KR20030094355A

KR20030094355A - 세포 표층 결합 단백질 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20030094355A
Application number: KR10-2003-7013627A
Authority: KR
Inventors: 후쿠다히데키; 곤도아키히코; 마쓰모토다케시; 노다히데오
Original assignee: 간사이가가쿠기카이세이사쿠가부시키가이샤
Priority date: 2001-04-19
Filing date: 2002-03-22
Publication date: 2003-12-11
Also published as: CN1708510A; EP1380592A1; ATE416192T1; EP1380592B1; WO2002085935A1; US20040197857A1; DK1380592T3; JPWO2002085935A1; EP1380592A4; CN1708510B; JP4340068B2; US7192764B2; DE60230128D1; KR100714670B1

Abstract

당쇄 결합 단백질 도메인과 원하는 단백질의 융합 단백질을 발현하도록 플라스미드를 작제한다. 당해 플라스미드를 세포에 도입하여 이러한 단백질을 세포 표층에 발현시킨다. 특히, C 말단부에 활성을 갖는 단백질을 세포 표층에 발현시키는 경우에 적절하다.

Description

세포 표층 결합 단백질 및 이의 용도{Cell surface layer-binding protein and utilization thereof}

세포 표층 편재 단백질은 세포 표층에 고정되어 있으며 세포 표층에 존재하는 단백질이다. 예를 들면, 효모의 응집 단백질인 α- 또는 a-응집소를 들 수 있다. 이러한 단백질은 분비 시그널 서열을 갖는다는 점에서 분비 단백질과 동일하지만 GPI 앵커를 통해 세포막에 고정되어 수송된다는 점에서 분비 단백질과는 상이하다. 일반적으로 세포 표층 편재 단백질은 C 말단부에 GPI 앵커 도메인을 갖고 있다. 세포 표층 편재 단백질은 세포막을 통과할 때, 이의 도메인의 일부(즉, GPI 앵커 부착 인식 시그널 서열)가 선택적으로 절단되며 새롭게 돌출된 C 말단 부분의 GPI 앵커가 세포막상에 결합되어 세포막에 고정된다. 이어서, 포스파티딜이노시톨 의존성 포스포리파제C(PI-PLC)에 의해 GPI 앵커의 근원부가 절단된다. 그리고, 세포막으로부터 절단된 단백질은 세포벽에 편입되어 세포 표층에 고정되며 세포 표층에 편재된다. 여기서, GPI 앵커란 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI)이라고 호칭되는 에탄올아민인산-6만노스α1-2만노스α1-6만노스α1-4글루코사민α1-6이노시톨 인 지질을 기본구조로 하는 당지질을 말한다.

GPI 앵커 도메인은 통상적으로 세포 표층 편재 단백질의 C 말단 또는 이의 근방에 위치한다. 예를 들면, α-응집소의 C 말단으로부터 320개의 아미노산 서열을 암호화하는 서열에는 GPI 앵커 부착 인식 시그널 서열 이외에 4개소의 당쇄 결합부위가 있다. GPI 앵커가 PI-PLC에 의해 절단된 후에 이들 당쇄와 세포벽을 구성하는 다당류가 공유결합함으로써 α-응집소의 C 말단 서열부분이 세포벽과 결합되며 α-응집소는 세포 표층에 유지된다.

이러한 GPI 앵커 도메인을 이용하여 발명자 등은 리파제를 세포 표층에 발현시키는 것에 성공하고 있다[참조: 일본 공개특허공보 제(평)11-290078호]. 즉, GPI 앵커 도메인을 암호화하는 DNA의 상류에 리파제의 구조 유전자를 배치한 다음, 상류에 분비 시그널 서열을 배치하여 N 말단부가 세포의 외측으로 되도록 세포 표층에 리파제를 발현시킨다.

본 발명은 당쇄 결합 단백질 도메인을 가지며 당해 당쇄 결합 단백질 도메인의 적어도 N 말단부 또는 C 말단부에 추가의 단백질이 결합되어 있는 세포 표층 결합 단백질에 관한 것이다.

도 1은 플라스미드 pWIFSpmROL 작제의 모식도이다.

도 2는 세포 표층에 리파제를 갖는 각종 효모의 증식 및 리파제 활성을 도시하는 그래프이다.

도 3은 단(short)형 FLO1 리파제를 발현하는 효모 MT8-1-단형 및 장(long)형 FL01 리파제를 발현하는 효모 MT8-1-장형의 메탄올 용해 활성을 도시하는 그래프이다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

본 발명에서 세포 표층 결합 단백질이란 적어도 당쇄 결합 단백질 도메인 및 추가의 단백질을 포함하는 융합 단백질이며 당쇄 결합 단백질 도메인에 의해 세포 표층에 고정되는 단백질을 말한다.

본 발명에서 당쇄 결합 단백질 도메인이란 복수의 당쇄를 가지며 이러한 당쇄가 세포벽 중의 당쇄와 상호작용 또는 얽힘으로써 세포 표층에 체류할 수 있는 도메인을 말한다. 예를 들면, 렉틴, 렉틴형 단백질 등의 당쇄 결합부위 등을 들 수 있다. 대표적으로는 GPI 앵커 단백질의 응집기능 도메인을 들 수 있다. GPI 앵커 단백질의 응집기능 도메인이란 GPI 앵커 도메인보다 N 말단부에 있으며 복수의 당쇄를 가지고 응집에 관여하고 있다고 생각되는 도메인을 말한다.

본 발명에서 GPI 앵커 단백질이란 일반적으로 세포 표층 편재 단백질이며 세포막 위에 존재하는 GPI 앵커를 통해 세포막에 결합할 수 있는 단백질을 말한다. GPI 앵커 단백질은 N 말단에 분비 시그널 서열 및 C 말단에 GPI 앵커 도메인을 갖는다. GPI 앵커 단백질로서는 효모의 응집 단백질(α-응집소, a-응집소, FLO 단백질) 및 알칼리포스파타제 등을 들 수 있지만 이들로 한정되지 않는다. 특히, 본 발명에서 적절하게 사용되는 응집 단백질로서는 FLO 단백질, 예를 들면, FLO1, FLO2, FLO4, FLO5, FLO9, FLO10 및 FLO11을 들 수 있다.

본 발명에서 GPI 앵커 도메인이란 세포벽 앵커 도메인 및 GPI 앵커 부착 인식 시그널 서열을 말한다. 통상적으로 세포 표층 편재 단백질의 C 말단 또는 이의 근방에 위치한다. 예를 들면, 효모의 α-응집소에서는 C 말단으로부터 320개의 아미노산 서열이다.

GPI 앵커 도메인 중에서 GPI 앵커 부착 인식 시그널 서열은 세포막 위의 GPI 앵커를 인식하는 부분이다. C 말단의 GPI 앵커 부착 인식 시그널 서열을 절단한 다음, GPI 앵커와 새롭게 돌출한 C 말단이 결합된다. 이어서, 결합된 GPI 앵커의 근원부가 PI-PLC에 의해 절단되며 따라서 단백질은 세포막을 이탈하여 세포벽에 편입된다. 여기서는 세포벽 앵커 도메인에 존재하는 당쇄가 세포벽 중의 당쇄와 결합하며 단백질은 세포 표층에 고정된다.

본 발명의 세포 표층 결합 단백질에는 (1)당쇄 결합 단백질 도메인의 N 말단부에 추가의 단백질이 결합되어 있는 융합 단백질, (2)당쇄 결합 단백질 도메인의 C 말단부에 추가의 단백질이 결합되어 있는 융합 단백질 및 (3)당쇄 결합 단백질 도메인의 N 말단부 및 C 말단부의 양쪽에 동일하거나 상이한 단백질이 결합되어 있는 융합 단백질이 포함된다. 추가의 단백질은 당쇄 결합 단백질 도메인에 직접 결합될 수 있으며 링커를 통해 결합될 수 있다. 또한, N 최말단부에 분비 시그널 서열이 결합되어 있다.

본 발명의 세포 표층 결합 단백질을 구성하는 추가의 단백질은 특별히 한정되지 않지만 본래 세포 표층에 편재되지 않은 단백질이며 세포 표층에 고정하는 것을 목적으로 하여 배치되는 단백질이 바람직하다. 예를 들면, 분비성 단백질, 항체 등을 들 수 있다. 분비성 단백질로서는 리파제, 아밀라제류(글루코아밀라제, α-아밀라제 등), 셀룰라제류, 형광 단백질, 단백질 A 및 이의 유도체 등을 들 수 있다.

이러한 효소는 그 특성에 따라서 N 말단부에 융합시키거나 C 말단부에 융합시킬것인가를 결정하면 양호하다. 특히, 리파제와 같이 C 말단부에 활성 부위를 갖는 단백질은 당쇄 결합 단백질 도메인의 C 말단부에 결합되어 있는 것이 바람직하다. 이러한 단백질은 당쇄 결합 단백질 도메인에 계속해서 C 말단부에 결합될 수 있으며 또한, 예를 들면, GPI 앵커 도메인의 일부를 통해 결합될 수 있다.

N 말단부에 융합시키는 경우, 단백질은 분비 시그널 서열과 당쇄 결합 단백질 도메인 사이에 융합되는 것이 바람직하다. 또한, 예를 들면, 당쇄 결합 단백질 도메인의 C 말단부에 다시 GPI 앵커 도메인의 일부를 함유할 수 있다. 그러나, 이 경우, GPI 앵커 부착 인식 시그널은 포함되지 않으며 따라서 발현된 융합 단백질은 GPI 앵커를 통해 세포 표층에 고정되는 것은 아니다.

분비 시그널 서열은 일반적으로 세포외[세포막주변공간(periplasm)도 포함한다]로 분비되는 단백질(분비성 단백질)의 N 말단에 결합되어 있는 소수성이 풍부한 아미노산을 많이 함유하는 아미노산 서열이며 통상적으로 분비성 단백질이 세포내에서 세포막을 통과하여 세포외로 분비될 때에 제거된다.

본 발명에서는 발현된 융합 단백질을 세포막으로 도입할 수 있는 분비 시그널 서열이면 어떠한 분비 시그널 서열이라도 사용할 수 있으며 기원은 묻지 않는다. 예를 들면, 분비 시그널 서열로서는 글루코아밀라제의 분비 시그널 서열, 효모의 α- 또는 a-응집소의 시그널 서열, 리파제의 분비 시그널 서열 등이 적절하게 사용된다. 세포 표층 결합 단백질에 융합하고 있는 추가의 단백질의 활성에 영향을 미치지 않은 것이면 분비 시그널 서열 및 프로 서열의 일부 또는 전부가 N 말단에 잔류될 수 있다.

본 명세서에서 리파제란 유지로부터 지방산을 유리시킬 수 있는 활성을 갖는 단백질(효소)를 말한다. 여기서, 유지란 글리세롤에 지방산이 결합된 것을 말한다. 이러한 활성을 갖고 있으면 리파제의 기원은 특별히 한정되지 않으며 일반적으로 미생물, 식물 및 동물(예: 돼지 췌장) 유래의 리파제가 사용된다. 또한, 리파제는 1,3-특이적일 수 있으며 비특이적이라도 양호하다. 예를 들면, 리파제를 응집성 효모의 세포 표층에 발현시킴으로써 폐유 등으로부터 바이오디젤 연료를 제조할 수 있다.

본 명세서에서 아밀라제류란 전분을 가수분해하는 효소를 말한다. 대표적으로는 글루코아밀라제 및 α-아밀라제를 들 수 있으며 추가로 이외에 β-아밀라제, 이소아밀라제 등을 들 수 있다.

본 명세서에서 글루코아밀라제란 전분의 비환원 말단에서 글루코스 단위를 절단 이탈시킨 엑소형의 가수분해 효소를 말한다. 이러한 활성을 갖고 있으면 이의 기원은 한정되지 않지만 리조푸스(Rhizopus) 및 아스퍼질러스(Aspergillus) 등의 곰팡이 유래의 글루코아밀라제가 사용된다. 예를 들면, 우에다 등[Appl. Environ. Microbiol. 63: 1362-1366(1997)]의 문헌에 기재된 바와 같이 리조푸스 오리재(Rhizopus oryzae) 유래의 글루코아밀라제가 적절하게 사용된다. 예를 들면, 글루코아밀라제를 효모 표층에 발현시킴으로써 전분 존재하에 효율적으로 에탄올을 제조할 수 있다.

본 발명에서 α-아밀라제는 전분의 α1,4-글루코시드 결합만을 가수분해하는 엔도형의 효소를 말한다. 이러한 활성을 갖고 있으면 이의 기원은 한정되지 않으며 예를 들면, 동물(타액, 췌장 등), 식물(맥아 등) 및 미생물 유래의 α-아밀라제가 사용된다. 예를 들면, α-아밀라제를 효모 표층에 발현시킴으로써 전분 존재하에 효율적으로 에탄올을 제조할 수 있다. 글루코아밀라제와 조합하여 발현시키면 알콜 발효가 효율적으로 진행된다.

셀룰라제류란 일반적으로는 엔도β1,4-글루카나제를 말하지만 본 발명에서는 엔도β1,4-글루카나제와 함께 생산되는 β1,4-글루코시드 결합을 절단하며 셀룰로스로부터 글루코스를 생산하는 1군의 효소(예: 셀로비오하이드롤라제, β-글루코시다제)를 호칭하여 셀룰라제라고 한다. 셀룰라제류로서는 예를 들면, 엔도β1,4-글루카나제, 셀로비오하이드롤라제, β-글루코시다제, 카복시메틸셀루라제 등을 들 수 있다. 이러한 활성을 갖고 있으면 이의 기원은 한정되지 않으며 예를 들면, 미생물 유래의 것이 적절하게 사용된다.

셀룰라제류를 단독 또는 조합하여 효모 표층에서 발현시킴으로써 목질 재료, 예를 들면, 종이, 펄프 또는 이들의 폐재로부터 알콜 발효가 효율적으로 실시된다.

본 발명에서 세포 표층에 단백질을 발현시키는 세포는 세균, 진균, 식물 세포 등의 세포벽을 갖는 세포이면 특별히 한정되지 않는다. 적절하게는 효모가 사용된다.

본 발명에 사용되는 세포는 목적하는 단백질을 세포 표층에 제시하도록 DNA를 도입하여 형질전환된 세포이다. 도입되는 DNA는 적어도 분비 시그널 서열, 당쇄 결합 단백질 도메인 및 목적하는 단백질을 암호화하는 서열을 포함한다. 또한, 목적하는 또 하나의 단백질을 암호화하는 서열을 포함할 수 있다.

상기한 각종 서열을 함유하는 DNA의 합성 및 결합은 당 업자가 통상적으로 사용할 수 있는 기술로 실시할 수 있다.

상기 DNA는 플라스미드의 형태인 것이 바람직하다. DNA 취득의 간이화의 점에서는 대장균과의 셔틀 벡터인 것이 바람직하다. 이러한 DNA의 출발 재료는 예를 들면, 효모의 2μm 플라스미드의 복제 오리진(0ri)과 ColE1의 복제 오리진을 가지며 또한, 효모 선택 마커(예: 약제 내성 유전자, TRP, LEU2 등) 및 대장균의 선택 마커(약제 내성 유전자 등)을 갖는 것이 보다 바람직하다. 또한, 단백질의 구조 유전자를 발현시키기 위해 이러한 유전자의 발현을 조절하는 오퍼레이터, 프로모터, 터미네이터, 인핸서 등의 소위 조절서열을 포함하는 것이 바람직하다. 예를 들면, GAPDH(글리세르알데하이드 3'-포스페이트 데하이드로게나제) 프로모터 및 GAPDH 터미네이터를 들 수 있다. 이러한 출발 재료의 플라스미드의 예로서는 GAPDH(글리세르알데하이드 3'-포스페이트 데하이드로게나제) 프로모터 및 GAPDH 터미네이터 서열을 포함하는 플라스미드 pYGA2270 또는 pYE22m 또는 UPR-ICL(이소시트레이트 리아제 상류영역) 서열과 Term-ICL(이소시트레이트 리아제의 터미네이터 영역) 서열을 포함하는 플라스미드 pWI3 등을 들 수 있다.

적절하게는 플라스미드 pYGA2270 또는 pYE22m의 GAPDH 프로모터 서열과GAPDH 터미네이터 서열 사이 또는 플라스미드 pWI3의 UPR-ICL의 서열과 Term-ICL의 서열 사이에 원하는 단백질을 암호화하는 DNA를 삽입하면 효모에 도입하기 위해 사용되는 플라스미드가 제조된다. 본 발명에서는 적절하게는 다중복제형의 플라스미드 pWIFS 또는 pWIFL이 사용되며 예를 들면, pWIFSpmROL 또는 pWIFLpmROL이 제조된다.

숙주의 효모로서는 어떠한 효모를 사용해도 양호하지만 응집성의 효모가 반응후의 분리가 간단한 점에서, 또는 간단하게 고정할 수 있으므로 연속반응을 실시할 수 있는 점에서 바람직하다. 또는 당쇄 결합 단백질 도메인으로서 응집기능 도메인을 사용하는 경우에는 어떠한 효모에도 강한 응집성을 부여할 수 있다.

응집성의 효모로서는 사카로마이세스 디아스타티쿠스(Saccharomyces diastaticus) ATCC 60715, ATCC 60712, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) IFO 1953, CG 1945, HF 7C 등을 들 수 있다.

또한, 새로운 응집성 효모를 구축할 수 있다. 예를 들면, 하기 실시예 1에 기재된 바와 같이 로스 엠.디.(M.D. Rose)등(Methods in Yeast Genetics, 1990, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)의 방법에 따라 응집성 효모 ATCC 60712와 비응집성 효모 W303-1B의 접합에 의한 2배체로부터 응집성 효모 YF207 및 이와 동등한 성질을 갖는 효모를 수득할 수 있다. 본 발명자 등이 취득한 응집성 효모 YF207주는 플라스미드의 안정성이 우수하며 또한 발효능이 대단히 높다. 따라서, 원하는 단백질, 예를 들면, α-아밀라제 및 글루코아밀라제를 단독 또는 양쪽을 세포 표층에 발현하도록 재조합된 응집성 효모 YF207주를 사용하는 경우에는 전분으로부터의 알콜 발효의 효율은 대단히 높아진다.

본 발명 방법에서 사용되는 세포는 DNA를 세포에 도입함으로써 수득된다. DNA의 도입이란 세포 속에 DNA를 도입하여 발현시키는 것을 의미한다. DNA의 도입방법에는 형질전환, 형질도입, 형질감염, 동시 형질감염, 전기천공등의 방법이 있으며 구체적으로는 아세트산리튬을 사용하는 방법, 부분 원형질체(protoplast)법 등이 있다.

도입되는 DNA는 상기한 바와 같은 플라스미드의 형태일 수 있으며 또는 숙주의 유전자에 삽입되거나 숙주의 유전자와 상동 재조합을 일으켜서 염색체에 통합할 수 있다.

DNA가 도입된 세포는 선택 마커(예: TRP)로 선택되며 발현된 단백질의 활성을 측정함으로써 선택된다. 단백질이 세포 표층에 고정되어 있는 것은 항 단백질 항체와 FITC 표지 항 IgG 항체를 사용하는 면역항체법에 의해 확인할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 세포는 담체에 고정화될 수 있다. 예를 들면, 효모의 경우, 고정되어 있으면 반복 회분(回分)발효 또는 연속발효에서의 사용에 편리하다.

본 명세서에서 담체란 세포를 고정화할 수 있는 물질을 의미하며 바람직하게는 물 또는 어떤 특정한 용매에 대하여 불용성의 물질이다. 본 발명에 사용할 수 있는 담체의 재질로서는 예를 들면, 폴리비닐알콜, 폴리우레탄 발포체, 폴리스티렌 발포체, 폴리아크릴아미드, 폴리비닐포르말 수지 다공질체, 실리콘 발포체, 셀룰로스 다공질체 등의 발포체 또는 수지가 바람직하다. 증식 및 활성이 저하된 세포또는 사멸한 세포의 탈착 등을 고려하면 다공질 담체가 바람직하다. 다공질체의 개구부의 크기는 세포에 따라서 상이하지만 세포가 충분하게 들어갈 수 있어서 증식할 수 있는 크기가 적당하다. 50μm 내지 1,000μm가 적절하지만 이것으로 한정되지 않는다.

또한, 담체의 형상은 상관없다. 담체의 강도, 배양 효율 등을 고려하면 구상 또는 입방체상이며 크기는 구상의 경우, 지름이 2mm 내지 50mm, 입방체상의 경우, 2mm 내지 50mm 각이 바람직하다.

본 명세서에서 세포의 고정화란 세포가 유리된 상태가 아닌 상태를 의미하며 예를 들면, 세포가 담체에 결합되거나 부착 또는 담체 내부에 포집된 상태 등을 말한다. 세포의 고정화에는 예를 들면, 담체결합법, 가교법, 포괄법 등의 당업자가 통상적으로 사용하는 방법을 적용할 수 있다. 이중에서도 응집성의 효모의 고정화에는 담체결합법이 최적이다. 담체결합법에는 이온교환성의 수지에 흡착시키는 화학적 흡착법 또는 물리적 흡착법이 포함된다.

예를 들면, 본 발명에서 사용할 수 있는 응집성 효모는 담체에 고정화되어 있음에도 불구하고 증식할 수 있으며 그리고 활성이 저하되면 자연적으로 탈착되는 성질을 갖고 있다. 따라서, 담체에 결합된 효모는 생균수가 거의 일정하게 유지되며 활성이 높다는 특징이 있다. 이러한 특징을 고려하면 담체에서의 결합은 물리적 흡착이 가장 바람직하다. 물리적 흡착에는 특별한 수단은 필요없다. 응집성 또는 접착성의 세포와 다공질의 담체를 단순히 혼합하여 배양함으로써 세포가 다공질체의 개구부에 들어가서 담체에 부착된다.

본 명세서에서 응집성이란 액체중에 부유 또는 분산되어 존재하는 효모 등의 세포가 집합하여 덩어리(집합체)를 만드는 성질을 의미하며 접착성이란 세포끼리 접착 또는 결합하여 집합체를 형성하는 성질을 의미한다.

본 명세서에서 활성이 저하된다라고 하는 것은 세포 자체는 사멸하지 않지만 세포 전체의 활성이 약해진 상태 또는 예를 들면, 응집에 관한 활성이 저하되거나 응집에 관한 효소를 암호화하는 DNA 수준에서 활성이 약해진 상태로 되어 응집할 수 없는 상태를 말한다.

또한, 본 발명에서 응집성 또는 접착성의 효모는 응집 또는 접착에 관한 유전자의 도입에 의해 응집성 또는 접착성이 부여된 효모일 수 있다.

응집 또는 접착에 관한 유전자란 응집 또는 접착에 관여하는 물질, 예를 들면, 효모에서의 키틴, 렉틴 등을 암호화하는 구조 유전자를 들 수 있으며 응집성에 관한 유전자로서는 FL01[J. Watari 등, Agric. biol. Chem., 55: 1547(1991), G.G. Stewart 등, Can. J. Microbiol., 23: 441(1977), I. Russell 등, J. Inst. Brew., 86: 120(1980), C.W. Lewis 등, J. Inst. Brew., 82: 158(1976)], FLO5[I. Russell 등, J. Inst. Brew., 85: 95(1979)], FLO8[I. Yamashita 등, Agric. biol. Chem., 48: 131(1984)] 등의 유전자를 들 수 있다.

이들의 응집 또는 접착에 관한 유전자는 상기한 출발 재료의 플라스미드에 삽입되어 원하는 단백질을 세포 표층에 제공하도록 설계된 DNA와 함께 세포에 도입된다.

이와 같이 수득되는 고정화된 세포는 담체에 부착된 상태로 부유 상태에서배양되거나 칼럼 등에 충전되어 소위 생반응기로서 사용할 수 있다. 연속적으로 또는 회분(배치)식으로 반복 배양 및 반응시킨 경우에도 활성이 저하되거나 사멸된 세포는 탈착하므로 세포로서의 활성이 저하되는 것은 아니며 효과적으로 이용할 수 있다.

상기와 같이 수득된 본 발명의 세포는 세포 표층에 발현된 단백질을 기질과 접촉시켜 이러한 기질과 결합하거나 이러한 기질을 다른 물질로 변환시킬 목적으로 사용할 수 있다. 예를 들면, 단백질이 효소인 경우, 효소를 발현하는 세포를 함유하는 효소 함유 제제로서 제공될 수 있다. 구체적으로는 본 발명의 효소 함유 제제로서는 본 발명의 세포 및 세포를 유지할 수 있는 배지를 포함하는 현탁액 및 본 발명의 세포가 동결보존 또는 동결건조, 또한 저온건조된 것을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 세포는, 무작위로 변이된 각종 단백질이 각각 별도의 세포의 표층에 제공되도록 하여 조합체 라이브러리로서 사용할 수 있다. 이러한 라이브러리에서 목적에 따른 최적인 성질을 갖는 클론을 신속하면서 또한 간편하게 선택할 수 있다. 여기서 말하는 조합체 라이브러리란 유전자를 무작위로 변이시켜 단백질의 다양성을 인위적으로 확대한 각종 변이체의 집합을 말한다.

이하, 실시예를 들어 본 발명을 설명하지만 본 발명은 이러한 실시예에 의해 한정되는 것이 아니다.

(실시예 1: FLO1의 5'영역 및 프로리파제의 구조 유전자를 이 순서로 갖는 DNA의 작제)

A: FLO1의 5'영역(시그널 서열 및 응집기능 도메인)의 유전자의 취득

다음과 같이 하여 FL01의 유전자를 취득한다. 우선, 에스. 세레비지애 ATCC 60715로부터 염색체 DNA를 추출한다. 이어서 이것을 주형으로 하며 프라이머로서 서열 1 및 서열 2에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 사용하여 PCR 증폭하며 BamHI 및 BglII로 절단하여 약 3300bp 길이의 BamHI-BglII 단편(BamHI-BglII FL01 3300bp 단편)을 수득한다. 이러한 3300bp 단편은 FLO1의 5' 부위의 서열(분비 시그널 서열 및 FLO1 응집기능 도메인)을 갖는다고 생각된다.

B: 리파제 유전자의 취득

다음과 같이 하여 리조푸스 오리재의 리파제 유전자를 취득한다. 간단하게 말하면 우선, 알. 오리재 IFO 4697로부터 염색체 DNA를 추출한다. 이어서, 이것을 주형으로 하며 프라이머로서 서열 3 및 서열 4에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 사용하여 PCR 증폭을 실시하며 BamHI 및 SalI로 절단하여 약 1100bp 길이의 BamHI-SalI 단편(BamHI-SalI 리파제 단편)을 수득한다. 이러한 리파제 단편은 리파제의 프로 서열 및 성숙 단백질 서열을 갖고 있으며 비어(Beer) 등의 보고(Biochim Biophys Acta, 1399: 173-180, 1998)에 기재된 서열과 거의 일치한다.

C: FLO1의 5'영역 및 프로리파제의 구조 유전자를 이 순서로 갖는 플라스미드의 작제

목적하는 DNA를 갖는 플라스미드는 상기 A에서 수득한 FLO1의 5'영역 유전자와 상기 B에서 수득한 프로리파제 유전자를 접속함으로써 수득된다. FLO1 유도체와 리파제의 융합 단백질을 작제하기 위해 하기의 조작을 실시한다. 작제의 모식도를 도 1에 도시한다.

우선, 다중복제형 플라스미드 pWI3을 BglII로 절단하여 탈인산화한 다음, 상기 A에서 수득한 BamHI-BglII FL01 3300bp 단편을 삽입하여 플라스미드 pWIFS를 수득한다. 이어서, 이러한 플라스미드 pWIFS를 BglII 및 XhoI로 절단하며 상기 B에서 수득한 BamHI-SalI 리파제 단편을 삽입하여 pWIFSpmROL을 수득한다. 이러한 플라스미드 pWIFSpmROL에 삽입된 유전자로부터 발현되는 단백질을 단형 FL01 리파제라고 명명한다.

(실시예 2: 세포벽 앵커 도메인을 포함하는 FLO1의 5'영역 및 프로리파제의 구조 유전자를 이 순서로 갖는 DNA의 작제)

실시예 1과 동일하게 하여 FL01의 염색체 DNA를 추출한다. 이것을 주형으로 하며 프라이머로서 서열 1 및 서열 5에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 사용하여 PCR 증폭하며 BamHI 및 BglII로 절단하여 약 4500bp 길이의 BamHI-BglII 단편(BamHI-BglII FLO1 4500bp 단편)을 수득한다. 이러한 4500bp 단편은 FLO1의 5'부위의 서열(분비 시그널 서열 및 FLO1 응집기능 도메인)을 갖는다고 생각된다.

수득된 BamHI-BglII FLO1 450Obp 단편을 사용하여 실시예 1과 동일한 조작을 실시한다. 즉, 실시예 1의 BamHI-BglII FL01 3300bp 단편 대신에 이러한 4500bp 단편을 pWI3에 삽입하여 플라스미드 pWIFL을 수득한다. 이어서, 이러한 플라스미드 pWIFL에 실시예 1과 동일하게 BamHI-SalI 리파제 단편을 삽입하여 pWIFLpmROL을 수득한다. 이러한 플라스미드 pWIFLpmROL에 삽입된 유전자로부터 발현되는 단백질을 장형 FL01 리파제라고 명명한다.

(실시예 3: 세포 표층에 리파제를 갖는 효모의 작제)

응집성 효모인 사카로마이세스 디아스타티쿠스 ATCC 60712(MATa leu2-3, 112 his2 lys2 stal FLO8) 및 비응집성 효모인 W303-1B(MATα ura3-52 trpl△2 leu2-3, 112 his3-11 ade2-1 can1-100)를 사용하고 M.D. Rose 등(상기 기재) 방법에 따라 트립토판 영양 요구성의 신규한 응집성의 균주 사카로마이세스 세레비지애 YF2O7(MATa ura3-52 trpl△2 his ade2-1 can1-100 sta1 FLO8)을 수득한다.

실시예 1에서 수득한 플라스미드 pWIFSpmR0L 및 실시예 2에서 수득한 플라스미드 pWIFLpmROL을 효모 마커(Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA)를 사용하는 아세트산리튬법에 의해 비응집성 효모 에스. 세레비지애 MT8-1(MATa ade his3 leu2 trpl ura3)(Tajima 등, Yeast, 1: 67-77, 1985) 및 응집성 효모 YF207에 도입한다. 이들을 L-트립토판을 함유하지 않는 적절한 아미노산 및 염기를 보충한 SD-W 한천 선택배지(6.7% 효모 질소 염기 w/o 아미노산(Difco Laboratories제), 2% 글루코스, 2% 한천 분말)을 사용하여 배양한다. 생육된 효모를 선택하여 단형 FLO1 리파제를 발현하는 효모를 각각 MT8-1-단형 및 YF207-단형이라고 명명하며 또한 장형 FLO1 리파제를 발현하는 효모를 각각 MT8-1-장형 및 YF207-장형이라고 명명한다.

수득된 효모를 SDC 액체 배지에서 배양하며 원심분리하여 배지와 균체를 분리하여 각각의 리파제 활성을 측정한다. 대조군으로서는 플라스미드 pWI3을 각각 에스. 세레비지애 MT8-1에 도입한 효모를 사용한다. 그 결과, 대조군으로서는 배지 및 균체에 리파제 활성이 확인되지 않는다. 또한, 형질전환체 MT8-1-단형, YF207-단형, MT8-1-장형 및 YF207-장형의 배양 상등액 중에는 거의 리파제 활성은보이지 않지만 이들의 효모 균체 자체는 모두 리파제 활성을 갖고 있다(도 2). 또한, 리파제 활성의 측정은 리파제 키트S(다이니혼세이야쿠제)를 사용하여 실시한다.

(실시예 4: 세포 표층에 리파제를 갖는 효모의 기능 확인)

실시예 3에서 수득한 단형 FLO1 리파제를 발현하는 효모 MT8-1-단형 및 YF207-단형 및 장형 FLO1 리파제를 발현하는 효모 MT8-1-장형 및 YF207-장형의 각각에 대해 균체 증식을 파장 600nm의 흡광도에서 측정한다. 어느 효모도 배지중에서 대조군과 동일한 정도로 순조롭게 증식하는 것을 알았다(데이터는 기재되지 않음).

이어서, 단형 FLO1 리파제를 발현하는 효모 MT8-1-단형 및 장형 FLO1 리파제를 발현하는 효모 MT8-1-장형의 메탄올 용해 활성을 측정한다. 30ml 바이알 중에서 배지 100ml로부터 집균한 각 효모에 반응액(0.1M 인산 완충액(pH 7.O) 2ml, 대두유 9.65g, 메틸알콜 0.35g)을 가하여 35℃에서 매분 150회 진탕하고 메틸에스테르의 생성량을 카이에다(Kaieda) 등의 방법(J. Biosci. Bioeng., 88: 627-631, 1999)에 의해 측정한다. 그 결과를 도 3에 도시한다.

어느 효모도 종래의 효모[α-응집소의 N 말단부에 리파제를 결합시켜 세포 표층에 발현시킨 효모(일본 공개특허공보 제(평)11-290078호)]와 비교하여 보다 많은 메틸에스테르를 생산하고 있다. 특히, 도 3에 도시된 바와 같이 단형 FLO1 리파제를 발현하는 균주 MT8-1-단형(○) 및 장형 FLO1 리파제를 발현하는 효모 MT8-1-장형(△)에서 메틸에스테르의 생산 활성은 대단히 높다.

또한, 이들 균주에 관해서 이의 응집능을 스미트(Smit) 등의 방법[Smit 등, Appl. Environ. Microbiol., 58: 3709-3714(1992)]에 따라서 측정한다. 그 결과, 응집성의 균주에 관해서는 플라스미드를 도입하기 전과 비교하여 장형 FLO1 리파제를 발현하는 균주가 형질전환 전과 동일하게 강한 응집능을 나타낸다. 그러나, 단형 FL01 리파제를 발현하는 균주에서는 응집능이 약해지고 있다. 이것은 단형 FLO1 리파제에는 세포벽 앵커 도메인이 없으며 그 대신에 응집 도메인이 세포벽에 매몰되어 있으므로 응집기능을 충분하게 발휘할 수 없다고 생각된다.

(실시예 5: 무작위 변이 리파제의 조합체 라이브러리의 구축 및 이의 이용)

실시예 1의 B에서 수득한 리조푸스 오리재의 리파제의 프로 서열 및 성숙 단백질 서열[366개 아미노산의 프로리파제(ProR0L)]를 암호화하는 1098bp의 유전자에 대해 약 3염기의 변이(ProROL 1분자당 1아미노산의 변이 도입)가 포함되도록 오류- 편향 PCR법에 의해 무작위로 변이시켜 각종 변이된 리파제 유전자를 수득한다. 실시예 1의 C의 경우와 동일하게 수득된 변이된 리파제 유전자를 각각 FLO1의 5'영역을 갖는 플라스미드 pWIFS에 삽입하여 pWIFSProROL 라이브러리를 수득한다. 이들 플라스미드를 각각, 실시예 3과 동일하게 효모 YF207주에 도입하며 각종 변이를 갖는 리파제가 세포 표층에 제공된 713개 주로 이루어진 효모의 조합체 라이브러리를 작제한다.

수득된 효모 조합체 라이브러리로부터 아래와 같이 에스테르 교환 활성을 갖는 클론을 선택한다. 713개 주의 라이브러리를 SD 플레이트(0.67% 효모 질소 염기 w/o 아미노산, 0.5% 글루코스 및 2% 한천 분말) 위에서 3일 동안 배양한다. 이어서, 이러한 플레이트에 오토클레이브 후에 45℃로 유지된 형광색소를 함유하는 연(軟) 한천 SD 배지(SD 배지+2.5% 대두유, 0.001% 로다민B, 50% 메탄올 및 0.8% 한천 분말)을 중층한다. 1일 후에 플레이트에 자외선을 조사하여 균체의 주위에 오렌지색의 형광을 발하는 클론을 선택함으로써 메탄올 용해의 기질인 메탄올의 존재하에 생존하는 클론(80 클론)을 수득한다.

이들 클론의 리파제 활성에 관해서 실시예 4의 기재와 동일하게 메탄올 용해에 의한 에스테르 교환 활성의 초기속도 및 리파제 키트S(다이니혼세이야쿠제)에 의한 가수분해 활성을 측정한다. 이들 중에서 변이가 도입되지 않은 리파제를 발현하고 있는 주(야생형 주)와 비교하여 에스테르 교환 활성 및 가수분해 활성으로 변화가 보이는 주에 관한 결과를 표 1에 기재한다.

리파제 활성
돌연변이체	에스테르 교환반응(g/l/분)	가수분해반응(IU/ml)	에스테르 교환반응/가수분해
야생형	2.38	0.23	10.35
S334T	2.51	0.22	11.41
P2S/F293Y	2.04	0.34	6.00
K36E	1.85	0.17	10.88
K326R	2.24	0.12	18.67
V56A/W224R	2.01	0.20	10.05
Q225H/Q294L	0.94	0.14	6.71
S10P	1.53	0.17	9.00
N62D	1.63	0.20	8.15

야생형 주에 대해 S334T주에서는 약간 높은 에스테르 교환 활성이 보인다. 또한, 가수분해활성에 대한 에스테르 교환 활성의 상대치로부터 P2S/F293Y주가 특이적으로 가수분해 반응, 그리고 K326R주가 에스테르 교환반응에 각각 높은 촉매능을 나타내는 것을 알았다. 이들 결과로부터 효모세포 표층에 조합체 라이브러리를 작제하며 목적에 적합한 변이체를 스크리닝할 수 있음을 알았다.

발명의 개시

이와 같이 발현시킨 단백질은 N 말단부에 활성 부위가 있는 것이면 세포 표층에서 충분한 활성을 나타낼 수 있다. 그러나, C 말단부에 활성 부위가 있는 경우, 활성 부위가 세포 표층에 너무 근접되어 입체장애가 일어나서 충분한 활성을 나타낼 수 없는 경우도 있다.

그래서 단백질을 세포 표층에 발현하는 방법을 여러가지로 검토한 바, 전혀 예상외로 종래, 필수적이라고 생각되고 있는 GPI 앵커 도메인의 기능을 상실시키는 경우조차도 GPI 앵커 단백질이 세포 표층에 유지되는 것을 밝혀내고 본 발명을 완성시켰다. 즉, 적어도 GPI 앵커 단백질의 응집기능 도메인만 포함되어 있으면 이의 N 말단부 또는 C 말단부의 어느 한쪽 또는 N 말단부 및 C 말단부의 양쪽에 원하는 단백질을 발현시키도록 하는 플라스미드를 구축함으로써 원하는 단백질을 세포 표층에 발현시킬 수 있게 된다.

본 발명은 당쇄 결합 단백질 도메인을 가지며 당해 당쇄 결합 단백질 도메인의 적어도 N 말단부 또는 C 말단부에 추가의 단백질이 결합되어 있는 세포 표층 결합 단백질을 제공한다.

바람직한 실시 양태에서는 당쇄 결합 단백질 도메인은 적어도 GPI 앵커 단백질의 응집기능 도메인을 포함하는 부분이다.

바람직한 실시 양태에서는 상기 GPI 앵커 단백질은 응집 단백질이다.

바람직한 실시 양태에서는 응집 단백질은 FLO1, FLO2, FLO4, FLO5, FLO9, FLO10 및 FLO11로 이루어진 그룹에서 선택되는 단백질이다.

기타 바람직한 실시 양태에서, 추가의 단백질은 당쇄 결합 단백질 도메인의 N 말단부에 결합되어 있다.

보다 바람직한 실시 양태에서, 추가의 단백질은 당쇄 결합 단백질 도메인의C 말단부에 결합되어 있다.

더욱 바람직한 실시 양태에서, 추가의 단백질은 리파제이다.

바람직한 실시 양태에서 추가의 단백질은 항체이다.

바람직한 실시 양태에서는 당쇄 결합 단백질 도메인의 N 말단부 및 C 말단부에 동일하거나 상이한 추가의 단백질이 결합되어 있다.

본 발명은 또한, 상기한 세포 표층 결합 단백질을 암호화하는 DNA를 제공한다.

본 발명은 추가로 DNA를 포함하는 플라스미드를 제공한다.

본 발명은 또한, DNA 또는 플라스미드가 도입되며 추가의 단백질이 세포 표층에 발현되는 세포를 제공한다.

바람직한 실시 양태에서, 세포는 효모이다.

바람직한 실시 양태에서, 추가의 단백질은 효소이다.

본 발명은 또한, 추가의 단백질과 기질을 접촉시켜 이러한 기질과 결합하거나 또는 이러한 기질을 다른 물질로 변환시키는 세포의 사용방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 세포를 포함하는 효소 함유 제제를 제공한다.

본 발명의 세포 표층 결합 단백질은 원하는 단백질을 세포 표층에 발현할 수 있다. 이와 같이 원하는 단백질은 활성 부위의 위치에 따라서 이의 반대측을 당쇄 결합 단백질 도메인과 융합시킴으로써 충분한 활성을 나타낼 수 있도록 발현될 수 있다. 따라서, 특히 C 말단부에 활성을 갖는 단백질을 세포 표층에 발현시키는 경우에 대단히 유용하다. 또한, 당쇄 결합 단백질 도메인의 양쪽 말단에 동일하거나 상이한 단백질을 결합시켜 효율적으로 보다 많은 단백질을 발현시킬 수 있다. 이러한 세포 표층에서 효율적인 단백질 발현을 이용하여 세포 표층 위에 개변 단백질의 조합체 라이브러리를 작제함으로써 용이하게 스크리닝할 수 있다.

Claims

당쇄 결합 단백질 도메인을 가지며 당해 당쇄 결합 단백질 도메인의 적어도 N 말단부 또는 C 말단부에 추가의 단백질이 결합되어 있는 세포 표층 결합 단백질.
제1항에 있어서, 당쇄 결합 단백질 도메인이 적어도 GPI 앵커 단백질의 응집기능 도메인을 포함하는 부분인 세포 표층 결합 단백질.
제2항에 있어서, GPI 앵커 단백질이 응집 단백질인 세포 표층 결합 단백질.
제3항에 있어서, 응집 단백질이 FLO1, FLO2, FLO4, FLO5, FLO9, FLO10 및 FLO11로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 단백질인 세포 표층 결합 단백질.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 추가의 단백질이 당쇄 결합 단백질 도메인의 N 말단부에 결합되어 있는 세포 표층 결합 단백질.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 추가의 단백질이 당쇄 결합 단백질 도메인의 C 말단부에 결합되어 있는 세포 표층 결합 단백질.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 당쇄 결합 단백질 도메인의 N 말단부 및 C 말단부에 동일하거나 상이한 추가의 단백질이 결합되어 있는 세포 표층 결합 단백질.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 세포 표층 결합 단백질을 암호화하는 DNA.
제8항에 따른 DNA를 포함하는 플라스미드.
제8항에 따른 DNA 또는 제9항에 따른 플라스미드가 도입되어 추가의 단백질이 세포 표층에 발현되는 세포.
제10항에 있어서, 효모인 세포.
제10항 또는 제11항에 있어서, 추가의 단백질이 효소인 세포.
추가의 단백질과 기질을 접촉시켜 기질을 단백질에 결합시키거나 기질을 다른 물질로 변환시킴을 포함하는, 제10항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 따른 세포의 사용방법.
제12항에 따른 세포를 함유하는 효소 함유 제제.