KR20030033721A - 항헬리코박터 필로리 유산균을 포함하는 식품 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항헬리코박터 필로리 유산균을 포함하는 식품에 관한 것이다. 특히 본 발명은 헬리코박터 필로리 및 식중독 균의 성장을 저해하여 식품의 정위 기능성, 정장 기능성, 안정성 및 보관성을 향상시킨 두유, 식빵, 생크림 및 녹즙을 제공한다.

Description

항헬리코박터 필로리 유산균을 포함하는 식품{FOODSTUFF CONTAINING LACTIC ACID BACTERIA HAVING ANTI-HELICOBACTER PYLORI ACTIVITY}
[발명이 속하는 기술분야]
본 발명은 항헬리코박터 필로리 유산균을 포함하는 식품에 관한 것으로, 보다 상세하게는 항헬리코박터 필로리 활성을 가지는 유산균을 포함하는 식품을 제조하여, 식품내 유해균의 성장을 억제하고, 위질환을 예방 및 치료할 수 있는 식품에 관한 것이다.
[종래기술]
헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori)는 그람음성 세균으로서 1983년 웨렌(Warren)과 마샬(Marshall)에 의하여 처음으로 사람의 위 점막조직에서 분리 및 동정되었다. 처음에는 캠필로박터 파이로리디스(Campylo bacter pyloridis)로 명명되었으나, 체내에서의 모양과 위내에서 주로 서식하는 유문부(pylorus)의 명칭을 인용하여 '헬리코박터 필로리'로 명명되었다.
헬리코박터 필로리는 위궤양의 원인균으로, 위암의 원인균이기도 하다.(Dubois, A. 1995. Spiral bacteria in the human stomach: the gastric Helicobacters. Emerg. Infect. Dis. 1: 790085 ; Slomiany, B. L. and A. Slomiany. 1992. Mechanism of Helicobacter pylori pathogenesis: focus on mucus.J. Clin. Gastroenterol. 14 Suppl 1 S114-21) 헬리코박터 필로리에 일단 감염되면 감염이 수십 년간 지속되고, 자연적으로 제거되는 경우는 거의 없어 헬리코박터 필로리는 만성 위염의 주원인이다.
헬리코박터 필로리의 감염은 식품 등과 함께 경구적으로 침입한 균이 위, 십이지장 점막에 부착함에 따라 시작된다. 헬리코박터 필로리의 병독인자로는 위내의 강산에서 생존하기 위해 분비하는 유레아제, 운동성을 유지하도록 하는 편모, 위 상피세포에 쉽게 부착하도록 도와주는 세포 표면의 외막단백질이 있다.
한편, 위염, 위궤양, 십이지장궤양의 치료제로는 현재 위산분비를 억제하는 H2 차단제가 주류를 이루고 있다. 이와 같은 제제들은 치료효과가 높은데 반하여 재발비율이 높다. 이는 제제들이 헬리코박터 필로리에 직접적으로 작용하지 않고, 위산분비를 억제하는 것을 주된 작용이기 때문이다. 따라서, 근래에는 위염, 위궤양, 십이지장궤양의 원인인 헬리코박터 필로리에 직접적으로 작용하는 제제에 관해 많은 연구가 이루어지고 있다.
대한민국 특허공개 제 2000-70973호는 크산토필을 함유하는 것을 특징으로하는 경구용 제제를 개시하였고, 대한민국 특허공개 제 2000-56981호는 헬리코박터 필로리의 병독인자를 항원으로 하여 제조한 난황항체를 유효성분으로 함유하는 위염, 위궤양 및 십이지장궤양 예방 및 치료식품을 개시하고 있다.
본 발명은 헬리코박터 필로리의 성장을 억제할 수 있는 식품을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 식품내 대장균의 발생을 저해할 수 있는 식품을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 헬리코박터 필로리 및 식중독균에 대하여 성장억제기능을 포함하는 식품을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 안정성 및 보관성이 향상된 식품을 제공하는 것을 목적으로 한다.
도 1은 유산균 함유 두유에 의한 헬리코박터 필로리 성장 억제효과를 나타낸 사진이고,
도 2는 유산균 함유 두유에 의한 에어로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila)성장 억제효과를 나타낸 사진이고,
도 3은 PL9001 배양액을 포함하는 두유에 의한 에어로모나스 하이드로필라 성장 억제능을 관찰한 디스크 검사를 나타낸 사진이고,
도 4는 PL9001을 포함하는 두유에 의한 헬리코박터 필로리 성장억제를 나타내는 플레이트 사진이고,
도 5는 PL9001을 포함하는 두유에 의한 리스테리아 모노사이토제네스 (Listeria monocytogenes) 성장억제를 나타내는 플레이트 사진이고,
도 6은 PL9001을 포함하는 두유에 의한 에어로모나스 하이드로필라 성장억제를 나타내는 플레이트 사진이고,
도 7은 열처리한 유산균 함유 두유의 웰 테스트를 실시한 플레이트를 나타낸 사진이고,
도 8은 열처리한 유산균 함유 두유의 웰 테스트를 실시한 플레이트를 나타낸사진이고,
도 9는 혼합 유산균 함유 두유의 항헬리코박터 필로리 효과를 나타낸 플레이트 사진이고,
도 10은 페놀레드 테스트를 실시한 사진이고,
도 11은 혼합 유산균 함유 두유의 항 식중독 효과를 웰 테스트한 플레이트 사진이고,
도 12는 유산균 함유 식빵에 의한 헬리코박터 필로리 성장 억제환을 나타낸 사진이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 헬리코박터 필로리의 성장을 억제하는 유산균 또는 유산균의 부산물을 포함하는 유산균 함유 식품을 제공한다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명자들은 헬리코박터 필로리에 대하여 성장억제 효과를 가지는 유산균을 이용한 식품을 개발하였다.
본 발명의 유산균 함유 식품은 유산균, 그의 부산물, 유산균 파쇄물, 유산균 배양여액, 또는 유산균 활성화액을 포함하는 것이다. 상기 유산균은 생체 또는 사체를 포함하고, 헬리코박터 필로리의 위점막 부착을 억제시키는 균주가 바람직하다. 대표적인 예로 락토바실러스 속 균주, 스트렙토코커스 속 균주 및 엔테로코커스 속 균주가 있다. 더욱 바람직하게는 유산균은 락토바실러스 컨퓨서스(Lactobacillus confusus), 스트렙토코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) 또는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)이며, 일예로 락토바실러스 컨퓨서스 PL9001 (KCCM-10245), 스트렙토코커스 패칼리스 PL9003 (KCCM-10247), 락토바실러스 컨퓨서스 PL9004 (KCCM-10248), 락토바실러스 퍼멘텀 PL9005 (KCCM-10250) 또는 락토바실러스 퍼멘텀 PL9006 (KCCM-10251)이 있다.
상기 배양여액은 통상적인 배양배지상에서 배양한 배양물을 여과 또는 원심분리하여 균주를 제거한 여액이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 MRS 액체배지에 PL 균주를 접종하고 37 ℃에서 1시간 내지 15시간 배양한 다음 원심분리로 분리한 상등액이다.
유산균 활성화액은 유산균을 접종하고 일정시간 배양하여 활성화시킨 것으로, 106내지 1010cfu/ml의 유산균을 접종하여 수득한다.
유산균 함유 식품은 모든 종류의 식품이 바람직하며, 바람직하기로는 과자류, 당류, 아이스크림 제품류, 우유, 유가공품, 이유식, 치즈, 두부류, 묵류, 면류, 음료류, 된장류, 간장류, 고추장류, 주류, 젓갈류, 햄류, 소세지류, 김치·절임식품류, 빵류이다. 그러나 상기 식품에만 제한되는 것이 아니며, 생크림 등의 식품을 추가로 포함할 수 있다. 일예로, 쥬스, 녹즙, 우유, 치즈, 분유, 요구르트, 생크림, 두유, 두부가 있다.
본 발명의 유산균 함유 식품은 헬리코박터 필로리 및 유해균의 성장을 억제하여, 식품의 안정성 및 보관성을 향상시킨다. 또한 헬리코박터 필로리의 위막 부착을 억제한다. 유해균은 혐기성 세균, 식중독 유발균, 여드름 유발균이다.
본 발명은 생녹즙 및 유산균 조성물을 포함하는 유산균 함유 녹즙을 제공한다. 본 발명의 생녹즙은 야채, 채소 또는 과일을 분쇄하거나, 착즙하여 제조된 것을 의미한다. 상기 유산균 조성물은 106내지 1010cfu/ml의 유산균, 1 내지 15 중량%의 유산균 활성화액 및 1 내지 15 중량%의 유산균 배양여액으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함한다. 상기 유산균 활성화액은 75 내지 95 중량%의 생녹즙, 1 내지 15 중량%의 고과당 및 0.01 내지 10 중량%의 유산균을 포함하며 일정시간 배양한 것이다. 또한 유산균 함유 녹즙은 식품첨가제를 더욱 포함할 수 있다.
유산균 함유 녹즙의 제조방법은 통상의 녹즙 제조방법으로 제조된 녹즙에 유산균을 혼합하거나, 유산균을 혼합한 후 30-37 ℃에서 일정시간 반응시켜 제조하는 것을 특징으로 한다. 상기 유산균은 건조분말, 유산균 배양물, 유산균 배양여액 또는 유산균 활성화액으로 사용할 수 있다. 유산균 활성화액은 유산균을 식용배지에서 30-37 ℃, 일정시간(1시간 내지 5시간) 활성화시킨 것이 바람직하다. 유산균 함유 녹즙은 유산균에 의하여 항헬리코박터 필로리 및 항 식중독균 효능을 포함할 뿐만 아니라 유해균인 대장균 및 기타 세균을 억제한다.
또한 유산균 함유 두유는 두유 조성물 및 유산균 조성물을 포함한다. 유산균 조성물은 106내지 1010cfu/ml의 유산균, 1 내지 15 중량%의 유산균 활성화액 및 1 내지 15 중량%의 유산균 배양여액으로 이루어진 군으로 선택되어진 것을 포함한다. 두유는 콩을 불려 삶아낸 다음 껍질을 벗기고 곱게 갈아서 만든 콩국물로, 우유 또는 식품첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 유산균 활성화액은 70 내지 97 중량%의 두유, 1 내지 10 중량%의 고과당, 1 내지 10 중량%의 탈지분유 및 0.01 % 내지 10 중량%의 유산균(107내지 1012cfu/g)를 포함한다. 두유 조성물은 두유를 포함하며, 식품첨가제를 더욱 포함할 수 있다. 식품첨가제는 고과당, 말토올리고당, 소금, 구연산나트륨 및 정제수로 이루어진 군으로부터 1종이상 선택되어진 것이 바람직하나, 이에 한정되진 않는다. 가장 바람직한 유산균 함유 두유는 10 중량%의 유산균 활성화액, 80 중량%의 두유, 2.5 중량%의 고과당, 2.0 중량%의 말토올리고당, 0.015 중량%의 소금, 0.02 중량%의 구연산나트륨 및 5.33 중량%의 정제수를 포함한다.
유산균 함유 두유는 완제품인 두유에 유산균을 혼합하여 제조할 수 있으며, 유산균 활성화액을 혼합, 살균과정을 통하여 제조할 수 있다. 시판되는 두유에 유산균(109cfu/ml)을 혼합한 다음 두유의 효능을 검사한 결과, 유산균 함유 두유는 헬리코박터 필로리 성장을 억제(도 1, 도 4)할 뿐만 아니라 식중독 균의 성장 역시 억제(도 2, 도 3, 도 5, 도 6)하는 것으로 확인되었다. 또한 유산균 함유 두유는 열처리를 실시하여도 항헬리코박터 필로리(도 7) 및 항 식중독균(도 8) 효능을 나타내었다.
또다른 유산균 함유 두유의 제조방법은 (a) 70 내지 97 중량%의 두유, 1 내지 10 중량%의 고과당 및 1 내지 10 중량%의 탈지분유를 혼합하여 배양액을 제조하는 단계, (b) 배양액을 살균하는 단계, (c) 배양액을 37 ℃로 냉각시키는 단계, (d) 배양액에 0.01 % 내지 10 중량%의 유산균(107내지 1012cfu/g)을 접종하고 배양하여 유산균 활성화액을 제조하는 단계, (e) 1 내지 15 중량%의 유산균 활성화액, 75 내지 85 중량%의 두유, 1 내지 5 중량%의 고과당, 1 내지 5 중량%의 말토올리고당, 0.01 내지 0.5 중량%의 소금, 0.005 내지 0.05 중량%의 구연산나트륨 및 2 내지 10 중량%의 정제수를 혼합하는 단계, (f) 혼합액을 균질화하는 단계, 및 (h) 혼합액을 130-135 ℃에서 2-40초간 살균하는 단계를 포함한다. 상기한 방법으로 제조된 유산균 함유 두유는 항헬리코박터 필로리(도 9, 도 10) 효능 및 항식중독 효능(도 11)을 가진다.
본 발명의 유산균 함유 식빵은 유산균 조성물 및 식빵조성물을 포함한다. 유산균 조성물은 106내지 1010cfu/ml의 유산균, 0.01 내지 10 중량%의 유산균 활성화액 및 0.01 내지 10 중량%의 유산균 배양여액으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함한다. 유산균 활성화액은 75 내지 90 중량%의 증류수에 10 내지 15 중량%의 탈지분유 및 1 내지 10 중량%의 유산균을 포함하며 30 ℃ 내지 40 ℃에서 일정시간 배양하여 제조한다. 식빵조성물은 통상적으로 제조되는 식빵에 혼합되는 것으로, 강력분, 생이스트, 이스트후드, 물, 정백당, 조제탈지분유, 정제염, S-500, 5가공버터, 전란, 알파가 및 소프트멕스로 이루어진 군으로부터 1종이상 선택된 것이다.
유산균 함유 식빵은 통상의 식빵제조공정으로 제조되어지며, 1차 배합단계 및 2차 발효단계 이후에 실시되는 2차 배합단계에 유산균 또는 유산균 활성화액을 혼합하여 제조한다. 바람직하게는 (a) 100 중량부의 강력분, 15 내지 40 중량부의 생이스트, 0.01 내지 1 중량부의 이스트후드 및 45 내지 65 중량부의 물을 혼합하는 1차 배합단계, (b) 1차 발효단계, (c) 100 중량부의 강력분, 15 내지 35 중량부의 정백당, 5 내지 25 중량부의 조제탈지분유, 1 내지 20 중량부의 정제염, 0.5 내지 15 중량부의 S-500, 20내지 40 중량부의 가공버터, 0.1 내지 5 중량부의 생이스트, 60 내지 80 중량부의 물, 15 내지 35 중량부의 전란, 0.01 내지 10 중량부의 유산균 활성화액, 0.1 내지 10 중량부의 알파가 및 0.1 내지 10 중량부의 소프트멕스를 포함하는 배합물을 1차 배합물과 혼합하는 2차 배합단계, (d) 분할, 성형단계, (e) 2차 발효단계 및 (f) 굽는 단계를 포함한다. 식빵 조성물의 함량은 이에 한정되지 않으며, 식빵 제조조건은 통상의 조건이 바람직하다. 본 발명의 유산균 함유 식빵의 효능을 확인한 결과 통상의 식빵에 비하여 헬리코박터 필로리 성장억제효과를 나타내었다.(도 12)
본 발명의 유산균 함유 생크림은 생크림 조성물 및 유산균 조성물을 포함한다. 유산균 조성물은 106내지 1010cfu/ml의 유산균, 0.01 내지 15중량%의 유산균 활성화액 및 0.01 내지 15 중량%의 유산균 배양여액으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함한다. 유산균 활성화액은 75 내지 90 중량%의 증류수에 10 내지 15중량%의 탈지분유 및 0.1 내지 10 중량%의 유산균(107- 1012cfu/g)을 포함하며 30 ℃ 내지 40 ℃에서 일정시간 배양하여 제조한다. 생크림 조성물은 통상적인 생크림 조성물로, 유지방분, 전란, 정백당 및 우유로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 것을 포함하는 것이 바람직하다. 본 발명의 유산균 함유 생크림은 헬리코박터 필로리 및 식중독 균에 대하여 성장억제효과를 가진다.
이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 유산균 함유 녹즙의 제조
유통되는 풀무원녹즙 (케일즙 75 %, 양배추즙 25 %, 당근즙), 청년시대 (케일, 파인애플, 농축과실즙), 풀무원당근즙(당근 100 %)를 구입하고, 각각의 녹즙에 락토바실러스 컨퓨서스 PL9001 (KCCM-10245, 이하 'PL9001'이라 함), 스트렙토코커스 패칼리스 PL9003 (KCCM-10247, 이하 'PL9003'이라 함), 락토바실러스 퍼멘텀 PL 9006 (KCCM-10251, 이하 'PL9006'이라 함) 또는 락토바실러스 플란타륨을 108CFU로 첨가하였다.
상기 유산균 함유 녹즙의 유해균(대장균)의 감소정도를 확인하였다. 상기 녹즙은 30 ℃에서 3 시간 반응시킨 후, 멕콘키(MacConkey)배지에 녹즙 100 ㎕을 접종하여 배양되는 대장균 군수를 측정하였다.
하기 표 1은 유산균 종류에 따른 녹즙내 대장균수의 변화를 나타낸 것이고, 하기 표 2는 대장균 사멸에 소요된 시간을 나타낸 것이다.
시간 (hr)
0 1 2 3 4 5 6
풀무원녹즙 대조군 2.4x103 2.2x103 1.7x103 4.4x102 2.5x102 4.0x102 3.8x102
PL9001 4.4x102 3.3x102 3.4x102 2.2x102 7.0x101 6.0x101 1.0x101
PL9003 3.1x102 1.9x102 5.0x101 1.0x101 0 0 0
PL9006 6.8x102 3.3x102 2.6x102 1.4x102 7.0x101 2.0x101 0
L. p. 4.8x102 3.2x102 2.0x102 7.0x101 4.0x101 0 0
청년시대 대조군 4.0x102 1.4x102 1.6x102 4.1x102 2.2x103 1.5E+03 1.6x104
PL9001 7.0x101 1.0x102 3.0x101 1.0x101 2.0x101 1.0x101 0
PL9003 1.0x101 1.0x101 0 0 0 0 0
PL9006 1.0x101 5.0x101 2.0x101 0 0 0 0
L. p. 2.0x101 1.0x101 1.0x101 0 0 0 0
풀무원당근즙 대조군 세균과다 세균과다 세균과다 세균과다 세균과다 세균과다 세균과다
PL9001 세균과다 3.2x102 1.5x103 7.1x102 6.4x102 3.9x102 6.7x102
PL9003 세균과다 세균과다 세균과다 3.6x102 7.2x102 4.9x102 4.0x101
PL9006 세균과다 세균과다 세균과다 7.0x102 6.1x102 5.6x102 0
L. p. 세균과다 세균과다 세균과다 4.8x102 1.7x102 1.0x101 0
유산균에 의한 생즙별 대장균 사멸시간(hr)
풀무원녹즙 청년시대 풀무원당근즙
PL9001 >6 6 >6
PL9003 4 2 >6
PL9006 6 3 6
락토바실러스 플란타륨 5 3 6
세가지 녹즙에 대해 네가지 유산균 모두 대장균에 대한 억제능이 탁월하였으며, 특히 PL9003의 대장균 억제기능이 뛰어났다. 풀무원당근즙은 녹즙 내 대장균의 초기수가 과다하여 대장균을 사멸하는데 장시간이 소요되었다.
따라서, 유산균을 포함하는 녹즙은 유해균의 성장이 억제되고, 제품의 안정성이 유지된다.
실시예 2: 유산균 함유 두유의 제조 및 효능
2001년 8월 1일에 제조된 두유에 10 중량%의 PL9001 활성화액을 첨가한 후135 ℃에서 30초간 멸균하여 유산균 함유 두유를 제조하였다. PL9001 활성화액은 두유 90 중량%, 고과당 5 중량%, 탈지분유 5 중량%을 혼합하여 90 ℃에서 30분간 살균한 다음 PL9001 0.1 중량%을 접종하였고, 37 ℃에서 3시간 반응시켜 제조하였다.
유산균 함유 두유를 원심분리(18,000 rpm, min)하여 얻은 상등액을 동결 건조하여 4배의 농축액을 제조하였다. 헬리코박터 필로리(ATCC 43504)는 Brucella 고형배지(Brucella broth, fungizone(2.5 mg/ml amphotericin B), Skirrow's supplement(0.16 mg/ml polymyxin B, 5 mg/ml vancomycin, 2.5 mg/ml trimethoprim, 10 % horse serum, 1.5 % agar)에 도말하고, 상기 농축액을 배지의 웰에 100 ㎕ 떨어뜨린 후 37 ℃에서 3일 내지 4일 배양하였으며, 웰 주변에 헬리코박터 필로리 성장억제환의 생성을 관찰하였다.
도 1은 유산균 두유의 헬리코박터 필로리 성장 억제효과를 나타낸 사진으로, 1은 판매되는 두유, 2는 PL9001 활성화액을 포함하는 두유, 3은 활성화액 무첨가 두유를 나타낸 것이다. PL9001 활성화액을 포함하는 두유는 헬리코박터 필로리 성장 억제환을 형성하여, 헬리코박터 필로리 성장을 억제함을 알 수 있었다.
실시예 3: PL9001 활성화액 함유 두유 제조 및 효능
2001년 8월 1일 제조된 두유에 10 중량%의 PL9001 활성화액을 첨가한 후 135 ℃에서 30초간 멸균하여 유산균 함유 두유를 제조하였다. PL9001 활성화액은 두유 90 중량%, 고과당 5 중량%, 탈지분유 5 중량%을 혼합하여 90 ℃에서 30분간 살균한 다음 PL9001 0.1 중량%을 접종하였고, 37 ℃에서 3시간 반응시켜 제조하였다. 유산균 두유는 원심분리(18,000 rpm, min)하여 얻은 상등액을 동결 건조하여 4배의 농축액으로 제조하였다.
(1) 식중독균 검사용 웰 테스트
식중독균으로 에어로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila)를 BHI(Brain Heart Infusion) 배지에 도말하고, 웰을 만든후 농축액을 웰에 100 ㎕ 넣었다. 37 ℃에서 24 시간 배양하여 웰 주변에 형성되는 식중독균 성장 억제환을 성장 억제력 확인하였다(도 2).
(2) 식중독균 검사용 디스크 검사
에어로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila)를 BHI 배지에 도말하고, PL9001배양액을 포함하는 두유의 상청액으로 젖신 디스크를 배지위에 두었다. 37 ℃에서 24 시간 배양한 후 식중독 균의 성장을 확인하였다.
도 3은 PL9001 활성화액을 포함하는 두유에 의한 에어로모나스 하이드로필라 성장 억제능을 관찰한 디스크 검사 결과를 나타낸 사진으로, 디스크 주변에 에어로모나스 하이드로필라의 성장이 억제되어 투명하게 나타남을 확인하였다.
따라서, PL9001 활성화액을 포함하는 두유는 식중독 균의 성장이 저해되어 식품의 안정성을 향상시킨다.
실시예 4: PL9001 배양액 함유 두유의 제조 및 효능
(1) 제조
시판되는 두유 40 ml에 PL9001을 109cfu/ml 농도로 혼합하여 35 ℃에서 일정시간 배양하였다.
(2) 항헬리코박터 필로리
배양 시간별로 유산균을 제거한 두유 상등액 100 ㎕을 취하여 항헬리코박터 필로리 효과를 관찰하였다. 헬리코박터 필로리(ATCC 43504)는 Brucella 고형배지(Brucella broth, fungizone(2.5 mg/ml amphotericin B), Skirrow's supplement(0.16 mg/ml polymyxin B, 5 mg/ml vancomycin, 2.5 mg/ml trimethoprim, 10 % horse serum, 1.5 % agar)에 도말하고, 상기 상등액을 배지의 웰에 100 ㎕ 떨어뜨린 후 37 ℃에서 3일 내지 4일 배양하였으며, 웰 주변에 헬리코박터 필로리 성장억제환의 생성을 관찰하였다.
도 4는 PL9001을 포함하는 두유의 헬리코박터 필로리 성장억제를 나타내는 플레이트 사진으로, 1은 PL9001을 두유상에 1시간 배양시킨 시료이고, 2는 2시간, 3은 3시간, 4는 4시간, 5는 5시간 배양시킨 시료이다. 도 4에서 PL9001을 포함하는 두유가 헬리코박터 필로리 성장저해효과를 가짐을 알 수 있었고, 특히 3시간 이상 PL9001을 두유에 배양시켰을 때 항헬리코박터 필로리 효과가 탁월하였다.
(3) 항식중독균
배양 시간별로 두유 상등액(유산균 제거됨) 100 ㎕을 취하여 식중독균 성장억제 효과를 관찰하였다.
(i) 리스테리아 모노사이토제네스 성장 억제
리스테리아 모노사이토제네스를 BHI 배지에 도말한 다음 배지에 웰을 형성하여 두유상등액 100 ㎕을 넣어 37 ℃에서 24 시간동안 배양하였다.
도 5는 PL9001을 포함하는 두유의 리스테리아 모노사이토제네스 성장억제를 나타내는 플레이트 사진으로, 1은 PL9001을 두유상에 1시간 배양시킨 시료이고, 2는 2시간, 3은 3시간, 4는 4시간, 5는 5시간 배양시킨 시료이다. PL9001을 포함하는 두유는 리스테리아 모노사이토제네스에 대한 성장저해효과를 가짐을 알 수 있었고, 특히 3시간 이상 PL9001을 두유에 배양시켰을 때 리스테리아 모노사이토제네스 성장저해효과가 뚜렷하였다.
(ii)에어로모나스 하이드로필라
상기 동일한 방법으로, PL9001을 포함하는 두유의 에어로모나스 하이드로필라 성장저해효과를 관찰하였다.
도 6은 PL9001을 포함하는 두유의 에어로모나스 하이드로필라 성장억제를 나타내는 플레이트 사진으로, 1은 PL9001을 두유상에 1시간 배양시킨 시료이고, 2는 2시간, 3은 3시간, 4는 4시간, 5는 5시간 배양시킨 시료이다. PL9001을 포함하는 두유는 에어로모나스 하이드로필라에 대한 성장저해효과를 가짐을 알 수 있었고, 특히 4시간 이상 PL9001을 두유에 배양시켰을 때 에어로모나스 하이드로필라 성장저해효과가 뚜렷하였다.
실시예 5: 열처리한 유산균 함유 두유의 제조 및 효능
2001년 8월 21에 제조된 두유에 PL9001을 109cfu/ml로 혼합하고 35 ℃에서 5시간 배양한 후 열처리하였다. 100 ℃에서 15분 열처리한 실험군 1과 135 ℃에서 30초 열처리한 실험군 2로 각각 처리하였다.
(1) 항헬리코박터 필로리
실험군 1 및 실험군 2 각각을 헬리코박터 필로리가 도말된 배지상 웰에 100 ㎕을 넣고 배양하였다.
도 7은 열처리한 유산균 함유 두유의 웰 테스트를 실시한 플레이트를 나타낸 사진으로, 100 ℃에서 15분간 열처리한 두유(실험군 1)는 항헬리코박터 필로리 효과를 나타내지 않았으나, 130 ℃에서 30초 열처리한 두유(실험군 2)는 헬리코박터 필로리 성장 억제능이 뚜렷하였다.
(2) 항식중독
실험군 1 및 실험군 2 각각을 리스테리아 모노사이토제네스가 도말된 배지상 웰에 100 ㎕을 넣고 배양하였다.
도 8은 열처리한 유산균 함유 두유의 웰 테스트를 실시한 플레이트를 나타낸 사진으로, 100 ℃에서 15분간 열처리한 두유(실험군 1)는 리스테리아 모노사이토제네스에 대하여 성장억제 효과를 나타내지 않았으나, 130 ℃에서 30초 열처리한 두유(실험군 2)는 리스테리아 모노사이토제네스 성장 억제능이 뚜렷하였다.
실시예 6: 혼합 유산균 함유 두유의 제조
두유 90 중량%, 고과당 5 중량%, 탈지분유 5 중량%을 혼합하여 90 ℃에서 30분간 살균한 다음 37 ℃로 냉각한 다음 PL9001(1011cfu) 0.05 중량% 및 PL9003(1011cfu) 0.025 중량%을 접종하였다. 37 ℃에서 3시간 반응시키고, 배양액 10 중량%, 두유(농도 7.5%) 80 중량 %, 고과당 2.5 중량%, 말토올리고당 2.0 중량%, 소금0.15 중량%, 구연산 나트륨 0.02 중량% 및 정제수 5.33 중량%를 혼합하여 유산균 함유 두유를 제조한 다음 균질화하고, 135 ℃에서 30초 살균하였다.
(1) 항헬리코박터 필로리(Disk Test)
별모양의 멸균된 디스크에 유산균 함유 두유를 1 ml 얹은 후 다 스며들도록 말렸다. 이를 배양접시에 깔고 위에 Brucella 고체배지를 부어 고정시킨 다음 헬리코박터 필로리를 도말하여 5 % 이산화탄소 배양기에 3-4일간 배양하였다.
도 9는 혼합 유산균 함유 두유의 항헬리코박터 필로리 효과를 나타낸 플레이트 사진으로, 헬리코박터 필로리의 성장 억제영역이 관찰되었다.
도 9의 헬리코박터 필로리 성장 억제를 확인하기 위하여 페놀 레드 테스트(PHENOL RED TEST)을 실시하였다. 페놀레드 테스트는 헬리코박터 필로리가 배출하는 암모니아와 페놀 레드 시약이 반응하여 붉은 색을 띄는 것을 이용한 헬리코박터 필로리 존재 확인방법이다. 도 9의 플레이트에 훨터페이퍼를 흡착시킨 다음 페놀레드를 훨터페이퍼에 반응시켰다. 도 10은 페놀레드 테스트를 실시한 사진(A)으로, 도 10A의 연한 부분은 붉은색이 관찰되지 않은 부분이고, 진한 부분은 붉은색이 나타난 부분이다. 도 10B의 헬리코박터 필로리의 성장이 억제된 부분은 붉은 색을 관찰할 수 없었으나, 다른 부분에서는 붉은색이 나타나, 혼합 유산균 함유 두유가 헬리코박터 필로리의 성장을 직접 억제함을 확인할 수 있었다.
(2) 헬리코박터 필로리의 유레아제 억제정도 측정
혼합 유산균 함유 두유 1 ml에 헬리코박터 필로피(OD625=1.0)를 10 ㎕씩 첨가하여 1시간동안 37 ℃ 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 원심분리(15000 rpm, 10 min)하여 상등액을 멸균 MQ로 1/2 희석한 후 인돌페놀(indophenol)방법에 의한 유레아제(urease)성분을 측정하였다. 측정된 수치는 헬리코박터 필로리로부터 유래한 유레아제 활성에 비례하므로 시료상에 존재하는 헬리코박터 필로리 균의 양을 알 수 있다. 이러한 원리를 통하여 혼합 유산균 함유 두유의 처리에 따른 헬리코박터 성장억제 효과를 측정하였다.
하기 표 3은 혼합 유산균 함유 두유의 처리에 따른 유레아제 활성을 나타낸 것으로, 혼합 유산균 함유 두유가 헬리코박터 필로리 성장 억제능이 있음을 알 수 있었다.
유레아제 활성 (O.D.=630)
대조군 (MQ) 7.4
혼합 유산균 함유 두유 2.8
(3) 혼합 유산균 함유 두유의 식중독균 성장 억제효과
상기와 동일한 방법으로 실시하여 혼합 유산균 함유 두유의 에어로모나스 하이드로필라 성장 억제능을 관찰하였다.
도 11은 혼합 유산균 함유 두유의 항 식중독 효과를 웰 테스트한 플레이트 사진으로, 웰 주변의 에러로모나스 하이드로필라의 성장이 억제됨을 알 수 있었다.
실시예 7: PL9001을 포함하는 식빵의 제조법
크라운베이커리사에 의뢰하여 1차 배합-> 1차 발효-> 2차 배합 -> 분할-> 성형-> 2차 발효-> 굽기 과정을 통하여 유산균 함유 식빵을 제조하였다. 1차 배합과2차 배합시 사용된 조성물 및 함량은 표 4에 나타내었다.
구분 재료명 배합비율 중량
% g 실험중량
1차 강력분 80 215.7 1,600
생이스트 2 5.4 40
이스트후드 0.1 0.3 2
물 46 124 920
2차 강력분 20 53.9 400
정백당 5 13.5 100
조제탈지 3 8.1 60
정제염 1.8 4.9 36
S-500 0.8 2.2 16
가공버터 6 16.2 120
생이스트 0.25 0.7 5
물 14 37.7 280
전란 4.5 12.1 90
PL9001 발효액 0.6 1.6 12
알파가 0.7 1.9 14
소프트멕스 0.7 1.9 14
소계 185.45 500.0 3,709
PL9001 유산균 발효액은 증류수 100 g, 조세탈지분유 15 g 및 PL9001(1011) 4 g를 혼합하고 38 ℃에서 4시간 배양한 것을 사용하였다.
실시예 8: PL9001을 포함하는 식빵의 제조법
증류수 100 g, 조세탈지분유 15 g 및 PL9001 8 g를 포함하는 PL9001 유산균 발효액으로 식빵을 제조하였다.
실시예 9: PL9003을 포함하는 식빵의 제조
증류수 100 g, 조세탈지분유 15 g 및 PL9003 4 g를 포함하는 PL9003 유산균 발효액으로 식빵을 제조하였다.
실시예 10: PL9003을 포함하는 식빵의 제조
증류수 100 g, 조세탈지분유 15 g 및 PL9003 8 g를 포함하는 PL9003 유산균 발효액으로 식빵을 제조하였다.
실시예 11: 유산균 함유 식빵의 항헬리코박터 필로리 효과
(1)유레아제 활성억제 측정
PL9001을 포함하는 식빵과 PL9003을 포함하는 식빵 0.5 g을 각각 1 ml의 MQ 물로 추출한 후 헬리코박터 필로리의 유레아제 억제정도를 측정하였다. 추출방법은 건조, 분쇄, 현탁 후 여과법이다.
하기 표 5는 유산균을 함유한 식빵의 헬리코박터 필로리 성장억제능을 나타낸 것이다.
유레아제 활성(O.D.=630)
대조군식빵 2.59
PL9001 1.98
PL9003 2.37
유산균 함유 식빵이 대조군 식빵에 비하여 헬리코박터 필로리 성장 억제능이 우수하였다.
(2) 헬리코박터 필로리 성장억제 측정
유산균 함유 식빵을 일정한 크기를 가진 원모양으로 잘라내고, 이를 배양접시에 깔고 위에 고체배지를 부어 고정시켰다. Brucella 배지를 고체배지 위에 덮고, 헬리코박터 필로리 균을 도말하여 콜로니가 형성될때까지 배양하였다.
도 12는 유산균 함유 식빵에 의한 헬리코박터 필로리 성장 억제환을 나타낸 사진으로, 1은 대조군이고, 2는 실시예 7의 식빵, 3은 실시예 8의 식빵, 4는 실시예 9의 식빵, 5는 실시예 10의 식빵이다. PL9001을 포함하는 식빵이 가장 확연한 성장 억제환을 형성하였고, 유산균의 함량이 두배인 경우 훨씬 큰 억제환을 형성하였다.
실시예 12-13: PL9001을 포함하는 식빵의 제조
(1) 식빵제조
하기 표 6의 조성물로 혼합하여 38 ℃에서 4시간 활성화시켜 유산균 발효액을 제조하고, 식빵에 0.6 중량%로 혼합하여 실시예 12의 식빵, 실시예 13의 식빵을 제조하였다.
성분 실시예 12 실시예 13
증류수 100g 100g
조제탈지분유 15 g 15 g
PL9001(1011) 2.5 g 5 g
실시예 12은 유산균 발효액 중 PL9001의 농도는 2.0 x 109cfu/g이며, 굽기전 성형물에서의 PL9001 수는 6 x 106cell/g이다. 또한 실시예 13은 유산균 발효액 중 PL9001의 농도는 4.0 x 109cfu/g이며, 굽기전 성형물에서의 PL9001 수는 1.2 x 107cell/g이다.
(2) 식빵의 효능검증
실시예 12의 식빵 및 실시예 13의 식빵에 대한 항헬리코박터 필로리 효능 및 항식중독균 효능을 검사하였다.
항헬리코박터 필로리 활성은 유레아제 활성측정으로 실시하였고, 하기 표 7의 결과를 수득하였다.
종류 대조군(MQ) 실시예 12 실시예 13
O.D630 5.7 3.5 3.2
실시예 12 및 실시예 13의 식빵은 헬리코박터 필로리 성장을 억제하였다.
또한 식빵조각을 이용한 유해균 성장 억제환 형성(점적법)을 측정한 결과 표 8의 결과를 수득하였다. 사용한 유해균은 헬리코박터 필로리, 에어로모나스 하이드로필라, 리스테리아 모노사이토제네스이다. 실시예 12의 식빵에 비하여 실시예 13의 식빵이 식중독균에 대하여 더 좋은 억제능을 나타내었고, 모두 항헬리코박터 필로리 기능이 관찰되었다.
유해균
리스테리아 모노사이토제네스 에어로모나 하이드로필라 헬리코박터 필로리
실시예 12 - + +
실시예 13 + + +
실시예 14-15: 유산균 함유 생크림의 제조
(1) 생크림제조
통상적인 생크림에 PL9001 또는 PL9003을 2 중량%로 혼합하여 실시예 14의 생크림(2 x 109cfu/g) 및 실시예 15의 생크림(2 x 109cfu/g)을 제조하였다.
(2) 생크림의 유해균억제효과 검증
실시예 14의 생크림에 의한 식중독균의 성장억제정도를 억제환 크기 측정으로 관찰하였다. 실시예 14의 생크림은 리스테리아 모노사이토제네스 및 에어로모나스 하이드로필라의 성장을 억제하였다.
실시예 16-18: PL9001 함유 생크림의 제조
(1) 생크림 제조
멸균수 100 ml, 스킴밀크 10 g, PL9001 10 g(1011cfu)을 혼합하고, 38 ℃에서 3시간 활성화시켜 활성화 유산균을 제조하였다. 활성화 유산균은 0.5 중량%, 1 중량%, 2 중량%로 포함하는 생크림을 실시예 16 내지 실시예 18로 제조하였다.
(2) PL9001 함유 생크림의 유해균 성장억제 검증
리스테리아 모노사이토제네스, 에어로모나스 하이드로필라,E.coliO157, 헬리코박터 필로리를 유해균으로 하여 웰 테스트 및 점적법을 실시하였다.
검사법 유해균 생크림
실시예 16 실시예 17 실시예 18
웰 테스트 리스테리아 모노하이토제네스 - - +
에어로모나스 하이드로필라 + + +
E.coliO157 - - +
헬리코박터 필로리 + + +
점적법 리스테리아 모노하이토제네스 - - +
에어로모나스 하이드로필라 + + +
E.coliO157 - - +
헬리코박터 필로리 + + +
PL9001 함유 생크림은 활성화 유산균의 함량이 높을수록 유해균의 억제정도가 높게 나타났다.
(3) 유레아제 활성 측정
실시예 16 내지 실시예 18의 생크림에 대한 헬리코박터 필로리 성장 억제효능을 유레아제 활성 측정법으로 검사하였다.
그 결과, 하기 표 10과 같이 활성화 유산균을 2 중량%로 포함하는 생크림(실시예 18)에서 유레아제 활성이 급격하게 적게 나타나 헬리코박터 필로리 성장이 거의 억8제되었음을 알 수 있었다.
O.D630
대조군(MQ) 6.9 6.94 6.92
실시예 16 5.74 5.87 5.805
실시예 17 5.29 5.48 5.385
실시예 18 0.41 0.45 0.43
본 발명은 유산균, 유산균 배양여액 함유 또는 유산균 활성화액을 포함하는 녹즙, 식빵, 두유 및 생크림은 헬리코박터 필로리 및 유해균의 성장을 억제하고, 식품의 안정성 및 보관성을 향상시켰다.

Claims (19)

  1. 헬리코박터 필로리의 성장을 억제하는 유산균 또는 유산균의 부산물을 포함하는 유산균 함유 식품.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스 컨퓨서스 PL9001 (KCCM-10245), 스트렙토코커스 패칼리스 PL9003 (KCCM-10247), 락토바실러스 컨퓨서스 PL9004 (KCCM-10248), 락토바실러스 퍼멘텀 PL9005 (KCCM-10250) 및 락토바실러스 퍼멘텀 PL9006 (KCCM-10251)으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 것인 유산균 함유 식품.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 식품은 과자류, 당류, 아이스크림 제품류, 유가공품, 두부류, 묵류, 면류, 음료류, 간장류, 된장류, 고추장류, 주류, 젓갈류, 햄류, 소세지류, 김치·절임식품류 또는 빵류인 유산균 함유 식품.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 식품은 생녹즙 및 유산균 조성물을 포함하는 유산균 함유 녹즙인 유산균 함유 식품.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 유산균 조성물은 106내지 1010cfu/ml의 유산균, 1 내지 15 중량%의 유산균 활성화액 및 1 내지 15 중량%의 유산균 배양여액으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함하는 것인 유산균 함유 식품.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 유산균 활성화액은 75 내지 95 중량%의 생녹즙, 1 내지 15 중량%의 고과당 및 0.01 내지 10 중량%의 유산균을 포함하는 것인 유산균 함유 식품.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 식품은 두유 조성물 및 유산균 조성물을 포함하는 유산균 함유 두유인 유산균 함유 식품.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 유산균 조성물은 106내지 1010cfu/ml의 유산균, 1 내지 15 중량%의 유산균 활성화액 및 1 내지 15 중량%의 유산균 배양여액으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함하는 것인 유산균 함유 식품.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 유산균 활성화액은 70 내지 97 중량%의 두유, 1 내지 10 중량%의 고과당, 1 내지 10 중량%의 탈지분유 및 0.01 내지 10 중량%의 유산균으로 이루어진 군으로부터 1종이상 선택된 것을 포함하는 것인 유산균 함유 식품.
  10. 제 7항에 있어서, 상기 유산균 함유 두유는 1 내지 15 중량%의 유산균 활성화액, 75 내지 85 중량%의 두유, 1 내지 5 중량%의 고과당, 1 내지 5 중량%의 말토올리고당, 0.01 내지 0.5 중량%의 소금, 0.005 내지 0.05 중량%의 구연산나트륨 및 2 내지 10 중량%의 정제수로 이루어진 군으로부터 1종이상 선택된 것을 포함하는 것인 유산균 함유 식품.
  11. 제 7항에 있어서, 상기 유산균 함유 두유는 130-135 ℃에서 2-40초간 살균된 것인 유산균 함유 식품.
  12. 제 1항에 있어서, 상기 식품은 식빵 조성물 및 유산균 조성물을 포함하는 유산균 함유 식빵인 유산균 함유 식품.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 유산균 조성물은 식빵 조성물의 1차 배합단계 및 1차 발효단계 이후에 혼합되는 것인 유산군 함유 식품.
  14. 제 12항에 있어서, 상기 유산균 조성물은 106내지 1010cfu/ml의 유산균, 0.01 내지 10 중량%의 유산균 활성화액 및 0.01 내지 10 중량%의 유산균 배양여액으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함하는 것인 유산균 함유 식품.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 유산균 활성화액은 75 내지 90 중량%의 증류수에 10내지 15 중량%의 탈지분유 및 1 내지 10 중량%의 유산균를 포함하는 것인 유산균 함유 식품.
  16. 제 12항에 있어서, 상기 식빵 조성물은 강력분, 생이스트, 이스트후드, 정백당, 조제탈지분유, 정제염, S-500, 가공버터, 물, 전란, 알파가 및 소프트멕스로 이루어진 군으로부터 1종이상 선택된 것을 포함하는 유산균 함유 식품.
  17. 제 1항에 있어서, 상기 식품은 생크림 조성물 및 유산균 조성물을 포함하는 유산균 함유 생크림인 유산균 함유 식품.
  18. 제 17항에 있어서, 상기 유산균 조성물은 106내지 1010cfu/ml의 유산균, 0.01 내지 15 중량%의 유산균 활성화액 및 0.01 내지 15 중량%의 유산균 배양여액으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함하는 것인 유산균 함유 식품.
  19. 제 18항에 있어서, 상기 유산균 활성화액은 75 내지 90 중량%의 증류수에 10 내지 15 중량%의 탈지분유 및 0.1 내지 10 중량%의 유산균(107- 1012cfu/g)으로 이루어진 군으로부터 1종이상 선택된 것을 포함하는 것인 유산균 함유 식품.
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