KR20030077543A

KR20030077543A - 죽상 경화증의 예방 및 치료를 위해 정의된 산화 인지질을사용하는 방법 및 이를 함유하는 조성물

Info

Publication number: KR20030077543A
Application number: KR10-2003-7006991A
Authority: KR
Inventors: 하라츠드로; 죠지제이콥; 할페린기데온
Original assignee: 바스큘라 바이오제닉스 리미티드
Priority date: 2000-11-24
Filing date: 2001-11-22
Publication date: 2003-10-01
Also published as: MXPA03004517A; CA2429817A1; JP2008222726A; WO2002041827A2; JP5001906B2; JP2012149075A; CA2429817C; JP2004537498A; KR100865142B1; WO2002041827A3; EP1341543A4; EP2425841A1; EP1341543A2; CN1529605A; AU1846102A; CN100577174C; IL156015A0; JP4162486B2; WO2002041827A9; AU2002218461B2

Abstract

죽상 경화증 및 다른 관련 장애의 예방 및 치료를 위한 에스테르화 산화 인지질의 신규한 합성 형태 및 이를 사용하는 방법이 제공된다. 또한, 죽상 경화증 및 다른 관련 장애의 예방 및 치료를 위한 에스테르화 산화 인지질의 합성 방법 및 이를 사용하는 방법이 또한 제공된다.

Description

죽상 경화증의 예방 및 치료를 위해 정의된 산화 인지질을 사용하는 방법 및 이를 함유하는 조성물{METHODS EMPLOYING AND COMPOSITIONS CONTAINING DEFINED OXIDIZED PHOSPHOLIPIDS FOR PREVENTION AND TREATMENT OF ATHEROSCLEROSIS}

심혈관 질환은 산업화 세계에 있어 주된 건강 위험이다. 가장 만연된 심혈관 질환인 죽상 경화증은 심장마비, 뇌졸증 및 사지의 괴저(gangrene)의 주요 원인으로, 미국의 사망의 주요인이다. 죽상 경화증은 다수의 세포 유형 및 분자 인자들이 관여하는 복합 질환이다(상세한 검토를 위해, Ross, 1993, Nature 362: 801-809를 참조할 것). 동맥벽의 내피 세포 및 평활근 세포(SMCs)의 손상에 반응하여 발생하는 과정은 섬유지방 및 섬유성 병변 또는 플라크(plaque)의 형성으로 이루어지며, 염증에 의해 선행 및 수반된다. 죽상 경화증의 출현 병변은 관련 동맥을 폐색하고, 손상의 다양한 형태에 대한 과도한 염증성-섬유 증식성 반응에 기인한다.예를 들면, 전단 응력은 분기점 및 불규칙적인 구조와 같이 혈류가 격렬해지는 순환계 영역에서 죽상 경화성 플라크의 빈번한 출현을 일으키는 것으로 생각된다.

죽상 경화성 플라크의 형성에서 첫 번째로 관찰가능한 것은 단핵 세포-유도 대식 세포와 같은 염증성 세포가 내피하층 세포 공간에 부착하여 혈관 내피하층을 통해 이동할 때 발생한다. 상승된 혈장 LDL 수준은 인접한 내피 세포가 산화된 저밀도 지질단백질(LDL)을 생산하면서 혈관벽의 지질 포식(lipid engorgement)을 초래한다. 또한, 세포외 매트릭스에 의한 지질단백질 포집은 리포옥시게나아제, 반응성 산소종, 퍼옥시니트라이트 및/또는 미엘로퍼옥시다아제에 의한 LDL의 점진적 산화를 초래한다. 이후, 이러한 산화 LDL은 그 표면상에서 발현하는 스케빈저(scavenger) 수용체를 통해 혈관 세포에 의해 다량으로 흡수된다.

지질이 채워진 단핵 세포 및 평활근 유도 세포는 포움 세포(foam cells)로 일컬어지며, 지방 선조(streak)의 주요 구성 요소이다. 포움 세포 및 이를 둘러싼 내피 및 평활근 세포 사이의 상호작용은 결국에는 내피 세포의 활성, 대식 세포 사멸의 증가, 평활근 세포의 증식 및 이동, 및 섬유성 플라크의 형성을 초래할 수 있는 만성 국소 염증 상태를 일으킨다(Hajjar, DP and Haberland, ME, J. Biol Chem 1997 Sep 12; 272 (37): 22975-78). 이러한 플라크는 관련 혈관을 폐색하고, 따라서 혈류를 제한하여, 불충분한 관류에 의한 기관 조직에서의 산소 공급 부족을 특징으로 하는 상태인 허열(ischemia)을 일으킨다. 관련 동맥이 심장으로 가는 혈류를 차단할 때, 사람은 '심장마비'를 일으킨다; 뇌동맥이 폐색되는 경우, 사람은 뇌졸중을 일으킨다. 사지로 가는 동맥이 좁아지면, 그 결과는 심한 통증이며, 신체적 이동이 감소되고, 심지어는 절단(amputation)할 필요가 있다.

산화 LDL은 그 단핵 세포와 평활근 세포에 대한 작용에 의해, 내피 세포의 세포 사멸을 유도하고, 내피 세포에서 항응집(antocoaulant) 균형을 손상시킴으로써 죽상 경화증 및 죽상 혈전의 병인학과 관련이 있다. 산화 LDL은 또한 산화 인지질의 항-죽종 형성(atherogenic) HDL-관련 손상(breakdown)을 억제한다(Mertens, A and Holvoet, P, FASEB J 2001 Oct; 15 (12): 2073-84). 이러한 관련성은 또한 죽종 형성의 다수 동물 모델에서 플라크 내 산화 LDL의 존재를 증명하고 있는 많은 연구들; 생리학적 및/또는 유전적 조작에 의한 산화의 억제를 통해 죽종 형성의 저지; 및 항산화 비타민에 의한 개입 시도의 유망한 결과에 의해 지지되고 있다(예를 들면, 본 명세서의 검토를 위해 Witztum J and Steinberg, D, Trends Cardiovasc Med 2001 Apr-May; 11 (3-4): 93-102 참조). 실제로, 산화 LDL 및 말론디알데히드(MDA)-개질 LDL은 관상(coronary) 동맥 질환의 제1 및 제2기에 대한 정확한 혈액 표지자로서 최근에 제안되어 왔다(Holvoet 등의 미국 특허 제 6,309,888호 및 Witztum 등의 제 6,255,070호).

LDL 산화 및 활성 억제는 심혈관 질환의 치료 및 예방에 대한 다수의 제안된 임상 적용의 목적이 되어 왔다. Bucala, 등(미국 특허 제 5869534호)은 출현 글리코실화 최종 생성물, 연령-, 질환- 및 당뇨병-관련 포움 세포 형성의 지질 특성을 감소시킴으로써 지질 과산화를 조절하기 위한 방법을 개시하고 있다. Incyte Pharmaceuticals, Inc.의 Tang 등(미국 특허 제 5,945,308호)은 심혈관 및 자가 면역(autoimmune) 질환 및 암의 치료에 있어서 인간 산화 LDL 수용체의 확인을 개시하고, 임상 적용을 제안하였다.

죽상 경화증 및 자가 면역 질환

죽상 경화증 및 허혈에서 과도한 염증성-섬유 증식성 반응의 예상된 역할 때문에, 점점 더 많은 연구자들이 혈관 손상의 자가 면역 성분을 정의하고자 하였다. 자가 면역 질환에서, 면역계는 침입하는 외부 항원을 공격하는 외에도 통상적으로 비-항원성 인체 성분(자가 항원(autoantigen))을 인식하여 공격한다. 자가 면역 질환은 자가- (또는 자기-) 항체 매개되거나 또는 세포 매개된 질환으로서 분류된다. 전형적인 자가 항체 매개된 자가 면역 질환은 근무력증(myasthenia gravis) 및 특발성 혈소판 감소성 자반증(idiopathic thrombocytopenic purpura, ITP)인 반면, 전형적인 세포 매개 질환은 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis) 및 I형(소아) 당뇨병이다.

면역 매개 과정이 죽상 경화성 병변 내에서 우세할 것이라는 인식은 초기에는 림프구 및 대식 세포, 즉 지방 선조의 일관성 있는 관찰에 기인하였다. CD4+ 세포(나머지는 CD8+ 세포임)의 우점종 개체군을 포함하는 이들 림프구는 초기 병변에서는 대식 세포에 비해 보다 풍부하며, 보다 진행된 병변에서는 그 비율이 역전이 되는 경향이 있는 것으로 밝혀졌다. 이러한 발견은 이들이 가능성이 있는 항원 또는 이전에 유발된 국소 조직 손상의 단지 부수 현상일 뿐인지에 대해 의심을 두었다. 이들 염증성 세포의 초기 플라크에 대한 점증의 원인인 인자에 관계없이, 이들은 MHC class II HLA-DR 및 인터루킨(IL) 수용체 뿐 아니라 백혈구 공동 항원(CD45R0) 및 베리 레이트(very late) 항원 1(VLA-1) 인테그린(integrin)의 동시 발현에 의해 증상 발현된 활성 상태를 나타내는 것처럼 보인다.

죽상 경화성 병변의 초기 단계에서 진행 중인 염증성 반응은 국소 세포(즉, 내피 세포, 대식 세포, 평활근 세포 및 염증성 세포)에 의해 다양한 사이토킨(cytokine)의 생성으로 유도되는 초기 개시 이벤트이거나, 또는 이러한 반응은 위험한 과정에 대한 체내 방어 면역계의 형태일 수 있다. 고정 세포에 의해 상향 조절되는(upregulated) 것으로 알려져 온 몇몇 사이토킨은 TNF-α, IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, IFN-γ및 단핵 세포 화학유주성제(chemoattractant) 펩티드-1 (MCP-1)을 포함한다. 죽상 경화성 플라크 내의 모든 세포 구성 성분에 의해 발현되는 혈소판 유도 성장 인자(PDGF) 및 인슐린류의 성장 인자(ILGF)는 과발현되는 것으로 밝혀졌으며, 따라서 분열촉진성(mitogenic) 및 주화성(chemotactic) 인자의 형태로 공-자극성 지지(co-stimulatory support)에 의해 이미 존재하는 염증성 반응을 강화시킬 수 있다. 최근, Uyemura 등(Cross regulatory roles of IL-12 and IL-10 in atherosclerosis. J Clin Invest 1996 97; 2130-2138)은 정상 동맥에 비해 IL-4 mRNA 가 아닌, IFN-γ 의 강한 발현에 의해 예시되는 인간 죽상 경화성 병변에서 1형 T-세포 사이토킨 패턴을 밝혔다. 또한, 활성 단핵 세포 및 Th1 사이토킨 패턴의 선택적 유도 인자에 의해 1차적으로 생성되는 IL-12-a T-세포 성장 인자는 그 주요 헤테로다이머(heterodimer)형 p70 및 p40(주요 유도성 단백질) mRNA이 풍부함에 의해 증상 발현된 바와 같이 병변 내에서 과발현되는 것으로 밝혀졌다.

죽상 경화성 플라크 내에서 세포 면역계의 우위(dominance)에 대한 강력한증거와 유사하게, 국소 체액성(humoral) 면역계의 관련성을 뒷받침하는 많은 데이터들이 있다. 따라서, 면역 글로블린 및 상보적 성분의 축적은 고정 대식 세포에서 C3b 및 C3Bi 수용체의 증가된 발현 이외에, 플라크에서도 밝혀졌다.

죽상 경화증의 진행에 대한 면역 매개 염증의 기여에 대한 귀중한 단서가 동물 모델로부터 유래하고 있다. 면역저하된(Immunocompromised) 마우스(class I MHC 결핍)는 면역반응성 마우스와 비교하여 가속화된 죽상 경화증이 진행되는 경향이 있다. 또한, C57BL/6 마우스(Emeson EE, Shen ML)의 치료는 사이클로스포린 A로 처리한 고질혈즈(hyperlipidemic) C57BL/6 마우스에서 죽상 경화증을 가속화시키고(Am J Pathol 1993; 142: 1906-1915), IL-2 전사의 강력한 억제제인 사이클로스포린 A를 가진 뉴질랜드 백색 토끼(Roselaar SE, Schonfeld G, Daugherty A. Enhanced development of atherosclerosis in cholesterol fed rabbits by suppression of cell mediated immunity. J Clin Invest 1995; 96: 1389-1394)는 "정상" 지질 단백질 하에서 유의적으로 강화된 죽상 경화증을 초래하였다. 후자의 연구들은 죽상 경화증 플라크 내에서 자기-영속(self-perpetuating) 염증성 과정에 대해 역행하는 면역계에 있어 가능한 역할에 대한 통찰력을 제공할 수 있다.

비록 혈관을 폐색시키는 플라크의 생성과 같은 몇몇 증상 발현이 이상(aberrant) 면역 반응과 관련이 있지만, 전통적인 자가 면역 질환은 아니다. 전통적인 자가 면역 질환에 있어서, 자가 항원(체액성, 즉 자가 항체 또는 세포성, 즉 림프구)을 인식하는 면역계 및 면역계의 성분(들)에 의해 공격되는 민감성 자가 항원을 매우 확실하게 정의할 수 있다. 특히, 면역계의 이러한 성분의 수동적 전이에 의해 건강한 동물에서 질환이 유도되거나 또는 인간의 경우 질환은 질병에 걸린 임산부에서 그녀의 후세에게로도 전이될 수 있다. 이들 다수는 죽상 경화증에서 만연하지는 않는다. 또한, 질환은 명백하게 고혈압, 당뇨병, 신체적 활동의 결여, 흡연 기타와 같은 통상적인 위험 인자를 가지며, 이러한 질환은 노인에게 영향을 미치며, 전통적인 자가 면역 질환에 비해 상이한 유전적 우위(preponderance)를 갖는다.

자가 면역 염증성 질환의 치료는 일반적 및/또는 질환-특이적 면역 반응성의 억제 또는 반전을 목적으로 할 수 있다. 따라서, 예를 들면 Aiello(미국 특허 제 6,034,102호 및 제 6,114,395호)는 염증성 세포 점증의 억제에 의해 죽상 경화증 및 죽상 경화성 병변의 진행을 치료 및 예방하기 위한 에스트로겐-류 화합물의 용도를 개시하고 있다. 유사하게, Medford 등(미국 특허 제 5,846,959호)은 세포의 부착 분자 VCAM-1에 의해 매개되는 심혈관 및 비-심혈관 염증성 질환의 치료를 위한 산화 PUFA의 형성을 예방하기 위한 방법을 개시하고 있다. 또한, Falb(미국 특허 제 6,156,500)는 항-염증성 치료의 강력한 타겟으로서 죽상 경화성 플라크 및 질환에 풍부하게 존재하는 다수의 세포 신호 및 부착 분자를 개시하고 있다.

산화 LDL이 죽상 경화증의 병인학에서 명백하게 관련이 있었기 때문에(상술함), 죽종성 질환 과정에서 자가 면역에 대한 상기 유망한 플라크 성분의 기여도에 대해 연구되어 왔다.

산화 LDL에 대한 면역 반응성

산화 LDL이 T-세포 및 단핵 세포에 대해 주화성(chemotactic)이라는 것이 알려져 있다. 산화 LDL 및 그 부산물이 강력한 성장 자극 인자들인 단핵 세포 주화성 인자 1과 같은 인자의 발현, 군체(colony) 자극 인자의 분비 및 혈소판 활성 특성을 유도하는 것으로 또한 알려져 있다. 죽상 경화증에서 세포 면역 반응의 활성 관련성은 최근에 자극 인자로서 산화 LDL에 반응하는 플라크 클론 내에서 CD4+를 분리하였던 Stemme. S 등에 의해 구체화되었다(Stemme S, 등, Proc Natl Acad Sci USA 1995; 92: 3893-97). 산화 LDL에 상응하는 클론(27 중 4)은 IL-4 보다는 인터페론-γ를 주로 생산하였다. 상기 T-세포 클론이 자극성 강한 면역원(산화 LDL)을 가진 세포 면역계와 단순히 접촉하는 것인지 또는 이 반응이 명백히 무활성인(indolent) 죽상 경화증 과정과 경쟁하는 수단을 제공하는지 살펴볼 필요가 있다.

체액성 기작과 그 의미의 관련성에 대한 데이터는 훨씬 더 논의의 여지가 있다. 최근의 한 연구는 심장 질환 및/또는 당뇨병 여성 환자에 있어 LDL 산화의 대사 산물(metabolite)인 MDA-LDL의 수준이 증가하였음을 보고하였다(Dotevall, 등., Clin Sci 2001 Nov; 101 (5): 523-31). 또 다른 연구자들은 죽상 경화증 및 당뇨병, 신혈관성(renovascular) 증후군, 요독증(uremia), 류마티스성 열 및 홍반성 낭창(lupus erythematsus)과 같은 다른 질환에 있어서 지질 및 아포지질단백질(apolipoprotein)에 대한 면역 반응성을 나타내는 산화 LDL에 대한 다발성 에피토프를 인식하는 항체에 대해 설명하였다(Steinerova A, 등., Physiol Res 2001; 50 (2): 131-41). 몇몇 보고서들은 죽상 경화증의 진행( 경동맥(carotid) 협착증(stenosis)의 정도, 말초 혈관 질환의 경중의 정도에 의해표시됨)에 따라 산화 LDL에 대한 항체의 증가 수준과 관련이 있다. 가장 최근에는, Sherer 등(Cardiology 2001; 95 (1) : 20-4)은 관상 심장 질환에서 포스파티딜 콜린 또는 내피 세포가 아닌 카르디올리핀(cardiolipin), beta 2GPI 및 산화 LDL에 대한 항체의 증가 수준을 설명하였다. 따라서, 비록 이러한 발견의 진정한 중요성이 밝혀지지는 않았지만 죽상 경화성 플라크 내에서 면역 복합체 형태의 산화 LDL 항체의 존재에 대한 교감이 있는 것으로 보인다.

산화 LDL에 대한 항체는 지질단백질 대사에서 활성적인 역할을 하는 것으로 가정되어 왔다. 따라서, 산화 LDL 및 그와 상응하는 항체의 면역 복합체가 산화 LDL와 비교하여 현탁액에서 대식 세포에 의해 보다 효율적으로 흡수되는 것으로 알려져 있다. 대식 세포에 의한 산화 LDL의 흡수의 가속화가 유리한 것인지 유해한 것인지에 대한 의문점이 아직 해결되지 않았기 때문에, 죽상 경화증의 병인에 대한 이러한 일관적인 발견으로부터 어떠한 결론도 도출할 수 없다.

죽종 형성에 있어서 체액성 면역계의 중요성에 대한 중요한 데이터는 동물 모델로부터 유래한다. 동족성 산화 LDL을 가진 LDL-수용체 결핍 토끼의 과다 면역은 항-산화 LDL 항체의 높은 수준을 초래할 수 있고, 포스페이트-완충 식염수(PBS)에 노출된 대조군에 비해 죽상 경화성 병변의 정도가 유의적으로 감소된 것과 관련이 있었다. 플라크 형성 감소는 또한 항-콜레스테롤 항체의 동시 형성을 가진 콜레스테롤이 풍부한 리포솜으로 토끼를 면역화시킴으로써 달성되었지만, 이러한 효과는 매우 낮은 밀도의 지질단백질 콜레스테롤 수준의 35% 감소를 수반하였다.

따라서, 산화 LDL 성분의 병인학적 역할 및 죽상 경화증 뿐 아니라 다른 질환에 있어서 자가 항원으로서 이들의 중요성은 실험실 및 임상 연구에서 광범위하게 증명되어 왔다.

자가 면역 질환의 치료에 있어 점막 내성

최근, 새로운 방법 및 약제학적 조성물이 자가 면역 질환(및 타가 이식(allograft) 거부 및 레트로바이러스-관련 신경학적 질환과 같은 관련 T-세포 매개 염증성 장애)을 치료하는데 있어 유용하다고 밝혀졌다. 이러한 치료는 내성제(tolerizer) 자가 항원, 방관자(bystander) 항원, 또는 질환-억제 단편 또는 자가 항원 또는 방관자 항원의 유사체를 사용하여 경구적 및 점막적으로 예를 들면 흡입에 의해 내성을 유도한다. 이러한 치료는 예를 들면 Weiner 등의 미국 특허 제 5,935,577호에 기재되어 있다. 자가 항원 및 방관자는 후술되어 있다(점막 내성을 전체적으로 검토하기 위해서는, Nagler-Anderson, C., Crit Rev Immunol 2000; 20 (2): 103-20를 참조할 것). 자가 항원(면역 우성(immunodominant) 에피토프성 부위를 함유하는 자가 항원의 단편)의 정맥내 투여는 클론성 면역성 결핍(anergy)으로 명명된 기작을 통해 면역 억제를 유도하는 것으로 밝혀졌다. 클론성 면역성 결핍은 특정 항원에 특이적인 단지 면역 공격 T-세포의 불활성을 초래하며, 그 결과는 상기 항원에 대한 면역 반응의 유의적 감소이다. 따라서, 일단 면역성이 결핍되면, 자가 항원에 특이적인 자가 면역 반응 촉진 T-세포는 더 이상 항원에 반응하여 증식하지 않는다. 이러한 증식 감소는 자가 면역 질환 증후군(MS에서 관찰되는 신경 조직 손상과 같은)에 대해 관련된 면역 반응을 감소시킨다. 1회 투여량 및 실질적으로 "활성 억제"를 촉진하는 양 이상으로 자가 항원(또는 면역 우성 단편)의 경구 투여는 면역성 결핍(또는 클론성 결손)을 통해 내성을 유도할 수도 있다.

활성 억제에 의해 선행되는 치료 방법이 개시되어 있다. 활성 억제는 클론성 면역성 결핍의 기작과는 다른 기작을 통해 기능한다. PCT 출원 PCT/US93/01705에서 집중적으로 논의되고 있는 방법은 자가 면역 공격하에서 조직에 대해 특이적인 항원의 구강 또는 점막 투여를 포함한다. 이들은 일명 "방관자 항원"이라 한다. 이러한 치료는 장-관련 림프성(lymphoid) 조직(GALT), 또는 기관지 관련 림프성 조직(BALT), 또는 가장 일반적으로는 점막 관련 림프성 조직(MALT)(MALT는 GALT 및 BALT를 포함한다)에서 조절(억제제) T-세포가 유도되도록 한다. 이들 조절 세포들은 혈액 또는 림프성 조직에서 방출된 다음, 자가 면역 질환을 앓고 있는 기관 또는 조직으로 이동하여 상기 앓고 있는 기관 또는 조직의 자가 면역 공격을 억제한다. 방관자 항원(T-세포를 유도하기 위해 사용되는 방관자 항원의 하나 이상의 항원성 결정 인자를 인식하는)에 의해 유도되는 T-세포는 임의의 자가 조절 인자 및 변형 성장 인자 베타(TGF-β), 인터류킨-4(IL-4) 및/또는 인터류킨-10(IL-10)과 같은 사이토킨의 국소 방출을 매개하는 자가 면역 공격의 병소(locus)를 타겟으로 한다. 이들 중에서, TGF-β는 공격을 촉진하는 항원에 관계없이 면역 공격을 억제한다는 점에서 항원-비특이적 면역 억제 인자이다(그러나, 방관자 항원에 의한 경구 또는 점막 내성은 다만 자가 면역 공격의 주변에서 TGF-β의 방출만을 야기하기 때문에, 어떠한 전신적 면역 억제가 보장되지 않는다). IL-4 및 IL-10은 또한 항원-비특이적 면역 조절 시토킨이다. 특히, IL-4(T 헬퍼(helper) Th2) Th₂반응은 즉 T-세포 전구체에 대해 작용하며, 이들로 하여금 Th₁반응을 이용하여 Th₂세포로 우선적으로 분화하도록 한다. IL-4는 또한 Th₁악화(exacerbation)를 간접적으로 억제한다. IL-10은 Th_l반응의 직접적인 억제자이다. 방관자 항원으로 자가 면역 질환 이상을 앓는 포유류를 구강 내성화한 후, TGF-β, IL-4 및 IL-10의 수준 증가는 자가 면역 공격의 병소(locus)에서 관찰된다(Chen, Y. 등., Science, 265: 1237-1240,1994). 이러한 방관자 억제 기작은 von Herreth 등.,(J. Clin. Invest., 96: 1324-1331, September 1996)에 의해 확인되었다.

보다 최근에는, 구강 내성은 정장제(probiotic) 박테리아를 주입함으로써 염증성 장 질환의 동물 모델의 치료에 효과적으로 사용되어 왔고(Dunne, C, 등., Antonie Van Leeuwenhoek 1999 Jul-Nov; 76 (1-4) : 279-92), 사구체 하부(glomerular basement) 막에 주입함으로써 자가 면역 사구체 신염(glomerulonephritis)의 동물 모델 치료에 효과적으로 사용되어 왔으며(Reynolds, J. 등., J Am Soc Nephrol 2001 Jan; 12 (1) : 61-70), 미엘린 기초 단백질(MBP)을 주입함으로써 실험 알레르기성 뇌척수염(encephalomyelitis)(다발성 경화증 또는 MS와 유사한 EAE)의 동물 모델 치료에 효과적으로 사용되었고, 콜라겐 및 HSP-65를 대상체에 주입함으로써 보강 관절염 및 콜라겐 관절염의 동물 모델 치료에 효과적으로 사용되었다. 보스톤 소재의 회사 Autoimmune사는 당뇨병, 다발성 경화증, 류마티스염 및 포도막염(uveitis)을 예방하기 위한 몇몇 인체 실험을 수행하였다. 인체 실험의 결과들은 비-인간 실험에 비해 덜 인상적이지만, 관절염의 예방에 있어서는 일부 성공적이었다.

죽상 경화성 플라크 병변에서 발견되는 자가 항원에 대한 구강 내성이 또한 연구되었다. 죽상 경화증의 임상 및 실험 모델에서 T-세포 및 Ig 역가에 의해 인식되는 에피토프에 관한 연구는 죽종성 병변에서 염증을 억제하기 위한 산화 LDL, 스트레스-관련 열 충격 단백질 HSP 65 및 카르디올리핀 결합 단백질 베타 2GP1의 3가지 후보 항원을 나타내었다. 본 명세서에 전체로서 포함되는 Shoenfeld 등의 미국 특허 출원 제 09/806,400호(1999년 9월30일 출원)는 산화 인간 LDL이 주입된 유전학적으로 민감한 LDL-RD 수용체 결핍 형질전환 마우스의 동맥에서 죽종 형성의 약 30%가 감소됨을 개시하고 있다. 그러나, 이러한 보호 효과는 Cu⁺⁺를 가진 긴 산화 과정 처리된 인간 혈청 LDL을 원심 분리, 여과 및 정제로 이루어진 조(crude) 항원 제제를 주입함으로써 달성되었다. 비록 죽종 형성의 유의적인 억제가 구강 내성에 의해 달성되었다 하더라도, 어떠한 특이적 지질 항원 또는 면역원성 LDL 성분도 확인된 바 없다. 겪게 되는 또 다른 장애는 간 및 세포 면역 기작에 의해 산화 LDL의 효소 활성 및 흡수에 의한 조 산화 LDL의 생체 내 고유한 불안정성이었다. 안정하고 보다 주위깊게 정의된 산화 LDL 유사체가 구강 내성의 큰 효율성을 제공할 것으로 보인다. 면역 내성의 유도 및 이후 후속적인 자가 면역 염증성 과정의 예방 또는 억제는 장 보다는 점막 부위를 통한 억제적 항원에 대해 노출함으로써 증명되었다. 눈 주위의 막상 조직 및 비강의 점막, 뿐 아니라 장은 다수의침입 뿐 아니라 자기-항원에 노출되어 면역 반응성에 대한 기작을 가지게 된다. 따라서, Rossi, 등(Scand J Immunol 1999 Aug; 50 (2): 177-82)은 글리아딘(gliadin)의 비강 투여는 셀리악(celiac) 질환의 마우스 모델에서 항원에 대한 면역 반응을 하향 조절하는데 있어 정맥내 투여 만큼의 효과가 있음을 발견하였다. 유사하게, 아세틸콜린 수용체 항원에 대한 비강 노출은 근무력증의 마우스 모델에서 근육 약화 및 특이적 림파구 증식을 지연시키고 감소시키는 데 있어 구강 노출에 비해 효과적이다(Shi, FD. 등, J Immunol 1999 May 15; 162 (10): 5757-63). 따라서, 정맥내 또는 복강내 투여 뿐 아니라 점막 투여를 위해 의도된 면역원성 화합물은 비강 및 다른 투여 막 경로에 대해 최적으로 적용가능하여야 한다.

따라서, 신규하고, 잘 정의되며, 정맥내, 복강내 및 점막 투여에 있어 강화된 대사 안정성 및 효율적인 내성 면역원성을 나타내는 합성 산화 인지질 유도체에 대한 필요성이 있다.

산화 인지질의 합성

인지질의 개질은 다양한 용도로 사용되어 왔다. 예를 들면, 지질-용해성 활성 화합물을 갖는 인지질은 피부 투과 및 투과-막 용도의 조성물에 혼입될 수 있고(Fournerou 등의 미국 특허 제 5,985,292), 또한 인지질 유도체는 약물 전달을 위한 리포솜 및 바이오벡터(biovector)에 혼입될 수 있다(예를 들면, 각각 Kurtz 및 Betbeder 등의 미국 특허 제 6,261,597호 및 제 6,017,513호). 혈소판 활성 인자(PAF) 구조를 모방하는 개질된 인지질 유도체는 혈관 투과성, 혈압, 심장 기능 억제 등과 같은 기능을 수행하면서 다양한 장애 및 질환에 약제학적으로 활성인 것으로 알려져 있다. 이들 일군의 유도체는 항암성 활성을 가질 수 있다고 제안되어 왔다(Inoue 등의 미국 특허 제 4,778,912호.). 그러나, 미국 특허 제 4,778,912호에 개시되어 있는 화합물은 포스파티딜기에서보다 포스페이트 및 3차 아민 잔기 사이의 보다 긴 브릿지를 가지고 있기 때문에, 면역학적으로 산화 LDL과 유사할 것으로 기대되지는 않는다.

크로마토그래피 분리용으로 의도된 개질 인지질 에테르 유도체의 또 다른 일군이 개시되어 왔지만, 일부 생리학적 효과만을 가질 수 있다(Berchtold의 스위스 특허 제 642,665호).

인지질의 산화는 죽종성 플라크에 풍부한 자유 라디칼의 작용 및 효소 반응을 통해 생체 내에서 일어난다. 시험관 내에서, 산화 인지질의 제조는 통상적으로 천연 LDL 또는 LDL 인지질 성분의 단순한 화학적 산화와 관련이 있다. 산화 LDL의 역할을 연구하는 연구자들은 예를 들면 철 이온 및 아스코르브산(Itabe, H, 등, J. Biol. Chem. 1996; 271: 33208-217) 및 황산 구리(George, J. 등, Atherosclerosis. 1998; 138 : 147-152; Ameli, S. 등, Arteriosclerosis Thromb Vasc Biol 1996; 16: 1074-79)를 사용하여 플라크 성분과 관련이 있는 분자와 유사한 산화 또는 약간 산화된 인지질 분자를 제조하여 왔다. 유사하게 제조된 분자들이 죽종 형성과 관련된 자가-항원과 동일한 것으로 밝혀졌고(Watson A. D. 등, J. Biol. Chem. 1997; 272: 13597-607), 마우스에서 보호성 항-죽종 형성 면역 내성을 유도할 수 있다는 것이 밝혀졌다(1999년 9월 30일 출원된 Shoenfeld 등의 미국 특허 출원 제 09/806,400). 마찬가지로, Koike(미국 특허 제 5,561,052호)는 진단용의 산화 아라카돈산(arachadonic acid) 또는 리놀레인산 및 산화 LDL을 제조하기 위해 황산 구리 및 슈퍼옥사이드 디스무타아제(superoxide dismutase)를 사용하여 산화 지질 및 인지질을 생산하는 방법을 개시하고 있다. 그러나, 사용되는 산화 기술은 다양한 산화 생성물을 수득하며, 더 많은 정제 또는 불순한 항원성 화합물의 사용을 더 필요로 하는 등 비-특이적이다. 이는 정제되면, 천연 LDL과 보다 많은 관련성을 갖는다.

또한, 위에서 제조된 산화 인지질을 사용하는 생체 내 용도는 인체내에서 활성 성분의 인식, 결합 및 신진대사에 대해 민감하다는 단점이 있어, 투여량 및 투여 후 안정성이 심각하게 고려된다.

따라서, 신규한 합성 산화 인지질 및 개선된 합성 방법 및 상술한 문제점들이 없는 이들의 용도를 갖는 것이 매우 유리하다는 광범위한 인식이 있어 왔다.

본 발명은 죽상 경화증(Atherosclerosis) 및 관련 질환의 예방 및 치료를 위해 정의된, 산화 LDL (oxLDL) 성분에 관한 것으로, 보다 상세하게는 점막 내성(mucosal tolerance)을 유도하고 죽종성(atheromatous) 혈관 질환 및 후유증에 관여하는 염증 과정을 억제하는데 유효한 산화 인지질을 사용하는 방법 및 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 단지 예시만을 위한 첨부 도면을 참조로 하여 기재된다. 도면을 상세히 참조하면, 단지 본 발명의 바람직한 실시형태의 예로서 또한 예시적인 논의를 목적으로 제공되며, 본 발명의 원리 및 개념적 요지의 기재가 가장 유용하고 쉽게 이해되도록 하는 것을 위하여 제공됨이 강조된다. 이와 관련하여, 본 발명의 기본적인 이해를 위해 필요 이상으로 본 발명의 구조적인 내용을 나타내고자 하는 시도는 없으며, 이러한 기재 내용은 도면과 함께 본 발명의 몇몇 유형이 어떻게 구체화되는지 당업자가 명백하게 이해하도록 한다.

도 1은 2,5' 알데히드 렉틴 에테르, 1-헥사데실-2-(5'-옥소-펜타닐)-sn-글리세로-3-포스포콜린 에테르(D-ALLE에 대해) 또는 3-헥사데실-2-(5'-옥소-펜타닐)-sn-글리세로-1-포스포콜린 에테르(L-ALLE에 대해) (ALLE)의 합성을 나타내는 공정도이다;

도 2는 POVAC의 합성을 나타내는 공정도이다;

도 3은 ALLE의 D-이성질체 및 L-이성질체의 혼합물로 복강내 면역화시킴으로써 apoE-결핍 마우스에서 초기 죽상 경화증의 억제를 나타내는 그래프이다. 5-7주령의 apo-E 마우스는 정제된 투베르쿨린(tuberculin) 단백질 유도체(ALLE L+D) (n=6)와 결합된 ALLE의 D-이성질체 또는 L-이성질체의 혼합물 150㎍/마우스, 150㎍/마우스 정제된 투베르쿨린 단백질 유도체 단독(PPD) (n=5)으로 면역화 또는 비면역화(CONTROL) (n=7)하였다. 죽상 경화증은 제4 면역화 후 6주째 대동맥동(aortic sinus)에서 죽종성 병변 부위로서 표시한다;

도 4는 ALLE를 주입하여 유도된 구강 내성에 의해 apoE-결핍 마우스에서의 초기 죽종 형성의 억제를 나타내는 그래프이다. 8-10주령의 apo-E 마우스는 ALLE의 D-이성질체 및 L-이성질체의 혼합물이 주입되었고: 10㎍/마우스 (ALLE L+D 10㎍) (n=11) 또는 lmg/마우스 (ALLE L+D 1mg)(n=11)이 주입되었고; 또는 5일 동안 2일에 1번 PBS (대조군) (n=12)이 주입되었다. 죽종 형성은 최종 주입 후 8주째 대동맥동에서의 죽종성 병변 부위로서 표시한다;

도 5는 L-ALLE에 노출시켜 유도된 점막 내성에 의해 apoE-결핍 마우스에서의 초기 죽종 형성의 억제를 나타내는 그래프이다. 7-9주령의 apo-E 마우스는 5일 동안 2일에 1번씩 1mg/마우스 L-ALLE가 주입되거나(OT L-ALLE) (n=11) 또는 3일 동안 2일에 1번씩 L-ALLE 10㎍/마우스에 비강 노출하였다(NT L-ALLE) (n=11). 대조군 마우스는 PBS (PBS 구강) (n=12)의 동일 부피(0.2ml)로 주입하였다. 죽종 형성은 최종 구강 또는 비강 노출 후 8주째 대동맥동에서 죽종성 병변 부위로서 표시한다;

도 6은 합성 산화 인지질 L-ALLE 및 POVPC에 구강 노출에 의해 유도되는 죽상 경화성 플라크 항원에 대한 면역 반응성의 억제를 나타내는 그래프이다. 6주령의 웅성 apo-E 마우스를 L-ALLE(L-ALLE) (n=2) 1mg/마우스 또는 0.2ml PBS 중의 POVPC(POVPC)(n=3)을 5일 동안 2일에 1번 주입하였다. 최종 주입 후 1주째에, 마우스를 50㎍ 인간 산화 LDL 항원의 1회 피하 주사로 감작시켰다. 7일 후, 서혜부(inguinal) 림프절의 T-세포를 후술하는 재료 및 방법란에 기재한 바와 같이 얻고, 시험관 내 증식 평가를 위해 감작성(sensitizing) 인간 산화 LDL 항원에 대해 노출하였다. 면역 반응성을 나타내는 증식은 인간 산화 LDL 항원의 존재 및 부재하에서 T-세포의 DNA로의 표지된 티미딘의 혼입 사이의 비율로서 표시한다 (자극 지수, S. I.);

도 7은 합성 산화 인지질 D-ALLE, L-ALLE 또는 POVPC에 의해 유도되는 구강 내성에 의해 apoE-결핍 마우스에서의 후기-단계의 죽종 형성의 진행 억제를 나타내는 그래프이다. 24.5주령의 apo-E 마우스를 lmg/마우스의 L-ALLE(L-ALLE) (n=11), D-ALLE(D-ALLE) (n=9) 또는 POVPC (POVPC) (n=10)를 5일 동안 2일에 1번씩, 4주 간격으로 12주 동안 주입하였다. 대조군 마우스는 동일 부피(0.2ml) 및 PBS(대조군) (n=10)의 섭생(regimen)으로 주입하였다. 죽종 형성은 주입 전(시간 0)의 미처리한 24.5주령 마우스의 병변 스코어와 비교하여 최초 주입 후 12주째 대동맥동에서의 죽종성 병변 부위로서 표시한다;

도 8은 합성 산화 인지질 D-ALLE, L-ALLE 또는 POVPC을 주입함으로써 유도된 24.5주령의 apoE-결핍 마우스에서 VLDL의 트리글리세라이드 함량의 감소를 나타내는 그래프이다. 24.5주령의 apo-E 마우스에 lmg/마우스 L-ALLE (삼각형) (n=11), D-ALLE (역삼각형) (n=9) 또는 POVPC (사각형) (n=10)을 5일 동안 2일에 1번, 12주에 걸쳐 4주 간격으로 주입하였다. 대조군 마우스는 동일 부피(0.2ml) 및 PBS (원) (n=10)의 섭생으로 주입하였다. 트리글리세라이드 함량(Tg, mg/ml)을 후술하는 재료 및 방법란에 기재한 바와 같이 FPLC 상에서 전체 혈액 샘플의 분리 후 VLDL 분획에서 효소 색도법(enzymatic colorimetric method)으로 측정하였다;

도 9는 합성 산화 인지질 D-ALLE, L-ALLE 또는 POVPC을 주입함으로써 유도된 24.5주령의 apoE-결핍 마우스에서 VLDL의 콜레스테롤 함량의 감소를 나타내는 그래프이다. 24.5주령의 apo-E 마우스에 lmg/마우스 L-ALLE (삼각형) (n=11), D-ALLE (역삼각형) (n=9) 또는 POVPC (사각형) (n=10)을 5일 동안 2일에 1번, 12주에 걸쳐 4주 간격으로 주입하였다. 대조군 마우스는 동일 부피(0.2ml) 및 PBS (원) (n=10)의 섭생으로 주입하였다. 콜레스테롤(콜레스테롤, mg/ml)을 후술하는 재료 및 방법란에 기재한 바와 같이 FPLC 상에서 전체 혈액 샘플의 분리 후 VLDL 분획에서 효소 색도법(enzymatic colorimetric method)으로 측정하였다.

본 발명에 따르면, 하기 화학식을 갖는 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염이 제공된다:

상기 식에서,

(i) A_l및 A₂는 각각 독립적으로 CH₂및 C=O으로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 이때 A₁및 A₂중 하나 이상은 CH₂이며;

(ii) R₁및 R₂는 각각 독립적으로 길이가 1-27인 탄소의 알킬 사슬 및

로 이루어지는 군으로부터 선택되고,

X는 C_l-24사슬이며, Y는

-OH, -H, 알킬, 알콕시, 할로겐, 아세톡시 및 방향족 작용기로 이루어지는 군으로부터 선택되고;

Z는

및 -OH로 이루어지는 군으로부터 선택되며;

(iii) R₃는 H, 아실, 알킬, 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 에탄올아민, 포스파티딜 세린, 포스파티딜 카르디올리핀 및 포스파티딜 이니시톨로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

본 발명의 하기 바람직한 실시형태에 있어서, R₃이 비-포스파티딜 잔기이고, 따라서 상기 화합물이 디글리세라이드인 것을 특징으로 한다.

후술하는 본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, R₁및 R₂중 하나 이상은 하기 화학식인 것을 특징으로 한다.

상기 식에서,

X는 C_1-24사슬이고, Y는

Z는

및 -OH로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

본 발명의 또 다른 요지에 따르면, 필요한 대상에 죽상 경화증, 심혈관 질환, 뇌혈관(cerebrovascular) 질환, 말초 혈관 질환, 협착증(stenosis), 재협착증(restenosis) 및/또는 스텐트내 협착증(in-stent-stenosis)의 예방 및/또는 치료를 위한 활성 성분으로서 하기 화학식의 군으로부터 선택된 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염의 치료학적 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다:

상기 식에서

(i) A_l및 A₂는 각각 독립적으로 CH₂및 C=O으로 이루어지는 군으로부터 선택되고;

로 이루어지는 군으로부터 선택되고,

X는 C_l-24사슬이며, Y는

Z는

및 -OH로 이루어지는 군으로부터 선택되며;

상기 식에서,

X는 C_1-24사슬이고, Y는

-OH, -H, 알킬, 알콕시, 할로겐, 아세톡시 및 방향족 작용기로이루어지는 군으로부터 선택되고;

Z는

및 -OH로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

후술하는 본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, A_l및 A₂중 하나 이상은 CH₂인 것을 특징으로 한다.

후술하는 본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 분자는 ALLE로 알려져 있는 것을 특징으로 한다.

후술하는 본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 점막 투여를 통해 산화 LDL에 대한 내성 유도가 의도되는 것을 특징으로 한다.

후술하는 본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 비강, 구강, 피하 또는 복강내 투여 단독 또는 다른 자가 조절 경로와 조합한 투여인 것을 특징으로 한다.

후술하는 본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 화합물은 상기 대상에 있어 산화 LDL에 대한 면역 반응성을 감소시키는 것을 특징으로 한다.

후술하는 본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 죽상 경화증, 심혈관 질환, 뇌혈관 질환, 말초 혈관 질환, 협착증, 재협착증 및/또는 스텐트내 협착증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 장애를 예방및/또는 치료하는 용도로 포장되고 확인되는 것을 특징으로 한다.

후술하는 본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 HMG CoA 리덕타아제 억제제(Statins) 점막 보조제, 코르티코스테로이드, 항-염증성 화합물, 진통제(analgesic), 성장 인자, 독소 및 추가적인 내성 항원으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가적인 화합물의 치료학적 유효량을 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 요지에 따르면, 필요한 대상에 죽상 경화증, 심혈관 질환, 뇌혈관 질환, 말초 혈관 질환, 협착증, 재협착증 및/또는 스텐트내 협착증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 질환, 증후군 또는 이상 상태의 예방 및/또는 치료를 위한 조성물로서, 활성 성분으로서 합성 LDL 유도체 또는 약제학적으로 허용되는 이들의 염의 치료학적 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 더 포함하는 조성물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 요지에 따르면, 필요한 대상에 죽상 경화증, 심혈관 질환, 뇌혈관 질환, 말초 혈관 질환, 협착증, 재협착증 및/또는 스텐트내 협착증을 예방 및/또는 치료하기 위한 방법으로서, 하기 화학식을 갖는 군으로부터 선택되는 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염의 치료학적 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 투여하는 것을 포함하는 방법이 제공된다:

상기 식에서,

(ii) R₁또는 R₂는 각각 독립적으로 길이가 1-27인 탄소의 알킬 사슬 및

로 이루어지는 군으로부터 선택되고,

X는 C_l-24사슬이며, Y는

Z는

및 -OH로 이루어지는 군으로부터 선택되며;

상기 식에서,

X는 C_1-24사슬이고, Y는

Z는

및 -OH로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

후술하는 본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 화합물은 1-헥사데실-2-(5'-옥소-펜타닐)-sn-글리세로-3-포스포콜린 에스테르, 3-헥사데실-2-(5'-옥소-펜타닐)-sn-글리세로-1-포스포콜린 및 이들의 라세믹(racemic) 혼합물(ALLE)인 것을 특징으로 한다.

후술하는 본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 화합물은 점막 투여에 의해 투여되는 것을 특징으로 한다.

후술하는 본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 조성물의 투여는 비강, 구강, 피하 또는 복강내 투여 단독 또는 다른 자가 조절 경로와 조합한 투여인 것을 특징으로 한다. 후술하는 본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 화합물은 상기 대상에 있어 산화 LDL에 대한 면역 반응성을 감소시키는 것을 특징으로 한다.

후술하는 본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 화합물은 HMG CoA 리덕타아제 억제제(Statins), 점막 보조제, 코르티코스테로이드, 항-염증성 화합물, 진통제, 성장 인자, 독소 및 추가적인 내성 항원으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가적인 화합물의 치료학적 유효량 이외에 투여되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 요지에 따르면, (a) 하나 이상의 지방산 측쇄가 단일-불포화된 지방산인 2개의 지방산 측쇄를 포함하는 인지질 주쇄를 제공하고; (b) 상기 단일-불포화된 지방산의 2중 결합을 산화시켜 산화 인지질을 형성하는 것을 포함하는 산화 인지질의 합성 방법이 제공된다.

후술하는 본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 인지질 주쇄는 H, 아실, 알킬, 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 에탄올아민, 포스파티딜 세린, 포스파티딜 카르디올리핀 및 포스파티딜 이니스톨로 이루어지는 군으로부터 선택되는 잔기를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

후술하는 본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 단일 불포화된 지방산은 C_2-l5인 것을 특징으로 한다.

후술하는 본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 산화 인지질은 l-팔미토일-2-옥소발레로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POVPC)이고, 상기 단일-불포화된 지방산은 5-헥센산인 것을 특징으로 한다.

본 발명은 예를 들면 신규한 산화 인지질인 POVPC 및 ALLE와 같은 합성 산화 LDL 유도체를 사용하여 산화 LDL에 대한 면역 내성을 유도하는 방법을 제공함으로써 현재까지 알려진 종래 기술의 단점을 성공적으로 해결하고 있다.

바람직한 실시형태의 기재

본 발명은 점막 내성을 유도하고 죽종성 혈관 질환 및 후유증에 관여하는 염증 과정을 억제하는데 효과적인 합성 산화 인지질의 사용 방법 및 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 원리 및 작동은 도면과 다음의 기재 내용을 참조로 하면, 보다 잘 이해될 것이다.

본 발명의 하나 이상의 실시형태를 상세히 설명하기 전에, 후술하는 기재 내용 및 실시예에 의해 예시되어 있는 용도로 본 발명이 한정되지 않음은 물론이다.

본 발명은 다른 실시형태를 가질 수 있거나 다양한 방법으로 실시 또는 수행될 수 있다. 또한, 술어 및 용어들은 기재를 목적으로 하는 것이며, 한정의 의미로서 간주되어서는 안됨은 물론이다.

실험 및 임상적인 증거는 죽상 경화증에서 과다한 염증성 반응의 병인학(etiology)에서 산화 LDL 및 LDL 성분에 대한 원인적 역할을 나타낸다. 산화 LDL과 관련이 있는 플라크에 대한 세포성 및 체액성 면역 반응성은 죽종 형성에서 중요한 항-산화 LDL 자가 면역 성분을 암시하면서 증명되었다. 따라서, 산화 LDL 및 그 성분은 심장 질환, 뇌-혈관 질환 및 말초 혈관 질환의 예방 및 치료용의 다양한 치료의 타겟이 되어 왔다.

비록 종래 기술이 LDL의 경구 투여가 죽종 형성을 30% 감소시킬 수 있음을 개시하고 있지만, 이러한 보호 효과는 Cu⁺⁺로 긴 산화 과정 처리한 원심분리된 인간 혈청 LDL의 여과, 정제로 이루어진 조 항원 제제의 투여 후 관찰되었다. 죽종 형성의 유의적인 억제가 구강 내성을 통해 달성되어도, 특이적 지질 항원 또는 면역원 LDL 성분의 어떠한 확인도 이루어진 바가 없다. 겪게 되는 또 다른 장애는 간 및 세포 면역 기작에 의해 산화 LDL의 효소 활성 및 흡수에 의한 조 산화 LDL의 생체 내 고유한 불안정성이었다.

본 발명을 실시하는 동안, 본 발명자들은 잘 정의된 합성 산화 LDL 유도체의 투여가 산화 LDL에 대해 면역 내성을 유도할 수 있고 따라서 상술한 문제점들을 피하면서 죽종 형성을 억제할 수 있음을 밝혔다.

따라서, 본 발명의 요지에 따르면, 인간과 같은 대상에 있어 산화 LDL에 대한 면역 내성을 유도하는 방법이 제공된다. 이러한 면역 내성은 죽상 경화증, 죽상 경화성 심혈관 질환, 뇌혈관 질환, 말초 혈관 질환, 협착증, 재협착증 및 스텐트내 협착증을 포함하는 플라크 형성과 관련한 장애를 예방 및 처리하기 위해 사용될 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 죽상 경화성 심혈관 질환의 몇몇 비-제한적 예로서는, 심근 경색(infarction), 급성 관성 증후군, 충혈성 심장 기능 부전, 협심증(angina pectoris) 및 심근 허혈이 있다. 말초 혈관 질환의 몇몇 비-제한적인 예로서는, 괴저, 당뇨병 맥관병(Diabetic vasculopathy), 허혈성 장 질환, 혈전증(thrombosis), 당뇨병 망막증(Diabetic retinopathy) 및 당뇨병신증(nephropathy)이 있다. 뇌혈관 질환의 비제한적인 예로서는, 뇌졸중, 뇌혈관 염증, 뇌출혈(cerebral hemorrhage) 및 척추골 동맥 부전증(arterial insufficiency)이 있다. 협착증은 통상적으로 죽종성 플라크 및 강화된 혈소판 활성에 의해 유발되는 혈관 구조(vasculature)의 폐색성 질환로서, 관상 혈관 구조에 가장 위험한 영향을 준다. 재협착증은 종종 협착성 혈관 구조에서의 폐색의 감소 후 발생하는 재-폐색이다. 혈관 구조의 개방(patency)이 스텐트의 기계적 지지를 필요로 하는 경우, 스텐트내 협착증이 치료된 혈관의 재폐색을 일으킬 수 있다.

후술하는 실시예 부분에서 상세히 설명하는 바와 같이, 본 발명의 요지에 따른 방법은 산화 인지질의 합성 에스테르 유도체(이하, 에스테르화 산화 인지질로 언급한다)의 치료학적 유효량을 대상에 투여함으로써 실시된다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 산화 인지질의 에스테르 유도체의 비-제한적 예는 POVPC(전체 화학식은 하기 실시예 부분을 참조할 것), POVPC, PGPC(Watson, AD 등 J. Biol. Chem. 1997 272: 13597-607 참조) 및 하기 화학식을 갖는 유도체를 포함한다:

상기 식에서,

(i) A_l및 A₂는 C=O이고,

로 이루어지는 군으로부터 선택되고,

X는 C_l-24사슬이며, Y는

Z는

및 -OH로 이루어지는 군으로부터 선택되며;

본 명세서에서 사용되는 용어 "C_l-n"는 n-1 탄소의 사슬에 공유 결합되는 탄소원자로 이루어지는 탄소 주쇄로서 정의된다.

본 발명의 또 다른 실시형태에서, R₃은 비-포스파티딜 잔기로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 그 결과 얻어지는 화합물은 인지질이 아니라 디글리세라이드 화합물이다. 이러한 디글리세라이드 화합물은 유사한 구조적 특성을 가지며, 이와 같이 모든 경우에 있어서 항원성 및 면역 내성 활성을 가질 것이다. 따라서, 이들 화합물은 또한 죽상 경화증 관련 장애의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있으며, 본 명세서에 기재되어 있는 산화 인지질 유도체와 유사하게 사용 및 적용될 수 있다.

최근에는, 인지질 및 인지질 대사 산물이 병인학에서 명백히 관련이 있어 왔으며, 따라서 추가적인 비-죽상 경화증-관련 질환의 잠재적인 치료와도 관련이 있다. 이러한 질환 및 증후군은 노화의 산화적 스트레스(Onorato JM, 등, Annal N Y Acad Sci 1998 Nov 20; 854: 277-90), 류마티스성 관절염(RA) (Paimela L, 등. Ann Rheum Dis 1996 Aug; 55 (8): 558-9), 소아 류마티스성 관절염(Savolainen A, 등, 1995; 24 (4): 209-11), 염증성 장 질환(IBD) (Sawai T, 등, Pediatr Surg Int 2001 May; 17 (4): 269-74) 및 신장암(Noguchi S, 등, Biochem Biophys Res Commun 1992 Jan 31; 182 (2): 544-50)을 포함한다. 따라서, 본 발명의 방법은 노화, RA, 소아 RA, IBD 및 암과 같은 비-죽상 경화증 관련 질환의 예방 및/또는 치료를 위해 사용될 수 있다.

합성 에스테르화 산화 인지질은 종래 기술의 방법을 사용하여 합성될 수 있다(Ou Z., Ogamo A., Guo L., Konda Y., Harigaya Y. and Nakagawa Y. Anal.Biochem. 227: 289-294, 1995).

이와 달리 또한 바람직하게는, 본 발명의 상기 요지에 의해 사용되는 산화 인지질의 합성 에스테르 유도체는 신규한 합성 방법을 사용하여 합성된다.

따라서, 본 발명의 또 다른 요지에 따르면, 에스테르화 산화 인지질의 합성 방법이 제공된다. 상기 방법은 먼저 하나 이상의 지방산 측쇄가 단일-불포화 지방(바람직하게는 C_2-15)산인 2개의 지방산 측쇄를 포함하는 인지질 주쇄를 제공하고, 단일-불포화 지방산의 2중 결합을 산화시켜, 에스테르화 산화 인지질을 제조함으로써 실시된다.

본 발명의 개시 내용에 따른 에스테르화 산화 인지질의 합성에 적합한 인지질 주쇄의 예로서는, 2개의 지방산 측쇄를 포함하는 레시틴 및 단일 측쇄를 포함하고 따라서 산화시키기 전에 추가적인 지방산 측쇄를 첨가하는 추가적인 합성 단계를 거쳐야 하는 리소레시틴(lysolecithin)을 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

POVPC을 합성하기 위해 사용할 때, 인지질 주쇄는 단일-불포화 지방산 측쇄로서 5-헥센산을 포함한다.

이러한 신규한 합성 방법은 종래의 합성 방법에 비해 몇몇 이점을 제공한다. 상기 합성 방법에서, 원하는 길이 및 구조를 가진 정의된 단일-불포화 산은 리소레시틴 주쇄를 가진 분자와 반응하여 이후 원하는 2중 결합에서 산화되는 단일-불포화 인지질이 제조된다.

상기 신규한 방법의 이점은 그 특이성과 단순성에 있다. 레시틴 주쇄를 갖는 단일-불포화 인지질을 산화시키면, 원하는 단일의 특정 생성물이 얻어지고, 따라서 상업적인 제품의 처리 및 정제가 훨씬 더 효율적이게 된다.

이러한 반응은 특이적이고, 복잡한 분리 및 정제를 실시할 필요가 없이 원하는 산화 인지질을 제공한다.

또한, 이러한 방법을 사용하면, 사슬의 말단에 2중 결합을 갖는 단일-불포화 인지질의 산화에 의해 합성 경로 중에 실질적으로 짧은 불포화 산 사슬을 사용할 수 있으면서 산화 인지질을 설계 및 합성할 수 있다. 이러한 단일-불포화 짧은 산 사슬은 상대적으로 저렴하여, 합성과 관련된 비용을 절감할 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 합성 방법은 대규모 제조 공정에 대해 편리하게 적용가능하다.

본 발명의 개시 내용에 따른 에스테르화 산화 인지질의 합성의 상세한 기재 내용이 후술하는 실시예 부분에서 제공된다.

실시예 부분에 명백하게 나타낸 바와 같이, 면역 내성은 또한 산화 인지질 에테르(이하, 에테르화 산화 인지질로서 칭함)에 의해 확립될 수 있다.

따라서, 본 발명의 또 다른 요지에 따르면, 산화 인지질 에테르를 대상체에 투여함으로써 실시되는 산화 LDL에 대한 면역 내성을 유도하는 방법(따라서 죽상 경화증 및 다른 관련 장애를 치료하는 방법)이 제공된다.

본 발명의 요지에 의해 사용가능한 산화 인지질 에테르의 일례는 ALLE[(바람직하게는 1-헥사데실-2-(5'-옥소-펜타닐)-sn-글리세로-3-포스포콜린 에테르(D-ALLE) 및 3-헥사데실-2-(5'-옥소-펜타닐)-sn-글리세로-1-포스포콜린 에테르(L-ALLE)의 혼합물]이고, 그 합성 및 용도는 후술하는 실시예에서 보다 상세히 기재된다.

본 명세서에 기재된 면역 내성 유도 화합물은 그 자체로 또는 적합한 담체 또는 부형제와 혼합한 약제학적 조성물로 투여될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "약제학적 조성물"은 생리학적으로 적합한 담체 및 부형제와 같은 다른 화학 성분을 갖는 본 명세서에 기재되어 있는 하나 이상의 활성 성분의 제제를 의미한다. 약제학적 조성물의 목적은 화합물을 유기체에 쉽게 투여하기 위함이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "활성 성분"은 생물학적 효과를 설명할 수 있는 화합물(예를 들면, POVPC 또는 ALLE)을 의미한다.

이하, 혼용하여 사용될 수 있는 용어 "생리학적으로 허용되는 담체" 및 "약제학적으로 허용되는 담체"는 유기체에 유의적인 자극을 유발하지 않고, 투여된 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미한다. 보조제(adjuvant)가 이 용어에 포함된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "부형제"는 활성 성분의 투여를 보다 용이하게 하기 위한 약제학적 조성물에 첨가되는 불활성 물질을 의미한다. 그 예들로서는, 탄산칼슘, 인산칼슘, 각종 당류 및 전분류, 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 식물성 오일 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

약물의 제형화 및 투여 기술은 본 명세서에 참고 문헌으로서도 포함되어 있는 "Remington's Pharmaceutical Sciences" Mack Publishing Co., Easton, PA,latest edition"에서 찾아볼 수 있다.

적절한 투여 경로는 예를 들면 경구, 직장, 경점막(transmucosal), 특히 경비강(transnasal), 장내 또는 근육내, 피하 및 골간(intramedullary) 주사 뿐 아니라, 지주막하(intrathecal), 직접 뇌실내(intraventricular), 정맥내, 복강내, 비강내(intranasal), 또는 수정체간(intraocular) 주사를 포함하는 비경구 전달을 포함할 수 있다.

이와 달리, 전신 투여 방식, 예를 들면 환자의 조직 부위에 직접 약제학적 조성물을 주입하는 것 보다는 국소 투여 방식으로 상기 약제학적 조성물을 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 본 기술 분야에 잘 알려진 공정, 예를 들면 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 당의정(dragee)화, 연화제화, 유제화, 캡슐화, 포집 또는 동결건조 공정에 의해 제조될 수 있다.

따라서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 약제학적 조성물은 활성 성분을 제제로 가공하는 것을 용이하게 하고, 약제학적으로 사용될 수 있는 부형제 및 보조제를 포함하는 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 담체를 사용하여 통상적인 방식으로 제형화될 수 있다. 적절한 제형화는 선택된 투여 경로에 따라 다르다.

주사제의 경우, 약제학적 조성물의 활성 성분은 수용액, 바람직하게는 행크스 용액(Hank's solution)과 같은 생리학적으로 상용성이 있는 완충액에서 제형화될 수 있다. 경점막(transmucosal) 투여를 위해, 침투시킬 장벽에 적절한 침투제(penetrant)가 제형을 위해 사용된다. 이러한 침투제는 본 기술 분야에 일반적으로 알려져 있다.

경구 투여를 위해, 약제학적 조성물은 본 기술 분야에 잘 알려진 약제학적으로 허용되는 담체와 활성 화합물을 조합하여 쉽게 제조될 수 있다. 이러한 담체는 환자에 의한 경구 섭취를 위해 정제, 알약, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 현탁제 등으로서 제형화할 수 있다. 경구 사용을 위한 생리학적 제제는 정제 또는 당의적 핵을 얻기 위해 고형 부형제를 사용하고, 경우에 따라 필요한 경우 적합한 보조제를 첨가한 후 얻어지는 혼합물을 분쇄하고, 과립 혼합물을 가공하여 제조될 수 있다. 적합한 부형제는 특히 락토오스, 수크로오스, 만니톨 또는 소르비톨을 포함하는 슈가와 같은 충전제; 예를 들면 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 트라가칸트 검, 메틸 셀룰로오스, 히드록시프로필메틸-셀룰로오스, 소듐 카르보메틸셀룰로오스와 같은 셀룰로오스 제제; 및/또는 폴리비닐피롤리돈(PVP)과 같은 생리학적으로 허용되는 폴리머이다. 필요한 경우, 가교된 폴리비닐피롤리돈, 한천 또는 알긴산 또는 알킨산 나트륨과 같은 그의 염과 같은 붕해제를 첨가할 수 있다.

당의정 코어는 적합한 코팅으로 제공된다. 이를 위해, 선택적으로 아라비아 검, 활석, 폴리비닐 피롤리돈, 카르보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜, 티타늄 디옥사이드, 래커 용액 및 적합한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 함유할 수 있는 진한 설탕액이 사용될 수 있다. 염료 또는 안료가 활성 화합물 투여량의 상이한 조합을 확인 또는 특성화하기 위해 정제 또는 당의정 코팅에 첨가될 수 있다.

경구적으로 사용될 수 있는 약제학적 조성물은 젤라틴으로 제조된푸쉬-핏(push-fit) 캡슐 뿐 아니라, 젤라틴 및 글리세롤 또는 소르비톨과 같은 가소제로 제조된 연질, 밀봉된 캡슐을 포함한다. 상기 푸쉬-핏 캡슐은 활성 성분과 함께 락토오스와 같은 충전제, 전분과 같은 결합제, 활석 또는 스테아르산 마그네슘과 같은 윤활제, 및 선택적으로 안정화제를 혼합하여 함유할 수 있다. 연질 캡슐에서, 상기 활성 성분은 지방 오일, 액상 파라핀, 또는 액상 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적절한 액체에 용해 또는 현탁될 수 있다. 경구 투여를 위한 모든 제형은 선택된 투여 경로에 대해 적합한 투여이어야 한다.

구강(buccal) 투여를 위해, 상기 조성물은 종래의 방식으로 제형된 정제 또는 마름모꼴 정제(lozenge) 형태를 가질 수 있다.

비강 흡입에 의한 투여를 위해, 본 발명에 따라 사용하기 위한 활성 성분은 적합한 추진제(propellant) 예를 들면 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로디플루오로메탄, 디클로로-테트라플루오로에탄 또는 이산화탄소의 사용과 함께 가압 팩(pack) 또는 분무기로부터의 에어로졸 분무 형태로 편리하게 전달된다. 가압 에어로졸의 경우, 투여 단위는 계량된 양을 전달하기 위한 밸브를 제공함으로서 결정될 수 있다. 캡슐 및 예를 들면 분배기(dispenser)에서 사용하기 위한 젤라틴의 카트리지는 상기 화합물 및 락토오스 또는 전분과 같은 적절한 분말 기재의 분말 혼합물을 함유하여 제형될 수 있다.

본 명세서에 기재되어 있는 약제학적 조성물은 예를 들면 순간(bolus) 주사 또는 연속 주입에 의해 비경구 투여를 위해 제형화될 수 있다. 주사를 위한 제형은 단위 투여 형태, 예를 들면 경우에 따라 보존제가 첨가된 앰플 또는 다중 투여용기로 제공될 수 있다. 상기 조성물은 유성 또는 수성 부형제(vehicle) 중의 현탁액, 용액 또는 유제일 수 있고, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형 제제를 함유할 수 있다.

비경구 투여를 위한 약제학적 조성물은 수용성 형태로 활성 제제의 수용액을 포함한다. 또한, 활성 성분의 현탁액은 적절한 유성 또는 수성 기재 주사 현탁액으로서 제조될 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 부형제는 참기름 또는 에틸 올레에이트, 트리글리세라이드 또는 리포솜과 같은 합성 지방산 에스테르와 같은 지방성 오일을 포함한다. 수성 주사 현탁액은 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스, 소르비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 함유할 수 있다. 경우에 따라, 상기 현탁액은 또한 고농도 용액을 제조하기 위해 활성 성분의 용해도를 증가시키는 적합한 안정화제 또는 제제를 함유할 수 있다.

이와 다르게, 상기 활성 성분은 사용하기 전에 예를 들면 무-피로겐(pyrogen) 수성 기재 용액과 같은 적합한 부형제으로 구성화하기 위한 분말 형태일 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 또한 예를 들면 코코아 버터 또는 다른 글리세라이드와 같은 종래의 좌약 기재를 사용하여 좌약 또는 배변 관장제(retension enema)와 같은 직장용 조성물로 제형화될 수 있다.

본 발명의 내용에 비추어 사용하기 적합한 약제학적 조성물은 활성 성분이 의도된 목적을 달성하기에 유효한 양으로 함유되어 있는 조성물을 포함한다. 보다 구체적으로, 치료학적 유효량은 장애(죽상 경화증)의 징후를 예방, 경감 또는 완화하거나 처리할 대상의 생존을 연장하기에 유효한 활성 성분의 양을 의미한다.

치료학적 유효량의 결정은 특히 본 명세서에 기재되어 있는 상세한 설명에 비추어 본 기술 분야의 당업자의 능력 안에 있다.

본 발명의 방법에서 사용되는 임의의 제제에 대해, 치료학적 유효량 또는 유효 투여량은 시험관 내 및 세포 배양 분석으로부터 최초로 평가될 수 있다. 예를 들면, 투여량은 동물 모델에서 계산되어, 원하는 농도 또는 역가를 달성할 수 있다. 이러한 정보는 인간에 있어 유효 투여량을 보다 정확히 결정하기 위해 사용될 수 있다.

본 명세서에 기재되어 있는 활성 성분의 독성 및 치료학적 효능은 시험관 내, 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 약제학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 시험관 내 및 세포 배양 및 동물 연구에서 얻어진 데이터는 인간에서 사용하기 위한 투여 범위를 계산화하는데 있어 사용될 수 있다. 상기 투여는 사용된 투여 형태 및 사용된 투여 경로에 따라 다양할 수 있다. 정확한 제형, 투여 경로 및 투여는 환자의 상태를 감안하여 의사에 의해 선택될 수 있다(예를 들면 Fingl, 등., 1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p. l 참조).

투여량 및 투여 간격은 개별적으로 조절되어 죽종 형성을 유도 또는 억제하기에 충분한 활성 성분의 혈장 또는 뇌 수준을 제공할 수 있다(최소 유효 농도, MEC). 상기 MEC는 각 제제에 대해 다양하지만, 시험관 내 데이터로부터 예상할 수 있다. MEC를 달성하기에 필요한 투여는 개인의 특성 및 투여 경로에 따라 다양할 것이다. 혈장 농도를 결정하기 위해 검출 분석이 사용될 수 있다.

처리할 상태의 경중 및 반응성에 따라서, 단일 또는 복수의 투여 형태일 수 있으며, 치료가 유효하거나 질환 상태의 감소가 달성될 때까지 치료 경과는 수일 내지 수주일간 지속된다.

물론, 투여될 조성물의 양은 치료 대상, 질환의 경중, 투여 방식, 처방 의사의 판단 등에 따라 다를 것이다.

본 발명의 조성물은 필요한 경우 활성 성분을 함유하는 1 이상의 단위 투여를 함유할 수 있는 FDA 승인된 키트(kit)와 같은 팩 또는 분배기로 제공될 수 있다. 이러한 팩은 예를 들면 블리스터(blister) 팩과 같은 금속 또는 플라스틱박을 포함한다. 상기 팩 또는 분배기는 투여 지침이 포함될 수 있다. 상기 팩 또는 분배기는 또한 약제의 제조, 사용 또는 판매를 규정하는 정부 당국에 의해 처방된 형태로 용기와 함께 관련 통지서가 포함될 수 있으며, 상기 통지서는 조성물의 형태 또는 인간 또는 동물에 관한 관련 당국의 승인 내용을 반영한다. 예를 들면, 이러한 통지서는 처방 약물에 대한 미국 식품 의약국에 의해 승인된 표지 또는 승인된 제품의 삽입물을 가질 수 있다. 상용성이 있는 약제학적 담체로 제형화된 본 발명의 제제를 포함하는 조성물이 또한 제조되어, 적절한 용기 내에 위치되며, 지정된 이상 상태의 치료를 위해 표지될 수 있다.

본 발명은 산화 LDL의 생물학적으로 유도된 형태를 활용하여 치료에 고유한 문제점이 전혀 없이 산화 인지질의 합성 유도체가 대상체의 죽상 경화증을 예방 및 치료하기 위해 사용될 수 있음을 최초로 증명하고 있다.

본 발명은 또한 에스테르화된 산화 인지질을 합성하기 위한 새로운 접근법을제공한다. 본 발명은 또한 죽상 경화증 및 그 관련 장애의 치료에 사용가능한 산화 인지질 에테르의 신규한 형태를 제공한다.

본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아닌 하기 실시예를 실시할 때, 본 발명의 추가적인 목적, 이점 및 신규한 특징은 본 기술 분야의 당업자에게는 명백하게 될 것이다. 부가적으로, 상술한 바와 같은 또한 청구범위에 기재되어 있는 바와 같은 본 발명의 다양한 실시형태 및 요지는 하기 실시예에서 실험적으로 뒷받침된다.

상기 기재 내용과 함께 하기 실시예를 참조로 하여 비-한정 방식으로 본 발명을 설명한다.

일반적으로, 본 발명에서 사용되고 있는 명명 및 실험 절차는 생화학 및 면역학적 기술을 포함한다. 이러한 기술들은 문헌에 상세히 설명되어 있다. 예를 들면 "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes 1-111 Coligan J. E., ed. (1994); Stites 등.(eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980); 사용 가능한 면역 분석은 특허 및 과학 논문에 광범위하게 기재되어 있다. 예를 들면, 미국 특허 제 3,791,932호; 3,839,153호; 3,850,752호; 3,850,578호; 3,853,987호; 3,867,517호; 3,879,262호; 3,901,654호; 3,935,074호; 3,984,533호; 3,996,345호; 4,034,074호; 4,098,876호; 4,879,219호; 5,011,771호 및 5,281,521호 참조; 및"Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; Marshak 등., 이들 모두는 본 멩서서에 전체적으로 포함된다. 다른 일반적인 참고 문헌들도 본 명세서 전반에 제공되어 있다. 이들 문헌에 나와 있는 절차들은 본 기술 분야에서 잘 공지되어 있는 것으로 믿어지며, 독자의 편의를 위해 제공된다. 이들 문헌에 포함되어 있는 모든 정보는 본 명세서에 포함된다.

일반적 재료 및 방법

동물

본 실험에서 사용된 apo-E 결핍 마우스는 죽상 경화증 경향의 균주 C57BL/6J-Apoe^tm1unc로부터 얻었다. Apoe^tmlunc돌연변이를 위한 마우스 접합체(homozygous)는 연령과 성에 의해 영향을 받지 않는 혈장내 총 콜레스테롤 수준의 현저한 증가를 나타낸다. 근위(proximal) 대동맥에서의 지방 선조는 3월령에서 발견된다. 병변은 연령에 따라 증가하였고, 전-죽상 경화성 병변의 보다 진행된 단계에서 전형적인 보다 적은 지질 그러나 보다 많은 연장된 세포를 갖는 병변으로 진행된다.

균주 성장: Apoe^tmlunc돌연변이 균주를 University of North Carolina at Chapel Hill의 Nobuyo Maeda 박사의 연구실에서 성장시켰다. 129-유도된 E14Tg2a ES 세포주를 사용하였다. 사용 플라스미드를 pNMC109로 지정하고, 그 파운더 라인(founder line)을 T-89로 지정한다. C57BL/6J 마우스 (11,12)에 대해 10번Apoe^tmlunc돌연변이를 역교배(backcrossing) 함으로써 C57BL/6J 균주를 얻었다.

상기 마우스를 22~24℃에서 12-시간 명/암 주기 상에서 Sheba Hospital Animal Facility(Tel-Hashomer, 이스라엘)에서 유지하고, 0.027% 콜레스테롤, 약 4.5% 총 지방 및 임의 량의(ad libitum) 물을 함유하는 실험실 식품(Purina Rodent Laboratory Chow No. 5001)의 정상 지방 식이를 공급하였다.

면역화:

I. ALLE에 의한 복강내 면역화: 인지질 에테르 유사체(ALLE D+L)를 1.6/1의 비율로 투베르쿨린(PPD)으로부터의 정제된 단백질 유도체에 결합하였다. ALLE(D+L)의 모액을 에탄올(99 mg/ml)에 용해시켰다. 모액으로부터 5 mg ALLE(D+L), 50.5㎕를 빙냉하 교반하여 0.25M 포스페이트 완충액, pH 7.2으로 5mg/ml까지 희석하였다. 300㎕의 포스페이트 완충액 중의 1.5 mg의 D- 및 L-ALLE을 300㎕의 포스페이트 완충액 중에 용해되어 있는 0.6mg의 PPD에 첨가하였다. 물 50㎕에 용해되어 있는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드-HCl (5 mg; Sigma, St. Louis, MO)을 20분동안 4℃에서 교반하면서 첨가하였다. 잔류 활성 부위를 100㎕의 1M 글리신으로 차단하였다. 결합된 화합물을 포스페이트 완충된 식염수(PBS)에 대해 투석하고, PBS로 3ml까지 조절하며, 4℃에서 보관하였다. 마우스 당 0.3ml (150㎍) 항원에 의한 면역화는 2주 마다 4번씩 복강내 실시하였다.

II. 인간 산화 LDL에 의한 피하 면역화: 인간 산화 LDL을 인간 혈장풀(pool)로부터 얻고(한외여과에 의해 d-1.019 내지 1.063g/ml), 밤새 Cu-산화하였다(1mg/ml 농도로 먼저 희석한 LDL의 각 ml에 15㎕의 1mM CuS0₄를 첨가함으로써). 산화 LDL을 식염수-Tris-EDTA에 대해 투석하고 여과하였다. 면역화를 위해, 산화 LDL를 PBS에 용해시키고, 동일 부피의 프로인트 불완전 보조제(Freund's incomplete adjuvant)와 혼합하였다. 0.2ml 부피로 50㎍ 항원/마우스의 단일 피하 주사하여 면역화를 실시하였다. 최종 경구 투여 후 1 내지 3일 째에, 마우스를 1회 면역화하고, 면역화 7-10일째에 희생시켰다.

콜레스테롤 수준 결정: 실험 종료시, 1-1.5ml의 혈액을 심장 천자(puncture)하여 얻고, 1000U/ml 헤파린을 각 샘플에 첨가하고, 총 혈장 콜레스테롤 수준을 자동화 효소 기술(Boehringer Mannheim, Germany)을 사용하여 결정하였다.

FPLC 분석: 콜레스테롤 및 지질단백질의 지질 함량의 Fast 단백질 액체 크로마토그래피 분석을 FPLC 장치(Pharmacia LKB. FRAC-200, Pharmacia, Peapack, NJ)으로 Superose 6 HR 10/30 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech, Inc, Peapack, NJ)을 사용하여 실시하였다. 300㎕의 최소 샘플 부피(3마리의 마우스로부터 전체 혈액을 1:2로 희석하고 로딩 전에 여과함)가 200㎕ 샘플 루프(loop)를 완전히 채우기 위해 자동 샘플러(sampler)에 대해 샘플링 바이알(vial)에서 요구되었다. 각 분획이 0.5ml를 함유하는 분획 10-40을 회수하였다. 각 분획으로부터 250㎕ 샘플을 각각 새로 준비한 콜레스테롤 시약 또는 트리글리세라이드 시약과 혼합하고, 5분 동안37℃에서 배양하며, 500nm에서 분광학적으로 분석하였다.

죽상 경화증의 분석: 상술한 바와 같이, 대동맥동에서의 병변 크기를 계산하고(16), 대동맥에서의 병변 크기를 계산함으로써 죽상 경화성 지방 선조 병변의 정량화를 실시하였다. 간단히 말해, 식염수 트리스 EDTA로 관주한 후, 심장 및 대동맥을 동물로부터 제거하고, 말초 지방을 조심스럽게 세척하였다. 심장의 윗 부분을 OCT 배지(10.24% w/w 폴리비닐 알코올; 4.26% w/w 폴리에틸렌 글리콜; 85.50% w/w 비반응성 성분)에 매립하고 동결시켰다. 전체 대동맥동(400㎛)에 걸쳐 모든 다른 절편(10㎛ 두께)을 취해 분석하였다. 대동맥동의 말초 부분은 심장과 대동맥의 인접 부분인 3개의 판막 첨판(valve cusp)에 의해 인식되었다. 오일-레드 O(oil-red O)로 염색한 후, 절편을 지방 선조 병변에 대해 평가하였다. 그리드(17) 상에서 단편 당 병변 영역을 미확인된 숫자를 가진 표본을 계수하는 관찰자에 의해 스코어링하였다. 대동맥을 심장으로부터 떼내고, 부정(adventitious) 조직을 제거하였다. 대동맥의 고정 및 혈관의 Sudan 염색을 상술한 바와 같이 실시하였다(21).

증식 분석: 죽상 경화증의 평가를 위해 마우스에 ALLE, POVPC 또는 PBS를 주입한 다음, 상술한 바와 같이 정제된 인간 LDL로부터 얻은 산화 LDL을 최종 주입한 후 1일째에 면역화하였다.

산화 LDL로 면역화한 후 8일 째에 증식을 다음과 같이 평가하였다: 비장 또는 림프절을 100 메쉬 스크린 상에서 조직을 체질하여 얻었다(면역화가 실시된 림프절 및 어떠한 면역화도 실시되지 않은 비장). 적혈구를 30초 동안 차가운 2차증류수(6ml)로 용균하고, 2ml의 NaCl 3.5%를 첨가하였다. 불완전 배지를 첨가하고(10ml), 세포를 7분 동안 1,700rpm으로 원심분리하며, RPMI 배지에서 재현탁하고, 1:20 희석(10㎕ 세포 + 190㎕ 트리판 블루)으로 혈구계(haemocytometer)로 계수하였다. 96웰 마이크로티터 판(microtiter plate)에서 패킹된 세포(2,5'x10⁶세포/ml)의 100㎕의 3개의 샘플들에서 DNA로 [³H] 티미딘을 혼입시켜 증식을 측정하였다. 산화 LDL(0-10㎍/ml, 100㎕/웰)의 3개의 샘플들을 추가하고, 세포를 72시간 동안 배양하고(37도, 5% C0₂및 ~98% 습도), lO㎕³[H] 티미딘(0. 5μCi/웰)을 첨가하였다. 수일간 배양한 후, 세포를 수거하여 세포 수거기(harvester)(Brandel)를 사용하여 유리 섬유 필터로 이송하고, β-계수기(Lumitron)를 사용하여 계수하였다. 사이토킨의 분석을 위해, 상청액을³[H] 티미딘을 첨가하지 않고 회수하여 ELISA로 분석하였다.

최종 주입 투여 후 1일 째에, 상술한 바와 같이 별도의 마우스 군에 ALLE 또는 PBS 주입하고, 산화 LDL로 면역화하였다. 증식 연구를 위해 각 군의 3마리의 마우스로부터 드레이닝(draining) 서혜부 림프절(면역후 8일째에)을 회수하였다. ml 당 1x10⁶세포를 10㎍/ml의 산화 LDL의 존재하 마이크로티터 웰에 있는 0.2ml의 배양 배지에서 72시간 동안 3번 배양하였다. 배양의 최종 12시간 동안 [³H] 티미딘을 DNA로 혼입함으로써, 증식을 측정하였다. 그 결과를 자극 지수(S. I.): 항원의 부재하에서 얻은 평균 배경(cpm)에 대한 항원의 평균 방사능(cpm)의 비율로서 표시하였다. 표준 편차는 항상 평균 cpm의 < 10%이었다.

통계 분석: 독립적 수치를 비교하기 위해 일방(one way) ANOVA 테스트를 사용하였다. p < 0.05이 통계적으로 유의적인 것으로 인정되었다.

실시예 1

내성/면역 항원 2,5' 알데히드 레시틴 에테르(ALLE) 및 POVPC의 합성

2,5' 알데히드 레시틴 에테르(ALLE)를 Eibl H., 등. Ann. Chem. 709: 226-230, (1967), W. J. Baumann and H. K. Mangold, J. Org. Chem. 31,498 (1996), E. Baer and Buchnea JBC. 230,447 (1958), Halperin G 등 Methods in Enzymology 129,838-846 (1986)에 의한 레시틴의 에테르 유사체의 합성에 대한 일반적인 방법의 변형법에 따라 합성하였다. 다음과 같은 프로토콜은 도 1의 2-D 형태로 표시한 화합물 및 공정을 의미한다.

헥사데실-글리세롤 에테르: 벤젠(100ml) 중의 L-ALLE 합성을 위한D-아세톤-글리세롤(4g) 또는 D-ALLE의 합성을 위한 L-아세톤 글리세롤, 분말화된 수산화칼륨(약 lOg) 및 헥사데실 브로마이드(9.3g)를 교반하고, 5시간 동안 환류시켜, 공비 증류(azeotropic distillation)에 의해 형성된 물을 제거하였다(W. J. Baumann and H. K. Mangold, J. Org. Chem. 29: 3055,1964 and F. Paltauf, Monatsh. 99: 1277, 1968 참조). 용매의 부피를 약 20ml로 점차 감소시키고, 차가운 혼합물을 에테르(100ml)에 용해시켰다. 상기 용액을 물(50ml)로 2회 세척하고, 용매를 진공에서 제거하였다. 잔사를 100ml 메탄올: 물: 진한 염산 90: 10: 5에서 10분간 환류시켰다. 얻어진 생성물을 물(50ml) 및 10% 수산화나트륨(20ml) 및 재차 물(20ml)로 중성이 될 때까지 세척한 에테르(200ml)로 추출하였다. 용매를 진공하에서 제거하고, 생성물(88%)을 헥산으로 결정화하여 7.4g의 D-ALLE 합성을 위한 순수한 1-헥사데실-글리세릴 에테르(화합물 1, 도 1) 또는 L-ALLE 합성을 위한 3-헥사데실-글리세릴 에테르를 얻었다.

5-헥세닐-메탄 술포네이트 : 5-헥세데센올(1.9ml) 및 건조 피리딘(5ml)을 테프론으로 보호된 스크류 캡이 구비된 배양 튜브에서 혼합하고, -4℃ 내지 -10℃의 얼음-소금조에서 냉각하였다. 메탄술포닐 클로라이드(lOml)를 60분에 걸쳐 1ml씩 첨가하고, 혼합물을 48시간 동안 4℃에서 유지하였다. 얼음(20g)을 첨가하고, 혼합물을 30분 동안 방치한 후, 생성물을 에테르(200ml)로 추출하였다. 유기상을 물(20ml), 10% 염산, 10% 중탄산나트륨(20ml) 및 재차 물(20ml)로 세척하였다. 용매를 증발시키고, 조 생성물을 실리카겔 60(100g)과 혼합하였다. 14g의 5-헥세닐-메탄 술포네이트를 클로로포름 중의 20% 에틸 아세테이트로 용출하였다.

l-헥사데실옥시-3-트리틸옥시-2-프로판올(D-ALLE에 대해) 또는 3-헥사데실옥시-l-트리틸옥시-2-프로판올(L-ALLE에 대해) (화합물 II) : 1-헥사데실옥시-글리세롤(D-ALLE에 대해) 또는 3-헥사데실옥시-글리세롤(L-ALLE에 대해) (7.9g) 및 트리페닐클로로메탄(8.4g) 및 건조 피리딘(40ml)을 환류 냉각기 및 염화나트륨 튜브를 구비한 둥근 바닥 플라스크에 위치시켰다. 상기 혼합물을 100℃의 오일조에서 12시간 동안 가열하였다. 냉각 후, 300ml의 에테르 및 150ml의 빙냉수를 첨가하고, 반응 혼합물을 분리 깔때기로 이송하였다. 분리된 에테르 상을 50ml의 얼음물, 1% 탄산칼륨 용액(염기성이 될 때까지) 및 50ml의 물로 연속적으로 세척한 다음, 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 조합된 수상의 두 번째 추출은 수율을 약간 증가시켰다. 용매를 증발시키고, 잔사를 150ml의 뜨거운 석유 에테르로 처리하고, 용액을 밤새 4℃에서 냉각시켰다. 300-400mg의 1-헥사데실-글리세릴 에테르(D-ALLE에 대해), 또는 3-헥사데실-글리세릴 에테르(L-ALLE에 대해) (화합물 I, 도 1)의 분리 후, 여액을 증발시키고, 잔사를 20ml의 에틸 아세테이트로 -30℃에서 재결정하여 융점 49℃인 8.2g의 1-헥사데실옥시-3-트리틸옥시-2-프로판올(D-ALLE에 대해) 또는 3-헥사데실옥시-l-트리틸옥시-2-프로판올(화합물 II, 도 1)(L-ALLE에 대해)을 수득하였다.

1-헥사데실-2-(5'-헥세닐)-글리세릴 에테르(D-ALLE에 대해) 또는 3-헥사데실-2-(5'-헥세닐)-글리세릴 에테르(L-ALLE에 대해) (화합물 IV): 1-헥사데실옥시-3-트리틸옥시-2-프로판올(D-ALLE에 대해) 또는 3-헥사데실옥시-l-트리틸옥시-2-프로판올(L-ALLE에 대해) (화합물 II, 도 1) (5. 5g)을 상술한 바와같이 벤젠 용액 중 분말화된 수산화칼륨을 가진 5-헥세닐-메탄술포네이트로 에테르화하였다. 얻어진 조 생성물 1-헥사데실옥시-2-(5'헥세닐옥시)-sn-3-트리틸옥시-프로판(D-ALLE에 대해) 또는 3-헥사데실옥시-2-(5'헥세닐옥시)-sn-3-트리틸옥시-프로판(L-ALLE에 대해) (화합물 III, 도 l)을 100ml의 메탄올: 물: 진한 염산 90: 10: 5에 용해시키고, 상기 혼합물을 6시간 동안 환류시켰다. 생성물을 에테르로 추출하고, 물로 세척한 다음 용매를 제거하였다. 잔사를 석유 에테르 (100ml)에 용해시키고, 4℃에서 밤새 유지하였더니, 대부분의 트리페닐 카르비놀이 침전되었다. 잔류 생성물을 실리카겔 60(40g) 상에서 크로마토그래프 처리하였다. 순수한 1-헥사데실-2-(5'-헥세닐)-글리세릴 에테르(D-ALLE에 대해) 또는 3-헥사데실-2-(5'-헥세닐)-글리세릴 에테르(L-ALLE에 대해) (화합물 IV, 도 1) (1.8g)을 석유 에테르 중의 50% 클로로포름으로 용출하였다.

1-헥사데실-2-(5'-헥세닐)-sn-글리세로-3-포스포콜린(D-ALLE에 대해) 또는 3헥사데실-2-(5'-헥세닐)-sn-글리세로-1-포스포콜린(L-ALLE에 대해) (화합물 V) : 하기 절차의 일부는 Eibl H., 등. Ann. Chem. 709: 226-230,1967.에 기재된 방법의 변형이다.

건조 클로로포름(15ml) 중의 1-헥사데실-2-헥세닐-글리세릴 에테르(D-ALLE에 대해) 또는 3-헥사데실-2-헥세닐-글리세릴 에테르(L-ALLE에 대해) (화합물 IV, 도 1) (2g) 용액을 교반과 함께 건조 클로로포름(15ml) 중의 건조 트리에틸아민(3ml) 및 2-브로모에틸 디클로로포스페이트(1.25ml)의 용액에 15분 동안 -4 내지 -10℃의 얼음조에서 적가하였다. 상기 혼합물을 6시간 동안 상온에서 유지한 다음 40℃에서 12시간 동안 유지하였다. 암갈색 용액을 0℃로 냉각하고, 0.1M 염화칼륨 (15ml)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 60분 동안 교반하고, 메탄올 (25ml) 및 클로로포름 (50ml)을 첨가하고, 유기상을 0.1M 염산(20ml) 및 물(20ml)로 세척하였다. 용매를 증발시키고, 배양 튜브에 있는 조 생성물을 얼음-소금조에서 메탄올(15ml)에 용해시켰다. 차가운 트리에틸아민(3ml, -76℃)을 첨가하고, 튜브를 스크류 캡으로 막았다. 상기 혼합물을 5℃에서 12시간 동안 유지하고, 용매를 질소 기류하에서 증발시켰다. 상기 잔사를 클로로포름: 메탄올 2: 1(25ml)으로 추출하였고, 1M 탄산칼륨(10ml)으로 세척하고, 물(10ml)로 2번 세척하였다. 용매를 진공하에서 제거하고, 생성물을 실리카겔 60(20g) 상에서 크로마토그래피 분리하였다. 클로로포름 중의 40% 메탄올로 용출하여 1.5g의 1-헥사데실-2-(5'-헥세닐)-sn-글리세로-3-포스포콜린(D-ALLE에 대해) 또는 3-헥사데실-2-(5'-헥세닐)-sn-글리세로-1-포스포콜린(L-ALLE에 대해) (화합물 V, 도 1)을 수득하였다. 화합물 V의 구조를 NMR 및 질량 스펙트럼법으로 확인하였다.

1-헥사데실-2-(5'-옥소-펜타닐)-sn-글리세로-3-포스포콜린(D-ALLE에 대해) 또는 3-헥사데실-2-(5'-옥소-펜타닐)-sn-글리세로-l-포스포콜린(L-ALLE에 대해) (화합물 VI):

포름산(15ml) 및 30% 과산화수소(3.5ml) 중의 화합물 V(0. 5g)을 상온에서 밤새 유지하였다. 얻어진 생성물을 클로로포름: 메탄올 2: 1(50ml)로 추출하고, 클로로포름 추출물을 10% 탄산나트륨(10ml) 및 물(10ml)로 세척하였다. 용매를 진공하에서 증발시키고, 잔사(0.4g)를 메탄올(10ml) 및 10% 수산화나트륨(4ml)과 혼합한 다음, 60분 동안 상온에 두었다. 80% 인산(2ml) 및 포타슘 메타 페이오데이트(0.8g)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 상온에서 밤새 유지하고, 클로로포름: 메탄올 2: 1(50ml)을 첨가하였다. 유기상을 10% 소듐 바이술피트(10ml) 및 물(10ml)로 세척하였다. 용매를 진공하에서 제거하고, 생성물(0.3g)을 실리카겔 60(10g) 상에서 크로마토그래프하였다. 화합물 1-헥사데실-2-(5'-옥소-펜타닐)-sn-글리세로-3-포스포콜린 (D-ALLE에 대해) 또는 3-헥사데실-2-(5'-옥소-펜타닐)-sn-글리세로-l-포스포콜린 (L-ALLE에 대해) (화합물 VI, 도 1) (249mg)을 클로로포름: 메탄올 1 : 1로 용출하였더니, Rf 0.15(TLC 시스템, 클로로포름: 메탄올: 물 60: 40: 8)을 나타내었고, 디니트로페닐히드라진에 양성 반응을 나타내었다. 화합물의 구조를 NMR 및 질량 스펙트럼법으로 확인하였다. 또 다른 방법에 있어서, 에틸렌기는 오존화 반응(ozonization) 및 팔라듐 칼슘 카보네이트와의 촉매 수소화 반응에 의해 알데히드기로 전환되었다.

2-브로모에틸 디클로로포스페이트의 제조

Gilman Org. Synth. 12: 117,1926에 기재되어 있는 바와 같이, 새로 증류한 2-브로모에탄올(0.5M)을 1시간에 걸쳐 건조 클로로포름 중의 새로 증류한 인산 옥시클로라이드(0.5M)의 빙냉액에 적가한 다음, 5시간 동안 환류하고 진공 증류하여 2-브로모에틸 디클로로포스페이트를 제조하였다(0.4-0.5mm Hg에서 비점 66-68℃). 상기 시약을 사용하기 전에 질소하 소량의 밀봉 앰플에 보관하였다(-20℃) (Hansen W. H 등. Lipids 17 (6): 453-459,1982).

1-헥사데카노일-2-(5'-옥소)-펜타노일-sn-3-글리세로포스포콜린 (POVPC)

디클로로메탄(100ml, 인산 펜톡사이드로부터 새로이 증류함) 중의 1-헥사데카노일-sn-3-글리세로포스포콜린(화합물 I, 도 2)(L-α-팔미토일-리소포스파티딜콜린)(3g), 5-헥센산(1.2ml), 1,3-디사이클로헥실카르보디아미드(DCC, 4.05g) 및 디메틸아미노피리딘(DMP, 1.6g)의 혼합물을 4일 동안 상온에서 철저히 교반하였다. 상기 혼합물을 직접 실리카겔 60(40g)에서 크로마토그래프하고, 생성물 1-헥사데카노일-2-(5'-헥세노일)-sn-3-글리세로포스포콜린(화합물 II, 도 2)을 클로로포름: 메탄올 25: 75 (2.8g)으로 용출하였다. 상기 용출액을 30% 과산화수소: 포름산 4: 15에 용해시키고, 상온에서 밤새 유지하였다. 물(50ml)을 첨가하고, 생성물을 클로로포름: 메탄올 2: 1(100ml)으로 추출한 다음, 유기상을 물로 세척하였다. 용매를 진공하에서 증발시키고, 잔사를 메탄올 (15ml) 및 10% 암모니아 용액(5ml)에 용해시키고, 상온에서 6시간 동안 유지하였다. 조 1-헥사데카노일-2-(5', 6'-디하이드록시)-헥사노일-sn-3-글리세로포스포콜린(화합물 III, 도 2) (화합물의 구조를 NMR 및 질량 스펙트럼법으로 확인하였다)은 추출되지 않았다. 80% 인산(3ml) 및 소듐 메타페리오데이트(1g)를 상기 용액에 첨가하고, 혼합물을 상온에서 밤새 유지하였다.

클로로포름-메탄올(2: 1)으로 추출, 실리카겔 60(20g)으로 크로마토그래피 및 클로로포름-메탄올 25: 75으로 용출한 결과, TLC 상에서 레시틴의 크로마토그래피 이동도 및 양성 디니트로페닐 히드라진 반응을 갖는 850mg의 1-헥사데카노일-2-(5'-옥소펜타노일)-sn-3-글리세로포스포콜린(POVPC, 화합물 IV, 도 2)을 수득하였다. 화합물의 구조를 NMR 및 질량 스펙트럼법으로 확인하였다. 이와 달리, 에틸렌기는 오존화 반응(ozonization) 및 팔라듐 칼슘 카보네이트와의 촉매 수소화 반응에 의해 알데히드기로 전환되었다.

실시예 II

L-ALLE + D-ALLE에 의한 면역화는 유전학적으로 처리된 (apoE-결핍) 마우스에서 죽종 형성을 특이적으로 억제한다.

본 발명자들은 안정하고 에테르화된 합성 LDL 성분 ALLE로 면역화시키면 민감성 마우스에서 죽상 경화성 플라크 형성 정도를 감소시킬 수 있다는 것을 증명하였다. 19마리의 자성 5-7주령의 Apo E/C 57 마우스를 3개 군으로 나누었다. A군에서(n=6), 상술한 재료와 방법 부분에 기재한 바와 같이 150㎍/마우스 L-ALLE + D-ALLE으로 8주 동안 2주마다 1회씩(0.3ml/마우스) 마우스를 복강내 면역시켰다. B군에서(n=6), 마우스를 투베르쿨린 독소 정제된 단백질 유도체(PPD)로 2주마다 1회씩(0.3ml/마우스) 면역화시켰다. C군에서(n=7), 마우스는 어떠한 면역화도 시키지 않았다. 상기 3개 군의 마우스를 면역시키기 전(시간 0) 및 항-산화 LDL 항체, 항-ALLE 항체 및 지질 농도의 결정을 위해 제2 면역화 후 1주째에 출혈시켰다. 항체 반응이 플래토(plateau)하지 않는 마우스를 플래토에 도달될 때까지 연속 2주 간격으로 출혈시켰다. 상술한 바와 같이 죽상 경화증을 평가하였고, 제4 면역화 후 6주째에 비장을 수거하였다. 모든 군의 마우스를 실험 내내 2주 간격으로 계량하였다. 모든 마우스에 4.5중량% 지방(0.02% 콜레스테롤) 및 임의량의 물을 함유하는 정상 식품-식이(chow-diet)를 제공하였다.

ALLE에 의한 apoE 마우스의 면역화는 죽종 형성을 억제한다.

군		100㎍/마우스L-ALLE+D-ALLE면역화N=6	PPDN=5	면역화하지 않은 대조군N=7	통계
시간 0	중량	17.3 ±0.5	17.3 ±0.7	17.8 ±0.4	P=0.780
	Chol	435.3 ±47.2	436.3 ±49.4	412.7 ±44.1	P=0.919
	TG	118 ±9.2	111.6 ±10.3	120.4 ±14.2	P=0.865
종료	중량	20.500 ±0.458	21.620 ±0.213	20.300 ±0.49	P=0.123
	Chol	299.400 ±17.6	293.760 ±15.1	303.714 ±21.6	P=0.937
	TG	57.267 ±3.286	53.020 ±4.416	66.057 ±3.76	P=0.075
	병변 크기(㎛²)	101000 ±8276	179500 ±13449	210833 ±26714	P=0.005
	TGF-βpmol/㎖	12032 ±2308	13963 ±944	12825 ±2340	P=0.831

도 3에 나타낸 바와 같이, 표 1의 결과는 PPD 및 미면역화시킨 대조군 마우스에 비해 ALLE 면역화된 마우스의 심장 조직에서 죽종성 병변의 유의적인 감소가 측정되었다. 면역 억제 사이토킨 TGF-β의 수준에 의해 측정된 바와 같이 증량, 트리글리세라이드 또는 콜레스테롤 혈액 수준, 또는 면역 반응성과 같은 측정된 다른 파라미터에 대해 어떠한 유의적 효과도 명백하지 않았다. 따라서, 합성 산화 LDL 성분 ALLE(라세믹 형태 D- 및 L-의 혼합물)로 면역화시키면, 상기 유전학적으로 민감한 apoE-결핍 마우스에서 죽상 경화성 병변 형성으로부터 유의적인( > 50%) 보호 효과를 제공한다. 유의적이지만, 급격하지 않은 플라크 감소가 PPD로 면역화된 마우스에서 관찰되었다.

실시예 III

L-ALLE 및 D-ALLE로 구강 내성을 유도함으로써 유전학적으로 전처리한 (apoE-결핍) 마우스에서 죽종 형성의 억제

플라크 병변 성분의 에스테르 유사체로 복강내 면역화하였더니, apoE-결핍 마우스에서 죽종 형성을 억제하는데 효과적이었다(도 1). 따라서, L- 및 D-ALLE의 구강 내성을 통한 죽종 형성의 억제 능력을 조사하였다. 34마리의 웅성 8-10 주령의 E/C 57 마우스를 3개의 군으로 나누었다. A군에서(n=11), 구강 내성은 5일 동안 2일에 1회씩 PBS 중에(5 mg/ml, 1 mg/마우스) 현탁된 L-ALLE + D-ALLE의 위관 영양법(gavage)에 의한 투여에 의해 유도되었다. B군에서(n=11), 마우스는 5일 동안 2일에 1회씩 PBS 중에 현탁된 10㎍/마우스의 L-ALLE + D-ALLE가 주입되었다(0.2ml/마우스). C군의 마우스는(n=12) PBS(A + B 군에서와 같이 에탄올의 동일 부피를 함유함)가 주입되었다. 마우스를 공급하기 전(시간 0) 및 지질 농도의 결정을 위해 실험 결과(종료)시 출혈시켰다. 죽상 경화증을 최종 주입 후 8주째에 상술한 바와 같이 심장, 대동맥 및 혈청에서 평가하였다. 마우스를 실험 내내 2주마다 계량하였다. 모든 마우스에 4.5중량%의 지방 및 임의량의 물을 함유하는 정상 식품-식이를 제공하였다.

L-ALLE 및 D-ALLE의 구강 투여에 의한 apoE-결핍 마우스에서 죽종 형성의 억제

군		PBSN=12	1㎎ ALLEN=11	10㎍ ALLEN=11	통계
시간 0	중량	20.7 ±0.6	21.5 ±0.8	21.1 ±0.8	P=0.794
	Chol	372 ±25	379 ±23	378 ±31	P=0.983
	TG	128	98	90	P=0.829
종료	중량	27.3 ±0.4	27.4 ±0.5	24.1 ±0.8	P〈0.001
	Chol	302.8 ±16.5	248.7 ±24.2	320.5 ±15.2	P=0.031
	TG	81.4 ±4.3	77.6 ±7.5	93.3 ±6.2	P=0.146
	병변 크기(㎛²)	176000 ±13735	85278 ±11633	103889 ±14320	P〈0.001
	TGF-βpmol/㎖	14696 ±1352	13388 ±1489	18010 ±1373	P=0.07

주: "중량"은 그램 중량이고; "Chol"는 혈청 콜레스테롤이며, "TG"는 mg/dL로 표시한 혈청 트리글리세라이드이다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 표 2의 결과는 비노출된 대조군 마우스에 비해 ALLE의 저투여량(10㎍-1mg/마우스)으로 공급된 마우스의 조직에서 죽상 경화성 진행의 놀라운 감소가 측정되었음을 나타내고 있다. 면역 억제 사이토킨 TGF-β의 수준에 의해 측정된 바와 같이 증량, 트리글리세라이드 또는 콜레스테롤 혈액 수준, 또는 면역 반응성과 같은 측정된 다른 파라미터에 대해 어떠한 유의적 효과도 명백하지 않았다. 따라서, 합성 산화 LDL 성분 ALLE는 구강 내성의 강력한 유도 인자로서, 복강 면역화로 달성된 보호 효과와 유사하게(도 1 참조) 상기 유전학적으로 민감한 apoE-결핍 마우스에서 죽상 경화증으로부터 유의적인( > 50%) 보호 효과를 제공한다.

실시예 IV

L-ALLE 및 D-ALLE에 의한 구강 및 비강 내성의 유도에 의한 유전학적으로 전처리된 (apoE-결핍) 마우스에서 죽종 형성의 억제

점막 내성의 기작은 비강 점막에서 뿐 아니라 장에서도 활성적이다. 따라서, L- 및 D-ALLE에 대한 비강 노출 및 구강 노출을 apoE-결핍 마우스에서 죽종 형성을 억제하는 효능을 비교하였다. 34마리의 웅성 7-9 주령의 Apo E/C 57 마우스를 3개의 군으로 나누었다. A군에서(n=11), 구강 내성은 5일 동안 2일에 1회씩 PBS 중에(5mg/ml, 1mg/마우스) 현탁된 L-ALLE + D-ALLE의 위관 영양법에 의한 투여에 의해 유도되었다. B군에서(n=11), 비강 내성은 5일 동안 2일에 1회씩 PBS 중에 현탁된 10㎍/마우스/10ul의 L-ALLE + D-ALLE의 투여에 의해 상술한 재료와 방법 부분에 기재한 바와 같이 유도되었다. C군의 마우스에는(n=12) PBS(A + B 군에서와 같이 에탄올의 동일 부피를 함유함)가 구강 및 비강 투여되었다. 마우스를 공급하기 전(시간 0) 및 지질 농도의 결정을 위해 실험 결과(종료)시 출혈시켰다. 죽상 경화증을 최종 주입 후 8주째에 상술한 바와 같이 심장, 대동맥 및 혈청에서 평가하였다. 마우스를 실험 내내 2주마다 계량하였다. 모든 마우스에 4.5중량%의 지방 및 임의량의 물을 함유하는 정상 식품-식이를 제공하였다.

L-ALLE 및 D-ALLE의 비강 투여에 의한 apoE-결핍 마우스에서의 죽종 형성의 억제

군		1㎎ ALLE구강(N=11)	10㎍ ALLE비강(N=11)	PBS구강(N=12)	통계
시간 0	중량	22.1 ±3.0	21.1 ±2.5	21.1 ±0.8	P=0.624
	Chol	353 ±31	351 ±27	362 ±27	P=0.952
	TG	144	143	138	P=0.977
종료	중량	24.2 ±0.2	23.3 ±1.1	24.0 ±0.5	P=0.558
	Chol	418 ±43	328 ±18	343 ±25	P=0.084
	TG	82 ±7	74 ±6	79 ±5	P=0.630
	병변 크기(㎛²)	76944 ±17072	82708 ±10986	135455 ±12472	P=0.007

도 5에 나타낸 바와 같이, 표 3의 결과는 비노출된 대조군 마우스에 비해 ALLE의 저투여량(10㎍/마우스)에 대한 비강 노출된 마우스의 조직에서 죽종 형성의 효과적인(구강 내성 정도의 효과) 억제가 측정되었음을 보여주고 있다. 면역 억제 사이토킨 TGF-β의 수준에 의해 측정된 바와 같이 증량, 트리글리세라이드 또는 콜레스테롤 혈액 수준, 또는 면역 반응성과 같은 측정된 다른 파라미터에 대해 비강 내성의 유도는 구강 내성의 유도와 같이 어떠한 유의적 효과도 없었다. 따라서, 합성 산화 LDL 성분 ALLE는 구강 내성 뿐 아니라 비강 내성의 강력한 유도 인자로서, 구강 내성 단독의 유도로 달성된 보호 효과와 유사하게 상기 유전학적으로 민감한 apoE-결핍 마우스에서 죽종 형성로부터 유의적인(약 50%) 보호 효과를 제공한다.

실시예 V

L-ALLE 및 POVPC의 구강 투여에 의해 유전학적으로 전처리한 (apoE-결핍) 마우스에서 특이적 항-산화 LDL 면역 반응성의 억제

POVPC

LDL의 산화 유사체에 대한 점막 노출에 의해 유도된 내성은 플라크-관련 항원에 대한 특이적 면역 반응의 억제에 의해 매개될 수 있다. POVPC(1-헥사데카노일-2-(5'-옥소-펜타노일)-sn-글리세로포스포콜린)은 ALLE와 달리 간에서의 손상에 민감한 비-에테르 산화 LDL 유사체이다. POVPC 및 보다 안정한 유사체 ALLE에 대한 구강 노출에 반응하는 림프구 증식을 apoE-결핍 마우스에서 측정하였다. 8마리의 웅성 6주령의 Apo E/C 57 마우스를 3개의 군으로 나누었다. A군에서(n=2), 구강 내성을 상술한 바와 같이 5일 동안 2일에 1회씩 위관 영양법에 의해 투여된 0.2ml PBS에 현탁된 1mg/마우스 L-ALLE로 유도하였다. B군에서(n=3), 구강 내성을 상술한 바와 같이 5일 동안 2일에 1회씩 per os 에 의해 투여된 0.2ml PBS에 현탁된 1mg/마우스 POVPC으로 유도하였다. C군에는(n=3) 5일 동안 2일에 1회씩 200㎕ PBS를 구강 투여하였다. 면역 반응성을 상술한 재료와 방법 부분에 기재한 바와 같이 최종 주입 후 1일째에 인간 산화 LDL로 면역화하여 자극하였다. 면역화 후 1주째에, 증식 분석을 위해 림프절을 수거하였다. 모든 마우스에 4.5중량% 지방(0.02% 콜레스테롤) 및 임의량의 물을 함유하는 정상 식품-식이(chow-diet)를 제공하였다.

합성 산화 LDL(ALLE 및 POVPC)으로 구강 전처리하면, apoE-결핍 마우스에서 인간 산화 LDL에 대한 면역 반응을 억제한다.

자극 지수(SI)
PBS	POVPC	L-ALLE
33.1 ±11.5	10.6 ±4.1	7.3 ±4.3
N=3	N=3	N=2
	-68%	-78%

도 6에 나타낸 바와 같이, 표 4의 결과는 apoE-결핍 마우스의 림프절에서 증식 억제에 의해 측정되는 apoE-LDL 항원에 대한 면역 반응성의 유의적인 억제를 나타내고 있다. ALLE 또는 POVPC의 죽종 형성-억제 투여량(1mg/마우스)에 대한 구강 노출된 마우스의 림프구는 대조군(PBS) 마우스에 비해 산화 LDL로 면역화한 후 감소된 자극 지수를 나타내었다. 비강 내성과 같이 구강 내성의 유도는 증량, 트리글리세라이드 또는 콜레스테롤 혈액 수준, 또는 면역 반응성과 같은 측정된 다른 파라미터에 대해 어떠한 유의적 효과도 없었기 때문에(표 1, 2 및 3 참조), 이러한 결과는 항-산화 LDL 면역 반응성의 특이적 억제를 보여주고 있다. 따라서, 전신 산화 LDL 성분 L-ALLE의 구강 투여는 유전학적으로 민감한 상기 apoE-결핍 마우스에서 면역원 및 죽종 형성 플라크 성분에 대한 세포성 면역 반응을 감소시키기 위한 유효한 방법이다. 도 4는 또한 덜 안정한 합성 산화 LDL 성분 POVPC의 구강 투여에 의한 덜 효과적이지만 유사한 증식 억제를 보여주고 있다.

실시예 VI

ALLE 및 POVPC의 D- 및 L-이성질체로 구강 내성을 유도함으로써 유전적으로 전처리된 (apoE-결핍) 마우스에서의 죽종 형성 억제

ALLE 및 POVPC의 주입은 플라크-관련 인간 LDL 항원에 대한 초기 죽종 형성 및 면역 반응성을 억제하는 것으로 나타났기 때문에, 에테르 LDL 유사체의 D- 및 L-이성질체 및 비-에테르 유사체 POVPC의 노령의 마우스에서의 죽종 형성 진행을 억제시키는 능력을 비교하였다. VLDL의 트리글리세라이드 및 콜레스테롤 분획에 대한 효과를 FPLC로 관찰하였다. 40마리의 웅성 24.5주령의 Apo E/C 57 마우스를 4개의 군으로 나누었다. A군에서(n=11), 구강 내성을 상술한 바와 같이 5일 동안 2일에 1회씩 위관 영양법에 의해 투여된 0.2ml PBS에 현탁된 1 mg/마우스 L-ALLE로 유도하였다. B군에서(n=9), 구강 내성을 상술한 바와 같이 5일 동안 2일에 1회씩 os 에 의해 투여된 0.2ml PBS에 현탁된 1mg/마우스 POVPC으로 유도하였다. C군은(n=10) 5일 동안 2일에 1회씩 0.2ml PBS에 현탁시킨 1mg/마우스 POVPC으로 유도하였다. 대조군 D에는(n=10) PBS(A, B, C군과 에탄올의 동일 부피를 함유함)를 구강 투여하였다. 시험된 항원의 구강 투여는 24.5주령에서 시작하여 12주 동안(3세트의 주입) 4주마다 실시하였다(5번의 구강 주입; 2일에 1회).

마우스를 공급하기 전(시간 0) 및 지질 농도, 지질 분획화 및 혈장 수거를 결정하기 위해 제2세트의 주입 및 실험 결과(종료)시 출혈시켰다. 죽상 경화증을 최초 주입 후 12주째에 상술한 바와 같이 심장, 대동맥 및 비장에서 평가하였다. 체중을 실험 내내 2주마다 계량하였다. 모든 마우스에 4.5중량%의 지방 및 임의량의 물을 함유하는 정상 식품-식이를 제공하였다.

L-ALLE, D-ALLE 및 POVPC의 구강 투여에 의한 apoE-결핍 마우스에서의 죽종 형성의 억제

		PBS(n=10)	1㎎L-ALLE(n=11)	1㎎D-ALLE(n=9)	1㎎POVPC(n=10)	통계
0	중량	28.1 ±0.5	29 ±0.6	29.8 ±0.7	29.6 ±0.7	P=0.305
	콜레스테롤	413 ±27	413 ±23	409 ±28	401 ±21	P=0.983
	트리글리세라이드	67 ±5	63 ±8	63 ±4	67 ±7	P=0.964
종료	중량	28.5 ±0.6	29.7 ±0.5	30.4 ±0.8	29.9 ±0.5	P=0.177
	콜레스테롤	365 ±15	391 ±18	394 ±15	358 ±28	P=0.481
	트리글리세라이드	84 ±4	83 ±4	94 ±4	85 ±3	P=0.207
	강 병변㎛²	369688 ±32570	233056 ±12746	245938 ±20474	245750 ±20423	P〈0.001

도 7에 나타낸 바와 같이, 표 5의 결과는 PBS-주입된 대조군 마우스에 비해 ALLE의 D- 및 L-이성질체 및 POVPC의 적절히 낮은 투여량(1mg/마우스)에 대해 연장된 구강 노출 후 노령의 마우스 조직에서 효과적인 말기 죽종 형성의 억제가 측정되었음을 보여주고 있다. 구강 내성의 유도는 증량, 총 트리글리세라이드 또는 콜레스테롤 혈액 수준과 같은 측정된 다른 파라미터에 대해 어떠한 유의적 효과도 없었다. 따라서, 합성 산화 LDL 성분 D-, L-ALLE 및 POVPC은 개별적으로 구강 내성의 강력한 유도 인자로서, 유전적으로 민감한 apoE-결핍 마우스에서 죽종성 진행으로부터 거의 완전한 보호 효과를 제공한다(24.5주에서의 병변 스코어와 비교하여). 놀라운 것은, FPLC에 의해 측정된 바와 같이, 이들 산화 LDL 유사체에 의한 죽종형성의 억제가 VLDL 콜레스테롤 및 트리글리세라이드의 유의적인 감소에 의해 수반됨이 관찰되었다(도 8 및 9).

본 발명을 구체적인 실시형태를 들어 기재하였지만, 많은 대체, 변형 및 변화가 본 기술 분야의 당업자에게 있어서는 자명하다. 따라서, 첨부되어 있는 청구범위의 정신 및 광범위한 범위 내에 속하는 이러한 대체, 변형 및 변화를 포함하고자 하는 것이다. 각각의 문헌, 특허 또는 특허 출원은 본 명세서에 참고 문헌으로 포함되도록 구체적으로 또한 개별적으로 나타낸 만큼, 본 명세서에서 언급하고 있는 모든 문헌, 특허, 특허 출원은 본 명세서에 참고 문헌으로 전적으로 포함된다. 또한, 본 출원에서 몇몇 문헌을 인용 또는 확인하는 것이 이러한 문헌들이 본 발명에 대한 종래 기술로서 이용될 수 있는 것으로 해석되어서는 안 된다.

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Claims

하기 화학식을 갖는 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염:

상기 식에서,

(i) A_l및 A₂는 각각 독립적으로 CH₂및 C=O으로 이루어지는 군으로부터 선택되고, A₁및 A₂중 하나 이상은 CH₂이며;

(ii) R₁및 R₂는 각각 독립적으로 길이가 1-27인 탄소의 알킬 사슬 및

로 이루어지는 군으로부터 선택되고,

X는 C_l-24사슬이며, Y는

-OH, -H, 알킬, 알콕시, 할로겐, 아세톡시 및 방향족 작용기로 이루어지는 군으로부터 선택되고;

Z는

및 -OH로 이루어지는 군으로부터 선택되며;

(iii) R₃는 H, 아실, 알킬, 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 에탄올아민, 포스파티딜 세린, 포스파티딜 카르디올리핀 및 포스파티딜 이니시톨로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
제 1 항에 있어서, R₁및 R₂중 하나 이상이 하기 화학식인 화합물:

상기 식에서,

X는 C_1-24사슬이고, Y는

-OH, -H, 알킬, 알콕시, 할로겐, 아세톡시 및 방향족 작용기로 이루어지는 군으로부터 선택되고;

Z는

및 -OH로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
필요한 대상에 죽상 경화증, 심혈관 질환, 뇌혈관 질환, 말초 혈관 질환, 협착증, 재협착증 및/또는 스텐트내 협착증의 예방 및/또는 치료를 위한 약제학적 조성물로서, 활성 성분으로서 하기 화학식의 군으로부터 선택된 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염의 치료학적 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물:

상기 식에서,

(i) A_l및 A₂는 각각 독립적으로 CH₂및 C=O으로 이루어지는 군으로부터 선택되고;

(ii) R₁및 R₂는 각각 독립적으로 길이가 1-27인 탄소의 알킬 사슬 및

로 이루어지는 군으로부터 선택되고,

X는 C_l-24사슬이며, Y는

-OH, -H, 알킬, 알콕시, 할로겐, 아세톡시 및 방향족 작용기로 이루어지는 군으로부터 선택되고;

Z는

및 -OH로 이루어지는 군으로부터 선택되며;

(iii) R₃는 H, 아실, 알킬, 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 에탄올아민, 포스파티딜 세린, 포스파티딜 카르디올리핀 및 포스파티딜 이니시톨로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
제 3 항에 있어서, R₁및 R₂중 하나 이상이 하기 화학식인 조성물:

상기 식에서,

X는 C_1-24사슬이고, Y는

-OH, -H, 알킬, 알콕시, 할로겐, 아세톡시 및 방향족 작용기로 이루어지는 군으로부터 선택되고;

Z는

및 -OH로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
제 3 항에 있어서, R₁및 R₂중 하나 이상이 CH₂인 조성물.
제 3 항에 있어서, 점막 투여를 통해 산화 LDL에 대한 내성 유도를 목적으로 하는 조성물.
제 3 항에 있어서, 비강, 구강 또는 복강내 투여를 목적으로 하는 조성물.
제 3 항에 있어서, 상기 화합물이 상기 대상에 있어 산화 LDL에 대한 면역 반응성을 감소시키는 조성물.
제 3 항에 있어서, 죽상 경화증, 심혈관 질환, 뇌혈관 질환, 말초 혈관 질환, 협착증, 재협착증 및/또는 스텐트내 협착증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 장애를 예방 및/또는 치료하는 용도로 포장되고 확인되는 조성물.
제 3 항에 있어서, HMGCoA 리덕타아제 억제제(Statins) 점막 보조제, 코르티코스테로이드, 항-염증성 화합물, 진통제, 성장 인자, 독소 및 추가적인 내성 항원으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가적인 화합물의 치료학적 유효량을 더 포함하는 조성물.
필요한 대상에 죽상 경화증, 심혈관 질환, 뇌혈관 질환, 말초 혈관 질환, 협착증, 재협착증 및/또는 스텐트내 협착증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 질환, 증후군 또는 이상 상태의 예방 및/또는 치료를 위한 조성물로서, 활성 성분으로서 합성 LDL 유도체 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염의 치료학적 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 더 포함하는 조성물.
필요한 대상에 죽상 경화증, 심혈관 질환, 뇌혈관 질환, 말초 혈관 질환, 협착증, 재협착증 및/또는 스텐트내 협착증을 예방 및/또는 치료하기 위한 방법으로서, 하기 화학식을 갖는 군으로부터 선택되는 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염의 치료학적 유효량을 투여하는 것을 포함하는 방법:

상기 식에서,

(i) A_l및 A₂는 CH₂또는 C=O이고;

(ii) R₁또는 R₂는 각각 독립적으로 길이가 1-27인 탄소의 알킬 사슬 및

로 이루어지는 군으로부터 선택되고,

X는 C_l-24사슬이며, Y는

-OH, -H, 알킬, 알콕시, 할로겐, 아세톡시 및 방향족 작용기로 이루어지는 군으로부터 선택되고;

Z는

및 -OH로 이루어지는 군으로부터 선택되며;

(iii) R₃는 H, 아실, 알킬, 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 에탄올아민, 포스파티딜 세린, 포스파티딜 카르디올리핀 및 포스파티딜 이니시톨로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
제 12 항에 있어서, R₁및 R₂중 하나 이상이 하기 화학식인 방법:

상기 식에서,

X는 C_1-24사슬이고, Y는

-OH, -H, 알킬, 알콕시, 할로겐, 아세톡시 및 방향족 작용기로 이루어지는 군으로부터 선택되고;

Z는

및 -OH로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
제 12 항에 있어서, A_l및 A₂중 하나 이상이 CH₂인 방법.
제 12 항에 있어서, 상기 화합물이 점막 투여에 의해 투여되는 방법.
제 12 항에 있어서, 상기 화합물의 투여가 비강, 구강 또는 복강내 투여인 방법.
제 12 항에 있어서, 상기 화합물의 투여가 상기 대상에 있어 산화 LDL에 대한 면역 반응성을 감소시키는 방법.
제 12 항에 있어서, 상기 화합물이 HMG CoA 리덕타아제 억제제(Statins), 점막 보조제, 코르티코스테로이드, 항-염증성 화합물, 진통제, 성장 인자, 독소 및 추가적인 내성 항원으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가적인 화합물의 치료학적 유효량 이외에 투여되는 방법.
(a) 하나 이상의 지방산 측쇄가 단일-불포화된 지방산 C_2-15인 2개의 지방산 측쇄를 포함하는 인지질 주쇄를 제공하고;

(b) 상기 단일-불포화된 지방산의 2중 결합을 산화시켜 산화 인지질을 형성하는 것을 포함하는 산화 인지질의 합성 방법.
제 19 항에 있어서, 상기 인지질 주쇄가 H, 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 에탄올아민, 포스파티딜 세린, 포스파티딜 카르디올리핀 및 포스파티딜 이니스톨로 이루어지는 군으로부터 선택되는 잔기를 더 포함하는 방법.
제 19 항에 있어서, 상기 단일 불포화된 지방산이 C_2-l5인 방법.
제 19 항에 있어서, 상기 산화 인지질이 POVPC이고, 상기 단일-불포화된 지방산이 5-헥센산인 방법.