BR102021005223A2

BR102021005223A2 - Coculturas bacterianas expressando um sistema de bacteriocina

Info

Publication number: BR102021005223A2
Application number: BR102021005223-6A
Authority: BR
Inventors: James L. Steele; Brooks Henningsen; Jeffery R. Broadbent; Ekkarat Phrommao; Fernanda Cristina Firmino
Original assignee: Lallemand Hungary Liquidity Management Llc.
Priority date: 2020-03-19
Filing date: 2021-03-19
Publication date: 2021-10-19
Also published as: CA3112751A1; US20210292803A1

Abstract

coculturas bacterianas expressando um sistema de bacteriocina. a presente revelação se refere a uma co-cultura de células bacterianas para fazer um produto fermentado a partir de uma biomassa. a co-cultura compreendendo uma primeira célula de bactéria láctica recombinante (lab) que expressa pelo menos uma bacteriocina e uma segunda célula de bactéria láctica recombinante (lab) capaz de converter, pelo menos em parte, a biomassa no produto fermentado. a segunda célula lab recombinante é imune à bacteriocina produzida pela primeira célula lab recombinante. a co-cultura pode ser usada, opcionalmente em combinação com uma célula hospedeira de levedura, para fazer um produto fermentado. a presente revelação também fornece processos para fazer o produto fermentado usando a co-cultura, bem como kits e meio compreendendo a co-cultura.

Description

COCULTURAS BACTERIANAS EXPRESSANDO UM SISTEMA DE BACTERIOCINA

CAMPO TECNOLÓGICO

[0001] A presente invenção refere-se a coculturas de células bacterianas que expressam um sistema de bacteriocina para limitar a contaminação durante a fermentação de uma biomassa para fazer um produto de fermentação (tal como, etanol).

FUNDAMENTO

[0002] A contaminação bacteriana em instalações comerciais de etanol é um problema crônico que levou a uma forte dependência da adição de antibióticos. No entanto, essa prática levanta preocupações relacionadas ao surgimento de cepas bacterianas resistentes e à presença de antibióticos nos resíduos de fermentação que são vendidos como ração animal. Várias espécies de bactérias do ácido láctico (LAB) produzem nativamente bacteriocinas, que são pequenos peptídeos que exibem propriedades antimicrobianas potentes. Esses compostos apresentam várias vantagens em relação ao uso de antibióticos convencionais, incluindo amplas faixas de pH e temperatura, e alguns já são usados na indústria alimentícia.

[0003] Uma das bacteriocinas mais estudadas é a nisina, uma molécula que é usada comercialmente como um conservante de alimentos há mais de 50 anos. Sua longa história de uso seguro, sem o surgimento de resistência generalizada, levou o FDA a conceder a nisina a classificação de geralmente considerada segura (GRAS). Os efeitos bactericidas da nisina ocorrem através da ligação da molécula precursora de peptidoglicano, o lipídeo II. Isso inibe a síntese da parede celular e gera poros na membrana citoplasmática que causam uma perda do potencial de membrana, vazamento do conteúdo celular e eventual morte celular. As cepas de Lactococcus lactis produtoras de nisina geram autoimunidade por meio da expressão de uma lipoproteína, Nisl, que impede a nisina de se ligar ao lipídeo II, e um transportador ABC de três componentes codificado pelos genes nisE, nisF e nisG. Embora a expressão heteróloga da produção de nisina tenha se mostrado difícil, é possível projetar o fenótipo de imunidade em outras espécies de LAB por meio da expressão dos componentes nisIEFG.

[0004] Existe, portanto, a necessidade de limitar a contaminação durante a fermentação, ao mesmo tempo que se limita o uso de antibióticos.

BREVE SUMÁRIO

[0005] A presente invenção refere-se a uma cocultura de duas células bacterianas de ácido láctico distintas, uma das quais sendo capaz de expressar uma bacteriocina. Ambas as células bacterianas de ácido láctico são imunes à bacteriocina e são capazes de fazer um produto fermentado (a partir de uma biomassa). A cocultura pode ser usada, opcionalmente em combinação com uma célula hospedeira de levedura, para fazer o produto fermentado e limitar a contaminação microbiana durante o processo de produção do produto fermentado.

[0006] De acordo com um primeiro aspecto, a presente invenção fornece uma cocultura de células bacterianas de ácido láctico para fazer um produto fermentado a partir de uma biomassa. A cocultura compreende uma primeira célula bacteriana de ácido láctico recombinante (LAB) que expressa, pelo menos, uma bacteriocina e, opcionalmente, uma outra bacteriocina. A primeira célula LAB recombinante e uma segunda célula LAB recombinante capazes de converter, pelo menos em parte, a biomassa no produto fermentado. A primeira LAB compreende (i) uma ou mais primeiras moléculas de ácido nucleico heterólogas que codificam um ou mais polipeptídeos para converter, pelo menos em parte, a biomassa no produto fermentado e (ii) opcionalmente uma ou mais segundas moléculas de ácido nucleico heterólogas que codificam a pelo menos, uma bacteriocina e/ou a bacteriocina adicional e um ou mais polipeptídeos para conferir imunidade contra a, pelo menos, uma bacteriocina e/ou a bacteriocina adicional. A segunda LAB recombinante compreende (i) uma ou mais terceiras moléculas de ácido nucleico heterólogas que codificam um ou mais polipeptídeos para converter, pelo menos em parte, a biomassa no produto fermentado e (ii) uma ou mais quartas moléculas de ácido nucleico heterólogas que codificam um ou mais polipeptídeos para conferir imunidade contra a, pelo menos, uma bacteriocina e/ou a bacteriocina adicional expressas pela primeira célula LAB recombinante. Em uma modalidade, a primeira LAB recombinante carece de uma ou mais segundas moléculas de ácido nucleico heterólogas. Em outra modalidade, a primeira célula LAB recombinante compreende uma ou mais segundas moléculas de ácido nucleico heterólogas.

[0007] Em algumas modalidades, a pelo menos uma bacteriocina e/ou a bacteriocina adicional compreendem um lantibiótico. Por exemplo, o lantibiótico pode ser nisina e a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga podem codificar NisI. Por exemplo, nisina tem a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 7 a 10, é uma variante da sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 7 a 10 tendo atividade de bacteriocina nisina ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 7 a 10 com atividade de bacteriocina nisina. Em uma modalidade, a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreendem uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 53 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades adicionais, a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreendem uma sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 54 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, NisI tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11 que confere imunidade contra a nisina ou é um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11 que confere imunidade contra nisina. Em algumas modalidades, a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreendem uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 55, 56 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 11. Em uma modalidade, a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga codificam adicionalmente NisE, NisF e/ou NisG. Em uma outra modalidade, NisE tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 tendo atividade transportadora de nisina ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 tendo atividade transportadora de nisina. Em algumas modalidades, a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreendem uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 59, 60 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 13. Em ainda outra modalidade, NisF tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12 com atividade transportadora de nisina ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 com atividade transportadora de nisina. Em algumas modalidades, a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreendem uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 57, 58 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 12. Em ainda uma outra modalidade, NisG tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14 é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14 com atividade de nisina permease ou é um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14 com atividade de nisina permease. Em algumas modalidades, a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreendem uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 61, 62 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 14.

[0008] Em algumas modalidades, a pelo menos, uma bacteriocina e/ou a bacteriocina adicional compreendem uma bacteriocina cíclica. Por exemplo, a bacteriocina cíclica pode ser gassericina e a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga podem codificar GaaI. Em outra modalidade, a gassericina tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 ou 16, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 ou 16 tendo atividade de bacteriocina gassericina ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 ou 16 com atividade de bacteriocina gassericina. Em algumas modalidades, a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreendem uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 63, 64 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 15. Em ainda uma outra modalidade, GaaI tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17 é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17 que confere imunidade contra a gassericina ou é um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17 que confere imunidade contra gassericina. Em algumas modalidades, a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreendem uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 65, 66, 67 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 17. Em ainda uma outra modalidade, a segunda molécula de ácido nucleico heteróloga codifica adicionalmente GaaT e/ou GaaE. Nas modalidades, GaaT tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18 tendo atividade transportadora de gassericina ou é um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18 tendo atividade transportadora de gassericina. Em uma modalidade, a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreendem uma sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 68, 69 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 18. Nas modalidades, GaaE tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19 com atividade de gassericina permease ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 com atividade de gassrina permease. Em uma modalidade, a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreendem uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 70, 71 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 19. Em ainda outra modalidade, a bacteriocina cíclica é plantariciclina A e a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga codificam PlcD e/ou PlcI. Em uma modalidade, a plantariciclina A tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28 ou 29, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28 ou 29 com atividade de bacteriocina plantariciclina A ou é um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28 ou 29 com atividade de bacteriocina plantariciclina A. Em ainda outra modalidade, a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreendem uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 94, 95 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 28. Em outra modalidade, PlcD tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 30, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 30 conferindo, na presença de PlcI, imunidade contra plantariciclina A ou é um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 30 conferindo, na presença de PlcI, imunidade contra plantariciclina A. Em uma outra modalidade, a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreendem uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 96, 97, 98 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 30. Em algumas modalidades, PlcI tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 conferindo, na presença de PlcD, imunidade contra plantariciclina A ou é um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 31 conferindo, na presença de PlcD, imunidade contra plantariciclina A. Em algumas modalidades, a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreendem uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 99, 100, 101 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 31. Em algumas modalidades, a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga codificam adicionalmente PlcT, PlcE e/ou PlcB. Em outra modalidade, PlcT tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 tendo atividade de ligação ATP ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 tendo atividade de ligação ATP. Em ainda outra modalidade, a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreendem uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 102, 103 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 32. Em algumas modalidades, PlcE tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 33, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 33 tendo atividade transportadora de plantariciclina A ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 tendo atividade transportadora de plantariciclina A. Em uma outra modalidade, a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreendem uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 104, 105 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 33. Em outra modalidade, PlcB tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34. Em uma outra modalidade, a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreendem uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 106, 107 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 34.

[0009] Em ainda outra modalidade, a pelo menos uma bacteriocina e/ou a bacteriocina adicional compreendem uma bacteriocina de Classe IIA. Por exemplo, a bacteriocina de Classe IIA pode ser plantaricina 423 e a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga codificam PlaB. Em algumas modalidades, a plantaricina 423 tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 35, 36, 111 ou 113, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 35, 36, 111 ou 113 com atividade de bacteriocina plantaricina 423 ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35, 36, 111 ou 113 com atividade de bacteriocina plantaricina 423. Em uma outra modalidade, a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreendem uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 108, 109 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 35. Em uma outra modalidade, a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreendem uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 110 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 111. Em ainda uma outra modalidade, a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreendem uma sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 112 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 113. Em algumas modalidades, PlaB tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37 conferindo imunidade contra plantaricina 423 ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 que confere imunidade contra plantaricina 423. Em uma outra modalidade, a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreendem uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 114, 115, 116 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 37. Em algumas modalidades, a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga codificam adicionalmente PlaC e/ou PlaD. Em uma modalidade, PlaC tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38 ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38. Em outra modalidade, a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreendem uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 117, 118 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 38. Em algumas modalidades, PlaD tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 tendo atividade transportadora de plantaricina 423 ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 tendo atividade transportadora de plantaricina 423. Em uma outra modalidade, a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreendem uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 119, 120 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 39. Por exemplo, a bacteriocina de Classe IIA pode ser pediocina e a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga podem codificar PedB. Nas modalidades, a pediocina tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20, 21, 51, 52, 75 ou 144, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20, 21, 51, 52, 75 ou 144 tendo atividade de bacteriocina pediocina ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, 21, 51, 52, 75 ou 144 tendo atividade de bacteriocina pediocina. Em uma outra modalidade, a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreendem uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 72, 73 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 20. Em ainda outra modalidade, a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreendem uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 141, 142 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 51. Em ainda outra modalidade, a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreendem uma sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 74 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 75. Em ainda uma outra modalidade, a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreendem uma sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 143 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 144. Em modalidades específicas, PedB tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22 que confere imunidade contra a pediocina ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 conferindo imunidade contra a pediocina. Em ainda uma outra modalidade, a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreendem uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 76, 77 ou 78 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 22. Em algumas modalidades, a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga codificam adicionalmente PlaC e/ou PlaD. Em algumas modalidades, PedC tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 146, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 146 tendo, na presença de PedD, atividade transportadora de pediocina acessória ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 146 tendo, na presença de PedD, atividade transportadora de pediocina acessória. Em uma outra modalidade, a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreendem uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 147, 148 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 146. Em algumas modalidades, PedD tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 149, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 149 com atividade transportadora de pediocina ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 149 com atividade transportadora de pediocina. Em uma outra modalidade, a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreendem uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 150, 151 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 149. Em outra modalidade, a bacteriocina de Classe IIA é lactoccina A e a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga codificam LciA. Em uma modalidade, a lactoccina A tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 40 ou 41, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 40 ou 41 com atividade de bacteriocina lactoccina A ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40 ou 41 com atividade de bacteriocina lactoccina A. Em uma outra modalidade, a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreendem uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 121 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 40. Em algumas modalidades, LciA tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 42 que confere imunidade contra a lactoccina A ou é um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 42 que confere imunidade contra a lactoccina A. Em uma outra modalidade, a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreendem uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 122, 123, ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 42. Em outra modalidade, a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga codificam adicionalmente LcmA e/ou LceA. Em uma modalidade, LcmA tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 tendo atividade de exportação/processamento de lactoccina A ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 com atividade de exportação/processamento de lactoccina A. Em uma outra modalidade, a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreendem uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 124 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 43. Em algumas modalidades, LceA tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 com atividade de ligação ATP ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 com atividade de ligação ATP. Em uma outra modalidade, a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreendem uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 125 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 44. Em outra modalidade, a bacteriocina de Classe IIA é horediocina A e a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga codificam HdrI. Em algumas modalidades, a horediocina A tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 45, 46, 129 ou 131, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 45, 46, 129 ou 131 com atividade de bacteriocina horediocina A ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45, 46, 129 ou 131 com atividade de bacteriocina horediocina A. Em uma outra modalidade, a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreendem uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 126, 127 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 45. Em uma outra modalidade, a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreendem uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 128 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 129. Em uma outra modalidade, a segunda e/ou quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreendem uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 130 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 131. Em algumas modalidades, HdrI tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 47, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 47 que confere imunidade contra horediocina A ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 que confere imunidade contra horediocina A. Em uma outra modalidade, a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreendem uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 132, 133, 134 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 47. Em algumas modalidades, a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga codificam adicionalmente HdrM, HdrD e/ou HdrC. Em algumas modalidades, HdrM tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48 com atividade de dissulfeto isomerase de horediocina A ou é um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48 com atividade de dissulfeto isomerase de horediocina A. Em uma outra modalidade, a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreendem uma sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 135, 136 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 48. Em algumas modalidades, HdrD tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49 tendo clivagem da horediocina A e atividade transportadora ou é um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49 tendo clivagem da horediocina A e atividade transportadora. Em uma outra modalidade, a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreendem uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 137, 138 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 49. Em algumas modalidades, HdrC tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 tendo, na presença de HdrD, atividade transportadora de horediocina A acessória ou é um fragmento de sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 tendo, na presença de HdrD, atividade transportadora de horediocina A acessória. Em uma outra modalidade, a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreendem uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 139, 140 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 50.

[00010] Em algumas modalidades, a pelo menos uma bacteriocina e/ou a bacteriocina adicional compreendem uma bacteriocina de Classe IIB. Por exemplo, a bacteriocina de Classe IIB pode ser brochocina e a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga podem codificar BrcI. Brochocina é um dímero que compreende BrcA e BrcB. Em algumas modalidades, BrcA tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23, 24, 82 ou 84, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23, 24, 82 ou 84 tendo, em combinação com BrcB, atividade de bacteriocina brochocina ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, 24, 82 ou 84 tendo, em combinação com BrcB, atividade de bacteriocina brochocina. Em uma outra modalidade, a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreendem uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 79 ou 80 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 23. Em uma outra modalidade, a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreendem uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 81 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 82. Em uma outra modalidade, a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreendem uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 83 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 84. Em modalidades adicionais, BrcB tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, 26, 88 ou 90, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, 26, 88 ou 90 tendo, em combinação com BrcA, atividade de bacteriocina brochocina ou é um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25, 26, 88 ou 90 tendo, em combinação com BrcA, atividade de bacteriocina brochocina. Em uma outra modalidade, a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreendem uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 85 ou 86 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 25. Em uma outra modalidade, a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreendem uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 87 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 88. Em uma outra modalidade, a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreendem uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 89 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 90. Em algumas modalidades, BrcI tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27 que confere imunidade contra brochocina ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 que confere imunidade contra brochocina. Em uma outra modalidade, a segunda e/ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreendem uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 91, 92 ou 93 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 27.

[00011] Em algumas modalidades, quando a pelo menos uma bacteriocina e/ou a bacteriocina adicional é a bacteriocina de Classe IIA ou Classe IIB, a pelo menos uma bacteriocina compreende, antes da secreção, uma sequência de sinal tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 145, sendo uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 145 tendo atividade de sequência de sinal ou sendo um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 145 tendo atividade de sequência de sinal. Em algumas modalidades, a segunda e/ou a quarta sequência de ácido nucleico heteróloga podem compreender uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 152 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 145.

[00012] Em ainda outra modalidade, a primeira LAB expressa uma pluralidade de bacteriocinas. Em algumas modalidades, a primeira e/ou a terceira molécula de ácido nucleico heteróloga codificam uma piruvato descarboxilase.

[00013] Em modalidades específicas, a piruvato descarboxilase tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 tendo atividade de piruvato descarboxilase ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 com atividade de piruvato descarboxilase. Em uma outra modalidade, a primeira e/ou a terceira molécula de ácido nucleico heteróloga compreendem uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2, 5 ou 153 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a primeira e/ou a terceira molécula de ácido nucleico heteróloga codificam uma álcool desidrogenase. Em uma modalidade específica, a álcool desidrogenase tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 com atividade da álcool desidrogenase ou é um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 com atividade de álcool desidrogenase. Em uma outra modalidade, a primeira e/ou a terceira molécula de ácido nucleico heteróloga compreendem uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 4, 6 ou 154 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 3. Em modalidades, a primeira célula LAB recombinante e/ou a segunda célula LAB recombinante têm uma atividade diminuída de lactato desidrogenase quando comparada a uma célula LAB nativa correspondente. Em outra modalidade, a primeira célula LAB recombinante e/ou a segunda célula LAB recombinante compreendem, pelo menos, um gene nativo inativado ou deletado que codifica para uma lactato desidrogenase. Em uma outra modalidade, o pelo menos um gene nativo que codifica para a lactato desidrogenase é ldh1, ldh2, ldh3, ldh4 ou dhic. Em algumas modalidades adicionais, a primeira célula LAB recombinante e/ou a segunda célula LAB recombinante compreendem genes ldh1, ldh2, ldh3, ldh4 e dhic nativos inativados ou deletados. Em uma outra modalidade, a primeira célula LAB recombinante e/ou a segunda célula LAB recombinante têm uma atividade diminuída de manitol desidrogenase em comparação com uma célula LAB nativa correspondente. Em algumas modalidades, a primeira célula LAB recombinante e/ou a segunda célula LAB recombinante compreendem, pelo menos, um gene nativo inativado ou deletado que codifica para uma manitol-1- fosfato 5-desidrogenase. Em modalidades específicas, o pelo menos um gene nativo que codifica para a manitol-1-fosfato 5-desidrogenase é mltD1 ou mltD2. Em algumas modalidades adicionais, a primeira célula LAB recombinante e/ou a segunda célula LAB recombinante compreendem genes mltD1 e mltD2 nativos inativados ou deletados. Em outra modalidade, pelo menos uma das primeira, segunda, terceira e/ou quarta moléculas de ácido nucleico heterólogas está em um vetor extracromossômico. Em ainda outra modalidade, pelo menos uma das primeira, segunda, terceira e/ou quarta moléculas de ácido nucleico heterólogas é integrada em um cromossomo bacteriano. Em algumas modalidades, a primeira célula LAB recombinante é do gênero Lactococcus e, em modalidades adicionais, da espécie Lactococcus lactis. Em algumas modalidades, a segunda célula LAB recombinante é do gênero Lactobacillus e, por exemplo, da espécie Lactobacillus paracasei.

[00014] De acordo com um segundo aspecto, a presente invenção compreende uma combinação que compreende a cocultura aqui descrita e uma célula de levedura. Em uma modalidade, a célula de levedura é uma célula de levedura recombinante. Em algumas modalidades, a célula de levedura é do gênero Saccharomyces sp. e, em algumas modalidades adicionais, da espécie Saccharomyces cerevisiae.

[00015] De acordo com um terceiro aspecto, a presente invenção fornece um processo para converter uma biomassa em um produto de fermentação. O processo compreende colocar em contato a biomassa com a cocultura aqui descrita ou a combinação aqui descrita sob condições para permitir a conversão de, pelo menos, uma parte da biomassa no produto de fermentação. Em uma modalidade, a biomassa compreende milho, que pode ser fornecido como uma pasta. Em algumas modalidades, o produto de fermentação é etanol. Em algumas modalidades, o processo é para prevenir a contaminação da biomassa por um micro-organismo contaminante.

[00016] De acordo com um quarto aspecto, a presente invenção fornece um kit que compreende a primeira célula bacteriana de ácido láctico recombinante (LAB) aqui descrita e a segunda célula bacteriana de ácido láctico recombinante (LAB) aqui descrita. Em uma modalidade, o kit compreende ainda a célula de levedura aqui descrita. Em modalidades adicionais, o kit compreende ainda instruções para realizar o processo aqui descrito.

[00017] De acordo com um quinto aspecto, a presente invenção fornece um meio que compreende a primeira célula bacteriana de ácido láctico recombinante (LAB) aqui descrita, a segunda célula bacteriana de ácido láctico recombinante (LAB) aqui descrita e, opcionalmente, a célula de levedura aqui descrita. Em uma modalidade, o meio é um meio de propagação. Em outra modalidade, o meio é um meio de fermentação. Em ainda uma outra modalidade, o meio compreende ainda um produto de fermentação, tal como, por exemplo, etanol.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00018] Tendo assim descrito genericamente a natureza da invenção, será feita agora referência aos desenhos anexos, mostrando a título de ilustração, uma modalidade preferencial da mesma, e na qual:

[00019] A Figura 1 ilustra o crescimento de Lb. paracasei E3.1 carregando o vetor vazio pDW2 (linhas pretas) ou o pDW2-PS-NisIEFG (linhas cinza) em MRS mais (linhas tracejadas) e menos (linhas sólidas) a inclusão de nisina. Os resultados são apresentados como a OD a 600 nm em função dos dias.

[00020] A Figura 2 ilustra o tempo necessário para que os diferentes isolados atinjam uma OD de 0,5 em diluições de 1/5, 1/10, 1/20 e 1/50 de sobrenadante contendo nisina de L. lactis. Os resultados são mostrados como o OD600 inicial de 0,5 em função da cepa, bem como, a concentração de sobrenadante usada.

[00021] As Figuras 3A a 3D ilustram a detecção por espectrometria de massa de várias bacteriocinas produzidas por várias cepas de L. lactis em um meio de cultura.

[00022] (Figura 3A) Uma cepa de L. lactis produtora de nisina foi transformada com um vetor vazio. No espectro de massa fornecido na Figura 3A, a nisina foi a única bacteriocina detectada.

[00023] (Figura 3B) Uma cepa de L. lactis produtora de nisina foi transformada com um vetor que codifica genes para a produção de pediocina. No espectro de massa fornecido na Figura 3B, nisina e pediocina foram detectadas.

[00024] (Figura 3C) Uma cepa de L. lactis produtora de nisina foi transformada com um vetor que codifica genes para a produção de brochocina. No espectro de massa fornecido na Figura 3C, nisina e brochocina foram detectadas.

[00025] (Figura 3D) Espectro de massa de um meio de crescimento não inoculado livre de bacteriocina.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[00026] A presente invenção refere-se a uma cocultura de duas células bacterianas de ácido láctico distintas, uma das quais sendo capaz de expressar uma bacteriocina (ou uma pluralidade de bacteriocinas). Ambas as células bacterianas de ácido láctico são capazes de fazer um produto fermentado (a partir de uma biomassa) e também imunes à bacteriocina. A cocultura pode ser usada, opcionalmente em combinação com uma célula de levedura, para limitar a contaminação microbiana durante um processo de preparação do produto fermentado. Em algumas modalidades, a cocultura da presente invenção pode limitar o uso de antibióticos durante a fermentação de uma biomassa para fazer um produto fermentado (por exemplo, um álcool, tal como, por exemplo, etanol).

[00027] As coculturas da presente invenção compreendem uma ou mais células LAB recombinantes e podem ser usadas em combinação com uma célula de levedura recombinante. Estas células recombinantes (bacterianas e de levedura) podem ser obtidas através da introdução de uma ou mais modificações genéticas em uma célula hospedeira microbiana nativa (parental) correspondente. Quando a modificação genética tem como objetivo reduzir ou inibir a expressão de um gene alvo específico (que é endógeno à célula hospedeira), as modificações genéticas podem ser feitas em uma ou em ambas as cópias dos genes alvo. Quando a modificação genética tem como objetivo aumentar a expressão de um gene alvo específico, a modificação genética pode ser feita em uma ou várias localizações genéticas. No contexto da presente invenção, quando células microbianas recombinantes são qualificadas como sendo "geneticamente modificadas", entende-se que elas foram manipuladas para adicionar, pelo menos um ou mais resíduos de ácido nucleico heterólogos ou exógenos e/ou remover pelo menos, um resíduo de ácido nucleico endógeno (ou nativo). Em algumas modalidades, um ou mais resíduos de ácido nucleico que são adicionados podem ser derivados de uma célula heteróloga ou da própria célula recombinante. No último cenário, os resíduos de ácido nucleico são adicionados em uma localização genômica que é diferente da localização genômica nativa. As manipulações genéticas não ocorreram na natureza e são os resultados de manipulações in vitro da célula hospedeira nativa.

[00028] Quando expressos em células microbianas recombinantes, os polipeptídeos heterólogos aqui descritos são codificados em uma ou mais moléculas de ácido nucleico heterólogas. O termo "heterólogo" quando usado em referência a uma molécula de ácido nucleico (tal como um promotor ou uma sequência de codificação) refere-se a uma molécula de ácido nucleico que não é encontrada nativamente na célula microbiana. "Heterólogo" também inclui uma região de codificação nativa, ou parte da mesma, que é removida do organismo de origem e subsequentemente reintroduzida no organismo de origem em uma forma que é diferente do gene nativo correspondente, por exemplo, não em sua localização natural no genoma do organismo. A molécula de ácido nucleico heteróloga é propositalmente introduzida na célula microbiana recombinante. O termo "heterólogo", tal como aqui utilizado, também refere-se a um elemento (ácido nucleico ou proteína) que é derivado de uma fonte diferente da fonte endógena. Assim, por exemplo, um elemento heterólogo pode ser derivado de uma cepa diferente de célula hospedeira, ou de um organismo de um grupo taxonômico diferente (por exemplo, reino diferente, filo, classe, ordem, gênero familiar ou espécie, ou qualquer subgrupo dentro de uma dessas classificações). O termo "heterólogo" também é usado como sinônimo aqui com o termo "exógeno".

[00029] Quando uma molécula de ácido nucleico heteróloga está presente na célula microbiana recombinante, ela pode ser integrada no cromossomo da célula hospedeira. O termo "integrado", tal como aqui utilizado, refere-se a elementos genéticos que são colocados, por meio de técnicas de biologia molecular, no cromossomo de uma célula hospedeira. Por exemplo, os elementos genéticos podem ser colocados nos cromossomos da célula microbiana em oposição a um vetor, tal como um plasmídeo transportado pela célula hospedeira. Métodos para integrar elementos genéticos no cromossomo de uma célula hospedeira são bem conhecidos na técnica e incluem recombinação homóloga. A molécula de ácido nucleico heteróloga pode estar presente em uma ou mais cópias nos cromossomos da célula hospedeira microbiana. Alternativamente, a molécula de ácido nucleico heteróloga pode se replicar independentemente do cromossomo da célula microbiana. Em tal modalidade, a molécula de ácido nucleico pode ser estável e autorreplicante.

[00030] Em algumas modalidades, as moléculas de ácido nucleico heterólogas que podem ser introduzidas nas células microbianas recombinantes são otimizadas por códons em relação à célula hospedeira microbiana recombinante destinatária pretendida (por exemplo, bactéria ou levedura, por exemplo). Tal como aqui utilizado, o termo "região de codificação otimizada por códons" significa uma região de codificação de ácido nucleico que foi adaptada para expressão nas células de um determinado organismo, substituindo pelo menos um, ou mais de um, códons por um ou mais códons que são mais frequentemente usados nos genes desse organismo. Em geral, genes altamente expressos em um organismo são tendenciosos para códons que são reconhecidos pelas espécies de tRNA mais abundantes naquele organismo. Uma medida desse viés é o "índice de adaptação do códon" ou "CAI", que mede até que ponto os códons usados para codificar cada aminoácido em um gene particular são aqueles que ocorrem com mais frequência em um conjunto de referência de genes altamente expressos de um organismo. O CAI da molécula de ácido nucleico heteróloga otimizada por códons aqui descrito corresponde a entre cerca de 0,8 e 1,0, entre cerca de 0,8 e 0,9 ou cerca de 1,0. Em algumas modalidades, as moléculas de ácido nucleico heterólogas que podem ser introduzidas nas células microbianas recombinantes são códon-otimizadas em relação à célula microbiana recombinante destinatária pretendida de modo a limitar ou prevenir a recombinação homóloga com o gene nativo correspondente.

[00031] As moléculas de ácido nucleico heterólogas da presente invenção compreendem uma região de codificação para um ou mais polipeptídeos a serem expressos pela célula microbiana recombinante. Uma "região codificadora" de DNA ou RNA é uma molécula de DNA ou RNA que é transcrita e/ou traduzida em um polipeptídeo em uma célula in vitro ou in vivo quando colocada sob o controle de sequências regulatórias apropriadas. "Regiões regulatórias adequadas" referem-se a regiões de ácido nucleico localizadas a montante (sequências não codificantes 5'), dentro ou a jusante (sequências não codificantes 3') de uma região codificadora e que influenciam a transcrição, processamento ou estabilidade de RNA, ou tradução da região de codificação associada. As regiões regulatórias podem incluir promotores, sequências líderes de tradução, locais de processamento de RNA, locais de ligação efetores e estruturas em grampo. Os limites da região de codificação são determinados por um códon de início no terminal 5' (amino) e um códon de terminação da tradução no terminal 3' (carboxil). Uma região de codificação pode incluir, mas não está limitada a regiões procarióticas, cDNA de mRNA, moléculas de DNA genômico, moléculas de DNA sintético ou moléculas de RNA. Se a região de codificação se destina à expressão em uma célula eucariótica, um sinal de poliadenilação e a sequência de terminação da transcrição estarão geralmente localizados na região de codificação 3’. Em uma modalidade, a região de codificação pode ser referida como um quadro de leitura aberto. "Quadro de leitura aberto" é abreviado para ORF e significa um comprimento de ácido nucleico, seja DNA, cDNA ou RNA, que compreende um sinal de início de tradução ou códon de iniciação, tal como um ATG ou AUG, e um códon de terminação e pode ser potencialmente traduzido em uma sequência polipeptídica.

[00032] As moléculas de ácido nucleico aqui descritas podem compreender uma região não codificante, por exemplo, uma região de controle da transcrição e/ou tradução. “Regiões de controle transcricional e translacional” são regiões regulatórias de DNA, tais como promotores, intensificadores, terminadores e similares, que fornecem a expressão de uma região codificadora em uma célula microbiana. Em células eucarióticas, os sinais de poliadenilação são regiões de controle.

[00033] A molécula de ácido nucleico heteróloga pode ser introduzida na célula hospedeira usando um vetor. Um "vetor", por exemplo, um "plasmídeo", "cosmídeo" ou "cromossomo artificial" (tal como, por exemplo, um cromossomo artificial bacteriano ou de levedura) refere-se a um elemento cromossômico extra e geralmente está na forma de uma molécula de DNA de filamento duplo circular. Tais vetores podem ser sequências de replicação autônomas, sequências de integração de genoma, sequências de fago ou de nucleotídeo, lineares, circulares ou superenroladas, de um DNA ou RNA de filamento único ou duplo, derivado de qualquer fonte, em que uma série de sequências de nucleotídeo foi unida ou recombinada em uma construção única que é capaz de introduzir um fragmento promotor e sequência de DNA para um produto de gene selecionado junto com a sequência não traduzida 3’ apropriada em uma célula microbiana.

[00034] Na molécula de ácido nucleico heteróloga aqui descrita, o promotor e a molécula de ácido nucleico codificam para um ou mais polipeptídeos que podem ser operativamente ligados um ao outro. No contexto da presente invenção, as expressões "operativamente ligado" ou "operativamente associado" referem-se ao fato de que o promotor está fisicamente associado à molécula de ácido nucleotídico que codifica para um ou mais polipeptídeos de uma maneira que permite, sob certas condições, para a expressão de um ou mais polipeptídeos da molécula de ácido nucleico. Em uma modalidade, o promotor pode estar localizado a montante (5') da sequência de ácido nucleico que codifica para um ou mais polipeptídeos. Em ainda outra modalidade, o promotor pode estar localizado a jusante (3') da sequência de ácido nucleico que codifica para um ou mais polipeptídeos. No contexto da presente invenção, um ou mais de um promotor podem ser incluídos na molécula de ácido nucleico heteróloga. Quando mais de um promotor é incluído na molécula de ácido nucleico heteróloga, cada um dos promotores está operacionalmente ligado à sequência de ácido nucleico que codifica para um ou mais polipeptídeos. Os promotores podem estar localizados, em vista da molécula de ácido nucleico que codifica para um ou mais polipeptídeos, a montante, a jusante, bem como, tanto a montante e a jusante.

[00035] "Promotor" refere-se a um fragmento de DNA capaz de controlar a expressão de uma sequência de codificação ou RNA funcional. O termo "expressão", tal como aqui utilizado, refere-se à transcrição e acumulação estável de sentido (mRNA) da molécula de ácido nucleico heteróloga aqui descrita. A expressão também pode se referir à tradução de mRNA em um polipeptídeo. Os promotores podem ser derivados em sua totalidade de um gene nativo, ou ser compostos de diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados na natureza, ou mesmo compreender segmentos de DNA sintéticos. É entendido por aqueles versados na técnica que diferentes promotores podem direcionar a expressão em diferentes estágios de desenvolvimento, ou em resposta a diferentes condições ambientais ou fisiológicas. Os promotores que fazem com que um gene seja expresso na maioria das células, na maioria das vezes em um nível substancialmente similar, são comumente referidos como "promotores constitutivos". É ainda reconhecido que, uma vez que na maioria dos casos os limites exatos das sequências regulatórias não foram completamente definidos, fragmentos de DNA de comprimentos diferentes podem ter atividade promotora idêntica. Um promotor é geralmente limitado em seu terminal 3' pelo local de iniciação da transcrição e se estende a montante (direção 5') para incluir o número mínimo de bases ou elementos necessários para iniciar a transcrição em níveis detectáveis acima do fundamento. Dentro do promotor será encontrado um local de iniciação da transcrição (convenientemente definido por exemplo, por mapeamento com nuclease S1), bem como, domínios de ligação de proteína (sequências de consenso) responsáveis pela ligação da polimerase.

[00036] O promotor pode ser heterólogo para a molécula de ácido nucleico que codifica um ou mais polipeptídeos. O promotor pode ser heterólogo ou derivado de uma cepa sendo do mesmo gênero ou espécie que a célula microbiana. Em uma modalidade, o promotor é derivado do mesmo gênero ou espécie da célula microbiana e o polipeptídeo heterólogo é derivado de gêneros diferentes.

[00037] Em algumas modalidades, a presente invenção refere-se à expressão de um ou mais polipeptídeos heterólogos, uma variante do mesmo ou um fragmento do mesmo em uma célula hospedeira. Uma variante compreende, pelo menos, uma diferença de aminoácidos quando comparada com a sequência de aminoácidos do polipeptídeo nativo (tipo selvagem). As "variantes" do polipeptídeo têm pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade ao polipeptídeo heterólogo aqui descrito e exibem a atividade biológica associada ao polipeptídeo heterólogo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo variante exibe mais atividade que o polipeptídeo de tipo selvagem correspondente. Na modalidade, em que o polipeptídeo é uma bacteriocina, a atividade biológica do polipeptídeo é sua atividade antibacteriana (por exemplo, bacteriostática e/ou citotóxica). Na modalidade em que o polipeptídeo é um transportador de bacteriocina ou uma permease ou de outra forma envolvido na secreção de bacteriocina (tal como, por exemplo, uma proteína acessória envolvida no transporte), a atividade biológica do polipeptídeo é a sua capacidade de translocar a bacteriocina dentro ou fora da célula. Na modalidade, em que o polipeptídeo confere imunidade contra a bacteriocina, a atividade biológica do polipeptídeo é imunidade. Na modalidade em que o polipeptídeo confere atividade de processamento de bacteriocina (por exemplo, tal como atividade de dissulfeto isomerase), a atividade biológica do polipeptídeo é a sua capacidade de modificar a bacteriocina (por exemplo, exibir atividade de isomerase em relação à bacteriocina). Na modalidade em que o polipeptídeo confere atividade de ligação ATP, a atividade biológica do polipeptídeo é a sua capacidade de se ligar a ATP. Em uma modalidade, o polipeptídeo variante exibe pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da identidade biológica em relação ao polipeptídeo de tipo selvagem. O termo "porcentagem de identidade", como conhecido na técnica, é uma relação entre duas ou mais sequências polipeptídicas ou duas ou mais sequências polinucleotídicas, conforme determinado pela comparação das sequências. O nível de identidade pode ser determinado convencionalmente usando programas de computador conhecidos. A identidade pode ser facilmente calculada por métodos conhecidos, incluindo mas não limitada aos descritos em: Computational Molecular Biology (Lesk, A.M., ed.) Oxford University Press, NY (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, NY (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.) Humana Press, NJ (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987); e Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Stockton Press, NY (1991). Os métodos preferidos para determinar a identidade são projetados para fornecer a melhor correspondência entre as sequências testadas. Métodos para determinar a identidade e similaridade são codificados em programas de computador publicamente disponíveis. Alinhamentos de sequência e cálculos de porcentagem de identidade podem ser realizados usando o programa Megalign do pacote de computação de bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, Wis.). Múltiplos alinhamentos das sequências aqui descritas foram realizados usando o método de alinhamento Clustal (Higgins and Sharp (1989) CABIOS. 5: 151-153) com os parâmetros padrão (GAP PENALTY = 10, GAP LENGTH PEN ALT Y = 10). Os parâmetros padrão para alinhamentos em pares usando o método Clustal foram KTUPLB 1, GAP PENALTY = 3, WINDOW = 5 e DIAGONALS SAVED = 5.

[00038] Os polipeptídeos heterólogos variantes descritos aqui podem ser (i) um em que um ou mais dos resíduos de aminoácidos são substituídos por um resíduo de aminoácido conservado ou não conservado (de preferência, um resíduo de aminoácido conservado) e tal resíduo de aminoácido substituído pode ser ou não um codificado pelo código genético, ou (ii) um em que um ou mais dos resíduos de aminoácidos incluem um grupo substituinte, ou (iii) um em que o polipeptídeo maduro é fundido com outro composto, tal como um composto para aumentar a meia-vida do polipeptídeo (por exemplo, polietileno glicol), ou (iv) um em que os aminoácidos adicionais são fundidos ao polipeptídeo maduro para purificação do polipeptídeo.

[00039] Uma "variante" do polipeptídeo pode ser uma variante conservativa ou uma variante alélica. Tal como aqui utilizado, uma variante conservativa refere-se a alterações na sequência de aminoácidos que não afetam adversamente as funções biológicas do polipeptídeo. Diz-se que uma substituição, inserção ou deleção afeta adversamente o polipeptídeo quando a sequência alterada previne ou interrompe uma função biológica associada ao polipeptídeo. Por exemplo, a carga geral, estrutura ou propriedades hidrofóbicashidrofílicas do polipeptídeo podem ser alteradas sem afetar adversamente sua atividade biológica. Desta maneira, a sequência de aminoácidos pode ser alterada, por exemplo, para tornar o polipeptídeo mais hidrofóbico ou hidrofílico, sem afetar adversamente as atividades biológicas do polipeptídeo.

[00040] O polipeptídeo heterólogo pode ser um fragmento do polipeptídeo nativo (tipo selvagem) ou fragmento de uma variante do polipeptídeo que exibe a atividade biológica do polipeptídeo ou da variante. Em uma modalidade, o fragmento exibe pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da atividade biológica dos polipeptídeos heterólogos ou variante dos mesmos. Em algumas modalidades, o polipeptídeo variante exibe mais atividade que o polipeptídeo de tipo selvagem correspondente. Na modalidade, em que o polipeptídeo é uma bacteriocina, a atividade biológica do polipeptídeo é sua atividade antibacteriana (por exemplo, bacteriostática e/ou citotóxica). Na modalidade, em que o polipeptídeo é um transportador de bacteriocina ou uma permease ou de outra forma envolvido na secreção de bacteriocina (tal como, por exemplo, uma proteína acessória envolvida no transporte), a atividade biológica do polipeptídeo é a sua capacidade de translocar a bacteriocina dentro ou fora da célula. Na modalidade, em que o polipeptídeo confere imunidade contra a bacteriocina, a atividade biológica do polipeptídeo é imunidade. Na modalidade, em que o polipeptídeo confere atividade de processamento de bacteriocina (por exemplo, tal como atividade de dissulfeto isomerase), a atividade biológica do polipeptídeo é a sua capacidade de modificar a bacteriocina (por exemplo, exibir atividade de isomerase em relação à bacteriocina). Na modalidade em que o polipeptídeo confere atividade de ligação ATP, a atividade biológica do polipeptídeo é a sua capacidade de se ligar a ATP. Em algumas modalidades, os "fragmentos" têm pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com os polipeptídeos de tipo selvagem aqui descritos.

[00041] Em algumas modalidades adicionais, a presente invenção também fornece a expressão de um polipeptídeo codificado por um gene ortólogo de um gene conhecido por codificar o polipeptídeo. Um “gene ortólogo” é entendido como um gene em uma espécie diferente que evoluiu de um gene ancestral comum por especiação. No contexto da presente invenção, um gene ortólogo codifica um polipeptídeo que exibe a mesma função biológica do polipeptídeo nativo.

[00042] Em algumas outras modalidades, a presente invenção também fornece a expressão de uma proteína codificada por um gene parálogo de um gene conhecido por codificar o polipeptídeo. Um “gene parálogo” é entendido como um gene relacionado por duplicação dentro do genoma. No contexto da presente invenção, um gene parálogo codifica um polipeptodo que pode exibir função biológica adicional do que o polipeptídeo nativo.

Primeira célula bacteriana de ácido láctico recombinante (LAB)

[00043] No contexto da presente invenção, a primeira célula bacteriana da cocultura é uma bactéria de ácido láctico (LAB). As primeiras células LAB recombinantes podem ser fornecidas como uma cultura pura para a fermentação ou como uma mistura com as segundas células LAB recombinantes. Como é conhecido na técnica, as LAB são um grupo de bactérias Gram-positivas, coccus ou bastonetes que não respiram e não formam esporos, que produzem ácido láctico como o principal produto final da fermentação de carboidratos. O gênero bacteriano de LAB inclui, mas não está limitado a Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus, Streptococcus, Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Sporolactobacillus, Tetragenococcus, Vagococcus e Weissella. Espécies bacterianas de LAB incluem, mas não são limitadas a, Lactococcus lactis, Lactococcus garviae, Lactococcus raffinolactis, Lactococcus plantarum, Oenococcus oeni, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus acidilactici, Carnococcus allantoicus, Carnobacterium gallinarum, Vagococcus fessus, Streptococcus thermophilus, Enterococcus phoeniculicola, Enterococcus plantarum, Enterococcus raffinosus, Enterococcus avium, Enterococcus pallens Enterococcus hermanniensis, Enterococcus faecalis, e Enterococcus faecium. Em uma modalidade, a LAB é um Lactobacillus e, em alguma modalidade adicional, a espécie Lactobacillus é L. acetotolerans, L. acidifarinae, L. acidipiscis, L. acidophilus, L. agilis, L. algidus, L. alimentarius, L. amylolyticus, L. amylophilus, L. amylotrophicus, L. amylovorus, L. animalis, L. antri, L. apodemi, L. aviarius, L. bifermentans, L. brevis, L. buchneri, L. camelliae, L. casei, L. catenaformis, L. ceti, L. coleohominis, L. collinoides, L. composti, L. concavus, L. coryniformis, L. crispatus, L. crustorum, L. curvatus, L. delbrueckii (incluindo L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. delbrueckii subsp. delbrueckii, L. delbrueckii subsp. lactis), L. dextrinicus, L. diolivorans, L. equi, L. equigenerosi, L. farraginis, L. farciminis, L. fermentum, L. fornicalis, L . fructivorans, L. frumenti, L. fuchuensis, L. gallinarum, L. gasseri, L. gastricus, L. ghanensis, L. graminis, L. ammesii, L. hamsteri, L. harbinensis, L. hayakitensis, L. helveticus, L. hilgardii, L. omohiochii, L. iners, L. ingluviei, L. intestinalis, L. jensenii, L. johnsonii, L. kalixensis, L. efiranofaciens, L. kefiri, L. kimchii, L. kitasatonis, L. kunkeei, L. leichmannii, L. lindneri, L. alefermentans, L. mali, L. manihotivorans, L. mindensis, L. mucosae, L. murinus, L. nagelii, L. namurensis, L. nantensis, L. oligofermentans, L. oris, L. panis, L. pantheris, L. parabrevis, L. parabuchneri, L. paracasei, L. paracollinoides, L. parafarraginis, L. parakefiri, L. aralimentarius, L. paraplantarum, L. pentosus, L. perolens, L. plantarum, L. pontis, L. protectus, L. psittaci, L. rennini, L. reuteri, L. rhamnosus, L. rimae, L. rogosae, L. rossiae, L. ruminis, L. saerimneri, L. sakei, L. salivarius, L. sanfranciscensis, L. satsumensis, L. secaliphilus, L. sharpeae, L. siliginis, L. spicheri, L. suebicus, L. thailandensis, L. ultunensis, L. vacinostercus, L. vaginalis, L. versmoldensis, L. vini, L. vitulinus, L. zeae ou L. zymae.

[00044] Em uma modalidade específica, a primeira célula LAB recombinante é do gênero Lactococcus sp. e pode ser, em uma outra modalidade, da espécie Lactococcus lactis. A primeira célula LAB recombinante é uma célula LAB recombinante porque compreende uma primeira molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica um polipeptídeo para converter, pelo menos em parte, uma biomassa (tal como milho, por exemplo) em um produto fermentado. Em algumas modalidades, mais de uma primeira molécula de ácido nucleico heteróloga pode ser fornecida para codificar uma pluralidade de polipeptídeos para converter, pelo menos em parte, uma biomassa (tal como milho, por exemplo) em um produto fermentado. Em tais modalidades, cada primeira molécula de ácido nucleico heteróloga pode incluir uma ou mais sequências de codificação correspondentes a um ou mais polipeptídeos. Em outra modalidade, uma única primeira molécula de ácido nucleico heteróloga pode codificar um ou mais polipeptídeos. O um ou mais polipeptídeos incluídos nas primeiras moléculas de ácido nucleico heterólogas podem ser feitos para melhorar o rendimento da fermentação e permitir que a primeira célula LAB recombinante faça um produto fermentado, tal como, por exemplo, etanol. Sem desejar estar limitado à teoria, a presença de uma ou mais primeiras moléculas de ácido nucleico e a expressão de um ou mais polipeptídeos na primeira célula LAB recombinante favorecem a produção do produto fermentado em vez de ácidos orgânicos que podem ser prejudiciais para o crescimento ou viabilidade de outras células microbianas (leveduras, por exemplo) durante a fermentação.

[00045] Em uma modalidade, uma ou mais primeiras moléculas de ácido nucleico heterólogas codificam uma piruvato descarboxilase e/ou uma álcool desidrogenase. Quando a primeira célula LAB recombinante tem uma capacidade intrínseca de expressar uma piruvato descarboxilase, a primeira molécula de ácido nucleico heteróloga pode codificar uma álcool desidrogenase heteróloga. Em tal modalidade, é possível que a primeira molécula de ácido nucleico heteróloga (molécula igual ou diferente) codifique uma piruvato descarboxilase heteróloga (para aumentar a atividade geral da piruvato descarboxilase da primeira célula LAB recombinante). Quando a primeira célula LAB recombinante tem uma capacidade intrínseca de expressar uma álcool desidrogenase, a primeira molécula de ácido nucleico heteróloga pode codificar uma piruvato descarboxilase. Em tal modalidade, é possível que a primeira molécula de ácido nucleico heteróloga codifique ainda uma álcool desidrogenase heteróloga (para aumentar a atividade geral da álcool desidrogenase da primeira célula LAB recombinante). Se a primeira LAB recombinante não tiver uma capacidade intrínseca de expressar uma piruvato descarboxilase e uma álcool desidrogenase, a primeira molécula de ácido nucleico heteróloga pode codificar uma álcool desidrogenase e uma piruvato descarboxilase (na mesma molécula ou em diferentes moléculas). As uma ou mais primeiras moléculas de ácido nucleico heterólogas podem ser integradas no genoma bacteriano ou ser replicadas independentemente a partir do genoma bacteriano. As sequências de ácido nucleico que codificam a piruvato descarboxilase e a álcool desidrogenase podem estar nas mesmas ou nas primeiras moléculas de ácido nucleico heterólogas distintas.

[00046] Em uma modalidade, o um ou mais polipeptídeos para a conversão de uma biomassa incluem uma piruvato descarboxilase heteróloga. Em tal modalidade, a primeira célula LAB recombinante inclui em uma primeira molécula de ácido nucleico heteróloga uma sequência de codificação para uma piruvato descarboxilase heteróloga. Tal como aqui utilizado, o termo "piruvato descarboxilase" refere-se a uma enzima que catalisa a descarboxilação do ácido pirúvico em acetaldeído e dióxido de carbono. Em Zymonas mobilis, o gene da piruvato descarboxilase é referido como PDC (Gene ID: 33073732) e pode ser usado na primeira célula LAB recombinante da presente invenção. Em algumas modalidades adicionais, o polipeptídeo de piruvato descarboxilase pode ser de Lactobacillus florum (Número de Acesso WP_009166425.1), Lactobacillus fructivorans (Número de Acesso WP_039145143.1), Lactobacillus lindneri (Número de Acesso WP_065866149.1), Lactococcus lactis (Número de Acesso WP_104141789.1), Carnobacterium gallinarum (Número de Acesso WP_034563038.1), Enterococcus plantarum (Número de Acesso WP_069654378.1), Clostridium acetobutylicum (Número de Acesso NP_149189.1), Bacillus megaterium (Número de Acesso WP_075420723.1) ou Bacillus thuringiensis (Número de Acesso WP_052587756.1). Na primeira célula LAB recombinante da presente invenção, a piruvato descarboxilase pode ter o aminoácido da SEQ ID NO: 1, ser uma variante da SEQ ID NO: 1 (com atividade da piruvato carboxilase) ou ser um fragmento da SEQ ID NO: 1 tendo atividade de piruvato carboxilase). Em algumas modalidades específicas, a primeira célula LAB recombinante da presente invenção pode expressar uma molécula de ácido nucleico heteróloga que compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2, 5 ou 153, uma variante da mesma (que codifica um polipeptídeo com atividade de piruvato carboxilase) ou um fragmento da mesma (que codifica um polipeptídeo com atividade de piruvato carboxilase). Em ainda uma outra modalidade específica, a primeira molécula de ácido nucleico heteróloga pode compreender a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 2, 5 ou 153 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 1.

[00047] Em uma modalidade, o um ou mais polipeptídeos para a conversão de uma biomassa incluem uma álcool desidrogenase heteróloga. Em tal modalidade, a primeira célula LAB recombinante inclui em uma primeira molécula de ácido nucleico heteróloga uma sequência de codificação para uma álcool desidrogenase heteróloga. A sequência de ácido nucleico que codifica a álcool desidrogenase heteróloga pode estar fisicamente localizada na mesma molécula ou em uma molécula de ácido nucleico distinta que a sequência de ácido nucleico que codifica a piruvato descarboxilase. Conforme usado aqui, o termo "álcool desidrogenase" refere-se a uma enzima da Classe EC 1.1.1.1. Em algumas modalidades, a álcool desidrogenase é uma álcool desidrogenase contendo ferro. A álcool desidrogenase que pode ser expressa na primeira célula LAB recombinante inclui, mas não está limitada a ADH4 de Saccharomyces cerevisiae, ADHB de Zymonas mobilis, FUCO de Escherichia coli, ADHE de Escherichia coli, ADH1 de Clostridium acetobutylicum, ADH1 de Entamoeba nuttalli, BDHA de Clostridium acetobutylicum, BDHB de Clostridium acetobutylicum, 4HBD de Clostridium kluyveri, DHAT de Citrobacter freundii ou DHAT de Klebsiella pneumoniae. Em uma modalidade, a álcool desidrogenase pode ser ADHB de Zymonas mobilis (Gene ID: AHJ71151.1), Lactobacillus reuteri (Número de Acesso: KRK51011.1), Lactobacillus mucosae (Número de Acesso WP_048345394.1), Lactobacillus brevis (Número de Acesso WP_003553163.1) ou Streptococcus thermophiles (Número de Acesso WP_113870363.1). Na primeira célula LAB recombinante da presente invenção, a álcool desidrogenase pode ter o aminoácido de SEQ ID NO: 3, ser uma variante de SEQ ID NO: 3 (com atividade de álcool desidrogenase) ou um fragmento de SEQ ID NO: 3 (com atividade de álcool desidrogenase). Em algumas modalidades específicas, a primeira célula LAB recombinante da presente invenção pode expressar uma molécula de ácido nucleico heteróloga que compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 4, 6 ou 154, ser uma variante da sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 4, 6 ou 154 (que codifica um polipeptídeo com atividade de álcool desidrogenase) ou ser um fragmento da sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 4, 6 ou 154 (que codifica um polipeptídeo com atividade de álcool desidrogenase). Em ainda outra modalidade, a primeira molécula de ácido nucleico heteróloga pode compreender a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4, 6 ou 154 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 3.

[00048] Em algumas modalidades, pode ser vantajoso reduzir a atividade da lactato desidrogenase na primeira célula LAB recombinante. Em tal modalidade, a primeira célula LAB recombinante pode ser geneticamente modificada para diminuir sua atividade de lactato desidrogenase. Conforme usado no contexto da presente invenção, a expressão "lactato desidrogenase" refere-se a uma enzima da Classe E.C. 1.1.1.27 que é capaz de catalisar a conversão do ácido pirúvico em lactato. A primeira célula LAB recombinante pode, assim, ter um ou mais genes que codificam para uma proteína com atividade de lactato desidrogenase que é inativada (através da deleção parcial ou total do gene). Em bactérias, os genes ldh1, ldh2, ldh3 e ldh4 codificam proteínas com atividade de lactato desidrogenase. Algumas bactérias podem conter até seis ou mais desses genes (ou seja, ldh5, ldh6, etc.). A enzima codificada pelo gene ldh3 é uma proteína com atividade de lactato desidrogenase e, é algumas vezes, referida como ácido l-hidroxiisocapróico desidrogenase (codificado pelo gene lhic). Outra enzima com atividade de lactato desidrogenase é o ácido d-hidroxiisocapróico desidrogenase (codificado pelo gene dhic). Em uma modalidade, pelo menos, um dos genes ldh1, ldh2, ldh3, ldh4 ou dhic, seus ortólogos e parálogos correspondentes, é inativado ou deletado na primeira célula LAB recombinante. Em uma modalidade, apenas um do gene ldh é inativado ou deletado na primeira célula LAB recombinante. Em outra modalidade, pelo menos, dois dos genes ldh são inativados ou deletados na primeira célula LAB recombinante. Em outra modalidade, apenas dois dos genes ldh são inativados ou deletados na primeira célula LAB recombinante. Em uma outra modalidade, pelo menos, três dos genes ldh são inativados ou deletados na primeira célula LAB recombinante. Em uma outra modalidade, apenas três dos genes ldh são inativados ou deletados na primeira célula LAB recombinante. Em uma outra modalidade, pelo menos, quatro dos genes ldh são inativados ou deletados na primeira célula LAB recombinante. Em uma outra modalidade, apenas quatro dos genes ldh são inativados ou deletados na primeira célula LAB recombinante. Por exemplo, na primeira célula LAB recombinante da presente invenção, os genes ldh1, ldh2, ldh3 e ldh4 são inativados ou deletados. Em uma outra modalidade, pelo menos, cinco dos genes ldh são inativados ou deletados na primeira célula LAB recombinante. Em uma outra modalidade, apenas cinco dos genes ldh são inativados ou deletados na primeira célula LAB recombinante. Por exemplo, na primeira célula LAB recombinante da presente invenção, os genes ldh1, ldh2, ldh3, ldh4 e dhic são inativados ou deletados. Em uma outra modalidade, pelo menos, seis dos genes ldh são inativados ou deletados na primeira célula LAB recombinante. Em uma outra modalidade, apenas seis dos genes ldh são inativados na primeira célula LAB recombinante. Em ainda outra modalidade, todos os genes ldh são inativados na primeira célula LAB recombinante.

[00049] Em algumas modalidades, pode ser vantajoso reduzir a atividade de manitol desidrogenase, tal como a atividade de manitol-1-fosfato 5- desidrogenase, na primeira célula LAB recombinante. Em tal modalidade, a primeira célula LAB recombinante pode ser geneticamente modificada para diminuir sua atividade de manitol-1-fosfato 5-desidrogenase. Conforme usado no contexto da presente invenção, a expressão "manitol-1-P 5-desidrogenase" refere-se a uma enzima da Classe E.C. 1.1.1.17 que é capaz de catalisar a conversão de manitol em frutose-6-fosfato. A primeira célula LAB recombinante pode, assim, ter um ou mais genes que codificam para uma proteína com atividade de manitol desidrogenase que é inativada (através de deleção parcial ou total do gene). Em bactérias, os genes mltd1 e mltd2 codificam proteínas com atividade manitol-1-P 5-desidrogenase. Em uma modalidade, pelo menos, um dos genes mltd1 e mtld2, seus ortólogos e parálogos correspondentes, está inativado na primeira célula LAB recombinante. Em uma modalidade, apenas um dos genes mltd1 e mtld2 é inativado na primeira célula LAB recombinante. Em outra modalidade, ambos os genes mltd1 e mtld2 são inativados na primeira célula LAB recombinante.

[00050] A primeira célula LAB recombinante expressa uma bacteriocina. Em algumas modalidades, a primeira célula LAB recombinante pode ter a capacidade intrínseca (por exemplo, uma capacidade que não é conferida pela introdução de uma molécula de ácido nucleico heteróloga) para expressar e produzir, pelo menos, uma bacteriocina (por exemplo, uma bacteriocina nativa, tal como, por exemplo, pelo menos um lantibiótico), além de ser imune à bacteriocina que a expressa. Em algumas modalidades, a primeira célula LAB recombinante pode ser geneticamente modificada para expressar e produzir uma ou mais bacteriocinas adicionais (que podem ser além daquela já expressa). Em tal modalidade, a primeira célula LAB recombinante incluirá uma ou mais segundas moléculas de ácido nucleico heterólogas que codificam a bacteriocina adicional e/ou os polipeptídeos associados à imunidade, à bacteriocina adicional. A sequência de codificação para a bacteriocina adicional e para os polipeptídeos associados à imunidade, à bacteriocina adicional pode ser fornecida nas mesmas ou segundas moléculas de ácido nucleico distintas. As segundas moléculas de ácido nucleico heterólogas podem ser integradas no genoma bacteriano ou ser replicadas independentemente a partir do genoma bacteriano.

[00051] Em outras modalidades, a primeira célula LAB recombinante também pode não ter a capacidade intrínseca de expressar uma ou mais bacteriocinas e pode ser geneticamente modificada para expressar e produzir uma ou mais bacteriocinas (por exemplo, uma bacteriocina recombinante). Em tal modalidade, a primeira célula LAB recombinante incluirá uma ou mais segundas moléculas de ácido nucleico heterólogas que codificam a bacteriocina recombinante. A sequência de codificação para a bacteriocina recombinante e para os polipeptídeos associados à imunidade, à bacteriocina recombinante pode ser fornecida nas mesmas ou em segundas moléculas de ácido nucleico distintas. Em algumas modalidades, a primeira célula LAB recombinante pode ser geneticamente modificada para expressar e produzir uma outra bacteriocina recombinante (além daquela já expressa). Em tal modalidade, a primeira célula LAB recombinante incluirá uma ou mais segundas moléculas de ácido nucleico heterólogas que codificam a bacteriocina recombinante adicional e/ou os polipeptídeos associados à imunidade, à bacteriocina recombinante adicional. A sequência de codificação para a bacteriocina recombinante adicional e para os polipeptídeos associados à imunidade, à bacteriocina recombinante adicional pode ser fornecida nas mesmas ou em segundas moléculas de ácido nucleico distintas. As segundas moléculas de ácido nucleico heterólogas podem ser integradas no genoma bacteriano ou ser replicadas independentemente do genoma bacteriano.

[00052] As bacteriocinas são conhecidas como uma Classe de peptídeos e polipeptídeos que exibem, conforme sua atividade biológica, propriedades antibacterianas. As bacteriocinas podem exibir atividade bacteriostática ou citotóxica. A bacteriocina pode ser fornecida como um polipeptídeo monomérico, um polipeptídeo dímero (homo- e heterodímeros), bem como, um polipeptídeo circular. Uma vez que a bacteriocina é geralmente expressa para ser exportada para fora da célula, ela geralmente é sintetizada como pró-polipeptídeos, incluindo uma sequência de sinal, sendo a última clivada após a secreção. A bacteriocina da presente invenção pode ser expressa usando sua sequência de sinal nativa ou uma sequência de sinal heteróloga. A bacteriocina da presente invenção pode ser expressa usando uma sequência de sinal que pode ser heteróloga à bacteriocina (tal como, por exemplo, a sequência de sinal usp45TM8 que pode ter, em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 145, ser uma variante ou um fragmento da mesma ou codificada pela sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 152 ou uma sequência degenerada relacionada). É conhecido na técnica que algumas bacteriocinas são modificadas após serem traduzidas para incluir aminoácidos incomuns (tais como lantionina, metilantionina, didesidroalanina e/ou ácido didesidroaminobutírico). As sequências de aminoácidos fornecidas aqui para as diferentes bacteriocinas não incluem tais modificações de pós-tradução, mas entende-se que uma primeira célula LAB recombinante expressando uma bacteriocina de uma segunda molécula de ácido nucleico pode produzir um polipeptídeo que não corresponde exatamente a sequência de aminoácidos das diferentes SEQ ID NOs, mas a bacteriocina exportada pode ser derivada de tais sequências de aminoácidos (por modificação de pós-tradução ou clivagem proteolítica da sequência de sinal).

[00053] Em algumas modalidades, a pelo menos uma bacteriocina compreende uma ou mais bacteriocinas de bactérias Gram-negativas. A bacteriocina de bactérias Gram-negativas que pode ser usada também ou em combinação com uma ou mais bacteriocinas adicionais. As bacteriocinas de bactérias Gram-negativas incluem, mas não são limitadas a microcinas, bacteriocinas similares à colicina e tailocinas. Em algumas modalidades, a pelo menos uma bacteriocina compreende uma ou mais bacteriocinas de bactérias Gram-positivas. A bacteriocina de bactérias Gram-positivas que pode ser usada também ou em combinação com uma ou mais bacteriocinas adicionais. Bacteriocinas de bactérias Gram-positivas incluem, mas não são limitadas a bacteriocinas de Classe I (tais como, por exemplo, nisina A e/ou nisina Z), bacteriocinas de Classe II, incluindo Classe IIa (tais como, por exemplo, plantaricina 423, pediocina, lactoccina A e/ou horediocina A) e IIb (tais como, por exemplo, brochocina, por exemplo) bacteriocinas, bacteriocinas de Classe III, bacteriocinas de Classe IV e bacteriocinas circulares (tais como, por exemplo, gassericina e/ou plantariciclina A). Bacteriocinas conhecidas incluem, mas não são limitadas à acidocina, actagardina, agrocina, alveicina, aureocina, aureocina A53, aureocina A70, bisina, carnocina, carnociclina, caseicina, cereína, circularina A, colicina, curvaticina, divercina, duramicina, enterocina, enterolisina, epidermina/galidermina, erwiniocina, gardimicina, gassericina A, glicinecina, halocina, haloduracina, clebicina, lactocina S, lactococina, lacticina, leucoccina, lisostapina, macedocina, mersacidina, mesentericina, microbisporicina, microcina S, mutacina, nisina A, nisina Z, paenibacilina, planosporicina, pediocina, pentocina, plantaricina, pneumociclina, piocina, reutericina 6, sakaci, salivaricina, sublancina, subtilina, sulfolobicina, tasmancina, turicina 17, trifolitoxina, variacina, vibriocina, warnericina e warnerin.

[00054] Em uma modalidade específica, a bacteriocina nativamente expressa pela primeira célula LAB recombinante ou codificada pela segunda molécula de ácido nucleico pode ser uma bacteriocina Gram-positiva de Classe I. A bacteriocina Gram-positiva de Classe I pode ser a única bacteriocina expressa na primeira célula LAB recombinante ou pode ser expressa com uma ou mais bacteriocinas adicionais. Por exemplo, a nisina pode ser a única bacteriocina produzida pela primeira célula LAB recombinante. Em outro exemplo, a nisina pode ser produzida em combinação com pediocina e brochocina na primeira célula LAB recombinante. Em algumas modalidades, a bacteriocina Gram-positiva de Classe I pode ser nisina A, nisina Z, nisina J (conforme descrito em O'Sullivan et al., 2020), nisina H (conforme descrito em O'Conner et al., 2015), nisina Q (conforme descrito em Fukao et al., 2008) e/ou nisina U (conforme descrito em Wirawan et al., 2006). A nisina é uma bacteriocina produzida nativamente por algumas cepas de Lactococcus lactis. A nisina é uma bacteriocina de espectro relativamente amplo, eficaz contra muitos organismos Gram-positivos e também contra esporos. Em uma modalidade, a nisina A tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9 (incluindo sua sequência de sinal nativa), é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de nisina A) ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de nisina A). Em uma modalidade, a nisina A tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10 (excluindo sua sequência de sinal nativa), é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de nisina A) ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de nisina A). Em uma modalidade, a nisina Z tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 (incluindo sua sequência de sinal nativa), é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de nisina Z) ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de nisina Z). Em algumas modalidades, a primeira célula de LAB recombinante pode incluir uma molécula de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) que compreende a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 53 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 7. Em uma modalidade, a nisina A tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 (excluindo sua sequência de sinal nativa), é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de nisina Z) ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de nisina Z). Em algumas modalidades, a primeira célula de LAB recombinante pode incluir uma molécula de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) que compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 54 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 8.

[00055] Em modalidades, em que a primeira célula LAB recombinante produz nisina como a bacteriocina, a primeira célula LAB recombinante pode possuir a maquinaria para produzir nisina ou pode ser geneticamente modificada para expressar a maquinaria para produzir nisina. Os polipeptídeos envolvidos na produção e/ou regulação da produção de nisina incluem, mas não são limitados a NisB, NisT, NisC, NisP, NisR e/ou NisK. O um ou mais polipeptídeos envolvidos na produção e/ou na regulação da produção de nisina podem estar localizados na mesma molécula ou em uma molécula de ácido nucleico distinta daquela que codifica a nisina.

[00056] Em modalidades, em que a primeira célula LAB recombinante produz nisina como a bacteriocina, a primeira célula LAB recombinante possui imunidade contra nisina ou pode ser geneticamente modificada para ganhar imunidade contra nisina. Um polipeptídeo conhecido por conferir imunidade ou resistência contra a nisina é o NisI. Em uma modalidade, NisI tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 (bem como, variantes funcionais e fragmentos das mesmas retendo, pelo menos em parte, sua capacidade de conferir imunidade contra nisina). Como tal, a primeira célula LAB recombinante pode compreender uma molécula de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) que codifica adicionalmente mais NisI. Em tal modalidade, a primeira célula LAB recombinante pode compreender a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 55, 56 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 11. Polipeptídeos adicionais envolvidos na concessão de imunidade contra a nisina incluem, sem limitação, NisE (que é um transportador de nisina), NisF (que é um transportador de nisina) e NisG (que é uma nisina permease). Como tal, a segunda molécula de ácido nucleico heteróloga pode codificar adicionalmente NisE, NisF e/ou NisG. Em uma modalidade, NisE tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 (bem como, variantes funcionais e fragmentos das mesmas retendo, pelo menos em parte, sua capacidade de transportar nisina). Em uma modalidade, a primeira célula LAB recombinante pode compreender uma molécula de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) tendo a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 59, 60 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 13. Em uma modalidade, NisF tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 (bem como, variantes funcionais e fragmentos das mesmas retendo, pelo menos em parte, sua capacidade de transportar nisina). Em tal modalidade, a primeira célula LAB recombinante pode compreender uma sequência de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) de SEQ ID NO: 57, 58 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 12. Em uma modalidade, NisG tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 (bem como, variantes funcionais e fragmentos das mesmas retendo, pelo menos em parte, sua capacidade de transportar nisina). Os um ou mais polipeptídeos envolvidos na imunidade conferida contra a nisina podem estar localizados na mesma molécula ou em uma molécula de ácido nucleico distinta como aquela que codifica a nisina e/ou os popilipeptídeos envolvidos na produção e/ou regulação da produção de nisina. Em uma modalidade, a primeira célula LAB recombinante pode compreender uma molécula de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) com a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 61, 62 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 14.

[00057] Em uma modalidade específica, a bacteriocina nativamente expressa pela primeira célula LAB recombinante ou codificada pela segunda molécula de ácido nucleico heteróloga pode ser uma bacteriocina Gram-positiva de Classe II. A bacteriocina Gram-positiva de Classe II pode ser a única bacteriocina expressa na primeira célula LAB recombinante ou pode ser expressa com uma ou mais bacteriocinas adicionais. As bacteriocinas Grampositivas de Classe II incluem dois subgrupos: bacteriocinas de Classe IIA e Classe IIB. Em um exemplo específico, a bacteriocina Gram-positiva de Classe IIA pode ser, sem limitação, pediocina (também referida como o polipeptídeo PedA), lactoccina A e horedicina A.

[00058] Em uma modalidade, a pediocina tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20 (incluindo sua sequência de sinal nativa), é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de pediocina) ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de pediocina). Em uma modalidade, a primeira célula LAB recombinante pode compreender uma molécula de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) com a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 72, 73 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 20. Em uma modalidade, a pediocina tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21 (excluindo sua sequência de sinal nativa), é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de pediocina) ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de pediocina). Em uma modalidade, a pediocina tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 51 (incluindo sua sequência de sinal nativa), é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 51 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de pediocina) ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de pediocina). Em uma modalidade, a primeira célula LAB recombinante pode compreender uma molécula de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) com a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 141, 142 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 51. Em uma modalidade, a pediocina tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 52 (excluindo sua sequência de sinal nativa), é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 52 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de pediocina) ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de pediocina). Em uma modalidade, a pediocina tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 75 (incluindo uma sequência de sinal heteróloga), é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 75 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de pediocina) ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 75 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de pediocina). Em uma modalidade, a primeira célula LAB recombinante pode compreender uma molécula de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) com a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 74 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 75. Em uma modalidade, a pediocina tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 144 (incluindo uma sequência de sinal heteróloga), é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 144 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de pediocina) ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 144 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de pediocina). Em uma modalidade, a primeira célula LAB recombinante pode compreender uma molécula de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) com a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 143 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 144.

[00059] Em modalidades em que a primeira célula LAB recombinante produz pediocina como a bacteriocina, a primeira célula LAB recombinante pode possuir a maquinaria para fazer e regular a produção de pediocina ou pode ser geneticamente modificada para expressar a maquinaria para fazer e regular a produção de pediocina. Um dos polipeptídeos envolvidos na produção e regulação da produção de pediocina é o PedC, um fator transportador de ABC acessório para pediocina. Em uma modalidade, PedC tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 146, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 146 (tendo, na presença de PedD, atividade transportadora de pediocina acessória) ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 146 (tendo, na presença de PedD, atividade transportadora de pediocina acessória). Em uma modalidade, a primeira célula LAB recombinante pode compreender uma molécula de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) com a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 147, 148 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 146. Outro polipeptídeo envolvido na produção e a regulação da produção de pediocina é o PedD, um transportador de pediocina. Em uma modalidade, PedD tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 149, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 149 (tendo atividade transportadora de pediocina) ou é um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 149 (tendo atividade transportadora de pediocina). Em uma modalidade, a primeira célula LAB recombinante pode compreender uma molécula de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) com a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 150, 151 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 149.

[00060] Em modalidades, em que a primeira célula LAB recombinante produz pediocina como a bacteriocina, a primeira célula LAB recombinante pode possuir imunidade contra pediocina ou pode ser geneticamente modificada para ganhar imunidade contra pediocina. Um polipeptídeo conhecido por conferir imunidade ou resistência contra a pediocina é o PedB. Em uma modalidade, PedB tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 (bem como variantes funcionais e fragmentos das mesmas retendo, pelo menos em parte, sua capacidade de conferir imunidade contra pediocina). Em uma modalidade, a primeira célula LAB recombinante pode compreender uma molécula de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) com a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 76, 77 ou 78 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 22. Como tal, a primeira célula LAB recombinante pode expressar PedB ou ser geneticamente modificada para expressar PedB. Em algumas modalidades, a segunda molécula de ácido nucleico heteróloga pode codificar adicionalmente PedB (que pode estar presente na mesma molécula de ácido nucleico que codifica pediocina ou uma distinta).

[00061] Em uma modalidade, a lactoccina A tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 40 (incluindo sua sequência de sinal nativa), é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 40 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de lactoccina A) ou é um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 40 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de lactoccina A). Em uma modalidade, a primeira célula LAB recombinante pode compreender uma molécula de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) com a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 121 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 40. Em uma modalidade, a lactoccina A tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41 (excluindo sua sequência de sinal nativa), é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de lactoccina A) ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de lactoccina A).

[00062] Em modalidades, em que a primeira célula LAB recombinante produz lactoccina A como a bacteriocina, a primeira célula LAB recombinante pode possuir a maquinaria para produzir e regular a produção de lactoccina A ou pode ser geneticamente modificada para expressar a maquinaria para produzir e regular a produção de lactoccina A. Os polipeptídeos envolvidos na produção e regulação da produção de lactoccina A incluem LcmA (que está envolvido na exportação e no processamento de lactoccina A) e LceA (que é uma proteína de ligação ATP). Em uma modalidade, LcmA tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 (tendo o processamento de lactoccina A e atividade transportadora) ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 (com processamento de lactoccina A e atividade transportadora). Em uma modalidade, a primeira célula LAB recombinante pode compreender uma molécula de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) tendo a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 124 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 43. Em uma modalidade, LceA tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 44, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4 (com atividade de ligação ATP) ou é um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 44 (com atividade de ligação ATP). Em uma modalidade, a primeira célula LAB recombinante pode compreender uma molécula de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) com a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 125 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 44.

[00063] Em modalidades, em que a primeira célula LAB recombinante produz lactoccina A como a bacteriocina, a primeira célula LAB recombinante pode possuir imunidade contra lactoccina A ou pode ser geneticamente modificada para ganhar imunidade contra lactoccina A. Um polipeptídeo conhecido por conferir imunidade ou resistência contra pediocina é LciA. Em uma modalidade, LciA tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 (bem como, variantes funcionais e fragmentos das mesmas retendo, pelo menos em parte, sua capacidade de conferir imunidade contra lactoccina A). Em uma modalidade, a primeira célula LAB recombinante pode compreender uma molécula de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) com a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 122, 123 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 42. Como tal, a primeira célula LAB recombinante pode expressar LciA ou ser geneticamente modificada para expressar LciA. Em algumas modalidades, a segunda molécula de ácido nucleico heteróloga pode codificar adicionalmente LciA (que pode estar presente na mesma molécula de ácido nucleico que codifica lactoccina A ou uma distinta).

[00064] Em uma modalidade, a horediocina A tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 45 (incluindo sua sequência de sinal nativa), é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 45 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de horediocina A) ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de horediocina A). Em uma modalidade, a primeira célula LAB recombinante pode compreender uma molécula de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) com a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 126, 127 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 45. Em uma modalidade, a horediocina A tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 46 (excluindo sua sequência de sinal nativa), é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 46 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de horediocina A) ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de horediocina A). Em uma modalidade, a horediocina A tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 129 (incluindo uma sequência de sinal de pediocina), é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 129 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de horediocina A) ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 129 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de horediocina A). Em uma modalidade, a primeira célula LAB recombinante pode compreender uma molécula de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) com a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 128 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 129. Em uma modalidade, a horediocina A tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 131 (incluindo uma sequência de sinal heteróloga), é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 131 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de horediocina A) ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 131 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de horediocina A). Em uma modalidade, a primeira célula LAB recombinante pode compreender uma molécula de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) com a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 130 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 131.

[00065] Em modalidades em que a primeira célula LAB recombinante produz horediocina A como a bacteriocina, a primeira célula LAB recombinante pode possuir a maquinaria para fazer e regular a produção de horediocina A ou pode ser geneticamente modificada para expressar a maquinaria para fazer e regular a produção de horediocina A. Os polipeptídeos envolvidos na produção e regulação da produção de horediocina A incluem HdrM (que está envolvido no processamento de horediocina A), HdrD (que está envolvido na clivagem e no transporte de horediocina A) e HdrC (que está envolvido no transporte de horediocina A). Em uma modalidade, HdrM tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48 (tendo atividade de dissulfeto isomerase de horediocina A) ou é um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48 (com atividade de dissulfeto isomerase de horediocina A). Em uma modalidade, a primeira célula LAB recombinante pode compreender uma molécula de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) com a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 135, 136 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 48. Em uma modalidade, HdrD tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49 (tendo atividade de clivagem e transportadora de horediocina A) ou é um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49 (tendo atividade de clivagem e transportadora de horediocina A). Em uma modalidade, a primeira célula LAB recombinante pode compreender uma molécula de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) com a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 137, 138 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 49. Em uma modalidade, HdrC tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 50, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 50 (tendo, na presença de HdrD, atividade transportadora de horediocina A acessória) ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 (tendo, na presença de HdrD, atividade transportadora de horediocina A acessória). Em uma modalidade, a primeira célula LAB recombinante pode compreender uma molécula de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) com a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 139, 140 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 50.

[00066] Em modalidades em que a primeira célula LAB recombinante produz horediocina A como a bacteriocina, a primeira célula LAB recombinante pode possuir imunidade contra horediocina A ou pode ser geneticamente modificada para ganhar imunidade contra horediocina A. Um polipeptídeo conhecido por conferir imunidade ou resistência contra pediocina é HdrI. Em uma modalidade, HdrI tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 (bem como, variantes funcionais e fragmentos das mesmas retendo, pelo menos em parte, sua capacidade de conferir imunidade contra horediocina A). Em uma modalidade, a primeira célula LAB recombinante pode compreender uma molécula de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) com a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 132, 133, 134 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 47. Como tal, a primeira célula LAB recombinante pode expressar HdrI ou ser geneticamente modificada para expressar HdrI. Em algumas modalidades, a segunda molécula de ácido nucleico heteróloga pode codificar adicionalmente HdrI (que pode estar presente na mesma molécula de ácido nucleico que codifica horediocina A ou uma distinta).

[00067] Em um exemplo específico, a bacteriocina Gram-positiva de Classe IIB pode ser, sem limitação, broncocina. Brochocina é um heterodímero que compreende um polipeptídeo BrcA e um polipeptídeo BrcB. Em uma modalidade, BrcA tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 (incluindo a sequência de sinal de pediocina), é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de broncocina ao formar um heterodímero com BrcB) ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de broncocina ao formar um heterodímero com BrcB). Em uma modalidade, a primeira célula LAB recombinante pode compreender uma molécula de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) tendo a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 79 ou 80 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 23. Em uma modalidade, BrcA tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24 (excluindo sua sequência de sinal nativa), é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de broncocina ao formar um heterodímero com BrcB) ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de broncocina ao formar um heterodímero com BrcB). Em uma modalidade, BrcA tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 82 (incluindo uma sequência de sinal de pediocina), é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 82 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de broncocina ao formar um heterodímero com BrcB) ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 82 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de broncocina ao formar um heterodímero com BrcB). Em uma modalidade, a primeira célula LAB recombinante pode compreender uma molécula de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) tendo a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 81 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 82. Em uma modalidade, BrcA tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 84 (incluindo uma sequência de sinal heteróloga), é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 84 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de broncocina ao formar um heterodímero com BrcB) ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 84 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de broncocina ao formar um heterodímero com BrcB). Em uma modalidade, a primeira célula LAB recombinante pode compreender uma molécula de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) com a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 83 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 84.

[00068] Em uma modalidade, BrcB tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 (incluindo a sequência de sinal de pediocina), é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de broncocina ao formar um heterodímero com BrcA) ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de broncocina ao formar um heterodímero com BrcA). Em uma modalidade, a primeira célula LAB recombinante pode compreender uma molécula de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) tendo a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 85 ou 86 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 25. Em uma modalidade, BrcB tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26 (excluindo sua sequência de sinal nativa), é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de broncocina ao formar um heterodímero com BrcA) ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de broncocina ao formar um heterodímero com BrcA). Em uma modalidade, BrcB tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 88 (incluindo a sequência de sinal de pediocina), é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 88 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de broncocina ao formar um heterodímero com BrcA) ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 88 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de broncocina ao formar um heterodímero com BrcA). Em uma modalidade, a primeira célula LAB recombinante pode compreender uma molécula de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) tendo a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 87 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 88. Em uma modalidade, BrcB tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 90 (incluindo uma sequência de sinal heteróloga), é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 90 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de broncocina ao formar um heterodímero com BrcA) ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 90 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de broncocina ao formar um heterodímero com BrcA). Em uma modalidade, a primeira célula LAB recombinante pode compreender uma molécula de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) com a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 89 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 90.

[00069] Em modalidades em que a primeira célula LAB recombinante produz brochocina como a bacteriocina, a primeira célula LAB recombinante pode possuir a maquinaria para produzir ou regular a produção de brochocina ou pode ser geneticamente modificada para expressar a maquinaria para produzir ou regular a produção de broncocina.

[00070] Em modalidades em que a primeira célula LAB recombinante produz brochocina como a bacteriocina, a primeira célula LAB recombinante pode possuir imunidade contra a brochocina ou pode ser geneticamente modificada para ganhar imunidade contra brochocina. Um polipeptídeo conhecido por conferir imunidade ou resistência contra a pediocina é o BrcI. Em uma modalidade, BrcI tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 (bem como, variantes funcionais e fragmentos das mesmas retendo, pelo menos em parte, sua capacidade de conferir imunidade contra brochocina). Em uma modalidade, a primeira célula LAB recombinante pode compreender uma molécula de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) com a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 91, 92 ou 93 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 27. Como tal, a primeira célula LAB recombinante pode expressar BrcI ou ser geneticamente modificada para expressar BrcI. Em algumas modalidades, a segunda molécula de ácido nucleico heteróloga pode codificar adicionalmenter BrcI (que pode estar presente na mesma molécula de ácido nucleico que codifica BrcA/BrcB ou uma distinta).

[00071] Em um exemplo específico, a bacteriocina de Classe IIA pode ser plantaricina 423. Em uma modalidade, plantaricina 423 tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 (incluindo sua sequência de sinal nativa), é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de plantaricina 423) ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de plantaricina 423). Em uma modalidade, a primeira célula LAB recombinante pode compreender uma molécula de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) com a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 108, 109 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 35. Em uma modalidade, a plantariciclina A tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36 (excluindo sua sequência de sinal nativa), é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de plantariciclina A) ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de plantariciclina A). Em tal modalidade, a primeira célula LAB recombinante inclui plantariciclina A que pode ser expressa a partir da segunda molécula de ácido nucleico heteróloga. Em uma modalidade, a plantaricina 423 tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 111 (incluindo uma sequência de sinal de pediocina), é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 111 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de plantaricina 423) ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 111 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de plantaricina 423). Em uma modalidade, a primeira célula LAB recombinante pode compreender uma molécula de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) com a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 110 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 111. Em uma modalidade, a plantaricina 423 tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 113 (incluindo uma sequência de sinal heteróloga), é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 113 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de plantaricina 423) ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 113 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de plantaricina 423). Em uma modalidade, a primeira célula LAB recombinante pode compreender uma molécula de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) com a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 112 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 113.

[00072] Em modalidades em que a primeira célula LAB recombinante produz plantaricina 423 como a bacteriocina, a primeira célula LAB recombinante pode possuir a maquinaria para produzir ou regular a produção de plantaricina 423 ou pode ser geneticamente modificada para expressar a maquinaria para produzir ou regular a produção de plantaricina 423. Os polipeptídeos envolvidos na maquinaria para a produção de plantariciclina A incluem, sem limitações, PlaC (que é uma proteína de plantaricina 423 acessória) e PlaD (que é um transportador de plantaricina 423 ABC). Como tal, a segunda molécula de ácido nucleico heteróloga pode codificar adicionalmente PlaC e/ou PlaD (que podem estar na mesma molécula ou em uma molécula de ácido nucleico diferente daquela que codifica plantaricina 423). Em uma modalidade, PlaC tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38 (bem como, variantes funcionais e fragmentos das mesmas). Em uma modalidade, a primeira célula LAB recombinante pode compreender uma molécula de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) com a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 117, 118 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 38. Em uma modalidade, PlaD tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 (bem como, variantes funcionais e fragmentos das mesmas retendo, pelo menos em parte, sua capacidade de transportar plantaricina 423). Em uma modalidade, a primeira célula LAB recombinante pode compreender uma molécula de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) com a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 119, 120 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 39.

[00073] Em modalidades em que a primeira célula LAB recombinante produz plantaricina 423 como a bacteriocina, a primeira célula LAB recombinante pode possuir imunidade contra plantaricina 423 ou pode ser geneticamente modificada para ganhar imunidade contra plantaricina 423. Um polipeptídeo conhecido por conferir imunidade ou resistência contra plantariciclina A é PlaB. Em uma modalidade, PlaB tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 (bem como, variantes funcionais e fragmentos das mesmas retendo, pelo menos em parte, sua capacidade de conferir imunidade contra plantaricina 423). Em uma modalidade, a primeira célula LAB recombinante pode compreender uma molécula de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) com a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 114, 115, 116 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 37. Como tal, a segunda molécula de ácido nucleico heteróloga pode codificar adicionalmente PlaB (que pode estar na mesma molécula ou em uma molécula de ácido nucleico diferente daquela que codifica plantaricina 423, PlaC e/ou PlaD).

[00074] Em modalidades em que a pelo menos, uma bacteriocina compreende uma bacteriocina de Classe IIA ou Classe IIB, é possível projetar a primeira célula LAB recombinante para usar seu sistema secretor nativo para exportar a bacteriocina para fora da célula. Em tais modalidades, pode ser útil incluir uma sequência de sinal heteróloga (em quadro com o quadro de leitura aberto que codifica a bacteriocina) que é reconhecida pelo sistema secretor nativo da primeira célula LAB recombinante. Em uma modalidade, esta sequência de sinal heteróloga pode ser a sequência de sinal usp45TM8. Em algumas modalidades específicas, a sequência de sinal usp45TM8 pode ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 145, ser uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 145 (com atividade de sequência de sinal) ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 145 (tendo atividade de sequência de sinal). Em uma outra modalidade, a segunda molécula de ácido nucleico pode compreender a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 152 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 145.

[00075] Em um exemplo específico, a bacteriocina cíclica Grampositiva pode ser gasserina. Em uma modalidade, a gasserina tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15 (incluindo sua sequência de sinal nativa), é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de gasserina) ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de gasserina). Em uma modalidade, a primeira célula LAB recombinante pode compreender uma molécula de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) com a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 63, 64 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 15. Em uma modalidade, a gasserina tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16 (excluindo sua sequência de sinal nativa), é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de gasserina) ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de gasserina). Em tal modalidade, a primeira célula LAB recombinante inclui gasserina que pode ser expressa a partir da segunda molécula de ácido nucleico heteróloga.

[00076] Em modalidades em que a primeira célula LAB recombinante produz gasserina como a bacteriocina, a primeira célula LAB recombinante pode possuir a maquinaria para fazer ou regular a produção de gasserina ou pode ser geneticamente modificada para expressar a maquinaria para fazer ou regular a produção de gasserina. Os polipeptídeos envolvidos na maquinaria para fazer gasserina incluem, sem limitações, GaaT (que é um transportador de gasserina) e GaaE (que é uma gasserina permease). Como tal, a segunda molécula de ácido nucleico heteróloga pode codificar adicionalmente GaaT e/ou GaaE (que podem estar na mesma molécula ou em uma molécula de ácido nucleico diferente daquela que codifica gasserina). Em uma modalidade, GaaT tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 (bem como, variantes funcionais e fragmentos das mesmas retendo, pelo menos em parte, sua capacidade de transportar gasserina). Em uma modalidade, a primeira célula LAB recombinante pode compreender uma molécula de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) com a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 68, 69 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 18. Em uma modalidade, GaaE tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 (bem como, variantes funcionais e fragmentos das mesmas retendo, pelo menos em parte, sua capacidade de transportar gasserina). Em uma modalidade, a primeira célula LAB recombinante pode compreender uma molécula de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) com a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 70, 71 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 19.

[00077] Em modalidades, em que a primeira célula LAB recombinante produz gasserina como a bacteriocina, a primeira célula LAB recombinante pode possuir imunidade contra gasserina ou pode ser geneticamente modificada para ganhar imunidade contra gasserina. Um polipeptídeo conhecido por conferir imunidade ou resistência contra a gasserina é GaaI. Em uma modalidade, GaaI tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 (bem como, variantes funcionais e fragmentos das mesmas retendo, pelo menos em parte, sua capacidade de conferir imunidade contra gasserina). Em uma modalidade, a primeira célula LAB recombinante pode compreender uma molécula de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) com a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 65, 66, 67 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 17. Como tal, a segunda molécula de ácido nucleico heteróloga pode codificar adicionalmente GaaI (que pode estar na mesma molécula ou em uma molécula de ácido nucleico diferente daquela que codifica gasserina, GaaT ou GaaE).

[00078] Em um exemplo específico, a bacteriocina cíclica Grampositiva pode ser gasserina. Em uma modalidade, a gasserina tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15 (incluindo sua sequência de sinal nativa), é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de gasserina) ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de gasserina). Em uma modalidade, a primeira célula LAB recombinante pode compreender uma molécula de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) com a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 63, 64 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 15. Em uma modalidade, a gasserina tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16 (excluindo sua sequência de sinal nativa), é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de gasserina) ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de gasserina). Em tal modalidade, a primeira célula LAB recombinante inclui gasserina que pode ser expressa a partir da segunda molécula de ácido nucleico heteróloga.

[00079] Em um exemplo específico, a bacteriocina cíclica Grampositiva pode ser plantariciclina A. Em uma modalidade, plantariciclina A tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 (incluindo sua sequência de sinal nativa), é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de plantariciclina A) ou é um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de plantariciclina A). Em uma modalidade, a primeira célula LAB recombinante pode compreender uma molécula de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) com a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 94, 95 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 28. Em uma modalidade, a plantariciclina A tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29 (excluindo sua sequência de sinal nativa), é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de plantariciclina A) ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 (retendo, pelo menos em parte, a atividade biológica de plantariciclina A). Em tal modalidade, a primeira célula LAB recombinante inclui plantariciclina A que pode ser expressa a partir da segunda molécula de ácido nucleico heteróloga.

[00080] Em modalidades em que a primeira célula LAB recombinante produz plantariciclina A como a bacteriocina, a primeira célula LAB recombinante pode possuir a maquinaria para produzir ou regular a produção de plantariciclina A ou pode ser geneticamente modificada para expressar a maquinaria para produzir ou regular a produção de plantariciclina A. Os polipeptídeos envolvidos na maquinaria para a produção de plantariciclina A incluem, sem limitações, PlcT (que é uma proteína de ligação ATP), PlcE (que é um transportador de plantariciclina A) e PlcB (que é uma proteína relacionada à plantariciclina A). Como tal, a segunda molécula de ácido nucleico heteróloga pode codificar adicionalmente PlcT, PlcE e/ou PlcB (que podem estar na mesma molécula ou em uma molécula de ácido nucleico diferente daquela que codifica a plantariciclina A). Em uma modalidade, PlcT tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 (bem como, variantes funcionais e fragmentos das mesmas retendo, pelo menos em parte, sua capacidade de se ligar a ATP). Em uma modalidade, a primeira célula LAB recombinante pode compreender uma molécula de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) com a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 102, 103 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 32. Em uma modalidade, PlcE tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 (bem como, variantes funcionais e fragmentos das mesmas retendo, pelo menos em parte, sua capacidade de transportar plantariciclina A). Em uma modalidade, a primeira célula LAB recombinante pode compreender uma molécula de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) com a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 104, 105 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 33. Em uma modalidade, PlcB tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 (bem como, variantes funcionais e fragmentos das mesmas). Em uma modalidade, a primeira célula LAB recombinante pode compreender uma molécula de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) com a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 106, 107 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 34.

[00081] Em modalidades em que a primeira célula LAB recombinante produz plantariciclina A como a bacteriocina, a primeira célula LAB recombinante pode possuir imunidade contra plantariciclina A ou pode ser geneticamente modificada para ganhar imunidade contra plantariciclina A. Os polipeptídeos conhecidos por conferir imunidade ou resistência contra plantariciclina A são PlcD e PlcI. Em uma modalidade, PlcD tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 (bem como, variantes funcionais e fragmentos das mesmas retendo, pelo menos em parte, sua capacidade de conferir imunidade, na presença de PlcI, contra plantariciclina A). Em uma modalidade, a primeira célula LAB recombinante pode compreender uma molécula de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) com a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 96, 97, 98 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 30. Em uma modalidade, PlcI tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 (bem como, variantes funcionais e fragmentos das mesmas retendo, pelo menos em parte, sua capacidade de conferir imunidade, na presença de PlcD, contra plantariciclina A). Em uma modalidade, a primeira célula LAB recombinante pode compreender uma molécula de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) com a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 99, 100, 101 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 30. Como tal, a segunda molécula de ácido nucleico heteróloga pode codificar adicionalmente PlcD e/ou PlcI (que podem estar na mesma molécula ou em uma molécula de ácido nucleico diferente daquela que codifica a plantariciclina A, PlcT, PlcE e/ou PlcB).

[00082] Em algumas modalidades, uma população de primeiras células LAB recombinantes é usada na cocultura. A população das primeiras células LAB recombinantes pode expressar as mesmas ou diferentes bacteriocinas (ou combinações de bacteriocinas).

Segunda célula bacteriana de ácido láctico recombinante (LAB)

[00083] No contexto da presente invenção, a segunda célula bacteriana da cocultura é uma bactéria de ácido láctico (LAB). A segunda célula LAB recombinante pode ser fornecida como uma cultura pura durante a fermentação ou como uma mistura com a primeira célula LAB recombinante. Como é conhecido na técnica, as LAB são um grupo de bactérias Grampositivas, coccus ou bastonetes que não respiram e não formam esporos, que produzem ácido láctico como o principal produto final da fermentação de carboidratos. O gênero bacteriano de LAB inclui, mas não está limitado a Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus, Streptococcus, Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Sporolactobacillus, Tetragenococcus, Vagococcus e Weissella. Espécies bacterianas de LAB incluem, mas não são limitadas a Lactococcus lactis, Lactococcus garviae, Lactococcus raffinolactis, Lactococcus plantarum, Oenococcus oeni, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus acidilactici, Carnococcus allantoicus, Carnobacterium gallinarum, Vagococcus fessus, Streptococcus thermophilus, Enterococcus phoeniculicola, Enterococcus plantarum, Enterococcus raffinosus, Enterococcus avium, Enterococcus pallens, Enterococcus hermanniensis, Enterococcus faecalis, e Enterococcus faecium. Em uma modalidade, a LAB é um Lactobacillus e, em alguma modalidade adicional, a espécie Lactobacillus é L. acetotolerans, L. acidifarinae, L. acidipiscis, L. acidophilus, L. agilis, L. algidus, L. alimentarius, L. amylolyticus, L. amylophilus, L. amylotrophicus, L. amylovorus, L. animalis, L. antri, L. apodemi, L. aviarius, L. bifermentans, L. brevis, L. buchneri, L. camelliae, L. casei, L. catenaformis, L. ceti, L. coleohominis, L. collinoides, L. composti, L. concavus, L. coryniformis, L. crispatus, L. crustorum, L. curvatus, L. delbrueckii (incluindo L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. delbrueckii subsp. delbrueckii, L. delbrueckii subsp. lactis), L. dextrinicus, L. diolivorans, L. equi, L. equigenerosi, L. farraginis, L. farciminis, L. fermentum, L. fornicalis, L. fructivorans, L. frumenti, L. fuchuensis, L. gallinarum, L. gasseri, L. gastricus, L. ghanensis, L. graminis, L. ammesii, L. hamsteri, L. harbinensis, L. hayakitensis, L. helveticus , L. hilgardii, L. omohiochii, L. iners, L. ingluviei, L. intestinalis, L. jensenii, L. johnsonii, L. kalixensis, L. efiranofaciens, L. kefiri, L. kimchii, L. kitasatonis, L. kunkeei, L. leichmannii, L. lindneri, L. alefermentans, L. mali, L. manihotivorans, L. mindensis, L. mucosae, L. murinus, L. nagelii, L. namurensis, L. nantensis, L. oligofermentans, L. oris, L. panis, L. pantheris, L. parabrevis, L. parabuchneri, L. paracasei, L. paracollinoides, L. parafarraginis, L. parakefiri, L. aralimentarius, L. paraplantarum, L. pentosus, L. perolens, L. plantarum, L. pontis, L. protectus, L. psittaci, L. rennini, L. reuteri, L. rhamnosus, L. rimae, L. rogosae, L. rossiae, L. ruminis, L. saerimneri, L. sakei, L. salivarius, L. sanfranciscensis, L. satsumensis, L. secaliphilus, L. sharpeae, L. siliginis, L. spicheri, L. suebicus, L. thailandensis, L. ultunensis, L. vacinostercus, L. vaginalis, L. versmoldensis, L. vini, L. vitulinus, L. zeae ou L. zymae. Em algumas modalidades, a segunda célula LAB recombinante é L. paracasei e em algumas modalidades, L. paracasei 12A. Por exemplo, a segunda célula LAB recombinante pode ser uma das descritas no documento WO 2018/013791.

[00084] A segunda célula LAB recombinante é uma célula LAB recombinante porque compreende uma terceira molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica um polipeptídeo para converter, pelo menos em parte, uma biomassa (tal como milho, por exemplo) em um produto fermentado. Em algumas modalidades, mais de uma terceira molécula de ácido nucleico heteróloga pode ser fornecida para codificar uma pluralidade de polipeptídeos para converter, pelo menos em parte, uma biomassa (tal como milho, por exemplo) em um produto fermentado. Em tais modalidades, cada terceira molécula de ácido nucleico heteróloga pode incluir uma ou mais sequências de codificação correspondentes a um ou mais polipeptídeos. Em outra modalidade, uma única terceira molécula de ácido nucleico heteróloga pode codificar um ou mais polipeptídeos.

[00085] A segunda célula LAB recombinante é uma célula LAB geneticamente modificada que inclui uma ou mais moléculas de ácido nucleico heterólogas (referida como uma ou mais terceiras moléculas de ácido nucleico heterólogas) que codificam um ou mais polipeptídeos para converter, pelo menos em parte, uma biomassa em um produto de fermentação. Em uma modalidade, uma ou mais terceiras moléculas de ácido nucleico heterólogas codificam uma piruvato descarboxilase e/ou uma álcool desidrogenase. Quando a segunda célula LAB recombinante tem uma capacidade intrínseca de expressar uma piruvato descarboxilase, a terceira molécula de ácido nucleico heteróloga pode codificar uma álcool desidrogenase heteróloga. Em tal modalidade, é possível que a terceira molécula de ácido nucleico heteróloga codifique adicionalmente uma piruvato descarboxilase heteróloga ou que uma terceira molécula de ácido nucleico heteróloga adicional seja fornecida e codifique a piruvato descarboxilase heteróloga (para aumentar a atividade geral da piruvato descarboxilase da segunda célula LAB recombinante). Quando a segunda célula LAB recombinante tem uma capacidade intrínseca de expressar uma álcool desidrogenase, a terceira molécula de ácido nucleico heteróloga pode codificar uma piruvato descarboxilase. Em tal modalidade, é possível que a terceira molécula de ácido nucleico heteróloga codifique adicionalmente uma álcool desidrogenase heteróloga ou que uma terceira molécula de ácido nucleico heteróloga codifique adicionalmente a álcool desidrogenase heteróloga (para aumentar a atividade geral da álcool desidrogenase da segunda célula LAB recombinante). Se a segunda LAB recombinante não tem uma capacidade intrínseca de expressar uma piruvato descarboxilase e uma álcool desidrogenase, a terceira molécula de ácido nucleico heteróloga pode codificar uma álcool desidrogenase e uma piruvato descarboxilase (na mesma ou em diferentes molcules). A terceira molécula de ácido nucleico heteróloga pode ser integrada no genoma bacteriano ou se replicar independentemente a partir do genoma bacteriano. As sequências de ácido nucleico que codificam a piruvato descarboxilase e a álcool desidrogenase podem estar na mesma molécula ou em moléculas de ácido nucleico distintas.

[00086] Tal como aqui utilizado, o termo "piruvato descarboxilase" refere-se a uma enzima que catalisa a descarboxilação do ácido pirúvico em acetaldeído e dióxido de carbono. Em Zymonas mobilis, o gene da piruvato descarboxilase é referido como PDC (Gene ID: 33073732) e pode ser usado na segunda célula LAB recombinante da presente invenção. Em algumas modalidades adicionais, o polipeptídeo de piruvato descarboxilase pode ser de Lactobacillus florum (Número de Acesso WP_009166425.1), Lactobacillus fructivorans (Número de Acesso WP_039145143.1), Lactobacillus lindneri (Número de Acesso WP_065866149.1), Lactococcus lactis (Número de Acesso WP_104141789.1), Carnobacterium gallinarum (Número de Acesso WP_034563038.1), Enterococcus plantarum (Número de Acesso WP_069654378.1), Clostridium acetobutylicum (Número de Acesso NP_149189.1), Bacillus megaterium (Número de Acesso WP_075420723.1) ou Bacillus thuringiensis (Número de Acesso WP_052587756.1). Na segunda célula LAB recombinante da presente invenção, a piruvato descarboxilase pode ter o aminoácido da SEQ ID NO: 1, ser uma variante da SEQ ID NO: 1 (com atividade da piruvato carboxilase) ou ser um fragmento da SEQ ID NO: 1 tendo atividade de piruvato carboxilase). Em algumas modalidades específicas, a segunda célula LAB recombinante da presente invenção pode expressar uma molécula de ácido nucleico heteróloga que compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2, 5 ou 153, uma variante da mesma (que codifica um polipeptídeo com atividade de piruvato carboxilase) ou um fragmento da mesma (que codifica um polipeptídeo com atividade de piruvato carboxilase). Em uma modalidade adicional, o terceiro ácido nucleico heterólogo compreende uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2, 5 ou 153 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 1.

[00087] Em uma modalidade, a segunda célula LAB recombinante compreende uma modificação genética adicional que permite a expressão de uma álcool desidrogenase heteróloga. Em algumas modalidades, a segunda célula LAB recombinante compreende uma modificação genética adicional que permite a expressão de uma piruvato carboxilase heteróloga e uma álcool desidrogenase heteróloga. Conforme usado aqui, o termo "álcool desidrogenase" refere-se a uma enzima da Classe EC 1.1.1.1. Em algumas modalidades, a álcool desidrogenase é uma álcool desidrogenase contendo ferro. A álcool desidrogenase que pode ser expressa na célula hospedeira bacteriana inclui, mas não está limitada a ADH4 de Saccharomyces cerevisiae, ADHB de Zymonas mobilis, FUCO de Escherichia coli, ADHE de Escherichia coli, ADH1 de Clostridium acetobutylicum, ADH1 de Entamoeba nuttalli, BDHA de Clostridium acetobutylicum, BDHB de Clostridium acetobutylicum, 4HBD de Clostridium kluyveri, DHAT de Citrobacter freundii ou DHAT de Klebsiella pneumoniae. Em uma modalidade, a álcool desidrogenase pode ser ADHB de Zymonas mobilis (Gene ID: AHJ71151.1), Lactobacillus reuteri (Número de Acesso: KRK51011.1), Lactobacillus mucosae (Número de Acesso WP_048345394.1), Lactobacillus brevis (Número de Acesso WP_003553163.1) ou Streptococcus thermophiles (Número de Acesso WP_113870363.1). Na segunda célula LAB recombinante da presente invenção, a álcool desidrogenase pode ter o aminoácido de SEQ ID NO: 3, ser uma variante de SEQ ID NO: 3 (com atividade de álcool desidrogenase) ou um fragmento de SEQ ID NO: 3 (com atividade de álcool desidrogenase). Em algumas modalidades específicas, a segunda célula LAB recombinante da presente invenção pode expressar uma molécula de ácido nucleico heteróloga que compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 4, 6 ou 154, ser uma variante da sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 4, 6 ou 154 (que codifica um polipeptídeo com atividade de álcool desidrogenase) ou ser um fragmento da sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 4, 6 ou 154 (que codifica um polipeptídeo com atividade de álcool desidrogenase). Em ainda outra modalidade, a terceira molécula de ácido nucleico heteróloga compreende uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 4, 6 ou 154 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 3.

[00088] Em algumas modalidades, pode ser vantajoso reduzir a atividade da lactato desidrogenase na segunda célula LAB recombinante. Em tal modalidade, a segunda célula LAB recombinante pode ser geneticamente modificada para diminuir sua atividade de lactato desidrogenase. Conforme usado no contexto da presente invenção, a expressão "lactato desidrogenase" refere-se a uma enzima da Classe E.C. 1.1.1.27 que é capaz de catalisar a conversão de ácido pirúvico em lactato. A segunda célula LAB recombinante pode, assim, ter um ou mais genes que codificam para uma proteína com atividade de lactato desidrogenase que é inativada (através de deleção parcial ou total do gene). Em bactérias, os genes ldh1, ldh2, ldh3 e ldh4 codificam proteínas com atividade de lactato desidrogenase. Algumas bactérias podem conter até seis ou mais desses genes (ou seja, ldh5, ldh6, etc.). A enzima codificada pelo gene ldh3 é uma proteína com atividade de l-lactato desidrogenase, às vezes referida como ácido d-hidroxiisocapróico desidrogenase (codificado pelo gene lhic). Outra enzima com atividade de lactato desidrogenase é o ácido d-hidroxiisocapróico desidrogenase (codificado pelo gene dhic). Em uma modalidade, pelo menos, um dos genes ldh1, ldh2, ldh3, ldh4 ou dhic, seus ortólogos e parálogos correspondentes, é inativado ou deletado na segunda célula LAB recombinante. Em uma modalidade, apenas um do gene ldh é inativado ou deletado na segunda célula LAB recombinante. Em outra modalidade, pelo menos, dois dos genes ldh são inativados ou deletados na segunda célula LAB recombinante. Em outra modalidade, apenas dois dos genes ldh são inativados ou deletados na segunda célula LAB recombinante. Em uma modalidade adicional, pelo menos, três dos genes ldh são inativados ou deletados na segunda célula LAB recombinante. Em uma outra modalidade, apenas três dos genes ldh são inativados ou deletados na segunda célula LAB recombinante. Em uma outra modalidade, pelo menos, quatro dos genes ldh são inativados ou deletados na segunda célula LAB recombinante. Em uma outra modalidade, apenas quatro dos genes ldh são inativados ou deletados na segunda célula LAB recombinante. Por exemplo, na segunda célula LAB recombinante da presente invenção, os genes ldh1, ldh2, ldh3, ldh4 e dhic são inativados ou deletados. Em uma outra modalidade, pelo menos, cinco dos genes ldh são inativados ou deletados na segunda célula LAB recombinante. Em uma outra modalidade, apenas cinco dos genes ldh são inativados ou deletados na segunda célula LAB recombinante. Em uma outra modalidade, pelo menos, seis dos genes ldh são inativados ou deletados na segunda célula LAB recombinante. Em uma outra modalidade, apenas seis dos genes ldh são inativados ou deletados na segunda célula LAB recombinante. Em ainda outra modalidade, todos os genes ldh são inativados na segunda célula LAB recombinante.

[00089] Em algumas modalidades, pode ser vantajoso reduzir a atividade de manitol desidrogenase, tal como, por exemplo, a atividade de manitol-1-fosfato 5-desidrogenase, na segunda célula LAB recombinante. Em tal modalidade, a segunda célula LAB recombinante pode ser geneticamente modificada para diminuir sua atividade de manitol-1-fosfato 5-desidrogenase. Conforme usado no contexto da presente invenção, a expressão "manitol-1-P 5- desidrogenase" refere-se a uma enzima da Classe E.C. 1.1.1.17 que é capaz de catalisar a conversão de manitol em frutose-6-fosfato. A segunda célula LAB recombinante pode, assim, ter um ou mais genes que codificam para uma proteína com atividade de manitol desidrogenase que é inativada (através de deleção parcial ou total do gene). Em bactérias, os genes mltd1 e mltd2 codificam proteínas com atividade de manitol-1-P 5-desidrogenase. Em uma modalidade, pelo menos, um dos genes mltd1 e mtld2, seus ortólogos e parálogos correspondentes, é inativado na segunda célula LAB recombinante. Em uma modalidade, apenas um dos genes mltd1 e mtld2 é inativado na segunda célula LAB recombinante. Em outra modalidade, ambos os genes mltd1 e mtld2 são inativados na segunda célula LAB recombinante.

[00090] A segunda célula LAB recombinante é uma célula LAB geneticamente modificada que inclui uma molécula de ácido nucleico heteróloga (referida como a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga) que codifica um ou mais polipeptídeos que conferem imunidade contra a bacteriocina expressa pela primeira célula LAB recombinante. Em uma modalidade, a segunda célula LAB recombinante pode incluir uma ou mais quarta molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica um ou mais polipeptídeos associados à imunidade, às bacteriocinas expressas pela primeira LAB. As sequências de codificação para os polipeptídeos associados à imunidade, à bacteriocina podem ser fornecidas nas mesmas ou em quartas moléculas de ácido nucleico heterólogas distintas. Em algumas modalidades, a terceira e a quarta moléculas de ácido nucleico heterólogas estão presentes na mesma molécula de ácido nucleico. Em modalidades alternativas, a terceira e a quarta moléculas de ácido nucleico heterólogas estão presentes em moléculas de ácido nucleico distintas. A quarta molécula de ácido nucleico heteróloga pode ser integrada no genoma bacteriano ou se replicar independentemente a partir do genoma bacteriano.

[00091] Em algumas modalidades, a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga codifica um polipeptídeo que confere imunidade/resistência contra uma ou mais bacteriocinas de bactérias Gram-negativas. Por exemplo, quando a primeira célula LAB recombinante produz nisina, a segunda célula LAB recombinante deve ser geneticamente modificada para ser imune à atividade biológica de nisina. Em outro exemplo, quando a primeira célula LAB recombinante produz nisina, pediocina e brochocina, a segunda célula LAB recombinante deve ser imune ou geneticamente modificada para ser imune à atividade biológica de nisina, pediocina e brochocina. As bacteriocinas de bactérias Gram-negativas incluem, mas não são limitadas a microcinas, bacteriocinas similares à colicina e tailocinas. Em algumas modalidades, a terceira molécula de ácido nucleico heteróloga codifica um polipeptídeo que confere imunidade/resistência contra uma ou mais bacteriocinas de bactérias Gram-positivas. Bacteriocinas de bactérias Gram-positivas incluem, mas não são limitadas a bacteriocinas de Classe I (tais como, por exemplo, nisina A e/ou nisina Z), bacteriocinas de Classe II, incluindo Classe IIa (tais como, por exemplo, plantaticina 423, pediocina, lactoccina A e/ou horediocina) e IIb (tal como, por exemplo, brochocina, por exemplo) bacteriocinas, bacteriocinas de Classe III, bacteriocinas de Classe IV e bacteriocinas circulares (tais como, por exemplo, gassericina e/ou plantariciclina A). Bacteriocinas conhecidas incluem, mas não são limitadas à acidocina, actagardina, agrocina, alveicina, aureocina, aureocina A53, aureocina A70, bisina, carnocina, carnociclina, caseicina, cereína, circularina A, colicina, curvaticina, divercina, duramicina, enterocina, enterolisina, epidermina/galidermina, erwiniocina, gardimicina, gassericina A, glicinecina, halocina, haloduracina, clebicina, lactocina S, lactococina, lacticina, leucoccina, lisostapina, macedocina, mersacidina, mesentericina, microbisporicina, microcina S, mutacina, nisina A, nisina Z, paenibacilina, planosporicina, pediocina, pentocina, plantaricina, pneumociclina, piocina, reutericina 6, sakaci, salivaricina, sublancina, subtilina, sulfolobicina, tasmancina, turicina 17, trifolitoxina, variacina, vibriocina, warnericina e warnerin.

[00092] Em modalidades em que a primeira célula LAB recombinante produz nisina como a bacteriocina, a segunda célula LAB recombinante é geneticamente modificada para ganhar imunidade contra nisina. Um polipeptídeo conhecido por conferir imunidade ou resistência contra a nisina é o NisI. Em uma modalidade, NisI tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 (bem como, variantes funcionais e fragmentos das mesmas retendo, pelo menos em parte, sua capacidade de conferir imunidade contra nisina). Como tal, a segunda célula LAB recombinante pode compreender uma molécula de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) que codifica adicionalmente NisI. Em tal modalidade, a segunda célula LAB recombinante pode compreender a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 55, 56 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 11. As segundas células LAB recombinantes que expressam apenas NisI ou NisEFG são consideradas parcialmente imunes contra a atividade biológica de nisina. As segundas células LAB recombinantes que expressam NisI e NisEFG são consideradas totalmente imunes contra a atividade biológica de nisina. NisE é um transportador de nisina, NisF é outro transportador de nisina e NisG é uma nisina permease. Os polipeptídeos NisE, NisF e NisG podem ser usados em combinação na ausência do polipeptídeo NisI para conferir uma imunidade parcial contra a nisina. O polipeptídeo NisI pode ser usado na ausência dos polipeptídeos NisE, NisF e NisG para conferir uma imunidade parcial contra a nisina. Os polipeptídeos NisI, NisE, NisF e NisG podem ser usados em combinação para conferir uma imunidade total contra a nisina (por exemplo, a imunidade total é conferida na presença de 1000 ppm de nisina). Como tal, a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga pode codificar adicionalmente NisE, NisF e/ou NisG (opcionalmente em combinação com NisI). Em uma modalidade, NisE tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 (bem como, variantes funcionais e fragmentos das mesmas retendo, pelo menos em parte, sua capacidade de transportar nisina). Em uma modalidade, a segunda célula LAB recombinante pode compreender uma molécula de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) tendo a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 59, 60 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 13. Em uma modalidade, NisF tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 (bem como, variantes funcionais e fragmentos das mesmas retendo, pelo menos em parte, sua capacidade de transportar nisina). Em tal modalidade, a segunda célula LAB recombinante pode compreender uma sequência de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) de SEQ ID NO: 57, 58 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 12. Em uma modalidade, NisG tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 (bem como, variantes funcionais e fragmentos das mesmas retendo, pelo menos em parte, sua capacidade de transportar nisina). Os um ou mais polipeptídeos envolvidos na imunidade conferida contra a nisina podem estar localizados na mesma molécula ou em uma molécula de ácido nucleico distinta como aquela que codifica a nisina e/ou os popilipeptídeos envolvidos na produção e/ou regulação da produção de nisina. Em uma modalidade, a segunda célula LAB recombinante pode compreender uma molécula de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) com a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 61, 62 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 14.

[00093] Em modalidades, em que a primeira célula LAB recombinante produz pediocina como a bacteriocina, a segunda célula LAB recombinante pode ser geneticamente modificada para ganhar imunidade contra a pediocina. Um polipeptídeo conhecido por conferir imunidade ou resistência contra a pediocina é PedB. Em uma modalidade, PedB tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 (bem como, variantes funcionais e fragmentos das mesmas retendo, pelo menos em parte, sua capacidade de conferir imunidade contra pediocina). Em uma modalidade, a segunda célula LAB recombinante pode compreender uma molécula de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) com a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 76, 77 ou 78 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 22. Como tal, a segunda célula LAB recombinante pode expressar PedB ou ser geneticamente modificada para expressar PedB. Como tal, a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga pode codificar PedB.

[00094] Em modalidades, em que a primeira célula LAB recombinante produz lactoccina A como a bacteriocina, a segunda célula LAB recombinante pode ser geneticamente modificada para ganhar imunidade contra lactoccina A. Um polipeptídeo conhecido por conferir imunidade ou resistência contra pediocina é LciA. Em uma modalidade, LciA tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 (bem como, variantes funcionais e fragmentos das mesmas retendo, pelo menos em parte, sua capacidade de conferir imunidade contra lactoccina A). Em uma modalidade, a segunda célula LAB recombinante pode compreender uma molécula de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) com a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 122, 123 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 42. Como tal, a segunda célula LAB recombinante pode expressar LciA ou ser geneticamente modificada para expressar LciA. Além disso, a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga pode codificar LciA.

[00095] Em modalidades, em que a primeira célula LAB recombinante produz horediocina A como a bacteriocina, a segunda célula LAB recombinante pode ser geneticamente modificada para ganhar imunidade contra horediocina A. Um polipeptídeo conhecido por conferir imunidade ou resistência contra pediocina é HdrI. Em uma modalidade, HdrI tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 (bem como, variantes funcionais e fragmentos das mesmas retendo, pelo menos em parte, sua capacidade de conferir imunidade contra horediocina A). Em uma modalidade, a segunda célula LAB recombinante pode compreender uma molécula de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) com a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 132, 133, 134 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 47. Como tal, a segunda célula LAB recombinante pode expressar HdrI ou ser geneticamente modificada para expressar HdrI. Além disso, a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga pode codificar HdrI.

[00096] Em modalidades, em que a primeira célula LAB recombinante produz brochocina como a bacteriocina, a segunda célula LAB recombinante pode ser geneticamente modificada para ganhar imunidade contra brochocina. Um polipeptídeo conhecido por conferir imunidade ou resistência contra pediocina é BrcI. Em uma modalidade, BrcI tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 (bem como, variantes funcionais e fragmentos das mesmas retendo, pelo menos em parte, sua capacidade de conferir imunidade contra brochocina). Em uma modalidade, a segunda célula LAB recombinante pode compreender uma molécula de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) com a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 91, 92 ou 93 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 27. Como tal, a segunda célula LAB recombinante pode expressar BrcI ou ser geneticamente modificada para expressar BrcI. Além disso, a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga pode codificar adicionalmente BrcI.

[00097] Em modalidades em que a primeira célula LAB recombinante produz gasserina como a bacteriocina, a segunda célula LAB recombinante pode ser geneticamente modificada para ganhar imunidade contra gasserina. Um polipeptídeo conhecido por conferir imunidade ou resistência contra gasserina é GaaI. Em uma modalidade, GaaI tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 (bem como, variantes funcionais e fragmentos das mesmas retendo, pelo menos em parte, sua capacidade de conferir imunidade contra gasserina). Em uma modalidade, a segunda célula LAB recombinante pode compreender uma molécula de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) com a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 65, 66, 67 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 17. Além disso, a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga pode codificar adicionalmente GaaI.

[00098] Em modalidades, em que a primeira célula LAB recombinante produz plantariciclina A como a bacteriocina, a segunda célula LAB recombinante pode ser geneticamente modificada para ganhar imunidade contra a plantariciclina A. Os polipeptídeos conhecidos por conferir imunidade ou resistência contra a plantariciclina A são PlcD e PlcI. Em uma modalidade, PlcD tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 (bem como, variantes funcionais e fragmentos das mesmas retendo, pelo menos em parte, sua capacidade de conferir imunidade, na presença de PlcI, contra plantariciclina A). Em uma modalidade, a segunda célula LAB recombinante pode compreender uma molécula de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) com a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 96, 97, 98 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 30. Em uma modalidade, PlcI tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 (bem como, variantes funcionais e fragmentos das mesmas retendo, pelo menos em parte, sua capacidade de conferir imunidade, na presença de PlcD, contra plantariciclina A). Em uma modalidade, a segunda célula LAB recombinante pode compreender uma molécula de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) com a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 99, 100, 101 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 30. Além disso, a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga pode codificar adicionalmente PlcD e/ou PlcI.

[00099] Em modalidades, em que a primeira célula LAB recombinante produz plantaricina 423 como a bacteriocina, a segunda célula LAB recombinante pode ser geneticamente modificada para ganhar imunidade contra plantaricina 423. Um polipeptídeo conhecido por conferir imunidade ou resistência contra plantariciclina A é PlaB. Em uma modalidade, PlaB tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 (bem como, variantes funcionais e fragmentos das mesmas retendo, pelo menos em parte, sua capacidade de conferir imunidade contra plantaricina 423). Em uma modalidade, a segunda célula LAB recombinante pode compreender uma molécula de ácido nucleico (nativa ou heteróloga) com a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 114, 115, 116 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 37. Além disso, a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga pode codificar adicionalmente PlaB.

[000100] Em modalidades, em que uma população da primeira célula LAB recombinante é usada na cocultura e essa população da primeira célula LAB recombinante pode expressar as mesmas ou diferentes bacteriocinas (ou combinações de bacteriocinas), uma população da segunda célula LAB recombinante pode ser usada desde que sejam imunes à bacteriocina produzida pela população da primeira célula LAB recombinante.

Combinações e kits

[000101] No contexto da presente invenção, as coculturas da presente invenção podem ser opcionalmente usadas em combinação com uma célula de levedura que pode, em algumas modalidades, ser uma célula de levedura recombinante. As células de levedura adequadas podem ser, por exemplo, do gênero Saccharomyces, Kluyveromyces, Arxula, Debaryomyces, Candida, Pichia, Phaffia, Schizosaccharomyces, Hansenula, Kloeckera, Schwanniomyces ou Yarrowia. As espécies de levedura adequadas podem incluir, por exemplo, S. cerevisiae, S. bulderi, S. barnetti, S. exiguus, S. uvarum, S. diastaticus, K. lactis, K. marxianus ou K. fragilis. Em algumas modalidades, a levedura é selecionada a partir do grupo que consiste em Saccharomyces cerevisiae, Schizzosaccharomyces pombe, Candida albicans, Pichia pastoris, Pichia stipitis, Yarrowia lipolytica, Hansenula polymorpha, Phaffia rhodozyma, Candida utilis, Arxula adeninivorans, Debaryomyces hansenii, Debaryomyces polymorphus, Schizosaccharomyces pombe e Schwanniomyces occidentalis. Em uma modalidade particular, a levedura é Saccharomyces cerevisiae. Em algumas modalidades, a célula hospedeira pode ser uma célula de levedura oleaginosa. Por exemplo, a célula hospedeira de levedura oleaginosa pode ser do gênero Blakeslea, Candida, Cryptococcus, Cunninghamella, Lipomyces, Mortierella, Mucor, Phycomyces, Pythium, Rhodosporidum, Rhodotorula, Trichosporon ou Yarrowia. Em algumas modalidades alternativas, a célula hospedeira pode ser uma célula hospedeira de microalgas oleaginosa (por exemplo, do gênero Thraustochytrium ou Schizochytrium). Em uma modalidade, a célula de levedura é do gênero Saccharomyces e, em algumas modalidades, da espécie Saccharomyces cerevisiae.

[000102] Em uma modalidade específica, a célula hospedeira de levedura pode ter atividade biológica aumentada em um polipeptídeo com atividade de aldeído desidrogenase acetilante. Conforme usado na presente invenção, um polipeptídeo com atividade de aldeído desidrogenase acetilante tem a capacidade de converter acetil-coA em um aldeído. Em algumas modalidades, o polipeptídeo com atividade de aldeído desidrogenase acetilante é uma AADH ou é uma aldeído desidrogenase/álcool desidrogenase acetilante bifuncional (ADHE). A acetaldeído/álcool desidrogenase bifuncional é uma enzima capaz de converter acetil-CoA em acetaldeído, bem como, acetaldeído em etanol. Acetaldeído/álcool desidrogenase heterólogo bifuncional (AADH) incluem, mas não são limitados àqueles descritos na Patente U.S. Número Serial 8.956.851 e WO 2015/023989. AADHs heterólogos da presente invenção incluem, mas não são limitados aos polipeptídeos ADHE ou um polipeptídeo codificado por um ortólogo de gene adhe. Em uma modalidade, a AADH é de um Bifidobacterium sp., tal como, por exemplo, um Bifidobacterium adolescentis. Em tal modalidade, a modificação genética pode compreender a introdução de uma molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica um polipeptídeo com atividade de aldeído desidrogenase acetilante na célula de levedura recombinante.

[000103] Em algumas modalidades, a célula de levedura também pode incluir uma ou mais modificações genéticas que limitam a produção de glicerol. Por exemplo, a modificação genética pode ser uma modificação genética que leva à redução na produção e, em uma modalidade, à inibição na produção, de uma ou mais enzimas nativas que funcionam para produzir glicerol. Conforme usado no contexto da presente invenção, a expressão "reduzindo a produção de uma ou mais enzimas nativas que funcionam para produzir glicerol" refere-se a uma modificação genética que limita ou impede a expressão de genes associados a um ou mais polipeptídeos nativos (em algumas modalidades enzimas) que funcionam para produzir glicerol, quando comparado a uma cepa de levedura correspondente que não suporta tal modificação genética. Em alguns casos, a modificação genética adicional reduz, mas ainda permite a produção de um ou mais polipeptídeos nativos que funcionam para produzir glicerol. Em outros casos, a modificação genética inibe a produção de uma ou mais enzimas nativas que funcionam para produzir glicerol. Polipeptídeos que funcionam para produzir glicerol referem-se a polipeptídeos que são encontrados endogenamente na célula de levedura. As enzimas nativas que funcionam para produzir glicerol incluem, mas não são limitadas aos polipeptídeos GPD1 e GPD2 (também referidos como GPD1 e GPD2, respectivamente), bem como os polipeptídeos GPP1 e GPP2 (também referidos como GPP1 e GPP2, respectivamente). Em uma modalidade, a célula de levedura carrega uma modificação genética em, pelo menos, um do gene gpd1 (que codifica o polipeptídeo GPD1), o gene gpd2 (que codifica o polipeptídeo GPD2), o gene gpp1 (que codifica o polipeptídeo GPP1) ou o gene gpp2 (que codifica o polipeptídeo GPP2). Em outra modalidade, a célula de levedura carrega uma modificação genética em, pelo menos, dois do gene gpd1 (que codifica o polipeptídeo GPD1), o gene gpd2 (que codifica o polipeptídeo GPD2), o gene gpp1 (que codifica o polipeptídeo GPP1) ou o gene gpp2 (que codifica o polipeptídeo GPP2). Exemplos de células de levedura recombinantes com tais modificações genéticas que levam à redução na produção de uma ou mais enzimas nativas que funcionam para produzir glicerol são descritos no documento WO 2012/138942. Em algumas modalidades, a célula de levedura tem uma modificação genética (tal como uma exclusão ou inserção genética) apenas em uma enzima que funciona para produzir glicerol, no gene gpd2, o que faria com que a célula de levedura tivesse um gene gpd2 nocauteado. Em algumas modalidades, a célula hospedeira de levedura recombinante pode ter uma modificação genética no gene gpd1 e o gene gpd2 resultante é uma célula hospedeira de levedura recombinante sendo nocauteada para o gene gpd1 e o gene gpd2. Em algumas modalidades específicas, a célula de levedura pode ser um nocaute para o gene gpd1 e ter cópias duplicadas do gene gpd2 (em algumas modalidades, sob o controle do promotor gpd1). Em ainda outra modalidade, a célula de levedura não suporta tal modificação genética e inclui seus genes nativos que codificam para as proteínas GPP/GDP. Como tal, em algumas modalidades, não há modificações genéticas que conduzam à redução na produção de uma ou mais enzimas nativas que funcionam para produzir glicerol na célula de levedura.

[000104] Alternativamente ou em combinação, a célula de levedura também pode incluir uma ou mais modificações genéticas adicionais que facilitam o transporte de glicerol na célula de levedura. Por exemplo, a modificação genética adicional pode ser uma modificação genética que leva ao aumento da atividade de uma ou mais enzimas nativas que funcionam para transportar glicerol. As enzimas nativas que funcionam para transportar as sínteses de glicerol incluem, mas não são limitadas ao polipeptídeo FPS1, bem como, o polipeptídeo STL1. O polipeptídeo FPS1 é um exportador de glicerol e as funções do polipeptídeo STL1 para importar glicerol na célula hospedeira de levedura recombinante. Ao reduzir ou inibir a expressão do polipeptídeo FPS1 e/ou aumentar a expressão do polipeptídeo STL1, é possível controlar, até certo ponto, as sínteses de glicerol.

[000105] A proteína STL1 é nativamente expressa em leveduras e fungos, portanto, a proteína heteróloga que funciona para importar glicerol pode ser derivada de leveduras e fungos. Os genes STL1 que codificam a proteína STL1 incluem, mas não são limitados a Saccharomyces cerevisiae ID do gene: 852149, Candida albicans, Kluyveromyces lactis ID do gene: 2896463, Ashbya gossypii ID do gene: 4620396, Eremothecium sinecaudum ID do gene: 28724161, Torulaspora delbrueckii ID do gene: 11505245, Lachancea thermotolerans ID do gene: 8290820, Phialophora attae ID do gene: 28742143, Penicillium digitatum ID do gene: 26229435, Aspergillus oryzae ID do gene: 5997623, Aspergillus fumigatus ID do gene: 3504696, Talaromyces atroroseus ID do gene: 31007540, Rasamsonia emersonii ID do gene: 25315795, Aspergillus flavus ID do gene: 7910112, Aspergillus terreus ID do gene: 4322759, Penicillium chrysogenum ID do gene: 8310605, Alternaria alternata ID do gene: 29120952, Paraphaeosphaeria sporulosa ID do gene: 28767590, Pyrenophora tritici-repentis ID do gene: 6350281, Metarhizium robertsii ID do gene: 19259252, Isaria fumosorosea ID do gene: 30023973, Cordyceps militaris ID do gene: 18171218, Pochonia chlamydosporia ID do gene: 28856912, Metarhizium majus ID do gene: 26274087, Neofusicoccum parvum ID do gene: 19029314, Diplodia corticola ID do gene: 31017281, Verticillium dahliae ID do gene: 20711921, Colletotrichum gloeosporioides ID do gene: 18740172, Verticillium albo-atrum ID do gene: 9537052, Paracoccidioides lutzii ID do gene: 9094964, Trichophyton rubrum ID do gene: 10373998, Nannizzia gypsea ID do gene: 10032882, Trichophyton verrucosum ID do gene: 9577427, Arthroderma benhamiae ID do gene: 9523991, Magnaporthe oryzae ID do gene: 2678012, Gaeumannomyces graminis var. tritici ID do gene: 20349750, Togninia minima ID do gene: 19329524, Eutypa lata ID do gene: 19232829, Scedosporium apiospermum ID do gene: 27721841, Aureobasidium namibiae ID do gene: 25414329, Sphaerulina musiva ID do gene: 27905328, bem como, Pachysolen tannophilus Números de Acesso GenBank JQ481633 e JQ481634, Saccharomyces paradoxus STL1 e Pichia sorbitophilia. Em uma modalidade, a proteína STL1 é codificada por Saccharomyces cerevisiae ID do gene: 852149.

[000106] Alternativamente ou em combinação, a célula de levedura pode ter uma modificação genética que permite a expressão de uma enzima sacarolítica heteróloga. Conforme usado no contexto da presente invenção, uma "enzima sacarolítica" pode ser qualquer enzima envolvida na digestão, metabolismo e/ou hidrólise de carboidratos, incluindo amilases, celulases, hemicelulases, enzimas acessórias celulolíticas e amilolíticas, inulinases, levanases e açúcar pentose utilizando enzimas, enzima amilolítica. Em uma modalidade, a enzima sacarolítica é uma enzima amilolítica. Tal como aqui utilizado, a expressão "enzima amilolítica" refere-se a uma classe de enzimas capaz de hidrolisar amido ou amido hidrolisado. As enzimas amilolíticas incluem, mas não são limitadas a alfa-amilases (EC 3.2.1.1, às vezes referidas como alfaamilase fúngica, ver abaixo), amilase maltogênica (EC 3.2.1.133), glucoamilase (EC 3.2.1.3), glucano 1, 4-alfa-maltotetraohidrolase (EC 3.2.1.60), pululanase (EC 3.2.1.41), isoamilase (EC 3.2.1.68) e amilomaltase (EC 2.4.1.25). Em uma modalidade, a uma ou mais enzimas amilolíticas podem ser uma alfa-amilase de Aspergillus oryzae, uma alfa-amilase maltogênica de Geobacillus stearothermophilus, uma glucoamilase de Saccharomycopsis fibuligera, uma glucano 1,4-alfa-maltotetraohidrolase de Pseudomonas saccharophila, uma pululanase de Bacillus naganoensis, uma pululanase de Bacillus acidopullulyticus, uma isoamilase de Pseudomonas amyloderamosa e/ou amilomaltase de Thermus thermophilus. Algumas enzimas amilolíticas foram descritas no documento WO2018/167670 e são aqui incorporadas por referência.

[000107] Por exemplo, a célula de levedura pode carregar uma ou mais modificações genéticas que permitem a produção de uma glucoamilase heteróloga. Muitos micróbios produzem uma amilase para degradar os amidos extracelulares. Além de clivar as últimas ligações α(1-4) glicosídicas na extremidade não redutora de amilose e amilopectina, produzindo glicose, a γ-amilase irá clivar as ligações α(1-6) glicosídicas. A glucoamilase heteróloga pode ser derivada de qualquer organismo. Em uma modalidade, a proteína heteróloga é derivada de uma γ-amilase, tal como, por exemplo, a glucoamilase de Saccharomycoces filbuligera (por exemplo, codificada pelo gene glu 0111). Exemplos de células de levedura carregando tais modificações genéticas são descritos no documento WO 2011/153516, bem como, no documento WO 2017/037614 e aqui incorporados em sua totalidade.

[000108] Alternativamente ou em combinação, a célula de levedura pode carregar uma ou mais modificações genéticas para aumentar a produção de formiato/acetil-CoA. Para fazer isso, a célula de levedura pode carregar uma ou mais modificações genéticas para aumentar sua atividade de piruvato formiato liase. Conforme usado no contexto da presente invenção, "uma enzima heteróloga que funciona para aumentar a produção de formiato/acetil-CoA" refere-se a polipeptídeos que podem ou não ser endogenamente encontrados na célula hospedeira de levedura e que são propositalmente introduzidos nas células de levedura para anabolizar o formiato. Em algumas modalidades, a enzima heteróloga que pode ser uma piruvato de formiato liase heteróloga (PFL), tal como PFLA ou PFLB, PFL heterólogo da presente invenção inclui, mas não está limitada ao polipeptídeo PFLA, um polipeptídeo codificado por um ortólogo de gene pfla, o polipeptídeo PFLB ou um polipeptídeo codificado por um ortólogo de gene pflb.

[000109] As modalidades da enzima ativadora de piruvato formiato liase e de PFLA podem ser derivadas, sem limitação, do seguinte (o número entre colchetes corresponde ao número de identificação do gene): Escherichia coli (MG1655945517), Shewanella oneidensis (1706020), Bifidobacterium longum (1022452), Mycobacterium bovis (32287203), Haemophilus parasuis (7277998), Mannheimia haemolytica (15341817), Vibrio vulnificus (33955434), Cronobacter sakazakii (29456271), Vibrio alginolyticus (31649536), Pasteurella multocida (29388611), Aggregatibacter actinomycetemcomitans (31673701), Actinobacillus suis (34291363), Finegoldia magna (34165045), Zymomonas mobilis subsp. mobilis (3073423), Vibrio tubiashii (23444968), Gallibacterium anatis (10563639), Actinobacillus pleuropneumoniae serovar (4849949), Ruminiclostridium thermocellum (35805539), Cylindrospermopsis raciborskii (34474378), Lactococcus garvieae (34204939), Bacillus cytotoxicus (33895780), Providencia stuartii (31518098), Pantoea ananatis (31510290), Teredinibacter turnerae (29648846), Morganella morganii subsp. morganii (14670737), Vibrio anguillarum (77510775106), Dickeya dadantii (39379733484), Xenorhabdus bovienii (8830449), Edwardsiella ictaluri (7959196), Proteus mirabilis (6801040), Rahnella aquatilis (34350771), Bacillus pseudomycoides (34214771), Vibrio alginolyticus (29867350), Vibrio nigripulchritudo (29462895), Vibrio orientalis (25689084), Kosakonia sacchari (23844195), Serratia marcescens subsp. marcescens (23387394), Shewanella baltica (11772864), Vibrio vulnificus (2625152), Streptomyces acidiscabies (33082227), Streptomyces davaonensis (31227069), Streptomyces scabiei (24308152), Volvox carteri f. nagariensis (9616877), Vibrio breoganii (35839746), Vibrio mediterranei (34766273), Fibrobacter succinogenes subsp. succinogenes (34755395), Enterococcus gilvus (34360882), Akkermansia muciniphila (34173806), Enterobacter hormaechei subsp. Steigerwaltii (34153767), Dickeya zeae (33924935), Enterobacter sp. (32442159), Serratia odorifera (31794665), Vibrio crassostreae (31641425), Selenomonas ruminantium subsp. lactilytica (31522409), Fusobacterium necrophorum subsp. funduliforme (31520833), Bacteroides uniformis (31507008), Haemophilus somnus (233631487328), Rodentibacter pneumotropicus (31211548), Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum (29706463), Eikenella corrodens (29689753), Bacillus thuringiensis (29685036), Streptomyces rimosus subsp. Rimosus (29531909), Vibrio fluvialis (29387180), Klebsiella oxytoca (29377541), Parageobacillus thermoglucosidans (29237437), Aeromonas veronii (28678409), Clostridium innocuum (26150741), Neisseria mucosa (25047077), Citrobacter freundii (23337507), Clostridium bolteae (23114831), Vibrio tasmaniensis (7160642), Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida (4995006), Escherichia coli O157:H7 str. Sakai (917728), Escherichia coli O83:H1 str. (12877392), Yersinia pestis (11742220), Clostridioides difficile (4915332), Vibrio fischeri (3278678), Vibrio parahaemolyticus (1188496), Vibrio coralliilyticus (29561946), Kosakonia cowanii (35808238), Yersinia ruckeri (29469535), Gardnerella vaginalis (99041930), Listeria fleischmannii subsp. Coloradonensis (34329629), Photobacterium kishitanii (31588205), Aggregatibacter actinomycetemcomitans (29932581), Bacteroides caccae (36116123), Vibrio toranzoniae (34373279), Providencia alcalifaciens (34346411), Edwardsiella anguillarum (33937991), Lonsdalea quercina subsp. Quercina (33074607), Pantoea septica (32455521), Butyrivibrio proteoclasticus (31781353), Photorhabdus temperata subsp. Thracensis (29598129), Dickeya solani (23246485), Aeromonas hydrophila subsp. hydrophila (4489195), Vibrio cholerae O1 biovar El Tor str. (2613623), Serratia rubidaea (32372861), Vibrio bivalvicida (32079218), Serratia liquefaciens (29904481), Gilliamella apicola (29851437), Pluralibacter gergoviae (29488654), Escherichia coli O104:H4 (13701423), Enterobacter aerogenes (10793245), Escherichia coli (7152373), Vibrio campbellii (5555486), Shigella dysenteriae (3795967), Bacillus thuringiensis serovar konkukian (2854507), Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium (1252488), Bacillus anthracis (1087733), Shigella flexneri (1023839), Streptomyces griseoruber (32320335), Ruminococcus gnavus (35895414), Aeromonas fluvialis (35843699), Streptomyces ossamyceticus (35815915), Xenorhabdus doucetiae (34866557), Lactococcus piscium (34864314), Bacillus glycinifermentans (34773640), Photobacterium damselae subsp. Damselae 34509297, Streptomyces venezuelae 34035779, Shewanella algae (34011413), Neisseria sicca (33952518), Chania multitudinisentens (32575347), Kitasatospora purpeofusca (32375714), Serratia fonticola (32345867), Aeromonas enteropelogenes (32325051), Micromonospora aurantiaca (32162988), Moritella viscosa (31933483), Yersinia aldovae (31912331), Leclercia adecarboxylata (31868528), Salinivibrio costicola subsp. costicola (31850688), Aggregatibacter aphrophilus (31611082), Photobacterium leiognathi (31590325), Streptomyces canus (31293262), Pantoea dispersa (29923491), Pantoea rwandensis (29806428), Paenibacillus borealis (29548601), Aliivibrio wodanis (28541257), Streptomyces virginiae (23221817), Escherichia coli (7158493), Mycobacterium tuberculosis (887973), Streptococcus mutans (1028925), Streptococcus cristatus (29901602), Enterococcus hirae (13176624), Bacillus licheniformis (3031413), Chromobacterium violaceum (24949178), Parabacteroides distasonis (5308542), Bacteroides vulgatus (5303840), Faecalibacterium prausnitzii (34753201), Melissococcus plutonius (34410474), Streptococcus gallolyticus subsp. gallolyticus (34397064), Enterococcus malodoratus (34355146), Bacteroides oleiciplenus (32503668), Listeria monocytogenes (985766), Enterococcus faecalis (1200510), Campylobacter jejuni subsp. jejuni (905864), Lactobacillus plantarum (1063963), Yersinia enterocolitica subsp. enterocolitica (4713333), Streptococcus equinus (33961143), Macrococcus canis (35294771), Streptococcus sanguinis (4807186), Lactobacillus salivarius (3978441), Lactococcus lactis subsp. lactis (1115478), Enterococcus faecium (12999835), Clostridium botulinum A (5184387), Clostridium acetobutylicum (1117164), Bacillus thuringiensis serovar konkukian (2857050), Cryobacterium flavum (35899117), Enterovibrio norvegicus (35871749), Bacillus acidiceler (34874556), Prevotella intermedia (34516987), Pseudobutyrivibrio ruminis (34419801), Pseudovibrio ascidiaceicola (34149433), Corynebacterium coyleae (34026109), Lactobacillus curvatus (33994172), Cellulosimicrobium cellulans (33980622), Lactobacillus agilis (33975995), Lactobacillus sakei (33973512), Staphylococcus simulans (32051953), Obesumbacterium proteus (29501324), Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi (1247402), Streptococcus agalactiae (1014207), Streptococcus agalactiae (1013114), Legionella pneumophila subsp. pneumophila str. Philadelphia (119832735), Pyrococcus furiosus (1468475), Mannheimia haemolytica (15340992), Thalassiosira pseudonana (7444511), Thalassiosira pseudonana (7444510), Streptococcus thermophilus (31940129), Sulfolobus solfataricus (1454925), Streptococcus iniae (35765828), Streptococcus iniae (35764800), Bifidobacterium thermophilum (31839084), Bifidobacterium animalis subsp. lactis (29695452), Streptobacillus moniliformis (29673299), Thermogladius calderae (13013001), Streptococcus oralis subsp. tigurinus (31538096), Lactobacillus ruminis (29802671), Streptococcus parauberis (29752557), Bacteroides ovatus (29454036), Streptococcus gordonii str. Challis substr. CH1 (25052319), Clostridium botulinum B str. Eklund 17B (19963260), Thermococcus litoralis (16548368), Archaeoglobus sulfaticallidus (15392443), Ferroglobus placidus (8778929), Archaeoglobus profundus (8739370), Listeria seeligeri serovar 1/2b (32488230), Bacillus thuringiensis (31632063), Rhodobacter capsulatus (31491679), Clostridium botulinum (29749009), Clostridium perfringens (29571530), Lactococcus garvieae (12478921), Proteus mirabilis (6799920), Lactobacillus animalis (32012274), Vibrio alginolyticus (29869205), Bacteroides thetaiotaomicron (31617701), Bacteroides thetaiotaomicron (31617140), Bacteroides cellulosilyticus (29608790), Bacteroides ovatus (29453452), Bacillus mycoides (29402181), Chlamydomonas reinhardtii (5726206), Fusobacterium periodonticum (35833538), Selenomonas flueggei (32477557), Selenomonas noxia (32475880), Anaerococcus hydrogenalis (32462628), Centipeda periodontii (32173931), Centipeda periodontii (32173899), Streptococcus thermophilus (31938326), Enterococcus durans (31916360), Fusobacterium nucleatum (31730399), Anaerostipes hadrus (31625694), Anaerostipes hadrus (31623667), Enterococcus haemoperoxidus (29838940), Gardnerella vaginalis (29692621), Streptococcus salivarius (29397526), Klebsiella oxytoca (29379245), Bifidobacterium breve (29241363), Actinomyces odontolyticus (25045153), Haemophilus ducreyi (24944624), Archaeoglobus fulgidus (24793671), Streptococcus uberis (24161511), Fusobacterium nucleatum subsp. animalis (23369066), Corynebacterium accolens (23249616), Archaeoglobus veneficus (10394332), Prevotella melaninogenica (9497682), Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida (4997325), Pyrobaculum islandicum (4616932), Thermofilum pendens (4600420), Bifidobacterium adolescentis (4556560), Listeria monocytogenes (986485), Bifidobacterium thermophilum (35776852), Methanothermobacter sp. CaT2 (24854111), Streptococcus pyogenes (901706), Exiguobacterium sibiricum (31768748), Clostridioides difficile (4916015), Clostridioides difficile (4913022), Vibrio parahaemolyticus (1192264), Yersinia enterocolitica subsp. enterocolitica (4712948), Enterococcus cecorum (29475065), Bifidobacterium pseudolongum (34879480), Methanothermus fervidus (9962832), Methanothermus fervidus (9962056), Corynebacterium simulans (29536891), Thermoproteus uzoniensis (10359872), Vulcanisaeta distributa (9752274), Streptococcus mitis (8799048), Ferroglobus placidus (8778420), Streptococcus suis (8153745), Clostridium novyi (4541619), Streptococcus mutans (1029528), Thermosynechococcus elongatus (1010568), Chlorobium tepidum (1007539), Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum (993139), Streptococcus pneumoniae (933787), Clostridium baratii (31579258), Enterococcus mundtii (31547246), Prevotella ruminicola (31500814), Aeromonas hydrophila subsp. hydrophila (4490168), Aeromonas hydrophila subsp. hydrophila (4487541), Clostridium acetobutylicum (1117604), Chromobacterium subtsugae (31604683), Gilliamella apicola (29849369), Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae (11846825), Enterobacter cloacae subsp. cloacae (9125235), Escherichia coli (7150298), Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium (1252363), Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi (1247322), Bacillus cereus (1202845), Bacteroides thetaiotaomicron (1074343), Bacteroides thetaiotaomicron (1071815), Bacillus coagulans (29814250), Bacteroides cellulosilyticus (29610027), Bacillus anthracis (2850719), Monoraphidium neglectum (25735215), Monoraphidium neglectum (25727595), Alloscardovia omnicolens (35868062), Actinomyces neuii subsp. neuii (35867196), Acetoanaerobium sticklandii (35557713), Exiguobacterium undae (32084128), Paenibacillus pabuli (32034589), Paenibacillus etheri (32019864), Actinomyces oris (31655321), Vibrio alginolyticus (31651465), Brochothrix thermosphacta (29820407), Lactobacillus sakei subsp. sakei (29638315), Anoxybacillus gonensis (29574914), variantes das mesmas, bem como, fragmentos das mesmas. Em uma modalidade, a proteína PFLA é derivada do gênero Bifidobacterium e em algumas modalidades da espécie Bifidobacterium adolescentis.

[000110] As modalidades de PFLB podem ser derivadas, sem limitação, a partir do seguinte (o número entre colchetes corresponde ao número de ID do gene): Escherichia coli (945514), Shewanella oneidensis (1170601), Actinobacillus suis (34292499), Finegoldia magna (34165044), Streptococcus cristatus (29901775), Enterococcus hirae (13176625), Bacillus (3031414), Providencia alcalifaciens (34345353), Lactococcus garvieae (34203444), Butyrivibrio proteoclasticus (31781354), Teredinibacter turnerae (29651613), Chromobacterium violaceum (24945652), Vibrio campbellii (5554880), Vibrio campbellii (5554796), Rahnella aquatilis HX2 (34351700), Serratia rubidaea (32375076), Kosakonia sacchari SP1 (23845740), Shewanella baltica (11772863), Streptomyces acidiscabies (33082309), Streptomyces davaonensis (31227068), Parabacteroides distasonis (5308541), Bacteroides vulgatus (5303841), Fibrobacter succinogenes subsp. succinogenes (34755392), Photobacterium damselae subsp. Damselae (34512678), Enterococcus gilvus (34361749), Enterococcus gilvus (34360863), Enterococcus malodoratus (34355213), Enterococcus malodoratus (34354022), Akkermansia muciniphila (34174913), Lactobacillus curvatus (33995135), Dickeya zeae (33924934), Bacteroides oleiciplenus (32502326), Micromonospora aurantiaca (32162989), Selenomonas ruminantium subsp. lactilytica (31522408), Fusobacterium necrophorum subsp. funduliforme (31520832), Bacteroides uniformis (31507007), Streptomyces rimosus subsp. Rimosus (29531908), Clostridium innocuum (26150740), Haemophilus ducreyi (24944556), Clostridium bolteae (23114829), Vibrio tasmaniensis (7160644), Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida (4997718), Listeria monocytogenes (986171), Enterococcus faecalis (1200511), Lactobacillus plantarum (1064019), Vibrio fischeri (3278780), Lactobacillus sakei (33973511), Gardnerella vaginalis (9904192), Vibrio vulnificus (33954428), Vibrio toranzoniae (34373229), Anaerostipes hadrus (34240161), Edwardsiella anguillarum (33940299), Edwardsiella anguillarum (33937990), Lonsdalea quercina subsp. Quercina (33074710), Enterococcus faecium (12999834), Aeromonas hydrophila subsp. hydrophila (4489100), Clostridium acetobutylicum (1117163), Escherichia coli (7151395), Shigella dysenteriae (3795966), Bacillus thuringiensis serovar konkukian (2856201), Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium (1252491), Shigella flexneri (1023824), Streptomyces griseoruber (32320336), Cryobacterium flavum (35898977), Ruminococcus gnavus (35895748), Bacillus acidiceler (34874555), Lactococcus piscium (34864362), Vibrio mediterranei (34766270), Faecalibacterium prausnitzii (34753200), Prevotella intermedia (34516966), Photobacterium damselae subsp. Damselae (34509286), Pseudobutyrivibrio ruminis (34419894), Melissococcus plutonius (34408953), Streptococcus gallolyticus subsp. gallolyticus (34398704), Enterobacter hormaechei subsp. Steigerwaltii (34155981), Enterobacter hormaechei subsp. Steigerwaltii (34152298), Streptomyces venezuelae (34036549), Shewanella algae (34009243), Lactobacillus agilis (33976013), Streptococcus equinus (33961013), Neisseria sicca (33952517), Kitasatospora purpeofusca (32375782), Paenibacillus borealis (29549449), Vibrio fluvialis (29387150), Aliivibrio wodanis (28542465), Aliivibrio wodanis (28541256), Escherichia coli (7157421), Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi (1247405), Yersinia pestis (1174224), Yersinia enterocolitica subsp. enterocolitica (4713334), Streptococcus suis (8155093), Escherichia coli (947854), Escherichia coli (946315), Escherichia coli (945513), Escherichia coli (948904), Escherichia coli (917731), Yersinia enterocolitica subsp. enterocolitica (4714349), variantes das mesmas, bem como, fragmentos das mesmas. Em uma modalidade, a proteína PFLB é derivada do gênero Bifidobacterium e em algumas modalidades da espécie Bifidobacterium adolescentis.

[000111] Em algumas modalidades, a célula de levedura compreende uma modificação genética para expressar uma proteína PFLA, uma proteína PFLB ou uma combinação. Em uma modalidade específica, a célula de levedura compreende uma modificação genética para expressar uma proteína PFLA e uma proteína PFLB que podem, em algumas modalidades, ser fornecidas em moléculas de ácido nucleico heterólogas distintas. Conforme indicado abaixo, a célula hospedeira de levedura recombinante também pode incluir modificações genéticas adicionais para fornecer ou aumentar sua capacidade de transformar acetil-CoA em um álcool, tal como etanol.

[000112] Alternativamente ou em combinação, a célula de levedura pode carregar uma ou mais modificações genéticas para utilizar acetil-CoA, por exemplo, fornecendo ou aumentando a atividade de acetaldeído e/ou álcool desidrogenase. O acetil-CoA pode ser convertido em um álcool, tal como o etanol, usando uma acetaldeído desidrogenase e, em seguida, uma álcool desidrogenase. A acilação de acetaldeído desidrogenase (E.C. 1.2.1.10) é conhecida por catalisar a conversão de acetil-CoA em acetaldeído. As álcool desidrogenases (E.C. 1.1.1.1) são conhecidas por serem capazes de catalisar a conversão de acetaldeído em etanol. A atividade de acetaldeído desidrogenase e de álcool desidrogenase pode ser fornecida por uma única proteína (por exemplo, uma acetaldeído/álcool desidrogenase bifuncional) ou por uma combinação de mais de uma proteína (por exemplo, uma acetaldeído desidrogenase e uma álcool desidrogenase). Em modalidades, em que a atividade de acetaldeído/álcool desidrogenase é fornecida por mais de uma proteína, pode não ser necessário fornecer a combinação de proteínas em uma forma recombinante na célula hospedeira de levedura recombinante, pois a célula pode ter algum acetaldeído preexistente ou atividade de álcool desidrogenase. Em tais modalidades, a modificação genética pode incluir o fornecimento de uma ou mais moléculas de ácido nucleico heterólogas que codificam uma ou mais de uma acetaldeído desidrogenase heteróloga (AADH), uma álcool desidrogenase heteróloga (ADH) e/ou acetalaldeído/álcool desidrogenase heteróloga bifuncional (ADHE). Em outra modalidade, a modificação genética compreende a introdução de um ácido nucleico heterólogo que codifica uma acetaldeído/álcool desidrogenase heteróloga bifuncional (ADHE), tais como aquelas descritas na Patente U.S. Número Serial 8.956.851 e WO 2015/023989. AADHs heterólogas da presente invenção incluem, mas não são limitadas aos polipeptídeos ADHE ou um polipeptídeo codificado por um ortólogo de gene adhe.

[000113] As coculturas aqui descritas podem ser fornecidas como uma combinação com a célula de levedura aqui descrita. Em tal combinação, as coculturas podem ser fornecidas em um recipiente distinto da célula de levedura. A própria cocultura pode ser fornecida em recipientes distintos (um para a primeira célula LAB recombinante, outro para a segunda célula LAB recombinante) ou no mesmo recipiente (compreendendo tanto a primeira célula LAB recombinante quanto a segunda célula LAB recombinante). As células LAB das coculturas podem ser fornecidas como um concentrado de células. O concentrado de células que compreende as células LAB pode ser obtido, por exemplo, propagando as células LAB em um meio de cultura e removendo, pelo menos, um componente do meio que compreende as células LAB propagadas. Isso pode ser feito, por exemplo, por desidratação, filtração (incluindo ultrafiltração) e/ou centrifugação do meio que compreende as células LAB propagadas. Em uma modalidade, as coculturas podem ser fornecidas como um concentrado congelado na combinação. A célula de levedura pode ser fornecida como um concentrado de células. O concentrado de células que compreende a célula de levedura pode ser obtido, por exemplo, propagando as células de levedura em um meio de cultura e removendo, pelo menos, um componente do meio que compreende a célula hospedeira de levedura propagada. Isso pode ser feito, por exemplo, por desidratação, filtração (incluindo ultrafiltração) e/ou centrifugação do meio que compreende as células de levedura propagadas. Em uma modalidade, a célula de levedura é fornecida como um creme na combinação.

[000114] As coculturas aqui descritas podem ser fornecidas como um kit para fazer um produto fermentado. O kit compreende a primeira célula LAB recombinante aqui descrita e a segunda célula LAB recombinante. Em algumas modalidades, o kit pode incluir adicionalmente a célula de levedura aqui descrita. No kit, as coculturas podem ser fornecidas em um recipiente distinto da célula de levedura. A própria cocultura pode ser fornecida em recipientes distintos (um para a primeira célula LAB recombinante, outro para a segunda célula LAB recombinante) ou no mesmo recipiente (compreendendo tanto a primeira célula LAB recombinante quanto a segunda célula LAB recombinante). As células LAB das coculturas podem ser fornecidas no kit como um concentrado de células. O concentrado de células que compreende as células LAB pode ser obtido, por exemplo, propagando as células LAB em um meio de cultura e removendo, pelo menos, um componente do meio que compreende as células LAB propagadas. Isso pode ser feito, por exemplo, por desidratação, filtração (incluindo ultrafiltração) e/ou centrifugação do meio que compreende as células LAB propagadas. Em uma modalidade, as coculturas podem ser fornecidas como um concentrado congelado na combinação. A célula de levedura pode ser fornecida no kit como um concentrado de células. O concentrado de células que compreende a célula de levedura pode ser obtido, por exemplo, propagando as células de levedura em um meio de cultura e removendo, pelo menos, um componente do meio que compreende a célula hospedeira de levedura propagada. Isso pode ser feito, por exemplo, por desidratação, filtração (incluindo ultrafiltração) e/ou centrifugação do meio que compreende as células de levedura propagadas. Em uma modalidade, a célula de levedura é fornecida no kit como um creme na combinação. O kit pode, em algumas modalidades, incluir as instruções para realizar o processo de fabricação do produto de fermentação.

[000115] A presente invenção fornece um meio que compreende a primeira célula LAB recombinante aqui descrita, a segunda célula LAB recombinante aqui descrita e, opcionalmente, a célula de levedura aqui descrita. O meio pode ser um meio de propagação, por exemplo, um meio que foi usado para propagar as células LAB. O meio pode ser um meio de fermentação, por exemplo, um meio que foi usado para converter uma biomassa em um produto de fermentação. Em tal modalidade, o meio de fermentação também pode incluir o produto de fermentação.

Processo para fazer um produto fermentado

[000116] As coculturas aqui descritas podem ser usadas (sozinhas ou em combinação com uma célula de levedura) para fazer um produto fermentado a partir de uma biomassa. Em algumas modalidades, as coculturas e as combinações são usadas para limitar a contaminação microbiana durante a fermentação e, consequentemente, manter ou melhorar o rendimento da fermentação (quando comparado a uma fermentação na ausência das coculturas ou combinações). É conhecido na técnica que a redução no rendimento da fermentação é influenciada pelo tipo de contaminação microbiana (bacteriana), a concentração de contaminação microbiana (bacteriana), o tipo de meio de fermentação (incluindo seu teor de sólidos), etc. No contexto da presente invenção, uma contaminação microbiana é definida como a presença de um micro-organismo (que pode ser uma bactéria) que (i) difere da primeira e da segunda células LAB recombinantes e da célula de levedura em fermentação que pode, opcionalmente, estar presente e (ii) causa uma redução no rendimento do produto final desejado (etanol, por exemplo) durante a fermentação. Em algumas modalidades, em que uma pasta de milho está sendo usada como a biomassa, as coculturas aqui descritas podem limitar a contaminação bacteriana a um nível abaixo de cerca de 106, 105, 104, 103, 102 ou menos CFU/g de pasta de milho.

[000117] A biomassa que pode ser fermentada com as coculturas e combinações aqui descritas inclui qualquer tipo de biomassa conhecido na técnica e aqui descrito. Por exemplo, a biomassa pode incluir, mas não está limitada a amido, açúcar e materiais lignocelulósicos. Os materiais de amido podem incluir, mas não são limitados a pastas, tal como milho, trigo, centeio, cevada, arroz ou milo. Os materiais de açúcar podem incluir, mas não são limitados à beterraba sacarina, tubérculos de alcachofra, sorgo doce, melaço ou cana. Os termos "material lignocelulósico", "substrato lignocelulósico" e "biomassa celulósica" significam qualquer tipo de biomassa que compreende celulose, hemicelulose, lignina ou combinações dos mesmos, tais como, mas não limitados à biomassa lenhosa, gramíneas forrageiras, culturas energéticas herbáceas, biomassa não lenhosa de planta, perdas agrícolas e/ou resíduos agrícolas, resíduos florestais e/ou perdas florestais, lama de produção de papel e/ou lama de papel residual, lama de tratamento de águas residuais, resíduos sólidos municipais, plantas de etanol de milho moído seco e úmido e resíduos de processamento de açúcar. Os termos "hemicelulósicos", "porções hemicelulósicas" e "frações hemicelulósicas" significam a não lignina, elementos não celulósicos de material lignocelulósico, tais como, mas não limitados à hemicelulose (isto é, compreendendo xiloglucano, xilano, glucuronoxilano, arabinoxilano, manano, glucomanano e galactoglucomanano), pectinas (por exemplo, homogalacturonanos, ramnogalacturonanos I e II e xilogalacturonano) e proteoglicanos (por exemplo, arabinogalactano-proteína, extensina e proteínas ricas em pró-linhagem). Em algumas modalidades, a biomassa pode incluir e/ou ser suplementada com ácido cítrico (especialmente quando o ácido acético ou acetato é o primeiro produto metabólico).

[000118] Em um exemplo não limitativo, o material lignocelulósico pode incluir, mas não é limitado à biomassa lenhosa, tais como fibra de polpa de madeira reciclada, serragem, madeira dura, madeira macia e combinações das mesmas; gramíneas, tais como grama, grama de cordão, grama de centeio, caniço-malhado, miscanto ou uma combinação dos mesmos; resíduos de processamento de açúcar, tais como, mas não limitados ao bagaço da cana-deaçúcar; resíduos agrícolas, tais como, mas não limitados à palha de arroz, casca de arroz, palha de cevada, espigas de milho, palha de cereal, palha de trigo, palha de canola, palha de aveia, cascas de aveia e fibra de milho; caules e folhas, tais como, mas não limitados a caules e folhas de soja, caules e folhas de milho; suculentas, tais como, mas não limitados a agave; e resíduos florestais, tais como, mas não limitados à fibra de polpa de madeira reciclada, serragem, madeira dura (por exemplo, choupo, carvalho, bordo, bétula, salgueiro), madeira macia ou qualquer combinação dos mesmos. O material lignocelulósico pode compreender uma espécie de fibra; alternativamente, o material lignocelulósico pode compreender uma mistura de fibras que se originam de diferentes materiais lignocelulósicos. Outros materiais lignocelulósicos são resíduos agrícolas, tais como palha de cereais, incluindo palha de trigo, palha de cevada, palha de canola e palha de aveia; fibra de milho; caules e folhas, tais como caules e folhas de milho e caules e folhas de soja; gramíneas, tais como grama, caniço-malhado, grama de cordão, e miscanto; ou combinações dos mesmos.

[000119] Os substratos para ensaios de atividade da celulose podem ser divididos em duas categorias, solúveis e insolúveis, com base em sua solubilidade em água. Substratos solúveis incluem celodextrinas ou derivados, carboximetil celulose (CMC) ou hidroxietil celulose (HEC). Substratos insolúveis incluem celulose cristalina, celulose microcristalina (Avicel), celulose amorfa, tal como celulose inchada com ácido fosfórico (PASC), celulose tingida ou fluorescente e biomassa lignocelulósica pré-tratada. Esses substratos são geralmente material celulósico altamente ordenado e, portanto, apenas moderadamente solúvel.

[000120] Será apreciado que o material lignocelulósico adequado pode ser qualquer matéria-prima que contenha celulose solúvel e/ou insolúvel, onde a celulose insolúvel pode estar em uma forma cristalina ou não cristalina. Em várias modalidades, a biomassa lignocelulósica compreende, por exemplo, madeira, milho, caules e folhas de milho, serragem, casca, melaço, cana-deaçúcar, folhas, resíduos agrícolas e florestais, gramíneas, tais como grama, produtos de digestão de ruminantes, resíduos municipais, efluentes de fábrica de papel, jornal, papelão ou combinações dos mesmos.

[000121] A lama de papel também é uma matéria-prima viável para a produção de lactato ou acetato. A lama de papel é um resíduo sólido proveniente da polpação e da fabricação de papel, e normalmente é removido da água residual do processo em um clarificador primário. O custo de descarte da lama úmida é um incentivo significativo para converter o material para outros usos, tal como a conversão em etanol. Os processos fornecidos pela presente invenção são amplamente aplicáveis. Além disso, os produtos de sacarificação e/ou fermentação podem ser usados para produzir etanol ou produtos químicos de maior valor adicionados, tais como ácidos orgânicos, aromáticos, ésteres, acetona e intermediários poliméricos.

[000122] O processo da presente invenção coloca em contato as coculturas ou combinações aqui descritas com uma biomassa, de modo a permitir a conversão de, pelo menos, uma parte da biomassa no produto de fermentação. O produto fermentado pode ser um álcool, tais como, por exemplo, etanol, isopropanol, n-propanol, 1-butanol, metanol, acetona e/ou 1,2 propanodiol. Em uma modalidade, a biomassa ou substrato a ser hidrolisado é uma biomassa lignocelulósica e, em algumas modalidades, compreende amido (em uma forma gelatinizada ou bruta). No processo da presente invenção, as células de levedura podem ser colocadas em contato primeiro com a biomassa. Alternativamente, as células LAB podem ser primeiro colocadas em contato com a biomassa. Além disso, em algumas modalidades, ambas as células de levedura e as células LAB podem ser colocadas em contato simultaneamente com a biomassa.

[000123] O processo de fermentação pode ser realizado a temperaturas de, pelo menos, cerca de 25°C, cerca de 28°C, cerca de 30°C, cerca de 31°C, cerca de 32°C, cerca de 33°C, cerca de 34°C, cerca de 35°C, cerca de 36°C, cerca de 37°C, cerca de 38°C, cerca de 39°C, cerca de 40°C, cerca de 41°C, cerca de 42°C ou cerca de 50°C. Em algumas modalidades, o processo pode ser conduzido a temperaturas acima de cerca de 30°C, cerca de 31°C, cerca de 32°C, cerca de 33°C, cerca de 34°C, cerca de 35°C, cerca de 36°C, cerca de 37°C, cerca de 38°C, cerca de 39°C, cerca de 40°C, cerca de 41°C, cerca de 42°C ou cerca de 50°C.

[000124] Em algumas modalidades, a levedura e as coculturas obtidas no final de um ciclo de fermentação inicial podem ser substancialmente isoladas do meio fermentado e recicladas em um ciclo de fermentação adicional. Em tais modalidades, as leveduras e as células LAB recombinantes podem ser substancialmente isoladas do meio fermentado usando, por exemplo, centrifugação. Em ainda outras modalidades, as leveduras substancialmente isoladas e as células LAB recombinantes podem ser submetidas a uma lavagem com ácido antes de serem usadas em um ciclo de fermentação adicional.

[000125] Em algumas modalidades, o processo pode ser usado para produzir etanol a uma taxa particular. Por exemplo, em algumas modalidades, o etanol é produzido a uma taxa de, pelo menos cerca de 0,1 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 0,25 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 0,5 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 0,75 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 1,0 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 2,0 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 5,0 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 10 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 15 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 20,0 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 25 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 30 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 50 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 100 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 200 mg por hora por litro, ou pelo menos cerca de 500 mg por hora por litro.

[000126] A produção de etanol pode ser medida usando qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, a quantidade de etanol em amostras de fermentação pode ser avaliada usando análises de HPLC. Muitos kits de ensaio de etanol são comercialmente disponíveis que usam, por exemplo, ensaios com base em enzima de álcool oxidase.

[000127] A presente invenção será mais facilmente compreendida referindo-se aos seguintes exemplos que são determinados para ilustrar a invenção em vez de limitar o seu escopo.

EXEMPLO I - SISTEMA DE PRODUÇÃO DE NISINA

[000128] A cepa de Lactobacillus paracasei 12A (descrita no documento WO2018/013791) foi modificada em um etanologen (L. paracasei E3.1) pela deleção de suas enzimas LDH nativas (ldh1, ldh2, ldh3, ldh4 e dhic) e adição de genes sintéticos que codificam as enzimas PDC (SEQ ID NO: 1, codificada pela sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5) e ADH (SEQ ID NO: 3, codificada pela sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 6) de Z. mobilis. Duas cópias dos genes Z. mobilis foram integradas ao genoma com um cassete conduzido pelo promotor da fosfoglicerato mutase glicolítico (pgm) e o segundo cassete conduzido pelo promotor da proteína A de estresse universal (uspA), que se mostrou ser regulado positivamente durante os estágios de crescimento finais. Além disso, dois genes nativos que codificam manitol-1- fosfato 5-desidrogenase, mtlD1 e mtlD2, também foram deletados para eliminar a conversão de frutose-6-fosfato em manitol.

[000129] A operon nisina de L. lactis é complexa e consiste em 11 genes distintos (nisA, B, T, C, P, R, K, F, E e G). Um operon sintético que consiste apenas nos genes de imunidade, nisIEFG (codificando respectivamente os polipeptídeos de SEQ ID NO: 11 (codificado pela sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 56), 13 (codificado pela sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 60), 12 (codificado pela sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 58) e 14 (codificado pela sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 62)), foi projetado e sintetizado. Na construção das cepas E6.2 e M26400, o agrupamento de gene nisIFEG foi integrado no cromossomo E3.1 e expresso pela fusão dos genes de nisina com o promotor P5 sintético.

[000130] A cepa NP1 de Lactococcus lactis foi modificada em um etanologen (por exemplo, L. lactis BAC-1 ou M25077) pela deleção da enzima L-LDH primária e adição de genes sintéticos para as enzimas PDC (SEQ ID NO: 1, codificada pela sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 153) e ADH (SEQ ID NO: 3, codificada pela sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 154) de Z. mobilis. Os genes Z. mobilis foram expressos a partir de um plasmídeo de alta cópia, pNZ8048, conduzido pelo promotor pepN.

[000131] As cepas de Lb. paracasei resultantes (± o construto de resistência à nisina) foram cultivadas em MRS (sem nisina) e MRS suplementado com 500 ppm de nisina. O OD600 foi monitorado. Quando a nisina estava ausente do meio, ambas as cepas cresceram de forma idêntica, indicando nenhum efeito deletério da expressão de NisIEFG (Figura 1). No entanto, quando a nisina estava presente, o crescimento de Lb. paracasei E3.1 abrigando o vetor vazio foi completamente inibido (Figura 1). Por outro lado, a cepa que expressa o constructo de autoimunidade sintético (pDW2-P5-nisIEFG) mostrou apenas uma diminuição mínima na taxa de crescimento (Figura 1).

[000132] A cepa de L. lactis produtora de nisina e um controle de L. lactis não produtor de nisina foram cultivados em caldo MRS a 30°C durante duas transferências. O sobrenadante foi colhido por centrifugação e esterilizado por filtro através de um filtro de seringa de 0,22 µm. Onze isolados de plantas de etanol, conforme descrito na Tabela 1, foram cultivados durante duas transferências em MRS e inoculados em uma placa de microtitulação contendo meio MRS com várias diluições (1/5, 1/10, 1/20 e 1/50) de sobrenadantes de cada uma das duas cepas de L. lactis.
Tabela 1. Lista de isolados de planta testados para sensibilidade à nisina. A etapa do processo a partir da qual a cepa foi isolada está incluída. Lb, Lactobacillus; P., Pediococcus.

[000133] O OD600 foi monitorado durante 18 horas e o tempo para atingir uma leitura de 0,5 foi registrado para cada cepa. O aumento no tempo observado entre o sobrenadante contendo nisina e o controle sem nisina foi traçado e usado como uma medida da inibição de nisina. Nenhuma diferença no crescimento foi observada para as cepas contendo as várias doses de sobrenadante de controle, enquanto seis das onze cepas testadas foram completamente inibidas pelo sobrenadante contendo nisina (Figura 2). As cepas restantes mostraram vários níveis de inibição, mas foram capazes de atingir um OD600 de 0,5 dentro do período de 18 horas (Figura 2).

[000134] As cepas L. paracasei E6.2 e L. lactis BAC-1 foram cultivadas individualmente ou juntas em um meio que compreende reversão de fermentação (por exemplo, um líquido obtido após a fermentação do milho, a remoção de grãos secos destilados e destilação de etanol) com 8,5 % de sólidos, um pH de 5,5, 4% de glicose a uma temperatura de 33°C. As unidades formadoras de colônia (CFU) foram determinadas em vários intervalos de tempo e são apresentadas na Tabela 2.
Tabela 2. CFU por mL de células L. paracasei E6.2 e L. lactis BAC-1 no início da cultura (0 h), bem como, 12 h, 36 h, 42 h e 48 h após o início da cultura.

EXEMPLO II - SISTEMA DE EXPRESSÃO DE PEDIOCINA

[000135] A cepa NP1 de L. lactis produtora de nisina foi modificada para secretar pediocina através do vetor pNZ8048 de alta cópia. Os quatro genes responsáveis pela produção, imunidade e processamento de pediocina, pedABCD, foram clonados em um único operon sob controle do promotor da fosfopentomutase de L. lactis. O sinal de secreção de pediocina nativa foi mantido em PedA. As cepas de L. lactis resultantes foram propagadas em substrato GM17 e os sobrenadantes foram analisados quanto à presença de pediocina por espectrometria de massa MALDI-TOF (ver resultados mostrados na Figura 3B).

EXEMPLO III - SISTEMA DE EXPRESSÃO DE BROCHOCINA

[000136] A cepa NP1 de L. lactis produtora de nisina foi modificada para secretar brochocina através do vetor pNZ8048 de alta cópia. Os genes estruturais e de imunidade do operon da pediocina descritos acima, PedAB, foram substituídos pelas duas proteínas estruturais da brochocina, brcAB, bem como o gene da imunidade brcI. O sinal de secreção de pediocina nativo foi, portanto, utilizado para a secreção de BrcA, bem como, para os genes de processamento de pediocina pedCD. As cepas resultantes foram propagadas em substrato GM17 e os sobrenadantes analisados quanto à presença de brochocina por espectrometria de massa MALDI-TOF (ver resultados mostrados na Figura 3C).

EXEMPLO IV - SISTEMAS DE EXPRESSÃO DE BACTERIOCINA ADICIONAIS

[000137] Sistemas de expressão de bacteriocina adicionais foram projetados e construídos. Os detalhes desses sistemas de expressão de bacteriocina adicionais são fornecidos na Tabela 3.
Tabela 3. Descrição das proteínas codificadas pelos vários sistemas de bacteriocina, bem como, o ácido nucleico presente nos vários sistemas de bacteriocina. Cada cassete inclui regiões de codificação para uma bacteriocina, suas proteínas de imunidade relacionadas e, quando presentes, suas proteínas relacionadas adicionais.

[000138] Embora a invenção tenha sido descrita em conexão com modalidades específicas da mesma, será entendido que o escopo das reivindicações não deve ser limitado pelas modalidades preferidas estabelecidas nos exemplos, mas deve ser determinada a interpretação mais ampla consistente com a descrição como um todo.

REFERÊNCIAS

[000139] Fukao M, Obita T, Yoneyama F, Kohda D, Zendo T, Nakayama J, Sonomoto K. Complete covalent structure of nisin Q, new natural nisin variant, containing post-translationally modified amino acids. Biosci Biotechnol Biochem. 2008 Jul;72(7):1750-5.

[000140] O'Connor PM, O'Shea EF, Guinane CM, O'Sullivan O, Cotter PD, Ross RP, Hill C. Nisin H Is a New Nisin Variant Produced by the Gut-Derived Strain Streptococcus hyointestinalis DPC6484. Appl Environ Microbiol. 2015 Jun 15;81(12):3953-60.

[000141] O'Sullivan JN, O'Connor PM, Rea MC, O'Sullivan O, Walsh CJ, Healy B, Mathur H, Field D, Hill C, Ross RP. Nisin J, a Novel Natural Nisin Variant, Is Produced by Staphylococcus capitis Sourced from the Human Skin Microbiota. J Bacteriol. 2020 Jan 15;202(3).

[000142] Wirawan RE, Klesse NA, Jack RW, Tagg JR. Molecular and genetic characterization of a novel nisin variant produced by Streptococcus uberis. Appl Environ Microbiol. 2006 Feb;72(2):1148-56.

Claims

Co-cultura de células bacterianas de ácido lático para preparar um produto fermentado a partir de uma biomassa, a co-cultura sendo CARACTERIZADA pelo fato de compreender:
- uma primeira célula de bactéria de ácido lático recombinante (LAB) que expressa pelo menos uma bacteriocina e, opcionalmente, uma outra bacteriocina, em que a primeira célula LAB recombinante compreende:
uma ou mais primeiras moléculas de ácido nucleico heterólogas que codificam um ou mais polipeptídeos para converter, pelo menos em parte, a biomassa no produto fermentado;
opcionalmente uma ou mais segundas moléculas de ácido nucleico heterólogas que codificam a pelo menos uma bacteriocina e / ou a bacteriocina adicional e um ou mais polipeptídeos para conferir imunidade contra a pelo menos uma bacteriocina e / ou a bacteriocina adicional; e
- uma segunda célula LAB recombinante capaz de converter, pelo menos em parte, a biomassa no produto fermentado, em que a segunda LAB recombinante compreende:
uma ou mais terceiras moléculas de ácido nucleico heterólogas que codificam um ou mais polipeptídeos para converter, pelo menos em parte, a biomassa no produto fermentado; e
uma ou mais quarta molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica um ou mais polipeptídeos para conferir imunidade contra a pelo menos uma bacteriocina e / ou a bacteriocina adicional expressa pela primeira célula LAB recombinante.
Co-cultura, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a pelo menos uma bacteriocina e / ou a bacteriocina adicional compreende um lantibiótico, uma bacteriocina cíclica, uma bacteriocina de Classe IIA ou uma bacteriocina de Classe IIB.
Co-cultura, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADA pelo fato de que:
o lantibiótico é nisina e a segunda e / ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga codifica NisI e opcionalmente NisE, NisF e / ou NisG;
a bacteriocina cíclica é gassericina e a segunda e / ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga codifica GaaI e opcionalmente GaaT e / ou GaaE;
a bacteriocina cíclica é plantariciclina A e a segunda e / ou quarta molécula de ácido nucleico heteróloga codifica PlcD e / ou PlcI e, opcionalmente, PlcT, PlcE e / ou PlcB;
a bacteriocina Classe IIA é plantaricina 423 e a segunda e / ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga codifica PlaB e opcionalmente PlaC e / ou PlaD;
a bacteriocina da Classe IIA é a pediocina e a segunda e / ou quarta molécula de ácido nucleico heteróloga codifica PedB e, opcionalmente, PedC e / ou PedD;
a bacteriocina de Classe IIA é lactoccina A e a segunda e / ou quarta molécula de ácido nucleico heteróloga codifica LciA e, opcionalmente, LcmA e / ou LceA;
a bacteriocina de Classe IIA é horediocina A e a segunda e / ou quarta molécula de ácido nucleico heteróloga codifica HdrI e opcionalmente HdrM, HdrD e / ou HdrC; e / ou
a bacteriocina Classe IIB é brochocina e a segunda e / ou quarta molécula de ácido nucleico heteróloga codifica BrcI, em que brochocina é um dímero que compreende BrcA e BrcB.
Co-cultura, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADA pelo fato de que:
nisina tem a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 7 a 10, é uma variante da sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 7 a 10 tendo atividade de bacteriocina nisina ou é um fragmento do aminoácido sequência de qualquer uma das SEQ ID NO: 7 a 10 com atividade de bacteriocina nisina;
a segunda e / ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreende uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 53 ou uma sequência degenerada que codifica SEQ ID NO: 7;
a segunda e / ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreende uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 54 ou uma sequência degenerada que codifica SEQ ID NO: 8;
NisI tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11 que confere imunidade contra a nisina ou é um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11 que confere imunidade contra nisin;
a segunda e / ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreende uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 55, 56 ou uma sequência degenerada que codifica SEQ ID NO: 11;
NisE tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13 com atividade de transportador de nisina ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 com transportador de nisina atividade;
a segunda e / ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreende uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 59, 60 ou uma sequência degenerada que codifica SEQ ID NO: 13;
NisF tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12 tendo atividade de transportador de nisina ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 tendo transportador de nisina atividade;
a segunda e / ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreende uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 57, 58 ou uma sequência degenerada que codifica SEQ ID NO: 12;
NisG tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 tendo atividade de nisina permease ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 tendo nisina permease atividade;
a segunda e / ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreende uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 61, 62 ou uma sequência degenerada que codifica SEQ ID NO: 14;
a gassericina tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15 ou 16, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15 ou 16 com atividade da bacteriocina da gassericina ou é um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15 ou 16 com atividade de bacteriocina gassericina;
a segunda e / ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreende uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 63, 64 ou uma sequência degenerada que codifica SEQ ID NO: 15;
GaaI tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17 que confere imunidade contra a gassericina ou é um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17 que confere imunidade contra gassericina;
a segunda e / ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreende uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 65, 66, 67 ou uma sequência degenerada que codifica SEQ ID NO: 17;
GaaT tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18 tendo atividade de transportador de gassericina ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 tendo transportador de gassericina atividade;
a segunda e / ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreende uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 68, 69 ou uma sequência degenerada que codifica SEQ ID NO: 18;
GaaE tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19 com atividade de gassericina-permease ou é um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19 com gassrina-permease atividade;
a segunda e / ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreende uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 70, 71 ou uma sequência degenerada que codifica SEQ ID NO: 19;
plantariciclina A tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 ou 29, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 ou 29 tendo atividade de bacteriocina plantariciclina A ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 ou 29 com atividade de bacteriocina plantariciclina A;
a segunda e / ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreende uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 94, 95 ou uma sequência degenerada que codifica SEQ ID NO: 28;
PlcD tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 30, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 30 conferindo, na presença de PlcI, imunidade contra a plantariciclina A ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 conferindo, na presença de PlcI, imunidade contra plantariciclina A;
a segunda e / ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreende uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 96, 97, 98 ou uma sequência degenerada que codifica SEQ ID NO: 30;
PlcI tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 31 conferindo, na presença de PlcD, imunidade contra a plantariciclina A ou é um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 31 conferindo, na presença de PlcD, imunidade contra plantariciclina A;
a segunda e / ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreende uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 99, 100, 101 ou uma sequência degenerada que codifica SEQ ID NO: 31;
PlcT tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 tendo atividade de ligação de ATP ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 tendo ligação de ATP atividade;
a segunda e / ou quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreende uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 102, 103 ou uma sequência degenerada que codifica SEQ ID NO: 32;
PlcE tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 33, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 33 com atividade de transportador de plantariciclina A ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 com plantariciclina Uma atividade transportadora;
a segunda e / ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreende uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 104, 105 ou uma sequência degenerada que codifica SEQ ID NO: 33;
PlcB possui a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 34, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 34 ou é um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 34;
a segunda e / ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreende uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 106, 107 ou uma sequência degenerada que codifica SEQ ID NO: 34;
plantaricina 423 tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35, 36, 111 ou 113, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35, 36, 111 ou 113 tendo atividade de bacteriocina plantaricina 423 ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35, 36, 111 ou 113 com atividade de bacteriocina plantaricina 423;
a segunda e / ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreende uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 108, 109 ou uma sequência degenerada que codifica SEQ ID NO: 35;
a segunda e / ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreende uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 110 ou uma sequência degenerada que codifica SEQ ID NO: 111;
a segunda e / ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreende uma sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 112 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 113;
PlaB tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37 que confere imunidade contra a plantaricina 423 ou é um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37 que confere imunidade contra a plantaricina 423;
a segunda e / ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreende uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 114, 115, 116 ou uma sequência degenerada que codifica SEQ ID NO: 37;
PlaC possui a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38 ou é um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38;
a segunda e / ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreende uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 117, 118 ou uma sequência degenerada que codifica SEQ ID NO: 38;
PlaD tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 39, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 39 com atividade de transportador de plantaricina 423 ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 com plantaricina 423 atividade transportadora;
a segunda e / ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreende uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 119, 120 ou uma sequência degenerada que codifica SEQ ID NO: 39;
pediocina tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, 21, 51, 52, 75 ou 144, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, 21, 51, 52, 75 ou 144 tendo pediocina atividade de bacteriocina ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, 21, 51, 52, 75 ou 144 com atividade de bacteriocina de pediocina;
a segunda e / ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreende uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 72, 73 ou uma sequência degenerada que codifica SEQ ID NO: 20;
a segunda e / ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreende uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 141, 142 ou uma sequência degenerada que codifica SEQ ID NO: 51;
a segunda e / ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreende uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 74 ou uma sequência degenerada que codifica SEQ ID NO: 75;
a segunda e / ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreende uma sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 143 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 144;
PedB tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22 que confere imunidade contra a pediocina ou é um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22 que confere imunidade contra pediocina;
a segunda e / ou quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreende uma sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 76, 77 ou 78 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 22;
PedC tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 146, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 146 tendo, na presença de PedD, atividade transportadora de pediocina acessória ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 146 tendo, na presença de PedD, atividade transportadora de pediocina acessória;
a segunda e / ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreende uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 147, 148 ou uma sequência degenerada que codifica SEQ ID NO: 146;
PedD tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 149, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 149 tendo atividade de transportador de pediocina ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 149 tendo transportador de pediocina atividade;
a segunda e / ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreende uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 150, 151 ou uma sequência degenerada que codifica SEQ ID NO: 149;
a lactoccina A tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 40 ou 41, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 40 ou 41 com atividade da bacteriocina da lactoccina A ou é um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 40 ou 41 com atividade da bacteriocina lactoccina A;
a segunda e / ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreende uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 121 ou uma sequência degenerada que codifica SEQ ID NO: 40;
LciA tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 42, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 42 que confere imunidade contra a lactoccina A ou é um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 42 que confere imunidade contra a lactoccina A;
a segunda e / ou quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreende uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 122, 123, ou uma sequência degenerada que codifica SEQ ID NO: 42;
LcmA tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43 tendo atividade de exportação / processamento de lactoccina A ou é um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43 tendo atividade de exportação / processamento de lactoccina A;
a segunda e / ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreende uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 124 ou uma sequência degenerada que codifica SEQ ID NO: 43;
LceA tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 44, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 44 com atividade de ligação de ATP ou é um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 44 com ligação de ATP atividade;
a segunda e / ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreende uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 125 ou uma sequência degenerada que codifica SEQ ID NO: 44;
horediocina A tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 45, 46, 129 ou 131, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 45, 46, 129 ou 131 com atividade da bacteriocina da horediocina A ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45, 46, 129 ou 131 possuindo atividade de bacteriocina horediocina A;
a segunda e / ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreende uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 126, 127 ou uma sequência degenerada que codifica SEQ ID NO: 45;
a segunda e / ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreende uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 128 ou uma sequência degenerada que codifica SEQ ID NO: 129;
a segunda e / ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreende uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 130 ou uma sequência degenerada que codifica SEQ ID NO: 131;
HdrI tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 47, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 47 que confere imunidade contra horediocina A ou é um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 47 que confere imunidade contra a horediocina A;
a segunda e / ou quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreende uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 132, 133, 134 ou uma sequência degenerada que codifica SEQ ID NO: 47;
HdrM tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48 com atividade de dissulfeto isomerase de horediocina A ou é um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48 tendo atividade de dissulfeto isomerase de horediocina A;
a segunda e / ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreende uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 135, 136 ou uma sequência degenerada que codifica SEQ ID NO: 48;
HdrD tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49 tendo atividade de clivagem e transportador da horediocina A ou é um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49 tendo atividade de clivagem e transportadora de horediocina A;
a segunda e / ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreende uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 137, 138 ou uma sequência degenerada que codifica SEQ ID NO: 49;
HdrC tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 50, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 50 tendo, na presença de HdrD, atividade transportadora acessória de horediocina A ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 tendo, na presença de HdrD, atividade transportadora acessória de horediocina A;
a segunda e / ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreende uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 139, 140 ou uma sequência degenerada que codifica SEQ ID NO: 50;
BrcA tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23, 24, 82 ou 84, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23, 24, 82 ou 84 tendo, em combinação com BrcB, atividade da bacteriocina da brochocina ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, 24, 82 ou 84 tendo, em combinação com BrcB, atividade de bacteriocina de brochocina;
a segunda e / ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreende uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 79 ou 80 ou uma sequência degenerada que codifica SEQ ID NO: 23;
a segunda e / ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreende uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 81 ou uma sequência degenerada que codifica SEQ ID NO: 82;
a segunda e / ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreende uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 83 ou uma sequência degenerada que codifica SEQ ID NO: 84;
BrcB tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25, 26, 88 ou 90 é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25, 26, 88 ou 90 tendo, em combinação com BrcA, atividade da bacteriocina da brochocina ou é um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25, 26, 88 ou 90 tendo, em combinação com BrcA, atividade da bacteriocina da brochocina;
a segunda e / ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreende uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 85 ou 86 ou uma sequência degenerada que codifica SEQ ID NO: 25;
a segunda e / ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreende uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 87 ou uma sequência degenerada que codifica SEQ ID NO: 88;
a segunda e / ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreende uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 89 ou uma sequência degenerada que codifica SEQ ID NO: 90;
BrcI tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27 que confere imunidade contra brochocina ou é um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27 que confere imunidade contra brochocina; e / ou
a segunda e / ou a quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreende uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 91, 92 ou 93 ou uma sequência degenerada que codifica SEQ ID NO: 27.
Co-cultura, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADA pelo fato de que quando a pelo menos uma bacteriocina e / ou a bacteriocina adicional é a bacteriocina da Classe IIA ou da Classe IIB:
a pelo menos uma bacteriocina e / ou a bacteriocina adicional compreende, antes da secreção, uma sequência de sinal tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 145, sendo uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 145 tendo a sequência de sinal atividade ou sendo um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 145 tendo atividade de sequência de sinal; e / ou
• a segunda e / ou quarta molécula de ácido nucleico heteróloga compreende a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 152 ou uma sequência degenerada que codifica a SEQ ID NO: 145.
Co-cultura, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADA pelo fato de que o primeiro LAB expressa uma pluralidade de bacteriocinas.
Co-cultura, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADA pelo fato de que a primeira e / ou terceira molécula de ácido nucleico heteróloga codifica uma piruvato descarboxilase e / ou uma álcool desidrogenase.
Co-cultura, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADA pelo fato de que:
a piruvato descarboxilase tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 tendo atividade de piruvato descarboxilase ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 tendo atividade da piruvato descarboxilase;
a primeira e / ou terceira molécula de ácido nucleico heteróloga compreende uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2, 5 ou 153 ou uma sequência degenerada que codifica SEQ ID NO: 1;
a álcool desidrogenase tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, é uma variante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 com atividade da álcool desidrogenase ou é um fragmento da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 tendo atividade da álcool desidrogenase;
a primeira e / ou terceira molécula de ácido nucleico heteróloga compreende uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 4, 6 ou 154 ou uma sequência degenerada que codifica SEQ ID NO: 3;
a primeira célula LAB recombinante e / ou a segunda célula LAB recombinante tem uma atividade diminuída de lactato desidrogenase quando comparada a uma célula LAB nativa correspondente;
a primeira célula LAB recombinante e / ou a segunda célula LAB recombinante compreende pelo menos um gene nativo inativado ou deletado que codifica para uma lactato desidrogenase;
a primeira célula LAB recombinante e / ou a segunda célula LAB recombinante tem uma atividade diminuída de manitol desidrogenase em comparação com uma célula LAB nativa correspondente;
a primeira célula LAB recombinante e / ou a segunda célula LAB recombinante compreende pelo menos um gene nativo inativado ou deletado que codifica para uma manitol-1-fosfato 5-desidrogenase.
Co-cultura, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADA pelo fato de que:
o pelo menos um gene nativo que codifica para a lactato desidrogenase é ldh1, ldh2, ldh3, ldh4 ou dhic;
a primeira célula LAB recombinante e / ou a segunda célula LAB recombinante compreende genes nativos inativados ou deletados ldh1, ldh2, ldh3, ldh4 e dhic;
o pelo menos um gene nativo que codifica para a manitol-1-fosfato 5- desidrogenase é mltD1 ou mltD2; e / ou
a primeira célula LAB recombinante e / ou a segunda célula LAB recombinante compreende genes mltD1 e mltD2 nativos inativados ou deletados.
Co-cultura, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADA pelo fato de que:
pelo menos uma da primeira, segunda, terceira e / ou quarta molécula de ácido nucleico heteróloga está em um vetor extracromossômico;
pelo menos uma da primeira, segunda, terceira e / ou quarta molécula de ácido nucleico heteróloga está integrada em um cromossomo bacteriano;
a primeira célula LAB recombinante é do gênero Lactococcus;
a primeira célula LAB recombinante é da espécie Lactococcus lactis;
a segunda célula LAB recombinante é do gênero Lactobacillus; e / ou
a segunda célula LAB recombinante é da espécie Lactobacillus paracasei.
Combinação CARACTERIZADA pelo fato de que compreende a co-cultura, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, e uma célula de levedura.
Combinação, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADA pelo fato de que:
a célula de levedura é uma célula de levedura recombinante; e / ou
a célula de levedura é do gênero Saccharomyces sp .; e / ou a célula de levedura é da espécie Saccharomyces cerevisiae.
Processo para converter uma biomassa em um produto de fermentação e, opcionalmente, prevenir a contaminação da biomassa por um microrganismo contaminante, o processo sendo CARACTERIZADO por compreender o contato da biomassa com a co-cultura, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 11 ou a combinação como definida na reivindicação 11 ou 12 sob a condição de permitir a conversão de pelo menos uma parte da biomassa no produto de fermentação.
Processo, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que:
a biomassa compreende milho fornecido opcionalmente como uma pasta; e / ou
o produto da fermentação é o etanol.
Kit, CARACTERIZADO pelo fato de compreender a primeira célula de bactéria láctica recombinante (LAB) como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10 e a segunda célula de bactéria láctica recombinante (LAB) como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10.
Kit, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda a célula de levedura como definida na reivindicação 11 ou 12 e / ou instruções para realizar o processo como definido na reivindicação 13 ou 14.
Meio, CARACTERIZADO pelo fato de compreender a primeira célula de bactéria láctica recombinante (LAB) como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, a segunda célula de bactéria láctica recombinante (LAB) como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10 e, opcionalmente, a célula de levedura como definida na reivindicação 13 ou 14 e / ou um produto de fermentação.
Meio, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que é um meio de propagação ou um meio de fermentação.
Meio, de acordo com a reivindicação 17 ou 18, CARACTERIZADO pelo fato de que o produto da fermentação é o etanol.