KR20040039316A

KR20040039316A - 퇴행성 신경 질환 치료용 조성물 및 치료 방법

Info

Publication number: KR20040039316A
Application number: KR10-2004-7003027A
Authority: KR
Inventors: 오자와게이야; 무라마쯔신이찌; 이께구찌구니히꼬; 나까노이마하루
Original assignee: 다나베 세이야꾸 가부시키가이샤
Priority date: 2001-08-29
Filing date: 2002-08-29
Publication date: 2004-05-10
Also published as: WO2003018821A2; JP4279141B2; EP1421199A2; ATE475716T1; CN1575340A; EP1421199B1; CA2457057A1; DE60237158D1; US20030050273A1; WO2003018821A3; AU2002326163B2; JP2005501127A; CA2457057C; CN1304581C

Abstract

기존 신경 손상이 있는 대상체의 치료를 위한 조성물 및 치료 방법이 개시되었다. 본 발명의 조성물 및 방법은 파킨스씨병과 같은 신경퇴행성 질환이 있는 대상체에 신경교 세포주 유래 신경영양성 인자 (GDNF) 의 전달을 위한 아데노-회합 바이러스 (AAV) 계 유전자 전달 시스템을 이용한다.

Description

퇴행성 신경 질환 치료용 조성물 및 치료 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING NEURODEGENERATIVE DISEASES}

중추 신경계 (CNS) 장애는 주요한 공중 보건 문제를 나타낸다. 파킨슨씨 병 (PD) 은 단독적으로는 미국에서 백만명 이상의 인구에 영향을 미친다. 임상적으로는, PD 는 자발 운동의 감소, 보행 장애, 자세 불안정, 경축 및 진전 (tremor) 을 특징으로 한다. PD 는 흑질-선조체 (SN) 내에서 도파민성 (DA) 신경세포에 주로 영향을 미치는 진행성 신경퇴행성 장애이다. 최근에는, 다수의 CNS 장애가 치료제의 전신 투여로 치료된다. 그러나, 전신 투여는 종종 약물이 혈뇌장벽 (blood-brain barrier) 을 통과하지 못하기 때문에 비효율적이다. 상기 화합물들이 혈뇌 장벽 침투에 성공하는 경우라도, 이들은 중추신경계 부작용을 유발할 수 있다. 따라서, 단백질과 같은 다수의 잠재적으로 유용한 화합물들은 전신투여되지 못한다.

PD 의 최근 이용가능한 요법은 운동 기능을 복구하기 위해 선조체에서의 도파민 교체에 목적을 두고 있다. 그러나, 진행되는 퇴행 과정을 차단 또는 감속하는 치료적인 중재를 개발하는 것이 핵심적이다 (Dunnett 등, Nature (1999)399: A32-39). 신경교 세포주-유도 신경영양 인자 (GDNF) 는 DA 신경세포에 대해 지금까지 발견된 가장 강력한 신경영양 인자이며, 시험관 내 및 생체내에서 DA 신경세포 생존을 증강시키는 것으로 나타났다 (Bjorklund 등, Brain Res. (2000)886: 82-98; Bohn, M.C., Mol. Ther. (2000)1: 494-496; Ozawa 등, J. Neural Transm. Suppl. (2000)58: 181-191). 그러나, 중추신경계로의 GDNF 단백질의 투여는 문제가 있다. GDNF 은 단기간 동안만 활성을 간직하며, 그의 비교적 큰 크기때문에 GDNF 는 혈뇌장벽을 통과하지 않아, 뇌로의 직접적인 투여만이 전달의 유일한 가능한 수단이다. 이는, 그의 치료 유용성을 심각하게 한정하는 뇌 또는 뇌실 (ICV) 로의 GDNF 의 정위 주입 전달을 필요조건으로 한다. 따라서, 직접적인 생체내 유전자 수송은 GDNF 전달의 더욱 효과적인 방법을 제공한다.

아데노-회합 바이러스 (AAV) 는 유전자 치료를 위한 유전자 전달에 성공적으로 이용된다. AAV 게놈은 선형의, 약 4681 개의 뉴클레오티드를 포함하는 단일-가닥 DNA 분자이다. AAV 게놈은 일반적으로 역전된 말단 반복서열 (ITRs) 에 의해 각각의 말단이 절단된 내재적인 비반복성 게놈을 포함한다. ITRs 는 길이가 약 145 염기쌍 (bp) 이다. ITRs 은 DNA 복제의 기원으로서의 기능 및 바이러스 게놈용 팩킹 시그널로서의 기능을 포함하는 다중적인 기능을 갖는다. 게놈의 내재적인 비반복성 부분은 AAV 복제 (rep) 및 캡시드 (cap) 유전자로 공지된 2 개의 큰 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 상기 rep 및 cap 유전자 코드는 바이러스가 비리온으로 복제 및 팩킹되도록 하는 바이러스성 단백질을 코딩한다. 특히, 4 개 이상의 바이러스 단백질의 패밀리는 그의 분자량에 따라 명명된 AAV rep 영역, Rep 78, Rep 68, Rep 52 및 Rep 40 로부터 발현된다. AAV cap 영역은 3 개 이상의 단백질 VPI, VP2 및 VP3 을 코딩한다.

AAV 은 AAV 게놈의 내재적인 비반복성 부분 (즉, rep 및 cap 유전자) 를 결실시키고, ITRs 사이에 이종성 유전자를 삽입함으로써 관심있는 유전자를 전달하도록 조작되었다. 이종성 유전자는 전형적으로는, 적당한 조건 하에 환자의 표적 세포에서 유전자 발현을 구동할 수 있는 이종성 프로모터 (구조적이거나, 세포 특이성이거나, 또는 유발성임) 에 기능적으로 연결되어 있다. 폴리아데닐화 부위와 같은 종결 시그널이 또한 포함될 수 있다.

AAV 는 헬퍼 의존성 바이러스이다; 즉, AAV 비리온을 형성하기 위해서는 헬퍼 바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스 또는 백시니아) 와 함께 감염되어야 한다. 헬퍼 바이러스와 함께 감염시키지 않으면, AAV 는 바이러스성 게놈이 숙주 세포 크로모좀에 삽입되나, 감염성 비리온은 생성되지 않는 휴면 상태에 들어간다. 헬퍼 바이러스에 의한 후속적인 감염은 통합된 게놈을 "구조 (rescue)" 하며, 이는 그의 게놈을 감염성 AAV 비리온으로 복제 및 팩킹되도록 한다. AAV 가 상이한 종 유래의 세포를 감염시킬 수 있지만, 헬퍼 바이러스는 숙주 세포와 동일한 종의 것이어야 한다. 따라서, 예를 들어, 인간 AAV 는 캐닌 아데노바이러스 (canine adenovirus) 로 감염된 캐닌 세포에서 복제한다.

연구들에서는 AAV, 아데노바이러스 (Ad) 또는 렌티바이러스 (lentiviral) 벡터계 시스템을 이용한 GDNF 유전자의 전달이 흑질 DA 신경세포를 보호하면서, 신경독소의 주입 전 또는 직후에 투여하는 경우 PD 의 설치류 및 영장류 모델에서 흑질-선조체 경로를 재생시킨다는 것을 증명했다 [Choi-Lundberg 등, Science (1997)275: 838-841; Mandel 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997)94: 14083-14088; Bilang-Bieuel 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997)94: 8818-8823; Choi-Lundberg 등, Exp. Neurol. (1998)154: 261-275; Mandel 등, Exp. Neurol. (1999)160: 205-214; Kirik 등, J. Neurosci (2000)20: 4686-4700; Bensadoun 등, Exp. Neurol. (2000)164: 15-24; 및 Kordower 등, Science (2000)290: 767-773]. 그러나, 선행 연구에서는 GDNF 가 발작 후 지연되어 투여되는 경우, DA 신경세포의 스페어링 (sparing) 은 주변적인 것일 뿐이며, 대부분의 기능 회복은 흑질-선조체 연결이 여전히 살아있고 유지되는 DA 신경세포의 갯수를 반영한다는 것을 나타낸다 [Kirik 등, J. Neurosci. (2000)20: 4686-4700; Connor 등, Gene Therapy (1999)6: 1936-1951; Winkler 등, J Neurosci. (1996)16: 7206-7215; Natsume 등, Exp. Neurol. (2001)169: 231-238). 따라서, 신경퇴행 과정에서 더 늦은 상에서의, AAV 벡터계 시스템을 통해 만성적으로 전달되는 GDNF 유전자의 유효성은 이전에 발표된 적이 없다.

PD 는 진행성 DA 퇴행을 특징으로 하며, 병후의 명확한 출현 전에 DA 신경세포의 실질적인 갯수가 감소된다. 따라서, 지연 방식으로 전달되는 GDNF 유전자가DA 신경세포를 구출할 수 있는지의 여부 및 과도한 흑질-선조체 DA 탈신경이 있는 동물 모델에서 거동 수행 개선되는지의 여부를 밝히는 것이 임상적으로는 더욱 중요하다. 또한, 벡터계 GDNF 가 SN 내에서 DA 신경세포의 액손 말단으로부터 세포체로 역행적으로 수송되는지 여부가 아직 명확하지 않다.

본 발명은 일반적으로 유전자 전달을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 파킨슨씨 병과 같은 신경퇴행 상태에 의해 초래되는 기존 신경세포 손상을 치료하기 위해 신경교 세포주 (glial cell) 유래 신경영양 인자 (GDNF) 를 전달하기 위한 아데노-회합 바이러스 (AAV) 계 유전자 전달 시스템에 관한 것이다.

발명의 개요

당 분야에서는 기존 신경세포 손상을 치료하기 위해 GDNF 를 전달하기 위한 대안적인 수단이 필요하다. 본 발명은 과도한 흑질-선조체 도파민성 (DA) 탈신경이 있는 대상체에 대한 AAV 벡터 중재 GDNF 전달이 흑질-선조체 (SA) 에서의 DA 신경세포의 생존을 촉진하고, 타이로신 히드록실라아제 (TH)-양성 DA 섬유의 밀도를 증가시키며, 퇴행 과정이 시작된 이후라도 행동학적 및 생화학적 결핍을 개선시킨다는 발견에 근거한다. 더욱이, 형질전환유전자-유도 GDNF 는 SN 내에서 선조체로부터 DA 세포체로 역방향으로 수송되면서, 실질적인 DA 세포수가 감소된 이후라도 흑질-선조체 경로 내에서의 기능적인 연결을 유지한다.

따라서, 한 구현예에서, 주제 발명은 기존 신경세포 손상이 있는 포유류 대상체의 치료 방법에 관한 것이다. 상기 방법은, 치료 효과를 제공하기 위해 생체내 신경세포 내에서의 폴리뉴클레오티드 발현을 초래하는 조건 하에, 프로모터를 포함하는 발현 제어 인자에 작동적으로 연결된 GDNF 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 대상체 재조합 AAV 비리온을 대상체 중추신경계에 투여하는 단계를 포함한다.

특정한 구현예에서, 기존 신경세포 손상에는 중등 또는 과도한 흑질-선조체 도파민성 (DA) 탈신경을 포함한다.

추가적인 구현예에서, 신경 세포는 생체내 형질도입되며, 재조합 AAV 비리온은 상기 대상체의 선조체에 투여된다.

추가적인 구현예에서, 상기 재조합 AAV 비리온은 컨벡션-강화 전달법 (CED) 을 이용해 선조체로 투여된다.

특정 구현예에서, 대상체는 인간이다.

또다른 구현예에서, 본 발명은 기존 신경세포 손상이 있는 포유류 대상체의 치료 방법에 관한 것이다. 기존 신경세포 손상에는 중등 내지 과도한 흑질-선조체 DA 탈신경이 포함되며, 상기 방법에는, 대상체의 선조체로 생체내 신경세포의 형질도입을 초래하는 조건 하에 프로모터를 포함하는 발현 제어 인자에 작동적으로 연결된 GDNF 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 AAV 비리온을 함유하는 조성물을 투여하는 단계가 포함되며, 생체내에 형질도입된 신경세포에 의한 폴리뉴클레오티드의 발현이 치료 효과를 제공한다.

추가적으로는, 상기 재조합 AAV 비리온은 CED 를 이용하여 대상체의 선조체에 투여될 수 있다.

또다른 구현예에서, 본 발명은 기존 신경세포 손상이 있는 포유류 대상체의 치료 방법에 관한 것이다. 기존 신경세포 손상에는 중등 내지 과도한 흑질-선조체 DA 탈신경이 포함되며, 상기 방법에는, CED 를 이용한, 생체내에서 대상체의 선조체로 신경세포의 형질도입을 초래하는 조건 하에 프로모터를 포함하는 발현 제어인자에 작동적으로 연결된 GDNF 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 AAV 비리온을 함유하는 조성물을 투여하는 단계가 포함되며, 생체내에 형질도입된 신경세포에 의한 폴리뉴클레오티드의 발현이 치료 효과를 제공한다.

상기 기재된 임의의 방법에서, 프로모터는 바이러스 프로모터, 예컨대 MLP, CMV 또는 RSV LTR 프로모터일 수 있다.

CED 가 이용되는 경우, 투여는 삼투압 펌프 또는 주입 펌프를 이용하여 수행될 수 있다.

상기 임의의 방법에서 폴리뉴클레오티드는 추가로 5' 위치 및 GDNF 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 가진 리딩 프레임 내에 분비 서열을 포함할 수 있다. 추가적으로는, 폴리뉴클레오티드는 인간 GDNF, 예컨대 인간 pre-pro-GDNF 를 코딩할 수 있다.

본 발명은 또한 상기 언급된 질환 또는 장애를 가진 포유류 대상체 치료용 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 치료 효과를 제공하기 위해 신경 세포의 형질도입을 초래하는 조건 하에, 프로모터를 포함하는 발현 제어 인자에 작동적으로 연결된 GDNF 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 AAV 비리온을 함유한다. 본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 임의로 함유하는 약제학적 조성물일 수 있다.

따라서, 본 발명은 하기를 제공한다.

1. 기존 신경세포 손상이 있는 포유류 대상체의 중추 신경계에 조성물을 투여함으로써 상기 대상체를 치료하기 위한 조성물의 용도로서, 상기 조성물이 재조합 아데노-회합 바이러스 (AAV) 비리온을 함유하며, 상기 비리온은 프로모터를 포함하는 발현 제어 인자에 작동적으로 연결된 신경교 세포주-유래 신경영양 인자(GDNF) 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 용도.

2. 제 1 항목에 있어서, 대상체가 인간인 용도.

3. 제 1 항목 또는 제 2 항목에 있어서, 상기 기존 신경세포 손상에 중등 내지 대규모의 흑질-선조체 (nigrostriatal) 도파민성 (DA) 탈신경이 포함되는 용도.

4. 제 1 항목 내지 제 3 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 GDNF 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 가진 리딩 프레임 (reading frame) 및 제 5' 위치에 분비 서열을 추가로 포함하는 용도.

5. 제 1 항목 내지 제 4 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 인간 GDNF 를 코딩하는 용도.

6. 제 5 항목에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 인간 pre-pro-GDNF 인 용도.

7. 제 1 항목 내지 제 6 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 조성물이 상기 대상체의 선조체에 투여되는 용도.

8. 제 1 항목 내지 제 7 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 프로모터가 바이러스 프로모터인 용도.

9. 제 8 항목에 있어서, 프로모터가 MLP, CMV 또는 RSV LTR 프로모터인 용도.

10. 제 1 항목 내지 제 9 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 재조합 AAV 비리온이 상기 대상체의 선조체에 투여되는 용도.

11. 제 10 항목에 있어서, 재조합 AAV 비리온이 컨벡션-강화 전달 (CED) 을 이용하여 선조체에 투여되는 용도.

12. 제 11 항목에 있어서, 투여가 삼투압 펌프를 이용하여 수행되는 용도.

13. 제 11 항목에 있어서, 투여가 주입 펌프를 이용하여 수행되는 용도.

본원에 기재된 관점에서 본 발명의 상기 및 기타 구현예는 당업자에게는 즉시 이행될 수 있다.

도면의 간단한 설명

도 1a 및 1b 는 AAV 벡터의 개념도이다. 도 1a 에서,LacZ 는 CMV 프로모터의 전사 제어 하에 있다. 도 1b 에서, 마우스 GDNF cDNA 는 FLAG 펩티드의 코딩 서열과 C-말단에서 융합되어 있으며, CMV 프로모터의 전사 제어 하에 있다. ITR, 역전 말단 반복; CMV, 싸이토메갈로바이러스 중재-초기 프로모터; 인트론, 인간 성장 호르몬의 제 1 인트론; 폴리 A, SV40 폴리아데닐화 시그널 서열.

도 2 는 AAV-GDNFflag로 형질도입 후 293 세포로부터의 세포 추출물의 웨스턴 블롯 분석의 대표도이다. mock (레인 1) 또는 AAV-LacZ (레인 2) 로 형질도입된 293 세포가 음성 대조군으로서 이용되었다. AAV-GDNFflag로 형질도입 (레인 3) 하고 36 시간 후, GDNFflag융합 단백질의 발현은 각각 항-GDNF 및 항-FLAG 항체로 탐지했다.

도 3 은 AAV-GDNFflag로 형질도입된 배양물에서 증가된 DA 신경세포 생존을 나타낸다. TH-IR (DA) 신경세포의 갯수는 AAV-GDNFflag, AAV-LacZ 또는 mock 을사용한 형질도입 9 일 후 래트 E14 중뇌 세포 배양물에서 계수했다. GDNF (10 ng/ml) 를 양성 대조군으로서 배양물에 첨가했다. 오차 바아는 s.e.m. (*P < 0.01) 을 표시한다.

도 4a - 4e 는 선조체에서의 GDNFflag의 발현 및 SN 로의 역방향 수송을 도시한다. AAV-GDNF 를 손상 선조체로 주입하고 4 주 후, 래트를 희생시키고 선조체를 관통하는 두정 부위 및 SN 를 면역염색시켰다. GDNFflag형질전환유전자 발현은 항-FLAG 항체를 가진 선조체에서 탐지되었다 (도 4a 및 4b). 동측 SN 에서의 GDNFflag의 역방향 수송은 폴리클로날 항-TH (4c) 및 모노클로날 항-FLAG (4d) 항체를 사용한 이중 면역형광 염색으로 확인했다. 도 4c 및 4d 의 중복 (4e) 은 SN 에서의 FLAG 및 TH-양성 신경세포의 공동 편재를 나타낸다. 이중양성 신경세포는 치밀한 부분 (pars compacta) 의 광범위한 영역에서 탐지되었다. 상기 도면은 TH 및 FLAG 의 가장 뚜렷한 공동편재가 관찰되는 영역을 나타낸다 (a, 바아 = 100 ㎛; b, 바아 = 25 ㎛; c-e, 바아 = 50 ㎛).

도 5a - 5e 는 선조체에서의 TH-IR 섬유 상의 AAV-GDNFflag주입의 영향을 나타낸다. TH-IR 섬유의 밀도는 AAV-LacZ-주입 동물의 손상 측면 상에서 현저히 감소되었다 (도 5a 및 5c). 대조적으로, AAV-GDNFflag-주입은 처리된 선조체에서의 TH-IR 섬유의 증가된 밀도를 나타냈다 (도 5b 및 5d). 도 5c 및 5d 는 도 5a 및 5b 에서 각각 손상 측면에 화살표로 표시된 영역의 고배율 도면이다. 도 5e 는 도 5b 의 빽빽한 측면 상에 화살표 머리로 표시한 영역 내의 진한 TH-IR 섬유를 나타낸다 (도 5a - 5b, 바아 = 1 mm; 도 5c - 5e, 바아 = 50 ㎛).

도 6a - 6f 는 6-OHDA 손상을 입히고 4 주 후에 CTB 를 사용한 역방향 표지를 나타낸다. SN 로부터의 섹션은 CTB (도 6a 및 6d) 및 TH (도 6b 및 6e) 에 대해 이중 염색했다. 손상 (도 6a - 6c) 및 반대편 (도 6d - 6f) 측면에서의 CTB 양성 세포들은 또한 TH-IR 양성을 나타내, DA 신경세포를 나타낸다. 손상 측면에서는 (도 6a - 6c), TH-양성 신경세포들은, CTB 로 역행 표지하여 손상 4 주째에 일부 DA 신경세포가 선조체 손상에 대한 연결을 유지한다는 것을 나타냈다. 도 6c 는 도 6a 및 6b 의 중복이다. 도 6f 는 도 6d 및 도 6e 의 중복이다 (바아 = 50 ㎛).

도 7a - 7f 는 SN 중에서의 다수의 TH- 및 CTB-양성 세포 상에서의 AAV-GDNFflag의 영향을 나타낸다. 중뇌를 통과하는 관상 섹션은 AAV 벡터 투여 후 20 주째의 TH-IR (도 7a - 7c) 및 CTB-양성 (도 7d - 7f) 흑질 신경세포를 나타낸다. CTB 는 동물을 희생시키기 3 일 전에 선조체에 양방향으로 투여했다. 각각, AAV-LacZ-주입 동물에서의 손상 측면 (도 7a 및 7d), 및 AAV-GDNIflag-주입 동물에서의 손상 측면 (도 7b 및 7e) 및 완전한 반구 (도 7c 및 7f) 로부터의 측면도의 예시. (도 7a - 7c, 바아 = 200 ㎛; 도 7d - 7f, 바아 = 100 ㎛).

도 8 은, AAV-LacZ-주입 동물 (n=8) 에 비해, AAV-GDNFflag주입을 수용한 래트의 손상 SN 에서의 TH-양성 및 CTB-양성 신경세포의 백분율에서의 현저한 증가를 나타낸다. 데이터는 양성 세포의 백분율로 나타냈다 (손상 대 비손상 반구, *P < 0.01).

도 9a - 9b 는 행동 회복에 대한 GDNFflag의 영향을 나타낸다. AAV-GDNFflag(n = 20), AAV-LacZ (n = 16) 또는 비히클 (n= 8) 의 선조체내 주입을 한 래트를 아포모르핀 유도 회전 (apomorphine-induced rotation) 및 원기둥 시험 (cylinder test) 에 대해 검증했다. 아포모르핀 유도 회전에서의 현저한 감소가 AAV-GDNFflag를 수용한 래트에서 관찰되었다. 대조적으로, AAV-LacZ 및 비히클 주입 군에서의 래트는 안정한 회전을 나타냈다. 회전은 60 분 당 회전수로서 나타냈다 (도 9a). 6-OHDA 손상 후 자발적인 앞다리 사용은 원통형 시험을 이용해 평가했다. AAV 처리 전, 래트는 반대쪽 앞발 이용의 감소된 빈도 (전체 접촉의 23 - 25%) 로 나타낸 바와 같이, 현저한 동측 측면 바이어스 (ipsilateral side bias) 를 나타냈다. AAV-GDNFflag-처리 래트는 서서히 개선되었으며, 20 주 째에는 거의 정상 (전체의 47 %) 에 도달했다. 대조적으로, 감소된 앞발 이용 빈도는 AAV-LacZ 또는 비히클을 수용한 래트에서 지속된다. 반대측 (우측) 앞발바닥 접촉은 전체에 대한 백분율로서 나타냈다 (*P < 0.01) (도 9b).

도 10a 및 10b 는 AAV-GDNFflag(n=8) 또는 AAV-LacZ (n=8) 주입 후 20 주 째의 6-OHDA 손상 선조체에서의 도파민 (도 10a) 및 DOPAC 및 HVA (도파민 대사물) (도 10b) 함량을 나타낸다. 데이터는 밀집한 선조체의 백분율로 나타냈다 (P < 0.01).

도 11 (서열 번호: 1 및 2) 는 인간 pre-pro-GDNF 에 대한 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열을 나타낸다. 성숙한 GDNF 분자는 아미노산 위치 78 - 121 에 편재한다.

도 12 (서열 번호: 3 및 4) 는 래트 pre-pro-GDNF 에 대한 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열을 나타낸다. 성숙한 GDNF 분자는 아미노산 위치 78 - 211 에 위치한다.

도 13 (서열 번호: 6 및 7) 는 마우스 pre-pro-GDNF 에 대한 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열을 나타낸다. 성숙한 GDNF 분자는 아미노산 위치 107-240 에 편재한다.

발명의 상세한 설명

본 발명의 수행은, 달리 표시되지 않으면, 당분야의 기술 내에서 바이러스학, 분자생물학 및 재조합 DNA 기술의 통상적인 방법을 이용한다. 상기 기술들은 문헌에 완전히 설명되어 있다. 참고 문헌으로는, 예를 들어, Sambrook 등 Molecular Cloning: A Laboratory Manual (최근판); DNA Cloning: A Practical Approach, Vol.I & II (D. Glover 편저); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, 편저, 최근판); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins 편저, 최근판); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins 편저, 최근판); CRC Handbook of Parvoviruses, vol. I & II (P. Tijssen 편저); Fundamental Virology, 제 2 판, vol. I & II (B.N. Fields 및 D.M. Knipe 편저); Freshney Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique (Wiley-Liss, 제 3 판); 및 Ausubel 등 (1991), Current Protocols in Molecular Biology (Wiley Interscience, NY).

본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태의 "a", "an" 및 "the" 에는, 내용을 달리 명확하게 기재하지 않는 한 복수의 의미도 포함한다.

A. 정의

본 발명을 기술함에 있어서, 하기 용어들이 이용될 것이며, 이는 하기에 나타낸 대로 정의하려 한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "신경교 세포주-유래 신경영양 인자 폴리펩티드" 또는 "GDNF 폴리펩티드" 는 임의의 기원의 신경영양 인자를 의미하며, 임의의 각종 공지된 GDNF 와 실질적으로 동종성이며 기능적으로 동등하다. 3 가지 포유류 종에 대한 대표적인 GDNF 를 도 11, 12 및 13 에 나타냈다. 래트 (도 12, 서열 번호 4) 및 인간 (도 11, 서열 번호 2) 단백질 사이의 상동성은 약 93% 이며, 모든 포유류 GDNF 는 유사한 정도의 상동성을 지녔다. 상기 GDNF 는 그의 생물학적으로 활성인 형태에서는 단량체, 이량체 또는 기타 다중체일 수 있다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "GDNF 폴리펩티드" 는 활성 단량체 GDNF 뿐만 아니라, 활성 다량체 GDNF, GDNF 의 활성 글리코실화 및 비-글리코실화 형태 및 분자의 활성 절단 형태를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 "기능적으로 동등한" 은 천연 GDNF 분자로서의 신경영양 특성의 일부 또는 전부를 보유하나, 동일한 정도일 필요는 없는 GDNF 폴리펩티드임을 의미한다.

"상동성" 은 2 개의 폴리뉴클레오티드들 또는 2 개의 폴리펩티드 부분들 사이의 백분율 유사도를 의미한다. 2 개의 폴리뉴클레오티드, 또는 2 개의 폴리펩티드 서열은, 정의된 분자 길이 전체적으로 약 50% 이상, 바람직하게는 약 75% 이상, 더욱 바람직하게는 80 - 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는95% - 99% 이상의 서열 유사성 또는 서열 동일성을 나타낼 때 서로 "실질적으로 상동" 이라고 일컫는다. 본원에 사용된 바와 같이, 실질적으로 상동임은 또한 특정 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열과 완전히 상동임을 나타내는 서열을 의미한다.

일반적으로, "동일성" 은 2 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열 각각의 정확한 뉴클레오티드 대 뉴클레오티드 또는 아미노산 대 아미노산 대응성을 의미한다. 백분율 동일성은, 서열을 지정해, 2 개의 지정된 서열 사이의 대응되는 정확한 갯수를 계수하고, 더 짧은 서열의 길이로 나눠, 그 결과에 100 을 곱해 결정될 수 있다.

즉시 이용가능한 컴퓨터 프로그램이 유사성 및 동일성 분석에서의 보조에 이용될 수 있는데, 예컨대 [ALIGN, Dayhoff, M.O. [Atlas of Protein Sequence and Structure, M. O. Dayhoff 편저, 5 Suppl.3: 353-358, National biomedical Research Foundation, Washington, DC] 를 이용할 수 있으며, 이는 펩티드 분석을 위해 [Smith and Waterman, Advances in Appl. Math.2: 482-489, 1981] 의 로컬 상동성 알고리즘을 이용한다. 뉴클레오티드 서열 유사성 및 동일성 결정을 위한 프로그램은 [Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 (Genetics Computer Group, Madison, WI 로부터 입수가능), 예를 들어, BESTFIT, FASTA 및 GAP programs, 이는 또한 Smith 및 Waterman 알고리즘에 의존한다] 이 있다. 상기 프로그램들은, 제조사에 의해 권장되며 상기 언급된 Wisconsin Sequence Analysis Package 에 기재된 디폴트 파라미터를 이용해 즉시 사용된다. 예를 들어, 기준서열에 대한 특정 뉴클레오티드 서열의 백분율 유사성은 6 개의 뉴클레오티드 위치에서의 갭 패널티 및 디폴트 스코어링 테이블을 사용한 Smith 및 Waterman 의 상동성 알고리즘을 이용하여 결정할 수 있다.

본 발명의 문맥에서 백분율 유사성을 정하는 또다른 방법은 John F. Collins 및 Shane S. Sturrok 에 의해 개발된 IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA) 에서 제공하며 University of Edinburgh 의 판권소유인 프로그램의 MPSRCH 팩키지를 이용하는 것이다. 패키지의 상기 한 조로부터, 스코어링 테이블을 위해 디폴트 파라미터가 이용되는 곳에 Smith-Waterman 알고리즘이 이용될 수 있다 (예를 들어, 갭 오픈 페널티 12, 갭 신장 페널티 1, 및 갭 6). 생성된 데이터로부터, "Match" 값은 "서열 유사성" 을 반영한다. 서열들 사이의 백분율 동일성 또는 유사성을 계산하기 위한 또다른 적합한 프로그램은 일반적으로 당 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 또다른 지정 프로그램은 디폴트 파라미터와 사용되는 BLAST 이다. 예를 들어, BLASTN 및 BLASTP 는 하기의 디폴트 파라미터를 이용하여 사용될 수 있다: genetic code = standard; filter = none; strand = both; cutoff = 60; expect = 10; Matrix = BLOSUTM62; Descriptions = 50 sequences; sort by = HIGH SCORE; database = non-redundant, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + Swiss protein + Spupdate + PIR. 상기 프로그램의 상세한 사항은 하기 인터넷 주소에서 찾을 수 있다: http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST.

대안적으로는, 상동성은 상동성인 영역들 사이에 안정한 이중선 (duplex) 을 형성하는 조건 하의 폴리뉴클레오티드 혼성화에 이어, 단일 가닥 특이적 뉴클레아제(들)을 사용해 절단하고, 절단된 단편의 크기 결정을 함으로써 결정할 수 있다. 실질적으로 상동성인 DNA 서열은, 예를 들어 특별한 시스템에 대해 정해진 엄격한 조건 하에서의 서던 혼성화 실험 (Southern hybridization experiment) 에서 밝혀질 수 있다. 적당한 혼성화 조건의 정의는 당업자의 재량이다. 예를 들어, Sambrook 등, 상기 문헌; DNA Cloning, 상기 문헌; Nucleic Acid Hybridization, 상기 문헌.

"GDNF 변이체" 는 기준 GDNF 분자의 생물학적으로 활성인 유도체, 또는 상기 유도체의 단편으로서, 요망되는 활성, 예컨대 본원에 기재된 검정에서의 신경영양 활성을 보유하는 것을 의미한다. 일반적으로, 용어 "변이체" 는, 예를 들어 천연 폴리펩티드 서열 및 변형이 신경영양 활성을 해치지 않는 한의 천연 분자에 대한 하나 이상의 부가, 치환 (일반적으로는 천연적으로 보존성임) 및/또는 결실을 가진 화합물을 의미한다. 바람직하게는, 변이체는 천연 분자와 적어도 동일한 신경영양 활성을 갖는다. GDNF 변이체에 대해 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제조하는 방법은 당 분야에 공지되어 있으며, 하기에 기재되어 있다.

GDNF 결실 변이체에 대해, 결실은 일반적으로 약 1 내지 30 개의 잔기, 더욱 일반적으로는 약 1 내지 10 개의 잔기, 전형적으로는 약 1 내지 5 개의 연속적인 잔기의 범위 또는 또는 상기 언급한 범위 내의 임의의 정수의 범위이다. N-말단, C-말단 및 내부적 결실이 포함된다. 결실은 일반적으로 최대 생물학적 활성을 유지하기 위해 다른 TGF-β수퍼 패밀리 멤버와 상동성이 낮은 영역으로 도입된다. 결실은 전형적으로는 영향받는 도메인에서의 GDNF 단백질 생성물의 3 차 구조를 보존하도록 선택되며, 예를 들어 시스테인 가교이다. 결실 변이체의 비제한적 예에는 GDNF 의 1 - 40 N-말단 아미노산이 없는 절단된 GDNF 단백질 생성물, 또는 GDNF 의 C-말단 잔기가 없는 변이체, 또는 이들의 조합이 포함된다.

GDNF 부가 변이체에 대해서는, 아미노산 서열 부가는 전형적으로는 1 개의 잔기 내지 수백개 이상의 잔기를 포함하는 폴리펩티드 길이의 N- 및/또는 C-말단 융합체 뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 내부적 부가를 포함한다. 내부적 부가는 일반적으로 약 1 - 10 잔기의 범위이며, 더욱 전형적으로는 약 1 - 5 잔기의 범위이며, 일반적으로는 약 1 - 3 아미노산 잔기의 범위, 또는 상기 언급된 범위 내에서의 임의의 정수이다. N-말단 부가 변이체의 예에는 GDNF 의 N-말단에 대한 이종성의 N-말단 시그널 서열의 융합체 뿐 아니라 다른 신경영양 인자의 서열로부터 유도된 아미노산 서열의 융합체가 포함된다.

GDNF 치환 변이체는 GDNF 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산 잔기가 제거되고, 그 자리에 삽입되는 상이한 잔기를 갖는다. 상기 치환 변이체에는 대립 유전자 변이체가 포함되며, 상기 변이체는 아미노산 변화를 초래하거나 초래하지 않을 수 있는 종 군집에서의 뉴클레오티드 서열 변화가 자연발생하는 것을 특징으로 한다. 특히 바람직한 치환은 천연의 것이 보존되는 것으로, 즉, 측쇄에 연관된 아미노산의 패밀리 내에서 발생하는 치환이다. 구체적으로는, 아미노산은 일반적으로 4 개의 패밀리로 분류된다: (1) 산성 - 아스파르테이트 및 글루타메이트; (2) 염기성 - 라이신, 아르기닌, 히스티딘; (3) 비극성 - 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판; 및 (4) 비하전 극성 - 글리신,아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 타이로신. 페닐알라닌, 트립토판, 및 타이로신은 종종 방향족 아미노산으로 분류된다. 예를 들어, 류신을 이소류신 또는 발린으로 치환하거나, 아스파르테이트를 글루타메이트로 치환하거나, 트레오닌을 세린으로 치환하거나, 아미노산을 구조적으로 연관된 아미노산으로 유사하게 보존 치환하는 것은 생물학적 활성에 주요한 영향을 갖지 못한다.

예를 들어, GDNF 분자는 분자의 요망되는 기능이 온전히 유지되는 한, 약 5 - 10 개 이하의 보존성 또는 비보존성 아미노산 치환을 가지거나, 또는 약 15 - 25 개 이하의 보존성 또는 비보존성 아미노산 치환, 또는 5 - 25 사이의 임의의 정수로 포함할 수 있다. 당업자는 당업계에 공지된 기술을 이용하여 변화를 견딜 수 있는 관심대상의 분자의 영역을 즉시 결정할 수 있다.

GDNF 아미노산 서열의 특이적인 돌연변이는 글리코실화 부위 (예를 들어, 세린, 트레오닌 또는 아스파라긴) 에 대한 변형을 수반할 수 있다. 글리코실화의 부재 또는 부분적이기만 한 글리코실화는 임의의 아스파라긴 연결 글리코실화 인식 부위 또는 O-연결 카르보히드레이트에 의해 변형되는 분자의 임의의 부위에서의 아미노산 치환 또는 결실로부터 초래된다. 아스파라긴-연결 글리코실화 인식 부위는 적당한 세포 글리코실화 효소에 의해 특이적으로 인식되는 트리펩티드를 포함한다. 상기 트리펩티드 서열은 Asn-Xaa-Thr 또는 Asn-Xaa-Ser 이며, 여기서 Xaa 는 Pro 이외의 임의의 아미노산일 수 있다. 글리코실화 인식 부위의 제 1 또는 제 3 아미노산 위치에서의 각종 아미노산 치환 또는 결실 (및/또는 제 2 위치에서의 아미노산 결실) 은 변형된 트리펩티드 서열에서의 비글리코실화를 초래한다. 따라서, 적당한 변경된 뉴클레오티드 서열의 발현은 상기 부위에서 글리코실화되지 않는 변이체들을 생성한다. 대안적으로는, GDNF 아미노산 서열이 변형되어 글리코실화 부위를 추가한다.

돌연변이화에 대한 GDNF 아미노산 잔기 또는 영역을 동정하기 위한 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다. 상기 중 한가지가, "알라닌 스캐닝 돌연변이화 (alanine scanning mutagenesis)" 로 공지되어 있다. 참고 문헌은, 예를 들어 [Cunningham and Wells, Science (1989)244: 1081-1085] 이다. 상기 방법에서, 표적 잔기의 아미노산 잔기 또는 기 (예를 들어, 하전된 잔기, 예컨대 Arg, Asp, His, Lys 및 Glu) 가 동정되고, 중성 또는 마이너스 하전된 아미노 산 (가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌) 으로 치환되어 아미노산과 주변 수성 환경 또는 세포외부와의 상호작용에 영향을 미친다. 치환에 대한 기능적 감수성을 나타내는 상기 도메인들은 치환 부위에 추가적이거나 또는 대체성인 잔기를 도입하여 정제된다. 따라서, 아미노산 변이체를 도입하기 위한 표적 부위가 결정되며, 알라닌 스캐닝 또는 랜덤 돌연변이화가 DNA 서열의 상응하는 표적 코돈 또는 영역 상에서 수행되며, 발현된 GDNF 변이체는 요망되는 활성 및 활성도의 최적의 조합에 대해 스크리닝된다.

돌연변이화에 대해 가장 관심있는 부위에는, 각종 종들 유래의 GDNF 단백질에서 발견되는 아미노산이 실질적으로 측쇄 벌크, 전하 및/또는 소수성의 측면에서 실질적으로 상이한 부위가 포함된다. 관심있는 다른 부위는 각종 종들로부터 수득되는 GDNF-형 단백질의 특정 잔기가 동일한 것이다. 상기 위치들은 일반적으로단백질의 생물학적 활성에 중요하다. 초기에는, 상기 부위들이 비교적 보존되는 방식으로 치환된다. 상기 치환이 생물학적 활성에서의 변화를 초래하는 경우, 더욱 실질적인 변화 (예시된 치환들) 이 도입되고/도입되거나 다른 부가 또는 결실이 행해질 수 있으며, 수득한 생성물은 활성에 대해 스크리닝된다.

GDNF 활성에 대한 검정법은 당 분야에 공지되어 있으며, 중뇌 신경세포의 배양물에서의 도파민 흡수를 증가시키는 능력 및 교감신경 신경절 신경세포의 생존을 증가시키는 능력을 포함한다. 참고문헌은, 예를 들어 U.S. 특허 제 6,362,319.

"파킨슨씨 병 유사 병후" 에는 근육 진전 (muscle tremor), 근력 약화, 경축, 운동완만, 자세 및 평형에서의 변화, 치매 등 일반적으로 파킨슨씨 병 또는 다른 신경퇴행성 질환과 연관된 병후를 포함한다.

"벡터" 는 플라스미드, 파지, 트랜스포존, 코스미드, 크로모좀, 바이러스, 비리온 등과 같은 임의의 유전 인자로서, 적절한 제어 인자와 회합될 시 복제가능하며 세포들 사이에서 유전자 서열을 수송시킬 수 있는 것을 의미한다. 따라서, 상기 용어에는 클로닝 및 발현 비히클 뿐 아니라 바이러스 벡터를 포함한다.

"AAV 벡터" 는 아데노-회합 바이러스 혈청형으로부터 유도된, 이에 한정되지 않는, AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV6, AAV-7 및 AAV-8 을 포함하는 벡터를 의미한다. AAV 벡터는, 바람직하게는 rep 및/또는 cap 유전자의, 전부 또는 일부에서 결실된 하나 이상의 AAV 야생형 유전자를 가질 수 있으나, 기능성 절단 ITR 서열을 포함할 수 있다. 기능성 ITR 서열은 AAV 비리온의 구조, 복제 및 팩킹에 필요하다. 따라서, AAV 벡터는 본원에서는 적어도 복제 및 팩킹 쪽에서 필요한 바이러스의 상기 서열들 (예를 들어, 기능성 ITR) 을 포함하는 것으로 정의된다. ITR 은 야생형 뉴클레오티드 서열일 필요는 없으며, 예컨대 서열이 기능성의 구조, 복제 및 팩킹을 제공하는 한, 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변경될 수 있다.

"AAV 헬퍼 기능" 은 AAV 유전자 생성물을 제공하도록 발현한 후 생산력을 가진 AAV 복제에 대해 다른 면에서 기능할 수 있는 AAV-유도 코딩 서열을 의미한다. 따라서, AAV 헬퍼 기능에는 주요 AAV 오픈 리딩 프레임 (ORFs), rep 및 cap 를 모두 포함한다. Rep 발현 생성물은 다른 것들 중에서도 특히, 하기의 것을 포함하는 다수의 기능을 보유하는 것으로 나타난다; DNA 복제의 AAV 기원의 인식, 결합 및 닉 (nick); DNA 헬리케이즈 활성; 및 AAV (또는 다른 이종성체) 프로모터로부터의 전사 조절. Cap 발현 생성물은 필요한 팩킹 기능을 공급한다. AAV 헬퍼 기능은 본원에서 AAV 벡터로부터 소실되는 AAV 기능을 다른 면에서 보완하기 위해 사용된다.

용어 "AAV 헬퍼 구축물" 은 일반적으로, 관심대상의 뉴클레오티드 서열의 전달을 위한 형질도입용 벡터를 생산하기 위해 사용되는 AAV 벡터에서 결실되는 AAV 기능들을 제공하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 의미한다. AAV 헬퍼 구축물은 일반적으로 용균성 AAV 복제에 필요한, 소실된 AAV 기능을 보완하기 위해 AAV rep 및/또는 cap 유전자의 일과성 발현을 제공하기 위해 사용된다; 그러나, 헬퍼 구축물은 AAV ITR 가 없으며, 자신을 복제 또는 팩킹할 수 없다. AAV 헬퍼 구축물은 플라스미드, 파지, 트랜스포존, 코스미드, 바이러스 또는 비리온의형태일 수 있다. 다수의 AAV 헬퍼 구축물이 기재되어 있으며, 예컨대 일반적으로 사용되는 플라스미드인, Rep 및 Cap 발현 생성물을 모두 코딩하는 pIM29+45 및 pAAV/Ad 가 기재되어 있다. 참고 문헌으로는, 예를 들어, [Samulski 등 (1989) J. Virol.63: 3822-3828; 및 McCarty 등 (1991) J. Virol.65: 2936-2945]. Rep 및/또는 Cap 발현 생성물을 코딩하는 다수의 다른 벡터들이 기재되어 있다. 참고 문헌으로는, 예를 들어 U.S. 특허 제 5,139,941 및 6,376,237.

용어 "부속 기능" 은 AAV 가 그의 복제에 의존성인 비-AAV 유래 바이러스 및/또는 세포 기능을 의미한다. 따라서, 상기 용어는, AAV 유전자 전사의 활성화, 단계 특이적 AAV mRNA 스플라이싱, AAV DNA 복제, Cap 발현 생성물 및 AAV 캡시드 어셈블리의 합성에 수반되는 상기 부분들을 포함하는, AAV 복제에 필요한 단백질 및 RNA 를 포괄한다. 바이러스 기재 부속 기능은 임의의 공지된 헬퍼 바이러스, 예컨대 아데노바이러스, 헤르페스바이러스 (헤르페스 심플렉스 바이러스 타입-1 은 제외) 및 백시니아 바이러스와 같은 임의의 공지된 헬퍼 바이러스로부터 유도될 수 있다.

용어 "부속 기능 벡터" 는 일반적으로 부속 기능을 제공하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 의미한다. 부속 기능 벡터는 적합한 숙주 세포에 트랜스펙션될 수 있는데, 이어서 벡터는 숙주 세포 내에서의 AAV 비리온 생성을 지지할 수 있다. 상기 용어에서 제외되는 것은 아데노바이러스, 헤르페스바이러스 또는 백시니아 바이러스 입자와 같이 천연적으로 존재하는 감염성 바이러스 입자들이다. 따라서, 부속 기능 벡터는 플라스미드, 파지, 트랜스포존 또는 코스미드의형태일 수 있다.

특히, 아데노바이러스 유전자의 완전 보완이 부속 헬퍼 기능에 필요한 것은 아니라는 것이 증명되었다. 특히, DNA 복제가 불가능하며 유전자 합성이 지연되는 아데노바이러스 돌연변이는 AAV 복제를 위해서는 허용된다는 것이 나타났다 [Ito 등, (1970) J. Gen. Virol.9: 243; Ishibashi 등, (1971) Virology45: 317]. 유사하게, E2B 및 E3 영역 내에서의 돌연변이는 AAV 복제를 지지하는 것으로 나타나, E2B 및 E3 영역이 부속 기능 제공에 수반되는 것이 아님을 나타냈다 [Carter 등, (1983) Virology126: 505]. 그러나, E1 영역이 결핍되거나 또는 E4 영역에 결실된 아데노바이러스는 AAV 복제를 지지하지 못한다. 따라서, E1A 및 E4 영역은 직접 또는 간접적으로 AAV 복제에 필요한 것으로 짐작된다 [Laughlin 등, (1982) J. Virol.41: 868; Janik 등, (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA78: 1925; Carter 등, (1983) Virology126: 505]. 기타 특징화된 Ad 돌연변이에는 하기가 포함된다: E1B (Laughlin 등 (1982), 상기 문헌; Janik 등 (1981), 상기 문헌; Ostrove 등, (1980) Virology104: 502); E2A (Handa 등, (1975) J. Gen. Virol.29: 239; Strauss 등, (1976) J. Virol.17: 140; Myers 등, (1980) J. Virol.35: 665; Jay 등, (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA78: 2927; Myers 등, (1981) J. Biol. Chem.256: 567); E2B (Carter, Adeno-Associated Virus Helper Function, in I CRC Handbook of Parvoviruses (P. Tijssen 편저, 1990)); E3 (Carter 등 (1983), 상기 문헌); 및 E4 (Carter 등 (1983), 상기 문헌; Carter (1995)). E1B 코딩 영역에 돌연변이를 가진 아데노바이러스에 의해 제공되는 부속 기능의 연구가 상충하는 결과를 냈지만, [Samulski 등, (1988) J. Virol.62: 206-210] 에서는 최근 E1B55k 는 AAV 비리온 제조에 필요하나, E1B19k 는 그렇지 않다고 보고했다. 또한, 국제 공보 WO 97/17458 및 문헌 [Matshushita 등, (1998) Gene Therapy5: 938-945] 에서는 각종 Ad 유전자를 코딩하는 부속 기능 벡터를 기재했다.

특히 바람직한 부속 기능 벡터에는 아데노바이러스 VA RNA 코딩 영역, 아데노바이러스 E4 ORF6 코딩 영역, 아데노바이러스 E2A 72 kD 코딩 영역, 아데노바이러스 E1A 코딩 영역, 및 완전한 E1B55k 코딩 영역이 없는 아데노바이러스 E1B 영역을 포함한다. 상기 벡터들은 국제 공보 WO 01/83797 에 기재되어 있다.

"충분한 rAAV 비리온 생산을 지지할 수 있음" 은 아데노바이러스 헬퍼 바이러스로 숙주 세포를 감염시켜 수득될 수 있는 것과 실질적으로 동등하거나 또는 더 높은 수준으로, 특별한 숙주 세포에서 rAAV 비리온 생산을 보완하기에 충분한 부속 기능을 제공하는 부속 기능 벡터 또는 시스템의 능력을 의미한다. 따라서, 유효한 rAAV 비리온 생산을 지지할 부속 기능 벡터 또는 시스템의 능력은, 감염성 아데노바이러스를 사용한 감염을 이용하여 수득되는 역가와 부가 벡터 또는 시스템을 이용하여 수득되는 rAAV 비리온 역가를 비교하여 결정할 수 있다. 더 구체적으로는, 부속 기능 벡터 또는 시스템은, 동등한 갯수의 숙주 세포로부터 수득되는 비리온의 양이 아데노바이러스 감염을 이용하여 수득되는 양보다 약 200 배 이하, 더욱 바람직하게는 약 100 배 미만, 가장 바람직하게는 아데노바이러스 감염을 이용하여 수득되는 양 이상인 경우, 감염 아데노바이러스를 이용하여 수득되는 것과 실질적으로 동일한 것 이상의 유효한 rAAV 비리온 생산을 지지한다.

"재조합 바이러스" 는 예를 들어, 이종성 핵산 구축물의 입자로의 부가 또는 삽입에 의해 유전적으로 변경된 바이러스를 의미한다.

"AAV 비리온" 은 완전한 바이러스 입자, 예컨대 야생형 (wt) AAV 바이러스 입자 (AAV 캡시드 단백질 코우트와 회합된, 선형의, 단일 가닥 AAV 핵산 게놈을 포함한다) 를 의미한다. 이에 대해, 상보적인 센스의 단일 가닥 AAV 핵산 분자, 예를 들어 "센스" 또는 "안티센스" 가닥은 임의의 AAV 비리온에 팩킹될 수 있으며, 두 가닥은 모두 동등하게 감염성이다.

"재조합 AAV 비리온" 또는 "rAAV 비리온" 은 본원에서, AAV ITR 에 의해 양측이 모두 절단된 관심대상의 이종성 뉴클레오티드 서열을 감싸는 AAV 단백질 쉘을 포함하는, 감염성의 복제-결함 바이러스로서 정의된다. rAAV 비리온은 AAV 벡터, AAV 헬퍼 기능 및 그곳에 도입된 부속 기능을 가진 적합한 숙주 세포 내에서 생산된다. 상기의 방법으로, 숙주 세포는 후속적인 유전자 전달을 위해 AAV 벡터 (관심 대상인 재조합 뉴클레오티드 서열을 포함) 를 감염성 재조합 비리온 입자로 팩킹할 때 필요한 AAV 폴리펩티드를 코딩할 수 있도록 한다.

용어 "트랜스펙션" 은 세포에 의한 외래 DNA 의 흡수를 일컫기 위해 사용되며, 세포는 외인성 DNA 가 세포막 내부에 도입되는 경우 "트랜스펙션" 된다. 다수의 트랜스펙션 기술이 일반적으로 당 분야에 공지되어 있다. 참고 문헌, 예를 들어, [Graham 등 (1973) Virology,52: 456, Sambrook 등 (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York,Davis 등 (1986); Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, 및 Chu 등 (1981) Gene13: 197]. 상기 기술들은 뉴클레오티드 인테그레이션 벡터 및 기타 헥산 분자와 같은 하나 이상의 외인성 DNA 부분을 적합한 숙주 세포로 도입하기 위해 이용될 수 있다.

용어 "숙주 세포" 는, 예를 들어, AAV 헬퍼 구축물, AAV 벡터 플라스미드, 부속 기능 벡터, 또는 다른 수송 DNA 의 수용체로서 사용될 수 있거나 또는 사용되고 있는 미생물, 효모 세포, 곤충 세포 및 포유류 세포를 의미한다. 상기 용어에는 트랜스펙션된 원래 세포의 후손도 포함된다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같은 "숙주 세포" 는 외인성 DNA 서열로 트랜스펙션된 세포를 일반적으로 의미한다. 단일한 모세포의 후손들은, 자연적이거나 우발적이거나 또는 계획적인 돌연변이에 의해, 원래 부모와 형태 또는 게놈 또는 전체 DNA 상보성이 완전히 동일할 필요는 없다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "세포주" 는 시험관 내에서 계속적 또는 연장된 성장 및 분열이 가능한 세포의 집단을 의미한다. 종종, 세포주는 단일 조상 세포로부터 유래된 클론 집단이다. 당 분야에는 상기 클론 집단의 보관 또는 수송 동안 자발적이거나 또는 유도된 변화가 핵형 중에 발생할 수 있다는 것이 추가로 공지되어 있다. 따라서, 지목된 세포주로부터 유도된 세포는 조상 세포 또는 배양물과 정확히 동일하지 않을 수도 있으며, 지목된 세포주에는 상기 변이체들이 포함된다.

코딩 서열 또는 제어 서열과 같은 핵산 서열에 관한 용어 "이종성" 은 특정세포와 정상적으로는 함께 결합되지 않고/않거나 정상적으로는 회합하지 않는 서열을 의미한다. 따라서, 핵산 구축물 또는 벡터의 "이종성" 영역은, 자연에서는 다른 분자와 회합되어 있는 것으로 발견되지 않는 또다른 핵산 분자 내의 핵산 분절 또는 그와 결합되는 핵산의 분절이다. 예를 들어, 핵산 구축물의 이종성 영역은 자연에서는 코딩 서열과 회합하는 것으로 발견되지 않는 서열에 의해 절단된 코딩 서열을 포함한다. 이종성 코딩 서열의 또다른 예는, 자체의 코딩 서열이 자연에서 발견되지 않는 (예를 들어, 천연 유전자와 상이한 코돈을 가진 합성 서열) 구축물이다. 유사하게, 세포 내에는 정상적으로는 존재하지 않는 구축물로 형질전환된 세포는 본 발명의 목적상 이종성으로 간주된다. 대립 유전자 변이 또는 자연 발생 돌연변이 사건은 본원에 사용되는 경우 이종성 DNA 를 초래하지 않는다.

"코딩 서열" 또는 특정 단백질을 "코딩" 하는 서열은 적당한 조절 서열의 제어 하에 위치하는 경우 시험관내 또는 생체내에서 폴리펩티드로 전사 (DNA 의 경우) 또는 번역 (mRNA 의 경우) 되는 핵산 서열이다. 코딩 서열의 범위는 5' (아미노) 말단의 개시 코돈에서 3' (카르복시) 말단의 번역 정지 코돈까지로 정의된다. 코딩 서열에는, 이에 한정되지 않지만, 원핵성 유래의 cDNA, 또는 진핵성 mRNA, 원핵성 또는 진핵성 DNA 유래의 게놈 DNA, 및 합성 cDNA 서열까지도 포함한다. 전사 종결 서열은 일반적으로 코딩 서열의 3' 에 위치한다.

"핵산" 서열은 DNA 또는 RNA 서열을 의미한다. 상기 용어는 임의의 공지된 DNA 및 RNA 의 염기 유사체, 예컨대 이에 한정되지 않지만 4-아세틸싸이토신, 8-히드록시-N6-메틸아데노신, 아지리디닐싸이토신, 슈도이소싸이토신, 5-(카르복시히드록시메틸) 우라실, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸 티오우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 디히드로우라실, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸아데닌, 1-메틸슈도우라실, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸싸이토신, 5-메틸싸이토신, N6-메틸아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실퀴오신, 5'-메톡시카르보닐메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산, 옥시부톡소신, 슈도우라실, 퀴오신, 2-티오싸이토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산, 슈도우라실, 퀴오신, 2-티오싸이토신, 및 2,6-디아미노퓨린을 포괄한다.

용어 DNA "제어 서열" 은 집합적으로 프로모터 서열, 폴리아데닐화 시그널, 전사 종결 서열, 상류 제어 도메인, 복제의 기원, 내재 리보솜 엔트리 부위 ("IRES"), 인핸서 등을 의미하며, 이는 수용체 세포에서의 코딩 서열의 복사, 전사 및 번역을 집합적으로 제공한다. 선택된 코딩 서열이 적당한 숙주 세포 내에서 복제, 전사 및 번역될 수 있는 한, 상기 제어 서열이 전부 존재해야 할 필요는 없다.

용어 "프로모터" 는 본원에서 DNA 제어 서열을 포함하는 뉴클레오티드 영역을 의미하는 그의 일반적인 의미로 사용되며, 여기서 제어 서열은 RNA 중합효소에 결합하고 하류 방향 (3'-방향) 의 전사를 개시할 수 있는 DNA 제어 서열을 포함하는 뉴클레오티드 영역을 의미한다. 전사 프로모터는 "유도성 프로모터" (프로모터에 작동적으로 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현은 분해자 (analyte), 공동인자 (cofactor), 제어 단백질 등에 의해 유도된다), "억제성 프로모터" (프로모터에 작동적으로 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현이 분해자, 공동인자, 제어 단백질 등에 의해 유도된다), 및 "구성 프로모터" 를 포함할 수 있다.

"작동적으로 연결된" 은 상기와 같이 기재된 구성원들이 그의 일반적인 기능을 수행하도록 배열된 구성원들의 배열을 의미한다. 따라서, 코딩 서열에 작동적으로 연결된 제어 서열은 코딩 서열의 발현에 영향을 줄 수 있다. 제어 서열은, 그의 발현을 명령할 수 있도록 기능하는 한, 연속적일 필요는 없다. 따라서, 예를 들어 아직 번역되지 않은 전사된 서열을 차단하는 것은 프로모터 서열 및 코딩 서열 사이에 존재할 수 있으며, 프로모터 서열은 여전히 코딩 서열에 대해서는 "작동적으로 연결된" 것으로 간주될 수 있다.

뉴클레오티드 서열을 일컬을 때 "분리된" 은 지목된 분자가 동일한 유형의 다른 생물학적 거대분자의 실질적인 부재 하에 존재한다는 것을 의미한다. 따라서, "특정 폴리펩티드를 코딩하는 분리된 핵산 분자" 는 대상 폴리펩티드를 코딩하지 않는 다른 핵산 분자가 실질적으로 없는 핵산 분자를 의미하나; 상기 분자는 조성물의 기본적인 특징에 악영향을 미치지 않는 일부 추가적인 염기 또는 부분들을 포함할 수 있다.

본 출원을 통해 특성 핵산 분자에서의 뉴클레오티드 서열의 상대적인 위치들을 기재하기 위해서, 예컨대 특정 뉴클레오티드 서열이 또다른 서열에 대해"상류", "하류", "3" 또는 "5" 에 놓이는 것 등으로 기재되는 경우, 당분야에서 동상적인 것으로 지칭되는 DNA 분자의 "센스" 또는 "코딩" 가닥에서의 서열의 위치인 것으로 이해된다.

주어진 AAV 폴리펩티드의 "기능 상동체" 또는 "기능 동등체" 에는 천연 폴리펩티드 서열 유래의 분자 뿐만 아니라, 요망되는 결과 달성에 대해 기준 AAV 분자와 유사하게 기능하는 재조합적으로 제조되거나 또는 화학적으로 합성된 폴리펩티드 서열도 포함한다. 따라서, AAV Rep68 또는 Rep78 의 기능 상동체에는 통합 활성이 남아 있기만 하다면, 이들의 내부 또는 아미노 또는 카르복시 말단에서 발생하는 임의의 단일 또는 다중 아미노산 부가, 치환 및/또는 결실을 포함하는 상기 폴리펩티드의 유도체 및 유사체가 포함된다.

주어진 아데노바이러스 뉴클레오티드 영역의 "기능 상동체" 또는 "기능 동등체" 에는, 또다른 바이러스 또는 세포성 원으로부터 유래된 이종성 아데노바이러스 혈청형 유래의 유사한 영역, 뉴클레오티드 영역 뿐만 아니라 요망되는 결과를 달성하기 위한 기준 뉴클레오티드 영역과 유사하게 기능하는 재조합적으로 제조되거나 또는 화학적으로 합성된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 따라서, 아데노바이러스 VA RNA 유전자 영역 또는 아데노바이러스 E2a 유전자 영역의 기능 상동체에는, 동종체가 상기 배경에서 탐지가능한 수준으로 AAV 비리온 생산을 지지하는 그의 유전적인 부속 기능을 제공하는 능력을 보유하는 한, 영역 내에서 발생하는 임의의 단일 또는 다중 뉴클레오티드 염기 부가, 치환 및/또는 결실을 포함하는, 상기 유전자 영역의 유도체 및 유사체를 포함한다.

"컨벡션-강화 전달 (CED)" 은 임의의 비-수동적 약제의 전달을 의미한다. 본 발명의 문맥에서, AAV 의 컨벡션-강화 전달법 (CED) 의 예는 주입 펌프 또는 삼투압 펌프에 의해 달성될 수 있다. CED 의 더욱 상세한 설명은 하기에 있다.

용어 "중추신경계" 또는 "CNS" 에는 척추동물의 뇌 및 척수의 모든 세포 및 조직이 포함된다. 따라서, 상기 용어에는, 이에 한정되지 않지만, 신경세포, 신경교 세포, 별 신경교세포 (astrocyte), 뇌척수액 (CSF), 세포간질강 (interstitial space), 골 (bone), 연골 등이 포함된다. CNS 의 영역은 각종 행동 및/또는 기능과 연관되어 있다. 예를 들어, 뇌의 기저핵은 운동 기능, 특히 자발성 운동과 연관되어 있다. 기저핵은 6 개의 짝지어진 핵으로 이루어져 있다: 미상핵, 조가비핵, 구선조 (또는 창백핵), 뉴클레우스 아컴벤 (nucleus accumben), 시상저핵 및 흑색체. 미상핵과 조가비핵은 비록 내부 피막에 의해 분리되어 있지만, 세포구조적 (cytoarchitechtonic), 화학적 및 생리학적 특성을 공유하며, 종종 선조체 (corpus striatum, 또는 간단히 striatum) 로 명명된다. 흑색체는, 파킨슨씨 병에서 퇴행되며, 기저핵으로의 주요 도파민 공급을 제공한다.

용어 "대상체", "개인" 또는 "환자" 는 본원에서 호환하여 사용되며, 척추동물, 바람직하게는 포유류를 의미한다. 포유류에는, 이에 한정되지 않지만, 설치류, 유인원, 인간, 가축, 경주용 동물 및 애완용 동물이 포함된다.

"유효량" 은 효과적이거나 또는 요망되는 결과를 초래하기에 충분한 양을 의미한다. 유효량은 1 회 이상의 투여, 적용 또는 투약으로 적용될 수 있다.

B. 일반적인 방법

본 발명은, 지연 방식으로 AAV 벡터 중재 GDNF 유전자 전달이 도파민성 (DA) 신경세포의 진행성 퇴행을 역행시키면서도, 기능성 흑질-선조체 경로는 보존된다는 놀라운 발견을 근거로 한다. 특히, 실시예에 기재된 바와 같이, 파킨슨씨 병에 대해 허용가능한 동물 모델이 FLAG 펩티드 (AAV-GDNFflag) 또는 β-갈락토시다아제 (AAV-LacZ) 로 태깅된(tagged) GDNF 를 발현하는 AAV 벡터의 손상된 선조체로의 주입을 수용했다. FLAG 에 대한 면역염색은 GDNFflag에서 흑색질 (SN) 로의 역행성 수송을 증명했다. 선조체 내에서의 타이로신 히드록실라아제 (TH)-양성 DA 섬유의 밀도 및 SN 내의 TH-양성 또는 콜레라 독소 서브유닛 B (CTB, 신경세포 추적자)-표지 신경세포의 갯수는, AAV-LacZ 군에서보다 AAV-GDNFflag군에서 훨씬 더 컸다. 선조체 내에서의 도파민 및 그의 대사물의 수준은, 대조군에 비해 AAV-GDNFflag군에서 훨씬 더 높았다. 해부학적 및 생화학적 변화와 일관되게, AAV-GDNFflag주입 후 현저한 행동학적 회복이 관찰되었다. 상기 데이터들은 AAV-계 전달 시스템을 이용한 GDNF 유전자의 지연된 전달이 진행성 퇴행의 안착 이후에도 효능적임을 나타낸다.

따라서, 본 발명은, 신경 손상이 이미 발생한 후 신경퇴행성 질환 및 기타 신경 장애를 치료하기 위한 방법을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 신경 손상은 파킨슨씨 병 또는 손상되거나 불충분하게 기능하는 도파민성 신경 세포에 의한 것이다.

따라서, 본 발명은 GDNF 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를, 이에 한정되지 않는 파킨슨씨 병 (PD), 근위축성 측삭 경화증 (amyotrophic lateralsclerosis; ALS), 간질, 알츠하이머병 등을 포함하는 임의의 각종 신경퇴행성 장애를 앓는 환자에게 전달하기 위해 이용될 수 있다. 또한, 본 발명은 중풍에서와 같이 또는 신경독소, 예컨대 암 화학치료제, 택솔, 시스플라틴 또는 빈크리스틴, 및 AIDS 화학치료제 ddI 또는 ddC 로의 노출에 의한 신경계의 일부 혈류의 일시적 또는 영구적 정지에 의한 신경 손상 뿐만 아니라, 당뇨 또는 신부전과 같은 만성 대사 질환에 기인한 신경 손상을 앓는 환자에게 GDNF 를 전달하기 위해 사용될 수 있다.

상기 설명한 바와 같이, GDNF 는 신경교 세포에서 동정되거나 또는 그로부터 수득될 수 있으며, 신경영양 활성을 나타내는 단백질이다. 더 구체적으로는, GDNF 는 흑색질 도파민성 신경세포의 태아 전구체 상에서의 도파민 흡수를 증가시키는 그의 능력 및 추가적으로는 부교감 및 교감신경 세포의 생존을 촉진하는 그의 능력에 의해 부분적으로 특징화되는 도파민성 신경영양성 단백질이다.

GDNF 는 그의 자연 형태에서는 단독 이량체로서 존재하는 약 39 kD 의 글리코실화된 단백질이다. GDNF 는 초기에는 pre-pro-GDNF 폴리펩티드로 번역되며, 시그널 서열 및 분자의 "pro" 부분의 단백질 가수분해 진행으로 성숙한 형태의 GDNF 가 형성된다. 인간 및 설치류에서는, 단독 유전자가 그와 다르게 스플라이싱된 형태로 된다. 참고 문헌으로서는, 예를 들어 U.S. 특허 제 6,362,319. 두 형태는 모두 단백질 가수분해 진행을 위한 일치하는 시그널 펩티드 서열 및 일치하는 서열을 포함한다. 단백질 가수분해성 절단은 동일한 성숙한 134 아미노산 잔기 형태를 생성한다. 따라서, 본 발명의 AAV 벡터에 이용되기 위한 GDNF 폴리뉴클레오티드는 상기 형태 중 하나 또는 모두를 코딩할 수 있으며, 완전한 pre-pro-분자, pre-분자, pro-분자, 성숙한 GDNF 폴리펩티드, 또한 상기 형태들의, 상기 정의된 바와 같은 생물학적으로 활성인 변이체를 코딩할 수 있다.

다수의 GDNF 폴리뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 공지되어 있다. 3 개의 대표적인 포유류 GDNF 서열이 본원에서 도 11, 12 및 13 에 기재되어 있다. 특히, 인간 GDNF 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 도 11 (서열 번호: 1 및 2) 에 나타냈다. 래트 GDNF 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 도 12 (서열 번호: 3 및 4) 에 나타냈고, 마우스 GDNF 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 도 13 (서열 번호: 6 및 7) 에 나타냈다. 래트와 인간 사이의 상동성 정도는 약 93 % 이며, 모든 포유류 GDNF 는 유사하게 높은 상동성 정도를 갖는다. 추가적인 GDNF 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 당 분야에 공지되어 있다. 참고 문헌으로서는, 예를 들어, 래트 및 인간 서열에 대해서는 U.S. 특허 제 6,221,376 및 제 6,363,319, 및 Lin 등, Science (1993)260: 1130-1132, 뿐만 아니라 인간 서열에 대해서는 NCBI 접근 번호 AY052832, AJO01896, AF053748, AF063586 및 L19063; 래트 서열에 대해서는 NCBI 접근 번호 AF184922, AF497634, X92495, NM019139; 자이언트 팬더 서열에 대해서는 NCBI 접근 번호 AF516767; 마우스 서열에 대해서는 NCBI 접근 번호 XM122804, NM010275, D88351S1, D49921, U36449, U37459, U66195; 따오기 서열에 대해서는 NCBI 접근 번호 AF469665; 짧은 꼬리 원숭이 (Macaca mulatta) 서열에 대해서는 NCBI 접근 번호 AF106678; 및 제브라피쉬 서열에 대해서는 NCBI 접근 번호 NM131732 및 AF329853. 상기 설명한 바와 같이, 임의의 상기 서열들 뿐 아니라이들의 변이체, 예컨대 상기 서열들과 실질적으로 상동성이며 기능적으로 동등한 것이 본 발명의 방법에서 용도를 발견할 수 있다.

AAV-전달 GDNF 폴리뉴클레오티드의 효능은 당 분야에 공지된 상기 질환의 다수의 임의의 동물 모델로 시험할 수 있다. 예를 들어, 가장 광범위하게 사용되는 파킨슨씨 병의 동물 모델은 독소의 투여로 도파민성 신경세포의 신경퇴행을 모사한다. 6-히드록시도파민 (6-OHDA) 의 마우스 또는 래트의 흑색질로의 편측 주입은 동측 선조체 및 흑색질에서 신경세포 감소와 함께 반대쪽 반구에서의 미세한 변화를 초래한다. 유사하게, 각성제 (methamphetamine) 유도 신경세포독성은 도파민성 및 세로토닌성 신경세포의 신경퇴행을 초래하며, 당업자에게는 인간 조건에 매우 근접한 것으로 간주된다. 치료제의 효능은 아포모르핀 유도 회전 행동을 이용한 행동 결과에 의해 평가될 수 있다.

또다른 파킨슨씨 병 모델은 신경독소 N-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라히드록시피리딘 (MPTP) 을 이용해 구축된다. MPTP 는 마우스, 래트 및 원숭이와 같은 포유류에 투여된다. 원숭이로의 MPTP 의 투여는 흑색질 및 선조체에서의 도파민성 및 세로토닌성 신경세포의 손실 뿐만 아니라 인간 파킨슨씨 병 환자에서 나타나는 것과 유사한 행동 소견, 예컨대 운동불능증 및 강직 자세를 초래한다. 참고 문헌으로는, 예를 들어, U.S. 특허 제 6,362,319.

상기 기재된 파킨슨씨 병의 동물 모델과 대조적으로, 다수의 근친교배 마우스 종족이 도파민성 세포수의 점차적인 감소를 나타내 이용가능하다. 예를 들어, 파킨슨씨 병을 가진 환자의 것과 유사한 행동 특징을 가진 D2 수용체 결핍 마우스는 동종 재조합에 의해 생성된다 [Fitzgerald 등 (1993) Brain Res.608: 247-258]. 제 2 예시는, 경시적으로는 중뇌 도파민성 신경세포수가 40% 까지 점차 감소하는 것을 나타내는 위버 돌연변이 마우스 (weaver mutant mouse) 이다 [Verina 등 (1997), Exp. Brain Res.113: 5-12; Adelbrecht 등 (1996), Mol. Brain Res.43: 291-300; Mitsumoto 등 (1994), Science265:1107-1110].

본 발명의 실시예는 Sauer 및 Oertel 부분 PD 모델을 이용했다 (Sauer and Oertel, Neuroscience (1994)59: 401-415). 상기 모델에서, 6-OHDA 의 선조체 내 주입은 손상 제 1 내지 2 주 째에 시작하여 8 내지 16 주에 걸쳐 지속되는, DA 신경세포의 진행성 역방향 퇴행을 유발한다. DA 신경세포의 상기 소모는 PD 의 질환 진행과 더욱 유사할 수 있으며, 안쪽 앞뇌 다발을 파괴하여 DA 신경세포의 더욱 신속한 퇴행을 초래하는 완전 모델보다 치료 연구용으로 더욱 적합할 수 있다. 하기 기재된 실험에서, 래트는 벡터 주입 전에는 시종일관된 행동 결함을 나타냈다. 아포모르핀 유도 회전의 외양은 일반적으로 선조체 도파민 함량의 ≥ 90% 가 존재한다는 것을 증명한다 (Hudson 등, Brain Res. (1993) 626: 167-174). 그러나, PD 환자 및 동물 모델 상에서의 연구는 제안된 도파민 수준보다 더 많은 DA 신경세포가 생존하고 있을 수 있다는 것을 나타낸다 [Javoy-Agid 등, Neuroscience (1990)38: 245-253; Fearnley 및 Lees, Brain (1991)114: 2283-2301; Schulzer 등, Brain (1994)117: 509-516]. 본원에 이용된 모델에서, SN 의 손상 측면 상에서의 CTB-양성 신경세포의 갯수는 손상 4 주 후에서의 반대쪽 값의 28.9% 이다. 이는, 손상된 SN 에서의 FG-양성 세포의 28.8 % (손상 35 일 후) (Kozlowski 등,Exp. Neuron (2000)166: 1-15) 또는 34 % (손상 4 주 후) (Sauer 및 Oertel, Neuroscience (1994)59: 401-415) 임을 불화금 (FG) 역행 표지를 이용해 보인 선행기술의 연구와 일치한다. 또한, 대부분의 CTB-표지 신경세포는 TH-양성이며, 이는 AAV 벡터 주입시 흑질-선조체 투사 부분이 온전하게 남아 있다는 것을 시사한다. 이론에 구애됨 없이, 완전한 흑질-선조체 투사 및 DA 신경세포의 상기 남은 부분은 GDNF 유전자 전달 후 재생 및 기능 회복의 기질로서 제공된다.

다른 신경퇴행성 질환의 동물 모델도 기재되어 있으며, PD 이외의 신경퇴행성 장애의 치료에서 AAV-전달 GDNF 폴리뉴클레오티드의 치료 효능 평가에 유용하다. 예를 들어, 문헌 [Martin 등 (1995) Brain Res.683: 172-178] 에서는 간질의 동물 모델을 기재하고, 문헌 [Matheson 등 (1997) NeuroReport8: 1739-1742] 및 [Oppenheim 등 (1995) Nature373: 344-346] 에서는 물리적 외상으로부터 초래되는 신경퇴행의 모델을 기재하며, 문헌 [Sagot 등 (1996) J. Neurosci.16: 2335-2341] 에서는 동물에서의 운동 신경 퇴행의 모델을 기재한다.

GDNF 코딩 서열을 포함하는 재조합 AAV 비리온은 하기에 더욱 완전히 기재된 각종 당분야 공지의 기술을 이용하여 생산될 수 있다. 야생형 AAV 및 헬퍼 바이러스는 rAAV 비리온 생산을 위한 필요한 복제 기능을 제공하기 위해 사용될 수 있다 (참고, 예를 들어 U.S. 특허 제 5,139,941). 대안적으로는, 공지된 헬퍼 바이러스 중 하나를 사용해 조합한, 헬퍼 기능 유전자를 포함하는 플라스미드는 복제 기능의 원으로서 이용될 수 있다 (참고 문헌으로는, 예를 들어, U.S. 특허 제 5,622,856 및 U.S. 특허 제 5,139,941). 유사하게, 필요한 복제 기능을 제공하기위해, 부속 기능 유전자를 포함하는 플라스미드는 야생형 AAV 에 의한 감염과 조합해 이용될 수 있다. rAAV 벡터와의 조합을 이용한 경우 상기의 3 가지 접근법은 각각 rAAV 비리온을 생산하기에 충분하다. 당 분야에 공지된 다른 접근법들도 rAAV 비리온을 생산하기 위해 당업자에 의해 이용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 삼중 트랜스펙션법 (U.S. 특허 제 6,001,650 에 상세히 기재되어 있음) 은 감염성 헬퍼 바이러스를 사용할 필요가 없어, 임의의 탐지가능한 헬퍼 바이러스가 존재하지 않아도 rAAV 비리온이 제조될 수 있게 하므로, rAAV 비리온 생산에 이용된다. 이는 rAAV 비리온 생산을 위한 3 개의 벡터를 이용하여 달성된다: AAV 헬퍼 기능 벡터, 부속 기능 벡터 및 rAAV 발현 벡터. 그러나, 당업자라면 상기 벡터에 의해 코딩되는 핵산 서열이 각종 조합에서 2 개 이상의 벡터 상에 공급될 수 있음을 고려할 것이다.

본원에 설명한 바와 같이, AAV 헬퍼 기능 벡터는 "AAV 헬퍼 기능" 서열 (즉, rep 및 cap) 을 코딩하며, 이는 AAV 복제 및 단백질 막 포장 (encapsidation) 에 대해 다른 면에서 기능한다. 바람직하게는, AAV 헬퍼 기능 벡터는 임의의 탐지가능한 wt AAV 비리온 (즉, 기능성 rep 및 cap 유전자를 포함하는 AAV 비리온) 을 생성하지 않고도 효율적인 AAV 벡터 생산을 지지한다. 상기 벡터의 예, pHLP19 는 U.S. 특허 제 6,001,650 에 기재되어 있다. AAV 헬퍼 기능 벡터의 rep 및 cap 유전자는 상기 설명한 바와 같이 임의의 공지된 AAV 혈청형으로부터 제거될 수 있다. 예를 들어, AAV 헬퍼 기능 벡터는 AAV-2 로부터 제거된 rep 유전자 및 AAV-6 로부터 제거된 cap 유전자를 가질 수 있으며; 당업자라면 기타 rep 및 cap 유전자 조합도 가능하고, 특성을 정하는 것은 rAAV 비리온 제조를 지지하는 능력이라는 것을 인지할 것이다.

부속 기능 벡터는 비-AAV 유도 비리알 및/또는 AAV 가 복제에 의존성인 세포 기능 (즉, "부속 기능") 에 대한 뉴클레오티드 서열을 코딩한다. 부속 기능에는 이에 한정되지 않지만, AAV 유전자 전사 활성화, 단계 특이적 AAV mRNA 스플라이싱, AAV DNA 복제, cap 발현 생성물의 복제, 및 AAV 캡시드 어셈블리에 수반되는, 상기 부분들을 포함하는, AAV 복제에 필요한 상기 기능들을 포함한다. 바이러스 기재의 부속 기능은, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스 (헤르페스 심플렉스 바이러스 타입-1 는 제외) 및 백시니아 바이러스와 같은 임의의 공지된 헬퍼 바이러스로부터 유도될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 부속 기능 플라스미드 pLadeno5 가 이용된다 (pLadeno5 에 대한 상세한 사항은 U.S. 특허 제 6,004,797 에 기재되어 있다). 상기 플라스미드는 AAV 벡터 제조를 위한 완전한 한 셋트의 아데노바이러스 부속 기능을 제공하나, 복제-능력보유 (competent) 아데노바이러스 형성에 필요한 구성원은 없다.

본 발명의 더 이해하기 위해서, 더욱 상세한 논의는 재조합 AAV 발현 벡터, AAV 헬퍼 및 부속 기능, AAV 비리온을 함유하는 조성물, 및 비리온의 전달에 관한 하기 부분에 제공한다.

재조합 AAV 발현 벡터

재조합 AAV (rAAV) 발현 벡터는 공지된 방법으로 구축하여, 적어도 전사 방향으로 작동적으로 연결된 구성원, 전사 개시 영역, 관심대상의 GDNF 폴리뉴클레오티드 및 전사 종결 영역을 포함하는 제어 구성원을 제공하도록 공지된 기술을 이용해 구축한다. 제어 구성원은 포유류 근육 세포에서 기능성이 되도록 선택한다. 작동적으로 연결된 구성원을 포함하는, 수득한 구축물은 기능성 AAV ITR 서열과 결합된다 (5' 및 3').

AAV ITR 영역의 뉴클레오티드 서열이 공지되어 있다. 참고 문헌, 예를 들어, AAV-2 서열에 대해서는 문헌 [Kotin, R.M. (1994) Human Gene Therapy5: 793-801; Berns, K.I. "Parvoviridae and their Replication" in Fundamental Virology, 제 2 판 (B.N. Fields 및 D.M. Knipe 편저]. 본 발명의 벡터에 사용된 AAV ITRs 은 야생형 뉴클레오티드 서열을 가질 필요는 없으며, 예컨대 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변경될 수 있다. 추가적으로, AAV ITR 은, 이에 한정되지 않으나 AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7 및 AAV-8 등을 포함하는 임의의 각종 AAV 혈청형으로부터 유도될 수 있다. 더욱이, AAV 발현 벡터 내에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 중단하는 5' 및 3' ITR 은, 이들이, 예를 들어, 숙주 세포 게놈 또는 벡터로부터 관심대상 서열의 적출 및 구조되도록 하고, AAV Rep 유전자 생성물이 세포 내에 존재하는 경우 DNA 분자의 통합물이 수용체 세포 게놈으로 갈 수 있게 기능하는 한, 동일한 AAV 혈청형 또는 분리물과 상동이거나 또는 그로부터 유도된 것일 필요는 없다.

AAV 벡터에서 사용하기 위한 적합한 GDNF 폴리뉴클레오티드 분자는 크기가 약 5 kb 미만이다. 선택된 폴리뉴클레오티드 서열은 대상체의 생체내에서 그의 전사 및 발현을 명령하는 제어 구성원에 작동적으로 연결되어 있다. 상기 제어구성원은 정상적으로는 선택된 유전자와 회합되는 제어 서열을 포함한다. 대안적으로는, 이종성 제어 서열이 이용될 수 있다. 유용한 이종성 제어 서열은 일반적으로 포유류 또는 바이러스 유전자를 코딩하는 서열로부터 유도된 것을 포함한다. 예에는, 이에 한정되지 않지만, 신경세포 특이적 에놀라아제 프로모터, GFAP 프로모터, SV40 초기 프로모터, 마우스 유방암 바이러스 LTR 프로모터, 아데노바이러스 메이저 레이트 프로모터 (major late promoter; MLP); 헤르페스 심플렉스 바이러스 (HSV) 프로모터, 싸이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터, 예컨대 CMV 즉각적인 초기프로모터 영역 (immediate early promoter region; CMVIE), 로우스 육종 바이러스 (rous sarcoma virus; RSV) 프로모터, 합성 프로모터, 하이브리드 프로모터 등이 포함된다. 또한, 비바이러스 유전자, 예컨대 설치류 메탈로티오네인 유전자로부터 유도된 서열도 또한 본원에서 사용된다. 상기 프로모터 서열은 예를 들어 Stratagene (San Diego, CA) 로부터 시판되어 입수가능하다.

AAV ITR 에 의해 관심대상의 GDNF 폴리뉴클레오티드 분자에 결합되는 AAV 발현 벡터는, 선택된 서열(들)을 그로부터 적출된 주요 AAV 오픈 리딩 프레임 ("ORFs") 를 가진 AAV 게놈에 직접 삽입함으로써 구축될 수 있다. AAV 게놈의 다른 부분도 또한 복제 및 팩킹 기능을 허용할 충분한 만큼의 ITRs 이 남는 한 결실될 수 있다. 상기 구축물들은 당 분야에 공지된 기술을 이용하여 고안될 수 있다. 참고 문헌으로는, 예를 들어 [U.S. 특허 제 5,173,414 및 5,139,941; 국제 공보 제 WO 92/01070 (1992 년 1 월 23 일 공개) 및 WO 93/03769 (1993 년 3 월 4 일 공개); Lebkowski 등 (1988) Molec. Cell. Biol.8: 3988-3996; Vincent 등(1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter (1992) Current Opinion in Biotechnology3: 533-539; Muzycka (1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol.158: 97-129; Kotin (1994) Human Gene Therapy5: 793-801; Shelling and Smith (1994) Gene Therapy1: 165-169; 및 Zhou 등 (1994) J. Exp. Med.179: 1867-1875].

대안적으로는, AAV ITR 은 바이러스 게놈 또는 동일한 것을 포함하는 AAV 벡터로부터 적출하여, Sambrook 등의 상기 문헌에 기재된 것과 같은 표준 라이게이션 기술을 이용하여 또다른 벡터에 존재하는 선택된 핵산 구축물의 5' 내지 3' 에 융합시킨다. 예를 들어, 라이게이션은 20 mM Tris-Cl pH 7.5, 1O mM MgCl₂, 10 mM DTT, 33 ㎍/mL BSA, 10 mM - 5O mM NaCl 및, 40 μM ATP, 0.01 - 0.02 (Weiss) 유닛 T4 DNA 라이게이즈 중 O℃ 에서 ("스틱키 말단" 라이게이션) 또는 1 mM ATP, 0.3 - 0.6 (Weiss) 유닛 T4 DNA 라이게이즈 중 14℃ 에서 ("블런트 말단" 라이게이션) 수행될 수 있다. 분자간 "스틱키 말단" 라이게이션은 일반적으로 30 - 100 ㎍/ml 전체 DNA 농도 (5 - 100 nM 전체 최종 농도) 에서 수행된다. ITR 을 포함하는 AAV 벡터는 예를 들어, U.S. 특허 제 5,139,941 에 기재되어 있다. 특히, American Type Culture Collection ("ATCC") 로부터 접근번호 53222, 53223, 53224, 53225 및 53226 로 입수가능한 각종 AAV 벡터가 기재되어 있다.

추가적으로, AAV ITR 서열은 키메라성 유전자가 하나 이상의 선택되는 핵산 서열의 5' 내지 3' 로 정렬된 AAV ITR 서열을 포함하도록 키메라성 유전자를 합성하여 제조할 수 있다. 포유류 근육 세포 중의 키메라성 유전자 서열의 발현을 위한 바람직한 코돈이 이용될 수 있다. 완전 키메라성 서열은 표준 방법에 의해 제조되는 중복 올리고뉴클레오티드로부터 어셈블리된다. 참고 문헌으로서는, 예를 들어, [Edge (1981), Nature292: 756; Nambair 등 (1984), Science223: 1299; Jay 등 (1984), J. Biol. Chem. (1984)259: 6311].

본 발명의 목적을 위해, AAV 발현 벡터로부터 rAAV 비리온을 제조하기 위한 적합한 숙주 세포에는, 이종성 DNA 분자의 수용체로서 사용될 수 있거나 또는 사용되었으며 현탁액 배양에서 성장가능한 미생물, 효모 세포, 곤충 세포 및 포유류 세포가 포함된다. 상기 용어에는 트랜스펙션된 원래 세포의 후손이 포함된다. 따라서, 본원에 사용된 "숙주 세포" 는 일반적으로 외인성 DNA 서열로 트랜스펙션된 세포를 의미한다. 안정한 인간 세포주로부터의 세포, 293 (American Type Culture Collection 로부터 접근 번호 ATCC CRL 1573 로서 즉시 입수가능) 는 본 발명의 실시에서 바람직하다. 특히, 인간 세포주 293 는 아데노바이러스 타입-5 DNA 분절로 형질전환된 인간 태아 신장 세포주이며 (Graham 등 (1977) J. Gen. Virol.36: 59), 아데노바이러스 E1a 및 E1b 유전자를 발현한다 (Aiello 등 (1979) Virology94: 460). 293 세포주는 즉시 트랜스펙션되어, rAAV 비리온을 생산하기에 특히 편리한 플랫폼을 제공한다.

AAV 헬퍼 기능

상기 기재된 AAV 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포는 비리온을 생산하기 위해 AAV ITR 로 중단된 뉴클레오티드 서열을 복제하고 감싸기(encapsidation) 위한 AAV헬퍼 기능을 제공할 수 있게 되어야 한다. AAV 헬퍼 기능은 일반적으로 AAV 유전자 생성물을 제공한 후 생성 AAV 복제에 대해 다른 면에서 작용할 수 있는 AAV-유도 코딩 서열이다. AAV 헬퍼 기능은 본원에서, AAV 발현 벡터로부터 소실된 필요한 AAV 기능을 보완하기 위해 사용된다. 따라서, AAV 헬퍼 기능에는 주요 AAV ORF, 즉 rep 및 cap 코딩 영역의 한쪽 또는 양쪽, 또는 이들의 기능적 상동체가 포함된다.

"AAV rep 코딩 영역" 은 복제 단백질 Rep 78, Rep 68, Rep 52 및 Rep 40 를 코딩하는 AAV 게놈의 당업자 인지 영역을 의미한다. 상기 Rep 발현 생성물은 DNA 복제의 AAV 기원의 인식, 결합 및 닉 (nick), DNA 헬리케이즈 활성 및 AAV (또는 기타 이종성) 프로모터로부터의 전사 조절을 포함하는 많은 기능들을 보유하는 것으로 나타났다. 상기 Rep 발현 생성물은 AAV 게놈의 복제에 집합적으로 필요하다. AAV rep 코딩 영역에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol.158: 97-129; 및 Kotin, R.M. (1994) Human Gene Therapy5: 793-801] 을 참조. AAV rep 코딩 영역의 적합한 동종체에는 AAV-2 DNA 복제를 중재하는 것으로 공지된 인간 헤르페스바이러스-6 (HHV-6) 를 포함한다 [Thomson 등 (1994) Virology204: 304-311].

"AAV cap 코딩 영역" 은 캡시드 단백질 VP1, VP2 및 VP3 또는 그의 기능성 동종체를 코딩하는 AAV 게놈의 당업계 인지 영역을 의미한다. 상기 Cap 발현 생성물은 바이러스 게놈의 팩킹에 집합적으로 필요한 팩킹 기능을 공급한다. AAV cap 코딩 영역에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Muzyczka, N. 및 Kotin, R.M. (상기문헌)] 을 참조한다.

AAV 헬퍼 기능은 AAV 발현 벡터의 트랜스펙션 이전에 또는 그와 동시에 숙주 세포를 AAV 헬퍼 구축물로 트랜스펙션하여 숙주 세포로 도입한다. 따라서, AAV 헬퍼 구축물은, AAV rep 및/또는 cap 유전자의 적어도 순간적인 발현을 제공하여 생산력을 가진 AAV 감염에 필요한 소실된 AAV 분절을 보완하기 위해 사용된다. AAV 헬퍼 구축물은 AAV ITR 이 없으며, 자체를 복제 또는 팩킹할 수 없다.

상기 구축물들은 플라스미드, 파지, 트랜스포존, 코스미드, 바이러스 또는 비리온의 형태일 수 있다. 다수의 AAV 헬퍼 구축물, 예컨대, Rep 및 Cap 발현 생성물을 코딩하는, 일반적으로 사용되는 플라스미드 pAAV/Ad 및 pIM29+45 이 공지되어 있다. 참고문헌은, 예를 들어 [Samulski 등 (1989) J. Virol.63: 3822-3828; 및 McCarty 등 (1991) J. Virol.65: 2936-2945]. Rep 및/또는 Cap 발현 생성물을 코딩하는 다수의 기타 벡터들도 기재되어 있다. 참고 문헌은, 예를 들어 U.S. 특허 제 5,139,941.

AAV 발현 벡터 및 AAV 헬퍼 구축물은 모두 하나 이상의 임의의 선택가능한 마커를 포함하도록 구축될 수 있다. 적합한 마커에는, 적당한 선별성 배지에서 세포를 생장시킬 경우, 선별가능한 마커를 포함하는 핵산 구축물로 트랜스펙션된 상기 세포들에 항생 내성 또는 감수성을 부여하거나, 색상을 부여하거나, 또는 항원 특성을 변경하는 유전자들을 포함한다. 본 발명의 실행에서 유용한 각종 선별가능 마커 유전자에는, G418 에 대한 내성을 비교하여 포유류 세포 내에서 선별하도록 하는 하이그로마이신 B 내성 유전자 (아미노글리코사이드 포스포트랜스퍼라아제 (APH) 를 코딩) 가 포함된다 (Sigma, St. Louis, Mo. 에서 입수가능). 다른 적합한 마커는 당업자에게 공지되어 있다.

AAV 부속 기능

숙주 세포 (또는 팩킹 세포) 는 또한 rAAV 비리온을 생산하기 위해 비-AAV -유래 기능 또는 "부속 기능" 을 제공할 수 있도록 되어야 한다. 부속 기능은 AAV 가 그의 복제에 의존성인 세포 기능 및/또는 비-AAV 유래 바이러스 기능이다. 따라서, 부속 기능에는 AAV 유전자 전사의 활성화, 단계 특이적 AAV mRNA 스플라이싱, AAV DNA 복제, Cap 발현 생성물의 합성 및 AAV 캡시드 어셈블리에 수반되는 것들이 포함된다. 바이러스 기재 부속 기능은 임의의 공지된 헬퍼 바이러스로부터 유도될 수 있다.

특히, 부속 기능은 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 숙주세포에 도입한 후 발현시킬 수 있다. 전형적으로는, 부속 기능은 숙주 세포를 비관련 헬퍼 바이러스로 감염시켜 제공한다. 아데노바이러스; 헤르페스바이러스, 예컨대 헤르페스 심플렉스 바이러스 유형 1 및 2; 및 백시니아 바이러스를 포함하는 다수의 적합한 헬퍼 바이러스가 공지되어 있다. 비바이러스 부속 기능이 또한 본원에서 이용되며, 예컨대 임의의 공지된 시약을 이용한 세포 동기화 (synchronization) 에 의해 제공되는 것이다. 참고 문헌은, 예를 들어 [Buller 등 (1981) J. Virol.40: 241-247; McPherson 등 (1985) Virology147: 217-222; Schlehofer 등 (1986) Virology152: 110-117].

대안적으로는, 부속 기능은 상기 정의된 바와 같은 부속 기능 벡터를 이용해제공될 수 있다. 참고 문헌은, 예를 들어 U.S. 특허 제 6,004,797 및 국제 공보 WO 01/83797. 부속 기능을 제공하는 핵산 서열은 천연원으로부터, 예컨대 아데노바이러스 입자의 게놈으로부터, 당업계에 공지된 방법으로 재조합법 또는 합성법으로 구축된 것으로부터 수득된다. 상기 설명한 바와 같이, 아데노바이러스 유전자의 완전한 상보성은 부속 헬퍼 기능에 꼭 필요한 것은 아니라는 것이 증명되었다. 특히, DNA 복제가 불가능하며 유전자 합성이 느린 아데노바이러스 돌연변이는 AAV 복제에 대하여 허용되는 것으로 나타났다 [Ito 등, (1970) J. Gen. Virol.9: 243; Ishibashi 등, (1971) Virology45: 317]. 유사하게, E2B 및 E3 영역 내의 돌연변이는 AAV 복제를 지지하는 것으로 나타나, E2B 및 E3 영역이 부속 기능 제공에 수반되지 않을 수도 있다는 것을 나타냈다 [Carter 등 (1983) Virology126: 505]. 그러나, E1 영역이 결핍되거나 또는 E4 영역이 결실된 아데노바이러스는 AAV 복제를 지지할 수 없다. 따라서, E1A 및 E4 영역은 직접적 또는 간접적으로 AAV 복제에 필요한 것 같다 [Laughlin 등, (1982) J. Virol.41: 868; Janik 등 (1981), Proc. Natl. Acad. Sci. USA78: 1925; Carter 등 (1983) Virology126: 505]. 다른 사람들은 하기를 포함하는 Ad 돌연변이를 특징화했다: E1B (Laughlin 등 (1982), 상기 문헌; Janik 등 (1981), 상기 문헌; Ostrove 등 (1980), Virology104: 502); E2A (Handa 등 (1975), J. Gen. Virol.29: 239; Strauss 등 (1976), J. Virol.17: 140; Myers 등 (1980), J. Virol.35: 665; Jay 등 (1981), Proc. Natl. Acad. Sci. USA78: 2927; Myers 등, (1981) J. Biol. Chem.256: 567); E2B (Carter, Adeno-Associated Virus Helper Functions, in I CRC Handbook ofParvoviruses (P. Tijssen 편저, 1990)); E3 (Carter 등 (1983), 상기 문헌); 및 E4 (Carter 등(1983) 상기 문헌; Carter (1995))]. E1B 코딩 영역에 돌연변이가 있는 아데노바이러스에 의해 제공되는 부속 기능의 연구가 반대되는 결과를 나타내긴 했지만 [Samulski 등 (1988), J. Virol.62: 206-210], 최근 E1B55k 는 AAV 비리온 제조에 필요하나, E1B19k 는 아니라고 보고되었다. 또한, 국제 공보 WO 97/17458 및 문헌 [Matshushita 등, (1998) Gene Therapy5: 938-945] 에서는 각종 Ad 유전자를 코딩하는 부속 기능 벡터를 기술한다.

특히 바람직한 부속 기능 벡터에는 아데노바이러스 VA RNA 코딩 영역, 아데노바이러스 E4 ORF6 코딩 영역, 아데노바이러스 E2A 72 kD 코딩 영역, 아데노바이러스 E1A 코딩 영역, 및 아데노바이러스 E1B 영역을 포함하며, 완전한 E1B55k 코딩 영역이 없다. 상기 벡터는 국제 공보 WO 01/83797 에 기재되어 있다.

헬퍼 바이러스를 사용한 숙주 세포의 감염 또는 부속 기능 벡터의 트랜스펙션 결과로서, AAV Rep 및/또는 Cap 단백질을 생산하기 위해 AAV 헬퍼 구축물을 처리하는 부속 기능이 발현된다. Rep 발현 생성물은 AAV 발현 벡터로부터 재조합 DNA (관심있는 DNA 를 포함) 를 삭제한다. Rep 단백질은 또한 AAV 게놈을 복제하기 위해 제공된다. 발현된 Cap 단백질은 캡시드로 어셈블되며, 재조합 AAV 유전자는 캡시드로 팩킹된다. 따라서, 생산력을 가진 AAV 복제가 후속되며, DNA 는 rAAV 비리온으로 팩킹된다.

재조합 AAV 복제에 이어, rAAV 비리온은 각종 통상적인 정제법, 예컨대 칼럼 크로마토그래피, CsCl 구배법 등을 이용하여 숙주 세포로부터 정제될 수 있다.예를 들어, 음이온 교환 칼럼, 친화성 칼럼 및/또는 양이온 교환 칼럼 상에서의 정제와 같은 여러 단계의 칼럼 정제가 이용될 수 있다. 참고 문헌으로는, 예를 들어 국제 공보 WO 02/12455 를 참조. 또한, 부속 기능 발현을 위해 감염이 이용되는 경우, 잔류한 헬퍼 바이러스는 공지된 방법을 이용하여 불활성화된다. 예를 들어, 아데노바이러스는 약 60℃ 의 온도에서 예를 들어 20 분 이상 가열하여 불활성화시킬 수 있다. 상기 온도는, AAV 가 열에 극히 안정한 반면 헬퍼 아데노바이러스는 열에 불안정하므로 헬퍼 바이러스만을 효과적으로 불활성화시킨다.

이어서, 관심있는 GDNF 뉴클레오티드 서열을 포함하는 수득한 rAAV 비리온은 하기에 기재된 기술을 이용한 유전자 전달에 이용될 수 있다.

조성물

조성물은, 목적 GDNF의 치료 유효량을 제조하기에 충분한 양, 즉 문제의 질환 상태에서의 병후를 저감 또는 개선하기에 충분한 양 또는 요망되는 잇점을 부여하기에 충분한 양의 유전 물질을 함유한다. 조성물은 또한, 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함한다. 그러한 부형제는, 그 자체가, 조성물을 수용하는 개인에게 유해한 항체를 생성하도록 하지 않는 것이며, 불필요한 독성 없이 투여 가능한 것이다. 약제학적으로 허용되는 부형제는 소르비톨, 각종 임의의 TWEEN 화합물, 물, 식염수, 글리세롤 및 에탄올과 같은 액체를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 약제학적으로 허용되는 염은, 예를 들어, 수소화염소, 수소화브롬, 포스페이트, 설페이트 등과 같은 무기산염; 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트 등의 유기산염을 포함한다. 추가로, 부가 물질로서의 습윤제 또는 에멀젼화제, pH 완충물질 등이 상기 비히클 내에 포함될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 부형제의 자세한 내용은 하기 문헌에 기재된 것이다 [REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J. 1991)].

특별히 유용한 한 제형물은, 하나 이상의 2 가 또는 다가 알콜, 및 임의로 소르비탄 에스테르와 같은 계면활성제와 조합된 재조합 AAV 비리온을 포함한다. 예를 들어, 국제 공보 WO 00/32233 을 참조한다.

본 내용의 개시를 참고하는 당업자에게 명백한 것처럼, 첨가해야 할 바이러스 벡터의 유효량은 실험으로 결정된다. 대표적 투여량은 하기하였다. 투여는 치료 과정 중 연속적으로 또는 간헐적으로 1 회 투여량으로 유효할 수 있다. 가장 효과적 수단 및 투여량의 검증법은, 당업자에게 공지되었고, 바이러스 벡터, 치료의 조성물, 표적 세포, 및 처리 대상에 따라 가변적이다. 치료 담당의에 의해 선택된 투여 수준과 패턴에 따라 단일 및 다중 투여한다.

전달된 재조합 비리온에 의해 하나 이상의 형질전환유전자가 발현 가능함을 이해하여야 한다. 이와 다르게, 하나 이상의 상이한 형질전환유전자를 각각 발현하는 개별적 벡터를 본원에 기재한대로 CNS 에 전달 가능하다. 또한, 본 발명의 방법에 의해 전달되는 바이러스 벡터는 기타 적절한 조성물 및 요법과 조합되어 이용가능하다. 예를 들어, 파킨슨씨 병은, GDNF 발현 재조합 AAV 비리온을 CNS 로 (즉, 미상 핵 또는 선조체의 피각 내로) 투여하고, AADC, 도파민 전구체 (즉, L-도파), 도파민 합성 억제제 (즉, 카르비도파), 도파민 동화의 억제제 (즉, MaOB 억제제), 도파민 애고니스트 또는 안타고니스트와 같은 부가제를, GDNF 을 코딩하는 재조합 비리온 투여 이전 또는 이후에 또는 동시에 투여할 수 있다. 예를 들어, AADC 코딩 유전자는, GDNF 코딩 유전자와 함께 CNS 에 투여 가능하다. 유사하게, L-도파 및 임의로 카르비도파는 전신 투여 가능하다. 이 방식으로, PD 환자에서 보통 결핍되는 도파민이 재생되는데, 이는 L-도파를 도파민으로 전환하는 AADC 에 의한 것으로 보인다. 형질전환유전자가 유도성 프로모터에 의해 조절되는 경우, 뮤리스테론, 포나스테론, 테트라싸이클린 또는 오핀과 같은 특정 전신 전달 화합물을 투여하여, 형질전환유전자의 발현을 조절 가능하다.

AAV 비리온의 전달

기존의 신경 손상에 대한 생체 내 또는 시험관 내 (생체 외로도 명명) 형질도입 기법으로 재조합 AAV 비리온을 CNS 세포내에 도입 가능하다. 시험관 내에서 형질도입 시, 대상체로부터 요망되는 수용체 세포를 제거하고, rAAV 비리온으로 형질도입하고 대상체에게 재도입한다. 이와 다르게, 상기 세포가 대상체에게서 부적절한 면역 반응을 일으키지 않는 경우, 동종 유전자성 또는 이종 유전자성 세포를 사용할 수 있다. 또한, 신경 선조 세포를 시험관 내에서 형질도입한 후, CNS에 전달 가능하다.

형질도입된 세포를 대상체에 도입하고 전달하는 적절한 방법은 공지이다. 예를 들어, 세포는 적절한 배지 중 형질도입될 세포를 재조합 AAV 비리온과 조합하여 형질도입하고, 관심있는 DNA를 수취한 세포는 서던 블랏 및/또는 PCR과 같은 공지의 기술 또는 선택 마커를 사용해 스크린 가능하다. 형질도입된 세포는 하기한 바와 같이 약제학적 조성물로 제형화되고, 하기한 각종 기법에 의해 대상체에게 하나 이상의 투여량으로 상기 조성물이 투여된다.

생체 내 전달을 위해, rAAV 비리온은 약제학적 조성물로 제형화되어, 하나 이상의 투여가 지시한 방식에 따라 직접 투여된다. 치료 유효 투여량은, 약 10⁶내지 10¹⁵의 rAAV 비리온, 보다 바람직하게는 10⁷내지 10¹², 더 바람직하게는 약 10⁸내지 10¹⁰의 rAAV 비리온 (또는 바이러스 게놈, 'vg' 로도 명명)을 함유하거나, 또는 이들 범위 내의 임의량을 함유한다. 일반적으로, 0.01 내지 1ml 의 조성물을 전달하며, 바람직하게는 0.01 내지 약 0.5 ml, 바람직하게는 약 0.05 내지 약 0.3 ml, 예를 들어, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2 등 및 이들 범위내의 정수 값의 조성물을 전달한다.

시험관 내에서 형질도입되는 재조합 AAV 비리온 또는 세포는, 입체공간적 주사와 같은 공지의 신경외과 기법을 이용하여, 바늘, 카테터 또는 관련 장치를 이용하여, 예를 들어 뇌실 영역으로의 주입을 통해 CNS 또는 뇌로 뿐만 아니라 선조체 (즉, 미상 행 또는 선조체의 비각), 척수 및 신경근육 연결부위 또는 대뇌 로브로 직접 전달된다; 즉, Stein 등, J. Virol.73: 3424-3429, 1999; Davidson 등, PNAS97: 3428-3432, 2000; Davidson 등, Nat. Genet.3: 219-223, 1993; 및 Alisky and Davidson, Hum. Gene Ther.11: 2315-2329, 2000). 대뇌 주사는, 주사 부위의 정확한 표적화를 위해 입체공간적 좌표를 사용할 수 없고, 대뇌 로브의 크기는 동물간에 상이할 뿐만 아니라, 이들의 절대 3차원 방향 또한 상이하다는 문제가 있다. 따라서, 콜레라 독소 서브유닛 b (CTb) 를 사용하여 주사의 정확한 위치를 결정하고, 주사 부위의 유도 가능한 신경의 푸울 (pool) 을 알아낼 수 있다. 주사는 분자층, 퍼킨지 세포층, 과립세포층 및 아보 비테 (arbor vitae) 의 백질을 채울 수 있으나, 대뇌 핵의 심부까지는 연장되지 않는다.

CNS 투여 방법의 하나는, 컨벡션-강화 전달 (CED) 시스템이다. 이 방법으로, 재조합 비리온을 뇌의 광범위한 영역에 걸쳐 많은 세포에 전달할 수 있다. 또한, 전달된 벡터는 CNS 세포 (즉, 신경 또는 신경교 세포) 내에서 형질전환유전자를 효과적으로 발현한다. 임의의 컨벡션 강화 전달 장치가 바이러스 벡터 전달에 적절하다. 바람직한 구현에서, 장치는 삼투압 펌프 또는 주입 펌프이다. 삼투압 펌프 및 주입 펌프 모두 다양한 공급자로부터 입수가능하다 (예를 들어, Alzet Corporation, Hamilton Corporation, Alza, Inc., Palo Alto, California). 일반적으로, 바이러스 벡터는 하기와 같이 CED 장치로 전달된다. 카테터, 캐뉼라 또는 다른 주사 장치를 선택된 대상체의 CNS 조직에 삽입한다. 당업자는 CNS의 일반 영역 중 적절한 목표 지점을 찾을 수 있다. 예를 들어, AAV-GDNF 를 투여하여 PD 를 치료하는 경우, 뇌 중 선조체가 적절한 표적 부위이다. 입체공간적 지도 및 위치화 장치 또한 이용 가능하다 (예를 들어, ASI Instruments, Warren, MI). 위치화는, 대상체 뇌의 CT 및/또는 MRI 이미지에서 수득한 해부학적 지도를 사용해서 실행 가능하며, 이는 선택된 표적으로 주사 장치를 안내하는데 유용하다. 또한, 본원에 기재된 방법은 상대적으로 광범위한 뇌 영역에서 바이러스 벡터를 취할 수 있도록 실행되므로, 주입 캐뉼라는 많이 필요치 않다. 수술상 문제는 투입 횟수와 관련되므로, 이러한 전달 양태는 통상의 전달 방법에 의해 나타나는 부작용을 감소시킨다. 예를 들어, CED 전달에 관한 자세한 내용은 공지이다 (U.S. 특허 제 6,309,634).

PD의 경우, 중등 내지 과동한 탈신경과 같은, 기존 흑질선조체 도파민성 (DA) 탈신경이 있는 것으로 증명된 대상체에게 전달을 실시한다. 일반적으로, 가시적인 PD 병후를 대상체가 나타내는 시점에서, 중등 내지 과도한 탈신경화가 이미 발생하고, 이는 존재하는 신경의 약 60-70% 내지 90% 이상이 손실된 것이다. 따라서, '중등'의 탈신경은 약 60-70% 이상의 신경 손실을, '과도한' 탈신경은 약 90% 이상의 신경 손실을 의미한다.

신경 손실의 한 척도는, CNS 중 도파민 활성 수준을 참조하는 것이다. 따라서 '중등' 의 탈신경화는, 한쪽 또는 양쪽의 선조 반구의 도파민 양의 약 60-70%이상의 손실을, '과도한' 탈신경은, 한쪽 또는 양쪽의 선조 반구의 도파민 양의 약 90% 이상의 손실을 나타낸다. 도파민 양의 측정을 위해, 대상체에게 표지된 트레이서를 투여한다. 표지의 측정에 의해 도파민 활성을 표시한다. 바람직하게, 표지된 트레이서는, 예를 들어, 포지트론 에미션 토모그라프 (PET) 스캐닝 또는 기타 CNS 이미징 기법에 의해 동물 전체의 뇌에서, 생체 내에서 가시화된다. 선택된 트레이서의 적절한 표지에는, 분광학, 광화학, 면역화학, 전지, 광학 또는 화학적 수단에 의해 측정 가능한 임의의 조성물이 포함된다. 본 발명에서 유용한 표지에는 방사성 표지 (즉,¹⁸F,³H,¹²⁵I,³⁵S,³²P 등), 효소, 발색 표지, 형광 염료 등을 포함한다. 바람직한 구현에서, 표지¹⁸F 를 DOPA 와 함께 사용하여 도파민활성을 측정한다. 따라서, 이러한 구현에서, 신경 손실의 정도는 [¹⁸F]-플루오로-DOPA를 트레이서를 이용해 측정한다. 도파민 활성을 측정하는 또다른 방법에서는, 표지된 트레이서 [¹⁸F]-플루오로-L-m-타이로신 (¹⁸F-FMT) 를 사용한다. FMT는 도파민 사용 세포에 결합한다. 생체 내 상에서 도파민의 양을 측정하는 방법은 U.S. 특허 제 6,309,634 를 참조한다.

세포의 재생 및 그에 따른 질병의 치료는 또한 상기한 도파민 수준을 측정하여 모니터링할 수 있다. 여기에 사용된 질병의 치료는, 신경의 재생 뿐만 아니라, 관심 대상 질병의 병후의 저감 또는 제거를 의미한다. 따라서, 치료 이전 및 이후의 도파민 수준을, 신경 재생 측정으로 비교한다. 이와 다르게, 질병의 시각적 병후를 치료의 척도로 사용한다.

신경 조직 분석 및 생화학 분석

치료될 대상체로부터 조직을 취하여, 보통의 방법에 의해 신경의 재생, 사멸 및 분화의 평가를 위해 처리한다. 본 발명에서, 선조체 및 흑색질 (substantia nigra; SN) 의 코로나 부위 검사와 같은, 예컨대 선조체와 SN의 각종 세포를 평가하는 것이 유용하다. 경시적 평가로 벡터 투여 부위에서 먼 세포의 정상화 증가를 나타낼 수 있다.

도파민 및 그 대사물, 즉 HVA 및 DOPAC은, 고성능 액체 크로마토그라피 (HPLC) 에 의해 선행기술의 방법대로 측정할 수 있다 (Shen, Y., Hum. Gene Ther. (2000)11: 1509-1519). CSF 또한 수합하여, 특히 벡터가 GDNF 형태의 분비형태를 코딩하는지에 관해서, 단백질 수준 및 효소 활성에 대해 평가할 수 있다.

대상체는 또한, 아포모르핀-HCl의 복강내 주사로 주기적으로 회전 양태를 실시한다.

C. 실험

하기는, 본 발명을 실시하는 구체적 구현예를 나타낸다. 실시예에는 예시 목적일 뿐, 본 발명의 의미를 어느 의미에서도 제한하는 것은 아니다.

사용한 숫자를 정확하게 하기 위해 노력하였으나 (예를 들어, 양, 온도 등), 어느 정도의 실험상 오차 및 오류는 인정되어야할 것이다.

물질 및 방법

동물 및 수술법

성숙한 수컷 Wistar 래트 (200 내지 250 g 체중)를, 12시간 동안 명/암 싸이클로 우리 안에 유지하되, 먹이와 물은 자유롭게 근접하게 하였다. 동물 케어에 대한 Jichi Medical School 가이드라인에 따라 실험을 실시하였다. PD의 래트 모델 일부는, 문헌에 공지된 대로 준비하였다 (Sauer and Oertel, Neuroscience (1994)59: 401-415). 간략하게, 하기 좌표에 따라 좌측 선조체에, 4 ㎕의 아스코베이트-식염수 (0.05%) 에 녹인 20 ㎍의 6-히드록시도파민 (6-OHDA; 자유염기로 계산한 것; Sigma, St. Louis MO) 을, 래트에게 입체공간적으로 주사하였다; 전방-후방 (AP) +1.0 mm, 내측-외측 (ML) 3.0 mm, 등-배 (DV) -4.5 mm. 입체공간적 좌표는, 브레그마 (정수리점) 및 경막 표면에 대해 상대적으로 계산하였다. 4 주 후, 아포모르핀 유도 회전 (복강내로 0.1mg/kg 주사)에 대해 동물을 시험하였고,60분 기간 동안 7회 이상의 반대쪽 회전을 나타내는 동물만을 추가의 실험을 위해 사용하였다. 흑질선조체 퇴화 정도를 관측하기 위해, 신경 트레이서 CTB (증류수 중에 희석된 1%, 1㎕; List Biological Laboratories, Campbell, CA, USA) 를, 희생시키기 3 일 전에 좌우로 선조체 내에 주사하였다 (n=5, AP=+l mm, ML=3.0 mm, DV= -4.5 mm). 이는, 6-OHDA 손상 4 주 후, 선조체로 기능 프로젝션을 유지한 SN 내의 DA 신경의 하부군을 역방향으로 표지하기 위해 시행되었다. PD 동물 모델에게, 3개의 상이한 부위에 하기의 좌표 (AP = +1.5 mm, +1.0 mm 및 +0.5 mm; ML = 2.6 mm, 3.0 mm 및 3.2 mm; DV = -4.5 mm) 를 이용하여 좌측 선조체에 다음을 무작위로 주사 (부위 당 2㎕, 10¹³벡터 지놈 카피/ml) 하였다: AAV-GDNFflag(n=32), AAV-LacZ (n=22), 또는 비히클 (0.1M PBS; n=8). 주사 속도는 1㎕/분이고, 바늘은 7분간 부위에 놓아둔 후 서서히 제거하였다. GDNFflag단백질의 역방향 전달 평가를 위해, 일부 래트 (각 시점에서, AAV-GDNFflag주입 그룹 (n=4), AAV-LacZ 주입 그룹 (n=2)) 를 AAV 주사 2, 4 및 8 주 후에 각각 희생시켰다. 벡터 주사 20 주 후, 래트를 무작위로 분류해, 생화학적 또는 면역조직학적 분석을 위해 희생시켰다. 8 마리의 래트에서는 희생 3 일전 선조체의 양측에 CTB 를 주사하였다.

행동 시험

AAV 벡터 주사 이후, 래트에 대해, 아포모르핀-HCl (0.1mg/kg) 의 복강내 주사로 매 2 주마다 회전 행동을 시험하였다. 공지의 방법에 따라, 60분 이상의 관측 기간 동안 완전한 신체 회전의 전체 횟수를 측정하였다 (Shen, Y., Hum. GeneTher. (2000)11: 1509-1519). 자발적인 사지 사용을, 원기둥 시험법에 의해 4 주마다 측정하였다 (Kirik 등, J.Neurosci. (2000)20: 4686-4700). 래트를 자유롭게 움직일 수 있을 만큼 큰 투명 유리 원기둥에 두었다. 원기둥 벽에 발 하나 이상을 붙이는 리어 (rear) 를 10 회 실행한 후에, 원기둥 벽에 대한 양 앞발의 접촉회수를 20회 이상 계수하였다. 반대쪽 앞발 접촉에 대한 결과를 총 백분율로 나타내었다.

생화학적 분석

래트를 나트륨 펜토바르비탈 마취 하에 머리를 제거함으로써 희생시키고, 뇌를 즉시 절제하여 드라이 아이스 상에 위치시켰다. 날카로운 말단의 스테인레스 관을 사용하여 선조체를 좌우 양측으로 천공해내었다. 아직 마르지 않은 조직 샘플을 칭량하고 그 다음 분석전까지 -80 ℃ 에서 보관하였다. 도파민 및 그의 대사물, HVA 및 DOPAC 수준을, 이미 기재된 것과 같은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 를 사용하여 평가하였다 (Shen, Y.,Hum. Gene Ther.(2000)11: 1509 - 1519).

면역조직화학

래트를 마취 하에 PBS 로 관류 후, 빙냉된 4 % PFA 로 관류시켰다. 뇌를 절제한 후, 4 시간 동안 4 % PFA 중에서 후고정시켰다 (post-fixed). 선조체 및 SN 으로부터의 관상 섹션을 (30 ㎛)을 PBS 중의 0.3 % H₂O₂중에서 30 분 동안 처리하고, PBS 중의 3 % 우태아 혈청 (FBS)/0.1 % Triton X-100 으로 1 시간 동안 블로킹시켰다. 섹션을 TH (1:1000, 마우스 항-TH 모노클로날 항체; Chemicon, Temecula, CA, USA), CTB (1:10000, CTB에 대한 염소 항혈청; List Biologic, Campbell, CA, USA) 또는 FLAG (1:1000, 항-FLAG M2 항체, Sigma, St. Louis, MO)에 대한 일차 항체와 함께 4 ℃ 에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 이를 (일차 항체의 종에 대하여) 비오틴화 이차 항체와 함께 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다 (1:400, Santa Cruz, Santa Cruz, CA). 절편들을 색소원으로서의 3,3-디아미노벤지딘 (DAB)를 사용하여, 아비딘-비오틴화 퍼옥시다아제 복합 방법 (Vectastain ABC kits; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) 으로 가시화하였다.

FLAG/TH 이중 면역형광 염색의 경우, 절편들을 순차적으로, PBS 중에 5 % 정상 염소 혈청을 함유하는 블록킹 용액과 실온에서 1 시간, 모노클로날 마우스 항-FLAG 항체 (1:250, Sigma) 및 폴리클로날 토끼 항-TH 항체 (1:500)와 4 ℃ 에서 하룻밤 동안, 그리고 로다민-콘쥬게이션 염소 항-마우스 IgG (1:200; Santa Cruz, Santa Cruz, CA) 및 FITC-콘쥬게이션 염소 항-토끼 IgG (1:200; Santa Cruz, Santa Cruz, CA) 와 2 시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 섹션들을 동일초점 레이저 주사 현미경 (TCS NT; Leica, Heidelberg, Germany) 하에서 검사 및 관찰하였다. CTB/TH 이중-면역형광 염색에 대해, 항-CTB (1:5000, CTB 에 대한 염소 항혈청) 및 마우스 항-TH (1:500) 항체를 사용하였다.

TH-양성 신경세포 및 CTB-표지된 신경세포의 정량 분석을 위해, SN 에서 좌우 양측으로 300 ㎛ 간격에서 절편들을 계수하였다. TH-IR 섬유의 광학 밀도를,선조체에서의 주둥이쪽에서 꼬리쪽으로 (rostro-caudally) 매 300 ㎛ 섹션 상에서, NIH Image 1.59 소프트웨어를 사용하여 정량하였다 (Kozlowski 등,Exp. Neurol.(2000)166: 1-15).

통계 분석

결과는 평균±s.e.m 으로 나타내었다. 반복측정 분산 분석 (ANOVA)을 사용하고, 이어서 Tukey 정직 유의차 (HSD) 시험에 의해 데이타를 통계 분석하였다 (StatView 5.0 소프트웨어).

실시예 1

재조합 AAV 벡터의 구축

FLAG-태깅된 GDNF 를 발현하는 재조합 AAV 벡터 (AAV-GDNFflag, 도 1a) 또는 β-갈락토시다아제를 발현하는 재조합 AAV 벡터 (AAV-LacZ, 도 1b) 를 하기와 같이 구축하였다. 6-OHDA 환부 또는 아포모르핀 주사는 GDNF 의 내생적인 발현을 유도하기 때문에 (Ohta 등,Biochem. Biophys. Res. Commun.(2000)272: 18-22; Zhou 등,Neuroreport(2000)11: 3289-3293), 유전자 전달의 효과를 평가하기 위해서는 내인성 GDNF 와 형질전환유전자-유도 GDNF 를 구별할 필요가 있다. 따라서, FLAG-태깅된 GDNF 를 발현하는 AAV 벡터를 구축하였다.

AAV 벡터 플라스미드 pAAV-GDNFflag을 이미 기재된 pAAV-GDNF 플라스미드로부터 유도하였다 (Fan 등,Neurosci. Lett.(1998)248: 61-64). 이 플라스미드는, 인간 싸이토메갈로바이러스 (CMV)의 즉각적인-초기 (IE) 프로모터 하에, 카르복실 말단에서 FLAG 서열 (DYKDDDDK: 서열번호 5) 에 의해 태깅된 마우스 GDNFcDNA (Matsushita 등,Gene(1997)203: 149-157) 를, 인간 성장 호르몬 제 1 인트론 및 AAV-2 게놈의 전환말단 반복부 (ITR) 들 사이의 원숭이 바이러스 40 (SV40) 폴리아데닐화 시그널 서열과 함께 함유하였다.

AAV 벡터 플라스미드 pAAV-LacZ, 보조 플라스미드 pHLP19 및 플라데놀 (pladenol) 은 선행기술에 기재되었다 (Fan 등, Neurosci. Lett. (1998)248: 61-64). 플라데노5 는 U.S. 특허 제 6,004,797 호에 기재되었다. 부융합성 (subconfluent) 인간 293 세포들을, 칼슘 포스페이트 공침전법을 사용하여 벡터 플라스미드 및 헬퍼 플라스미드로 일시적으로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 후 72 시간째에, 세포들을 수합해 3 회의 동결 해동 사이클에 의해 용균시켰다. AAV 벡터들 (AAV-GDNFflag및 AAV-LacZ) 을, 이미 기재된 것과 같이 2 개의 순차적인 연속 CsCl 구배법을 사용하여 정제하였다 (Matsushita, 등,Gene Therapy(1998)5: 938-945). DNA 도트-블랏 혼성화 (dot-blot hybridization) 정량 분석에 의해 평가한 최종 입자 역가는 AAV-GDNFflag의 경우 1.6×10¹³벡터 게놈 복제수/㎖ 이었고, AAV-LacZ 의 경우 2.1 ×10¹³벡터 게놈 복제수/㎖ 였다.

실시예 2

AAV-GDNF flag 의 시험관내 발현

GDNFflag융합 단백질의 시험관내 발현을 탐지하기 위하여, 293 세포를 AAV-GDNFflag 또는 AAV-LacZ (5000 벡터 게놈 복제수/세포)로 형질도입시켰다. 형질도입한지 36 시간 후, 세포 용균물들을 15 % 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분리하고, 폴리비닐리덴 디플루오라이드 멤브레인으로 이동시켰다 (Millipor, Bedford, MA, USA). 잔류 단백질-결합 부위를 TBS 중의 5 % 탈지분유로 1 시간 동안 실온에서 블록킹시켰다. 마우스 항-FLAG M2 항체 (1:1000, Sigma, St Louis, MO) 또는 토끼 항-GDNF 항체 (1:2000, Santa Cruz, Santa Cruz, CA)를 사용하여, 막을 4 ℃ 에서 하룻밤동안 인큐베이션시킨 후, 서양고추냉이 퍼옥시다아제에 콘쥬게이션된 이차 항-마우스 또는 항-토끼 항체 (1:2500, Amersham, Arlington, Arlington Heights, IL) 와 2 시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 화학발광 신호가 ECL 시스템 (Amersham)에 의해 탐지되었다.

웨스턴 블롯 분석에서, GDNFflag융합 단백질이 항-GDNF 및 항-FLAG 항체 모두에 의해 AAV-GDNFflag-형질도입된 293 세포들 중에서 탐지되었다. AAV-LacZ-형질도입된 세포들의 용균물 중에서는 신호가 탐지되지 않았다 (도 2).

AAV 벡터-유도 GDNFflag융합 단백질의 생물학적 활성을 분석하기 위하여, 래트 태아 DA 신경세포의 일차 배양액을 제조하였다. 즉, 배쪽 (ventral) 중뇌를 14 일째의 Wistar 래트 배로부터 절제하고, 잘게 다져서 PBS 중의 0.25 % 트립신과 함께 15 분 동안 인큐베이션하였다. 단리된 세포들을 폴리-L-라이신을 미리 도말해 놓은 35 mm 디쉬에, 10⁵세포/디쉬의 초기 세포 밀도로 플레이팅시키고, B27 (Gibco BRL), 100 유닛/㎖ 의 페니실린, 100 ㎍/㎖ 의 스트렙토마이신, 25 mM KCl, 및 2mM 글루타민으로 보충된 Neurobasal-SFM 배지 (Gibco BRL) 와 함께 37 ℃ 에서 인큐베이션하였다. AAV 벡터 처리된 디쉬에서, 배양액을 AAV-GDNFflag또는 AAV-LacZ (5000 벡터 게놈 복제수/세포) 로 감염시켰다. 양성 대조군 디쉬 또는 음성 대조군 디쉬에서, 재조합 인간 GDNF (rhGDNF, Santa Cruz) 또는 BSA 를 최종 농도 10 ng/㎖ 로 배양액에 첨가하였다. 배양 배지를 3 일 간격으로 절반의 신선한 배지로 갈아주되, rhGDNF 또는 BSA 는 동일한 농도로 유지시켰다. 9 일 후, 세포를 4 % 파라포름알데히드 (PFA)로 30 분 동안 고정시키고, 면역세포화학적 염색 처리하여 GDNFflag및 TH 의 발현을 점검하였다. 존재하는 TH-IR 세포의 수를 문헌 [Sawada 등,J. Neurochem.(2000)74: 1175-1184] 에 기재된 바와 같이 계수하였다.

타이로신 히드록실라아제 (TH) 면역염색으로, AAV-LacZ 형질도입된 배양액에서보다 AAV-GDNFflag 형질도입된 배양액에서 약 2 배 더 많은 TH-면역반응성 (TH-IR) 세포들이 살아남았다는 것을 발견하였다 (도 3). 이러한 결과는 AAV-GDNFflag이 시험관 내에서 생활성인 GDNFflag융합 단백질의 생산을 가능하게 한다는 것과, FLAG 펩티드의 첨가가 DA 신경세포 상에서 GDNF 의 향신경성 효과를 변경시키지 않아, 항-FLAG 항체에 의해 외인적으로 발현된 GDNFflag융합 단백질의 동정을 가능하게 한다는 것을 확인시켜 주는 것이다.

실시예 3

선조체에서의 GDNF flag 의 발현 및 SN 에 대한 역방향 수송

AAV-GDNFflag주사 후 2, 4, 8 및 20 주째에 항-FLAG 항체로, GDNFflag형질전환유전자 발현을 선조체에서 탐지하였다. FLAG 면역반응 (FLAG-IR) 세포들이 선조체 전체적으로 주사 부위 주변에서 탐지되었다. 이들 세포들은 중간 스파이니 (spiny) 신경세포의 전형적인 형태를 나타내었다 (도 4a 및 4b). 또한, 항-TH 및 항-FLAG 항체를 사용한 이중 면역형광 염색으로, 선조체 내부로의 AAV-GDNFflag주사 후 4 주 및 8 주째에 동측 SN 의 흑색질에서 이중 양성 세포들을 탐지하였다 (도 4c~4e). AAV 벡터 주사 후 8 주째에, 13.1±2.4% (n=4)의 TH-IR 세포들이 SN 에 분산된 FLAG-IR 세포들과 중복되었으며, 이는 수득된 형질전환유전자성 GDNFflag일부가 DA 신경세포에 접근한다는 것을 나타낸다. FLAG-IR 세포들은 반대쪽 선조체 또는 SN 에서는 관찰되지 않았으며, AAV-LacZ 또는 비히클-주사된 래트에서의 상기 영역에서 관찰되지 않았다. AAV-LacZ-주사된 래트에서, X-gal-양성 세포들이 주사 후 2 - 20 주째에 선조체에서 탐지되었지만, β-갈락토시다아제 신호는 SN 에서 탐지되지 않았다.

이러한 결과는 AAV-GDNFflag이 선조체에서의 GDNFflag융합 단백질의 발현을 유도할 수 있다는 사실과, AAV 벡터 그 자체가 아니라, GDNFflag융합 단백질이 선조체에서 말단으로부터, SN 중 DA 신경세포체로 역방향으로 수송될 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 4

선조체에서 DA 신경분포의 구조 (rescue)

AAV-GDNFflag이 손상된 선조체에서의 DA 신경세포 신경분포를 구조할 수 있는지의 여부를 결정하기 위하여, TH-IR 섬유 말단 크기를 주사 후 20 주째에 선조체에서 300 ㎛ 간격으로 슬라이스상에서 검사하였다. AAV-LacZ-주사된 래트에서, 손상된 선조체에서 TH-IR 섬유의 밀도는 현저히 감소되어 온전한 면의 단지13.5±3.0% 였다 (도 5a 및 5c). 반면에, AAV-GDNFflag로 주사된 래트에서, TH-IR 섬유의 밀도는 현저히 증가되어, 온전한 면의 거의 48.7±7.3% 에 도달하였다 (도 5b, 5d 및 5e). 유지된 TH-IR 섬유는 주사 부위 주변에 분포되었으며, 이는 TH-IR 섬유의 신경분포가 선조체에서 발현된 GDNFflag에 의해 구조되었음을 나타내는 것이다.

항-TH 면역염색 단독에 비해 CTB 후면-표지가 흑질 기능의 평가에 보다 정확한데, 이는 CTB 는 기능성 흑질-선조체 투사 (projection) 를 유지하는 SN 신경세포들만을 표지하는 반면, 항-TH 면역염색은 단지 신경세포체에서 TH 효소의 존재성만을 증명하기 때문이다. AAV-GDNFflag군에서 CTB-표지된 DA 신경세포들이 SN 에서보다 더 많이 존재하였으며, 이는 선조체에서 발현된 GDNFflag이 DA 신경세포들을 구조하고, 선조체로의 기능적 투사를 촉진할 수 있다는 것을 암시한다. 또한, 선조체 내부로의 AAV-GDNFflag주사에 의한 흑질-선조체의 성공적인 구조는 선조체 중에서 도파민 및 그의 대사물의 높은 수준에 의해 뒷받침되며, 이는 흑색질 계에서 도파민의 장기지속적인 활성을 나타내는 것이다.

실시예 5

흑질-선조체 투사의 유지

콜레라 독소 서브유닛 B (CTB, 신경세포성 트레이서) (Leman 등,Brain Res. Brain Res. Protoc.(2000)5: 298-304) 를 좌우 양측으로 선조체 내에 주사하고, 잔존하는 흑색질 경로의 크기를 평가하였다. 6-OHDA 주사의 동일 대등물을, 희생시키기 3 일 전에 사용하여 선조체에 투사를 유지하고 있는 하위개체군의 DA 신경세포을 역방향으로 표지하였다. AAV 벡터 처리시, 즉 6-OHDA 주사 4 주 후에, 손상된 SN 에서 CTB-양성 신경세포의 수는 온전한 반대쪽의 28.9±3.7% 였다 (n=5). 항-CTB 및 항-TH 항체를 사용한 이중 면역형광은 SN 중에서 가장 큰 CTB-양성 신경세포도 TH-양성임을 나타내었다 (도 6). 손상부분에서 TH-IR 신경세포의 백분율은 온전한 부분의 34.9±2.6 % (n=4) 였다. 이러한 결과는 손상 4 주 후에 흑질-선조체 연결의 일부가 유지되었다는 것을 증명한다. AAV 벡터 주사 20 주 후에, TH-IR 세포들 (온전한 부분의 19.5±2.0%) 및 CTB-양성 세포들 (온전한 부분의 17.9±1.6%) 의 막대한 손실이 AAV-LacZ 로 주사된 래트에서 관찰되었다. 반면, AAV-GDNFflag주사는 TH-IR 신경세포 및 CTB-양성 세포를 현저히 증가시켜, 반대쪽에 대해 각각 57.3±6.2 % 및 50.8±8.5 % 에 도달하였다 (도 7 및 8, P< 0.01).

이들 결과는, 손상 4 주 후에 선조체 내부로의 AAV-GDNFflag주사가 SN 에서 DA 신경세포의 존속을 구조하며, 흑색질 투사의 유지를 촉진한다는 것을 증명한다.

실시예 6

AAV-GDNF flag 의 선조체 내부로의 주사 후 거동 회복

6-OHDA 투여 4 주 후에, 3 개의 군 (AAV-GDNFflag, n=20; AAV-LacZ, n=16; 및 비히클, n=8)의 모든 래트들은, 아포모르핀-유도 회전 시험 및 원기둥 시험 모두에서 유사한 정도의 감소를 나타내었으며, 이는 동등한 수준의 DA 고갈을 암시한다.

아포모르핀-유도 회전의 감소가 AAV-GDNFflag이 부여된 래트에서, 벡터 주입 후 4 주째부터 관찰되었다 (도 9a). 이러한 감소는 서서히 진행되어 시험기간전체에 걸쳐 (20 주) 유지되었다. 반면에, AAV-LacZ 또는 비히클 주사군에서의 래트들은 동일한 기간 동안 상당히 안정된 회전 속도를 나타내었다.

원기둥 시험을 이용하여 손상된 래트에서의 자발적인 앞다리 사용을 측정하였다 (도 9b). AAV 처리 전에는, 본 시험에서 반대쪽 다리 사용의 감소된 빈도 (총 접촉의 23 - 25%) 로 나타낸 바와 같이 6-OHDA 손상 후 각 군의 래트들은 동측의 몸에서 유사한 등급의 경향을 나타냈다. AAV-GDNFflag이 수용된 래트에서는, 주사 후 4 주째에 현저한 개선이 관찰되었으며, 이는 서서히 발전되어 20 주에는 거의 정상 수준 (총 접촉의 47 %) 에 도달하였다. 반면에, AAV-LacZ 또는 비히클이 수용된 래트에서는, 20 주 내내 반대측 사용이 동일한 수준으로 유지되었다. 아모포르핀-유도 회전 및 실린더 시험 모두에 대해, AAV-GDNFflag이 주사된 래트 대 AAV-LacZ 또는 비히클 주사된 래트의 통계 분석은 현저한 유의차를 나타내었다 (P<0.01).

실시예 7

손상된 선조체에서 도파민 함량의 보존

AAV-GDNFflag주사 후의 행동 회복이 흑질-선조체에서의 흑색질 도파민 생산, 도파민 수준 및 그의 대사물의 수준과 상관성이 있는지의 여부를 시험하기 위하여, 헤모바닐산 (HVA) 및 3,4-디히드록시페닐아세트산 (DOPAC) 을 주사 후 20 주째에 분석하였다. AAV-GDNFflag주사된 군 (n = 8) 에서, 선조체의 손상부에서 도파민 수준은 반대쪽 온전한 면의 50.9 ±7.7 % 인 반면, AAV-LacZ 주사된 군 (n = 8) 에서는 반대쪽 면의 11.5±4.8 % 로 유지되었다 (도 10, P<0.01). 또한,HVA 및 DOPAC 의 수준은 AAV-GDNFflag주사된 군에서 보다 높았다. 선조체의 온전한 쪽에서는 두 군 사이에서 도파민 또는 그의 대사물의 수준에서의 현저한 유의차가 관찰되지 않았다.

상기의 상세한 실시예들은, PD의 허용가능한 동물 모델의 선조체 내로의 AAV 벡터-매개 GDNF 유전자 전달이, SN 신경세포들의 선조체로의 연결을 유지하면서도, 이들이 이후에 추가적으로 퇴화되는 것으로부터 보호한다는 것을 나타낸다.

본 연구에서, GDNFflag가 주사 후 4-8 주째부터 AAV-GDNFflag주사부에 대해 동측의 SN 세포들에서 탐지되었다. 이들 SN 세포들이 DA 세포라는 것은, 항-FLAG 및 항-TH 항체로의 이중 면역형광 염색을 사용하여 확인하였다. AAV 벡터 처리 후 8 주째에 FLAG-IR 세포들이 흑질의 광범위한 영역에서 관찰되었지만, FLAG-IR 세포들의 백분율은 낮은 것으로 보였다 (13.1 %의 TH-IR 세포). GDNF 는 DA 신경세포에서 피코몰 양의 범위에서도 매우 강한 효과를 나타내기 때문에, 일과성으로 수송되어 사멸시 면역조직화학방법에 의해 탐지되지 않은 소량의 GDNFflag단백질도 독소-유도 세포 사멸에 대항하여 흑질 DA 신경세포들을 보호할 것이다. 반면에, 선조체에 AAV-LacZ 를 주사한 래트는 SN 에서 β-갈락토시다아제 신호를 나타내지 않았다. 이전의 연구 (Chamberlin 등,Brain Res.(1998)793: 169 - 175) 와 일치하여, AAV 벡터 자체는 중추신경계에서 역방향으로 수송되지 않았지만, GDNFflag단백질은 SN 중 선조체에서 DA 신경세포로 역방향 수송되었다. 선조체에서의 GDNFflag단백질의 실질적인 발현도 주사 후 20 주째에 탐지되었다. GDNFflag생산의 이러한 지속성은 일회의 AAV 벡터 주사 후 흑색질계의 장기간 구조를 제공하였다. 손상된 선조체에서의 TH-IR 섬유의 밀도는 AAV-GDNFflag주사 후에 보존되었다.

따라서, 선조체에서 AAV-매개 GDNF 유전자 전달은 PD 및 다른 CNS 퇴행성 질병의 신경보호 유전자 치료법과 같이 효능적이다.

따라서, 신경퇴행성 장애의 신규한 치료방법이 제공된다. 본 발명의 바람직한 구현예들을 일부 상세히 기재되었으나, 첨부된 특허청구범위로 정의되는 본 발명의 기술사상 및 범주로부터 벗어나지 않으면서도 자명한 변화들이 만들어질 수 있다는 것이 이해되어야 한다.

본 발명은 이미 존재하는 신경 손상이 있는 대상의 치료를 위한 조성물 및 치료방법을 개시한다. 본 조성물 및 방법은, 신경교 세포주-유도 향신경성 인자 (GDNF)를 파킨슨씨 병과 같은 신경퇴행성 병증을 갖는 대상체에게 전달하기 위하여 아데노-연결 바이러스 (AAV) 기재의 유전자 전달계를 사용한다.

Claims

기존 신경세포 손상이 있는 포유류 대상체의 중추 신경계에 조성물을 투여함으로써 상기 대상체를 치료하기 위한 조성물의 용도로서, 상기 조성물이 재조합 아데노-회합 바이러스 (AAV) 비리온을 함유하며, 상기 비리온은 프로모터를 포함하는 발현 제어 인자에 작동적으로 연결된 신경교 세포주-유래 신경영양 인자(GDNF) 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 용도.
제 1 항에 있어서, 대상체가 인간인 용도.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 기존 신경세포 손상에 중등 내지 대규모의 흑질-선조체 (nigrostriatal) 도파민성 (DA) 탈신경이 포함되는 용도.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 GDNF 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 가진 리딩 프레임 (reading frame) 및 제 5' 위치에 분비 서열을 추가로 포함하는 용도.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 인간 GDNF 를 코딩하는 용도.
제 5 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 인간 pre-pro-GDNF 를 코딩하는 용도.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 상기 대상체의 선조체에 투여되는 용도.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터가 바이러스 프로모터인 용도.
제 8 항에 있어서, 프로모터가 MLP, CMV 또는 RSV LTR 프로모터인 용도.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 AAV 비리온이 상기 대상체의 선조체에 투여되는 용도.
제 10 항에 있어서, 재조합 AAV 비리온이 컨벡션-강화 전달 (CED) 을 이용하여 선조체에 투여되는 용도.
제 11 항에 있어서, 투여가 삼투압 펌프를 이용하여 수행되는 용도.
제 11 항에 있어서, 투여가 주입 펌프를 이용하여 수행되는 용도.