KR20030065831A

KR20030065831A - 사이클로스포린을 함유한 지속 방출형 약학적 조성물

Info

Publication number: KR20030065831A
Application number: KR1020020005856A
Authority: KR
Inventors: 양정화; 박함용; 임동우; 김정주
Original assignee: 주식회사 태평양
Priority date: 2002-02-01
Filing date: 2002-02-01
Publication date: 2003-08-09
Also published as: JP2005522423A; EP1469840A1; WO2003063841A1; EP1469840A4; US20030147954A1; CN1625391A; CA2472242A1

Abstract

본 발명은 사이클로스포린을 함유한 지속방출형 약학적 조성물에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는 본 발명은 생분해성 고분자와 이에 봉입된, 사이클로스포린 및 방출조절제를 필수적으로 포함하는 사이클로스포린-함유 지속 방출형 약학적 조성물로서, 상기 방출조절제가 친수성 방출 조절제와 친유성 방출 조절제로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 성분인 것인 사이클로스포린-함유 지속 방출형 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

사이클로스포린을 함유한 지속 방출형 약학적 조성물 {cyclosporin-containing sustained release pharmaceutical composition}

본 발명은 사이클로스포린을 함유한 지속방출형 약학적 조성물에 관한 것이다.

지금까지의 사이클로스로린에 대한 임상 연구의 주요 영역은 면역 억제제로서 특히 심장, 폐, 조합된 심장-폐, 간, 신장, 췌장, 골수, 피부 및 각막 이식물과같은 기관 이식물 및 구체적으로 동종 기관 이식물의 수용자에 대한 이의 적용과 관련되어 왔다. 이 분야에서, 사이클로스포린을 사용하여 확연한 성공을 이루어 왔다.

이와 동시에, 다양한 자가 면역 질병 및 염증성 질환, 구체적으로 관절염 및 류마티스성 질병과 같은 자가 면역 성분을 포함하는 병인에 의한 염증성 질환에 대한 사이클로스포린의 적용성이 강조되어 왔고, 시험관내에서, 동물 모델 및 임상 시험에서의 보고 및 결과가 문헌에 광범위하게 나타나 있다. 사이클로스포린 치료가 제안되거나 적용되는 특정 자가-면역 질병은 자가 면역 혈액학적 장애 (예컨대, 용혈성 빈혈, 재생불량성 빈혈, 진정 적혈구성 빈혈 및 특발성 혈소판 감소증을 포함한다), 전신성 홍반성 루프스,다연골염, 공피증, 베그너 그래뉼라마토시스 (Wegner granulamatosis), 피부근염, 만성 활성 간염, 중증 근무력증, 건선,스티븐-존슨 증후군, 특발성 스프루우, 자가 면역 염증성 장 질병(예컨대 궤양성 대장염 및 크론병 (Crohn's disease)을 포함), 내분비성 옵탈모패시 (opthalmopathy), 그레이브스병, 유육종증, 다발성 경화증, 원발성 담즙성 간경변, 연소성 당뇨병(진성 타입 I 당뇨병), 포도막염 (전포도막염 및 후포도막염), 건성 각결막염 및 베르날(vernal) 각결막염, 간질성 폐섬유증, 건선 관절염 및 사구체신염(예컨대, 특발성 신증 증후군 또는 최소 변화 신증을 포함하는 신증 증후군을 갖거나 갖지 않음)을 포함한다. 연구의 추가 영역은 항기생충제, 구체적으로 항원생제로서의 강력한 적용성을 갖고, 말라리아, 콕시디오이디즈 진균증(coccidiomycosis) 및 주혈흡충증의 치료를 포함하여 사용할 수 있음이 제안되었고, 보다 최근에는 종양 등에서의 항종양제 내성을 전환시키거나 제거하기 위한 약제로서 사용할 수 있게 되었다.

사이클로스포린은 지금까지 모든 면역 억제제중 가장 광범위하게 사용되지만, 낮은 생체내 이용 효율이라는 심각한 단점을 갖는다. 사이클로스포린은 투여시에 전체 흡수량의 10-27%가 간에서 초회 통과 효과를 받으며 분포반감기는 0.7-1.7시간, 소실반감기는 6.2-23.9시간이다. 사이클로스포린의 이런 약물속도론적 파라메타들은 답즙산 배설정도, 환자의 상태 및 이식장기의 종류에 따라 개체마다 큰 차이를 보이고 있다. 또한 사이클로스포린은 사구체 여과율이 감소하고 근위 세뇨관 재흡수가 증가하는 등의 신 부작용을 나타낸다. 사이클로스포린 제제를 복용하는 환자들 중의 30% 정도가 높은 혈중 농도로 인한 신독성을 부작용으로 나타낸다고 보고되어 있다. 따라서 사이클로스포린은 환자에 대해 주기적인 약물혈중 농도체크를 실시하여야 하는 약물군 중 하나로 분류되어 있다.

이러한 사이클로스포린의 특이한 물성, 즉 난용성, 흡수에 있어서 낮은 생체내 이용률과 개체간 흡수율의 격차, 큰 투여단위와 좁은 치료계수, 그리고 사이클로스포린으로 치료받는 환자의 상태가 불안정한 상태일 수 있다는 점 때문에 유효하고 부작용과 거부반응을 피할 수 있는 일정한 혈중농도를 유지함으로써 이식환자의 생명 유지를 위한 최적의 약물 투여계획 수립이 매우 어렵다. 불량하고 변화 가능한 생체내 이용 효율 때문에, 목적하는 혈중 농도를 달성하기 위해 요구되는 일일 투여량은 사이클로스포린의 현행 투여 형태에 따라 상당히 변화될 필요가 있고, 동시에 혈중 농도를 모니터링하는 것이 필수적이며 현재는 환자들의 이식 수술전에 미리 약물을 투여하여 환자 개개인의 혈중 농도 패턴을 미리 분석한 결과를 토대로 사이클로스포린의 투여량을 결정하고 있다. 향 후 의료기술과 학문의 발달로 장기이식은 꾸준히 늘어날 것이고, 사이클로스포린과 같은 면역억제제의 사용은 계속 증가할 것이다. 그렇게 되면, 개개인의 투여량을 결정하기 위하여 사이클로스포린의 혈중농도 패턴을 분석하고, 수술 이후에도 혈중 농도를 추적하는 방법을 사용하는 것은 의료비의 상승으로 인한 환자 부담 상승 뿐만 아니라, 환자 수가 많아지게 되었을 때 의료의 질 저하가 발생할 수도 있다.

그러므로, 생체 이용율이 높고, 개체차 없이 일정 혈중 농도를 유지할 수 있는 새로운 제제의 개발이 절실히 요구되고 있다.

실제로, 생체 내 이용 효율을 개선시키기 위해, 몇몇 시도가 수행되어 사이클로스포린의 제형을 개선시켰다. 이러한 연구는 주로 사이클로스포린을 가용화시킬 수 있는 수단에 중점을 두고 진행되어 왔다. 대표적인 예는 리포좀, 마이크로스피어, 또는 일반 식물유와 계면활성제로 이루어지는 혼합용제의 이용, 그리고 흡착, 포접 복합체, 고형 분산체 등을 이용한 분말 조성물의 형성, 그리고 기타 여러 가지 제형이 있으며 주로 경구투여를 목적으로 하는 제제이다.

사이클로스포린의 투여 형태로부터 이의 생체 내 이용 효율을 개선시키기 위한 가장 중요한 시도중 하나는 미국 특허 제5342625 호에 기술된 것이다. 이 기술은 3개의 상 시스템, 즉 (1) 친수성 상 성분, (2) 친유성 상 성분 및 (3) 계면활성제로 이루어진 미세 유화액 예비-농축물의 사용을 기술한다. 이러한 조성물은 본질적 성분으로서 알콜을 갖고, 물로 희석될 때 이러한 조성물은 100nm 미만의 평균입자경을 갖는 수중 유적형 미세유화액을 제공한다. 이렇게 향상된 표면적은 통상적인 투여 형태와 비교할 경우 사이클로스포린의 생체내 이용 효율을 증가시킨다. 생체 내에서 이용 가능한 형태인 미세-유화액 투여 형태(미국 특허 제 5342625 호로부터의 조성물I)와 미국 특허 제 4388307 호에서 보다 먼저 보고된 통상적인 에탄올-오일 기제 투여 형태와의 비교는, 건강한 지원자에 대해 수행되었고, 그 내용은 미국 특허 제 5342625 호에 기록되어 있다. 조성물 X(이의 생체내 이용 효율은 100%로 설정됨)와 비교하여 149.0%(±48)의 생체내 이용 효율 수준이 조성물 I에 대해 기록된다. 조성물 I로부터 얻어진 평균 AUC 수준은 조성물 X로부터 얻어진 것과 비교할 경우 40%가 높지만, 여전히 20%의 높은 편차를 갖고 있다.

미국특허 제 5641745 호에서는 사이클로스포린을 생분해성 고분자에 봉입시켜 제조한 마이크로스피어를 8시간 내에 80%이상을 방출시켜 소장에서의 흡수를 극대화하고자 하였다. 폴리락티드에 봉입된 사이클로스포린이 흡수 부위인 소장상부에서 방출을 극대화시켜 생체이용율을 향상시킬 수 있는 제제를 제시하고 있다. 그러나, 이 제제는 사이클로스포린이 8시간 이내에 약물 방출이 80% 이상으로 되는 것으로 생분해성 고분자에 의한 방출 조절이라기 보다는 마이크로스피 제제에서 통상적으로 일어나는 초기 방출에 의한 것으로 볼 수 있다. 또한 고분자중 폴리락티드의 함량에 따라 방출량이 달라짐을 제시하고 있으나, 이것은 고분자의 종류에 따라서 사이클로스포린의 무정형 또는 결정형의 차이에 의해 약물의 용해도가 달라진 것이지 생분해성 고분자의 방출조절은 아니라고 사료된다. 실제로, 8시간 내에 1차적인 초기 방출이 일어난후 측정시간 내에 추가적인 약물 방출이 없다. 이는경구투여 시 목적하는 장기(소장 상부)에서 방출을 완료해야 하는 경구용 제제에서는 적당하지만, 장기간 지속적으로 약물을 방출하는 방출 제어 제제로서는 적당하지 않을 뿐만 아니라 경구투여에 의한 장기간 약물전달은 기대하기 어렵다. 사이클로스포린의 낮고 일정하지 않은 흡수율은 경구투여에 의한 개체차에서 발생하는 문제이므로 경구가 아닌 다른 경로로 약물을 투여한다면 환자 개체들간의 불균일한 장내 흡수율에 따른 차이를 극복할 수 있을 것임을 예상할 수 있다.

현재 사이클로스포린의 주사제가 시판 중이지만, 가용화제로 폴리옥시에틸레이티드 캐스터 오일 유도체 (polyoxyethylated castor oil derivatives)를 포함하고 있어, 이 부형제에 의한 과민반응의 유발 위험 때문에 경구 투여할 수 없는 환자에만 사용하도록 제한되고 있는 실정이다. 이러한 단점을 극복하기 위하여 미국특허 제 5527537 호에서는 폴리옥시에틸레이티드 캐스터 오일 유도체 (polyoxyethylated castor oil derivatives)를 포함하지 않는 정맥투여 제제를 제시하고 있으나, 장기간 복용해야 하는 약물의 특성을 고려할 때 매일 투여해야 하는 정맥 투여 제제는 경구 투여를 대체할 수 있는 제제는 아닌 것으로 사료된다.

최근에 몇몇 연구자들이 사이클로스포린과 폴리락티드 또는 폴리락티드 코 글콜리드등을 이용하여 장기간 약물을 지속적으로 방출할 수 있는 생분해성 마이크로스피어 제제를 연구하여 그 결과를 보고하고 있다. 사이클로스포린을 포함하는 마이크로스피어가 시험관 내에서 초기에 빠른 방출이 일어나고, 그 이후에 서서히 방출되어 4주동안 최고 50%가량 방출됨을 보고하고 있다 (Int. J. Pharmaceut. 99 (1993) 263-273). 방출을 조절하는 일반적인 방법중의 하나인 입자의 크기를 조절할 경우에도 초기 방출만 증가될 뿐 방출속도의 증가로 이어지지는 않았다. 이것은 방출 후반기로 갈수록 사이클로스포린과 폴리락티드 코 글콜리드의 상호작용에 의하여 충분히 방출되지 못한 결과로 사료된다. 시험관 내에서 방출 후반기에 약물의 방출이 거의 일어나지 않는 것은 소수성 뿐만 아니라 친수성 단백질 약물에도 흔히 관찰되는 현상인데, 이것은 생분해성이라는 고분자의 특성을 고려할 때, 생체내에서 일어나는 방출 양상이 완벽하게 시험관내에서 재현되기를 기대하기는 어렵기 때문일 것으로 보인다. 그런 점을 고려한다고 하여도 4주 동안 50%미만의 방출율을 보인다는 것은 추가적인 방출의 촉진이 필요함을 시사한다.

티. 우라타 (T. Urata) 등은 사이클로스포린의 시험관내 방출 속도를 증가시키기 위하여, 여러가지 지방산 에스테르(fatty acid ester)를 첨가하여 시험관내 방출을 개선시키는 연구를 수행하여 시험관내 방출이 증가함을 보여주였다(J. Controlled Release58 (1999) 133-141). 지용성인 사이클로스포린이 첨가된 지방산 에스테르에 대부분 용해되어 폴리락티드에 분산되어 있고 이 지방산 에스테르에 의해 형성된 물채널(water channel)로 용해되어 있던 약물이 방출되는 것이라고 설명하고 있다. 연구에 적용된 지방산 에스테르는 대부분 액상이고, 탄소수 18인 에틸 스테아레이트(ethyl stearate)만 고체이지만, 녹는점이 섭씨 33-35도로서, 시험관내 방출온도나 체내 온도인 섭씨 37도 에서는 액상으로 존재하게 된다. 즉 액상에 녹아있는 사이클로스포린이 시간에 따라 방출되어 나오는 것이므로 첨가되는 지방산 에스테르의 양은 사이클로스포린을 충분히 용해시킬 수 있도록 30%이상으로 높을 때 의도하는 방출 증가 효과가 나타난다. 본 연구의 문제점은 통상적으로 폴리락티드나 폴리락티드 코 글콜리드를 이용하여 용매 증발법으로 마이크로스피어를 제조할 때 액상이 30% 이상 고농도로 함유 될 경우 제조 공정 중에 액상이 휘발될 가능성이 많아서 일정한 함량의 지방산 에스테르를 마이크로스피어내에 봉입하기 어렵다는 것이다. 이는 지방산 에스테르에 용해되어 있는 사이클로스포린의 봉입율에 영향을 미칠 수 있고 균일한 함량의 마이크로스피어를 얻기 힘들다는 것을 예상하게 한다. 또한 방출 증가 기전상 비교적 많은 양의 지방산 스테르가 필요하게 되며, 이는 결과적으로 생분해성 고분자 마이크로스피어에 사이클로스포린을 봉입시키는데 제한 요소로 작용한다. 연구 결과에 따르면 실제 봉입 가능한 사이클로스포린의 양은 20% 미만이다. 사이클로스포린의 약물 투여량이 비교적 많은 것을 고려한다면, 약물 봉입량이 적다는 것은 지속 방출 제제에서 실용화에 큰 어려움이 있을 것을 시사한다. 사이클로스포린의 필요한 일일 투여량이 사람에서 60mg/60kg ~ 120mg/60kg 이므로, 약물 함량이 20% 라면 일주일간만 지속하는 사이클로스포린을 함유한 마이크로스피어 양으로 환산하여도 2.1 g ~ 4.2 g을 투여해야 하는 셈이므로 실제 인체에 적용하는 데는 어려움이 예상된다. 편리한 투여경로인 주사로 투여할 경우 실용화하여 주사제로 적용하기에는 투여량이 너무 많다고 할 수 있다. 뿐만 아니라 약제학적으로 사용 가능성이 확립되지 않은 지방산 에스테르를 고용량으로 함유하여야 함으로 이로 인한 국소 자극 및 괴사등의 부작용 유발 가능성도 배제할 수는 없다.

이에 본 발명자들은 경구 복용으로 인한 일정하지 않은 생체이용율 및 개체차 때문에 발생될 수 있는 부작용을 최소화하고 사전 모니터링으로 유발되는 치료비의 절감을 실현하고, 환자의 복약순응도를 높일 수 있으며, 신뢰성 있는 약물 투여계획이 가능한 새로운 개념의 사이클로스포린 제제를 개발하고자 하였다. 본 발명은 주사 가능한 사이클로스포린 제제로서 특히 수일 내지 수주간 지속적으로 약물이 방출되어 수일 내지 수주간 유효혈중농도 이내에서 약물의 혈중농도를 일정하게 조절하고 유지할 수 있는 사이클르스포린-함유 지속방출형 약학적 조성물을 제공하고자 한다.

도 1은, 실시예 5의 마이크로스피어의 주사전자현미경 사진이며,

도 2는, 비교실시예 1 (◆) 및 실시예 1 (△), 2 (▲), 3 (●), 4 (□) 및 5 (■)의 마이크로스피어로부터의 사이클로스포린의 방출시험결과로서, 방출용액에 트윈 80을 첨가하고 시험관을 진동방향에 대하야 수직으로 위치시켜 실험한 것이며, 이때 트윈 80의 농도를 도 2a는 0.025%, 도 2b는 0.05%가 되도록 첨가하여 실험한 결과이며,

도 3은 비교실시예 1 (◆) 및 실시예 3 (●) 및 5 (■)의 마이크로스피어를 흰쥐에 피하주사한 후 관찰된 사이클로스포린의 혈중농도 변화이다.

본 발명의 약학적 조성물중 사이클로스포린, 생분해성 고분자 및 방출조절제의 함량은 각각 15~70%, 25~80% 및 0.01~20%인 것이 바람직하며, 각각 25~60%, 35~70% 및 0.1~10%인 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 조성물에 사용되는 생분해성 고분자로서는 주사 또는 이식 가능한생분해성 고분자라면 어느 것이라도 사용 가능하며 바람직하게는 폴리락티드(polylactides : PLA) 및 폴리글리콜리드(polyglycolides : PGA)와 같은 히드록시 산; 폴리락티드 코 글리콜리드(poly(lactide-co-glycolides : PLGA), 폴리β-히드록시 부틸산(poly β-hydroxy butyric acid; PHB), 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 폴리언하이드라이드(polyanhydrides), 폴리오르토에스테르 (polyorthoesters), 폴리언하이드라이드, 폴리우레탄, 폴리(부틸산), 폴리(발레릴 산) 및 폴리(락티드-코-카프로락톤); 이들의 유도체와 공중합체 및 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 사용할 수 있다.

본 발명자들은 사이클로스포린과 고분자와의 상호작용을 적절하게 막아주고, 봉입된 생분해성 고분자로부터 약물 방출을 촉진시킬 수 있는 방출조절제의 사용을 통해, 주사하였을 경우 체내에서 약물 방출 속도를 조절할 수 있다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명에서 사이클로스포린을 함유하는 마이크로스피어의 제조방법은 일반적인 적당한 혼합기를 이용하는 물/기름 단일 유제 용매 증발법, 용매 추출법등으로 제조할 수도 있으며, 분무건조법을 이용하여 제조할 수도 있다. 본 발명의 조성물이 목적하는 방출 조절 효과를 낼 수 있도록 조제하기 위하여서는 비교적 온화한 조건에서 단시간 내에 마이크로스피어를 제조하는 것이 중요하다.

본 발명의 조성물에 사용되는 방출 조절제는 친수성 방출 조절제와 친유성 방출 조절제로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 성분을 사용할 수 있으며 바람직하게는 친수성과 친유성을 적절히 배합함으로써, 약물이 체내에 머무르는 동안일정한 속도로 약물을 계속해서 방출될 수 있게 조절해 줄 수 있다.

본 발명에서 사용할 수 있는 친수성 방출조절제는 예를 들어, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르 (polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters), 글리세릴 모노올레이트 (glyceryl monooleate), 소르비탄 지방산 에스테르 (sorbitan fatty acid esters), 폴리비닐알코올 [poly(vinyl alcohol)], 폴록사머 (poloxamers), 폴리에틸렌글리콜 [poly(ethylene glycol)], 글리세릴 팔미토스테아레이트 (glyceryl palmitostearate), 벤질벤조에이트 (benzyl benzoate),에틸올레이트 (ethyl oleate), 알파 사이클로덱스트린(α-cyclodextrin), 베타 사이클로덱스트린(β-cyclodextrin), 감마 사이클로덱스트린(γ-cyclodextrin), 히드록시프로필 베타 사이클로덱스트린(hydroxypropyl β-cyclodextrin) 등이다.

이들은 전하를 띠지 않으면서 히드록시(-OH), 에스테르(ester), 에틸렌 옥사이드(ethylene oxide), 프로필렌 옥사이드(propylene oxide) 등의 친수성기를 포함하고 있으며 약제학적으로 사용 가능한 것으로서 방출 초기에 마이크로스피어 내부에서 적당한 작은 구멍(pore)을 생성하여 초기 약물 방출을 유도한다. 이들은 사이클로스포린의 용해도에 영향을 미치는 것이 아니라, 마이크로스피어의 구조에 적당한 작은 구멍을 생성하는 것으로, 과다한 초기 약물 방출을 유도하지는 않는다. 초기 방출을 유도하기 위한 친수성 방출조절제의 종류와 함량은 사용하는 생분해성 고분자의 종류와 친유성 방출 조절제의 종류에 따라 달라진다.

본 발명에서 사용할 수 있는 친유성 방출조절제는 예를 들어, 약제학적으로 사용 가능한 대두유 (soybean oil), 면실유 (cotton seed oil), 참기름 (sesameoil) 등의 천연오일 (natural oil) 등이 해당되며, 이들은 후반기의 방출 저해에 주 원인으로 사료되는, 사이클로스포린과 생분해성 고분자 사이에서 발생하는 소수성 상호작용을 줄여 후기 약물 방출을 계속 유도해낼 수 있다. 천연 오일류는 소수성인 생분해성 고분자와 사이클로스포린 사이에서 일종의 완충작용을 하여, 소수성 상호 작용으로 인한 약물 방출 저해를 억제할 수 있다. 또한 이들은 인체에 무해하며 주사제에 현재 널리 사용되고 있다. 친유성 방출조절제의 종류와 함량은 사용되는 생분해성 고분자와 친수성 방출조절제의 종류 및 함량에 따라 달라진다.

상기한 친수성 및 친유성 방출 조절제 1종 혹은 2종 이상을 적절히 혼용하면 생분해성 고분자에 봉입된 사이클로스포린의 방출을 효과적으로 조절할 수 있다.

본 발명의 조성물은 주사 또는 이식하는 방법으로 투여할 수 있다. 더욱 구체적으로 주사의 방법으로는 피하주사, 근육주사 등을 들 수 있다. 또한 그의 적용가능한 제형의 예를 들면, 주사액 및 용시조제형 주사액 제조용 분말 등의 주사용 제제, 이식정 등의 임플란트 제제 등이 있다.

따라서 본 발명의 조성물은 실제적용하기 위하여 상기의 제형으로 제제화할 경우 각각 요구되는 부형제, 안정화제, pH 조절제, 등장화제 등을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은, 동결건조, 증발건조, 분무건조, 감압건조 등의 방법으로 제조할 수 있다.

본 발명의 조성물은, 약물을 지속적으로 방출하여 7일~28일간 체내에서 사이클로스포린의 혈중농도 100-500 ng/ml의 농도를 유지할 수 있다.

본 발명에 의한 조성물은, 제형화할 경우 사이클로스포린 제제에서 요구되는 치료학적인 유효농도를 일정하게 유지하면서도 경구투여 후에 관찰되는 일시적인 혈중농도의 상승이 없어 이로 인한 약물 독성을 감소시킬 수 있으며, 흡수율의 개인차가 없어져 혈중농도 예측이 가능하여 투여량을 결정하기 위한 불필요한 약물 투여 및 혈중농도 분석 등의 과정이 생략 가능하게 될 것이다. 또한 수일에서 수주동안 일정한 농도의 약물을 방출함으로써 매일 복용해야 하는 불편을 없앨 수 있어 복약 순응도 또한 높일 수 있을 것으로 기대된다.

[사이클로스포린의 방출시험방법]

본 발명자들은 사이클로스포린 마이크로스피어 제제의 시험관내 방출시 방출 용매의 조성을 바꾸면 시험관내 방출 양상이 달라지는 것을 확인하였다. 이것은 우리가 목표하는 제제가 경구가 아닌 경로(주사제 또는 임플란트)임을 고려할 때, 기존 연구에서 보고된 시험관내에서의 방출 양상은 본 발명자들이 개발하고자 하는 제제의 체내 방출 양상을 반영하지 못할 수도 있다는 것을 예상하게 하였다. 따라서, 본 발명에 적당한 시험관내 방출 시험법을 확립하여 사이클로스포린의 시험관내 방출 양상을 분석하여 후보 처방을 검색하고, 흰쥐에 투여하여 혈중 농도 분석한 결과를 바탕으로 본 발명을 완성하였다.

본 발명자들은 시험관내 마이크로스피어의 최적 방출 조건을 확립하기 위하여, 여러가지 방출 용매를 시험한 결과 폴리솔베이트 80 즉 트윈 80을 첨가한 방출 용매가 가장 효과적임을 발견하였다. 최근 보고에 따르면 트윈 80의 농도를 20배 증가시킬 때, 사이클로스포린이 트윈 80에 의해 마이셀화 (micellization)화 되어그 용해도가 60-160배까지 증가된다(AAPS PharmSciTech 2001:2 (1) article 2). 따라서 방출용액인 0.01% 소듐 아자이드 (sodium azide)을 포함하고 있는 pH 7.5인 소듐 포스페이트 완충용액 (phosphate buffered saline)에 소수성인 사이클로스포린을 가용화시킬 수 있는 트윈 80의 농도를 0.025-0.1%범위의 농도로 변화시킴으로써, 마이크로스피어 내부에 봉입된 사이클로스포린의 친수화 정도에 따라 방출 형태를 조절시킬 수 있다. 동결건조된 사이클로스포린이 봉입된 마이크로스피어 10 mg을 0.025-0.1% (W/V) 범위의 농도인 트윈 80, 0.01% 소듐 아자이드을 포함하고 있는 pH 7.5인 소듐 포스페이트 완충 용액에 분산시킨 뒤, 시험관 내에서 방출실험을 진행하였다. 섭씨 37도로 유지되고, 일정한 방향으로 진동하는 수욕조에 방출량을 측정하는 시험관을 진동하는 방향에 대해 수직방향 또는 수평방향으로 위치시켜 놓았다. 방출 실험 장치에서 시험관을 수욕조에서의 진동방향과 수직방향과 수평방향으로 각각 설치함으로써, 사이클로스포린의 방출형태를 다르게 진행시킬 수 있다는 결과를 얻었다. 특히 방출실험을 실시하는 수욕조 내에서 시험관을 진동하는 방향에 수평으로 위치시켜 놓은 시험관 내에서의 마이크로스피어는 시험관 내의 진동으로 인한 빠른 유속으로 용액의 움직임으로 인해 가라앉지 않고, 미세입자들 끼리 접촉할 기회가 줄어들어서, 개개의 입자형태로 존재하게 되어, 마이크로스피어에 봉입되어 있는 사이클로스포린이 비교적 쉽게 물 채널 (water channel)을 형성되어 소수성인 마이크로스피어가 빠르게 용출되는 결과를 나타냈다. 반면에 방출실험을 실시하는 수욕조 내에서 시험관을 진동하는 방향에 수직으로 세워놓고 방출실험을 할 경우, 마이크로스피어의 무게로 인한 중력 때문에 입자들이 가라앉은채로 서로 뭉친 상태로 변하였다. 시험관 하부에 가라앉은 형태의 응집된 마이크로스피어 집합체는 사이클로스포린이 봉입된 마이크로스피어 내부에 물채널 (water channel)을 형성하기 어려울 뿐만 아니라, 응집체로 부터의 방출이기 때문에 소수성인 사이클로스포린이 천천히 방출되는 결과를 보였다.

본 발명에 있어서 체내에서의 사이클로스포린의 방출 형태를 예상하기 위해 시험관 내에서는 사이클로스포린의 방출 용액에서의 농도를 0.025-0.1%의 범위에서 변화시키는 동시에 진동하는 방향에 수직방향으로 시험관을 설치해서 투여했을 때의 체내의 상황과 유사하게 재현한 시스템을 개발하여 연구에 이용하였다.

본 발명은 다음의 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명되나, 본 발명이 이들에 의해 어떤 식으로든 제한되는 것은 아니다.

실시예 1~5 및 비교실시예 1. 생분해성 고분자로서 PLGA 5015를 이용한 마이크로스피어의 제조- 용매증발법

하기 표 1의 처방에 따라 각각 수중유형 단일 에멀젼 (W/O single emulsion)에 의한 용매 증발법을 이용하여 마이크로스피어를 제조하였다.

생분해성 고분자로서 PLGA 5015를 이용한 마이크로스피어의 처방

	비교실시예 1 (CyA-PLGA)	실시예 1(RP5)	실시예 2(RP10)	실시예 3(RP2S2)	실시예 4(RP5S5)	실시예 5(RP10S10)
사이클로스포린	160 mg	160 mg	160 mg	160 mg	160 mg	160 mg
폴리락티드 코 글콜리드(PLGA 5015)	240 mg	220 mg	200 mg	224 mg	200 mg	160 mg
폴록사머 188	-	20 mg	40 mg	8 mg	20 mg	40 mg
참기름	-	-	-	8 mg	20 mg	40 mg

비교실시예 1 및 실시예 1~5의 제조에는 분자량 15000, lactic acid : glycolic acid 50:50 인 폴리락티드 코 글리콜리드(poly(lactide-co-glycolides : PLGA) [PLGA5015, Wako pure chemical industry, Japan]을 이용하였다.

직경 70 mm, 높이 105 mm의 원통 벽면에 10 mm 두께의 격벽 3개를 120도 간격으로 설치한 원통형 용기에, 바닥에서 30 mm 높이에 직경 45 mm의 날을 고정시켜 교반할 수 있는 장치를 고안하여 마이크로스피어 제조에 사용하였다.

적당한 크기의 뚜껑이 있는 유상 제조용 용기에 분량의 사이클로스포린, 폴리락티드 코 글콜리드, 폴록사머 188, sesame oil을 칭량하여 가하고, 디클로메탄 4 ml을 가한 후 용기를 밀봉하고 교반하여 완전히 녹여 유상을 제조한다[1액]. 0.3% 폴리비닐알콜과 0.3% 트윈80 를 포함하는 수용액[2액] 150 ml을 마이크로스피어 제조 용기에 가한 후 1000 rpm 으로 교반하면서 1액을 서서히 가하고 30분간 교반시켜 O/W emulsion을 형성시켰다. 300 rpm 에서 1시간 추가 교반하여 마이크로스피어를 고화시켰다. 고화된 마이크로스피어 용액을 0.22 μm 셀룰로오스 아세테이트 멤브레인 (cellulose acetate membrane)에 여과시키고 증류수로 3회 세척하여 마이크로스피어를 회수한 다음, 24시간 동결건조하여 비교실시예 1 및 실시예 1~5의 마이크로스피어 제조를 완료하였다. 이 모든 과정은 무균 작업대에서 수행하였으며, 최대한 무균 조건을 유지하였다.

실시예 6~10 및 비교실시예 2. 생분해성 고분자로서 PLGA 5015를 이용한 마이크로스피어의 제조- 초음파 제조법

실시예 1~5. 에서와 동일한 1액 2액을 사용하여, 2액에 1액을 가한 후 재빨리 출력 70mW로 3분동안 분산시킨 후 magnetic stirrer로 700rpm 2시간 교반시켜 고화시켰다. 고화된 마이크로스피어 용액을 0.22um cellulose acetate membrane에 여과시키고 증류수로 3회 세척하여 마이크로스피어를 회수한 다음, 24시간 동결건조하여 제조하였다.

이 모든 과정은 clean bench에서 수행하였으며, 최대한 무균 조건을 유지하였다.

실험예 1. 마이크로스피어의 주사전자현미경 사진

도 1은, 실시예 5의 마이크로스피어에 대한 주사전자현미경 사진을 촬영한 결과이다. 20%의 방출 조절제를 포함하여도 입자경 30 ㎛ (마이크로미터) 미만의 일정하고도 균일한 마이크로스피어를 본 방법으로 간편하게 제조할 수 있음을 확인할 수 있었다.

실험예 2. 마이크로스피어에 봉입된 사이클로스포린 함유효율

메탄올은 사이클로스포린을 매우 잘 용해시키나, 사이클로스포린 담체인 생분해성 고분자인 폴리락티드 코 글콜리드, 폴리락티드들은 용해시키지 못하는 물리화학적 성질을 이용하였다. 본 방법은 매우 간편하고 정확하게, 높은 봉입량을 목적으로 하는 사이클로스포린을 함유한 마이크로스피어에서의 사이클로스포린 봉입량을 측정할 수 있는 효율적인 방법이다.

본 방법은 사이클로스포린이 높은 비율 (30-60%)로 함유되어 있는 마이크로스피어 10 mg을 메탄올 50 ml에 분산시킨다. 봉입된 사이클로스포린을 완전하고, 가속화해서 추출하기 위해서 초음파기로 1시간 정도 초음파를 가하여 주었다. 메탄올에 추출되어진 사이클로스포린은 역상 고압 액체 크로마토그래피를 이용해 파장이 215 nm인 영역에서 측정하였다. 또한 마이크로스피어 내부에 완전하게 사이클로스포린이 추출되어 있는가를 확인하기 위해서 젤 형태로 변화된 생분해성 고분자를 양성자 핵자기 공명 스펙트로스코피를 이용해서 측정하였다.

비교실시예 및 실시예 1~5에서 제조된 마이크로스피어 내부에 봉입된 사이클로스포린의 봉입효율은 표 2와 같았다. 비교실시예 및 실시예 1~5에서 제조된 마이크로스피어내로 사이클로스포린이 95% 이상 완전하게 봉입되었다. 봉입효율은 아래의 식에 의해 계산하였다.(n=3)

봉입효율(%) =10mg 마이크로스피어내의 사이클로스포린 함량X 1004 mg

마이크로스피어 봉입효율

	비교실시예 1	실시예 1(RP5)	실시예 2(RP10)	실시예 3(RP2S2)	실시예 4(RP5S5)	실시예 5(RP10S10)
봉입효율	99%(±2)	105%(±3)	103%(±2)	95%(±4)	98%(±5)	102%(±3)

실험예 3. 사이클로스포린이 함유된 마이크로스피어의 인 비트로 상 약물 방출량

동결건조된 사이클로스포린이 봉입된 마이크로스피어 10 mg을 0.025-0.1% (W/V) 범위의 농도인 트윈 80, 0.01% 소듐 아자이드을 포함하고 있는 pH 7.5인 소듐 포스페이트 완충용액에 분산시킨 뒤, 시험관 내에서 방출실험을 진행하였다. 섭씨 37도로 유지되고, 일정한 방향으로 진동하는 수욕조에 방출량을 측정하는 시험관을 진동하는 방향에 대해 수직방향으로 위치시켜 놓았다.

사이클로스포린의 제어방출을 측정하기 위해 일정하게 정해진 시간마다 시험관을 3000 rpm의 속도로 15분 동안 원심분리시킨 뒤, 상층액 50 ml 모든 용액을 취한 뒤, 같은 부피의 새로운 용액을 다시 방출시험관에 넣었다. 상층액에서 취한 방출용액을 이용하여 사이클로스포린의 방출량과 안정성을 역상 고압 액체 크로마토그래피를 통해 파장이 215nm인 자외선 탐지기로 측정하였다. 역상 고압 액체크로마토그래피의 구성은 Waters 510 HPLC 펌프 시스템이 Waters 484 자외선 흡광기로 연결되어 있고, 칼럼의 온도가 섭씨 70도로 유지되게 하고, 이동상은 아세토나이트릴 : 물이 80:20인 비율로 균일하게 혼합된 용액을 사용했다. 칼럼은 PhenomenexColumn-Luna, RP-18 (4.6*250mm, 입자크기 5mm, USA)을 사용했다.

도 2a 와 도 2b의 시험관내 방출 양상을 비교해보면 트윈 80의 농도가 0.025%일 때는 방출 조절제가 첨가되지 않은 비교실시예와, 방출 조절제를 함유한 처방들 실시예 1~5 (RP5, RP10, RP2S2, RP5S5, RP10S10)과는 방출 3일째 방출량이 약 15% 정도의 차이가 나지만, 방출 조절제의 함량에 따른 차이를 반영하지 못하고 그 이후 방출량의 증가가 관찰되지 않는 반면, 트윈 80의 함량을 0.05%로 높인 경우 조절제의 함량에 따라 방출 양상의 차이를 3일째 최고 40%까지 보여주고 있다. 본 발명에서 시험관내 방출 용매는 0.05% Tween 80을 함유하는 조성을 선택하여 처방 선정 연구에 이용하였다.

실험예 4. 사이클로스포린이 함유된 마이크로스피어에서 생체내 약물 방출

생체내 약물 방출 측정에서는 200 g 웅성 흰쥐에 주사 용매에 현탁한 사이클로스포린이 봉입된 마이크로스피어를 37.5 mg/kg 로 피하 주사하였다. 주사 용매는 주사용 증류수에 0.9% 염화나트륨, 0.1% 트윈 20을 포함하는 1.5% 소듐 카르복시메틸셀룰로오즈 용액을 제조하여 사용하였다. 주사 부위의 통증을 감소시키기 위하여 염화나트륨을 사용하여 등장액으로 하고, 마이크로스피어를 효과적으로 현탁시키고, 주사하는 동안 균일한 현탁액으로 유지 시키게 함과 동시에 주사 부위에서 마이크로스피어 입자들이 머물도록 하기 위하여, 200-400cps 점도를 유지할 수 있도록 점증제로서 소듐 카르복시메틸셀룰로오즈를 사용하였다. 주사 가능하고 독성이 없는 점증제는 무엇이나 적용 가능하지만, 주사 용매는 상기한 점도의 범위를유지하는 것이 중요하다. 주사 용매는 제조 후 멸균하여 사용하였다. 사이클로스포린 마이크로스피어를 투여 직전에 50 mg/ml로 현탁하여 흰쥐의 중량에 따라 환산된 양을 주사하였고, 이때 22 게이지로 바늘을 이용하였다. 흰쥐에서의 혈중농도 분석은 전혈을 이용하여 Fluorescence Polarization Immunoassay(FPIA)를 이용한 사이클로스포린 단일 항체 전혈 분석법을 이용하였다(TDx System, Abbott Lab., USA).

사이클로스포린 마이크로스피어를 투여한 결과, 방출 조절제의 함량에 따라 현저한 혈중 농도의 차이가 관찰되었다 (도 3). 방출 조절제를 함유하지 않은 군은 기 보고된 결과와 동일하게 유효혈중 농도에 미치지 못하는 양인 100 ng/ml 정도의 혈중 농도를 유지하였다 (비교실시예 1: ◆). 반면에 본 발명에 따라 방출조절제를 포함한 실시예 3 (●)및 5 (■)의 경우 전반적으로 훨씬 높은 혈중농도를 유지함을 학인할 수 있었다.

아울러 방출조절제로서 폴록사머 188 과 참기름을 각각 10% 포함한 실시예 5 (RP10S10)의 경우 최고혈중농도가 500 ng/ml 이상으로 높게 나타나지만, 방출조절제의 함량을 각각 2%로 조절한 실시예 3 (RP2S2)의 경우에는 150 ng/ml ~ 350 ng/ml 사이에서 유효하고도 일정한 혈중농도를 나타냄을 관찰할 수 있었다. 이는 방출 조절제의 함량을 조절함으로써 혈중농도를 조절할 수 있음을 보여준다. 방출 조절제의 종류 및 필요한 함량은 사용하는 생분해성 고분자의 종류와, 사이클로스포린의 함량에 따라 달라질 수 있다.

본 발명의 고농도의 사이클로스포린을 함유한 지속 방출형 마이크로스피어를 제형화할 경우 사이클로스포린 제제에서 요구되는 치료학적인 유효농도를 수일~수주 동안 일정하게 유지하면서도, 일정한 속도로 전량 방출될 수 있고, 경구복용으로 인한 일정하지 않은 생체이용율 때문에 발생될 수 있는 부작용을 최소화하여, 사전 모니터링으로 유발되는 치료비의 절감을 실현하고, 환자의 복약순응도를 높일 수 있을 것이다.

Claims

생분해성 고분자와 이에 봉입된, 사이클로스포린 및 방출조절제를 필수적으로 포함하는 사이클로스포린-함유 지속 방출형 약학적 조성물로서, 상기 방출조절제가 친수성 방출 조절제와 친유성 방출 조절제로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 성분인 것인 사이클로스포린-함유 지속 방출형 약학적 조성물.
제 1항에 있어서 사이클로스포린, 생분해성 고분자 및 방출조절제의 함량이 각각 15~70%, 25~80% 및 0.01~20%인 것인 약학적 조성물.
제 2항에 있어서 사이클로스포린, 생분해성 고분자 및 방출조절제의 함량이 각각 25~60%, 35~70% 및 0.1~10%인 것인 약학적 조성물.
제 1 항에 있어서 생분해성 고분자는 폴리락티드 및 폴리글리콜리드; 폴리락티드 코 글리콜리드, 폴리β-히드록시 부틸산, 폴리카프로락톤, 폴리언하이드라이드, 폴리오르토에스테르, 폴리언하이드라이드, 폴리우레탄, 폴리(부틸산), 폴리(발레릴 산) 및 폴리(락티드-코-카프로락톤); 이들의 유도체와 공중합체 및 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 1항에 있어서 친수성 방출 조절제로서 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산에스테르, 글리세릴 모노올레이트, 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리비닐알코올, 폴록사머, 폴리에틸렌글리콜, 글리세릴 팔미토스테아레이트, 벤질벤조에이트, 에틸올레이트, 알파 사이클로덱스트린, 베타 사이클로덱스트린, 감마 사이클로덱스트린 및 히드록시프로필 베타 사이클로덱스트린으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 성분임을 특징으로 하는 약학적 조성물
제 1항에 있어서, 친유성 방출 조절제가 대두유, 면실유 및 참기름으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 천연 오일임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 주사용 제제인 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 임플란트 제제인 약학적 조성물
제 1항에 있어서, 7일~28일간 체내에서 사이클로스포린의 혈중농도 100-500 ng/ml의 농도를 유지하도록 지속 방출하는 약학적 조성물.