KR20040064821A

KR20040064821A - 벼 유래 신규 ｍｉｔｅ

Info

Publication number: KR20040064821A
Application number: KR1020030001682A
Authority: KR
Inventors: 김남수; 박경철
Original assignee: 대한민국(강원대학교 총장)
Priority date: 2003-01-10
Filing date: 2003-01-10
Publication date: 2004-07-21
Also published as: KR100555084B1

Abstract

본 발명은 벼 유래 신규 MITE(miniature inverted-repeat transposable element)에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 말단 역위 반복 서열(terminal inverted repeat)로서, 5' 말단 영역에 서열번호 4로 표시되는 올리고뉴클레오티드와 3' 말단 영역에 서열번호 5로 표시되는 올리고뉴클레오티드를 갖는 것을 특징으로 하는 MITE(miniature inverted-repeat transposable element)에 관한 것이다. 본 발명에 따른 MITE는 식물의 유전적 다양성 분석, 연관 유전자의 지도 작성, 유전자의 탐색, 특정 형질에 대한 DNA 마커의 개발 등에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

벼 유래 신규 ＭＩＴＥ{Novel MITE isolated from Oryza spp.}

본 발명은 벼 유래 신규 MITE(miniature inverted-repeat transposable element)에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 말단 역위 반복 서열(terminal inverted repeat)로서, 5' 말단 영역에 서열번호 4로 표시되는 올리고뉴클레오티드와 3' 말단 영역에 서열번호 5로 표시되는 올리고뉴클레오티드를 갖는 것을 특징으로 하는 MITE(miniature inverted-repeat transposable element)에 관한 것이다.

전이인자(transposable element; TE)는 게놈의 한 장소에서 다른 장소로 이동할 수 있는 DNA 절편을 말하는 것으로서, 이들은 전이(transposition)에 의해 염색체 내에서 이곳 저곳으로 옮겨 다니므로 유전적 다양성(genetic diversity)을 일으키는 중요한 요소이다. 전이인자는 트랜스포존(transposon)이라고도 하는데, 그 길이는 수백에서 수천 개의 염기서열에 이른다. 각각의 전이인자는 자신의 이동에 필요한 DNA를 절단하고 연결시킬 수 있는 전이효소(transposase) 유전자를 지니고 있으며, 각 전이인자들은 상기 전이효소에 의해 인식되는 DNA 염기서열을 가지고 있다. 일부 전이인자들은 그 내부에 앰피실린(ampicillin)이나 테트라사이클린(tetracycline)과 같은 항생제를 불활성화시키는 효소를 암호화하는 유전자(ampR, terR)를 지니고 있다. 또한, 어떤 전이인자들은 전사 프로모터를 지니고 있어, 전이인자가 염색체 내 특정 유전자 근처에 삽입될 경우, 삽입부 근처에 위치한 유전자의 발현 양을 변화시키거나, 특정 조건 하에서도 유전자가 발현할 수 있게 한다.

전이인자는 클래스 1(class 1)과 클래스 2(class 2)로 분류되는데, 전자에 속하는 전이인자들은 RNA 매개체(intermediate)를 통하여 숙주의 염색체 내로 삽입되고(Kumar A., and J. L. Benntzen.,Annu. Rev. Genet., 33:479-532, 1999), 후자에 속하는 전이인자들은 DNA 매개체를 통하여 숙주의 염색체 내로 삽입된다. 클래스 1에 속하는 전이인자로는 레트로트랜스포존(retrotransposon), SINE(short interspersed nuclear element) 및 LINE(long interspersed nuclear element)가 있으며, 이들은 게놈 내에서 매우 높은 복제수(copy number)로 존재한다. 한편, 클래스 2에 속하는 전이인자들은 다시 전이능력(transposability)에 따라Ac와Spm과 같은 자발적 인자(autonomous elements)와Ds와dSpm과 같은 비자발적 인자(nonautonomous elements)로 나뉜다. 자발적 인자들은 전이(transposition)에 필요한 모든 요소를 암호화하기 때문에 그 자체가 전이될 수 있다. 그러나, 비자발적인 인자들은 대부분 자발적 인자들의 결실 유도체이거나 중요한 조절 서열(regulatory sequence)이 메틸화에 의해 유전적으로 불활성화되어 있기 때문에, 전이를 위해서는 반드시 게놈 내 자발적 인자의 존재를 필요로 한다(Wessler, S. R.,et al.,Science, 242: 399-405. 1988). 클래스 2에 속하는 전이인자들은 전이능력과는 상관없이 짧은 말단 역위 반복 서열(terminal inverted repeat, 이하 'TIR'이라 함)을 가진다는 특징이 있으며, 보존된 메카니즘에 의한 DNA 매개체를 통하여 전이되기 때문에 게놈 내에서 비교적 낮은 복제수로 존재한다(보통 게놈 반수체 당 <100 카피).

한편, MITE(miniature inverted-repeat transposable element)는 동물과 식물 등 여러 진핵생물의 핵 게놈에 존재하는 또 다른 계열(family)의 전이인자로서(Wessler S. R.,et al.,Curr. Opin. In. Genet. And Develop., 5: 814-821, 1995), 유전자의 5' 말단이나 3' 말단 부위 등에 존재하여 유전자 조절에도 관여하는 것으로 알려져 있다(Bureau and Wessler,Plant Cell., 4: 1283-1294,1992; Wessler S. R.et al., Curr. Opin. In Genet. AND Develop., 5: 814-821, 1995). 또한, MITE에도 양 말단에 십여 개의 염기로 구성된 TIR이 존재하는데, 같은 계열의 MITE은 동일한 염기서열의 TIR을 가진다. 그러나, 그 내부의 염기서열은 다르다. 이렇게 MITE에도 클래스 2의 전이인자와 같이 TIR이 존재하기는 하나, MITE는 <500bp의 작은 크기, 높은 복제수(게놈 반수체 당 100-15000 카피), 그리고 삽입 부위 특이성과 같은 다른 전이인자와 구별되는 특징을 가진다. MITE의 주목할 만한 또 다른 특징은 주로 다양한 유전자의 내부 또는 그 근처, 특히 프로모터 상류에서 발견된다는 점이다(Wessleret al.,Curr. Opin. Genet. Dev., 5: 914-921, 1995). 또한, 다수의 MITE가 매트릭스 부착 영역(MAR) 부근에 존재한다고 보고된 바 있다(Avramovaet al.,Nucleic Acids Res., 26: 761-767, 1998). 상기와 같은 MITE의 특징으로 인해 MITE가 유전자 발현의 활성화 및 게놈의 구조와 중요한 관련성을 가지는 것으로 예상되고 있다. 따라서, MITE는 게놈 구조와 유전자 발현 사이의 관계를 규명하는 과학적 관점에서 매우 흥미있는 전이인자이다. 현재까지 밝혀진 MITE 계열로는 디토(Ditto), 가이진(Gaijin), 캐스타웨이(Castaway), 투어리스트(Tourist) 및 스토와웨이(Stowaway)가 있다(Turcotte K.et al.,Plant J., 25: 1-13, 2001). 그러나, 식물에는 다양한 계열의 MITE가 존재하기 때문에, 새로운 MITE를 규명하기 위한 연구는 계속 요구되고 있다.

최근 MITE 등의 전이인자들이 다양한 생명공학 기술에 사용되고 있으며, 또한 전이인자를 이용한 여러 기술들이 개발되고 있다. 그 예로는 전이인자의 역위반복 서열(inverted repeat sequence) 내에 유전자를 삽입할 수 있는 벡터를 제작하여 인위적으로 전이를 유발시켜 형질전환체를 제조하는 형질전환 기술이 있으며, 이에 이용되는 전이인자의 일 예로는 노랑초파리에서 분리된 P 인자가 있다. 또한, 전이인자를 이용하여 식물체 내에서의 유용 유전자의 분리를 하려는 시도가 계속되고 있는데, 종래에는 주로 전이인자의 삽입에 의한 돌연변이 효과를 통하여 유전자를 클로닝하는 역유전학적 방법이 사용되어져 왔다. 그러나, 최근에는 SINE 또는 LINE 등의 클래스 1의 전이인자를 이용하거나 MITE를 이용한 Inter-MITE(Chang R.-Y.et al.,Theo. Appl. Genet., 102: 773-781, 2001), 트랜스포존 디스플레이(transposon display)(Casaet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 29: 10083-10089, 2000) 등이 개발되었다. 상기 트랜스포존 디스플레이는 MITE의 각 인자별 보존적인 염기서열을 이용하여 기존의 AFLP 방법을 약간 수정하여 수행하는 방법으로서 트랜스포존 내 고정된 프라이머를 이용한다. 트랜스포존 디스플레이 방법에 의해 증폭된 PCR 단편들은 기존의 AFLP에서 증폭된 단편들과는 달리 단백질 코딩 부위 등에 연관되었을 가능성이 높다. 이러한 방법들을 통해 현재 MITE는 유전자의 다양성 분석, 연관 유전자의 지도 작성, 특정 형질에 대한 DNA 마커의 개발 등에 이용되고 있다.

따라서, 본 발명자들은 식물체 내 유전적 다양성 분석 및 유용 유전자의 분리 등 다양한 생명공학 분야에 사용될 수 있는 신규한 MITE를 탐색하기 위하여 노력하던 중, 벼속 식물에 존재하는 새로운 MITE 계열을 찾아내고 이들의 염기서열및 유용성을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 새로운 계열의 MITE를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 MITE를 증폭하기 위한 프라이머를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머를 이용하여 식물에서 MITE를 탐색하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 MITE 또는 이의 단편을 이용하여 식물의 유전적 다양성을 분석하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 MITE 또는 이의 단편을 이용하여 식물의 연관 유전자 지도를 작성하는 방법을 제공하는 것이다.

나아가, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 MITE 또는 이의 단편을 이용하여 식물의 유전자를 탐색하는 방법을 제공하는 것이다.

도 1은Aes19의 일부 염기서열(410-448bp)과 오리자 사티바(Oryza sativa, japonica cultivar-group) 게놈 DNA 염색체 1의 PAC 클론 P0025D05(진뱅크 등록번호: AP001072)의 일부 염기서열과의 상동성 비교 결과(A)와Aes19의 전체 염기서열과 오리자 사티바(japonica cultivar-group) 게놈 DNA 염색체 8의 클론 P0543D10(등록번호: AP004587)의 염기서열과의 상동성 비교 결과(B)를 나타낸 것이다.

회색 음영: 두 서열이 일치하는 부위

박스: TIR(terminal inverted repeat)의 염기서열

화살표:Aes19의 410-448bp의 염기서열

도 2는Aes19-F/Aes19-R 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 결과를 나타낸 것이다.

레인 1: 오리자 글라베리마(Oryza glaberrima; AA)

레인 2: 오리자 니바라(Oryza nivara; AA)

레인 3: 오리자 루피포곤(Oryza rufipogon; AA)

레인 4: 오리자 사티바(Oryza sativa; japonica cultivar-group; AA)

레인 5: 오리자 사티바(indica cultivar-group; AA)

레인 6: 오리자 미누타(Oryza minuta; BBCC)

레인 7: 오리자 푼크타타(Oryza punctata; BB)

레인 8: 오리자 오피시날리스(Oryza officinalis; CC)

레인 9: 오리자 알타(Oryza alta; CCDD)

레인 10: 오리자 그란디글루미스(Oryza grandiglumis; CCDD)

레인 11: 오리자 라티폴리아(Oryza latifolia; CCDD)

레인 12: 오리자 오스트라리엔시스(Oryza australiensis; EE)

레인 13: 오리자 글루미파툴라(Oryza glumipatula; AA)

M: 분자량 마커

도 3은Aes19-F 및Aes19-R 프라이머를 이용한 PCR에 의해 AA 게놈의 벼속 식물에서 증폭된 PCR 산물 중 대표적인 5개의 PCR 산물들의 염기서열을 다중 서열 정렬(multiple sequence alignment)한 결과이다.

O. sat: 오리자 사티바

O. gla: 오리자 글라베리마

O. glu: 오리자 글루미파툴라

O. niv: 오리자 니바라

O. ruf: 오리자 루피포곤

화살표:Aes19-F 및Aes19-R 프라이머

박스: TIR의 염기서열

밀줄: 회문 배열(palindrome)

검정색 음영의 소문자: TIR 옆의 보존적 염기서열(DIR; direct repeat)

도 4는 벼 게놈에 존재하는 방랑자의 RESites를 나타낸 것이다.

밑줄: 방랑자의 TIR 서열

붉은색 글씨: 회문배열

도 5는 다양한 벼속 식물로부터 분리된 DNA를 주형으로 하고 본 발명에 따른 PangFR 프라이머를 이용하여 PCR를 수행한 결과(A)와 오리자 사티바로부터 클로닝된 방랑자를 탐침으로 하여 서던 블럿을 수행한 결과(B)를 나타내는 사진이다. 하기의 레인 설명에서 괄호 안의 알파벳은 게놈의 종류를 나타낸 것이다.

1: 오리자 사티바(AA)

2: 오리자 루피포곤(AA)

3: 오리자 니바라(AA)

4: 오리자 글라베리마(AA)

5: 오리자 롱기스타미나타(AA)

6: 오리자 바디아이(AA)

7: 오리자 메리디오날리스(AA)

8: 오리자 미누타(BBCC)

9: 오리자 푼크타타(BB)

10: 오리자 오피시날리스(CC)

11: 오리자 알타(CCDD)

12: 오리자 그란디글루미스(CCDD)

13: 오리자 라티폴리아(CCDD)

14: 오리자 오스트라리엔시스(EE)

도 6은 벼 게놈을EcoRⅠ으로 절단하여 0.8% 아가로스 겔 전기영동을 수행한 결과(A)와 오리자 사티바로부터 클로닝한 방랑자를 탐침으로 하여 게놈 서던 블럿을 수행한 결과(B)를 나타내는 것이다. 하기의 레인 설명에서 괄호 안의 알파벳은 게놈의 종류를 나타낸 것이다.

레인 1: 오리자 글라베리마(AA)

레인 2: 오리자 글루미파툴라(AA)

레인 3: 오리자 루피포곤(AA)

레인 4: 오리자 사티바(indica cultivar-group; AA)

레인 5: 오리자 사티바(japonica cultivar-group; AA)

레인 6: 오리자 니바라(AA)

레인 7: 오리자 롱기스타미타나(AA)

레인 8: 오리자 바디아이(AA)

레인 9: 오리자 메리디오날리스(AA)

레인 10: 오리자 푼크타타(BB)

레인 11: 오리자 미누타(BBCC)

레인 12: 오리자 오피시날리스(CC)

레인 13: 오리자 알타(CCDD)

레인 14: 오리자 그란디글루미스(CCDD)

레인 15: 오리자 라티폴리아(CCDD)

레인 16: 오리자 오스트라리엔시스(EE)

도 7a는 다양한 벼속 식물로부터 증폭된 방랑자들의 5' 영역의 염기서열을 비교한 결과를 나타낸다.

박스: TIR

도 7b는 도 7a에 도시된 염기서열에 뒤이은 3' 영역의 염기서열을 비교한 것이다.

박스: TIR

도 8은 다양한 속의 식물의 게놈 DNA를EcoRⅠ으로 절단하여 0.8% 아가로스 겔 전기영동을 수행한 결과(A)와 오리자 사티바로부터 클로닝한 방랑자를 탐침으로 하여 게놈 서던 블럿을 수행한 결과(B)를 나타내는 것이다.

레인 1: 벼(Oryza rufipogon)

레인 2: 벼(Oryza sativa, japonica cultivar-group ; 일품벼)

레인 3: 벼(Oryza sativa, japonica cultivar-group ; 화성벼)

레인 4: 밀(Triticum monococcum)

레인 5: 밀(Triticum aestivum)

레인 6: 보리(Hordeum vulgare)

레인 7: 보리(Hordeum bulbosum)

레인 8-9: 수수(Sorghum bicolor)

레인 10: 귀리(Avena strigosamarinum)

레인 11-12: 옥수수(Zea mays)

레인 13-14: 테오신테(Teosinte)

레인 15-16: 감마그래스(Tripsacum dactyloides)

도 9는 다양한 속의 식물로부터 분리한 DNA를 주형으로 하고 본 발명에 따른 PangFP 프라이머를 이용하여 PCR를 수행한 결과(A)와 오리자 사티바로부터 클로닝된 방랑자를 탐침으로 하여 서던 블럿을 수행한 결과(B)를 나타내는 사진이다.

M: 분자량 마커

레인 1-3: 벼

레인 4-5: 밀

레인 6-7: 보리

레인 8-9: 귀리

레인 10-11: 수수

레인 12-13: 감마그래스

레인 14-15: 옥수수

레인 16-17: 테오신테

도 10은 다양한 벼속 식물을 대상으로 KPMP3(MseⅠ+AG)/PangMAP 프라이머 조합을 이용하여 방랑자-AFLP 분석을 수행한 결과를 나타내는 사진이다.

A: 오리자 사티바(japonica cultivar-group)

B: 오리자 사티바(indica cultivar-group)

C: 오리자 루피포곤

D: 오리자 니바라

E: 오리자 글라베리마

F: 오리자 롱기스타미나타(Oryza longistaminata)

G: 오리자 바디아이(Oryza barthii)

H: 오리자 메리디오날리스(Oryza meridionalis)

화살표 ①: 모든 종들이 공통적으로 가지고 있는 단편

화살표 ②: 대립 유전자 좌

화살표 ③: 종 특이적 단편

도 11은 일품벼(모), 오리자 루피포곤(모), 그리고 이들의 교배에 의한 F2 식물체에 대해 방랑자-AFLP 분석을 수행한 결과를 나타내는 것으로서, 화살표는 모/부와 F2 식물체간에 확연히 분리되는 단편을 표시한 것이다.

M: 분자량 마커

도 12는 표 5에 기재된 16개의MseⅠ+2 /PangMAP 프라이머 조합을 이용하여 방랑자-AFLP를 BSA 분석에 접목시켜 실시한 결과를 나타내는 것으로서, 화살표는 각각 저항성 및 이병성에 대한 마커 단편들을 표시한 것이다.

M: 분자량 마커

1: KPMP1(MseⅠ+AA)/PangMAP 프라이머 조합

2: KPMP2(MseⅠ+AC)/PangMAP 프라이머 조합

3: KPMP3(MseⅠ+AG)/PangMAP 프라이머 조합

4: KPMP4(MseⅠ+AT)/PangMAP 프라이머 조합

5: KPMP5(MseⅠ+CA)/PangMAP 프라이머 조합

6: KPMP6(MseⅠ+CC)/PangMAP 프라이머 조합

7: KPMP7(MseⅠ+CG)/PangMAP 프라이머 조합

8: KPMP8(MseⅠ+CT)/PangMAP 프라이머 조합

9: KPMP9(MseⅠ+GA)/PangMAP 프라이머 조합

10: KPMP10(MseⅠ+GC)/PangMAP 프라이머 조합

11: KPMP11(MseⅠ+GG)/PangMAP 프라이머 조합

12: KPMP12(MseⅠ+GT)/PangMAP 프라이머 조합

13: KPMP13(MseⅠ+TA)/PangMAP 프라이머 조합

14: KPMP14(MseⅠ+TC)/PangMAP 프라이머 조합

15: KPMP15(MseⅠ+TG)/PangMAP 프라이머 조합

16: KPMP16(MseⅠ+TT)/PangMAP 프라이머 조합

①: 저항성 식물체의 게노믹 DNA

②: 이병성 식물체의 게노믹 DNA

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 말단 역위 반복 서열(terminal inverted repeat)로서, 5' 말단 영역에 서열번호 4로 표시되는 올리고뉴클레오티드와 3' 말단 영역에 서열번호 5로 표시되는 올리고뉴클레오티드를 갖는 것을 특징으로 하는 MITE를 제공한다.

구체적으로 본 발명은 서열번호 6 내지 35로 기재되는 염기서열을 갖는 MITE를 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 MITE를 증폭하기 위한 서열번호 36으로 표시되는 염기서열을 갖는 프라이머를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 프라이머를 이용하여 PCR을 수행함으로써 식물에서 MITE를 탐색하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 MITE 또는 이의 단편을 이용하여 식물의 유전적 다양성을 분석하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하며, 본 발명은 상기 MITE 또는 이의 단편을 이용하여 식물의 연관 유전자 지도를 작성하는 방법을 제공한다.

나아가, 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 MITE 또는 이의 단편을 이용하여 식물의 유전자를 탐색하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 '방랑자(Pangrangja)'라 함은, 본 발명자들이 화본과 식물, 보다 구체적으로는 벼속 식물로부터 분리한 새로운 계열의 MITE를 의미하는 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 벼속 식물로부터 분리된 새로운 계열의 MITE 및 이를 이용하는 방법을 제공한다는 점에 특징이 있다. 본 발명자들은 밀로부터 분리된 반복된 서열을 갖는 690bp의 DNA 단편(Aes19)의 서열분석을 하던 중 상기 서열의 일부(410-448bp)가 벼의 게놈 상에서 역반복되어 있고,Aes19과 상동성을 보이는 벼 게놈의 염기서열 사이에 180bp 크기의 염기서열이 삽입되어 있으며, 그 서열 내에 TIR 유사 서열이 존재하는 것을 확인할 수 있었다(도 1 참조). 본 발명자들은 이러한 특성이 다른 벼속 식물에서도 공통적으로 존재하는지 확인하기 위하여,Aes19의 염기서열을 참고로 하여Aes19-F와Aes19-R 프라이머를 제작하였다.

본 발명의 일 실시예에서는 다양한 벼속 식물로부터 분리된 DNA를 주형으로 하고,Aes19-F 및Aes19-R 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 그 결과, AA 게놈을 가진 식물에서만 약 320bp 크기의 단일 PCR 산물이 검출됨을 확인할 수 있었다(도 2 참조). 이후, 각 PCR 산물의 염기서열을 분석한 결과, MITE로 추정되는 약 183-185bp의 서열이 존재하고, 그 서열 내에 완전 역반복되어있는 16bp의 TIR이 존재하는 것을 확인할 수 있었다(도 3 참조). 또한, TIR의 양 말단에는 5'-TTG-3'와 5'-AAA-3'의 DIR(direct repeat)가 보존되어 있음을 확인할 수 있었다. 각 PCR 산물 내에 존재하는 TIR의 서열을 비교한 결과, 98.1% 이상의 매우 높은 상동성을 나타내었다. 5' 말단 영역의 TIR의 경우, 오리자 글루미파툴라에서 증폭된 TIR의 서열에서만 하나의 염기, G가 동일한 퓨린 계열의 A로 치환되어 있었고, 다른 종의 TIR의 서열은 모두 동일하였다(도 3 참조). 대표적인 5' 말단 영역의 TIR의 서열을 서열번호 4로 기재하였다. 또한, 3' 말단 영역의 TIR의 경우, 오리자 글라베리마와 오리자 글루미파툴라에서 증폭된 TIR의 서열에서만 각각 A가 G로, 그리고 T가 C로 치환되어 있을 뿐 다른 종의 염기서열은 동일하였다(도 3 참조). 대표적인 3' 말단 영역의 TIR 서열을 서열번호 5로 기재하였다. 각 종에서 증폭된 TIR의 내부서열의 상동성은 98.9% 이상의 상동성을 나타내었다. 또한, 상기 TIR 서열을 종래 알려진 MITE들에서 탐색한 결과, 어떤 MITE에서도 발견되지 않았으며, 상기 TIR을 포함하는 전체 MITE의 서열은 종래 알려진 어떤 MITE의 염기서열과도 상동성을 보이지 않은 것을 확인할 수 있었다. 이로부터 본 발명에서 분리된 MITE가 신규한 TIR 서열을 갖는 새로운 계열의 MITE임을 확인할 수 있었으며, 이들을 '방랑자(Pangrangja)'라 명명하였다.

본 발명의 다른 실시예에서는 AA 게놈이 아닌 다른 게놈을 가진 벼속 식물들에도 방랑자가 존재하는지 확인하기 위하여, 방랑자의 TIR+DIR 서열을 프라이머로 제작하여 PCR을 수행하였다. 제작된 프라이머를 'PangFR'로 명명하였으며, 이의 염기서열을 서열번호 36으로 기재하였다. 그 결과, 모든 게놈의 종들에서 PCR 산물이 증폭됨을 확인할 수 있었다(도 5의 A 참조). AA 게놈의 종에서는 예상한대로 약 180bp 크기의 단편이 증폭되었으나, 다른 게놈의 종에서는 다양한 크기를 갖는 다수의 단편이 증폭되었다. 본 발명자들은 상기 PCR로 증폭된 단편들이 방랑자인지 확인하기 위하여, 오리자 사티바로부터 클로닝된 방랑자를 탐침으로 하여 서던 블럿을 실시하였다. 그 결과, AA 게놈의 종에서는 대부분 강한 시그널이 검출되었으나, 다른 게놈의 종에서는 비교적 약한 시그널이 검출되었다(도 5의 B 참조). 또한, AA 게놈을 비롯한 다른 게놈의 종들에서 증폭된 각 PCR 산물들을 무작위로 선발하여 이들의 염기서열을 분석한 결과, PCR 산물들의 크기는 189-551bp로 다양하였으며, 모두 5' 말단과 3' 말단에 완전 역반복된 16bp의 TIR을 가지고 있음을 확인할 수 있었다(도 7a 및 7b 참조). 또한, TIR의 양말단에는 5'-TTG-3'와 5'-MAA-3'(M= A 또는 C)가 보존되어 있음을 확인할 수 있었다. 또한, AA 게놈의 방랑자와 마찬가지로 다른 게놈의 종들에서 증폭된 PCR 산물들도 TIR 서열 내에 A 또는 T 염기가 풍부함을 확인할 수 있었다. 이로부터 본 발명자들은 AA 게놈이 아닌 다른 게놈의 벼속 식물에도 방랑자와 동일한 계열의 MITE가 존재함을 확인하였다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 본 발명에 따른 방랑자가 벼 이외의 다른 종의 식물에도 존재하는지 알아보기 위하여, 여러 종류의 식물을 대상으로 게놈 서던 블럿을 실시하였다. 그 결과, 밀, 보리, 수수, 감마그래스(gammma grass) 등의 식물에도 여러 개의 방랑자가 존재함을 확인할 수 있었다(도 8 참조). 또한, PangFR 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 결과, 벼, 밀, 보리, 귀리, 수수, 감마그래스, 옥수수 및 테오신테 모두에서 PCR 산물이 증폭됨을 확인할 수 있었다(도 9의 A 참조). 그러나, 오리자 사티바로부터 분리된 방랑자를 이용하여 서던 블럿을 실시한 결과, 벼에서만 혼성화가 이루어졌을 뿐 다른 식물에서는 혼성화가 이루어지지 않음을 확인할 수 있었다(도 9의 B 참조). 이는 밀, 보리를 비롯한 다른 식물에도 본 발명에 다른 방랑자와 동일한 TIR 서열이 다수 존재하기는 하나, 그 내부의 염기서열은 방랑자와 낮은 상동성을 갖는다는 것을 나타내는 결과이다. 또한, 본 발명에 따른 PangFR 프라이머를 이용하여 다양한 식물에 존재하는 MITE를 탐색할 수 있음을 알 수 있다.

본 발명에서는 11종의 벼속 식물로부터 총 30개의 방랑자를 분리하였다. 본 발명에 따라 방랑자들의 구체적인 기원(source), 크기, 서열번호 및 진뱅크 등록번호를 하기 표 3에 기재하였으며, 이들의 염기서열을 서열번호 6 내지 35로 각각 기재하였다.

본 발명에 따라 벼속 식물로부터 분리된 신규 MITE 계열인 방랑자는 TIR로서 5' 말단 영역에 서열번호 4로 표시되는 올리고뉴클레오티드와 3' 말단 영역에 서열번호 5로 표시되는 올리고뉴클레오티드를 갖는다. 구체적으로 본 발명에 따른 방랑자는 오리자 사티바를 비롯한 대다수의 벼속 식물의 방랑자와 같이 서열번호 4에서 R이 G인 올리고뉴클레오티드와 서열번호 5에서 R이 A이고 Y가 T인 올리고뉴클레오티드를 TIR로 가질 수도 있다. 또한, 오리자 글라베리마의 방랑자와 같이 서열번호 4에서 R이 G인 올리고뉴클레오티드와 서열번호 5에서 R이 G이고 Y가 T인 올리고뉴클레오티드를 TIR로 가질 수도 있으며, 또는 오리자 글루미파툴라의 방랑자와 같이 서열번호 4에서 R이 A인 올리고뉴클레오티드와 서열번호 5에서 R이 A이고 Y가 C인 올리고뉴클레오티드를 가질 수도 있다.

본 발명에 따른 방랑자의 특징은 다음과 같다:

1) TIR의 5'쪽 서열이 포고 계열(pogofamily)의 스토와웨이-유사 포고-트리거-에미그란트 군(Stowaway-likepogo-Trigger-Emigrantgroup)의 5'쪽 서열 (5'-CAGT-3')과 동일하다.

2) 그러나, TA, TAA 또는 ATA와 같은 TSD(targetsiteduplication)을 갖는 상기 MITE 계열과는 달리(Bureauet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,93: 8524-8529, 1996; Casacubertaet al.,Plant J.,16: 79-85, 1998; Turcotteet al.,Plant J., 25: 1-13, 2001), 본 발명에 따른 방랑자는 인접한 측면 부위(flanking region)에는 5'-TTG-3'와 5'-MAA-3'(M= A 또는 C)를 가진다. 이는 종래 알려진 TE 수퍼패밀리(superfamily)의 표적 사이트(target-site)와 서열이 거의 일치함을 볼 때(Turcotte and BureauGenome82-90, 2002), TIR 내 5'-CAGT-3' 모티프를 갖는 포고-티거-에미그란트 그룹의 MITE와는 다른 특성이다. 따라서, 본 발명에 따른 방랑자가 TIR 내 5'-CAGT-3' 모티프를 가지지만 TSD 내 TA 또는 TAA 서열을 갖지 않는다는 것은 독특한 특징이다.

3) 본 발명에 따른 방랑자는 3' 말단 영역에 위치하는 TIR의 일부 서열과 이에 인접한 부위에 5'-CTTTGATCAAAG-3'의 회문배열(palindrome)이 존재한다.

4) 본 발명에 따른 방랑자는 AA 게놈의 경우 90% 이상의 상동성을 갖는다.

6) 벼 게놈의 종류와는 상관없이 방랑자의 TIR 내부의 서열은 A 또는 T 염기가 많이 중복되어 있다.

본 발명자들은 본 발명에 따른 방랑자의 유용성을 확인하기 위하여, 방랑자-AFLP 분석을 수행하였다. 방랑자-AFLP 분석은 카사 등의 트랜스포존-디스플레이 분석(Casaet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 37: 10083-10089, 2000)을 약간 변형한 것으로서, 종래 AFLP 분석에서 사용되는 어댑터에 상보적인 서열에 선택적 염기가 부가된 프라이머 대신에 본 발명에 따른 방랑자의 일부 염기서열을 프라이머로 사용한다. 구체적으로 본 발명자들은 방랑자-AFLP 분석을 위해 방랑자 내TIR 부위를 프라이머로 제작하였는데, 선택적 증폭을 위해 TIR의 5'쪽에 'AAR'의 트리뉴클레오티드를 부가하였다. 상기 'AAR'의 트리뉴클레오티드에 있어서, R은 'A' 또는 'G'의 염기를 의미한다. 이렇게 제작된 프라이머를 'PangMAP'이라 명명하였으며, 이의 염기서열을 서열번호 40으로 기재하였다. 종래 카사 등의 트랜스포존-디스플레이 분석은 선택적 증폭을 위한 프라이머로서 TIR의 내부 서열을 사용하는 반면(Casaet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,29: 10083-10089, 2000), 본 발명에 따른 방랑자-AFLP 분석은 방랑자 내 TIR 부위만을 프라이머로 이용한다는 점에 특징이 있다.

본 발명의 일 실험예에서는 벼 8종 66점을 대상으로 본 발명에 따른 방랑자-AFLP 분석을 수행하였다. 그 결과, 벼 전종에 걸쳐 존재하는 공통 DNA 단편, 대립 유전자좌 및 종 특이적 DNA 단편 등을 포함하는 많은 다형성 밴드들이 나타남을 확인할 수 있었다(도 10 참조). 또한, 본 발명에 따른 방랑자-AFLP 분석을 통해 증폭된 DNA 단편의 수는 이전에 발표된 다른 MITE를 이용한 AFLP 분석 결과(Casaet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 10083-10090, 2000)와 비교하여 전혀 떨어지지 않았다.

본 발명의 다른 실험예에서는 우리나라 공시품종인 일품벼(모)와 오리자 루피포곤(부)의 교배로부터 얻은 F2 식물체를 대상으로 하여 방랑자-AFLP 분석을 수행하였다. 그 결과, 모/부와 F2 식물체간에 확연히 분리되는 14개의 단편들을 획득할 수 있었다(도 11 참조). 이 결과로부터 본 발명에 따른 방랑자를 이용한 방랑자-AFLP 분석을 통하여 벼 연관 유전자 지도를 작성할 수 있음을 확인할 수 있었다.

본 발명의 또 다른 실험예에서는 벼멸구에 저항성을 보이는 안다벼와 이병성을 보이는 IR71190-45-2-1의 교배로 얻어진 F2 식물체를 대상으로 방랑자-AFLP를 접목시킨 BSA 분석(Paran & Michelmore,Theor. Appl. Genet.,85: 985-993, 1993)을 수행하였다. 그 결과, 저항성 및 이병성에 관련된 DNA 단편을 획득할 수 있었다(도 12 및 표 7 참조). 이후, 상기 획득한 DNA 단편들 중 임의로 선택된 2개의 저항성 관련 DNA 단편의 염기서열을 분석하여 NCBI GenBank를 통해 상동성을 검색한 결과, 벼멸구 저항성과 관계있는 것으로 밝혀진 벼 염색체 12번(Multaniet al.,Theor Appl Genet., 88: 102-109, 1994; D.S. Brar and G.S. Khush,Plant Molecular Biology, 35: 35-47, 1997)의 일부 서열과 높은 상동성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다(결과 미도시). 상기 2개의 저항성 관련 DNA 단편의 염기서열을 서열번호 41과 42로 각각 기재하였다. 상기 결과로부터 본 발명에 따른 방랑자 단편을 이용한 AFLP 분석을 BSA 분석법에 접목시킴으로써 특정 형질에 대한 DNA 마커의 개발 및 유전자 분리를 용이하게 수행할 수 있음을 확인할 수 있었다.

이와 같이 본 발명에 따른 MITE, 또는 이의 단편은 식물의 유전적 다양성을 분석하는 방법, 식물의 연관 유전자 지도를 작성하는 방법 또는 식물의 유전자를 탐색하는 방법 등에 유용하게 이용될 수 있다. 상기에서 MITE 단편은 TIR 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 TIR의 내부에 보존된 염기서열의 일부일 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따른 PangFR 프라이머, PangMAP 프라이머 또는 트랜스포존 디스플레이 분석을 위해 TIR 내부에 보존된 염기서열로부터 디자인될 수 있는올리고뉴클레오티드를 포함한다.

상기 본 발명의 MITE 또는 이의 단편들을 이용할 수 있는 방법들의 예로는, 이에 한정되지는 않으나 MITE의 TIR 서열을 프라이머로 이용하는 MITE-AFLP 분석, TIR 내부의 서열을 프라이머로 이용하는 트랜스포존 디스플레이 분석(Casaet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 29: 10083-10089, 2000), MITE의 삽입을 통한 돌연변이 분석, Inter-MITE 분석(Chang R.-Y.et al.,Theo. Appl. Genet., 102: 773-781, 2001), MITE 또는 이의 단편을 탐침으로 이용하는 RFLP(restrictionfragmentlengthpolymorphism) 분석 등이 있다.

이와 같은 본 발명에 따른 MITE를 이용한 방법들은 쌍자엽 식물 또는 단자엽 식물에 적용될 수 있다. 쌍자엽 식물의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 담배, 가지, 고추, 페튜니아, 감자, 토마토, 배추, 유채, 양배추, 목화, 상추, 복숭아, 배, 딸기, 수박, 참외, 오이, 당근 및 샐러리 등이 있다. 단자엽 식물의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 벼, 옥수수, 밀, 호밀, 보리, 수수, 귀리, 감마그래스(gamma grass), 테오신테(teosinte) 및 양파 등이 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

Aes19 의 클로닝 및 서열분석

김 등의 방법(Kim N.-S.,et al.,Mol. Cells, 10: 127-164, 2000)에 따라 Inter-SSR 분석을 수행하여 밀(Aegilops searsii)로부터 반복된 서열을 갖는 690bp의 DNA 단편을 분리하였다. 분리된 단편을 'Aes19'라 명명하였으며, 그의 염기서열을 서열번호 1로 기재하였다. 상기Aes19의 서열을 BLAST(http://www.ncbi.nlm.gov/blast)로 분석한 결과, 39bp의 서열(440-448bp)이 오리자 사티바(Oryza sativa, japonica cultivar-group) 게놈 DNA 염색체 1의 PAC 클론 P0025D05(진뱅크 등록번호: AP001072)의 전체 염기서열 중 48616-48654bp와는 정방향으로, 그리고 48457-48419bp와는 역방향으로 높은 상동성을 보임을 확인할 수 있었다(도 1의 A 참조). 이로부터Aes19의 410-448bp 부위가 게놈 DNA 상에서 역반복(invert repeat)으로 존재하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 상기 410-448bp의 서열이 다른 염색체의 클론에도 많은 복제수로 존재하고 있음이 확인되었다(결과 미도시).

본 발명자들은Aes19에 대한 더 많은 정보를 얻기 위해, 방대한 양의 벼 염기서열을 확보하고 있는 일본의 DNA 데이타베이스(http://www.genome.ad.jp)에 BLASTN/nr-nt4587과 OJ1314_F06 옵션 하에 서열 분석을 다시 수행하였다. 그 결과,Aes19의 염기서열 중 161-673bp의 부위가 오리자 사티바(japonica cultivar-group) 염색체 8의 클론 P0543D10(진뱅크 등록번호: AP003891)의 전체 염기 서열 중 51780-51089bp, 그리고 102092-101821bp에 99%의 상동성을 보임을 확인할 수 있었다. 그 중에서, 오리자 사티바(japonica cultivar-group) 염색체 8의 클론 P0543D10(등록번호: AP004587)과의 서열 상동성 비교 결과를 도 1의 B에 도시하였다. 도 1의 B에서 도시된 바와 같이, 벼의 염기서열에는Aes19의 410-448bp과 일치하는 서열의 앞 부분에 180bp 크기의 염기서열이 삽입(insertion)되어 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 51521-51505bp와 51354-51339bp에 16bp의 TIR 유사 서열이 존재하고 있음을 확인할 수 있었다(도 1의 B 참조). 상기 TIR 유사 서열 중 51352-51339bp 부위의 서열은 도 1의 A에서 진뱅크 AP001072의 벼 게놈의 일부 염기서열과 정방향/역방향으로 높은 상동성을 보인Aes19의 410-448bp의 일부 서열과 일치하였다.

본 발명자들은 이러한 특성이 벼속 식물에서도 공통적으로 존재하는지 확인하기 위하여,Aes19의 염기서열을 참고로 하여Aes19-F와Aes19-R 프라이머를 제작하였다. 프라이머쌍은 DNASTAR 프로그램을 이용하여 제작하였으며, 각 프라이머는 바이오니아(주)에 의뢰하여 합성하였다. 제작된 프라이머쌍을 각각 'Aes19-F', 그리고 'Aes19-R'로 명명하였으며, 이들의 염기서열을 서열번호 2와 서열번호 3으로 기재하였다.

<실시예 2>

벼속 식물로부터 새로운 MITE 계열인 '방랑자'의 클로닝

2-1) 게놈 DNA 준비

먼저, 하기 표 1에 기재된 각 벼속 식물의 종자를 파종한 후, 본엽이 3-4매에 도달했을 때 0.5g 정도의 엽 조직을 채취하여 1.5㎖ 튜브에 넣고 액체질소로 급냉시켰다. 이후, 플라스틱 마쇄기를 사용하여 고운 분말로 만들었다. 마쇄된 엽절편 가루에 추출 완충용액(200mM Tris-HCl pH8.0, 200mM NaCl, 25mM EDTA pH8.0, 0.5% SDS; Amersham Biosciences) 750㎕를 넣어준 후, 상기 완충용액과 잎 분말이 완전히 포화되게 흔들어 주었다. 이후, 동량의 페놀(phenol):클로로포름(chloroform):이소아밀알코올( isoamylalchol) = 25:24:1의 혼합액(Sigma)을 첨가하여 약 5분간 손으로 조심스럽게 흔들어 준 후, 65℃에서 15분간 정치하였다. 그리고 나서, 14,000rpm에서 15분간 원심분리하고, 맑은 상층액을 취하여 새 튜브에 옮겼다. 이후, 상기 상층액과 동량의 클로로포름:이소아밀알코올 = 24:1의 혼합액(Sigma)을 넣고 손으로 천천히 약 5분간 흔들어 준 후, 14,000rpm에서 15분간 다시 한번 원심 분리하였다. 그리고 나서, -20℃에서 보관해 놓은 차가운 이소프로판올(isopropanol, Sigma)을 동량으로 첨가하고, -20℃에서 1시간 동안 정치하였다. 이후, 14,000rpm에서 15분간 원심분리하여 침전된 DNA를 튜브 바닥에 고정시키고, 70% 에탄올로 조심스럽게 세척하였다. 세척이 끝난 DNA를 실온에서 충분히 건조시킨 다음, 약 50㎍/㎖ RNase(Boehringer Mangeim) 200㎕가 첨가된 TE 완충용액(10mM Tris-HCl pH8.0, 1mM EDTA pH8.0)을 넣어 충분히 녹인 후, 37℃에서 1시간 정도 보관하여 잔여 RNA들을 제거하였다. 이와 같은 방법으로 추출된 DNA의 농도를 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 측정하였으며, 0.8% 아가로스 겔(agarose gel) 전기영동을 수행하여 분리·정제된 DNA를 확인하였다(결과 미도시).

실시예 2에서 사용한 벼속 식물의 종류

번호	속 명	게놈	입수처
1	오리자 글라베리마(Oryza glaberrima)	AA	^*IRRI, 필리핀
2	오리자 니바라(Oryza nivara)	AA	IRRI, 필리핀
3	오리자 루피포곤(Oryza rufipogon)	AA	IRRI, 필리핀
4	오리자 사티바(Oryza sativa,japonica cultivar-group)	AA	IRRI, 필리핀
5	오리자 사티바(indica cultivar-group)	AA	IRRI, 필리핀
6	오리자 미누타(Oryza minuta)	BBCC	IRRI, 필리핀
7	오리자 푼크타타(Oryza punctata)	BB	IRRI, 필리핀
8	오리자 오피시날리스(Oryza officinalis)	CC	IRRI, 필리핀
9	오리자 알타(Oryza alta)	CCDD	IRRI, 필리핀
10	오리자 그란디글루미스(Oryza grandiglumis)	CCDD	IRRI, 필리핀
11	오리자 라티폴리아(Oryza latifolia)	CCDD	IRRI, 필리핀
12	오리자 오스트라리엔시스(Oryza australiensis)	EE	IRRI, 필리핀
13	오리자 글루미파툴라(Oryza glumipatula)	AA	IRRI, 필리핀

^*IRRI:InternationalRiceResearchInstitute

2-2)Aes19-F/Aes19-R 프라이머를 이용한 PCR

상기 실시예 2-1)에서 얻은 각 게놈 DNA 100ng을 주형으로 하고, 상기 실시예 1에서 제작한Aes19-F/Aes19-R 프라이머 5μM을 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR은 94℃에서 5분간 주형 DNA를 전변성화시킨 후, 94℃/1분; 52℃/1분; 및 72℃/1분을 한 사이클로 하여 최종 35회 반복한 다음, 마지막으로 72℃에서 4분간 반응시키는 조건으로 수행하였다. 이후, 1.5% 아가로스 겔 전기영동을 수행하여 PCR 반응 산물을 확인하였다. 그 결과, AA 게놈의 벼속 식물들에서만 약 320bp 크기의 단일 PCR 산물이 검출됨을 확인할 수 있었다(도 2 참조).

2-3) 각 PCR 산물의 클로닝 및 염기서열 분석

상기 실시예 2-2)에서 얻은 PCR 산물들을 진클린 Ⅱ 킷트(BIO 101)를 이용하여 겔로부터 분리·정제한 후, 이들을 각각 pGEM-T 이지 벡터(Promega)에 클로닝하였다. 각 재조합 벡터로 대장균 XL-1 블루 MRF' 균주(Stratagene)를 형질전환시켰다. 이후, 형질전환된 균주로부터 재조합 벡터를 분리·정제하여 클로닝된 PCR 산물의 염기서열을 분석하였다. 서열분석은 자동서열 분석기(ABI Prism 377 DNA Sequencing System, Applied Biosystems)를 이용하여 수행하였다. 이후, DNASTAR 시스템을 이용하여 분석된 염기서열들의 상동성 검색과 다중 서열 정렬(multiple sequence alignment)을 수행하였다. 그 결과, 도 3에 도시된 바와 같이, 각 PCR 산물은 324-333bp로 이루어지고, 그 내부에 완전 역반복 되어있는 16bp의 TIR이 존재함을 확인할 수 있었다(도 3의 박스). 또한, TIR의 양말단 측면에는 5'-TTG-3'와 5'-AAA-3'의 DIR(direct repeat)이 보존되어 있으며, TIR의 내부 염기서열의 크기는 151-153bp이었다. 특히, 상기 3' 말단 영역의 TIR의 5'쪽 서열은 포고 계열(pogofamily)의 스토와웨이-유사 포고-트리거-에미그란트 군(Stowaway-likepogo-Trigger-Emigrantgroup)의 5'쪽 서열(5'-CAGT-3')과 동일하였다(Robertsonet al.,Mol. Gen. Genet., 252: 761-766, 1996; Turcotte K., S. Srinivase and T. Bureau.Plant J., 25: 1-13, 2001). 또한, 3' 말단 영역 TIR의 일부 서열과 이에 인접하는 부위에 5'-CTTTGATCAAAG-3'의 회문배열(palindrome)이 존재하는 것을 확인할 수 있었다.

NCBI 진뱅크와 일본의 DNA 데이타베이스를 이용하여 상기 TIR 서열을 종래 알려진 MITEs(Bureau T, Ronald PC, Wessler SR.Proc. Natl. Acad. Sci. USA,93: 8524-8529, 1996)의 것들과 비교한 결과, 본 발명에 따른 MITE의 TIR 서열은 어떤MITE의 TIR 서열과도 상동성을 보이지 않은 것으로 확인되었으며, TIR을 포함하는 전체 MITE의 서열 또한 종래 알려진 MITE들과 상동성을 보이지 않는 것으로 확인되었다. 이는 본 발명에서 분리한 MITE가 신규한 MITE임을 나타내는 것이다. 본 발명자들은 본 발명에서 분리한 새로운 계열의 MITE를 '방랑자(Pangranja)'라 명명하였다.

2-4) RESites 탐색

RESites(related toemptysite)는 많은 전이인자 계열과 관련있다고 보고된 바 있으며(Turcotteet al.,Plant J. 25: 1-13, 2001), TSD 서열 중 하나는 RESites 내 발자국(footprint)으로 남게 된다. 본 발명에 따른 방랑자가 벼 게놈에서 이동한 흔적을 탐색하기 위하여, 방랑자의 양 말단에 위치하는 측면 서열(flanking sequence)의 50 뉴클레오티드를 이용하여 일본의 DNA 데이터베이스(http://www. genome. ad. jp)에서 상동성을 검색하였다. 그 결과, 8개의 RESites를 찾을 수 있었다. 이들 8개의 RESites는 5'-TTG-3'와 5'-AAA-3'의 트리뉴클레오티드의 측면에 보존되어 있는지 여부에 따라 3가지 그룹으로 분류하였다. 8개의 RESites 중 2개는 5'-TTG-3'과 5'-AAA-3'를 모두 가지고 있지 않았고, 다른 2개는 5'-TTG-3'만을 가지고 있었으며, 나머지 4개는 5'-AAA-3'만을 가지고 있었다. 대표적인 결과를 도 4에 도시하였다. 특히, AC083751 클론에 존재하는 하나의 RESite는 방랑자가 삽입된 곳에 5'-TTTAACTTTGATCAAAGTTAAA-3'의 완전한 회문 역반복 서열(palindromic invert repeat sequences)을 가지고 있음을 확인할 수있었다(도 4 참조). 이 결과로부터 본 발명에 따른 방랑자가 전이인자로서 벼 게놈 내에서 이동하였다는 것을 알 수 있다.

<실시예 3>

다른 게놈의 벼속 식물로부터 방랑자의 클로닝

본 발명자들은 상기 실시예 2에서 AA 게놈을 가진 벼속 식물로부터 새로운 계열의 MITE를 분리하였다. 본 발명자들은 AA 게놈이 아닌 다른 게놈의 벼속 식물에도 방랑자가 존재하는지 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

3-1) PangFR 프라이머의 제작

방랑자의 TIR이 완전 역반복되어 있다는 것을 고려하여 방랑자의 TIR+DIR의 서열을 프라이머로 제작하였다. 제작된 프라이머를 'PangFR'이라 명명하였으며, 그의 염기서열을 서열번호 36으로 기재하였다. 이 때 프라이머는 (주)바이오니아에 의뢰하여 제작하였다.

3-2) PCR 수행

상기 실시예 3-1)에서 제작된 PangFR 프라이머를 이용하여 하기 표 2에 기재된 각 벼속 식물을 대상으로 PCR을 수행하였다.

실시예 3에서 사용한 벼속 식물

번호	속 명	개체수	게놈	입수처
1	오리자 글라베리마(Oryza glaberrima)	11	AA	^*IRRI, 필리핀
2	오리자 니바라(Oryza nivara)	10	AA	IRRI, 필리핀
3	오리자 루피포곤(Oryza rufipogon)	9	AA	IRRI, 필리핀
4	오리자 사티바(Oryza sativa)	10	AA	IRRI, 필리핀
5	오리자 롱기스타미나타(Oryza longistaminata)	10	AA	IRRI, 필리핀
6	오리자 바디아이(Oryza barthii)	10	AA	IRRI, 필리핀
7	오리자 메리디오날리스(Oryza meridionalis)	6	AA	IRRI, 필리핀
8	오리자 라티폴리아(Oryza latifolia)	2	CCDD	IRRI, 필리핀
9	오리자 알타(Oryza alta)	2	CCDD	IRRI, 필리핀
10	오리자 그란디글루미스(Oryza grandiglumis)	2	CCDD	IRRI, 필리핀
11	오리자 푼크타타(Oryza punctata)	2	BB	IRRI, 필리핀
12	오리자 오피시날리스(Oryza officinalis)	2	CC	IRRI, 필리핀
13	오리자 미누타(Oryza minuta)	2	BBCC	IRRI, 필리핀
14	오리자 오스트라리엔시스(Oryza australiensis)	2	EE	IRRI, 필리핀

^*IRRI:InternationalRiceResearchInstitute

먼저, 각 벼의 DNA 50ng에 10μM 프라이머, 20mM dNTP(Promega), 1unit Taq DNA 중합효소(Biotolls; 자연과학), 2mM MgCl₂, 1×완충용액을 첨가하여 최종 30㎕의 PCR 반응 용액을 제조하였다. 이후, 94℃에서 1분; 52℃에서 1분; 및 72℃에서 2분을 한 사이클로 하여 최종 35회 반복 수행한 후, 마지막으로 72℃에서 4분간 반응시키는 조건으로 PCR을 수행하였다. 1% 아가로스 겔 전기영동을 실시한 결과, 도 5의 A에서 보는 바와 같이, 모든 게놈의 벼속 식물에서 PCR 산물이 검출되었다. 특히, AA 게놈이 아닌 다른 게놈의 벼속 식물에서는 크기가 서로 다른 여러 개의 단편이 증폭되는 것을 확인할 수 있었다.

3-3) 서던 블럿

상기 실시예 3-2)에서 PCR을 통해 증폭된 여러 크기의 단편들이 방랑자인지확인하기 위하여, 오리자 사티바로부터 분리된 방랑자를 탐침으로 하여 서던 블럿을 실시하였다. 먼저, 상기 실시예 3-2)에서 겔 전기영동으로 분리된 각 PCR 산물을 알칼리 전이 방법(alkaline transfer method)으로 하이본드(Hybond) N⁺나일론 막에 옮겼다. 탐침은 오리자 사티바로부터 분리된 방랑자를 진 이미지 랜덤 라벨링 키트(Gene Images random labeling kit, Amersham Pharmacia Biotech)를 이용하여 플루오레스세인(fluorescein)-dUTP로 표지하여 제조하였다. 이후, 혼성화 완충용액(0.25M disodium phosphate, pH7.2, 1mM EDTA, 7% SDS)을 이용하여 65℃에서 하룻밤동안 혼성화시켰다. 그리고 나서, 혼성화된 막을 2×SSX, 1% SDS로 상온에서 한번 세척한 후, 동일한 용액으로 65℃에서 2분간 2회 세척하였다. 마지막으로 0.2×SSC, 1% SDS로 65℃에서 10분간 세척하였다. 이후, 진 이미지 CDP-스타 검출 키트(Gene Images CDP-Star detection kit, Amersham Pharmacia Biotech)를 이용하여 혼성화 시그널을 검출하였다. 그 결과, 도 5의 B에 도시된 바와 같이, AA 게놈의 벼속 식물에서는 대부분 강한 시그널이 검출된 반면, 다른 게놈의 벼속 식물에서는 매우 약한 시그널이 검출됨을 확인할 수 있었다. 또한, 특히, BBCC 게놈을 갖는 오리자 미누타와 CCDD 게놈을 갖는 오리자 알타의 경우에는 방랑자의 크기보다 더 큰 위치에서 강한 시그널을 보였다. 반면, AA 게놈의 오리자 메리디오날리스의 경우에는 PCR 산물은 증폭된 반면, 오리자 사티바와 혼성화되지 않는 것을 확인할 수 있었다. 이는 오리자 메리디오날리스의 MITE가 오리자 사티바와 서열 상동성이 낮다는 것을 나타내는 것이다.

3-4) 게노믹 겔 블럿(genomic gel blot)

오리자 사티바로부터 분리된 방랑자를 탐침으로 하여 게놈 블럿을 실시하였다. 각 벼속 식물로부터 게노믹 DNA를 분리하여EcoRⅠ으로 절단한 후, 0.8% 아가로스 겔 전기영동을 수행하였다(도 6의 A 참조). 이후, 게노믹 DNA를 겔로부터 하이본드 N⁺나일론 막으로 옮긴 후, 상기 실시예 3-3)과 동일한 방법에 따라 서던 블럿을 실시하였다. 그 결과, AA 게놈의 벼속 식물에서는 다수의 강한 시그널이 검출되었으나, 다른 게놈의 벼속 식물에서는 비교적 약한 소수의 시그널이 검출되었다(도 6의 B 참조). 이는 본 발명에 따른 방랑자가 AA 게놈에 다수 존재한다는 것을 나타내는 것이다.

3-5) PCR 산물의 염기서열 분석

상기 실시예 3-3)에서 얻은 각 PCR 산물들을 무작위로 선발하여 상기 실시예 2-3)과 동일한 방법에 따라 염기서열을 분석하였다. 그 결과, 방랑자의 TIR+DIR의 서열로 이루어진 PangFR 프라이머에 의해 각 벼속 식물로부터 증폭된 PCR 산물들은 그 크기가 191-551bp로 다양하였으며, 모두 16bp의 완전한 TIR을 가지고 있음을 확인할 수 있었다(도 7a 및 7b 참조). 그러나, AA 게놈의 PCR 산물과는 다른 게놈의 PCR 산물은 달리 대체적으로 TIR 내부에 삽입된 서열이 더욱 컸으며, 이로 인해 서열 상동성이 비교적 낮았다. 그러나, AA 게놈과 마찬가지로 TIR 내부의 서열에는A 또는 T 염기가 풍부하게 존재함을 확인할 수 있었다.

상기 결과들로부터, AA 게놈이 아닌 다른 게놈의 벼속 식물에도 AA 게놈과 동일한 TIR을 갖는 다양한 크기의 MITE가 존재함을 확인하였으며, 이들 MITE 또한 AA 게놈에서 분리된 방랑자와 동일한 계열의 MITE임을 확인하였다. 방랑자에 공통적으로 존재하는 대표적인 5' 말단 영역의 TIR 서열과 3' 말단 영역의 TIR 서열을 서열번호 4와 서열번호 5로 각각 기재하였다. PangFR 프라이머에 의해 증폭된 PCR 산물들의 염기서열 중 DIR을 제외한 방랑자의 염기서열을 서열번호 6 내지 35로 각각 기재하였다. 본 발명자들은 벼속 식물로부터 총 30개의 방랑자를 분리하였으며, 이들의 염기서열(오리자 알타로부터 분리된 185bp 크기의 MITE 제외)을 NCBI 진뱅크에 등록하였다. 하기 표 3은 본 발명에 따른 방랑자들의 기원(source), 크기, 서열번호 및 진뱅크 등록번호를 기재한 것이다.

본 발명에 따른 방랑자 목록

번호	기원	게놈	크기(bp)	서열번호	진뱅크 등록번호
1	오리자 글라베리마	AA	183	6	AY133195
2	오리자 글루미파툴라	AA	185	7	AY133196
3	오리자 니바라	AA	184	8	AY133197
4	오리자 루피포곤	AA	183	9	AY133198
5	오리자 사티바	AA	184	10	AY133199
6	오리자 라티폴리아	CCDD	186	11	AY133200
7			186	12	AY133205
8			452	13	AY133219
9	오리자 알타	CCDD	185	14	-
10			235	15	AY133209
11			378	16	AY133210
12			378	17	AY133211
13			452	18	AY133214
14			452	19	AY133216
15	오리자 그란디글루미스	CCDD	185	20	AY133202
16			185	21	AY133203
17			378	22	AY133212
18			378	23	AY133213
19			452	24	AY133218
20	오리자 푼크타타	BB	235	25	AY133207
21			235	26	AY133208
22			452	27	AY133215
23			452	28	AY133217
24	오리자 오피시날리스	CC	187	29	AY133204
25			543	30	AY133220
26			543	31	AY133222
27			545	32	AY133223
28	오리자 미누타	BBCC	235	33	AY133206
29			544	34	AY133221
30			544	35	AY133224

<실시예 4>

벼 이외의 다른 종류의 식물에도 방랑자가 존재하는지에 대한 조사

4-1) 게노믹 겔 블럿

벼속 식물이 아닌 다른 종의 식물에도 방랑자가 존재하는지 확인하기 위하여, 상기 실시예 3-4)와 동일한 방법에 따라 게놈 서던 블럿을 실시하였다. 먼저, 하기 표 4에 기재된 다양한 식물로부터 DNA를 분리한 후, 이를EcoRⅠ으로 절단한 후, 0.8% 아가로스 겔 전기영동을 수행하였다(도 8의 A 참조). 이후, 오리자 사티바로부터 분리된 방랑자를 탐침으로 하여 서던 블럿을 실시하였다. 그 결과, 도 8의 B에 도시된 바와 같이, 밀, 보리 및 감마그래스에서는 강한 다수의 시그널이 검출되었으나, 수수, 귀리, 옥수수 및 테오신테에서는 매우 약한 시그널이 검출됨을 확인할 수 있었다.

실시예 4에 사용된 식물의 종류

	식물의 종류
1	벼(Oryza sativaspp. indica)
2	벼(Oryza sativaspp. japonica)
3	밀(Triticum monococcum)
4	밀(Triticum aestivum)
5	보리(Hordeum vulgare)
6	보리(Hordeum bulbosum)
7	수수(Sorghum bicolor)
8	귀리(Avena strigosamarinum)
9	옥수수(Zea mays)
10	테오신테(Teosinte)
11	감마그래스(Tripsacum dactyloides)

4-2) PangFR 프라이머를 이용한 PCR

상기 실시예 3-1)에서 제작한 PangFR 프라이머를 이용하여 다른 종의 식물에서도 방랑자가 증폭되는지 확인하였다. 상기 실시예 3-2)와 동일한 방법에 따라 PCR을 수행한 결과, 벼를 비롯한 다양한 식물에서 다양한 크기를 갖는 단편이 증폭됨을 확인할 수 있었다(도 9의 A 참조).

4-3) 서던 블럿

상기 PCR로 증폭된 단편이 방랑자와 혼성화되는지 확인하기 위하여, 오리자 사티바로부터 분리된 방랑자를 탐침으로 하여 상기 실시예 3-3)과 동일한 방법에 따라 서던 블럿을 실시하였다. 그 결과, 방랑자가 벼에서 증폭된 단편에만 혼성화되는 것을 확인할 수 있었다(도 9의 B 참조). 이는 다른 종의 식물에도 본 발명에 따른 방랑자와 동일한 염기서열을 갖는 TIR이 다수 존재하기는 하나, 그 내부의 서열이 다르다는 것을 의미하는 것이다.

상기 실험결과로부터 본 발명에 따른 방랑자가 벼 이외의 다른 식물들에도 존재한다는 것을 알 수 있다.

<실험예 1>

본 발명에 따른 방랑자를 이용한 식물의 유전적 다양성 분석

본 발명자들은 본 발명에 따른 MITE를 이용하여 식물의 유전적 다양성을 분석할 수 있는지 알아보기 위하여, 카사 등의 트랜스포존-디스플레이 분석방법(Casaet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 37: 10083-10089, 2000)을 약간 변형하여 방랑자-AFLP 분석을 수행하였다. 하기 표 5는 방랑자-AFLP 분석 방법에 사용된 어댑터 및 프라이머의 염기서열을 기재한 것이다.

방랑자-AFLP 분석에 사용된 어댑터 및 프라이머

	염기서열	서열번호
MseⅠ어댑터	5'-GACGATGAGTCCTGAG-3'3'-TACTCAGGACTCAT-5'	3738
MseⅠ+0 프라이머	5'-GACGATGAGTCCTGAGTAA-3'	39
MseⅠ+2 프라이머	+AA(KRMP1) +AC(KRMP2) +AG(KRMP3) +AT(KRMP4)+CA(KRMP5) +CC(KRMP6) +CG(KRMP7) +CT(KRMP8)+GA(KRMP9) +GC(KRMP10) +GG(KRMP11) +GT(KRMP12)+TA(KRMP13) +TC(KRMP14) +TG(KRMP15) +TT(KRMP16)	-
PangMAP 프라이머	5'-AARCAGTTTGACTTTGATC-3' (R=A,G)	40

1-1) 게놈 DNA의 준비

먼저, 하기 표 6에 기재된 AA 게놈을 가지는 벼속 식물로부터 상기 실시예 1-1)과 동일한 방법에 따라 게놈 DNA를 추출하였다.

방랑자-AFLP 분석에 사용된 식물의 종류

	속 명
1	오리자 사티바(japonica cultivar group)오리자 사티바(indica cultivar group)
2	오리자 루피포곤
3	오리자 니바라
4	오리자 글라베리마
5	오리자 롱기스타미나타
6	오리자 바디아이
7	오리자 메리디오날리스

1-2) 방랑자-AFLP 분석을 위한 프라이머 구축

본 발명자들은 방랑자-AFLP 분석을 수행하기 위하여 방랑자의 TIR 부위를 프라이머로 제작하였다. 구체적으로 방랑자의 TIR 서열의 5'쪽에 'AAR'(여기서, R은 'A' 또는 'G'를 말함)을 부가하여 제작하였다. 제작된 프라이머를 'PangMAP'이라 명명하였으며, 이의 염기서열을 서열번호 40으로 기재하였다. 이 때 프라이머는바이오니아(주)에 의뢰하여 제작하였다.

1-3) 방랑자-AFLP 분석

단계 1: 벼 게놈 DNA의 제한 효소 처리 및 어댑터의 라이게이션(ligation)

상기 실험예 1-1)에서 분리한 500ng의 게놈 DNA를MseⅠ(Gibco BRL)으로 37℃에서 하룻밤 동안 절단한 후, 에탄올 침전법으로 정제하였다. 이후, 20㎕의 총 반응용액에 절단된 DNA 100ng, 서열번호 37로 기재된 염기서열의 5 내지 16번의 뉴클레오티드와 서열번호 38로 기재되는 염기서열의 1 내지 12번의 뉴클레오티드가 상보적으로 결합된MseⅠ 어댑터 1 μM, 그리고 T4 DNA 라이게이즈(Promega)를 첨가하여 실온에서 3시간 동안 라이게이션시켰다.

단계 2: 전-증폭(Pre-amplification)

상기 단계 1에서 라이게이션된 DNA를 주형으로 하고, 상기 어댑터에 상보적인MseI + 0 프라이머와 PangMAP 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응 혼합물은 50㎕의 총 볼륨에 5㎕의 라이게이션된 DNA, 0.5μM의 각 프라이머, 0.2mM dNTP(Promega), 1.5mM MgCl₂, 1.5unit Taq DNA 중합효소(BIOTOOLs; 자연과학)를 첨가하여 제조하였으며, PCR은 바이오메트라 UN0Ⅱ 써모사이클러(Biometra UNOⅡ Thermocycler; 96wells ; Biotoron)를 이용하여 수행하였다. PCR 반응조건은 초기에 72℃/2분의 한 사이클과 94℃/3분의 한 사이클을 순차적으로 반응시킨 후,94℃/30초; 53℃/30초; 및 72℃/1분을 한 사이클로 하여 25회 반복한 다음, 마지막으로 72℃에서 5분간 반응시키고 종료하였다. 이후, 1% 아가로스 겔 전기영동을 수행하여 전-증폭된 PCR 산물을 확인한 후(결과 미도시), 겔로부터 PCR 산물을 분리·정제하였다.

단계 3: 방랑자를 이용한 선택적 증폭

상기 단계 2에서 얻은 PCR 산물을 1:50으로 희석하여 이중 3㎕를 주형으로 하고, 0.5μM의MseI +2 프라이머 및 0.5μM의 PangMAP 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 이 때 상기MseⅠ+2 프라이머로는MseⅠ+0 프라이머의 3'쪽에 다양한 종류의 2 뉴클레오티드가 부가된 16개의 프라이머(KPMP1 ~ KPMP16)를 각각 사용하였다(표 5 참조). PCR 반응조건은 94℃에서 5분간 주형 DNA를 전변성시킨 후, 최초 94℃/30초; 62℃/30초; 및 72℃/1분을 첫 사이클로 시작하여 다음 사이클부터는 어닐링(annealing) 온도를 1℃씩 감소시키면서 26회 반복한 뒤, 마지막으로 72℃에서 5분간 반응시키고 반응을 종료하였다.

단계 4: 전기영동

상기 단계 3의 선택적 증폭을 통해 얻은 PCR 산물 5㎕을 취하여 10㎕의 포름아미드 로딩 완충용액(formamide loading buffer; 0.02% BPB, 0.02% Xylene C. FF., 5mM NaOH)과 혼합하였다. 혼합된 용액을 95℃에서 5분간 가열한 후, 그 중 2.5㎕를 6% 변성 아크릴아미드 겔(denaturing acrylamide gel; AmershamBiosciences)에 로딩하였다. 이후, Hoefer^TMSQ₃시퀀서(Amersham Biosciences)를 이용하여 1800V, 60W에서 2시간 동안 전기영동한 후, 실버 염색(silver staining)을 수행하였다. 그 결과,MseⅠ+2 프라이머 중 KRMP3(MseⅠ+AG)/PangMAP 프라이머 조합을 이용한 경우에서 벼 전종에 걸쳐 존재하는 공통 DNA 단편, 대립 유전자 좌, 그리고 종 특이적 DNA 단편 등을 포함하는 많은 다형성을 보이는 단편들이 나타남을 확인할 수 있었다(도 10 참조). 본 발명에 따른 방랑자-AFLP 분석을 통해 증폭된 DNA 단편의 수는 종래 알려진 다른 MITE를 이용한 분석의 결과(Casaet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 10083-10090, 2000)와 비교하여 전혀 떨어지지 않았다. 상기 결과로부터 본 발명에 따른 방랑자를 이용한 AFLP 분석이 유전적 연관성을 분석하는데 유용하게 이용될 수 있음을 알 수 있다.

<실험예 2>

식물의 연관 유전자 지도 작성

본 발명자들은 본 발명에 따른 방랑자의 단편을 이용하여 식물의 연관 유전자 지도 작성을 할 수 있는지에 대해 확인하기 위하여 방랑자-AFLP 분석을 수행하였다. 실험재료를 위하여 우리나라 공시품종인 일품벼(농촌진흥청 춘천출장소)와 오리자 루피포곤의 교배로부터 얻은 1000개의 F2 식물체 중에서 150점의 식물체를 무작위로 선별하였다. 이후, 실시예 2-1)과 동일한 방법에 따라 선별된 150점의 F2 식물체로부터 게노믹 DNA를 추출하였다. 이후, 상기 DNA를 주형으로 하고KAMP1(MseⅠ+AA)/PangMAP 프라이머 조합을 이용하여 AFLP를 수행하였다. 80점에 대한 결과를 도 11에 도시하였다. 도 11에서 보는 바와 같이, 100-400bp에 걸쳐 모(일품벼)/부(오리자 루피포곤)와 F2 식물체간에 확연히 분리되는 14개의 단편들을 획득할 수 있었다. 이는 카사 등이 발표한 트랜스포존-디스플레이 분석의 프라이머 조합당 얻어지는 마커 수(Casaet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 29: 10083-10089, 2000)와 동등한 것이며, 또한 벼 연관 유전자 지도를 작성함에 있어서, 본 발명자에 따른 방랑자-AFLP 분석법이 유용하게 사용될 수 있음을 나타내는 것이다.

<실험예 3>

본 발명에 따른 방랑자를 이용한 유전자 마커의 개발

본 발명자들은 본 발명에 따른 방랑자가 식물에서 특정 형질에 대한 마커 개발에 이용될 수 있는지 확인하기 위하여, 본 발명에 따른 방랑자의 단편을 이용한 방랑자-AFLP을 BSA 분석법(Paran & Michelmore,Theor. Appl. Genet.,85: 985-993, 1993)에 접목시켜 수행하였다.

먼저, 벼멸구에 대해 저항성을 보이는 안다벼(수원 농촌진흥청)와 이병성을 보이는 IR71190-45-2-1(수원 농촌진흥청)의 교배로 얻어진 F2 식물체 50점을 대상으로 벼멸구에 대한 저항성 및 이병성 테스트를 하여 저항성 식물체와 이병성 식물체를 선별하였다. 이후, 선별된 각 식물체로부터 상기 실시예 2-1)과 동일한 방법에 따라 게노믹 DNA를 추출하였으며, 각각의 DNA를 10개씩을 섞어 방랑자-AFLP 분석을 수행하였다. 이 때 상기 표 5에 기재된, 16개의MseⅠ+2 프라이머/PangMAP 프라이머의 조합을 이용하여 AFLP를 실시하였다. 그 결과, 도 12에 도시된 바와 같이, 6개의MseⅠ+2/PangMAP 프라이머 조합에서 저항성 및 이병성에 관련된 DNA 단편을 획득하였다. 하기 표 7은 저항성/이병성 관련 DNA 단편이 나타난 AFLP 프라이머 조합과 DNA 단편의 수를 기재한 것이다.

본 발명에 따른 방랑자-AFLP 분석/BSA 분석을 통해 획득한 저항성/이병성 관련 DNA 단편

프라이머 조합	저항성 관련 DNA 단편	이병성 관련 DNA 단편
KPMP1(MseⅠ+AA)/PangMAP	2개	1개
KPMP2(MseⅠ+AC)/PangMAP	1개	-
KPMP3(MseⅠ+AG)/PangMAP	-	1개
KPMP10(MseⅠ+GC)/PangMAP	2개	-
KPMP12(MseⅠ+GT)/PangMAP	1개	-
KPMP14(MseⅠ+TC)/PangMAP	1개	-

이후, KPMP1(MseⅠ+AA)/PangMAP 프라이머 조합과 KPMP2(MseⅠ+AC)/PangMAP 프라이머 조합에서 획득된 약 250bp 크기의 저항성 관련 DNA 단편을 임의로 선발하여 이들의 염기서열을 분석하였다. 분석된 염기서열의 벼멸구 저항성에 대한 연관성 여부를 확인하기 위하여 NCBI GenBank를 통해 상동성 검색을 수행한 결과, 상기 DNA 단편들이 벼멸구 저항성과 관계있는 것으로 알려진 염색체 12번에 위치하는 것을 확인할 수 있었다. 상기 2개의 저항성 관련 DNA 단편의 염기서열을 서열번호41과 42로 각각 기재하였다.

이로부터 본 발명에 따른 방랑자의 단편을 이용하여 특정 형질에 대한 DNA 마커의 개발 및 특정 기능을 가진 유전자의 분리를 용이하게 수행할 수 있음을 알 수 있다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명자들은 벼속 식물에 존재하는 신규한 MITE를 클로닝하고 이의 염기서열을 규명하였다. 본 발명에 따른 MITE는 식물의 유전적 다양성 분석, 연관 유전자의 지도 작성, 유전자의 탐색, 특정 형질에 대한 DNA 마커의 개발 등에 유용하게 이용될 수 있다.

<110> Kangwon national university <120> Novel MITE isolated from Oryza spp. <130> NP02-1105 <160> 42 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 690 <212> DNA <213> Aegilops searsii <400> 1 agagagagag agagagctag gtggagacag agagagagag agagagagag cgatatggag 60 agacagggag agagagagag agcgagagat agggagagat agagaggaga gagagagctg 120 acacctcggg cccagagaga gagagagaga gagcgagaga cgatcggaga ggtgaggcta 180 gcagcaaata cattaatcgg acaaccttag gatggtcgaa tttttcttaa ttatgtacgg 240 gcaggaagca tggagtactt taggatttgt gcaattttcg gaaccacaag aagtatgcac 300 agaagtttca tccggcttct ggatgctaac atgatggatc acatcacaat tcacccgtat 360 tcctttcatt ttaaaataaa taaatatagt agttttaggt cataagatgg tttgactttg 420 atccaaatca aaacatttta taatctgaca aagtcagaat attttataac ctgaaacaga 480 aggagtacgg gatatgacac acattcgttt gtccaggata tgtcatgcta ctattttgtg 540 atgacggggg gagtacgtag acgtgtagca cacagtgaca tcattaactc aagaggtctt 600 cagtgatcga tacaacaact tggtggccat gtttgggggc ctaacacaca gtaaaagctt 660 ggcaggggca cagcctctct ctctctctct 690 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aes19-F primer for PCR <400> 2 gtgtcatatc ccgtactcct tct 23 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aes19-R primer for PCR <400> 3 aatgaaagga atacgggtga at 22 <210> 4 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' TIR of Pangrangja <400> 4 ratcaaagtc aaactg 16 <210> 5 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' TIR of Pangrangja <400> 5 cagtttgact ttgryc 16 <210> 6 <211> 183 <212> DNA <213> Oryza glaberrima <400> 6 gatcaaagtc aaactgcttt aaatttaacc aagtttataa aaaaatagta atatttttta 60 tctaagataa atttattata aaaatatatt taagtattaa tttaataaaa tcaatttggt 120 aatataaata ttattatatt tatctataaa tttagttaaa ttttaaacag tttgactttg 180 gtc 183 <210> 7 <211> 185 <212> DNA <213> Oryza glumipatula <400> 7 aatcaaagtc aaactgcttt aaatttgacc aaatttatag gaaaaaatag taatattttt 60 tatctaagat aaatttatta taaaaatata tttaagtatt aatttaataa aatcaatttg 120 gtaatataaa tattattata tttatctata aatttagtta aatttaaaac agtttgactt 180 tgacc 185 <210> 8 <211> 184 <212> DNA <213> Oryza nivara <400> 8 gatcaaagtc aaactgcttt aaatttggac caagtttata aaaaaatagt aatatttttt 60 atctgagata aatttattat aaaaatatat ttaagtatta atttaataaa atcaatttgg 120 taatataaat attattatat ttatctttaa atttagttaa atttaaaaca gtttgacttt 180 gatc 184 <210> 9 <211> 183 <212> DNA <213> Oryza rufipogon <400> 9 gatcaaagtc aaactgcttt aaatttgacc aagtttataa aaaaatagta atatttttta 60 tctaagataa atttattata aaaatatatt taagtattaa tttaataaaa tcaatttggt 120 aatataaata ttattatatt tatctataaa tttagttaaa tttaaaacag tttgactttg 180 atc 183 <210> 10 <211> 184 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 10 gatcaaagtc aaactgcttt aaatttgacc aagtttataa aaaaatagta atatttttta 60 tctaagataa atttattata aaaatatatt taagtattaa ttttaataaa atcaatttgg 120 taatataaat attattatat ttatctataa atttagttaa atttaaaaca gtttgacttt 180 gatc 184 <210> 11 <211> 186 <212> DNA <213> Oryza latifolia <400> 11 gatcaaagtc aaactgcttt aaatttgact aagtttgtag acaaatatac taatatctat 60 aatattaaat tagtttttat taaatctata attgaatata tttttatagc acatttgtct 120 tgggttgaat atgttactat tttttcctac aaacttaatc tagcttggaa cagtttgact 180 ttgatc 186 <210> 12 <211> 186 <212> DNA <213> Oryza latifolia <400> 12 gatcaaagtc aaactgcttt aagtttaact aagtttgtag acaaatatac taatatctat 60 aatattaaat tagtttttat taaatctata attgaataca tttttatagc acatttgtct 120 tgggttgaat atgttactat tttttcctac aaaattaatc tagcttggaa cagtttgact 180 ttgatc 186 <210> 13 <211> 452 <212> DNA <213> Oryza latifolia <400> 13 gatcaaagtc aaactgtgcc tcttgtgttt ctctatcttc ccagaaaatt ccataatcag 60 caagagggcc atgatccatt ggtggattgg tgagggttta gtagcagcca cacgaaatca 120 gaccgcagaa gatgttggga aagattgctt taacaagctg attgctaagg agataattga 180 acctgtgcac gtgaaacgga gctgtagtgt cagtcaatgt aagttgcacc cttggattcg 240 ccgtatgttg attactgttg cgagaaaagc acattttttt gaatttgatt cagaaggcaa 300 tgcaacatgg gacaattcag gtactcaccg tgcttgttta gttgaagaac ataaacgaga 360 aatagaaaca gcaaaggtca aaaaccaacc tacagatggc ctgctcacaa tatttaatgt 420 gaacgagcga tacctccagt ttgactttga tc 452 <210> 14 <211> 185 <212> DNA <213> Oryza alta <400> 14 gatcaaagtc aaactgtttt aattttgacc gagtttatag aaaaaaataa taacatattc 60 cacataagac aaatataata taaaaatata ttcaattata gatttaataa aactaatttg 120 atgttataga tattaatata tttgtctgtg aacttgatca aacttaaagc agtttgactt 180 tgatc 185 <210> 15 <211> 235 <212> DNA <213> Oryza alta <400> 15 gatcaaagtc aaactgacat gattaataac aaaaaagaac tgctggttgc agacatagat 60 ttttctaaaa acactaaatt agcatctaca ttgtatgaag aatgaacaga aaaaaacata 120 tgtacgtcag gaacaaaaga aaaaaagaat gtggtacaac ctctatgcta cttatagtca 180 gttgttatcc actaccagtg ctagcaggag catggaatcc agtttgactt tgatc 235 <210> 16 <211> 378 <212> DNA <213> Oryza alta <400> 16 gatcaaagtc aaactgcacc agctcatgtc ttcgatggac caattacacg tagccgagct 60 aaacaactac aacaagaggt gcacacgcta ctttgtgaaa ttccatttat taatgagaat 120 tatatacttc ctaaatcgtg catgttgtta ttactcaggt tcaccaagga cgatggcaaa 180 gacacaccaa gactgaacca gggaggagaa ctacgtcgag tcagttcggc cttggcagaa 240 ctgtcatgaa gaatccgtca tatcttttga ttcatagaag ctatgaaggt ccgtgagtac 300 acgttggaaa gatattgaag tcaactttct aatgccacta gtgccgagtg gtttagagct 360 ttcagtttga ctttgatc 378 <210> 17 <211> 378 <212> DNA <213> Oryza alta <400> 17 gatcaaagtc aaactgcacc agctcatgtc ttcgatggac caattacacg tagccgagct 60 aaacagctac aacaagaggt gcacgcgcta ctttgcgaaa ttccatttat taatgagaat 120 tatatacttc ctaaatcgtg catgttgtta ttactcaggt tcaccaagga ggatggcaaa 180 gacacaccaa gattgaacca gggaggagaa ctacgtcgag tcagttcggc cttggcaaaa 240 ctgtcatgaa gaatcagtca tatcttttga ttcatagaag ctatgaaggt ccgtgagtac 300 acgttggaaa gatattgaag tcaactttct aatgccacta gtgccgagtg gtttagagct 360 ttcagtttga ctttgatc 378 <210> 18 <211> 452 <212> DNA <213> Oryza alta <400> 18 gatcaaagtc aaactgtgcc tcttgtgttt ctctatcttc ccagaaaatt ccataatcag 60 caagagggcc atgatccatt ggtggattgg tgagggttta gtagcagcca cacgaaatca 120 gactgcagaa gatgttggga aagattgctt taacaagctg attgctaagg agataattga 180 acctgtgcac gtgaaacgga gctgtagtgt cagtcaatgt aagttgcacc cttggattcg 240 ccgtatgttg attactgttg cgagaaaagc acatcttttt gaatttgatt cagaaggcaa 300 tgcaacatgg gacatttcag gtactcaccg tgcttgtttt gttgaagaac ataaacgaga 360 aatagaaaca gcaaaggtca aaaaccaacc tacagatggc ctgctcacaa tatttaatgt 420 gaatgagcga tacctccagt ttgactttga tc 452 <210> 19 <211> 452 <212> DNA <213> Oryza alta <400> 19 gatcaaagtc aaactgtgcc tcttgtgttt ctctattttc ccagaaaatt ccataatcag 60 caagagggcc atgatccatt ggtggattgg tgagggttta gtagcagcca cacgaaatca 120 gactgcagaa gatgttggga aagattgctt taacaagctg attgctaagg agataattga 180 acctgtgcac gtgaaacgga gctgtagtgt cagtcaatgt aagttgcacc cttggattcg 240 ccgtatgttg attactgttg cgagaaaagc acattttttt gaatttgatt cagaaggcaa 300 tgcaacatgg gacatttcag gtactcaccg tgcttgttta gttgaagaac ataaacgaga 360 aatagaaaca gcaaaggtca aaaaccaacc tacagatggc ctgctcacaa tatttaatgt 420 gaatgagcga tacctccagt ttgactttga tc 452 <210> 20 <211> 185 <212> DNA <213> Oryza grandiglumis <400> 20 gatcaaagtc aaactgcttt aagtttgatc aagttcacaa acaaatatat taatatctat 60 aacaccaaat tagttttatt aaatctataa ttgaatatat ttttatattg tatttgtctt 120 atgtggaata tgttattatt attttctata aactcggtca aaattaaaac agtttgactt 180 tgatc 185 <210> 21 <211> 185 <212> DNA <213> Oryza grandiglumis <400> 21 gatcaaagtc aaactgcttt aagtttgatc aagttcacag acaaatatat taatatctat 60 aacaccaaat tagttttatt aaatctataa ttgaatatat ttttatatta tatttgtctt 120 atgtggaata tgttattatt attttctata aactcggtca aaattaaaac agtttgactt 180 tgatc 185 <210> 22 <211> 378 <212> DNA <213> Oryza grandiglumis <400> 22 gatcaaagtc aaactgcacc agctcatgtc ttcgatggac caattacatg tagccgagct 60 aaacagctac aacaagaggt gcacgcgtta ctttgtgaaa ttccatttat tagtgagaat 120 tatatacttc ctaaatcgtg catgttgtta ttactcaggt tcaccaagga ggatggcaaa 180 gacacaccaa gactgaacca gggaggagaa ctacgtcgag tcagttcagc cttggcagaa 240 ctgtcatgaa gaattagtca tatcttttga ttcatagaag ctatgaaggt ccgtgagtac 300 acgttggaaa gatattgaag tcaactttct aatgccacta gtgccgagtg gtttagagct 360 ttcagtttga ctttgatc 378 <210> 23 <211> 378 <212> DNA <213> Oryza grandiglumis <400> 23 gatcaaagtc aaactgcacc agctcatgtc ttcgatggac caattacacg tagccgagct 60 aaacagctac aacaagaggt gcacgcgcta ctttgtgaaa ttccatttat taatgagaat 120 tatatacttc ctaaatcgtg catgttgtta ttactcaggt tcaccaagga ggatggcaaa 180 gacacaccaa gactgaacca gggaggagaa ctacgtcgag tcagttcggc cttggcagaa 240 ctgtcatgaa gaatcagtca tatcttttga ttcatagaag ctatgaaggt ccgtgagtac 300 acgttggaaa gatattgaag tcaactttct aatgccacta gtgccgagtg gtttagagct 360 ttcagtttga ctttgatc 378 <210> 24 <211> 452 <212> DNA <213> Oryza grandiglumis <400> 24 gatcaaagtc aaactgtgcc tcttgtgttt ctctatcttc ccagaaaatt ccataatcag 60 caagagggcc atgatccatt ggtggattgg tgagggttta gtagcagcca cacgaaatca 120 gactgcagaa gatgttggga aagattgctt taacaagctg attgctaagg agataattga 180 acctgtgcac gtgaaacgga gctgtagtgt cagtcaatgt aagttgcacc cttggattcg 240 ccgtatgttg attactgttg cgagaaaagc actttttttt gaatttgatt cagaaggcaa 300 tgcaacatgg gacatttcag gtactcaccg tgcttgttta gttgaagaac ataaacgaga 360 aatagaaaca gcaaaggtca aaaaccaacc tacagatggc ctgctcacaa tatttaatgt 420 gaatgagcga tacctccagt ttgactttga tc 452 <210> 25 <211> 235 <212> DNA <213> Oryza punctata <400> 25 gatcaaagtc aaactgacat gattaataac aaaaaagaac tgctggttgc agacatagat 60 ttttctaaaa acactaaatt agcacctaca ttgtatgaag aatgaacaaa aagaaacata 120 tgtacgtcag gaacaaaaga aaaaaagaat gtggtacaac ctctatgcta cttatagtca 180 gttgttatcc actaccagtg ctagcaggac cacggaatcc agtttgactt tgatc 235 <210> 26 <211> 235 <212> DNA <213> Oryza punctata <400> 26 gatcaaagtc aaactgacat gattaataac aaaaaagaac tgctggttgc agacatagat 60 ttttctaaaa acactaaatt agcacctaca ttgtatgaag aatgaacaaa gagaaacata 120 tgtacgtcag gaacaaaaga aaaaaagaat gtggtacaac ctctatgcta cttatagtca 180 gttgttatcc actaccagtg ctagcaggac cacggaatcc agtttgactt tgatc 235 <210> 27 <211> 452 <212> DNA <213> Oryza punctata <400> 27 gatcaaagtc aaactgtgcc tcttgtgttt ctctatcttc ccagaaaatt ccatcatcag 60 caagaaggcc atgatccttt ggtggattgg tgagggttta gtagtagcca cacgaaatca 120 gactgcggaa gatgttggga aagattgctt tgataagctg attgctaagg agatgattga 180 acctgtgcac gtgaaacgga gctgtagtgt caatcaatgt aagttgcacc cttggattcg 240 ccgtatgttg attactgttg caagaaaagc acaatttttt gaatttgatt cagaaggcga 300 tgcaacatgg gacatttcag gtactcaccg tgcttgttta gttgaagaac ataaacgaga 360 aatagaaaca gcaaaggtca aaaaccaacc tacagatggc ctgctcacaa tgtttaatgt 420 gaatgagcga tacctccagt ttgactttga tc 452 <210> 28 <211> 452 <212> DNA <213> Oryza punctata <400> 28 gatcaaagtc aaactgtgcc tcttgtgttt ctctatcttc ccagaaaatt ccatcatcag 60 caagaaggcc atgatccttt ggtggattgg tgagggttta gtagcagcca cacgaaatca 120 gactgcggaa gatgttggga aagattgctt tgataagctg attgctaagg agatgattga 180 acctgtgcac gtgaaacgga gctgtagtgt caatcaatgt aagttgcacc cctggattcg 240 ccgtatgttg attactgttg caagaaaagc acaatttttt gaatttgatt cagaaggcaa 300 tgcaacatgg gacatttcag gtactcaccg tgcttgttta gttgaagaac ataaacgaga 360 aatagaaaca gcaaaggtca aaaaccaacc tacagatggc ctgctcacaa tatttaatgt 420 gaatgagcga tacctccagt ttgactttga tc 452 <210> 29 <211> 187 <212> DNA <213> Oryza officinalis <400> 29 gatcaaagtc aaactgcttc aaacttaaac taagtttcta tacaaatata gtaatgttta 60 tataatacct aattagtttc cttaaatgta taattgaata tattttcata ttatacttat 120 cttgggttga aaatattact acttttccta taaactcggt caaacttgaa acagtttgac 180 tttgatc 187 <210> 30 <211> 543 <212> DNA <213> Oryza officinalis <400> 30 gatcaaagtc aaactgtcaa agctttgtat tttgttctgt gattaagctt gctggacggg 60 tttaaaaaaa ttaaccaaat ttctaacctt agcttgtgat tatattttgg gggcaaaatt 120 actcgaattt atgaccttgt atttgttctg tgattcgtgc ttcgtctcgt cgagtgatgg 180 atgtatagac atctcctaaa cacatatgat acacatggaa ttgcctttga tgacgtcata 240 taacatattt acacaatgtc aaacgatttt tcataaaatc gtctatgacg atggtaaccg 300 tgtgaatgcc agtcattcaa ctataccgat cgaccagatg ccccatatag ctccatgtgt 360 caaatcttaa atagctataa cttaataaat tagtgtggtc acagttttca aatactcctt 420 tattccaacc aacatacggg aaccacggtt gctagcaaag accatatata agaagccgcg 480 gatagacata catatgcctg tttggtacaa ggtggtagtc ctacagccag tttgactttg 540 atc 543 <210> 31 <211> 543 <212> DNA <213> Oryza officinalis <400> 31 gatcaaagtc aaactgtcaa agctttgtat tttgttctgt gattaagctt gctggacggg 60 tttaaaaaaa ttaaccaaat ttctaacctt agcttgtgat tatattttgg gggcaaaatt 120 actcgaattt atgaccttgt attttgttct gtgattcgtg cttcgtctcg tcgagtgatg 180 gatatataga catctcctaa acacatatga tacacatgga attgcctttg atgacgtcat 240 ataacatatt tacacaatgt caaacgattt ttcataaatc gtctatgacg atggtaaccg 300 tgtgaatgcc agtcattcaa ctataccgat cgaccagatg ccccatatag ctccatgtgt 360 caaatcttaa atagctataa cttaataaat tagtgtggtc acagttttca aatactcctt 420 tattccaacc aacatacggg aaccacggtt gctagcaaag accatatata agaagccgcg 480 gatagacata catatgcctg tttggtacaa ggtggtagtc ctacagccag tttgactttg 540 atc 543 <210> 32 <211> 545 <212> DNA <213> Oryza officinalis <400> 32 gatcaaagtc aaactgtcaa agctttgtat tttgttctgt gattaagctt gctggacggg 60 gtttaaaaaa attaaccaaa tttctaacct tagcttgtga ttatattttg ggggcaaaat 120 tactcgaatt tatgaccttg tattttgttc tgtgattcgt gcttcgtctc gtcgagtgat 180 ggatatatag acatctccta aacacatatg atacacatgg aattgccttt gatgacgtca 240 tataacatat ttacacaatg tcaaacgatt tttcataaaa tcgtctatga cgatggtaac 300 cgtgtgaatg ccagtcattc aactataccg atcgaccaga tgccccatat agctccatgt 360 gtcaaatctt aaatagctat aacttaataa attagtgtgg tcacagtttt caaatactcc 420 tttattccaa ccaacatacg ggaaccacgg ttgctagcaa agaccatata taagaagccg 480 cggatagaca tacatatgcc tgtttggtac aaggtggtag tcctacagcc agtttgactt 540 tgatc 545 <210> 33 <211> 235 <212> DNA <213> Oryza minuta <400> 33 gatcaaagtc aaactgacat gattaataac aaaaaagaac tgctggttgc agacatagat 60 ttttctaaaa gcactaaatt agcacctaca ttgtatgaag aatgaacaaa aagaaacata 120 tgtacgtcag gaacaaaaga aaaaaagaat gtggtacaac ctctatgcta cttatagtca 180 gttgttatcc accaccagtg ctagcaggac cacggaatcc agtttgactt tgatc 235 <210> 34 <211> 544 <212> DNA <213> Oryza minuta <400> 34 gatcaaagtc aaactgtcaa agctttgtat tttgttctgt gattaagctt gctggacggg 60 tttaaaaaaa ttaaccaaat ttctaacctt agcttgtgat tatattttgg gggcaaaatt 120 actcgaattt atgaccttgt attttgttct gtgattcgtg cttcgtctcg tcgagtgatg 180 gatatataga catctcctaa acacatatga tacacatgga attgcctttg atgacgtcat 240 ataacatatt tacacaatgt caaacgattt ttcataaaat cgtctatgac gatggtaacc 300 gtgtgaatgc cagtcattca actatgccga tcgaccagat gccccatata gctccatgtg 360 tcaaatctta aatagctata acttaataaa ttagcgtggt cacagttttc aaatactcct 420 ttattccaac caacatacgg gaaccacggt tgctagcaaa gaccatatat aagaagccgc 480 ggatagacat acatatgcct gtttggtaca aggtggtagt cctacagcca gtttgacttt 540 gatc 544 <210> 35 <211> 544 <212> DNA <213> Oryza minuta <400> 35 gatcaaagtc aaactgtcaa agctttgtat tttgttctgt gattaagctt gctggacggg 60 tttaaaaaaa ttaaccaaat ttctaacctt agcttgtgat tatattttgg gggcaaaatt 120 actcgaattt atgaccttgt attttgttct gtgattcgtg cttcgtctcg tcgagtgatg 180 gatatataga catctcctaa acacatatga tacacatgga attgccttag atgacgtcat 240 ataacatatt tacacaatgt caaacgattt ttcataaaat cgtctatgac gatggtaacc 300 gtgtgaatgc cagtcattca actataccga tcgaccagat gccccatata gctccatgtg 360 tcaaatctta aatagctata acttaataaa ttagcgtggt cacagttttc aaatactcct 420 ttattccaac caacatacgg gaaccacggt tgctagcaaa gaccatatat aagaagccgc 480 ggatagacat acatatgcct gtttggtaca aggtggtagt cctacagcca gtttgacttt 540 gatc 544 <210> 36 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PangFR primer for PCR <400> 36 ttkgatcaaa gtcaaactg 19 <210> 37 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequence of MseI adaptor for AFLP <400> 37 gacgatgagt cctgag 16 <210> 38 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequence of MseI adaptor for AFLP <400> 38 tactcaggac tcat 14 <210> 39 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MseI+0 primer for AFLP <400> 39 gacgatgagt cctgagtaa 19 <210> 40 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PangMAP primer for AFLP <400> 40 aarcagtttg actttgatc 19 <210> 41 <211> 244 <212> DNA <213> Oryza sp. <400> 41 gacgatgagt cctgagtaaa acttttttta ctaatctctt accatcaaaa tttgcgcaga 60 ttagagggca cttagcgagg ccactaacca ctgtggcacg gacggaatca tgggtttgat 120 ccctcgcacg cagatatcga atcacgtatc tacggtgata gatcgtgcgg tggaactcgt 180 tgtaaaatac tacatccatt ttagcttgta agatatattg agtttgatca aagtcaaact 240 gctt 244 <210> 42 <211> 245 <212> DNA <213> Oryza sp. <400> 42 gacgatgagt cctgagtaaa cagaaaacgg ctgtgcaaat catatccaga cagcgaaata 60 ataaacaaat catgtgatct aataattatc tttgtttatg ccttgtagtc tacctagtat 120 tcagcgaaat aataaacaaa tcatgtgatc taataattat ctttgtttat ggcttgtagt 180 ctacccagta ttccctccgt ttcaggttac aagacgtttt gatattgatc aaagtcaaac 240 tgctt 245

Claims

말단 역위 반복 서열(terminal inverted repeat)로서, 5' 말단 영역에 서열번호 4로 표시되는 올리고뉴클레오티드와 3' 말단 영역에 서열번호 5로 표시되는 올리고뉴클레오티드를 갖는 것을 특징으로 하는 MITE(miniature inverted-repeat transposable element).
제 1항에 있어서, 벼속(Oryzaspp.) 식물로부터 분리된 것을 특징으로 하는 MITE.
제 1항에 있어서, 서열번호 6으로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 MITE.
제 3항에 있어서, 오리자 글라베리마(Oryza glaberrima)로부터 분리된 것을 특징으로 하는 MITE.
제 1항에 있어서, 서열번호 7로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 MITE.
제 5항에 있어서, 오리자 글루미파툴라(Oryza glumipatula)로부터 분리된 것을 특징으로 하는 MITE.
제 1항에 있어서, 서열번호 8로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 MITE.
제 7항에 있어서, 오리자 니바라(Oryza nivara)로부터 분리된 것을 특징으로 하는 MITE.
제 1항에 있어서, 서열번호 9로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 MITE.
제 9항에 있어서, 오리자 루피포곤(Oryza rufipogon)으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 MITE.
제 1항에 있어서, 서열번호 10으로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 MITE.
제 11항에 있어서, 오리자 사티바(Oryza sativa)로부터 분리된 것을 특징으로 하는 MITE.
제 1항에 있어서, 서열번호 11로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 MITE.
제 1항에 있어서, 서열번호 12로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 MITE.
제 1항에 있어서, 서열번호 13으로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 MITE.
제 13항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 오리자 라티폴리아(Oryza latifolia)로부터 분리된 것을 특징으로 하는 MITE.
제 1항에 있어서, 서열번호 14로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 MITE.
제 1항에 있어서, 서열번호 15로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 MITE.
제 1항에 있어서, 서열번호 16으로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 MITE.
제 1항에 있어서, 서열번호 17로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 MITE.
제 1항에 있어서, 서열번호 18로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 MITE.
제 1항에 있어서, 서열번호 19로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 MITE.
제 17항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 오리자 알타(Oryza alta)로부터 분리된 것을 특징으로 하는 MITE.
제 1항에 있어서, 서열번호 20으로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 MITE.
제 1항에 있어서, 서열번호 21로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 MITE.
제 1항에 있어서, 서열번호 22로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 MITE.
제 1항에 있어서, 서열번호 23으로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 MITE.
제 1항에 있어서, 서열번호 24로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 MITE.
제 24항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, 오리자 그란디글루미스(Oryza grandiglumis)로부터 분리된 것을 특징으로 하는 MITE.
제 1항에 있어서, 서열번호 25로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 MITE.
제 1항에 있어서, 서열번호 26으로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 MITE.
제 1항에 있어서, 서열번호 27로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 MITE.
제 1항에 있어서, 서열번호 28로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 MITE.
제 30항 내지 제 33항 중 어느 한 항에 있어서, 오리자 푼크타타(Oryza punctata)로부터 분리된 것을 특징으로 하는 MITE.
제 1항에 있어서, 서열번호 29로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 MITE.
제 1항에 있어서, 서열번호 30으로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 MITE.
제 1항에 있어서, 서열번호 31로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 MITE.
제 1항에 있어서, 서열번호 32로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 MITE.
제 35항 내지 제 38항 중 어느 한 항에 있어서, 오리자 오피시날리스(Oryza officinalis)로부터 분리된 것을 특징으로 하는 MITE.
제 1항에 있어서, 서열번호 33으로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 MITE.
제 1항에 있어서, 서열번호 34로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 MITE.
제 1항에 있어서, 서열번호 35로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 MITE.
제 40항 내지 제 42항 중 어느 한 항에 있어서, 오리자 미누타(Oryza minuta)로부터 분리된 것을 특징으로 하는 MITE.
제 1항의 MITE를 증폭하기 위한 프라이머.
제 44항에 있어서, 서열번호 36으로 표시되는 프라이머.
제 44항 또는 제 45항의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행함으로써 식물에서 MITE를 탐색하는 방법.
제 1항의 MITE 또는 이의 단편을 이용하여 식물의 유전적 다양성을 분석하는 방법.
제 47항에 있어서, 서열번호 40으로 표시되는 프라이머를 이용하여 AFLP(amplified fragment length polymorphism)를 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항의 MITE 또는 이의 단편을 이용하여 식물의 연관 유전자 지도를 작성하는 방법.
제 49항에 있어서, 서열번호 40으로 표시되는 프라이머를 이용하여 AFLP를 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항의 MITE 또는 이의 단편을 이용하여 식물의 유전자를 탐색하는 방법.
제 51항에 있어서, 상기 유전자는 특정 형질에 대한 DNA 마커인 것을 특징으로 하는 방법.
제 51항에 있어서, 서열번호 40으로 표시되는 프라이머를 이용하여 AFLP를 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.