KR20040075940A - 제2형 당뇨병에 대한 표적으로서의 ριμ-3 키나제 - Google Patents

제2형 당뇨병에 대한 표적으로서의 ριμ-3 키나제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 분리된 핵산 분자 및 이러한 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 PIM-3 활성 및 확정된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 항-제2형 당뇨병 약물을 동정하기 위한 선별 제제 및 인슐린 내성 또는 제2형 당뇨병의 치료용 약제를 제조하기 위한 선별 제제로서 PIM-3의 용도에 관한 것이다.

Description

제2형 당뇨병에 대한 표적으로서의 ΡΙΜ-3 키나제{ΡΙΜ-3 kinase as a target for type 2 diabetes mellitus}
본 발명은 PIM-3 키나제의 신규한 용도, 신규한 PIM-3 키나제 아유형 및 이의 용도에 관한 것이다.
래트 PIM-3(본래 KID-1으로 지칭됨, KID "탈분극에 의해 유도된 키나제"), 개구리 PIM-1 및 사람 및 쥐 PIM-1이 시험관 내 인산화 분석에서 세린/트레오닌 단백질 키나제 활성을 갖는 것으로 공지되어 있다. 사람, 쥐 및 래트 PIM-3, 개구리 PIM-1 및, 사람 및 쥐 PIM-1사이의 높은 폴리펩티드 서열 유사성은 사람 및 쥐 PIM-3가 세린/트레오닌 단백질 키나제임을 증명한다.
래트 PIM-3는 문헌[참조: Feldman, J.D. et al. (J. Biol. Chem. (1998)273, 16535-16543)]에 개시되어 있다. 래트 PIM-3는 해마회 및 피질의 특정 영역에서 카인산 및 전기경련 수반 충격에 대한 반응으로 유도되며, 이는 PIM-3가 카인산 발작 및 발작 및 간질과 같은 임의의 신경계-관련 질환과 신경기능, 시냅스 가소성, 학습 및 기억과 관련된다는 것을 암시한다.
문헌[참조: US 제6,143,540호, Konietzko, U. et al.(EMBO(1999) 18, 3359-3369] 및 [참조: Eichmann, A. (Oncogene(2000) 19, 1215-1224)] 또한 PIM-3 키나제를 언급한다.
본 발명은 신규한 PIM-3 암호화 서열 및 PIM-3의 신규한 용도를 제공한다.
본 발명은 신규한 사람 및 쥐 PIM-3 서열을 제공한다. 서열번호 1은 사람 PIM-3의 DNA 서열을 서술하며 서열번호 2는 사람 PIM-3의 추론된 아미노산 서열이다. 서열번호 1의 개방형 판독 프레임은 뉴클레오티드 17 내지 뉴클레오티드 995에 이른다(서열번호 3).
서열 번호 5는 쥐 PIM-3의 DNA 서열을 서술하며 서열번호 6은 쥐 PIM-3의 추론된 아미노산 서열이다. 서열번호 5의 개방형 판독 프레임은 뉴클레오티드 199 내지 뉴클레오티드 1177에 이른다(서열번호 7).
본 발명은 쥐 PIM-3 유전자의 발현이 인슐린 내성의 2가지 독립적인 모델의 지방세포내에서 감소됨을 증명한다. 인슐린 감작제의 처리는 쥐 3T3-L1 세포내에서 PIM-3 유전자 발현을 증가시킨다. 사람 및 쥐 PIM-3는 래트 PIM-3의 종 정형체(ortholog)이기 때문에 사람 및 쥐 PIM-3는 래트 PIM-3가 관련된 일부 또는 모든 과정 및 질환과 관련된다. PIM-3, 특히 사람 및 쥐 PIM-3는 인슐린 내성의 발달과 관련된다. 이 외에 PIM-3, 특히 사람 및 쥐 PIM-3는 제2형 당뇨병의 발달과 관련된다. 이 외에, 사람 및 쥐 PIM-3 파랄로그(paralog), PIM-1 단백질은 원발암유전자이다. 따라서, PIM-3, 특히 사람 및 쥐 PIM-3는 세포 성장 조절, 암, 및 관련 경로 및 질환과 관련된다.
본 발명은 a) 인슐린 내성 또는 제2형 당뇨병을 조절하는 화합물을 동정하기 위한 선별 분석; b) 인슐린 내성 또는 제2형 당뇨병을 검출하기 위한 검출 분석(예를 들면, 염색체 지도작성, 조직 형별검사, 법의생물학); c) 예측의학(예를 들면, 진단분석, 예후분석, 임상시험 모니터링 및 약물유전체학에 의한 인슐린 내성 또는 제2형 당뇨병의 예측)에서 핵산 분자, PIM-3 단백질 및 단백질 동족체를 암호화하는 PIM-3의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 특히 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자에 관한 것이다.
본 발명은
a) 서열번호 5,
b) 서열번호 7,
c) 서열번호 5 또는 서열번호 7에 하이브리드화하는 DNA 서열, 및
d) a), b) 및 c)에 정의된 서열에 대한 유전자 암호의 결과로서 축퇴된, PIM-3형의 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 각각의 DNA 서열 또는 이의 일부를 포함하는 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명은
a) 아미노산 서열 서열번호 6을 갖는 폴리펩티드,
b) a)에 관하여 1개 이상의 아미노산이 결실된 폴리펩티드,
c) a)에 관하여 1개 이상의 아미노산이 상이한 아미노산으로 대체된 폴리펩티드,
d) a)에 관하여 1개 이상의 아미노산이 서열에 첨가된 폴리펩티드,
e) 서열번호 6의 모든 또는 일부 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드로부터 선택된, PIM-3 활성을 갖는 폴리펩티드에 관한 것이다. 바람직하게는, 10개 이하의 아미노산이 c)에 따라 대체된다.
본 발명은 항당뇨병 약물을 동정하기 위한 선별 제제로서의 PIM-3의 용도, 예를 들면 이러한 목적을 위한 PIM-3 활성을 갖는 PIM-3 암호화 DNA 또는 폴리펩티의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 인슐린 내성 또는 제2형 당뇨병의 치료용 약제를 제조하기 위한 PIM-3의 용도 및 인슐린 내성 또는 제2형 당뇨병을 예측하기 위한 PIM-3의 용도에 관한 것이다.
따라서 다른 세포성 단백질과 상호작용하는 PIM-3 단백질은 PIM-3 단백질을 발현하는 세포 또는 PIM-3 경로에 포함되는 세포(예를 들면, 지방세포)내에서 PIM-3 단백질 조절용 치료 분자를 개발하기 위한 표적으로서 사용될 수 있다. 본 발명의 핵산 분자는 PIM-3 단백질을 발현시키기 위해(예를 들면, 유전자 치료 적용에서 숙주 세포내의 재조합 발현 벡터를 통하여), PIM-3 mRNA(예를 들면, 생물학적 샘플내에서) 또는 PIM-3 유전자내의 유전적 병소를 검출하기 위해, 그리고 PIM-3 활성을 조절하기 위해 사용될 수 있다. PIM-3 단백질은 PIM-3 활성 또는 발현을 조절하는 약물 또는 화합물을 선별하고 PIM-3 야생형 단백질과 비교하여 감소되거나 비정상적 활성을 갖는 PIM-3 단백질 또는 PIM-3 단백질 형태의 생성물의 부족하거나과잉된 생산을 특징으로 하는 장애를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 조절자, 즉, PIM-3 단백질에 결합하거나 예를 들면, PIM-3 발현 또는 PIM-3 활성에 자극 또는 억제 효과를 갖는 후보 또는 시험 화합물 또는 시험 제제(예를 들면, 펩티드, 펩티드모방체, 소분자 또는 기타 약물)를 동정하는 방법(또한 본원에서 "선별 분석"으로 지칭됨)을 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 PIM-3 단백질 또는 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 활성 부분에 결합하거나 이의 활성을 조절하는 후보 또는 시험 화합물을 선별하기 위한 시험 화합물을 제공한다. 본 발명의 시험 화합물은 생물학적 라이브러리(library); 공간적으로 호출가능한 평행 고체상 또는 용액상 라이브러리; 탈회선(deconvolution)을 필요로 하는 합성 라이브러리 방법; "하나의 비드(bead)당 하나의 화합물" 라이브러리 방법; 및 친화 크로마토크래피 선택을 사용하는 합성 라이브러리 방법을 포함하는, 당해 분야에 공지된 조합 라이브러리 방법의 수많은 접근법 중 임의의 접근법을 사용하여 수득할 수 있다.
본 양태에서, 본 발명의 분석은 시험 화합물과 PIM-3 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분을 접촉시키고 및 시험 화합물의 PIM-3 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분과 결합하는 능력을 측정함을 포함하는 무세포 분석이다. 시험 화합물의 PIM-3 단백질에의 결합은 직접적으로 또는 간접적으로 측정될 수 있다.
다른 양태에서, 분석은 PIM-3와 결합하는 공지된 화합물과 PIM-3 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분을 접촉시켜 분석 혼합물을 형성하고, 분석 혼합물과 본 시험 화합물을 접촉시키고, 시험 화합물의 PIM-3 단백질과 상호 작용하는 능력(여기서, 시험 화합물의 PIM-3 단백질과 상호 작용하는 능력측정은 공지된 화합물에 비교하여 PIM-3 또는 이의 생물학적 활성 부분에 우선적으로 결합하는 시험 화합물의 능력을 측정함을 포함한다)을 측정함을 포함한다.
다른 양태에서, 분석은 시험 화합물과 PIM-3 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분을 접촉시키고 시험 화합물의 PIM-3 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분의 활성을 조절(예를 들면, 자극 또는 억제)하는 능력을 측정함을 포함하는 무세포 분석방법이다. 시험 화합물의 PIM-3의 활성을 조절하는 능력의 측정은 예를 들면, PIM-3 단백질의 PIM-3 표적 분자에 결합하는 능력을 측정함으로써 수행할 수 있으며, 이는 직접 결합 측정을 의미한다. 대안적 양태에서, 시험 화합물의 PIM-3의 활성을 조절하는 능력의 측정은 추가로 PIM-3 단백질의 PIM-3 표적 분자를 조절하는 능력을 측정함으로써 수행할 수 있다. 예를 들면, 적합한 기질상의 표적 분자의 촉매/효소 활성을 측정할 수 있다.
다른 양태에서, 무세포 분석은 PIM-3와 결합하는 공지된 화합물과 PIM-3 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분을 접촉시켜 분석 혼합물을 형성하고, 시험 화합물과 분석 혼합물을 접촉시키고, 시험 화합물의 PIM-3 단백질과 상호작용하는 능력을 측정(여기서, 시험 화합물의 PIM-3 단백질과 상호 작용하는 능력측정은 PIM-3 단백질의 PIM-3 표적 분자에 우선적으로 결합하거나 이의 활성을 조절하는 능력을 측정함을 포함한다)함을 포함한다.
인산화 기질의 포스포아미노산 분석은 또한 PIM-3 기질상의 잔기가 인산화되었는지를 측정하기 위해 수행할 수 있다. 간단히, 방사성인산화 단백질 밴드(band)를 SDS 겔로부터 떼어내어 부분적 산 가수분해에 적용할 수 있다. 이어서 본 생성물을 1차원 전기영동으로 분리하여 예를 들면, 인산영상기(phosphoimager)상에서 분석하고 닌하이드린-염색된 포스포아미노산 표준과 비교할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에서, 무세포 분석은 예를 들면, 시험관내 키나제 분석에 의해 PIM-3 단백질의 PIM-3 표적 분자를 인산화시키는 능력을 측정한다. 간단히, PIM-3 표적 분자, 예를 들면, 이러한 분자를 발현하는 세포주로부터 면역침전된 PIM-3 표적 분자를 PIM-3 단백질 및 방사성 ATP와 함께 항온처리할 수 있다.
다른 양태에서, 분석은 PIM-3 단백질 또는 이의 생물학적 활성 단백질의 가용성 형태를 발현하는 세포를 시험 화합물과 접촉시키고 본 시험 화합물의 PIM-3 단백질과 결합하는 능력을 측정하는 세포계 분석이다. 예를 들면, 당해 세포는 효모 세포 또는 포유동물 기원의 세포일 수 있다. 시험 화합물의 PIM-3 단백질에 결합하는 능력의 측정은 예를 들면, 방사성 동위원소 또는 효소 표지와 시험 화합물을 커플링시켜 수행할 수 있는데, 시험 화합물의 PIM-3 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분에의 결합은 예를 들면,125I,35S,14C 또는3H를 사용하거나, 예를 들면, 서양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제 또는 루시퍼라제를 사용하여 효소적으로 복합체 내의 표지된 화합물을 검출함으로써 측정할 수 있다.
다른 양태에서, 분석은 PIM-3 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분의 가용성 형태를 발현하는 세포와 시험 화합물을 접촉시키고 시험 화합물의 PIM-3 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분의 활성을 조절(예를 들면, 자극 또는 억제)하는 능력을 측정함을 포함하는 세포계 분석이다. 시험 화합물의 PIM-3 또는 이의 생물학적 활성 부분을 조절하는 능력의 측정은 예를 들면, PIM-3 표적 분자에 결합하거나 이와 상호 작용하는 PIM-3 단백질의 능력을 측정함으로써 수행할 수 있다.
본원에 사용한 바와 같이, "표적 분자"는 PIM-3 단백질과 자연적으로 결합하거나 상호작용하는 분자, 예를 들면, PIM-3 단백질을 발현하는 세포내의 PIM-3 단백질에 의해 인산화된 기질 분자, 막수용체의 세포내 도메인, 세포막의 내부 표면과 결합된 분자 또는 세포질 분자이다. PIM-3 표적 분자는 본 발명의 비(非)-PIM-3 분자 또는 PIM-3 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 한 양태에서, PIM-3 표적 분자는 신호의 전달을 매개하는 신호전달 경로의 성분이다.
본 양태에서, PIM-3 단백질의 PIM-3 표적 분자에 결합하거나 상호작용하는 능력의 측정은 표적 분자의 활성을 측정함으로써 수행할 수 있다. 예를 들면, 표적 분자의 활성은 표적의 세포성 제2 전달자(예를 들면, 세포내 Ca2+, 디아실글리세롤, IP3 등)의 유도를 검출하고, 적합한 기질상의 표적의 촉매/효소 활성을 검출하고, 리포터 유전자(예를 들면, 검출가능한 마커, 예를 들면 루시퍼라제를 암호화하는 핵산과 작동 가능하게 연결된 PIM-3-반응 조절 요소)의 유도를 검출하거나, 세포반응, 예를 들면, 세포분화 또는 세포증식을 검출함으로써 측정할 수 있다.
본 발명의 분석의 각종 형식에서, PIM-3 또는 이의 표적 분자를 고정시켜 하나 또는 둘다의 단백질의 비복합된 형태로부터 복합된 형태의 분리를 촉진시키기고, 본 분석의 자동화를 조절하는 것이 바람직할 수 있다. 시험 화합물의 PIM-3에의 결합, 또는 후보 화합물의 존재 및 부재하에 표적 분자와 PIM-3의 상호작용은 반응물을 함유하기에 적합한 특정한 용기에서 수행할 수 있다. 이러한 용기의 예는 미세적정 플레이트, 실험 튜브 및 미세-원심분리 튜브를 포함한다. 한 양태에서, 융합 단백질은 하나 또는 둘다의 단백질을 매트릭스에 결합시키는 도메인을 첨가함으로써 수득할 수 있다. 예를 들면, 글루타티온-S-트랜스퍼라제/PIM-3 융합 단백질 또는 글루타티온-S-트랜스퍼라제/표적 융합 단백질은 글루타티온 세파로스 비드 또는 글루타티온 유도된 미세적정 플레이트 상에 흡착시킬 수 있으며, 이어서 이를 시험 화합물과 화합시키거나 시험 화합물 및 비-흡착 표적 단백질 또는 PIM-3 단백질과 화합시키고, 본 혼합물을 착물 형성에 기여하는 조건하에(예를 들면, 염 및 pH에 대한 생리학적 조건에서) 항온처리한다. 항온처리 후, 비드 또는 미세적정 플레이트 웰(well)을 세척하여 임의의 비결합 성분을 제거하고 복합체 형성을 직접적 또는 간접적으로 측정한다. 대안적으로, 본 복합체를 매트릭스로부터 분리하고, 표준 기법을 사용하여 PIM-3 결합 또는 활성 수준을 측정할 수 있다. 매트릭스에 단백질을 고정시키기 위한 다른 기법 또한 본 발명의 선별 분석에 사용할 수 있다. 예를 들면, PIM-3 또는 이의 표적 분자를 비오틴 및 스트렙타비딘의 접합을 사용하여 고정시킬 수 있다. 비오티닐화된 PIM-3 또는 표적 분자를 당해 분야에 공지된 기법을 사용하여 비오틴-NHS (N-하이드록시-석신이미드)로부터 제조할 수 있다. 대안적으로, PIM-3 또는 표적 분자와 반응하지만 PIM-3 단백질의 이의 표적 분자로의 결합을 방해하지는 않는 항체를 플레이트의 웰에 유도할 수 있고, 비결합 표적 또는 PIM-3를 항체 접합에 의해 웰내에 가둘 수 있다. GST-고정 복합체에 대한 상기한 방법 외에, 이러한 복합체의 검출방법은 PIM-3 또는 표적 분자와 반응하는 항체를 사용하는 복합체의 면역검출과, PIM-3 또는 표적 분자에 관련된 효소 활성의 검출에 의존하는 효소-관련 분석을 포함한다.
다른 양태에서, PIM-3 발현의 조절자는 세포를 후보 화합물과 접촉시키고 세포내의 PIM-3 mRNA 또는 단백질의 발현을 측정하는 방법으로 동정한다. 후보 화합물의 존재하의 PIM-3 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 후보 화합물의 부재하의 PIM-3 mRNA 또는 단백질의 발현 수준과 비교한다. 이어서 후보 화합물을 이러한 비교를 토대로 PIM-3 발현의 조절자로서 동정할 수 있다. 예를 들면, PIM-3 mRNA 또는 단백질의 발현이 후보 화합물의 부재하에서보다 존재하에 더 클 경우(통계적으로 현저하게 큰), 후보 화합물을 PIM-3 mRNA 또는 단백질 발현의 자극자로서 동정할 수 있다. 대안적으로, PIM-3 mRNA 또는 단백질의 발현이 후보 화합물의 부재하에서보다 존재하에 더 작을 경우(통계적으로 현저하게 작은), 후보 화합물은 PIM-3 mRNA 또는 단백질 발현의 억제제로서 동정할 수 있다. 세포내의 PIM-3 mRNA 또는 단백질 발현의 수준은 본원에 기술한 PIM-3 mRNA 또는 단백질을 검출하기 위한 방법에 의해 측정할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서, PIM-3 단백질 또는 이의 폴리펩티드는 2-하이브리드 분석 또는 3-하이브리드 분석에서 PIM-3에 결합하거나 이와 상호작용하고 ("PIM-3-결합 단백질" 또는 "PIM-3-bp") PIM-3 활성을 조절하는 다른 단백질을 동정하기 위해, "미끼 단백질"로 사용할 수 있다. 이러한 PIM-3-결합 단백질은 또한 PIM-3 단백질에 의한 신호 전달, 예를 들면 PIM-3 경로의 업스트림(upstream) 또는다운스트림(downstream) 요소로서 포함되는 경향이 있다. 또한 본 발명은 PIM-3와 상호 작용하는 단백질, 예를 들면, 2-하이브리드 선별 및 PIM-3 상호작용 단백질과 상호 작용하는 단백질의 동정에서 미끼로서의, PIM-3와의 2-하이브리드의 상호 작용자의 용도를 제공한다. PIM-3 상호작용 단백질과 상호 작용하는 단백질은 PIM-3 신호 전달 경로에 포함되는 경향이 있다.
또한 본 발명은 진단분석, 예후분석, 약물유전체학 및 임상시험 모니터링이 이에 따라, 예방적으로 개체를 치료하기 위한 예후(예측) 목적으로 사용되는 예측의학의 분야를 제공한다. 따라서, 본 발명의 한 측면은 생물학적 샘플(예를 들면, 개체, 바람직하게는 사람으로부터의 혈액, 혈청, 세포, 조직)의 측면에서 PIM-3 단백질 및/또는 핵산 발현과 PIM-3 활성을 측정함으로써, 개체가 비정상적 PIM-3 발현 또는 활성에 관련된 질환 또는 장애에 걸렸는지, 장애의 발달의 위험이 있는지를 측정하는 진단 분석에 관한 것이다. 본 발명은 또한 개체가 PIM-3 단백질, 핵산 발현 또는 활성에 관련된 장애의 발달 위험에 있는지를 측정하기 위한 진단(또는 예측) 분석을 제공한다. 예를 들면, PIM-3 유전자내의 돌연변이는 생물학적 샘플에서 분석할 수 있다. 이러한 분석은 PIM-3 단백질, 핵산 발현 또는 활성을 특징으로 하거나 이와 관련된 장애의 발병 전에 개체를 이에 따라 예방적으로 치료하기 위한 진단 또는 예측 목적으로 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 개체의 생물학적 샘플 내에서의 PIM-3 단백질, 핵산 발현 또는 PIM-3 활성을 측정하여 상기 개체에 적합한 치료 또는 예방 제제를 이에 따라 선택하기 위한 방법을 제공한다(본원에서 "약물유전체학"으로 지칭됨). 약물유전체학은 개체의 유전자형을 기준으로 하여 개체의 치료 또는 예방적 치료용 제제(예를 들면, 약물)의 선택을 허용한다(예를 들면, 특정 제제에 반응하는 개체의 능력을 측정하기 위해 개체의 유전자형을 조사한다).
본 발명의 다른 측면은 임상 시험에서 PIM-3의 발현 또는 활성에 대한 제제(예를 들면, 약물 또는 기타 화합물)의 영향을 모니터링하는 방법을 제공한다.
생물학적 샘플 내의 PIM-3의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 대표적 방법은 실험 대상으로부터 생물학적 샘플을 수득하고 생물학적 샘플과 PIM-3 단백질을 암호화하는 PIM-3 단백질 또는 핵산(예를 들면, mRNA, 유전자 DNA)를 검출할 수 있는 화합물 또는 제제를 접촉시켜 PIM-3의 존재를 생물학적 샘플 내에서 검출함을 포함한다. PIM-3 mRNA 또는 유전자 DNA 검출용 제제는 PIM-3 mRNA 또는 유전자 DNA에 하이브리드화할 수 있는 표지된 핵산 프로브(probe)일 수 있다.
PIM-3 단백질 검출용 제제는 PIM-3 단백질에 결합할 수 있는 항체, 바람직하게는 검출 가능한 표지를 가진 항체일 수 있다. 항체는 폴리클로날, 또는 보다 바람직하게는, 모노클로날일 수 있다. 완전한 항체, 또는 이의 단편(예를 들면, Fab 또는 F(ab')2)를 사용할 수 있다.
용어 "생물학적 샘플"은 개체로부터 분리된 조직, 세포 및 체액과 개체 내에 존재하는 조직, 세포 및 체액을 포함한다. 즉, 본 발명의 검출 방법은 예를 들면, 시험관 내 및 생체 내에서, 생물학적 샘플 내의 PIM-3 mRNA, 단백질 또는 유전자 DNA를 검출하기 위해 사용할 수 있다. 한 양태에서, 생물학적 샘플은 실험 대상으로부터의 단백질 분자를 함유한다. 대안적으로, 생물학적 샘플은 실험 대상으로부터의 mRNA 분자 또는 실험 대상으로부터의 유전자 DNA 분자를 함유할 수 있다. 생물학적 샘플은 예를 들면, 대상으로부터 통상적인 방법으로 분리한 지방 조직으로부터의 생체 검사물이다.
다른 양태에서, 본 방법은 추가로 대조 대상으로부터 대조 생물학적 샘플을 수득하고, 대조 샘플과 PIM-3 단백질, mRNA 또는 유전자 DNA를 검출할 수 있는 화합물 또는 제제를 접촉시켜, PIM-3 단백질, mRNA 또는 유전자 DNA의 존재를 생물학적 샘플 내에서 검출하고, 대조 샘플 내의 PIM-3 단백질, mRNA 또는 유전자 DNA의 존재와 실험 샘플 내의 PIM-3 단백질, mRNA 또는 유전자 DNA의 존재를 비교함을 포함한다.
본 발명은 또한 생물학적 샘플(실험 샘플)내의 PIM-3의 존재를 검출하기 위한 킷트(kit)를 포함한다. 이러한 킷트는 개체가 인슐린 내성 또는 제2형 당뇨병과 관련된 장애에 걸렸는지 이의 발달 위험이 증가되었는지 측정하는 데 사용될 수 있다. 예를 들면, 킷트는 생물학적 샘플 내의 PIM-3 단백질 또는 mRNA를 검출할 수 있는 표지된 화합물 또는 제제 및 샘플 내의 PIM-3의 양을 측정하기 위한 수단(예를 들면, 항-PIM-3 항체 또는 PIM-3를 암호화하는 DNA, 예를 들면, 서열번호: 1, 서열번호: 3, 서열번호: 5 또는 서열번호: 7에 결합하는 올리고뉴클레오티드 프로브)을 포함할 수 있다.
본원에 기술한 방법은 추가로 비정상 PIM-3 발현 또는 활성과 관련된 질환 또는 장애를 갖거나 이의 발달 위험에 있는 대상을 동정하기 위한 진단 또는 예후분석으로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 전술한 진단 분석 또는 후술한 분석과 같은 본원에 기술한 분석은 인슐린 내성 또는 제2형 당뇨병을 갖거나 이의 발달 위험에 있는 대상을 동정하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 PIM-3 단백질 또는 핵산(예를 들면, mRNA, 유전자 DNA)을 개체로부터의 시험 샘플로부터 검출하는 방법을 제공하며, 여기서 PIM-3 단백질 또는 핵산의 존재는 비정상 PIM-3 발현 또는 활성과 관련된 질환 또는 장애를 갖거나 이의 발달 위험이 있는 개체에 대한 진단증상이다. 본원에 사용한 바와 같이, "실험 샘플"은 관심의 대상으로부터 수득한 생물학적 샘플을 지칭한다. 예를 들면, 실험 샘플은 체액(예를 들면, 혈청), 세포 샘플 또는 조직일 수 있다.
추가로, 예후 분석은 대상에 인슐린 내성 또는 제2형 당뇨병을 치료하기 위해 제제(예를 들면, 효능제, 길항제, 펩티드모방체, 단백질, 펩티드, 핵산, 소분자 또는 기타 약물 후보)의 투여 여부를 결정하기 위해 사용할 수 있다. 예를 들면, 이러한 방법은 대상이 특정 제제 또는 특정 부류의 제제(예를 들면, PIM-3 활성을 감소시키는 유형의 제제)로 효과적으로 치료될 수 있는지를 결정하기 위해 사용할 수 있다.
선별 분석에 의해 동정된 것으로서 PIM-3 활성(예를 들면, PIM-3 유전자 발현)에 자극 또는 억제 효과를 갖는 제제, 또는 조절자를 비정상 PIM-3 활성과 관련된 장애(예를 들면, 지방세포와 같은, PIM-3가 발현된 세포 또는 조직을 포함하는 장애)의 처리(예방적 또는 치료적으로)용으로 유용한 약제를 제조하기 위해 사용할 수 있다. 이러한 치료와 함께, 개체의 약물유전체학(즉, 개체의 유전자형과 외부화합물 또는 약물에 대한 개체의 반응사이의 관계에 대한 연구)을 고려할 수 있다. 치료의 대사에서의 상이점은 약리학적 활성 약물의 용량 및 혈중 농도사이의 관계를 변화시킴으로써 심각한 독성 또는 치료 실패를 초래할 수 있다. 따라서, 개체의 약물유전체학은 개체의 유전자형에 대한 고려를 토대로 한 예방 또는 치료적 처리를 위해 효과적인 제제(예를 들면, 약물)를 선별하도록 한다. 추가로 이러한 약물유전체학은 적합한 용량 및 치료 섭생을 결정하는 데 사용할 수 있다. 따라서, 개체의 치료 또는 예방적 처리를 위해 적합한 제제(들)을 이에 따라 선별하기 위해 개체 내에서의 PIM-3 단백질의 활성, PIM-3 핵산의 발현 또는 PIM-3 유전자의 돌연변이 함량을 측정할 수 있다.
PIM-3의 발현 또는 활성에 대한 제제(예를 들면, 약물, 화합물)의 영향을 모니터링(예를 들면, 비정상 세포 증식 및/또는 분화를 조절하는 능력)하는 것은 기본 약물 선별 뿐 아니라, 임상 시험에도 적용할 수 있다.
PIM-3 단백질 활성을 조절하는 항 제2형 당뇨병제는 소분자(예를 들면, PIM-3, 핵산 또는 단백질, PIM-3 단백질의 천연발생적 동종 리간드, 펩티드 또는 PIM-3 펩티드모방체의 단백질 키나제 활성을 조절하는 소분자)와 같은 제제를 사용할 수 있다. 한 양태에서, 본 제제는 PIM-3 단백질의 하나 이상의 생물학적 활성을 자극한다. 이러한 자극제의 예는 PIM-3의 하나 이상의 활성, 예를 들면, PIM-3 단백질 키나제 활성, 활성 PIM-3 단백질 및 세포 내에 도입된 PIM-3를 암호화하는 핵산 분자를 자극하는 소분자를 포함한다. 다른 양태에서, 본 제제는 PIM-3 단백질의 하나 이상의 생물학적 활성을 억제한다. 이러한 억제제의 예는 하나 이상의 PIM-3활성, 예를 들면, PIM-3 단백질 키나제 활성, 안티센스 PIM-3 핵산 분자 및 항-PIM-3 항체를 억제하는 소분자를 포함한다.
본 발명은 추가로 제한적으로 해석되지 않아야 하는 다음의 실시예에 의해 예시된다. 본 출원에 언급한 모든 참조, 특허 및 공개 특허출원은 본원에 참조로써 인용된다.
실시예 1
사람 및 쥐 PIM-3의 뉴클레오티드 서열의 측정
래트 PIM-3 뉴클레오티드 서열(AF057026, NM_022602, 서열번호 9)를 블로섬(BLOSUM)62 매트릭스를 갖는 블라스튼(BLASTN) 프로그램을 사용하는 독점 데이타베이스를 조회하기 위해 사용하였다. 본 독점 데이타베이스는 표준 클로닝 벡터내에 작제된 독점 cDNA 라이브러리를 기준으로 한다. 본 블라스튼에 의해 동정된 가장 밀접하게 연관된 cDNA를 서열화하였다. 본 cDNA 서열은 콘티그(contig)로 조합할 수 있다. 사람 PIM-3 서열은 이러한 콘티그의 컨센서스 서열로부터 결정되었고, 이러한 콘티그의 추가의 분석으로 길이 1977bp의 cDNA 서열이 나타났다. 본 사람 PIM-3 cDNA는 신규한 326개 아미노산 단백질을 암호화하는 것으로 추론되는 978개 염기쌍 개방형 판독 프레임을 함유한다.
래트 PIM-3 뉴클레오티드 서열은 또한 블로섬62 매트릭스를 갖는 블라스튼 프로그램을 사용하는 공공의 유니진 마우스(UNIGENE Mouse) 데이타베이스를 조회하기 위해 사용하였다. 몇몇 밀관된 EST 서열을 본 블라스튼에 의해 동정하였다. 본 ESTs의 서열 정보는 Gene Trapper II Technology(제조사: Life Technologies, Karlsruhe, Germany)사용하여 작제된 마우스 배아 cDNA 라이브러리를 선별하기 위해 사용하였다. cDNA 클론을 서열화하였고, 본 cDNA 서열을 콘티그로 조합하였다. 쥐 PIM-3 서열은 이러한 콘티그의 컨센서스 서열로부터 결정되었고, 이러한 콘티그의 추가의 분석 및 인트론 서열의 배제로 길이 2236bp의 cDNA 서열이 나타났다. 본 쥐 PIM-3 cDNA는 신규한 326개 아미노산 단백질을 암호화하는 것으로 추론되는 978개 염기쌍 개방형 판독 프레임을 함유한다.
실시예 2
사람 및 쥐 PIM-3 단백질의 특징 결정
본 실시예에서, 사람 PIM-3 및 쥐 PIM-3 단백질의 추론된 아미노산 서열을 단백질에 존재하는 공지된 모티프 및/또는 도메인의 아미노산 서열 및 공지된 단백질의 폴리펩티드 서열과 비교하였다. 사람 PIM-3 및 쥐 PIM-3에 존재하는 폴리펩티드 도메인 및/또는 모티프가 사람 PIM-3 및 쥐 PIM-3와 유사한 중요한 아미노산을 갖는 단백질인 것으로 동정되었다. 또한, 사람 PIM-3 및 쥐 PIM-3 단백질의 분자량을 예측하였다.
상기한 바와 같이 동정된 사람 및 쥐 뉴클레오티드 서열(서열번호 1; 서열번호 5)은 326개 아미노산 단백질(서열번호 2 및 서열번호 6)을 암호화한다. 사람 및 쥐 PIM-3는 각각, 약 35.9kDa의 예측된 MW를 가지며, 암호해독후 변형을 포함하지 않는다. 잠정적 키나제 활성 및 가능한 암호해독후 변형 위치에 대한 증거를 확인하기 위해, 서열번호 2 및 서열번호 6의 사람 및 쥐 폴리펩티드 서열 각각을 단백질 패턴의 프로사이트(PROSITE) 데이타베이스 및 임팔라(IMPALA) 및 피팜(PFAM)을 사용하여 분석하였다.
프로사이트 데이타베이스의 조사는 서열번호 2 및 서열번호 6의 아미노산 260-263으로부터 1개의 cAMP 및 cGMP 의존성 단백질 키나제 인산화 위치; 서열번호 2의 아미노산 202-205, 211-214 및 321-324로부터의 3개의 카세인 키나제 II 인산화 위치 및 서열번호 6의 아미노산 202-205, 211-214, 299-302 및 321-324로부터의 4개의 카세인 키나제 II 인산화 위치; 서열번호 2 및 서열번호 6의 아미노산 43-48, 49-54, 52-57, 57-62, 63-68, 80-85, 98-103, 101-106, 295-300 및 316-321로부터의 10개의 N-미리스토일화 위치; 서열번호 2 및 서열번호 6의 아미노산 137-139, 275-277 및 279-281로부터의 3개의 단백질 키나제 C 인산화 위치; 서열번호 2 및 서열번호 6의 아미노산 33-40으로부터의 1개의 타이로신 키나제 인산화 위치; 서열번호 2 및 서열번호 6의 아미노산 46-69로부터의 1개의 단백질 키나제 기호 및 프로필(ATP 결합 위치); 서열번호 2 및 서열번호 6의 아미노산 166-178로부터의 1개의 세린/트레오닌 단백질 키나제 활성 위치 기호의 존재를 나타냈다. 임팔라를 사용한 조사는 각각, 186비트의 스코어와 8e-49의 기대값 및 184비트의 스코어와 4e-48의 기대값으로, 서열번호 2 및 서열번호 6의 아미노산 40-293(각각, 서열번호 4 및 서열번호 8)으로부터의 1개의 진핵 단백질 키나제 도메인의 존재를 나타냈다. 피팜을 사용한 조사 또한 각각, 262.5의 스코어와 5.7e-75의 기대값 및 261.1비트의 스코어와 1.5e-74의 기대값으로 서열번호 2 및 서열번호 6의 아미노산 40-293으로부터의 1개의 진핵 단백질 키나제 도메인의 존재를 나타냈다.
사람, 쥐 및 래트 PIM-3 폴리펩티드 서열(서열번호 2, 서열번호 6 및 서열번호 10)은 단백질 중량 매트릭스로서 블로섬을 사용하는 한쌍의 와이즈 클루스탈 더블류 배열 분석(wise Clustal W alignment analysis)으로 배열된다. 이에 따라, 사람 PIM-3는 2011의 스코어로 쥐 및 래트 PIM-3(AF057026, NM_022602, 서열번호 10)와 95% 동일하고, 쥐 PIM-3는 2074의 스코어로 래트 PIM-3(AF057026, NM_022602, 서열번호 10)과 99% 동일함이 밝혀졌다.
또한 서열번호 2 및 서열번호 6의 사람 및 쥐 PIM-3 폴리펩티드 서열을 블로섬62 매트릭스를 갖는 블라스트피(BLASTP) 프로그램을 사용하는 단백질 서열의 스위스프롯(Swissprot) 데이타베이스를 조회하기 위해 사용하였다. 본 블라스트피 분석에 의해 동정된 사람 및 쥐 PIM-3에 가장 밀접하게 연관된 4개의 단백질을 열거한다: 사람 및 쥐 PIM-3는 518의 스코어로 제노푸스 라에비스{Xenopus laevis(개구리)} PIM-1(Q91822; 서열번호 11)과 76% 동일하고, 점수 442의 스코어로 래트 PIM-1(P26794; 서열번호 12)과 72% 동일하고, 441의 스코어로 사람 PIM-1(P11309; 서열번호 13)과 71% 동일하며 각각, 436 및 438의 스코어로 쥐 PIM-1(P06803; 서열번호 14)와 71% 동일함이 밝혀졌다.
실시예 3:
인슐린 내성 및 제2형 당뇨병의 생체 내 모델에서 PIM-3의 유전자 발현
주커 당뇨병성 비만{Zucker diabetic fatty(ZDF)} 래트는 렙틴 수용체 파(fa) 유전자내에 동질접합 결손을 수반하는 공지된 동물 모델이다. 이러한 래트종은 명백한 제2형 당뇨병/고혈당 상태에 대한 진행보다 인슐린 내성/과인슐린 상태를 연령 의존적으로 발달시킨다. 발현이 유도되거나 억제되어 인슐린 내성 또는 제2형 당뇨병의 발달에 기여하거나 이를 방해할 수 있는 유전자를 동정하기 위해, ZDF 래트의 유전자 발현 프로필 및 이들의 마른 이형접합 대조 한배 배우자(littermate)를 프로파일링 기법에 기초한 올리고뉴클레오티드 배열을 사용하여 수집하였다.
물질 및 방법:
생후 6, 8 및 13주의 주커 당뇨병성 비만(ZDF/Gmi.TM.-fa/fa) 수컷 래트와 건강한 대조군으로 사용된 이들의 마른 수컷 fa+/fa- 대조 래트를 제네틱 모델스 인코포레이티드{Genetic Models Inc.(Indianapolis, IND., US)}로부터 입수했다.
본 동물을 연구에 포함시키기 전에 이들을 표준 동물 거주 환경 하에 1주일 동안 두었다. 부고환 지방 조직 및 혈액 샘플을 수집하기 위해 본 동물을 경추탈골에 의해 치사시켰다. 연령 그룹당 6마리의 ZDF 래트 및 6마리의 마른 fa+/fa- 한배 배우자를 하기한 바와 같이 유전자 발현 분석을 위해 사용하였다.
조직 수집 및 RNA 분리:
경추탈골시킨 후, 부고환 지방 패드를 외과적으로 제거하고, 분할하여 충분한 용적의 RNA(제조사: Ambion, TX, US)를 함유하는 적합한 튜브내로 신속하게 옮겼다. 각각의 동물로부터의 샘플을 개별적으로 저장했다. 본 샘플의 장기 저장은 -80℃에서 수행하였다.
총 세포 RNA를 지방 조직으로부터의 RNA 분리에 대한 제조사 지침에 따라 에르엔이지 미니 킷트{Rneasy Mini kit(제조사: Qiagen, Hilden, Germany)}을 사용하여 지방 조직으로부터 추출하였다. RNA를 RNase 비함유 물 50㎕로 2회 용출시키고, RNA 농도를 분광학적으로 측정하였다(A260).
추가의 정제를 위해, RNA 용액을 RNase 비함유 물로 총 용적 100㎕까지 채웠다. 퀴아젠 에르엔이지 미니 킷트를 사용하여 제조사 지침에 따라 RNA 제거를 수행하였다. RNA를 RNase 비함유 물 50㎕로 2회 용출시키고, RNA 농도를 분광학적으로 측정하였다(A260).
RNA 용출액의 농축을 위해, NH4아세테이트 및 에탄올을 첨가하고, RNA를 에탄올-무수 빙욕에서 밤새 침전시켰다. RNA를 4℃에서 최대 속도로 원심분리하여 수거하였다. 펠렛화된 RNA를 80% 에탄올로 2회 세척하고, 공기 건조시키고 소량의 RNase 비함유 물에 용해시켰다. RNase 농도를 분광학적으로 측정하였다(A260).
유전자 발현 프로파일링:
유전자 발현 모니터링을 위한 올리고뉴클레오티드 배열의 일반적 용도가 US 제6,177,248호에 기술되어 있다. 관용적 적용에서, 사용된 미세배열은 대략 8000개의 공지된 유전자 또는 EST 집단을 나타내는 데옥시뉴클레오티드 서열을 함유한다. 각각의 유전자 또는 EST 서열은 최대 20쌍의 올리고뉴클레오티드(각 쌍은 전사체의 단편에 매치되는 1개의 올리고로 이루어진다) 및 중앙에 위치한 1bp 미스매치를 함유하는 대조 올리고에 의해 나타내어진다. 래트에 대한, 공지된 유전자 또는 EST 서열의 데이타베이스로부터 유도된, 총 약 24000개의 유전자 및 EST 서열을 나타내는 3개의 배열(RG U34A, RG U34B 및 RG U34C)는 제조사[Affymetrix, Santa Clara, CA, US]에 의해 제공된다.
하이브리드화를 위한 cRNA 침전:
상기한 바와 같이 부고환 지방으로부터 RNA를 수득하였다. T7 프로모터 위치를 함유하는 올리고 dT 프라이머를 총 세포 RNA(10.mu.g)+-에 첨가하였다. 프라이머를 어닐링시킨 후, 제조사 지침에 따라, RNA를 슈퍼스크립트(Superscript) 선택 역전사효소를 사용하여 연속적으로 역전사시켰다. 상고정 겔 튜브{phase lock gel tube(에펜도르프, 독일 함부르크 소재)}를 사용하여, 페놀:클로로포름:이소아밀알코올로 추출하고, 에탄올 침전시킨 후, cDNA를 원심분리로 수집하고 80% 에탄올로 2회 세척하였다. 펠렛을 RNase 비함유 물에 용해시키고 제조사 지침에 따라 엔조 고수율 표지 전사 킷트{Enzo High Yield labelling transcription(제조사: Enzo Diagnostics, Farmingdale NY, US)} 또는 메가스크립트(MEGAscript) T7 고수율 전사 킷트(제조사: Ambion, Austin, TX, US)를 사용하여 비오티닐화된 cRNA로 전사시켰다. 후자의 적용을 위해, 비오틴 표지된 UTP 및 CTP(제조사: Sigma,Munich, Germany)와 비표지된 ATP 및 GTP를 1:3(표지 대 비표지)의 몰비율로 사용하였다. 이어서 상기한 바와 같이 cRNA를 침전시키고 세척하였다. 마지막으로, 침전시키고, 공기 건조시킨 cRNA를 작은 용적의 RNase 비함유 물에 용해시켰다. RNA 농도를 분광학적으로 측정하였고(A260), 아가로스 겔 전기영동에 의해 크기 분포를 확인하였다. 이어서, cRNA를 94℃에서 40mM 트리스-아세테이트 pH 8.1, 100mM 칼륨 아세테이트, 30mM 마그네슘 아세테이트내에서 25분 동안 항온처리하여 길이 50뉴클레오티드의 평균 크기로 가수분해하였다. 아피메트릭스의 지침에 따라 하이브리드화 칵테일을 제조하기 위해 분획된 cRNA 20㎍을 사용하였다. 하이브리드화 전에, RNA 샘플을 하이브리드화 칵테일 내에서 99℃로 10분 동안 가열하고, 5분 동안 얼음 위에 두고, 하이브리드화 유동 세포 내에 두기 전에 실온에서 평형을 유지시켰다. 이어서 하이드리드화 칵테일을 하이브리드화 오븐에서 밤새 45℃ 및 60rpm에서 미세배열로 하이브리드화시켰다. 하이브리드화 후, 하이브리드화 칵테일을 제거하고 추가의 사용을 위해 -80℃에서 저장하였다. 본 배열을 세척하고 제조사 지침에 따라 피코에리트린-스텝타비딘-항체 증폭 프로토콜 EukWS2를 사용하여 아피메트릭스 유체 산지에서 염색하였다. 휴렛 팩카드사의 아피메트릭스{Hewlett Packard (Affymetrix, Santa Clara, CA, US로부터 상업적으로 수득가능)를 위해 제조된 주사 공초점 현미경을 사용하여 데이타를 수집하였다. 본 영상주사기는 자극원으로서 530nm 밴드패스 필터(플루오레세인) 또는 560nm 롱패스 필터(피코에리트린)를 통해 광전자증배관에 의해 검출되는 방사를 갖는, 아르곤 이온 레이저를 사용한다.
하이브리드화 패턴 및 강도의 정량 분석
배열의 정량적 주사 후, 마커로서 공지된 차원의 배열 및 코너 대조 영역을 사용하여 영상에 격자를 배열시킨다. 본 영상을 아피메트릭스에서 개발한 소프트웨어(공초점 주사영상기와 함께 사용할 수 있는)를 사용하여 위치 및 강도 정보를 포함하는 간단한 문서 파일로 축소한다. 이러한 정보를 서열을 규명하기 위한 배열상의 물리적 위치 및 올리고뉴클레오티드 프로브가 설계된 RNA(및 RNA의 특정 부분)의 정체와 관련된 정보를 포함하는 다른 문서 파일과 병합시킨다. 하이브리드화 결과의 정량 분석은 특정 RNA의 존재하에, PM(PM은 US 제6,177,248호에서 "완벽한 매치"를 의미한다) 프로브가 이들의 MM(MM은 US 제6,177,248호에서 "미스매치"를 의미한다) 파트너보다 평균적으로 보다 강하게 하이브리드화할 것이다라는 가정에 기초한, 간단한 형태의 패턴 인식을 포함한다. PM 하이브리드화 신호가 MM 신호보다 큰 경우의 수를 각각의 프로브 셋트에 대한 PM/MM 비율의 대수의 평균과 함께 계산한다. 이들 값은 RNA의 존재 또는 부재와 관련지어 결정(미리 정해진 결정 매트릭스를 사용)하는 데 사용된다. 정량적 RNA 양을 측정하기 위해, 각 프로브계에 대한 평균 차이(PM - MM)을 계산하였다. 차이 방법의 이점은 특정 하이브리드화는 PM 프로브에 보다 많이 기여하는 반면, 임의의 교차-하이브리드화로부터의 신호가 PM 및 MM 프로브에 평균적으로, 동등하게 기여한다는 것이다. 쌍별 차이의 평균화에 의해, 교차-하이브리드화가 형성하는 기여가 취소되는 경향이 있는 동안실제 신호를 추정적으로 첨가한다. 2개의 상이한 RNA 샘플사이의 차이를 평가할 시, 동일하게 합성된 배열상의 나란한 실험으로부터의 하이브리드화 신호를 직접적으로 비교한다. 평균 차이(PM-MM)값의 변화의 크기를 첨가 실험 및 각각의 샘플내에 공지된 양으로 첨가된 내부 표준 박테리아 및 파지 RNA에 대해 관측된 신호의 결과를 비교함으로써 해석한다. 데이타 분석 프로그램은 이들 공정을 자동적으로 수행하는 아피메트릭스에서 개발되었다.
ZDF 래트, 7주생
비교 ZDF # 1대대조군 #1 ZDF # 2대대조군 #2 ZDF # 3대대조군 #3 ZDF # 4대대조군 #4 ZDF # 5대대조군 #5
변화량 -4.3 -4.8 -3.1 -5.3 -4.6
ZDF 래트, 9주생
비교 ZDF 7대대조군 #7 ZDF 8대대조군 #8 ZDF 9대대조군 #9 ZDF 10대대조군 #10 ZDF 11대대조군 #11
변화량 -5.4 -3.3 -2.9 -1.7 -1.3
ZDF 래트, 14주생
비교 ZDF 13대대조군 #13 ZDF 14대대조군 #14 ZDF 15대대조군 #15 ZDF 16대대조군 #16 ZDF 17대대조군 #17
변화량 1 -1.7 -3.0 -2.4 -1.7
실시예 4: 인슐린 내성의 시험관 내 모델에서 PIM-3의 유전자 발현
지방세포를 160-180g 수컷 스프라규 다울리(Sprague Dawley) 래트의 부고환지방 패드로부터 분리하고 기술한 바와 같이 항온처리하였다[참조: Muller, G. and Wied, S. Diabetes(1993) 42:1852-1867]. 간단히, 지방세포를 20마리의 수컷 래트의 집합된 부고환 지방으로부터 분리하였다. 분리된 지방세포를 2개의 풀(pool)로 나누었다. 하나의 풀은 25mM D-글루코스와 10nM 인슐린을 함유하는 배지 내에서 5시간 동안 세포를 항온처리하여 인슐린 내성체를 만들었다.
제2 풀은 5mM D-글루코스를 함유하는 배지내에서 5시간 동안 항온처리하여, 세포를 인슐린 민감성 상태로 유지시켰다. 항온처리 후에 기술한 바와 같은 2개의 풀의 분취액으로 인슐린 의존성 글루코스 섭취를 측정하여 인슐린 민감성 및 인슐린 내성을 확인하였다[참조: Muller, G. and Wied, S. Diabetes(1993) 42: 1852-1867]. 대부분의 지방세포는 실시예 3에 기술한 바와 같이 RNA 분리용으로 사용하였다.
이어서 RNA를 실시예 3에 기술한 바와 같이 아피메트릭스 기법을 사용하여 유전자 발현 모니터링에 사용하였다. 아피메트릭스 정량기(qualifier) AF086624_S_AT를 사용하여 PIM-3에 대한 유전자 발현의 변화량을 분석하였다. 이러한 분석의 결과는 표 4에 요약되어 있다:
5시간 항온처리한 시험관 내 인슐린 내성 지방세포
비교 내성체 1 대대조군 1 내성체 2 대대조군 2 내성체 3 대대조군 3 내성체 4 대대조군 4 내성체 5 대대조군 5
변화량 -2.4 -2.7 -4.0 -2.1 -2.4
실험 5: 항당뇨병 약물(PPARγ 효능제)로 처리한 3T3-L1 지방세포 내의 PIM-3의 유전자 발현
물질 및 방법:
3T3-L1 전구지방세포를 글루코스 1g/l 및 10% 소태아혈청(FCS)를 함유하는 둘베코 개질된 이글배지{Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)} 중 10% CO2내에서 37℃에서 배양하였다. 성숙한 지방세포로 분화시키기 위해, 융합성 전구지방세포를 글루코스 4.5g/l, 10% FCS, 아스코르브산 50㎍/㎖, 비오틴 1μM, 판토텐산 17μM(= 기본배지), 3-이소부틸메틸크산틴 500μM, 덱사메타손 0.25μM 및 사람 재조합 인슐린 1㎍/㎖를 공급한 DMEM내에서 4일 동안 배양하였다. 처리하는 4일 동안 배지를 1회 교환하였다. 마지막으로, 3T3-L1 세포를 1㎍/㎖ 인슐린을 함유하는 기본배지로 3일 동안 처리하였고, 그 결과 약 90%의 세포가 지방세포로 전환되었다.
분화된 3T3-L1 세포를 추가로 1일 동안 기본 배지내에서 유지시켰고 이어서 4시간 동안 무혈청 기본배지 내에 유지시켰다. 이어서, 기본배지 내에서 희석시킨 PPARγ 효능제를 하기한 바와 같이 지방세포에 첨가하였다(농도 및 조건은 표 5를 참조한다):
프로브 번호 화합물* 농도 처리 기간
1 로시글리타존 1μM 6시간
2 로시글리타존 5μM 6시간
3 트로글리타존 1μM 6시간
4 트로글리타존 5μM 6시간
5 DMSO 대조군 0.02% (v/v) 6시간
6 로시글리타존 1μM 24시간
7 로시글리타존 5μM 24시간
8 트로글리타존 1μM 24시간
9 트로글리타존 5μM 24시간
10 DMSO 대조군 0.02% (v/v) 24시간
11 로시글리타존 1μM 48시간
12 로시글리타존 5μM 48시간
13 트로글리타존 1μM 48시간
14 트로글리타존 5μM 48시간
15 DMSO 대조군 0.02%(v/v) 48시간
* DMSO에 용해시킨 로시글리타존 및 트로글리타존 5mM 및 25mM 모액을 제조하고 배양배지 내에서 최종 농도(1μM/5μM)로 5000배 희석시킨다. 대조군용으로, 화합물이 없는 DMSO를 최종농도 0.02%(v/v)로 동등하게 5000배 희석시킨다.
RNA를 트리졸 시약(제조사: Life Technologies, Karlsruhe, Germany)를 사용하여 분리하고 무DNA 킷트(제조사: Ambion, Austin, TX, US)를 적용하여 DNase I으로 처리하였다. 에르엔이지 미니 킷트(RNeasy mini kit)(제조사: Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 추가로 RNA를 정제하고 2100생분석기(Bioanalyzer)(제조사: Agilent, Boblingen, Germany)를 사용하여 질적/양적 조절을 수행한다. 총 RNA 10㎍을 진칩(GeneChip) 발현 분석 기법 편람(제조사: Affymetrix, Santa Clara, CA, US)에 따라 비오티닐화된 cRNA로 전환시켰다. 간단히, 수퍼스크립트(Superscript) 이중쇄 cDNA 합성 킷트를 적용하여 제1 및 제2 쇄 합성을 수행하고 바이오어레이(BioArray) RNA 전사 표지 킷트(제조사: Enzo Diagnostics, Framingdale, NY, US)를 사용하여 비오틴 표지된 cRNA를 제조하였다. cRNA 10㎍을 가열하여 단편화하고, 진칩 진핵성 하이브리드화 대조 용액(아피메트릭스)에 첨가하여 진칩 MG-U74Av2 배열(아피메트릭스)에서 45℃에서 16시간 동안 회전시켜 하이브리드화하였다. 아피메트릭스에 의해 제공된 하드웨어를 사용하는 표준 공정으로 본 배열을 세척, 염색 및 주사하였다. 원 데이타를 미세배열 적합 버전 4.0.1 소프트웨어(아피메트릭스, 위를 참조)를 적용시켜 분석하였다.
전체 실험을 2회 반복하여 3개의 생물학적 복제물을 수득하였다.
데이타 분석:
상기한 바와 같이 변화량의 추산을 포함한 데이타 분석을 수행하였다. PIM-3에 대한 변화량 값을 각 시간 포인트에 대한 비처리 대조군에 대한 화합물 처리 샘플을 비교함으로써 수득하였다. 따라서, 아피메트릭스 정량기 96841_AT를 사용하였다.
본 결과는 표 6 a)-c)에 요약되어 있다.
6시간 24시간 48시간
로시 1μM 로시 5μM 트로 1μM 트로 5μM 로시 1μM 로시 5μM 트로 1μM 트로 5μM 로시 1μM 로시 5μM 트로 1μM 트로 5μM
비교 1/5 2/5 3/5 4/5 6/10 7/10 8/10 9/10 11/15 12/15 12/15 14/15
변화량 2.1 2.2 1.7 2.1 2.9 2.9 1.8 2.7 2.6 2.6 1.8 2.4
6시간 24시간 48시간
로시 1μM 로시 5μM 트로 1μM 트로 5μM 로시 1μM 로시 5μM 트로 1μM 트로 5μM 로시 1μM 로시 5μM 트로 1μM 트로 5μM
비교 1/5 2/5 3/5 4/5 6/10 7/10 8/10 9/10 11/15 12/15 13/15 14/15
변화량 1.5 1.3 1.7 1.7 2.2 1.9 1.6 1.9 2.0 1.9 1.6 1.9
6시간 24시간 48시간
로시 1μM 로시 5μM 트로 1μM 트로 5μM 로시 1μM 로시 5μM 트로 1μM 트로 5μM 로시 1μM 로시 5μM 트로 1μM 트로 5μM
비교 1/5 2/5 3/5 4/5 6/10 7/10 8/10 9/10 11/15 12/15 13/15 14/15
변화량 2.0 2.2 1.8 2.3 1.9 1.9 1.6 2.0 2.1 2.0 1.6 2.3
"로시"는 "로시글리타존"을 나타내며, "트로"는 "트로글리타존"을 나타낸다.
실시예 6: 항당뇨병 약물(PPARγ 효능제)로 처리한 ZDF 래트에서 Pim-3의 유전자 발현
생후 5주된 주커 당뇨병성 비만(ZDF/Gmi.TM.-fa/fa) 수컷 래트와 이들의 마른 fa+/fa- 대조 래트(대조군 1-5, ZDF 1-10)를 제네틱 모델스 인코포레이티드(인디아나폴리스, 인디아나 소재)로부터 입수하였다. 본 래트를 음식 및 물에 자유롭게 접근하도록 하였다. ZDF 동물을 2 그룹으로 나누었다: 그룹 1(동물 ZDF 1-5)은 어떠한 제제로도 처리하지 않은 반면, 제2 그룹은 항당뇨병 약물 로시글리타존(3mg/kg/일, 동물 6-10, 로시 1-5)으로 14주 동안 처리하였다. 부고환 지방 패드 및 또한 혈액 샘플을 수집하기 위해, 각각의 경우의 5마리의 동물을 경추탈골시켜 치사시켰다. 항당뇨병 치료의 성과를 관찰하기 위해, 장기 혈액 글루코스 농도의 마커로서의 HbA1c를 실험이 끝난 후 표준 방법에 의해 측정하였다. 이들 측정 결과는 표 7에 요약되어 있다:
상이한 래트에서의 % HbA1c: 대조군 래트(C), 비처리 ZDF 래트(Z), 로시글리타존 처리 ZDF 래트(R)
동물 C1 C2 C3 C4 C5 Z1 Z2 Z3 Z4 Z5 R1 R2 R3 R4 R5
HbA1c(%) 4.20 4.28 4.21 4.16 4.09 5.12 8.01 7.59 8.71 9.51 4.30 4.27 4.14 4.14 4.13
부고환 지방 조직의 수집, RNA 분리 및 아피메트릭스 실험을 실험 1에 기술한 바와 같이 수행하였다. 데이타 분석은 마른 대조군 동물 대 비처리 ZDF 래트로부터 유래한 샘플의 발현 데이타의 비교 및 로시글리타존 처리 ZDF 동물 대 비처리 ZDF 동물로부터 유래한 발현 데이타의 비교를 포함한다. 아벤티스 파마슈티칼스(Aventis pharmaceuticals)에서 개발한 독점 소프트웨어를 사용하여 변화량의 추산 및 이들 변화량의 통계학적 중요성의 고찰을 포함하는 데이타 분석을 수행하였다. 아피메트릭스 정량기 AF086624_S_AT를 사용하여 Pim-3에 대한 유전자 발현의 변화량을 분석하였다. 이들 분석 결과는 다음의 표 8a 및 8b에 요약되어 있다.
생후 20주 된, ZDF 래트
비교 ZDF 1 대대조군 #1 ZDF 2 대대조군 #2 ZDF 3 대대조군 #3 ZDF 4 대대조군 #4 ZDF 5 대대조군 #5
변화량 -1.5 -1.8 -1.6 1 -1.7
생후 20주 된, 로시글리타존 처리 ZDF 래트와 비처리 ZDF 래트의 비교
비교 로시 1 대ZDF 1 로시 2 대ZDF 2 로시 3 대ZDF 3 로시 4 대ZDF 4 로시 5 대ZDF 5
변화량 1.6 1.3 1.6 1.5 1.4
서열 목록

Claims (10)

  1. 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자.
  2. 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자.
  3. a) 서열번호 5,
    b) 서열번호 7,
    c) 서열번호 5 또는 서열번호 7에 하이브리드화 하는 DNA 서열 및
    d) a), b) 및 c)에 정의한 서열에 대한 유전자 암호의 결과로서 축퇴된, PIM-3형 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 따르는 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포.
  5. a) 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드,
    b) a)에 관하여 1개 이상의 아미노산이 결실된 폴리펩티드,
    c) a)에 관하여 1개 이상의 아미노산이 상이한 아미노산으로 대체된 폴리펩티드,
    d) a)에 관하여 1개 이상의 아미노산이 서열에 첨가된 폴리펩티드, 및
    e) 서열번호 6의 아미노산 서열 전체 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드로부터 선택되는, PIM-3 활성을 갖는 폴리펩티드.
  6. 항-제2형 당뇨병 약물을 동정하기 위한 선별 제제로서 PIM-3의 용도.
  7. 제6항에 있어서, PIM-3를 암호화하는 DNA를 사용하는 용도.
  8. 제6항에 있어서, PIM-3 활성을 갖는 폴리펩티드를 사용하는 용도.
  9. 인슐린 내성 또는 제2형 당뇨병 치료용 약제 제조를 위한 PIM-3의 용도.
  10. PIM-3를 시험할 화합물과 함께 항온처리하고 PIM-3 활성의 변화를 측정하는, 항-당뇨병 화합물의 동정방법.
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2005014809A1 (ja) * 2003-08-11 2006-11-24 株式会社クレハ 肝臓ガン特異的ポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び該ポリペプチドの発現を抑制するｒｎａ分子
US20220235343A1 (en) * 2019-06-27 2022-07-28 Industrial Cooperation Foundation Chonbuk National University Novel adp-ribosyl cyclase and inhibitor thereof

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0911391A3 (en) * 1997-10-24 2000-01-19 Smithkline Beecham Corporation A clone HWHHJ20
US6143540A (en) * 1999-01-26 2000-11-07 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Molecules of the HKID-1-related protein family and uses thereof
CN1328134A (zh) * 2001-04-13 2001-12-26 复旦大学 一种蛋白激酶编码序列,其编码的多肽、制法及用途
DE10123055A1 (de) * 2001-05-11 2003-03-20 Gruenenthal Gmbh Screeningverfahren mit PIM1-Kinase oder PIM3-Kinase

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