la suspensión se dispensó a una placa de 24 pocillos
(fabricada por Greiner) en una cantidad de 1 mL/pocillo. El cultivo
se realizó en una incubadora con CO_{2} al 5% a 37ºC durante 1 a
2 semanas para inducir una línea transformada que tenía resistencia
a MTX de 50 nmoles/L. La actividad de unión al antígeno del
anticuerpo quimérico neutralizador
anti-FGF-8 en el sobrenadante de
cultivo del pocillo donde se observó el crecimiento de los
transformantes se midió mediante el ELISA descrito en el apartado
2.(6) del Ejemplo de Referencia 1.
Con respecto a la línea transformada del pocillo
en la que se observó la expresión del anticuerpo quimérico
neutralizador anti-FGF-8 en el
sobrenadante de cultivo, la concentración de MTX se incrementó
mediante el método precedente para obtener la línea transformada
5-D susceptible de crecimiento en el medio de
hibridoma-SFM-FBS(5) que
contenía G418 a una concentración final de 1 mg/mL y MTX a una
concentración final de 200 nmoles/L y que expresaban sumamente el
anticuerpo quimérico neutralizador
anti-FGF-8. El transformante
resultante se sometió a clonación mediante el método de dilución
limitante para obtener la línea de transformantes que muestra la
expresión más alta del anticuerpo quimérico neutralizador
anti-FGF-8. La línea de
transformantes obtenida de este modo se denominó KM3334.
Se sintetizó un péptido que comprendía una
secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 17 que es
la misma que la de un péptido antigénico del anticuerpo
neutralizador anti-FGF-8 KM1334 de
ratón (Solicitud de Patente Japonesa No examinada Núm. 271391/97)
en forma de un péptido parcial de FGF-8 humano capaz
de reaccionar con el anticuerpo
anti-FGF-8. El SEQ ID NO. 17 es una
secuencia donde se añade un residuo cisteína para la preparación de
un producto conjugado al extremo C de la secuencia 23^{a} a
46^{a} en la secuencia de aminoácidos de FGF-8
humano. Este péptido es referido más adelante como compuesto 1. Se
produjo un producto conjugado con albúmina de suero bovino
(fabricada por Nacalai Tesque, más adelante abreviada como BSA) (más
adelante referido como BSA-compuesto 1) mediante el
método siguiente para su uso en un ELISA. Esto es, se añadieron
gota a gota 100 \mul de una solución de 25 mg/ml de SMCC éster de
N-hidroxisuccinimida de ácido
[4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxílico]
(fabricado por Sigma-Aldrich)-DMSO
agitando a 900 \mul de una solución de PBS que comprendía 10 mg de
BSA, seguido de agitación lenta durante 30 minutos. Se colocó 1 mL
de la solución de reacción en una columna de filtración en gel
(columna NAP-10) equilibrada con 25 mL de PBS, y se
hizo eluir con 1,5 mL de PBS. El producto eluido resultante se
denominó solución de BSA-SMCC. La concentración de
BSA de cada fracción se midió en términos de la absorbancia a 280
nm. Con posterioridad, se añadieron 200 \muL de DMSO a 1,0 mg del
compuesto 1, y después se añadieron 800 \muL de PBS para
disolverlos completamente. Se añadió la solución de
BSA-SMCC anterior (2,5 mg según se calculó en
términos de BSA) mientras se agitaba, y la mezcla se agitó
suavemente a temperatura ambiente durante 3 horas. La solución de
reacción se dializó frente a PBS durante la noche a 4ºC, y se añadió
azida sódica de manera que la concentración final se hizó el 0,05%.
Después de eso, la mezcla se filtró a través de un filtro que tenía
un diámetro de poro de 0,22 \mum, y la solución resultante se
denominó solución de BSA-compuesto 1.
La solución de BSA-compuesto 1
preparada anteriormente se dispensó a una placa de ELISA de 96
pocillos (fabricada por Greiner) a una concentración de 0,5 a 1,0
\mug/mL en una cantidad de 50 \muL/pocillo, y se dejó estar
durante la noche a 4ºC para la adsorción. Después del lavado con
PBS, se añadió PBS que contenía BSA al 1% (más adelante referido
como BSA-PBS) en una cantidad de 100 \muL/pocillo
y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora para
bloquear un grupo activo restante. Después de lavar cada pocillo con
PBS que contenía Tween al 0,05% (más adelante referido como
Tween-PBS), el sobrenadante de cultivo o el
anticuerpo purificado de los transformantes se añadió en una
cantidad de 50 \muL/pocillo, y la reacción se condujo a
temperatura ambiente durante 1 hora. Después de la reacción, cada
pocillo se lavó con Tween-PBS, se añadió una
solución de anticuerpo anti-IgG (H y L) humano de
cabra marcado con peroxidasa (fabricada por AmericanQualex) diluida
de 3.000 a 6.000 veces con BSA-PBS como segunda
solución de anticuerpo en una cantidad de 50 \muL/pocillo. La
reacción se realizó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después
de la reacción, cada pocillo se lavó con Tween-PBS,
se añadió una solución sustrato de ABTS [solución obtenida
disolviendo 0,55 g de
2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonato
de amonio) en 1 L de solución de tampón citrato 0,1 M (pH 4,2) y
añadiendo una solución de peróxido de hidrógeno al 30% a una razón
de 1 \muL/mL inmediatamente antes de su uso] en una cantidad de 50
\muL/pocillo para permitir una reacción de desarrollo de color.
Al cabo de 5 minutos, se añadió una solución de SDS al 5% en una
cantidad de 50 \muL/pocillo para detener la reacción. Después, se
midió la absorbancia a 415 nm.
La línea de transformantes KM3034 que expresaba
el anticuerpo quimérico neutralizador
anti-FGF-8 obtenido en el apartado
2.(4) del Ejemplo de Referencia 1 se suspendió en medio
IMDM-dFBS(10) que contenía 500 nmoles/L de
MTX a una concentración de 1 a 2 x 10^{5} células/mL, y la
suspensión se dispensó a un matraz de 175 cm^{2} (fabricado por
Greiner) en una cantidad de 40 mL. El cultivo se realizó en una
incubadora con CO_{2} al 5% a 37ºC durante 5 a 7 días. Cuando la
células se volvieron confluentes, el sobrenadante de cultivo se
separó, y las células se lavaron con 20 mL de PBS. El PBS se separó,
y se añadieron 40 mL de medio EX-CELL 301
(fabricado por JRH Biosciences). El cultivo se realizó en una
incubadora con CO_{2} al 5% a 37ºC durante 7 a 14 días, y el
sobrenadante de cultivo se recuperó después. El anticuerpo quimérico
neutralizador anti-FGF-8 se
purificó a partir del sobrenadante de cultivo utilizando una columna
Prosep-A (fabricado por Millipore) de acuerdo con
el manual adjunto. El anticuerpo quimérico neutralizador
anti-FGF-8 resultante se denominó
KM3034.
La línea de transformantes KM3334 que expresaban
el anticuerpo quimérico neutralizador
anti-FGF-8 obtenido en el apartado
2.(5) del Ejemplo de Referencia 1 se cultivó con un matraz de 175
cm^{2} en una incubadora con CO_{2} al 5% a 37ºC utilizando
medio de hibridoma-SFM que contenía 200 nmoles/L de
MTX y GF21 de Daigo al 5% (fabricado por Wako Pure Chemical
Industries, Ltd.). El cultivo se realizó durante 8 a 10 días, y el
sobrenadante de cultivo se recuperó. Del sobrenadante de cultivo, se
purificó el anticuerpo quimérico neutralizador
anti-FGF-8 utilizando una columna
Prosep-A de acuerdo con el manual adjunto. El
anticuerpo quimérico neutralizador
anti-FGF-8 obtenido de este modo se
denominó KM3334.
Cuatro \mug de cada uno de los dos anticuerpos
quiméricos neutralizadores
anti-FGF-8 KM3034 y KM3334
expresados en diferentes células animales y purificados según se
obtuvieron en el apartado 3. del Ejemplo de Referencia 1 se
sometieron a electroforesis en SDS de acuerdo con el método conocido
(Nature, 227,680, 1970) para analizar peso molecular y la pureza.
En cada uno de los anticuerpos quiméricos neutralizadores
anti-FGF-8 purificados, se
observaron una sola banda con un peso molecular de aproximadamente
150 Kd en condiciones no reductoras y dos bandas con pesos
moleculares de aproximadamente 50 Kd y aproximadamente 25 Kd en
condiciones reductoras. Estos pesos moleculares fueron casi
coincidentes con los pesos moleculares (cadena H: aproximadamente 49
Kd, cadena L: aproximadamente 23 Kd, peso molecular total:
aproximadamente 144 Kd) estimados a partir de las secuencias de
nucleótidos de los ADNc de la cadena H y la cadena L del anticuerpo.
Por otra parte, el anticuerpo de tipo IgG fue coincidente con el
informe de que el peso molecular es de aproximadamente 150 Kd en
condiciones no reductoras y el enlace S-S en la
molécula se corta con lo que la molécula se degrada en la cadena H
que tiene un peso molecular de aproximadamente 50 Kd y la cadena L
que tiene un peso molecular de aproximadamente 25 Kd en condiciones
reductoras (Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory, Capítulo 14, 1988; Monoclonal Antibodies: Principles
and Practice, Academic Press Limited, 1996). Por consiguiente, se
confirmó que el anticuerpo quimérico neutralizador
anti-FGF-8 se expresaba y purificaba
en forma de una molécula de anticuerpo de una estructura
correcta.
La actividad neutralizadora de
FGF-8 del anticuerpo quimérico neutralizador
anti-FGF-8 purificado se evaluó
midiendo el siguiente efecto inhibidor del crecimiento dependiente
de FGF-8 de la línea celular SC-3 de
cáncer de mama de ratón (Tanaka A. et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 89, 8928-8932, 1992) descrito más abajo.
Esto es, se suspendieron células SC-3 a una
concentración de 3,0 x 10^{4} células/mL en medio DMEM:F12 de Ham
(1:1) [un medio mixto de medio DMEM y medio de F12 de Ham (fabricado
por Invitrogen) a una razón de 1:1] que contenía FBS tratado con
carbón activado a una concentración de 2%. La suspensión se inoculó
en una placa de 96 pocillos en una cantidad de 150 \muL (4,5 x
10^{3} células)/pocillo. Después del cultivo en una incubadora
con CO_{2} al 5% a 37ºC durante 18 horas, el medio se remplazó por
100 \muL/pocillo de un medio de ensayo. El medio de ensayo fue
producido disolviendo 50 ng/mL de FGF-8 (fabricado
por R & D) y el anticuerpo quimérico neutralizador
anti-FGF-8 a cada concentración
diluido en medio DMEM:F12 de Ham (1:1) que contenía BSA al 0,1%. Se
utilizó el anticuerpo quimérico KM2760 contra la quimioquina humana
CCR4 descrito en el documento WO 01/64754 como anticuerpo de
control negativo. Después del cultivo en una incubadora con CO_{2}
al 5% a 37ºC durante 48 horas, el medio se remplazó por un medio de
ensayo recién preparado, y el cultivo se realizó adicionalmente
durante 48 horas. Se añadió reactivo WST-1
(fabricado por Roche) en una cantidad de 10 \muL/pocillo, y la
mezcla se cultivó en una incubadora con CO_{2} al 5% a 37ºC
durante 1 hora mientras se agitaba suavemente. Después, se midió la
absorbancia (DO_{450/650}). En la Fig. 22, la abscisa representa
la concentración del anticuerpo añadido, y la ordenada representa
el crecimiento relativo (%) al crecimiento cuando se añaden 50
ng/mL de FGF-8 solo. El crecimiento relativo (%) al
crecimiento cuando se añaden 50 ng/mL de FGF-8 solo
se calculó mediante la siguiente formula.
Crecimiento\
relativo\ (%)\ al\ crecimiento\ cuando\ se\ añade\
\text{FGF-8} = \{(Absorbancia\ cuando\ se\ añaden\
\text{FGF-8} y\ anticuerpo - Absorbancia\
cuando\ no\ se\ añaden\ \text{FGF-8}\ y\
anticuerpo)/(Absorbancia\ cuando\ se\ añade
\text{FGF-8}\ solo - Absorbancia\ cuando\ no\ se\
añaden\ \text{FGF-8}\ y\ anticuerpo)\}\ x\
100
Como se ha mostrado en la Fig. 22, el anticuerpo
neutralizador anti-FGF-8 de ratón
KM1334 y los anticuerpos quiméricos neutralizadores
anti-FGF-8 KM3034 y KM3334 mostraron
todos una actividad inhibidora del crecimiento de las células
SC-3 similar sin observar descenso de la actividad
neutralizadora por el cambio al anticuerpo quimérico.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de Referencia
2
En primer lugar, la secuencia de aminoácidos de
VH del anticuerpo injertado a CDR neutralizador
anti-FGF-8 se diseñó como sigue. Se
seleccionó la secuencia de aminoácidos de FR de VH del anticuerpo
humano para injertar la secuencia de aminoácidos de CDR de VH del
anticuerpo neutralizador anti-FGF-8
KM1334 de ratón identificado en el apartado 1.(4) del Ejemplo de
Referencia 1. Kabat et al. han clasificado las VH de
diferentes anticuerpos humanos conocidos en tres subgrupos (HSG I a
III) de acuerdo con la homología de sus secuencias de aminoácidos,
y han informado adicionalmente de secuencias comunes en los
respectivos subgrupos (Secuencias de Proteínas de Interés
Inmunológico). Puesto que en estas secuencias comunes se considera
que la inmunogenicidad podría descender más en seres humanos, se
decidió que la secuencia de aminoácidos de VH del anticuerpo
injertado a CDR neutralizador
anti-FGF-8 se diseñara sobre la base
de estas secuencias comunes. Para preparar el anticuerpo injertado
a CDR neutralizador anti-FGF-8 que
tiene la actividad más alta, se seleccionó la secuencia de
aminoácidos de FR que tenía la homología más alta con la secuencia
de aminoácidos de FR de VH de KM1334 en el diseño entre las
secuencias de aminoácidos de las FR de las secuencias comunes de los
tres subgrupos de VH del anticuerpo humano. La Tabla 4 muestra los
resultados de la búsqueda de homología. Como se muestra en la Tabla
4, la secuencia de aminoácidos de FR de la región VH de KM1334
tenía la homología más alta con el subgrupo I.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
De los resultados anteriores, se injertó la
secuencia de aminoácidos de CDR de VH del anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 KM1334 de ratón en una
posición apropiada de la secuencia de aminoácidos de FR en la
secuencia consenso de subgrupo I de VH del anticuerpo humano para
diseñar la secuencia de aminoácidos HV.0 de VH del anticuerpo
injertado a CDR neutralizador
anti-FGF-8 descrito en el SEQ ID NO.
18.
Con posterioridad, se diseñó la secuencia de
aminoácidos de VL del anticuerpo injertado a CDR neutralizador
anti-FGF-8 como sigue. Se seleccionó
la secuencia de aminoácidos de FR en VL del anticuerpo humano para
injertar la secuencia de aminoácidos de CDR en VL del anticuerpo
neutralizador anti-FGF-8 KM1334 de
ratón identificado en el apartado 1.(4) del Ejemplo de Referencia
1. Kabat et al. han clasificado las VL de diferentes
anticuerpos humanos conocidos en cuatro subgrupos (HSG I a IV) de
acuerdo con la homología de sus secuencias de aminoácidos, y han
informado adicionalmente sobre secuencias consenso en sus
respectivos subgrupos (Secuencias de Proteínas de Interés
Inmunológico). Por lo tanto, de la misma manera que en el caso de
VH, se seleccionó la secuencia de aminoácidos de FR que tenía la
mayor homología con la secuencia de aminoácidos de FR de VL de
KM1334 de entre las secuencias de aminoácidos de las FR de las
secuencias comunes de los cuatro subgrupos de VL del anticuerpo
humano.
La Tabla 5 muestra los resultados de la búsqueda
de homología. Como se muestra en la Tabla 5, la secuencia de
aminoácidos de FR de VL de KM1334 tenía la homología más alta con el
subgrupo II.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
De los resultados anteriores, se injertó la
secuencia de aminoácidos de CDR de VL del anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 KM1334 de ratón en una
posición apropiada de la secuencia de aminoácidos de FR de la
secuencia consenso del subgrupo II de VL del anticuerpo humano para
diseñar la secuencia de aminoácidos LV.0 de VL del anticuerpo
injertado a CDR neutralizador
anti-FGF-8 descrito en el SEQ ID NO.
19.
La secuencia de aminoácidos HV.0 de VH y la
secuencia de aminoácidos LV.0 de VL del anticuerpo injertado a CDR
neutralizador anti-FGF-8 diseñadas
antes son secuencias donde sólo se injerta la secuencia de
aminoácidos de CDR del anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 KM1334 de ratón en la
secuencia de aminoácidos seleccionada de FR en el anticuerpo
humano. En el anticuerpo injertado a CDR humana, la actividad de
unión disminuye, en muchos casos, por el mero injerto de la
secuencia de aminoácidos de la CDR del anticuerpo de ratón. Con el
fin de evitar esto, después de comparar las secuencias de
aminoácidos de FR del anticuerpo humano y del anticuerpo de ratón,
los residuos aminoácido que se consideraba que influían en la
actividad de unión entre los diferentes residuos aminoácido de FR
habían sido injertados junto con la secuencia de aminoácidos de CDR.
También en este Ejemplo de Referencia, se examinó la identificación
de los residuos aminoácido de FR que se consideraba que influían en
la actividad de unión.
En primer lugar, se construyó la estructura
tridimensional de la región V del anticuerpo (HVOLVO) que comprende
la secuencia de aminoácidos HV.0 de VH y la secuencia de aminoácidos
LV.0 de VL del anticuerpo injertado a CDR neutralizador
anti-FGF-8 diseñada antes mediante
el método de modelado por ordenador. Se prepararon los productos
coordinados de la estructura tridimensional utilizando el Soporte
Lógico AbM (fabricado por Oxford Molecular), y se realizó la
presentación de la estructura tridimensional utilizando el Soporte
Lógico Pro-Explore (fabricado por Oxford Molecular)
o RasMol (fabricado por Glaxo) de acuerdo con el manual adjunto. El
modelo por ordenador de la estructura tridimensional de la región V
del anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 KM1334 de ratón se
construyó de la misma manera. Además, con respecto a las secuencias
de aminoácidos de las FR de VH y VL de HV0LV0, se construyó un
modelo de la estructura tridimensional de una región V de una
variante que comprendía una secuencia de aminoácidos en la que se
los residuos aminoácido diferentes de los del anticuerpo
neutralizador anti-FGF-8 KM1334 de
ratón eran remplazados en orden por los residuos aminoácido
encontrados en las posiciones correspondientes del anticuerpo
neutralizador anti-FGF-8 KM1334 de
ratón. Se compararon las estructuras tridimensionales de las
regiones V del anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 KM1334 de ratón, HVOLVO
y de la variante. Por consiguiente, como residuos que se considera
que cambian la estructura tridimensional del sitio de unión al
antígeno e influyen en la actividad del anticuerpo entre los
residuos aminoácido de FR de HV0LV0, se seleccionaron Lys de la
posición 12, Lys de la posición 13, Ala de la posición 40, Pro de
la posición 41, Met de la posición 48, Val de la posición 68, Ile de
la posición 70, Thr de la posición 74, Thr de la posición 76, Glu
de la posición 82, Arg de la posición 87 y Tyr de la posición 95 en
HV.0 e Ile de la posición 2, Val de la posición 3, Thr de la
posición 14, Pro de la posición 15, Gln de la posición 50, Leu de
la posición 51 y Tyr de la posición 92 en LV.0 respectivamente, y se
remplazaron los aminoácidos. Al menos uno o más de estos residuos
aminoácido se remplazaron por los residuos aminoácido encontrados en
el anticuerpo KM1334 de ratón, y VH y VL del anticuerpo injertado a
CDR humana con diferentes reemplazos se diseñaron como sigue.
Específicamente, la secuencia de aminoácidos
HV.6 descrita en el SEQ ID NO. 20 donde 6 residuos, Lys de la
posición 12, Lys de la posición 13, Ala de la posición 40, Pro de la
posición 41, Met de la posición 48 y Tyr de la posición 95 se
remplazaron por Ala, Arg, Arg, Ser, Ile y Phe como los residuos
aminoácido encontrados en el anticuerpo KM1334 de ratón
respectivamente se diseñó como VH. La secuencia de aminoácidos LV.6
descrita en el SEQ ID NO. 21 donde 6 residuos, Ile de la posición
2, Thr de la posición 14, Pro de la posición 15, Gln de la posición
50, Leu de la posición 51 y Tyr de la posición 92 se remplazaron por
Val, Ser, Leu, Lys, Val y Phe como los residuos aminoácido
encontrados en el anticuerpo KM1334 de ratón respectivamente se
diseñó como VL.
Se construyó un ADN que codificaba la secuencia
de aminoácidos HV.0 de VH del anticuerpo injertado a CDR
neutralizador anti-FGF-8 diseñado
en el apartado 1.(1) del Ejemplo de Referencia 2 mediante PCR como
sigue.
En primer lugar, la secuencia señal secretora
(secuencia de aminoácidos 1^{a} a 19^{a} de SEQ ID NO. 2) de la
cadena H del anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 KM1334 de ratón se
conectó a la secuencia de aminoácidos diseñada. La secuencia de
aminoácidos resultante se convirtió después en un codón genético.
Cuando están presentes dos o más codones genéticos para un residuo
aminoácido, el codón genético correspondiente se determinó
considerando la frecuencia de uso encontrada en la secuencia de
nucleótidos del gen del anticuerpo (Secuencias de Proteínas de
Interés Inmunológico). Los codones genéticos determinados se
conectaron para diseñar la secuencia de nucleótidos del ADN que
codifica la secuencia de aminoácidos completa de la región V del
anticuerpo. Las secuencias que comprendían secuencias de
reconocimiento de endonucleasas de restricción para clonar un vector
para la expresión del anticuerpo humanizado se añadieron al extermo
5' y al extremo 3' de esta secuencia de nucleótidos, y se añadieron
adicionalmente las secuencias complementarias a la secuencia del
cebador RV de M13 (fabricada por Takara Shuzo) y la secuencia del
cebador M4 de M13 (fabricada por Takara Shuzo) al extremo 5' y al
extremo 3' respectivamente. La secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO.
22) diseñada de este modo se dividió en cuatro secuencias de 141
bases a partir del lado terminal 5' de manera que se solaparon 20
bases del extremo para sintetizar químicamente cuatro ADN que
comprendían las secuencias representadas por los SEQ ID NOS. 23 a 26
que correspondían a una cadena efectora, una cadena antisentido,
una cadena efectora y una cadena antisentido de cada secuencia
(fabricada por GENSET).
De acuerdo con el manual adjunto a KOD
Polymerase, se preparó una solución de reacción para PCR en una
cantidad total de 50 \muL utilizando 0,1 \mumoles/L de cada ADN
sintético, 0,5 \mumoles/L de cebador RV de M13, 0,5 \mumoles/L
de cebador M4 de M13 y 2,5 unidades de KOD Polymerase (fabricada por
Toyobo) para realizar la PCR. Con respecto a las condiciones de
reacción, la solución de reacción se llevó a cabo calentando a 94ºC
durante 5 minutos, 25 ciclos subsiguientes de reacciones a 94ºC
durante 30 segundos, 50ºC durante 30 segundos, 74ºC durante 60
segundos como un ciclo, y adicionalmente calentando a 74ºC durante 5
minutos. La solución de reacción se hizo precipitar con etanol, y
se disolvió en agua estéril. La reacción se condujo a 37ºC durante
1 hora utilizando 10 unidades de endonucleasa de restricción
EcoRI y 10 unidades de endonucleasa de restricción
SpeI (fabricada por Takara Shuzo). La solución de reacción se
fraccionó mediante electroforesis en gel de agarosa para recuperar
aproximadamente 0,3 \mug de un fragmento EcoRI-SpeI
de aproximadamente 0,47 kb.
Con posterioridad, se hicieron reaccionar 3
\mug de plásmido pBluescript II SK(-) (fabricado por Stratagene)
con 10 unidades de endonucleasa de restricción EcoRI y 10
unidades de endonucleasa de restricción SpeI a 37ºC durante
1 hora. La solución de reacción se fraccionó mediante electroforesis
en gel de agarosa para recuperar aproximadamente 2,9 \mug de un
fragmento EcoRI-SpeI de aproximadamente 2,95 kb.
Después, se añadieron 0,1 \mug del fragmento
EcoRI-SpeI como producto de la PCR que codificaba VH
del anticuerpo injertado a CDR neutralizador
anti-FGF-8 y 0,1 \mug del
fragmento EcoRI-SpeI del plásmido pBluescript II
SK(-) obtenido antes a agua estéril en una cantidad total de 10
\muL, y se ligaron utilizando Ligation High. La cepa DH5\alpha
de Escherichia coli (fabricada por Toyobo) se transformó
utilizando la solución del ADN plasmídico recombinante obtenido de
este modo, y los ADN plasmídicos se prepararon a partir de 10 clones
del transformante. El análisis de la secuencia de nucleótidos se
realizó utilizando Big Dye Terminator Kit Ver. 2 y un Secuenciador
de ADN. Como resultado del análisis de la secuencia de nucleótidos,
se obtuvo el plásmido pKM1334HV0 que tenía la secuencia de
nucleótidos deseada como se muestra en la Fig. 23.
Se diseñó un ADN que codificaba la secuencia de
aminoácidos HV.6 de VH del anticuerpo injertado a CDR neutralizador
anti-FGF-8 diseñado en el apartado
1.(1) del Ejemplo de Referencia 2 de la misma manera que el ADN que
codificaba HV.0 (SEQ ID NO. 27), y se construyó mediante PCR de la
siguiente manera utilizando cuatro ADN sintéticos (fabricados por
GENSET) que comprendían las secuencias descritas en los SEQ ID NOS.
28 a 31. Se repitió el mismo procedimiento que para pKM1334HV0 para
obtener el plásmido pKM1334HV6 que comprendía el ADN que codificaba
HV.6.
Se diseñó un ADN que codificaba la secuencia de
aminoácidos LV.0 de VL del anticuerpo injertado a CDR neutralizador
anti-FGF-8 diseñado en el apartado
1.(1) del Ejemplo de Referencia 2 de la misma manera que el ADN que
codificaba HV.0 (SEQ ID NO. 32). No obstante, en el diseño del ADN
sintético, se utilizó la secuencia señal secretora (secuencia de
aminoácidos 1^{a} a 19^{a} del SEQ ID NO. 4) de la cadena L del
anticuerpo neutralizador anti-FGF-8
KM1334 de ratón como secuencia señal secretora. El ADN que
codificaba LV.0 se construyó mediante PCR utilizando los cuatro ADN
sintéticos (fabricados por GENSET) que comprendían las secuencias de
los SEQ ID NOS. 33 a 36 de la misma manera que el ADN que
codificaba HV.0. Se repitió el mismo procedimiento que para
pKM1334HV0 para obtener el plásmido pKM1334LV0 que comprendía el ADN
que codificaba LV.0.
Se diseñó un ADN que codificaba la secuencia de
aminoácidos LV.6 de VL del anticuerpo injertado a CDR neutralizador
anti-FGF-8 según se diseñó en el
apartado 1.(1) del Ejemplo de Referencia 2 de la misma manera que el
ADN que codificaba LV.0 (SEQ ID NO. 37), y se construyó mediante
PCR utilizando los cuatro ADN sintéticos (fabricados por GENSET)
que comprendían las secuencias de los SEQ ID NOS. 38 a 41 de la
manera anterior. Se repitió el mismo procedimiento que en
pKM1334HV0 para obtener el plásmido pKM1334LV6 que comprendía el ADN
que codifica LV.6.
El vector de expresión del anticuerpo injertado
a CDR neutralizador anti-FGF-8
pKANTEX1334HV0LV0 se construyó de la siguiente manera utilizando el
vector pKANTEX93 para la expresión del anticuerpo humanizado
descrito en el documento WO 97/10354 y los plásmidos pKM1334HV0 y
pKM1334LV0 obtenidos en los apartados 1.(2) y (3) del Ejemplo de
Referencia 2.
Se hicieron reaccionar 3 \mug del plásmido
pKM1334HV0 obtenido en el apartado 1.(2) del Ejemplo de Referencia
2 con 10 unidades de endonucleasa de restricción ApaI y 10
unidades de endonucleasa de restricción NotI (fabricada por
Takara Shuzo) a 37ºC durante 1 hora. La solución de reacción se
fraccionó mediante electroforesis en gel de agarosa para recuperar
aproximadamente 0,3 \mug de un fragmento ApaI-NotI
de aproximadamente 0,47 kb.
Después, se hicieron reaccionar 3 \mug del
vector pKANTEX93 para la expresión del anticuerpo humanizado con 10
unidades de endonucleasa de restricción ApaI y 10 unidades de
endonucleasa de restricción NotI a 37ºC durante 1 hora. La
solución de reacción se fraccionó mediante electroforesis en gel de
agarosa para recuperar aproximadamente 2 \mug de un fragmento
ApaI-NotI de aproximadamente 12,8 kb.
Después, se añadieron 0,1 \mug del fragmento
NotI-ApaI derivado de pKM1334HVO y 0,1 \mug del
fragmento NotI-ApaI derivado del plásmido pKANTEX93
obtenido antes a agua estéril en una cantidad total de 10 \muL, y
se ligaron utilizando Ligation High. La cepa DH5\alpha de
Escherichia coli se transformó utilizando la solución de ADN
plasmídico recombinante obtenido de este modo para obtener el
plásmido pKANTEX1334HV0 mostrado en la Fig. 24.
Con posterioridad, se hicieron reaccionar 3
\mug del plásmido pKM1334LV0 obtenido en el apartado 1.(3) del
Ejemplo de Referencia 2 con 10 unidades de endonucleasa de
restricción EcoRI y 10 unidades de endonucleasa de
restricción BsiWI a 37ºC durante 1 hora. La solución de
reacción se fraccionó mediante electroforesis en gel de agarosa
para recuperar aproximadamente 0,3 \mug de un fragmento
EcoRI-BsiWI de aproximadamente 0,45 kb.
Después, se hicieron reaccionar 3 \mug del
plásmido pKANTEX1334HV0 obtenido anteriormente con 10 unidades de
endonucleasa de restricción EcoRI y 10 unidades de
endonucleasa de restricción BsiWI a 37ºC durante 1 hora. La
solución de reacción se fraccionó mediante electroforesis en gel de
agarosa para recuperar aproximadamente 2 \mug de un fragmento
EcoRI-BsiWI de aproximadamente 13,30 kb.
Después, se añadieron 0,1 \mug de del
fragmento EcoI-BsiWI derivado de pKM1334LV0 y 0,1
\mug del fragmento EcoI-BsiWI derivado del plásmido
pKANTEX1334HV0 obtenido antes a agua estéril en una cantidad total
de 10 \muL, y se ligaron utilizando Ligation High. La cepa
DH5\alpha de Escherichia coli se transformó utilizando la
solución de ADN plasmídico recombinante obtenido de este modo para
obtener el vector de expresión pKANTEX1334HV0LV0 mostrado en la
Fig. 24.
Utilizando 400 ng del plásmido resultante, se
analizó la secuencia de nucleótidos mediante Big Dye Terminator Kit
Ver. 2 y un Secuenciador de ADN. Como resultado, se confirmó que se
obtuvo el plásmido con el ADN deseado clonado.
El vector de expresión pKANTEX1334HV0LV6 se
construyó de la manera anterior utilizando el plásmido
pKM1334HV0 obtenido en el apartado 1.(2) del Ejemplo de Referencia 2 y el plásmido pKM1334LV6 obtenido en el apartado 1.(3) del Ejemplo de Referencia 2.
pKM1334HV0 obtenido en el apartado 1.(2) del Ejemplo de Referencia 2 y el plásmido pKM1334LV6 obtenido en el apartado 1.(3) del Ejemplo de Referencia 2.
El vector de expresión pKANTEX1334HV6LV6 se
construyó de la manera anterior utilizando el plásmido
pKM1334HV6 obtenido en el apartado 1.(2) del Ejemplo de Referencia 2 y el plásmido pKM1334LV6 obtenido en el apartado 1.(3) del Ejemplo de Referencia 2.
pKM1334HV6 obtenido en el apartado 1.(2) del Ejemplo de Referencia 2 y el plásmido pKM1334LV6 obtenido en el apartado 1.(3) del Ejemplo de Referencia 2.
La expresión estable de diferentes anticuerpos
injertados a CDR neutralizadores de FGF-8 en células
YB2/0 se realizó mediante el método descrito en el apartado 2.(5)
del Ejemplo de Referencia 1 utilizando los vectores de expresión
del anticuerpo injertado a CDR neutralizador
anti-FGF-8, pKANTEX1334HV0LV0,
pKANTEX1334HV0LV6 y pKANTEX1334HV6LV6 obtenidos en el apartado 2.
del Ejemplo de Referencia 2.
El cultivo del transformante derivado de células
YB2/0 que expresa los diferentes anticuerpos injertados a CDR
neutralizadores anti-FGF-8 obtenidos
en el apartado 3. del Ejemplo de Referencia 2 y la purificación de
los anticuerpos injertados a CDR neutralizadores
anti-FGF-8 a partir del sobrenadante
se realizaron mediante el método descrito en el apartado 3.(2) del
Ejemplo de Referencia 1. El anticuerpo derivado del transformante
con pKANTEX1334HV0LV0 introducido se denominó HV0LV0, el anticuerpo
derivado del transformante con pKANTEX1334HV0LV6 introducido se
denominó HV0LV6, y el anticuerpo derivado del transformante con
pKANTEX1334HV6LV6 introducido se denominó HV6LV6
respectivamente.
Se realizó la SDS-PAGE de los
diferentes anticuerpos injertados a CDR neutralizadores
anti-FGF-8 obtenidos en el apartado
4. del Ejemplo de Referencia 2 mediante el método descrito en el
apartado 4. del Ejemplo de Referencia 1. Por consiguiente, se
confirmó que todos los anticuerpos fueron expresados en forma de
moléculas de anticuerpo con las estructuras correctas y se
purificaron.
La actividad de unión a FGF-8 de
los diferentes anticuerpos injertados a CDR neutralizadores
anti-FGF-8 obtenidos en el apartado
4. del Ejemplo de Referencia 2 se midió mediante el ELISA descrito
en el apartado 2.(6) del Ejemplo de Referencia 1. El anticuerpo
quimérico neutralizador anti-FGF-8
derivado de células YB2/0 KM3334 obtenido en el apartado 3.(2) del
Ejemplo de Referencia 1 se utilizó como control positivo. Los
resultados se mostraron en la Fig. 25. Según se muestra en la Fig.
25, cada uno de los anticuerpos injertados a CDR
anti-FGF-8 mostraron una actividad
de unión a FGF-8 similar a la de KM3334, de manera
que no se observó una reducción significativa de la actividad de
unión ocasionada por el injerto a CDR.
Con el fin de examinar la actividad de unión a
FGF-8 de los diferentes anticuerpos injertados a CDR
neutralizadores anti-FGF-8
obtenidos en el apartado 4. del Ejemplo de Referencia 2 con más
detalle, la actividad de unión a FGF-8 de los
diferentes anticuerpos injertados a CDR neutralizadores
anti-FGF-8 se midió y comparó de la
siguiente manera utilizando BIAcore 2000 (fabricado por BIACORE). El
anticuerpo quimérico neutralizador
anti-FGF-8 derivado de células
YB2/0 KM3334 obtenido en el apartado 3.(2) del Ejemplo de Referencia
1 se utilizó como control
positivo.
positivo.
Más adelante se utilizó HBS-EP
(fabricado por BIACORE) como diluyente de la muestra y tampón
durante la medición. En primer lugar, se instaló Sensor Chip CM5
(fabricado por BIACORE), y FGF-8 (fabricado por R
& D) disuelto en 31,25 \mug/mL de una solución de tampón
acetato de 10 mmoles/L (pH 4,0) se inmovilizó sobre la superficie
del chip sensor mediante el método de acoplamiento de aminas. La
cantidad de inmovilización medida utilizando una señal de
resonancia (RU) como índice fue 4498 RU.
Se añadieron 60 \muL de cada una de las
soluciones de anticuerpo a una célula de flujo inmovilizada con
FGF-8 a una velocidad de flujo 20 \muL/min, y la
reacción de disociación se controló después durante 3 minutos.
Después de la reacción de disociación, se añadieron 20 \muL de una
solución de glicina-hidrocloruro de 10 mmoles/L (pH
1,5) a la célula de flujo dos veces continuamente para regenerar la
superficie del chip. Este ciclo se realizó con la solución de
anticuerpo a diferentes concentraciones (de 50 a 0,068 \mug/mL)
para obtener gramos sensores a diferentes concentraciones. Los
gramos sensores de los anticuerpos respectivos se convirtieron en
gramos sensores de reacciones específicas deduciendo un gramo sensor
obtenido utilizando el anticuerpo quimérico KM871 (Shitara K. et
al., Cancer Immunol. Immunother., 36, 373-380,
1993) respecto a GD3 como control negativo. Los gramos sensores de
los diferentes anticuerpos a una concentración de 50 \mug/mL se
mostraron en la Fig. 26. Como resulta evidente de los gramos
sensores, casi no se observó disociación en ninguno de los
anticuerpos en el momento de la reacción de disociación, y a penas
se obtuvo una constante de la velocidad de disociación exacta. Por
consiguiente, la actividad de unión de los diferentes anticuerpos
se comparó en términos de la unión [señal de resonancia (RU)] en la
reacción de unión. Por consiguiente, como se muestra en la Fig. 26,
el anticuerpo quimérico KM3334 mostró la reacción de unión más alta,
y el anticuerpo HV0LV6 injertado a CDR mostró la misma alta
reacción de unión que KM3334. Mientras tanto, los anticuerpos
HV0LV0 y HV6LV6 injertados a CDR mostraron una reacción de unión que
era ligeramente baja en comparación con KM3334 y HV0LV6. Estos
resultados revelan que la comparación de la actividad de unión entre
los anticuerpos que era imposible mediante ELISA es posible
utilizando BIAcore 2000 y la actividad de unión de los anticuerpos
injertados a CDR se restaura al mismo nivel que el del anticuerpo
quimérico mediante la reposición de los 6 residuos aminoácido de FR
de VL. El efecto de restauración de la actividad de unión no se
observó en los 6 residuos aminoácido de FR de VH.
El anticuerpo HV0LV6 injertado a CDR derivado de
células YB2/0 que mostró la misma alta reacción de unión que el
anticuerpo quimérico KM3334 se denominó KM8037, y la línea celular
transformada derivada de células YB2/0 que expresaba sumamente
KM8037 también se denominó KM8037. El transformante KM8037 se
depositó como FERM BP-8084 en el Despósito de
Organismos de Patentes Internacionales, Instituto Nacional de
Ciencia y Tecnología Industrial Avanzadas (AIST Tsukuba Central 6,
1-1-1 Higashi, Tsukubashi Ibaraki,
305-8566, Japan) el 20 de Junio de 2002.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de Referencia
3
Los resultados del Ejemplo de Referencia 2
revelaron que el anticuerpo injertado a CDR neutralizador
anti-FGF-8 HV0LV6 donde FR de VL
experimentó la modificación de 6 residuos aminoácido derivado del
anticuerpo KM1334 de ratón mostró la misma actividad de unión que
el anticuerpo quimérico. Por lo tanto, después de estudiar el
efecto de los 6 residuos sobre la recuperación de la actividad, la
producción de los anticuerpos injertados a CDR neutralizadores
anti-FGF-8 que tienen actividad
satisfactoria, que comprenden menos residuos aminoácido derivados
del anticuerpo de ratón y que se espera que disminuyan más la
antigenicidad se llevó a cabo de la siguiente manera.
Con respecto a los 6 residuos aminoácido
anteriores, se diseñaron las secuencias de aminoácidos de seis tipos
de VL que tenían las siguientes modificaciones. Todas ellas
mostraron modificaciones a partir de los residuos aminoácido de
LV.0.
En LV.4-1, 4 residuos de Ile de
la posición 2, Gln de la posición 50, Leu de la posición 51 y Tyr de
la posición 92 se cambiaron a Val, Lys, Val y Phe, respectivamente,
que son residuos aminoácido encontrados en el anticuerpo KM1334 de
ratón.
En LV.4-2, 4 residuos de Ile de
la posición 2, Thr de la posición 14, Pro de la posición 15 y Tyr de
la posición 92 se cambiaron a Val, Ser, Leu y Phe, respectivamente,
que son residuos aminoácido encontrados en el anticuerpo KM1334 de
ratón.
En LV.3-1, 3 residuos de Ile de
la posición 2, Leu de la posición 51 y Tyr de la posición 92 se
cambiaron a Val, Val y Phe, respectivamente, que son residuos
aminoácido encontrados en el anticuerpo KM1334 de ratón.
En LV.3-2, 3 residuos de Thr de
la posición 14, Pro de la posición 15 y Tyr de la posición 92 se
cambiaron a Ser, Leu y Phe, respectivamente, que son residuos
aminoácido encontrados en el anticuerpo KM1334 de ratón.
En LV.2-1, 2 residuos de Leu de
la posición 51 y Tyr de la posición 92 se cambiaron a Val y Phe,
respectivamente, que son residuos aminoácido encontrados en el
anticuerpo KM1334 de ratón.
En LV.2-2, 2 residuos de Ile de
la posición 2 y Tyr de la posición 92 se cambiaron respectivamente a
Val y Phe, respectivamente, que son residuos aminoácido encontrados
en el anticuerpo KM1334 de ratón.
Las secuencias de aminoácidos de
LV.4-1, LV.4-2,
LV.3-1, LV.3-2,
LV.2-1 y LV.2-2 se describieron en
los SEQ ID NO. 42 a 47 respectivamente.
Los ADN que codifican las secuencias de
aminoácidos de diversos VL de los anticuerpos injertados a CDR
neutralizadores anti-FGF-8
diseñados en el Ejemplo de Referencia 3 se construyeron como
sigue.
El ADN que codifica LV.4-1 se
construyó mediante el método descrito en 1.(3) del Ejemplo de
Referencia 2 utilizando cuatro ADN sintéticos (fabricados por
GENSET) que comprende los SEQ ID NO. 38, 34, 40 y 41
respectivamente. Con posterioridad, se obtuvo el plásmido
pKM1334LV4-1 que comprende el ADN que codifica
LV.4-1.
Utilizando 50 ng del plásmido pKM1334LV6
obtenido en el apartado 1.(3) del Ejemplo de Referencia 2 utilizado
como molde, se añadieron el cebador RV de M13 y el ADN sintético que
tenía la secuencia de nucleótidos descrita en el SEQ ID NO: 48
(fabricado por GENSET) como cebadores para producir una
concentración final de 0,3 \mumoles/L, y se llevó a cabo la PCR
en un volumen total de 50 \muL calentando primero a 94ºC durante 2
minutos y con posterioridad 35 ciclos de reacciones a 94ºC durante
15 segundos, 50ºC durante 30 segundos y 68ºC durante 1 minuto como
un ciclo de acuerdo con el manual adjunto a la Polimerasa KOD. La
solución de reacción se purificó, y después se disolvió en agua
estéril. La reacción se realizó a 37ºC durante 1 hora utilizando 10
unidades de endonucleasa de restricción KpnI (fabricada por
Takara Shuzo) y 10 unidades de endonucleasa de restricción
SpeI. La solución de reacción se fraccionó mediante
electroforesis en gel de agarosa para recuperar aproximadamente 0,3
\mug de un fragmento KpnI-SpeI de aproximadamente
0,22 kb.
Con posterioridad, se hicieron reaccionar 3
\mug del plásmido pKM1334LV4-1 obtenido en 2.(1)
del Ejemplo de Referencia 3 con 10 unidades de endonucleasa de
restricción KpnI a 37ºC durante 1 hora. La solución de
reacción se fraccionó mediante electroforesis en gel de agarosa para
recuperar aproximadamente 0,2 \mug de un fragmento KpnI de
aproximadamente 0,21 kb.
Adicionalmente, se hicieron reaccionar 3 \mug
del plásmido pBluescript II SK(-) con 10 unidades de endonucleasa
de restricción KpnI y 10 unidades de endonucleasa de
restricción SpeI a 37ºC durante 1 hora. La solución de
reacción se fraccionó mediante electroforesis en gel de agarosa para
recuperar aproximadamente 2 \mug de un fragmento
KpnI-SpeI de aproximadamente 2,95 kb.
Se añadieron 0,1 \mug del fragmento
KpnI-SpeI de ADN de VL, 0,1 \mug del fragmento
KpnI derivado del plásmido pKM1334LV4-1 y
0,1 \mug del fragmento KpnI-SpeI derivado del
plásmido pBluescript II SK(-) obtenido antes a agua estéril en una
cantidad total de 10 \muL, y se ligaron utilizando Ligation High.
Se transformó la cepa DH5\alpha de Escherichia coli
utilizando la solución de ADN recombinante del plásmido obtenido de
este modo para obtener el plásmido pKM1334LV3-1 que
comprende el ADN que codifica LV.3-1 como se muestra
en la Fig. 27.
Se obtuvo el plásmido
pKM1334LV2-1 que comprende el ADN que codifica
LV.2-1 mediante un método similar al descrito en el
apartado 2.(1) del Ejemplo de Referencia 3 excepto que se utilizó el
plásmido pKM1334LV0 obtenido en el apartado 1.(3) del Ejemplo de
Referencia 2 en lugar del plásmido pKM1334LV4-1.
Se obtuvo el plásmido
pKM1334LV2-2 que comprende el ADN que codifica
LV.2-2 mediante un método similar al descrito en el
apartado 2.(1) del Ejemplo de Referencia 3 excepto que se utilizó el
ADN sintético descrito en el SEQ ID NO. 49 en lugar del ADN
sintético descrito en el SEQ ID NO. 48 como cebador.
Se hicieron reaccionar 3 \mug del plásmido
pKM1334LV2-2 obtenido en el apartado 2.(4) del
Ejemplo de Referencia 3 con 10 unidades de endonucleasa de
restricción KpnI a 37ºC durante 1 hora. La solución de
reacción se fraccionó mediante electroforesis en gel de agarosa
para recuperar aproximadamente 2 \mug de un fragmento KpnI
de aproximadamente 3,16 kb.
Con posterioridad, se hicieron reaccionar 3
\mug del plásmido pKM1334LV6 obtenido en el apartado 1.(3) del
Ejemplo de Referencia 2 con 10 unidades de endonucleasa de
restricción KpnI a 37ºC durante 1 hora. La solución de
reacción se fraccionó mediante electroforesis en gel de agarosa para
recuperar aproximadamente 0,2 \mug de un fragmento KpnI de
aproximadamente 0,21 kb.
Se añadieron 0,1 \mug del fragmento
KpnI derivado del plásmido pKM1334LV2-2 y 0,1
\mug del fragmento KpnI derivado del plásmido pKM1334LV6
obtenido antes a agua estéril en una cantidad total de 10 \mul, y
se ligaron utilizando Ligation High. Se transformó la cepa
DH5\alpha de Escherichia coli utilizando la solución de
ADN recombinante del plásmido obtenido de este modo para obtener el
plásmido pKM1334LV4-2 que comprende el ADN que
codifica LV.4-2 como se muestra en la Fig. 28.
Se hicieron reaccionar 3 \mug del plásmido
pKM1334LV4-2 obtenido en el apartado 2.(5) del
Ejemplo de Referencia 3 con 10 unidades de endonucleasa de
restricción Tth111I (fabricada por Takara Shuzo) y
XmnI (fabricado por New England Biolabs) a 37ºC durante 1
hora. La solución de reacción se fraccionó mediante electroforesis
en gel de agarosa para recuperar aproximadamente 2 \mug de un
fragmento Tth111I-XmnI de aproximadamente 2,24
kb.
Con posterioridad, se hicieron reaccionar 3
\mug del plásmido pKM1334LV0 obtenido en el apartado 1.(3) del
Ejemplo de Referencia 2 con 10 unidades de endonucleasa de
restricción Tth111I y 10 unidades de endonucleasa de
restricción XmnI a 37ºC durante 1 hora. La solución de
reacción se fraccionó mediante electroforesis en gel de agarosa
para recuperar aproximadamente 1 \mug de un fragmento
Tth111I-XmnI de aproximadamente 1,11 kb.
Se añadieron 0,1 \mug del fragmento
Tth111I-XmnI derivado del plásmido
pKM1334LV4-2 y 0,1 \mug del fragmento
Tth111I-XmnI derivado del plásmido pKM1334LV0 obtenido
antes a agua estéril en una cantidad total de 10 \mul, y se
ligaron utilizando Ligation High. La cepa DH5\alpha de
Escherichia coli se transformó utilizando la solución de ADN
recombinante del plásmido obtenido de este modo para obtener el
plásmido pKM1334LV3-2 que comprende el ADN que
codifica LV.3-2 como se muestra en la Fig. 29.
El fragmento EcoRI-BsiWI que
comprende el ADN que codifica VL del vector de expresión
pKANTEX1334
HV0LV6 obtenido en el apartado 2. del Ejemplo de Referencia 2 se remplazó por los fragmentos EcoRI-BsiWI que comprenden los ADN que codifican diversos VL construidos en el apartado 2. del Ejemplo de Referencia 3 para construir vectores de expresión del anticuerpo injertado a CDR neutralizador anti-FGF-8 que tienen los ADN que codifican diversos VL. Específicamente, se construyeron seis tipos, pKANTEX1334HV0LV4-1, pKANTEX1334HV0LV4-2, pKANTEX1334HV0LV3-1, pKANTEX1334HV0LV3-2, pKANTEX1334HV0LV2-1 y pKANTEX1334HV0LV2-2.
HV0LV6 obtenido en el apartado 2. del Ejemplo de Referencia 2 se remplazó por los fragmentos EcoRI-BsiWI que comprenden los ADN que codifican diversos VL construidos en el apartado 2. del Ejemplo de Referencia 3 para construir vectores de expresión del anticuerpo injertado a CDR neutralizador anti-FGF-8 que tienen los ADN que codifican diversos VL. Específicamente, se construyeron seis tipos, pKANTEX1334HV0LV4-1, pKANTEX1334HV0LV4-2, pKANTEX1334HV0LV3-1, pKANTEX1334HV0LV3-2, pKANTEX1334HV0LV2-1 y pKANTEX1334HV0LV2-2.
Se realizó la expresión estable de los
diferentes anticuerpos injertados a CDR neutralizadores
anti-FGF-8 en células CHO/DG44
mediante el método descrito en el apartado 2.(4) del Ejemplo de
Referencia 1 utilizando los vectores de expresión del anticuerpo
injertado a CDR neutralizador
anti-FGF-8 pKANTEX1334HV0LV0 y
pKANTEX1334HV0LV6 obtenidos en el apartado 2. del Ejemplo de
Referencia 2 y los vectores de expresión del anticuerpo injertado a
CDR neutralizador anti-FGF-8
obtenidos en el apartado 3. del Ejemplo de Referencia 3.
Se realizaron el cultivo de transformantes
derivados de células CHO/DG44 que expresan los diferentes
anticuerpos injertados a CDR neutralizadores
anti-FGF-8 obtenidos en el apartado
4. del Ejemplo de Referencia 3 y la purificación del los
anticuerpos injertados a CDR neutralizadores
anti-FGF-8 a partir del sobrenadante
mediante el método descrito en el apartado 3.(1) del Ejemplo de
Referencia 1.
El anticuerpo derivado de los transformantes que
introdujo pKANTEX1334HV0LV0 se denominó HV0LV0/CHO, el anticuerpo
derivado de los transformantes que introdujo pKANTEX1334HV0LV6 se
denominó HV0LV6/CHO, el anticuerpo derivado de los transformantes
que introdujo pKANTEX1334HV0LV4-1 se denominó
HV0LV4-1/CHO, el anticuerpo derivado de los
transformantes que introdujo pKANTEX1334HV0LV4-2 se
denominó HV0LV4-2/CHO, el anticuerpo derivado de los
transformantes que introdujo pKANTEX1334HV0LV3-1 se
denominó HV0LV3-1/CHO, el anticuerpo derivado de los
transformantes que introdujo pKANTEX1334HV0LV3-2 se
denominó HV0LV3-2/CHO, el anticuerpo derivado de los
transformantes que introdujo pKANTEX1334HV0LV2-1 se
denominó HV0LV2-1/CHO, y el anticuerpo derivado de
los transformantes que introdujo
pKANTEX1334HV0LV2-2 se denominó
HV0LV2-2/CHO.
Se realizó la SDS-PAGE de los
anticuerpos injertados a CDR neutralizadores
anti-FGF-8 obtenidos en el apartado
5. del Ejemplo de Referencia 3 mediante el método anterior descrito
en el apartado 4. del Ejemplo de Referencia 1. Como resultado, se
confirmó que todos los anticuerpos eran expresados como moléculas de
anticuerpo de estructura correcta, y se purificaron.
Con el fin de examinar la actividad de unión a
FGF-8 de los anticuerpos injertados a CDR
neutralizadores anti-FGF-8
obtenidos en el apartado 5. del Ejemplo de Referencia 3, se midió la
actividad de unión a FGF-8 de los diferentes
anticuerpos injertados a CDR neutralizadores
anti-FGF-8 y se comparó por medio de
BIAcore 2000 utilizando el compuesto 1 como péptido parcial de
FGF-8 con el extremo C terminal marcado con biotina
de la siguiente manera. El anticuerpo quimérico neutralizador
anti-FGF-8 KM3034 derivado de
células CHO/DG44 obtenido en el apartado 3.(1) del Ejemplo de
Referencia 1 se utilizó como control positivo.
Se utilizó HBS-EP como diluyente
de la muestra y tampón durante la medición. En primer lugar, se
instaló Sensor Chip SA (fabricado por BIACORE), y se añadieron 5
\muL de compuesto 1 marcado con biotina que había sido ajustada a
0,05 \mug/mL a una velocidad de flujo de 5 \muL/min. Después, se
añadieron 5 \muL de una solución de 10 mmoles/L de
glicina-hidrocloruro (pH 1,5) dos veces
continuamente para lavar la superficie de la punta. La cantidad
inmovilizada del péptido FGF-8 fue de 35 RU.
Se añadieron 60 \muL de cada una de las
soluciones de anticuerpo a una célula de flujo con el péptido
FGF-8 inmovilizado a una velocidad de flujo de 20
\muL/min, y la reacción de disociación se controló después durante
3 minutos. Después de la reacción de disociación, se añadieron 20
\muL de solución de 10 mmoles/L de
glicina-hidrocloruro (pH 1,5) dos veces
continuamente para regenerar la superficie del chip. Este ciclo se
realizó sobre la solución del anticuerpo a diversas concentraciones
(de 50 a 1,85 \mug/mL) para obtener gramos sensores a diversas
concentraciones. Los gramos sensores de los respectivos anticuerpos
se convirtieron en gramos sensores de reacciones específicas
deduciendo un gramo sensor obtenido utilizando el anticuerpo
quimérico KM871 con respecto a GD3 como control negativo.
Los gramos sensores de los diferentes
anticuerpos a una concentración de 16,7 \mug/mL se mostraron en la
Fig 30. Como resulta evidente a partir del sensograma, apenas se
observaba disociación en el momento de la reacción de disociación
de cada anticuerpo, de manera que era difícil obtener una constante
de disociación exacta. Por consiguiente, la actividad de unión de
los diversos anticuerpos se llevó a cabo comparando la intensidad
de unión [señal de resonancia (RU)] en el momento de la reacción de
unión.
Por consiguiente, como se muestra en la Fig. 30,
los anticuerpos quiméricos KM3034 y HV0LV6/CHO mostraron la
reacción de unión máxima, y HV0LV3-1/CHO,
HV0LV4-1/CHO y HV0LV2-1/CHO
mostraron la reacción de unión más elevada. Mientras,
HV0LV3-2/CHO, HV0LV2-2/CHO y
HV0LV4-2 mostraron la reacción de unión más baja, y
HV0LV0/CHO mostró la reacción de unión mínima. Estos resultados
coincidieron con los resultados obtenidos utilizando los
anticuerpos derivados de las células YB2/0 injertados a CDR
neutralizadores anti-FGF-8 descritos
en el apartado 7. del Ejemplo de Referencia 2.
Con respecto a los cuatro anticuerpos injertados
a CDR neutralizadores anti-FGF-8,
HV0HV0LV6/CHO, HV0LV3-1/CHO,
HV0LV4-1/CHO y HV0LV2-1/CHO donde la
reacción de unión elevada a FGF-8 fue confirmada en
el apartado 7. del Ejemplo de Referencia 3, se evaluó la actividad
neutralizadora de FGF-8 mediante el método descrito
en el apartado 5. del Ejemplo de Referencia 2. El anticuerpo
quimérico neutralizador anti-FGF-8
KM3034 derivado de células CHO/DG44 obtenido en el apartado 3. (1)
del Ejemplo de Referencia 1 se utilizó como control positivo, y el
anticuerpo quimérico KM2760 para la quimioquina humana CCR4 descrito
en la publicación WO 01/64754 se utilizó como control negativo. Los
resultados se muestran en la Fig. 31. Según se muestra en la Fig.
31, HV0LV6/CHO mostró una actividad neutralizadora de
FGF-8 con respecto a la del anticuerpo quimérico
KM3034, y HV0LV3-1/CHO mostró la actividad
neutralizadora de FGF-8 más alta siguiente.
HV0LV4-1/CHO mostró una actividad neutralizadora de
FGF-8 ligeramente más baja que
HV0LV3-1/CHO, y HV0LV2-1/CHO mostró
la actividad neutralizadora mínima. Se encontró correlación entre
la intensidad de la actividad neutralizadora de
FGF-8 y la intensidad de la reacción de unión
medida por medio de BIAcore.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de Referencia
4
Los resultados in Ejemplo de Referencia 3
revelaron que entre las modificaciones de los 6 residuos aminoácido
de LV6, la modificación en la posición 51 era esencial para
recuperar la actividad. Con respecto a la modificación en la
posición 2, se sugirió que era la única modificación que contribuía
cooperativamente a la recuperación de la actividad en combinación
con la modificación en la posición 51, aunque el efecto sobre la
recuperación de la actividad era pequeño. También se sugirió que la
modificación de las posiciones 14 y 15 contribuía cooperativamente
a recuperar la actividad en combinación con la modificación de la
posición 51. Mientras, se sugirió que el efecto de la modificación
de la posición 50 era bajo. Por consiguiente, para examinar cuál
entre la modificación de la posición 2, la modificación de la
posición 14, 15 era más eficaz para recuperar la actividad y para
examinar el efecto de la modificación de la posición 92, se volvió a
examinar la producción de los anticuerpos injertados a CDR
neutralizadores anti-FGF-8.
Se diseñaron secuencias de aminoácidos de dos VL
que tienen las siguientes modificaciones. Cada caso muestra una
modificación de residuos aminoácido de LV.0.
En LV.4-3, 4 residuos Thr de la
posición 14, Pro de la posición 15, Leu de la posición 51 y Tyr de
la posición 92 se cambiaron a Ser, Leu, Val y Phe, respectivamente,
que son residuos aminoácido encontrados en el anticuerpo KM1334 de
ratón.
En LV.3-3, 3 residuos Thr de la
posición 14, Pro de la posición 15 y Leu de la posición 51 se
cambiaron a Ser, Leu y Val, respectivamente, que son residuos
aminoácido encontrados en el anticuerpo KM1334 de ratón.
La secuencia de aminoácidos de
LV.4-3 se describió en el SEQ ID NO. 50, y la
secuencia de aminoácidos de LV.3-3 en el SEQ ID NO.
51 respectivamente.
Los ADN que codifican los residuos aminoácido de
diversos VL de los anticuerpos injertados a CDR neutralizadores
anti-FGF-8 diseñados en el apartado
1. del Ejemplo de Referencia 4 se construyeron como sigue.
El ADN se construyó mediante el método descrito
en el apartado 2. (5) del Ejemplo de Referencia 3 excepto que el
plásmido pKM1334LV2-1 obtenido en 2. (3) del Ejemplo
de Referencia 3 se utilizó en lugar del plásmido
pKM1334LV2-2 y el plásmido
pKM1334LV3-2 obtenido en el apartado 2. (6) del
Ejemplo de Referencia 3 en lugar del plásmido pKM1334LV6. Como
resultado, se obtuvo el plásmido pKM1334LV4-3 que
comprende los ADN que codifican LV.4-3.
Se hicieron reaccionar 3 \mug del plásmido
pKM1334LV4-3 obtenido en el apartado 2.(1) del
Ejemplo de Referencia 4 con 10 unidades de endonucleasa de
restricción BamHI (fabricada por Takara Shuzo) y 10 unidades
de endonucleasa de restricción SpeI a 37ºC durante 1 hora.
La solución de reacción se fraccionó mediante electroforesis en gel
de agarosa para recuperar aproximadamente 2,5 \mug de un fragmento
BamHI-SpeI de aproximadamente 3,23 kb.
Con posterioridad, se hicieron reaccionar 3
\mug del plásmido pKM1334LV0 obtenido en el apartado 1.(3) del
Ejemplo de Referencia 2 con 10 unidades de endonucleasa de
restricción BamHI y 10 unidades de endonucleasa de
restricción SpeI a 37ºC durante 1 hora. La solución de
reacción se fraccionó mediante electroforesis en gel de agarosa
para recuperar aproximadamente 0,15 \mug de un fragmento
BamHI-SpeI de aproximadamente 0,13 kb.
Se añadieron 0,1 \mug del fragmento
BamHI-SpeI derivado del plásmido
pKM1334LV4-3 y 0,1 \mug del fragmento
BamHI-SpeI derivado del plásmido pKM1334LV0 obtenido
antes a agua estéril en una cantidad total de 10 \mul, y se
ligaron utilizando Ligation High. Se transformó la cepa DH5\alpha
de Escherichia coli utilizando la solución de ADN
recombinante del plásmido obtenido de este modo para obtener el
plásmido pKM1334LV3-3 que comprende el ADN que
codifica LV3-3 como se muestra en la Fig. 32.
Los vectores de expresión del anticuerpo
injertado a CDR neutralizador
anti-FGF-8 que tienen los ADN que
codifican diversos VL fueron construidos remplazando el fragmento
EcoRI-BsiWI que comprende el ADN que codifica VL del
vector de expresión pKANTEX1334HV0LV6 obtenido en el apartado 2. del
Ejemplo de Referencia 2 por los fragmentos
EcoRI-BsiWI que comprenden los ADN que codifican
diversos VL construidos en el apartado 2. del Ejemplo de Referencia
4. Específicamente, se construyeron dos tipos,
pKANTEX1334HV0LV4-3 y
pKANTEX1334HV0LV3-3.
Se realizó la expresión estable de los
anticuerpos injertados a CDR neutralizadores
anti-FGF-8 en células CHO/
DG44 mediante el método descrito en el apartado 2. (4) del Ejemplo de Referencia 1 utilizando los vectores de expresión del anticuerpo injertado a CDR neutralizador anti-FGF-8 obtenidos en el apartado 3. del Ejemplo de Referencia 4.
DG44 mediante el método descrito en el apartado 2. (4) del Ejemplo de Referencia 1 utilizando los vectores de expresión del anticuerpo injertado a CDR neutralizador anti-FGF-8 obtenidos en el apartado 3. del Ejemplo de Referencia 4.
Se realizaron el cultivo de los transformante
derivados de células CHO/DG44 que expresan los diferentes
anticuerpos injertados a CDR neutralizadores
anti-FGF-8 obtenidos en el apartado
4. del Ejemplo de Referencia 4 y la purificación de los anticuerpos
injertados a CDR neutralizadores
anti-FGF-8 a partir del sobrenadante
mediante el método descrito en el apartado 3. (1) del Ejemplo de
Referencia 1. El anticuerpo derivado del transformante con
pKANTEX1334HV0LV4-3 introducido se denominó
HV0LV4-3/CHO, y el anticuerpo derivado del
transformante con pKANTEX1334HV0LV3-3 introducido
se denominó HV0LV3-3/CHO.
Se realizó la SDS-PAGE de los
anticuerpos injertados a CDR neutralizadores
anti-FGF-8 obtenidos en el apartado
5. del Ejemplo de Referencia 4 mediante el método descrito en el
apartado 4. del Ejemplo de Referencia 1. Como resultado, se
confirmó que todos los anticuerpos fueron expresados en forma de
moléculas de anticuerpo con una estructura correcta, y se
purificaron.
La actividad de unión a FGF-8 de
los anticuerpos injertados a CDR neutralizadores
anti-FGF-8 HV0LV6/CHO y
HV0LV3-1/CHO obtenidos en el apartado 5. del Ejemplo
de Referencia 3 y los anticuerpos injertados a CDR neutralizadores
anti-FGF-8
HVOLV4-3/CHO y HV0LV3-3/CHO
obtenidos en el apartado 5. del Ejemplo de Referencia 4 se midió
mediante el método descrito en el apartado 7. del Ejemplo de
Referencia 3. El anticuerpo quimérico neutralizador
anti-FGF-8 derivado de células
CHO/DG44 KM3034 obtenido en el apartado 3. (1) del Ejemplo de
Referencia 1 se utilizó como control positivo.
Los gramos sensores de los diferentes
anticuerpos a una concentración de 16,7 \mug/mL se mostraron en la
Fig. 33. Como resulta evidente a partir de los gramos sensores,
apenas se observaba disociación en el momento de la reacción de
disociación de los anticuerpos, de manera que fue difícil obtener
una constante de disociación exacta. Por consiguiente, la actividad
de unión de los diferentes anticuerpos se comparó en términos de la
unión [señal de resonancia (RU)] en el momento de la reacción de
unión. Por consiguiente, como se muestra en la Fig. 33, el
anticuerpo quimérico KM3034 mostró una reacción de unión máxima, y
HV0LV4-3/CHO mostró una reacción de unión más
elevada que la de HV0LV3-1/CHO y similar a la de
HV0LV6/CHO. La reacción de unión de HV0LV3-3/CHO
era inferior a la de HVOLV3-1. Estos resultados
sugirieron que respecto a la envergadura de la reacción de unión,
las modificaciones de la posición 14 y 15 funcionaron más
cooperativamente que las modificaciones de la posición de 2, y las
modificaciones de la posición de 92 fueron esenciales para la
recuperación de la actividad.
Se evaluó la actividad neutralizadora de
FGF-8 de los anticuerpos injertados a CDR
neutralizadores anti-FGF-8
HVOLV6/CHO y HV0LV3-1/CHO obtenidos en el apartado
5. del Ejemplo de Referencia 3 y de los anticuerpos injertados a
CDR neutralizadores anti-FGF-8
HV0LV4-3/CHO y HV0LV3-3/CHO
obtenidos en el apartado 5. del Ejemplo de Referencia 4 mediante el
método descrito en el apartado 5. del Ejemplo de Referencia 2. El
anticuerpo quimérico neutralizador
anti-FGF-8 KM3034 derivado de
células CHO/DG44 obtenido en el apartado 3. (1) del Ejemplo de
Referencia 1 se utilizó como control positivo, y el anticuerpo
quimérico KM2760 para la quimioquina humana CCR4 descrito en la
publicación WO 01/64754 se utilizó como control negativo. Los
resultados se mostraron en la Fig. 34. Según se muestra en la Fig.
34, HVOLV6/CHO y HV0LV3-1/CHO mostraron una
actividad neutralizadora de FGF-8 similar a la del
anticuerpo quimérico KM3034. Mientras, HVOLV4-3/CHO
y HVOLV3-3/CHO mostraron una actividad
neutralizadora similar que era aproximadamente la mitad que la del
anticuerpo quimérico KM3034. La actividad neutralizadora de
HV0LV3-1/CHO y HV0LV4-3/CHO no
mostró correlación con la envergadura de la reacción de unión
medida por medio de BIAcore, y se sugirió que los residuos
aminoácido de la posición 2 y los residuos aminoácido de la
posición 14 y 15 proporcionaron influencias independientes sobre la
actividad de unión a FGF-8 de FGF-8
y la actividad neutralizadora de FGF-8 de las
células.
A la vista de los diversos resultados de
evaluación anteriores, el anticuerpo injertado a CDR HVOLV6/CHO
derivado de células CHO/DG44 que muestra una reacción de unión
elevada y una actividad neutralizadora de FGF-8
similar a la del anticuerpo quimérico KM3034 se denominó KM8034, y
el transformante derivado de células CHO/DG44 que expresaba KM8034
sumamente se denominó KM8034 de la misma manera. El anticuerpo
injertado a CDR HV0LV4-3/CHO derivado de células
CHO/DG44 que muestra una reacción de unión elevada similar a la de
KM8034 se denominó KM8035, y el transformante derivado de células
CHO/DG44 que expresaba sumamente KM8035 se denominó KM8035 de la
misma manera. La secuencia de aminoácidos de VL
LV.4-3 de KM8035 se describió en el SEQ ID NO. 38.
Adicionalmente, el transformante KM8035 se depositó como FERM
BP-8082 en Depósito de Organismos de Patentes
Internacionales, Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología
Industrial Avanzadas (AIST Tsukuba Central 6,
1-1-1 Higashi, Tsukubashi Ibaraki,
305-8566, Japan) el 20 de Junio de 2002. El
anticuerpo injertado a CDR derivado de células CHO/DG44
HV0LV3-1/CHO que muestra una actividad
neutralizadora de FGF-8 similar a la de KM8034 se
denominó KM8036, y el transformante derivado de células CHO/DG44
que expresa KM8036 sumamente se denominó KM8036 de la misma manera.
La secuencia secuencia de aminoácidos de VL LV.3-1
de KM8036 se describió en el SEQ ID NO. 39. El transformante KM8036
se depositó como FERM BP-8083 en el Depósito de
Organismos de Patentes Internacionales, Instituto Nacional de
Ciencia y Tecnología Industrial Avanzadas (AIST Tsukuba Central 6,
1-1-1 Higashi, Tsukubashi Ibaraki,
305-8566, Japan) el 20 de Junio de 2002.
El anticuerpo injertado a CDR neutralizador
anti-FGF-8 KM8034 mostró una
reacción de unión elevada y una actividad neutralizadora de
FGF-8 similar a la del anticuerpo quimérico KM3034,
y la antigenicidad en seres humanos es más reducida que la del
anticuerpo quimérico. De este modo, se espera un efecto terapéutico
superior al del anticuerpo quimérico. Los anticuerpos injertados a
CDR neutralizadores anti-FGF-8
KM8036 y KM8035 podrían tener una actividad de unión y una
actividad neutralizadora de FGF-8 ligeramente
inferiores a la de KM8034. No obstante, puesto que los residuos
aminoácido de FR de la región V derivada del anticuerpo KM1334 de
ratón son 3 residuos y 4 residuos, se espera que su inmunogenicidad
disminuya más que la de KM8034.
La presente invención proporciona un agente para
prevenir o tratar la artritis, un agente protector del cartílago,
un inhibidor de la destrucción de la articulación y un inhibidor del
crecimiento de la membrana sinovial que comprende un anticuerpo
neutralizador anti-FGF-8 como
ingrediente activo, así como un agente diagnóstico de la artritis
que comprende un anticuerpo
anti-FGF-8 como ingrediente activo y
un método para evaluar la artritis utilizando el anticuerpo.
- SEQ ID NO. 13 -
- Cebador para amplificar VH de KM1334.
- SEQ ID NO. 14 -
- Cebador para amplificar VH de KM1334.
- SEQ ID NO. 15 -
- Cebador para amplificar VL de KM1334.
- SEQ ID NO. 16 -
- Cebador para amplificar VL de KM1334.
- SEQ ID NO. 17 -
- Péptido de FGF-8 humano con un residuo cisteína añadido al extremo C (residuos aminoácido 23º a 46º).
- SEQ ID NO. 18 -
- Secuencia de aminoácidos, HV.0 de VH de un anticuerpo injertado a CDR neutralizador anti-FGF-8 diseñado.
- SEQ ID NO. 19 -
- Secuencia de aminoácidos, LV.0 de VL de un anticuerpo injertado a CDR neutralizador anti-FGF-8 diseñado.
- SEQ ID NO. 20 -
- Secuencia de aminoácidos, HV.6 de VH de un anticuerpo injertado a CDR neutralizador anti-FGF-8 diseñado.
- SEQ ID NO. 21 -
- Secuencia de aminoácidos, LV.6 de VL de un anticuerpo injertado a CDR neutralizador anti-FGF-8 diseñado.
- SEQ ID NO. 22 -
- ADN que codifica HV.0.
- SEQ ID NO. 23 -
- ADN sintético para la construcción de ADN que codifica HV.0.
- SEQ ID NO. 24 -
- ADN sintético para la construcción de ADN que codifica HV.0.
- SEQ ID NO. 25 -
- ADN sintético para la construcción de ADN que codifica HV.0.
- SEQ ID NO. 26 -
- ADN sintético para la construcción de ADN que codifica HV.0.
- SEQ ID NO. 27 -
- ADN que codifica HV.6.
- SEQ ID NO. 28 -
- ADN sintético para la construcción de ADN que codifica HV.6.
- SEQ ID NO. 29 -
- ADN sintético para la construcción de ADN que codifica HV.6.
- SEQ ID NO. 30 -
- ADN sintético para la construcción de ADN que codifica HV.6.
- SEQ ID NO. 31 -
- ADN sintético para la construcción de ADN que codifica HV.6.
- SEQ ID NO. 32 -
- ADN que codifica LV.0.
- SEQ ID NO. 33 -
- ADN sintético para la construcción de ADN que codifica LV.0.
- SEQ ID NO. 34 -
- ADN sintético para la construcción de ADN que codifica LV.0.
- SEQ ID NO. 35 -
- ADN sintético para la construcción de ADN que codifica LV.0.
- SEQ ID NO. 36 -
- ADN sintético para la construcción de ADN que codifica LV.0.
- SEQ ID NO. 37 -
- ADN que codifica LV.6.
- SEQ ID NO. 38 -
- ADN sintético para la construcción de ADN que codifica LV.6.
- SEQ ID NO. 39 -
- ADN sintético para la construcción de ADN que codifica LV.6.
- SEQ ID NO. 40 -
- ADN sintético para la construcción de ADN que codifica LV.6.
- SEQ ID NO. 41 -
- ADN sintético para la construcción de ADN que codifica LV.6.
- SEQ ID NO. 42 -
- Secuencia de aminoácidos, LV.4-1 de VL de un anticuerpo injertado a CDR neutralizador anti-FGF-8 diseñado.
- SEQ ID NO. 43 -
- Secuencia de aminoácidos, LV.4-2 de VL de un anticuerpo injertado a CDR neutralizador anti-FGF-8 diseñado.
- SEQ ID NO. 44 -
- Secuencia de aminoácidos, LV.3-1 de VL de un anticuerpo injertado a CDR neutralizador anti-FGF-8 diseñado.
- SEQ ID NO. 45 -
- Secuencia de aminoácidos, LV.3-2 de VL de un anticuerpo injertado a CDR neutralizador anti-FGF-8 diseñado.
- SEQ ID NO. 46 -
- Secuencia de aminoácidos, LV.2-1 de VL de un anticuerpo injertado a CDR neutralizador anti-FGF-8 diseñado.
- SEQ ID NO. 47 -
- Secuencia de aminoácidos, LV.2-2 de VL de un anticuerpo injertado a CDR neutralizador anti-FGF-8 diseñado.
- SEQ ID NO. 48 -
- Cebador para la construcción de ADN que codifica LV.3-1.
- SEQ ID NO. 49 -
- Cebador para la construcción de ADN que codifica LV.2-2.
- SEQ ID NO. 50 -
- Secuencia de aminoácidos, LV.4-3 de VL de un anticuerpo injertado a CDR neutralizador anti-FGF-8 diseñado.
- SEQ ID NO. 51 -
- Secuencia de aminoácidos, LV.3-3 de VL de un anticuerpo injertado a CDR neutralizador anti-FGF-8 diseñado.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Agente terapéutico para la
artritis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 1442
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP2001-400677
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2001-12-28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 420
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Inventor: Tamura, Tadafumi; Uchii,
Masako; Toshio, Suda
\hskip1cmInventor: Ichiro, Miki; Akira, Tanaka
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(420)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /organismo = "Mus
musculus"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(420)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido_señal
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(57)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 140
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SEÑAL
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(19)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 393
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(393)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /organismo = "Mus
musculus"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(393)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido_señal
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(57)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 131
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SEÑAL
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(19)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 121
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 112
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> un cebador para la amplificación de
VH de KM1334
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> un cebador para la amplificación de
VH de KM1334
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> un cebador para la amplificación de
VL de KM1334
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<400> 15
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<210> 16
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<211> 28
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> un cebador para la amplificación de
VL de KM1334
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<400> 16
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<210> 17
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<211> 25
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> péptido FGF-8 humano
(residuos aminoácido 23-46) con un residuo cisteína
añadido en su extremo C
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<400> 17
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<210> 18
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<211> 121
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> HV.0, una secuencia de aminoácidos
diseñada de VH de un anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 injertado
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\hskip-.1em\dddseqskipa CDR
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<400> 18
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<210> 19
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> LV.0, una secuencia de aminoácidos
diseñada de VL de un anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 injertado
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\hskip-.1em\dddseqskipa CDR
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<210> 20
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<211> 121
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
\vskip1.000000\baselineskip
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<223> HV.6, una secuencia de aminoácidos
diseñada de VH de un anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 injertado
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipa CDR
\hfill
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\hskip0,8cm
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<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 112
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
\vskip1.000000\baselineskip
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<223> LV.6, una secuencia de aminoácidos
diseñada de VL de un anticuerpo neutralizador
anti-FGF-8 injertado
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipa CDR
\hfill
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<210> 22
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<211> 504
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<223> un ADN que codifica HV.0
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<220>
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<221> CDS
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<222> (47)..(466)
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<221> péptido_señal
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<222> (47)..(103)
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<400> 22
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\hskip0,8cm
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<210> 23
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<211> 141
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> un ADN sintético para la
construcción de un ADN que codifica HV.0
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<400> 23
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<210> 24
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<211> 141
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<223> un ADN sintético para la
construcción de un ADN que codifica HV.0
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<400> 24
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<210> 25
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<211> 141
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> un ADN sintético para la
construcción de un ADN que codifica HV.0
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<211> 141
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> un ADN sintético para la
construcción de un ADN que codifica HV.0
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<400> 26
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<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 504
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> un ADN que codifica HV.6
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<220>
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<221> CDS
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<222> (47)..(466)
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<220>
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<221> péptido_señal
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<222> (47)..(103)
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<400> 27
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\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
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<210> 28
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<211> 141
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> un ADN sintético para la
construcción de un ADN que codifica HV.6
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<400> 28
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<211> 141
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<223> un ADN sintético para la
construcción de un ADN que codifica HV.6
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<400> 29
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<211> 141
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> a ADN sintético para la construcción
de un ADN que codifica HV.6
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<210> 31
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<211> 141
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> un ADN sintético para la
construcción de un ADN que codifica HV.6
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<210> 32
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<211> 459
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
\vskip1.000000\baselineskip
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<223> un ADN que codifica LV.0
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<220>
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<221> CDS
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<222> (40)..(432)
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<221> péptido_señal
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<222> (40)..(96)
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<400> 32
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\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
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<210> 33
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> un ADN sintético para la
construcción de un ADN que codifica LV.0
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<400> 33
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<210> 34
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> un ADN sintético para la
construcción de un ADN que codifica LV.0
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<400> 34
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> un ADN sintético para la
construcción de un ADN que codifica LV.0
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 129
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> un ADN sintético para la contrucción
de un ADN que codifica LV.0
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<400> 36
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\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 459
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
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<220>
\vskip1.000000\baselineskip
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<223> un ADN que codifica LV.6
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> CDS
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<222> (40)..(432)
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<220>
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<221> péptido_señal
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<222> (40)..(96)
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\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 38
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<211> 130
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> un ADN sintético para la
construcción de un ADN que codifica LV.6
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<400> 38
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\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 39
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<211> 130
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<223> un ADN sintético para la
construcción de un ADN que codifica LV.6
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 39
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<210> 40
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<211> 130
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> un ADN sintético para la
construcción de un ADN que codifica LV.6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 129
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> un ADN sintético para la
construcción de un ADN que codifica LV.6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 112
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> LV.4-1, una
secuencia de aminoácidos diseñada de VL de un anticuerpo
neutralizador anti-FGF-8 injertado
a CDR
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 112
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> LV.4-2, una
secuencia de aminoácidos diseñada de VL de un anticuerpo
neutralizador anti-FGF-8 injertado
a CDR
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 112
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> LV.3-1, una
secuencia de aminoácidos diseñada de VL de un anticuerpo
neutralizador anti-FGF-8 injertado
a CDR
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 112
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> LV.3-2, una
secuencia de aminoácidos diseñada de VL de un anticuerpo
neutralizador anti-FGF-8 injertado
a CDR
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 112
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> LV.2-1, una
secuencia de aminoácidos diseñada de VL de un anticuerpo
neutralizador anti-FGF-8 injertado
a CDR
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 112
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> LV.2-2, una
secuencia de aminoácidos diseñada de VL de un anticuerpo
neutralizador anti-FGF-8 injertado
a CDR
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> un cebador para la construcción de
ADN que codifica LV.3-1
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> un cebador para la construcción de
ADN que codifica LV.2-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 112
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> LV.4-3, una
secuencia de aminoácidos diseñada de VL de un anticuerpo
neutralizador anti-FGF-8 injertado
a CDR
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 112
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> LV.3-3, una
secuencia de aminoácidos diseñada de VL de un anticuerpo
neutralizador anti-FGF-8 injertado
a CDR
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
Claims (32)
1. Un anticuerpo que se une específicamente a
FGF-8 inhibiendo la actividad de
FGF-8 para su uso en la prevención o tratamiento de
la artritis.
2. El anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 1, donde el anticuerpo que se une específicamente a
FGF-8 es un anticuerpo policlonal o un anticuerpo
monoclonal.
3. El anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 2, donde el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo
seleccionado de un anticuerpo producido por un hibridoma, un
anticuerpo humanizado y uno de sus fragmentos de anticuerpo.
4. El anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 3, donde el hibridoma es el hibridoma KM1334
depositado bajo el número de acceso FERM
BP-5451.
5. El anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 3, donde el anticuerpo humanizado es un anticuerpo
quimérico o un anticuerpo injertado a CDR.
6. El anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 5, donde el anticuerpo quimérico es un anticuerpo
quimérico que comprende VH y VL de un anticuerpo monoclonal que se
une específicamente a FGF-8 y CH y CL de un
anticuerpo humano.
7. El anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 6, donde el anticuerpo quimérico es cualquiera de los
siguientes anticuerpos quiméricos (a) a (c),
(a) un anticuerpo quimérico donde VH comprende
una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 5,
(b) un anticuerpo quimérico donde VL comprende
una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 6,
y
(c) un anticuerpo quimérico donde VH comprende
una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 5 y VL
comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID
NO. 6.
8. El anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 7, donde el anticuerpo quimérico es un anticuerpo
quimérico producido por el transformante KM3034 depositado bajo el
número de acceso FERM BP-7836.
9. El anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 5, donde el anticuerpo injertado a CDR es un
anticuerpo injertado a CDR que comprende las CDR de VH y VL de un
anticuerpo monoclonal que se une específicamente a
FGF-8 inhibiendo la actividad de
FGF-8 y CH y CL de un anticuerpo humano.
10. El anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 9, donde el anticuerpo injertado a CDR es un
anticuerpo injertado a CDR que comprende las CDR de VH y VL de un
anticuerpo monoclonal que se une específicamente a
FGF-8 inhibiendo la actividad de
FGF-8, FR de VH y VL de un anticuerpo humano y CH y
CL de un anticuerpo humano.
11. El anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 9 o 10, donde el anticuerpo injertado a CDR es
cualquiera de los siguientes anticuerpos injertados a CDR (a) a
(c),
(a) un anticuerpo injertado a CDR donde CDR1,
CDR2 y CDR3 de VH comprenden las secuencias de aminoácidos
representadas por los SEQ ID NOS. 7, 8 y 9 respectivamente,
(b) un anticuerpo injertado a CDR donde CDR1,
CDR2 y CDR3 de VL comprenden las secuencias de aminoácidos
representadas por los SEQ ID NOS. 10, 11 y 12 respectivamente,
y
(c) un anticuerpo injertado a CDR donde CDR1,
CDR2 y CDR3 de VH comprenden las secuencias de aminoácidos
representadas por los SEQ ID NOS. 7, 8 y 9 respectivamente, y CDR1,
CDR2 y CDR3 de VL comprenden las secuencias de aminoácidos
representadas por los SEQ ID NOS. 10, 11 y 12 respectivamente.
12. El anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 9 o 10, donde el anticuerpo injertado a CDR es
cualquiera de los siguientes anticuerpos injertados a CDR (a) a
(c),
(a) un anticuerpo injertado a CDR donde VH
comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID
NO. 18 donde al menos uno o más residuos aminoácido seleccionados
entre Lys de la posición 12, Lys de la posición 13, Ala de la
posición 40, Pro de la posición 41, Met de la posición 48, Val de la
posición 68, Ile de la posición 70, Thr de la posición 74, Thr de
la posición 76, Glu de la posición 82, Ser de la posición 84, Arg
de la posición 87 y Tyr de la posición 95 se remplazan por otros
residuos aminoácido,
\newpage
(b) un anticuerpo injertado a CDR donde VL
comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID
NO. 19 donde al menos uno o más residuos aminoácido seleccionados
entre Ile de la posición 2, Val de la posición 3, Thr de la
posición 14, Pro de la posición 15, Gln de la posición 50, Leu de la
posición 51 y Tyr de la posición 92 se remplazan por otros residuos
aminoácido, y
(c) un anticuerpo injertado a CDR donde VH
comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID
NO. 18 donde al menos uno o más residuos aminoácido seleccionados
entre Lys de la posición 12, Lys de la posición 13, Ala de la
posición 40, Pro de la posición 41, Met de la posición 48, Val de la
posición 68, Ile de la posición 70, Thr de la posición 74, Thr de
la posición 76, Glu de la posición 82, Ser de la posición 84, Arg
de la posición 87 y Tyr de la posición 95 se remplazan por otros
residuos aminoácido, y VL comprende una secuencia de aminoácidos
representada por el SEQ ID NO. 19 donde al menos uno o más residuos
aminoácido seleccionados entre Ile de la posición 2, Val de la
posición 3, Thr de la posición 14, Pro de la posición 15, Gln de la
posición 50, Leu de la posición 51 y Tyr de la posición 92 se
remplazan por otros residuos aminoácido.
13. El anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 9 o 10, donde el anticuerpo injertado a CDR es
cualquiera de los siguientes anticuerpos injertados a CDR (a) a
(c),
(a) un anticuerpo injertado a CDR donde VH
comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID
NO. 18 o 20,
(b) un anticuerpo injertado a CDR donde VL
comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID
NO. 19, 21, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 50 o 51, y
(c) un anticuerpo injertado a CDR donde VH
comprende una secuencia de aminoácidos, representada por el SEQ ID
NO. 18 o 20 y VL comprende una secuencia de aminoácidos representada
por el SEQ ID NO. 19, 21, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 50 o 51.
14. El anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 13, donde el anticuerpo injertado a CDR es cualquiera
de los siguientes anticuerpos injertados a CDR (a) a (c),
(a) un anticuerpo injertado a CDR donde VH
comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID
NO. 18 y VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por
el SEQ ID NO. 21,
(b) un anticuerpo injertado a CDR donde VH
comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID
NO. 18 y VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por
el SEQ ID NO. 44, y
(c) un anticuerpo injertado a CDR donde VH
comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID
NO. 18 y VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por
el SEQ ID NO. 50.
15. El anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 9 o 10, donde el anticuerpo injertado a CDR es
cualquiera de los siguientes anticuerpos injertados a CDR (a) a
(c),
(a) un anticuerpo injertado a CDR producido por
el transformante KM8037 depositado bajo el número de acceso FERM
BP-8084,
(b) un anticuerpo injertado a CDR producido por
el transformante KM8035 depositado bajo el número de acceso FERM
BP-8082, y
(c) un anticuerpo injertado a CDR producido por
el transformante KM8036 depositado bajo el número de acceso FERM
BP-8083.
16. El anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 3, donde el fragmento de anticuerpo es un fragmento
de anticuerpo seleccionado entre Fab, Fab', F(ab')_{2}, un
anticuerpo de cadena sencilla (scFv), un fragmento de la región V
dimerizado (fragmento bivalente), un fragmento de la región V
estabilizado por disulfuro (dsFv) y un péptido que comprende las
CDR.
17. El uso de un anticuerpo que se une
específicamente a FGF-8 para la preparación de una
composición para diagnosticar la artritis.
18. El uso de acuerdo con la reivindicación 17,
donde el anticuerpo que se une específicamente a
FGF-8 es un anticuerpo policlonal o un anticuerpo
monoclonal.
19. El uso de acuerdo con la reivindicación 18,
donde el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo seleccionado de un
anticuerpo producido por un hibridoma, un anticuerpo humanizado y
uno de sus fragmentos de anticuerpo.
20. El uso de acuerdo con la reivindicación 19,
donde el hibridoma es el hibridoma KM1334 depositado bajo el número
de acceso FERM BP-5451.
21. El uso de acuerdo con la reivindicación 19,
donde el anticuerpo humanizado es un anticuerpo quimérico o un
anticuerpo injertado a CDR.
22. El uso de acuerdo con la reivindicación 21,
donde el anticuerpo quimérico es un anticuerpo quimérico que
comprende VH y VL de un anticuerpo monoclonal que se une
específicamente a FGF-8 y CH y CL de un anticuerpo
humano.
23. El uso de acuerdo con la reivindicación 22,
donde el anticuerpo quimérico es cualquiera de los siguientes
anticuerpos quiméricos (a) a (c),
(a) un anticuerpo quimérico donde VH comprende
una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 5,
(b) un anticuerpo quimérico donde VL comprende
una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 6,
y
(c) un anticuerpo quimérico donde VH comprende
una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO. 5 y VL
comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID
NO. 6.
24. El uso de acuerdo con la reivindicación 23,
donde el anticuerpo quimérico es un anticuerpo quimérico producido
por el transformante KM3034 depositado bajo el número de acceso FERM
BP-7836.
25. El uso de acuerdo con la reivindicación 21,
donde el anticuerpo injertado a CDR es un anticuerpo injertado a
CDR que comprende las CDR de VH y VL de un anticuerpo monoclonal que
se une específicamente a FGF-8 y CH y CL de un
anticuerpo humano.
26. El uso de acuerdo con la reivindicación 25,
donde el anticuerpo injertado a CDR es un anticuerpo injertado a
CDR que comprende las CDR de VH y VL de un anticuerpo monoclonal que
se une específicamente a FGF-8, FR de VH y VL de un
anticuerpo humano y CH y CL de un anticuerpo humano.
27. El uso de acuerdo con la reivindicación 25 o
26, donde el anticuerpo injertado a CDR es cualquiera de los
siguientes anticuerpos injertados a CDR (a) a (c),
(a) un anticuerpo injertado a CDR donde CDR1,
CDR2 y CDR3 de VH comprenden las secuencias de aminoácidos
representadas por los SEQ ID NOS. 7, 8 y 9 respectivamente,
(b) un anticuerpo injertado a CDR donde CDR1,
CDR2 y CDR3 de VL comprenden las secuencias de aminoácidos
representadas por los SEQ ID NOS. 10, 11 y 12 respectivamente,
y
(c) un anticuerpo injertado a CDR donde CDR1,
CDR2 y CDR3 de VH comprenden las secuencias de aminoácidos
representadas por los SEQ ID NOS. 7, 8 y 9 respectivamente, y CDR1,
CDR2 y CDR3 de VL comprenden las secuencias de aminoácidos
representadas por los SEQ ID NOS. 10, 11 y 12 respectivamente.
28. El uso de acuerdo con la reivindicación 25 o
26, donde el anticuerpo injertado a CDR es cualquiera de los
siguientes anticuerpos injertados a CDR (a) a (c),
(a) un anticuerpo injertado a CDR donde VH
comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID
NO. 18 donde al menos uno o más residuos aminoácido seleccionados
entre Lys de la posición 12, Lys de la posición 13, Ala de la
posición 40, Pro de la posición 41, Met de la posición 48, Val de la
posición 68, Ile de la posición 70, Thr de la posición 74, Thr de
la posición 76, Glu de la posición 82, Ser de la posición 84, Arg
de la posición 87 y Tyr de la posición 95 se remplazan por otros
residuos aminoácido,
(b) un anticuerpo injertado a CDR donde VL
comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID
NO. 19 donde al menos uno o más residuos aminoácido seleccionados
entre Ile de la posición 2, Val de la posición 3, Thr de la
posición 14, Pro de la posición 15, Gln de la posición 50, Leu de la
posición 51 y Tyr de la posición 92 se remplazan por otros residuos
aminoácido, y
(c) un anticuerpo injertado a CDR donde VH
comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID
NO. 18 donde al menos uno o más residuos aminoácido seleccionados
entre Lys de la posición 12, Lys de la posición 13, Ala de la
posición 40, Pro de la posición 41, Met de la posición 48, Val de la
posición 68, Ile de la posición 70, Thr de la posición 74, Thr de
la posición 76, Glu de la posición 82, Ser de la posición 84, Arg
de la posición 87 y Tyr de la posición 95 se remplazan por otros
residuos aminoácido, y VL comprende una secuencia de aminoácidos
representada por el SEQ ID NO. 19 donde al menos uno o más residuos
aminoácido seleccionados entre Ile de la posición 2, Val de la
posición 3, Thr de la posición 14, Pro de la posición 15, Gln de la
posición 50, Leu de la posición 51 y Tyr de la posición 92 se
remplazan por otros residuos aminoácido.
29. El uso de acuerdo con la reivindicación 25 o
26, donde el anticuerpo injertado a CDR es cualquiera de los
siguientes anticuerpos injertados a CDR (a) a (c),
(a) un anticuerpo injertado a CDR donde VH
comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID
NO. 18 o 20,
(b) un anticuerpo injertado a CDR donde VL
comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID
NO. 19, 21, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 50 o 51, y
(c) un anticuerpo injertado a CDR donde VH
comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID
NO. 18 o 20 y VL comprende una secuencia de aminoácidos representada
por el SEQ ID NO. 19, 21, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 50 o 51.
30. El uso de acuerdo con la reivindicación 29,
donde el anticuerpo injertado a CDR es cualquiera de los siguientes
anticuerpos injertados a CDR (a) a (c),
(a) un anticuerpo injertado a CDR donde VH
comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID
NO. 18 y VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por
el SEQ ID NO. 21,
(b) un anticuerpo injertado a CDR donde VH
comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID
NO. 18 y VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por
el SEQ ID NO. 44, y
(c) un anticuerpo injertado a CDR donde VH
comprende una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID
NO. 18 y VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por
el SEQ ID NO. 50.
31. El uso de acuerdo con la reivindicación 25 o
26, donde el anticuerpo injertado a CDR es cualquiera de los
siguientes anticuerpos injertados a CDR (a) a (c),
(a) un anticuerpo injertado a CDR producido por
el transwformante KM8037 depositado bajo el número de acceso FERM
BP-8084,
(b) un anticuerpo injertado a CDR producido por
el transformante KM8035 depositado bajo el número de acceso FERM
BP-8082, y
(c) un anticuerpo injertado a CDR producido por
el transformante KM8036 depositado bajo el número de acceso (FERM
BP-8083).
32. El uso de acuerdo con la reivindicación 19,
donde el fragmento de anticuerpo es un fragmento de anticuerpo
seleccionado entre Fab, Fab', F(ab')_{2}, un anticuerpo de
cadena sencilla (scFv), un fragmento de la región V dímerizado
(fragmento bivalente), un fragmento de la región V estabilizado por
disulfuro (dsFv) y un péptido que comprende las CDR.
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