WO2004006910A1 - Lipidoxidationsprodukte zur hemmung von entzündungen - Google Patents

Abstract

Verwendung von Oxidationsprodukten von diversen Phospholipidklassen (Phosphatidylcholine, ethanolamine, -serine) zur Hemmen der Aktivierung von TLR4 durch LPS und daraus resultierende entzündliche Prozesse in vitro und in vivo durch Hemmung von LPS-induzierten Signaltransduktionswegen, Expression von entzündlichen Genen, Gewebsschädigung od. dergl., so wie die Verwendung von OXPAPC zur Behandlung von Ödemformation und durch Entotoxin induzierten Schock.

Description

Lipidoxidationsprodukte zur Hemmung von Entzündungen.

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Lipidoxidationsprodukten zur Hemmung von Entzündungen, die durch bakterielle Infektion verursacht wurden.

Bei entzündlichen Prozessen kommt es durch Einwanderung von weißen Blutzellen in den Entzündungsherd unweigerlich durch die dadurch entstehenden freien Radikale zu oxidativer Modifikation von Lipiden und Proteinen. Diese oxidierten Lipide wirken nun ihrerseits auf Zellen und Gewebe in ihrer Umgebung. Einerseits können diese Lipide den Entzündungsprozess verstärken indem sie die Expression von Entzündungsgenen in verschiedenen Zellen anschalten, sie können aber auch durch Infektion verursachte Entzündung hemmen.

Durch Entzündungsmediatoren wie z.B. bakterielles Lipopolysaccharid (LPS), Tumor Nekrose Faktor (TNF) oder rnterleukin-l (IL-1) werden Signaltransdu tionswege in Endofhelzellen angeschaltet, die zur Translokation des Transkriptionsfaktors Nuklearer Faktor kappa B (NFkB) in den Zellkern führen, wodurch die Expression von Entzündungsgenen angeschalten wird. Dies führt zur Expression von Zytokinen und Adhäsionsmolekülen und in weiterer Folge zur Adhäsion und Transmigration von weißen Blutzellen an und durch das Endothel.

Wir haben die Wirkung von spezifischen Phospholipidoxidationsprodukten auf Endofhelzellen untersucht. Oxidiertes l-palmitoyl-2-arachidonyl-sn-glycero- phosphorylcholin (OxPAPC), welches in oxidiertem Low-Density-Lipoprotein, ein Verursacher von Atherosklerose, sowie in diversen entzündlichen Geweben und in atherosklerotischen Läsionen nachgewiesen wurde, stimuliert Endothelzellen spezifisch Monozyten zu binden, ein Effekt der vor allem bei chronischen Entzündungskrankheiten eine bedeutende Rolle spielt. Es konnte gezeigt werden, daß oxPAPC die Expression von Tissue Factor (TF) in Endothelzellen stimuliert. Untersuchungen der intrazellulären Signaltransduktionswege die zur TF Expression durch oxPAPC führen haben gezeigt, dass die MAP inasen ERK1/2 und p38MAP stimuliert werden. Hemmung des ERK Pafhways führte zur Hemmung der TF Expression. Weiters konnte gezeigt der Transkriptionsfaktor egr-1 durch die oxidierten Phospholipide stimuliert wird. Überexpression von NAB2, einem natürlichen Korepressor von egr-1 hemmte die durch oxPAPC induzierte TF Expression. Darüberhinaus haben wir gezeigt, dass die intrazelluläre Kalziumkonzentration durch oxPAPC erhöht wird. Dies führt zu einer Aktivierung von Calcineurin und in weiterer Folge zur Translokation von NFAT (nuclear factor of activated T-cells) in den Zellkern. Diese Prozesse konnten durch Zyklosporin gehemmt werden. Der klassische NFDB Signalweg wird durch oxPAPC nicht angeschaltet. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass oxPAPC die Expression von TF in Endothelzellen über Aktivierung folgender Signalwege, unabhängig von NFDB, aktiviert: PKC-ERKl/2-egr-l und

In der spezifischen Induktion von Monozytenadhäsion durch l-Palmitoyl-2-Oxovaleroyl- Phosphatidylcholin (POVPC) und oxPAPC haben wir gezeigt, dass die MAP Kinasen eine wesentliche Rolle spielen, da spezifische Inhibitoren dieser Enzyme zu einer Hemmung der oxidierten Phospholipid induzierten Monozytenadhäsion führten. Wir konnten zeigen, dass zumindest IDB Degradation, die zur Translokation des NFDB führt, nicht induziert ist und deshalb keine Rolle spielt. Wir haben weiters gezeigt dass die Aktivierung von ERK1/2 durch oxPAPC zu einer Aktivierung von zytosolischer Phospholipase A2 führt. Freie Arachidonsäure wird von aktivierter 12/15 Lipoxygenase in spezifische Lipoxygenaseprodukte umgewandelt, die wahrscheinlich als Liganden für PPARs wirken und so einen bisher unbekannten Mechanismus in Gang setzen, der schließlich zur Expression von Adhäsionsmolekülen (nicht VCAM, ICAM, oder E- selectin) führt, die spezifische Monozytenadhäsion bewirken. Weiters konnten wir zeigen, dass ein cAMP-PKA-mediierter Signalweg, der zur Phosphorylierung von CREB führt eine wesentliche Rolle in oxPAPC-induzierter Monozytenadhäsion spielt.

Um den Einfluß oxidierter Phospholipide auf Entzündungsprozesse die durch andere Mediatoren, zB bakterielle Infektionen, hervorgerufen werden, zu untersuchen, wurde zunächst der Effekt an Endothelzellkulturen in vitro getestet.

Lipopolysaccharid (LPS, Endotoxin), ein Membranbestandteil von Gram-negativen Bakterien, interagiert mit dem LPS-bfnding Protein (LBP) und CD 14, welche LPS seinem Rezeptor (toll-like receptor 4, TLR4) präsentieren. Dieser Prozess st Expression von inflammatorischen Genen durch Aktivierung der NFkB uuu ivi ur- Kinasen Signaltransduktionswege. Abwehrmechanismen zur Bekämpfung von Bakterien sind vor allem Aktivierung von neutrophilen Granulozyten, welche sog. reactive oxygen species (ROS) produzieren, welche wiederum Bakterien abtöten, aber auch zu Lipidoxidation fuhren.

Wir konnten zeigen, dass LPS-induzierte Induktion des NFkB Signaltransduktionsweges sowie die daraus resultierende Expression der Adhäsionsmoleküle E-selectin, ICAM-1 und VCAM-1 auf Endothelzellen durch OxPAPC gehemmt werden (Fig. la,b). Dieser Effekt resultierte aus der Hemmung von LPS-induzierten Signaltransduktionswegen wie NFkB und p38 MAP Kinaseen Fig. lc,d,eDieser Inbibitionseffekt war spezifisch für LPS- induzierte Entzündung, da IL-1 und TNF-induzierte NFkB Aktivierung sowie E-selektin Expression nicht durch OxPAPC gehemmt werden konnten (Fig. lf). ). Der Mechanismus dieser Hemmung begründet sich darauf, dass OxPAPC die Interaktion von LPS mit den Proteinen LBP und CD14 hemmt (Fig.2). Die Hemmung von LPS-induzierter Expression von Adhäsionsmolekülen war spezifisch für Oxidationsprodukte von Phospholipiden, da nicht oxidierte Lipide, sowie Enzymatische Produkte diese Eigenschaft nicht aufwiesen (Fig. 3a,b). Der Hemmeffekt war nicht abhängig von freien Radikalen (Fig. 3c) und eine definierte Komponente von OxPAPC, nämlich POVPC, war ein Molekül welches diese Hemmeigenschaften aufwies (Fig. 3d). Bisher war nur ein Zusatz bekannt, das Polymy- xin B, LPS Kontamination großes Problem zB in Zellkultur).

Die Spezifität für LPS deutet bereits auf eine klinische Anwendung im Bereich der Sepsisbehandlung hin, da durch OxPAPC sehr wohl die bakterielle Infektion, aber nicht die körpereigene Abwehr, die vor allem durch TNF mediiert ist, behindert und unterdrückt wird. Um zu zeigen daß OxPAPC auch in vivo wirksam ist, haben wir in verschiedenen Mausmodellen für Entzündung gezeigt, dass sowohl der LPS-induzierte Einstrom von weißen Blutzellen (Fig. 4 a, b, c, g) als auch die Expression von entzündlichen Adhäsionsmolekülen ( Fig. 4 d,e,f) und darüber hinaus Ödemformation (Fig. 4h) durch oxidierte Phospholipide gehemmt wurden. Darüber hinaus schützten oxidierte Phospholipide gegen letalen, durch Endotoxin induzierten Schock (Fig. 4i). . .

Zusammenfassend kann man sagen, dass bei entzündlichen Prozessi entstehende Lipidoxidationsprodukte als negativer Feedbackmechanismus funi iomeren könnten um sog. innate immune responses zu hemmen. Darüberhinaus können die in dieser Studie identifizierten für die Hemmung verantwortlichen chemischen Strukturen dazu verwendet werden um neue Medikamente zur Sepsisbehandlung zu entwickeln.

Claims

Patentansprüche:

1. Verwendung von Oxidationsprodukten von diversen Phospholipidklassen (Phosphatidyl-choline, ethanolamine, -serine) zur Hemmen der Aktivierung von TLR4 durch LPS und daraus resultierende entzündliche Prozesse in vitro und in vivo durch Hemmung von LPS-induzierten Signaltransduktionswegen, Expression von entzündlichen Genen, Gewebsschädigung od.dergl..

2. Chemische Struktur eines identifizierten Oxidationsproduktes, welches diese Hemmeigenschaft besitzt (POVPC, l-palmitoyl-2-(5)-oxovaleryl--?«-glycero- phosphatidylcholine), wobei die Struktur an der sn-2 Position essentiell für die Hemmeigenschaft ist, während die sn-1 Position (palmitoyl) sowie die Kopfgruppe

(Cholin) variabel sind.

3. Mechanismus der Hemmung: Oxidierte Phospholipide hemmen die Interaktion von LPS mit den für die LPS-TLR4 Interaktion notwendigen akzessorischen Proteinen LBP und CD14.

4. Medikamente zur Behandlung von Gram-negativer Sepsis auf der Grundlage der Strukturen und des Mechanismus des Hemmeffektes gemäß einem der voranstehenden Ansprüche.

5. Medikamente zur Immunmodulation, sowohl innate als auch adaptive immune responses, auf der Grundlage der Strukturen und des Hemmeffektes nach einem der voranstehenden Ansprüche.

6. Neutralisation von LPS sowohl bei in vitro als auch bei in vivo Experimenten durch Zusätze, z.B. für Zellkulturmedien.