KR20030081457A - 약독된 생백신 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 플라비바이러스 변종을 포함하는 약독된 플라비바이러스 생백신으로서, 이러한 플라비바이러스 변종이 적어도 4개를 초과하는 연속 아미노산이 결실된 캡시드 단백질을 포함하며, 소수성 카르복시-말단 영역은 이러한 결실에 의해 영향을 받지 않음을 특징으로 하는 약독된 플라비바이러스 생백신에 관한 것이다.

Description

약독된 생백신 {ATTENUATED LIVE VACCINE}
플라비비리대 (flaviviridae)과는 플라비바이러스속, 페스티바이러스속 및 헤파시바이러스속의 3가지 속을 포함한다.
플라비바이러스속은 주로 모기 또는 진드기에 의해 전달되는 바이러스를 포함하며, 이들 중 다수는 인간 및 동물의 중요한 병원체이다. 특히, 황열 (YF) 바이러스, 일본 뇌염 (JE) 바이러스, 뎅기(Den) 바이러스의 4가지 혈청형, 진드기 매개 뇌염 (TBE) 바이러스 및 인간 및 다수의 조류종에서 병원체로서 북아메리카에서 최근 출현한 웨스트 나일(WN) 바이러스가 중요하다.
페스티바이러스속은 경제적 중요도가 큰 동물 병원체, 즉, 전형적 돼지열 (CPF) 바이러스, 우형 바이러스성 설사 (BVD) 바이러스 및 국경병 바이러스를 함유한다.
헤파시바이러스속은 C형 간염 바이러스 (HCV) 및 관련 바이러스, 예를 들어 G형 간염 바이러스 (HGV)의 다양한 서브타입을 포함한다.
이러한 3가지 속은 플라비비리대과로 합쳐지는데, 이는 이러한 과의 모든 대표적 바이러스가 거의 동일한 게놈 구조를 지니며, 다수의 구조적 및 기능적 특성이 일치하기 때문이다. 모든 플라비바이러스는 게놈으로서 mRNA 극성이 있는 단일 가닥 RNA 분자를 포함하는, 비교적 작은 피막성 바이러스이다. 게놈은 모든 단백질을 폴리프로테인 형태로 코딩하는 긴 오픈 리딩 프레임을 지닌다. 개개의 성숙한 바이러스 단백질은 바이러스 및 세포 프로테아제의 활성에 의해 형성된다. 게놈내의 개개의 바이러스 단백질의 배치는 모든 플라비바이러스가 동일한데, 5' 말단에서 캡시드 단백질로 출발하여, 표면 단백질 및 일련의 비구조 단백질이 위치하고, 마지막으로 바이러스 폴리머라제가 위치한다. 특별한 특징으로서, 페스티바이러스는 캡시드 단백질 전방에 오토프로테아제 (autoprotease)를 추가로 함유한다. 플라비바이러스의 누클레오캡시드는 단지 하나의 바이러스 단백질, 즉, 캡시드 단백질에 의해 형성되며, 바이러스 게놈을 둘러싼다. 캡시드는 정이십면체 대칭을 지니는 것으로 추정된다.
캡시드 단백질의 정확한 3차원 구조는 플라비바이러스의 어느 것에 대해서도 아직 알려진 바가 없다. 그러나, 공지된 아미노산 서열은 다수의 상관관계를 지니므로, 캡시드 단백질이 다수의 구조적 유사성을 지닐 것으로 여겨진다. 이러한 경우, 동일한 속의 대표적 바이러스 간의 유사성은 상이한 속의 대표적 바이러스 사이에서 보다 더욱 클 것이다. 모든 경우, 캡시드 단백질은 약 100개 내지 190개의 아미노산 길이를 지닌 보다 작은 단백질이다. 이것은 염기성 아미노산, 즉, 리신 및 아르기닌의 부분이 현저히 높다. 염기성 아미노산은 바이러스 RNA와의 상호작용을 위해 중요한 것으로 추정된다 (Khromykh 및 Westaway, 1996). 그러나, 모든 플라비바이러스 캡시드 단백질은 특징적인 소수성 섹션을 또한 지닌다 (도 1). 이러한 소수성 섹션은 항상 카르복시-말단의 약 20개 아미노산에 의해 형성된다. 이러한 섹션은 게놈 서열에서 다음에 위치하는 표면 구조 단백질에 대한 내부 신호 서열로서 기능한다. 단백질 합성 동안 소포체의 막으로 삽입되는 이러한 신호 서열에 의해, 먼저 캡시드 단백질이 막에 고착된다. 그 후, 고착은 단백가수분해적으로 분해된다. 또한, 내부 소수성 섹션이 존재한다. 플라비바이러스속의 대표 바이러스에 있어서, 내부 소수성 도메인의 기능적 중요성이 기술되었다 (Markoff et al. 1997). 저자들은 일련의 플라비바이러스에 대한 이러한 도메인의 경계를 다음과 같이 나타내었다: 뎅기 1: 46-47, 뎅기 2: 46-66, 뎅기 3: 46-67, 뎅기 4: 45-65, 일본 뇌염: 46-62, 웨스트 나일: 46-62, 머레이 밸리 뇌염: 46-62, 세인트 루이스 뇌염: 45-61, 황열: 43-58, 랑가트: 42-54, 포와산: 40-52, TBE: 42-54. 또한, C형 간염 바이러스의 경우, 아미노산 119번 내지 145번, 특히 125번 내지 144번의 기능적으로 중요한 내부 소수성 도메인이 확인되었다 (Hope 및 McLauchlan, 2000). 또한, 페스티바이러스는 주로 소수성 특성을 지닌 짧은 내부 섹션을 지닌다.
일부 플라비바이러스에 대한 백신이 성공적으로 사용되어 왔다. 따라서, YF 바이러스, JE 바이러스 및 CPF 바이러스에 대한 생백신이 존재하며, 비활성화된 백신이 JE 및 TBE에 대해 사용된다. 인간 의학 및 수의학에서 플라비바이러스가 매우 중요하다는 점에서, 신규하고 개선된 백신의 개발이 절실히 요구된다.
약독화가 게놈의 다양한 영역의 돌연변이를 기초로 하는 일련의 약독된 플라비바이러스가 알려져 있다. 약독화 돌연변이는 천연 스트레인에서 관찰되거나, 실험실에서 바이러스의 연속 계대에 의해 수득되거나, 중화 항체의 존재하에서 변종을 선택하거나 재조합 클로닝 기술의 도움으로 돌연변이를 표적화 도입시킴으로써 제조되었다. 다수의 플라비바이러스의 감염성 cDNA 클론이 존재하며, 당업자는 이러한 클론을 제조하는 방법을 인지한다. 종래 기술에 따른 이러한 감염성 cDNA 클론의 도움으로, 돌연변이가 플라비바이러스의 게놈내로 특이적으로 도입될 수 있다.
플라비바이러스를 약독화시키는 공지된 돌연변이는 게놈의 하기 섹션에서 발견된다:
피막 단백질: 약독화 돌연변이의 관찰의 대부분은 피막 단백질 E (플라비바이러스속)에 관한 것이다 (참조: McMinn, 1977; Mandl et al., 2000). 마찬가지로, 단백질 E(rns) (페스티바이러스속)에서의 약독화 돌연변이가 기술되었다 (Meyers et al., 1999).
비구조 단백질: 쿤진 (Kunjin) 바이러스의 단백질 NS1에서의 점 돌연변이는 복제를 지연시켜서, 약독화시켰다 (Hall et al., 1999). 약독화 돌연변이는 단백질 NS3 (Butrapet et al., 2000) 및 NS5 (Xie et al., 1998)에서 또한 기술되었다.
비-엔코딩 (non-encoding) 게놈 섹션: 3'-말단 비-엔코딩 영역에서의 결실에 의한 TBE 바이러스의 약독화가 기술되었다 (Mandl et al., 1998). 뎅기 바이러스의 경우, 5' 및 3' 비-엔코딩 영역 둘 모두에서 결실을 지닌 실험용 백신이 제조되었다 (Lai et al., 1998). 이들 바이러스의 약독화의 분자적 기초는 이러한 돌연변이에 의해 바이러스 복제에 미치는 역효과인 것으로 추정된다.
본 발명은 약독된 플라비바이러스 생백신에 관한 것이다.
도 1a 내지 1c는 플라비비리대과의 3가지 속 각각의 3개의 대표적 바이러스의 캡시드 단백질의 친수성 프로파일을 도시한다. 음값은 우세하게 소수성 특성을 지닌 영역을 나타낸다. 카르복시-말단 소수성 영역은 게놈에서 다음에 위치하는 피막 단백질에 대한 신호 서열이다. 각각의 단백질에 대해, 친수성이 예로서 한번은 윈도우 사이즈가 9개 아미노산 잔기인 카이트 및 둘리틀의 알고리듬 (1982)에 따라 (상부) 계산되고 도시되며, 한번은 윈도우 사이즈가 7개 아미노산 잔기인 호프 및 우즈의 알고리듬 (1981)에 따라 (하부) 계산되고 도시된다.
도 2는 플라비비리대과의 3가지 속 각각의 3개의 대표적 바이러스의 캡시드 단백질의 서열 정렬을 도시한다. 우세하게 소수성 특성을 지닌 서열 섹션 (윈도우 사이즈가 5인 카이트 및 둘리틀의 알고리듬에 따라 결정됨)이 밑줄그어져 있다. 이 경우, 각각의 가장 카르복시-말단 배열된 섹션은 후속 피막 단백질에 대한 신호 서열을 나타낸다. 이러한 섹션에 있어서, 임의의 결실은 없어야 한다. 나머지 (내부) 소수성 섹션은 약독화 결실을 위한 바람직한 영역을 나타낸다.
본 발명의 목적은 플라비바이러스를 약독화시키는 추가의 가능한 방법을 제공하여, 플라비바이러스 야기된 질병의 예방에 1차적으로 적합한 생백신을 생성시키는 데에 있다.
본 발명에 따르면, 이러한 목적은 플라비바이러스 변종을 포함하는 약독된 플라비바이러스 생백신으로서, 이러한 플라비바이러스 변종이 캡시드 단백질에서 적어도 4개를 초과하는 연속 아미노산의 결실을 지니며, 카르복시-말단 소수성 영역은 이러한 결실에 의해 영향을 받지 않음을 특징으로 하는 생백신에 의해 달성된다. 상기 언급한 바와 같이, 약독화가 돌연변이에 기초하는 일련의 약독된 플라비바이러스가 이미 공지되었다고 하더라도, 현재까지 어느 돌연변이의 경우에서도, 특히 캡시드 단백질에서의 결실이 플라비바이러스의 약독화의 기초로서 기술되지 않았다. 또한, 캡시드 단백질에 본 발명에 따른 돌연변이를 함유하는 플라비바이러스가 플라비바이러스의 신뢰성있는 약독화를 초래하여, 플라비바이러스 생백신으로서 사용될 수 있다는 것은 아주 의외였다. 이는 캡시드 단백질에 제공된 본 발명의 돌연변이에도 불구하고, 본 발명에 따른 바이러스를 생백신으로서 투여한 후 약독된 바이러스의 증식이 백신접종된 피검체에서 일어날 수 있기 때문이다. 이것은 비활성화된 백신에 비해 일련의 잇점을 가져다준다.
캡시드 단백질에서의 결실은 플라비바이러스에 대한 전혀 새로운 약독화 원리를 구성한다. 현재까지, 캡시드 단백질은 당 분야에서 관련 대상으로서 간주된 적이 없었다. 따라서, 기술된 결실 변종이 독성 표현형으로 복귀하는 것에 내성이어서 인간에 대한 광범위한 적용에 매우 적합한 약독된 플라비바이러스 생백신을 실제로 성공적으로 생성시킨다는 본 발명의 발견은 더욱 의외였다.
통상적인 비활성화된 백신을 제조하기 위해서는, 대량의 감염성이고 독성인 바이러스를 생성시킬 필요가 있다. 또한, 재조합적으로 제조된 비활성화된 백신의 경우, 대량의 항원이 생성되고 정제되어야 한다. 생백신의 경우, 생성하고자 하는 양은 실질적으로 보다 적은데, 이는 백신 자체가 백신접종된 피검체내에서 증식하기 때문이며, 이로써 일반적으로 생백신의 생산 비용은 비활성화된 백신의 생산 비용 보다 훨씬 적다. 더욱이, 독성이 아닌 비병원성 바이러스가 생산되므로, 생산과정은 건강 위험을 수반하지 않는다. 통상적인 비활성화된 플라비바이러스 백신은 포르말린 처리에 의해 감염성 입자를 비활성화시킴으로써 제조되어, 항원 구조를 어느 정도 변화시킨다. 백신접종된 피검체내에서는, 항원 구조가 천연 형태와 정확히 일치하지 않는 구조 단백질에 대한 체액성 면역 반응이 주로 유도되지만, 장기 지속성 면역의 증강 및 세포독성 T 세포의 형성에 매우 중요한 비구조 단백질에 대한 면역 반응은 유도되지 않는다.
대조적으로, 본 발명에 따른 백신의 경우, 완전히 천연 형태로 존재하고 생체내에서 생성되는 표면 및 비구조 단백질에 대한 체액성 및 세포성 면역 반응이 획득될 수 있으므로, 현재의 기술 수준에 따르면, 비활성화된 백신을 사용하는 경우 보다 훨씬 장기 지속성인 보호 면역 반응이 획득될 수 있다.
특히 본 발명의 바람직한 구체예에 따른 약독된 플라비바이러스 생백신은 유전공학적 방법에 의해 제조된 통상적인 생백신 및 실험용 생백신에 비해 추가의 잇점을 지닌다.
현재 사용되는 플라비바이러스 생백신은 실험실에서 수 회 계대되어, 다수의 돌연변이를 일으켰는데, 이러한 바이러스의 생물학에 대한 이러한 돌연변이의 의미 및 이러한 바이러스의 약독화에 대한 각각의 돌연변이의 기여가 아직 완전히 이해되어 있지 않을 뿐만 아니라, 개개의 약독된 돌연변이 사이의 상호작용은 아직 완전히 알려져 있지 않다 (Nitayaphan et al., 1990 (JE); Post et al., 1992 (YF); Bjorklund et al., 1998 (CPF)). 또한, 몇몇 돌연변이는 면역 반응에 특히 중요한 항원, 예를 들어 표면 단백질 E에 위치한다. 따라서, 특정한 항원 결정기는 야생형 바이러스에 비해 변화된 형태로 존재한다. 이들 바이러스의 약독화의 유전학적 기초의 복잡성은 약독화의 기초를 이루는 원리가 그 밖의 플라비바이러스에 직접 적용될 수 없게 한다.
대조적으로, 본 발명에 따른 백신의 경우, 단지 한정적이고 일반적으로 적용가능한 약독화 돌연변이가 캡시드 단백질에 도입되므로, 면역 반응에 특히 중요한 단백질 (피막 단백질 또는 특정한 비구조 단백질, 예를 들어 플라비바이러스속의 경우 NS1)을 변화시킬 필요가 없다.
따라서, 본 발명에 따른 생백신의 바람직한 구체예는 특히 피막 단백질 뿐만 아니라 면역 반응에 관여하는 그 밖의 단백질에도 임의의 추가의 돌연변이를 포함하지 않는다.
또한 상기 이미 언급한 바와 같이, 약독화가 점 돌연변이를 기초로 하는 일련의 유전공학처리된 약독된 플라비바이러스가 기술되었다. 이러한 점 돌연변이를유전학적으로 복귀시키는 것은 비교적 쉽다. 또한, 점 돌연변이에 의해 약독된 바이러스를 제 2의 점 돌연변이에 의해 독성 표현형으로 복귀시키는 것이 기술되었다 (Mandl et al., 2000). 대조적으로, 본 발명에 따른 생백신의 경우, 약독화는 야생형으로의 복귀가 불가능한 결실에 의해 달성된다.
또 다른 알려진 경우에 있어서, 약독화는 면역 반응에 중요한 피막 단백질 또는 복제 및 번역에 중요한 게놈의 섹션의 변화를 기초로 한다. 피막 단백질의 항원 구조의 변화도 복제 또는 번역에 대한 실질적인 역효과도 가능한 천연적이고 효과적인 면역 반응을 유도시키고자 하는 경우에는 바람직하지 못하다. 이러한 단점은 임의의 피막 단백질, 비구조 단백질 또는 조절성 비-엔코딩 섹션이 아닌 단지 내부 구조적 성분이 변화되는 본 발명에 의해 해소된다.
또 다른 구성에 있어서, 플라비바이러스 백신은 다양한 바이러스를 조합함으로써 제조되었다 (키메라 바이러스) (Guirakhoo et al., 2000). 키메라 바이러스는 병원성 바이러스들의 유전자가 서로 비-천연 방식으로 새로 조합된 생물체이므로, 백신접종에 의한 이러한 바이러스의 방출은 이러한 키메라 바이러스가 특성을 예측할 수 없는 신규한 바이러스가 되게 할 위험을 지닌다. 대조적으로, 본 발명의 백신은 다양한 바이러스 게놈의 조합물로 구성되지 않으므로, 백신접종에 의한 방출이 현재까지 천연적으로 없었던 바이러스종을 형성시키지 않는다.
예를 들어, 재조합 기술의 도움으로, 당업자가 과도한 실험없이 당 분야에 공지된 방법을 사용하여 본 발명의 결실을 플라비바이러스의 캡시드 단백질내로 도입시키는 것이 가능하다. 각각의 캡시드 단백질을 코딩하는 유전자 섹션은 게놈서열이 현재까지 명백히 밝혀진 모든 플라비바이러스에 대해 알려져 있고, 신규한 플라비바이러스 서열에 대해서는, 서열 비교에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 물론, 이 경우에 결실은 카르복시-말단 소수성 영역이 결실에 의해 영향을 받지 않도록 리딩 프레임의 임의의 시프팅을 일으키지 않아야 한다. 이러한 카르복시-말단 소수성 영역이 대부분 유지되어, 결실에 의해 영향을 받지 않는 것이 필수적이다. 언급된 기술을 사용하여, 증식시에 캡시드 단백질을 제외한 모든 바이러스 단백질이 천연 형태로 형성되는 감염성 변종 바이러스를 제조하는 것이 가능하다. 그 후, 이들 바이러스의 복제 및 번역은 제한되지 않거나, 본질적으로 제한되지 않을 것이다. 세포 배양액에서 증식시킴으로써, 백신으로서 사용될 수 있는 제제가 이들 바이러스로부터 생성될 수 있다. 불변 야생형 바이러스와 대조적으로, 본 발명에 따른 바이러스는, 적합한 숙주 생물체에 접종된 후, 약독된 표현형을 나타내는데, 즉, 이들 바이러스는 질병을 유발하지 않는다. 그렇지만, 이들 바이러스는 특이적 면역 반응의 형성을 유도한다. 본 발명의 플라비바이러스 생백신으로 면역화된 숙주 생물체는 독성 야생형에 의한 후속 감염으로부터 보호되는데, 즉, 보호되지 않은 생물체와 대조적으로 야생형 바이러스에 의해 유발되는 질병이 나타나지 않는다.
백신의 특성이 백신으로서 적합한 변종의 제조시에 개선될 수 있게 해주는 다수의 특징에 유의하는 경우, 캡시드 단백질의 영역에서의 본 발명의 결실은 생백신으로서 적합한 변종을 제조하는 데에 특히 적합하다. 여하튼, 본 발명에 따라 제공되는 결실은 적합한 약독된 면역원성 바이러스가 제조되도록 4개가 넘는 아미노산이어야 하는데, 이는 4개 이하의 아미노산의 결실을 지닌 바이러스는 야생형 바이러스와 유사한 독성 표현형을 나타내기 때문이다. 더욱이, 독성 바이러스 타입으로의 복귀가 제외될 수 있는 것은 이러한 순서의 결실뿐이다.
또한, 본 발명에 따른 결실은 캡시드 단백질의 카르복시-말단 소수성 영역과 관련되지 않아야 한다. 이러한 서열은 게놈에서 다음에 위치하는 피막 단백질의 올바른 형성에 필요하고, 단백가수분해에 의해 성숙한 캡시드 단백질로부터 제거된다는 것이 알려져 있다. 이러한 신호 서열의 길이는 개개의 플라비바이러스에 따라 달라지지만, 이는 친수성 프로파일을 확립함으로써 쉽게 결정될 수 있다 (도 1 참조). 따라서, 본 발명에 따른 결실은 이러한 카르복시-말단 영역을 포함하지 않아야 한다.
카르복시-말단 소수성 영역은 적어도 이 영역에서 -1 이하의 도 1에 따른 친수성 스코어를 지닌 모든 아미노산과 관련된다. 특히 바람직하게는, 도 1에 따른, 0 미만의 친수성을 지닌 C-말단 영역이 불변 상태로 남아있는다.
본 발명에 따른 바람직한 결실은 내부 소수성 도메인의 영역과 관련된다. 도 1로부터, 모든 플라비바이러스의 캡시드 서열 뿐만 아니라 카르복시 말단에 있는 상기 언급된 소수성 신호 서열이 우세하게 친수성인 아미노산 사슬 가운데에 우세하게 소수성 특성을 지닌 섹션을 추가로 함유한다는 것을 알 수 있다. 이러한 내부 도메인을 부분적으로 또는 완전히 제거하는 결실은 특히 적합한 약독된 플라비바이러스 생백신을 생성시킨다. "내부 소수성 도메인"으로서 적어도 도 1에서 음값의 소수성 스코어를 지닌 모든 영역이 간주될 수 있다.
도 2에 있어서, 본 발명에 따른 백신에서 적어도 부분적으로 결실될 수 있는 특히 바람직한 소수성 영역이 다수의 플라비바이러스에 대해 특징화되어 있다. 이러한 영역은 각각의 아미노산 서열의 소수성 프로파일을 계산함으로써 결정될 수 있다. 도 2에서 밑줄그어진 영역은 윈도우 사이즈 (window size)가 5인 카이트 (Kyte) 및 둘리틀 (Doolittle)의 알고리듬 (1992)을 사용하여 계산되었다. 대안적으로, 소수성 영역은 5개 내지 13개 아미노산 잔기의 윈도우 사이즈를 사용하여 계산되거나, 3 내지 11의 윈도우 사이즈가 선택될 수 있는 호프 (Hopp) 및 우즈 (Woods)의 알고리듬 (1981)과 같은 그 밖의 알고리듬에 의해 계산될 수 있다.
도 1에 따른 친수성 블롯은 윈도우 사이즈가 9개 아미노산 잔기인 카이트 및 둘리틀의 알고리듬 (1982) 또는 윈도우 사이즈가 7개 아미노산 잔기인 호프 및 우즈의 알고리듬 (1981)에 따라 각각 계산되었다. 바람직한 소수성 영역은 뎅기 1: 46-67, 뎅기 2: 46-66, 뎅기 3: 46-67, 뎅기 4: 45-65, 일본 뇌염: 46-62, 웨스트 나일: 46-62, 머레이 밸리 뇌염: 46-62, 세인트 루이스 뇌염: 45-61, 황열: 43-58, 랑가트: 42-54, 포와산: 40-52, TBE: 42-54 및 HCV: 119-145, 특히 125-144로부터 선택된다.
약독된 백신의 특정한 구체예는 생성된 변종 게놈이 세포 배양액에서 계대될 수 있는 바이러스를 생성하지 못할 정도로 내부 소수성 도메인의 큰 부분이 제거된 캡시드 결실이다. 이러한 게놈은 천연 형태의 캡시드 단백질을 제외한 모든 단백질을 복제하고 효과적으로 번역할 수 있으며, 가능하게는 비감염성 서브바이러스 입자를 또한 형성할 수 있다. 캡시드 단백질의 소수성을 증가시키는 추가의 점 돌연변이 또는 삽입서열을 도입시킴으로써, 이러한 결실 변종은 계대될 수 있고 생백신으로서 적합한 바이러스 변종으로 될 수 있다. 이러한 삽입서열은 최초로 결실된 서열과 상이한 서열이다. 세포 배양 시스템에서 더 이상 복제할 수 없는 결실 변종이 세포 배양액 보다 더욱 민감한 증식 시스템 (예를 들어, 플라비바이러스속의 바이러스용 실험 마우스, 페스티바이러스용 천연 숙주, C형 간염 바이러스의 경우, 돼지, 양, 소 또는 침팬지)내로 도입되고, 적합한 돌연변이가 이러한 시스템에서 계대에 의해 생성되고 선택된다는 점에서, 적합한 추가의 돌연변이가 예를 들어 생성되고 확인될 수 있다. 이 경우, 특히 바람직한 더욱 민감한 시스템은 동물, 특히, 마우스, 래트, 집토끼, 산토끼, 돼지, 양, 소 또는 영장류, 예를 들어 침팬지이다. 생성된 바이러스 변종은 특히 안전한 백신을 구성하는데, 이는 추가의 돌연변이의 임의의 복귀가 증식할 수 없거나 매우 제한된 정도로만 증식할 수 있는 바이러스를 생성시키기 때문이다. 결실의 복귀는 선험적으로 불가능하다.
바람직한 약독된 플라비바이러스 생백신은 캡시드 단백질에서 5개 내지 70개, 바람직하게는 6개 내지 25개, 특히 7개 내지 20개의 연속 아미노산의 결실을 지닌 플라비바이러스 변종을 포함한다. 이러한 각각의 바람직한 순서의 결실은 이들의 약독화 계대 거동에서 정량적으로 변화된 특성을 특징으로 한다. 결실이 20개가 넘는 연속 아미노산인 경우, 숙주 세포에서 생백신의 제조 동안 계대 능력의 손실이 일어날 수 있다. 이러한 손실된 계대 능력 특성은 숙주 세포의 민감성에 좌우되지만, 이는 특정한 추가 돌연변이에 의해 각각의 숙주 세포에 대해 회복될 수 있다. 회복은 캡시드 단백질의 소수성을 증가시키는 하나 이상의 돌연변이에의해 이루어질 수 있다. 이러한 추가의 돌연변이는 바람직하게는 캡시드 단백질의 소수성을 증가시키는 점 돌연변이로부터 선택되거나, 우세하게 소수성 특성을 지닌 아미노산 섹션을 캡시드 단백질 유전자에 도입시킴으로써 일어난다. 캡시드 단백질의 소수성 영역의 중복이 특히 유리한 것으로 입증되었다. 특히 바람직한 점 돌연변이는 하전 또는 친수성 아미노산 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 트립토판, 글루타민, 아스파라진, 티로신, 세린 등)을 각각 덜 극성인 아미노산 또는 비극성 아미노산 (예를 들어, 이소루신, 루신, 페닐알라닌, 메티오닌, 알라닌, 발린 등)으로 교환하는 것을 포함한다. 이러한 추가의 돌연변이는 특히 바람직하게는 더욱 민감한 시스템내로 도입시킴으로써 자동적으로 생성된다. 또한, 이러한 추가의 돌연변이의 선택은 계대 능력 자체를 회복시킴으로써 자동적으로 일어난다.
종종, 아미노산의 극성의 점진적 변화만을 생성시키는 단일 돌연변이가 계대 능력을 회복시키는 데에 충분하다 (예를 들어, 프롤린을 루신으로 치환하거나 발린을 페닐알라닌으로 치환하는 것).
바람직하게는, 결실은 아미노산 말단의 15개 아미노산까지 및/또는 카르복시-말단 신호 서열의 개시점 바로 앞까지 이를 수 있다. 지금까지 플라비바이러스 캡시드 단백질의 최초 20개 아미노산 (또는 이러한 아미노산을 코딩하는 게놈 섹션)이 복제를 위해 절대적으로 필요한 것으로 추정되었지만 (Khromykh 및 Westaway, 1997), 본 발명의 범위내에서, 이러한 영역까지 이어지는 결실을 지닌, 복제하고 증식할 수 있는 바이러스가 또한 성공적으로 제조될 수 있다.
본 발명은 플라비바이러스의 모든 대표적 바이러스에 적용될 수 있다. 본원의 범위내에서, "플라비바이러스"란 용어는 플라비바이러스속의 대표적 바이러스만을 의미하는 것으로 명백히 나타난 경우를 제외하고는 플라비비리대과의 모든 대표적 바이러스를 나타낸다. 본 발명을 실현시키는 특히 바람직한 플라비바이러스의 대표적 바이러스는 황열 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 뎅기 바이러스의 4가지 혈청형, 진드기 매개 뇌염 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 머레이 밸리 뇌염 바이러스, 세인트 루이스 뇌염 바이러스, 포와산 바이러스, 전형적 돼지열 바이러스, 우형 바이러스성 설사 바이러스, 국경병 바이러스, C형 간염 바이러스 및 G형 간염 바이러스로 구성된 군으로부터 선택된다. 이러한 대표적 바이러스는 인간 및 동물에 대한 공지된 병원성으로 인해 본 발명에 특히 적합한데, 이는 이러한 대표적 바이러스의 경우, 적합한 약독된 생백신에 대한 요구가 특히 높기 때문이다.
본 발명에 따른 생백신의 경우, 효과적인 면역화를 위해 단지 적은 양의 바이러스가 필요한데, 투여 당 101내지 107개, 바람직하게는 102내지 106개, 특히 103내지 105개의 플라비바이러스의 감염 단위가 본 발명에 따른 생백신과 관련하여 충분하다. 바람직하게는, 생백신은 이러한 감염 단위의 양으로 단일 용량으로서 투여될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 생백신은 추가의 활성 물질 또는 보조 물질을 포함한다. 특히 바람직한 것은 네오마이신 또는 카나마이신과 같은 항생제, 티오머살과 같은 방부제, 및 인간 알부민, 락토오스-소르비트, 소르비트-젤라틴, 폴리젤린과 같은 안정제 또는 MgCl2또는 MgSO4와 같은 염을 첨가하는 것이다. 일반적으로, 바람직하게는 아미노산, 폴리사카라이드 및 (완충) 염이 첨가제로서 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 생백신을 제조하는 데에 있어서, 인간에게 투여하고자 하는 경우, 형질전환되지 않은 숙주 세포를 사용할 것이 권고되는데, 이는 이러한 방식으로 특성 변화의 위험 (예를 들어, 신규한 바람직하지 못한 돌연변이의 용이한 도입) 및 이러한 세포의 성분이 오염될 위험 둘 모두가 방지되기 때문이다.
본 발명의 추가의 일면에 따르면, 플라비바이러스 백신은 본 발명에 따라 결실된 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산 백신으로서 또한 제공될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 핵산 플라비바이러스 백신은 핵산 이외에, 플라스미드 백신에 대해 FDA에 의해 권고되는 바와 같이 네오마이신 또는 카나마이신과 같은 아미노글리코시드 항생제를 함유한다. 종래 기술 분야에는, "네이키드 (naked)" 핵산을 이용한 백신접종을 위한 매우 다양한 방법이 기술되었다 (참조: 본원에 참고문헌으로 인용된, WO 90/11092, WO 94/29469, WO 97/47197, 리포솜 매개 핵산 전달, 바람직하게는 (바람직하게는 생분해성) 미소구체에 의한 핵산 전달, ...).
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 생백신을 제조하는 방법으로서,
●캡시드 단백질에서 본 발명의 결실을 지닌 플라비바이러스 또는 플라비바이러스 핵산을 제공하는 단계,
●플라비바이러스 또는 플라비바이러스 핵산을 적합한 숙주 세포에서 증식시키는 단계,
●숙주 세포에 의해 증식된 바이러스 입자를 회수하는 단계, 및
●바이러스 입자를 생백신으로 처리하는 단계를 특징으로 한다.
바람직한 숙주 세포는 계배 세포, 1차 계배 세포, 인간 이배체 세포주 (예를 들어, WI-38, MRC-5), 베로 세포, 1차 햄스터 신장 세포, 1차 개 신장 세포 또는 이배체 붉은털원숭이 태아 폐 세포로부터 선택된다.
최종적으로, 본 발명은 플라비바이러스 감염 예방용 백신을 제조하기 위한, 캡시드 단백질에 본 발명의 결실을 지닌 플라비바이러스 핵산의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 하기 실시예 뿐만 아니라 첨부된 도면을 참조로 하여 더욱 상세히 설명되지만, 이들에 제한되는 것은 아니다.
실시예 1:생백신으로서 TBE 바이러스의 캡시드 결실 변종의 용도
TBE 바이러스의 경우, 병원성 및 면역원성은 성체 마우스 모델에서 조사될 수 있다. 생백신으로서, 캡시드 단백질의 영역에서 16개 아미노산이 결실된 TBE 바이러스의 변종 (CD28-43)을 사용하였다. 이러한 변종 및 하기 실시예에서 검토된 그 밖의 변종을 표 1에 요약하였다. 변종 CD28-43은 야생형 바이러스에 필적하는 유전자 발현을 나타내며, BHK-21 세포에서 요망에 따라 계대될 수 있다. 이 변종은 각각의 돌연변이를 TBE 바이러스의 감염성 cDNA 클론내로 도입시킴으로써 제조하였다. 이러한 변종 cDNA 클론으로부터의 RNA를 시험관내에서 전사하고, 이 RNA를 BHK-21 세포에 일렉트로포레이션시켰다. 3일 후, 세포 배양 현탁액을 수거하고, 바이러스를 베이비 마우스 뇌에서 2회 계대하여 고역가 바이러스 현탁액을 수득하였다. 이러한 고역가 바이러스 현탁액을 이용하여 성체 마우스 모델에서 생백신으로서 변종의 적합성을 조사하였다. 이를 위해, 10마리의 5주령 마우스를 각각 10,000 pfu의 변종 또는 독성 야생형 바이러스로 피하 접종하고, 생존율을 4주에 걸쳐 관찰하였다. 표 2에서 명백히 알 수 있는 바와 같이, 독성 야생형 바이러스의 경우, 10마리 중 9마리는 전형적인 뇌염 징후를 나타내면서 치사되었다. 이와 대조적으로, 캡시드 결실 변종으로 접종된 마우스는 한 마리도 치사되지 않았다. 또한, 변종을 사용하여 100배 더 높은 용량으로 접종한 경우, 10마리 마우스 중 한 마리도 병들지 않았다. 이러한 결과는 캡시드 결실 변종이 비병원성임을 의미한다. 변종으로 접종된 모든 마우스의 혈청 샘플을 검정한 결과, 모두 TBE 바이러스에 대한 특이적 면역 반응을 일으킨 것으로 나타났다. 보다 높은 용량의 독성 바이러스로 접종시킴으로써, 이러한 면역 반응이 야생형 바이러스에 의한 감염에 대해 보호를 제공할 수 있는 지를 시험하였다. 모든 마우스는 어떠한 질병의 징후없이 이러한 공격으로부터 생존하였다. 이러한 결과는 캡시드 결실 변종이 보호 면역을 유도시키므로, 야생형 바이러스에 대한 백신으로서 사용될 수 있음을 의미한다.
실시예 2:아미노-말단 20개 아미노산의 영역에 이르는 결실을 지니며, 계대될 수 있는 변종의 회수
감염성 cDNA 클론의 도움으로, 아미노산 16번 내지 아미노산 25번에 이르는 결실을 TBE 바이러스의 캡시드 단백질에 도입하였다 (변종 CD16-25; 표 1 참조). 변종 CD16-25는 세포 배양액에서 요망에 따라 계대될 수 있다. 이러한 결과는, 종래 기술과 대조적으로, 아미노산 16번을 포함하는 20개의 아미노-말단 아미노산의 영역에 이르는 결실이 플라비바이러스의 복제를 파괴하지 않는다는 것을 나타낸다.
실시예 3:독성 캡시드 결실 변종
캡시드 변종 CD28 및 CD28-31은 각각 1개 및 4개의 아미노산 길이의 결실을 함유한다 (표 1). 이러한 변종에서, 결실된 아미노산은 내부 소수성 도메인의 일부가 아니다 (도 1). 이러한 변종을 성체 마우스에 접종한 결과, 이들은 야생형 바이러스에 상응하는 독성 표현형을 지니며, 마우스의 80% 및 100%를 각각 치사시켰다 (표 2). 이러한 결과는 캡시드 단백질의 비-소수성 영역에서 4개 이하의 아미노산 크기의 결실이 약독된 백신을 제조하기에 부적합함을 나타낸다.
실시예 4:약독된 캡시드 결실 변종
캡시드 결실 변종 CD28-35, CD28-39, 및 실시예 1에 기술된 변종 CD28-43은 8개, 12개 및 16개의 아미노산 길이를 지니는 결실을 함유한다 (표 1). 이러한 결실은 내부 소수성 도메인의 일부를 제거한다 (도 1). 이들 변종을 성체 마우스에 접종시킨 결과, 이들은 약독된 표현형을 지니며, 즉, 한 마리도 치사시키지 않거나, 변종 CD28-35의 경우, 마우스의 단지 10%를 치사시키는 것으로 나타났다 (표 2). 이러한 결과는 내부 소수성 도메인의 일부를 제거하는 결실이 약독화를 초래함을 나타낸다. 약독화의 정도는 결실의 크기에 좌우되며, 결실의 크기가 커짐에 따라 증가할 수 있다. 이러한 약독된 변종으로 면역화된 모든 마우스는 독성 야생형 바이러스에 의한 감염으로부터 완전히 보호되었다. 이러한 결과는 캡시드 결실 변종이 생백신으로서 사용될 수 있다는 실시예 1의 결과를 확인해준다.
실시예 5:추가 돌연변이의 확인
캡시드 결실 변종 CD28-48, CD28-54 및 CD28-89는 21개, 27개 및 62개의 아미노산 길이를 지닌 결실을 함유한다 (표 1). 이러한 결실은 내부 소수성 도메인을 완전히 제거하거나, 최대 결실의 경우, 캡시드 단백질의 모든 내부 소수성 섹션을 제거한다 (도 1). 이들 변종은 동요없는 유전자 발현을 나타내지만, 이들 변종은 BHK-21 세포에서 계대될 수 없다. 이들 변종으로 트랜스펙션된 BHK-21 세포 배양액의 상층액을 3일 후 수거하고, 10마리의 베이비 마우스 (1일령)에 각각 두개내 접종하였다. 이는 TBE 바이러스에 대한 공지된 증식 시스템 중 가장 민감한 시스템을 구성한다. 5일 내지 10일 후, 변종 CD28-48의 경우에는 전부, 변종 CD28-54의 경우에는 10마리의 베이비 마우스 중 7마리가 뇌염의 명백한 임상적 징후를 나타내면서 치사되었다. 모든 치사된 마우스의 뇌에서, TBE 바이러스가 PCR에 의해 검출될 수 있었지만, 어떠한 바이러스도 생존 마우스에서 발견할 수 없었다. 치사된 마우스의 뇌로부터의 바이러스는 요망에 따라 BHK-21 세포 배양액에서 계대될 수 있었다. 이러한 결과는, 소수성 도메인의 제거에 의해 세포 배양액에서 계대 능력을 상실한 변종의 경우, 세포 배양액에서 다시 계대될 수 있는 복귀변이주가 선택될 수 있음을 나타낸다.
이러한 변화의 유전학적 기초를 결정하기 위해, 캡시드 단백질을 코딩하는 게놈 섹션을 일련의 이러한 복귀변이주에 대해 시퀀싱하였다. 각각의 경우, 최초로 도입된 결실 이외에 단백질 C에서 추가의 돌연변이가 존재하는 것으로 밝혀졌다. 이는 점 돌연변이 또는 서열 중복이었다. 추가의 돌연변이를 표 3에 요약하였다. 이러한 모든 돌연변이의 한 가지 공통된 특징은 이들이 캡시드 단백질의 소수성을 증가시킨다는 데에 있다. 이 결과는 캡시드 단백질의 소수성을 증가시키는 돌연변이가 세포 배양액에서 플라비바이러스의 계대 능력에 관하여 내부 소수성 서열의 결실의 효과를 복귀시킬 수 있음을 나타낸다.
실시예 6:생백신으로서 추가의 돌연변이를 지닌 캡시드 결실 변종
감염성 클론의 도움으로, 내부 소수성 도메인의 21개 아미노산의 길이를 지닌 결실과 함께 캡시드 단백질에서 각각 하나의 추가의 돌연변이 (표 3에 나열된 돌연변이로부터 선택됨)를 함유하는 2가지 변종을 제조하였다. 추가의 돌연변이가 없는 상응하는 결실 변종 (CD28-43)과 대조적으로, 이러한 2가지 변종, 즉, CD28-43/L70 및 CD28-43/Du8은 요망에 따라 계대될 수 있었다 (표 1). 이러한 결과는 실시예 5의 결과를 확인해준다. 이러한 변종을 성체 마우스에 접종한 결과, 둘 모두 비병원성이며, 보호 면역을 유도시키는 것으로 나타났다 (표 2). 이러한 결과는 결실 및 상기 기술된 견지에 따른 추가 돌연변이를 지닌 변종이 생백신으로서 적합하다는 것을 보여준다.
표 1
TBE 바이러스의 캡시드 결실 변종
명칭 결실a 추가 돌연변이 유전자발현b 계대 능력c
CD28 Q28 + +
CD28-31 Q28-V31 + +
CD28-35 Q28-N35 + +
CD28-39 Q28-L39 + +
CD28-43 Q28-M43 + +
CD28-46 Q28-L46 + +
CD28-48 Q28-H48 + -
CD28-54 Q28-A54 + -
CD28-89 Q28-L89 + -
CD16-25 R16-K25 + +
CD28-48/L70 Q28-H48 Q70 →L + +
CD28-48/Du8 Q28-H48 178-L85 Dupld + +
a결실되는 최초 아미노산 및 최종 아미노산을 나타낸다. 숫자는 캡시드 단백질의 아미노 말단으로부터 계수한 AA의 위치를 나타낸다.
bTBE-특이적 항혈청을 사용하여 BHK-21 세포를 면역형광 염색함으로써 결정된다. + = 야생형 바이러스와 필적하는 강도의 면역형광 염색; - = 염색되지 않음.
c세포 배양 상층액을 BHK-21 세포로 수 회 전달함으로써 결정된다. + 는 계대될 수 있음을 나타내고; - 는 계대될 수 없음을 나타낸다.
d78번 내지 85번의 8개 아미노산의 중복.
표 2
성체 마우스의 면역화
접종물 양a 생존율` 보호 면역율`
야생형 104pfu 1/10 n.a.
CD28 104pfu 0/10 n.a.
CD28-31 104pfu 2/10 n.a.
CD28-35 104pfu 9/10 9/10
CD28-39 104pfu 10/10 10/10
CD28-43 104pfu 10/10 10/10
CD28-43 106pfu 10/10 10/10
CD28-48/L70 104pfu 10/10 10/10
CD28-48/Du8 104pfu 10/10 10/10
a마우스 당 플라크 형성 단위 (pfu)로 표시된, 피하 적용된 접종물의 양
b생존 마우스 숫자/전체 마우스 숫자
c면역 마우스 숫자/전체 마우스 숫자. 면역화는 혈청에서 TBE-특이적 항체를 검출함으로써 결정되었다. 독성 야생형 바이러스에 의한 후속 감염은 면역화가 질병에 대해 완전하게 보호를 제공함을 확인해주었다. n.a. = 적용 불가
표 3
캡시드 결실 변종에서의 보상 돌연변이
RNAa 단백질b
A299 →U D56 →I
C302 →U P57 →L
G328 →U V66 →F
A341 →U Q70 →L
C347 →U T72 →I
A368 →U K79 →I
C374 →U T81 →M
A401 →U Q90 →L
364-387 Duplc I78-L85 Dupl
307-363 Dupl L59-K77 Dupl
aTBE 바이러스의 게놈에서 누클레오티드 위치 (GenBank No. U27495)
b단백질 C에서 아미노산 위치
c지시된 섹션의 중복

Claims (14)

  1. 플라비바이러스 변종을 포함하는 약독된 플라비바이러스 생백신으로서, 이러한 플라비바이러스 변종이 캡시드 단백질에서 적어도 4개를 초과하는 연속 아미노산의 결실을 지니며, 카르복시-말단 소수성 영역은 이러한 결실에 의해 영향을 받지 않음을 특징으로 하는 생백신.
  2. 제 1항에 있어서, 결실이 캡시드 단백질의 내부 소수성 도메인과 관련됨을 특징으로 하는 생백신.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 캡시드 단백질에서 5개 내지 70개, 바람직하게는 6개 내지 25개, 특히 7개 내지 20개의 연속 아미노산이 결실됨을 특징으로 하는 생백신.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 결실되는 연속 아미노산이 20개를 초과하고, 캡시드 단백질이 캡시드 단백질의 소수성을 증가시키는 하나 이상의 추가 돌연변이를 추가로 포함하며, 추가 돌연변이가 바람직하게는,
    ●캡시드 단백질의 소수성을 증가시키는 점 돌연변이, 또는
    ●주로 소수성 특성을 지닌 아미노산 부분의 삽입, 특히 캡시드 단백질의 소수성 영역의 중복으로부터 선택됨을 특징으로 하는 생백신.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 플라비바이러스가 황열 바이러스 (YFV), 일본 뇌염 바이러스 (JEV), 뎅기 바이러스 (DV)의 4가지 혈청형, 진드기 매개 뇌염 바이러스 (TBE 바이러스), 웨스트 나일 바이러스 (WNV), 머레이 밸리 (Murray Valley) 뇌염 바이러스 (MVEV), 세인트 루이스 뇌염 바이러스 (SLEV), 포와산 (Powassan) 바이러스 (PV), 전형적 돼지열 (porcine fever) 바이러스 (CPFV), 우형 바이러스성 설사 바이러스 (BDV), 국경병 바이러스 (BDV), C형 간염 바이러스 (HCV) 및 G형 간염 바이러스 (HGV)로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 생백신.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 101내지 107개, 바람직하게는 102내지 106개, 특히 103내지 106개의 플라비바이러스 감염 단위를 포함함을 특징으로 하는 생백신.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 항생제, 방부제, 안정제, 완충 물질 또는 이들의 혼합물을 포함함을 특징으로 하는 생백신.
  8. 제 7항에 있어서, 네오마이신, 카나마이신, 티오머살, 인간 알부민, 락토오스-소르비트, 소르비트-젤라틴, 폴리젤린 (polygeline), MgCl2, MgSO4, 아미노산, 폴리사카라이드, 완충염 또는 이들의 혼합물을 포함함을 특징으로 하는 생백신.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 형질전환되지 않은 숙주 세포에 의해 생성됨을 특징으로 하는 생백신.
  10. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 규정된 결실된 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산을 포함함을 특징으로 하는 플라비바이러스 백신.
  11. 제 10항에 있어서, 아미노글리코시드 항생제, 특히 네오마이신 또는 카나마이신, 리포솜, 미소구체 또는 이들의 혼합물을 포함함을 특징으로 하는 플라비바이러스 백신.
  12. ●제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 규정된, 캡시드 단백질에서 적어도 4개를 초과하는 연속 아미노산의 결실을 지닌 플라비바이러스 또는 플라비바이러스 핵산을 제공하는 단계,
    ●플라비바이러스 또는 플라비바이러스 핵산을 적합한 숙주 세포에서 증식시키는 단계,
    ●숙주 세포에 의해 증식된 바이러스 입자를 회수하는 단계, 및
    ●바이러스 입자를 생백신으로 처리하는 단계를 특징으로 하는, 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 따른 생백신을 제조하는 방법.
  13. 제 12항에 있어서, 숙주 세포가 계배 세포, 1차 계배 세포, 인간 이배체 세포주, 베로 세포, 1차 햄스터 신장 세포, 1차 개 신장 세포 또는 이배체 붉은털원숭이 태아 폐 세포로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  14. 플라비바이러스 감염의 예방 백신을 제조하기 위한, 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 규정된, 캡시드 단백질에서 적어도 4개를 초과하는 연속 핵산의 결실을 지닌 플라비바이러스 핵산의 용도.
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