KR20030073456A - 마이크로새틀라이트 표지인자를 이용한 진도개의 친자감별방법 - Google Patents

마이크로새틀라이트 표지인자를 이용한 진도개의 친자감별방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 마이크로새틀라이트 표지인자를 이용한 진도개의 친자감별 방법에 관한 것으로, 진도개에서 16개의 마이크로새틀라이트 표지인자를 선택하고, 이들의 대립유전자의 크기와 분포, PIC 값, 이형접합률, 배제력을 산출하고 각 표지인자들을 유전적 다형성 분석에 적용함으로써, 아직까지 외모에 대한 육안적 판단이 중심이 되어 품종판별이나 심사를 실시하는 종래 기술에 비해 진도개 품종 및 친자확인 방법이 훨씬 안정적이며 거의 100%의 정확성과 재현성을 가지고 신속 정확하게 진도개의 유전적 다형성을 분석할 수 있는 매우 뛰어난 효과가 있다.

Description

마이크로새틀라이트 표지인자를 이용한 진도개의 친자감별 방법{Paternity testing of native Jindo dog by microsatelite marker}
본 발명은 마이크로새틀라이트 표지인자를 이용한 진도개의 친자감별 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 진도개에서 발견되는 여러 선택적인 마이크로새틀라이트 표지인자(microsatelite marker)들의 대립유전자의 크기와 분포, PIC 값, 이형접합률, 배제력을 산출하여 유전적 표지인자를 확보하고, 또한 이들 각 표지인자들을 진도개의 유전적 다형성에 적용하는 신속하고 간편한 진도개의 친자감별 방법에 관한 것이다.
개는 사람에게 애완동물(pet animal) 혹은 반려동물(companion animal)로서뿐만 아니라 재난 구조견, 목축견, 경비견, 경찰견 그리고 군용견 등 다양한 실용적 목적을 위해 사육되고 있으며 특히 사회가 도시화, 핵가족화, 노령화 되어가면서 삶의 반려자로서 개의 역할이 점점 더 중요하게 여겨지고 있다(Dossey L (1997) The healing power of pets: a look at animal-assisted therapy.Altern Ther Health Med3: 8-16.; Jorgenson J (1997) Therapeutic use of companion animals in health care.Image J Nurs Sch29: 249-254.). 이러한 개는 인간의 육종의지에 따라 다양한 목적으로 개량되어 왔으며 현재 약 400품종 이상이 세계 각지에 분포되어 있다. 이러한 품종들은 품종 고유의 형태 및 성질을 가지고 있으며 이러한 특성이 순종견 혈통에 따라 비교적 잘 유지되고 있다(Clutton-Block J. Man-made animals; Dogs. In: Mason IL, editor. A Natural History of Domesticated Mammals. Cambridge University Press, Cambridge. 1987 pp. 34-35.). 외국에서는 1874년 이후로 많은 애견협회(Kennel club)들이 생겨났으며 말과 같은 가축에서 등록을 위해 필수적으로 실시하고 있는 친자감별을 개에서는 오랜 기간 동안 적용시키지 않았으나 최근에 들어서는 실시하고 있다(Binns MM, Holmes NG, Marti E and Bowen N (1995) Dog parentage testing using canine microsatellites.J Small Anim Pract36: 493-497.). 국내의 고유한 품종으로는 진도개를 비롯하여 풍산개, 삽살개 등이 있으며 이러한 토종견들에 대한 관심도가 증가하면서 여러 순종견의 정확한 혈통관리에 대한 필요성이 커지고 있으나 우리 나라의 경우 순종견의 관리는 많은 애견협회나 기관에서 통일된 기준에 의해 실시하지 않고 있어서 순종견 등록업무의 일관성과 신뢰성에 의문이 제기되는 경우가 많은 실정이다. 특히 진도개는 천연기념물 제 53호로 지정되어 보호받고 있으며 많은 애견가들에 의하여 사육되고 있으나 아직까지 외모에 대한 육안적 판단이 중심이 되어 품종판별이나 심사를 실시하고 있으므로 진도개와 같은 우리 고유의 유전자원을 보호, 육성하고 하나의 우수 품종으로 확보하기 위해서는 근친교배를 막아 우수 품종의 혈통관리가 이루어져야 할 것이다.
이처럼 동물 육종분야에서 혈통의 정확한 결정과 순종 등록의 효과적인 조절은 매우 중요하여 혈액형 분석과 혈청 단백질 다형 분석들이 혈통관리를 위한 전통적인 방법으로 많이 사용되어 왔었다(Fredholm M and Wintero AK (1995) Variation of short tandem repeats within and between species belonging to the Canidae family.Mamm Genome6: 11-18.). 그러나 최근 분자유전학과 DNA 분석기술의 발달로 유전자 분석법이 다른 방법들에 비하여 정확도가 높으며 분석방법도 간편하기 때문에 혈통관리를 위해서 많이 행해지고 있다(Pihkanen S, Vainola R and Varvio S (1996) Characterizing dog breed differentiation with microsatellite markers.Anim Genet27: 343-346.). 이 유전자 분석에 의한 친자감별법에는 minisatellite를 이용한 유전자 지문법(DNA fingerprinting), 제한효소 절편다형 분석법(Restriction Fragment Length Polymorphism)과 microsatellite 분석법 등이 있으며(Fredholm M and Wintero AK (1996) Efficient resolution of parentage in dogs by amplification of microsatellites.Anim Genet27: 19-23.; Wager JL, Brunett SA, DeRose LV, Francisco RS and Ostrandr EA (1996) Histocompatibility testing of dog families with highly polymorphicmicrosatellite markers.Transplantation62: 876-877.;Zajc I and Sampson J (1996) DNA microsatellites in domesticated dogs: application in paternity disputes.Pflugers Arch431: 201-202.;Alford RL, Hammond HA, Coto I and Caskey CT (1994) Rapid and efficient resolution of parentage by amplification of short tandem repeats.Am J Hum Genet55: 190-195.;Zajc I, Mellersh C, Kelly EP and Sampson J (1994) A new method of paternity testing for dogs, based on microsatellite sequences.Vet Rec135: 545-547.; Mellersh CS and Ostrander EA (1997) The canine genome.Adv Vet Med40: 191-216.; Ostrander EA, Sprague GF Jr and Rine J (1993) Identification and characterization of dinucleotide repeat (CA)n markers for genetic mapping in dog.Genomics16: 207-213.) 대부분의 국가에서는 이와 같은 방법을 사용하여 국제동물유전협회 (International Society for Animal Genetic)의 기준에 따라 소, 돼지 및 말들의 순종 보존 등 육종 분야에 이용하고 있다(Fredholm M and Wintero AK (1996) Efficient resolution of parentage in dogs by amplification of microsatellites.Anim Genet27: 19-23.). 그러나 개와 같은 반려동물에서도 효과적인 품종분류방법이 요구되고 있지만 단지 몇 개의 연구소에서만 locus-specific probe법(Joseph SS and Sampson J (1994) Identification, isolation and characterization of canine minisatellite sequences.Anim Genet25: 307-312.)이나 polymorphic canine microsatellite법(Holmes NG, Humphreys SJ, Binns MM, Curtis R, Holliman A and Scott AM. (1993) Characterization of caninemicrosatellites. EXS. 67: 415-420.; Holmes NG, Strange NJ, Binns MM, Mellersh CS and Sampson J (1994) Three polymorphic canine microsatellites.Anim Genet25: 200.;Ostrander EA, Sprague GF Jr and Rine J (1993) Identification and characterization of dinucleotide repeat (CA)n markers for genetic mapping in dog.Genomics16: 207-213.;Zajc I, Mellersh C, Kelly EP and Sampson J (1994) A new method of paternity testing for dogs, based on microsatellite sequences.Vet Rec135: 545-547.;Francisco LV, Langston AA, Mellersh CS, Neal CL and Ostrander EA (1996) A class of highly polymorphic tetranucleotide repeats for canine genetic mapping.Mamm Genome7: 359-362.;Fredholm M and Wintero AK (1996) Efficient resolution of parentage in dogs by amplification of microsatellites.Anim Genet27: 19-23.) 등으로 유전자분석법을 발전시켜 친자감별을 비롯한 개의 등록업무에 활용하고 있다(Koskinen MT and Bredbacka P (1999) A convenient and efficient microsatellite-based assay for resolving parentages in dogs.Anim Genet30: 148-149.).
사람이나 동물의 친자감별에 사용되는 마이크로새틀라이트(microsatellite)와 미니새틀라이트(minisatellite)는 일정한 염기서열이 반복되는 DNA군 (repetitive DNA group)으로 게놈 내에 골고루 분포하고 매우 높은 다형성을 나타내는 비암호화 DNA 서열(non-coding DNA sequence)에 속한다(Zajc I and Sampson J (1999) Utility of canine microsatellites in revealing the relationships of pure bred dogs.J Hered90: 104-107.). 이러한 반복적 DNA 서열의 종류에는 반복단위가 5∼100 bp정도 되며 100 Mb 정도의 크기를 가진 부수체 DNA(satellite DNA), 반복단위의 크기 범위가 15∼30 bp정도 되며 전체크기는 0.5∼30 kb 정도되는 미니새틀라이트 DNA, 그리고 마지막으로 2∼6개의 염기가 반복되며 포유류의 게놈 내에서 높은 다형성을 지닌 것으로 알려진 마이크로새틀라이트 DNA (microsatellite DNA)가 있으며, 미니새틀라이트(minisatellite)와 마이크로새틀라이트(microsatellite)는 특정 좌위에서 반복단위의 반복수에 따라 개체간의 다양성이 인정된다(Koreth J, O'Leary JJ and McGee JO (1996) Microsatellites and PCR genomic analysis.J Pathol178: 239-248.).
개나 사람 집단에서의 유전적 분석방법에 사용되는 마이크로새틀라이트와 미니새틀라이트 중에서 미니새틀라이트의 다형성은 유전자 지문법으로 분석할 수 있는데 1987년 Morton 등에 의해 사람 이외의 동물에도 미니새틀라이트가 존재하는 것이 알려지고 같은 해 개에 미니새틀라이트를 이용한 친자감별이 처음 적용되었다 (Morton DB, Yaxeley RE, Patel I, Jeffreys SJ and Debenham (1987) Use of DNA fingerprint analysis in identification of the sire.Vet Rec121: 592-594.). 유전자지문법은 반복단위의 염기서열을 프로브(probe)로 사용하여 특정좌위의 미니새틀라이트(minisatellite)를 검출하는 기법으로 한 개체 내에서 크기가 다른 여러 좌위에 프로브가 결합하여 사다리 모양의 밴드를 나타내며 이러한 밴드패턴은은 개체간에 밴드의 수와 크기에서 차이를 보이며 개체 식별의 도구로 이용될 수 있는 방법으로써(Zajc I, Mellersh C, Kelly EP and Sampson J (1994) A new method of paternity testing for dogs, based on microsatellite sequences.VetRec135: 545-547.) 이러한 기법은 법의학(Gill P, Jefferey AJ and Weret DJ (1985) Forensic application of DNA 'fingerprints'Nature318: 577-579.)과 친자감별(Jeffreys AJ, Brookfield JFY and Semenoff R (1985) Positive identification of an immigration test-case using human DNA fingerprints.Nature317: 818-819.)에 성공적으로 적용되었다. 그러나 유전자지문법의 경우 사용되는 프로브는 반복단위의 염기서열을 이용하기 때문에 같은 반복단위를 가지는 여러 좌위가 있는 경우 DNA 밴드는 사다리 모양으로 나타나며 이러한 경우에 법의학에 적용하기는 유리하지만 각각의 밴드가 어떤 좌위의 밴드인지는 구별이 어려워진다. 또한, 미니새틀라이트(minisatelite)의 다형성을 분석하는 제한효소 절편다형 분석법은 제한효소들을 이용하여 여러 가지의 크기로 게놈 DNA를 절단하고 특정한 DNA 프로브와의 상동성에 의해 유전적 다양성을 연구하는 방법이다. 그러나 제한효소 절편다형 분석법은 이형질성이 낮으며 이것을 검사하는 데 서던 블릇(Southern blot) 기법을 이용하기 때문에 시간이 오래 걸리고 많은 노력이 든다. 게다가 미니새틀라이트(minisatellite)는 주로 염색체의 끝에 위치하는 경향을 보이므로 게놈 전체의 검색 표지인자로 사용하기는 어렵다.
포유류의 게놈내에서 미니새틀라이트(minisatellite) 이외에 높은 다형성을 보이는 마이크로새틀라이트(microsatellite)도 유전적 분석방법에 사용된다(Wager JL, Brunett SA, DeRose LV, Francisco RS and Ostrandr EA (1996) Histocompatibility testing of dog families with highly polymorphic microsatellite markers.Transplantation62: 876-877.; Zajc I and Sampson J(1996) DNA microsatellites in domesticated dogs: application in paternity disputes.Pflugers Arch431: 201-202.;Binns MM, Holmes NG, Marti E and Bowen N (1995) Dog parentage testing using canine microsatellites.J Small Anim Pract36: 493-497.). 마이크로새틀라이트(microsatellite)는 다른 유전자들과 마찬가지로 멘델의 유전법칙에 따라 자식에게 전달되며 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)을 이용하여 증폭할 수 있고, 전기영동을 할 경우 공우성(co-dominant)의 양상을 보인다. 또한 마이크로새틀라이트(microsatellite)는 포유류의 게놈 전반에 고루 분포하며 그 수가 매우 많이 존재하고 유전적 다형성 정도가 크기 때문에 인간유전체프로젝트(human genome project)에서 100 kilobase pair의 거리에 한 개씩의 검색표지인자를 설정하고 있다. 마이크로새틀라이트 (icrosatellite)는 PCR을 이용하여 증폭하기 때문에 염색체의 특정 부위만을 증폭시킬 수 있어 분석이 가능하다. 뿐만 아니라, DNA 지문법(DNA fingerprinting)과는 달리 소량의 DNA 재료만 있어도 분석이 가능하여 혈액은 물론 머리카락의 모근, 그리고 DNA의 양이 매우 적게 존재하는 화석이나 박물관의 유골등 DNA를 얻을 수 있는 재료면 어느 것이든 이용 가능하다(Binns MM, Holmes NG, Marti E and Bowen N (1995) Dog parentage testing using canine microsatellites.J Small Anim Pract36: 493-497.). 특히 마이크로새틀라이트(microsatellite)는 크기가 작기 때문에 2개에서 최대 8개까지의 프라이머(primer)를 동시에 증폭할 수 있으므로 (Chamberlain JS, Gibbs RA, Ranier JE, Nguyen PN and Caskey CT (1988) Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNAamplification.Nucleic Acids Res16: 11141-11156.) 유전자의 다형성을 분석하는데 시간과 비용을 줄일 수 있으며 민감성과 정확성이 높은 결과를 얻을 수 있고 최근 형광물질을 부착한 프라이머를 이용한 PCR의 사용으로 더욱 정확도와 재현성이 증가되었다(Hearne CM, Ghosh S and Todd JA (1992) Microsatellites for linkage analysis of genetic traits.Trends Genet8: 288-294.). 그래서 이와 같은 마이크로새틀라이트(microsatellite)는 가축의 분자육종분야에도 이용가치가 대단히 높으며 근친교배에 의한 퇴화를 방지하는 데 유용할 뿐만 아니라 특정형질을 선택하는 것에도 이용될 수 있다고 한다.
그러나 진도개와 같은 순수한 품종 집단에서는 이 마이크로새틀라이트 (microsatellite)법을 이용한 유전적 다형 분석이 많이 실시되지 않았으며 유전적 대립유전자 빈도(allele frequencies)와 친자감별에 대한 보고도 드문 실정이었다.
본 발명자들은 아직까지 진도개의 확실한 친자감별법이 확립되어있지 않은 상태에서 행해지고 있는 경험적 육안판별 기준이 안고 있는 문제점과 한계성을 극복하기 위하여 보다 신속하고 정확한 판별기술을 개발하고자 지금까지 보고된 마이크로새틀라이트 표지인자(microsatellite marker) 가운데 비교적 PIC(polymorphic informative content) 값이 높은 표지인자 16개를 선택하여 진도개에서 마이크로새틀라이트(microsatellite)를 이용한 친자감별 및 그 유용성을 분석하고, 분석한 마이크로새틀라이트 표지인자(microsatellite marker)의 multiplex PCR로의 활용능력및 조건이 같은 표지인자들을 조합하였을 경우 친자감별에의 유용성을 검토한 결과, 사용된 16개 표지인자들 모두 0.6이상의 PIC 값을 나타내었고, 2016, 2132, 2146, 2158, 2165, 2131, 2137, 2138, 137 marker에서는 0.8이상의 높은 PIC 값을 얻었으며, 134, RVC1, CCX30를 제외한 모든 표지인자에서 0.5 이상의 배제력을 나타내었을 뿐만 아니라, 같은 조건의 표지인자를 조합하여 사용하였을 때는 0.99이상의 배제력을 나타내었기 때문에, 이러한 마이크로새틀라이트 표지인자 (micosatellite marker)들이 진도개의 순수혈통 고정을 위한 유전적 표지인자로 이용될 수 있고, 또한 신속하고 간편하게 진도개의 친자감별을 행하는데도 유용하게 사용될 수 있음을 확인하고는 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 마이크로새틀라이트 표지인자들을 이용하여 신속하고 간편하게 진도개의 개체확인 및 친자감별을 수행하는 분석방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 구성 및 작용효과를 보다 상세히 설명한다. 본 발명의 다른 목적들 및 잇점들은 하기 구성에 의해 보다 명백히 이해될 것이다.
도 1은 Genotype 소프트웨어를 사용하여 대립유전자의 크기를 표시한 것으로, CCX30 유전자좌에서 대립유전자의 크기는 149bp, 157 bp (Dog), 149 bp (Bitch) 및 149 bp (Litter 1, 2, 3)이었다.
도 2는 Genotype 소프트웨어를 사용하여 대립유전자의 크기를 표시한 것으로, 2137 유전자좌에서 대립유전자의 크기는 170 bp 및 174 bp (Bitch), 166 bp 및 180 (Dog), 174 bp 및 180 bp (Litter 1), 170 bp 및 180 bp (Litter 2), 166 bp 및 170 bp (Litter 3)이었다.
도 3은 Genotype 소프트웨어를 사용하여 대립유전자의 크기를 표시한 것으로, 2138 유전자좌에서 대립유전자의 크기는 326 bp 및 380 bp (Dog), 278 bp 및 342 (Bitch), 342 bp 및 380 bp (Litter 1), 326 bp 및 342 bp (Litter 2, 3)이었다.
도 4는 Genotype 소프트웨어를 사용하여 대립유전자의 크기를 표시한 것으로, 2161 유전자좌에서 대립유전자의 크기는 244 bp 및 260 bp (Bitch), 240 bp 및 256 (Dog), 240 bp 및 244 bp (Litter 1, 2), 256 bp 및 260 bp (Litter 3), 252bp 및 256 bp (Control)이었다.
도 5는 Genotype 소프트웨어를 사용하여 대립유전자의 크기를 표시한 것으로, 134 유전자좌에서 대립유전자의 크기는 128 bp 및 134 bp (Bitch), 126 bp 및 128 bp (Dog), 126 bp 및 134 bp (Litter 1), 126 bp 및 128 bp (Litter 2), 128 bp 및 1134 bp (Litter 3), 126 bp 및 130 bp (Control)이었다.
도 6은 Genotype 소프트웨어를 사용하여 대립유전자의 크기를 표시한 것으로, 2158 유전자좌에서 대립유전자의 크기는 284 bp(Bitch), 284 bp 및 296 (Dog), 284 bp 및 296 bp (Litter 1), 284 bp(Litter 2), 316 bp 및 328 bp (Control)이었다.
본 발명의 상기 목적은 먼저, 아직까지 확실한 친자감별법이 확립되어있지 않은 진도개에서 비교적 PIC(polymorphic informative content) 값이 높은 마이크로새틀라이트 표지인자 16개를 선택하고, 이를 이용하여 진도개에서 친자감별 및 그 유용성을 분석함으로써 달성되었다.
본 발명은 진도개에서 발견되는 여러 선택적인 마이크로새틀라이트 표지인자(microsatelite marker)들의 대립유전자의 크기와 분포, PIC 값, 이형접합성, 배제력을 산출하고 이들 표지인자들을 진도개의 개체확인이나 친자감별에 적용하는 진도개의 친자감별 방법에 관한 것으로, 진도개의 세포나 조직, 또는 털이나 혈액으로부터 게놈 DNA을 분리하고 진도개에 대한 선택적 감별력이 높은 방사성 또는 형광물질 표지된 프라이머(표지인자)를 합성하고 이를 이용하여 게놈 특정 분위를 PCR증폭한 후에 마이크로새틀라이트 표지인자 분석을 통해 진도개의 유전적 다양성, 예컨대 개체확인이나 친자감별을 행하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 사용된 마이크로새틀라이트 표지인자(microsatelite marker)는 지금까지 진도개의 마이크로새틀라이트 유전자 다형분석에 의해 보고된 디뉴클레오티드 표지인자(dinucleotide marker)인 134, 137, RVC1, RVC8 4개(봉영훈 (2000) Genetic Characteristics and Individual relationship of the Jindo by polymorphism analysis of microsatellites. 석사학위논문, 전남대학교.), 테트라뉴클레오티드 표지인자(tetranucleotide maker)인 2004, 2016, 2097, 2132, 2146, 2149, 2158, 2161, 2164, 2165, 2175 10개(채영진, 이병천, 이항 (1998) 유전자감식에 의한 개에서의 친자감별. 한국임상수의학회지 15: 274-278.)와 2137, 2138, 2159, 2201 4개(김민지 (2001) Microsatellite Marker를 이용한 진도개의 유전적 특성 분석. 석사학위논문, 전남대학교.), 2131, CCX30, CCX130(2000년도 진도개 시험연구 성과 보고서 (2001) 진도군 진도개보육관리소.) 3개 중 테트라뉴클레오티드 표지인자(tetranuclotide marker)인 2004, 2016, 2132, 2146, 2158, 2161, 2165, 2137, 2138, 2131 9개와 디뉴클레오티드 표지인자(dinuclotide marker)인 134,137, RVC1, RVC8, CCX30, CCX130 6개를 포함하여 총 16개의 표지인자들이며, 이들 표지인자를 이용하여 진도개 친자감별 가능성을 검토한 후 분석한 마이크로새틀라이트 표지인자(microsatellite marker)를 조합하여 multiplex PCR로의 활용 가능성과 신속하고 정확한 친자감별법을 확립하기 위하여 본 발명을 완성하였다.
우선 개에서 유전자 분석에 의한 신속하고 정확한 친자감별 및 개체확인을 위하여 본 발명자들은 ABI prism 377 genetic analyzer(PEApplied Biosystems, USA)을 사용함으로써 최대 36개의 재료를 동시에 분석할 수 있어 분석시간을 줄일 수 있었다. 또한 전기영동상을 육안적으로도 확인할 수 있어 각각의 샘플 간의 간섭여부를 일차적으로도 구별할 수 있어서 더 정확한 결과를 얻을 수 있었으며 Genotyper라는 컴퓨터 프로그램을 사용함으로써 전기영동상의 염색이 필요하지 않아 분석을 신속하고 정확하게 할 수 있었다.
GenotyperTMsoftware(PEApplied Biosystems, USA)를 이용하여 친자감별을 행한 결과 도 1에서와 같이 부견에서는 149, 157 bp에서 이형접합(heterozygous)을 형성하였고, 모견에서는 149 bp에서 동형접합(homozygous)을 형성하였다. 마이크로새틀라이트(microsatellite)의 자견으로의 유전은 부견과 모견에서 하나씩 유전된다는 사실에 입각하여 세 마리의 자견 모두 149 bp에서 동형접합(homozygous)을 형성하여 친자임을 확인하였고 도 2와 도 3에서도 마찬가지로 부견과 모견이 가지고 있는 대립유전자 중 하나씩을 유전받는다는 것을 확인함으로써 친자임을 확인하였다. 도 4에서는 대조군(control)으로 임의의 진도개 자견을 같이 분석하였을때, 모견에서는 244와 260 bp에서 이형접합(heterozygous), 부견에서 240와 256 bp에서 이형접합(heterozygous), 세 마리 자견에서는 240, 244, 256 bp에서 이형접합(heterozygous)으로 나타나 친자임을 확인하였으나 임의의 진도개 자견에서는 252 bp와 256 bp에서 형성되어 252 bp는 부견과 모견이 모두 가지고 있지 않으므로 친자가 아님을 확인하였다. 도 5와 도 6도 같은 방법으로 분석한 결과 대조군이 친자가 아님을 확인하였다.
PIC 값은 대립유전자의 빈도뿐만 아니라 대립유전자의 수에 의해서도 영향을 받기 때문에 동물의 다양성을 조사하는데 좀더 좋은 평가지표를 제공하는 것으로 알려지고 있는데(Zajc I, Mellersh CS and Sampson J (1997) Variability of canine microsatellites within and between different dog breeds.Mamm Genome8: 182-185.) 본 발명자들은 진도개에서 16개의 마이크로새틀라이트를 분석한 결과 PIC 값이 모든 표지인자에서 0.6 이상 되었으며 그중 0.8이상의 높은 PIC 값을 나타내는 표지인자도 9개였다 (표 7). 이러한 결과와 채 등(1998), 봉 (2000), 김 (2001)의 연구 그리고 진도개 연구결과 보고서 (2001)에서의 PIC 값을 비교하였을 때에 각각의 연구에 사용된 진도개의 마리수에 차이가 있었을지라도 각각의 표지인자들에 대한 PIC 값은 거의 유사하였다. 이러한 표지인자들이 진도개의 유전자 다형분석과 친자감별 등 게놈 분석에 좋은 표지인자로 이용될 수 있을 것으로 판단된다.
친자감별의 지표로서 마이크로새틀라이트(microsatellite) 유용성의 유무는 산출된 배제력(exclusion power)를 측정함으로써 이 표지인자가 어느 정도 감별능력을 가지는지를 나타내는 지표로 이용되고 있다(Jamiesonet al., 1996). 또한 높은 다형성을 나타내는 마이크로새틀라이트(microsatellite) 표지인자는 대부분의 견종에서 친자감별을 위한 좋은 지표로 사용되며 이러한 다형성이 높은 표지인자들이 많이 선택되어짐으로써 배제력은 증가하나 어떤 일정한 수준에 이르면 그 값은 크게 변하기 않는데 이것을 " plateae value"라 표현했다(Zajcet al., 1997). 이렇듯 많은 다형성을 가진 표지인자를 확보하는 일도 중요하지만 이러한 친자감별을 위한 표지인자의 선택은 신중을 기해야 하며 대립유전자가 없는 표지인자나 돌연변이율이 높은 표지인자를 제외하는 것도 매우 중요한데, 본 발명에서 사용된 16개의 표지인자들 중에서 134, RVC1, CCX30을 제외한 모든 표지인자들이 0.5 이상의 배제력을 나타내었으며, 9개의 표지인자에서는 0.7 이상의 높은 배제력을 나타내었다(표 8).
한편, Zajc 등(1994)은 순종개에서 친자감별을 위한 프로브로서의 다양한 DNA 염기서열의 사용에서 문제점 중에 하나는 근친교배(inbreeding)와 동족교배 (line breeding)의 결과로 사람보다는 개에서 DNA 수준에서 매우 유사하기 때문에, 이러한 유전적 동질성(genetic homogenity)의 증가가 마이크로새틀라이트의 프로브로서의 사용을 어렵게 만들 수 있다고 보고한 바 있으며, 이들은 실제 20개의 마이크로새틀라이트 표지인자를 친자감별에 성공적으로 이용한 바 있으나, 본 발명자들은 16개의 표지인자가 모두 프로브로 사용될 수 있고 이들 표지인자들을 조합적으로 사용할 경우 친자감별을 신속하고 간편하게 수행할 수 있음을 확인하였다(표 7).
본 발명의 한 바람직한 실시예에 있어서, 마이크로새틀라이트의 테트라뉴클레오티드 표지인자(tetranucleotide marker) 10개를 조합하고 디뉴클레오티드 표지인자(dinucleotide marker) 6개를 조합하여 친자감별을 했을 때에 각각의 경우에 대한 배제력과 이 결과의 의미는 다음과 같았다. 즉, 테트라뉴클레오티드 표지인자를 조합했을 때 부모견 중에서 어느 한쪽을 알고 있는 경우와 부모견 모두 알수 없는 경우 모두 0.9999의 배제력을 나타냈고 이것은 모견 혹은 부견 둘 중 하나를 알고 있는 경우 무작위로 개체를 선택하여 검사했을 때 10,000마리 중에서 9,999마리는 친부견 혹은 친모견이 아니라고 판정을 할 수 있고 모견과 부견 모두 알 수 없는 경우에도 10,000마리 중 9,999마리는 친자관계에서 제외시킬 수 있다는 것을 의미하고 있다. 또한 디뉴클레오티드 표지인자(dinucleotide marker)의 조합에서는 부모견 중 한쪽을 알고 있을 경우에는 0.9905, 부모견을 모두 알 수 없는 경우에는 0.9323의 배제력을 나타내었고 이는 모견과 부견 둘 중 하나를 알고 있는 경우에 무작위로 개체를 선택하여 검사를 했을 때 10,000마리 중 9,905마리는 친부견 혹은 친모견이 아니라고 판정을 할 수 있고, 모견과 부견을 모두 알 수 없는 경우에도 10,000마리의 무작위로 선택한 개체 중에서 9,323마리는 친자관계에서 제외시킬 수 있다는 의미이다 (표 10).
실제 친자감별시에는 모든 표지인자를 다 사용할 필요가 없으므로 증폭조건과 부착된 형광물질의 차이를 고려하여 적당한 조합을 만들어 보면 표 9와 같았다. 테트라뉴클레오티드 표지인자(tetranucleotide marker)의 조합 1과 2에서는 0.99이상의 배제력을 나타내었고, 디뉴클레오티드(dinucleotide marker)의 조합 3과 4에서도 0.90에 가까운 배제력을 나타내었다. 기존 보고에 의하면 Fredholm 등 (1996)은 CPH2, CPH3, CPH5, CPH6, CPH8, CPH9, CPH10, CPH11, CPH13, CPH14, CPH15, CPH16 총 12개 마이크로새틀라이트 표지인자(microsatellite marker)를 12품종의 개에 적용하여 얻은 배제력은 각각 0.310, 0.381, 0.223, 0.395, 0.220, 0.295, 0.109, 0.278, 0.240, 0.336, 0.170, 0.274로 12개 모두가 0.5이하의 낮은 배제력을 얻었고, 이것들을 조합하여 사용하였을 때는 0.9784였으며, 또한 Koskinen 등 (1999)도 10개의 마이크로새틀라이트 유전자좌(microsatellite loci)를 Labrador Retriever, German Shepherd, Golden Retriever, Finnish Hound 4 품종의 부모견 중에서 하나만 알고 있다는 가정하에 Jamieson (1994)에 의해 고안된 공식에 의한 배제력은 단지 Labrador Retriever에서 사용된 locus CXX.2132이 가장 높은 0.74값을 얻었고 사용된 marker를 조합하여 사용하였을 경우 배제력은 각각 0.9978 (Labrador Retriever), 0.9946 (German Shepherd), 0.9934 (Golden Retriever), 0.9993 (Finnish Hound)이었는데, 이러한 기존 결과들을 본 발명과 비교하였을 때 본 발명의 16개의 표지인자 중 13개가 0.5이상의 값을 나타내었고 이 중에서 9개는 0.7이상이었다. 조건이 같은 표지인자들을 조합하여 사용할 경우(표10) 에도 0.99이상의 높은 배제력을 보임으로써 본 발명에 사용된 마이크로새틀라이트 표지인자(microsatellite marker)들은 기존의 보고에 의한 것보다는 더욱 친자감별에 효과적으로 적용될 수 있을 것으로 판단된다.
이하, 본 발명의 구성을 하기 실시예를 통하여 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적일 뿐 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예
실험예 1 : 혈액재료의 채취
진도개 보육관리소에서 사육되는 진도개 9복 36두의 요골쪽 피부정맥 (Cephalic vein)에서 5 ㎖을 채혈하여 항응고제인 Acid Citrate Dextrose (ACD)로 처리하여 혈액응고를 방지하였으며 처리된 혈액을 아이스박스에 담아 24시간 이내에 실험실로 운반하여 DNA를 분리하였다(표 1).
진도개의 친자감별을 위한 DNA 샘플
No. Dog / Bitch Litter Sex No. Dog / Bitch Litter Sex
1 D1 M 19 D4B4 F
2 D2 M 20 B5 F
3 D3 M 21 B5 M
4 D4 M 22 B5 F
5 B1 F 23 B6 F
6 D1B1 M 24 B6 F
7 D1B1 F 25 B6 M
8 D1B1 M 26 B6 F
9 B2 F 27 B7 F
10 D2B2 M 28 D2B7 M
11 D2B2 F 29 D2B7 M
12 B3 F 30 B8 F
13 D3B3 F 31 D3B8 M
14 D3B3 F 32 D3B8 M
15 D3B3 F 33 D3B8 F
16 B4 F 34 B9 F
17 D4B4 M 35 B9 F
18 D4B4 F 36 B9 F
D, dog; B, bitch; L, litter.
실험예 2 : 게놈 DNA의 분리
Genomic DNA 분리는 phenol/chloroform extraction 방법 (Blin and Stafford, 1976) 또는 Dr. GenTLETMkit (Takara Biomedical Co. Japan)을 사용하여 DNA를 분리하였다.
(1) 페놀/클로로포름 DNA 추출
5 ㎖의 전혈을 13,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 상층의 plasma를 제거한 후 조심스럽게 buffy coat를 수거하여 microcentrifuge tube에 옮긴 다음 0.5 ㎖의 DNA extraction buffer (10mM Tris-cl pH 8.0 ; 20 ㎕/㎖ RNAase, 0.5% SDS)를 첨가한 후 37℃에서 1시간 방치시켰다. 그 후 proteinase K (100 ㎕/㎖)를 넣고 50℃에서 3시간 동안 방치한 다음 동량의 phenol을 첨가하여 10분 동안 천천히 잘 혼합한 후 상온에서 13,000 rpm으로 15분간 원심분리하여 상층액을 새로운 microcentrifuge tube에 옮긴 다음 phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1)로 다시 이 과정을 2회 반복하였다. 상온에서 2배 용량의 100% ethanol을 첨가하여 잘 혼합한 후 13,000 rpm에서 5분동안 원심분리하여 70% ethanol로 2회 세척한 다음 상온에서 건조하여 TE buffer (pH 8.0)에 녹인 후 spectrophotometer에서 흡광도 (OD 260/280)를 측정하여 모든 DNA의 농도를 60 ng/㎕로 일정하게 한 후 PCR 반응에 이용하였다.
(2) Dr. GenTLETMkit (Takara Biomedical Co. Japan)를 이용하여 DNA 추출
Dr. GenTLETMkit에는 세 개의 용액이 포함되어 있는데 용액Ⅰ은 혈구세포, virus, 균체를 파괴하여 핵산과 전기적으로 중성인 복합체를 형성하고, 용액 Ⅱ는 세정, 정제의 기능을 가지고 있으며, 용액 Ⅲ는 순수한 DNA만을 분리하는 기능을 가지고 있다. 먼저 혈액 100 ㎕에 용액Ⅰ 0.5 ㎖을 혼합한 후 실온에서 15분간 방치하여 12,000 rpm에서 5분간 원심분리 하였다. 상층액을 제거한 후 용액Ⅱ 1 ㎖을 첨가하여 가볍게 혼합한 다음 12,000 rpm에서 2분간 원심분리한 후 다시 상층액을 제거한 후에 용액Ⅲ 0.5 ㎖을 첨가하여 12,000 rpm에서 5분간 원심분리 하였다. 상층액을 새로운 microcentrifuge tube에 옮기고 Isopropanol 0.5 ㎖를 혼합하여 4℃, 12,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 70% ethanol로 세정, 건조시켜 TE buffer (pH 0.8)에 녹인 다음 spectrophotometer에서 흡광도 (OD 260/280)를 측정하여 모든 DNA의 농도를 60 ng/㎕로 일정하게 한 후 PCR 반응에 이용하였다.
(3) 프라이머 합성과 형광물질 러벨링(labelling)
PCR반응을 위한 프라이머(primer)는 채 등 (1998), 봉 (2000), 김 (2001) 및 진도개 시험연구 보고서(2001)에서 보고된 표지인자(marker) 중에서 비교적 PIC 값이 높은 테트라뉴클레오티드(tetranucleotide) 마이크로새틀라이트 프라이머 2004(순방향 : 서열번호 1, 역방향 : 서열번호 2), 2016 (순방향 : 서열번호 3, 역방향 : 서열번호 4), 2132(순방향 : 서열번호 5, 역방향 : 서열번호 6), 2146(순방향 : 서열번호 7, 역방향 : 서열번호 8), 2158(순방향 : 서열번호 9, 역방향 : 서열번호10), 2161(순방향 : 서열번호 11, 역방향 : 서열번호 12), 2165(순방향 : 서열번호 13, 역방향 : 서열번호 14), 2131(순방향 : 서열번호 15, 역방향 : 서열번호 16), 2137(순방향 : 서열번호 17, 역방향 : 서열번호 18), 2138(순방향 : 서열번호 19, 역방향 : 서열번호 20)과 디뉴클레오티드 마이크로새틀라이트(dinucleotide microsatellite) 134(순방향 : 서열번호 21, 역방향 : 서열번호 22), 137(순방향 : 서열번호 23, 역방향 : 서열번호 24), RVC1(순방향 : 서열번호 25, 역방향 : 서열번호 26), CCX30(순방향 : 서열번호 27, 역방향 : 서열번호 28), CCX130(순방향 : 서열번호 29, 역방향 : 서열번호 30), RVC8(순방향 : 서열번호 31, 역방향 : 서열번호 32)를 선택하여 사용하였다. 선택한 프라이머는 6-FAM, HEX, 그리고 NED phisphoramiditis(PEApplied Biosystems)중 한가지를 가지고 형광물질표지된 올리고뉴클레오티드(fluorescent labelled oligonucleotide)를 합성하여 사용하였다. 본 발명에 사용한 프라이머들의 염기서열을 하기 표 2, 3에 나타내었다.
진도개의 친자감별을 위해 선택된 테트라뉴클레오티드 마이크로새틀라이트 표지인자(teranucleotide microsatellite markers)
Primer Sequence of primer
2004 F(서열번호 1): 6FAM-CTAAGTGGGGAGCCTCCTCTR(서열번호 2): ACTGTGACCTACTGAGG
2016 F:(서열번호 3) HEX-CATTTTTAAGGATGGAGAGACAGCR:(서열번호 4) AACAGTGTCCCATGGCCTAC
2132 F:(서열번호 5) 6FAM-CACTGGGAGTGGAGACTGCTR:(서열번호 6) TGCACAGCCAACTAGAGGTG
2146 F:(서열번호 7) HEX-GGGCTCCACTAAGCACTATCTR:(서열번호 8) TGCCATAACAAAGGCAAGGC
2158 F:(서열번호 9) NED-ATGGCCACATCACCCTAGTCR:(서열번호 10) CTCTCTCTGCATCTCTCATGAA
2161 F:(서열번호 11) HEX-TCAGCAAGAAACCCTCCAGTR:(서열번호 12) CATTCCCAACGGAGGACTC
2165 F:(서열번호 13) 6FAM-GGATGGAGTCCCACATCGR:(서열번호 14) CCTCACCCCAAATTCTTTAGC
2131 F:(서열번호 15) HEX-ATGAAGCCTCACGCCAAGR:(서열번호 16) TGATCACACTCATCTCCCCA
2137 F:(서열번호 17) NED-GCACTCCCTTATTCCAACATGR:(서열번호 18) CCCCAAGTTTTGCATCTGTT
2138 F:(서열번호 19) 6FAM- AATGTGCCCAACATTCCACTR:(서열번호 20) AAGTCCCATGTCAGGCTCC
진도개의 친자감별을 위해 선택된 디뉴클레오티드 마이크로새틀라이트 표지인자(dinucleotide microsatellite markers)
Primer Sequence of primer
134 F(서열번호 21): 6FAM-CAGTTCTAACACCCAGGAGTCCR(서열번호 22): GCTGGCTGGGAAAAATGA
137 F(서열번호 23): HEX-TACAGAGCTCTTAACTGGGTCCR(서열번호 24): CCTTGCAAAGTGTCATTGCT
RVC1 F(서열번호 25): NED-TCACTGCATATAGAATTAGGR:(서열번호 26) CCAATAGGCTGTGAGTGAAA
CCX30 F:(서열번호 27) HEX-GCCTTTTAGGGAGCTTTCTTTR:(서열번호 28) AAGTCCCACATCAGGCTCC
CCX130 F:(서열번호 29) 6FAM-ACAGGTTTTCCCATTGTATTGR:(서열번호 30) GAGTCTGCTTTTCTCCTTCCC
RVC8 F:(서열번호 31) NED-GCAAGCCAGCGAGGCTCTTGR:(서열번호 32) CCTGCGTATTCCGTGCCAGG
실험예 3 : Microsatellite의 증폭
PCR mixture조성은 총 15 ㎕로 5μM fluorescent dye-labelled primer 각각 1 ㎕, 2.5 mM MgCl21.5 ㎕, 10× Gene Amp PCR Gold buffer 1.5 ㎕, dNTP (각각250μM) 1.5 ㎕와 0.6 U AmpliTag Gold DNA polymerase (PEApplied Biosystems), template로 60 ng의 genomic DNA가 포함되었다. 분석을 위한 시간과 비용을 줄이기 위해 Perkin-Elmer 9600 thermocycler를 이용한 " Touch-down ” PCR 방법을 사용하였다 (Donet al., 1991; Mellershet al., 1994). Primer의 annealing 온도는 Francisco 등 (1996)을 참고하였으며 최적온도는 조건에 따라 조절하였다 (표 4, 5).
진도개의 친자감별을 위해 디뉴클레오티드 마이크로새틀라이트 증폭용으로 사용된 "Touch-down" PCR 과정
Initial incubation step 10 cycle 20 cycle FinalExtention Finalstep
Melt Anneal Extend Melt Anneal Extend
95℃12 min. 94℃ 58℃ 72℃ 89℃ 58℃ 72℃ 72℃10 min. 4℃∞
15 sec. 15 sec. 15 sec. 15 sec. 15 sec. 15 sec.
진도개의 친자감별을 위해 테트라뉴클레오티드 마이크로새틀라이트 증폭용으로 사용된 "Touch-down" PCR 과정
Initial incubation step 10 cycle 20 cycle FinalExtention Finalstep
Melt Anneal Extend Melt Anneal Extend
95℃12 min. 94℃ 61℃ 72℃ 89℃ 61℃ 72℃ 72℃10 min. 4℃∞
15 sec. 15 sec. 15 sec. 15 sec. 15 sec. 15 sec.
실험예 4 : 전기영동 및 DNA 절편 크기 측정
size standard 0.5 ㎕ (Gene Scan 500-ROX), PCR product 1 ㎕, deionized formamide 2.5 ㎕, 0.25 ㎕ loading buffer (25 mM EDTA, 50 ㎎/㎖ blue dextran)를 혼합한 후 gel loading 바로 전에 95℃에서 5분 가열하였으며 ABI prism 377 Genetic Analyzer (PEApplied Biosystems, U.S.A.)를 이용하여 polyacrylamide gel electrophoresis를 실시하였다. DNA단편 크기분석은 GenotyperTM(ver 2.5) software (PEApplied Biosystems, U.S.A.)를 이용하였다.
이상 실험예 1 내지 실험예4의 결과로부터 각 표지인자의 유용성을 대립유전자 빈도(allele frequency)와 Polymorphic informative content (PIC)값으로 측정하였으며 친자감별의 지표로서 마이크로새틀라이트(microsatellites) 유용성의 유무는 Jamieson 등 (1996)의 방법에 따라 산출된 배제력 (exclusion power)을 측정하여 비교하였다. 이형접합률(heterozygosity), PIC 값과 배제력은 cerves program (Marshallet al., 1998)을 이용하여 산출하였다.
PIC(polymorphic informative content)값은 다음과 같다 (Bosteinet al., 1980).
PIC= 1-∑n i=1Pi 2-2·∑i=1 n-1∑j=i＋1 nPi 2Pj 2,
Pi는 i번째 대립유전자가 나타나는 빈도이며 n은 대립유전자의 갯수이다.
chi-square값은 Hardy-weinberg 방정식에 의해 산출되어진다.
X2= (1-h0/hE)2·n, 여기서 h0와 hE는 관찰되는 heterozygosity와 기대되는heterozygosity값을 나타내며 n은 집단의 크기이다.
자유도 측정은df=r·r-1/2 (r: 한 유전자좌에서 allele수) (Hartlet al., 1988)
배제력은 전체 집단에서 무작위로 개체를 선택했을 때 비교하고자 하는 개체간에 서로 같은 대립유전자를 갖지 않을 확률로 친자 감별시에 이용하는 표지인자 어느 정도의 감별능력을 가지는지를 나타내는 지표로 이용된다 (Jamiesonet al., 1996).
양친부모 모두가 알려져 있을 때의 Exclusion Power산출방법은
P=∑ P(1-P)2-∑(Pi×Pj)2×〔4-3(Pi+Pj)〕이며
어느 한쪽부모가 알려져 있을 때의 Exclusion Power는
P=∑2PiPj(1-Pi-Pj)2+∑Pi2(1-Pi)2이다.
친자감별시의 확률적인 표현을 위하여 paternity index (PI) 및 probability of paternity (PP)를 사용하였으며 계산 방법은 다음과 같다.
1. Statistiscal frequency (SF) =δ=무작위로 선택한 개체가 일치하는 대립유전자를 가질 확률
2. β=친자관계가 성립될 때 일치하는 대립유전자가 나타날 확률
3. Paternity index (PI) 혹은 Likelihood Ratio (LR)=β/δ
4. Probability of paternity (PP) : [β/(β+δ)]×100(%)
16개의 마이크로새틀라이트 표지인자(microsatellite marker)들에 대한 대립유전자의 크기와 빈도를 표 6에 요약하였으며 각 표지인자에서 6∼27개의 다양한 대립유전자가 관찰되었다. 대부분의 표지인자들이 어느 일정 범위 내에 집중적으로 분포되어 있는 경향을 보였다.
진도개의 대립유전자 크기 및 빈도
Locus No Allele size(bp) Allelefrequency Locus No Allele size(bp) Allelefrequency
2004 1 236 0.0750 2132 19 334 0.0160
2 240 0.3500 20 338 0.0160
3 244 0.2950 21 342 0.0479
4 248 0.1650 22 350 0.0106
5 252 0.0850 23 358 0.0213
6 256 0.0300 24 362 0.0426
2016 1 285 0.0303 25 366 0.0266
2 289 0.0404 26 370 0.0266
3 293 0.1111 27 382 0.0106
4 297 0.1919 2146 1 334 0.0172
5 301 0.1111 2 338 0.0172
6 305 0.1364 3 342 0.1034
7 309 0.1515 4 354 0.0690
8 313 0.0707 5 362 0.1552
9 317 0.0909 6 366 0.1379
10 321 0.0657 7 378 0.1724
2132 1 242 0.0106 8 382 0.1552
2 250 0.0266 9 386 0.0517
3 254 0.0213 10 428 0.0345
4 262 0.0372 11 430 0.0345
5 266 0.0319 12 432 0.0172
6 270 0.0426 13 436 0.0345
7 274 0.0319 2158 1 240 0.0102
8 278 0.0319 2 268 0.0428
9 282 0.0638 3 276 0.0408
10 286 0.0213 4 280 0.0153
11 294 0.0053 5 284 0.2908
12 298 0.0053 6 288 0.0714
13 302 0.0266 7 292 0.0357
14 306 0.3511 8 296 0.0714
15 310 0.0106 9 300 0.0510
16 314 0.0266 10 304 0.0204
17 318 0.0266 11 308 0.1071
18 322 0.0106 12 312 0.0561
Locus No Allele size(bp) Allelefrequency Locus No Allele size(bp) Allelefrequency
2158 13 316 0.1429 10 383 0.0798
14 328 0.0255 11 387 0.1223
15 340 0.0204 12 391 0.1436
2161 1 240 0.1875 13 395 0.0957
2 244 0.2188 14 399 0.0106
3 248 0.2344 15 403 0.0053
4 252 0.2500 2137 1 154 0.0404
5 256 0.0938 2 158 0.1111
6 260 0.0156 3 162 0.0354
2165 1 273 0.0161 4 166 0.0657
2 297 0.0161 5 170 0.2020
3 301 0.2097 6 174 0.1919
4 313 0.0323 7 178 0.0707
5 317 0.161 8 182 0.1364
6 321 0.1290 9 186 0.0253
7 325 0.0323 10 190 0.0657
8 329 0.0806 11 194 0.0404
9 341 0.0161 12 198 0.0152
10 353 0.0161 2138 1 262 0.1765
11 357 0.1774 2 266 0.1618
12 373 0.0968 3 270 0.0441
13 381 0.0484 4 274 0.2059
14 385 0.0161 5 286 0.0588
15 393 0.0645 6 326 0.0441
16 397 0.0323 7 336 0.0882
2131 1 339 0.0266 8 342 0.0882
2 351 0.1223 9 362 0.0294
3 355 0.0532 10 366 0.0147
4 359 0.0532 11 378 0.0294
5 363 0.0638 12 384 0.0294
6 367 0.0638 134 1 120 0.0059
7 371 0.0372 2 122 0.0118
8 375 0.0213 3 124 0.0353
9 379 0.0904 4 126 0.5294
Locus No Allele size(bp) Allelefrequency Locus No Allele size(bp) Allelefrequency
5 128 0.2325 3 192 0.0253
6 130 0.0294 4 196 0.2727
7 132 0.0824 5 198 0.3182
8 134 0.0588 6 200 0.0859
9 136 0.0059 7 202 0.2172
10 138 0.0059 8 204 0.0202
137 1 132 0.1047 9 206 0.0051
2 134 0.0930 RVC8 1 106 0.0050
3 136 0.0349 2 108 0.3000
4 138 0.1047 3 110 0.2050
5 140 0.0058 4 112 0.0700
6 142 0.0116 5 114 0.0150
7 144 0.0116 6 116 0.0150
8 146 0.0814 7 118 0.2650
9 148 0.0998 8 120 0.1150
10 150 0.2267 9 122 0.0100
11 152 0.2209
12 154 0.0058
RVC1 1 153 0.0291
2 155 0.3198
3 157 0.4128
4 159 0.1628
5 161 0.0628
6 163 0.0116
CCX30 1 145 0.0291
2 147 0.0243
3 149 0.5534
4 151 0.1019
5 153 0.1117
6 155 0.0146
7 157 0.0825
8 159 0.0388
9 161 0.0194
10 163 0.0243
CCX130 1 188 0.0101
2 190 0.0455
하디-바인베르크(Hardy-Weinberg) 방정식으로부터 산출된 각 표지인자에 대한 대립유전자의 수(N), 이형접합률(Het) 값과 PIC(Polymorphic informative Content) 값을 하기 표 7에 요약하였다. 모든 좌위에서 0.6 이상의 PIC 값을 가졌으며 2016, 2132, 2146, 2158, 2165, 2131, 2137, 2138, 137 좌위에서는 0.8이상의 높은 PIC 값을 가졌다.
진도개의 친자감별에 사용된 각 표지인자의 대립유전자 수(N), 이형접합률 (Het), 및 PIC값
Primer N Het PIC
2004 6 0.753 0.710
2016 10 0.881 0.864
2132 27 0.860 0.850
2146 13 0.878 0.863
2158 15 0.866 0.850
2161 6 0.799 0.765
2165 16 0.943 0.934
2131 15 0.914 0.902
2137 12 0.877 0.860
2138 12 0.887 0.862
134 10 0.656 0.612
137 12 0.856 0.835
RVC1 6 0.700 0.643
CCX30 10 0.663 0.638
CCX130 9 0.770 0.730
RVC8 9 0.663 0.638
N, number of allele; Het, heterozygosity; PIC, polymorphic informative content.
표 8에서는 각 표지인자에 대한 배제력(exclusion power)을 요약하였다. 배제력 1(exclusion power 1)은 모견과 부견 모두를 알수 없을 경우의 확률이며 배제력 2(exclusion power 2)는 부모견 중 하나는 알고 있는 경우에 적용된다. 배제력은 134, RVC1, CCX30를 제외한 모든 표지인자에서 0.5 이상의 값을 나타내었다.
진도개의 친자감별을 위한 각 표지인자의 배제력
Primer Eclusion power 1 Exclusion power 2
2004 0.350 0.527
2016 0.599 0.751
2132 0.595 0.747
2146 0.608 0.757
2158 0.580 0.735
2161 0.420 0.598
2165 0.779 0.875
2131 0.688 0.816
2137 0.593 0.746
2138 0.731 0.844
134 0.254 0.429
137 0.541 0.705
RVC1 0.278 0.446
CCX30 0.279 0.470
CCX130 0.375 0.553
RVC8 0.393 0.571
위에서 분석된 각각의 표지인자들을 조합하여 친자감별을 하였을 때 배제력을 표 9와 10에 나타내었다.
표 9는 부착된 형광물질이 서로 다른 표지인자를 세 개씩 조합하여 multiplex PCR을 행한 후 친자감별을 하였을 경우 나타나는 배제력이다. 조합 1과 조합 2는 0.99이상의 배제력을 나타내었고 조합 3과 4는 0.90에 가까운 수치를 나타내었다.
진도개의 친자감별을 위한 표지인자들의 조합에 의한 배제력
Primer Exclusion power 1 Exclusion power 2
Combination 1 2165, 2146, 2137 0.965 0.992
Combination 2 2138, 2131, 2158 0.965 0.992
Combination 3 134, 137, RVC1 0.726 0.907
Combination 4 CCX130, CCX30, RVC8 0.726 0.898
표 10은 본 연구에 사용된 PCR 조건이 같은 테트라뉴클레오티드 표지인자 10개의 조합(combination 1)과 디뉴클레오티드 표지인자(dinucleotide marker) 6개를 조합(combinatioin 2)하였을 때의 배제력을 나타내었다. 조합 1과 2 모두에서 0.99이상으로 나타났다.
진도개의 친자감별을 위한 표지인자들의 조합에 의한 배제력
Primer Exclusion power 1 Exclusion power 2
Combination 1 tetranucleotide marker 0.9999 0.9999
Combination 2 dinucleotide marker 0.9323 0.9905
GenotyperTMsoftware (PEApplied Biosystems, USA)를 이용하여 부견과 모견이 가지고 있는 대립유전자를 자견이 하나씩 유전받는다는 사실을 기초로 하여 친자감별을 실시하였다. 모두 부견과 모견이 가지고 있는 대립유전자를 하나씩 가지고 있다는 것을 확인하고(도 1 내지 도 3) 비교를 위해 사용된 임의의 진도개 자견에서는 대립유전자 중 하나 또는 모두 부견과 모견에서 유전되지 않았음을 확인함으로써 친자를 감별하였다 (도 4, 도 5).
이러한 실험결과는 다수의 진도개를 대상으로 상세한 유전자형 구별에 관계없이 단지 마이크로새틀라이트를 이용한 젤 상의 밴드만으로도 진도개의 유전적 다양성 및 개체확인을 매우 신속하고 정확하게 실시할 수 있는 방법을 제공한다.
이상 설명한 바와 같이, 아직까지 외모에 대한 육안적 판단이 중심이 되어 품종판별이나 심사를 실시하는 종래 기술에 비해 신속 간편하게 실시할 수 있는 본 발명 방법은 진도개표지인자인 16개의 마이크로새틀라이트를 진도개의 순수혈통 고정을 위한 유전적 표지인자로 이용할 수 있을뿐만 아니라 진도개 품종 및 친자확인방법이 훨씬 안정적이며 거의 100%의 정확성과 재현성을 가지고 진도개의 유전적 다형성을 분석할 수 있는 매우 뛰어난 효과가 있다.

Claims (6)

  1. 진도개의 세포나 조직 또는 털이나 혈액으로부터 채취한 개체의 DNA와 기준이 되는 방사성 또는 형광물질 표지된 정방향 및 역방향의 마이크로새틀라이트 표지인자 프로브를 결합시키고 PCR 증폭한 후에 상기 개체의 DNA와 마이크로새틀라이트 표지인자간의 결합 패턴을 방사성 또는 형광물질에 의한 감광으로 분석하여 진도개의 개체를 확인하는 것을 특징으로 하는 마이크로새틀라이트 표지인자를 이용한 진도개의 친자감별 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 정방향 및 역방향의 마이크로새틀라이트 표지인자가 서열번호 1 및 2, 서열번호 3 및 4, 서열번호 5 및 6, 서열번호 7 및 8, 서열번호 9 및 10, 서열번호 11 및 12, 서열번호 13 및 14, 서열번호 15 및 16, 서열번호 17 및 18, 서열번호 19 및 20, 서열번호 21 및 22, 서열번호 23 및 24, 서열번호 25 및 26, 서열번호 27 및 28, 서열번호 29 및 30, 및 서열번호 31 및 32로 구성된 군으로부터 선택된 것이고, 상기 선택된 2개 이상의 정방향 및 역방향 프로브를 조합하여 진도개 개체를 확인하는 것임을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 프로브의 조합이 서열번호 7 및 8, 서열번호 13 및 14, 및 서열번호 17 및 18인 것임을 특징으로 하는 방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 프로브의 조합이 서열번호 9 및 10, 서열번호 15 및 16, 및 서열번호 19 및 20인 것임을 특징으로 하는 방법.
  5. 제2항에 있어서, 상기 프로브의 조합이 서열번호 1 및 2, 서열번호 3 및 4, 서열번호 5 및 6, 서열번호 7 및 8, 서열번호 9 및 10, 서열번호 11 및 12, 서열번호 13 및 14, 서열번호 15 및 16, 서열번호 17 및 18, 및 서열번호 19 및 20인 것임을 특징으로 하는 방법.
  6. 제2항에 있어서, 상기 프로브의 조합이 서열번호 21 및 22, 서열번호 23 및 24, 서열번호 25 및 26, 서열번호 27 및 28, 서열번호 29 및 30, 및 서열번호 31 및 32인 것임을 특징으로 하는 방법.
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