BR112019019110A2 - células hospedeiras de levedura recombinantes que expressam proteínas heterólogas associadas a célula - Google Patents

células hospedeiras de levedura recombinantes que expressam proteínas heterólogas associadas a célula Download PDF

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Abstract

o presente relatório diz respeito a células hospedeiras de levedura recombinante que expressam proteínas heterólogas associadas a célula que são expressas durante a fase de propagação das células hospedeiras de levedura recombinante e a processos para a propagação das mesmas. a célula hospedeira de levedura recombinantes pode ser utilizada para se obter uma composição de levedura ou um produto de levedura enriquecido das proteínas heterólogas de célula hospedeira de levedura lisadas.

Description

CÉLULAS HOSPEDEIRAS DE LEVEDURA RECOMBINANTES QUE EXPRESSAM PROTEÍNAS HETERÓLOGAS ASSOCIADAS A CÉLULA
DECLARAÇÃO RELATIVA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS [oooi] A listagem de sequências associada com este pedido é provida no formato de texto em lugar de uma cópia em papel e é incorporada aqui como referência no relatório. O nome do arquivo em texto contendo a listagem de sequências é “PCT - Sequence listing as filed”. O arquivo em texto de 224 KB, foi criado em 13 de março de 2018 e está sendo apresentado eletronicamente.
CAMPO TECNOLÓGICO [0002] O presente relatório se refere a células hospedeiras de levedura recombinante que expressam polipeptídeos heterólogos associados a célula (incluindo enzimas heterólogas), composições as compreendendo, bem como processos as incluindo.
ANTECEDENTES [0003] A produção comercial de enzima utilizando bactérias e fungos requer fermentações longas, meios especializados e condições estéreis. Tendo em vista que adequados enzimas são excretadas, o grande volume de caldo líquido deve ser separado da biomassa e então concentrado e purificado para recuperar a enzima. Leveduras são geralmente mais robustas que bactérias e fungos e podem crescer mais rapidamente em meios menos dispendiosos em condições menos estéreis.
[0004] Leveduras são também utilizadas em vários processos industriais para a fabricação de composições de leveduras e produtos de levedura. E tais processos, é comum se suplementar as leveduras com proteínas exógenas purificadas (que podem ser heterólogas às leveduras) de maneira a se obter mais rapidamente ou mais eficientemente produtos contendo leveduras ou derivados de levedura. No entanto, os custos da adição de tais proteínas exógenas pode ser significativo e há um incentivo
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2/108 para a redução da utilização ou tornar obsoleto o uso de proteínas exógenas na produção de produtos de leveduras.
[0005] Desta forma, há uma necessidade em prover proteínas heterólogas que possam ser obtidas em uma quantidade suficiente para serem utilizadas em um processo comercial subsequente e a custos que permitiríam o uso de proteínas heterólogas em uma escala comercial.
BREVE SUMÁRIO [0006] O presente relatório diz respeito a células hospedeiras de levedura recombinante que expressam e permanecem associadas com proteínas heterólogas enquanto as células hospedeiras de levedura estão sendo propagadas, a processos para a propagação das mesmas, bem como para a fabricação de composições de leveduras e produtos de leveduras a partir das mesmas.
[0007] De acordo com um primeiro aspecto, o presente relatório diz respeito a um processo para a obtenção de uma proteína heteróloga associada a célula a partir de uma célula hospedeira de levedura recombinante. A célula hospedeira de levedura recombinante contém uma molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica a proteína heteróloga associada a célula e a molécula de ácido nucleico heteróloga sendo operacionalmente associada com um promotor heterólogo que permite a expressão da molécula de ácido nucleico heteróloga durante a propagação. O processo compreende a propagação da célula hospedeira de levedura recombinante em um meio colocado em um vaso de acordo com um método de produção da levedura de padeiro, de forma a permitir a expressão da proteína heteróloga associada a célula. Em uma realização, o método de produção da levedura de padeiro é um método contínuo ou um método de alimentação em batelada. Em ainda uma outra realização, a taxa de crescimento específica da célula hospedeira de levedura recombinante durante a propagação é de 0,25 h-1 ou menos. Em ainda uma realização adicional, o processo compreende adicionalmente o controle da taxa de
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3/108 aeração do vaso em pelo menos cerca de 0,5 ou cerca de 1,0 volume de ar/volume do vaso/minuto. Em ainda uma realização adicional, o meio compreende uma fonte de carboidrato, uma fonte de nitrogênio, uma fonte de fósforo e opcionalmente micronutrientes. Em uma realização, a fonte de carboidrato é derivada de melaços, milho, glicerol e/ou uma biomassa lignocelulósica. Em uma realização adicional, a fonte de nitrogênio é amônia. Em ainda uma realização adicional, a fonte de fósforo é ácido fosfórico. Em uma outra realização, o processo compreende o controle da adição da fonte de carboidrato ao meio de maneira a limitar a taxa de crescimento da célula hospedeira de levedura recombinante. Em ainda uma realização adicional, o processo compreende a manutenção da concentração da fonte de carboidrato a 0,1 ou 0,0001 porcento em peso ou menos em relação ao volume total do meio. Em ainda uma outra realização, o processo compreende adicionalmente a adição da fonte de nitrogênio e/ou da fonte de fósforo para combinar com a taxa de crescimento da célula hospedeira de levedura recombinante. Em ainda uma outra realização, o processo compreende adicionalmente o controle do pH do meio entre cerca de 4,0 e 5,0, por exemplo, a cerca de 4,5. Em ainda uma outra realização, o processo compreende adicionalmente o controle da temperatura do meio entre cerca de 20°C e cerca de 40°C, por exemplo, a entre cerca de 30°C e cerca de 35°C. Em uma realização, após a etapa de propagação, a concentração da célula hospedeira de levedura recombinante é de pelo menos 0,25 ou 1% em peso do volume total do meio. Em uma realização, a célula hospedeira de levedura recombinante é do gênero Saccharomyces sp. Em uma realização adicional, a célula hospedeira de levedura recombinante é da espécie Saccharomyces cerevisiae.
[0008] De acordo com um segundo aspecto, o presente relatório diz respeito a uma célula hospedeira de levedura recombinante para a produção de uma composição de levedura ou de um produto de levedura,
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4/108 a célula hospedeira de levedura recombinante contendo uma molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica uma proteína heteróloga associada a célula, onde a molécula de ácido nucleico heteróloga é operacionalmente associada com um promotor heterólogo que permite a expressão da molécula de ácido nucleico heteróloga durante a propagação. Em uma realização, a proteína heteróloga associada a célula representa pelo menos 0,1% (em percentagem em peso seco) das proteínas totais na composição de levedura ou no produto de levedura. Em uma realização, o polipeptídeo heterólogo associado a célula é uma enzima heteróloga, tal como, por exemplo, uma oxido redutase, uma transferase, uma hidrolase, uma liase, uma isomerase, uma fosfatase e/ou uma ligase. Em uma realização, a enzima heteróloga é uma glicosilase tal como, por exemplo, uma amilase heteróloga. Em realizações nas quais a proteína heteróloga associada a célula é a amilase, esta pode ser, sem limitações, uma alfaamilase maltogênica, uma glucoamilase, uma alfa-amilase ou uma amilase fúngica. Em uma realização, a amilase é a amilase maltogênica. Em uma realização a amilase é a glucoamilase. Em uma realização, a amilase é a alfa-amilase. Em uma realização, a amilase é uma amilase fúngica. Em ainda uma realização adicional, a oxidase é uma glicose oxidase. Em ainda uma outra realização, a enzima heteróloga é uma fosfatase, tal como, por exemplo, uma fitase. Em uma realização adicional, a enzima heteróloga é uma oxidase, tal como, por exemplo, uma glicose oxidase. Em uma outra realização, a molécula de ácido nucleico heteróloga permite a expressão intracelular da proteína heteróloga associada a célula. Em ainda uma outra realização, a molécula de ácido nucleico heteróloga permite a expressão de uma proteína heteróloga associada a membrana. Em uma realização adicional, a molécula de ácido nucleico heteróloga permite a expressão de uma proteína heteróloga imobilizada. Em ainda uma realização adicional, a proteína heteróloga imobilizada é uma proteína quimérica de fórmula (I):
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5/108 (NH2) HP-L-TT (COOH) (I) onde HP é o polipeptídeo heterólogo, L está presente ou ausente e é um ligante de aminoácido e TT é um radical de imobilização de aminoácido para a associação do polipeptídeo heterólogo a uma parede celular da célula hospedeira de levedura recombinante e “-“é uma ligação amido. Na proteína quimérica de fórmula (I), (NH2) indica o local do terminal amino da proteína quimérica enquanto (COOH) indica o terminal carboxil da proteína quimérica. Em uma outra realização, a proteína heteróloga imobilizada é uma proteína quimérica de fórmula (II):
(NH2) TT-L-HP (COOH) (II) onde HP é o polipeptídeo heterólogo, L está presente ou ausente e é um ligante de aminoácido, TT é um radical de imobilização de aminoácido para a associação do polipeptídeo heterólogo a uma parede celular da célula hospedeira de levedura recombinante e “-“é uma ligação amido. Na proteína quimérica de fórmula (II), (NH2) indica o local do terminal amino terminus da proteína quimérica enquanto (COOH) indica o terminal carboxil terminus da proteína quimérica. Em uma realização da proteína quimérica, L está presente e pode, por exemplo, compreender um ou mais motivos G4S (SEQ ID NO: 41) e/ou um ou mais EA2K motivos (SEQ ID NO: 100) ou EA3K (SEQ ID NO: 101). Em outras realizações da proteína quimérica, TT pode compreender um domínio de transmembrana, uma variante ou um fragmento deste. Por exemplo, TT pode ser de uma proteína FLO1. Por exemplo, 0 TT pode apresentar a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14, ser uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14 ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 14. Em realizações adicionais da proteína quimérica, 0 TT pode ser modificado por um mecanismo posterior à tradução de maneira a apresentar uma âncora de glicosilfosfatidilinositol (GPI). Por exemplo, 0 TT pode ser de uma proteína SED1, uma proteína TIR1, uma proteína CWP2, uma proteína CCW12, uma proteína SPI1, uma proteína PST1 ou uma combinação de
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6/108 uma proteína AGA1 e uma proteína AGA2. Em uma realização específica, o TT é da proteína SPI1 e pode apresentar, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 74, ser uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 74 ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 74. Em uma realização adicional, o TT pode ser um fragmento da proteína SPI e pode apresentar a sequência de aminoácidos das SEQ ID NO: 76, 78, 80 ou 82; ser uma variante da sequência de aminoácidos das SEQ ID NO: 76, 78, 80 ou 82 ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos das SEQ ID NO: 76, 78, 80 ou 82. Em uma outra realização específica, o TT pode ser da proteína CCW12 e pode, por exemplo, apresentar a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 84, ser uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 84 ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 84. Em ainda uma realização adicional, o TT pode ser um fragmento da proteína CCW12 e pode apresentar a sequência de aminoácidos das SEQ ID NO: 86, 88, 90 ou 92; ser uma variante da sequência de aminoácidos das SEQ ID NO: 86, 88, 90 ou 92 ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos das SEQ ID NO: 86, 88, 90 ou 92. Em uma outra realização, o TT é da combinação da proteína AGA1 e da proteína AGA2. Em ainda uma outra realização, a combinação da proteína AGA1 e da proteína AGA2 apresenta a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24, é um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24, apresenta a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26 ou é um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26. Em uma realização adicional, o promotor é um promotor nativo ou heterólogo tal como, por exemplo, compreende o promotor do gene tdh1, do gene hor7, do gene hsp150, do gene hxt7, do gene gpm1, do gene pgk1 e/ou do gene stl1. Em uma realização, o promotor heterólogo compreende o promotor do gene tdh1. Em ainda uma
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7/108 outra realização, o promotor heterólogo compreende o promotor do gene hor7. Em ainda uma outra realização, a molécula de ácido nucleico heteróloga é operacionalmente associada com um terminador. Em ainda uma realização adicional, o terminador é um terminador nativo ou heterólogo e pode compreender, por exemplo, o terminador do gene dit1, do gene idp1, do gene gpm1, do gene pma1, do gene tdh3, do gene hxt2 e/ou do gene ira2. Em uma realização específica, o terminador heterólogo pode ser do gene dit1. Em uma outra realização específica, o terminador heterólogo pode ser do gene adh3. Em ainda uma outra realização específica, o terminador heterólogo pode ser do gene idp1. Em ainda uma outra realização, a molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica o polipeptídeo heterólogo associado a membrana é associada com uma molécula de ácido nucleico adicional que codifica um peptídeo sinalizador heterólogo. Em uma realização, o peptídeo sinalizador heterólogo é derivado de uma proteína procariótica, tal como, por exemplo, uma proteína bacteriana. Em uma realização adicional, o peptídeo sinalizador heterólogo pode ser uma proteína invertase (apresentando a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 68, sendo uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 68 ou sendo um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 68), uma proteína AGA2 (apresentando a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 69, sendo uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 69 ou sendo um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 69) ou uma amilase fúngica (apresentando a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 107, sendo uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 107 ou sendo um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 107). Em uma realização, a célula hospedeira de levedura recombinante é do gênero Saccharomyces sp. Em uma realização adicional, a célula hospedeira de levedura recombinante é da espécie Saccharomyces cerevisiae.
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8/108 [0009] De acordo com um terceiro aspecto, o presente relatório provê um processo para a preparação de uma composição de levedura. Genericamente, o processo compreende a) a propagação da célula hospedeira de levedura recombinante apresentando uma proteína heteróloga associada a célula tal como definida aqui para se obter uma célula hospedeira de levedura recombinante propagada e b) a formulação da célula hospedeira de levedura propagada em uma composição de levedura. Em uma realização, a composição de levedura é um creme. Em ainda uma outra realização, a etapa a) é conduzida em um meio de cultura que pode, por exemplo, compreender melaços. Em uma realização, a proteína heteróloga associada a célula representa pelo menos 0,1% (em percentagem em peso seco) das proteínas totais na composição de levedura. Em ainda uma outra realização, a proteína heteróloga associada a célula é uma enzima heteróloga. O processo pode compreender a propagação da célula hospedeira de levedura recombinante in um meio colocado em um vaso de acordo com um método de produção da levedura de padeiro de maneira a permitir a expressão da proteína heteróloga associada a célula. Em uma realização, o método de produção da levedura de padeiro é um método contínuo ou um método de alimentação em batelada. Em ainda uma outra realização, a taxa de crescimento específica da célula hospedeira de levedura recombinante durante a propagação é de 0,25 It1 ou menos. Em ainda uma realização adicional, o processo compreende adicionalmente o controle da taxa de aeração do vaso para pelo menos cerca de 0,5 ou cerca de 1,0 volume de ar/volume do vaso/minuto. Em ainda uma realização adicional, o meio compreende uma fonte de carboidrato, uma fonte de nitrogênio, uma fonte de fósforo e opcionalmente micronutrientes. Em uma realização, a fonte de carboidrato é derivada de melaços, milho, glicerol e/ou uma biomassa lignocelulósica. Em uma realização adicional, a fonte de nitrogênio é amônia. Em ainda uma realização adicional, a fonte de fósforo é ácido fosfórico. Em uma
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9/108 outra realização, o processo compreende adicionalmente o controle da adição da fonte de carboidrato ao meio de maneira a limitar a taxa de crescimento da célula hospedeira de levedura recombinante. Em ainda uma realização adicional, o processo compreende a manutenção da concentração da fonte de carboidrato a 0,1 ou 0,0001 porcento em peso ou menos em relação ao volume total do meio. Em ainda uma outra realização, o processo compreende adicionalmente a adição da fonte de nitrogênio e/ou da fonte de fósforo para combinar com a taxa de crescimento da célula hospedeira de levedura recombinante. Em ainda uma outra realização, o processo compreende adicionalmente o controle do pH do meio entre cerca de 4,0 e 5,0, por exemplo, a cerca de 4,5. Em ainda uma outra realização, o processo compreende adicionalmente o controle da temperatura do meio entre cerca de 20°C e cerca de 40°C, por exemplo, a entre cerca de 30°C e cerca de 35°C. Em uma realização, após a etapa de propagação, a concentração da célula hospedeira de levedura recombinante é de pelo menos 0,25 ou 1% em peso do volume total do meio. Em uma realização, a célula hospedeira de levedura recombinante é do gênero Saccharomyces sp. Em uma realização adicional, a célula hospedeira de levedura recombinante é da espécie Saccharomyces cerevisiae.
[0010] De acordo com um quarto aspecto, o presente relatório provê uma composição de levedura compreendendo a célula hospedeira de levedura propagada obtenível ou obtida pelo processo descrito aqui. Em uma realização, a proteína heteróloga associada a célula representa pelo menos 0,1% (em percentagem em peso seco) das proteínas totais na composição de levedura. Em ainda uma outra realização, a proteína heteróloga associada a célula é uma enzima heteróloga.
[0011] De acordo com um quinto, o presente relatório provê um processo para a preparação de um produto de levedura. Genericamente, o processo compreende a) o provimento da célula hospedeira de levedura
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10/108 recombinante propagada obtenível pelo processo descrito aqui ou da composição de levedura compreendendo a célula hospedeira de levedura recombinante propagada descrita aqui; b) a lise da célula hospedeira de levedura propagada para se obter uma célula hospedeira de levedura recombinante lisada, c) opcionalmente, secagem da célula hospedeira de levedura recombinante lisada para se obter uma célula hospedeira de levedura recombinante seca e d) a formulação da célula hospedeira de levedura recombinante lisada ou da célula hospedeira de levedura recombinante seca no produto de levedura. Em uma realização, a etapa b) compreende a submissão da célula hospedeira de levedura recombinante propagada a autólise para se obter a célula hospedeira de levedura recombinante lisada. Em uma realização, a etapa c) é conduzida diretamente após a etapa b) para prover um autolisado como produto de levedura. Em uma outra realização, a célula hospedeira de levedura recombinante lisada compreende uma ração solúvel e uma fração insolúvel e o processo compreende adicionalmente, após a etapa b) e antes da etapa c), a separação (por exemplo, por filtração) da fração solúvel da fração insolúvel. Em ainda uma outra realização, o processo compreende a submissão da fração insolúvel à etapa d) para prover as paredes celulares de levedura como o produto de levedura. Em ainda uma realização adicional, o processo compreende a submissão da fração solúvel à etapa d) para prover um extrato de levedura como o produto de levedura. Em uma realização adicional, o processo compreende adicionalmente a remoção de componentes apresentando um peso molecular igual ou menor que cerca de 10 kDa da fração solúvel para prover um concentrado. Em ainda uma outra realização, o processo compreende a submissão do concentrado à etapa c) para prover um concentrado seco como o produto de levedura. Em uma realização, a proteína heteróloga associada a célula representa pelo menos 0,1% (em percentagem em peso seco) das proteínas totais no produto de levedura.
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Em ainda uma outra realização, o processo compreende adicionalmente a purificação substancial da proteína heteróloga a partir da célula hospedeira de levedura propagada para prover uma proteína heteróloga purificada como o produto de levedura.
[0012] De acordo com um sexto aspecto, o presente relatório provê um produto de levedura obtenível ou obtido pelo processo descrito aqui. Em uma realização, a proteína heteróloga associada a célula representa pelo menos 0,1% (em percentagem em peso seco) das proteínas totais no produto de levedura. Em ainda uma outra realização, o produto de levedura é provido como uma forma ativa, uma forma semiativa, uma forma inativa ou uma combinação destas.
[0013] De acordo com um sétimo aspecto, o presente relatório provê uma proteína heteróloga isolada obtenível ou obtida pelo processo descrito aqui. A proteína heteróloga isolada é produzida por uma célula hospedeira de levedura recombinante contendo uma molécula de ácido nucleico heteróloga e uma molécula de ácido nucleico adicional tal comoO definida aqui. Em adição, a molécula de ácido nucleico adicional codifica um peptideo sinalizador heterólogo (por exemplo, bacteriano).
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0014] Tendo desta forma descrito genericamente a natureza da invenção, será feita agora referência aos desenhos anexos, que mostram como ilustração, uma realização preferida da invenção, e nos quais:
[0015] A Figura 1 provê a atividade da enzima amilase maltogênica (MAA) medida em péletes de célula de levedura do tipo selvagem (M10474) ou células hospedeiras de levedura recombinante. Os resultados são mostrados como a atividade de amilase maltogênica (provida como MANU/mL) em função do tipo testado de levedura (da esquerda para a direita, M10474, T2986, T2987, T2988, T2989, T2990, T2991, T2944; as cepas estão descritas na Tabela 1).
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12/108 [0016] A Figura 2 provê a atividade da enzima glucoamilase medida em péletes (“ligado”, cinza claro) e sobrenadante (“livre”, cinza escuro) de células hospedeiras de levedura recombinante cultivadas expressando uma glucoamilase heteróloga na ausência (cepa M8498) e na presença (cepa M14244) de um imobilizador Sed1. Os resultados são mostrados como atividade de glucoamilase em função da cepa utilizada.
[0017] A Figura 3 provê a atividade da enzima alfa-amilase medida em péletes (“ligado”, cinza claro) e sobrenadante (“livre”, cinza escuro) de células hospedeiras de levedura recombinante cultivadas expressando uma alfa-amilase heteróloga na presença de um imobilizador Sed1 e um ligante (cepa M14253), na presença de um imobilizador Sed1, mas sem ligante (M14254) e na ausência de um imobilizador Sed1 (cepa M10074). Os resultados são mostrados como atividade de alfa-amilase em função da cepa utilizada.
[0018] A Figura 4 provê a atividade em amido de trigo de várias cepas que expressam uma amilase maltogênica. Os resultados são mostrados como atividade em amido de trigo como MANU por mL (medida a OD 600 nm) para a cultura total (barras à esquerda), sobrenadante (barras no meio) e pélete lavado (barras à direita) das cepas M10474, M13822, M13819, M13879 e T3892 (descritas na Tabela 1). Os dados para as cepas “M” são a média de culturas em duplicata. Os dados para T3892 incluem a atividade média de culturas com atividades cruzadas de oito isolados transformados e a atividade do isolado com maior desempenho (□ = melhor isolado, cultura total; Δ = melhor isolado, sobrenadante; o = melhor isolado, pélete celular lavado). Os gráficos abaixo indicam o fenótipo de localização previsto da enzima de cada estratégia de engenharia.
[0019] As Figuras 5A e 5B provêm a atividade de fitase em sobrenadante da cultura (barras cinzas) ou associada com células (barras com traços diagonais na Figura 5A ou □ na Figura 5B) para cepas que expressam a fitase livre ou imobilizada de Citrobacter braakii. O sobrenadante foi
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13/108 incubado com 5 mM de uma solução de fitato de sódio com pH 5,5 por 30 minutos e as células foram incubadas na mesma solução por 2 horas. (Figura 5A). A absorbância a 700 nm foi comparada com uma curva padrão de concentrações conhecidas de fosfato para expressar a atividade em FTUs. A absorbância foi medida no sobrenadante (barras cinzas) e as células (barras com traços diagonais) em diferentes cepas (M12548, T2633, T2634, T2635, T2636, T2637 e T2638). (Figura 5B) as FTUs foram comparadas entre as diferentes cepas. O eixo vertical esquerdo mostra a atividade do sobrenadante e a FTU para cada cepa é provida como barras cinzas. O eixo direito mostra a atividade FTU associada a célula e é provida como □ para cada uma das cepas (M12548, T2633, T2634, T2635, T2636, T2637 e T2638). Os valores para a cepa parental e a atividade associada a célula do imobilizador Pst1 ficaram fora da curva padrão e, por esta razão, abaixo do limite de detecção.
[0020] A Figura 6 provê a atividade de fitase no sobrenadante da cultura (barras cinzas) ou associada com células (barras com traços diagonais) para cepas que expressam a fitase de Escherichia co//fundida ou com um imobilizador de terminal N ou C. O sobrenadante foi incubado com uma solução a 5 mM de fitato de sódio a pH 5,5 por 30 minutos e as células foram incubadas na mesma solução por 2 horas. Os resultados são mostrados como a densidade ótica a 700 nm em função de cada cepa (M11312, T2705 e T2706).
[0021] A Figura 7 provê a atividade de fitase em sobrenadante de cultura (barras cinzas) ou associada com células (barras com traços diagonais) para cepas que expressam a fitase de E. coli fundida ou com um imobilizador de terminal N ou sem super-expressão de AGA1, e comparado com a fitase DE E. coli fundida com um imobilizador de terminal C Sed1. O sobrenadante foi incubado com uma solução a 5 mM fitato de sódio a pH 5,5 por 30 minutos e as células foram incubadas na mesma solução por 2
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14/108 horas. Os resultados são mostrados como a densidade ótica a 700 nm em função de cada cepa (M12550, M12795, M12983 e T2816).
[0022] A Figura 8 provê a atividade em amido de trigo de cepas que expressam amilase maltogênica. Os resultados são providos como a razão da absorbância a 450 nm / densidade ótica a 600 nm para a cultura total (barras à esquerda), o sobrenadante (barras no meio) e células lavadas (barras à direita) para as diferentes cepas (M10474, M13819, M13822, M14851, T4328, T4329, T4330, M12962, T4336, T4337 e T4338). Os dados para as cepas “M” são a média de culturas em duplicata. Os dados para as cepas “T” incluem a média da atividade em culturas cruzadas de sete isolados transformados. A expressão tipo 1 refere-se à presença de um peptídeo sinalizador de invertase e um imobilizador Spi 1 de maneira a gerar uma enzima imobilizada. A expressão tipo 2 refere-se à presença de um peptídeo sinalizador de invertase e à ausência de um imobilizador de maneira a gerar uma enzima secretada. A expressão tipo 3 refere-se à ausência de um peptídeo sinalizador e à ausência de um imobilizador de maneira a gerar uma enzima intracelular.
[0023] A Figura 9 mostra um gel SDS-PAGE de amostras de proteína total da enzima comercial Novamil® e do sobrenadantes de várias amostras da cepa M15532: creme de levedura (-20% sólidos), creme autolisado após incubação a 55°C por 48 horas e creme homogeneizado por moinho de esfera. A seta aponta para a banda principal do mesmo peso molecular da enzima Novamil® presente em todas as amostras de M15532, especialmente após a autólise ou moagem por esfera para liberar a enzima intracelular.
[0024] A Figura 10 mostra um SDS-PAGE da enzima Novamil® e da amilase maltogênica purificada a partir de duas cepas que expressam a enzima sem o peptídeo sinalizador (enzima intracelular prevista): M14851 e M15532. Os resultados foram gerados em condições não redutoras (colunas 3 a 5) e redutoras (colunas 7 a 9).
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15/108 [0025] A Figura 11 provê uma realização dos processos do presente relatório para a preparação de diferentes produtos de leveduras.
[0026] A Figura 12 mostra a atividade de alfa-amilase associada com as células de cepas de levedura que expressam várias proteínas quiméricas compreendendo uma alfa-amilase termotolerante derivada de Pyrococcus furiosus (SEQ ID NO: 71) em combinação com diferentes radicais de imobilização derivados da proteína SPI1 ou truncamentos associados (M15774, M15771, M15777, M15772 e M15222) em comparação com uma cepa de controle (M2390). Os resultados são mostrados como a absorbância a 540 nm em função da cepa de levedura utilizada.
[0027] A Figura 13 mostra a atividade de alfa-amilase associada com células de cepas de levedura que expressam várias proteínas quiméricas compreendendo uma alfa-amilase derivada de Thermococcus hydrothermalis (SEQ ID NO: 72) em combinação com diferentes radicais de imobilização derivados da proteína CCW12 ou truncamentos associados (M15773, M15776, M16251 e M15215) em comparação com uma cepa de controle (M2390). Os resultados são mostrados como a absorbância a 540 nm em função da cepa de levedura utilizada.
[0028] A Figura 14 mostra a atividade de alfa-amilase associada com as células de cepas de levedura que expressam várias proteínas quiméricas compreendendo uma alfa-amilase derivada de T. hydrothermalis (SEQ ID NO: 72) em combinação com um radical de imobilização derivado da proteína CCW12 e diferentes ligantes (M15785, M15786, M15782, M16252, M16221 e M16222) em comparação com uma cepa de controle (M2390). Os resultados são mostrados como a absorbância a 540 nm em função da cepa de levedura.
[0029] A Figura 15 mostra a atividade de alfa-amilase associada com as células de cepas de levedura que expressam várias proteínas quiméricas compreendendo uma alfa-amilase derivada de P. furiosus (SEQ ID NO: 71), um radical de imobilização derivado da proteína SPI1 e diferentes
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16/108 ligantes (M15784, M15778, M15779, M15787, M15780, M15788 e M15783) em comparação com uma cepa de controle (M2390). Os resultados são mostrados como a absorbância a 540 nm em função da cepa de levedura.
[0030] A Figura 16 mostra a atividade de glicose oxidase (GO) associada com a cultura total (barras cinzas), células lavadas (barras com traços diagonais) ou o sobrenadante de células lavadas rompidas (barras brancas) de cepas de levedura que expressam a glicose oxidase derivada de Aspergillus niger, expressa em uma forma secretada (M16780) ou intracelular (M16273) em comparação com uma cepa de controle negativo (M10474) e uma quantidade de controle positiva positive de uma glicose oxidase purificada comercialmente disponível (controle positivo, Gluzyme Mono®). Os resultados são mostrados como a absorbância a 510 nm em função da cepa de levedura/controle utilizada.
[0031] A Figura 17 mostra a atividade de glicose oxidase (GO) associada com a cultura total (barras cinzas), células lavadas (barras com traços diagonais) de cepas de levedura que expressam a glicose oxidase derivada de Aspergillus niger, expressa em uma forma secretada (M16780) ou intracelular (M16273). Os resultados são mostrados como a absorbância a 510 nm (corrigida de maneira a remover a absorbância associada com a cepa de controle M10474) em função da cepa de levedura utilizada.
[0032] A Figura 18 mostra a atividade de amilase fúngica (FA) associada com a cultura total (barras cinzas), células lavadas (barras diagonais) ou o sobrenadante de células lavadas rompidas (barras brancas) de cepas de levedura que expressam a amilase fúngica derivada de Aspergillus oryzae expressa em uma forma secretada com diferentes peptídeos sinalizadores (invertase de S. cerevisiae para M16772, peptídeo sinalizador de alfaamilase de A. oryzae para a M16540) em comparação com uma cepa de controle negativo (M10474) e um quantidade de controle positivo de uma
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17/108 alfa-amilase fúngica comercialmente disponível purificada (controle positivo, Fungamil®). Os resultados são mostrados como a absorbância a 540 nm em função da cepa de levedura/controle utilizada.
[0033] A Figura 19 mostra a atividade de amilase fúngica (FA) associada com uma cultura total (barras cinzas), células lavadas (barras com traços diagonais) ou o sobrenadante de células lavadas rompidas (barras brancas) de cepas de levedura que expressam a amilase fúngica derivada de Aspergillus oryzae expressa em uma forma secretada com diferentes peptídeos sinalizadores (invertase de S. cerevisiae para a M16772, peptídeo sinalizador de alfa-amilase nativo de A. oryzae para a M16540). Os resultados são mostrados como a absorbância a 540 nm (corrigida de maneira a remover a absorbância associada com a cepa de controle M10474) em função da cepa de levedura utilizada.
DESCRIÇÃO DETALHADA [0034] O presente relatório provê células hospedeiras de levedura recombinante que expressam uma proteína heteróloga associada a célula durante sua fase de propagação. Conforme utilizada no contexto do presente relatório, a expressão “fase de propagação” refere-se a uma fase de expansão de um processo comercial na qual asa leveduras são propagadas sob condições aeróbicas de maneira a maximizar a conversão de um substrato em biomassa. Em alguns casos, a biomassa propagada pode ser utilizada na etapa de fermentação seguinte (usualmente sob condições aeróbicas) de maneira a maximizar a produção de um ou mais metabólitos desejados. Vantajosamente, tendo em vista que a célula hospedeira de levedura recombinante do presente relatório expressa uma proteína heteróloga associada a célula, provê uma composição de levedura ou um produto de levedura enriquecido na proteína heteróloga, quando em comparação com uma célula hospedeira de levedura recombinante que expressa a proteína heteróloga em uma forma livre (que não é associada a célula ou não imobilizada). Em uma realização, a
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18/108 composição de levedura ou o produto de levedura pode compreender pelo menos 1% (em peso seco) da proteína heteróloga das proteínas totais da composição de levedura ou do produto de levedura. Em algumas realizações, a composição de levedura ou o produto de levedura compreende pelo menos 0,1 % em peso da proteína heteróloga quando em comparação com o peso total das proteínas da célula hospedeira de levedura recombinante, da composição de levedura ou do produto de levedura. Em algumas realizações, a composição de levedura ou o produto de levedura compreende pelo menos 0,001 g da proteína heteróloga quando em comparação com o peso total das proteínas da célula hospedeira de levedura recombinante, da composição de levedura ou do produto de levedura. Em algumas realizações, a composição de levedura ou o produto de levedura compreende pelo menos 0,05% em peso da proteína heteróloga quando em comparação com o peso total da célula hospedeira de levedura recombinante. Em algumas realizações, a composição de levedura ou o produto de levedura compreende pelo menos 0,0005 g da proteína heteróloga / g do peso seco da célula hospedeira de levedura recombinante. Em algumas realizações nas quais a proteína heteróloga é uma enzima, a composição de levedura ou o produto de levedura provê uma atividade enzimática mínima de pelo menos 50 nidades de atividade enzimática / g de peso celular seco da célula hospedeira de levedura recombinante ou /g de proteínas totais da célula hospedeira de levedura recombinante. Em uma realização, a atividade associada a célula da proteína heteróloga associada a célula é de pelo menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mesmo 25 vezes aumentada quando em comparação com a atividade associada a célula de uma proteína heteróloga correspondente expressa em uma forma livre (por exemplo, secretada). Em algumas realizações, a célula hospedeira de levedura recombinante apresenta pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 20, 35, 40, 45, 50% ou mais da proteína heteróloga quando em comparação com uma célula
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19/108 hospedeira de levedura que não expressa a proteína heteróloga (mas que não obstante expressa uma proteína nativa correspondente). Em uma realização, para uma proteína heteróloga associada a célula, a razão da atividade associada com as células em comparação com a atividade associada o sobrenadante de cultura celular (por exemplo, livre) é maior que 1:33, e é, por exemplo, entre cerca de 1:12 e 1:1,4. Em uma outra realização, para uma proteína heteróloga associada a célula, a percentagem da atividade associada com as células (quando em comparação com a atividade total) é qualquer percentagem entre 8 e 42%. As células hospedeiras de levedura recombinante do presente relatório são vantajosas porque provêm uma fonte de custo mais baixo de atividade enzimática que os produtos purificados que são tradicionalmente utilizados. Além disto, a atividade da proteína heteróloga nas células hospedeiras de levedura recombinante pode vantajosamente ser facilmente medida, dosada e formulada antes de sua inclusão em um processo industrial.
Células hospedeiras de levedura recombinante [0035] As células hospedeiras de levedura recombinante do presente relatório destinam-se a serem utilizadas nos processos para a preparação de uma composição de levedura que pode ser utilizada em vários processos para a fabricação de produtos de leveduras. A célula hospedeira de levedura recombinante do presente relatório (e, pela mesma razão, a composição de levedura e o produto de levedura) compreende a proteína heteróloga em uma forma associada a célula, ou em uma forma intracelular ou associada com sua membrana. Tal como utilizada no contexto do presente relatório, uma “composição de levedura” é uma composição compreendendo a célula hospedeira de levedura recombinante do presente relatório a qual foi propagada. A combinação de levedura pode ser utilizada, por exemplo, em uma fermentação seguinte (para prover a proteína heteróloga in situ durante a fermentação) ou para
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20/108 produzir um produto de levedura. Em uma realização, a célula hospedeira de levedura recombinante é provida em uma forma ativa ou em uma forma semiativa na composição de levedura. Por exemplo, uma realização da composição de levedura é um creme preparado a partir da célula hospedeira de levedura recombinante do presente relatório.
[0036] Também como utilizado no contexto do presente relatório, um “produto de levedura” é uma composição compreendendo um produto preparado pela célula hospedeira de levedura recombinante do presente relatório e compreendendo a proteína heteróloga. Em uma realização, um produto de levedura pode ser provido como uma forma inativa na célula de levedura provida do presente relatório. Em ainda uma outra realização, o produto de levedura pode ser um metabólito produzido pela célula hospedeira de levedura recombinante do presente relatório, por exemplo, uma proteína heteróloga produzida pela célula hospedeira de levedura recombinante.
[0037] As células hospedeiras de levedura recombinante do presente relatório podem ser utilizadas opcionalmente em um processo de fermentação. Em uma realização, o processo de fermentação pode ser um processo relativamente longo e as células hospedeiras de levedura recombinante podem ser utilizadas, por exemplo, na fabricação de biocombustíveis, produtos destilados, vinho e cerveja. Em uma outra realização, o processo de fermentação pode ser um processo relativamente curto e as células hospedeiras de levedura recombinante podem ser utilizadas, por exemplo, na fabricação de produtos de panificação levedados com levedura.
[0038] As células hospedeiras de levedura recombinante do presente relatório podem ser também utilizadas em um processo que não inclua uma etapa de fermentação. Por exemplo, a célula hospedeira de levedura recombinante pode ser utilizada para a preparação de alimentos e bebidas (por exemplo, levedados ser levedura (levedados quimicamente), produtos
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21/108 de panificação, produtos de laticínios, extratos de levedura, sucos, gorduras e óleos, assim como amido), ração ou outros produtos industriais (por exemplo, detergentes, têxteis, couro, polpa e papel, óleo e gás e/ou biopolímeros).
[0039] As células hospedeiras de levedura recombinante do presente relatório podem ser providas em uma forma ativa (por exemplo, levedura líquida, comprimida ou seca em leito fluidizado), em uma forma semiativa (por exemplo, líquida, comprimida ou seca em leito fluidizado), em uma forma inativa (por exemplo, seca em tambor ou por aspersão), bem como em uma mistura destas. Por exemplo, as células hospedeiras de levedura recombinante podem ser uma combinação das formas ativa e semiativa ou inativa para prover a proporção e dose da proteína heteróloga requerida para a preparação da composição de levedura.
[0040] O presente relatório refere-se a células hospedeiras de levedura recombinante que foram geneticamente engenheiradas. A(s) modificação(ões) genética(s) é (são) destinada(s) a aumentar a expressão de um gene alvo específico (o qual é considerado heterólogo à célula hospedeira de levedura) e que pode(m) ser feita(s) em uma ou múltiplas localizações genéticas (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou mais). No contexto do presente relatório, quando a célula de levedura recombinante é qualificada como sendo “geneticamente engenheirada”, deve ser entendido que isto significa que foi manipulada para adicionar pelo menos um ou mais resíduos de ácido nucleico heterólogos ou exógenos. Em algumas realizações, o um ou mais resíduos de ácido nucleico que são adicionados podem ser derivados de uma célula heteróloga ou a célula hospedeira recombinante em si. Neste último cenário, o(s) resíduo(s) de ácido nucleico é (são) adicionado(s) em um ou mais locais genômicos que são diferentes dos locais genômicos nativos. As manipulações genéticas não ocorreram na natureza e são os resultados de manipulações in vitro da levedura.
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22/108 [0041] Quando expressas em células hospedeiras de levedura recombinante, as proteínas heterólogas descritas aqui são codificadas em uma ou mais moléculas de ácido nucleico heterólogas. O termo “heteróloga”, quando utilizado com referência a uma molécula de ácido nucleico (tal como um promotor, um terminador ou uma sequência de codificação) ou uma proteína, refere-se a uma molécula de ácido nucleico ou a uma proteína que não é encontrada de forma nativa na célula hospedeira recombinante. “Heteróloga” inclui também uma região de codificação/promotor/terminador nativo ou uma parte deste, que foi removida do organismo fonte e subsequentemente reintroduzida no organismo fonte em uma forma que é diferente do gene nativo correspondente, não em seu local natural no genoma do organismo. A molécula de ácido nucleico heteróloga é introduzida propositalmente na célula hospedeira recombinante. Por exemplo, um elemento heterólogo podería ser derivado de uma cepa diferente da célula hospedeira, ou de um organismo de um grupo taxonômico diferente (por exemplo, reino, filo, classe, ordem, família, gênero ou espécie diferente, ou qualquer subgrupo dentro de uma destas classificações).
[0042] A molécula de ácido nucleico heteróloga presente na célula hospedeira recombinante pode ser integrada no genoma da célula hospedeira. O termo “integrado” tal como utilizado aqui refere-se a elementos genéticos que são colocados, por meio de técnicas de biologia molecular, no genoma de uma célula hospedeira. Por exemplo, elementos genéticos podem ser colocados nos cromossomos da célula hospedeira em oposição a em um vetor tal como um plasmídeo pela célula hospedeira. Métodos para a integração de elementos genéticos no genoma de uma célula hospedeira são bem conhecidos na técnica e incluem recombinação homóloga. A molécula de ácido nucleico heteróloga pode estar presente em uma ou mais cópias (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou mesmo mais cópias) no genoma de célula hospedeira de levedura. Alternativamente, a
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23/108 molécula de ácido nucleico heteróloga pode ser de replicação independente do genoma da levedura. Em tal realização, a molécula de ácido nucleico pode ser estável e de auto replicação.
[0043] Células hospedeiras de levedura adequadas que podem ser utilizadas no contexto do presente relatório podem ser, por exemplo, do gênero Saccharomyces, Kluyveromyces, Arxula, Debaryomyces, Candida, Pichia, Phaffia, Schizosaccharomyces, Hansenula, Kloeckera, Schwanniomyces, Torula ou Yarrowia. Espécies de levedura adequadas podem incluir, por exemplo, S. cerevisiae, S. bulderi, S. barnetti, S. exiguus, S. uvarum, S. diastaticus, C. utilis, K. lactis, K. marxianus ou K. fragilis. Em algumas realizações, a levedura é selecionada do grupo consistindo em Saccharomyces cerevisiae, Schizzosaccharomyces pombe, Candida albicans, Pichia pastoris, Pichia stipitis, Yarrowia lipolitica, Hansenula polimorpha, Phaffia rhodozyma, Candida utilis, Arxula adeninivorans, Debaryomyces hansenii, Debaryomyces polimorphus, Schizosaccharomyces pombe e Schwanniomyces occidentalis. Em uma realização particular, a levedura é Saccharomyces cerevisiae. Em algumas realizações, a célula hospedeira pode ser uma célula de levedura oleaginosa. Por exemplo, a célula hospedeira de levedura oleaginosa pode ser do gênero Blakeslea, Candida, Cryptococcus, Cunninghamella, Lipomyces, Mortierella, Mucor, Phycomyces, Pythium, Rhodosporidum, Rhodotorula, Trichosporon ou Yarrowia. Em algumas realizações alternativas, a célula hospedeira pode ser uma célula hospedeira e microalga oleaginosa (por exemplo, por exemplo, do gênero Thraustochytrium ou Schizochytrium). Em uma realização, a célula hospedeira de levedura recombinante é do gênero Saccharomyces e, em algumas realizações, da espécie Saccharomyces cerevisiae.
[0044] As células hospedeiras de levedura recombinante do presente relatório incluem uma molécula de ácido nucleico heteróloga destinada a permitir a expressão (por exemplo, que codifica) da uma ou mais proteínas
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24/108 heterólogas. Em uma realização, a proteína heteróloga é uma enzima heteróloga. No contexto do presente pedido, a enzima heteróloga pode ser, sem limitação, uma oxido redutase heteróloga, uma transferase heteróloga, uma hidrolase heteróloga, uma liase heteróloga, uma isomerase heteróloga, uma fosfatase heteróloga e/ou uma ligase heteróloga.
[0045] Tal como utilizada no contexto do presente relatório, a expressão “oxido redutase” (também referido como uma oxidase, E.C. 1) refere-se a uma proteína apresentando atividade enzimática e capaz de catalisar a transferência de elétrons de uma molécula (o redutor ou o doador de elétron) para uma outra (o oxidante ou o receptor de elétron). Em uma realização, a oxido redutase é uma hexose oxidase (E.C. 1.1.3.5), por exemplo, a hexose oxidase pode ser uma glicose oxidase (E.C. 1.1.3.4). Em algumas realizações, as oxidases (tais como as glicoses oxidases) pode melhorar a maleabilidade da massa. Em uma realização, a uma ou mais oxido redutases podem ser uma glicose oxidase de Aspergillus niger (e apresentar, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 44 ou 103, uma variante desta ou um fragmento desta). As oxido redutases podem ser utilizadas em processos de fermentação para a obtenção de biocombustíveis, produtos destilados, vinho, cerveja e produtos de panificação levedados com levedura. As oxido redutases podem ser utilizadas para a preparação de alimentos e bebidas (por exemplo, produtos de panificação não levedados com levedura (levedados quimicamente)), rações ou outros produtos industriais (por exemplo, detergentes, têxteis, couro, poupa e papel, óleo e gás e/ou biopolímeros). [0046] Tal como utilizada no contexto do presente relatório, a expressão “transferase” (E.C. 2) refere-se a uma proteína apresentando atividade enzimática e capaz de catalisar a transferência de grupos funcionais específicos (por exemplo, a grupo metil ou glicosil) de uma molécula (chamada de doadora) para uma outra (chamada de receptora). Por
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25/108 exemplo, as transferases podem ser aciltransferases (E.C. 2.3 tais como transglutaminases (E.C. 2.3.2.13) por exemplo) ou glicosiltransferases (E.C. 2.4 tais como amilomaltases (E.C. 2.4.1.3) por exemplo). Uma transglutaminase pode ser utilizada em produtos de panificação para melhorar a resistência da massa.
[0047] Tal como utilizada no contexto do presente relatório, a expressão “liase” (E.C. 4) refere-se a uma proteína apresentando atividade enzimática e capaz de catalisar a eliminação de várias ligações químicas por meios outros que não a hidrólise (por exemplo, uma reação de “substituição”) e oxidação. Por exemplo, a liase pode ser uma enzima malolática (EC 4.1.1.101), acetolactato descarboxilase (ou alfa-acetolatato descarboxilase, EC 4.1.1.5) e/ou uma pectato liase (E.C. 4.2.2.2). As liases podem ser utilizadas em processos de fermentação para a obtenção de biocombustíveis, produtos destilados, vinho, cerveja e produtos de panificação levedados com levedura. As liases podem ser utilizadas também para a preparação de alimentos e bebidas (por exemplo, produtos de panificação não levedados com (levedados quimicamente)), rações ou outros produtos industriais (por exemplo, detergentes, têxteis, couro, polpa e papel, óleo e gás e/ou biopolímeros).
[0048] Tal como utilizada no contexto do presente relatório, a expressão “isomerase” (E.C. 5) refere-se a uma proteína apresentando atividade enzimática e capaz de catalisar a conversão de uma molécula de um isômero a um outro. Por exemplo, a isomerase pode ser uma glicose isomerase (E.C. 5.1.3) ou xilose isomerase (EC 5.1.3.5). As isomerases podem ser utilizadas em processos de fermentação processes para a obtenção de biocombustíveis, produtos destilados, vinho, cerveja e produtos de panificação levedados com levedura. As isomerases podem ser utilizadas também para a preparação de alimentos e bebidas (por exemplo, produtos de panificação não levedados com (levedados
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26/108 quimicamente)), rações ou outros produtos industriais (por exemplo, detergentes, têxteis, couro, polpa e papel, óleo e gás e/ou biopolímeros). [0049] Tal como utilizada no contexto do presente relatório, a expressão “ligase” (E.C. 6) refere-se a uma proteína apresentando atividade enzimática e capaz de catalisar a união de duas moléculas pela formação de uma nova ligação química. Por exemplo, a ligase pode ser uma ureia amidoliase (E.C. EC 6.3.4.6). As ligases podem ser utilizadas em processos de fermentação para a obtenção de biocombustíveis, produtos destilados, vinho, cerveja e produtos de panificação levedados com levedura. As ligases podem ser utilizadas também para a obtenção de alimentos e bebidas (por exemplo, produtos de panificação não levedados com (levedados quimicamente)), rações ou outros produtos industriais (por exemplo, detergentes, têxteis, couro, polpa e papel, óleo e gás e/ou biopolímeros).
[0050] Tal como utilizada no contexto do presente relatório, a expressão “hidrolase” (E.C. 3) refere-se a uma proteína apresentando atividade enzimática e capaz de catalisar a hidrólise de uma ligação química. Por exemplo, a hidrolase pode ser uma estearase (E.C. 3.1, por exemplo lipase, fosfolipase A1 e/ou fosfolipase A2), pode clivar ligações não peptídicas C-N (E.C. 3.5, por exemplo, uma asparaginase), pode ser uma glicosilase (E.C. 3.2, por exemplo, uma amilase (E.C. 3.2.1.1), uma glucanase, uma glicosidase (E.C. 3.2.1), uma celulase (E.C. 3.2.1.4)), uma pectinase e/ou uma lactase (E.C. 3.2.1.108)), uma protease (E.C. 3.4, por exemplo uma protease bacteriana, uma protease vegetal ou uma protease fúngica). Quando a hidrolase é uma amilase, pode ser, por exemplo, uma alfa amilase fúngica, uma alfa amilase bacteriana, uma alfa amilase maltogênica, uma maltotetrahidrolase, uma alfa ou beta amilase vegetal (por exemplo, de cevada) e/ou uma glucoamilase. Quando a hidrolase é uma glicosidase, pode ser, por exemplo, uma beta glucosidase. Quando a
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27/108 hidrolase é uma celulase, pode ser, por exemplo, uma celulase, uma hemicelulase e/ou uma xilanase.
[0051] Tal como utilizada aqui, a expressão “fosfatase” refere-se a uma proteína apresentando atividade enzimática e capaz, na presença de água, de catalisar a divagem de um moo éster de ácido fosfórico em um íon fosfate e um álcool. Uma realização de uma fosfatase é uma fitase, uma proteína apresentando atividade enzimática e capaz de catalisar a hidrólise de ácido fítico (mio-inositol hexacisfosfato) em fósforo inorgânico. Existem quatro classes distintas de fitase: histidino fosfatases ácidas (HAPS), fitases β-propeller, fosfatases ácidas púrpuras e fitases semelhantes à proteína tirosino fosfatase (fitases semelhantes a PTP). O ácido fítico apresenta seis grupos fosfato que podem ser liberados pelas fitases a diferentes taxas e em ordem diferente. As fitases hidrolisam fosfatos a partir de ácido fítico de maneira gradual, produzindo produtos que novamente se tornam substratos para uma hidrólise posterior. As fitases foram agrupadas com base na posição do primeiro fosfato do ácido fítico que é hidrolisado: são 3-fitase (EC 3.1.3.8), 4-fitase (EC 3.1.3.26) e 5-fitase (EC 3.1.3.72). Em uma realização, a fitase é derivada de uma espécie bacteriana, tal como, por exemplo, uma Citrobacter sp. ou uma Escherichia sp. Em uma realização específica, a fitase heteróloga é derivada de uma Citrobacter sp., tal como, por exemplo Citrobacter braakii e pode apresentar, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 66, uma variante desta ou um fragmento desta. Em uma outra realização, a fitase heteróloga é derivada de uma Escherichiasp., tal como, por exemplo, Escherichia coli e pode apresentar, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 67, uma variante desta ou um fragmento desta.
[0052] Tal como utilizada aqui, a expressão “enzima aminolítica” refere-se a uma classe de enzimas capaz de hidrolisar amido. As enzimas aminolíticas incluem, mas não se limitam a, alfa-amilases (EC 3.2.1.1,
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28/108 algumas vezes referidas como alfa-amilases fúngicas, ver abaixo), amilase maltogênica (EC 3.2.1.133), glucoamilase (EC 3.2.1.3), glucan 1,4-alfamaltotetraohidrolase (EC 3.2.1.60), pululanase (EC 3.2.1.41), iso-amilase (EC 3.2.1.68) e amilomaltase (EC 2.4.1.25). Em uma realização, a uma ou mais enzimas aminolíticas podem ser uma alfa-amilase de Aspergillus oryzae (e apresentar, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 ou 105, uma variante desta ou um fragmento desta), uma alfaamilase maltogênica de Geobacillus stearothermophilus (a apresentar, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, 51, 65, ou 108, uma variante desta ou um fragmento desta), uma glucoamilase de Saccharomycopsis fibuligera (e apresentar, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, uma variante desta ou um fragmento desta), uma glucan 1,4-alfa-maltotetraohidrolase de Pseudomonas saccharophila (e apresentar, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4, uma variante desta ou um fragmento desta), uma pululanase de Bacillus naganoensis (e apresentar, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5, uma variante desta ou um fragmento desta), uma pululanase de Bacillus acidopullulyticus (e apresentar, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6, uma variante desta ou um fragmento desta), uma iso-amilase de Pseudomonas amiloderamosa (e apresentar, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7, uma variante desta ou um fragmento desta), e/ou amilomaltase de Thermus thermophilus (e apresentar, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8, uma variante desta ou um fragmento desta).
[0053] Tal como utilizada aqui, a expressão “celulase/hemicelulase” refere-se a uma classe de enzimas capaz de hidrolisar, respectivamente, celulose ou hemicelulose. As celulases/hemicelulases incluem, mas não se limitam a, celulase (E.C. 3.2.1.4) e uma endoB(1,4)D-xilanase (E.C. 3.2.1.8). Em uma realização, a uma ou mais celulases/hemi-celulases
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29/108 podem ser uma celulase de Penicillium funiculosum (e apresentar, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 42, uma variante desta ou um fragmento desta) e/ou uma endoB(1,4)D-xilanase de Rasamsonia emersonii (e apresentar, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43, uma variante desta ou um fragmento desta).
[0054] Tal como utilizada aqui, a expressão “lipase” refere-se a uma classe de enzimas capaz de hidrolisar lipídeos. Em uma realização, a uma ou mais lipases podem ser uma triacilglicerol lipase de Thermomyces lanuginosis (e apresentar, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 45, uma variante desta ou um fragmento desta), uma fosfolipase A2 de Sus scrofa (e apresentar, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 46, uma variante desta ou um fragmento desta), uma fosfolipase A2 de Streptomyces vialaceoruber (e apresentar, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 47, uma variante desta ou um fragmento desta) e/ou uma fosfolipase A2 de Aspergillus oryzea (e apresentar, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48, uma variante desta ou um fragmento desta).
[0055] Tal como utilizado no presente relatório, o termo “amilase maltogênica” refere-se a um polipeptídeo capaz de hidrolisar amido em maltose. A amilase maltogênicas inclui, mas não se limita a, alfa-amilases fúngicas (derivadas, por exemplo, de Aspergillus sp. (por exemplo, A. Niger, A. kawachi, e A. oryzae); Trichoderma sp. (por exemplo, T. reesie), Rhisopus sp., Mucor sp., e Penicillium sp.), amilase fúngica ácida estável (derivada, por exemplo, de Aspergillus niger), β-amilases (derivadas, por exemplo, de vegetais (trigo, cevada, centeio, sorgo, soja, batata doce, arroz) e microrganismos (Bacillus cereus, Bacillus polimixa, Bacillus megaterium, Arabidopsis thaliana), amilases maltogênicas (E.C. 3.2.1.133) (derivada, por exemplo, de microrganismos tais como Bacillus subtilis, Geobacillus stearothermophilus, Bacillus thermoalkalophilus, Lactobacillus
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30/108 gasseri, Thermus sp.). Em uma realização específica, as células hospedeiras de levedura recombinante do presente relatório incluem uma molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica para a amilase maltogênica heteróloga derivada de Geobacillus stearothermophilus e apresenta, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, 51,65 ou 108, uma variante desta ou um fragmento desta.
[0056] A proteína heteróloga pode ser uma variante de uma proteína conhecida/nativa. Uma variante compreende pelo menos um aminoácido diferente quando em comparação com a sequência de aminoácidos da proteína nativa/conhecida. Tal como utilizada aqui, uma variante refere-se a alterações na sequência de aminoácidos que não afeta adversamente as funções biológicas da proteína heteróloga. Uma substituição, inserção ou deleção é dita afetar adversamente a proteína quando a sequência alterada previne ou rompe uma função biológica associada com a proteína heteróloga. Por exemplo, a carga global, estrutura ou propriedades hidrofóbicas-hidrofílicas da proteína podem ser alteradas sem afetar adversamente uma atividade biológica. Da mesma forma, a sequência de aminoácidos pode ser alterada, por exemplo, para tornar o peptideo mais hidrofóbico ou hidrofílico, sem afetar adversamente as atividades biológicas da proteína heteróloga. As variantes da proteína apresentam pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a proteína heteróloga descrita aqui. O termo “identidade percentual”, tal como conhecido na técnica, é uma relação entre duas ou mais sequências de polipeptídeo ou duas ou mais sequências de polinucleotídeo, tal como determinado por comparação das sequências. O nível de identidade pode ser determinado convencionalmente utilizando-se programas de computador conhecidos. A identidade pode ser facilmente calculada por métodos conhecidos, incluindo, mas não se limitando a, os descritos em: Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, NY (1988);
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Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, NY (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., e Griffin, H. G., eds.) Humana Press, NJ (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987); e Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. e Devereux, J., eds.) Stockton Press, NY (1991). Os métodos preferidos para a determinação da identidade são projetados para produzir a melhor combinação entre as sequências testadas. Os métodos para determinar a identidade e similaridade são codificados em programas de computador disponíveis publicamente. Alinhamentos de sequência e cálculos de identidade percentual podem ser realizados utilizando-se o programa Megalign da LASERGENE bioinformatics computing suite (DNASTAR Inc., Madison, Wis.). Alinhamentos múltiplos das sequências descritas aqui foram realizados utilizando-se o método Clustal de alinhamento (Higgins e Sharp (1989) CABIOS. 5:151-153) com os parâmetros padrão (GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PEN ALT Y= 10). Os parâmetros padrão para alinhamentos em pares utilizando-se o método Clustal foram KTUPLB 1, GAP PENALTY=3, WINDOW=5 e DIAGONALS SAVED=5.
[0057] A proteína heteróloga variante descrita aqui pode ser (i) uma na qual um ou mais dos resíduos de aminoácidos são substituídos com um resíduo de aminoácido conservado ou não conservado (preferivelmente um resíduo de aminoácido conservado) e tal resíduo de aminoácido substituído pode ser ou não um codificado pelo código genético, ou (ii) uma na qual um ou mais dos resíduos de aminoácidos incluem um grupo substituinte, ou (iii) uma na qual a polipeptídeo maduro é fundido com um outro composto, tal como um composto para aumentar a meia vida do polipeptídeo (por exemplo, polietileno glicol), ou (iv) uma na qual os aminoácidos adicionais são fundidos a um polipeptídeo maduro para purificação do polipeptídeo. Uma “variante” da proteína heteróloga pode ser uma variante conservative ou uma variante alélica.
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32/108 [0058] A proteína heteróloga pode ser um fragmento de uma proteína conhecida/nativa ou fragmento de uma variante de uma proteína conhecida/nativa. Em uma realização, o fragmento corresponde à proteína conhecida/nativa da qual a sequência do peptídeo sinalizador foi removida. Em algumas realizações, os “fragmentos” da proteína heteróloga apresentam pelo menos 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 ou mais aminoácidos consecutivos da proteína heteróloga. Um fragmento compreende pelo menos um resíduo de aminoácido a menos quando em comparação com a sequência de aminoácidos da proteína heteróloga conhecida/nativa e ainda possuir a atividade enzimática da proteína heteróloga de comprimento total. Em uma realização, o fragmento corresponde à sequência de aminoácidos da proteína que não apresenta o peptídeo sinalizador. Em algumas realizações, os fragmentos da proteína heteróloga podem ser empregados para a produção da proteína heteróloga de comprimento total por síntese de peptídeo. Desta forma, os fragmentos podem ser empregados como intermediários para a produção das proteínas de comprimento total.
[0059] Na célula hospedeira de levedura recombinante do presente relatório, a proteína heteróloga é “associada a célula” à célula hospedeira de levedura recombinante porque é desenhada para ser expressa e permanecer fisicamente associada com as células hospedeiras de levedura recombinante. Em uma realização, a proteína heteróloga pode ser expressa no interior da célula hospedeira de levedura recombinante (de forma intracelular). Em tal realização, a proteína heteróloga não necessita ser associada à parede da célula hospedeira de levedura recombinante. Quando a proteína heteróloga é destinada a ser expressa intracelularmente, sua sequência sinalizadora, se presente na sequência nativa, pode ser deletada de maneira a permitir a expressão intracelular.
[0060] Em uma outra realização, a proteína heteróloga do presente relatório pode ser secretada, mas quando é, deve permanecer fisicamente
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33/108 associada com a célula hospedeira de levedura recombinante. Em uma realização, pelo menos uma parte (usualmente pelo menos um terminal) da proteína heteróloga é ligada, covalentemente, não covalentemente e/ou eletrostaticamente, por exemplo, à parede celular (e em algumas realizações à membrana citoplasmática). Por exemplo, a proteína heteróloga pode ser modificada para conter num ou mais domínios de transmembrana, para apresentar uma ou mais modificações de lipídeo (miristoilação, palmitoilação, farnesilação e/ou prenilação), para interagir com uma ou mais proteínas associadas a membrana e/ou para interações com as balsas lipídicas celulares. Embora a proteína heteróloga possa não ser diretamente ligada à membrana celular ou parede celular (por exemplo, tal como quando a ligação ocorre por meio de um radical de imobilização), a proteína é não obstante considerada uma proteína heteróloga “associada a célula” de acordo com o presente relatório.
[0061] Em algumas realizações, a proteína heteróloga pode ser expressa para ser localizada na e associada à parede celular da célula hospedeira de levedura recombinante. Em algumas realizações, a proteína heteróloga é expressa para ser localizada na e associada à superfície externa da parede celular da célula hospedeira. As células hospedeiras de levedura recombinante todas apresentam uma parede celular (que inclui uma membrana citoplasmática) definindo os ambientes intracelular (por exemplo, voltado internamente para o núcleo) e extracelular (por exemplo, voltado para o exterior). A proteína heteróloga pode ser localizada (e, em algumas realizações, fisicamente associada a) na face externa da parede celular da levedura hospedeira recombinante e, em realizações adicionais, à face externa da membrana citoplasmática da levedura hospedeira recombinante. No contexto do presente relatório, a expressão “associada à face externa da parede celular/membrana citoplasmática da célula hospedeira de levedura recombinante” refere-se à capacidade da proteína heteróloga em se integrar fisicamente (em uma maneira covalente ou não
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3Α/Λ 08 covalente), pelo menos em parte, na parede celular (e, em algumas realizações, na membrana citoplasmática) da célula hospedeira de levedura recombinante. A integração física pode ser atribuída à presença, por exemplo, de um domínio de transmembrana na proteína heteróloga, um domínio capaz de interagir com uma proteína da membrana citoplasmática na proteína heteróloga, uma modificação posterior à tradução realizada na proteína heteróloga (por exemplo, lipidação), etc.
[0062] Algumas proteínas heterólogas apresentam a capacidade intrínseca de se localizarem e se associarem à parede celular de uma célula hospedeira de levedura recombinante (por exemplo, sendo associada a célula). Um exemplo de uma proteína heteróloga apresentando a capacidade intrínseca de ser associada a célula é mostrado na Figura 1A (por exemplo, a cepa T2994 na Figura 1). Nesta figura, os resultados são apresentados para a alfa-amilase maltogênica de Geobacillus stearothermophilus expressa em S. cerevisiae na ausência de um radical de imobilização e claramente mostra que esta proteína heteróloga é intrinsicamente “associada a célula” e exibe atividade enzimática (por exemplo, atividade de alfa-amilase maltogênica).
[0063] No entanto, em algumas circunstâncias, é garantido que aumenta ou provê a associação a célula para algumas proteínas heterólogas porque exibem associação a célula intrínseca insuficiente ou simplesmente não apresentam associação intrínseca a célula. Em tal realização, é possível prover a proteína heteróloga como uma construção quimérica pela combinação desta com um radical de imobilização de aminoácido o qual irá prover ou aumentar a fixação à parede celular da célula hospedeira de levedura recombinante. Em tal realização, a proteína heteróloga quimérica irá ser considerada”. É preferido que o radical de imobilização de aminoácido da proteína quimérica seja neutro em relação à atividade biológica da proteína heteróloga, por exemplo, não interfira com a atividade biológica (tal como, por exemplo, a atividade enzimática) da proteína
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35/108 heteróloga. Em algumas realizações, a associação do radical de imobilização de aminoácido com a proteína heteróloga pode amentar a atividade biológica da proteína heteróloga (quando em comparação com forma “livre não imobilizada).
[0064] Em uma realização, um radical de imobilização pode ser utilizado para ser expresso com a proteína heteróloga de maneira a localizar a proteína heteróloga na parede da célula hospedeira de levedura recombinante. Vários radicais de imobilização de aminoácido são conhecidos na técnica e podem ser utilizados nas proteínas quiméricas do presente relatório. O radical de imobilização pode ser um domínio de transmembrana encontrado em uma outra proteína e permite que a proteína quimérica apresente um domínio de transmembrana. Em tal realização, o radical de imobilização pode ser derivado da roteína FLO1 (apresentando, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10, uma variante desta ou um fragmento desta ou sendo codificado pela sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 9).
[0065] Em ainda um outro exemplo, o radical de imobilização de aminoácido pode ser modificado após a tradução de maneira a incluir uma âncora de glicosilfosfatidilinositol (GPI) e permitir que a proteína quimérica contenha uma âncora GPI. As âncoras GPI são glicolipídeos fixados no terminal de uma proteína (e, em algumas realizações, ao terminal carboxil terminus de uma proteína) o que permite a ancoragem da proteína à membrana citoplasmática da membrana celular. Os radicais de imobilização de aminoácido capazes de prover uma âncora GPI incluem, mas não se limitam a, aqueles associados com/derivados de uma proteína SED1 (apresentando, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12, uma variante desta ou um fragmento desta ou sendo codificado pela sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 11), uma proteína TIR1 (apresentando, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14, uma variante desta ou um fragmento desta ou sendo codificada pela
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36/108 sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 13), uma proteína CWP2 (apresentando, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16, uma variante desta ou um fragmento desta ou sendo codificada pela sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 15), uma proteína CCW12 (apresentando, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18 ou 84, uma variante destas ou um fragmento destas ou sendo codificada pela sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 17), uma proteína SPI1 (apresentando, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20 ou 74, uma variante destas ou um fragmento destas ou sendo codificada pela sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 19), uma proteína PST1 (apresentando, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22, uma variante desta ou um fragmento desta ou sendo codificada pela sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 21) ou uma combinação de uma proteína AGA1 e uma proteína AGA2 (apresentando, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24, uma variante desta ou um fragmento desta ou sendo codificada pela sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 23 ou apresentando, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26, uma variante desta ou um fragmento desta ou sendo codificada pela sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 25). Em uma realização, o radical de imobilização provê uma âncora GPI e, em ainda uma realização adicional, o radical de imobilização é derivado da proteína SPI1 (apresentando, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20, uma variante desta ou um fragmento desta ou sendo codificada pela sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 19) ou a proteína CCW12 (apresentando, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18, uma variante desta ou um fragmento desta ou sendo codificada pela sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 17).
[0066] Em uma realização, o radical de imobilização é um fragmento da proteína SPI1 que reteve sua capacidade em se localizar na membrana da
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37/108 célula. O fragmento da proteína SP11 compreende menos de 129 resíduos de aminoácidos consecutivos da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 74. Por exemplo, o fragmento do radical de imobilização da proteína SPI1 pode compreender pelo menos 10, 20, 21,30, 40, 50, 51,60, 70, 80, 81, 90, 100, 110, 111 ou 120 resíduos de aminoácidos consecutivos da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 74. Em ainda uma outra realização, o fragmento do radical de imobilização da proteína SPI1 pode compreender ou consistir essencialmente da sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 76, 78, 80 ou 82.
[0067] Em uma outra realização, o radical de imobilização é um fragmento de uma proteína CCW12 que reteve sua capacidade em se localizar na membrana da célula. O fragmento da proteína CCW12 compreende menos de 112 resíduos de aminoácidos consecutivos da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 84. Por exemplo, o fragmento do radical de imobilização da proteína CCW12 pode compreender pelo menos 10, 20, 24, 30, 40, 49, 50, 60, 70, 74, 80, 90, 99, 100 ou 110 resíduos de aminoácidos consecutivos da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 84. Em ainda uma outra realização, o fragmento do radical de imobilização da proteína CCW12 pode compreender ou consistir essencialmente na sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 86, 88, 90 ou 92.
[0068] O radical de imobilização de aminoácido pode ser uma variante de um radical de imobilização de aminoácido conhecido/nativo, por exemplo, uma variante da radical de imobilização de aminoácido apresentando a sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90 ou 92. Uma variante compreende pelo menos um aminoácido de diferença quando em comparação com a sequência de aminoácidos do radical de imobilização de aminoácido nativo. Tal como utilizada aqui, uma variante refere-se a alterações na sequência de aminoácidos que não afeta adversamente as funções
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38/108 biológicas do radical de imobilização de aminoácido (por exemplo, a localização na face externa e a ancoragem da proteína heteróloga na membrana citoplasmática). Uma substituição, inserção ou deleção é dita afetar adversamente a proteína quando a sequência alterada previne ou rompe uma função biológica associada com o radical de imobilização de aminoácido (por exemplo, a localização na face externa e a ancoragem da proteína heteróloga na membrana citoplasmática). Por exemplo, a carga global, estrutura ou propriedades hidrofóbicas ou hidrofílicas da proteína podem ser alteradas sem afetar adversamente uma atividade biológica. Da mesma forma, a sequência de aminoácidos pode ser alterada, por exemplo, para tornar o peptídeo mais hidrofílico ou mais hidrofóbico, sem afetar adversamente as atividades biológicas do radical de imobilização de aminoácido. As variantes do radical de imobilização de aminoácido apresentam pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com os radicais de imobilização de aminoácido descritos aqui. O termo “identidade percentual”, tal como conhecido na técnica, é uma relação entre duas ou mais sequências de polipeptídeo ou duas ou mais sequências de polinucleotídeo, tal como determinada por comparação das sequências. O nível de identidade pode ser determinado convencionalmente utilizando-se programas de computador conhecidos. A identidade pode ser facilmente calculada por métodos conhecidos, incluindo, mas não se limitando a, aqueles descritos em: Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, NY (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, NY (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., e Griffin, H. G., eds.) Humana Press, NJ (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987); e Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. e Devereux, J., eds.) Stockton Press, NY (1991). Os métodos preferidos para a determinação da identidade são projetados para
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39/108 fornecer a melhor combinação entre as sequências testadas. Os métodos para a determinação da identidade e similaridade são codificados em programas de computador disponíveis publicamente. Os alinhamentos de sequência e cálculos de identidade percentual podem ser realizados utilizando-se o programa Megalign da LASERGENE bioinformatics computing suite (DNASTAR Inc., Madison, Wis.). Alinhamentos múltiplos das sequências descritas aqui foram realizados utilizando-se o método Clustal de alinhamento (Higgins e Sharp (1989) CABIOS. 5:151-153) com os parâmetros padrão (GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PEN ALT Y= 10). Os parâmetros padrão para alinhamentos em pares utilizando-se o método Clustal foram KTUPLB 1, GAP PENALTY=3, WINDOW=5 e DIAGONALS SAVED=5.
[0069] A variante dos radicais de imobilização de aminoácido descritos aqui pode ser (i) uma na qual um ou mais dos resíduos de aminoácidos são substituídos com um resíduo de aminoácido conservado ou não conservado (preferivelmente um resíduo de aminoácido conservado) e tal resíduo de aminoácido conservado pode ser ou não um codificado pelo código genético, ou (ii) uma na qual um ou mais dos resíduos de aminoácidos incluem um grupo substituinte, ou (iii) uma na qual o polipeptídeo maduro é fundido com um outro composto, tal como um composto para aumentar a meia vida do polipeptídeo (por exemplo, polietileno glicol), ou (iv) uma na qual os aminoácidos adicionais são fundidos ao polipeptídeo maduro para a purificação do polipeptídeo. Uma “variante” do radical de imobilização de aminoácido pode ser uma variante conservative ou uma variante alélica.
[0070] O radical de imobilização de aminoácido pode ser um fragmento de um radical de imobilização de aminoácido conhecido/nativo ou fragmento de uma variante de um radical de imobilização de aminoácido conhecido/nativo (tal como, por exemplo, um fragmento do radical de imobilização de aminoácido apresentando a sequência de aminoácidos
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40/108 das SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90 ou 92 ou uma variante destas). Os “fragmentos” do radical de imobilização de aminoácido apresentam pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou mais aminoácidos consecutivos do radical de imobilização de aminoácido. Um fragmento compreende pelo menos um resíduo de aminoácido a menos quando em comparação com a sequência de aminoácidos do radical de imobilização de aminoácido conhecido/nativo e ainda possui a atividade biológica do radical de imobilização de aminoácido de comprimento total (por exemplo, a localização na parede celular).
[0071] In realizações nas quais um radical de imobilização de aminoácido é desejável, a proteína heteróloga pode ser provida como uma proteína quimérica expressa pela célula hospedeira de levedura recombinante e apresentando uma das seguintes fórmulas (providas na orientação a partir do terminal amino (NH2) para 0 terminal carboxil (COOH)):
HP-L-TT(I) ou TT-L - HP (II) [0072] Em ambas estas fórmulas, 0 resíduo “HP” refere-se ao radical da proteína heteróloga, 0 resíduo “L” refere-se à presença de um ligante opcional enquanto 0 resíduo “TT” refere-se a um radical de imobilização de aminoácido. Nas proteínas quiméricas de fórmula (I), 0 terminal amino do imobilizador de aminoácido é localizado (diretamente ou indiretamente) no terminal carboxil (COOH ou C) do radical da proteína heteróloga. Na proteína quiméricas de fórmula (II), 0 terminal carboxi do imobilizador de aminoácido é localizado (diretamente ou indiretamente) no terminal amino (NH2 ou N) d radical da proteína heteróloga.
[0073] Quando 0 ligante de aminoácido (L) está ausente, 0 radical de imobilização de aminoácido é diretamente associado com a proteína heteróloga. Nas quimeras de fórmula (I), isto significa que 0 terminal carboxil do radical da proteína heteróloga é diretamente associado (com
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41/108 uma ligação amido) ao terminal amino do radical de imobilização de aminoácido. Nas quimeras de fórmula (II), isto significa que o terminal carboxil do radical de imobilização de aminoácido está diretamente associado (com uma ligação amido) ao terminal amino da proteína heteróloga.
[0074] Em algumas realizações, a presença de um ligante de aminoácido (L) é desejável ou para prover, por exemplo, alguma flexibilidade entre o radical da proteína heteróloga e o radical de imobilização de aminoácido ou para facilitar a construção da molécula de ácido nucleico heteróloga. Tal como utilizado no presente relatório, o “ligante de aminoácido” ou “L” refere-se a uma extensão de um ou mais aminoácidos separando o radical da proteína heteróloga HP e o radical de imobilização de aminoácido TT (por exemplo, ligando indiretamente a proteína heteróloga HP ao radical de imobilização de aminoácido TT). É preferido que o ligante de aminoácido seja neutro, por exemplo, não interfira com a atividade biológica da proteína heteróloga nem com a atividade biológica do radical de imobilização de aminoácido. Em algumas realizações, o ligante de aminoácido L pode aumentar a atividade biológica do radical da proteína heteróloga e/ou do radical de imobilização de aminoácido. Nos casos em que o ligante (L) está presente nas quimeras de fórmula (I), sua extremidade amino está associada (com uma ligação amido) à extremidade carboxil do radical da proteína heteróloga e sua extremidade carboxil está associada (com uma ligação amido) à extremidade amino do radical de imobilização de aminoácido. Nos casos em que o ligante (L) está presente nas quimeras de fórmula (II), sua extremidade amino está associada (com uma ligação amido) à extremidade carboxil do radical de imobilização de aminoácido e sua extremidade carboxil está associada (com uma ligação amido) à extremidade amino do radical da proteína heteróloga. Existem vários ligantes de aminoácido e incluem, sem limitação, (G)n, (GS)n; (GGS)n; (GGGS)n; (GGGGS)n; (GGSG)n; (GSAT)n, onde n = é um número inteiro
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42/108 entre 1 e 8 (ou mais). Em uma realização, o ligante de aminoácido L é (GGGGS)n (também chamado de G4S) e, em ainda realizações adicionais, 0 ligante de aminoácido L compreende mais de um motivo G4S (SEQ ID NO: 41). Por exemplo, 0 ligante de aminoácido L pode ser (G4S)s e apresentar a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 93. Em um outro exemplo, 0 ligante de aminoácido L pode ser (G)e e apresentar a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 94. Em ainda um outro exemplo, 0 ligante de aminoácido L pode ser (G4S)e e apresentar a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 95.
[0075] O ligante de aminoácido pode ser também, em algumas realizações, GSAGSAAGSGEF (SEQ ID NO: 96).
[0076] Existem ligantes de aminoácidos adicionais e incluem, sem limitações, (EAAK)n e (EAAAK)n, onde n = é um número inteiro entre 1 e 8 (ou mais). Em algumas realizações, 0 um ou mais motivos (EAAK)n/(EAAAK)n podem ser separados por um ou mais resíduos de aminoácidos adicionais. Em uma realização, 0 ligante de aminoácido compreende um ou mais motivos EA2K (SEQ ID NO: 100) ou EA3K (SEQ ID NO: 101). Em uma realização, 0 ligante de aminoácido pode ser (EAAK)s e apresenta a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 97. Em uma outra realização, 0 ligante de aminoácido pode ser (A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A) e apresenta a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 99.
[0077] Ligantes de aminoácidos adicionais incluem aqueles apresentando um ou mais motivos (AP)n onde n = é um número inteiro entre 1 e 10 (ou mais). Em uma realização, 0 ligante é (AP)weapresenta a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 98.
[0078] Em algumas realizações, 0 ligante inclui também uma ou mais etiquetas HA (SEQ ID NO: 53).
Ferramentas para se obter a célula hospedeira de levedura recombinante
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43/108 [0079] De maneira a se obter as células hospedeiras de levedura recombinante, são obtidas moléculas de ácido nucleico heterólogas (também referidas como cassetes de expressão) in vitro e introduzidas na célula hospedeira de levedura de maneira a permitir a expressão recombinante da proteína heteróloga.
[0080] As moléculas de ácido nucleico heterólogas do presente relatório compreendem uma região de codificação para o polipeptídeo heterólogo, por exemplo, a proteína heteróloga ou a proteína quimérica as compreendendo. Uma “região de codificação” de DNA ou RNA é uma molécula de DNA ou RNA (preferivelmente uma molécula de DNA) que é transcrita e/ou traduzida em uma proteína heteróloga em uma célula in vitro ou in vivo quando colocada sob o controle de sequências reguladoras apropriadas. “Regiões reguladoras adequadas” refere-se a regiões do ácido nucleico localizadas a montante (sequências não codificantes 5'), dentro, ou a jusante (sequências não codificantes 3') de uma região de codificação, e que influenciam na transcrição, no processamento ou estabilidade do RNA, ou na tradução da região de codificação associada. As regiões reguladoras podem incluir promotores, sequências líder de tradução, sítio de processamento de RNA, sítio de ligação a efetor e estrutura haste-alça. Os limites da região de codificação são determinados por um códon de iniciação no terminal 5' (amino) e um códon de terminação de tradução no terminal 3' (carboxil). Uma região de codificação pode incluir, mas não se limitando a, regiões procarióticas, cDNA de mRNA, moléculas de DNA genômico, moléculas de DNA sintéticas, ou moléculas de RNA. Se a região de codificação é destinada para a expressão em uma célula eucariótica, um sinal de poliadenilação e transcrição será usualmente localizado do terminal 3' para a região de codificação. Em uma realização, a região de codificação pode ser referida como um quadro de leitura aberto. “Quadro de leitura aberto” é abreviado por ORF e significa um comprimento de ácido nucleico, seja DNA, cDNA ou RNA, que
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44/108 compreende um sinal de iniciação de tradução ou códon de iniciação, tal como um ATG ou AUG, e um códon de terminação e pode ser potencialmente traduzido em uma sequência de polipeptídeo.
[0081] As moléculas de ácido nucleico heterólogas descritas aqui pode compreender regiões de controle de transcrição e/ou de tradução. “Regiões de controle de transcrição e de tradução” são regiões reguladoras de DNA, tais como promotores, amplificadores, terminadores e semelhantes, que provêm para a expressão de uma região de codificação em uma célula hospedeira. Em células eucarióticas, os sinais de poliadenilação são regiões de controle.
[0082] Em algumas realizações, as moléculas de ácido nucleico heterólogas do presente relatório incluem um promotor, bem como uma sequência de codificação para uma proteína heteróloga (incluindo proteínas quiméricas as compreendendo). A sequência de ácidos nucleicos heteróloga pode incluir também um terminador. Nas moléculas de ácido nucleico heterólogas do presente relatório, o promotor e o terminador (quando presentes) são operacionalmente ligados à sequência de ácidos nucleicos de codificação da proteína heteróloga (incluindo proteínas quiméricas as compreendendo), por exemplo, controlam a expressão e a terminação da expressão da sequência de ácidos nucleicos da proteína heteróloga (incluindo proteínas quiméricas as compreendendo). As moléculas de ácido nucleico heterólogas do presente relatório podem incluir também um ácido nucleico que codifica para um peptídeo sinalizador, por exemplo, uma sequência peptídica curta para exportar a proteína heteróloga para fora da célula hospedeira. Quando presente, a sequência de ácidos nucleicos que codifica para o peptídeo sinalizador é localizada diretamente a montante e está em quadro com a sequência de ácidos nucleicos que codifica para a proteína heteróloga (incluindo proteínas quiméricas as compreendendo).
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45/108 [0083] Na molécula de ácido nucleico heteróloga descrita aqui, o promotor e a molécula de ácido nucleico que codifica para a proteína heteróloga (incluindo proteínas quiméricas as compreendendo) são ligados operacionalmente entre si. No contexto do presente relatório, as expressões “ligado operacionalmente” ou ‘Operacionalmente associado” referem-se ao fato do promotor estar fisicamente associado à molécula de ácido nucleico que codifica para o polipeptídeo heterólogo em uma maneira que permite, sob certas condições, para a expressão da proteína heteróloga a partir da molécula de ácido nucleico. Em uma realização, o promotor pode ser localizado a montante (5’) da sequência de ácidos nucleicos que codifica para a proteína heteróloga. Em ainda uma outra realização, o promotor pode ser localizado a jusante (3’) da sequência de ácidos nucleicos que codifica para a proteína heteróloga. No contexto do presente relatório, um ou mais de um promotor podem ser incluídos na molécula de ácido nucleico heteróloga. Quando mais de um promotor é incluído na molécula de ácido nucleico heteróloga, cada um dos promotores é ligado operacionalmente à sequência de ácidos nucleicos que codifica para a proteína heteróloga. Os promotores podem ser localizados, em relação à molécula de ácido nucleico que codifica para a proteína heteróloga, a montante, a jusante, bem como tanto a montante quanto a jusante.
[0084] “Promotor” refere-se a um fragmento de DNA capaz de controlar a expressão de uma sequência de codificação ou RNA funcional. O termo “expressão,” tal como utilizado aqui, refere-se à transcrição e acúmulo estável em senso (mRNA) a partir da molécula de ácido nucleico heteróloga descrita aqui. Expressão pode se referir também à tradução do mRNA em um polipeptídeo. Os promotores podem ser derivados em sua totalidade de um gene nativo, ou serem compostos de diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados na natureza, ou mesmo compreenderem segmentos de DNA sintético. Deve ser
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46/108 entendido pelos técnicos no assunto que promotores diferentes podem direcionar a expressão em estágios diferentes de desenvolvimento, ou em resposta a diferentes condições ambientais ou fisiológicas. Os promotores que fazem com que um gene seja expresso na maioria das células na maioria das vezes a um nível similar substancial são comumente chamados de “promotores constitutivos”. Os promotores que fazem com que um gene seja expresso durante a fase de propagação de uma célula de levedura são aqui chamados de “promotores de propagação”. Os promotores de propagação incluem promotores tanto constitutivos quanto induzíveis, tais como, por exemplo, promotores regulados por glicose, regulados por melaços, de resposta a estresse (incluindo promotores de resposta a estresse osmótico) e promotores regulados aeróbicos. No contexto do presente relatório, é importante que o promotor selecionado permita a expressão da molécula de ácido nucleico heteróloga durante a fase de propagação da célula hospedeira de levedura recombinante de maneira a permitir uma quantidade suficiente de proteína heteróloga associada a células seja expressa. É adicionalmente reconhecido que, uma vez que na maioria dos casos os limites exatos das sequências reguladoras não foram completamente definidos, fragmentos de DNA de diferentes comprimentos podem apresentar atividades de promotor idênticas. Um promotor é geralmente ligado em seu terminal 3' por um sítio de iniciação de transcrição e se estende a montante (direção 5') para incluir o número mínimo de bases ou elementos necessários ao início da transcrição a níveis detectáveis acima do fundo. Dentro do promotor será encontrado um sítio de iniciação de transcrição (convenientemente definido, por exemplo, pelo mapeamento com a nuclease S1), bem como domínios de ligação a proteína (sequências consenso) responsáveis pela ligação da polimerase.
[0085] O promotor pode ser nativo ou heterólogo à molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo heterólogo. O promotor pode ser
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47/108 heterólogo ou derivado de uma cepa do mesmo gênero ou espécie do da célula hospedeira recombinante. Em uma realização, o promotor é derivado do mesmo gênero ou espécie do da célula hospedeira de levedura e o polipeptídeo heterólogo é derivado de um gênero diferente do da célula hospedeira. O promotor pode ser um promotor único ou uma combinação de diferentes promotores.
[0086] No presente relatório, são preferidos os promotores que permitem ou favorecem a expressão das proteínas heterólogas durante a fase de propagação das células hospedeiras de levedura recombinante. Leveduras que são aeróbicas facultativas são capazes de reprodução respiratória sob condições aeróbicas e reprodução fermentativa sob condições anaeróbicas. Em muitas aplicações comerciais, as leveduras são propagadas sob condições aeróbicas de maneira a maximizar a conversão de um substrato a biomassa. Opcionalmente, a ‘biomassa pode ser utilizada em uma fermentação subsequente sob condições anaeróbicas para produzir um metabólito desejado. No contexto do presente relatório, é importante que o promotor ou a combinação de promotores presente no ácido nucleico heteróloga seja capaz de permitir a expressão da proteína heteróloga ou sua quimera correspondente durante a fase de propagação da célula hospedeira de levedura recombinante. Isto irá permitir o acúmulo da proteína heteróloga associada com a célula hospedeira de levedura recombinante antes de qualquer uso subsequente em uma fermentação (se houver). Em algumas realizações, o promotor permite a expressão da proteína heteróloga ou sua quimera correspondente durante a fase de propagação, mas não durante a fase de fermentação (se houver) do ciclo de vida da célula hospedeira de levedura recombinante.
[0087] Os promotores podem ser nativos ou heterólogos ao gene heterólogo que codifica a proteína heteróloga. Os promotores que podem ser incluídos na molécula de ácido nucleico heteróloga podem ser promotores constitutivos ou induzíveis (tais como aqueles descritos em
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Perez-Torrado et al., 2005). Os promotores induzíveis incluem, mas não se limitam a, promotores regulados por glicose (por exemplo, o promotor do gene hxt7 (chamado de hxt7p) e apresentam a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 30, uma variante funcional ou um fragmento funcional desta; o promotor do gene ctt1 (referido como cttlp) e apresentando a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 60, uma variante funcional ou um fragmento funcional desta; o promotor do gene glo1 (referido como glo1 p) e apresentando a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 59, uma variante funcional ou um fragmento funcional desta; o promotor do gene ygp1 (referido como ygplp) e apresentando a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 61, uma variante funcional ou um fragmento funcional desta; o promotor do gene gsy2 (referido como gsy2p) e apresentando a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 53, uma variante funcional ou um fragmento funcional desta), promotores regulados por melaços (por exemplo, o promotor do gene mol1 (referido como mol1p) descrito em Praekelt et al., 1992 ou apresentando a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 64, uma variante funcional ou um fragmento funcional desta), promotores regulados por choque térmico (por exemplo, o promotor do gene glo1 (referido como glolp) e apresentando a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 59, uma variante funcional ou um fragmento funcional desta; o promotor do gene sti1 (referido como stilp) e apresentando a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 56, uma variante funcional ou um fragmento funcional desta; o promotor do gene ygp1 (referido como ygplp) e apresentando a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 61, uma variante funcional ou um fragmento funcional desta; o promotor do gene gsy2 (referido como gsy2p) e apresentando a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 53, uma variante funcional ou um fragmento funcional desta), promotores de resposta a estresse oxidativo (por exemplo, o promotor do gene cup1 (referido como cup1 p) e apresentando a sequência de ácidos nucleicos da
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SEQ ID NO: 58, uma variante funcional ou um fragmento funcional desta; o promotor do gene ctt1 (referido como cttlp) e apresentando a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 60, uma variante funcional ou um fragmento funcional desta; o promotor do gene trx2 (referido como trx2p) e apresentando a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 55, uma variante funcional ou um fragmento funcional desta; o promotor do gene gpcH (referido como gpdlp) e apresentando a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 57, uma variante funcional ou um fragmento funcional desta; o promotor do gene hsp12 (referido como hsp12p) e apresentando a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 63, uma variante funcional ou um fragmento funcional desta), promotores de resposta a estresse osmótico (por exemplo, o promotor do gene ctt1 (referido como cttlp) e apresentando a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 60, uma variante funcional ou um fragmento funcional desta; o promotor do gene glo1 (referido como glo1 p) e apresentando a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 59, uma variante funcional ou um fragmento funcional desta; o promotor do gene gpcH (referido como gpd1 p) e apresentando a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 57, uma variante funcional ou um fragmento funcional desta; o promotor do gene ygp1 (referido como ygplp) e apresentando a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 61, uma variante funcional ou um fragmento funcional desta) e promotores regulados por nitrogênio (por exemplo, o promotor do gene ygp1 (referido como ygp1 p) e apresentando a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 61, uma variante funcional ou um fragmento funcional desta).
[0088] Promotores que podem ser incluídos na molécula de ácido nucleico heteróloga do presente relatório incluem, sem limitação, o promotor do gene tdh1 (referido como tdhlp e apresentando, por exemplo, a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 27, uma variante funcional ou um fragmento funcional desta), do gene hor7 (referido como hor7p e
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50/108 apresentando, por exemplo, a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 28, uma variante funcional ou um fragmento funcional desta), do gene hsp150 (referido como hsp150p e apresentando, por exemplo, a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 29, uma variante funcional ou um fragmento funcional desta), do gene hxt7 (referido como hxt7p e apresentando, por exemplo, a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 30, uma variante funcional ou um fragmento funcional desta), do gene gpm1 (referido como gpm1 p e apresentando, por exemplo, a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 31, uma variante funcional ou um fragmento funcional desta), do gene pgk1 (referido como pgklp e apresentando, por exemplo, a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 32, uma variante funcional ou um fragmento funcional desta) e/ou do gene stl1 (referido como stHp e apresentando, por exemplo, a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 33, uma variante funcional ou um fragmento funcional desta). Em uma realização, o promotor é ou compreende o tdhlp e/ou o hor7p. Em ainda uma outra realização, o promotor compreende ou consiste essencialmente no tdhlp e no hor7p. Em uma realização adicional, o promotor é o thdlp.
[0089] Um ou mais promotores podem ser utilizados para permitir a expressão de cada um dos polipeptídeos heterólogos na célula hospedeira de levedura recombinante. No contexto do presente relatório, a expressão “fragmento funcional de um promotor” quando utilizada em combinação com um promotor refere-se a uma sequência de ácidos nucleicos mais curta que a do promotor nativo que retém a capacidade de controlar a expressão da sequência de ácidos nucleicos que codifica a proteína heteróloga ou sua quimera durante a fase de propagação das células hospedeiras de levedura recombinante. Usualmente, fragmentos funcionais são ou truncamentos 5’ e/ou 3’ em um ou mais resíduos de ácido nucleico da sequência de ácidos nucleicos nativa do promotor.
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51/108 [0090] Em algumas realizações, as moléculas de ácido nucleicos incluem uma ou uma combinação de sequências terminadoras na extremidade de tradução da proteína heteróloga (ou da proteína quimérica as compreendendo). O terminador pode ser nativo ou heterólogo à sequência de ácidos nucleicos que codifica a proteína heteróloga ou sua quimera correspondente. Em algumas realizações, um ou mais terminadores podem ser utilizados. Em algumas realizações, o terminador compreende o terminador derivado do gene dit1 (referido como ditlt e pode apresentar, por exemplo, a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 34, uma variante funcional ou um fragmento funcional desta), do gene idp1 (referido como idplt e pode apresentar, por exemplo, a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 35, uma variante funcional ou um fragmento funcional desta), do gene gpm1 (referido como gpmlt e pode apresentar, por exemplo, a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 36, uma variante funcional ou um fragmento funcional desta), do gene pma1 (referido como pmalt e pode apresentar, por exemplo, a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 37, uma variante funcional ou um fragmento funcional desta), do gene tdh3 (referido como tdh3t e pode apresentar, por exemplo, a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 38, uma variante funcional ou um fragmento funcional desta), do gene hxt2 (referido como hxt2t e pode apresentar, por exemplo, a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 39, uma variante funcional ou um fragmento funcional desta), do gene adh3 (referido como adh3t e pode apresentar, por exemplo, a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 70, uma variante funcional ou um fragmento funcional desta), e/ou do gene ira2 (referido como ira2t e pode apresentar, por exemplo, a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 40, uma variante funcional ou um fragmento funcional desta). Em uma realização, o terminador compreende ou é derivado do gene dit1 (referido como ditlt e pode apresentar, por exemplo, a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 34, uma variante
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52/108 funcional ou um fragmento funcional desta). Em uma outra realização, o terminador compreende ou é derivado do gene adh3 (e pode apresentar, por exemplo, a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 70, uma variante funcional ou um fragmento funcional desta). No contexto do presente relatório, a expressão “variante funcional de um terminador” refere-se a uma sequência de ácidos nucleicos que foi substituída em pelo menos uma posição do ácido nucleico quando em comparação com o terminador nativo que retém a capacidade de finalizar a expressão da sequência de ácidos nucleicos que codifica para a proteína heteróloga ou sua quimera correspondente. No contexto do presente relatório, a expressão “fragmento funcional de um terminador” refere-se a uma sequência de ácidos nucleicos mais curta que a do terminador nativo que retém a capacidade de finalizar a expressão da sequência de ácidos nucleicos que codifica para a proteína heteróloga ou sua quimera correspondente.
[0091] Em algumas realizações, as moléculas de ácido nucleico heterólogas incluem um ou uma combinação de sequências sinalizadoras que permitem a exportação da proteína heteróloga (ou da proteína quimérica a compreendendo) para fora da parede de célula hospedeira de levedura. A sequência sinalizadora pode ser simplesmente adicionada à molécula de ácido nucleico (usualmente no quadro com a sequência que codifica a proteína heteróloga) ou substituir a sequência sinalizadora já presente na proteína heteróloga. A sequência sinalizadora pode ser nativa ou heteróloga à sequência de ácidos nucleicos que codifica a proteína heteróloga ou sua quimera correspondente. Em algumas realizações, uma ou mais sequências sinalizadoras podem ser utilizadas. Em algumas realizações, a sequência sinalizadora é do mesmo gene que codifica a proteína invertase (e pode apresentar, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 68, ser uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 68 ou ser um fragmento da sequência de
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53/108 aminoácidos da SEQ ID NO: 68), a proteína AGA2 (e pode apresentar, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 69, ser uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 69 ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 69) ou a amilase fúngica (e pode apresentar, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 107, ser uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 107 ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 107). No contexto do presente relatório, a expressão “variante funcional de uma sequência sinalizadora” refere-se a uma sequência de ácidos nucleicos que foi substituída em pelo menos uma posição de ácido nucleico quando em comparação com a sequência sinalizadora nativa que retém a capacidade de direcionar a expressão da enzima heteróloga para alimento e/ou para ração ou sua quimera correspondente para fora da célula. No contexto do presente relatório, a expressão “fragmento funcional de uma sequência sinalizadora” refere-se a uma sequência de ácidos nucleicos mais curta que a sequência sinalizadora nativa que retém a capacidade de direcionar a expressão da enzima heteróloga para alimento e/ou para ração ou sua quimera correspondente para fora da célula.
[0092] Em algumas realizações nas quais é desejável expressar a proteína heteróloga no interior da célula hospedeira de levedura recombinante, a molécula de ácido nucleico heteróloga pode excluir a parte que codifica para a sequência sinalizadora que é encontrada no gene nativo que codifica a enzima para alimento e/ou para ração.
[0093] A molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica a proteína heteróloga, quimera, variante ou fragmento desta pode ser integrada no genoma da célula hospedeira de levedura. O termo “integrada”, tal como utilizada aqui, refere-se a elementos genéticos que são colocados, por meio de técnicas de biologia molecular, no genoma de uma célula hospedeira. Por exemplo, os elementos genéticos podem ser colocados nos cromossomos da célula hospedeira em oposição a em um vetor tal
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54/108 como um plasmídeo contido na célula hospedeira. Os métodos para a integração de elementos genéticos no genoma de uma célula hospedeira são bem conhecidos na técnica e incluem recombinação homóloga. A molécula de ácido nucleico heteróloga pode estar presente em uma ou mais cópias no genoma da célula hospedeira de levedura. Alternativamente, a molécula de ácido nucleico heteróloga pode ser de replicação independente do genoma da levedura. Em tal realização, a molécula de ácido nucleico pode ser de replicação estável de auto replicação.
[0094] O presente relatório provê também moléculas de ácido nucleicos para a modificação da célula hospedeira de levedura de maneira a permitir a expressão das proteínas heterólogas, quimeras, variantes ou fragmentos destas. A molécula de ácido nucleico pode ser DNA (tal como DNA complementar, DNA sintético ou DNA genômico) ou RNA (o que inclui RNA sintético) e pode ser provida em uma forma de fita única (em fita senso ou em fita anti-senso) ou de fita dupla. As moléculas de ácido nucleicos podem incluir alterações nas regiões de codificação, regiões de não codificação, ou ambas. Exemplos são variantes de molécula de ácido nucleico contendo alterações que produzem substituições, adições ou deleções silenciosas, mas que não alteram as propriedades ou atividades das proteínas heterólogas, quimeras, variantes ou fragmentos codificados. [0095] Em algumas realizações, as moléculas de ácido nucleico heterólogas que podem ser introduzidas nas células hospedeiras recombinantes são otimizadas para códon em relação à célula hospedeira de levedura recombinante receptora pretendida. Tal como utilizado aqui, o termo “região de codificação otimizada para códon” significa uma região de codificação de ácido nucleico que foi adaptada para a expressão nas células de um dado organismo pela substituição de pelo menos um, ou mais de um, códon com um ou mais códons que são mais frequentemente utilizados nos genes deste organismo. Em geral, genes altamente
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55/108 expressos em um organismo são desviados na direção dos códons que são reconhecidos pela espécie mais abundante de tRNA neste organismo. Uma medida desde desvio é o “índice de adaptação de códon” ou “CAI”, que mede a extensão na qual os códons utilizados para codificar cada aminoácido em um gene particular são aqueles que ocorrem mais frequentemente em um conjunto de referência de genes altamente expressos de um organismo. O CAI da molécula de ácido nucleico heteróloga otimizada para códon descrita aqui corresponde a entre cerca de 0,8 e 1,0, entre cerca de 0,8 e 0,9, ou cerca de 1,0.
[0096] As moléculas de ácido nucleico heterólogas podem ser introduzidas na célula hospedeira de levedura utilizando-se um vetor. Um “vetor”, por exemplo, um “plasmídeo”, “cosmídeo” ou “cromossomo artificial” (tal como, por exemplo, um cromossomo artificial de levedura) refere-se a um elemento extra cromossômico e é usualmente na forma de uma molécula de DNA circular de fita dupla. Tais vetores podem ser sequências de replicação autônoma, sequências de integração em genoma, fago ou sequências de nucleotídeos, linear, circular, ou super enrolada, de um DNA ou RNA de fita única ou dupla, derivados de qualquer fonte, nos quais um número de sequências de nucleotídeos foram unidas ou recombinadas em uma construção única que é capaz de introduzir um fragmento de promotor e sequência de DNA para um produto genético selecionado juntamente com uma sequência não traduzida 3' apropriada em uma célula.
[0097] O presente relatório provê também moléculas de ácido nucleicos que são hibridizáveis para as moléculas de ácido nucleicos complementares que codificam os polipeptídeos heterólogos, bem como variantes ou fragmentos. Uma molécula de ácido nucleico é “hibridizável” a uma outra molécula de ácido nucleico, tal como um cDNA, DNA genômico ou RNA, quando uma forma em fita única da molécula de ácido nucleico pode anelar a uma outra molécula de ácido nucleico sob condições apropriadas de temperatura e força iônica da solução. As
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56/108 condições de hibridização e lavagem são bem conhecidas e exemplifica, por exemplo, em Sambrook, J., Fritsch, E. F. e Maniatis, T. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989), particularmente o Capítulo 11 e Tabela 11.1. As condições de temperatura e força iônica determinam o “rigor” da hibridização. As condições de rigor podem ser ajustadas para rastrear fragmentos moderadamente similares, tais como sequências homólogas de organismos distantemente relacionados, para fragmentos altamente similares, tais como genes que duplicam enzimas funcionais de organismos proximamente relacionados. Lavagens posteriores à hibridização determinam as condições de rigor. Um conjunto de condições utiliza uma série de lavagens começando com 6X SSC, 0,5% SDS à temperatura ambiente por 15 min, então repetidas com 2X SSC, 0,5% SDS a 45°C por 30 min, e então repetidas com 0,2X SSC, 0,5% SDS a 50°C por 30 min. Para condições mais rigorosas, as lavagens são realizadas a temperaturas mais altas nas quais as lavagens são idênticas às lavagens acima exceto que a temperatura das duas lavagens finais de 30 min em 0,2X SSC, 0,5% SDS são aumentadas para 60°C. Um outro conjunto de condições altamente rigorosas utiliza duas lavagens finais em 0,1X SSC, 0,1% SDS a 65°C. Um conjunto adicional de condições rigorosas é definido pela hibridização a 0,1X SSC, 0,1% SDS, 65°C e lavagem com 2X SSC, 0,1% SDS seguida de 0,1 X SSC, 0,1% SDS.
[0098] A hibridização requer que as duas moléculas de ácido nucleico contenham sequências complementares, embora dependendo do rigor da hibridização, desencontros entre bases sejam possíveis. O rigor apropriado para a hibridização de ácidos nucleicos depende do comprimento dos ácidos nucleicos e do grau de complementaridade, variáveis bem conhecidas na técnica. Quanto maior for o grau de similaridade ou homologia entre as duas sequências de nucleotídeos, maior o valor de Tm para híbridos de ácidos nucleicos apresentando estas
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57/108 sequências. A estabilidade relativa (correspondendo a Tm mais alta) das hibridizações de ácido nucleico se reduz na seguinte ordem: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. Para híbridos de mais de 100 nucleotídeos de comprimento, foram derivadas equações para o cálculo de Tm. Para hibridizações com ácidos nucleicos mais curtos, isto é, oligonucleotídeos, a posição dos desencontros se torna mais importante, e o comprimento do oligonucleotídeo determina sua especificidade. Em uma realização, o comprimento para um ácido nucleico hibridizável é de pelo menos cerca de 10 nucleotídeos. Preferivelmente, um comprimento mínimo para um ácido nucleico hibridizável é de pelo menos cerca de 15 nucleotídeos; mais preferivelmente de pelo menos cerca de 20 nucleotídeos; e o mais preferido sendo o comprimento de pelo menos 30 nucleotídeos. Além disto, o técnico no assunto irá reconhecer que a temperatura e a concentração salina na solução de lavagem podem ser ajustadas de acordo com fatores tais como comprimento da sonda.
Composição de leveduras e processos para a preparação de composição de leveduras [0099] Conforme indicado aqui, o presente relatório permite a preparação de uma composição de levedura a partir da célula hospedeira de levedura recombinante do presente relatório. Em uma realização, a composição de levedura compreende pelo menos 0,1,0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0% em peso ou mais da proteína heteróloga quando em comparação com as proteínas totais da composição de levedura. Em uma realização específica, a composição de levedura compreende pelo menos 0,2% em peso da proteína heteróloga quando em comparação com as proteínas totais da composição de levedura. Em uma outra realização, a composição de levedura compreende pelo menos 0,001, 0,002, 0,003, 0,004, 0,005, 0,006, 0,007, 0,008, 0,009, 0,01,0,011,0,012, 0,013, 0,014, 0,015, 0,016, 0,017, 0,018, 0,019, 0,02, 0,021, 0,022, 0,023, 0,024, 0,025 g ou mais da proteína
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58/108 heteróloga / g de proteínas totais da célula hospedeira de levedura recombinante. Em uma realização específica, a composição de levedura compreende pelo menos 0,02 g da proteína heteróloga / g de proteínas totais da célula hospedeira de levedura recombinante. Em ainda uma outra realização, A composição de levedura compreende pelo menos 0,05, 0,075, 0,1,0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5% em peso ou mais da proteína heteróloga quando em comparação com o peso total da célula hospedeira de levedura recombinante. Em ainda uma outra realização, a composição de levedura compreende pelo menos 0,1% em peso da proteína heteróloga quando em comparação com o peso total da célula hospedeira de levedura recombinante. Em ainda uma realização adicional, a composição de levedura compreende pelo menos 0,0005, 0,0006, 0,0007, 0,0008, 0,0009, 0,001, 0,0011, 0,0012, 0,0013, 0,0014, 0,0015, 0,0016, 0,0017, 0,0018, 0,0019, 0,002, 0,003, 0,004, 0,005, 0,006, 0,007, 0,008, 0,009, 0,01 g ou mais da proteína heteróloga quando em comparação com o peso seco da célula hospedeira de levedura recombinante. Em uma realização específica, a composição de levedura compreende pelo menos 0,0011 g da proteína heteróloga / g (peso seco) da célula hospedeira de levedura recombinante. Em uma realização na qual a célula hospedeira de levedura recombinante é formulada como um creme de levedura, o creme de levedura compreende pelo menos 45, 46, 47, 48, 49, 50, 50,2, 51, 52, 53, 54, 55% em peso ou mais da proteína heteróloga quando em comparação com o peso total do creme de levedura. Em uma realização específica, o creme de levedura compreende pelo menos 50,2% em peso da proteína heteróloga quando em comparação com o peso total do creme de levedura. Tais realizações reduz ou dispensa o requerimento de suplementação da composição de levedura com uma proteína exógena (tal como uma enzima exógena) em uma etapa subsequente de fermentação. Em uma outra realização na qual a proteína heteróloga é uma enzima heteróloga, o presente relatório provê processos,
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59/108 bem como composição de leveduras apresentando uma atividade enzimática mínima específica e/ou uma faixa específica de atividade enzimática. Por exemplo, a composição de levedura pode compreender uma quantidade mínima de atividade enzimática que pode prover uma atividade enzimática mínima/g de peso celular seco, o qual pode ser, por exemplo, de pelo menos 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000 ou mais unidades de atividade enzimática / g de peso celular seco. Em uma realização específica, a composição de levedura pode compreender uma quantidade mínima de atividade enzimática de pelo menos cerca de 300 unidades de atividade enzimática / g de peso celular seco. Alternativamente ou em combinação, a composição de levedura pode prover uma atividade enzimática mínima / g ou mg da total proteína da célula hospedeira de levedura recombinante, a qual pode ser, por exemplo, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 ou mais unidades de atividade enzimática / g ou mg de proteínas totais da célula hospedeira de levedura recombinante. Em uma realização específica, a composição de levedura pode compreender uma quantidade mínima de atividade enzimática de pelo menos cerca de 200 unidades de atividade enzimática / g ou mg de proteínas totais da célula hospedeira de levedura recombinante. Em um outro exemplo, quando a enzima heteróloga é uma amilase tal como uma amilase maltogênica, a composição de levedura pode compreender uma quantidade mínima de atividade de amilase maltogênica (por exemplo, medida como MANU / g de peso seco da composição de levedura) que pode ser, por exemplo, de pelo menos cerca de 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000 ou mais MANU / g de peso celular seco ou 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 ou mais MANU / g de proteínas totais da
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60/108 célula hospedeira de levedura recombinante. Em uma realização específica, a composição de levedura pode compreender uma quantidade mínima de atividade de amilase maltogênica (por exemplo, medida como MANU / g de peso seco da composição de levedura) a qual pode ser de pelo menos cerca de 1000 MANU / g de peso celular seco de proteínas totais da célula hospedeira de levedura recombinante. Em ainda um outro exemplo, quando a enzima heteróloga é uma amilase tal como uma glucoamilase, a composição de levedura pode compreender uma quantidade mínima de atividade de glucoamilase (por exemplo, medida como unidades de atividade de glucoamilase / g de peso seco da composição de levedura), a qual pode ser de, por exemplo, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000 ou mais de unidades de glucoamilase / g de peso celular seco. Por exemplo, quando a enzima heteróloga é uma amilase tal como uma glucoamilase, a composição de levedura pode compreender uma quantidade mínima de 300 unidades de glucoamilase / g de peso celular seco. Em uma realização adicional, quando a enzima heteróloga é uma amilase tal como uma alfa-amilase, a composição de levedura pode compreender uma quantidade mínima de atividade de alfa-amilase (por exemplo, medida como unidades de atividade de alfa-amilase / g de peso seco da composição de levedura), a qual pode ser, por exemplo, de 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000 ou mais unidades de alfa-amilase / g de peso celular seco. Por exemplo, quando a enzima heteróloga é uma amilase tal como uma alfa-amilase, a composição de levedura pode compreender uma quantidade mínima de 300 unidades de alfa-amilase / g de peso celular seco. Em ainda uma outra realização, quando a enzima heteróloga é uma fosfatase tal como uma fitase, a composição de levedura pode compreender uma quantidade mínima de atividade de fitase (por exemplo,
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61/108 medida como unidades de atividade de fitase / g de peso seco da composição de levedura), a qual pode ser, por exemplo, de 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000 ou mais unidades de atividade de fitase / g de peso celular seco. Por exemplo, quando a enzima heteróloga é uma fosfatase tal como uma fitase, a composição de levedura pode compreender uma quantidade mínima de atividade de fitase de 300 unidades de atividade de fitase / g de peso celular seco. Em ainda um outro exemplo, quando a enzima heteróloga é uma oxidase tal como uma glicose oxidase, a composição de levedura pode compreender uma quantidade mínima de atividade de glicose oxidase (por exemplo, medida como unidades de atividade de glicose oxidase / g de peso seco da composição de levedura), a qual pode ser, por exemplo, de 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000 ou mais unidades de atividade de glicose oxidase / g de peso celular seco. Por exemplo, quando a enzima heteróloga é uma oxidase tal como uma glicose oxidase, a composição de levedura pode compreender uma quantidade mínima de 300 unidades de atividade de glicose oxidase / g de peso celular seco.
[0100] O processo para a preparação da composição de levedura compreende genericamente duas etapas: uma primeira etapa de propagação da célula hospedeira de levedura recombinante e uma segunda etapa de formulação da composição de levedura.
[0101] A propagação pode ser conduzida de acordo com um método de produção da levedura de padeiro tradicional com uma célula hospedeira de levedura recombinante como descrito aqui. O processo é vantajoso na medida em que permite a expressão de uma proteína heteróloga (que não apresenta benefício fisiológico para a célula hospedeira de levedura recombinante) para níveis pelo menos similares (dentro de uma ordem de magnitude) àqueles de proteínas homólogas que são expressas
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62/108 nativamente na célula hospedeira de levedura recombinante (tal como, por exemplo, a proteína invertase, a qual pode estar presente, em algumas realizações, como 11700 U/g quando medida em creme de levedura seco; a atividade específica de 2900 U/mg de enzima, das proteínas totais; 0,004 g / g de peso seco da célula hospedeira de levedura recombinante; 0,4% em peso quando em comparação com o peso da célula hospedeira de levedura recombinante; 50,2%% em peso em um creme de levedura; 0,008 g / g de proteínas totais; 0,8% em peso das proteínas totais como indicado em Gascon, 1968). O processo de propagação pode ser um método contínuo, um método em batelada ou um método por alimentação em batelada. O meio (de cultura) pode compreender uma fonte de carbono (tal como, por exemplo, melaços, sacarose, glicose, xarope de dextrose, etanol, milho, glicerol, milhocina e/ou uma ‘biomassa lignocelulósica), uma fonte de nitrogênio (tal como, por exemplo, amônia ou uma outra fonte inorgânica de nitrogênio) e uma fonte de fósforo (tal como, por exemplo, ácido fosfórico ou uma outra fonte inorgânica de fósforo). O meio de cultura pode compreender adicionalmente micronutrientes adicionais tais como vitaminas e/ou minerais para suportar a propagação da célula hospedeira de levedura recombinante.
[0102] No processo de propagação, a célula hospedeira de levedura recombinante é colocada em um meio de cultura o qual pode, em algumas realizações, permitir uma taxa de crescimento específica de 0,25, 0,24, 0,23, 0,22, 0,21, 0,20, 0,19, 0,18, 0,17, 0,16 ou 0,15 h1 ou menos. De maneira a limitar a taxa de crescimento da célula hospedeira de levedura recombinante, em algumas realizações, o processo pode adicionalmente compreender o controle da adição de nutrientes, tais como carboidratos. A limitação da taxa de crescimento da célula hospedeira de levedura recombinante durante a propagação pode ser obtida pela manutenção da concentração de carboidratos abaixo de 0,1, 0,01, 0,001 ou 0,0001% em peso em relação ao volume do meio de cultura. O controle da
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63/108 concentração dos carboidratos do meio de cultura pode ser alcançado por vários meios conhecidos na técnica e pode envolver a amostragem do meio de cultura a vários intervalos, determinando a concentração de carboidrato, concentração de álcool e/ou concentração de gás (CO2) nestas amostras e adicionando ou evitando a adição, se necessário, de carboidratos no meio de cultura de maneira a acelerar ou desacelerar 0 crescimento da célula hospedeira de levedura recombinante. Em algumas realizações, 0 processo provê a adição de nitrogênio e/ou fósforo de maneira a combinar com/suportar a taxa de crescimento da célula hospedeira de levedura recombinante.
[0103] O processo de propagação é preferivelmente conduzido sob condições de alta aeração. Por exemplo, em algumas realizações, 0 processo pode incluir 0 controle da aeração do vaso de maneira a se alcançar uma taxa de aeração específica, por exemplo, de pelo menos 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2 ou 1,3 volume de ar/volume do vaso/minuto.
[0104] O processo de propagação pode ser conduzido a um pH específico e/ou uma temperatura específica que sejam ótimos para a expressão da proteína heteróloga. Como tal, em realizações nas quais a levedura é do gênero Saccharomyces, 0 processo pode compreender 0 controle do pH do meio de cultura para entre cerca de 3,0 a cerca de 6,0, cerca de 3,5 a cerca de 5,5 ou cerca de 4,0a cerca de 5,5. Em uma realização específica, 0 pH é controlado para cerca de 4,5. Em um outro exemplo, em realizações nas quais a levedura é do gênero Saccharomyces, 0 processo pode compreender 0 controle da temperatura do meio de cultura para entre cerca de 20°C a cerca de 40°C, cerca de 25°C a cerca de 30°C ou cerca de 30°C a cerca de 35°C. Em uma realização específica, a temperatura é controlada para entre cerca de 30°C a cerca de 35°C (32°C, por exemplo). [0105] O final do processo de propagação, uma concentração específica pode ser pretendida e alcançada. Em algumas realizações, a
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64/108 concentração da célula hospedeira de levedura recombinante propagada no meio de cultura é de pelo menos cerca de 0,1,0,15, 0,2, 0,25, 0,3, 0,35, 0,4, 0,45, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0% em peso ou mais em relação ao volume do meio de cultura. Em uma realização específica na qual a célula hospedeira de levedura recombinante é propagada utilizando-se um processo de alimentação em batelada, a concentração da célula hospedeira de levedura recombinante propagada no meio de cultura é de pelo menos cerca de 0,25% em peso em relação ao volume do meio de cultura.
[0106] Na etapa de formulação, a mistura obtida após a propagação (compreendendo a(s) célula(s) hospedeira(s) de levedura recombinante(s) propagada(s)) é modificada para prover uma composição de levedura. Uma das vantagens das células hospedeiras de levedura recombinante do presente relatório é que a proteína heteróloga é associada com a célula hospedeira de levedura recombinante, o que, por esta razão, a concentração da biomassa após a propagação irá também aumentar a quantidade/atividade da proteína heteróloga. Em uma realização, para o provimento de uma composição de levedura, pelo menos um componente da mistura obtido após a propagação é removido do meio de cultura para prover a composição de levedura. Este componente pode ser, sem limitação, água, aminoácidos, peptídeos e proteínas, resíduos de ácido nucleico e moléculas de ácidos nucleicos, detritos celulares, produtos de fermentação, etc. Em uma realização, a etapa de formulação compreende substancialmente no isolamento das células hospedeiras de levedura recombinantes propagadas (por exemplo, a ‘biomassa) dos componentes do meio de cultura. Tal como utilizada no contexto do presente relatório, a expressão “isolar substancialmente” refere-se à remoção da maior parte dos componentes do meio de cultura das células hospedeiras de levedura recombinantes propagadas. Em algumas realizações, “isolar substancialmente” refere-se à concentração da célula hospedeira de
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65/108 levedura recombinante propagada para pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 45% ou mais quando em comparação com a concentração da célula hospedeira de levedura recombinante antes do isolamento. De maneira a prover a composição de levedura, as células hospedeiras de levedura recombinantes propagadas podem ser centrifugadas (e o pélete celular resultante compreendendo as células hospedeiras de levedura recombinantes propagadas pode opcionalmente ser lavado), filtradas e/ou secadas (opcionalmente utilizando-se uma técnica de secagem a vácuo). As células hospedeiras de levedura recombinante isoladas podem ser formuladas em uma composição de levedura. A etapa de formulação pode, em algumas realizações, preservar a viabilidade (pelo menos em parte) das células hospedeiras de levedura recombinante. Como tal, a composição de levedura pode ser provida em uma forma ativa ou uma forma semiativa. A composição de levedura pode ser provida em uma forma líquida, semilíquida ou seca. Em uma realização, a composição de levedura pode ser provida na forma de um creme de levedura.
Produto de leveduras e processos para a preparação de produtos de leveduras [0107] A célula hospedeira de levedura recombinante do presente relatório pode ser utilizada na preparação de uma composição de levedura para, em última análise, preparar um produto de levedura. Em uma realização, o produto de levedura compreende pelo menos 0,1,0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0% em peso ou mais da proteína heteróloga quando em comparação com as proteínas totais do produto de levedura. Em uma realização específica, o produto de levedura compreende pelo menos 0,2% em peso da proteína heteróloga quando em comparação com as proteínas totais do produto de levedura. Em uma outra realização, o produto de levedura compreende pelo menos 0,001,0,002, 0,003, 0,004, 0,005, 0,006, 0,007, 0,008, 0,009, 0,01,0,011, 0,012, 0,013, 0,014, 0,015, 0,016, 0,017, 0,018, 0,019, 0,02, 0,021,0,022,
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0,023, 0,024, 0,025 g ou mais da proteína heteróloga / g de proteínas totais da célula hospedeira de levedura recombinante. Em uma realização específica, o produto de levedura compreende pelo menos 0,02 g da proteína heteróloga / g de proteínas totais da célula hospedeira de levedura recombinante. Em ainda uma outra realização, o produto de levedura compreende pelo menos 0,05, 0,075, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5% em peso ou mais da proteína heteróloga quando em comparação com o peso total da célula hospedeira de levedura recombinante. Em ainda uma outra realização, o produto de levedura compreende pelo menos 0,1 % em peso da proteína heteróloga quando em comparação com o peso total da célula hospedeira de levedura recombinante. Em ainda uma realização adicional, o produto de levedura compreende pelo menos 0,0005, 0,0006, 0,0007, 0,0008, 0,0009, 0,001, 0,0011, 0,0012, 0,0013, 0,0014, 0,0015, 0,0016, 0,0017, 0,0018, 0,0019, 0,002, 0,003, 0,004, 0,005, 0,006, 0,007, 0,008, 0,009, 0,01 g ou mais da proteína heteróloga quando em comparação com o peso seco da célula hospedeira de levedura recombinante. Em uma realização específica, o produto de levedura compreende pelo menos 0,0011 g da proteína heteróloga / g (peso seco) de célula hospedeira de levedura recombinante. Tais realizações reduzem ou dispensam o requerimento de suplementação do produto de levedura com uma proteína exógena (tal como uma enzima exógena) em uma etapa de fermentação subsequente. Em uma outra realização na qual a proteína heteróloga é uma enzima heteróloga, o presente relatório provê processos, bem como produtos de leveduras apresentando uma atividade enzimática específica mínima e/ou uma faixa específica de atividade enzimática. Por exemplo, o produto de levedura pode compreender uma quantidade mínima de atividade enzimática que pode prover uma atividade enzimática mínima/g de peso celular seco, a qual pode ser, por exemplo, de 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000,
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6000, 7000, 8000 ou mais unidades de atividade enzimática / g de peso celular seco. Em uma realização específica, o produto de levedura pode compreender uma quantidade mínima de atividade enzimática de pelo menos cerca de 300 unidades de atividade enzimática / g de peso celular seco. Alternativamente ou em combinação, o produto de levedura pode prover uma atividade enzimática mínima/g ou mg da total proteína da célula hospedeira de levedura recombinante, a qual pode ser, por exemplo, de 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 ou mais unidades de atividade enzimática / g de proteínas totais da célula hospedeira de levedura recombinante. Em uma realização específica, o produto de levedura pode compreender uma quantidade mínima de atividade enzimática de pelo menos cerca de 200 unidades de atividade enzimática / g de proteínas totais da célula hospedeira de levedura recombinante. Em uma outra realização, quando a enzima heteróloga é uma amilase tal como uma amilase maltogênica, o produto de levedura pode compreender uma quantidade mínima de atividade de amilase maltogênica (por exemplo, medida como MANU / g de peso seco do produto de levedura) a qual pode ser, por exemplo, de pelo menos cerca de 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000 ou mais MANU / g de peso celular seco ou 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000 ou mais MANU / g de proteínas totais da célula hospedeira de levedura recombinante. Por exemplo, o produto de levedura pode compreender uma quantidade mínima de atividade de amilase maltogênica (por exemplo, médica como MANU / g de peso seco do produto de levedura) a qual pode ser de pelo menos cerca de 1000 MANU / g de peso celular seco da célula hospedeira de levedura recombinante. Em ainda uma outra realização, quando a enzima heteróloga é uma amilase tal como uma glucoamilase, o produto de
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68/108 levedura pode compreender uma quantidade mínima de atividade de glucoamilase (por exemplo, medida como unidades de atividade de glucoamilase / g de peso seco do produto de levedura), a qual pode ser, por exemplo, de 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000 ou mais unidades de glucoamilase / g de peso celular seco. Por exemplo, quando a enzima heteróloga é uma amilase tal como uma glucoamilase, o produto de levedura pode compreender uma quantidade mínima de 300 unidades de glucoamilase / g de peso celular seco. Em uma realização adicional, quando a enzima heteróloga é uma amilase tal como uma alfa-amilase, o produto de levedura pode compreender uma quantidade mínima de atividade de alfa-amilase (por exemplo, medida como unidades de atividade de alfa-amilase / g de peso seco do produto de levedura), a qual pode ser, por exemplo, de 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000 ou mais unidades de alfa-amilase / g de peso celular seco. Por exemplo, quando a enzima heteróloga é uma amilase tal como uma alfa-amilase, o produto de levedura pode compreender uma quantidade mínima de 300 unidades de alfa-amilase / g de peso celular seco. Em ainda uma outra realização, quando a enzima heteróloga é uma fosfatase tal como uma fitase, o produto de levedura pode compreender uma quantidade mínima de atividade de fitase (por exemplo, medida como unidades de atividade de fitase / g de peso seco do produto de levedura), a qual pode ser, por exemplo, de 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000 ou mais unidades de atividade de fitase / g de peso celular seco. Por exemplo, quando a enzima heteróloga é uma fosfatase tal como uma fitase, o produto de levedura pode compreender uma quantidade mínima de atividade de fitase de 300 unidades de atividade de fitase / g de peso celular seco. Em ainda uma
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69/108 outra realização, quando a enzima heteróloga é uma oxidase tal como uma glicose oxidase, o produto de levedura pode compreender uma quantidade mínima de atividade de glicose oxidase (por exemplo, medida como unidades de atividade de glicose oxidase / g de peso seco do produto de levedura), a qual pode ser, por exemplo, de 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000 ou mais unidades de atividade de glicose oxidase / g de peso celular seco. Por exemplo, quando a enzima heteróloga é uma oxidase tal como uma glicose oxidase, o produto de levedura pode compreender uma quantidade mínima de atividade de glicose oxidase de 300 unidades de atividade de glicose oxidase / g de peso celular seco.
[0108] Em uma outra realização na qual a proteína heteróloga é uma enzima heteróloga, o presente relatório provê processos, bem como produtos de leveduras apresentando uma atividade enzimática específica mínima e/ou uma faixa específica de atividade enzimática. Vantajosamente, a proteína heteróloga associada a célula presente na composição de levedura pode ser concentrada durante o processamento e pode permanecer biologicamente ativa para realizar sua função pretendida nos produtos de leveduras.
[0109] O processo para a preparação do produto de levedura compreende genericamente duas etapas: uma primeira etapa de provimento de células hospedeiras de levedura recombinantes propagadas (que podem, por exemplo, serem obtidas pelo processo de preparação de uma composição de levedura como indicado aqui) e uma segunda etapa de lise das células hospedeiras de levedura propagadas. O processo pode incluir uma etapa opcional de separação e uma etapa opcional de secagem.
[ono] Uma realização do processo para a preparação do produto de levedura é mostrada na Figura 11. Na etapa 010, são providas as células hospedeiras recombinantes propagadas. Na realização mostrada na
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Figura 11, são providas as células hospedeiras recombinantes propagadas como um creme de levedura a 20% mesmo embora realizações adicionais das células hospedeiras recombinantes propagadas possam ser providas (não mostradas na Figura 11). Então, na etapa 020, as células hospedeiras de levedura recombinantes propagadas são lisadas para prover células hospedeiras de levedura recombinantes lisadas. Por exemplo, as células podem ser lisadas utilizando-se autólise (a qual pode ser opcionalmente realizada na presença enzimas exógenas adicionais) ou homogeneização (por exemplo, utilizando-se uma técnica de moagem com esferas). Em uma realização, as células hospedeiras de levedura recombinantes propagadas pode ser lisadas utilizando-se autólise. Na realização mostrada na Figura 11, as células recombinantes propagadas podem ser submetidas a um tratamento térmico e de pH combinados por uma quantidade específica de tempo (por exemplo, 24 h) de maneira a causar a autólise das células hospedeiras de levedura recombinantes propagadas para prover as células hospedeiras de levedura recombinantes lisadas. Por exemplo, as ‘células recombinantes propagadas podem ser submetidas a uma temperatura de entre cerca de 40°C a cerca de 70 °C ou entre cerca de 50°C a cerca de 60°C. As células recombinantes propagadas podem ser submetidas a uma temperatura de pelo menos cerca de 40°C, 41 °C, 42°C, 43°C, 44°C, 45°C, 46°C, 47°C, 48°C, 49°C, 50°C, 51 °C, 52°C, 53°C, 54°C, 55°C, 56°C, 57°C, 58°C, 59°C, 60°C, 61 °C, 62°C, 63°C, 64°C, 65°C, 66°C, 67°C, 68°C, 69°C ou 70°C. Alternativamente ou em combinação, as células recombinantes propagadas podem ser submetidas a uma temperatura de não mais que cerca de 70°C, 69°C, 68°C, 67°C, 66°C, 65°C, 64°C, 63°C, 62°C, 61 °C, 60°C, 59°C, 58°C, 57°C, 56°C, 55°C, 54°C, 53°C, 52°C, 51 °C, 50°C, 49°C, 48°C, 47°C, 46°C, 45°C, 44°C, 43°C, 42°C, 41 °C ou 40°C. Em um outro exemplo, as células recombinantes propagadas podem ser submetidas a um pH entre cerca de 4,0 e 8,5 ou entre cerca de 5,0 e 7,5. As células
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71/108 recombinantes propagadas podem ser submetidas a um pH de pelo menos cerca de 4,0, 4,1,4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1,5,2, 5,3, 5,4,
5.5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1,6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1,
7.2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4 ou 8,5. Alternativamente ou em combinação, as células recombinantes propagadas podem ser submetidas a um pH de não mais que 8,5, 8,4, 8,3,
8.2, 8,1,8,0, 7,9, 7,8, 7,7, 7,6, 7,5, 7,4, 7,3, 7,2, 7,1,7,0, 6,9, 6,8, 6,7, 6,6,
6.5, 6,4, 6,3, 6,2, 6,1,6,0, 5,9, 5,8, 5,7, 5,6, 5,5, 5,4, 5,3., 5,2, 5,1,5,0, 4,9, 4,8, 4,7, 4,6 ou 4,5.
[0111] O processo pode incluir também uma etapa de secagem. A etapa de secagem pode incluir, por exemplo, secagem por spray-drying e/ou secagem em leito fluidizado. Esta etapa é mostrada como as etapas 031, 032, 033 ou 034 na Figura 11. Quando o produto de levedura é um autolisado, o processo inclui a secagem direta das células hospedeiras de levedura recombinantes lisadas após a etapa de lise sem a realização de uma separação adicional da mistura lisada. A etapa de secagem direta após a etapa de lise é mostrada como etapa 031 na Figura 11.
[0112] Para prover produtos de leveduras adicionais, pode ser necessário separar adicionalmente os componentes das células hospedeiras de levedura recombinantes lisadas. Por exemplo, os componentes da parede celular (referidos como uma “fração insolúvel”) da célula hospedeira de levedura recombinante lisada podem ser separados de outros componentes (referidos como uma “fração solúvel) das células hospedeiras de levedura recombinantes lisadas. Esta etapa de separação pode ser feita, por exemplo, pela utilização de centrifugação e/ou filtração. A etapa de separação é mostrada na Figura 11 como etapa 040.
[0113] Na realização mostrada na Figura 11, a fração insolúvel não é submetida a uma etapa de lavagem antes da subsequente etapa de secagem 032 para prover as paredes celulares (“CW” na Figura 11) como o produto de levedura ou a etapa de secagem subsequente 033 para
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72/108 prover o extrato de levedura (“YE” na Figura 11) como o produto de levedura. No entanto, o processo do presente relatório pode incluir uma ou mais etapas de lavagem entre as etapas 040 e 032 para prover as paredes celulares ou entre as etapas 040 e 033 para prover o extrato de levedura.
[0114] Em uma realização do processo, a fração insolúvel pode ser adicionalmente separada antes da secagem. Por exemplo, e como mostrado na etapa 050 na Figura 11, os componentes da fração solúvel apresentando um peso molecular acima de 10 kDa podem ser separados da fração solúvel. Esta separação pode ser obtida, por exemplo, pela utilização de filtração (e mais especificamente ultrafiltração). Quando a filtração é utilizada para separar os componentes, é possível retirar por filtração (por exemplo, remover) os componentes apresentando um peso molecular menor que cerca de 10 kDa e manter os componentes apresentando um peso molecular acima de cerca de 10 kDa. Os componentes da fração solúvel apresentando um peso molecular acima de 10 kDa podem ser então opcionalmente secados, na etapa 034, para prover um concentrado como o produto de levedura.
[0115] No processo descrito aqui, o produto de levedura é provido como uma forma inativa. O produto de levedura pode ser provido em uma forma líquida, semilíquida ou seca.
[0116] Em uma realização, o processo pode compreender também o isolamento/purificação substanciais das proteínas heterólogas do produto de levedura. Tal como utilizada no contexto do presente relatório, a expressão “isolamento/purificação substanciais das proteínas heterólogas das células hospedeiras de levedura recombinantes lisadas” refere-se à remoção da maior parte dos componentes das células hospedeiras de levedura recombinantes lisadas das proteínas heterólogas e o provimento das mesmas em uma forma isolada/purificada. A proteína heteróloga pode ser provida em uma forma líquida ou em uma forma sólida (seca). Como
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73/108 tal, o presente relatório provê uma proteína heteróloga isolada obtenível ou obtida pelo processo descrito aqui. Em uma realização, a proteína heteróloga isolada é produzida por uma célula hospedeira de levedura recombinante apresentando seu sinal sequenciado que foi trocado por um peptídeo sinalizador de uma proteína que é expressada de forma natural em um organismo heterólogo, tal como procariotos, uma bactéria, por exemplo. Em uma realização alternativa, uma sequência sinalizadora foi adicionada à proteína heteróloga e esta nova sequência sinalizadora é de uma proteína expressa de forma natural em procariotos tais como bactérias.
[0117] A presente invenção será mais facilmente entendida por referência aos exemplos a seguir, os quais são fornecidos de maneira a ilustrar a invenção, e não para limitar seu escopo.
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EXEMPLO I - MATERIAL E MÉTODOS
Tabela 1. Descrição das cepas de levedura utilizadas nos exemplos. Estas cepas foram construídas com cassetes de expressão, integrados no loco FCY1 em cada cromossomo, o número de cópias é provido na tabela. A cepa original de base utilizada para cada cepa é também provida na tabela. Cada cassete integrado incluiu uma cópia de uma enzima heteróloga, um ou mais promotores e um ou mais terminadores. Em alguns casos, o peptídeo sinalizador da enzima heteróloga foi substituído por um outro peptídeo sinalizador como indicado na tabela. Quando uma enzima heteróloga é expressa em uma forma imobilizada, a geometria do imobilizador é provida (ver definição das fórmulas I e II acima) e o ligante, bem como o imobilizador são providos. N.A. = não aplicável.
Nome Enzima heterólog IIM expressa Cepa origin ΙΙΙΒΙΙΙ lliiiii Cópias da ΙΙΙΙββοϊβϊβιιϊ heteróloga integrada II· cromosso Promotor Terminad li· Tipo de express ll· Peptídeo sinalizad IIM Ligante Imobilizad llllll®
M2390 (Saccharomy ces cerevisiae) Nenhuma N.A. N.A. N.A. N.A. N.A. N.A. N.A. N.A.
1 Invertase = SEQ ID NO : 52, Aga2 = SEQ ID NO: 69, amilase fúngica = SEQ ID NO: 107 2 HA = SEQ ID NO: 53; (G4S)2 = SEQ ID NO : 54 3 imobilizador Flo1 é um domínio de transmembrana localizado no terminal C = SEQ ID NO: 10; imobilizador Sed1 é uma âncora GPI localizada no terminal C = SEQ ID NO: 12; imobilizador Tir1 é um fragmento da manoproteína GPI localizado no terminal C = SEQ ID NO: 14; imobilizador Cwp2 é um fragmento da manoproteína GPI localizado no terminal C = SEQ ID NO: 16; imobilizador Ccw12 é um fragmento da manoproteína GPI localizado no terminal C = SEQ ID NO: 18; imobilizador Spi1 é uma âncora GPI localizada no terminal C = SEQ ID NO: 20; imobilizador Pst1 é uma âncora GPI = SEQ ID NO: 22; imobilizador Aga1/2, Aga2 ligação bissulfeto a Aga1; Aga1 apresenta umqa âncora GPI, a enzima é fundida a Aga2 no terminal C = SEQ ID NO: 24; imobilizador Aga1/2, Aga2 ligação bissulfeto a Aga1; Aga1 apresenta uma âncora GPI, a enzima é fundida a Aga2 no terminal N = SEQ ID NO: 26.
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Nome Enzima heterólog Cepa origin líiliil llillll Cópias da enzima heteróloga integrada ΙΗΪΗΙΪΪ^Ο^ΗΪΗΪΙΗ cromosso Promotor Terminad Tipo de |||·^ Peptídeo sinalizad Ligante Imobilizad 11·^
M8498 Glucoamila se (SEQ ID NO: 29) M104 74 1 TEF2p SED1t Secretad a livre Invertase Nenhu m Nenhum
Μ10074 Alfaamilase (SEQ ID NO: 50) M104 74 1 TEF2p SED1t Secretad a livre Invertase Nenhu m Nenhum
Μ10474 (Saccharomy ces cerevisiae) Nenhum N.A. N.A. N.A. N.A. N.A. N.A. N.A. N.A.
M11312 Fitase (SEQ ID NO: 67) M239 0 1 TEF2p ADH3t Secretad a livre Invertase N.A. N.A.
Μ12550 (Saccharomy ces cerevisiae) Nenhum N.A. N.A. N.A. N.A. N.A. N.A. N.A. N.A.
M12548 (Saccharomy ces boulardii) Nenhum N.A. N.A. N.A. N.A. N.A. N.A. N.A. N.A.
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Nome Enzima heterólog Cepa origin liiliil llillll Cópias da enzima heteróloga integrada ΙΗΪΗΙΪΪ^Ο^ΗΪΗΪΙΗ cromosso llllllliBiOililil Promotor Terminad Tipo de |||·^ Peptídeo sinalizad Ligante Imobilizad 11·^
Μ12795 Fitase (SEQ ID NO: 67) M125 50 1 TEF2p ADH3t Imobiliza da - Fórmula (II) Aga2 (648)2 Aga1/2 (Aga2 no terminal N da enzima)
Μ12938 Fitase (SEQ ID NO: 67) M125 50 1 TEF2p ADH3t Imobiliza da - Fórmula (II) Aga2 (648)2 Aga1/2
Μ12962 (Saccharomy ces cerevisiae var diastaticus) Nenhum N.A. N.A. N.A. N.A. N.A. N.A. N.A. N.A.
M13819 Alfaamilase maltogênic a (SEQ ID NO: 51) M104 74 2 TDH1p/HO R7p DIT1t/IDP 1t Imobiliza da - Fórmula (I) Invertase HA/64S Spi1
M13822 Alfaamilase maltogênic a (SEQ ID NO: 51) M104 74 2 TDH1p/HO R7p DIT1t/IDP 1t Secretad a livre Invertase Nenhu m Nenhum
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Nome Enzima heterólog |f||(||J|Jí||| Cepa origin liiliil llillll Cópias da enzima heteróloga integrada ΙΗΪΗΙΪΪ^Ο^ΗΪΗΪΙΗ cromosso Promotor Terminad Tipo de |||·^ Peptídeo sinalizad Ligante Imobilizad 11·^
Μ13979 Alfa amilase maltogênic a (SEQ ID NO: 51) M104 74 4 TDH1p/HO R7p DIT1t/IDP 1t Imobiliza da fórmula (I) Invertase (648)2 Spi1
Μ14244 Glucoamila se (SEQ ID NO: 29) M104 74 1 TEF2p SED1t Imobiliza da fórmula (I) Invertase HA/G4S Sed1
Μ14253 Alfaamilase (SEQ ID NO: 50) M104 74 1 TEF2p SED1t Imobiliza da - Fórmula (I) Invertase HA/G4S ligante Sed1
Μ14254 Alfaamilase (SEQ ID NO: 50) M104 74 1 TEF2p SED1t Imobiliza da - Fórmula (I) Invertase Nenhu m Sed1
Μ14851 Alfa amilase maltogênic a (SEQ ID NO: 65) M104 74 2 TDH1p/HO R7p DIT1t/IDP 1t Intracelul ar N.A. N.A. N.A.
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Nome Enzima heterólog Cepa origin liiliil lllillll Cópias da enzima heteróloga integrada ΙΗΪΗΙΪΪ^Ο^ΗΪΗΪΙΗ cromosso Promotor Terminad Tipo de |||·^ Peptídeo sinalizad Ligante Imobilizad 11·^
M15215 Alfaamilase (SEQ ID NO: 72) M239 0 1 TEF2p ADH3t Imobiliza da - Fórmula (I) Invertase HA/(G4 S)3 SEQ ID NO: 84
Μ15222 Alfaamilase (SEQ ID NO: 71) M239 0 1 TEF2p ADH3t Imobiliza da - Fórmula (I) Invertase HA/(G4 S)3 SEQ ID NO: 74
Μ15532 Alfa amilase maltogênic a (SEQ ID NO: 108) M104 74 2 TDH1p/HO R7p DIT1Í/IDP 1t Intracelul ar N.A. N.A. N.A.
Μ15771 Alfaamilase (SEQ ID NO: 71) M239 0 1 TEF2p ADH3t Imobiliza da - Fórmula (I) Invertase HA/(G4 S)3 SEQ ID NO: 78
Μ15772 Alfaamilase (SEQ ID NO: 71) M239 0 1 TEF2p ADH3t Imobiliza da - Fórmula (I) Invertase HA/(G4 S)3 SEQ ID NO: 82
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Nome Enzima heterólog Cepa origin líiliil llillll Cópias da enzima heteróloga integrada ΙΗΪΗΙΪΪ^Ο^ΗΪΗΪΙΗ cromosso Promotor Terminad Tipo de |||·^ Peptídeo sinalizad Ligante Imobilizad 11·^
Μ15773 Alfaamilase (SEQ ID NO: 72) M239 0 1 TEF2p ADH3t Imobiliza da - Fórmula (I) Invertase HA/(G4 S)3 SEQ ID NO: 86
Μ15774 Alfaamilase (SEQ ID NO: 71) M239 0 1 TEF2p ADH3t Imobiliza da - Fórmula (I) Invertase HA/(G4 S)3 SEQ ID NO: 76
Μ15775 Alfaamilase (SEQ ID NO: 72) M239 0 1 TEF2p ADH3t Imobiliza da - Fórmula (I) Invertase HA/(G4 S)3 SEQ ID NO: 92
Μ15776 Alfaamilase (SEQ ID NO: 72) M239 0 1 TEF2p ADH3t Imobiliza da - Fórmula (I) Invertase HA/(G4 S)3 SEQ ID NO: 88
Μ15777 Alfaamilase (SEQ ID NO: 71) M239 0 1 TEF2p ADH3t Imobiliza da Fórmula ________(!)_______ Invertase HA/(G4 S)3 SEQ ID NO: 80
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Nome Enzima heterólog Cepa origin líiliil llillll Cópias da enzima heteróloga integrada ΙΗΪΗΙΪϊ^ΟιίίΗΪΗΪΗΙ cromosso Promotor Terminad Tipo de |||·^ Peptídeo sinalizad Ligante Imobilizad 11·^
Μ15778 Alfaamilase (SEQ ID NO: 71) M239 0 1 TEF2p ADH3t Imobiliza da - Fórmula (I) Invertase SEQ ID NO: 94 SEQ ID NO: 74
Μ15779 Alfaamilase (SEQ ID NO: 71) M239 0 1 TEF2p ADH3t Imobiliza da - Fórmula (I) Invertase SEQ ID NO: 95 SEQ ID NO: 74
Μ15780 Alfaamilase (SEQ ID NO: 71) M239 0 1 TEF2p ADH3t Imobiliza da - Fórmula (I) Invertase SEQ ID NO: 97 SEQ ID NO: 74
Μ15781 Alfaamilase (SEQ ID NO: 72) M239 0 1 TEF2p ADH3t Imobiliza da - Fórmula (I) Invertase SEQ ID NO: 98 SEQ ID NO: 84
Μ15782 Alfaamilase (SEQ ID NO: 72) M239 0 1 TEF2p ADH3t Imobiliza da Fórmula ________(!)_______ Invertase SEQ ID NO: 95 SEQ ID NO: 84
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Nome Enzima heterólog Cepa origin líiliil ιΐιιιιι Cópias da enzima heteróloga integrada ΙΗΪΗΙΪΪ^Ο^ΗΪΗΪΙΗ cromosso lllllIliBiOililil Promotor Terminad Tipo de |||·^ Peptídeo sinalizad Ligante Imobilizad 11·^
Μ15784 Alfaamilase (SEQ ID NO: 71) M239 0 1 TEF2p ADH3t Imobiliza da - Fórmula (I) Invertase SEQ ID NO: 93 SEQ ID NO: 84
Μ15783 Alfaamilase (SEQ ID NO: 71) M239 0 1 TEF2p ADH3t Imobiliza da - Fórmula (I) Invertase SEQ ID NO: 99 SEQ ID NO: 74
Μ15785 Alfaamilase (SEQ ID NO: 72) M239 0 1 TEF2p ADH3t Imobiliza da - Fórmula (I) Invertase SEQ ID NO: 93 SEQ ID NO: 84
Μ15786 Alfaamilase (SEQ ID NO: 72) M239 0 1 TEF2p ADH3t Imobiliza da - Fórmula (I) Invertase SEQ ID NO: 94 SEQ ID NO: 84
Μ15787 Alfaamilase (SEQ ID NO: 71) M239 0 1 TEF2p ADH3t Imobiliza da Fórmula ________(!)_______ Invertase SEQ ID NO: 96 SEQ ID NO: 74
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Nome Enzima heterólog Cepa origin líiliil 11··· Cópias da enzima heteróloga integrada ΙΗΪΗΙΪΪ^Ο^ΗΪΗΪΙΗ cromosso Promotor Terminad Tipo de |||·^ Peptídeo sinalizad Ligante Imobilizad 11·^
Μ15788 Alfaamilase (SEQ ID NO: 71) M239 0 1 TEF2p ADH3t Imobiliza da - Fórmula (I) Invertase SEQ ID NO: 98 SEQ ID NO: 74
Μ16221 Alfaamilase (SEQ ID NO: 72) M239 0 1 TEF2p ADH3t Imobiliza da - Fórmula (I) Invertase SEQ ID NO: 97 SEQ ID NO: 84
Μ16222 Alfaamilase (SEQ ID NO: 72) M239 0 1 TEF2p ADH3t Imobiliza da - Fórmula (I) Invertase SEQ ID NO: 99 SEQ ID NO: 84
Μ16251 Alfaamilase (SEQ ID NO: 72) M239 0 1 TEF2p ADH3t Imobiliza da - Fórmula (I) Invertase HA/(G4 S)3 SEQ ID NO: 90
Μ16252 Alfaamilase (SEQ ID NO: 72) M239 0 1 TEF2p ADH3t Imobiliza da Fórmula ________(!)_______ Invertase SEQ ID NO: 96 SEQ ID NO: 84
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Nome Enzima heterólog Cepa origin liiliil llillll Cópias da enzima heteróloga integrada ΙΗΪΗΙΪΪ^Ο^ΗΪΗΪΙΗ cromosso Promotor Terminad Tipo de |||·^ Peptídeo sinalizad Ligante Imobilizad 11·^
Μ16273 Glicose oxidase (SEQ ID NO: 103) M104 74 2 TDH1p/HO R7p DIT1t/IDP 1t Intracelul ar N.A. N.A. N.A.
Μ16540 Amilase fúngica (SEQ ID NO: 105) M104 74 2 TDH1p/HO R7p DIT1t/IDP 1t Secretad a livre Amilase fúngica N.A. N.A.
Μ16772 Amilase fúngica (SEQ ID NO: 105) M104 74 2 TDH1p/HO R7p DIT1t/IDP 1t Secretad a livre Invertase N.A. N.A.
Μ16780 Glicose oxidase (SEQ ID NO: 103) M104 74 2 TDH1p/HO R7p DIT1t/IDP 1t Secretad a livre Invertase N.A. N.A.
Τ2633 Fitase (SEQ ID NO: 66) M125 48 1 TEF2p ADH3t Secretad a livre Invertase N.A. N.A.
Τ2634 Fitase (SEQ ID NO: 66) M125 48 1 TEF2p ADH3t Imobiliza da Fórmula ________(!)_______ Invertase (G4S)2 Sed1
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Nome Enzima heterólog Cepa origin líiliil llillll Cópias da enzima heteróloga integrada ΙΗΪΗΙΪΪ^Ο^ΗΪΗΪΙΗ cromosso Promotor Terminad Tipo de |||·^ Peptídeo sinalizad Ligante Imobilizad 11·^
T2635 Fitase (SEQ ID NO: 66) M125 48 1 TEF2p ADH3t Imobiliza da - Fórmula (I) Invertase (648)2 Tir1
T2636 Fitase (SEQ ID NO: 66) M125 48 1 TEF2p ADH3t Imobiliza da - Fórmula (I) Invertase (648)2 Cwp2
T2637 Fitase (SEQ ID NO: 66) M125 48 1 TEF2p ADH3t Imobiliza da - Fórmula (I) Invertase (648)2 Spi1
T2638 Fitase (SEQ ID NO: 66) M125 48 1 TEF2p ADH3t Imobiliza da - Fórmula (I) Invertase (648)2 Pst1
T2705 Fitase (SEQ ID NO: 67) M239 0 1 TEF2p ADH3t Imobiliza da Fórmula ______(1!)______ Aga2 (648)2 Aga1/2
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Nome Enzima heterólog Cepa origin líiliil llillll Cópias da enzima heteróloga integrada ΙΗΪΗΙΪΪ^Ο^ΗΪΗΪΙΗ cromosso Promotor Terminad Tipo de |||·^ Peptídeo sinalizad Ligante Imobilizad 11·^
T2706 Fitase (SEQ ID NO: 67) M239 0 1 TEF2p ADH3t Imobiliza da - Fórmula (I) Invertase (648)2 Aga1/2
T2816 Fitase (SEQ ID NO: 67) M125 50 1 TEF2p ADH3t Imobiliza da - Fórmula (I) Invertase (648)2 Sed1
T2986 Alfaamilase maltogênic a (SEQ ID NO: 51) M104 74 2 TDH1p/HO R7p DIT1t/IDP 1t Imobiliza da - Fórmula (I) Invertase HA/(64 S)2 Flo1
T2987 Alfaamilase maltogênic a (SEQ ID NO: 51) M104 74 2 TDH1p/HO R7p DIT1t/IDP 1t Imobiliza da - Fórmula (I) Invertase HA/(64 S)2 Sed1
T2988 Alfaamilase maltogênic a (SEQ ID NO: 51) M104 74 2 TDH1p/HO R7p DIT1t/IDP 1t Imobiliza da - Fórmula (I) Invertase HA/(64 S)2 Tir1
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Nome Enzima heterólog Cepa origin líiliil 11··· Cópias da enzima heteróloga integrada ΙΗΪΗΙΪΪ^Ο^ΗΪΗΪΙΗ cromosso lllllIliBiOililil Promotor Terminad Tipo de |||·^ Peptideo sinalizad I· Ligante Imobilizad 11·^
T2989 Alfaamilase maltogênic a (SEQ ID NO: 51) M104 74 2 TDH1p/HO R7p DIT1Í/IDP 1t Imobiliza da - Fórmula (I) Invertase HA(648)2 Cwp2
T2990 Alfaamilase maltogênic a (SEQ ID NO: 51) M104 74 2 TDH1p/HO R7p DIT1Í/IDP 1t Imobiliza da - Fórmula (I) Invertase HA/(G4 S)2 Ccw1
T2991 Alfaamilase maltogênic a (SEQ ID NO: 51) M104 74 2 TDH1p/HO R7p DIT1Í/IDP 1t Imobiliza da - Fórmula (I) Invertase HA/(G4 S)2 Spi1
T2994 Alfaamilase maltogênic a (SEQ ID NO: 51) M104 74 2 TDH1p/HO R7p DIT1Í/IDP 1t Secretad a livre Invertase Nenhu m Nenhum
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Nome Enzima heterólog IlIJilIJIjilll Cepa origin líiliil llillll Cópias da enzima heteróloga integrada ΙΗΪΗΙΪϊ^ΟιίίΗΪΗΪΗΙ cromosso Promotor Terminad Tipo de |||·^ Peptídeo sinalizad Ligante Imobilizad 11·^
T3892 Alfa amilase maltogênic a (SEQ ID NO: 65) M104 74 2 TDH1p/HO R7p DIT1t/IDP 1t Intracelul ar N.A. N.A. N.A.
T4328 Alfa amilase maltogênic a (SEQ ID NO: 51) M104 74 2 TDH1p/HO R7p DIT1t/IDP 1t Imobiliza da Invertase (648)2 Spi1
T4329 Alfa amilase maltogênic a (SEQ ID NO: 51) M104 74 2 TDH1p/HO R7p DIT1t/IDP 1t Secretad a livre Invertase N.A. N.A.
T4330 Alfa amilase maltogênic a (SEQ ID NO: 65) M104 74 2 TDH1p/HO R7p DIT1t/IDP 1t Intracelul ar N.A. N.A. N.A.
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Nome Enzima heterólog Cepa origin líiliil 11··· Cópias da enzima heteróloga integrada ΙΗΪΗΙΪΪ^Ο^ΗΪΗΪΙΗ cromosso lllllIliBiOililil Promotor Terminad Tipo de |||·^ Peptídeo sinalizad Ligante Imobilizad 11·^
T4336 Alfa amilase maltogênic a (SEQ ID NO: 51) M129 62 2 TDH1p/HO R7p DIT1t/IDP 1t Imobiliza da - Fórmula (I) Invertase (648)2 Spi1
T4337 Alfa amilase maltogênic a (SEQ ID NO: 51) M129 62 2 TDH1p/HO R7p DIT1t/IDP 1t Secretad a livre Invertase N.A. N.A.
T4338 Alfa amilase maltogênic a (SEQ ID NO: 65) M129 62 2 TDH1p/HO R7p DIT1t/IDP 1t Intracelul ar N.A. N.A. N.A.
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89/108 [0118] Crescimento celular. As células foram crescidas durante a noite em 5 ml_ de YPD (10 g/L de extrato de levedura, 20 g/L de peptona bacteriológica, 40 g/L de glicose). Um (1) mL da cultura total foi colhido e as células foram peletizadas por centrifugação. O sobrenadante livre de células foi removido e guardado para análise posterior. O pélete celular foi lavado uma vez e novamente suspendido em água deionizada.
[0119] Creme de levedura e creme de levedura desativado. Após a fermentação, o cal da fermentação coletado foi centrifugado e lavado utilizando-se um separador de escala laboratorial (da GEA) para preparar o creme de levedura com um peso seco final próximo a 20%. De maneira a se obter o creme de levedura desativado, cerca de 600 g de creme de levedura foram aquecidos em uma placa quente de agitação com temperatura controlada até se alcançar 75°C. O creme foi mantido por 15 minutos a 75°C e então removido da fonte de calor.
[0120] Spray drying. Amostras secas por aspersão foram preparadas por secagem a 150°C com um mini spray dryer (Buchi B-290). A taxa de alimentação foi mantida à temperatura de saída em torno de 80-85°C.
[0121] Moagem por esferas/preparação de homogeneizado por moagem por esferas. O creme de levedura foi rompido (com eficiência de rompimento típica de >95% de células) por moagem por esferas sob as seguintes condições de moagem por esferas. O creme de levedura (-20% de sólidos) foi moído por esferas com um Dyno KDL com volume de câmara de 0,6 L a 4°C, utilizando-se esferas de vidro de 0,5-0,75 mm preenchendo a câmara a 80% com capacidade de embalagem de 1,6 g/mL e um agitador de 64 mm de diâmetro com velocidade periférica de 10 m/s. A taxa de fluxo do creme de levedura foi de 6 kg/L/h.
[0122] Preparação de levedura seca instantânea (IDY). Após as fermentações comerciais objetivando a produção de amostras de IDY, o caldo coletado foi centrifugado e lavado utilizando-se um separador GEA de escala laboratorial para preparar o creme de levedura com um peso seco final próximo a 20%. O creme foi então filtrado em um sistema de
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90/108 filtração a vácuo para produzir uma torta de levedura. De maneira a remover a água adicional, a torta de levedura foi pressionada adicionalmente para alcançar um peso seco de cerca de 35% antes da extrusão. A torta pressionada foi então extrudada após bem misturada com extensor por for 5 minutos. A taxa de adição do extensor foi de 1% com base na matéria seca da levedura. Após a extrusão, a levedura foi seca em um secador de leito fluidizado de escala laboratorial (Aeromatic AG). A temperatura de secagem estabelecida e controlada a 35-40°C. A secagem durou cerca de 20-25 minutos para se obter um conteúdo em sólidos de mais de 94%. Em termos das receitas de fermentação, a diferente significativa para a receita de fermentação para IDY é que apresenta um período de maturação de 2 horas para o final da fermentação, no qual a amônia (N) é interrompida e a temperatura de fermentação é aumentada para 35°C.
[0123] Autólise em fermentador. Pelo menos 3 L (volume mínimo de trabalho) de creme a 20% de sólidos foram transferidos para um fermentador de 20 L (BiOENGiNEERiNG). A autólise foi realizada a 55°C e pH 5,5 (controle automático do pH com ácido sulfúrico 2N) com uma agitação suave a 70 rpm. O autolisado (-20% de peso seco) foi coletado após um período de incubação de 24 horas e separado como descrito abaixo.
[0124] Autólise em escala laboratorial. Esta autólise é similar à autólise em fermentador descrita acima, mas foi realizada em uma escala menor e com parâmetros ligeiramente diferentes. O creme de levedura (20% de sólidos) foi submetido a autólise e o pH foi ajustado para pH 7. A mistura foi incubada em tubos cônicos de 50 mL em um banho de água a 55°C por 48 horas.
[0125] Separação do autolisado sem lavagem. Após a autólise em fermentador, o autolisado total foi separado a 11000 RCF por 10 minutos em garrafas de 1 L em uma centrífuga Sorvall Lynx 6000 de maneira a se obter uma fração solúvel (11-13% de peso seco, extrato de levedura) e
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91/108 uma fração insolúvel (parede celular de levedura). O peso seco e a atividade enzimática foram medidos para as frações de autolisado total, extrato de levedura e parede celular para equilíbrios de peso seco e MANU. [0126] Separação do autolisado com lavagem. As separações foram realizadas pela centrifugação do autolisado em fermentador em tubos cônicos de 50 ml_ por 10 minutos a 3000 RCF. Duas lavagens adicionais foram realizadas pela adição de água igual ao peso do sobrenadante obtido da etapa de centrifugação. O rendimento da separação do YE (extrato de levedura) é calculado como a recuperação da separação apenas (WF = 0) e da separação mais uma ou duas lavagens (WF = 1 ou 2, respectivamente), em relação aos sólidos de partida no autolisado. A MANU da recuperação de YE é calculado como a atividade (em MANU de Phadebas) da separação apenas (WF = 0) e da separação mais uma ou duas lavagens (WF = 1 ou 2), em relação à MANU de Phadebas total de partida no autolisado.
[0127] Ultrafiltração. O autolisado em fermentador foi separado por centrifugação em garrafas de 1 L a 11000 RCF e a fração de extrato de levedura foi adicionalmente concentrada por ultrafiltração com um corte de peso molecular de 10 kDa em membrana PES (Millipore, Biomax-10). A fração concentrada é retida pela membrana e o a fração de permeado passa através da membrana.
[0128] Ensaio de amilase maltogênica. Uma Amilase Maltogênica Novo Unit, MANU, é a quantidade de enzima que sob condições padrão irá clivar um micromol de maltotriose por minuto. Antes do ensaio para atividade enzimática, amostras de creme de levedura foram desativadas por incubação a 60°C por 10 minutos em tampão de ensaio de MANU (0,1 M de ácido cítrico, pH 5,0). As amostras foram então misturadas com 20 mg/ml de substrato de maltotriose e incubadas a 37°C por 30 minutos. As reações foram interrompidas pela adição de um volume igual de um reagente de interrupção de hidróxido de sódio 1N. A glicose hidrolisada pela atividade de amilase maltogênica foi medida após uma incubação à
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92/108 temperatura ambiente por 15 minutos com reagente de ensaio de glicose (HK) (Sigma G3293). A absorbância foi lida a 340 nm em um espectrofotômetro. Amostras desconhecidas foram comparadas com uma curva de dose de Novamil® com atividade enzimática conhecida. Este método foi aplicado para gerar os resultados apenas da Figura 1.
[0129] Ensaio de atividade enzimática de MANU de Phadebas. Tabletes de Phadebas contêm um substrato de amido insolúvel em água e um corante azul, ligado ao corante com reticulações. O substrato é hidrolisado por amilase maltogênica, liberando o corante azul que é solúvel. Após o término da reação e centrifugação, a absorbância da solução foi medida por espectrofotômetro e é considerada uma aproximação para a atividade enzimática. Para cada amostra, um tablete de Phadebas foi adicionado a 4,9 mL de tampão de citrato-fosfato (70 mM de hidrogeno fosfato de dissódio, 30 mM de ácido cítrico, pH 5,5), incubado em um banho de água a 60°C por 5 minutos. Então, 0,1 mL de padrão ou de amostra, diluídos em tampão de citrato-fosfato, foi adicionado ao tablete e solução tampão e incubados por 15 minutos em um banho de água a 60°C. A reação foi interrompida pela adição de 1 mL de 0,5 M de uma solução de hidróxido de sódio e mistura. Os tubos foram centrifugados para remover os sólidos e a absorbância do substrato foi medida a 620 nm com um espectrofotômetro. As amostras (seca ou líquida) foram comparadas com uma curva de dose curve de Novamil® com atividade conhecida. Este método foi aplicado para gerar todos os resultados de MANU, exceto para a Figura 1.
[0130] Ensaio da glicose oxidase. Células foram crescidas em batelada em meio de peptona de extrato de levedura mais 2% de glicose a 30°C por 24 horas. De maneira a se obter o sobrenadante de células lavadas rompidas, as células foram mortas por batimento com esferas de vidro 2 x 1 min em tampão de ensaio, com um minuto de repouso entre os batimentos. O sobrenadante foi separado do lisado total por centrifugação. A cultura total, sobrenadante, sobrenadante de células lavadas rompidas
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93/108 (que reflete a atividade celular intracelular associada de uma célula), células lavadas ou um controle positivo de Gluzyme® (2,40 GODU/mL correspondendo a 10000BG) foram medidos com o kit K-GLOX™ (Megazyme): as amostras em tampão de ensaio (100 mM de fosfato de potássio, pH 7, contendo 0,5 mg/mL de BSA e 0,02% (p/v) de azida de sódio) foram misturados com 90 mg/mL de glicose e mistura POD e incubados à temperatura ambiente por 20 minutos. A absorbância foi medida com um espectrofotômetro a 510 nm.
[0131] Ensaio da alfa-amilase (Figura 3). A atividade de alfa-amilase foi medida pela adição de 25 pL de células lavadas ou sobrenadante livre de células a 25 pL 5 mM de p-Nitrofenil α-D-hexaosídeo em 50mM de acetato de sódio pH 5. A reação foi incubada a 35°C por 2 horas e interrompida pela adição de 50 pL de bicarbonate de sódio 1M. As células foram peletizadas, foram transferidos 50 pL da mistura de ensaio para uma placa de microtítulo e a absorbância a 405 nm foi medida. A atividade da fração celular foi representada como uma percentagem da atividade total (“ligada” + “livre”).
[0132] Ensaio da alfa-amilase (Figuras 12 a 15). As cepas foram inicialmente crescidas em 600 pL de YPD40 a 35°C por 48 h em placas de 96 poços em um agitador a 900 rpm. A atividade de alfa-amilase foi determinada pela adição de 25 pL de células lavadas ou sobrenadante livre de células a 100 pL de amido bruto 1% com 50 mM de tampão de acetato de sódio (pH 5,2). O ensaio foi tratado por 30 min a 85°C utilizando-se um Eppendorf Gradient Cycler. Os açúcares redutores foram determinados utilizando-se o método da Solução de Reagente Ácido Dinitrosalicílico (DNS), utilizando-se uma proporção de ensaio de 2:1 de DNS:amido e fervidos a 100°C por 5 min. A absorbância foi medida a 540 nm.
[0133] Ensaio da atividade em amido de trigo. As células foram crescidas em batelada em meio de peptona de extrato de levedura mais 4% de glicose a 35°C por 48 horas. A cultura total, sobrenadante e células lavadas ressuspendidas em tampão de ensaio (50 mM de acetato de sódio,
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94/108 pH 5) foram misturados com 1 % de amido de trigo em tampão de ensaio e incubados a 60°C por 5 minutos. Então, foi adicionado ácido 3,5dinitrosalicílico para reagir com as extremidades redutoras e fervidos a 99°C por 5 minutos. A absorbância foi medida com um espectrofotômetro a 540 nm.
[0134] Atividade de amilase fúngica. Células foram crescidas em batelada em meio de peptona de extrato de levedura mais 2% de glicose a 30°C por 24 horas. A cultura total, sobrenadante, e ou sobrenadante de células rompidas ou células lavadas foram ressuspendidos em tampão de ensaio (70 mM de fosfato hidrogeno de sódio, 30 mM de ácido cítrico, pH 5,5) foram misturados com 1% de amido de trigo gelatinizado em tampão de ensaio e incubados a 30°C por 1 hora. Foi adicionado ácido 3,5dinitrosalicílico (DNS) para reagir com as extremidades redutoras e fervidos a 99°C por 5 minutos. A absorbância foi medida com um espectrofotômetro a 540 nm.
[0135] Ensaio da atividade de fitase. Uma diluição em série de 2 vezes de fosfato de potássio monobásico 1M foi preparada para o cálculo das FTUs. Foram adicionados 190 μΙ de uma solução 5 mM de fitato de sódio a pH 5,5 a cada poço de uma placa de PCR de 96 poços. Padrões ou sobrenadantes de culturas de uma noite de levedura em meio de peptona de extrato de levedura com 4% de glicose foram combinados com 5 mM de uma solução de fitato de sódio a pH 5,5 e foram incubados a 37°C por 30 min. As amostras associadas a célula foram medidas novamente após 2 horas de incubação. Volumes iguais de reação e solução de troca de cor (4 partes de reagente A para 1 parte de reagente B, onde o reagente A é heptamolibdato de amônio-HCI 12 mM em água e o reagente B é sulfato ferroso a 2,7% em água) foram combinados e incubados por 10 minutos à temperatura ambiente antes da peletização a 3500 rpm por 3 minutos. A absorbância de cada amostra ou padrão foi lida a 700 nm em um espectrofotômetro.
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95/108 [0136] SDS-PAGE. Volumes iguais de amostra e tampão de carga (250 mM Tris, pH 6,8, 30% de glicerol, 10% de SDS, 0,1% de azul de bromofenol; com ou sem 50mM de DTT para condições redutoras ou não redutoras, respectivamente) foram misturados e aquecidos a 100°C por 2 minutos. Foram carregados 20 μΙ de cada amostra mas tampão em um gel 4-20% Tris glicina e corrida a 175V por 75 minutos. Após a eletroforese, o gel foi lavado em água e marcado com SimplyBlue SafeStain® para visualizar a proteína total. O padrão de proteína Bio-rad All Blue® foi utilizado como peso molecular de referência.
EXEMPLO II - EXPRESSÃO DE ALFA-AMILASES MALTOGÊNICAS ASSOCIADAS UMA CÉLULA [0137] A expressão da MAA heteróloga, especialmente na presença de um imobilizador, proveu as leveduras recombinantes com atividade de amilase maltogênica tanto no pélete celular (Figura 1A) quanto, em uma maior escala, no creme de leveduras (Figura 1B). Em comparação, a cepa correspondente do tipo selvagem falhou em exibir qualquer atividade de amilase maltogênica (Figuras 1Ae 1B).
[0138] Os resultados mostrados na Figura 1 foram obtidos pela expressão da MAA heteróloga a partir do promotor do gene tdh1. Resultados similares foram obtidos quando uma combinação de dois promotores (do gene tdh1 e do gene hor7, dados não mostrados). A atividade enzimática é maior em cepas que expressam a amilase maltogênica heteróloga.
[0139] Uma cepa de levedura expressando MAA de G. stearothermophilus intracelular (M15532) foi propagada por alimentação em batelada aeróbica em melaços e um creme de levedura foi então obtido. Sua atividade em MANU foi determinada. Como mostrado na Tabela 2, a enzima heteróloga é calculada como sendo 3,7% da proteína celular total.
Tabela 2. Cálculos para amilase maltogênica como uma percentagem da proteína celular total. Atividade enzimática do creme de levedura e da enzima purificada foi determinada em um ensaio da enzima Phadebas em
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96/108 comparação a uma curva de dose dos padrões da enzima Novamil® com unidades de amilase maltogênica (MANU) conhecidas.
Percentagem da proteína no creme 50,2%
Atividade enzimática (MANU/g de peso celular seco), medida após liberação por autólise ou homogeneização 16000
Atividade específica da enzima pura (MANU/mg) 872
Atividade específica da enzima pura (MANU/g) 872000
Enzima por grama de peso seco (g/g) 0,018
Enzima por proteína total (g/g) 0,037
Enzima como % da proteína total 3,7%
[0140] Uma outra cepa expressando MAA de G. stearothermophilus intracelular (M14851) foi propagada (alimentação em batelada em melaços) e a atividade em MANU foi determinada. Como mostrado na Tabela 3, no caldo total não tratado, entre 25,6 e 39,3 a atividade em MANU foi detectada. Após lavagem e concentração do creme, entre 112 e 288 a atividade em MANU foi detectada.
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Tabela 3. Concentração dos concentrados de biomassa de levedura de amilase maltogênica associada a célula. A atividade enzimática foi determinada em ensaios da enzima Phadebas em comparação com uma curva de dose curve de padrões Novamil com unidades de amilase maltogênica (MANU) conhecidas.
MANU de Phadebas/ml
propagação de M14851 Caldo total (~6% llllllilllllll sólidos) Creme lavado e concentrado (19-20% de sólidos)
1200617 25,6 112,2
1210617 35,6 232,0
1220617 39,3 287,6
[0141] Uma outra expressando uma MAA imobilizada de G. stearothermophilus (M13879) foi propagada (alimentação em batelada em melaços) e a atividade em MANU foi determinada em várias preparações de levedura. Os resultados são mostrados na Tabela 4. Os dados de atividade do creme de levedura atividade no dia 1 após a propagação comercial é a medida mais representativa do creme em sua forma original. Todos os outros dados foram obtidos nos 8 dias após a propagação comercial.
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Tabela 4. Atividade em MANU de Phadebas por grama de peso seco de várias preparações de M13979. A atividade enzimática foi determinada por ensaios da enzima Phadebas em comparação com uma curva de dose dos padrões da enzima Novamil® com unidades de amilase maltogênica (MANU) conhecidas.
Equivalente em MANU de Phadebas/g de peso seco
Amostra de M13979 1 dia após a propagação 8 dias após a propagação
Creme 1087 3157
Homogeneizado por moagem com esferas 8698
Creme, seco por aspersão 1121
Creme desativado, seco por aspersão 2039
Homogeneizado por moagem por esferas, seco por aspersão 6721
[0142] A MANU e a atividade em amido de trigo foram determinadas em diferentes preparações de uma cepa de levedura expressando intracelularmente a alfa amilase maltogênica de G. stearothermophilus (M15532) e propagada com alimentação em batelada em melaços. Os resultados são providos nas Tabelas 5 a 9 mostrando os efeitos das diferentes preparações sobre o nível de atividade enzimática observada.
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Tabela 5. Ensaios com Phadebas e enzima de amido de trigo para medir a atividade de amilase maltogênica em várias preparações de M15532. A atividade enzimática foi determinada em ensaios com a enzima Phadebas em comparação com uma curva de dose curve dos padrões da enzima
Novamil® com unidades de amilase maltogênica (MANU) conhecidas.
Propagaçã o de M15532 Amostra de M15532 Forma MANU de Phadebas/ g de peso seco MANU de amido de trigo/g de peso seco
Receita de alta proteína 1060917 Creme não tratado Liquida 287 574
Creme autolisado cozido em laboratório (pH 7, 48 h, 55°C) (Líquido) Liquida 17826 15328
Mistura de 4 propagaçõe s (1280817, B300817, B310817, B300817) Creme não tratado Liquida 96
Creme autolisado cozido em laboratório (pH 7, 48 h, 55°C) (Líquido) Liquida 23614 12920
Homogeneizado por moagem por esferas (Liquida) Liquida 15916 12903
Homogeneizado por moagem por esferas (seco por aspersão) Seca 10607 7764
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Tabela 6. Resultados da atividade em creme, crema autolisado em escala de laboratório (incubado por 48ch a 55°C, pH 7) e amostras de levedura seca instantânea reidratada (IDY). A atividade enzimática foi determinada em ensaios coma enzima Phadebas em comparação com uma curva de dose dos padrões da enzima Novamil® com unidades de amilase maltogênica (MANU) conhecidas.
Amostra de M15532 ||IÍ||||| sólidos MANU de Phadebas/ml de amostra MANU de Phadebas/g DCW
Creme 17,9 58 325
Creme após 48 h, 55°C, pH 7 17,9 3572 19955
37°C IDY reidratado 15,9 545 3438
IDY com cheque frio 15,4 454 2958
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Tabela 7. Peso seco e balanços da atividade enzimática em preparações de autolisado, extrato de levedura, concentrado de ultrafiltração e parede celular de levedura antes e após a secagem de diferentes preparações da cepa de levedura M15532. A atividade enzimática foi determinada em ensaios com a enzima Phadebas em comparação com uma curva de dose dos padrões da enzima Novamil® com unidades de amilase maltogênica (MANU) conhecidas.
AMOSTRA
AUTOLISADO
YE
ANTES DA SECAGEM
dw MAA
% MANU / gdw
18, 0 8983
11, 6 14422
APÓS SECAGEM
dw NRC10NO lllllllllll COZIDO EM LABORATÓRI llllllllil NRC24NOV
MANU/ ||||||li|||||| MANU/ gdw MANU/gdw
% llllllllil ι·ιιιιι llllllllil %C V
91, 3 13568 14812 6% 1686 4 17%
93, 7 23067 27566 5% 2402 8 14%
PROCESSO DE BALANÇO DE MANU + SECAGEM
dwt ΙΙ··1Ι NRC
BALANÇ lilili 24NO
O V
100 100 100
47 87 66
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102/108 kDa CONCENTRAD O
CW
15, 1 83332 93, 7 25984 80817 5% 7555 2 15% 18 98 80
37, 0 883 94, 1 700 3757 4% 3421 4% 53 14 11
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Tabela 8. Resultados da separação do extrato de levedura do autolisado total e recuperação da enzima com e sem lavagem da cepa de levedura M15532. Rendimento da separação do YE (extrato de levedura) é a recuperação de sólidos apenas da separação (WF = 0) e da separação mais uma ou duas lavagens (WF = 1 ou 2, respectivamente), em relação aos sólidos iniciais no autolisado. Recuperação em MANU do YE é a atividade (em MANU de Phadebas) apenas da separação (WF = 0) e da separação mais uma ou duas lavagens (WF = 1 ou 2), em relação ao MANU de Phadebas total inicial no autolisado. A atividade enzimática foi determinada com ensaios da enzima Phadebas em comparação com uma curva de dose dos padrões da enzima Novamil® com unidades de amilase maltogênica (MANU) conhecidas.
FATOR DE LAVAGEM (WF) RENDIMENTO DA SEPARAÇÃO DE YE (%) RECUPERAÇÃO DE YE EM MANU (%) %DW EM YE
0 36 58 12,3
1 50 71 8,3
2 54 75 6,0
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Tabela 9. Os resultados da ultrafiltração do extrato de levedura de M15532 com um corte de peso molecular de 10 kDa. YE é o extrato de levedura, obtido por centrifugação do autolisado de fermentador em garrafas de 1 litro por 10 minutos a 11000 RCF, de maneira a mimetizar a separação em escala industrial. O concentrado é a amostra retida pela ultrafiltração e o permeado é a amostra não retida. A MANU de Phadebas/ml foi determinada para cada uma das amostras e MANU/g DW (peso seco) foi calculada com base no peso seco por amostra. A atividade enzimática foi determinada com ensaios da enzima Phadebas em comparação com uma curva de dose dos padrões da enzima Novamil® com unidades de amilase maltogênica (MANU) conhecidas.
Amostra Fator de concentração %DW llliilllll amostra MANU/mL MANU/ Ijllllll Balanço llliilllll MANU Balanço de DW (%)
YE 1,0 11,6 1672 14422 100 100
10 kDa CONCENTRA- DO 3,5 15,5 12583 83332 222 38
10 kDa PERMEADO 10,9 22 203 1 67
[0143] Várias preparações de cepas de levedura que expressam a alfa amilase maltogênica de G. stearothermophilus foram obtidas e sua atividade em MANU foi determinada. Algumas cepas expressaram a MAA em uma forma secretada (M13822), outras cepas expressaram a MAA em uma forma imobilizada (M13819 e M13979) enquanto uma outra cepa expressou a MAA intracelularmente (T3892). Como visto na Figura 4, as atividades mais altas foram observadas na cepa que expressa a MAA intracelularmente (T3892).
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105/108 [0144] A atividade em amido de trigo normalizada para a densidade celular foi determinada na cultura total, no sobrenadante de cultura e nas células lavadas de várias cepas de levedura que expressam a alfa amilase maltogênica de G. stearothermophilus expressa em uma forma secretada, em uma forma imobilizada ou expressa intracelularmente como explicado na legenda da Figura 8. Os resultados são mostrados na Figura 8 e é indicado que as atividades mais altas foram observadas quando a é expressa intracelularmente.
[0145] O teor em proteína da enzima Novamil® foi comparado com um SDS-page para o teor de proteína de um creme não tratado, um creme termicamente tratado um creme tratado por moagem por esferas da cepa de levedura M15532. Os resultados são mostrados na Figura 9. A seta na figura 9 aponta para uma banda principal da proteína observada em todas as preparações tratadas, bem como na enzima Novamil®.
[0146] Na figura 10, o teor em proteína da enzima Novamil® foi comparado com um SDS-page para o teor em proteína derivada das cepas de levedura M14851 e M15532 sob condições não redutoras (pistas 3 a 5) e condições redutoras (pistas 7 a 9). Uma banda principal de proteína é observada em todas as amostras de proteína testadas.
EXEMPLO III - EXPRESSÃO DE ALFA-AMILASES, GLUCOAMILASES, FIT ASES, GLICOSE OXIDASES E AMILASE FÚNGICAS HETERÓLOGAS [0147] Uma glucoamilase heteróloga (GA) foi expressa em S. cerevisiae a partir do promotor do gene tef2. Quando a GA foi expressa como uma enzima imobilizada, a atividade associada com o pélete celular é aumentada (Figura 2).
[0148] Uma alfa-amilase heteróloga (AA) do promotor do gene tef2. Quando a AA foi expressa em uma enzima imobilizada, a atividade associada com o pélete é aumentada, especialmente na presença de um ligante (Figura 3).
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106/108 [0149] Várias preparações de cepas de levedura que expressam a fitase a partir de C. braakii foram obtidas e sua atividade FTU foi determinada. Algumas cepas expressaram a fitase em uma forma secretada (T2633), outras cepas expressaram a fitase em uma forma imobilizada (T2634, T2635, T2636, T2637 e T2638) utilizando-se diferentes imobilizadores. Os resultados são mostrados nas Figuras 5A e 5B tanto para o sobrenadante quanto para as células em si.
[0150] Várias preparações de cepas de levedura que expressam a fitase a partir de E. coli foram obtidas e sua atividade FTU foi determinada. Algumas cepas expressaram a fitase em uma forma secretada (M11312), outras cepas expressaram a fitase em uma forma imobilizada (T2705, T2706, M12795, M12938, T2816) utilizando-se as diferentes configurações de imobilizadores. Os resultados são mostrados nas Figuras 6 e 7 tanto para o sobrenadante quanto para as células em si.
[0151] Construtos de alfa-amilase-SPI1 de P. furiosus quiméricos heterólogos termotolerantes e construtos de alfa-amilase-CCW12 de T. hydrothermalis foram obtidos utilizando-se vários truncamentos dos radicais de imobilização. A atividade de alfa-amilase associada com as células lavadas das cepas que expressam os polipeptídeos quiméricos com as partes de ancoragem GPI truncadas foi comparada com a parte de ancoragem GPI não truncada e é mostrada nas Figuras 12 e 13.
[0152] Como visto na Figura 12, o polipeptídeo quimérico com o radical de imobilização de comprimento total (expresso a partir da cepa M15222) mostrou a mesma atividade de alfa amilase ou maior que o polipeptídeos com radicais de imobilização truncados (expressos a partir das cepas M15774 (21 truncamento de comprimento aa), M15771 (51 truncamentos de comprimento aa), M1577 (81 truncamentos de comprimento aa) ou M15772 (130 truncamentos de comprimento aa)).
[0153] Como visto na Figura 13, os polipeptídeos quiméricos com o radical de imobilização de comprimento completo (expressão a partir da cepa M15215) exibiram atividade de alfa-amilase similar ou mais alta quando em
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107/108 comparação com os polipeptídeos quiméricos apresentando um radical de imobilização truncado (expressos a partir da cepas M15773 (24 truncamento de comprimento aa), M15776 (49 truncamentos de comprimento aa), M16251 (74 truncamentos de comprimento aa) ou M15775 (99 truncamentos de comprimento aa)).
[0154] Construtos de alfa-amilase-SPI1 de P. furiosus quiméricos heterólogos termotolerantes e construtos de alfa-amilase-CCW12 de T. hydrothermalis foram obtidos utilizando-se vários ligantes e o mesmo radical de imobilização. A atividade de alfa-amilase associada com as células lavadas das cepas que expressam os polipeptídeos quiméricos com os diferentes ligantes é mostrada nas Figuras 14 e 15.
[0155] Como visto na Figura 14, a atividade de alfa-amilase de todas as cepas foi mais alta que a da cepa de controle (M2390), independente do tipo de ligante utilizado. A atividade de alfa-amilase foi a mais alta quando o ligante 7 (SEQ ID NO: 99) foi utilizado (cepa M16222).
[0156] Como visto na Figura 15, a atividade de alfa-amilase de todas as cepas foi mais alta que a da cepa de controle (M2390), independente do tipo de ligante utilizado. A atividade de alfa-amilase foi a mais alta quando o ligante 5 (SEQ ID NO: 97) foi utilizado (cepa M15780).
[0157] Construtos de glicose oxidase (GO) quimérica heteróloga foram expressos intracelularmente ou em uma forma secretada. A atividade de GO obtida de várias frações celulares foi comparada com uma cepa de controle (M10474) ou uma preparação enzimática de Gluzyme Mono® como controle positivo (Figura 16). A atividade de GO associada com as cepas M16780 e M16273 foi mais alta que a atividade de GO de controle associada com a cepa M10474 parental (Figura 17).
[0158] Construtos da amilase fúngica (FA) quimérica heteróloga foram expressos em uma forma secretada. A atividade de FA obtida de várias frações celulares foi comparada com a cepa de controle M10474 ou uma preparação enzimática de Fungamil® como controle positivo (Figura 18). A atividade de FA associada com as cepas M16772 e M16540 foi mais alta
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108/108 que a atividade do controle associada com a cepa M10474 parental (Figura 19).
[0159] Embora a invenção tenha sido descrita em conexão com suas realizações específicas, deve ser entendido que o escopo das reivindicações não deve ficar limitado pelas realizações preferidas apresentadas nos exemplos, mas deve ser dada a interpretação mais ampla consistente com a descrição como um todo.
REFERÊNCIA
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Pérez-Torrado R, Bruno-Bárcena JM, Matallana E. Monitoring stressrelated genes during the process of ‘biomass propagation of Saccharomyces cerevisiae strains used for wine making. Appl Environ Microbiol. 2005 Nov;71 (11 ):6831 -7.
Praekelt UM, Meacock PA. MOL1, a Saccharomyces cerevisiae gene that is highly expressed in early stationary phase during growth on molasses. Yeast. 1992 Sep;8(9):699-710.

Claims (81)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Processo para a obtenção de uma proteína heteróloga associada a célula a partir de uma célula hospedeira de levedura recombinante, caracterizado pelo fato de compreender a propagação da célula hospedeira de levedura recombinante em um meio colocado em um vaso de acordo com um método de produção de levedura de padeiro de maneira a permitir a expressão da proteína heteróloga associada a célula, onde a célula hospedeira de levedura recombinante contém uma molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica a proteína heteróloga associada a célula e a molécula de ácido nucleico heteróloga é associada operacionalmente com um promotor heterólogo que permite a expressão da molécula de ácido nucleico heteróloga durante a propagação.
  2. 2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do método de produção da levedura de padeiro ser um método contínuo.
  3. 3. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do método de produção da levedura de padeiro ser um método de alimentação em batelada.
  4. 4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato da taxa de crescimento específica da célula hospedeira de levedura recombinante durante a propagação ser de 0,25 It 1 ou menos.
  5. 5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente o controle da taxa de aeração no vaso para pelo menos cerca de 0,5 volume de ar/volume de vaso/minuto.
  6. 6. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato da taxa de aeração ser de pelo menos cerca de 1,0 volume de ar/volume do vaso/minuto.
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    2/12
  7. 7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato do meio compreender uma fonte de carboidrato, uma fonte de nitrogênio e uma fonte de fósforo.
  8. 8. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato da fonte de carboidrato ser derivada de melaços, milho, glicerol e/ou uma biomassa lignocelulósica.
  9. 9. Processo de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato da fonte de nitrogênio ser amônia.
  10. 10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato da fonte de fósforo ser ácido fosfórico.
  11. 11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 10, caracterizado pelo fato do meio compreender adicionalmente um ou mais micronutrientes.
  12. 12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 11, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente o controle da adição da fonte de carboidrato ao meio de tal forma a limitar a taxa de crescimento da célula hospedeira de levedura recombinante.
  13. 13. Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de compreender a manutenção da concentração da fonte de carboidrato a 0,1 porcento em peso ou menos em relação ao volume total do meio.
  14. 14. Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato da concentração da fonte de carboidrato ser mantida a 0,0001 porcento em peso ou menos em relação ao volume total do meio.
  15. 15. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 14, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente a adição da fonte de nitrogênio e/ou da fonte de fósforo de maneira a combinara com a taxa de crescimento da célula hospedeira de levedura recombinante.
  16. 16. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente o controle do pH do meio entre cerca de 4,0 e 5,0.
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  17. 17. Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de compreender o controle do pH do meio a cerca de 4,5.
  18. 18. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente o controle da temperatura do meio entre cerca de 20°C a cerca de 40°C.
  19. 19. Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de compreender o controle da temperatura do meio entre cerca de 30°C a cerca de 35°C.
  20. 20. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de, após a etapa de propagação, a concentração da célula hospedeira de levedura recombinante ser de pelo menos 0,25% em peso do volume total do meio.
  21. 21. Processo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de, após a etapa de propagação, a concentração da célula hospedeira de levedura recombinante ser de pelo menos 1% em peso do volume total do meio.
  22. 22. Célula hospedeira de levedura recombinante para a obtenção de uma composição de levedura ou de um produto de levedura, caracterizada pelo fato de conter uma molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica uma proteína heteróloga associada a célula, onde a molécula de ácido nucleico heteróloga é operacionalmente associada com um promotor heterólogo que permite a expressão da molécula de ácido nucleico heteróloga durante a propagação.
  23. 23. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato da proteína heteróloga associada a célula representar pelo menos 0,1% (em percentagem de peso seco) das proteínas totais na composição de levedura ou no produto de levedura.
  24. 24. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com a reivindicação 22 ou 23, caracterizada pelo fato do polipeptídeo heterólogo associado a célula ser uma enzima heteróloga.
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    4/12
  25. 25. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato da enzima heteróloga ser uma oxido redutase, uma transferase, uma hidrolase, uma liase, uma isomerase, uma fosfatase e/ou uma ligase.
  26. 26. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato da enzima heteróloga ser uma alfa-amilase maltogênica, uma glucoamilase, uma alfa-amilase, uma amilase fúngica, uma fitase ou uma glicose oxidase.
  27. 27. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 26, caracterizada pelo fato da molécula de ácido nucleico heteróloga permitir a expressão intracelular da proteína heteróloga associada a célula.
  28. 28. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 26, caracterizada pelo fato da molécula de ácido nucleico heteróloga permitir a expressão de uma proteína heteróloga associada a membrana.
  29. 29. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato da molécula de ácido nucleico heteróloga permitir a expressão de uma proteína heteróloga imobilizada.
  30. 30. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato da proteína heteróloga imobilizada ser uma proteína quimérica de fórmula (I) ou (II):
    (NH2) HP-L-TT (COOH) (I) (NH2) TT-L-HP (COOH) (II) onde HP é o polipeptídeo heterólogo;
    L está presente ou ausente e é um ligante de aminoácido;
    TT é um radical de imobilização de aminoácido para a associação do polipeptídeo heterólogo a uma parede celular da célula hospedeira de levedura recombinante;
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    5/12 (NH2) indica o terminal amino da proteína quimérica;
    (COOH) indica o terminal carboxil da proteína quimérica; e “-“é uma ligação amida.
  31. 31. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de L estar presente.
  32. 32. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo fato de L compreender um ou mais motivos G4S (SEQ ID NO: 41).
  33. 33. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo fato de L compreender um ou mais motivos EA2K (SEQ ID NO: 100) ou EA3K (SEQ ID NO: 101)
  34. 34. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 33, caracterizada pelo fato de TT compreender um domínio de transmembrana, uma variante ou um fragmento deste.
  35. 35. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com a reivindicação 34, caracterizada pelo fato do TT ser de uma proteína FLO1.
  36. 36. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com a reivindicação 35, caracterizada pelo fato do TT apresentar a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14, ser uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14 ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 14.
  37. 37. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 33, caracterizada pelo fato do TT poder ser modificado por um mecanismo posterior à tradução de maneira a apresentar uma âncora de glicosilfosfatidilinositol (GPI).
  38. 38. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo fato do TT ser de uma proteína SED1, uma proteína TIR1, uma proteína CWP2, uma proteína CCW12, uma
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    6/12 proteína SPI1, uma proteína PST1 ou uma combinação de uma proteína AGA1 e uma proteína AGA2.
  39. 39. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com a reivindicação 38, caracterizada pelo fato do TT ser da proteína SPI1.
  40. 40. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com a reivindicação 39, caracterizada pelo fato do TT apresentar a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 74, ser uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 74 ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 74.
  41. 41. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com a reivindicação 39, caracterizada pelo fato do TT apresentar a sequência de aminoácidos das SEQ ID NO: 76, 78, 80 ou 82; uma variante da sequência de aminoácidos das SEQ ID NO: 76, 78, 80 ou 82 ou um fragmento da sequência de aminoácidos das SEQ ID NO: 76, 78, 80 ou 82.
  42. 42. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com a reivindicação 38, caracterizada pelo fato do TT ser da proteína CCW12.
  43. 43. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com a reivindicação 42, caracterizada pelo fato do TT apresentar a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 84, ser uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 84 ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 84.
  44. 44. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com a reivindicação 42, caracterizada pelo fato do TT apresentar a sequência de aminoácidos das SEQ ID NO: 86, 88, 90 ou 92; ser uma variante da sequência de aminoácidos das SEQ ID NO: 86, 88, 90 ou 92 ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos das SEQ ID NO: 86, 88, 90 ou 92.
  45. 45. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com a reivindicação 38, caracterizada pelo fato do TT ser da combinação da proteína AGA1 e da proteína AGA2.
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    7/12
  46. 46. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com a reivindicação 45, caracterizada pelo fato da combinação da proteína AGA1 e da proteína AGA2 apresentar uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24, ser uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24, ser um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24, apresentar uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26, ser uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26 ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26.
  47. 47. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 46, caracterizada pelo fato do promotor ser um promotor nativo ou um promotor heterólogo.
  48. 48. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com a reivindicação 47, caracterizada pelo fato do promotor heterólogo compreender o promotor do gene tdh1, do gene hor7, do gene hsp150, do gene hxt7, do gene gpm1, do gene pgk1 e/ou do gene stl1.
  49. 49. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com a reivindicação 48, caracterizada pelo fato do promotor heterólogo compreender o promotor do gene tdh1.
  50. 50. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com a reivindicação 48 ou 49, caracterizada pelo fato do promotor heterólogo compreender o promotor do gene hor7.
  51. 51. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 50, caracterizada pelo fato da molécula de ácido nucleico heteróloga ser operacionalmente associada com um terminador.
  52. 52. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com a reivindicação 51, caracterizada pelo fato do terminador ser um terminador nativo ou um terminador heterólogo.
  53. 53. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com a reivindicação 52, caracterizada pelo fato do terminador ser o terminador
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    8/12 heterólogo e compreender o terminador do gene dit1, do gene idp1, do gene gpm1, do gene pma1, do gene tdh3, do gene hxt2, do gene adh3 e/ou do gene ira2.
  54. 54. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com a reivindicação 53, caracterizada pelo fato do terminador heterólogo compreender o terminador do gene dit1.
  55. 55. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com a reivindicação 53 ou 54, caracterizada pelo fato do terminador heterólogo compreender o terminador do gene adh3.
  56. 56. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 a 55, caracterizada pelo fato do terminador heterólogo compreender o terminador do gene idp1.
  57. 57. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 56, caracterizada pelo fato da molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica o polipeptídeo heterólogo associado a membrana estar associado com uma molécula de ácido nucleico adicional que codifica um peptídeo sinalizador heterólogo.
  58. 58. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com a reivindicação 57, caracterizada pelo fato do peptídeo sinalizador heterólogo ser de uma proteína invertase e apresentar a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 68, ser uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 68 ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 68.
  59. 59. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com a reivindicação 57, caracterizada pelo fato do peptídeo sinalizador heterólogo ser de uma proteína AGA2 e apresentar a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 69, ser uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 69 ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 69.
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    9/12
  60. 60. Célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com a reivindicação 57, caracterizada pelo fato do peptídeo sinalizador heterólogo ser de uma amilase fúngica e apresentar a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 107, ser uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 107 ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 107.
  61. 61. Processo ou célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 60, caracterizado pelo fato da célula hospedeira de levedura recombinante ser do gênero Saccharomyces sp.
  62. 62. Processo ou célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato da célula hospedeira de levedura recombinante ser da espécie Saccharomyces cerevisiae.
  63. 63. Processo para a obtenção de uma composição de levedura, caracterizado pelo fato de compreender:
    a) a propagação da célula hospedeira de levedura recombinante apresentando uma proteína heteróloga associada a célula tal como definida em qualquer uma das reivindicações 22 a 62 para a obtenção de uma célula hospedeira de levedura recombinante propagada; e
    b) a formulação da célula hospedeira de levedura propagada em uma composição de levedura.
  64. 64. Processo de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato da composição de levedura ser um creme de levedura.
  65. 65. Processo de acordo com a reivindicação 63 ou 64, caracterizado pelo fato da etapa (a) ser conduzida em um meio.
  66. 66. Processo de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo fato do meio compreender melaços.
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  67. 67. Composição de levedura caracterizada pelo fato de compreender a célula hospedeira de levedura propagada obtida pelo processo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 63 a 66.
  68. 68. Processo para a obtenção de um produto de levedura, caracterizado pelo fato de compreender:
    a) o provimento da célula hospedeira de levedura recombinante propagada obtida pelo processo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 21 ou 63 a 66 ou da composição de levedura compreendendo a célula hospedeira de levedura recombinante propagada da reivindicação 67;
    b) a lise da célula hospedeira de levedura propagada de maneira a se obter uma célula hospedeira de levedura recombinante lisada;
    c) opcionalmente secagem da célula hospedeira de levedura recombinante lisada de maneira a se obter uma célula hospedeira de levedura recombinante seca; e
    d) formulação da célula hospedeira de levedura recombinante lisada ou da célula hospedeira de levedura recombinante seca no produto de levedura.
  69. 69. Processo de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato da etapa (b) compreender a submissão da célula hospedeira de levedura recombinante propagada a autólise de maneira a se obter a célula hospedeira de levedura recombinante lisada.
  70. 70. Processo de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato da etapa (c) ser conduzida diretamente após a etapa (b) para prover um autolisado como produto de levedura.
  71. 71. Processo de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato da célula hospedeira de levedura recombinante lisada compreender uma fração solúvel e uma fração insolúvel e o processo compreender adicionalmente, após a etapa (b), a separação da fração solúvel da fração insolúvel.
    Petição 870190091689, de 13/09/2019, pág. 131/312
    11/12
  72. 72. Processo de acordo com a reivindicação 71, caracterizado pelo fato de compreender a filtração da célula hospedeira recombinante lisada para separar a fração solúvel da fração insolúvel.
  73. 73. Processo de acordo com a reivindicação 71 ou 72, caracterizado pelo fato de compreender a submissão da fração insolúvel à etapa (d) para prover as paredes da célula de levedura como o produto de levedura.
  74. 74. Processo de acordo com a reivindicação 71 ou 72, caracterizado pelo fato de compreender a submissão da fração solúvel à etapa (d) para prover um extrato de levedura como o produto de levedura.
  75. 75. Processo de acordo com a reivindicação 71,72 ou 74, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente a remoção de componentes apresentando um peso molecular igual ou menor que cerca de 10 kDa da fração solúvel de maneira a prover um concentrado.
  76. 76. Processo de acordo com a reivindicação 75, caracterizado pelo fato de compreender a submissão do concentrado à etapa (d) para prover um concentrado seco como produto de levedura.
  77. 77. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 63 a 66 e 68 a 76, caracterizado pelo fato da proteína heteróloga associada a célula ser uma enzima heteróloga.
  78. 78. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 68 a 77, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente a purificação substancial da proteína heteróloga da célula hospedeira de levedura lisada para prover uma proteína heteróloga purificada como produto de levedura.
  79. 79. Produto de levedura caracterizado pelo fato de ser obtido pelo processo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 68 a 78.
  80. 80. Produto de levedura de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelo fato de estar em uma forma inativa.
  81. 81. Proteína heteróloga isolada obtida pelo processo conforme definido na reivindicação 78, caracterizada pelo fato de ser produzida por uma célula hospedeira de levedura recombinante contendo uma molécula de
    Petição 870190091689, de 13/09/2019, pág. 132/312
    12/12 ácido nucleico heteróloga e uma molécula de ácido nucleico adicional tal como definida em qualquer uma das reivindicações 30 a 60 e a molécula de ácido nucleico adicional codificar um peptídeo sinalizador heterólogo.
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