BR112021009161A2

BR112021009161A2 - Expressão combinada de enzimas de produção de trealose e degradação de trealose

Info

Publication number: BR112021009161A2
Application number: BR112021009161-0A
Authority: BR
Inventors: Trisha Barrett; Ryan Skinner; Aaron Argyros
Original assignee: Lallemand Hungary Liquidity Management Llc.
Priority date: 2018-11-13
Filing date: 2019-11-13
Publication date: 2021-08-31
Also published as: WO2020100062A1; US20220220487A1; CA3119631A1

Abstract

expressão combinada de enzimas de produção de trealose e degradação de trealose referência cruzada a pedidos relacionados e declaração de listagem de sequências. a presente invenção refere-se a uma célula hospedeira de levedura recombinante com uma primeira modificação genética para expressar uma trealase heteróloga, e uma segunda modificação genética para aumentar a produção de trealose. a presente invenção também refere-se a um processo usando a célula hospedeira de levedura recombinante para fazer um produto fermentado, tal como etanol.

Description

“EXPRESSÃO COMBINADA DE ENZIMAS DE PRODUÇÃO DE TREALOSE E DEGRADAÇÃO DE TREALOSE” REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS E DECLARAÇÃO DE LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0001] Este pedido reivindica prioridade do Pedido Provisional U.S. 62/760.649 depositado em 13 de Novembro de 2018 e aqui incorporado em sua totalidade. A listagem de sequência associada a este pedido é fornecida em formato de texto em vez de uma cópia em papel e é aqui incorporada por referência no relatório descritivo. O nome do arquivo de texto que contém a listagem de sequência é PCT _-_ Sequence_listing_as_filed. O arquivo de texto é 293 Ko, foi criado em 13 de Novembro de 2019 e está sendo enviado eletronicamente.

CAMPO TECNOLÓGICO

[0002] A presente invenção refere-se a uma célula hospedeira de levedura recombinante capaz de ser modificada para expressar uma trealase heteróloga e aumentar a produção de trealose durante a fermentação.

FUNDAMENTO

[0003] Considerando que a redução da glucoamilase e da alfa- amilase representa uma economia de custo substancial para os produtores de etanol, aumentar o rendimento geral é significativamente mais valioso. Um potencial para melhorias de rendimento é o direcionamento de açúcares fermentáveis residuais. Por exemplo, uma fermentação típica de etanol de milho terá aproximadamente 4 g/L de açúcares DP2 residuais, compostos por maltose, isolmaltose e a maioria sendo trealose. Esses dissacarídeos representam um potencial de 4 g/L de etanol adicional. A trealose é um produto essencial do metabolismo da levedura, normalmente produzida como um protetor de estresse e reserva de carboidratos. Sendo um açúcar produzido por levedura, há potencial para ambas as estratégias de engenharia metabólica reduzirem a produção e/ou secreção de trealases que podem hidrolisar a trealose em duas porções de glicose.

[0004] A trealose é um dissacarídeo não redutor composto por duas moléculas de glicose ligadas no carbono 1, formando uma ligação α-α. Na levedura, a trealose pode atuar como armazenamento de carboidratos, mas mais importante, foi bem caracterizada por atuar como um protetor de estresse contra a dessecação, altas temperaturas, toxicidade do etanol e condições acídicas, estabilizando membranas biológicas e polipeptídeos nativos. A trealose intracelular é bem regulada em leveduras com base no equilíbrio entre síntese e degradação. Conforme apresentado na Figura 1, em leveduras, a trealose é catalisada pela combinação de uma porção uridina-difosfato-glicose a uma glicose-6-fosfato para formar trealose-6-fosfato (etapa 010). O grupo fosfato é, em seguida, removido para formar trealose (etapa 020). A via primária (etapas 010 e 020) é facilitada por um complexo polipeptídico codificado por 4 genes: a trealose-6-fosfato sintase (TPS1), trealose-6-fosfato fosfatase (TPS2) e dois polipeptídeos reguladores, TPS3 e TSL1. A trealose pode ser catabolizada em duas moléculas de glicose pela enzima trealase citoplasmática, NTH1, ou pela trealase extracelular amarrada, ATH1 (etapa 030). A via biossintética da trealose também foi proposta para ser um regulador primário da glicólise, criando um ciclo fútil. Como a glicose é fosforilada pela hexoquinase (HXK, etapa 040), os níveis de fosfato orgânico livre intracelular são rapidamente depletados, o que é necessário para processos a jusante e outros processos metabólicos. A conversão de glicose-6-fosfato em trealose não apenas remove o açúcar da glicólise, criando um tampão, mas a via também regenera o fosfato inorgânico. Outro controle primário da glicólise é a inibição de HXK2 pela trealose-6-fosfato, desacelerando ainda mais o fluxo da glicólise.

[0005] Numerosas manipulações da via da trealose em Saccharomyces cerevisiae foram descritas. As tentativas de manipulações de trealose como um meio de direcionar o aumento de rendimento de etanol focaram principalmente na superexpressão da via, particularmente com TPS1/TPS2 (Cao et al., 2014; Guo et al., 2011; An et al., 2011). Ge et al. (2013) melharam com sucesso os rendimentos de etanol na glicose pura com a superexpressão do componente TSL1, que também foi implicado na sinalização da glicose. No entanto, a deleção da via biossintética tem se apresentado mais desafiadora. Conforme revisado por Thevelein and Hohmann (1995), as tentativas de remover a função TPS1 levaram à diminuição da capacidade de crescer em fontes de carbono prontamente fermentáveis devido ao controle da glicólise acima mencionado. As análises funcionais do complexo TPS foram extensivamente estudadas usando abordagens de nocaute (Bell et al., 1998).

[0006] Seria altamente desejável ser fornecido com uma célula hospedeira recombinante capaz de melhorar o rendimento da fermentação e que também retivesse sua robustez durante a fermentação, especialmente na presença de um estressor.

BREVE SUMÁRIO

[0007] A presente invenção refere-se a uma célula hospedeira de levedura robusta recombinante capaz de manter os rendimentos de fermentação durante uma fermentação estressante, bem como, processos usando a célula hospedeira de levedura robusta recombinante para fazer um produto de fermentação a partir de uma biomassa.

[0008] De acordo com um primeiro aspecto, a célula hospedeira de levedura recombinante tem uma primeira modificação genética para expressar uma trealase heteróloga, e uma segunda modificação genética para aumentar a produção de trealose. Em uma modalidade, a trealase heteróloga pode ser uma trealase associada à célula. Em outra modalidade, a trealase heteróloga pode ser uma trealase secretada. Em ainda uma outra modalidade, a trealase heteróloga: (a) tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36 ou 38; (b) é uma variante da sequência de aminoácidos de (a) exibindo atividade de trealase; ou (c) é um fragmento da sequência de aminoácidos de (a) ou (b) exibindo atividade de trealase. Em uma modalidade, a trealase heteróloga é de Achlya sp., por exemplo Achlya hypogyna, e pode ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36, ser uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 exibindo atividade de trealase ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 ou a variante e exibindo atividade de trealase. Em outra modalidade, a trealase heteróloga é de Ashbya sp., por exemplo, Ashbya gossypii e pode ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, ser uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 exibindo atividade de trealase ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 ou a variante e exibindo atividade de trealase. Em ainda outra modalidade, a trealase heteróloga é de Aspergillus sp.. Em tal modalidade, a trealase pode ser de Aspergillus clavatus e tem, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, ser uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 exibindo atividade de trealase ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 ou a variante e exibindo atividade de trealase.

Em tal modalidade, a trealase heteróloga é de Aspergillus flavus, e pode ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, ser uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 exibindo atividade de trealase ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 ou a variante e exibindo atividade de trealase.

Ainda em tal modalidade, a trealase heteróloga é de Aspergillus fumigatus, e tem, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, ser uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 exibindo atividade de trealase ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou a variante e exibindo atividade de trealase.

Ainda nesta modalidade, a trealase heteróloga é de Aspergillus lentulus e pode ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, ser uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 exibindo atividade de trealase ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 ou a variante e exibindo atividade de trealase.

Ainda nesta modalidade, a trealase heteróloga é de Aspergillus ochraceoroseus e pode ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, ser uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 exibindo atividade de trealase ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 ou a variante e exibindo atividade de trealase.

Em ainda outra modalidade, a trealase heteróloga é de Escovopsis sp., por exemplo de Escovopsis weberi, e pode ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, ser uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 exibindo atividade de trealase ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 ou a variante e exibindo atividade de trealase.

Em ainda outra modalidade, a trealase heteróloga é de Fusarium sp., por exemplo de Fusarium oxysporum, e pode ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, ser uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 exibindo atividade de trealase ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 ou a variante e exibindo atividade de trealase.

Em ainda outra modalidade, a trealase heteróloga é de Kluyveromyces sp., por exemplo, de Kluyveromyces marxianus, e pode ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, ser uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 exibindo atividade de trealase ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 ou a variante e exibindo atividade de trealase.

Em ainda outra modalidade, a trealase heteróloga é de Komagataella sp., por exemplo de Komagataella phaffii, e pode ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, ser uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 exibindo atividade de trealase ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 ou a variante e exibindo atividade de trealase.

Em ainda uma outra modalidade, a trealase heteróloga é de Metarhizium sp., por exemplo de Metarhizium anisopliae, e pode ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, ser uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 exibindo atividade de trealase ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 ou a variante e exibindo atividade de trealase.

Em ainda outra modalidade, a trealase heteróloga é de Microsporum sp., por exemplo, de Microsporum gypseum, e pode ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, ser uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 exibindo atividade de trealase ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 ou a variante e exibindo atividade de trealase.

Em ainda uma outra modalidade, a trealase heteróloga é de Neosartorya sp., por exemplo de Neosartorya udagawae, e pode ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, ser uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 exibindo atividade de trealase ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 ou a variante e exibindo atividade de trealase.

Em uma outra modalidade, a trealase heteróloga é de Neurospora sp., por exemplo, de Neurospora crassa, e pode ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, ser uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 exibindo atividade de trealase ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 ou a variante e exibindo atividade de trealase.

Em ainda outra modalidade, a trealase heteróloga é de Ogataea sp., por exemplo, de Ogataea parapolymorpha, e pode ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, ser uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 exibindo atividade de trealase ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 ou a variante e exibindo atividade de trealase.

Em outra modalidade, a trealase heteróloga é de Rhizoctonia sp., por exemplo de Rhizoctonia solani, e pode ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, ser uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 exibindo atividade de trealase ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 ou a variante e exibindo atividade de trealase.

Em ainda uma outra modalidade, a trealase heteróloga é de Schizopora sp., por exemplo, de Schizopora paradoxa, e pode ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38, ser uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38 exibindo atividade de trealase ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38 ou a variante e exibindo atividade de trealase.

Em uma outra modalidade, a trealase heteróloga é de Thielavia sp., por exemplo, de Thielavia terrestris, e pode ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, ser uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 exibindo atividade de trealase ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 ou a variante e exibindo atividade de trealase.

Em ainda outra modalidade, a segunda modificação genética permite a expressão de uma segunda enzima (heteróloga) envolvida na produção de trealose (TPS1 e/ou TPS2, por exemplo) e/ou um segundo polipeptídeo regulador (heterólogo) envolvido na regulação da produção de trealose (TPS3 e/ou TSL1, por exemplo). Em ainda outra modalidade, a célula hospedeira de levedura recombinante superexpressa a segunda enzima e/ou o segundo polipeptídeo regulador.

Em uma modalidade, a segunda modificação genética permite a expressão de, pelo menos, um de TPS1, TPS2, TPS3 ou TSL1. Em outra modalidade, a segunda modificação genética permite a expressão de TPS1. Em uma outra modalidade, a segunda modificação genética permite a expressão de TPS2. Em ainda outra modalidade, a segunda modificação genética permite a expressão de TPS3. Em ainda outra modalidade, a segunda modificação genética permite a expressão de TSL1. Em algumas modalidades, a célula hospedeira de levedura recombinante exibe robustez aumentada na presença de um estressor, quando comparada a uma célula hospedeira de levedura recombinante correspondente com a primeira modificação genética e sem a segunda modificação genética.

Em alguma modalidade adicional, a célula hospedeira de levedura recombinante ainda compreende, pelo menos, um de: uma terceira modificação genética permitindo ou aumentando a expressão de uma enzima sacarolítica heteróloga; uma quarta modificação genética permitindo ou aumentando a produção de formiato; uma quinta modificação genética permitindo ou aumentando a utilização de acetil- CoA; uma sexta modificação genética limitando a produção de glicerol; e/ou uma sétima modificação genética facilitando o transporte de glicerol na célula hospedeira de levedura recombinante. Em algumas modalidades, a célula hospedeira de levedura recombinante é do gênero Saccharomyces sp., por exemplo, Saccharomyces cerevisiae.

[0009] Em um segundo aspecto, a presente invenção fornece um processo para converter uma biomassa em um produto de fermentação, o processo compreende colocar em contato a biomassa com a célula hospedeira de levedura recombinante aqui definida sob condições para permitir a conversão de, pelo menos, uma parte da biomassa no produto de fermentação. Em algumas modalidades, a biomassa compreende milho que pode ser opcionalmente fornecido como uma pasta. Em algumas modalidades adicionais, o produto da fermentação é um álcool, tal como etanol. Em ainda outra modalidade, o processo é conduzido, pelo menos em parte, na presença de um estressor.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00010] Tendo assim descrito genericamente a natureza da invenção, referência será feita agora aos desenhos anexos, mostrando a título de ilustração, uma modalidade preferida da mesma, e na qual:

[00011] A Fig. 1 ilustra a via das sínteses de trealose nativa. Abreviações: HXK = hexoquinase; GLK = glucoquinase; PGM = fosfoglucomutase; UGP1 = UDP-glicose pirofosforilase; GSY = glicogênio sintase; GPH = glicogênio fosforilase; TPS1 = trealose-6-fosfato sintase; TPS3 = trealose-6-fosfato sintase; TSL1 = cadeia longa de trealose sintase; TPS2 = trealose-6-fosfato fosfatase; NTH = trehalase neutra; ATH1 = trealase ácida.

[00012] A Fig. 2 fornece a atividade de trealase secretada média (como medida com o ensaio DNS) de dez (10) isolados clonais para cada enzima candidata em comparação com a trealase MP244. Todas as cepas testadas foram derivadas da M2390 anterior. As cepas testadas são identificadas usando a nomenclatura de trealase expressa. Os resultados são apresentados como a absorvância a 540 nm em função da trealase expressa.

[00013] A Fig. 3 fornece um curso de tempo da atividade de trealase para os cinco principais candidatos testados. Os resultados são apresentados como a absorvância a 540 nm em função da trealase expressa para os diferentes pontos de tempo (30 minutos = barras brancas, 60 minutos = barras cinzentas claras, 90 minutos = barras cinzentas escuras).

[00014] A Fig. 4 mostra o efeito da expressão de diferentes trealase heterólogas no rendimento de etanol e no consumo de glicose em uma fermentação permissiva. A expressão da trealase N. crassa (MP1067) na cepa M16283 aumentou o rendimento de etanol em ~ 0,5%. As fermentações foram conduzidas em temperaturas permissivas. As barras representam o rendimento de etanol (em g/L) em 50 h (eixo esquerdo). Os quadrados representam o conteúdo de glicose (em g/L) em 50 h (eixo direito).

[00015] A Fig. 5 mostra o efeito da expressão de diferentes trealase heterólogas no rendimento de etanol e no consumo de glicose em uma fermentação de estresse (altas temperaturas). A expressão de N. crassa trealase (MP1067) na cepa M16283 não perdeu robustez quando exposta à fermentação de alta temperatura. As barras representam o rendimento de etanol (em g/L) em 50 h (eixo esquerdo). As pastilhas representam o conteúdo de glicose (em g/L) em 50 h (eixo direito).

[00016] As Figuras 6A a 6C mostram os resultados da fermentação das cepas que superexpressam trealase/TSL1 ou das cepas de controle. (Fig. 6A). Os resultados são apresentados para as fermentações permissivas como a quantidade de etanol (barras, g/L, eixo esquerdo) e de glicerol (♦, g/L, eixo direito) produzida. (Fig. 6B) Os resultados são apresentados para as fermentações lácticas como a quantidade de etanol (barras, g/L, eixo esquerdo) e glicerol (♦, g/L, eixo direito) após 50 h, bem como, a quantidade de glicose residual (▲, g/L, eixo direito). (Fig. 6C) Os resultados são apresentados para as fermentações permissivas de estresse de alta temperatura e fermentações de estresse bacteriano como a quantidade de etanol (barras, g/L, eixo esquerdo) e de glicerol (♦, g/L, eixo direito) produzida após 50 h, bem como, a quantidade de glicose residual (■, g/L, eixo direito).

[00017] A Fig. 7 ilustra a redução na trealose medida no final da fermentação para cepas modificadas para expressar uma trealase recombinante. Os sobrenadantes obtidos no final da fermentação (permissivo = barras pretas, estresse bacteriano = barras cinzas) foram corridos no Dionex e medidos para trealose residual. A cepa que superexpressa uma trealase junto com TSL1 (M16750 e M16573) mostrou uma redução na trealose em comparação com a cepa de controle parental M15419. Os resultados são apresentados como o conteúdo de trealose no sobrenadante (em g/L) em função da cepa testada e do tipo de fermentação conduzido.

[00018] A Fig. 8 mostra a contagem de células vivas e mortas no final de uma fermentação permissiva. Os resultados são apresentados como o número de leveduras vivas (barras pretas), mortas (barras cinza claro) e totais (barras cinza escuro) em função da cepa testada.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[00019] De acordo com a presente invenção, é fornecida uma célula hospedeira de levedura recombinante com uma capacidade aumentada de degradar trealose (de preferência, fora da célula) para aumentar o rendimento de fermentação e uma capacidade aumentada de sintetizar trealose (de preferência, dentro da célula) para melhorar o rendimento de fermentação e manter a robustez da célula durante a fermentação. Expressar uma trealase heteróloga (e, em algumas modalidades, uma trealase heteróloga exibindo sua atividade principalmente fora da célula hospedeira de levedura recombinante) em uma célula hospedeira recombinante tem o potencial de aumentar o rendimento de fermentação (especialmente o rendimento de álcool), pois fornece à célula a possibilidade de usar trealose como uma fonte de carbono durante a fermentação. No entanto, como apresentado nos Exemplos abaixo e aqui discutidos, as tentativas de expressar uma trealase heteróloga causaram uma redução na robustez da célula hospedeira de levedura recombinante durante a fermentação, especialmente na presença de um estressor. Inesperadamente, a introdução de uma segunda modificação genética na célula hospedeira de levedura recombinante, permitindo um aumento na produção de trealose, restaurou a robustez na célula hospedeira de levedura recombinante e permitiu um rendimento de fermentação aumentado. Célula hospedeira de levedura recombinante

[00020] A presente invenção refere-se a células hospedeiras de levedura recombinantes. A célula hospedeira de levedura recombinante é obtida pela introdução de, pelo menos duas, modificações genéticas distintas em uma célula hospedeira de levedura ancestral ou nativa correspondente. As modificações genéticas na célula hospedeira de levedura recombinante da presente invenção compreendem, consistem essencialmente em ou consistem em uma primeira modificação genética para expressar uma trealase heteróloga e uma segunda modificação genética para aumentar a produção de trealose. No contexto da presente invenção, a expressão "as modificações genéticas no hospedeiro de levedura recombinante consistem essencialmente em uma primeira modificação genética e uma segunda modificação genética" refere-se ao fato de que a célula hospedeira de levedura recombinante pode incluir outras modificações genéticas que não estão relacionadas ou não diretamente relacionadas ao anabolismo ou catabolismo da trealose.

[00021] Quando a modificação genética tem como objetivo reduzir ou inibir a expressão de um gene alvo específico (que é endógeno à célula hospedeira), as modificações genéticas podem ser feitas em uma ou em ambas as cópias dos genes alvo. Quando a modificação genética tem como objetivo aumentar a expressão de um gene alvo específico, a modificação genética pode ser feita em uma ou várias localizações genéticas. No contexto da presente invenção, quando células hospedeiras de levedura recombinantes são qualificadas como sendo "geneticamente modificadas", entende-se que elas foram manipuladas para adicionar, pelo menos, um ou mais resíduos de ácido nucleico heterólogo ou exógeno e/ou remover, pelo menos, um resíduo de ácido nucleico endógeno (ou nativo). Em algumas modalidades, um ou mais resíduos de ácido nucleico que são adicionados podem ser derivados de uma célula heteróloga ou da própria célula hospedeira de levedura recombinante. No último cenário, os resíduos de ácido nucleico são adicionados em uma localização genômica que é diferente da localização genômica nativa. As manipulações genéticas não ocorreram na natureza e são resultados de manipulações in vitro da levedura nativa ou da célula bacteriana hospedeira.

[00022] Quando expressos em uma célula hospedeira de levedura recombinante, os polipeptídeos (incluindo as enzimas) aqui descritos são codificados em uma ou mais moléculas de ácido nucleico heterólogas. O termo "heterólogo" quando usado em referência a uma molécula de ácido nucleico (tal como um promotor ou uma sequência de codificação) refere-se a uma molécula de ácido nucleico que não é encontrada nativamente na célula hospedeira recombinante. "Heterólogo" também inclui uma região de codificação nativa, ou porção da mesma, que é removida do organismo de origem e subsequentemente reintroduzida no organismo de origem em uma forma que é diferente do gene nativo correspondente, por exemplo, não em sua localização natural no genoma do organismo. A molécula de ácido nucleico heteróloga é propositalmente introduzida na célula hospedeira recombinante. O termo "heterólogo", tal como aqui utilizado, também refere-se a um elemento (ácido nucleico ou polipeptídeo) que é derivado de uma fonte diferente da fonte endógena. Assim, por exemplo, um elemento heterólogo pode ser derivado de uma cepa diferente de célula hospedeira, ou de um organismo de um grupo taxonômico diferente (por exemplo, reino diferente, filo, classe, ordem, gênero familiar ou espécie, ou qualquer subgrupo dentro de uma dessas classificações). O termo "heterólogo" também é usado como sinônimo aqui com o termo "exógeno".

[00023] Quando uma molécula de ácido nucleico heteróloga está presente na célula hospedeira de levedura recombinante, ela pode ser integrada no genoma da célula hospedeira de levedura. O termo "integrado", tal como aqui utilizado, refere-se a elementos genéticos que são colocados, por meio de técnicas de biologia molecular, no genoma de uma célula hospedeira. Por exemplo, os elementos genéticos podem ser colocados nos cromossomos da célula hospedeira em oposição a um vetor, tal como um plasmídeo transportado pela célula hospedeira. Métodos para integrar elementos genéticos no genoma de uma célula hospedeira são bem conhecidos na técnica e incluem recombinação homóloga. A molécula de ácido nucleico heteróloga pode estar presente em uma ou mais cópias no genoma da célula hospedeira de levedura. Alternativamente, a molécula de ácido nucleico heteróloga pode se replicar independentemente do genoma da célula hospedeira. Em tal modalidade, a molécula de ácido nucleico pode ser estável e autorreplicante.

[00024] Em algumas modalidades, as moléculas de ácido nucleico heterólogas que podem ser introduzidas nas células hospedeiras de levedura recombinante são otimizadas por códons em relação à célula hospedeira de levedura recombinante de recipiente pretendida. Tal como aqui utilizado, o termo "região de codificação otimizada para códons" significa uma região de codificação de ácido nucleico que foi adaptada para expressão nas células de um determinado organismo, substituindo pelo menos um, ou mais de um, códons por um ou mais códons que são mais frequentemente usados nos genes desse organismo. Em geral, genes altamente expressos em um organismo são polarizados para códons que são reconhecidos pelas espécies de tRNA mais abundantes naquele organismo. Uma medida dessa polarização é o "índice de adaptação de códon" ou "CAI", que mede até que ponto os códons usados para codificar cada aminoácido em um gene particular são aqueles que ocorrem com mais frequência em um conjunto de referência de genes altamente expressos de um organismo. O CAI da molécula de ácido nucleico heteróloga otimizada por códons aqui descrito corresponde a entre cerca de 0,8 e 1,0, entre cerca de 0,8 e 0,9, ou cerca de 1,0.

[00025] As moléculas de ácido nucleico heterólogas da presente invenção compreendem uma região de codificação para um ou mais polipeptídeos (incluindo enzimas) a serem expressos pela célula hospedeira recombinante. Uma "região de codificação" de DNA ou RNA é uma molécula de DNA ou RNA que é transcrita e/ou traduzida em um polipeptídeo em uma célula in vitro ou in vivo quando colocada sob o controle de sequências regulatórias apropriadas. "Regiões regulatórias adequadas" referem-se a regiões de ácido nucleico localizadas a montante (sequências não codificantes 5'), dentro ou a jusante (sequências não codificantes 3') de uma região de codificação, e que influenciam a transcrição, processamento ou estabilidade de RNA, ou tradução da região de codificação associada. As regiões regulatórias podem incluir promotores, sequências líderes de tradução, locais de processamento de RNA, locais de ligação efetores e estruturas em grampo. Os limites da região de codificação são determinados por um códon de início no terminal 5' (amino) e um códon de terminação da tradução no terminal 3' (carboxil). Uma região de codificação pode incluir, mas não está limitada a regiões procarióticas, cDNA de mRNA, moléculas de DNA genômicas, moléculas de DNA sintéticas ou moléculas de RNA. Se a região de codificação se destina à expressão em uma célula eucariótica, um sinal de poliadenilação e a sequência de terminação da transcrição estarão geralmente localizados à região de codificação 3'. Em uma modalidade, a região de codificação pode ser referida como um quadro de leitura aberto. "Quadro de leitura aberto" é abreviado para ORF e significa um comprimento de ácido nucleico, seja DNA, cDNA ou RNA, que compreende um sinal de início de tradução ou códon de iniciação, tal como um ATG ou AUG, e um códon de terminação e pode ser potencialmente traduzido em uma sequência polipeptídica.

[00026] As moléculas de ácido nucleico heterólogas aqui descritas podem compreender uma região de não codificação, por exemplo, regiões de controle transcripcional e/ou translacional. “Regiões de controle transcripcional e translacional” são regiões regulatórias de DNA, tais como promotores, intensificadores, terminadores e similares, que fornecem a expressão de uma região de codificação em uma célula hospedeira. Em células eucarióticas, os sinais de poliadenilação são regiões de controle.

[00027] A molécula de ácido nucleico heteróloga pode ser introduzida e opcionalmente mantida na célula hospedeira usando um vetor. Um "vetor", por exemplo, um "plasmídeo", "cosmídeo" ou "cromossomo artificial" (tal como, por exemplo, um cromossomo artificial de levedura) refere-se a um elemento cromossômico extra e geralmente está na forma de uma molécula de DNA de filamento duplo circular. Tais vetores podem ser sequências de replicação autônoma, sequências de integração de genoma, sequências de fago ou nucleotídeo, lineares, circulares ou superenroladas, de um DNA ou RNA de filamento único ou duplo, derivado de qualquer fonte, em que uma série de sequências de nucleotídeo foi unida ou recombinada em uma construção única que é capaz de introduzir um fragmento de promotor e sequência de DNA para um produto de gene selecionado junto com a sequência não traduzida 3' apropriada em uma célula hospedeira.

[00028] Na molécula de ácido nucleico heteróloga aqui descrita, o promotor e a molécula de ácido nucleico codificam para um ou mais polipeptídeos (incluindo enzimas) podem ser operativamente ligados uns com os outros. No contexto da presente invenção, as expressões "operativamente ligado" ou "operativamente associado" referem-se ao fato de que o promotor está fisicamente associado à molécula de ácido nucleotídico que codifica para uma ou mais enzimas de uma maneira que permite, sob certas condições, para a expressão de uma ou mais enzimas da molécula de ácido nucleico. Em uma modalidade, o promotor pode estar localizado a montante (5') da sequência de ácido nucleico que codifica para uma ou mais enzimas. Em ainda outra modalidade, o promotor pode estar localizado a jusante (3') da sequência de ácido nucleico que codifica para uma ou mais enzimas. No contexto da presente invenção, um ou mais de um promotor podem ser incluídos na molécula de ácido nucleico heteróloga. Quando mais de um promotor é incluído na molécula de ácido nucleico heteróloga, cada um dos promotores está operacionalmente ligado à sequência de ácido nucleico que codifica para uma ou mais enzimas.

Os promotores podem ser localizados, em vista da molécula de ácido nucleico que codifica para um ou mais polipeptídeos, a montante, a jusante, bem como, a montante e a jusante.

[00029] "Promotor" refere-se a um fragmento de DNA capaz de controlar a expressão de uma sequência de codificação ou RNA funcional. O termo "expressão", tal como aqui utilizado, refere-se à transcrição e acumulação estável de sentido (mRNA) da molécula de ácido nucleico heteróloga aqui descrita. A expressão também pode se referir à tradução de mRNA em um polipeptídeo. Os promotores podem ser derivados em sua totalidade de um gene nativo, ou ser compostos de diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados na natureza, ou mesmo compreender segmentos de DNA sintético. É entendido por aqueles versados na técnica que diferentes promotores podem direcionar a expressão em diferentes estágios de desenvolvimento, ou em resposta a diferentes condições ambientais ou fisiológicas. Os promotores que fazem com que um gene seja expresso na maioria das células, na maioria das vezes em um nível substancialmente similar, são comumente referidos como "promotores constitutivos". É ainda reconhecido que, uma vez que na maioria dos casos os limites exatos das sequências regulatórias não foram completamente definidos, fragmentos de DNA de comprimentos diferentes podem ter atividade promotora idêntica. Um promotor é geralmente limitado em seu terminal 3' pelo local de iniciação da transcrição e se estende a montante (direção 5') para incluir o número mínimo de bases ou elementos necessários para iniciar a transcrição em níveis detectáveis acima do anterior. Dentro do promotor será encontrado um local de iniciação da transcrição (convenientemente definido por exemplo, por mapeamento com nuclease S1), bem como, domínios de ligação de polipeptídeo (sequências de consenso) responsáveis pela ligação da polimerase.

[00030] O promotor pode ser heterólogo para a molécula de ácido nucleico que codifica um ou mais polipeptídeos. O promotor pode ser heterólogo ou derivado de uma cepa sendo do mesmo gênero ou espécie que a célula hospedeira de levedura recombinante. Em uma modalidade, o promotor é derivado do mesmo gênero ou espécie da célula hospedeira de levedura e o polipeptídeo heterólogo é derivado de um gênero diferente da célula hospedeira. Em uma modalidade, o promotor usado na molécula de ácido nucleico heteróloga é o mesmo promotor que controla a expressão do polipeptídeo codificado em seu contexto nativo.

[00031] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se à expressão de um ou mais polipeptídeos (incluindo uma enzima), uma variante do mesmo ou um fragmento do mesmo em uma célula hospedeira recombinante. Uma variante compreende, pelo menos, uma diferença de aminoácido quando comparada à sequência de aminoácido do polipeptídeo nativo (enzima) e exibe uma atividade biológica substancialmente similar ao polipeptídeo nativo. As "variantes" de polipeptídeo/enzima têm, pelo menos, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com o polipeptídeo aqui descrito. As "variantes" da trealase heteróloga podem ter, pelo menos, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de atividade biológica quando comparada ao polipeptídeo nativo. O termo "porcentagem de identidade", como conhecido na técnica, é uma relação entre duas ou mais sequências polipeptídicas ou duas ou mais sequências polinucleotídicas, conforme determinado pela comparação das sequências. O nível de identidade pode ser determinado convencionalmente usando programas de computador conhecidos. A identidade pode ser facilmente calculada por métodos conhecidos, incluindo mas não limitada aos descritos em: Computational Molecular Biology (Lesk, A.M., ed.) Oxford University Press, NY (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, NY (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.) Humana Press, NJ (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987); e Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Stockton Press, NY (1991). Os métodos preferidos para determinar a identidade são projetados para fornecer a melhor correspondência entre as sequências testadas. Métodos para determinar a identidade e semelhança são codificados em programas de computador publicamente disponíveis. Alinhamentos de sequência e cálculos de porcentagem de identidade podem ser realizados usando o programa Megalign do pacote de computação de bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, Wis.). Múltiplos alinhamentos das sequências aqui descritas foram realizados usando o método de alinhamento Clustal (Higgins and Sharp (1989) CABIOS. 5: 151-153) com os parâmetros padrão (GAP PENALTY = 10, GAP

LENGTH PEN ALT Y = 10). Os parâmetros padrão para alinhamentos em pares usando o método Clustal foram KTUPLB 1, GAP PENALTY = 3, WINDOW = 5 e DIAGONALS SAVED = 5.

[00032] O polipeptídeo variante aqui descrito pode ser (i) um, em que um ou mais dos resíduos de aminoácidos são substituídos por um resíduo de aminoácido conservado ou não conservado (de preferência, um resíduo de aminoácido conservado) e tal resíduo de aminoácido substituído pode ou não pode ser um codificado pelo código genético, ou (ii) um, em que um ou mais dos resíduos de aminoácidos inclui um grupo substituinte, ou (iii) um, em que o polipeptídeo maduro é fundido com outro composto, tal como um composto para aumentar a meia-vida do polipeptídeo (por exemplo, polietileno glicol), ou (iv) um, em que os aminoácidos adicionais são fundidos ao polipeptídeo maduro para purificação do polipeptídeo.

[00033] Uma "variante" do polipeptídeo pode ser uma variante conservativa ou uma variante alélica. Tal como aqui utilizado, uma variante conservativa refere-se a alterações na sequência de aminoácidos que não afetam adversamente as funções biológicas do polipeptídeo/enzima. Diz-se que uma substituição, inserção ou deleção afeta adversamente o polipeptídeo quando a sequência alterada previne ou interrompe uma função biológica associada à enzima. Por exemplo, a carga geral, estrutura ou propriedades hidrofóbicas-hidrofílicas do polipeptídeo podem ser alteradas sem afetar adversamente a atividade biológica. Desta maneira, a sequência de aminoácidos pode ser alterada, por exemplo, para tornar o polipeptídeo mais hidrofóbico ou hidrofílico, sem afetar adversamente as atividades biológicas da enzima.

[00034] O polipeptídeo pode ser um fragmento de polipeptídeo ou fragmento de polipeptídeo variante. Um fragmento de polipeptídeo compreende, pelo menos, um resíduo de aminoácido a menos quando comparado com a sequência de aminoácidos que possui e ainda possui uma atividade biológica substancialmente similar ao polipeptídeo de comprimento total nativo ou variante de polipeptídeo. Os "fragmentos" de polipeptídeo têm, pelo menos, 100, 200, 300, 400, 500 ou mais aminoácidos consecutivos do polipeptídeo ou da variante do polipeptídeo. Os "fragmentos" de trealase heterólogos podem ter, pelo menos, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com o polipeptídeo ou com o polipeptídeo variante.

Os "fragmentos" de trealase heterólogos podem ter, pelo menos, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de atividade biológica quando comparados com o polipeptídeo nativo ou o polipeptídeo variante. Em algumas modalidades, fragmentos dos polipeptídeos podem ser empregados para a produção da enzima de comprimento total correspondente por sínteses de peptídeo. Portanto, os fragmentos podem ser empregados como intermediários para a produção de polipeptídeos de comprimento total.

[00035] Em algumas modalidades adicionais, a presente invenção também fornece a expressão de um polipeptídeo codificado por um gene ortólogo de um gene conhecido por codificar o polipeptídeo. Um “gene ortólogo” é entendido como um gene em uma espécie diferente que evoluiu de um gene ancestral comum por especiação. No contexto da presente invenção, um gene ortólogo codifica o polipeptídeo que exibe uma atividade biológica substancialmente similar ao polipeptídeo nativo.

[00036] Em algumas outras modalidades, a presente invenção também fornece a expressão de um polipeptídeo codificado por um gene parólogo de um gene conhecido por codificar o polipeptídeo. Um “gene parólogo” é entendido como um gene relacionado por duplicação dentro do genoma. No contexto da presente invenção, um gene parólogo codifica um polipeptídeo que pode exibir funções biológicas adicionais quando comparado ao polipeptídeo nativo.

[00037] No contexto da presente invenção, a célula hospedeira recombinante/nativa é uma levedura. As células hospedeiras de levedura adequadas podem ser, por exemplo, do gênero Saccharomyces, Kluyveromyces, Arxula, Debaryomyces, Candida, Pichia, Phaffia, Schizosaccharomyces, Hansenula, Kloeckera, Schwanniomyces ou Yarrowia. As espécies de levedura adequadas podem incluir, por exemplo, S. cerevisiae, S. bulderi, S. barnetti, S. exiguus, S. uvarum, S. diastaticus, K. lactis, K. marxianus ou K. fragilis. Em algumas modalidades, a levedura é selecionada a partir do grupo que consiste em Saccharomyces cerevisiae, Schizzosaccharomyces pombe, Candida albicans, Pichia pastoris, Pichia stipitis, Yarrowia lipolytica, Hansenula polymorpha, Phaffia rhodozyma, Candida utilis, Arxula adeninivorans, Debaryomyces hansenii, Debaryomyces polymorphus,

Schizosaccharomyces pombe e Schwanniomyces occidentalis. Em uma modalidade particular, a levedura é Saccharomyces cerevisiae. Em algumas modalidades, a célula hospedeira pode ser uma célula de levedura oleaginosa. Por exemplo, a célula hospedeira de levedura oleaginosa pode ser do gênero Blakeslea, Candida, Cryptococcus, Cunninghamella, Lipomyces, Mortierella, Mucor, Phycomyces, Pythium, Rhodosporidum, Rhodotorula, Trichosporon ou Yarrowia. Em algumas modalidades alternativas, a célula hospedeira pode ser uma célula hospedeira de microalgas oleaginosa (por exemplo, do gênero Thraustochytrium ou Schizochytrium). Em uma modalidade, a célula hospedeira de levedura recombinante é do gênero Saccharomyces e, em algumas modalidades adicionais, da espécie Saccharomyces cerevisiae.

[00038] Uma vez que a célula hospedeira de levedura recombinante pode ser usada para a fermentação de uma biomassa e a geração do produto de fermentação, é contemplado aqui que ela tem a capacidade de converter uma biomassa em um produto de fermentação sem incluir as modificações genéticas adicionais aqui descritas. Em uma modalidade, a célula hospedeira de levedura recombinante tem a capacidade de converter amido em etanol durante a fermentação, conforme descrito abaixo. Em ainda outra modalidade, a célula hospedeira de levedura recombinante da presente invenção pode ser geneticamente modificada para fornecer ou aumentar a atividade biológica de um ou mais polipeptídeos envolvidos na fermentação da biomassa e na geração do produto de fermentação. Primeira modificação genética: expressão de uma trealase heteróloga

[00039] A introdução da primeira modificação genética na célula hospedeira de levedura recombinante confere uma atividade de trealase aumentada à célula hospedeira de levedura recombinante. De preferência, a atividade de trealase aumentada é observada principalmente fora da célula hospedeira de levedura recombinante, embora seja originalmente sintetizada dentro da célula hospedeira de levedura recombinante. A primeira modificação genética pode ser a introdução de uma primeira molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica a trealase heteróloga na célula hospedeira de levedura recombinante. Esta primeira modificação genética pode fornecer uma célula hospedeira de levedura recombinante com uma primeira molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica a trealase heteróloga.

[00040] Trealases são glicosídeos hidrolases capazes de converter trealose em glicose.

As trealases foram classificadas no número EC 3.2.1.28. As trealases podem ser classificadas em duas grandes categorias com base em seu pH ideal: trealases neutras (tendo um pH ótimo de cerca de 7) e trealases ácidas (tendo um pH ótimo de cerca de 4,5). As trealases heterólogas que podem ser usadas no contexto da presente invenção podem ser de várias origens, tal como origem bacteriana, fúngica ou vegetal.

Em uma modalidade específica, a trealase é de origem fúngica.

Em uma modalidade, a trealase é de Aspergillus sp., por exemplo Aspergillus fumigatus que pode ter, em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, ser uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Em tal modalidade, a trealase pode ser codificada, por exemplo, pela sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade, a trealase é de Neosartorya sp., por exemplo Neosartorya udagawae que pode ter, em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, ser uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. Em tal modalidade, a trealase pode ser codificada, por exemplo, pela sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3. Em uma modalidade, a trealase é de Aspergillus sp., por exemplo Aspergillus flavus que pode ter, em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, ser uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Em tal modalidade, a trealase pode ser codificada, por exemplo, pela sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 5. Em uma modalidade, a trealase é de Fusarium sp., por exemplo Fusarium oxysporum que pode ter, em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, ser uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. Em tal modalidade, a trealase pode ser codificada, por exemplo, pela sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 7. Em uma modalidade, a trealase é de Escovopsis sp., por exemplo Escovopsis weberi que pode ter, em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, ser uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. Em tal modalidade, a trealase pode ser codificada, por exemplo, pela sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 9. Em uma modalidade, a trealase é de Microsporum sp., por exemplo Microsporum gypseum que pode ter, em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, ser uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12. Em tal modalidade, a trealase pode ser codificada, por exemplo, pela sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 11. Em uma modalidade, a trealase é de Aspergillus sp., por exemplo Aspergillus clavatus que pode ter, em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, ser uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. Em tal modalidade, a trealase pode ser codificada, por exemplo, pela sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 13. Em uma modalidade, a trealase é de Metarhizium sp., por exemplo Metarhizium anisopliae que pode ter, em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, ser uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16. Em tal modalidade, a trealase pode ser codificada, por exemplo, pela sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 15. Em uma modalidade, a trealase é de Ogataea sp., por exemplo Ogataea parapolymorpha que pode ter, em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, ser uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18. Em tal modalidade, a trealase pode ser codificada, por exemplo, pela sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 17. Em uma modalidade, a trealase é de Kluyveromyces sp., por exemplo Kluyveromyces marxianus que pode ter, em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, ser uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20. Em tal modalidade, a trealase pode ser codificada, por exemplo, pela sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 19. Em uma modalidade, a trealase é de Komagataella sp., por exemplo Komagataella phaffii que pode ter, em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, ser uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22. Em tal modalidade, a trealase pode ser codificada, por exemplo, pela sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 21. Em uma modalidade, a trealase é de Ashbya sp., por exemplo, Ashbya gossypii que pode ter, em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, ser uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24. Em tal modalidade, a trealase pode ser codificada, por exemplo, pela sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 23. Em uma modalidade, a trealase é de Neurospora sp., por exemplo Neurospora crassa que pode ter, em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, ser uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26. Em tal modalidade, a trealase pode ser codificada, por exemplo, pela sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 25. Em uma modalidade, a trealase é de Thielavia sp., por exemplo Thielavia terrestris que pode ter, em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, ser uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28. Em tal modalidade, a trealase pode ser codificada, por exemplo, pela sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 27. Em uma modalidade, a trealase é de Aspergillus sp., por exemplo, Aspergillus lentulus que pode ter, em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, ser uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30. Em tal modalidade, a trealase pode ser codificada, por exemplo, pela sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 29. Em uma modalidade, a trealase é de Aspergillus sp., por exemplo Aspergillus ochraceoroseus que pode ter, em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, ser uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32. Em tal modalidade, a trealase pode ser codificada, por exemplo, pela sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 31. Em uma modalidade, a trealase é de Rhizoctonia sp., para exemplo Rhizoctonia solani que pode ter, em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, ser uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34. Em tal modalidade, a trealase pode ser codificada, por exemplo, pela sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 33. Em uma modalidade, a trealase é de Achlya sp., por exemplo Achlya hypogyna que pode ter, em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36, ser uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36. Em tal modalidade, a trealase pode ser codificada, por exemplo, pela sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 35. Em uma modalidade, a trealase é de Schizopora sp., por exemplo Schizopora paradoxa que pode ter, em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38, ser uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38 ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38. Em tal modalidade, a trealase pode ser codificada, por exemplo, pela sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 38. Em uma modalidade específica, a trealase heteróloga tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 20, 24, 26, 28, 30 ou 36, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 20, 24, 26, 28, 30 de 36 ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 20, 24, 26, 28, 30 de 36. Em uma modalidade, a trealase heteróloga tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou 4, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou 4 ou é um fragmento da sequência de aminoácidos NO: 2 ou 4. Em uma modalidade, a trealase heteróloga tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou 20, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou 20 ou é um fragmento da sequência de aminoácidos NO: 2 ou 20. Em uma modalidade, a trealase heteróloga tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou 24, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou 24 ou é um fragmento da sequência de aminoácidos NO: 2 ou 24. Em uma modalidade, a trealase heteróloga tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou 26, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou 26 ou é um fragmento da sequência de aminoácidos NO: 2 ou 26. Em uma modalidade, a trealase heteróloga tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 ou 28, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou 28 ou é um fragmento da sequência de aminoácidos NO: 2 ou 28. Em uma modalidade, a trealase heteróloga tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou 30, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou 30 ou é um fragmento da sequência de aminoácidos NO: 2 ou 30. Em uma modalidade, a trealase heteróloga tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou 36, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou 36 ou é um fragmento da sequência de aminoácidos NO: 2 ou 36. Em uma modalidade, a trealase heteróloga tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 ou 20, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 ou 20 ou é um fragmento da sequência de aminoácidos NO: 4 ou 20. Em uma modalidade, a trealase heteróloga tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 ou 24, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 ou 24 ou é um fragmento da sequência de aminoácidos NO: 4 ou 24. Em uma modalidade, a trealase heteróloga tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 ou 26, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 ou 26 ou é um fragmento da sequência de aminoácidos NO: 4 ou 26. Em uma modalidade, a trealase heteróloga tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 ou 28, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 ou 28 ou é um fragmento da sequência de aminoácidos NO: 4 ou 28. Em uma modalidade, a trealase heteróloga tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 ou 30, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 ou 30 ou é um fragmento da sequência de aminoácidos NO: 4 ou 30. Em uma modalidade, a trealase heteróloga tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 ou 36, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 ou 36 ou é um fragmento da sequência de aminoácidos NO: 4 ou 36. Em uma modalidade, a trealase heteróloga tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 ou 24, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 ou 24 ou é um fragmento da sequência de aminoácidos NO: 20 ou 24. Em uma modalidade, a trealase heteróloga tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 ou 26, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 ou 26 ou é um fragmento da sequência de aminoácidos NO: 20 ou 26. Em uma modalidade, a trealase heteróloga tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 ou 28, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 ou 28 ou é um fragmento da sequência de aminoácidos NO: 20 ou 28. Em uma modalidade, a trealase heteróloga tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 ou 30, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 ou 30 ou é um fragmento da sequência de aminoácidos NO: 20 ou 30. Em uma modalidade, a trealase heteróloga tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 ou 36, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 ou 36 ou é um fragmento da sequência de aminoácidos NO: 20 ou 36. Em uma modalidade, a trealase heteróloga tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 ou 26, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 ou 26 ou é um fragmento da sequência de aminoácidos NO: 24 ou 26. Em uma modalidade, a trealase heteróloga tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 ou 28, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 ou 28 ou é um fragmento da sequência de aminoácidos NO: 24 ou 28. Em uma modalidade, a trealase heteróloga tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 ou 30, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 ou 30 ou é um fragmento da sequência de aminoácidos NO: 24 ou 30. Em uma modalidade, a trealase heteróloga tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 ou 36, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 ou 36 ou é um fragmento da sequência de aminoácidos NO: 24 ou 36. Em uma modalidade, a trealase heteróloga tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 ou 28, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 ou 28 ou é um fragmento da sequência de aminoácidos NO: 26 ou 28. Em uma modalidade, a trealase heteróloga tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 ou 30, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 ou 30 ou é um fragmento da sequência de aminoácidos NO: 26 ou 30. Em uma modalidade, a trealase heteróloga tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 ou 36, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 ou 36 ou é um fragmento da sequência de aminoácidos NO: 26 ou 36. Em uma modalidade, a trealase heteróloga tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 ou 30, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 ou 30 ou é um fragmento da sequência de aminoácidos NO: 28 ou 30. Em uma modalidade, a trealase heteróloga tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 ou 36, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 ou 36 ou é um fragmento da sequência de aminoácidos NO: 28 ou 36. Em uma modalidade, a trealase heteróloga tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 ou 36, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 ou 36 ou é um fragmento da sequência de aminoácidos NO: 30 ou 36. Uma vez que a trealase heteróloga se destina a exercer a sua atividade biológica principalmente fora da célula hospedeira de levedura recombinante, a trealase heteróloga pode ser selecionada com base na sua capacidade de ser translocada para fora da célula ou, alternativamente, modificada para ser secretada ou permanecer associada com a superfície externa da membrana celular hospedeira de levedura recombinante.

[00041] Conforme indicado acima, a presente invenção inclui célula hospedeira de levedura recombinante que expressa uma ou mais variantes de trealase. Uma variante de trealase compreende, pelo menos, uma diferença de aminoácidos quando comparada à sequência de aminoácidos da trealase e exibe atividade de trealase substancialmente similar à trealase. As "variantes" heterólogas podem ter, pelo menos, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com o polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 20, 24, 26, 28, 30 ou 36. As "variantes" heterólogas têm, pelo menos, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com o polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. As "variantes" heterólogas podem ter, pelo menos, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com o polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. As "variantes" heterólogas podem ter, pelo menos, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com o polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20. As "variantes" heterólogas podem ter, pelo menos, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com o polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24. As "variantes" heterólogas podem ter, pelo menos, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com o polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26. As "variantes" heterólogas podem ter, pelo menos, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com o polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID 28. As "variantes" heterólogas podem ter, pelo menos, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com o polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30. As "variantes" heterólogas pode ter, pelo menos, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com o polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID

NO: 36. O termo “porcentagem de identidade”, como conhecido na técnica, é uma relação entre duas ou mais sequências polipeptídicas ou duas ou mais sequências polinucleotídicas, conforme determinado pela comparação das sequências. O nível de identidade pode ser determinado convencionalmente usando programas de computador conhecidos. A identidade pode ser facilmente calculada por métodos conhecidos, incluindo mas não limitada aos descritos em: Computational Molecular Biology (Lesk, A.M., ed.) Oxford University Press, NY (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, NY (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.) Humana Press, NJ (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987); e Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Stockton Press, NY (1991). Os métodos preferidos para determinar a identidade são projetados para fornecer a melhor correspondência entre as sequências testadas. Métodos para determinar a identidade e semelhança são codificados em programas de computador publicamente disponíveis. Alinhamentos de sequência e cálculos de porcentagem de identidade podem ser realizados usando o programa Megalign do pacote de computação de bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, Wis.). Múltiplos alinhamentos das sequências aqui descritas foram realizados usando o método de alinhamento Clustal (Higgins and Sharp (1989) CABIOS. 5: 151-153) com os parâmetros padrão (GAP PENALTY = 10, GAP LENGTH PEN ALT Y = 10). Os parâmetros padrão para alinhamentos em pares usando o método Clustal foram KTUPLB 1, GAP PENALTY = 3, WINDOW = 5 e DIAGONALS SAVED = 5.

[00042] A trealase variante aqui descrita pode ser (i) uma, em que um ou mais dos resíduos de aminoácido são substituídos por um resíduo de aminoácido conservado ou não conservado (de preferência, um resíduo de aminoácido conservado) e tal resíduo de aminoácido substituído pode ou não pode ser um codificado pelo código genético, ou (ii) uma, em que um ou mais dos resíduos de aminoácidos inclui um grupo substituinte, ou (iii) uma, em que o polipeptídeo maduro é fundido com outro composto, tal como um composto para aumentar a meia-vida do polipeptídeo (por exemplo, polietileno glicol), ou (iv) uma, em que os aminoácidos adicionais são fundidos ao polipeptídeo maduro para purificação do polipeptídeo.

[00043] Uma "variante" da trealase pode ser uma variante conservativa ou uma variante alélica. Tal como aqui utilizado, uma variante conservativa refere-se a alterações na sequência de aminoácidos que não afetam adversamente as funções biológicas da enzima. Diz-se que uma substituição, inserção ou deleção afeta adversamente o polipeptídeo quando a sequência alterada previne ou interrompe uma função biológica associada à enzima. Por exemplo, a carga geral, estrutura ou propriedades hidrofóbicas- hidrofílicas do polipeptídeo podem ser alteradas sem afetar adversamente uma atividade biológica. Desta maneira, a sequência de aminoácidos pode ser alterada, por exemplo, para tornar a trealase mais hidrofóbica ou hidrofílica, sem afetar adversamente as atividades biológicas da enzima.

[00044] A trealase pode ser um fragmento de trealase ou fragmento de uma trealase variante. Um fragmento de trealase compreende, pelo menos, um resíduo de aminoácido a menos quando comparado com a sequência de aminoácidos que possui e ainda possui uma atividade de trealase substancialmente similar ao polipeptídeo de comprimento total nativo ou variante de polipeptídeo. Os "fragmentos" de trealase têm, pelo menos, 100, 200, 300, 400, 500 ou mais aminoácidos consecutivos do polipeptídeo ou da variante do polipeptídeo. Em algumas modalidades, fragmentos dos polipeptídeos podem ser empregados para a produção da enzima de comprimento total correspondente por sínteses de peptídeo. Portanto, os fragmentos podem ser empregados como intermediários para a produção de polipeptídeos de comprimento total. Os "fragmentos" de trealase heterólogos podem ter, pelo menos, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com o polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 20, 24, 26, 28, 30 ou 36. Os "fragmentos" heterólogos têm, pelo menos, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com o polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Os "fragmentos heterólogos" podem ter, pelo menos, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com o polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. Os "fragmentos" heterólogos podem ter, pelo menos, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com o polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20. Os "fragmentos" heterólogos podem ter, pelo menos, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com o polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24. Os "fragmentos" heterólogos podem ter, pelo menos, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com o polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26. Os "fragmentos" heterólogos podem ter, pelo menos, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com o polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID 28. Os "fragmentos" heterólogos podem ter, pelo menos, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com o polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30. Os "fragmentos" heterólogos podem ter, pelo menos, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com o polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36.

[00045] Alguma trealase heteróloga possui uma sequência de sinal e presume-se que seja secretada da célula hospedeira de levedura recombinante. Por exemplo, as trealases com a seguinte sequência de aminoácido possuem uma sequência de sinal nativa predispondo-as a serem secretadas: SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 17, 26, 28, 30, 34, 36 e 38. Para estas trealases heterólogas, é contemplado o uso de sua sequência de sinal nativa ou substituí-la por outra sequência de sinal que irá facilitar a sua secreção da célula hospedeira de levedura recombinante. Para as outras trealases (aquelas com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, 20, 22, 24 e 32), é possível incluir uma sequência de sinal apropriada permitindo sua secreção fora da célula, por exemplo, incluindo uma sequência de sinal de outra trealase ou uma sequência de sinal sendo reconhecida como tal pela célula hospedeira de levedura recombinante.

[00046] Em algumas modalidades, as trealases heterólogas secretadas são liberadas no meio de cultura/fermentação e não permanecem fisicamente ligadas à célula de levedura recombinante. Em modalidades alternativas, as trealases heterólogas da presente invenção podem ser secretadas, mas permanecem fisicamente associadas à célula hospedeira de levedura recombinante. Em uma modalidade, pelo menos, uma porção (geralmente, pelo menos, um terminal) da trealase heteróloga é ligada, covalentemente, não covalentemente e/ou eletrostaticamente, por exemplo, à parede celular (e, em algumas modalidades à membrana citoplasmática). Por exemplo, a trealase heteróloga pode ser modificada para carregar um ou mais domínios de transmembrana, para ter uma ou mais modificações lipídicas (miristoilação, palmitoilação, farnesilação e/ou prenilação), para interagir com um ou mais polipeptídeos associados à membrana e/ou para interações com as jangadas de lipídeos celulares. Embora a trealase heteróloga possa não estar diretamente ligada à membrana celular ou parede celular (por exemplo, como quando a ligação ocorre por meio de uma porção de amarração), o polipeptídeo é, no entanto, considerado um polipeptídeo heterólogo "associado à célula" de acordo com a presente invenção.

[00047] Em algumas modalidades, as trealases heterólogas podem ser expressas para serem localizadas e associadas à parede celular da célula hospedeira de levedura recombinante. Em algumas modalidades, o polipeptídeo heterólogo é expresso para estar localizado e associado à superfície externa da parede celular da célula hospedeira. Todas as células hospedeiras de levedura recombinantes têm uma parede celular (que inclui uma membrana citoplasmática) definindo os ambientes intracelular (por exemplo, voltado para o interior do núcleo) e extracelular (por exemplo, voltado para o lado externo). A trealase heteróloga pode estar localizada na (e, em algumas modalidades, fisicamente associada) à face externa da parede celular do hospedeiro de levedura recombinante e, em outras modalidades, à face externa da membrana citoplasmática do hospedeiro de levedura recombinante. No contexto da presente invenção, a expressão "associada à face externa da parede celular/membrana citoplasmática da célula hospedeira de levedura recombinante" refere-se à capacidade da trealase heteróloga de se integrar fisicamente (em uma forma covalente ou não covalente), pelo menos em parte, na parede celular (e, em algumas modalidades na membrana citoplasmática) da célula hospedeira de levedura recombinante. A integração física pode ser atribuída à presença de, por exemplo, um domínio de transmembrana no polipeptídeo heterólogo, um domínio capaz de interagir com um polipeptídeo de membrana citoplasmática no polipeptídeo heterólogo, uma modificação de pós- tradução feita ao polipeptídeo heterólogo (por exemplo, lipidação), etc.

[00048] Em algumas circunstâncias, pode ser necessário aumentar ou fornecer associação de células a algumas trealases heterólogas porque elas exibem associação celular intrínseca insuficiente ou simplesmente não têm associação celular intrínseca. Em tal modalidade, é possível fornecer a trealase heteróloga como um constructo quimérico combinando-a com uma porção de aminoácido de amarração que irá fornecer ou aumentar a ligação à parede celular da célula hospedeira de levedura recombinante. Em tal modalidade, o polipeptídeo heterólogo quimérico será considerado "amarrado". É preferido que a porção de amarração de aminoácido do polipeptídeo quimérico seja neutra em relação à atividade biológica da trealase heteróloga, por exemplo, não interfere com a atividade biológica (tal como, por exemplo, a atividade enzimática) da trealase heteróloga. Em algumas modalidades, a associação da porção de amarração de aminoácido com o polipeptídeo heterólogo pode aumentar a atividade biológica do polipeptídeo heterólogo (quando comparada com a forma "livre" não amarrada).

[00049] Em uma modalidade, uma porção de amarração pode ser usada para ser expressa com a trealase heteróloga para localizar o polipeptídeo heterólogo na parede da célula hospedeira de levedura recombinante. Várias porções de aminoácidos de amarração são conhecidas na técnica e podem ser usadas nos polipeptídeos quiméricos da presente invenção. A porção de amarração pode ser um domínio de transmembrana encontrado em outro polipeptídeo e permitir que o polipeptídeo quimérico tenha um domínio de transmembrana. Em tal modalidade, a porção de amarração pode ser derivada do polipeptídeo FLO1.

[00050] Em ainda outro exemplo, a porção de amarração de aminoácido pode ser modificada após a tradução para incluir uma âncora de glicosilfosfatidilinositol (GPI) e permitir que o polipeptídeo quimérico tenha uma âncora de GPI. As âncoras de GPI são glicolipídeos ligados ao terminal de um polipeptídeo (e, em algumas modalidades, ao terminal carboxil de um polipeptídeo) que permite a ancoragem do polipeptídeo à membrana citoplasmática da membrana celular. Porções de aminoácidos de amarração capazes de fornecer uma âncora de GPI incluem, mas não são limitadas àquelas associadas com/derivadas de um polipeptídeo SED1, um polipeptídeo TIR1, um polipeptídeo CWP2, um polipeptídeo CCW12, um polipeptídeo SPI1, um polipeptídeo PST1 ou uma combinação de um polipeptídeo AGA1 e um AGA2. Em uma modalidade, a porção de amarração fornece uma âncora de GPI e, ainda em uma outra modalidade, a porção de amarração é derivada do polipeptídeo SPI1 ou do polipeptídeo CCW12.

[00051] A porção de aminoácido de amarração pode ser uma variante de uma porção de aminoácido de amarração conhecida/nativa. A porção de aminoácido de amarração pode ser um fragmento de uma porção de aminoácido de amarração conhecida/nativa ou fragmento de uma variante de uma porção de aminoácido de amarração conhecida/nativa.

[00052] Em modalidades, em que uma porção de amarração de aminoácido é desejável, o polipeptídeo heterólogo pode ser fornecido como um polipeptídeo quimérico expresso pela célula hospedeira de levedura recombinante e tendo uma das seguintes fórmulas (fornecidas a partir do amino (NH2) para a orientação carboxil (COOH)): HT - L - TT (I) ou TT - L - HT (II)

[00053] Em ambas as fórmulas, o resíduo "HT" refere-se à porção trealase heteróloga, o resíduo "L" refere-se à presença de um ligante opcional, enquanto o resíduo "TT" refere-se a uma porção de amarração de aminoácido. Nos polipeptídeos quiméricos de fórmula (I), o terminal amino da corrente de aminoácido está localizado (direta ou indiretamente) no terminal carboxil (COOH ou C) da porção trealase heteróloga. Nos polipeptídeos quiméricos de fórmula (II), o terminal carbóxi da corrente de aminoácido está localizado (direta ou indiretamente) no terminal amino (NH2 ou N) da porção trealase heteróloga. As modalidades de polipeptídeos heterólogos amarrados quiméricos foram descritas no documento WO2018/167670 e estão incluídas aqui em sua totalidade. Segunda modificação genética: aumento na produção de trealose

[00054] A introdução da segunda modificação genética na célula hospedeira de levedura recombinante restaura sua robustez aumentando a produção de trealose e, mais de preferência, aumentando os níveis de trealose intracelular na célula hospedeira de levedura recombinante. Em algumas modalidades, a introdução da segunda modificação genética permite um aumento no rendimento da fermentação, tal como, por exemplo, um aumento no rendimento alcoólico. A segunda modificação genética pode ser a introdução de uma segunda molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica um ou mais polipeptídeos envolvidos na produção de trealose (por exemplo, uma segunda enzima heteróloga envolvida na produção de trealose e/ou um segundo polipeptídeo regulador envolvido na regulação da produção de trealose) na célula hospedeira de levedura recombinante. Esta segunda modificação genética pode fornecer uma célula hospedeira de levedura recombinante com uma segunda molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica um ou mais polipeptídeos envolvidos na produção de trealose (por exemplo, uma segunda enzima heteróloga envolvida na produção de trealose e/ou um segundo polipeptídeo regulador envolvido na regulação da produção de trealose).

[00055] A segunda modificação genética pode ser feita para permitir a expressão de uma enzima envolvida na produção de trealose. Conforme indicado na Figura 1, as enzimas envolvidas na produção de trealose incluem, mas não são limitadas a TPS1, TPS2, HXH1, HXK2, GLK1, PGM1, PGM2 e UGP1, bem como, ortólogos e parálogos que codificam essas enzimas. Em uma modalidade, a segunda modificação genética na célula hospedeira de levedura recombinante permite a expressão de, pelo menos, um dos genes que codificam para TPS1, TPS2, HXH1, HXK2, GLK1, PGM1, PGM2 ou UGP1 incluindo os ortólogos e parálogos associados.

[00056] Em um exemplo, a célula hospedeira de levedura recombinante pode exibir atividade biológica aumentada em, pelo menos, uma de uma trealose-6-fosfato (trealose-6-P) sintase ou uma trealose-6-fosfato fosfatase ou ambas as enzimas. Conforme indicado acima, isso pode ser feito através da introdução de um promotor forte e/ou constitutivo para aumentar a expressão da trealose-6-P sintase endógena e/ou da trealose-6-P fosfatase endógena. Alternativamente ou em combinação, isso também pode ser feito pela introdução de, pelo menos, uma cópia de uma ou mais moléculas de ácido nucleico heterólogas que codificam uma trealose-6-P sintase heteróloga e/ou uma trealose-6-P fosfatase heteróloga. Em uma modalidade, a célula hospedeira de levedura recombinante tem atividade biológica aumentada de uma trealose- 6-P sintase, mas não da trealose-6-P fosfatase. Em outra modalidade, a célula hospedeira de levedura recombinante tem atividade biológica aumentada de uma trealose-6-P fosfatase, mas não da trealose-6-P sintase. Em ainda outra modalidade, a célula hospedeira de levedura recombinante tem atividade biológica aumentada em ambas trealose-6-P sintase e trealose-6-P fosfatase.

[00057] A segunda modificação genética pode incluir o aumento da expressão de uma trealose-6-fosfato sintase endógena (fornecendo um promotor alternativo, por exemplo) e/ou expressando uma trealose-6-fosfato sintase heteróloga (fornecendo cópias adicionais do gene que codifica a trealose -6-fosfato sintase) na célula hospedeira de levedura recombinante. Tal como aqui utilizado, o termo "trealose-6-fosfato sintase" refere-se a uma enzima capaz de catalisar a conversão de glicose-6-fosfato e UDP-D-glicose em α-α-trealose- 6-fosfato e UDP. Em Saccharomyces cerevisiae, o gene da trealose-6-fosfato sintase pode ser referido como TPS1 (SGD: S000000330, Gene ID: 852423), BYP1, CIF1, FDP1, GGS1, GLC6 ou TSS1. A célula hospedeira de levedura recombinante da presente invenção pode incluir uma molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica para TPS1, uma variante da mesma, um fragmento da mesma ou para um polipeptídeo codificado por um gene ortólogo ou parálogo TPS1.

[00058] A segunda modificação genética pode incluir o aumento da expressão de uma trealose-6-fosfato fosfatase endógena (fornecendo um promotor alternativo, por exemplo) e/ou expressando uma trealose-6-fosfato fosfatase heteróloga (fornecendo cópias adicionais do gene que codifica a trealose-6-fosfato fosfatase) na célula hospedeira de levedura recombinante. Como também usado aqui, o termo "trealose-6-fosfato fosfatase" refere-se a uma enzima capaz de catalisar a conversão de α-α-trealose-6-fosfato e H2O em fosfato e trealose. Em Saccharomyces cerevisiae, o gene da trealose-6-fosfato fosfatase pode ser referido como TPS2 (SGD: S000002481, Gene ID: 851646), HOG2 ou PFK3. A célula hospedeira de levedura recombinante da presente invenção pode expressar um TPS2 heterólogo (bem como, uma variante ou um fragmento do mesmo) de qualquer origem, incluindo, mas não limitado a Saccharomyces cerevisiae (Gene ID: 851646), Arabidopsis thaliana (Gene ID: 838269), Schizosaccharomyces pombe (Gene ID: 2543109), Fusarium pseudograminearum (Gene ID: 20363081), Sugiyamaella lignohabitans (Gene ID: 30036691), Chlamydomonas reinhardtii (Gene ID: 5727896), Phaeodactylum tricornutum (Gene ID: 7194914), Candida albicans (Gene ID: 3636892), Kluyveromyces marxianus (Gene ID: 34714509), Scheffersomyces stipitis (Gene ID: 4840387), Spathaspora passalidarum (Gene ID: 18869689), Emiliania huxleyi (Gene ID: 17270873) ou Pseudogymnoascus destructans (Gene ID: 36290309). A célula hospedeira de levedura recombinante da presente invenção pode incluir uma molécula de ácido nucleico que codifica para TPS2, uma variante da mesma, um fragmento da mesma ou para um polipeptídeo codificado por um gene ortólogo ou parálogo TPS2. Em modalidades específicas, a célula hospedeira de levedura recombinante da presente invenção inclui uma molécula de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46 ou um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46.

[00059] Alternativamente ou em combinação, a segunda modificação genética pode incluir o aumento da expressão de um polipeptídeo envolvido na regulação da produção de trealose (fornecendo um promotor alternativo, por exemplo) ou a expressão de um polipeptídeo heterólogo envolvido na regulação da trealose (fornecendo cópias adicionais do gene que codifica o polipeptídeo). Em Saccharomyces cerevisiae, os polipeptídeos envolvidos na regulação da produção de trealose incluem, mas não são limitados a TPS3 e TSL1. Em alguma modalidade específica, o polipeptídeo envolvido na regulação da produção de trealose é TSL1. A célula hospedeira de levedura recombinante da presente invenção pode expressar uma TSL1 heteróloga (bem como, uma variante ou um fragmento da mesma) de qualquer origem, incluindo, mas não limitado a Saccharomyces cerevisiae (SGD: S000004566, Gene ID 854872), Gallus gallus (Gene ID107050801), Kluyveromyces marxianus (Gene ID: 34714558), Saccharomyces eubayanus (Gene ID: 28933129), Schizosaccharomyces japonicus (Gene ID: 7049746), Pichia kudriavzevii (Gene ID: 31691677) ou Hydra vulgaris (Gene ID 105848257). Em modalidades específicas, a célula hospedeira de levedura recombinante da presente invenção inclui uma molécula de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45, uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 ou um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45. Modificações genéticas adicionais

[00060] A célula hospedeira de levedura recombinante da presente invenção também pode incluir uma ou mais modificações genéticas adicionais. Estas modificações adicionais podem, por exemplo, aumentar as capacidades de fermentação da célula hospedeira de levedura recombinante e, em algumas modalidades, aumentar o rendimento de etanol e/ou diminuir o rendimento de glicerol da célula hospedeira de levedura recombinante durante a fermentação. Em algumas modalidades, a célula hospedeira de levedura recombinante pode ter uma terceira modificação genética permitindo ou aumentando a expressão de uma enzima sacarolítica heteróloga (em relação a uma célula hospedeira de levedura nativa sem a terceira modificação genética); uma quarta modificação genética permitindo ou aumentando a produção de formiato/acetil-CoA (em comparação com uma célula hospedeira de levedura nativa sem a quarta modificação genética); uma quinta modificação genética permitindo ou aumentando a utilização de acetil-CoA (quando comparada a uma célula hospedeira de levedura nativa sem a quinta modificação genética), uma sexta modificação genética para reduzir/limitar a produção de glicerol (quando comparada a uma célula hospedeira de levedura nativa sem a sexta modificação genética) e/ou uma sétima modificação genética para facilitar o transporte de glicerol para a célula hospedeira de levedura recombinante (em comparação com uma célula hospedeira de levedura nativa sem a sétima modificação genética). Em uma modalidade, a célula hospedeira recombinante tem, pelo menos, uma da terceira, quarta, quinta, sexta ou sétima modificação genética. Em outra modalidade, a célula hospedeira recombinante tem, pelo menos, duas da terceira, quarta, quinta, sexta ou sétima modificação genética. Em uma modalidade, a célula hospedeira recombinante tem, pelo menos, três da terceira, quarta, quinta, sexta ou sétima modificação genética. Em uma modalidade, a célula hospedeira recombinante tem, pelo menos, quatro da terceira, quarta, quinta, sexta ou sétima modificação genética. Em uma modalidade, a célula hospedeira recombinante tem a terceira, quarta, quinta, sexta e sétima modificações genéticas.

[00061] Conforme indicado acima, a célula hospedeira de levedura recombinante pode ter uma terceira modificação genética permitindo a expressão de uma enzima sacarolítica heteróloga, tal como uma enzima amilolítica. Conforme usado no contexto da presente invenção, uma "enzima sacarolítica" pode ser qualquer enzima envolvida na digestão, metabolismo e/ou hidrólise de carboidratos, incluindo amilases, celulases, hemicelulases, enzimas acessórias celulolíticas e amilolíticas, inulinases, levanases e açúcar pentose utilizando enzimas. Uma modalidade da enzima sacarolítica é uma enzima amilolítica. Tal como aqui utilizado, a expressão "enzima amilolítica" refere-se a uma classe de enzimas capazes de hidrolisar amido ou amido hidrolisado. As enzimas amilolíticas incluem, mas não são limitadas a alfa-amilases (EC 3.2.1.1, algumas vezes referida como alfa-amilase fúngica, ver abaixo), amilase maltogênica (EC 3.2.1.133), glucoamilase (EC 3.2.1.3), glucano 1, 4-alfa- maltotetraohidrolase (EC 3.2.1.60), pululanase (EC 3.2.1.41), isoamilase (EC

3.2.1.68) e amilomaltase (EC 2.4.1.25). Em uma modalidade, a uma ou mais enzimas amilolíticas podem ser uma alfa-amilase de Aspergillus oryzae, uma alfa-amilase maltogênica de Geobacillus stearothermophilus, uma glucoamilase (GA) de Saccharomycopsis fibuligera, um glucano 1,4-alfa-maltotetraohidrolase de Pseudomonas saccharophila, uma pullulanase de Bacillus naganoensis, uma pululanase de Bacillus acidopullulyticus, uma isoamilase de Pseudomonas amyloderamosa, e/ou amilomaltase de Thermus thermophilus. Algumas enzimas amilolíticas foram descritas no documento WO2018/167670 e são incorporadas aqui por referência.

[00062] Em modalidades específicas, a célula hospedeira de levedura recombinante pode carregar uma ou mais modificações genéticas que permitem a produção de uma glucoamilase heteróloga como a enzima amilolítica heteróloga. Muitos micróbios produzem uma amilase para degradar os amidos extracelulares. Além de clivar as últimas ligações α(1-4) glicosídicas na extremidade não redutora da amilose e amilopectina, produzindo glicose, a γ- amilase irá clivar as ligações α(1-6) glicosídicas. A glucoamilase heteróloga pode ser derivada de qualquer organismo. Em uma modalidade, o polipeptídeo heterólogo é derivado de uma γ-amilase, tal como, por exemplo, a glucoamilase de Saccharomycoces filbuligera (por exemplo, codificada pelo gene glu 0111). Exemplos de células hospedeiras de levedura recombinantes portadoras de tais primeiras modificações genéticas são descritos no documento WO 2011/153516, bem como, no documento WO 2017/037614 e aqui incorporados em sua totalidade. Em uma modalidade, a terceira modificação genética compreende a introdução, na célula hospedeira de levedura recombinante, de uma molécula de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40, uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40 ou um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40. Como tal, a presente invenção fornece uma célula hospedeira de levedura recombinante compreendendo uma molécula de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40, uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40 ou um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40.

[00063] Alternativamente ou em combinação, a célula hospedeira de levedura recombinante pode carregar uma ou mais quartas modificações genéticas permitindo ou aumentando a produção de formiato/acetil-CoA. Isso pode ser alcançado promovendo a conversão de piruvato em acetil-CoA e formiato. Em algumas modalidades específicas, a célula hospedeira de levedura recombinante pode carregar uma ou mais modificações genéticas que permitem a expressão de polipeptídeos heterólogos com atividade de piruvato formiato liase. Como tal, em algumas modalidades adicionais, a célula hospedeira de levedura recombinante pode incluir uma ou mais modificações genéticas adicionais para aumentar a produção de uma enzima heteróloga que funciona para anabolizar (formar) formiato. Conforme usado no contexto da presente invenção, "uma enzima heteróloga que funciona para anabolizar formiato" refere- se a polipeptídeos que podem ou não ser endogenamente encontrados na célula hospedeira de levedura recombinante e que são propositalmente introduzidos nas células hospedeiras de levedura recombinante. Em algumas modalidades, a enzima heteróloga que funciona para anabolizar o formiato é uma piruvato formiato liase heterólogo (PFL). O PFL heterólogo da presente invenção inclui, mas não está limitado ao polipeptídeo PFLA, um polipeptídeo codificado por um gene ortólogo ou parálogo pfla, o polipeptídeo PFLB ou um polipeptídeo codificado por um gene ortólogo ou parálogo pflb. Em uma modalidade, a quarta modificação genética compreende a introdução, na célula hospedeira de levedura recombinante, uma molécula de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42, uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 ou um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42. Como tal, a presente invenção fornece uma célula hospedeira de levedura recombinante compreendendo uma molécula de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42, uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 ou um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42. Em uma modalidade, a quarta modificação genética compreende a introdução, na célula hospedeira de levedura recombinante, de uma molécula de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43, uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 ou um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

43. Como tal, a presente invenção fornece uma célula hospedeira de levedura recombinante compreendendo uma molécula de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43, uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 ou um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43. Em uma modalidade, a quarta modificação genética compreende a introdução, na célula hospedeira de levedura recombinante, de uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 e 43, uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 e 43 ou um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 e 43. Como tal, a presente invenção fornece uma célula hospedeira de levedura recombinante compreendendo uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 e 43, uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 e 43 ou um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 ou 43. Em uma modalidade, a célula hospedeira de levedura recombinante portadora de uma ou mais quarta modificação genética pode ter genes de formiato desidrogenase (FDH) nativos (tais como, por exemplo, FDH1 e FDH2) e são capazes de expressar os genes FDH nativos. Em outra modalidade, a célula hospedeira de levedura recombinante portadora de uma ou mais quarta modificação genética pode ser ainda modificada para ter genes FDH nativos inativados (tais como, por exemplo, FDH1 e FDH2) e ter uma capacidade limitada ou nenhuma capacidade de expressão de genes FDH nativos.

[00064] Alternativamente ou em combinação, a célula hospedeira de levedura recombinante pode carregar uma ou mais quinta modificação genética permitindo ou aumentando a utilização de acetil-CoA. Isso pode ser alcançado promovendo a conversão de acetil-CoA em um álcool como o etanol. Em algumas modalidades específicas, a célula hospedeira de levedura recombinante pode carregar uma ou mais modificações genéticas que permitem a expressão de polipeptídeos heterólogos com atividade de acetaldeído desidrogenase, atividade de álcool desidrogenase ou ambas. Em acetaldeído desidrogenase heteróloga (AADH), álcool desidrogenase heteróloga (ADH), e/ou acetaldeído/álcool desidrogenase heteróloga bifuncional (ADHE), tais como aquelas descritas na Patente U.S. Número Serial 8.956.851 e no documento WO 2015/023989. Mais especificamente, as enzimas PFL e AADH para uso nas células hospedeiras de levedura recombinantes podem vir de uma fonte bacteriana ou eucariótica. AADHs heterólogas da presente invenção incluem, mas não são limitadas aos polipeptídeos ADHE ou um polipeptídeo codificado por um gene ortólogo ou parálogo adhe. Em uma modalidade, a quarta modificação genética compreende a introdução, na célula hospedeira de levedura recombinante, de uma molécula de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44, uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 ou um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44. Como tal, a presente invenção fornece uma célula hospedeira de levedura recombinante compreendendo uma molécula de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44, uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 ou um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44.

[00065] A presente invenção compreende o fornecimento de uma célula hospedeira de levedura recombinante tendo a quarta modificação genética, mas não a quinta modificação genética, a quinta modificação genética, mas não a quarta modificação genética, bem como, ambas as quarta e quinta modificações genéticas. Em uma modalidade específica, o recombinante compreende a quarta modificação genética (compreendendo uma ou mais moléculas de ácido nucleico para expressar um PFLA e PFLB heterólogo) e a quinta modificação genética (compreendendo uma molécula de ácido nucleico para expressar uma ADHE heteróloga).

[00066] Alternativamente ou em combinação, a célula hospedeira de levedura recombinante também pode incluir uma ou mais sexta modificações genéticas que limitam a produção de glicerol. Por exemplo, a sexta modificação genética pode ser uma modificação genética que leva à redução na produção e, em uma modalidade, à inibição na produção, de uma ou mais enzimas nativas que funcionam para produzir glicerol. Conforme usado no contexto da presente invenção, a expressão "reduzindo a produção de uma ou mais enzimas nativas que funcionam para produzir glicerol" refere-se a uma modificação genética que limita ou impede a expressão de genes associados a um ou mais polipeptídeos nativos (em algumas modalidades enzimas) que funcionam para produzir glicerol, quando comparado a uma cepa de levedura correspondente que não carrega tal modificação genética.

Em alguns casos, a modificação genética adicional reduz, mas ainda permite a produção de um ou mais polipeptídeos nativos que funcionam para produzir glicerol.

Em outros casos, a modificação genética inibe a produção de uma ou mais enzimas nativas que funcionam para produzir glicerol.

Os polipeptídeos que funcionam para produzir glicerol referem- se a polipeptídeos que são encontrados endogenamente na célula hospedeira de levedura recombinante.

As enzimas nativas que funcionam para produzir glicerol incluem, mas não são limitadas a GPD1 e o polipeptídeo GPD2 (também referidos como GPD1 e GPD2, respectivamente), bem como, os polipeptídeos GPP1 e GPP2 (também referidos como GPP1 e GPP2, respectivamente). Em uma modalidade, a célula hospedeira de levedura recombinante carrega uma modificação genética em, pelo menos, um do gene gpd1 (que codifica o polipeptídeo GPD1), o gene gpd2 (que codifica o polipeptídeo GPD2), o gene gpp1 (que codifica o polipeptídeo GPP1) ou o gene gpp2 (que codifica o polipeptídeo GPP2). Em outra modalidade, a célula hospedeira de levedura recombinante carrega uma modificação genética em, pelo menos, dois do gene gpd1 (que codifica o polipeptídeo GPD1), o gene gpd2 (que codifica o polipeptídeo GPD2), o gene gpp1 (que codifica o polipeptídeo GPP1) ou o gene gpp2 (que codifica o polipeptídeo GPP2). Exemplos de células hospedeiras de levedura recombinantes com tais modificações genéticas que levam à redução na produção de uma ou mais enzimas nativas que funcionam para produzir glicerol são descritos no documento WO 2012/138942. Em algumas modalidades, a célula hospedeira de levedura recombinante tem uma modificação genética (tal como, uma deleção ou inserção genética) apenas em uma enzima que funciona para produzir glicerol, no gene gpd2, o que faria com que a célula hospedeira tivesse um gene gpd2 nocauteado.

Em algumas modalidades, a célula hospedeira de levedura recombinante pode ter uma modificação genética no gene gpd1 e o gene gpd2 resultante é uma célula hospedeira de levedura recombinante sendo nocauteada para o gene gpd1 e o gene gpd2. Em algumas modalidades específicas, a célula hospedeira de levedura recombinante pode ser um nocaute para o gene gpd1 e ter cópias duplicadas do gene gpd2 (em algumas modalidades, sob o controle do promotor gpd1). Em ainda outra modalidade (em combinação ou alternativa à modificação genética descrita acima).

[00067] Em ainda outra modalidade, a célula hospedeira de levedura recombinante não carrega uma sexta modificação genética e inclui seus genes nativos que codificam para os polipeptídeos GPP/GDP.

[00068] Alternativamente ou em combinação, a célula hospedeira de levedura recombinante também pode incluir uma ou mais sétimas modificações genéticas que facilitam o transporte de glicerol na célula hospedeira de levedura recombinante. Por exemplo, a sétima modificação genética pode ser uma modificação genética que leva ao aumento da atividade de uma ou mais enzimas nativas que funcionam para transportar glicerol. As enzimas nativas que funcionam para transportar as sínteses de glicerol incluem, mas não são limitadas ao polipeptídeo FPS1, bem como, o polipeptídeo STL1. O polipeptídeo FPS1 é um exportador de glicerol e as funções do polipeptídeo STL1 importam glicerol na célula hospedeira de levedura recombinante. Ao reduzir ou inibir a expressão do polipeptídeo FPS1 e/ou aumentar a expressão do polipeptídeo STL1, é possível controlar, até certo ponto, o transporte de glicerol.

[00069] O polipeptídeo STL1 é expresso nativamente em leveduras e fungos, portanto, o polipeptídeo heterólogo funcionando para importar glicerol pode ser derivado de leveduras e fungos. Os genes STL1 que codificam o polipeptídeo STL1 incluem, mas não são limitados a, Saccharomyces cerevisiae Gene ID: 852149, Candida albicans, Kluyveromyces lactis Gene ID: 2896463, Ashbya gossypii Gene ID: 4620396, Eremothecium sinecaudum Gene ID: 28724161, Torulaspora delbrueckii Gene ID: 11505245, Lachancea thermotolerans Gene ID: 8290820, Phialophora attae Gene ID: 28742143, Penicillium digitatum Gene ID: 26229435, Aspergillus oryzae Gene ID: 5997623, Aspergillus fumigatus Gene ID: 3504696, Talaromyces atroroseus Gene ID: 31007540, Rasamsonia emersonii Gene ID: 25315795, Aspergillus flavus Gene ID: 7910112, Aspergillus terreus Gene ID: 4322759, Penicillium chrysogenum Gene ID: 8310605, Alternaria alternata Gene ID : 29120952, Paraphaeosphaeria sporulosa Gene ID: 28767590, Pyrenophora tritici-repentis Gene ID: 6350281,

Metarhizium robertsii Gene ID: 19259252, Isaria fumosorosea Gene ID: 30023973, Cordyceps militaris Gene ID: 18171218, Pochonia chlamydosporia Gene ID: 28856912, Metarhizium majus Gene ID: 26274087, Neofusicoccum parvum Gene ID:19029314, Diplodia corticola Gene ID: 31017281, Verticillium dahliae Gene ID: 20711921, Colletotrichum gloeosporioides Gene ID: 18740172, Verticillium albo-atrum Gene ID: 9537052, Paracoccidioides lutzii Gene ID: 9094964, Trichophyton rubrum Gene ID: 10373998, Nannizzia gypsea Gene ID: 10032882, Trichophyton verrucosum Gene ID: 9577427, Arthroderma benhamiae Gene ID: 9523991, Magnaporthe oryzae Gene ID: 2678012, Gaeumannomyces graminis var. tritici Gene ID: 20349750, Togninia minima Gene ID: 19329524, Eutypa lata Gene ID: 19232829, Scedosporium apiospermum Gene ID: 27721841, Aureobasidium namibiae Gene ID: 25414329, Sphaerulina musiva Gene ID: 27905328, bem como, Pachysolen tannophilus Números de Acesso GenBank JQ481633 e JQ481634, Saccharomyces paradoxus STL1 e Pichia sorbitophilia. Em uma modalidade, o polipeptídeo STL1 é codificado por Saccharomyces cerevisiae Gene ID: 852149. Em uma modalidade, o polipeptídeo STL1 tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39. Processo para fazer um produto fermentado

[00070] As células hospedeiras de levedura recombinantes aqui descritas podem ser usadas para melhorar o rendimento de fermentação, tal como o rendimento de álcool (por exemplo, etanol), mantendo a robustez da levedura durante a fermentação, mesmo na presença de um estressor, uma contaminação bacteriana (que pode estar associada, em algumas modalidades, a um aumento no ácido lático durante a fermentação), um aumento no pH, uma redução na aeração, temperaturas elevadas ou combinações. Conforme aqui apresentado, embora a expressão da trealase heteróloga tenha o potencial de aumentar a produção de etanol, a mesma demonstrou causar uma redução na robustez na célula hospedeira de levedura recombinante. Esta redução na robustez foi restaurada pela introdução de uma segunda modificação genética para aumentar a produção de trealose.

[00071] O produto fermentado pode ser um álcool, tais como, por exemplo, etanol, isopropanol, n-propanol, 1-butanol, metanol, acetona e/ou 1,2 propanodiol.

[00072] A presente invenção fornece, assim, uma célula hospedeira de levedura recombinante que aumenta a produção de trealose e também exibe atividade de trealase de modo a manter ou aumentar o rendimento da fermentação. Em uma modalidade, quando uma biomassa (por exemplo, compreendendo milho) é fermentada pela célula hospedeira de levedura recombinante da presente invenção, na conclusão de uma fermentação, o meio de fermentação tem menos de 10 g/L, 9 g/L, 8 g/L, 7 g/L, 6 g/L, 5 g/L, 4 g/L, 3 g/L, 2 g/L ou 1 g/L de glicerol. Alternativamente ou em combinação, quando uma biomassa (por exemplo, compreendendo milho) é fermentada pela célula hospedeira de levedura recombinante da presente invenção, na conclusão de uma fermentação, o meio de fermentação tem menos de 120 g/L, 110 g/L, 100 g/L, 90 g/L, 80 g/L, 70 g/L, 60 g/L, 50 g/L, 40 g/L, 30 g/L, 20 g/L ou 10 g/L de glicose. Alternativamente ou em combinação, quando uma biomassa (por exemplo, compreendendo milho) é fermentada pela célula hospedeira de levedura recombinante da presente invenção, na conclusão de uma fermentação permissiva, o meio de fermentação tem, pelo menos, 100 g/L, 105 g/L, 110 g/L, 115 g/L, 120 g/L, 125 g/L, 130 g/L, 135 g/L ou 140 g/L de etanol. Alternativamente ou em combinação, quando uma biomassa (por exemplo, compreendendo milho) é fermentada pela célula hospedeira de levedura recombinante da presente invenção, na conclusão de uma fermentação de estresse, o meio de fermentação tem, pelo menos, 50 g/L, 55 g/L, 60 g/L, 65 g/L, 70 g/L, 75 g/L, 80 g/L, 85 g/L ou 90 g/L de etanol.

[00073] A biomassa que pode ser fermentada com as células hospedeiras de levedura recombinantes aqui descritas inclui qualquer tipo de biomassa conhecido na técnica e aqui descrito. Por exemplo, a biomassa pode incluir, mas não está limitada a amido, açúcar e materiais lignocelulósicos. Os materiais de amido podem incluir, mas não são limitados a pastas, tal como milho, trigo, centeio, cevada, arroz ou milo. Os materiais de açúcar podem incluir, mas não são limitados à beterraba sacarina, tubérculos de alcachofra, sorgo doce, melaço ou cana-de-açúcar. Os termos "material lignocelulósico", "substrato lignocelulósico" e "biomassa celulósica" significam qualquer tipo de biomassa compreendendo celulose, hemicelulose, lignina ou combinações dos mesmos, tais como, mas não limitados à biomassa lenhosa, gramíneas forrageiras, culturas energéticas herbáceas, biomassa não lenhosa de planta, perdas agrícolas e/ou resíduos agrícolas, resíduos florestais e/ou perdas florestais, lama de produção de papel e/ou lama de papel residual, lama de tratamento de águas residuais, resíduos sólidos municipais, plantas de etanol de milho moído seco e úmido e resíduos do processamento de açúcar. Os termos "hemicelulósicos", "porções hemicelulósicas" e "frações hemicelulósicas" significam a não lignina, elementos não celulósicos de material lignocelulósico, tais como, mas não limitados à hemicelulose (isto é, compreendendo xiloglucano, xilano, glucuronoxilano, arabinoxilano, manano, glucomanano e galactoglucomanano), pectinas (por exemplo, homogalacturonanos, ramnogalacturonanos I e II e xilogalacturonano) e proteoglicanos (por exemplo, polipeptídeo arabinogalactano, extensina e polipeptídeos ricos em pró- linhagem).

[00074] Em um exemplo não limitativo, o material lignocelulósico pode incluir, mas não está limitado à biomassa lenhosa, tal como fibra de polpa de madeira reciclada, serragem, madeira dura, madeira macia e combinações das mesmas; gramíneas, tais como grama, grama de cordão, grama de centeio, caniço-malhado, miscanto, ou uma combinação dos mesmos; resíduos do processamento de açúcar, tais como, mas não limitados ao bagaço da cana-de- açúcar; resíduos agrícolas, tais como, mas não limitados à palha de arroz, casca de arroz, palha de cevada, espigas de milho, palha de cereal, palha de trigo, palha de canola, palha de aveia, casca de aveia e fibra de milho; caules e folhas, tais como, mas não limitados a caules e folhas de soja, caules e folhas de milho; suculentas, tais como, mas não limitados a agave; e resíduos florestais, tais como, mas não limitados à fibra de polpa de madeira reciclada, serragem, madeira dura (por exemplo, choupo, carvalho, bordo, bétula, salgueiro), madeira macia ou qualquer combinação dos mesmos. O material lignocelulósico pode compreender uma espécie de fibra; alternativamente, o material lignocelulósico pode compreender uma mistura de fibras que se originam de diferentes materiais lignocelulósicos. Outros materiais lignocelulósicos são resíduos agrícolas, tais como palha de cereais, incluindo palha de trigo, palha de cevada, palha de canola e palha de aveia; fibra de milho; caules e folhas, tais como caules e folhas de milho e caules e folhas de soja; gramíneas, tais como grama, caniço-malhado, grama de cordão e miscanto; ou combinações dos mesmos.

[00075] Os substratos para ensaios de atividade da celulose podem ser divididos em duas categorias, solúveis e insolúveis, com base em sua solubilidade em água. Substratos solúveis incluem celodextrinas ou derivados, carboximetil celulose (CMC) ou hidroxietil celulose (HEC). Substratos insolúveis incluem celulose cristalina, celulose microcristalina (Avicel), celulose amorfa, tal como celulose inchada com ácido fosfórico (PASC), celulose tingida ou fluorescente e biomassa lignocelulósica pré-tratada. Esses substratos são geralmente material celulósico altamente ordenado e, portanto, apenas moderadamente solúvel.

[00076] Será apreciado que o material lignocelulósico adequado pode ser qualquer matéria-prima que contenha celulose solúvel e/ou insolúvel, onde a celulose insolúvel pode estar em uma forma cristalina ou não cristalina. Em várias modalidades, a biomassa lignocelulósica compreende, por exemplo, madeira, milho, caules e folhas de milho, serragem, casca, melaço, cana-de- açúcar, folhas, resíduos agrícolas e florestais, gramíneas, tal como gramas, produtos de digestão de ruminantes, resíduos municipais, efluentes de fábrica de papel, jornal, papelão ou combinações dos mesmos.

[00077] A lama de papel também é uma matéria-prima viável para a produção de lactato ou acetato. A lama de papel é um resíduo sólido proveniente da polpação e da fabricação de papel, e normalmente é removida da água residual do processo em um clarificador primário. O custo de descarte da lama úmida é um incentivo significativo para converter o material para outros usos, tal como a conversão em etanol. Os processos fornecidos pela presente invenção são amplamente aplicáveis. Além disso, os produtos de sacarificação e/ou fermentação podem ser usados para produzir etanol ou produtos químicos de maior valor agregado, tais como ácidos orgânicos, aromáticos, ésteres, acetona e intermediários poliméricos.

[00078] O processo da presente invenção colocando em contato as células hospedeiras recombinantes aqui descritas com uma biomassa de modo a permitir a conversão de, pelo menos, uma parte da biomassa no produto de fermentação (por exemplo, um álcool, tal como etanol). Em uma modalidade, a biomassa ou substrato a ser hidrolisado é uma biomassa lignocelulósica e, em algumas modalidades, compreende amido (em uma forma gelatinizada ou bruta). O processo pode incluir, em algumas modalidades, o aquecimento da biomassa lignocelulósica antes da fermentação para fornecer amido em uma forma gelatinizada.

[00079] O processo de fermentação pode ser realizado a temperaturas de, pelo menos, cerca de 25°C, cerca de 28°C, cerca de 30°C, cerca de 31°C, cerca de 32°C, cerca de 33°C, cerca de 34°C, cerca de 35°C, cerca de 36°C, cerca de 37°C, cerca de 38°C, cerca de 39°C, cerca de 40°C, cerca de 41°C, cerca de 42°C ou cerca de 50°C. Em algumas modalidades, o processo pode ser conduzido a temperaturas acima de cerca de 30°C, cerca de 31°C, cerca de 32°C, cerca de 33°C, cerca de 34°C, cerca de 35°C, cerca de 36°C, cerca de 37°C, cerca de 38°C, cerca de 39°C, cerca de 40°C, cerca de 41°C, cerca de 42°C ou cerca de 50°C.

[00080] O processo de fermentação pode ser conduzido, pelo menos em parte, na presença de um estressor (tais como altas temperaturas ou a presença de uma contaminação bacteriana).

[00081] Em algumas modalidades, o processo pode ser usado para produzir etanol a uma taxa particular. Por exemplo, em algumas modalidades, o etanol é produzido a uma taxa de, pelo menos, cerca de 0,1 g por hora por litro, pelo menos cerca de 0,25 g por hora por litro, pelo menos cerca de 0,5 g por hora por litro, pelo menos cerca de 0,75 g por hora por litro, pelo menos cerca de 1,0 g por hora por litro, pelo menos cerca de 2,0 g por hora por litro, pelo menos cerca de 5,0 g por hora por litro, pelo menos cerca de 10 g por hora por litro, pelo menos cerca de 15 g por hora por litro, pelo menos cerca de 20,0 g por hora por litro, pelo menos cerca de 25 g por hora por litro, pelo menos cerca de 30 g por hora por litro, pelo menos cerca de 50 g por hora por litro, pelo menos cerca de 100 g por hora por litro, pelo menos cerca de 200 g por hora por litro, ou pelo menos cerca de 500 g por hora por litro.

[00082] A produção de etanol pode ser medida usando qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, a quantidade de etanol em amostras de fermentação pode ser avaliada usando análises de HPLC. Muitos kits de ensaio de etanol estão comercialmente disponíveis que usam, por exemplo, ensaios com base em enzima álcool oxidase.

[00083] A presente invenção será mais facilmente compreendida referindo-se aos seguintes exemplos que são dados para ilustrar a invenção em vez de limitar o seu escopo.

EXEMPLO I - TELA DE TREALASE Tabela 1. Descrição das trealases usadas nos Exemplos Ácido nuclei- Aminoácido Cepa # Cepa # Referência Fonte Acesso co – - SEQ ID (M2390) (M15419) SEQ NO: ID NO: M16740, Aspergillus MP244 XP_748551 1 2 M11245 M16742, fumigatus M16744 Neosartorya MP1056 GAO81301 3 4 M16289 M16738 udagawae MP1057 Aspergillus flavus XP_002380869 5 6 M16291 Fusarium MP1058 EMT72108 7 8 oxysporum MP1059 Escovopsis weberi KOS20950 9 10 Microsporum MP1060 XP_003169590 11 12 gypseum Aspergillus MP1061 XP_001273664 13 14 clavatus Metarhizium MP1062 KJK86671 15 16 anisopliae Ogataea MP1063* XP_013934584 17 18 parapolymorpha Kluyveromyces MP1064* BAP73405 19 20 M16293 marxianus Komagataella MP1065* CCA40810 21 22 phaffii MP1066* Ashbya gossypii AAS54220 23 24 M16295 M16732, M16746, MP1067 Neurospora crassa XP_965136 25 26 M16283 M16752, M16753 M16734, MP1068 Thielavia terrestris XP_003656356 27 28 M16285 M16748, M16750 Aspergillus MP1069 GAQ05120 29 30 M16287 M16736 lentulus Aspergillus MP1070* KKK15878 31 32 ochraceoroseus MP1071 Rhizoctonia solani AGM46811 33 34 MP1072 Achlya hypogyna AIG56056 35 36 M16281 M16731 Schizopora MP1073 KLO15949 37 38 paradoxa

* Trealases sem uma sequência de sinal

[00084] Duas cópias de cassetes de expressão (com códon otimizado para S. cerevisiae) para cada trealase identificada na Tabela 1 foram modificadas na cepa anterior de tipo selvagem M2390 sob o controle de um promotor constitutivo (TEF2p) e com seu respectivo peptídeo de sinal nativo. Dez (10) isolados clonais foram cultivados durante 48 h em meio YPD e, em seguida, os sobrenadantes da cultura foram incubados com 1% de trealose durante 2 h antes da incubação com dinitrossalicilato (DNS). A Figura 2 exibe a atividade de trealase média para cada enzima em relação a M2390 e MP244. Das quinze sequências testadas, oito tinham atividade mensurável superior a M2390 (MP1056, MP1057, MP1064, MP1066, MP1067, MP1068, MP1069 e MP1072).

[00085] O ensaio de trealose foi repetido usando colônias únicas dos cinco primeiros candidatos. Colônias únicas dos cinco melhores candidatos foram cultivadas em YPD durante 48 h e, em seguida, os sobrenadantes da cultura foram incubados com 1% de trealose durante 30 min, 60 min ou 90 min antes da incubação com DNS. Como apresentado na Figura 3, sob essas condições, MP244 (A. fumigatus trealase expressa na cepa M11245) e MP1072 (A. hypogyna trealase expressa na cepa M16281) tiveram a maior atividade secretada. MP1056 (N. udagawae trealase na cepa M16289) foi o próximo maior, seguido por MP1069 (A. lentulus trealase na cepa M16287), MP1067 (N. crassa trealase em M16283) e MP1068 (T. terrestris trealase em M16285).

[00086] Os cinco principais candidatos que expressam trealases nas cepas M16281, M16283, M16285, M16287 e M16289 foram submetidos à fermentação de pasta de milho permissiva ou de alta temperatura e comparados com M2390 (tipo selvagem) e M11245 (expressando A. fumigatus MP244 trealase). A fermentação permissiva foi realizada a 31,5% de sólidos totais (TS) contendo 100% de glucoamilase (GA a 0,6AGU/gTS) e 300 ppm de ureia a 33- 31°C (mudança às 20 h) em um sistema de monitoramento de CO2. As condições para a fermentação à alta temperatura foram as mesmas permitidas, mas com a temperatura mantida a 37°C durante todo o período. As 50 amostras finais foram submetidas às análises de HPLC e medição de trealose usando uma coluna Dionex.

[00087] Como pode ser visto na Figura 4, a cepa M16283, expressando a N. crassa trealase, forneceu um aumento de etanol de ~ 0,5%

em relação a M2390. A cepa M16285 também se saiu muito bem. No final da fermentação, a trealose residual para a cepa M2390 foi medida em 0,73 g/L. Nenhuma trealose detectável foi medida para as cepas modificadas.

[00088] Em termos de robustez em altas temperaturas, a N. crassa trealase expressa na cepa M16283 não pareceu perder robustez em relação à cepa M2390, o que é uma melhoria da trealase atual expressa na cepa M11245 (Figura 5). As outras cepas de atividade mais baixa (M16285, M16287 e M16289) também apresentam desempenho similar ao M2390 (Figura 5). As cepas M11245 e M16281, as duas cepas de maior atividade, foram as mais sensíveis à temperatura, como pode ser visto por títulos de etanol mais baixos e glicose residual mais alta na tela de fermentação de alta temperatura (Figura 5). No final da fermentação, a trealose residual para a cepa M2390 foi medida a 0,6 g/L de trealose, enquanto para a cepa M16281 a mesma foi medida a 0,25 g/L. As cepas modificadas restantes não mostraram quantidades de trealose detectáveis. EXEMPLO II - COMBINAÇÕES DE TREALASE

[00089] Os cinco principais candidatos à trealase identificados no Exemplo I (MP1072, MP1067, MP1068, MP1069 e MP1056) também foram modificados em duas cópias sob o controle de um promotor constitutivo (TEF2p) e um terminador (ADH3t) sozinho ou em combinação com a superexpressão de TSL1 ou TPS2 nativo (regulador de trealose ou polipeptídeo de síntese) (TSL1 e TPS2 apenas com N. crassa ou T. terrestris trealase) como indicado nas Tabelas 2A e B. Tabela 2A. Descrição das cepas anteriores usadas neste Exemplo Gene(s) deletado(s) Gene(s) superexpresso(s) M2390 Nenhuma – cepa do tipo selvagem M14926 STL1 (SEQ ID NO: 39), GA (SEQ ID NO: 40) M4080 GA (SEQ ID NO: 40) 2 cópias de FDH1 (SEQ ID NO: 41), PFLA (SEQ ID NO: 42), fdh1∆ fdh2∆ M15419 PFLB (SEQ ID NO: 43), ADHE (SEQ ID NO: 44), STL1 (SEQ ID gpd2Δ NO: 39)

Tabela 2B.

Descrição das cepas usadas neste Exemplo.

GA = SEQ ID NO: 40, TSL1 = SEQ ID NO: 45, STL1 = SEQ ID NO: 39, Formiato = PFLA (SEQ ID NO: 42), PFLB (SEQ ID NO: 43) e ADHE (SEQ ID NO: 44), FDH1 = SEQ ID NO: 41, TPS2 = SEQ ID NO: 46 Cepa anterior M14926 M4080 M2390 M15419 Trealase MP1068 MP1067 MP1068 MP1067 MP1068 MP1067 MP1072 MP1068 MP1067 MP1072 MP244 Outros genes superexpressos GA/TSL1 GA/STL1/TSL1 M17363 M17512 M17356 M17502 M17626 GA/STL1/Formiato/TSL1 M17513 M17515 M17504 M17505 M17623 GA/STL1/Formiato/FDH1 M16731 M16752 M16742 M17621 M16750 GA/STL1/Formiato/TSL1/FDH1 M16753 GA/STL1/Formiato/FDH1/TPS2 M16748 M16746 M16744 STL1/TSL1 M17358 M17562 STL1/Formiato/TSL1 M17564 M17566 Formiato/TSL1 TSL1 Apenas trealase M16285 M16283 M16281

[00090] Uma tela de fermentação inicial foi executada para avaliar o desempenho permissivo e de estresse láctico das cepas em comparação com as cepas de controle. A fermentação foi executada a 32,5% de TS, 33% ou 32,5% de TS usando pasta sob estresse permissivo de alta temperatura, ácido lático (0,38% p/v de ácido lático adicionado às 18 h, ou condições de estresse bacteriano. Ureia (300 ppm de ureia) foi adicionada nas condições permissivas apenas. Cada cepa de levedura foi dosada a 65% de GA com 100% de GA = 0,6A de GU/gTS. O conjunto permissivo foi incubado a 33,3°C - 31°C (a mudança de temperatura foi feita a 18 h) durante 50 h, o conjunto de altas temperaturas foi incubado a 37°C durante 50 h e o conjunto de estresse bacteriano foi incubado a 34°C durante 50 h. Lactobacillys plantarum (1.2E9) foi adicionado na frente para a condição de estresse bacteriano.

[00091] As cepas que expressam a N. crassa (M16752) ou T. terrestris (M16750) trealase em combinação com a superexpressão de TSL1 demonstraram um aumento de 1% de rendimento em relação a M15419 sob condições permissivas e sem perda de robustez sob estresse láctico ou contaminação bacteriana (Figuras 6A a 6C, Tabela 3). Os resultados aqui apresentados mostram que as cepas capazes de aumentar a produção de trealose e expressar uma trealase são mais robustas (por exemplo, produzem mais etanol, menos glicerol e/ou consomem mais glicose) do que as cepas que expressam apenas uma trealase. Tabela 3A1. Resultados adicionais obtidos após 50 h de fermentação permissiva conduzida com 32,5% de pasta TS, 300 ppm de ureia, 65% de GA para cepas modificadas (100% = 0,6AGU/gTS), 33 - 31°C, 150 rpm de agitação Cepas Dose Glicose Láctico Glicerol Ácido Etanol Potencial Formiato GA YP acético M2390 100% 0,6 0,3 8,5 0,6 148,7 148,9 0,000 M12156 65% 0,8 0,3 4,2 0,0 153,3 153,6 0,200 M15419 65% 0,4 0,4 5,3 0,1 151,5 151,7 0,000 M17512 65% 0,6 0,4 7,0 0,4 151,3 151,6 0,000 M17513 65% 2,6 0,3 3,8 0,0 153,7 154,9 0,155 M17515 65% 2,3 0,4 4,1 0,1 153,4 154,5 0,155 M17502 65% 0,8 0,4 6,8 0,5 150,6 151,0 0,000 M17504 65% 2,0 0,3 3,7 0,0 153,4 154,3 0,140 M17505 65% 3,9 0,3 3,6 0,0 151,3 153,1 0,155 M17562 100% 0,7 0,4 6,9 0,4 151,1 151,4 0,000 M17564 100% 3,1 0,4 4,7 0,1 152,1 153,6 0,135

M17566 100% 2,8 0,3 3,9 0,0 153,3 154,6 0,150 Tabela 3A2. Desvio padrão dos resultados da Tabela 3A1 Glicerol Ácido Cepas Glicose Láctico Etanol Potencial Formiato YP acético M2390 0,049 0,028 0,071 0,014 0,502 0,525 0,000 M12156 0,014 0,007 0,035 0,000 0,297 0,303 0,000 M15419 0,000 0,007 0,106 0,007 1,336 1,336 0,000 M17512 0,007 0,000 0,042 0,000 0,460 0,463 0,000 M17513 0,035 0,007 0,021 0,000 0,502 0,486 0,007 M17515 0,071 0,000 0,021 0,021 0,255 0,222 0,007 M17502 0,028 0,007 0,007 0,014 0,191 0,204 0,000 M17504 0,021 0,007 0,028 0,000 0,014 0,024 0,000 M17505 0,205 0,014 0,064 0,000 0,764 0,669 0,007 M17562 0,014 0,021 0,071 0,127 0,325 0,319 0,000 M17564 0,014 0,000 0,014 0,000 0,332 0,339 0,007 M17566 0,057 0,000 0,014 0,000 0,085 0,111 0,000 Tabela 3B1. Resultados adicionais obtidos após 50 h de fermentação conduzida sob condições permissivas (31,5% de pasta TS, 300 ppm de ureia, 65% de GA para cepas modificadas (100% = 0,6AGU/gTS), 33 - 31°C, 150 rpm de agitação; EE = 32,5% de pasta TS, 400 ppm de ureia, 65% de GA para cepas modificadas (100% = 0,6AGU/gTS), 33 - 31°C, 150 rpm de agitação), condições lácticas (31,5% de pasta TS, 65% de GA para cepas modificadas (100% = 0,6AGU/gTS), 34°C, 150 rpm de agitação) ou condições de alta temperatura (33% de pasta TS, 0 ppm de ureia, 65% de GA para cepas modificadas (100% = 0,6AGU/gTS), 37°C, 150 rpm de agitação). Condição GA Cepas Glicose Láctico Glicerol Ácido Etanol Formiato YP acético Permissiva 100% M2390 0,44 0,32 8,69 0,61 140,21 0,00 Láctica 100% M2390 2,64 3,76 8,57 0,66 137,96 0,00 Permissiva 65% M12156 0,69 0,22 4,46 0,00 143,13 0,15 Láctica 65% M12156 41,02 4,05 4,35 0,14 121,11 0,11 Permissiva 65% M15419 0,26 0,30 5,43 0,12 142,45 0,00 Láctica 65% M15419 0,35 3,99 5,99 0,11 140,17 0,00 Permissiva 65% M17356 0,32 0,33 7,00 0,32 142,19 0,00 Láctica 65% M17356 8,60 4,06 6,41 0,30 137,60 0,00 Permissiva 65% M17363 0,46 0,31 7,32 0,37 140,28 0,00 Láctica 65% M17363 8,01 3,91 6,55 0,31 138,37 0,00 EE 100% M2390 0,2 0,5 9,4 0,5 144,9 0,0 Permissiva Temp 100% M2390 33,1 0,3 10,2 0,9 130,1 0,0 esterlina

Condição GA Cepas Glicose Láctico Glicerol Ácido Etanol Formiato YP acético EE 50% M12156 0,4 0,6 5,4 0,1 147,6 0,4 Permissiva Temp 65% M12156 48,7 0,3 6,1 0,3 125,0 0,0 esterlina EE 50% M15419 0,2 0,6 6,3 0,2 146,7 0,1 Permissiva Temp 65% M15419 43,9 0,3 7,4 0,4 126,1 0,0 esterlina EE 50% M17356 0,3 0,6 7,2 0,3 146,2 0,0 Permissiva Temp 65% M17356 38,6 0,3 7,7 0,5 130,4 0,0 esterlina EE 50% M17363 0,3 0,4 7,5 0,4 147,7 0,0 Permissiva Temp 65% M17363 44,8 0,3 7,6 0,6 127,7 0,0 esterlina Tabela 3B2. Desvios padrão dos resultados apresentados na Tabela 3B1 Cepas Glicose Láctico Glicerol Ácido Etanol Formiato YP acético M2390 0,049 0,014 0,148 0,049 0,361 0,000 M12156 0,085 0,276 0,064 0,007 0,304 0,000 M15419 0,170 0,007 0,049 0,000 0,226 0,007 M12156 2,680 0,170 0,028 0,000 1,633 0,000 M15419 0,007 0,014 0,042 0,014 0,177 0,000 M15419 0,021 0,127 0,028 0,014 1,153 0,000 M17356 0,000 0,000 0,014 0,000 0,311 0,000 M17356 0,163 0,007 0,049 0,007 0,311 0,000 M17363 0,042 0,035 0,099 0,007 3,295 0,000 M17363 1,259 0,134 0,007 0,000 0,764 0,000 M2390 0,007 0,014 0,028 0,021 0,184 0,007 M2390 2,157 0,007 0,057 0,014 0,990 0,000 M2390 0,035 0,007 0,028 0,028 0,226 0,007 M12156 0,502 0,007 0,007 0,007 0,629 0,000 M12156 0,049 0,000 0,205 0,007 0,156 0,007 M15419 0,580 0,007 0,000 0,000 0,035 0,000 M15419 0,007 0,000 0,000 0,014 0,148 0,000 M15419 0,396 0,021 0,148 0,007 0,361 0,000 M17363 0,042 0,085 0,113 0,064 0,233 0,000 M17363 0,856 0,007 0,127 0,014 0,205 0,000 Tabela 3C1. Resultados adicionais obtidos após 50 h de fermentação conduzida sob condições permissivas (31,5% de pasta TS, 300 ppm de ureia,

100% de GA 33 - 31°C, 150 rpm de agitação) ou condições de alta temperatura (31,5% de pasta TS, 100% de GA, 37°C, 150 rpm de agitação) Condições Cepas Glicose Láctico Glicerol Glicerol Ácido Etanol Formiato YP acético Permissiva M2390 0,3 0,4 10,5 8,0 0,4 147,4 0,00 M11245 0,6 0,3 11,1 8,7 0,5 147,0 0,00 M16281 5,6 0,3 12,6 10,1 0,4 143,3 0,00 M16283 0,3 0,4 10,4 8,0 0,4 148,1 0,00 M16285 0,4 0,3 10,6 8,2 0,4 147,9 0,00 M16287 0,6 0,3 11,1 8,6 0,4 147,1 0,00 M16289 3,0 0,3 11,3 8,8 0,5 146,2 0,00 Alta Temp M2390 38,0 0,4 11,2 8,8 0,8 126,8 0,00 M11245 47,7 0,3 12,6 10,1 1,0 121,8 0,00 M16281 57,4 0,3 12,6 10,2 0,9 116,3 0,02 M16283 37,1 0,4 11,2 8,8 0,8 128,3 0,00 M16285 42,3 0,4 11,3 8,8 0,8 125,3 0,00 M16287 38,3 0,3 11,7 9,3 0,9 127,2 0,00 M16289 43,0 0,3 11,7 9,2 0,9 124,9 0,00 Tabela 3C2. Desvios padrão dos resultados apresentados na Tabela 3C1 Cepas Glicose Láctico Glicerol Ácido Etanol Formiato YP acético M2390 0,021 0,028 0,014 0,035 0,382 0,000 M11245 0,198 0,007 0,148 0,028 0,219 0,000 M16281 1,160 0,007 0,382 0,042 0,884 0,000 M16283 0,000 0,028 0,049 0,071 0,078 0,000 M16285 0,042 0,007 0,092 0,021 0,205 0,000 M16287 0,113 0,000 0,141 0,042 0,148 0,000 M16289 0,969 0,007 0,092 0,014 0,658 0,000 M2390 1,117 0,007 0,007 0,014 0,750 0,000 M11245 3,026 0,000 0,014 0,007 1,541 0,000 M16281 3,585 0,007 0,028 0,014 1,478 0,000 M16283 3,330 0,000 0,057 0,007 1,747 0,000 M16285 3,917 0,014 0,113 0,007 1,478 0,000 M16287 2,220 0,000 0,007 0,014 0,940 0,000 M16289 1,626 0,000 0,021 0,007 0,870 0,000 Tabela 3D1. Resultados adicionais obtidos após 50 h de fermentação conduzida sob condições permissivas (32,5% de pasta TS, 300 ppm de ureia, GA como indicado na tabela, 33 - 31°C, 150 rpm de agitação), condições lácticas (32,5% de pasta TS, 0 ppm de ureia, GA conforme indicado na tabela, 34°C, 0,38% p/v de ácido láctico adicionado às 18 h, 150 rpm de agitação) ou condições de alta temperatura (33% de pasta TS, 0 ppm de ureia, 65% de GA para cepas modificadas (100% = 0,6AGU/gTS), 37°C, 150 rpm de agitação) Condição GA Cepas Glicose Láctico Glicerol Ácido Etanol Formiato YP acético Permissiva 100% M2390 0,5 0,3 9,2 0,6 145,2 0,0 Láctica 100% M2390 6,8 4,2 9,0 0,7 141,8 0,0 Permissiva 65% M12156 0,4 0,3 4,9 0,1 148,9 0,3 Láctica 65% M12156 43,7 4,1 4,4 0,1 125,7 0,2 Permissive 65% M15419 0,2 0,3 5,8 0,2 148,3 0,0 Lactic 65% M15419 5,3 4,2 6,4 0,2 143,0 0,0 Permissiva 65% M17621 0,2 0,3 6,8 0,5 148,3 0,0 Láctica 65% M17621 22,9 4,2 6,8 0,3 135,9 0,0 Permissiva 65% M17623 0,8 0,3 5,5 0,2 150,2 0,2 Láctica 65% M17623 38,4 4,1 5,1 0,1 130,2 0,1 Permissiva 65% M17626 0,4 0,3 7,4 0,4 149,1 0,0 Láctica 65% M17626 24,4 4,2 6,5 0,4 136,7 0,0 Tabela 3D2. Desvios padrão dos resultados apresentados na tabela 3D1 Cepas Glicose Láctico Glicerol Ácido Etanol Formiato YP acético M2390 0,021 0,007 0,078 0,021 0,750 0,000 M2390 0,820 0,028 0,092 0,000 0,290 0,000 M12156 0,000 0,000 0,042 0,014 0,622 0,007 M12156 0,742 0,049 0,057 0,042 0,042 0,007 M15419 0,014 0,035 0,064 0,042 0,212 0,014 M15419 2,001 0,198 0,113 0,042 1,803 0,000 M17621 0,007 0,000 0,071 0,049 0,679 0,000 M17621 1,202 0,099 0,042 0,021 0,417 0,000 M17623 0,014 0,007 0,007 0,007 0,205 0,000 M17623 0,948 0,042 0,078 0,014 0,799 0,000 M17626 0,021 0,035 0,028 0,021 0,092 0,000 M17626 0,290 0,071 0,035 0,057 0,106 0,000

[00092] Uma fermentação secundária foi executada para comparar a colônia de irmãos de M16752, M16753, que teve um desempenho ligeiramente melhor e foi selecionada para estudos posteriores (dados não apresentados).

[00093] As fermentações adicionais foram realizadas para avaliar M16750 e M16753 sob sólidos mais elevados, alta temperatura ou condições de estresse bacteriano. Os resultados estão resumidos na Figura 6. Ambas as cepas parecem fornecer aumento de rendimento de ~ 1% em relação a ambas M12156 e M15419. Além disso, essas cepas mantêm a temperatura e a tolerância ao estresse bacteriano em comparação com M15419.

[00094] Duas cepas foram avaliadas para quantificar a trealose no final da fermentação. Os sobrenadantes da fermentação (de fermentações permissivas e bacterianas) foram executados no Dionex e demonstraram uma redução na trealose em relação às cepas de controle (Figura 7). Além disso, o fim das amostras de fermentação permissivas foi analisado para células vivas e mortas através de coloração azul de metileno e contagem de células em hemocitômetro. Conforme apresentado na Figura 8, as cepas M16750 e M16753 foram apresentadas ter contagens de células similares como M15419.

[00095] Embora a invenção tenha sido descrita em conexão com modalidades específicas da mesma, será entendido que o escopo das reivindicações não deve ser limitado pelas modalidades preferidas estabelecidas nos exemplos, mas deve ser dada a interpretação mais ampla consistente com a descrição como um todo.

REFERÊNCIAS

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[00097] Bell W, Sun W, Hohmann S, Wera S, Reinders A, De Virgilio C, Wiemken A, Thevelein JM. Composition and functional analysis of the Saccharomyces cerevisiae trealose synthase complex. J Biol Chem. 1998 Dec 11; 273(50):33311-9.

[00098] Cao TS, Chi Z, Liu GL, Chi ZM. Expression of TPS1 gene from Saccharomycopsis fibuligera A11 in Saccharomyces sp. W0 enhances trealose accumulation, ethanol tolerance, and ethanol production. Mol Biotechnol. 2014 Jan; 56(1):72-8.

[00099] Ge XY, Xu Y, Chen X. Improve carbon metabolic flux in Saccharomyces cerevisiae at high temperature by overexpressed TSL1 gene. J Ind Microbiol Biotechnol. 2013 Apr; 40(3-4):345-52.

[000100] Guo ZP, Zhang L, Ding ZY, Shi GY. Minimization of glycerol synthesis in industrial ethanol yeast without influencing its fermentation performance. Metab Eng. 2011 Jan; 13(1):49-59.

[000101] Thevelein JM, Hohmann S. Trealose synthase: guard to the gate of glycolysis in yeast? Trends Biochem Sci. 1995 Jan; 20(1):3-10.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Célula hospedeira de levedura recombinante, CARACTERIZADA pelo fato de ter: uma primeira modificação genética para expressar uma trealase heteróloga; e uma segunda modificação genética para aumentar a produção de trealose.

2. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a trealase heteróloga é uma trealase associada à célula.

3. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a trealase heteróloga é uma trealase secretada.

4. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADA pelo fato de que a trealase heteróloga: (a) tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 28, 30, 32, 34, 36 ou 38; (b) é uma variante da sequência de aminoácidos de (a) exibindo atividade de trealase; ou (c) é um fragmento da sequência de aminoácidos de (a) ou (b) exibindo atividade de trealase.

5. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADA pelo fato de que a trealase heteróloga é de Neurospora sp.

6. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADA pelo fato de que a trealase heteróloga é de Neurospora crassa.

7. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADA pelo fato de ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, sendo uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 exibindo atividade de trealase ou sendo um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 ou a variante e exibindo atividade de trealase.

8. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADA pelo fato de que a trealase heteróloga é de Achlya sp.

9. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADA pelo fato de que a trealase heteróloga é de Achlya hypogyna.

10. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADA pelo fato de ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36, sendo uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 exibindo atividade de trealase ou sendo um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 ou a variante e exibindo atividade de trealase.

11. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADA pelo fato de que a trealase heteróloga é de Ashbya sp.

12. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADA pelo fato de que a trealase heteróloga é de Ashbya gossypii.

13. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADA pelo fato de ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, sendo uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 exibindo atividade de trealase ou sendo um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 ou a variante e exibindo atividade de trealase.

14. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADA pelo fato de que a trealase heteróloga é de Aspergillus sp.

15. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADA pelo fato de que a trealase heteróloga é de Aspergillus clavatus.

16. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADA pelo fato de ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, sendo uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 exibindo atividade de trealase ou sendo um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 ou a variante e exibindo atividade de trealase.

17. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADA pelo fato de que a trealase heteróloga é de Aspergillus flavus.

18. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADA pelo fato de ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, sendo uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 exibindo atividade de trealase ou sendo um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 ou a variante e exibindo atividade de trealase.

19. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADA pelo fato de que a trealase heteróloga é de Aspergillus fumigatus.

20. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADA pelo fato de ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, sendo uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 exibindo atividade de trealase ou sendo um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou a variante e exibindo atividade de trealase.

21. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADA pelo fato de que a trealase heteróloga é de Aspergillus lentulus.

22. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADA pelo fato de ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, sendo uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 exibindo atividade de trealase ou sendo um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 ou a variante e exibindo atividade de trealase.

23. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADA pelo fato de que a trealase heteróloga é de Aspergillus ochraceoroseus.

24. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADA pelo fato de ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, sendo uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 exibindo atividade de trealase ou sendo um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 ou a variante e exibindo atividade de trealase.

25. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADA pelo fato de que a trealase heteróloga é de Escovopsis sp.

26. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADA pelo fato de que a trealase heteróloga é de Escovopsis weberi.

27. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 26, CARACTERIZADA pelo fato de ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, sendo uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 exibindo atividade de trealase ou sendo um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 ou a variante e exibindo atividade de trealase.

28. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADA pelo fato de que a trealase heteróloga é de Fusarium sp.

29. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADA pelo fato de que a trealase heteróloga é de Fusarium oxysporum.

30. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 29, CARACTERIZADA pelo fato de ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, sendo uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 exibindo atividade de trealase ou sendo um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 ou a variante e exibindo atividade de trealase.

31. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADA pelo fato de que a trealase heteróloga é de Kluyveromyces sp.

32. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 31, CARACTERIZADA pelo fato de que a trealase heteróloga é de Kluyveromyces marxianus.

33. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADA pelo fato de ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, sendo uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 exibindo atividade de trealase ou sendo um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 ou a variante e exibindo atividade de trealase.

34. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADA pelo fato de que a trealase heteróloga é de Komagataella sp.

35. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 34, CARACTERIZADA pelo fato de que a trealase heteróloga é de Komagataella phaffii.

36. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 35, CARACTERIZADA pelo fato de ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, sendo uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 exibindo atividade de trealase ou sendo um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 ou a variante e exibindo atividade de trealase.

37. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADA pelo fato de que a trealase heteróloga é de Metarhizium sp.

38. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 37, CARACTERIZADA pelo fato de que a trealase heteróloga é de Metarhizium anisopliae.

39. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 38, CARACTERIZADA pelo fato de ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, sendo uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 exibindo atividade de trealase ou sendo um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 ou a variante e exibindo atividade de trealase.

40. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADA pelo fato de que a trealase heteróloga é de Microsporum sp.

41. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADA pelo fato de que a trealase heteróloga é de Microsporum gypseum.

42. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 41, CARACTERIZADA pelo fato de ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, sendo uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 exibindo atividade de trealase ou sendo um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 ou a variante e exibindo atividade de trealase.

43. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADA pelo fato de que a trealase heteróloga é de Neosartorya sp.

44. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 43, CARACTERIZADA pelo fato de que a trealase heteróloga é de Neosartorya udagawae.

45. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 44, CARACTERIZADA pelo fato de ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, sendo uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 exibindo atividade de trealase ou sendo um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 ou a variante e exibindo atividade de trealase.

46. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADA pelo fato de que a trealase heteróloga é de Ogataea sp.

47. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 46, CARACTERIZADA pelo fato de que a trealase heteróloga é de Ogataea parapolymorpha.

48. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 47, CARACTERIZADA pelo fato de ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, sendo uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 exibindo atividade de trealase ou sendo um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 ou a variante e exibindo atividade de trealase.

49. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADA pelo fato de que a trealase heteróloga é de Rhizoctonia sp.

50. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 49, CARACTERIZADA pelo fato de que a trealase heteróloga é de Rhizoctonia solani.

51. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 50, CARACTERIZADA pelo fato de ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, sendo uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 exibindo atividade de trealase ou sendo um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 ou a variante e exibindo atividade de trealase.

52. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADA pelo fato de que a trealase heteróloga é de Schizopora sp.

53. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 52, CARACTERIZADA pelo fato de que a trealase heteróloga é de Schizopora paradoxa.

54. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 53, CARACTERIZADA pelo fato de ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38, sendo uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38 exibindo atividade de trealase ou sendo um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38 ou a variante e exibindo atividade de trealase.

55. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADA pelo fato de que a trealase heteróloga é de Thielavia sp.

56. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 55, CARACTERIZADA pelo fato de que a trealase heteróloga é de Thielavia terrestris.

57. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 56, CARACTERIZADA pelo fato de ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, sendo uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 exibindo atividade de trealase ou sendo um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 ou a variante e exibindo atividade de trealase.

58. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 57, CARACTERIZADA pelo fato de que a segunda modificação genética permite a expressão de uma segunda enzima heteróloga envolvida na produção de trealose e/ou um segundo polipeptídeo regulador heterólogo envolvido na regulação da produção de trealose.

59. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 58, CARACTERIZADA pelo fato de superexpressar a segunda enzima heteróloga e/ou o segundo polipeptídeo regulador.

60. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 58 ou 59, CARACTERIZADA pelo fato de que a segunda modificação genética permite a expressão de, pelo menos, um de TPS1, TPS2, TPS3 ou TSL1.

61. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 60, CARACTERIZADA pelo fato de que a segunda modificação genética permite a expressão de TPS1.

62. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 60, CARACTERIZADA pelo fato de que a segunda modificação genética permite a expressão de TPS2.

63. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 60, CARACTERIZADA pelo fato de que a segunda modificação genética permite a expressão de TPS3.

64. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 60, CARACTERIZADA pelo fato de que a segunda modificação genética permite a expressão de TSL1.

65. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 64, CARACTERIZADA pelo fato de exibir robustez aumentada na presença de um estressor, quando comparada a uma célula hospedeira de levedura recombinante correspondente tendo a primeira modificação genética e sem a segunda modificação genética.

66. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 65, CARACTERIZADA pelo fato de que ainda compreende pelo menos um de: uma terceira modificação genética permitindo ou aumentando a expressão de, pelo menos, uma enzima sacarolítica heteróloga; uma quarta modificação genética permitindo ou aumentando a produção de formiato; uma quinta modificação genética permitindo ou aumentando a utilização de acetil-CoA; uma sexta modificação genética limitando a produção de glicerol; e/ou uma sétima modificação genética facilitando o transporte de glicerol na célula hospedeira de levedura recombinante.

67. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 66, CARACTERIZADA pelo fato de ser do gênero Saccharomyces sp.

68. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 67, CARACTERIZADA pelo fato de ser da espécie Saccharomyces cerevisiae.

69. Processo para a conversão de uma biomassa em um produto de fermentação, o processo sendo CARACTERIZADO pelo fato de que compreende colocar em contato a biomassa com a célula hospedeira de levedura recombinante como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 68 sob condições para permitir a conversão de, pelo menos, uma parte da biomassa no produto de fermentação.

70. Processo, de acordo com a reivindicação 69, CARACTERIZADO pelo fato de que a biomassa compreende milho.

71. Processo, de acordo com a reivindicação 70, CARACTERIZADO pelo fato de que o milho é fornecido como uma pasta.

72. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 69 a 71, CARACTERIZADO pelo fato de que o produto da fermentação é o etanol.

73. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 69 a 71, CARACTERIZADO pelo fato de ser conduzido, pelo menos em parte, na presença de um estressor.