BR112020018535A2 - Levedura e produto de levedura inativados para melhorar o rendimento de fermentação - Google Patents

Abstract

levedura e produto de levedura inativados para melhorar o rendimento de fermentação. a presente revelação se refere ao uso de um produto de levedura inativado feito de uma célula hospedeira de levedura para aumentar o rendimento de um produto de fermentação de uma célula hospedeira de levedura de fermentação. o extrato de levedura inativado pode ser formulado como um aditivo de liquefação ou fermentação e pode ser usado para melhorar o rendimento de um produto fermentado, como o etanol.

Description

“LEVEDURA E PRODUTO DE LEVEDURA INATIVADOS PARA MELHORAR O RENDIMENTO DA FERMENTAÇÃO” CAMPO TECNOLÓGICO

[0001] A presente invenção se refere a produtos de levedura que podem ser utilizados para melhorar o rendimento de um produto de fermentação.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[0002] A Saccharomyces cerevisiae é um importante biocatalizador utilizado na produção comercial de etanol combustível. Este organismo é proficiente na conversão da glicose em etanol via fermentação, muitas vezes em concentrações superiores a 20% p/v. No entanto, a S. cerevisiae não é capaz de hidrolisar polissacarídeos e, portanto, requer a adição exógena de enzimas caras para converter açúcares complexos em glicose. Por exemplo, nos Estados Unidos, a principal fonte de etanol combustível é o amido de milho, que, independentemente do processo de brassagem, requer a adição exógena de alfa-amilase e glucoamilase. O custo das enzimas purificadas varia de 0,02 a 0,04 dólar por 4,5 litros (1 galão), que, a 63,6 bilhões de litros (14 bilhões de galões) de etanol produzidos a cada ano, representaria uma oportunidade substancial de economia de custos para os produtores se eles pudessem reduzir sua dose de enzima.

[0003] Em um sentido amplo, há dois processos de fermentação importantes na indústria de etanol de milho: brassagem de milho liquefeito e farinha de milho crua. No processo de brassagem, o milho é liquefeito termicamente e enzimaticamente usando alfa-amilases antes da fermentação, a fim de decompor os polímeros de amido de cadeia longa em dextrinas menores. A brassagem é, então, resfriada e inoculada com S. cerevisiae juntamente com a adição exógena de glucoamilase purificada, uma enzima de ação exo que irá decompor ainda mais a dextrina em moléculas de glicose que podem ser utilizadas. No processo de farinha crua, o milho é apenas moído, não aquecido, criando um substrato semelhante à farinha crua que depende fortemente da adição de enzimas exógenas para completar o processo de sacarificação. Em ambos os processos, a adição de uma cepa de levedura robusta e tolerante ao etanol é necessária para fermentar o amido hidrolisado no produto final desejado, etanol.

[0004] Nutrientes de levedura são comumente adicionados durante o processo de fermentação para garantir fermentações eficientes. A levedura precisa de nutrientes exógenos para crescimento saudável e viabilidade. Embora a própria brassagem com milho possa fornecer alguns nutrientes na forma de carboidratos, ácidos graxos e nitrogênio, ela não fornece nutrientes suficientes para o crescimento e o metabolismo necessários em uma fermentação típica. A nutrição adequada também melhora a robustez da célula e aumenta a probabilidade de a célula sobreviver às condições de fermentação rigorosas e variáveis de etanol elevado, temperaturas variáveis e ácidos orgânicos potenciais resultantes de eventos de contaminação. Há muitos produtos nutritivos disponíveis no mercado hoje, mas, como os produtores continuam a reduzir os custos de processo, os nutrientes são frequentemente subdosificados.

[0005] Seria, por conseguinte, altamente desejável dispor de um processo de fermentação melhorado que inclua nutrientes de levedura, bem como enzimas para apoio à produção de produtos de fermentação.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0006] A presente revelação fornece leveduras inativadas e produtos delas derivados (que podem incluir enzimas heterólogas) para melhorar o rendimento de uma fermentação conduzida por uma célula de levedura de fermentação. As leveduras e os produtos de levedura associados podem ser incluídos em um meio de liquefação. Os produtos de levedura podem ser incluídos em um meio liquefeito ou em um meio de fermentação. Os produtos de levedura compreendem uma fonte de nutrientes para o organismo de fermentação, bem como, em algumas formas de realização, uma fonte de enzima para facilitar a degradação da biomassa e a conversão da biomassa em um produto de fermentação (tal como, por exemplo, o etanol).

[0007] De acordo com um primeiro aspecto, a presente revelação fornece um processo para melhorar o rendimento de um produto de fermentação feito a partir de uma célula de levedura de fermentação em um meio de fermentação. O processo compreende (i) liquefazer um meio de liquefação para obter um meio de fermentação; e/ou (ii) fermentar o meio de fermentação (que pode ser opcionalmente liquefeito) com a célula de levedura de fermentação para obter o produto de fermentação.

O processo pode ainda incluir um primeiro produto de levedura inativada produzido a partir de uma primeira célula hospedeira de levedura recombinante no meio de liquefação e/ou no meio de fermentação, em que a primeira célula hospedeira de levedura recombinante compreende uma primeira molécula de ácido nucleico heteróloga para expressar uma primeira enzima heteróloga e o primeiro produto de levedura inativada compreende a primeira enzima heteróloga.

Alternativamente, ou em combinação, o processo pode ainda compreender uma segunda célula hospedeira de levedura recombinante no meio de liquefação para obter um segundo produto de levedura inativada no meio de fermentação, em que a segunda célula hospedeira de levedura recombinante compreende uma segunda molécula de ácido nucleico heteróloga para expressar uma segunda enzima heteróloga e o segundo produto de levedura inativada compreende a segunda enzima heteróloga.

Em alternativa, ou em combinação, o processo pode incluir ainda um terceiro produto de levedura inativada produzido a partir de uma célula hospedeira de levedura não geneticamente modificada para o meio de liquefação.

O processo é conduzido de forma a melhorar o rendimento do produto de fermentação (por exemplo, quando comparado a um processo que não inclui o primeiro produto de levedura inativada, a segunda célula hospedeira de levedura recombinante ou o terceiro produto de levedura inativada). Em uma forma de realização, o primeiro produto de levedura inativada, o segundo produto de levedura inativada e/ou o terceiro produto de levedura inativada é um extrato de levedura.

Em outra forma de realização, o processo pode ainda compreender a moagem de esferas, a agitação com esferas e/ou a homogeneização de alta pressão da primeira célula hospedeira de levedura recombinante e/ou da célula hospedeira de levedura não geneticamente modificada para obter o primeiro produto de levedura inativada e/ou o terceiro produto de levedura inativada.

Em algumas formas de realização, a segunda molécula de ácido nucleico heteróloga permite a expressão intracelular da enzima heteróloga.

Em algumas formas de realização adicionais, a segunda célula hospedeira de levedura recombinante é fornecida como um fermento em creme.

Em algumas formas de realização alternativas, a primeira e/ou a segunda molécula de ácido nucleico heteróloga permite a expressão da primeira e/ou segunda enzima heteróloga em associação com a membrana da primeira e/ou da segunda célula hospedeira de levedura recombinante, como, por exemplo, em uma forma conectada.

Em outras formas de realização, a primeira e/ou a segunda molécula de ácido nucleico heteróloga permite a expressão da primeira e/ou da segunda enzima heteróloga em uma forma secretada.

Em algumas formas de realização, a primeira e/ou a segunda molécula de ácido nucleico heteróloga está operacionalmente associada a um primeiro e/ou segundo promotor que permite a expressão da enzima heteróloga durante a propagação da primeira e/ou segunda célula hospedeira de levedura recombinante.

Em uma forma de realização, a primeira e/ou a segunda enzima heteróloga pode ser uma enzima amilolítica.

Por exemplo, a enzima amilolítica tem atividade de alfa-amilase e pode compreender, em algumas formas de realização, a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 13, 60, 61, 62, 63 ou 64; ser uma variante da sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 13, 60, 61, 62, 63 ou 64; ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 13, 60, 61, 62, 63 ou 64. Em outra forma de realização, a enzima amilolítica tem atividade de glucoamilase e pode compreender, em algumas formas de realização, a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 3 ou 67; ser uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 ou 67; ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 ou 67. Em ainda outra forma de realização, a enzima amilolítica tem atividade de trealase e pode compreender, em algumas formas de realização, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 70 ou 71; ser uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 70 ou 71; ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 70 ou 71. Em ainda outra forma de realização, a enzima amilolítica tem atividade de xilanase e pode compreender, em algumas formas de realização, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 72, ser uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 72 ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 72. Em outra forma de realização, a primeira e/ou a segunda enzima heteróloga é uma esterase.

Por exemplo, a enzima esterase tem atividade de fitase e pode compreender, em algumas formas de realização, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 73, ser uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 73 ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 73. Em outra forma de realização, a primeira e/ou a segunda enzima heteróloga é uma protease.

Por exemplo, a protease tem atividade de protease aspártica e pode ter, em algumas formas de realização, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 74 ou 75; ser uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 74 ou 75; ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 74 ou 75. Em outra forma de realização, a célula de levedura de fermentação é uma célula hospedeira de levedura recombinante de fermentação. Em algumas formas de realização, a célula hospedeira de levedura de fermentação pode compreender uma modificação genética para reduzir a produção de uma ou mais enzimas nativas que funcionam para produzir glicerol ou regular a síntese de glicerol, uma modificação genética para permitir a produção de um segundo polipeptídeo com atividade de glucoamilase, e/ou uma modificação genética para reduzir a produção de uma ou mais enzimas nativas que funcionam para catabolizar o formiato. Em algumas formas de realização, a célula hospedeira de levedura de fermentação compreende a modificação genética para permitir a produção do segundo polipeptídeo com atividade de glucoamilase. Na forma de realização, a etapa (ii) do processo é conduzida em condições anaeróbicas. Em algumas formas de realização, o meio de fermentação compreende ou é derivado de milho, cana-de-açúcar ou um material lignocelulósico. Em outra forma de realização, o produto da fermentação é o etanol. Em algumas formas de realização, o processo pode ainda compreender um polipeptídeo exógeno com atividade de alfa-amilase com o terceiro produto de levedura inativada. Em ainda outra forma de realização, o processo pode compreender pelo menos 0,00001 g do primeiro e/ou do terceiro produto de levedura inativada por L do meio de fermentação. Ainda em outra forma de realização, o processo pode ser usado para aumentar o equivalente de dextrose e/ou o nitrogênio amino livre do meio de fermentação quando comparado ao equivalente de dextrose e/ou o nitrogênio amino livre do meio de liquefação.

[0008] De acordo com um segundo aspecto, a presente revelação fornece um aditivo para melhorar o rendimento de um produto de fermentação feito a partir de uma célula de levedura de fermentação. O aditivo compreende um produto de levedura inativada produzido a partir da primeira célula hospedeira de levedura recombinante descrita neste documento. O aditivo pode ser um produto de levedura homogeneizado em alta pressão moído ou agitado com esferas. A primeira célula hospedeira de levedura recombinante compreende a primeira molécula de ácido nucleico heteróloga para expressar uma primeira enzima heteróloga e o primeiro produto de levedura inativada compreende a primeira enzima heteróloga. Em outra forma de realização, a primeira molécula de ácido nucleico heteróloga permite a expressão intracelular da primeira enzima heteróloga. Em outra forma de realização, a primeira molécula de ácido nucleico heteróloga permite a expressão da primeira enzima heteróloga em associação com a membrana da primeira célula hospedeira de levedura recombinante. Por exemplo, a primeira segunda molécula de ácido nucleico heteróloga pode permitir a expressão da primeira enzima heteróloga conectada à membrana da primeira célula hospedeira de levedura recombinante. Ainda em outro exemplo, a primeira segunda molécula de ácido nucleico heteróloga pode permitir a expressão da primeira enzima heteróloga em uma forma secretada. Em outra forma de realização, a primeira molécula de ácido nucleico heteróloga está operacionalmente associada a um primeiro promotor que permite a expressão da enzima heteróloga durante a propagação da segunda célula hospedeira de levedura recombinante. As formas de realização da enzima heteróloga e da célula hospedeira de levedura de fermentação aqui descrita podem ser usadas no aditivo.

[0009] De acordo com um terceiro aspecto, a presente revelação se refere a um kit para melhorar o rendimento de um produto de fermentação produzido a partir de uma célula de levedura de fermentação, o kit compreendendo (i) pelo menos um componente de um meio de liquefação e/ou meio de fermentação, e (ii) pelo menos um dentre o primeiros produto de levedura inativada, a segunda célula hospedeira de levedura recombinante ou o terceiro produto de levedura inativada, tal como definido no presente documento. Em algumas formas de realização, o primeiro e/ou o terceiro produto de levedura inativada é formulado para ser adicionado ao meio de liquefação e/ou ao meio de fermentação a uma concentração de pelo menos cerca de 0,00001 g/L. Em algumas formas de realização, o pelo menos um componente pode ser uma fonte de carboidratos, uma fonte de fósforo e/ou uma fonte de nitrogênio. Em outras formas de realização, o kit pode ainda compreender a célula de levedura de fermentação conforme definida neste documento.

[0010] De acordo com um quarto aspecto, a presente revelação fornece um meio de liquefação compreendendo o primeiro produto de levedura inativada, a segunda célula hospedeira de levedura recombinante e/ou o terceiro produto de levedura inativada, conforme aqui descrito.

[0011] De acordo com um quinto aspecto, a presente revelação proporciona um meio de fermentação compreendendo o primeiro produto de levedura inativada, o segundo produto de levedura inativada e/ou o terceiro produto de levedura inativada, conforme aqui descrito.

[0012] De acordo com um sexto aspecto, a presente revelação compreende um processo para melhorar o rendimento de um produto de fermentação feito a partir de uma célula de levedura de fermentação em um meio de fermentação. O processo pode compreender contatar o primeiro, segundo e/ou terceiro produto de levedura inativada aqui descrito com a célula de levedura de fermentação no meio de fermentação, de modo a melhorar o rendimento do produto de fermentação. Alternativamente, ou em combinação, o processo pode compreender adicionar a segunda célula hospedeira de levedura recombinante ao meio de liquefação para obter um meio de liquefação suplementado e aquecer (por exemplo, liquefazer) o meio de liquefação suplementado até que o segundo produto de levedura inativa seja obtido. Em outras formas de realização, o produto da fermentação é o etanol. Em ainda outra forma de realização, o meio de fermentação compreende ou é derivado de milho, cana-de-açúcar ou um material lignocelulósico. Em uma forma de realização adicional, o processo pode ainda compreender adicionar o primeiro, segundo e/ou terceiro produto de levedura inativada antes, ao mesmo tempo e/ou após a adição da célula de levedura de fermentação ao meio de fermentação. Em outra forma de realização, o processo pode compreender pelo menos 0,00001 g do primeiro, segundo e/ou terceiro produto de levedura inativada por L do meio de fermentação.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0013] Tendo assim descrito em geral a natureza da invenção, referência será feita aos desenhos que a acompanham, mostrando, por meio de ilustração, uma forma de realização preferida da mesma, e na qual:

[0014] A Figura 1 mostra um perfil de equivalente de dextrose associado à cepa M15958 durante uma fermentação em escala laboratorial. Os resultados são mostrados como o percentual de dextrose equivalente em função do tempo (minutos).

[0015] A Figura 2 mostra a curva de crescimento da cepa M11589 em meio de Verduyn, na ausência (0 g/L, ◊) ou na presença (0,05 g/L (Δ), 0,1 g/L (ж) ou 0,5 g/L (□)) de um extrato de levedura comercial. Os resultados são mostrados como a densidade óptica medida a 600 nm em função do tempo (hh:mm) e da concentração do extrato de levedura.

[0016] A Figura 3 mostra a produção de etanol e glicerol das cepas M2390, M8841 ou M11589 cultivadas em meio de Verduyn por 24 h, na ausência (0,00 g/L) ou na presença (0,01 g/L, 0,1 g/L ou 0,5 g/L) de um extrato de levedura comercial. Os resultados são mostrados como a concentração de etanol (eixo Y esquerdo, barras pretas, em g/L) e a concentração de glicerol (eixo Y direito, quadrados cinzas, em g/L) em função da cepa de levedura e da concentração do extrato de levedura.

[0017] A Figura 4 mostra o peso seca da célula (DCG) da cepa M2390, M8841 ou M11589 cultivada em meio de Verduyn por 24 h, na ausência (0,00 g/L) ou na presença (0,01 g/L, 0,1 g/L ou 0,5 g/L) de um extrato de levedura comercial. Os resultados são mostrados como o peso seco da célula (em g/L), em função da cepa de levedura e a concentração (em g de DCW por L) do extrato de levedura.

[0018] A Figura 5 mostra a curva de crescimento da cepa de levedura M2390 cultivada em meio de Verduyn, na ausência (0 g/L) ou na presença (0,01 g/L, 0,1 g/L ou 0,5 g/L) de um extrato de levedura comercial. Os resultados são mostrados como a soma de pressão (PSI) em função da concentração do extrato de levedura e do tempo.

[0019] A Figura 6 mostra a curva de crescimento da cepa de levedura M8841 cultivada em meio de Verduyn, na ausência (0 g/L) ou na presença (0,01 g/L, 0,1 g/L ou 0,5 g/L) de um extrato de levedura comercial. Os resultados são mostrados como a soma de pressão (PSI) em função da concentração do extrato de levedura e do tempo.

[0020] A Figura 7 mostra a curva de crescimento da cepa de levedura M11589 cultivada em meio de Verduyn, na ausência (0 g/L) ou na presença (0,01 g/L, 0,1 g/L ou 0,5 g/L) de um extrato de levedura comercial cultivado. Os resultados são mostrados como a soma de pressão (PSI) em função da concentração do extrato de levedura e do tempo.

[0021] A Figura 8 mostra o desempenho da fermentação da cepa M2390 em uma fermentação a 33% de matéria sólida, usando liquefações em escala laboratorial suplementadas com uma enzima alfa-amilase comercial (0,02% AA comercial); ou 0,012%, 0,03% ou 0,3% de levedura inativada (obtida da cepa M10474) juntamente com uma alfa-amilase comercial a 0,02%. Os resultados são mostrados como a concentração de etanol (eixo Y esquerdo, barras, em g/L) e glicose residual (eixo Y direito, círculos , em g/L) em função das condições de liquefação.

[0022] A figura 9 mostra o desempenho da fermentação da cepa M2390 em uma fermentação a 32% de matéria sólida, usando liquefações em escala laboratorial suplementadas com uma alfa-amilase comercial (apenas a enzima alfa- amilase comercial a 0.02%); ou 0,01%, 0,02% ou 0,03% de levedura inativada (obtida da cepa M10474), juntamente com uma alfa-amilase comercial a 0,02%. Os resultados são mostrados como a concentração de etanol (eixo Y esquerdo, barras, em g/L) e glicose residual (eixo Y direito, quadrados , em g/L) ou a produção de glicerol (eixo Y direito, triângulos , em g/L) em função das condições de liquefação.

[0023] A Figura 10 mostra as concentrações de nitrogênio amino livre após liquefação suplementada com uma alfa-amilase comercial de controle (apenas a enzima alfa-amilase comercial a 0,02%) ou com adições em peso seco de células (DCW) (0,01%, 0,02% ou 0,03%) da cepa M10474. O nitrogênio solúvel total é mostrado como amino nitrogênio livre (FAN) em partes por milhão (ppm) como uma função das condições de liquefação individuais.

[0024] A Figura 11 mostra o perfil da tendência de torque de liquefações em escala laboratorial contendo: 0,03% g DCW/g de adições de matéria sólida de levedura de expressão de alfa-amilase inativada, moída com esferas, em suporte de YPD, M19211, com uma dose de 25% (0,005%) da enzima alfa-amilase comercial nº 1 (); 0,03% g DCW/g de adições de matéria sólida de levedura de expressão de alfa- amilase inativada homogeneizada em alta pressão, com lavagem, M19211, com uma dose de 25% (0,005%) da enzima alfa-amilase comercial nº 1 (); 0,03% g DCW/g de adições de matéria sólida de levedura de expressão de alfa-amilase inativada homogeneizada em alta pressão, sem lavagem M19211, com uma dose de 25% (0,005%) da enzima alfa-amilase comercial nº 1 (); as enzimas alfa-amilases comerciais nº 1 dosificadas a 100% (0,02% p/p) (linha tracejada escura); ou as enzimas alfa-amilases comerciais nº 2 dosificadas a 100% (0,02% p/p) (linha tracejada clara). Os resultados são mostrados como tendências de torque em centímetros Newton (eixo Y esquerdo) em função do tempo (h:mm:ss, eixo X).

[0025] A Figura 12 mostra o perfil do equivalente de dextrose final de uma liquefação em escala laboratorial contendo: 0,03% g DCW/g de adições de matéria sólida de levedura de expressão de alfa-amilase inativada, moída com esferas, em suporte de YPD, M19211, com uma dose de 25% (0,005%) da enzima alfa-amilase comercial nº 1; 0,03% g DCW/g de adições de matéria sólida de levedura de expressão de alfa-amilase inativada homogeneizada em alta pressão, com lavagem, M19211, com uma dose de 25% (0,005%) da enzima alfa-amilase comercial nº 1; 0,03% g DCW/g de adições de matéria sólida de levedura de expressão de alfa- amilase inativada homogeneizada em alta pressão, sem lavagem, M19211, com uma dose de 25% (0,005%) da enzima alfa-amilase comercial nº 1; as enzimas alfa- amilases comerciais nº 1 dosificadas a 100% (0,02% p/p) (linha tracejada escura); ou as enzimas alfa-amilases comerciais nº 1 dosificadas a 100% (0,02% p/p) (linha tracejada clara). Os resultados são mostrados como % de equivalente de dextrose (eixo Y, barras cinza) em função das condições de liquefação.

[0026] A figura 13 mostra o potencial de etanol obtido usando a cepa M2390 em uma fermentação a 33% de matéria sólida usando liquefações em escala laboratorial dosificadas com: enzima alfa-amilase comercial nº 2 (0,02% p/p); enzima alfa-amilase comercial nº 1 (0,02% p/p); 0,03% g DCW/g de adições de matéria sólida de levedura de expressão de alfa-amilase inativada moída com esferas, em suporte de YPD, M19211, com uma dose de 25% (0,005%) da enzima nº 1; 0,03% g DCW/g de adições de matéria sólida de levedura de expressão de alfa-amilase inativada homogeneizada em alta temperatura, com lavagem, M19211, com uma dose de 25% (0,005%) da enzima alfa-amilase comercial nº 1; ou 0,03% g DCW/g de adições de matéria sólida de levedura de expressão de alfa-amilase inativada homogeneizada em alta temperatura, sem lavagem, M19211, com uma dose de 25% (0,005%) da enzima alfa-amilase comercial nº 1. Os resultados são mostrados como concentração de etanol potencial (eixo Y esquerdo, barras cinza, em g/L) em função das condições de liquefação.

[0027] A Figura 14 mostra o desempenho da fermentação de várias cepas de levedura em uma fermentação a 32% de matéria sólida usando brassagem comercial rico em nutrientes. O percentual de glucoamilase exógena (“% GA”) refere- se à dose percentual de glucoamilase comercial utilizada durante a fermentação. Os resultados são mostrados como as concentrações de etanol (eixo Y esquerdo, barras, em g/L), glicose residual (eixo Y direito, círculos , em g/L) ou glicerol (eixo Y direito, triângulos , em g/L) em função da adição de levedura inativada e da respectiva dose de GA exógena.

[0028] A Figura 15 mostra o desempenho da fermentação de várias cepas de levedura em uma fermentação a 30% de matéria sólida usando mosto comercial pobre em nutrientes. Os resultados são mostrados como concentrações de etanol (eixo Y esquerdo, barras cinzas, em g/L), glicose residual (eixo Y direito, círculos pretos, em g/L) e glicerol (eixo Y direito, triângulos pretos, em g/L) em função da adição de levedura inativada.

[0029] A Figura 16 mostra o perfil de tendência de torque das liquefações em escala laboratorial contendo: enzima alfa-amilase comercial nº 1 dosificada a 100% (0,02% p/p) (linha tracejada escura); enzima alfa-amilase comercial nº 2 dosificada a 100% (0,02% p/p) (linha tracejada clara); cepa autolisada M19211 dosificada a 0,03% g DCW/g de adições de matéria sólida de levedura de expressão de alfa-amilase inativada, com uma dose de 25% (0,005%) da enzima alfa-amilase comercial nº1 ( ); cepa M19211 agitada ou moída com esferas dosificada a 0,03% g DCW/g de adições de matéria sólida de levedura de expressão de alfa-amilase inativada, com uma dose de 25% (0,005%) da enzima alfa-amilase comercial nº 1 ( ); ou a cepa M19211 homogeneizada em alta pressão dosificada a 0,03% g DCW/g de adições de matéria sólida de levedura de expressão de alfa-amilase inativada, com uma dose de 25% (0,005%) da enzima alfa-amilase comercial nº 1 ( ). Os resultados mostrados como tendências de torque em centímetros Newton (eixo Y) em função do tempo (eixo X, h:mm:ss).

[0030] A Figura 17 mostra o equivalente de dextrose terminal de uma liquefação em escala laboratorial contendo: cepa M19211 autolisada dosificada a 0,03% g DCW/g de adições de matéria sólida de levedura de expressão de alfa- amilase inativada, com uma dose de 25% (0,005%) da enzima alfa-amilase comercial nº 1 (autólise a 0,003% DCW de M19211 + 0,0005% da enzima alfa-amilase comercial nº 1); cepa M19211 moída ou agitada com esferas, dosificada a 0,03% g DCW/g de adições de matéria sólida de levedura de expressão de alfa-amilase inativada, com uma dose de 25% (0,005%) da enzima alfa-amilase comercial nº 1 (M19211 moída com esferas a 0,003% DCW + 0,005% da enzima alfa-amilase comercial nº 1); cepa homogeneizada à alta pressão M19211 dosificada a 0,03% g DCW/g de adições de matéria sólida de levedura de expressão de alfa-amilase inativada, com uma dose a 25% (0,005%) da enzima alfa-amilase comercial nº 1 (M19211 homogeneizada em alta pressão a 0,03% DCW + 0,005% da enzima alfa-amilase comercial nº 1); enzima alfa-amilase comercial nº 1 a 100% (0,02% p/p, enzima alfa-amilase comercial n º 1); ou a enzima alfa-amilase comercial nº 2 dosificada a 100% (0,02% p/p, enzima alfa- amilase comercial nº 2). Os resultados são mostrados como % de equivalente de dextrose (eixo Y) em função das condições de liquefação (eixo X).

[0031] A Figura 18 mostra o perfil de equivalente de dextrose de uma miniliquefação de 1 g hidrolisada com vários métodos de inativação de M19211: creme sem lavagem, creme com lavagem, esferas moídas sem lavagem, sem lavagem homogeneizadas à alta pressão, com lavagem homogeneizadas à alta pressão, levedura seca instantaneamente (IDY) sem lavagem, IDY com lavagem, YPD não processada e agitada com esferas em YPD. Os resultados são mostrados como % equivalente de dextrose (eixo Y) em função dos métodos de inativação (eixo X).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0032] De acordo com um aspecto da presente revelação, são fornecidos aditivos (sob a forma de uma célula hospedeira de levedura recombinante ou sob a forma de um produto de levedura inativada) para melhorar o rendimento de um produto de fermentação feito por uma célula de levedura de fermentação. Tal como se usa na presente revelação, a expressão “aditivo” se refere a um produto que fornece nutrientes (como, por exemplo, uma fonte de nitrogênio) para melhorar o desempenho de um organismo (por exemplo, fornecer robustez melhorada em condições difíceis e/ou variáveis, como na fermentação). O aditivo inclui um produto de levedura, que pode ser um produto de levedura inativada (como, por exemplo, um extrato de levedura) produzido a partir de uma célula de levedura não modificada geneticamente e/ou de uma célula hospedeira de levedura recombinante. A célula hospedeira de levedura recombinante inclui uma molécula de ácido nucleico heteróloga para expressão de uma enzima heteróloga (que está presente no produto de levedura).

[0033] Tal como se usa no contexto da presente revelação, um “produto de levedura” é um produto obtido a partir de uma célula de levedura (que pode ser geneticamente modificada ou não). Quando o produto de levedura é feito a partir de uma célula hospedeira de levedura recombinante, ele compreende a enzima heteróloga (codificada pela molécula de ácido nucleico heteróloga).

[0034] O produto de levedura pode ser um produto ativo ou semiativo, como, por exemplo, um creme de levedura ou uma célula de levedura em suporte. O produto de levedura pode ser, por exemplo, uma levedura de células inteiras inativada, um lisado de levedura (por exemplo, um autolisado), um extrato de levedura e/ou uma fração de levedura (por exemplo, paredes celulares de levedura). O extrato de levedura pode ser um extrato de levedura moído com esferas obtido a partir da moagem com esferas da célula de levedura. O extrato de levedura pode ser um extrato de levedura agitado com esferas obtido a partir da agitação com esferas da célula de levedura. O extrato de levedura pode ser um extrato de levedura homogeneizado em alta pressão obtido a partir da homogeneização em alta pressão da célula de levedura. O produto de levedura pode ser produzido antes do início da liquefação e/ou fermentação por meios conhecidos por aqueles qualificados na arte. Alternativamente, ou em combinação, o produto de levedura pode ser produzido in situ antes da fermentação (por exemplo, durante a liquefação) ou durante a fermentação, adicionando a segunda célula hospedeira de levedura recombinante ao meio de fermentação e tratando o meio de fermentação (por exemplo, utilizando calor) para converter a célula hospedeira de levedura recombinante em um produto de levedura.

[0035] O aditivo inclui nutrientes que suportam o crescimento e/ou a viabilidade da célula de levedura de fermentação; melhoram a robustez da célula de levedura de fermentação; e/ou aumentam a probabilidade de que a célula de levedura de fermentação sobreviva a condições de fermentação, como etanol elevado e/ou açúcares redutores, temperaturas flutuantes e/ou a presença de ácidos orgânicos de eventos de contaminação. Como mostrado nos exemplos abaixo, o aditivo pode ser usado para melhorar a etapa de liquefação aumentando o equivalente de dextrose e/ou o teor de aminoácidos livres do método de fermentação liquefeita e/ou reduzir a necessidade de adição de enzima purificada durante a etapa de liquefação. O custo da preparação de um produto de levedura da segunda célula hospedeira de levedura recombinante pode ser semelhante ao dos extratos de levedura convencionais. No entanto, como a célula hospedeira de levedura recombinante expressa a enzima heteróloga, que está presente no produto de levedura, o produto de levedura pode fornecer funcionalidade adicional não presente em extratos de levedura convencionais. Células de Levedura não Geneticamente Modificadas

[0036] Em algumas formas de realização, as células de levedura usadas para fornecer o produto de levedura não são geneticamente modificadas, por exemplo, elas não incluem modificações genéticas introduzidas propositadamente por um ser humano e não são a progênie de células hospedeiras de levedura que foram geneticamente modificadas. As células hospedeiras de levedura não geneticamente modificadas que podem ser usadas no contexto da presente revelação para fazer o primeiro aditivo podem ser, por exemplo, do gênero Saccharomyces, Kluyveromyces, Arxula, Debaryomyces, Candida, Pichia, Phaffia, Schizosaccharomyces, Hansenula, Kloeckera, Schwanniomyces, Torula ou Yarrowia. Espécies de leveduras adequadas podem incluir, por exemplo, S. cerevisiae, S. bulderi, S. barnetti, S. exiguus, S. uvarum, S. diastaticus, S. boulardii, C. utilis, K. lactis, K. marxianus ou K. fragilis. Em algumas formas de realização, a levedura é selecionada no grupo que consiste em Saccharomyces cerevisiae, Schizzosaccharomyces pombe, Candida albicans, Pichia pastoris, Pichia stipitis, Yarrowia lipolytica, Hansenula polymorpha, Phaffia rhodozyma, Candida utilis, Arxula adeninivorans, Debaryomyces hansenii, Debaryomyces polymorphus, Schizosaccharomyces pombe e Schwanniomyces occidentalis. Em outras formas de realização, a levedura é de Saccharomyces cerevisiae, Schizzosaccharomyces pombe, Candida albicans, Pichia pastoris, Pichia stipitis, Yarrowia lipolytica, Hansenula polymorpha, Phaffia rhodozyma, Candida utilis, Arxula adeninivorans, Debaryomyces hansenii, Debaryomyces polymorphus, Schizosaccharomyces pombe ou Schwanniomyces occidentalis. Em uma forma de realização particular, a célula hospedeira de levedura é Saccharomyces cerevisiae. Em algumas formas de realização, a célula hospedeira pode ser uma célula de levedura oleaginosa. Por exemplo, a célula hospedeira de levedura oleaginosa pode ser do gênero Blakeslea, Candida, Cryptococcus, Cunninghamella, Lipomyces, Mortierella, Mucor, Phycomyces, Pythium, Rhodosporidum, Rhodotorula, Trichosporon ou Yarrowia. Em algumas formas de realização alternativas, a célula hospedeira pode ser uma célula hospedeira de microalgas oleaginosas (por exemplo, do gênero Thraustochytrio ou Schizochytrio). Em uma forma de realização, a célula de levedura e a célula hospedeira de levedura recombinante são do gênero Saccharomyces e, em algumas formas de realização, da espécie Saccharomyces cerevisiae. Células Hospedeiras de Levedura Recombinantes

[0037] Em algumas formas de realização, as células hospedeiras de levedura são células hospedeiras de levedura recombinantes que foram geneticamente modificadas. A(s) modificação(ões) genética(s) visa(m) aumentar a expressão de um gene-alvo específico (considerado heterólogo para a célula hospedeira de levedura) e pode(m) ser feita(s) em um ou vários locais genéticos (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou mais). No contexto da presente revelação, quando a célula de levedura recombinante é qualificada como sendo “geneticamente modificada”, entende-se que ela foi manipulada para adicionar pelo menos um ou mais resíduos de ácido nucleico heterólogo ou exógeno (por exemplo, uma modificação genética). Em algumas formas de realização, o um ou mais resíduos de ácido nucleico adicionados podem ser derivados de uma célula heteróloga ou da própria célula hospedeira recombinante. Neste último cenário, o(s) resíduo(s) de ácido nucleico é(são) adicionado(s) em um ou mais locais genômicos diferentes do local genômico nativo. As manipulações genéticas não ocorreram na natureza e são os resultados de manipulações in vitro da levedura.

[0038] Quando expressos em células hospedeiras de levedura recombinantes, as enzimas heterólogas aqui descritas são codificadas em uma ou mais moléculas de ácido nucleico heterólogas. O termo “heterólogo”, quando usado em referência a uma molécula de ácido nucleico (como um promotor, um terminador ou uma sequência de codificação) ou uma proteína, se refere a uma molécula de ácido nucleico ou a uma proteína que não é encontrada nativamente na célula hospedeira recombinante. “Heterólogo” também inclui uma região de codificação/promotor/terminador nativa, ou parte dela, que é introduzida ao organismo de origem em uma forma diferente do gene nativo correspondente, por exemplo, não em seu local natural no genoma do organismo. A molécula de ácido nucleico heteróloga é intencionalmente introduzida na célula hospedeira recombinante. Por exemplo, um elemento heterólogo poderia ser derivado de uma cepa diferente da célula hospedeira, ou de um organismo de um grupo taxonômico diferente (por exemplo, domínio, reino, filo, classe, ordem, gênero familiar ou espécie diferente, ou qualquer subgrupo dentro de uma dessas classificações).

[0039] A molécula de ácido nucleico heteróloga presente na célula hospedeira de levedura recombinante pode ser integrada ao genoma da célula hospedeira. O termo “integrado(a)(s)”, tal como aqui utilizado, se refere a elementos genéticos que são colocados, através de técnicas de biologia molecular, no genoma de uma célula hospedeira. Por exemplo, os elementos genéticos podem ser colocados nos cromossomos da célula hospedeira em oposição a um vetor, como um plasmídeo transportado pela célula hospedeira. Métodos de integração de elementos genéticos ao genoma de uma célula hospedeira são bem conhecidos na técnica e incluem a recombinação homóloga. A molécula de ácido nucleico heteróloga pode estar presente em uma ou mais cópias (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou até mais cópias) no genoma da célula hospedeira de levedura. Alternativamente, a molécula de ácido nucleico heteróloga pode ser de replicação independentemente do genoma da levedura. Nessa forma de realização, a molécula de ácido nucleico pode ser estável e auto-replicante.

[0040] As células hospedeiras de levedura recombinantes adequadas que podem ser usadas no contexto da presente revelação podem ser, por exemplo, do gênero Saccharomyces, Kluyveromyces, Arxula, Debaryomyces, Candida, Pichia, Phaffia, Schizosaccharomyces, Hansenula, Kloeckera, Schwanniomyces, Torula ou Yarrowia. Espécies de leveduras adequadas podem incluir, por exemplo, S. cerevisiae, S. bulderi, S. barnetti, S. exiguus, S. uvarum, S. diastaticus, S. boulardii, C. utilis, K. lactis, K. marxianus ou K. fragilis. Em algumas formas de realização, a levedura é selecionada no grupo que consiste em Saccharomyces cerevisiae, Schizzosaccharomyces pombe, Candida albicans, Pichia pastoris, Pichia stipitis, Yarrowia lipolytica, Hansenula polymorpha, Phaffia rhodozyma, Candida utilis, Arxula adeninivorans, Debaryomyces hansenii, Debaryomyces polymorphus, Schizosaccharomyces pombe e Schwanniomyces occidentalis. Em outra forma de realização, a célula hospedeira de levedura recombinante é de Saccharomyces cerevisiae, Schizzosaccharomyces pombe, Candida albicans, Pichia pastoris, Pichia stipitis, Yarrowia lipolytica, Hansenula polymorpha, Phaffia rhodozyma, Candida utilis, Arxula adeninivorans, Debaryomyces hansenii, Debaryomyces polymorphus, Schizosaccharomyces pombe ou Schwanniomyces occidentalis. Em uma forma de realização particular, a célula hospedeira de levedura é de Saccharomyces cerevisiae. Em algumas formas de realização, a célula hospedeira pode ser uma célula de levedura oleaginosa. Por exemplo, a célula hospedeira de levedura oleaginosa pode ser do gênero Blakeslea, Candida, Cryptococcus, Cunninghamella, Lipomyces, Mortierella, Mucor, Phycomyces, Pythium, Rhodosporidum, Rhodotorula, Trichosporon ou Yarrowia. Em algumas formas de realização alternativas, a célula hospedeira pode ser uma célula hospedeira de microalgas oleaginosas (por exemplo, do gênero Thraustochytrio ou Schizochytrio). A célula de levedura e a célula hospedeira de levedura recombinante podem ser do mesmo ou diferente gênero ou espécie. Em uma forma de realização, a célula hospedeira de levedura recombinante é do gênero Saccharomyces e, em algumas formas de realização, da espécie Saccharomyces cerevisiae. Em uma forma de realização, a célula de levedura e a célula hospedeira de levedura recombinante são do gênero Saccharomyces e, em algumas formas de realização, da espécie Saccharomyces cerevisiae. Enzima Heteróloga

[0041] A célula hospedeira de levedura recombinante da presente revelação inclui uma molécula de ácido nucleico heteróloga destinada a permitir a expressão (por exemplo, a codificação) de uma ou mais enzimas heterólogas. Em uma forma de realização, a célula hospedeira de levedura recombinante pode incluir mais de uma molécula de ácido nucleico heteróloga para expressar mais de uma enzima heteróloga. Em algumas formas de realização específicas, a célula hospedeira de levedura recombinante pode incluir duas enzimas heterólogas distintas que podem ser codificadas em uma ou mais moléculas de ácido nucleico heterólogas. No contexto da presente revelação, a enzima heteróloga pode ser, sem limitação, uma enzima envolvida na clivagem ou hidrólise de seu substrato (por exemplo, uma enzima lítica e, em algumas formas de realização, uma enzima sacarolítica). Ainda em outra formas de realização, a enzima pode ser uma glicosídeo hidrolase. No contexto da presente revelação, o termo “glicosídeo hidrolase” refere-se a uma enzima envolvida na digestão, metabolismo e/ou hidrólise de carboidratos, incluindo amilases, celulases, hemicelulases, enzimas acessórias celulolíticas e amilolíticas, inulinases, levanases, trealases, pectinases e enzimas que usam açúcar pentose. Em outra forma de realização, a enzima pode ser uma protease. No contexto da presente revelação, o termo “protease” se refere a uma enzima envolvida na digestão, metabolismo e/ou hidrólise de proteínas. Ainda em outra formas de realização, a enzima pode ser uma esterase. No contexto da presente revelação, o termo “esterase” refere-se a uma enzima envolvida na hidrólise de um éster proveniente de um ácido ou álcool, incluindo fosfatases, como as fitases.

[0042] Como se usa no contexto da presente revelação, a expressão “hidrolase” (E.C. 3) refere-se a uma proteína que tem atividade enzimática e é capaz de catalisar a hidrólise de uma ligação química. Por exemplo, a hidrolase pode ser uma esterase (E.C. 3.1, por exemplo, fitase, lipase, fosfolipase A1 e/ou fosfolipase A2), pode ser ligações não peptídicas C-N clivadas (E.C. 3.5, por exemplo, uma asparaginase), pode ser uma glicosilase (E.C. 3.2, por exemplo, uma amilase (E.C.

3.2.1.1), uma glucanase, uma glicosidase (E.C. 3.2.1), uma celulase (E.C. 3.2.1.4), uma trealase (E.C. 3.2.1.28), uma pectinase e/ou uma lactase (E.C. 3.2.1.108)), uma protease (E.C. 3.4, por exemplo, uma protease bacteriana, uma protease vegetal ou uma protease fúngica). Quando a hidrolase é uma amilase, ela pode ser, por exemplo, uma alfa-amilase fúngica, uma alfa-amilase bacteriana, uma alfa-amilase maltogênica, uma maltotetra-hidrolase, uma alfa- ou beta-amilase de planta (por exemplo, cevada) , uma alfa-amilase fúngica e/ou uma glucoamilase. Quando a hidrolase é uma glicosidase, ela pode ser, por exemplo, uma beta glucosidase. Quando a hidrolase é uma celulase, ela pode ser, por exemplo, uma celulase e/ou uma hemicelulase (tal como, por exemplo, uma xilanase).

[0043] Em algumas formas de realização, a hidrolase é uma enzima amilolítica. Conforme aqui utilizado, a expressão “enzima amilolítica” refere-se a uma classe de enzimas capazes de hidrolisar amido ou amido hidrolisado. As enzimas amilolíticas incluem, mas não se limitam a, α-amilases (EC 3.2.1.1, algumas vezes referidas como α-amilase fúngica, consulte abaixo), amilase maltogênica (EC

3.2.1.133), glucoamilase (EC 3.2.1.3), glucan 1,4-α-maltotetra-hidrolase (EC

3.2.1.60), pululanase (EC 3.2.1.41), isoamilase (EC 3.2.1.68) e amilomaltase (EC 2.4

1.25). Em uma forma de realização, a uma ou mais enzimas amilolíticas pode ser uma alfa-amilase de Aspergillus oryzae (e tem, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, uma variante da mesma ou um fragmento da mesma), Saccharomycopsis fibuligera (Acesso ao GenBank nº CAA29233.1) (e tem, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 68, uma variante da mesma ou um fragmento da mesma), e Bacillus amyloliquefaciens (Acesso ao GenBank nº ABS72727) (e tem, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 69, uma variante da mesma ou um fragmento da mesma), uma alfa-amilase maltogênica de Geobacillus stearothermophilus (e tem, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, uma variante da mesma ou um fragmento da mesma), uma glucoamilase de Saccharomycopsis fibuligera (e tem, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, uma variante da mesma ou um fragmento da mesma), e Rasamsonia emersonii (Acesso ao GenBank nº CAC28076) (e tem, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 67, uma variante da mesma ou um fragmento da mesma), uma glucan 1,4-alfa-maltotetrao-hidrolase de Pseudomonas saccharophila (e tem, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4, uma variante da mesma ou um fragmento da mesma), uma pululanase de Bacillus naganoensis (e tem, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5, uma variante da mesma ou um fragmento da mesma), uma pululanase de Bacillus acidopullulyticus (e tem, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6, uma variante da mesma ou um fragmento da mesma), uma isoamilase de Pseudomonas amyloderamosa (e tem, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7, uma variante da mesma ou um fragmento da mesma), uma amilomaltase de Thermus thermophilus (e tem, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8, uma variante da mesma ou um fragmento da mesma), e / ou uma termotolerante de alfa-amilase de Pyrococcus furiosus (Acesso ao GenBank nº WP_014835153.1) (e tem, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13 ou 64, uma variante da mesma ou um fragmento da mesma), Thermococcus thioreducens (Acesso ao GenBank nº WP_055428342.1) (e tem, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10 ou 61, uma variante da mesma ou um fragmento da mesma), Thermococcus eurythermalis (Acesso ao GenBank nº WP_050002265.1) (e tem, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11 ou 62, uma variante da mesma ou um fragmento da mesma), Thermococcus hydrothermalis (Acesso ao GenBank nº AAC97877.1) (e tem, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 63, uma variante da mesma ou um fragmento da mesma), e Thermococcus gammatolerans (Acesso ao GenBank nº ACS32724.1) (e tem, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9 ou 60, uma variante da mesma ou um fragmento da mesma). Em uma forma de realização, a enzima heteróloga é uma alfa-amilase de Pyrococcus furiosus (Acesso ao GenBank nº WP_014835153.1) (e tem, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13, uma variante da mesma ou um fragmento da mesma). Em uma forma de realização, a enzima heteróloga é derivada de uma alfa-amilase de Pyrococcus furiosus (e tem, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 65, uma variante da mesma ou um fragmento da mesma). Em uma forma de realização, a enzima heteróloga é derivada de uma alfa-amilase de Thermococcus hidrothermalis (e tem, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 66, uma variante da mesma ou um fragmento da mesma).

[0044] Em algumas formas de realização, a hidrolase é uma enzima trealase. Conforme aqui utilizado, a expressão “enzima trealase” refere-se a uma classe de enzimas capazes de catalisar a conversão de trealose em glicose. Em uma forma de realização, a uma ou mais enzimas trealase pode ser uma trealase de Aspergillus fumigatus (Acesso ao GenBank nº XP_748551) (e tem, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 70, uma variante da mesma ou um fragmento da mesma), e Neurospora crassa (Acesso ao GenBank nº XP_960845. 1) (e tem, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 71, uma variante da mesma ou um fragmento da mesma).

[0045] A enzima heteróloga adicional pode ser uma “enzima celulolítica”, uma enzima envolvida na digestão, metabolismo e/ou hidrólise da celulose. O termo “celulase” refere-se a uma classe de enzimas que catalisam a celulólise (ou seja , a hidrólise da celulose). São conhecidos vários tipos diferentes de celulases, que diferem estruturalmente e mecanisticamente. Existem tipos gerais de celulases com base no tipo de reação catalisada: a endocelulase quebra as ligações internas para romper a estrutura cristalina da celulose e expor as cadeias individuais de polissacarídeos de celulose; a exocelulase cliva 2-4 unidades das extremidades das cadeias expostas produzidas por endocelulase, resultando em tetrassacarídeos ou dissacarídeos, como a celobiose. Existem dois tipos principais de exocelulases (ou celobio-hidrolases, forma abreviada CBH) - um tipo que funciona processivamente a partir da extremidade redutora e um tipo que trabalha processivamente a partir da extremidade não redutora da celulose; a celobiase ou betaglucosidase hidrolisa o produto da exocelulase em monossacarídeos individuais; as celulases oxidativas que despolimerizam a celulose por reações radicais, como, por exemplo, a celobiose desidrogenase (receptora); as celulose fosforilases que despolimerizam a celulose usando fosfatos em vez de água. No caso mais familiar da atividade de celulase, o complexo enzimático decompõe a celulose em beta-glucose. A “celulase” pode ser qualquer enzima envolvida na digestão, metabolismo e/ou hidrólise da celulose, incluindo uma endoglucanase, glucosidase, celobio-hidrolase, xilanase, glucanase, xilosidase, xilano esterase, arabinofuranosidase, galactosidase, celobiose fosforilase, celodextrina fosforilase, mananase, manosidase, xiloglucanase, endoxilanase, glucuronidase, acetilxilanoesterase, arabinofurano-hidrolase, swolenina, glucuronil esterase, expansina, pectinase e a proteína feruloil esterase.

[0046] A enzima heteróloga adicional pode ter “atividade hemicelulolítica”, uma enzima envolvida na digestão, metabolismo e/ou hidrólise da hemicelulose. O termo “hemicelulase” refere-se a uma classe de enzimas que catalisam a hidrólise da celulose. Sabe-se que vários tipos diferentes de enzimas têm atividade hemicelulolítica, incluindo, mas não se limitando a, xilanases e manases.

[0047] A enzima heteróloga adicional pode ter “atividade xilanolítica”, uma enzima que tem a capacidade de hidrolisar as ligações glicosídicas em oligopentoses e polipentoses. O termo “xilanase” é o nome dado a uma classe de enzimas que degradam o polissacarídeo linear beta-1,4-xilano em xilose, assim quebrando a hemicelulose, um dos principais componentes das paredes celulares de plantas. As xilanases incluem as enzimas que correspondem ao Número da Comissão de Enzimas 3.2.1.8. A proteína heteróloga também pode ser uma “enzima que metabiliza a xilose”, uma enzima envolvida na digestão, metabolismo e/ou hidrólise da xilose, incluindo uma xilose isomerase, xiluloquinase, xilose redutase, xilose desidrogenase, xilitol desidrogenase, xilonato desidratase, xilose transcetolase e uma proteína xilose transaldolase. A “enzima que usa açúcar pentose” pode ser qualquer enzima envolvida na digestão, metabolismo e/ou hidrólise do açúcar pentose, incluindo xilanase, arabinase, arabinoxilanase, arabinosidase, arabinofuranosidase, arabinoxilanase, arabinosidase e arabinofuranosidase, arabinose isomerase, ribulose- 5-fosfato 4-epimerase, xilose isomerase, xiluloquinase, xilose redutase, xilose desidrogenase, xilitol desidrogenase, xilonato desidratase, xilose transcetolase e / ou xilose transaldolase Em uma forma de realização, a uma ou mais enzimas xilanase pode ser uma xilanase de Aspergillus niger (Acesso ao GenBank nº CAA03655.1) (e tem, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 72, uma variante da mesma ou um fragmento da mesma).

[0048] A enzima heteróloga adicional pode ter “atividade manânica”, uma enzima que tem a capacidade de hidrolisar os resíduos β-D-manose não redutores terminais em β-D-manosídeos. As manases são capazes de quebrar a hemicelulose, um dos principais componentes das paredes da célula vegetal. As xilanases incluem as enzimas que correspondem ao Número da Comissão de Enzimas 3.2.25.

[0049] A enzima heteróloga adicional pode ser uma “pectinase”, uma enzima como a pectoliase, pectozima e poligalacturonase, comumente referidas na fabricação de enzimas pécticas. Essas enzimas quebram a pectina, um substrato polissacarídeo encontrado nas paredes celulares das plantas.

[0050] A enzima heteróloga adicional pode ter “atividade fitolítica”, uma enzima que catalisa a conversão de ácido fítico em fósforo inorgânico. As fitases (EC

3.2.3) podem pertencer à família das histidina ácido fosfatases, fitases β-propulsoras, fosfatases ácidas roxas ou fitases semelhantes à proteína tirosina fosfatase. Em uma forma de realização, a uma ou mais enzimas fitase pode ser uma fitase deCitrobacter braakii (Acesso ao GenBank nº AY471611.1) (e tem, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 73, uma variante da mesma ou um fragmento da mesma).

[0051] A enzima heteróloga adicional pode ter “atividade proteolítica”, uma enzima envolvida na digestão, metabolismo e/ou hidrólise de proteínas, incluindo serina proteases, treonina proteases, cisteína proteases, aspartato proteases (por exemplo, proteases com atividade aspártica), proteases de ácido glutâmico e metaloproteases. Em algumas formas de realização, a enzima heteróloga com atividade proteolítica é uma enzima protease. Em uma forma de realização, a uma ou mais enzimas protease pode ser uma protease deSaccharomycopsis fibuligera (Acesso ao GenBank nº P22929) (e tem, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 74, uma variante da mesma ou um fragmento da mesma), e Aspergillus fumigatus (Acesso ao GenBank nº P41748) (e ter, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 75, uma variante da mesma ou um fragmento da mesma).

[0052] A enzima heteróloga pode ser uma variante de uma enzima conhecida/nativa. Uma variante compreende pelo menos uma diferença de aminoácidos quando comparada à sequência de aminoácidos da enzima nativa/conhecida. Conforme aqui utilizado, uma variante refere-se a alterações na sequência de aminoácidos que não afetam negativamente as funções biológicas da enzima heteróloga. Diz-se que uma substituição, inserção ou deleção afeta adversamente a enzima quando a sequência alterada impede ou interrompe uma função biológica associada à enzima heteróloga. Por exemplo, a carga geral, a estrutura ou as propriedades hidrofóbicas-hidrofílicas da enzima podem ser alteradas sem afetar negativamente uma atividade biológica. Assim, a sequência de aminoácidos pode ser alterada, por exemplo, para tornar o peptídeo mais hidrofóbico ou hidrofílico, sem afetar negativamente as atividades biológicas da enzima heteróloga. As variantes enzimáticas têm pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade à enzima heteróloga descrita neste documento. O termo “identidade percentual”, conhecido na técnica, é uma relação entre duas ou mais sequências de polipeptídeos ou duas ou mais sequências de polinucleotídeos, conforme determinado por comparação das sequências. O nível de identidade pode ser determinado convencionalmente usando programas de computador conhecidos. A identidade pode ser facilmente calculada por métodos conhecidos, incluindo, entre outros, os descritos em: Computational Molecular Biology (editora Lesk, A. M.) Editora Oxford University, NY (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (editora Smith, D. W.) editora

Academic Press, NY (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Parte I (Griffin, A. M. e Griffin, H. G., eds.) Editora Humana Press, NJ (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) editora Academic Press (1987); e Sequence Analysis Primer (editores Gribskov, M. e Devereux, J.) Editora Stockton, NY (1991). Os métodos preferidos para determinar a identidade são concebidos para oferecer a melhor correspondência entre as sequências testadas. Os métodos para determinar a identidade e a semelhança são codificados em programas de computador publicamente disponíveis. Os alinhamentos de sequência e os cálculos de identidade percentual podem ser realizados usando o programa Megalign do conjunto de computação de bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, Wisconsin). Vários alinhamentos das sequências aqui reveladas foram realizados usando o método de alinhamento Clusteral (Higgins e Sharp (1989) CABIOS. 5:151 a 153) com os parâmetros padrão (PENALIDADE PARA LACUNAS = 10, PENALIDADE PARA COMPRIMENTO DAS LACUNA = 10). Os parâmetros padrão para alinhamentos de pares usando o método Clusteral foram KTUPLB 1, PENALIDADE PARA LACUNAS = 3, JANELA = 5 e DIAGONAIS SALVAS = 5.

[0053] A enzima heteróloga variante aqui descrita pode ser (i) aquela em que um ou mais dos resíduos de aminoácidos são substituídos por um resíduo de aminoácido conservado ou não conservado (de preferência, um resíduo de aminoácido conservado) e esse resíduo de aminoácido substituído pode ou não ser codificado pelo código genético, ou (ii) aquela em que um ou mais dos resíduos de aminoácido incluem um grupo substituinte, ou (iii) aquela em que o polipeptídeo maduro é fusionado com outro composto, como um composto para aumentar a meia- vida do polipeptídeo (por exemplo, o polietilenoglicol), ou (iv) aquela em que os aminoácidos adicionais são fusionados ao polipeptídeo maduro para purificação do polipeptídeo. Uma “variante” da enzima heteróloga pode ser uma variante conservadora ou uma variante alélica.

[0054] A enzima heteróloga pode ser um fragmento de uma enzima ou fragmento conhecido/nativo de uma variante de uma enzima conhecida/nativa. Em algumas formas de realização, o fragmento corresponde à enzima conhecida/nativa da qual o peptídeo de sinal foi removido. Nas formas de realização adicionais, os “fragmentos” de proteínas heterólogas têm pelo menos 100, 200, 300, 400, 500, 600,

700, 800, 900 ou mais aminoácidos consecutivos da enzima heteróloga. Um fragmento compreende pelo menos um resíduo de aminoácido a menos quando comparado à sequência de aminoácidos da enzima heteróloga conhecida / nativa e ainda possui a atividade enzimática da enzima heteróloga de comprimento total. Em algumas formas de realização, fragmentos da enzima heteróloga podem ser empregados para produzir o heterólogo de comprimento total correspondente pela síntese peptídica. Portanto, os fragmentos podem ser empregados como intermediários para a produção de proteínas de comprimento total.

[0055] Na célula hospedeira de levedura recombinante da presente revelação, a enzima heteróloga pode ser “de associação celular” à célula hospedeira de levedura recombinante porque ela é concebida para ser expresso e permanecer fisicamente associada às células hospedeiras de levedura recombinantes. Em uma forma de realização, a enzima heteróloga pode ser expressa dentro da célula hospedeira de levedura recombinante (intracelularmente). Nessa forma de realização, a enzima heteróloga não precisa estar associado à parede da célula hospedeira de levedura recombinante. Quando se pretende que a enzima heteróloga seja expressa intracelularmente, sua sequência de sinal, se presente na sequência nativa, pode ser excluída para permitir a expressão intracelular.

[0056] Em outra forma de realização, a enzima heteróloga da presente revelação pode ser secretada. Em algumas formas de realização, a enzima heteróloga secretada permanece fisicamente associada à célula hospedeira de levedura recombinante. Em uma forma de realização, pelo menos uma parte (geralmente pelo menos um terminal) da enzima heteróloga é ligada, covalentemente, não covalentemente e/ou eletrostaticamente, por exemplo, à parede celular (e, em algumas formas de realização, à membrana citoplasmática). Por exemplo, a enzima heteróloga pode ser modificada para portar um ou mais domínios transmembrana, para ter uma ou mais modificações lipídicas (miristoilação, palmitoilação, farnesilação e/ou fenilação), para interagir com uma ou mais proteínas associadas à membrana e/ou para interações com as balsas lipídicas celulares. Embora a enzima heteróloga possa não estar diretamente ligado à membrana celular ou parede celular (por exemplo, tal como quando a ligação ocorre através de uma porção de conexão), a enzima é, no entanto, considerada uma enzima heteróloga “associada à célula”, de acordo com a presente invenção.

[0057] Em algumas formas de realização, a enzima heteróloga pode ser expressa para estar localizada e associada à parede celular da célula hospedeira de levedura recombinante. Em algumas formas de realização, a enzima heteróloga é expressa para estar localizada e associada à superfície externa da parede celular da célula hospedeira. Todas as células hospedeiras de levedura recombinantes têm uma parede celular (que inclui uma membrana citoplasmática) que define os ambientes intracelulares (por exemplo, voltados internamente para o núcleo) e extracelulares (por exemplo, voltados externamente). A enzima heteróloga pode estar localizada (e, em algumas formas de realização, fisicamente associada a) na face externa da parede celular do hospedeiro de levedura recombinante e, em outras formas de realização, na face externa da membrana citoplasmática do hospedeiro de levedura recombinante. No contexto da presente revelação, a expressão “associada à face externa da parede celular/membrana citoplasmática da célula hospedeira de levedura recombinante” refere-se à capacidade da enzima heteróloga de se integrar fisicamente (de forma covalente ou não covalente), pelo menos em parte, à parede celular (e, em algumas formas de realização, à membrana citoplasmática) da célula hospedeira de levedura recombinante. A integração física pode ser atribuída à presença, por exemplo, de um domínio transmembrana na enzima heteróloga, um domínio capaz de interagir com uma proteína da membrana citoplasmática na enzima heteróloga, uma modificação pós-translacional feita à enzima heteróloga (por exemplo, lipidação), etc.

[0058] Algumas enzimas heterólogas têm a capacidade intrínseca de se localizar em e associar-se à parede celular de uma célula hospedeira de levedura recombinante (por exemplo, sendo associadas à célula). Exemplos de enzimas heterólogas com a capacidade intrínseca de serem associadas a células podem ser encontrados, por exemplo, no pedido de patente PCT/IB2018/051670 depositado em 13 de março de 2018 e publicado sob o nº WO2018/167669 em 20 de setembro de

2018.

[0059] No entanto, em algumas circunstâncias, pode ser justificado aumentar ou fornecer associação celular a algumas enzimas heterólogas porque elas apresentam associação celular intrínseca insuficiente ou simplesmente não têm associação celular intrínseca. Nessa forma de realização, é possível fornecer a enzima heteróloga como uma construção quimérica combinando-a com uma porção de aminoácidos de conexão que fornecerá ou aumentará a fixação à parede celular da célula hospedeira de levedura recombinante. Nessa forma de realização, a enzima heteróloga quimérica será considerada “conectada”. É preferível que a porção de conexão de aminoácidos da enzima quimérica seja neutra em relação à atividade biológica da enzima heteróloga, por exemplo, não interfira com a atividade enzimática da enzima heteróloga. Em algumas formas de realização, a associação da porção de conexão de aminoácidos com a enzima heteróloga pode aumentar a atividade biológica da enzima heteróloga (quando comparada à forma “livre” não conectada).

[0060] Em uma forma de realização, uma porção de conexão pode ser usada para ser expressa com a enzima heteróloga para localizar a enzima heteróloga na parede da célula hospedeira de levedura recombinante. Várias porções de conexão de aminoácidos são conhecidas na arte e podem ser usadas nas enzimas quiméricas da presente revelação. A porção de conexão pode ser um domínio transmembrana encontrado em outra proteína e permitir que a enzima quimérica tenha um domínio transmembrana. Nessa forma de realização, a porção de conexão pode ser derivada da proteína FLO1 (tendo, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15, uma variante da mesma ou um fragmento da mesma ou ser codificada pela sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 14).

[0061] Ainda em outro exemplo, a porção de conexão de aminoácidos pode ser modificada após a tradução para incluir uma âncora de glicosilfosfatidilinositol (GPI) e permitir que a proteína quimérica tenha uma âncora de GPI. As âncoras de GPI são glicolipídeos ligados ao terminal de uma proteína (e, em algumas formas de realização, ao terminal carboxila de uma proteína), o que permite a ancoragem da proteína à membrana citoplasmática da membrana celular. As porções de ligação de aminoácido capazes de fornecer uma âncora de GPI incluem, mas não se limitam às associadas/derivadas de uma proteína SET1 (tendo, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17, uma variante da mesma ou um fragmento da mesma ou ser codificada pela sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 16); a proteína TIR1 (tendo, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25, uma variante da mesma ou um fragmento da mesma ou ser codificada pela sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 24); a proteína CWP2 (tendo, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23, uma variante da mesma ou um fragmento da mesma ou ser codificada pela sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 22); a proteína CCW12 (tendo, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, uma variante da mesma ou um fragmento da mesma ou ser codificada pela sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 20); a proteína SPI1 (tendo, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19, uma variante da mesma ou um fragmento da mesma ou ser codificada pela sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 18); a proteína PST1 (tendo, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27, uma variante da mesma ou um fragmento da mesma ou ser codificada pela sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 26) ou uma combinação de uma proteína AGA1 e uma AGA2 (tendo, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29, uma variante da mesma ou um fragmento da mesma ou ser codificada pela sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 28 ou ter, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 31, uma variante da mesma ou um fragmento da mesma ou ser codificada pela sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 30).

[0062] A porção de conexão de aminoácidos pode ser uma variante de um porção de conexão de aminoácidos conhecida/nativa, por exemplo, uma variante das porções de conexão de aminoácidos aqui descritas. Uma variante compreende pelo menos uma diferença de aminoácidos quando comparada à sequência de aminoácidos da porção de conexão de aminoácidos nativa. Conforme aqui utilizado, uma variante refere-se a alterações na sequência de aminoácidos que não afetam negativamente as funções biológicas da porção de conexão de aminoácidos (por exemplo, a capacidade de localizar-se sobre a face externa e a ancoragem da proteína heteróloga na membrana citoplasmática). Diz-se que uma substituição, inserção ou deleção afeta adversamente a proteína quando a sequência alterada impede ou interrompe uma função biológica associada à porção de conexão de aminoácidos (por exemplo, a localização sobre a face externa e a ancoragem da proteína heteróloga na membrana citoplasmática). Por exemplo, a carga geral, a estrutura ou as propriedades hidrofóbicas-hidrofílicas da proteína podem ser alteradas sem afetar negativamente uma atividade biológica. Assim, a sequência de aminoácidos pode ser alterada, por exemplo, para tornar o peptídeo mais hidrofóbico ou hidrofílico, sem afetar negativamente as atividades biológicas da porção de conexão de aminoácidos. As variantes da porção de conexão de aminoácidos têm pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade às porções de conexão de aminoácidos descritas neste documento. O termo “identidade percentual”, conhecido na técnica, é uma relação entre duas ou mais sequências de polipeptídeos ou duas ou mais sequências de polinucleotídeos, conforme determinado por comparação das sequências. O nível de identidade pode ser determinado convencionalmente usando programas de computador conhecidos. A identidade pode ser facilmente calculada por métodos conhecidos, incluindo, entre outros, os descritos em: Computational Molecular Biology (editora Lesk, A. M.) Editora Oxford University, NY (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (editora Smith, D. W.) editora Academic Press, NY (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Parte I (Griffin, A. M. e Griffin, H. G., eds.) Editora Humana Press, NJ (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) editora Academic Press (1987); e Sequence Analysis Primer (editores Gribskov, M. e Devereux, J.) Editora Stockton, NY (1991). Os métodos preferidos para determinar a identidade são concebidos para oferecer a melhor correspondência entre as sequências testadas. Os métodos para determinar a identidade e a semelhança são codificados em programas de computador publicamente disponíveis. Os alinhamentos de sequência e os cálculos de identidade percentual podem ser realizados usando o programa Megalign do conjunto de computação de bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, Wisconsin). Vários alinhamentos das sequências aqui reveladas foram realizados usando o método de alinhamento Clusteral (Higgins e Sharp (1989) CABIOS. 5:151 a 153) com os parâmetros padrão (PENALIDADE PARA LACUNAS = 10, PENALIDADE PARA COMPRIMENTO DAS LACUNA = 10). Os parâmetros padrão para alinhamentos de pares usando o método Clusteral foram KTUPLB 1, PENALIDADE PARA LACUNAS = 3, JANELA = 5 e DIAGONAIS SALVAS = 5.

[0063] As porções de conexão de aminoácidos variantes aqui descritas podem ser (i) aquela em que um ou mais dos resíduos de aminoácidos são substituídos por um resíduo de aminoácido conservado ou não conservado (de preferência, um resíduo de aminoácido conservado) e esse resíduo de aminoácido substituído pode ou não ser codificado pelo código genético, ou (ii) aquela em que um ou mais dos resíduos de aminoácido incluem um grupo substituinte, ou (iii) aquela em que o polipeptídeo maduro é fusionado com outro composto, como um composto para aumentar a meia-vida do polipeptídeo (por exemplo, o polietilenoglicol), ou (iv) aquela em que os aminoácidos adicionais são fusionados ao polipeptídeo maduro para purificação do polipeptídeo. Uma “variante” da porção de conexão de aminoácidos pode ser uma variante conservadora ou uma variante alélica.

[0064] A porção de conexão de aminoácidos pode ser um fragmento de um porção de conexão de aminoácidos conhecida/nativa ou fragmento de uma variante de uma porção de conexão de aminoácidos conhecida/nativa. Os “fragmentos” da porção de conexão de aminoácidos têm pelo menos 10 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou mais aminoácidos consecutivos da porção de conexão de aminoácidos. Um fragmento compreende pelo menos um resíduo de aminoácido quando comparado à sequência de aminoácidos da porção de conexão de aminoácidos conhecida/nativa e ainda possui a atividade biológica da porção de conexão de aminoácidos de comprimento total (por exemplo, a localização para a parede celular).

[0065] Nas formas de realização em que uma porção de conexão de aminoácidos é desejável, a enzima heteróloga pode ser fornecida como uma enzima quimérica expressa pela célula hospedeira de levedura recombinante e tendo uma das seguintes fórmulas (fornecidas da orientação amino (NH2) à carboxila (COOH)): HE – L – TT (I) ou TT – L – HE (II)

[0066] Em ambas as fórmulas, o resíduo “HE” refere-se à porção de enzima heteróloga, o resíduo “L” refere-se à presença de um ligante opcional, enquanto o resíduo “TT” refere-se a uma porção de conexão de aminoácidos. Nas enzimas quiméricas da fórmula (I), o terminal amino do conector de aminoácidos está localizado (direta ou indiretamente) no terminal carboxila (COOH ou C) da porção de enzima heteróloga. Nas enzimas quiméricas da fórmula (II), o terminal carbóxi do conector de aminoácidos está localizado (direta ou indiretamente) no terminal amino (NH2 ou N) da porção de enzima heteróloga.

[0067] Quando o ligante de aminoácidos (L) está ausente, a porção de conexão de aminoácidos está diretamente associada à enzima heteróloga. Nas quimeras da fórmula (I), isso significa que o terminal carboxila da porção de enzima heteróloga está diretamente associado (com uma ligação amida) ao terminal amino da porção de conexão de aminoácidos. Nas quimeras da fórmula (I), isso significa que o terminal carboxila da porção de conexão de aminoácidos está diretamente associado (com uma ligação amida) ao terminal amino da enzima heteróloga.

[0068] Em algumas formas de realização, a presença de um ligante de aminoácidos (L) é desejável para fornecer, por exemplo, alguma flexibilidade entre a porção de enzima heteróloga e a porção de conexão de aminoácidos ou para facilitar a construção da molécula de ácido nucleico heteróloga. Como usado na presente revelação, o “ligante de aminoácido” ou “L” refere-se a um trecho de um ou mais aminoácidos separando a porção de enzima heteróloga HE e a porção de conexão de aminoácidos TT (por exemplo, indiretamente ligando a porção de enzima heteróloga HE à porção de conexão de aminoácidos TT). Os ligantes de aminoácidos são frequentemente compostos por resíduos flexíveis, como glicina e serina, de modo que os domínios de proteína ou polipeptídeos adjacentes são livres para se moverem em relação uns aos outros. Ligantes mais longos são usados quando necessário garantir que dois domínios adjacentes não interfiram estericamente um com o outro. É preferível que o ligante de aminoácidos seja neutro , por exemplo, não interfira com a atividade biológica da enzima heteróloga nem com a atividade biológica da porção de conexão de aminoácidos. Em algumas formas de realização, o ligante de aminoácidos L pode aumentar a atividade biológica da porção de enzima heteróloga e/ou da porção de conexão de aminoácidos.

[0069] Nos casos em que o ligante (L) está presente nas quimeras da fórmula (I), sua extremidade amino é associada (com uma ligação amida) à extremidade carboxila da porção de enzima heteróloga e sua extremidade carboxila é associada (com uma ligação amida) à extremidade amino da porção de conexão de aminoácidos. Nos casos em que o ligante (L) está presente nas quimeras da fórmula (II), sua extremidade amino é associada (com uma ligação amida) à extremidade carboxila da porção de conexão de aminoácidos e sua extremidade carboxila está associada (com uma ligação amida) à extremidade amino da porção de enzima heteróloga.

[0070] Existem vários ligantes de aminoácidos e incluem, sem limitações, (GS)n; (GGS)n; (GGGS)n; (GGGGS)n; (GGSG)n; (GSAT)n, em que n = é um número inteiro entre 1 e 8 (ou mais). Em uma forma de realização, o ligante de aminoácidos L é (GGGGS)n (também referido como um motivo G4S) e, em ainda outras formas de realização, o ligante de aminoácidos L compreende mais de um motivos G4S. Em algumas formas de realização, L é escolhido dentre: (G4S) 3 (SEQ ID NO: 32), (G)8 (SEQ ID NO: 33) ou (G4S)8 (SEQ ID NO: 34).

[0071] O ligante de aminoácidos também pode ser, em algumas formas de realização, GSAGSAAGSGEF (SEQ ID NO: 35).

[0072] Existem ligantes de aminoácidos adicionais e incluem, sem limitações, (EAAK)n e (EAAAK)n, em que n = um número inteiro entre 1 e 8 (ou mais). Em algumas formas de realização, o um ou mais motivos (EAAK)n/(EAAAK)n podem ser separados por um ou mais resíduos adicionais de aminoácidos. Em uma forma de realização, o ligante de aminoácidos compreende um ou mais motivos EA2K (SEQ ID NO: 49) ou EA3K (SEQ ID NO: 50). Em uma forma de realização, o ligante de aminoácidos pode ser (EAAK)3 e tem a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 36. Em outra forma de realização, o ligante de aminoácidos pode ser (A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A) e tem a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 38.

[0073] Outros ligantes de aminoácidos incluem aqueles com um ou mais motivos (AP)n, em que n = um inteiro entre 1 e 10 (ou mais). Em uma forma de realização, o ligante é (AP)10 e tem o aminoácido da SEQ ID NO: 37.

[0074] Em algumas formas de realização, o ligante também inclui uma ou mais etiquetas HA (SEQ ID NO: 51).

[0075] As enzimas heterólogas da presente revelação podem ser selecionadas ou concebidas para serem expressas em forma secretada. Em algumas formas de realização, as enzimas heterólogas da presente revelação incluem uma sequência de peptídeo de sinal (que pode ser nativa ou heteróloga à enzima heteróloga). Entende-se que a sequência de sinal estará presente na enzima heteróloga quando a enzima estiver localizada intracelularmente e removida por clivagem quando a enzima for secretada. Conforme aqui usado, uma “sequência de peptídeo de sinal” refere-se a uma sequência curta de aminoácidos apresentada no terminal N de um polipeptídeo recém-sintetizado destinado à via secretora. As sequências de sinal podem ser encontradas em polipeptídeos que residem dentro de certas organelas (retículo endoplasmático, golgi ou endossomas), secretadas pela célula ou inseridas na maioria das membranas celulares. Em alguns casos em que a enzima heteróloga é secretada pela célula, a sequência de sinal é clivada a partir da enzima heteróloga, liberando a enzima heteróloga para secreção da célula. Em uma forma de realização, a sequência de sinal das enzimas heterólogas da presente revelação é endógena à enzima heteróloga. Em outra forma de realização, a sequência de sinal das enzimas heterólogas é heteróloga à enzima heteróloga e pode ser derivada, por exemplo, de um polipeptídeo conhecido por ser secretado a partir de seu hospedeiro. Em algumas formas de realização, uma ou mais sequências de sinal podem ser usadas.

[0076] Em uma forma de realização das enzimas heterólogas da presente revelação, as enzimas heterólogas incluem uma sequência de sinal no terminal N do polipeptídeo. Em outras formas de realização, as enzimas heterólogas da presente revelação não têm uma sequência de sinal. Em ainda outras formas de realização, as enzimas heterólogas da presente revelação são derivadas da clivagem das sequências de sinais de polipeptídeos com uma sequência de sinal.

[0077] Em uma forma de realização, a molécula de ácido nucleico que codifica a enzima heteróloga pode incluir uma sequência de sinal que é endógena à célula hospedeira que expressa a molécula de nucleotídeo. Por exemplo, quando o hospedeiro é S. cerevisiae, a molécula de ácido nucleico que codifica a enzima heteróloga pode incluir a sequência de sinal de um gene endogenamente expresso em S. cerevisiae, como a sequência de sinal do gene da invertase (SUC2).

[0078] Em algumas formas de realização, a sequência de sinal é do gene que codifica a proteína invertase (e pode ter, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38, uma variante da mesma ou um fragmento da mesma), a proteína AGA2 (e pode ter, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 39, uma variante da mesma ou um fragmento da mesma) ou a amilase fúngica (e pode ter, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 59,

uma variante da mesma ou um fragmento da mesma). No contexto da presente revelação, a expressão “variante funcional de uma sequência de sinal” se refere a uma sequência de ácidos nucleicos que foi substituída em pelo menos uma posição de ácido nucleico quando comparada à sequência de sinal nativa que mantém a capacidade de direcionar a expressão da enzima heteróloga para fora da célula. No contexto da presente revelação, a expressão “fragmento funcional de uma sequência de sinal” se refere a uma sequência de ácido nucleico mais curta do que a sequência de sinal nativa que mantém a capacidade de direcionar a expressão da enzima heteróloga para fora da célula.

[0079] Em algumas formas de realização, a molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica a enzima heteróloga inclui uma sequência de codificação para uma ou uma combinação de sequências de sinal, permitindo a exportação da enzima heteróloga para fora da parede da célula hospedeira de levedura. A sequência de sinal pode simplesmente ser adicionada à molécula de ácido nucleico (geralmente em quadro com a sequência que codifica a enzima heteróloga) ou substituir a sequência de sinal já presente na enzima heteróloga. A sequência de sinal pode ser nativa ou heteróloga à sequência de ácido nucleico que codifica a proteína heteróloga ou sua quimera correspondente. Em algumas formas de realização, uma ou mais sequências de sinal podem ser usadas.

[0080] Em algumas formas de realização, a enzima heteróloga é uma alfa-amilase conectada e tem, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 65 ou 66, uma variante da mesma ou um fragmento da mesma. Ferramentas para Produzir a Célula Hospedeira de Levedura Recombinante

[0081] A fim de produzir as células hospedeiras de levedura recombinantes, moléculas de ácido nucleico heterólogas (também conhecidas como cassetes de expressão) são feitas in vitro e introduzidas à célula hospedeira de levedura, a fim de permitir a expressão recombinante da enzima heteróloga.

[0082] As moléculas de ácido nucleico heterólogas da presente revelação compreendem uma região de codificação para a enzima heteróloga ou uma enzima quimérica compreendendo a mesma. Uma “região de codificação” de DNA ou RNA é uma molécula de DNA ou RNA (de preferência uma molécula de DNA) que é transcrita e/ou traduzida em uma enzima heteróloga em uma célula in vitro ou in vivo quando colocada sob o controle de sequências reguladoras apropriadas. “Regiões reguladoras adequadas” referem-se a regiões de ácido nucleico localizadas a montante (sequências de não codificação 5’), dentro ou a jusante (sequências de não codificação 3’) de uma região de codificação e que influenciam a transcrição, o processamento ou a estabilidade do RNA ou a tradução da região de codificação associada. As regiões reguladoras podem incluir promotores, sequências líderes de tradução, sítio de processamento de RNA, sítio de ligação de efetores e estrutura característica enrolada em forma de haste e ansa. Os limites da região de codificação são determinados por um códon de iniciação no terminal 5’ (amino) e um códon de parada de tradução no terminal 3’ (carboxila). Uma região de codificação pode incluir, mas não se limita a, regiões procarióticas, cDNA de mRNA, moléculas de DNA genômico, moléculas de DNA sintético ou moléculas de RNA. Se a região de codificação for destinada à expressão em uma célula eucariótica, um sinal de poliadenilação e uma sequência de terminação de transcrição estarão geralmente localizados a 3’ da região de codificação. Em uma forma de realização, a região de codificação pode ser chamada de um quadro de leitura aberta. “Quadro de leitura aberta” é abreviado como ORF e significa um comprimento de ácido nucleico, seja DNA, cDNA ou RNA, que compreende um sinal de início de tradução ou códon de iniciação, como um ATG ou AUG, e um códon de terminação, podendo ser potencialmente traduzido em uma sequência de polipeptídeos.

[0083] As moléculas de ácido nucleico heterólogas aqui descritas podem compreender regiões de controle transcricionais e/ou translacionais. As “regiões de controle transcricionais e/ou translacionais” são regiões reguladoras de DNA, como promotores, potenciadores, terminadores e similares, que fornecem a expressão de uma região de codificação em uma célula hospedeira. Nas células eucarióticas, os sinais de poliadenilação são considerados regiões de controle.

[0084] Em algumas formas de realização, as moléculas de ácido nucleico heterólogas da presente revelação incluem um promotor, bem como uma sequência de codificação para uma enzima heteróloga (incluindo proteínas quiméricas compreendendo a mesma). A sequência de ácido nucleico heteróloga também pode incluir um terminador. Nas moléculas de ácido nucleico heterólogas da presente revelação, o promotor e o terminador (quando presentes) estão ligados operacionalmente à sequência de codificação de ácido nucleico da enzima heteróloga (incluindo as proteínas quiméricas compreendendo a mesma), por exemplo, eles controlam a expressão e a terminação da expressão da sequência de ácido nucleico da enzima heteróloga (incluindo as proteínas quiméricas compreendendo a mesma). As moléculas de ácido nucleico heterólogas da presente revelação também podem incluir um ácido nucleico que codifica para um peptídeo de sinal, por exemplo, uma sequência de peptídeos curta para exportar a enzima heteróloga fora da célula hospedeira. Quando presente, a sequência de ácidos nucleicos que codifica para o peptídeo de sinal está localizada diretamente a montante e está em quadro com a sequência de ácidos nucleicos que codifica para a enzima heteróloga (incluindo as proteínas quiméricas compreendendo a mesma).

[0085] Na molécula de ácido nucleico heteróloga descrita neste documento, o promotor e a molécula de ácido nucleico que codifica para a enzima heteróloga (incluindo as proteínas quiméricas compreendendo a mesma) estão ligados operacionalmente entre si. No contexto da presente invenção, as expressões “ligada(o)(s) operacionalmente” ou “associada(o)(s) operacionalmente” referem-se ao fato de o promotor estar fisicamente associado à molécula de ácido nucleico que codifica para a enzima heteróloga de uma forma que permita, em determinadas condições, a expressão da enzima heteróloga a partir da molécula de ácido nucleico. Em uma forma de realização, o promotor pode estar localizado a montante (5’) da sequência de ácidos nucleicos que codifica para a enzima heteróloga. Ainda em outra forma de realização, o promotor pode estar localizado a jusante (3’) da sequência de ácidos nucleicos que codifica para a enzima heteróloga. No contexto da presente invenção, um ou mais de um promotor podem ser incluídos na molécula de ácido nucleico heteróloga. Quando mais de um promotor estão incluídos na molécula de ácido nucleico heteróloga, cada um dos promotores é ligado operacionalmente à sequência de ácidos nucleicos que codifica para a proteína heteróloga. Os promotores podem estar localizados, tendo em vista a molécula de ácido nucleico que codifica para a enzima heteróloga, a montante, a jusante, bem como a montante e a jusante.

[0086] “Promotor” refere-se a um fragmento de DNA capaz de controlar a expressão de uma sequência de codificação ou RNA funcional. O termo “expressão”,

conforme aqui utilizado, refere-se à transcrição e ao acúmulo estável de sequências senso (mRNA) da molécula de ácido nucleico heteróloga descrita neste documento. A expressão também pode se referir à tradução de mRNA em um polipeptídeo. Os promotores podem ser inteiramente derivados de um gene nativo, ou ser compostos por diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados na natureza, ou até mesmo compreender segmentos de DNA sintético. É entendido por aqueles qualificados na técnica que diferentes promotores podem direcionar a expressão em diferentes estágios de desenvolvimento ou em resposta a diferentes condições ambientais ou fisiológicas. Os promotores que levam um gene a ser expresso na maior parte das células, na maior parte das vezes a um nível substancial semelhante, são normalmente referidos como “promotores constitutivos”. Os promotores que levam um gene a ser expresso durante a fase de propagação de uma célula de levedura são aqui referidos como “promotores de propagação”. Os promotores de propagação incluem tanto promotores constitutivos quanto induzíveis, como, por exemplo, promotores regulados por glicose, regulados por melaços, de resposta ao estresse (incluindo promotores de resposta a estresse osmótico) e promotores regulados anaerobicamente. Em uma forma de realização preferida, o promotor selecionado permite a expressão da molécula de ácido nucleico heteróloga durante a fase de propagação da célula hospedeira de levedura recombinante, a fim de permitir a expressão de uma quantidade suficiente de enzima heteróloga. É ainda reconhecido que, na maioria dos casos, os limites exatos das sequências reguladoras não foram completamente definidos, os fragmentos de DNA de comprimentos diferentes podem ter uma atividade de promotor idêntica. Um promotor é geralmente limitado em seu terminal 3’ pelo sítio de iniciação da transcrição e estende-se a montante (direção 5’) para incluir o número mínimo de bases ou elementos necessários para iniciar a transcrição em níveis detectáveis acima do nível de base. Dentro do promotor será encontrado um sítio de iniciação de transcrição (convenientemente definido, por exemplo, por mapeamento com a nuclease S1), bem como domínios de ligação de proteínas (sequências consenso) responsáveis pela ligação da polimerase.

[0087] O promotor pode ser nativo ou heterólogo à molécula de ácido nucleico que codifica a enzima heteróloga. O promotor pode ser heterólogo ou derivado de uma cepa proveniente do mesmo gênero ou espécie que a célula hospedeira recombinante. Em uma forma de realização, o promotor é derivado do mesmo gênero ou espécie da célula hospedeira de levedura, e a enzima heteróloga é derivada de um gênero diferente da célula hospedeira. O promotor pode ser um promotor único ou uma combinação de diferentes promotores.

[0088] Na presente revelação, são preferidos os promotores que permitem ou favorecem a expressão das enzimas heterólogas durante a fase de propagação das células hospedeiras de levedura recombinante. Leveduras que são anaeróbios facultativos são capazes de reprodução respiratória em condições aeróbicas e reprodução fermentativa em condições anaeróbicas. Em muitas aplicações comerciais, a levedura é propagada sob condições aeróbicas para maximizar a conversão de um substrato em biomassa. Opcionalmente, a biomassa pode ser usada em uma fermentação subsequente em condições anaeróbicas para produzir um metabólito desejado. No contexto da presente revelação, é importante que o promotor ou a combinação de promotores presentes no ácido nucleico heterólogo seja capaz de permitir a expressão da enzima heteróloga ou sua quimera correspondente durante a fase de propagação da célula hospedeira de levedura recombinante. Isso permitirá o acúmulo da enzima heteróloga associada à célula hospedeira de levedura recombinante antes da fermentação (se houver). Em algumas formas de realização, o promotor permite a expressão da enzima heteróloga ou de sua quimera correspondente durante a propagação, mas não durante a fermentação (se houver) da célula hospedeira de levedura recombinante.

[0089] Os promotores podem ser nativos ou heterólogos para o gene heterólogo que codifica a enzima heteróloga. Os promotores que podem ser incluídos na molécula de ácido nucleico heteróloga podem ser promotores constitutivos ou induzíveis (como os descritos em Perez-Torrado et al.), 2005). Os promotores induzíveis incluem, mas não se limitam a, promotores regulados por glicose (por exemplo, o promotor do gene hxt7 (referido como hxt7p) e a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 40, uma variante funcional ou um fragmento funcional da mesma; o promotor do gene ctt1 (referido como ctt1p) e tendo a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 41, uma variante funcional ou um fragmento funcional da mesma; o promotor do gene glo1 (referido como glo1p) e tendo a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 42, uma variante funcional ou um fragmento funcional da mesma; o promotor do gene ygp1 (referido como ygp1p) e tendo a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 43, uma variante funcional ou um fragmento funcional da mesma; o promotor do gene gsy2 (referido como gsy2p) e tendo a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 44, uma variante funcional ou um fragmento funcional da mesma); promotores regulados por melaços (por exemplo, o promotor do gene mol1 (referido como mol1p) descrito em Praekelt et al, 1992 ou tendo a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 45, uma variante funcional ou um fragmento funcional da mesma; promotores regulador por choque térmico (por exemplo, o promotor do gene glo1 (referido como glo1p) e tendo a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 42, uma variante funcional ou um fragmento funcional da mesma; o promotor do gene sti1 (referido como sti1p) e tendo a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 46, uma variante funcional ou um fragmento funcional da mesma; o promotor do gene ygp1 (referido como ygp1p) e tendo a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 43, uma variante funcional ou um fragmento funcional da mesma; o promotor do gene gsy2 (referido como gsy2p) e tendo a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 44, uma variante funcional ou um fragmento funcional da mesma), promotores de resposta ao estresse oxidativo (por exemplo, o promotor do gene cup1 (referido como cup1p) e tendo a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 51, uma variante funcional ou um fragmento funcional da mesma; o promotor do gene ctt1 (referido como ctt1p) e tendo a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 42, uma variante funcional ou um fragmento funcional da mesma; o promotor do gene trx2 (referido como trx2p) e tendo a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 52, uma variante funcional ou um fragmento funcional da mesma; o promotor do gene gpd1 (referido como gpd1p) e tendo a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 53, uma variante funcional ou um fragmento funcional da mesma; o promotor do gene hsp12 (referido como hsp12p) e tendo a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 54, uma variante funcional ou um fragmento funcional da mesma), promotores de resposta ao estresse osmótico (por exemplo, o promotor do gene ctt1 (referido como ctt1p) e tendo a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 42, uma variante funcional ou um fragmento funcional da mesma; o promotor do gene glo1 (referido como glo1p) e tendo a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 43, uma variante funcional ou um fragmento funcional da mesma; o promotor do gene gpd1 (referido como gpd1p) e tendo a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 53, uma variante funcional ou um fragmento funcional da mesma; o promotor do gene ygp1 (referido como ygp1p) e tendo a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 43, uma variante funcional ou um fragmento funcional da mesma e promotores regulador por nitrogênio (por exemplo, o promotor do gene ygp1 (referido como ygp1p) e tendo a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 43, uma variante funcional ou um fragmento funcional da mesma.

[0090] Os promotores que podem ser incluídos na molécula de ácido nucleico heteróloga da presente invenção incluem, sem limitação, o promotor do gene tdh1 (referido como tdh1p, uma variante funcional ou um fragmento funcional do mesmo), do gene hor7 (referido como hor7p, uma variante funcional ou um fragmento funcional do mesmo), do gene hsp150 (referido como hsp150p, uma variante funcional ou um fragmento funcional do mesmo), do gene hxt7 (referido como hxt7p, uma variante funcional ou um fragmento funcional do mesmo), do gene gpm1 (referido como gpm1p, uma variante funcional ou um fragmento funcional do mesmo), do gene pgk1 (referido como pgk1p, uma variante funcional ou um fragmento funcional do mesmo) e/ou do gene stl1 (referido como stl1p, uma variante funcional ou um fragmento funcional do mesmo).

[0091] Um ou mais promotores podem ser usados para permitir a expressão de cada enzima heteróloga na célula hospedeira de levedura recombinante. No contexto da presente revelação, a expressão “fragmento funcional de um promotor”, quando utilizado em combinação com um promotor, refere-se a uma sequência de ácido nucleico mais curta do que o promotor nativo que mantém a capacidade de controlar a expressão da sequência de ácido nucleico que codifica o alimento heterólogo e / ou a enzima alimentar ou sua quimera durante a fase de propagação das células hospedeiras de levedura recombinantes. Normalmente, os fragmentos funcionais são truncagem 5’ e/ou 3’ de um ou mais resíduos de ácido nucleico da sequência de ácido nucleico do promotor nativo.

[0092] Em algumas formas de realização, as moléculas de ácido nucleico heterólogas incluem uma ou uma combinação de sequências terminadoras para finalizar a tradução da enzima heteróloga (ou da enzima quimérica que compreende a mesma). O terminador pode ser nativo ou heterólogo à sequência de ácido nucleico que codifica a enzima heteróloga ou sua quimera correspondente. Em algumas formas de realização, um ou mais terminadores podem ser usados. Em algumas formas de realização, o terminador compreende o terminador derivado do gene dit1 (referido como dit1, uma variante funcional ou um fragmento funcional do mesmo), do gene idp1 (referido como idp1t, uma variante funcional ou um fragmento funcional do mesmo), do gene gpm1 (referido como gpm1t, uma variante funcional ou um fragmento funcional do mesmo), do gene pma1 (referido como pma1t, uma variante funcional ou um fragmento funcional do mesmo), do gene tdh3 (referido como tdh3t, uma variante funcional ou um fragmento funcional do mesmo), do gene hxt2 (referido como uma variante funcional ou um fragmento funcional do mesmo), do gene adh3 (referido como adh3t, uma variante funcional ou um fragmento funcional do mesmo) e / ou do gene ira2 (referido como ira2t, uma variante funcional ou um fragmento funcional do mesmo). Em uma forma de realização, o terminador é derivado do gene dit1. Em outra forma de realização, o terminador compreende ou é derivado do gene adh3. No contexto da presente revelação, a expressão “variante funcional de uma terminadora” se refere a uma sequência de ácidos nucleicos que foi substituída em pelo menos uma posição de ácido nucleico quando comparada com a terminadora nativa, que mantém a capacidade de finalizar a expressão da sequência de ácidos nucleicos que codifica para a proteína heteróloga ou sua quimera correspondente. No contexto da presente revelação, a expressão “fragmento funcional de um terminador” se refere a uma sequência de ácidos nucleicos mais curta do que o terminador nativo que mantém a capacidade de finalizar a expressão da sequência de ácidos nucleicos que codifica para a proteína heteróloga ou sua quimera correspondente.

[0093] Em algumas formas de realização, as moléculas de ácido nucleico heterólogas incluem uma sequência de codificação para uma ou uma combinação de sequências de sinal, permitindo a exportação da enzima heteróloga para (ou da enzima quimérica compreendendo a mesma) fora da parede da célula hospedeira de levedura. A sequência peptídica de sinal pode simplesmente ser adicionada à molécula de ácido nucleico (geralmente em quadro com a sequência que codifica a enzima heteróloga) ou substituir a sequência de sinal já presente na enzima heteróloga. A sequência de sinal pode ser nativa ou heteróloga à sequência de ácido nucleico que codifica a proteína heteróloga ou sua quimera correspondente. Em algumas formas de realização, uma ou mais sequências de sinal podem ser usadas. Em algumas formas de realização, a sequência de sinal é do gene que codifica a proteína invertase (e pode ter, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 39, uma variante da mesma ou um fragmento da mesma), a proteína AGA2 (e pode ter, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 40, uma variante da mesma ou um fragmento da mesma) ou a proteína amilase fúngica (e pode ter, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 59, uma variante da mesma ou um fragmento da mesma). No contexto da presente revelação, a expressão “variante funcional de uma sequência de sinal” se refere a uma sequência de ácidos nucleicos que foi substituída em pelo menos uma posição de ácido nucleico quando comparada à sequência de sinal nativa que mantém a capacidade de direcionar a expressão da enzima heteróloga ou de sua quimera correspondente para fora da célula. No contexto da presente revelação, a expressão “fragmento funcional de uma sequência de sinal” se refere a uma sequência de ácido nucleico mais curta do que a sequência de sinal nativa que mantém a capacidade de direcionar a expressão da enzima heteróloga ou de sua quimera correspondente para fora da célula.

[0094] A molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica a enzima heteróloga variante ou seu fragmento pode ser integrada ao genoma da célula hospedeira de levedura. O termo “integrado(a)(s)”, tal como aqui utilizado, se refere a elementos genéticos que são colocados, através de técnicas de biologia molecular, no genoma de uma célula hospedeira. Por exemplo, os elementos genéticos podem ser colocados nos cromossomos da célula hospedeira em oposição a um vetor, como um plasmídeo transportado pela célula hospedeira. Métodos de integração de elementos genéticos ao genoma de uma célula hospedeira são bem conhecidos na técnica e incluem a recombinação homóloga. A molécula de ácido nucleico heteróloga pode estar presente em uma ou mais cópias no genoma da célula hospedeira de levedura. Alternativamente, a molécula de ácido nucleico heteróloga pode ser de replicação independentemente do genoma da levedura. Nessa forma de realização, a molécula de ácido nucleico pode ser estável e auto-replicante.

[0095] A presente revelação também fornece moléculas de ácido nucleico para modificar a célula hospedeira de levedura de modo a permitir a expressão das enzimas heterólogas, quimeras, variantes ou fragmentos das mesmas. A molécula de ácido nucleico pode ser DNA (como DNA complementar, DNA sintético ou DNA genômico) ou RNA (que inclui RNA sintético) e pode ser fornecida em forma de um filamento único (no filamento sense ou no filamento antisense) ou em forma de um filamento duplo. As moléculas de ácido nucleico contempladas podem incluir alterações nas regiões codificadoras, regiões não codificadoras ou ambas. Exemplos são variantes da molécula de ácido nucleico contendo alterações que produzem substituições silenciosas, adições ou supressões, mas não alteram as propriedades ou atividades das enzimas codificadas, quimeras, variantes ou fragmentos.

[0096] Em algumas formas de realização, as moléculas de ácido nucleico heterólogas que podem ser introduzidas às células hospedeiras recombinantes são códon-otimizadas em relação à célula hospedeira recombinante receptora pretendida. Tal como aqui se utiliza, o termo “região de codificação códon- otimizada” significa uma região de codificação de ácido nucleico que foi adaptada para expressão nas células de um determinado organismo, substituindo pelo menos um, ou mais de um, códons com um ou mais códons que são usados mais frequentemente nos genes desse organismo. Em geral, os genes altamente expressos em um organismo têm preferência pelos códons que são reconhecidos pelas espécies de tRNA mais abundantes nesse organismo. Uma medida dessa preferência é o “índice de adaptação de códons” ou “CAI”, que avalia a medida em que os códons usados para codificar cada aminoácido em um gene específico são aqueles que ocorrem com maior frequência em um conjunto de referência de genes altamente expressos de um organismo. O CAI da molécula de ácido nucleico heteróloga códon-otimizada descrita neste documento corresponde a entre cerca de 0,8 a 1,0, entre cerca de 0,8 e 0,9, ou cerca de 1,0.

[0097] As moléculas de ácido nucleico heterólogas podem ser introduzidas na célula hospedeira de levedura usando um vetor. Um “vetor”, por exemplo, um “plasmídeo”, “cosmídeo” ou “cromossomo artificial” (como, por exemplo, um cromossomo artificial de levedura) refere-se a um elemento extracromossômico e geralmente é na forma de uma molécula de DNA circular de duplo filamento. Esses vetores podem ser sequências de replicação autônoma, sequências de integração do genoma, sequências de fagos ou nucleotídeos, lineares, circulares ou superenroladas,

de DNA ou RNA de filamento único ou duplo, derivadas de qualquer fonte, em que várias sequências de nucleotídeos foram unidas ou recombinadas em uma construção única que é capaz de introduzir um fragmento promotor e uma sequência de DNA para um produto de gene selecionado, juntamente com uma sequência adequada não traduzida 3’ a uma célula.

[0098] A presente revelação também fornece moléculas de ácido nucleico que são hibridizáveis às moléculas de ácido nucleico complementares que codificam as enzimas heterólogas, bem como variantes ou fragmentos. Uma molécula de ácido nucleico é “hibridizável” em outra molécula de ácido nucleico, como um cDNA, DNA genômico ou RNA, quando uma forma de filamento único da molécula de ácido nucleico pode recombinar-se na outra molécula de ácido nucleico nas condições apropriadas de temperatura e força iônica de solução. As condições de hibridização e lavagem são bem conhecidas e exemplificadas, por exemplo, em Sambrook, J., Fritsch, E. F. e Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, segunda edição, editora Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (1989), particularmente o Capítulo 11 e a Tabela 11.1. As condições de temperatura e de força iônica determinam a “rigor” da hibridização. As condições de rigor podem ser ajustadas para a triagem de fragmentos moderadamente semelhantes, como sequências homólogas de organismos pouco relacionados a fragmentos altamente semelhantes, como genes que duplicam enzimas funcionais de organismos intimamente relacionados. As lavagens pós-hibridização determinam as condições de rigor. Um conjunto de condições usa uma série de lavagens, começando com 6X SSC, SDS a 0,5% à temperatura ambiente por 15 min, depois repetida com 2X SSC, SDS a 0,5% a 45 ºC por 30 min e, em seguida, repetida duas vezes com 0,2X SSC, SDS a 0,5% a 50 ºC por 30 min. Para condições mais rigorosas, as lavagens são realizadas em temperaturas mais altas, nas quais as lavagens são idênticas às acima, com a exceção de que as temperaturas das duas lavagens finais de 30 min em 0,2X SSC, SDS a 0,5% são aumentadas para 60 ºC. Outro conjunto de condições altamente rigorosas usa duas lavagens finais em 0,1X SSC, SDS a 0,1% a 65 ºC. Um conjunto adicional de condições altamente rigorosas é definido por hibridização a 0,1X SSC, SDS a 0,1%, 65 ºC e lavagens com 2X SSC, SDS a 0,1% seguidas de 0,1X SSC, SDS a 0,1%.

[0099] A hibridização requer que as duas moléculas de ácido nucleico contenham sequências complementares, embora, dependendo da rigor da hibridização, sejam possíveis incompatibilidades entre as bases. O rigor adequado para a hibridização de ácidos nucleicos depende do comprimento dos ácidos nucleicos e do grau de complementação, essas variáveis sendo bem conhecidas na técnica. Quanto maior for o grau de similaridade ou a homologia entre duas sequências de nucleotídeos, maior será o valor de Tm para híbridos de ácidos nucleicos com essas sequências. A estabilidade relativa (correspondente ao valor mais elevado de Tm) das hibridizações de ácido nucleico diminui na seguinte ordem: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. Para híbridos com mais de 100 nucleotídeos de comprimento, foram derivadas equações para o cálculo de Tm. Para hibridizações com ácidos nucleicos mais curtos , ou seja, oligonucleotídeos, a posição das incompatibilidades torna-se mais importante, e o comprimento do oligonucleotídeo determina a sua especificidade. Em uma forma de realização, o comprimento de um ácido nucleico hibridizável é de pelo menos aproximadamente 10 nucleotídeos. De preferência, um comprimento mínimo para um ácido nucleico hibridizável é de, pelo menos, cerca de 15 nucleotídeos; de preferência, pelo menos cerca de 20 nucleotídeos; e, de preferência, o comprimento é de pelo menos 30 nucleotídeos. Além disso, o versado na técnica reconhecerá que a temperatura e a concentração de sal da solução de lavagem podem ser ajustadas conforme necessário, de acordo com fatores como o comprimento da sonda. Fermentação de Células de Levedura para a Fabricação de um Produto de Fermentação

[0100] No contexto da presente revelação, a célula de levedura de fermentação é uma célula de levedura que pode produzir um produto de fermentação nas condições de fermentação. As células de levedura de fermentação adequadas que podem ser usadas no contexto da presente revelação podem ser, por exemplo, do gênero Saccharomyces, Kluyveromyces, Arxula, Debaryomyces, Candida, Pichia, Phaffia, Schizosaccharomyces, Hansenula, Kloeckera, Schwanniomyces, Torula ou Yarrowia. Espécies de leveduras adequadas podem incluir, por exemplo, S. cerevisiae, S. bulderi, S. barnetti, S. exiguus, S. uvarum, S. diastaticus, S. boulardii, C. utilis, K. lactis, K. marxianus ou K. fragilis. Em algumas formas de realização, a levedura é selecionada no grupo que consiste em Saccharomyces cerevisiae, Schizzosaccharomyces pombe, Candida albicans, Pichia pastoris, Pichia stipitis, Yarrowia lipolytica, Hansenula polymorpha, Phaffia rhodozyma, Candida utilis, Arxula adeninivorans, Debaryomyces hansenii, Debaryomyces polymorphus, Schizosaccharomyces pombe e Schwanniomyces occidentalis. Em outras formas de realização, a levedura é de Saccharomyces cerevisiae, Schizzosaccharomyces pombe, Candida albicans, Pichia pastoris, Pichia stipitis, Yarrowia lipolytica, Hansenula polymorpha, Phaffia rhodozyma, Candida utilis, Arxula adeninivorans, Debaryomyces hansenii, Debaryomyces polymorphus, Schizosaccharomyces pombe ou Schwanniomyces occidentalis. Em uma forma de realização particular, a levedura é Saccharomyces cerevisiae. Em algumas formas de realização, a célula de levedura de fermentação pode ser uma célula de levedura oleaginosa. Por exemplo, a célula hospedeira de levedura oleaginosa pode ser do gênero Blakeslea, Candida, Cryptococcus, Cunninghamella, Lipomyces, Mortierella, Mucor, Phycomyces, Pythium, Rhodosporidum, Rhodotorula, Trichosporon ou Yarrowia. Em algumas formas de realização alternativas, a célula de levedura de fermentação pode ser uma célula hospedeira de microalgas oleaginosas (por exemplo, do gênero Thraustochytrio ou Schizochytrio). A célula de levedura e a célula hospedeira de levedura recombinante podem ser do mesmo ou diferentes gêneros ou espécies. Em uma forma de realização, a célula hospedeira de levedura de fermentação é do gênero Saccharomyces e, em algumas formas de realização, da espécie Saccharomyces cerevisiae. Em uma forma de realização, a célula de levedura e a célula hospedeira de levedura recombinante são do gênero Saccharomyces e, em algumas formas de realização, da espécie Saccharomyces cerevisiae.

[0101] Em algumas formas de realização, a célula de levedura de fermentação é uma célula hospedeira recombinante incluindo uma ou mais modificações genéticas que codificam uma ou mais proteínas heterólogas.

[0102] Em algumas formas de realização, a célula de levedura de fermentação compreende uma modificação genética (por exemplo, uma molécula de ácido nucleico heteróloga) para reduzir a produção de uma ou mais enzimas nativas que funcionam para produzir glicerol ou regular a síntese de glicerol, permitir a produção de um polipeptídeo com atividade de glucoamilase e/ou para reduzir a produção de uma ou mais enzimas nativas que funcionam para catabolizar o formiato. Alternativamente, a célula de levedura de fermentação com uma das modificações genéticas acima é usada em combinação com uma ou mais células hospedeiras recombinantes, cada uma com uma das outras modificações genéticas para reduzir a produção de uma ou mais enzimas nativas que funcionam para produzir glicerol ou regular a síntese de glicerol, para permitir a produção do segundo polipeptídeo com atividade de glucoamilase e/ou para reduzir a produção de uma ou mais enzimas nativas que funcionam para catabolizar o formiato.

[0103] Tal como utilizado no contexto da presente revelação, a expressão “reduzir a produção de uma ou mais enzimas nativas que funcionam para produzir glicerol ou regular a síntese de glicerol” refere-se a uma modificação genética que limita ou impede a expressão de genes associados a um ou mais polipeptídeos nativos (em algumas formas de realização, enzimas) que funcionam para produzir glicerol ou regular a síntese de glicerol, quando comparada a uma cepa hospedeira correspondente que não porta a modificação genética. Em algumas formas de realização, a modificação genética reduz, mas ainda permite, a produção de um ou mais polipeptídeos nativos que funcionam para produzir glicerol ou regular a síntese de glicerol. Em outros casos, a modificação genética inibe a produção de uma ou mais enzimas nativas que funcionam para produzir glicerol ou regular a síntese de glicerol. Em algumas formas de realização, as células hospedeiras recombinantes portam uma pluralidade de segundas modificações genéticas, em que pelo menos uma reduz a produção de um ou mais polipeptídeos nativos e pelo menos outra inibe a produção de um ou mais polipeptídeos nativos.

[0104] Como usado no contexto da presente revelação, a expressão “polipeptídeos nativos que funcionam para produzir glicerol ou regular a síntese de glicerol” refere-se a polipeptídeos encontrados endogenamente na célula hospedeira recombinante. As enzimas nativas que funcionam para produzir glicerol incluem, mas não se limitam a, os polipeptídeos GPD1 e GPD2 (também referidos como GPD1 e GPD2, respectivamente). As enzimas nativas que funcionam para regular a síntese de glicerol incluem, mas não se limitam a, o polipeptídeo FPS1. Em uma forma de realização, a célula hospedeira recombinante porta uma modificação genética em pelo menos um dentre o gene gpd1 (que codifica o polipeptídeo GPD1), o gene gpd2 (que codifica o polipeptídeo GPD2), o gene fps1 (que codifica o polipeptídeo FPS1) ou ortólogos dos mesmos. Em outra forma de realização, a célula de levedura de fermentação porta uma modificação genética em pelo menos dentre o gene gpd1 (que codifica o polipeptídeo GPD1), o gene gpd2 (que codifica o polipeptídeo GPD2), o gene fps1 (que codifica o polipeptídeo FPS1) ou seus ortólogos. Em ainda outra forma de realização, a célula hospedeira de levedura recombinante porta uma modificação genética em cada um dentre o genegpd1 (que codifica o polipeptídeo GPD1), o gene gpd2 (que codifica o polipeptídeo GPD2) e o gene fps1 (que codifica o polipeptídeo FPS1) ou seus ortólogos. Exemplos de células hospedeiras de levedura recombinantes que portam essas modificações genéticas que levam à redução da produção de uma ou mais enzimas nativas que funcionam para produzir glicerol ou regular a síntese de glicerol são descritos no Documento WO 2012/138942. De preferência, a célula de levedura de fermentação tem uma modificação genética (como uma deleção ou inserção genética) apenas em uma enzima que funciona para produzir glicerol, no gene gpd2, o que levaria a célula hospedeira a ter um gene gpd2 inativado. Em algumas formas de realização, a célula de levedura de fermentação pode ter uma modificação genética no gene gpd1, no gene gpd2 e no gene fps1, resultando em uma célula hospedeira recombinante que é inativada para o gene gpd1, o gene gpd2 e o gene fps1.

[0105] Como usado no contexto da presente revelação, a expressão “polipeptídeos nativos que funcionam para catabolizar formiato” refere-se a polipeptídeos encontrados endogenamente na célula de levedura de fermentação. As enzimas nativas que funcionam para catabolizar formiato incluem, mas não se limitam a, os polipeptídeos FDH1 e FDH2 (também referidos como FDH1 e FDH2, respectivamente). Em uma forma de realização, a célula de levedura de fermentação porta uma modificação genética em pelo menos um dentre o gene fdh1 (que codifica o polipeptídeo FDH1), o gene fdh2 (que codifica o polipeptídeo FHD2) ou seus ortólogos. Em outra forma de realização, a célula de levedura de fermentação porta modificações genéticas tanto no gene fdh1 (que codifica o polipeptídeo FDH1) quanto no gene fdh2 (que codifica o polipeptídeo FDH2) ou seus ortólogos. Exemplos de células de levedura de fermentação que portam essas modificações genéticas que levam à redução da produção de uma ou mais enzimas nativas que funcionam para catabolizar formiato são descritos no Documento WO 2012/138942. De preferência, a célula de levedura de fermentação tem modificações genéticas (como uma supressão ou inserção genética) no gene fdh1 e no gene fdh2, que levariam a célula hospedeira a ter genes fdh1 e fdh2 inativados.

[0106] Em uma forma de realização, a célula hospedeira de fermentação recombinante inclui uma modificação genética que alcança maior atividade da piruvato-formiato liase na célula hospedeira de levedura recombinante ou outra. Este aumento na atividade da piruvato-formiato liase é relativo a uma célula hospedeira de levedura nativa correspondente que não inclui a primeira modificação genética. Como utilizado no contexto da presente revelação, o termo “piruvato-formiato liase” ou “PFL” refere-se a uma enzima (EC 2.3.1.54), também conhecida como formiato C- acetiltransferase, piruvato formiato-liase, formiato pirúvico-liase e formiato- acetiltransferase. As piruvato-formiato liases são capazes de catalisar a conversão da coenzima A (COA) e o piruvato em acetil-COA e formiato. Em algumas formas de realização, a atividade da piruvato-formiato liase pode ser aumentada expressando uma enzima ativadora da piruvato-formiato liase heteróloga e/ou um enzimato da piruvato-formiato liase (como, por exemplo, PFLA e/ou PFLB).

[0107] No contexto da presente revelação, a modificação genética pode incluir a introdução de uma molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica uma enzima ativadora da piruvato-formiato liase e/ou uma enzima piruvato-formiato liase, como a PFLA. As formas de realização da enzima ativadora da piruvato-formiato liase e da PFLA podem ser derivadas, sem limitação, do seguinte (o número entre parênteses corresponde ao número de ID do Gene): Escherichia coli (MG1655945517), Shewanella oneidensis (1706020), Bifidobacterium longum (1022452), Mycobacterium bovis (32287203), Haemophilus parasuis (7277998), Mannheimia haemolytica (15341817), Vibrio vulnificus (33955434), Cronobacter sakazakii (29456271), Vibrio alginolyticus (31649536), Pasteurella multocida (29388611), Aggregatibacter actinomycetemcomitans (31673701), Actinobacillus suis (34291363), Finegoldia magna (34165045), Zymomonas mobilis subsp. mobilis (3073423), Vibrio tubiashii (23444968), Gallibacterium anatis (10563639), Actinobacillus pleuropneumoniae serovar (4849949), Ruminiclostridium thermocellum (35805539), Cylindrospermopsis raciborskii (34474378), Lactococcus garvieae

(34204939), Bacillus cytotoxicus (33895780), Providencia stuartii (31518098), Pantoea ananatis (31510290), Teredinibacter turnerae (29648846), Morganella morganii subsp. morganii (14670737), Vibrio anguillarum (77510775106), Dickeya dadantii (39379733484), Xenorhabdus bovienii (8830449), Edwardsiella ictaluri (7959196), Proteus mirabilis (6801040), Rahnella aquatilis (34350771), Bacillus pseudomycoides (34214771), Vibrio alginolyticus (29867350), Vibrio nigripulchritudo (29462895), Vibrio orientalis (25689084), Kosakonia sacchari (23844195), Serratia marcescens subsp. marcescens (23387394), Shewanella baltica (11772864), Vibrio vulnificus (2625152), Streptomyces acidiscabies (33082227), Streptomyces davaonensis (31227069), Streptomyces scabiei (24308152), Volvox carteri f. nagariensis (9616877), Vibrio breoganii (35839746), Vibrio mediterranei (34766273), Fibrobacter succinogenes subsp. succinogenes (34755395), Enterococcus gilvus (34360882), Akkermansia muciniphila (34173806), Enterobacter hormaechei subsp.

Steigerwaltii (34153767), Dickeya zeae (33924935), Enterobacter sp. (32442159), Serratia odorifera (31794665), Vibrio crassostreae (31641425), Selenomonas ruminantium subsp. lactilytica (31522409), Fusobacterium necrophorum subsp. funduliforme (31520833), Bacteroides uniformis (31507008), Haemophilus somnus (233631487328), Rodentibacter pneumotropicus (31211548), Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum (29706463), Eikenella corrodens (29689753), Bacillus thuringiensis (29685036), Streptomyces rimosus subsp.

Rimosus (29531909), Vibrio fluvialis (29387180), Klebsiella oxytoca (29377541), Parageobacillus thermoglucosidans (29237437), Aeromonas veronii (28678409), Clostridium innocuum (26150741), Neisseria mucosa (25047077), Citrobacter freundii (23337507), Clostridium bolteae (23114831), Vibrio tasmaniensis (7160642), Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida (4995006), Escherichia coli cepa O157:H7 Sakai (917728), Escherichia coli cepa O83:H1 (12877392), Yersinia pestis (11742220), Clostridioides difficile (4915332), Vibrio fischeri (3278678), Vibrio parahaemolyticus (1188496), Vibrio coralliilyticus (29561946), Kosakonia cowanii (35808238), Yersinia ruckeri (29469535), Gardnerella vaginalis (99041930), Listeria fleischmannii subsp.

Coloradonensis (34329629), Photobacterium kishitanii (31588205), Aggregatibacter actinomycetemcomitans (29932581), Bacteroides caccae (36116123), Vibrio toranzoniae (34373279), Providencia alcalifaciens

(34346411), Edwardsiella anguillarum (33937991), Lonsdalea quercina subsp.

Quercina (33074607), Pantoea septica (32455521), Butyrivibrio proteoclasticus (31781353), Photorhabdus temperata subsp.

Thracensis (29598129), Dickeya solani (23246485), Aeromonas hydrophila subsp. hydrophila (4489195), cepa de Vibrio cholerae O1 biovar El Tor (2613623), Serratia rubidaea (32372861), Vibrio bivalvicida (32079218), Serratia liquefaciens (29904481), Gilliamella apicola (29851437), Pluralibacter gergoviae (29488654), Escherichia coli O104:H4 (13701423), Enterobacter aerogenes (10793245), Escherichia coli (7152373), Vibrio campbellii (5555486), Shigella dysenteriae (3795967), Bacillus thuringiensis serovar konkukian (2854507), Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium (1252488), Bacillus anthracis (1087733), Shigella flexneri (1023839), Streptomyces griseoruber (32320335), Ruminococcus gnavus (35895414), Aeromonas fluvialis (35843699), Streptomyces ossamyceticus (35815915), Xenorhabdus doucetiae (34866557), Lactococcus piscium (34864314), Bacillus glycinifermentans (34773640), Photobacterium damselae subsp.

Damselae 34509297, Streptomyces venezuelae 34035779, Shewanella algae (34011413), Neisseria sicca (33952518), Chania multitudinisentens (32575347), Kitasatospora purpeofusca (32375714), Serratia fonticola (32345867), Aeromonas enteropelogenes (32325051), Micromonospora aurantiaca (32162988), Moritella viscosa (31933483), Yersinia aldovae (31912331), Leclercia adecarboxylata (31868528), Salinivibrio costicola subsp. costicola (31850688), Aggregatibacter aphrophilus (31611082), Photobacterium leiognathi (31590325), Streptomyces canus (31293262), Pantoea dispersa (29923491), Pantoea rwandensis (29806428), Paenibacillus borealis (29548601), Aliivibrio wodanis (28541257), Streptomyces virginiae (23221817), Escherichia coli (7158493), Mycobacterium tuberculosis (887973), Streptococcus mutans (1028925), Streptococcus cristatus (29901602), Enterococcus hirae (13176624), Bacillus licheniformis (3031413), Chromobacterium violaceum (24949178), Parabacteroides distasonis (5308542), Bacteroides vulgatus (5303840), Faecalibacterium prausnitzii (34753201), Melissococcus plutonius (34410474), Streptococcus gallolyticus subsp. gallolyticus (34397064), Enterococcus malodoratus (34355146), Bacteroides oleiciplenus (32503668), Listeria monocytogenes (985766), Enterococcus faecalis (1200510), Campylobacter jejuni subsp. jejuni (905864), Lactobacillus plantarum

(1063963), Yersinia enterocolitica subsp. enterocolitica (4713333), Streptococcus equinus (33961143), Macrococcus canis (35294771), Streptococcus sanguinis (4807186), Lactobacillus salivarius (3978441), Lactococcus lactis subsp. lactis (1115478), Enterococcus faecium (12999835), Clostridium botulinum A (5184387), Clostridium acetobutylicum (1117164), Bacillus thuringiensis serovar konkukian (2857050), Cryobacterium flavum (35899117), Enterovibrio norvegicus (35871749), Bacillus acidiceler (34874556), Prevotella intermedia (34516987), Pseudobutyrivibrio ruminis (34419801), Pseudovibrio ascidiaceicola (34149433), Corynebacterium coyleae (34026109), Lactobacillus curvatus (33994172), Cellulosimicrobium cellulans (33980622), Lactobacillus agilis (33975995), Lactobacillus sakei (33973512), Staphylococcus simulans (32051953), Obesumbacterium proteus (29501324), Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi (1247402), Streptococcus agalactiae (1014207), Streptococcus agalactiae (1013114), cepa de Legionella pneumophila subsp. pneumophila Philadelphia (119832735), Pyrococcus furiosus (1468475), Mannheimia haemolytica (15340992), Thalassiosira pseudonana (7444511), Thalassiosira pseudonana (7444510), Streptococcus thermophilus (31940129), Sulfolobus solfataricus (1454925), Streptococcus iniae (35765828), Streptococcus iniae (35764800), Bifidobacterium thermophilum (31839084), Bifidobacterium animalis subsp. lactis (29695452), Streptobacillus moniliformis (29673299), Thermogladius calderae (13013001), Streptococcus oralis subsp. tigurinus (31538096), Lactobacillus ruminis (29802671), Streptococcus parauberis (29752557), Bacteroides ovatus (29454036), cepa de Streptococcus gordonii Challis substr.

CH1 (25052319), cepa de Clostridium botulinum B Eklund 17B (19963260), Thermococcus litoralis (16548368), Archaeoglobus sulfaticallidus (15392443), Ferroglobus placidus (8778929), Archaeoglobus profundus (8739370), Listeria seeligeri serovar 1/2b (32488230), Bacillus thuringiensis (31632063), Rhodobacter capsulatus (31491679), Clostridium botulinum (29749009), Clostridium perfringens (29571530), Lactococcus garvieae (12478921), Proteus mirabilis (6799920), Lactobacillus animalis (32012274), Vibrio alginolyticus (29869205), Bacteroides thetaiotaomicron (31617701), Bacteroides thetaiotaomicron (31617140), Bacteroides cellulosilyticus (29608790), Bacteroides ovatus (29453452), Bacillus mycoides (29402181), Chlamydomonas reinhardtii (5726206), Fusobacterium periodonticum

(35833538), Selenomonas flueggei (32477557), Selenomonas noxia (32475880), Anaerococcus hydrogenalis (32462628), Centipeda periodontii (32173931), Centipeda periodontii (32173899), Streptococcus thermophilus (31938326), Enterococcus durans (31916360), Fusobacterium nucleatum (31730399), Anaerostipes hadrus (31625694), Anaerostipes hadrus (31623667), Enterococcus haemoperoxidus (29838940), Gardnerella vaginalis (29692621), Streptococcus salivarius (29397526), Klebsiella oxytoca (29379245), Bifidobacterium breve (29241363), Actinomyces odontolyticus (25045153), Haemophilus ducreyi (24944624), Archaeoglobus fulgidus (24793671), Streptococcus uberis (24161511), Fusobacterium nucleatum subsp. animalis (23369066), Corynebacterium accolens (23249616), Archaeoglobus veneficus (10394332), Prevotella melaninogenica (9497682), Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida (4997325), Pyrobaculum islandicum (4616932), Thermofilum pendens (4600420), Bifidobacterium adolescentis (4556560), Listeria monocytogenes (986485), Bifidobacterium thermophilum (35776852), Methanothermobacter sp.

CaT2 (24854111), Streptococcus pyogenes (901706), Exiguobacterium sibiricum (31768748), Clostridioides difficile (4916015), Clostridioides difficile (4913022), Vibrio parahaemolyticus (1192264), Yersinia enterocolitica subsp. enterocolitica (4712948), Enterococcus cecorum (29475065), Bifidobacterium pseudolongum (34879480), Methanothermus fervidus (9962832), Methanothermus fervidus (9962056), Corynebacterium simulans (29536891), Thermoproteus uzoniensis (10359872), Vulcanisaeta distributa (9752274), Streptococcus mitis (8799048), Ferroglobus placidus (8778420), Streptococcus suis (8153745), Clostridium novyi (4541619), Streptococcus mutans (1029528), Thermosynechococcus elongatus (1010568), Chlorobium tepidum (1007539), Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum (993139), Streptococcus pneumoniae (933787), Clostridium baratii (31579258), Enterococcus mundtii (31547246), Prevotella ruminicola (31500814), Aeromonas hydrophila subsp. hydrophila (4490168), Aeromonas hydrophila subsp. hydrophila (4487541), Clostridium acetobutylicum (1117604), Chromobacterium subtsugae (31604683), Gilliamella apicola (29849369), Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae (11846825), Enterobacter cloacae subsp. cloacae (9125235), Escherichia coli (7150298), Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium (1252363), Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi (1247322), Bacillus cereus (1202845), Bacteroides thetaiotaomicron (1074343), Bacteroides thetaiotaomicron (1071815), Bacillus coagulans (29814250), Bacteroides cellulosilyticus (29610027), Bacillus anthracis (2850719), Monoraphidium neglectum (25735215), Monoraphidium neglectum (25727595), Alloscardovia omnicolens (35868062), Actinomyces neuii subsp. neuii (35867196), Acetoanaerobium sticklandii (35557713), Exiguobacterium undae (32084128), Paenibacillus pabuli (32034589), Paenibacillus etheri (32019864), Actinomyces oris (31655321), Vibrio alginolyticus (31651465), Brochothrix thermosphacta (29820407), Lactobacillus sakei subsp. sakei (29638315), Anoxybacillus gonensis (29574914), bem como suas variantes e seus fragmentos. Em uma forma de realização, a proteína PFLA é derivada do gênero Bifidobacterium e, em algumas formas de realização, da espécie Bifidobacterium adolescentis. Em uma forma de realização, a molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica a proteína PFLA está presente em pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou mais cópias na célula hospedeira de levedura recombinante. Ainda em outra forma de realização, a molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica a proteína PFLA está presente em não mais de cinco, quatro, três, duas ou uma cópia na célula hospedeira de levedura recombinante.

[0108] No contexto da presente revelação, a célula hospedeira de levedura de fermentação recombinante tem uma modificação genética que codifica uma enzima formiato acetiltransferase e/ou uma enzima piruvato-formiato liase, como a PFLB. As formas de realização da PFLB podem ser derivadas, sem limitação, do seguinte (o número entre parênteses corresponde ao número de ID do Gene): Escherichia coli (945514), Shewanella oneidensis (1170601), Actinobacillus suis (34292499), Finegoldia magna (34165044), Streptococcus cristatus (29901775), Enterococcus hirae (13176625), Bacillus (3031414), Providencia alcalifaciens (34345353), Lactococcus garvieae (34203444), Butyrivibrio proteoclasticus (31781354), Teredinibacter turnerae (29651613), Chromobacterium violaceum (24945652), Vibrio campbellii (5554880), Vibrio campbellii (5554796), Rahnella aquatilis HX2 (34351700), Serratia rubidaea (32375076), Kosakonia sacchari SP1 (23845740), Shewanella baltica (11772863), Streptomyces acidiscabies (33082309), Streptomyces davaonensis (31227068), Parabacteroides distasonis (5308541), Bacteroides vulgatus (5303841), Fibrobacter succinogenes subsp. succinogenes

(34755392), Photobacterium damselae subsp.

Damselae (34512678), Enterococcus gilvus (34361749), Enterococcus gilvus (34360863), Enterococcus malodoratus (34355213), Enterococcus malodoratus (34354022), Akkermansia muciniphila (34174913), Lactobacillus curvatus (33995135), Dickeya zeae (33924934), Bacteroides oleiciplenus (32502326), Micromonospora aurantiaca (32162989), Selenomonas ruminantium subsp. lactilytica (31522408), Fusobacterium necrophorum subsp. funduliforme (31520832), Bacteroides uniformis (31507007), Streptomyces rimosus subsp.

Rimosus (29531908), Clostridium innocuum (26150740), Haemophilus] ducreyi (24944556), Clostridium bolteae (23114829), Vibrio tasmaniensis (7160644), Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida (4997718), Listeria monocytogenes (986171), Enterococcus faecalis (1200511), Lactobacillus plantarum (1064019), Vibrio fischeri (3278780), Lactobacillus sakei (33973511), Gardnerella vaginalis (9904192), Vibrio vulnificus (33954428), Vibrio toranzoniae (34373229), Anaerostipes hadrus (34240161), Edwardsiella anguillarum (33940299), Edwardsiella anguillarum (33937990), Lonsdalea quercina subsp.

Quercina (33074710), Enterococcus faecium (12999834), Aeromonas hydrophila subsp. hydrophila (4489100), Clostridium acetobutylicum (1117163), Escherichia coli (7151395), Shigella dysenteriae (3795966), Bacillus thuringiensis serovar konkukian (2856201), Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium (1252491), Shigella flexneri (1023824), Streptomyces griseoruber (32320336), Cryobacterium flavum (35898977), Ruminococcus gnavus (35895748), Bacillus acidiceler (34874555), Lactococcus piscium (34864362), Vibrio mediterranei (34766270), Faecalibacterium prausnitzii (34753200), Prevotella intermedia (34516966), Photobacterium damselae subsp.

Damselae (34509286), Pseudobutyrivibrio ruminis (34419894), Melissococcus plutonius (34408953), Streptococcus gallolyticus subsp. gallolyticus (34398704), Enterobacter hormaechei subsp.

Steigerwaltii (34155981), Enterobacter hormaechei subsp.

Steigerwaltii (34152298), Streptomyces venezuelae (34036549), Shewanella algae (34009243), Lactobacillus agilis (33976013), Streptococcus equinus (33961013), Neisseria sicca (33952517), Kitasatospora purpeofusca (32375782), Paenibacillus borealis (29549449), Vibrio fluvialis (29387150), Aliivibrio wodanis (28542465), Aliivibrio wodanis (28541256), Escherichia coli (7157421), Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi (1247405), Yersinia pestis (1174224), Yersinia enterocolitica subsp. enterocolitica (4713334), Streptococcus suis (8155093), Escherichia coli (947854), Escherichia coli (946315), Escherichia coli (945513), Escherichia coli (948904), Escherichia coli (917731), Yersinia enterocolitica subsp. enterocolitica (4714349), bem como suas variantes e seus fragmentos. Em uma forma de realização, a proteína PFLB é derivada do gênero Bifidobacterium e, em algumas formas de realização, da espécie Bifidobacterium adolescentis. Em uma forma de realização, a molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica a proteína PFLB está presente em pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou mais cópias na célula hospedeira de levedura recombinante. Ainda em outra forma de realização, a molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica a proteína PFLB está presente em não mais de cinco, quatro, três, duas ou uma cópia na célula hospedeira de levedura recombinante.

[0109] Em algumas formas de realização, a célula hospedeira de lvedura de fermentação recombinante compreende uma primeira modificação genética para expressar uma proteína PFLA, uma proteína PFLB ou uma combinação. Em uma forma de realização específica, a célula hospedeira de levedura de fermentação recombinante compreende uma primeira modificação genética para expressar uma proteína PFLA e uma proteína PFLB que podem, em algumas formas de realização, ser fornecidas em moléculas de ácido nucleico heterólogas distintas. Conforme indicado abaixo, a célula hospedeira de levedura recombinante também pode incluir modificações genéticas adicionais para fornecer ou aumentar sua capacidade de transformar acetil-COA em um álcool, como o etanol.

[0110] Alternativamente, ou em combinação, a célula hospedeira de levedura de fermentação recombinante pode portar uma ou mais modificações genéticas para a utilização de acetil-COA, por exemplo, fornecendo ou aumentando a atividade de acetaldeído e/ou álcool desidrogenase. A acetil-COA pode ser convertida em álcool, como etanol, usando primeiro uma acetaldeído desidrogenase e depois uma álcool desidrogenase. As acetaldeído desidrogenases de acilação (E.C. 1.2.1.10) são conhecidas por catalisar a conversão de acetaldeído em acetil-COA na presença de coA. As álcool desidrogenases (E.C. 1.1.1.1) são sabidamente capazes de catalisar a conversão de acetaldeído em etanol. A atividade das acetaldeído desidrogenase e álcool desidrogenase pode ser fornecida por uma única proteína (por exemplo, uma acetaldeído/álcool desidrogenase bifuncional) ou por uma combinação de mais de uma proteína (por exemplo, uma acetaldeído desidrogenase e uma álcool desidrogenase). Nas formas de realização em que a atividade da acetaldeído/álcool desidrogenase é fornecida por mais de uma proteína, pode não ser necessário fornecer a combinação de proteínas de forma recombinante na célula hospedeira de levedura recombinante, pois a célula pode ter alguma atividade pré-existente de acetaldeído ou álcool desidrogenase. Nessas formas de realização, a modificação genética pode incluir fornecer uma ou mais moléculas heterólogas de ácido nucleico que codificam uma ou mais de uma acetaldeído desidrogenase (AADH) heteróloga, uma álcool desidrogenase (ADH) heteróloga e/ou acetilaldeído / álcool desidrogenases (ADHE) bifuncional heteróloga. Por exemplo, a modificação genética pode compreender a introdução de uma molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica uma acetaldeído desidrogenase. Em outro exemplo, a modificação genética pode compreender a introdução de uma molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica uma álcool desidrogenase. Ainda em outro exemplo, a modificação genética pode compreender a introdução de pelo menos duas moléculas de ácido nucleico heterólogas, uma primeira codificando uma acetaldeído desidrogenase heteróloga e uma segunda codificando uma álcool desidrogenase heteróloga. Em outra forma de realização, a modificação genética compreende a introdução de um ácido nucleico heterólogo que codifica acetilaldeído/álcool desidrogenases (AADH) heterólogas bifuncionais, como as descritas na Patente US Número de Série 8,956,851 e WO 2015/023989. Os AADHs heterólogas da presente revelação incluem, mas não se limitam a, os polipeptídeos ADHE ou um polipeptídeo codificado por um gene adhe ortólogo.

[0111] A célula hospedeira de levedura de fermentação recombinante pode ser geneticamente modificada para permitir a produção de polipeptídeos heterólogos adicionais. Em uma forma de realização, a célula de levedura de fermentação recombinante pode ser usada para a produção de uma enzima, e especialmente uma enzima envolvida na clivagem ou hidrólise de seu substrato (por exemplo, uma enzima lítica e, em algumas formas de realização, uma enzima sacarolítica). Ainda em outra formas de realização, a enzima pode ser uma glicosídeo hidrolase. No contexto da presente revelação, o termo “glicosídeo hidrolase” refere-se a uma enzima envolvida na digestão, metabolismo e/ou hidrólise de carboidratos, incluindo amilases (além daquelas descritas acima), celulases, hemicelulases, enzimas acessórias celulolíticas e amilolíticas, inulinases, levanases, trealases, pectinases e enzimas que usam açúcar pentose. Em outra forma de realização, a enzima pode ser uma protease. No contexto da presente revelação, o termo “protease” se refere a uma enzima envolvida na digestão, metabolismo e/ou hidrólise de proteínas. Ainda em outra formas de realização, a enzima pode ser uma esterase. No contexto da presente revelação, o termo “esterase” refere-se a uma enzima envolvida na hidrólise de um éster proveniente de um ácido ou álcool, incluindo fosfatases, como as fitases.

[0112] A fim de produzir as células hospedeiras de levedura de fermentação recombinantes, uma ou mais moléculas de ácido nucleico heterólogas (também conhecidas como cassetes de expressão) são feitas in vitro e introduzidas à célula de levedura a fim de permitir a expressão recombinante dos polipeptídeos aqui descritos. Produtos e Processos de Levedura para a Produção de Produtos de Levedura

[0113] As células de levedura da presente revelação podem ser utilizadas na preparação de um produto de levedura que pode, em última análise, ser utilizado como aditivo para melhorar o rendimento de uma fermentação por meio de uma célula de levedura de fermentação. Em algumas formas de realização em que a célula de levedura é uma célula hospedeira de levedura recombinante, os produtos de levedura feitos pelo processo da presente revelação podem conter pelo menos 0,1% (em porcentagem de peso seco) da enzima heteróloga quando em comparação com o total de proteínas do produto de levedura. Os produtos de levedura da presente revelação podem incluir uma ou mais enzimas heterólogas, conforme aqui descrito. Em outra forma de realização, a presente revelação fornece processos, bem como produtos de levedura com uma atividade enzimática mínima específica e/ou uma faixa específica de atividade enzimática. Vantajosamente, a enzima heteróloga presente em algumas formas de realização dos produtos de levedura pode ser concentrada durante o processamento e pode permanecer biologicamente ativa para realizar sua função pretendida nos produtos de levedura.

[0114] Quando o produto de levedura é um produto de levedura inativada, o processo para produzir o produto de levedura compreende amplamente duas etapas: uma primeira etapa de fornecer células hospedeiras de levedura propagadas e uma segunda etapa de lisar as células hospedeiras de levedura propagadas para produzir o produto de levedura. O processo de produção do produto de levedura pode incluir uma etapa de separação opcional e uma etapa de secagem opcional. Em algumas formas de realização, o processo pode incluir o fornecimento das células hospedeiras de levedura propagadas que foram propagadas em melaços. Alternativamente, o processo pode incluir fornecer as células hospedeiras de levedura propagadas que são propagadas em um meio compreendendo um extrato de levedura. Em uma forma de realização, o processo pode incluir ainda a propagação das células hospedeiras de levedura (em um melaço ou meio YPD, por exemplo).

[0115] Em algumas formas de realização, as células podem ser lisadas usando autólise (que pode ser opcionalmente realizada na presença de enzimas exógenas adicionais) ou homogeneizadas (por exemplo, usando uma técnica de moagem com esferas, agitação com esferas ou homogeneização em alta pressão).

[0116] Em algumas formas de realização, as células hospedeiras de levedura recombinantes propagadas podem ser lisadas usando autólise. Por exemplo, as células hospedeiras de levedura recombinantes propagadas podem estar sujeitas a um tratamento combinado de calor e pH por uma quantidade específica de tempo ( por exemplo, 24 h) para fazer com que a autólise das células hospedeiras de levedura recombinantes propagadas forneça as células hospedeiras de levedura recombinantes lisadas. Por exemplo, as células recombinantes propagadas podem ser submetidas a uma temperatura entre cerca de 40ºC e cerca de 70ºC ou entre cerca de 50ºC e cerca de 60ºC, As células recombinantes propagadas podem ser submetidas a uma temperatura de pelo menos cerca de 40°C, 41°C, 42°C, 43°C, 44°C, 45°C, 46°C, 47°C, 48°C, 49°C, 50°C, 51°C, 52°C, 53°C, 54°C, 55°C, 56°C, 57°C, 58°C, 59°C, 60°C, 61°C, 62°C, 63°C, 64°C, 65°C, 66°C, 67°C, 68°C, 69°C ou 70°C. Alternativamente, ou em combinação, as células recombinantes propagadas podem ser submetidas a uma temperatura não superior a cerca de 70°C, 69°C, 68°C, 67°C, 66°C, 65°C, 64°C, 63°C, 62°C, 61°C, 60°C, 59°C, 58°C, 57°C, 56°C, 55°C, 54°C, 53°C, 52°C, 51°C, 50°C, 49°C, 48°C, 47°C, 46°C, 45°C, 44°C, 43°C, 42°C, 41°C ou 40°C. Em outro exemplo, as células recombinantes propagadas podem ser submetidas a um pH entre cerca de 4,0 e 8,5 ou entre cerca de 5,0 e 7,5. As células recombinantes propagadas podem ser submetidas a um pH de pelo menos cerca de 4,0; 4,1; 4,2; 4,3; 4,4; 4,5; 4,6; 4,7; 4,8; 4,9; 5,0; 5,1; 5,2; 5,3; 5,4; 5,5; 5,6; 5,7; 5,8; 5,9; 6,0; 6,1; 6,2; 6,3; 6,4; 6,5; 6,6; 6,7; 6,8; 6,9; 7,0; 7,1; 7,2; 7,3; 7,4; 7,5; 7,6; 7,7; 7,8; 7,9; 8,0; 8,1; 8,2; 8,3; 8,4 ou 8,5. Alternativamente, ou em combinação, as células recombinantes propagadas podem ser submetidas a um pH de, no máximo, 8,5; 8,4; 8,3; 8,2; 8,1; 8,0; 7,9; 7,8; 7,7; 7,6; 7,5; 7,4; 7,3; 7,2; 7,1; 7,0; 6,9; 6,8; 6,7; 6,6; 6,5; 6,4; 6,3; 6,2; 6,1; 6,0; 5,9; 5,8; 5,7; 5,6; 5,5; 5,4; 5,3; 5,2; 5,1; 5,0; 4,9; 4,8; 4,7; 4,6 ou 4,5.

[0117] Em algumas formas de realização, as células hospedeiras de levedura podem ser homogeneizadas (por exemplo, utilizando uma técnica de moagem com esferas, uma técnica de trituração com esferas ou uma técnica de homogeneização de alta pressão) e, dessa forma, o processo de produção do produto de levedura compreende uma etapa de homogeneização.

[0118] O processo também pode incluir uma etapa de secagem. A etapa de secagem pode incluir, por exemplo, secagem por aspersão e/ou secagem em leito fluidizado. Quando o produto de levedura é um autolisado, o processo pode incluir a secagem direta das células hospedeiras de levedura recombinantes lisadas após a etapa de lise, sem realizar uma separação adicional da mistura lisada.

[0119] Para fornecer produtos de levedura adicionais, pode ser necessário ainda separar os componentes das células hospedeiras de levedura recombinantes lisadas. Por exemplo, os componentes da parede celular (chamados de “fração insolúvel”) da célula hospedeira de levedura recombinante lisada podem ser separados dos outros componentes (chamados de “fração solúvel”) das células hospedeiras de levedura recombinantes lisadas. Essa etapa de separação pode ser feita, por exemplo, usando centrifugação e/ou filtragem. O processo da presente revelação pode incluir uma ou mais etapas de lavagem para fornecer as paredes celulares ou o extrato de levedura. O extrato de levedura pode ser feito por secagem da fração solúvel obtida.

[0120] Em uma forma de realização do processo, a fração solúvel pode ser ainda separada antes da secagem. Por exemplo, os componentes da fração solúvel com um peso molecular superior a 10 kDa podem ser separados da fração solúvel. Essa separação pode ser obtida, por exemplo, usando filtragem (e, mais especificamente, ultrafiltragem). Quando a filtragem é utilizada para separar os componentes, é possível filtrar (por exemplo, remover) os componentes com um peso molecular inferior a cerca de 10 kDa e reter os componentes com um peso molecular superior a cerca de 10 kDa. Os componentes da fração solúvel com um peso molecular superior a 10 kDa podem, opcionalmente, ser secos para fornecer um retentato como produto de levedura.

[0121] Quando o produto de levedura é um produto ativo/semiativo, ele pode ser submetido a uma etapa de concentração, por exemplo, uma etapa de remoção de parte do meio de propagação das células hospedeiras de levedura propagadas. A etapa de concentração pode incluir ressuspender as células hospedeiras de levedura concentradas e propagadas no meio de propagação (por exemplo, preparação sem lavagem) ou um meio fresco ou água (por exemplo, preparação com lavagem).

[0122] No processo aqui descrito, o produto de levedura é fornecido como uma forma inativa ou é criado durante o processo de liquefação/fermentação. O produto de levedura pode ser fornecido em uma forma líquida, semilíquida ou seca. Em algumas formas de realização, o produto de levedura inativada é fornecido na forma de um creme de levedura. Conforme aqui utilizado, “creme de levedura” refere- se a um produto de levedura ativo ou semiativo obtido após a propagação das células hospedeiras de levedura. Processo e Kit para Melhorar o Rendimento de um Produto de Fermentação

[0123] A presente revelação fornece um processo para melhorar o rendimento de um produto de fermentação. O processo envolve liquefazer um meio de liquefação em um meio de fermentação (liquefeito). Alternativamente, ou em combinação, o processo envolveu a fermentação do meio de fermentação (que pode ou não ter sido liquefeito) com uma célula de levedura de fermentação para obter o produto de fermentação. O processo pode ser usado para melhorar a produção de etanol, como um produto de fermentação. O processo também pode ser utilizado para aumentar o aminoácido livre e/ou o equivalente de dextrose no meio de fermentação

(liquefeito) (comparado ao meio de liquefação), de modo a aumentar o rendimento do produto de fermentação.

[0124] A fim de alcançar esse aumento do rendimento, o processo também compreende incluir uma célula hospedeira de levedura ou de um produto de levedura obtido da célula hospedeira de levedura ao meio de liquefação e/ou meio de fermentação (que pode ser ou talvez tenha sido liquefeito).

[0125] Em uma forma de realização, um primeiro produto de levedura inativada (obtido a partir de uma primeira célula hospedeira de levedura recombinante compreendendo um primeiro ácido nucleico heterólogo que codifica uma primeira enzima heteróloga) é adicionado ao meio de liquefação. Nessa forma de realização, o primeiro produto de levedura inativada está presente durante a etapa de liquefação. Espera-se que alguns componentes do primeiro produto de levedura inativada permaneçam no meio liquefeito, que pode ser, por fim, usado como um meio de fermentação.

[0126] Em outra forma de realização, um primeiro produto de levedura inativada (obtido a partir de uma primeira célula hospedeira de levedura recombinante compreendendo um primeiro ácido nucleico heterólogo que codifica uma primeira enzima heteróloga) é adicionado ao meio de fermentação. O meio de fermentação pode ter sido previamente liquefeito ou não. Nessa forma de realização, o primeiro produto de levedura inativada não é adicionado ao meio de liquefação, mas está incluído no meio de fermentação. Alternativamente, o primeiro produto de levedura inativada pode ser adicionado ao meio de liquefação e ao meio de fermentação (que pode ou não ter sido liquefeito).

[0127] Em outra forma de realização, um produto de levedura inativada é formado in situ, incluindo uma segunda célula hospedeira de levedura recombinante (compreendendo um segundo ácido nucleico heterólogo que codifica uma segunda enzima heteróloga) no meio de liquefação. Nessa forma de realização, a etapa de liquefação/aquecimento gerará um segundo produto de levedura inativada (a partir da segunda célula hospedeira de levedura recombinante) no meio liquefeito que pode ser usado como um meio de fermentação. Em algumas formas de realização, a segunda célula hospedeira de levedura recombinante não é adicionada ao meio de fermentação antes da formação da segunda célula hospedeira de levedura inativada.

[0128] Em outra forma de realização, um terceiro produto de levedura inativada (obtido a partir de uma célula hospedeira de levedura não geneticamente modificada) é adicionado apenas ao meio de liquefação e não é adicionado diretamente ao meio de fermentação. Espera-se que alguns componentes do terceiro produto de levedura inativada permaneçam no meio liquefeito, que pode ser, por fim, usado como um meio de fermentação. Em algumas formas de realização, o terceiro produto de levedura inativada é adicionado isoladamente ou em conjunto com enzimas exógenas adicionais. Em uma forma de realização, o terceiro produto de levedura inativada é combinado com uma alfa-amilase exógena. Em uma forma de realização, o processo inclui a adição de uma alfa-amilase exógena com o terceiro produto de levedura inativada ao meio de liquefação.

[0129] Como aqui usado, um meio de liquefação compreende moléculas de amido relativamente intactas. Um meio liquefeito é um meio obtido após uma etapa de liquefação (que normalmente envolve uma etapa de aquecimento do meio de liquefação), em que pelo menos algumas das moléculas de amido foram hidrolisadas. O meio liquefeito tem uma viscosidade mais baixa que o meio de liquefação. Um meio de fermentação é um meio liquefeito ao qual foi adicionado um organismo de fermentação (como uma célula de levedura) capaz de metabolizar o amido para produzir um produto de fermentação (por exemplo, etanol e CO 2). O meio de fermentação pode ter sido previamente liquefeito (por exemplo, obtido a partir de um meio liquefeito). Em algumas formas de realização, o meio de fermentação não foi previamente liquefeito.

[0130] Em uma forma de realização, o processo aumenta o equivalente de dextrose do meio de fermentação (liquefeito) quando comparado ao equivalente de dextrose do meio de liquefação. Em outras formas de realização, o processo aumenta o amino nitrogênio livre do meio de fermentação (liquefeito) quando comparado ao amino nitrogênio livre do meio de liquefação. Em uma forma de realização, o processo aumenta tanto o equivalente de dextrose quanto o amino nitrogênio livre do meio de fermentação (liquefeito) quando comparado ao meio de liquefação.

[0131] A presente revelação também fornece um processo para melhorar o rendimento de um produto de fermentação. O kit compreende pelo menos um dos seguintes: o primeiro produto de levedura inativada, a segunda célula hospedeira de levedura recombinante e/ou o terceiro produto de levedura inativada e pelo menos um componente para fazer o meio de fermentação (por exemplo, uma fonte de carboidratos, uma fonte de fósforo e/ou uma fonte de nitrogênio, por exemplo).

[0132] O kit também pode inclui instruções sobre como usar o primeiro produto de levedura inativada, a segunda célula hospedeira de levedura recombinante e/ou o terceiro produto de levedura inativada para melhorar o rendimento da fermentação da célula de levedura de fermentação durante a fermentação. Por exemplo, as instruções podem indicar quando usar, como usar ou quanto do primeiro produto de levedura inativada, da segunda célula hospedeira de levedura recombinante, do terceiro produto de levedura inativada e/ou da célula de levedura de fermentação. Em uma forma de realização, o kit compreende os componentes secos para produzir o meio de fermentação. Em outra forma de realização, o kit compreende o meio de fermentação em uma forma líquida. Em outra forma de realização, o kit pode compreender o meio de fermentação em uma forma seca, que pode, em algumas formas de realização, ser fornecido como componentes a serem combinados para produzir o meio de fermentação. Ainda em outra forma de realização, o meio de fermentação do kit já contém o primeiro e/ou o terceiro produto de levedura inativada. Os componentes do kit podem ser fornecidos em uma forma estéril.

[0133] Conforme aqui usado, um “meio” é um substrato que é fermentável pela célula de fermentação de levedura para produzir pelo menos um produto de fermentação (como, por exemplo, etanol). Em algumas formas de realização, o meio inclui nutrientes usados pela célula de levedura durante o processo de fermentação. Os componentes do meio podem incluir uma fonte de carboidratos, uma fonte de fósforo e uma fonte de nitrogênio. O meio pode opcionalmente incluir micronutrientes (como vitaminas e minerais), ácidos graxos, nitrogênio, aminoácidos ou uma combinação deles. Além disso, o meio pode incluir componentes que não são inerentemente fermentáveis pela célula de levedura de fermentação.

[0134] Em algumas formas de realização, o meio de liquefação, o meio de fermentação liquefeito e/ou o meio de fermentação pode incluir ou ser suplementado com uma biomassa que pode ser fermentada pela célula de levedura de fermentação e inclui qualquer tipo de biomassa conhecida na arte e descrita aqui. Por exemplo, a biomassa pode incluir, mas não se limita a, amido, açúcar e materiais lignocelulósicos. Os materiais de amido podem incluir, mas não se limitam a, purês como milho, trigo, centeio, cevada, arroz ou milo. Os materiais de açúcar podem incluir, mas não se limitam a, beterraba sacarina, tubérculos de alcachofra, sorgo doce, melaços ou cana. Os termos “material lignocelulósico”, “substrato lignocelulósico” e “biomassa celulósica” significam qualquer tipo de biomassa compreendendo celulose, hemicelulose, lignina ou suas combinações, tais como, mas não se limitando a, biomassa lenhosa, gramíneas forrageiras, culturas energéticas herbáceas, biomassa de plantas não lenhosas, resíduos agrícolas e/ou restos agrícolas, resíduos florestais e/restos florestais, lamas de produção de papel e/ou lamas de papel usado, lamas de tratamento de águas residuais, resíduos sólidos municipais, fibras de milho de plantas de etanol de milho moídas a úmido e a seco e resíduos do processamento de açúcar. Os termos “hemicelulósicos”, “partes hemicelulósicas” e “frações hemicelulósicas” significam os elementos não lignina, não celulose do material lignocelulósico, tais como, mas não se limitando a, hemicelulose (isto é, compreendendo xiloglucano, xilano, glucuronoxilano, arabinoxilano, manano, glucomanano e galactoglucomanano), pectinas (por exemplo, homogalacturonanos, ramnogalacturonanos I e II e xilogalacturonano) e proteoglicanos (por exemplo, arabinogalactano-proteína, extensina e proteínas ricas em prolina).

[0135] Em um exemplo não limitante, o material lignocelulósico pode incluir, mas não se limita a, biomassa lenhosa, tal como fibra de polpa de madeira reciclada, serragem, madeira dura, madeira macia e suas combinações; switchgrass, capim da praia, azevém, capim-amarelo, miscanto ou uma combinação dos mesmos; resíduos do processamento de açúcar, tais como, mas não se limitando ao bagaço da cana-de-açúcar; resíduos agrícolas, tais como, mas não se limitando à palha de arroz, casca de arroz, palha de cevada, espigas de milho, palha de cereal, palha de trigo, palha de canola, palha de aveia, casca de aveia e fibra de milho; paleta (stover), tal como, mas não se limitando à paleta de soja, paleta de milho; suculentas, tais como, mas não se limitando a, agave; e resíduos florestais, tais como, mas não se limitando a, fibra de polpa de madeira reciclada, serragem, madeira dura (por exemplo, choupo, carvalho, bordo, bétula, salgueiro), madeira macia ou qualquer combinação dos mesmos. O material lignocelulósico pode compreender uma espécie de fibra; alternativamente, o material lignocelulósico pode compreender uma mistura de fibras que se originam de diferentes materiais lignocelulósicos. Outros materiais lignocelulósicos são resíduos agrícolas, como palhas de cereais, incluindo palha de trigo, palha de cevada, palha de canola e palha de aveia; fibra de milho; paletas, como paleta de milho e pelate de soja; gramíneas, como switchgrass, capim-amarelo, capim da praia e miscanto; ou combinações dos mesmos.

[0136] Será apreciado que o material lignocelulósico adequado pode ser qualquer matéria-prima que contenha celulose solúvel e/ou insolúvel, onde a celulose insolúvel pode estar em forma cristalina ou não cristalina. Em várias formas de realização, a biomassa lignocelulósica compreende, por exemplo, madeira, milho, paleta de milho, serragem, casca, melaços, cana-de-açúcar, folhas, resíduos agrícolas e florestais, gramíneas como switchgrass, produtos da digestão ruminantes, resíduos municipais, efluente da indústria de papel, jornal, papelão ou combinações dos mesmos.

[0137] A lama de papel também é uma matéria-prima viável para a produção de lactato ou acetato. A lama de papel é um resíduo sólido proveniente da produção de celulose e papel, e geralmente é removida da água residual de processo em um clarificador primário. O custo da eliminação de lamas úmidas é um incentivo significativo para converter o material em outros usos, como a conversão em etanol. Os processos fornecidos pela presente invenção são amplamente aplicáveis. Além disso, os produtos de fermentação podem ser usados para produzir etanol ou produtos químicos de maior valor adicionado, como ácidos orgânicos, aromáticos, ésteres, acetona e intermediários de polímeros.

[0138] Em algumas formas de realização, o meio de fermentação pode não conter nutrientes suficientes necessários para o crescimento e o metabolismo da célula de levedura de fermentação durante a fermentação. O primeiro, segundo e/ou terceiro produto de levedura inativada da presente revelação pode incluir nutrientes que complementam os nutrientes presentes nativamente no meio de fermentação. A enzima heteróloga presente no primeiro produto de levedura inativada e/ou na segunda célula hospedeira de levedura recombinante pode ainda sustentar a fermentação. Por exemplo, quando o meio de fermentação inclui amido, a enzima pode ser uma enzima amilolítica que decompõe o amido em moléculas menores.

[0139] Em algumas formas de realização, o primeiro e/ou o terceiro produto de levedura inativada pode ser formulado para ser adicionado ao meio de liquefação a uma concentração de pelo menos cerca de 0,00001 g por litro do meio de liquefação, 0,00005 g por litro do meio de liquefação, 0,0001 g por litro do meio de liquefação, 0,0005 g por litro do meio de liquefação, 0,001 g por litro do meio de liquefação, 0,005 g por litro do meio de liquefação, 0,01 g por litro do meio de liquefação, 0,05 g por litro do meio de liquefação, 0,1 g por litro do meio de liquefação, 0,5 g por litro do meio de liquefação ou ainda mais. Em uma forma de realização, o primeiro e/ou o terceiro produto de levedura inativada é formulado para ser adicionado ao meio de liquefação a uma concentração de pelo menos 0,01 g por litro do meio de liquefação. Em uma forma de realização, o primeiro e/ou o terceiro produto de levedura inativada é formulado para ser adicionado ao meio de liquefação a uma concentração de pelo menos 0,03 g por litro do meio de liquefação.

[0140] Em algumas formas de realização, o segundo produto de levedura inativada pode ser formulado para ser adicionado ao meio de liquefação para fornecer um segundo produto de levedura inativada a uma concentração de pelo menos cerca de 0,00001 g por litro do meio de liquefação, 0,00005 g por litro do meio de liquefação, 0,0001 g por litro do meio de liquefação, 0,0005 g por litro do meio de liquefação, 0,001 g por litro do meio de liquefação, 0,005 g por litro do meio de liquefação, 0,01 g por litro do meio de liquefação, 0,05 g por litro do meio de liquefação, 0,1 g por litro do meio de liquefação, 0,5 g por litro do meio de liquefação ou ainda mais. Em uma forma de realização, a segunda célula hospedeira de levedura recombinante pode ser formulada para ser adicionada ao meio de liquefação para fornecer um segundo produto de levedura inativada a uma concentração de pelo menos 0,01 g por litro do meio de liquefação. Em uma forma de realização, a segunda célula hospedeira de levedura recombinante pode ser formulada para ser adicionada ao meio de liquefação para fornecer um segundo produto de levedura inativada a uma concentração de pelo menos 0,03 g por litro do meio de liquefação.

[0141] Em algumas formas de realização, o primeiro produto de levedura inativada é formulado para ser adicionado ao meio de fermentação a uma concentração de pelo menos cerca de 0,00001 g por litro do meio de fermentação, 0,00005 g por litro do meio de fermentação, 0,0001 g por litro do meio de fermentação, 0,0005 g por litro do meio de fermentação, 0,001 g por litro do meio de fermentação, 0,005 g por litro do meio de fermentação, 0,01 g por litro do meio de fermentação, 0,05 g por litro do meio de fermentação, 0,1 g por litro do meio de fermentação, 0,5 g por litro do meio de fermentação ou ainda mais. Em uma forma de realização, o processo compreende a adição do primeiro produto de levedura inativada a uma concentração de pelo menos 0.01 g por litro do meio de fermentação. Em uma forma de realização, o processo compreende a adição do primeiro produto de levedura inativada a uma concentração de pelo menos 0.03 g por litro do meio de fermentação.

[0142] Em algumas formas de realização, o kit inclui a célula de levedura de fermentação. A inclusão da célula de levedura de fermentação permite a combinação dos elementos do kit para usar o processo de aumento do rendimento de um produto de fermentação produzido pela primeira célula de levedura, conforme descrito no presente documento.

[0143] Os produtos de levedura inativadas e as células hospedeiras de levedura recombinantes aqui descritas podem ser utilizados em um processo de fermentação para melhorar/otimizar um rendimento de um produto de fermentação da célula de levedura fermentada. Os produtos de levedura inativadas e as células hospedeiras de levedura recombinantes são especialmente úteis em combinação com um meio de fermentação que pode não fornecer nutrientes suficientes para a célula de levedura de fermentação sobreviver, crescer, reproduzir e/ou converter biomassa em um produto fermentável.

[0144] A presente revelação proporciona o uso do primeiro produto de levedura inativada, da segunda célula hospedeira de levedura recombinante e/ou do terceiro produto de levedura inativada com a célula de levedura de fermentação para fornecer nutrientes para suportar o crescimento e/ou melhorar e, em algumas formas de realização, limitar ou evitar a necessidade de adicionar fonte exógena adicional de enzimas purificadas durante a fermentação. O uso dos produtos da levedura inativados e/ou das células hospedeiras de levedura recombinantes pode ser vantajoso porque, em algumas formas de realização, pode reduzir ou eliminar a necessidade de complementar o meio de liquefação ou fermentação com fonte externa de enzimas purificadas (por exemplo, glucoamilase e/ou alfa-amilase), ao mesmo tempo fornecendo nutrientes à célula de levedura de fermentação durante a fermentação do meio de fermentação em um produto de fermentação (por exemplo, o etanol).

[0145] Além de aumentar o rendimento da fermentação, o uso dos produtos de levedura inativadas e/ou célula hospedeira de levedura recombinante pode reduzir a complexidade no controle de insumos no meio de fermentação, pois uma única composição é capaz de fornecer múltiplas funcionalidades. Além disso, os custos de fornecimento do(s) aditivo(s) podem ser relativamente mais baixos do que o fornecimento de nutrientes e enzimas de levedura separados, uma vez que ambos são fornecidos a partir de uma única célula hospedeira de levedura recombinante.

[0146] Em algumas formas de realização em que a enzima heteróloga presente no primeiro e/ou segundo produto de levedura inativada é uma alfa-amilase termoestável, isso pode simplificar o processo de fermentação através da hidrólise do amido (incluindo o amido cru), principalmente durante o processo de liquefação de uma forma mais eficiente. Em algumas formas de realização, o uso de uma alfa- amilase termoestável como a enzima heteróloga pode reduzir ou oscilar o uso de alfa- amilase adicional durante a etapa de fermentação subsequente.

[0147] Em algumas formas de realização, as células de produtos de levedura inativada podem ser adicionadas ao meio de fermentação antes, ao mesmo tempo e/ou depois que a célula de levedura de fermentação é adicionada ao meio de fermentação. Os produtos de levedura inativada/células hospedeiras de levedura recombinantes podem ser adicionados uma ou várias vezes durante a liquefação. Em uma forma de realização, os produtos de levedura inativadas são adicionados ao meio de fermentação antes da adição da célula de levedura de fermentação. Isso é especialmente conveniente quando a enzima heteróloga é uma alfa-amilase termoestável, pois permitirá aquecer o amido a altas temperaturas e liquefazê-lo antes da adição da célula de levedura de fermentação. Alternativamente, ou em combinação, o primeiro produto de levedura inativada e/ou a segunda célula hospedeira de levedura recombinante podem ser utilizados para melhorar a etapa de liquefação aumentando o equivalente de dextrose ou o teor de aminoácidos livres do meio de fermentação liquefeito. Em outra forma de realização, o primeiro produto de levedura inativada pode ser adicionado ao meio de fermentação ao mesmo tempo que a célula de levedura de fermentação. Em ainda outra forma de realização, o primeiro produto de levedura inativada é adicionado ao meio de fermentação após a adição da célula de levedura de fermentação. Em ainda outra forma de realização, o primeiro e/ou o terceiro produto de levedura inativada é adicionado ao meio de fermentação antes e ao mesmo tempo em que a célula de levedura de fermentação é adicionada ao meio de fermentação. Em outra forma de realização, o primeiro e/ou o terceiro produto de levedura inativada é adicionado ao meio de fermentação antes e depois que a célula de levedura de fermentação é adicionada ao meio de fermentação. Em algumas formas de realização, o primeiro produto de levedura inativada pode ser adicionado ao meio de fermentação ao mesmo tempo e depois que a célula de levedura de fermentação é adicionada ao meio de fermentação. Em ainda outra forma de realização, o primeiro e/ou o terceiro produto de levedura inativada é adicionado ao meio de fermentação antes, ao mesmo tempo e depois que a célula de levedura de fermentação é adicionada ao meio de fermentação.

[0148] Em algumas formas de realização, o primeiro e/ou o terceiro produto de levedura inativada é adicionado ao meio de liquefação de modo a que a sua concentração seja de pelo menos 0,00001 g do aditivo por L do meio de liquefação, pelo 0,00005 g do aditivo por L do meio de liquefação, pelo menos 0,0001 g do aditivo por L do meio de liquefação, pelo menos 0,0005 g do aditivo por L do meio de liquefação, pelo menos 0,001 g do aditivo por L do meio de liquefação, pelo menos 0,005 g do aditivo por L do meio de liquefação, pelo menos 0,01 g do aditivo por L do meio de liquefação, pelo menos 0,05 g do aditivo por L do meio de liquefação, pelo menos 0,1 g do aditivo por L do meio de liquefação, pelo menos 0,5 g do aditivo por L do meio de liquefação ou mais. O primeiro e/ou o terceiro produto de levedura inativada pode ser formulado em uma forma de dosagem específica para fornecer uma concentração apropriada específica ao meio de liquefação.

[0149] Em algumas formas de realização, a segunda célula hospedeira de levedura recombinante é adicionada ao meio de liquefação para fornecer um segundo produto de levedura inativada à concentração de pelo menos 0,00001 g do aditivo por L do meio de liquefação, pelo menos 0,00005 g do aditivo por L do meio de liquefação, pelo menos 0,0001 g do aditivo por L do meio de liquefação, pelo menos

0,0005 g do aditivo por L do meio de liquefação, pelo menos 0,001 g do aditivo por L do meio de liquefação, pelo menos 0,005 g do aditivo por L do meio de liquefação, pelo menos 0,01 g do aditivo por L do meio de liquefação, pelo menos 0,05 g do aditivo por L do meio de liquefação, pelo menos 0,1 g do aditivo por L do meio de liquefação, pelo menos 0,5 g do aditivo por L do meio de liquefação ou mais. A segunda célula hospedeira de levedura recombinante é adicionada ao meio de liquefação para fornecer um segundo produto de levedura inativada em uma forma de dosagem específica para fornecer uma concentração específica apropriada ao meio de liquefação.

[0150] Em algumas formas de realização, o primeiro produto de levedura inativada é adicionado ao meio de fermentação de modo a que a sua concentração seja de pelo menos 0,00001 g do aditivo por L do meio de fermentação, pelo 0,00005 g do aditivo por L do meio de fermentação, pelo menos 0,0001 g do aditivo por L do meio de fermentação, pelo menos 0,0005 g do aditivo por L do meio de fermentação, pelo menos 0,001 g do aditivo por L do meio de fermentação, pelo menos 0,005 g do aditivo por L do meio de fermentação, pelo menos 0,01 g do aditivo por L do meio de fermentação, pelo menos 0,05 g do aditivo por L do meio de fermentação, pelo menos 0,1 g do aditivo por L do meio de fermentação, pelo menos 0,5 g do aditivo por L do meio de fermentação ou mais. O primeiro produto de levedura inativada pode ser formulado em uma forma de dosagem específica para fornecer uma concentração apropriada específica ao meio de fermentação.

[0151] O processo de fermentação pode ser realizado a temperaturas de pelo menos cerca de 25°C, cerca de 28°C, cerca de 30°C, cerca de 31°C, cerca de 32°C, cerca de 33°C, cerca de 34°C, cerca de 35°C, cerca de 36°C, cerca de 37°C, cerca de 38°C, cerca de 39°C, cerca de 40°C, cerca de 41°C, cerca de 42°C ou cerca de 50°C.

[0152] Em algumas formas de realização, a etapa de fermentação é realizada em condições anaeróbicas. Como descrito acima, a levedura tende a passar por processos de fermentação em condições anaeróbicas, ao mesmo tempo em que tende a passar por processos de propagação em condições aeróbicas. Conforme aqui utilizado, “condições anaeróbicas” significa que o meio de liquefação está sob um ambiente pobre em oxigênio. Um ambiente pobre em oxigênio pode ter uma concentração de oxigênio abaixo da concentração do ar. Por exemplo, a concentração de oxigênio pode estar abaixo de 21%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% em volume.

[0153] Em algumas formas de realização, o processo pode ser usado para produzir etanol a uma determinada taxa. Por exemplo, em algumas formas de realização, o etanol é produzido a uma taxa de pelo menos cerca de 0,1 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 0,25 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 0,5 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 0,75 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 1,0 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 2,0 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 5,0 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 10 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 15 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 20,0 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 25 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 30 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 50 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 100 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 200 mg por hora por litro, ou pelo menos cerca de 500 mg por hora por litro.

[0154] A produção de etanol pode ser medida usando qualquer método conhecido na arte. Por exemplo, a quantidade de etanol em amostras de fermentação pode ser avaliada por meio de análise via HPLC. Muitos kits de ensaio de etanol estão disponíveis comercialmente usam, por exemplo, ensaios baseados na enzima álcool oxidase.

[0155] A presente invenção será mais facilmente compreendida, por referência aos exemplos a seguir, que são dados para ilustrar a invenção, e não para limitar o seu escopo. Exemplo I – Caracterização de um Extrato de Levedura Compreendendo Alfa-Amilase nos Desempenhos de Crescimento e Fermentação de Cepas de Levedura

[0156] Liquefação em escala laboratorial. Células da cepa M15958 foram suportadas em YPD durante a noite, centrifugadas, lavadas e, em seguida, dosificadas a 0,9 g de peso seco de células em uma liquefação de 300 mL a 85ºC. As liquefações foram realizadas usando 33% de farinha de milho com 40% de backset a pH 5,3. A lama foi elevada para 60ºC e 0,9 g/L da cepa M15958 adicionada e a temperatura elevada 2ºC/min a 85ºC As amostras foram ensaiadas em um ensaio de

Solução Reagente Ácido Dinitrosalicílico (DNS) usando 25 µl de amostra diluída a 1:8 com 50 µl de DNS e fervida por 5 minutos. A absorvância foi lida a 540 nm e o equivalente de dextrose (DE) calculado usando-se uma curva padrão de dextrose.

[0157] Crescimento da placa de microtitulação em meio de Verduyn. Os ensaios de crescimento foram realizados com leitores de placa para monitorar a densidade óptica a 600 nm em função do tempo. As células foram pré-cultivadas em meio de Verduyn (Verduyn et al. 1992) utilizando 4.2 g/L de glicose a pH 4,2, em seguida diluídas a 1:1000 em meio fresco suplementado com 0; 0,05; 0,1 ou 0,5 g/L de um extrato de levedura comercial. Os ensaios foram incubados a 32 ºC por 30 h.

[0158] Crescimento em Escala Laboratorial em Meio de Verduyn. Experimentos de fermentação foram realizados com 50 ml de meio de Verduyn a pH 4,2 em frascos de 250 mL Pyrex®, com adição de extrato de levedura a 0; 0,01; 0,1 ou 0,5 g/L. Os inóculos foram cultivados durante a noite em meio de Verduyn, centrifugados e lavados antes de serem dosificados a 0,1 g/L de peso seco de células. O efluente gasoso de CO2 foi coletado usando um sistema de monitoramento de CO2. A quantidade de etanol e glicerol foi determinada por cromatografia líquida de alta performance. Tabela 1. Descrição das Cepas Usadas neste Exemplo. Todas as Cepas Foram Derivadas de uma Cepa M2390 do Tipo Selvagem (Não Geneticamente Modificada) de Saccharomyces Cerevisiae. Nome Proteína heteróloga expressa Genes nativos inativados Uma proteína quimérica da fórmula (I): Δfcy1 M15958 (NH2) – SS – AA – L – TT (COOH) em que SS tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 39, AA tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13, L tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 32, e TT tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18. A proteína quimérica foi engenheirada em 2 cópias por cromossomo sob o controle do TEF2p e do IDP1t e ADH1p e DIT1T Gene que codifica Saccharomycopsis fibuligera Δgpd2, M8841 glu0111 (Acesso ao GeneBank CAC83969.1) Δfdh1,

Nome Proteína heteróloga expressa Genes nativos inativados Gene que codifica o polipeptídeo PFLA (Acesso ao Δfdh2, UniProtKB A1A239) Δfcy1 Gene que codifica o polipeptídeo PFLB (Acesso ao UniProtKB A1A240) Gene que codifica o polipeptídeo ADHE (Acesso ao UniProtKB A1A067) Gene que codifica Saccharomycopsis fibuligera Δgpd2, glu0111 (Acesso ao GeneBank CAC83969.1) Δfdh1, Gene que codifica o polipeptídeo PFLA (Acesso ao Δfdh2, UniProtKB A1A239) Δfcy1 Gene que codifica o polipeptídeo PFLB (Acesso ao M11589 UniProtKB A1A240) Gene que codifica o polipeptídeo ADHE (Acesso ao UniProtKB A1A067) Gene que codifica STL1 de Saccharomycopsis fibuligera (Acesso ao GeneBank NP_010825)

[0159] A cepa M15958 foi cultivada durante a noite em YPD40, concentrada em uma lama de alta densidade celular com 200 g/L de peso seco de células (DCW) e dosificada em uma liquefação de escala de laboratório usando 0,9 g/L de levedura DCW. O produto de levedura obtido da cepa M15958 foi capaz de alcançar hidrólise industrialmente relevante dentro de uma liquefação de 60 min sem a adição de enzima exógena (Figura 1).

[0160] A Figura 2 ilustra um experimento com leitor de placas de microtitulação, no qual o crescimento de uma cepa de redução de glicerol, M11589, foi melhorado com as adições tituladas do extrato de levedura à medida que a fase de retardo é significativamente reduzida. Da mesma forma, a adição de extrato de levedura em uma fermentação anaeróbica em meio de Verduyn definido mostrou melhora na produção de etanol e redução de glicerol para uma cepa convencional, M2390, e duas cepas separadas de redução de glicerol, M8841 e M11589 (Figura 3). Todas as três cepas apresentaram melhora na produção de biomassa (Figura 4) junto com melhora da cinética de crescimento, medidas pela produção de CO2 (Figuras 5 a 7).

Exemplo II – Aumentos do Rendimento na Fermentação Usando Liquefações Contendo Extrato de Levedura

[0161] Liquefação em escala laboratorial: As células da cepa do tipo selvagem (não geneticamente modificada) M10474 foram suportadas em YPD durante a noite, centrifugadas, lavadas e agitadas com esferas de vidro de 0,2 μm em homogeneizador de bancada MP Biomedical durante 3 min. As células agitadas com esferas foram dosificadas a 0,012%, 0,03%, ou 0,3% grama de peso seco de células por grama de matéria sólida de milho, em uma liquefação de 300 mL, juntamente com um controle de adição de água, todos usando 0,02% gramas de alfa-amilase termoestável comercial por grama de sólidos. As liquefações foram realizadas usando 34% de farinha de milho com 40% de vinhaça fina a pH 5,2. A lama foi elevada para 70 ºC antes da adição da enzima e da levedura, e a temperatura elevada 2 ºC/min até 85 ºC, onde foi mantida por 2 h. Após a liquefação, as amostras foram resfriadas à temperatura ambiente e a matéria sólida e o pH ajustados para 33% e 4,8 para uma fermentação subsequente.

[0162] Fermentações em escala laboratorial: As fermentações foram realizadas usando 50 g da liquefação em escala laboratorial a 33% de matéria sólida ajustada em um frasco de 200 mL, em duplicata. Cada fermentação recebeu as mesmas doses de 500 ppm de ureia, 0,6 AGU/grama de matéria sólida total de glucoamilase e 0,05 g/L de inóculo da cepa M2390 do tipo selvagem (não geneticamete modificada). As fermentações foram misturadas a 150 rpm e incubadas a 33ºC por 24 h, e as temperaturas caíram para 31ºC pelo restante da fermentação. As amostras foram coletadas após 54 h, e o etanol e a glicose quantificados usando cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC).

[0163] Com apenas 0,012% p/p da levedura M10474 adicionada à liquefação, observou-se aumento de 0,26% no rendimento de etanol na fermentação subsequente (Figura 8). Observou-se um aumento de 1,26% no rendimento com a adição de 0,03% de levedura, e um modesto aumento adicional de 1,57% de etanol com 0,3% de levedura. Os dados apresentados na Figura 8 mostraram que os benefícios de nutrientes e rendimento podem ser adicionados com o uso de culturas de células rompidas na liquefação em vez da fermentação.

[0164] Liquefação e fermentação subsequentes foram realizadas usando os mesmos protocolos de liquefação e fermentação em escala laboratorial mencionados anteriormente, exceto pelo uso de 33% de matéria sólida para a liquefação e 32% de matéria sólida para a fermentação. Neste experimento, foram adicionadas doses agitadas com esferas da cepa M10474 do tipo selvagem com 0,01%, 0,02% ou 0,03% grama de peso seco de célula por grama de matéria sólida de milho, juntamente com cada liquefação dosificada a 0,02% de enzima alfa-amilase comercial. As fermentações foram analisadas com o uso de HPLC para quantificar etanol, glicerol e glicose residual. Como mostra a Figura 9, as liquefações adicionadas com levedura a 0,01%, 0,02% ou 0,03% DCW de M10474 forneceram um aumento no rendimento de 0,15%, 0,61% e 1,48% em comparação com a condição de enzima comercial apenas.

[0165] As liquefações também foram analisadas quanto amino nitrogênio livre (FAN) utilizando um ensaio baseado em placas, conforme descrito em Abernathy et al., 2009. As liquefações foram normalizadas a 32% de matéria sólida e comparadas a uma curva padrão de FAN para estimar as concentrações em partes por milhão. Como observado na Figura 10, as adições de levedura de 0,02% e 0,03% apresentaram um aumento de 20% e 39% em FAN em comparação ao controle com enzima comercial apenas, embora não tenha havido alteração mensurável na condição de levedura a 0,01%. Exemplo III – Aumentos do Rendimento na Fermentação Usando Liquefações Contendo Extrato de Levedura Derivado de Cepas de Levedura de Expressão de Alfa-Amilase Termoestável

[0166] A cepa M19211 foi engenheirada, coexpressando a alfa-amilase termoestável conectada de ambas as P. furiosus e T. hydrothermalis. A M19211 foi construída usando um fundo de M16449, expressando um cassete de P. furiosus conectado com 2 cópias por cromossomo, concebido para expressar a alfa-amilase termoestável de P. furiosus conectada (tendo a SEQ ID NO: 65), e cassete de T. hidrothermalis de 4 cópias por cromossomo concebido para expressar a alfa-amilase termoestável de T. hidrothermalis conectada (tendo a SEQ ID NO: 66) (consulte a Tabela 2).

[0167] A M19211 foi preparada por suporte de YPD durante a noite, ou por meio de uma produção de creme de levedura usando melaços. O creme de levedura foi lavada com água e ressuspensa a aproximadamente 20% de DCW total com água, ou não lavada e ressuspensa a 20% de sólidos em cerveja gasta. As amostras em creme foram rompidas usando um homogeneizador de alta pressão entre 1000 e 1500 bar. A cultura suportada em YPD foi concentrada em sobrenadante gasto e agitada com esferas por 3 minutos usando o homogeneizador de bancada. Cada cultura rompida foi dosificada a 0,03% de g de DCW por grama de matéria sólida de milho, juntamente com uma dose de 25% de enzima alfa-amilase comercial (0,005% em peso de enzima por peso de matéria sólida de milho).

[0168] As liquefações foram realizadas usando 34% de farinha de milho com 40% de backset a pH 5,2 em volumes de 300 mL. A lama foi elevada para 70 ºC, seguida por adições de enzimas e leveduras, e a temperatura elevada 2 ºC/min até 85 ºC. As alterações na viscosidade foram medidas com o uso do software IKA Microstar30 e software labworldsoft. As amostras foram coletadas após 2 h e misturadas com 1% de ácido sulfúrico para interromper a hidrólise. Cada amostra foi medida quanto aos açúcares redutores usando o ensaio de DNS e correlacionada a uma curva padrão de dextrose para correlacionar as concentrações de dextrose e expressa como um percentual em uma base seca total de matéria sólida.

[0169] Como se observa na Figura 11, a adição da levedura de expressão amilase M19211 em combinação com a enzima alfa-amilase comercial a 0,005% proporcionou curvas de viscosidade semelhantes à dose total de 0,02% de duas enzimas alfa-amilase comerciais separadas. A viscosidade foi medida indiretamente usando misturadores suspensos IKA Microstar30 que monitoram as tendências de torque, que aumentaram à medida que a viscosidade aumentou. Com base nos experimentos anteriores, a adição da enzima alfa-amilase comercial a 0,005% não hidrolisou com sucesso o milho e maximizou as capacidades de medição de torque da máquina a 30 Ncm e, portanto, não foi incluída neste experimento. Esses dados indicaram que os produtos de levedura M19211 rompida são capazes de eliminar quase 75% da dose da enzima alfa-amilase comercial.

Tabela 2. Descrição da cepa M19211 Cópias da Enzima enzima Nome da Cepa de heteróloga heteróloga Promotor Terminador Peptídeo de sinal Ligante Conector Cepa fundo expressa integrada por cromossomo alfa-amilase de ADH1 DIT1 Invertase de S.

SPI1 SEQ ID NO: P. furiosus 2 cerevisiae SEQ ID NO: 77 SEQ ID NO: 64 TEF1 IDP1 SEQ ID NO: 39 19

M19211 M16449 ADH1 DIT1 fator de alfa-amilase de CCW12 TDH1 IDP1 pareamento α de SEQ ID NO: T. hydrothermalis 4 SEQ ID NO: ADH1 DIT1 S. cerevisiae 38 SEQ ID NO: 63 78 SEQ ID NO: 76 TDH1 IDP1

[0170] As liquefações subsequentes foram avaliadas quanto à hidrólise por meio da medição do equivalente de dextrose. As amostras foram avaliadas quanto às concentrações de açúcar redutor solubilizado usando-se o ensaio de DNS e correlacionadas às concentrações de glicose utilizando-se uma curva padrão de glicose. O %DE é uma medida da quantidade de açúcares redutores e expresso como um percentual seco em relação à dextrose. O equivalente de dextrose dá uma indicação da hidrólise do amido de grau médio. Como se vê na Figura 12, cada uma das liquefações de amilase-levedura forneceu um %DE equivalente ou superior quando comparado às doses de enzima alfa-amilase comerciais a 100%, indicando hidrólise suficiente durante a liquefação de 2 h.

[0171] As liquefações foram posteriormente fermentadas ajustando-se a matéria sólida para 33% e fermentadas com a cepa M2390. A liquefação da M19211 suportada em YPD proporcionou um aumento potencial de 1% no rendimento de etanol em relação à condição da enzima alfa-amilase comercial de 100% (enzima alfa- amilase comercial nº 1), e os produtos em creme da M19211 rompidos proporcionaram um aumento adicional de 0,7% do etanol nas células suportadas em YPD, com um potencial total de aumento de etanol de 1,7% em comparação ao controle de enzima (Figura 13). Exemplo IV – Aumentos do Rendimento na Fermentação com Adições de Extrato de Levedura Derivado de Cepas de Levedura de Expressão Várias Enzimas

[0172] Brassagem comercial rica em nutrientes. As fermentações foram realizadas usando brassagem comercial rica em nutrientes coletados do campo. As matérias sólidas foram reduzidas para 32% e as fermentações realizadas em frascos de 200 mL com 50 g de brassagem. Cada fermentação recebeu as mesmas doses de 300 ppm de ureia, 0,6 AGU/grama de matéria sólida total de glucoamilase comercial (exceto por duas das adições de levedura GA que receberam uma dose de GA a 75%) e 0,05 g/L de inóculo da cepa convencional M2390. Além disso, leveduras de expressão de várias enzimas amilolíticas e de aumento do rendimento (consulte a descrição na Tabela 3) foram cultivadas durante a noite em YPD a 35 ºC, centrifugadas e ressuspensas em sobrenadante gasto para calibrar todos os pesos secos de células. Um total de 1 mL de cada amostra foi agitado com esferas usando esferas de vidro em um homogeneizador de bancada MP Bio para inativar e romper as células. A levedura inativada foi dosificada nas respectivas fermentações a 0,1 g/L. Além disso, a cepa M2390 parental também foi agitada com esferas e dosificada na mesma concentração, juntamente com um controle de água para mostrar tanto o efeito da adição de levedura quanto o efeito da enzima. As fermentações foram misturadas a 150 rpm e incubadas a 33ºC por 24 h, e as temperaturas caíram para 31ºC pelo restante da fermentação. As amostras foram coletadas após 54 h e o etanol, glicerol e/ou glicose quantificados por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Tabela 3. Descrição das Cepas Usadas Neste Exemplo Nome da Origem da enzima Enzima heteróloga Sequência de Cepa heteróloga expressa aminoácidos M2390 N/A N/A N/A (controle) M15035 S. fibuligera glucoamilase SEQ ID NO: 3 M15621 R. emersonii glucoamilase SEQ ID NO: 67 G. alfa-amilase M14845 SEQ ID NO: 2 stereothermophilus maltogênica alfa-amilase P. furiosus SEQ ID NO: 65 termoestável M19211 alfa-amilase T. hidrotermalis SEQ ID NO: 66 termoestável M10077 S. fibuligera alfa-amilase SEQ ID NO: 68 M17188 B. amiloliquefaciens alfa-amilase SEQ ID NO: 69 M11313 C. brakii fitase SEQ ID NO: 73 M10885 S. fibuligera protease SEQ ID NO: 74 M10890 A. fumigatus protease SEQ ID NO: 75 M11245 A. fumigatus trealase SEQ ID NO: 70 M16283 N. crassa trealase SEQ ID NO: 71 M5791 A. niger xilanase SEQ ID NO: 72

[0173] Como visto na Figura 14, a adição de levedura inativada M2390 proporcionou um ligeiro aumento na produção de etanol, ao passo que a adição da maioria das cepas de enzima de levedura inativadas proporcionou um aumento adicional de rendimento na brasagem rica em nutrientes. Ambas as cepas de glucoamilase (GA) que expressam a GA de S. fibuligera ou R. emersonii proporcionaram um aumento de aproximadamente 0,5% no rendimento sobre a condição de controle da água com uma adição de GA de 100% e permitiram uma redução de GA exógena de 25%, usando a inclusão de GA a 75%. A adição de levedura de alfa-amilase proporcionou um aumento de rendimento de 0,36% a 1% semelhante em comparação à condição de controle de água; mais acentuadamente, a cepa M19211 inativada mencionada acima que expressa as alfa-amilases termoestáveis conectadas proporcionou um dos maiores aumentos de rendimento com 1% adicional sobre o controle de água. Cada adição de levedura de aumento do desempenho proporcionou um aumento de > 0,36% do rendimento com as duas trealases separadas de N. Crassa e A. fumigatus, e fornecendo 0,9 e 1,16% de aumento do rendimento com uma diminuição mensurável em DP2 e DP3 residuais. O uso de uma cepa de expressão de celulose (xilanase de A. niger) também foi bem- sucedido no aumento do rendimento com um aumento de 0,8% no rendimento. Um resumo dos aumentos de rendimento pode ser encontrado na Tabela 4. Tabela 4. Resumo dos aumentos de rendimento observados nas fermentações apresentadas na Figura 14. % de aumento do rendimento

[0174] em relação a: Controle de Dose de GA Adição de levedura inativada M2390 água M2390 0,21 GA a 100% Cepa de expressão de GA de S. fibuligera 0,46 0,25 Cepa de expressão de GA de R. emersonii 0,57 0,37 Cepa de expressão de GA de S. fibuligera 0,36 0,15 GA a 75% Cepa de expressão de GA de R. emersonii 0,82 0,61 Cepa de expressão de AA matogênica de G. 0,84 0,63 stereothermophilus GA a 100% Cepa de expressão de AA M19211 (P. 1,00 0,79 furiosus e T. hydrothermalis) Cepa de expressão de AA de S. fibuligera 0,36 0,15

Cepa de expressão de AA de B. 0,46 0,25 amiloliquefaciens Cepa de expressão de fitase de C. brakii 0,39 0,18 Cepa de expressão de protease de S. 0,36 0,15 fibuligera Cepa de expressão de protease de A. 0,45 0,24 fumigatus Cepa de expressão de trealase de A. 0,90 0,69 fumigatus Cepa de expressão de trealase de N. crassa 1,16 0,95 Cepa de expressão de xilanase de A. niger 0,80 0,59

[0175] Brassagem comercial pobre em nutrientes. As fermentações foram realizadas usando brassagem comercial pobre em nutrientes coletados do campo. As matérias sólidas foram reduzidas para 30% e as fermentações realizadas em frascos de soro de 100 mL com 25 g de brassagem. Cada fermentação recebeu as mesmas doses de 300 ppm de ureia, 0,6 AGU/grama de matéria sólida total de glucoamilase e 0,05 g/L de inóculo da cepa M2390. Além disso, leveduras de expressão de várias enzimas amilolíticas e de aumento do rendimento foram cultivadas durante a noite em YPD a 35 ºC, centrifugadas e ressuspensas em sobrenadante gasto para calibrar todos os pesos secos de células. Um total de 1 mL de cada amostra foi agitado com esferas usando esferas de vidro em um homogeneizador de bancada MP Bio para inativar e romper as células. A levedura inativada foi dosificada nas respectivas fermentações a 0,1 g/L. Além disso, a cepa M2390 parental também foi agitada com esferas e dosificada na mesma concentração, juntamente com um controle de água para mostrar tanto o efeito da adição de levedura quanto o efeito da enzima. As fermentações foram misturadas a 150 rpm e incubadas a 33ºC por 24 h, e as temperaturas caíram para 31ºC pelo restante da fermentação. As amostras foram coletadas após 54 h e o etanol, glicerol e/ou glicose quantificados por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC).

[0176] Como visto na Figura 15, a adição de levedura inativada M2390 proporcionou um modesto aumento na produção de etanol, ao passo que a adição da maioria das cepas de enzima de levedura inativadas proporcionou um aumento adicional de rendimento na brasagem pobre em nutrientes quando comparada ao controle de água. Ambas as cepas de glucoamilase que expressam a GA de S. fibuligera ou R. emersonii proporcionaram um aumento de aproximadamente 0,69 a 0,95% no rendimento sobre a condição de controle da água com uma a GA a 100%. A adição de levedura de alfa-amilase proporcionou um aumento de rendimento de 1,1 a 1,4% semelhante em comparação à condição de controle de água; mais acentuadamente, a cepa M19211 inativada mencionada acima que expressa as alfa- amilases termoestáveis conectadas proporcionou um dos maiores aumentos de rendimento com 1% adicional sobre o controle de água. Cada adição de levedura de aumento do rendimento proporcionou um aumento do rendimento > 1% com as duas trealases separadas de N. Crassa e A. fumigatus e proporcionando um aumento de rendimento de 1.5% com uma diminuição mensurável dos carboidratos residuais com grau de polimerização de 2 ou 3 (DP2 e DP3, maltose e maltotriose). Cada uma das cepas de protease apresentou melhora, com a protease de S. fibuligera fornecendo o título geral mais alto com uma subsequente redução de glicerol. A adição da levedura de fitase também aumentou o rendimento em 1,5%. O uso de uma cepa de expressão de celulose (xilanase de A. niger) também foi bem sucedido no aumento do rendimento, com um aumento de 1.3% no rendimento. Um resumo dos aumentos de rendimento pode ser encontrado na Tabela 5. Tabela 5. Resumo dos Aumentos de Rendimento Observados nas Fermentações Apresentadas na Figura 15.

% de aumento do rendimento em relação a: Cepa Controle de água M2390 M2390 0,17 Cepa de expressão de GA de S. fibuligera 0,69 0,52 Cepa de expressão de GA de R. emersonii 0,95 0,79 1,10 0,94 M19211 (Cepa de expressão de AA de P. furiosus e T. hydrothermalis) 1,42 1,25 Cepa de expressão de AA de S. fibuligera 1,08 0,91 Cepa de expressão de AA de B. amiloliquefaciens 1,20 1,03 Cepa de expressão de fitase de C. brakii 1,49 1,33 Cepa de expressão de protease de S. fibuligera 1,77 1,60

Cepa de expressão de protease de A. fumigatus 1,03 0,87 Cepa de expressão de trealase de A. fumigatus 1,52 1,35 Cepa de expressão de trealase de N. crassa 1,51 1,34 Cepa de expressão de xilanase de A. niger 1,32 1,16 Exemplo V – Comparação de Diferentes Métodos de Ruptura de Células para Inativação de Levedura de Expressão de Alfa-Amilase para Adição em Liquefações

[0177] Uma liquefação em escala laboratorial semelhante, conforme descrito anteriormente, foi realizada com a cepa M19211 usando vários métodos de inativação da levedura. A levedura foi preparada por suporte de YPD durante a noite, ou por meio de uma produção de creme de levedura usando melaços. O creme de levedura se concentrou a 20% de matéria sólida em cerveja gasta. As amostras em creme foram rompidas usando um homogeneizador de alta pressão entre 1000 e 1500 bar. A cultura suportada em YPD foi concentrada em sobrenadante gasto e ou agitada com esferas por 3 minutos usando o homogeneizador de bancada ou autolisada a 70ºC por 24 h. Cada cultura rompida foi dosificada a 0,03% de g de DCG por grama de matéria sólida de milho, juntamente com uma dose de 25% de enzima alfa-amilase comercial (0,005% em peso de enzima por peso de matéria sólida de milho). Como se observa na Figura 16, a adição da levedura de expressão amilase M19211 com uma enzima alfa-amilase comercial a 0,005% proporcionou curvas de viscosidade semelhantes à dose total de 0,02% de duas enzimas alfa-amilase comerciais separadas, representando condições e variações comercialmente relevantes com produtos de enzima. As mudanças na viscosidade são medidas indiretamente usando misturadores suspensos IKA Microstar30 que monitoram as tendências de torque, que aumentam à medida que a viscosidade aumenta, e software Labworldsoft. Com base nos experimentos anteriores, a adição da enzima alfa-amilase comercial a 0,005% não hidrolisa com sucesso o milho e maximiza as capacidades de medição de torque da máquina a 30 Ncm e, portanto, não foi incluída neste experimento. Esses dados indicam que as culturas de M19211 rompidas são capazes de eliminar quase 75% da dose da enzima alfa-amilase comercial.

[0178] As liquefações subsequentes foram avaliadas quanto à hidrólise por meio da medição do equivalente de dextrose. Como se vê na Figura 17, cada uma das liquefações de amilase-levedura forneceu um %DE equivalente quando comparado às doses de enzima comerciais a 100%, indicando hidrólise suficiente durante a liquefação de 2 h.

[0179] A cepa M19211 também foi avaliada quanto aos métodos adicionais de processamento para demonstrar potenciais formatos de produtos. A cepa foi produzida em uma produção de creme usando melaço, na qual o creme de levedura resultante foi lavada com água e ressuspensa a aproximadamente 20% de DCW total com água, ou não lavada e ressuspensa a 20% de sólidos em cerveja gasta. Ambas as amostras em creme lavadas e não lavadas foram rompidas usando um homogeneizador de alta pressão (HPH) entre 1000 e 1500 bar. Ambas as amostras também foram preparadas em levedura seca inativa (IDY). Todas essas amostras foram comparadas a uma preparação de laboratório suportada em YPD, na qual as células foram não processadas ou agitadas com esferas por 3 minutos, conforme mencionado anteriormente. Todas as amostras foram comparadas a creme não processado ou a células cultivadas em YPD para demonstrar um aumento na atividade pós-processamento, pois o %DE foi maior em uma miniliquefação de 1 grama (Figura 18).

[0180] Embora a invenção tenha sido descrita em ligação com suas formas de realização específicas, será entendido que o escopo das reivindicações não deve ser limitado pelas formas de realização preferidas estabelecidas nos exemplos, mas deve ser dada a interpretação mais ampla consistente com a descrição como um todo.

REFERÊNCIAS Abernathy, D.G., Spedding, G. e Starcher, B. (2009). Analysis of Protein and Total Usable Nitrogen in Beer and Wine Using a Microwell Ninhydrin Assay.

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Yeast.

Julho de 1992;8(7):501-17.

Claims (72)

REIVINDICAÇÕES

1. Processo para melhorar o rendimento de um produto de fermentação feito a partir de uma célula de levedura de fermentação em um meio de fermentação, o processo sendo CARACTERIZADO pelo fato de compreender: (i) liquefazer um meio de liquefação para obter um meio de fermentação; e/ou (ii) fermentar o meio de fermentação com a célula de levedura de fermentação para obter o produto de fermentação; em que o processo compreende ainda incluir pelo menos um de: - um primeiro produto de levedura inativado feito a partir de uma primeira célula hospedeira de levedura recombinante no meio de liquefação e/ou meio de fermentação, em que a primeira célula hospedeira de levedura recombinante compreende uma primeira molécula de ácido nucleico heteróloga para expressar uma primeira enzima heteróloga e o primeiro produto de levedura inativado compreende a primeira enzima heteróloga; - uma segunda célula hospedeira de levedura recombinante no meio de liquefação para obter um segundo produto de levedura inativado no meio de fermentação, em que a segunda célula hospedeira de levedura recombinante compreende uma segunda molécula de ácido nucleico heteróloga para expressar uma segunda enzima heteróloga e o segundo produto de levedura inativado compreende a segunda enzima heteróloga; e/ou - um terceiro produto de levedura inativado feito de uma célula hospedeira de levedura não modificada geneticamente para o meio de liquefação; de modo a melhorar o rendimento do produto de fermentação.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de o primeiro produto de levedura inativada, o segundo produto de levedura inativada e/ou o terceiro produto de levedura inativada ser um extrato de levedura.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de compreender ainda moagem com esferas, agitação com esferas ou homogeneização em alta pressão da primeira célula hospedeira de levedura recombinante para obter o primeiro produto de levedura inativado.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de compreender ainda moagem com esferas, agitação com esferas ou homogeneização em alta pressão da célula hospedeira de levedura não geneticamente modificada para obter o terceiro produto de levedura inativado.

5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a segunda célula hospedeira de levedura recombinante é fornecida como um creme de levedura.

6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que a primeira molécula de ácido nucleico heteróloga permite a expressão intracelular da primeira enzima heteróloga.

7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que a segunda molécula de ácido nucleico heteróloga permite a expressão intracelular da segunda enzima heteróloga.

8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que a primeira molécula de ácido nucleico heteróloga permite a expressão da primeira enzima heteróloga em associação com a membrana da primeira célula hospedeira de levedura recombinante.

9. Processo, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que a primeira molécula de ácido nucleico heteróloga permite a expressão da primeira enzima heteróloga associada à membrana da primeira célula hospedeira de levedura recombinante.

10. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, 8 e 9, CARACTERIZADO pelo fato de que a segunda molécula de ácido nucleico heteróloga permite a expressão da segunda enzima heteróloga em associação com a membrana da segunda célula hospedeira de levedura recombinante.

11. Processo, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que a segunda molécula de ácido nucleico heteróloga permite a expressão da segunda enzima heteróloga associada à membrana da segunda célula hospedeira de levedura recombinante.

12. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que a primeira molécula de ácido nucleico heteróloga permite a expressão da primeira enzima heteróloga em uma forma secretada.

13. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 e 12, CARACTERIZADO pelo fato de que a segunda molécula de ácido nucleico heteróloga permite a expressão da segunda enzima heteróloga em uma forma secretada.

14. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, CARACTERIZADO pelo fato de que a primeira molécula de ácido nucleico heteróloga está operacionalmente associada a um primeiro promotor permitindo a expressão da primeira enzima heteróloga durante a propagação da primeira célula hospedeira de levedura recombinante.

15. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, CARACTERIZADO pelo fato de que a segunda molécula de ácido nucleico heteróloga está operacionalmente associada a um segundo promotor permitindo a expressão da segunda enzima heteróloga durante a propagação da segunda célula hospedeira de levedura recombinante.

16. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, CARACTERIZADO pelo fato de que a primeira enzima heteróloga e/ou a segunda enzima heteróloga é uma enzima amilolítica.

17. Processo, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que a enzima amilolítica tem atividade de alfa-amilase.

18. Processo, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que a enzima amilolítica com atividade de alfa-amilase compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 13, 60, 61, 62, 63 ou 64; é uma variante da sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 13, 60, 61, 62, 63 ou 64; ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 13, 60, 61, 62, 63 ou 64.

19. Processo, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que a enzima amilolítica tem atividade glucoamilase.

20. Processo de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de que a enzima amilolítica com atividade de glucoamilase compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 3 ou 67; é uma variante da sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 3 ou 67; ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 3 ou 67.

21. Processo, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que a enzima amilolítica tem atividade de trealase.

22. Processo, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de que a enzima amilolítica com atividade de trealase compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 70 ou 71; é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 70 ou 71; ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 70 ou 71.

23. Processo, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que a enzima amilolítica possui atividade de xilanase.

24. Processo, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo fato de que a enzima amilolítica com atividade de xilanase compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 72, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 72 ou é um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 72.

25. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, CARACTERIZADO pelo fato de que a primeira enzima heteróloga e/ou a segunda enzima heteróloga é uma esterase.

26. Processo, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de que a esterase tem atividade de fitase.

27. Processo, de acordo com a reivindicação 26, CARACTERIZADO pelo fato de que a esterase com atividade de fitase compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 73, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 73 ou é um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 73.

28. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, CARACTERIZADO pelo fato de que a primeira enzima heteróloga e/ou a segunda enzima heteróloga é uma protease.

29. Processo, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADO pelo fato de que a protease tem atividade de protease aspártica.

30. Processo, de acordo com a reivindicação 29, CARACTERIZADO pelo fato de que a protease com atividade de protease aspártica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 74 ou 75; é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 74 ou 75; ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 74 ou 75.

31. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30,

CARACTERIZADO pelo fato de que a célula de levedura de fermentação é uma célula hospedeira de levedura recombinante de fermentação.

32. Processo, de acordo com a reivindicação 31, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula de levedura recombinante de fermentação compreende: - uma modificação genética para reduzir a produção de uma ou mais enzimas nativas que funcionam para produzir glicerol ou regular a síntese de glicerol, - uma modificação genética para permitir a produção de um segundo polipeptídeo com atividade de glucoamilase, e/ou - uma modificação genética para reduzir a produção de uma ou mais enzimas nativas que funcionam para catabolizar formiato.

33. Processo, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula de levedura recombinante de fermentação compreende a modificação genética para permitir a produção do segundo polipeptídeo com atividade de glucoamilase.

34. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 33, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa (ii) é conduzida sob condições anaeróbias.

35. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 34, CARACTERIZADO pelo fato de que o meio de fermentação compreende ou é derivado de milho, cana-de-açúcar ou um material lignocelulósico.

36. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 35, CARACTERIZADO pelo fato de que o produto da fermentação é etanol.

37. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 36, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda incluir um polipeptídeo exógeno com atividade de alfa-amilase com o terceiro produto de levedura inativado.

38. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 37, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende incluir pelo menos 0,00001 g do primeiro produto de levedura inativado e/ou do terceiro produto de levedura inativado por L do meio de liquefação liquefeito.

39. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 38, CARACTERIZADO pelo fato de ser para aumentar o equivalente de dextrose e/ou o nitrogênio amino livre do meio de fermentação em comparação com o meio de liquefação.

40. Aditivo para melhorar o rendimento de um produto de fermentação feito por uma célula de levedura de fermentação, o aditivo sendo CARACTERIZADO pelo fato de compreender um primeiro produto de levedura inativado feito a partir de uma primeira célula hospedeira de levedura recombinante, em que a primeira célula hospedeira de levedura recombinante compreende uma primeira molécula de ácido nucleico heteróloga para expressar uma primeira enzima heteróloga e o primeiro produto de levedura inativado compreende a primeira enzima heteróloga.

41. Aditivo, de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADO pelo fato de que o primeiro produto de levedura inativada é um extrato de levedura.

42. Aditivo, de acordo com a reivindicação 40 ou 41, CARACTERIZADO pelo fato de que o primeiro produto de levedura inativado é um produto de levedura moído ou agitado com esferas.

43. Aditivo, de acordo com a reivindicação 40 ou 41, CARACTERIZADO pelo fato de que o primeiro produto de levedura inativado é um produto de levedura homogeneizado em alta pressão.

44. Aditivo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 43, CARACTERIZADO pelo fato de que a primeira molécula de ácido nucleico heteróloga permite a expressão intracelular da primeira enzima heteróloga.

45. Aditivo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 44, CARACTERIZADO pelo fato de que a primeira molécula de ácido nucleico heteróloga permite a expressão da primeira enzima heteróloga em associação com a membrana da primeira célula hospedeira de levedura recombinante.

46. Aditivo, de acordo com a reivindicação 45, CARACTERIZADO pelo fato de que a primeira molécula de ácido nucleico heteróloga permite a expressão da primeira enzima heteróloga associada à membrana da primeira célula hospedeira de levedura recombinante.

47. Aditivo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 43, CARACTERIZADO pelo fato de que a primeira molécula de ácido nucleico heteróloga permite a expressão da primeira enzima heteróloga em uma forma secretada.

48. Aditivo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 47, CARACTERIZADO pelo fato de que a primeira molécula de ácido nucleico heteróloga está operacionalmente associada a um primeiro promotor, permitindo a expressão da primeira enzima heteróloga durante a propagação da primeira célula hospedeira de levedura recombinante.

49. Aditivo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 48, CARACTERIZADO pelo fato de que a primeira enzima heteróloga é uma enzima amilolítica.

50. Aditivo, de acordo com a reivindicação 49, CARACTERIZADO pelo fato de que a enzima amilolítica tem atividade de alfa-amilase.

51. Aditivo, de acordo com a reivindicação 50, CARACTERIZADO pelo fato de que a enzima amilolítica com atividade de alfa-amilase compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 13, 60, 61, 62, 63 ou 64; é uma variante da sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 13, 60, 61, 62, 63 ou 64; ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 13, 60, 61, 62, 63 ou 64.

52. Aditivo, de acordo com a reivindicação 49, CARACTERIZADO pelo fato de que a enzima amilolítica tem atividade de glucoamilase.

53. Aditivo, de acordo com a reivindicação 52, CARACTERIZADO pelo fato de que a enzima amilolítica com atividade de glucoamilase compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 ou 67, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 ou 67, ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 ou 67.

54. Aditivo, de acordo com a reivindicação 49, CARACTERIZADO pelo fato de que a enzima amilolítica tem atividade de trealase.

55. Aditivo, de acordo com a reivindicação 54, CARACTERIZADO pelo fato de que a enzima amilolítica com atividade de trealase compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 70 ou 71, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 70 ou 71 ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 70 ou 71.

56. Aditivo, de acordo com a reivindicação 49, CARACTERIZADO pelo fato de que a enzima amilolítica tem atividade de xilanase.

57. Aditivo, de acordo com a reivindicação 56, CARACTERIZADO pelo fato de que a enzima amilolítica com atividade de xilanase compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 72, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 72 ou é um fragmento do aminoácido sequência da SEQ ID NO: 72.

58. Aditivo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 48, CARACTERIZADO pelo fato de que a primeira enzima heteróloga é uma esterase.

59. Aditivo, de acordo com a reivindicação 58, CARACTERIZADO pelo fato de que a esterase tem atividade de fitase.

60. Aditivo, de acordo com a reivindicação 59, CARACTERIZADO pelo fato de que a esterase com atividade de fitase compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 73, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 73 ou é um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 73.

61. Aditivo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 48, CARACTERIZADO pelo fato de que a primeira enzima heteróloga é uma protease.

62. Aditivo, de acordo com a reivindicação 60, CARACTERIZADO pelo fato de que a protease tem atividade de protease aspártica.

63. Aditivo, de acordo com a reivindicação 62, CARACTERIZADO pelo fato de que a protease compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 74 ou 75, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 74 ou 75, ou é um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 74 ou 75.

64. Aditivo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 63, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula de levedura de fermentação é uma célula hospedeira de levedura de fermentação recombinante.

65. Aditivo, de acordo com a reivindicação 64, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula hospedeira de levedura de fermentação recombinante compreende: - uma modificação genética para reduzir a produção de uma ou mais enzimas nativas que funcionam para produzir glicerol ou regular a síntese de glicerol, - uma modificação genética para permitir a produção de um segundo polipeptídeo com atividade de glucoamilase, e/ou

- uma modificação genética para reduzir a produção de uma ou mais enzimas nativas que funcionam para catabolizar formiato.

66. Aditivo, de acordo com a reivindicação 65, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula hospedeira de levedura recombinante de fermentação compreende a modificação genética para permitir a produção do segundo polipeptídeo com atividade de glucoamilase.

67. Kit para melhorar o rendimento de um produto de fermentação feito a partir de uma célula de levedura de fermentação, o kit sendo CARACTERIZADO pelo fato de compreender (i) pelo menos um componente de um meio de liquefação e/ou um meio de fermentação para a célula de levedura de fermentação e (ii) pelo menos um do primeiro produto inativado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 39, da segunda célula hospedeira de levedura recombinante como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 39 ou do terceiro produto inativado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 39.

68. Kit, de acordo com a reivindicação 67, CARACTERIZADO pelo fato de o primeiro produto inativado e/ou o terceiro produto inativado ser formulado para ser adicionado ao meio de liquefação e/ou ao meio de fermentação a uma concentração de pelo menos cerca de 0,00001 g/L.

69. Kit, de acordo com a reivindicação 67 ou 68, CARACTERIZADO pelo fato de que o pelo menos um componente é uma fonte de carboidrato, uma fonte de fósforo e/ou uma fonte de nitrogênio.

70. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 67 a 69, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda a célula de levedura de fermentação, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 39.

71. Meio de liquefação, CARACTERIZADO pelo fato de compreender o primeiro produto de levedura inativado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 39, a segunda célula hospedeira de levedura recombinante como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 39, ou o terceiro produto de levedura inativado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 39.

72. Meio de fermentação, CARACTERIZADO pelo fato de compreender o primeiro produto de levedura inativado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 39, o segundo produto de levedura inativado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 39, ou o terceiro produto de levedura inativado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 39.