KR20030032187A - 마이코박테리움 에스피를 사용하는9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온의 제조방법 - Google Patents

마이코박테리움 에스피를 사용하는9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온을 생산하는 미생물 마이코박테리움 에스피를 사용하는 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온의 제조방법에 관한 것으로서, 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온을 생산하는 미생물 마이코박테리움 에스피(Mycobacteriumsp. ; 러시아 미생물협회 수탁번호 VKM Ac 1817D, 한국생명공학연구원 유전자은행 수탁번호 KCTC 10049BP)를 사용하여 코르티코스테로이드를 제조하는 중요한 시작물질로서 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온을 높은 효율로 경제적으로 제조하는 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

Description

마이코박테리움 에스피를 사용하는 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온의 제조방법 {9-alpha-hydroxy-androst-4-en-3,17-dion manufacturing method using Mycobacterium sp.}
본 발명은 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온을 생산하는 미생물 마이코박테리움 에스피를 사용하는 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온의 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 본 발명은 자연에서 스크리닝된 미생물인 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온을 생산하는 미생물 마이코박테리움 에스피(Mycobacteriumsp. ; 러시아 미생물협회 수탁번호 VKM Ac 1817D, 한국생명공학연구원 유전자은행 수탁번호 KCTC 10049BP)를 사용하여 코르티코스테로이드를 제조하는 중요한 시작물질로서 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온을 높은 효율로 경제적으로 제조하는 제조방법에 관한 것이다.
스테로이드 물질이 미생물에 의해서 전환이 가능하다는 것은 잘 알려진 사실이다. 비싸고 복잡한 화학공정을 대체하기 위해서 미생물을 이용한 많은 스테로이드 전환공정이 개발되어왔다. 유용한 스테로이드 합성 중간체들 또한 쉽게 구할 수 있는 스테롤로부터 생산될 수 있다. 예를 들면, 콜레스테롤이나 시토스테롤 등이 있다. 여러 미생물들이 이들 값싼 물질들로부터 스테로이드 중간체를 생산할 수 있도록 자연계에서 선택되어지고, 변형되어 왔다. 네덜란드 특허 NL6513718, NL6705450 등에는 스테로이드의 핵심구조를 포함하고, 17번 탄소의 가지를 분해시켜서 유용한 물질을 생산하는 방법이 기술되어 있다. 특별한 저해물질을 첨가시키거나, 특별히 준비된 돌연변이를 이용하여 스테로이드 합성의 시작물질인 안드로스텐디온을 고수율로 생산하였다는 보고도 있었다(미합중국 특허 US3684657, US3759791, US434029 등을 참조).
미생물로부터 얻어질 수 있는 여러 가지 스테로이드 중에서 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온은 특히 중요하다. 왜냐하면, 이 물질은 코르티코스테로이드를 준비하는 중요한 시작물질로 사용될 수 있기 때문이다.
미생물을 이용하여 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온을 생산할 수 있는 몇 가지 방법들이 발표되어져 있으며, 이를 요약하면 다음과 같다.
가. 안드로스텐디온에 9-하이드록시기를 첨가하는 공정. 이때, 미생물은노카디아(US4397947) 또는 코린네스포라 카시콜라(EP-A-0027829)를 사용하였다.
나. US3759791에서는 마이코박테리움 포리튜이텀 NRRL B-8119 균주를 이용하여 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온을 생산하였다. 그러나, 수율이 매우 낮았으며, 그 이유는 제조된 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온이 천천히 분해되어 없어진다는 것이었다.
다. 동독 특허 DD232167에는 마이코박테리움 균주를 사용하여 스테롤로부터 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온을 생산하는 방법이 기술되어 있는데, 역시 수율이 낮다.
라. 영국 특허 GB2197869에는 마이코박테리움 로지움을 사용하여, 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온을 생산하는 방법이 기술되어 있다. 이때, 수율은 100g의 스테롤로부터 28.5g의 스테로이드를 얻는 정도였다.
상기한 기술들을 보면, 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온을 생산하는 수율이 낮고, 사용하는 스테롤의 농도도 최대 20g/ℓ로 상업적으로 응용하기에는 낮은 농도이다. 게다가, 일부의 경우, 고가의 고분자물질을 사용하는 경우도 있다.
본 발명의 목적은 상기한 바와 같은 종래 기술에서의 낮은 생산성과 높은 생산 비용 문제를 해결하기 위한 것으로서, 값싼 스테롤 혼합물을 사용하여 높은 수율로 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온을 생산하는 미생물 마이코박테리움 에스피(Mycobacteriumsp. ; 러시아 미생물협회 수탁번호 VKM Ac 1817D, 한국생명공학연구원 유전자은행 수탁번호 KCTC 10049BP)를 사용하는 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온의 제조방법을 제공하는 데 있다.
도 1은 30g/ℓ의 스테롤 혼합물이 본 발명에 사용되는 마이코박테리움 에스피(Mycobacteriumsp.)에 의해 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온으로 전환되는 과정을 도시한 그래프이다.
도 2는 본 발명에 따라 메틸화된 사이클로덱스트린의 재활용도를 높이기 위해 반복하여 전환공정에 사용하였을 경우, 스테롤이 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온으로 전환되는 것을 시간에 따라 도시한 그래프이다.
본 발명에 따른 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온의 제조방법은, (1) 마이코박테리움 에스피(Mycobacteriumsp. ; 러시아 미생물협회 수탁번호 VKM Ac 1817D, 한국생명공학연구원 유전자은행 수탁번호 KCTC 10049BP)를 종배양배지에서 배양하는 종배양단계; (2) 배양된 상기 미생물을 전환시키고자 하는 시토스테롤, 캠패스테롤, 스티그마스테롤 또는 이들 중 2이상의 혼합물로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 스테롤 및 메틸화된 사이클로덱스트린을 포함하는 전환배지에 접종시키되, 상기 종배양배지의 5 내지 20배의 양의 전환배지에 접종시키고, 배양시키는 전환배양단계; (3) 상기 전환배양단계에서 전환이 종료된 배양액을 50 내지 80℃로 10 내지 60분 동안 가열하여 미생물을 사멸시키고, 11,200g에서 30분간 원심분리하여 고형의 세포덩어리를 제거하고, 상등액을 에틸아세테이트로 추출하는 생성물 회수단계; 및 (4) 상기 생성물 회수단계에서 회수된 생성물을 결정화 및 재결정화시켜 정제하는 정제단계;들을 포함하여 이루어진다.
이하, 본 발명의 구체적인 실시예를 첨부한 도면을 참조하여 상세히 설명한다.
마이코박테리움 에스피(Mycobacteriumsp.)는 자연계에서 선별된 것으로서, 스테롤 또는 스테롤 혼합물들을 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온으로 전환시키는 능력을 가지고 있다. 또한, 이는 이미 생산된 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온의 분해능력이 낮아 결과적으로 높은수율로 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온을 생산할 수 있다. 더욱이, 이는 시토스테롤을 단독으로 사용하는 경우 이외에, 시토스테롤, 캠패스테롤 및 스티그마스테롤 등을 혼합한 스테롤 혼합물을 사용하여 높은 수율로 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온을 생산할 수 있다. 상기한 바의 특성을 갖는 본 발명에서 사용되는 마이코박테리움 에스피 균주는 러시아 유전자은행(Russian Collection of Microorganisms)에 수탁번호 VKM Ac 1817D로 기탁되었다. 상기 마이코박테리움 에스피 균주는 또한 대한민국 소재 한국생명공학연구원 유전자은행에 수탁번호 KCTC 10049BP(LG-Myc-001)로 기탁되었으며, 이들 수탁기관들로부터 용이하게 입수할 수 있다.
본 발명에 따른 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온의 제조방법은 (1) 마이코박테리움 에스피(Mycobacteriumsp. VKM Ac 1817D)를 종배양배지에서 배양하는 종배양단계; (2) 배양된 상기 미생물을 전환시키고자 하는 시토스테롤, 캠패스테롤, 스티그마스테롤 또는 이들 중 2이상의 혼합물로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 스테롤 및 메틸화된 사이클로덱스트린을 포함하는 전환배지에 접종시키되, 상기 종배양배지의 5배에서 20배의 양의 전환배지에 접종시키고, 배양시키는 전환배양단계; (3) 상기 전환배양단계에서 전환이 종료된 배양액을 50 내지 80℃로 10 내지 60분 동안 가열하여 미생물을 사멸시키고, 11,200g에서 30분간 원심분리하여 고형의 세포덩어리를 제거하고, 상등액을 에틸아세테이트, 클로로포름 등으로 추출하는 생성물 회수단계; 및 (4) 상기 생성물 회수단계에서 회수된 생성물을 결정화 및 재결정화시켜 정제하는 정제단계; 들을 포함하여 이루어짐을 특징으로 한다.
상기 (1)의 종배양단계는 통상 원주를 확대배양하는 단계로 이해될 수 있는 것으로서, 종배양배지에서 미생물 마이코박테리움 에스피(Mycobacteriumsp. VKM Ac 1817D)을 확대배양하는 단계이다. 상기 종배양배지는 바람직하게는 효모추출물, 황산암모늄, 인산일칼륨, 인산이칼륨, 글리세롤, 황산마그네슘, 황산철 및 황산아연을 그 성분으로 하며 pH는 7.0 내지 7.4 사이로 유지된다.
상기 (2)의 전환배양단계에서는, 상기 종배양단계에서 확대배양된 마이코박테리움 에스피를 전환시키고자 하는 시토스테롤, 캠패스테롤, 스티그마스테롤 또는 이들 중 2이상의 혼합물로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 스테롤 및 메틸화된 사이클로덱스트린을 포함하는 전환배지에 접종시키되, 상기 종배양배지의 5 내지 20배의 양의 전환배지에 접종시키고, 배양시키는 단계이다. 이 단계에서, 마이코박테리움 에스피는 시토스테롤, 캠패스테롤, 스티그마스테롤 또는 이들 중 2이상의 혼합물로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 스테롤로부터 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온을 생산하게 된다. 상기 스테롤 또는 스테롤 혼합물 중의 스테롤 함량은 70 내지 90%가 될 수 있다. 또한, 이보다 낮은 스테롤 함량을 갖는 경우, 핵산으로 세척하거나 에틸아세테이트에 용해시킨 후, 재결정시키는 방법에 의해 스테롤 함량을 높여서 사용할 수도 있다.
상기 전환배지는 마이코박테리움 에스피에 의해 전환될 스테롤 또는 스테롤의 혼합물을 포함하며, 또한 상기한 미생물에 영양을 공급하여 신규 미생물이 정상적으로 또는 과잉으로 증식하면서 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온을 생산토록 하는 기능을 한다.
상기 전환배지는 바람직하게는 우레아, 황산암모늄, 인산일칼륨, 인산이칼륨, 글리세롤, 트윈80, 황산화마그네슘, 황산철, 황산아연, 진한 황산 및 메틸화된 사이클로덱스트린, 그리고 스테롤 또는 스테롤 혼합물을 그 성분으로 하며, pH는 7.0 내지 7.4로 된다.
상기 전환배지에서 사용된 메틸화된 사이클로덱스트린은, 본 발명에 따르는 마이코박테리움 에스피에 의해 전환된 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온의 용해도를 높이고, 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온을 미생물로부터 공간적으로 분리하여 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온의 미생물에 의한 분해를 저해하는 기능을 한다. 상기 메틸화된 사이클로덱스트린은 전체 배양액의 20% 이상 높은 농도로 사용되는 경우에도 본 마이코박테리움 에스피가 성장하는데 저해가 없고, 간단한 회수공정을 거쳐서 재활용할 수 있다는 장점을 가지고 있다. 메틸화된 사이클로덱스트린을 사용하는 경우, 스테롤의 배지 중 농도가 10 g/L 이상인 고농도 배양에서도 높은 수율로 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온으로의 전환이 가능하다. 특히, 전환배지 중의 스테롤의 함량이 높아질수록 메틸화된 사이클로덱스트린의 함량을 증가시켜 스테롤의 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온으로의 높은 수율로의 전환을 가능하게 한다.
상기한 바와 같은 조건에서 스테롤을 전부 전환시키는 데에는 50 내지 120시간 정도가 소요된다.
상기 (3)의 생성물 회수단계는 전환에 사용된 마이코박테리움 에스피를 사멸시키고, 생성물을 추출에 의해 회수하는 단계로서, 상기 전환배양단계에서 전환이 종료된 배양액을 50 내지 80℃로 10 내지 60분 동안 가열하여 미생물을 사멸시키고, 원심분리하여 고형의 세포덩어리를 제거하고, 상등액을 에틸아세테이트로 추출하는 단계이다. 이 단계에서 비로소 스테롤로부터 전환된 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온을 에틸아세테이트로 추출하여 회수하게 된다. 추출된 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온은 백색 분말로 수득된다.
상기에서 배양액의 가열온도가 50℃ 미만인 경우, 미생물이 충분히 사멸하지 못하여 사멸되지 않은 미생물이 계속해서 전환된 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온을 분해하여 수율을 저하시키는 문제점이 있을 수 있으며, 80℃를 초과하는 경우, 세포가 깨져서 원심분리로 마이코박테리움 에스피 세포를 제거하는데 어려움이 생긴다. 상기에서 상등액을 에틸아세테이트로 추출하고 난 후의 수성층 중에는 메틸화된 사이클로덱스트린이 포함되어 있어 1 내지 3회 반복하여 전환배지로 사용될 수 있다. 이때 상기 재사용되는 수성층에는 전환공정 중 소모되는 성분인 황산암모늄, 인산이칼륨, 글리세롤, 트윈80, 그리고 스테롤 또는 스테롤 혼합물 들을 보충하여야 한다.
이와 같이 적어도 3회 이상의 반복 사용후에, 상기 수성층 중에 포함된 메틸화된 사이클로덱스트린을 재사용하기 위하여 상기 수성층을 핵산으로 추출하고 난 후, 잔여의 수성층을 다시 사용하는 것이 바람직하다. 이때, 핵산으로의 추출은 스테로이드 이외의 성분을 제거하기 위한 공정이다. 핵산으로의 추출 후, 메틸화된 사이클로덱스트린을 포함하는 상기 수성층은 다시 1 내지 3회 재사용이 가능하게 된다. 핵산으로의 추출공정을 포함하여 적어도 7회 반복 사용된 메틸화된 사이클로덱스트린을 포함하는 상기 수성층으로부터 클로로포름을 이용하여 메틸화된 사이클로덱스트린을 추출하여 회수할 수 있다. 이와같이 회수된 메틸화된 사이클로덱스트린은 다시 전환배지를 구성하는 데 사용될 수 있다.
상기 (4)의 정제단계는 상기 (3)의 생성물 회수단계에서 회수된 생성물을 결정화 및 재결정화시켜 정제하는 단계이다. 이 단계에서는 상기 회수단계에서 사용된 추출용매인 에틸아세테이트 중의 생성물을 결정화에 의해 분리하거나 또는 분리된 조생성물(crude product)을 재결정 방법으로 정제하며, 당업자에게는 용이하게 이해될 수 있는 정도로 통상적으로 진행되는 절차로 이해될 수 있다. 본 발명에서는 상기한 결정화 및 재결정화를 추출용매에 용해시킨 후 증발시켜 제거하는 등의 방법을 반복하는 것에 의해 수행하나, 다른 통상의 결정화 및 재결정화 방법들이 적용될 수 있음은 당연히 이해될 수 있는 것이다.
이하에서 본 발명의 바람직한 실시예 및 비교예들이 기술되어질 것이다.
이하의 실시예들은 본 발명을 예증하기 위한 것으로서 본 발명의 범위를 국한시키는 것으로 이해되어져서는 안될 것이다.
실시예 1
시토스테롤을 사용한 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온의 생산(5ℓ 규모)
마이코박테리움 에스피(Mycobacteriumsp. ; 러시아 미생물협회 수탁번호 VKM Ac 1817D, 한국생명공학연구원 유전자은행 수탁번호 KCTC 10049BP)를 효모추출물, 황산암모늄, 인산일칼륨, 인산이칼륨, 글리세롤, 황산마그네슘, 황산철 및 황산아연을 그 성분으로 하며 pH는 7.0 내지 7.4 사이로 유지되는 종배양배지에서 확대배양하여, 제시된 전환배지 조성 중 스테롤은 50g의 시토스테롤만 사용한 배지에 접종시켰다. 이때, 종배양배지의 부피는 500㎖, 전환배지는 5ℓ로 하였다.
시토스테롤이 전부 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온으로 전환되었음을 박막 액체크로마토그래피 방법으로 확인하고, 배양액의 온도를 60℃로 올려서 20분간 가열하였다. 상기 배양액은 원심분리기를 이용하여 세포와 상등액으로 분리한 후, 세포덩어리는 폐기하였다. 상등액은 약 7.5ℓ의 에틸아세테이트로 추출하였다. 층분리를 한 후, 수성층은 다음 번 전환공정에 사용하기 위해 모아두고, 이 7.5ℓ의 에틸아세이트층은 약 500㎖가 되도록 증발시킨 후, 4℃에서 방치하여 1차 결정화시키고, 다시 에틸아세테이트를 약 100㎖로 증발시켜 농축시킨 후, 4℃에서 방치하여 2차로 결정화시켰다. 2회의 결정화 단계에서 수득된 결정을 모아서 재결정을 하였다. 이렇게 하여 18.5g의 순도 98% 이상의 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온 분말을 37%의 수율로 수득하였다.
실시예 2
시토스테롤을 사용한 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온의 생산(3ℓ 규모)
10g/ℓ의 시토스테롤을 포함하는 3ℓ의 전환배지를 사용하여 실시예 1과 같은 방법으로 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온을 생산하였다. 수성층을 약 4.5ℓ의 에틸아세테이트로 추출하고, 추출 후 에틸아세테이트층의 증발 후 잔량을 300㎖가 되도록 증발시킨 뒤, 4℃에서 방치하여 1차로 결정화시켰다. 이 에틸아세테이트를 다시 약 60㎖로 증발시켜 농축시킨 후, 4℃에서 방치하여 2차로 결정화시켰다. 본 회수, 정제 단계에서는 2회의 결정화 단계에서 수득된 결정을 모아서 재결정화 시키는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 조작하였다. 시토스테롤이 모두 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온으로 전환되는 데 걸린 시간은 약 65시간 이었다. 이렇게 하여 10.8g의 순도 98% 이상의 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온 분말을 38%의 수율로 수득하였다.
실시예 3
스테롤 혼합물을 사용한 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온의 생산(3ℓ 규모)
시토스테롤, 스티그마스테롤 그리고 불순물이 52.5:37:10.5의 중량혼합비로 섞인 혼합물을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 2와 동일하게 수행하였다. 스테롤 혼합물이 모두 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온으로 전환되는 데 걸린 시간은 약 70시간 이었다. 이렇게 하여 10.0g의 순도 98% 이상의 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온 분말을 33%의 수율로 수득하였다.
실시예 4
고농도의 스테롤 혼합물(20g/ℓ)을 사용한 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온의 생산(3ℓ 규모)
전환배지 중 실시예 3에 적시된 스테롤 혼합물을 20g/ℓ의 농도로 사용하고, 메틸화된 사이클로덱스트린의 양을 100g/ℓ(원래의 양의 2배)를 사용하는 것을 제외하고는 상기 실시예 3과 동일하게 수행하였다. 이렇게 하여 21.0g의 순도 96% 이상의 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온 분말을 35%의 수율로 수득하였다.
실시예 5
고농도의 스테롤 혼합물(30g/ℓ)을 사용한 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온의 생산(3ℓ 규모)
전환배지에 투입되는 마이코박테리움 에스피의 세포량을 실시예 3에 비해 4배량으로 확대배양하여 투입하고, 메틸화된 사이클로덱스트린의 양을 150g/ℓ(원래의 양의 3배), 다른 전환배지 성분들은 원래의 양의 2배를 사용하며, 스테롤 혼합물은 초기에 20g을 가한 뒤, 전환 중간에 10g을 추가하는 것을 제외하고는 상기 실시예 3과 동일하게 수행하였다. 이 경우, 단위양의 스테롤 혼합물을 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온으로 모두 전환시키는 데 소요되는 시간이 약 13시간으로 80% 이상 감소하였다.
실시예 6
고농도의 스테롤 혼합물(40g/ℓ)을 사용한 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온의 생산(3ℓ 규모)
메틸화된 사이클로덱스트린의 양을 200g/ℓ(원래의 양의 4배)를 사용하고, 다른 전환배지 성분들은 원래의 양의 2배를 사용하고, 스테롤 혼합물은 초기에 20g을 가하고, 전환 중간에 20g을 추가하는 것을 제외하고는 상기 실시예 3과 동일하게 수행하였다. 이렇게 하여 39.2 g의 순도 90% 이상의 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온 분말을 33%의 수율로 수득하였다. 또한, 단위양의 스테롤 혼합물을9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온으로 전환시키는 데 소요되는 시간이 약 144시간이 소요되었다.
실시예 7
고농도의 스테롤 혼합물(50g/ℓ)을 사용한 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온의 생산(3ℓ 규모)
메틸화된 사이클로덱스트린의 양을 250g/ℓ(원래의 양의 5배)를 사용하고, 다른 전환배지 성분들은 원래의 양의 2배를 사용하고, 스테롤 혼합물은 초기에 20g을 가하고, 전환 중간에 20g을 추가하고, 다시 10g을 추가하는 것을 제외하고는 상기 실시예 3과 동일하게 수행하였다. 이 경우, 단위양의 스테롤 혼합물을 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온으로 모두 전환시키는 데 소요되는 시간이 약 231시간이 소요되었다.
실시예 8
메틸화된 사이클로덱스트린의 연속 사용
실시예 1과 동일하게 1차로 전환공정(전환배지, 5ℓ)을 수행하여, 50g의 스테롤 혼합물로부터 18.5g의 순도 98% 이상의 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온 분말을 37.0%의 수율로 수득하였다. 세포가 분리되고, 에틸아세테이트로 추출하여 에틸아세테이트층이 분리된 후의 수성층을 전환배지로 재사용하되, 상기 적시한 추가배지(황산암모늄, 인산이칼륨, 글리세롤, 트윈80 및 스테롤 혼합물) 만을 첨가하여 다시 배양액을 구성하고, 실시예 1과 동일하게 2차 전환공정을 수행하였다. 이렇게 하여 17.83g의 순도 95% 이상의 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온 분말을 35.7%의 수율로 수득하였다.
전환이 완료된 후, 다시 세포를 분리하고, 에틸아세테이트로 추출하여 에틸아세테이트층이 분리된 후의 수성층을 전환배지로 재사용하되, 상기와 같은 성분들을 포함하는 추가배지만을 첨가하여 다시 배양액을 구성하고, 실시예 1과 동일하게 3차로 전환공정을 수행하였다. 이렇게 하여 17.59g의 순도 95.4% 이상의 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온 분말을 35.2%의 수율로 수득하였다.
상기와 같은 공정을 다시 반복하여 4차로 전환공정을 수행하여 17.41g의 순도 95% 이상의 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온 분말을 35%의 수율로 수득하였다. 4차 전환공정이 완료된 후, 회수된 수성층에 수성층 부피의 20%에 해당하는 양의 핵산으로 2회 추출한 후, 상기와 같은 공정을 반복해서 5차, 6차, 7차 및 8차 전환공정을 수행하여, 각각 18.0g, 17.6g, 17.7g 및 13.4g의 순도 96% 이상의 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온 분말을 수득하였으며, 이때의 수율은 각각 36.0%, 35.2%, 35.4% 및 26.8%였다.
실시예 9
1차 전환 공정 후, 수성층으로부터의 메틸화된 사이클로덱스트린의 회수
1차 전환공정이 끝난 후, 원심분리로 얻어진 수성층 2.6ℓ를 1.3ℓ의 클로로포름으로 추출하여 메틸화된 사이클로덱스트린을 68%의 수율로 회수하였다.
실시예 10
수차의 전환 공정 후, 수성층으로부터의 메틸화된 사이클로덱스트린의 회수
3차의 전환공정이 끝난 후, 원심분리로 얻어진 수성층 5.2ℓ를 2.6ℓ의 클로로포름으로 추출하여 메틸화된 사이클로덱스트린을 61%의 수율로 회수하였다.
실시예 11
순도가 낮은 스테롤 혼합물을 사용한 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온의 생산
시토스테롤 함량이 약 42%, 스티그마스테롤 함량이 약 27% 함유된 순도가 낮은 스테롤 혼합물에 스테롤 혼합물 부피의 30% 내지 100%에 해당하는 핵산으로 세척하여, 시토스테롤 52.5% 및 스티그마스테롤 37%로 순도를 높인 후, 이를 전환배지에 포함시키는 것을 제외하고는, 상기 실시예 3과 동일하게 수행하였다. 이렇게 하여, 9.8g의 순도 96% 이상의 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온 분말을 32.6%의 수율로 수득하였다.
실시예 12
순도가 낮은 스테롤 혼합물을 사용한 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온의 생산
시토스테롤 함량이 약 42%, 스티그마스테롤 함량이 약 27% 함유된 순도가 낮은 스테롤 혼합물을 2배 부피의 에틸아세테이트로 용해시킨 후, 재결정을 하여 시토스테롤 함량 48.3%, 스티그마스테롤 36%로 순도를 높인 후, 이를 전환배지에 포함시키는 것을 제외하고는 상기 실시예 3과 동일하게 수행하였다. 이렇게 하여, 9.7g의 순도 96% 이상의 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온 분말을 32.3%의 수율로 수득하였다.
실험예
메틸화된 사이클로덱스트린의 회수
50g/ℓ의 메틸화된 사이클로덱스트린 수용액 100㎖를 20 내지 200㎖의 클로로포름으로 3회 분할 추출하였다. 3번에 걸쳐 수득되는 클로로포름 층만을 상분리를 통해 분리한 후, 감압증류하고, 약 40℃에서 48시간 동안 건조시켜 메틸화된 사이클로덱스트린을 회수하고, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
메틸화된 사이클로덱스트린 수용액 부피(㎖) 클로로포름 부피(㎖)* 회수량(g) 회수율(%)
100 200(67*3) 4.14 84
100 125(42*3) 4.17 84
100 100(33*3) 3.94 79
100 50(17*3) 3.83 77
100 20(7*3) 3.62 73
* ; 사용량(분할사용량*분할사용횟수)
상기한 실시예들을 종합한 결과, 마이코박테리움 에스피는 높은 효율로 스테롤 또는 스테롤 혼합물을 코르티코스테로이드의 중요한 시작물질인 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온으로 전환시킬 수 있는 능력이 있음을 확인하고, 본 발명에 따라 상기 마이코박테리움 에스피를 사용하여 높은 효율로 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온을 생산할 수 있으며, 스테롤 또는 스테롤 혼합물을 고농도로 사용하여 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온의 생산시간을 크게 줄일 수 있어 높은 경제성으로 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온을 생산할 수 있음을 확인할 수 있었다.
따라서 본 발명에 의하면, 마이코박테리움 에스피를 이용한 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온의 제조방법을 제공하여, 우수한 생산성으로 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온을 생산할 수 있도록 하는 효과가 있다. 상기 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온은 코르티코스테로이드의 중요한 시작물질이다.
이상에서 본 발명은 기재된 구체예에 대해서만 상세히 설명되었지만 본 발명의 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속함은 당연한 것이다.

Claims (12)

  1. (1) 마이코박테리움 에스피(Mycobacteriumsp. ; 러시아 미생물협회 수탁번호 VKM Ac 1817D, 한국생명공학연구원 유전자은행 수탁번호 KCTC 10049BP)를 종배양배지에서 배양하는 종배양단계;
    (2) 배양된 상기 미생물을 전환시키고자 하는 시토스테롤, 캠패스테롤, 스티그마스테롤 또는 이들 중 2이상의 혼합물로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 스테롤 및 메틸화된 사이클로덱스트린을 포함하는 전환배지에 접종시키되, 상기 종배양배지의 5 내지 20배의 양의 전환배지에 접종시키고, 배양시키는 전환배양단계;
    (3) 상기 전환배양단계에서 전환이 종료된 배양액을 50 내지 80℃로 10 내지 60분 동안 가열하여 미생물을 사멸시키고, 11,200g에서 30분간 원심분리하여 고형의 세포덩어리를 제거하고, 상등액을 에틸아세테이트로 추출하는 생성물 회수단계; 및
    (4) 상기 생성물 회수단계에서 회수된 생성물을 결정화 및 재결정화시켜 정제하는 정제단계;
    들을 포함하여 이루어짐을 특징으로 하는 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온의 제조방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 전환배지 중의 스테롤의 함량이 높아질수록 메틸화된 사이클로덱스트린의 함량을 증가시키는 것을 특징으로 하는 상기 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온의 제조방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 스테롤 또는 스테롤 혼합물의 농도가 10 내지 50g/ℓ인 것을 특징으로 하는 상기 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온의 제조방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 스테롤 또는 스테롤 혼합물 중의 스테롤함량이 70 내지 90%인 것을 특징으로 하는 상기 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온의 제조방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 메틸화된 사이클로덱스트린의 농도가 50 내지 250g/ℓ의 범위로 사용되는 것을 특징으로 하는 상기 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온의 제조방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 (3)의 생성물 회수단계에서 상등액을 에틸아세테이트 혹은 클로로포름 등으로추출하고 난 후의 수성층을 1 내지 3회 반복하여 전환배지로 사용하는 것을 특징으로 하는 상기 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온의 제조방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 수성층을 반복하여 전환배지로 사용하는 경우, 글리세롤, 황산암모늄, 인산이칼륨, 스테롤 또는 스테롤 혼합물, 트윈 80들을 포함하여 이루어지는 추가배지를 더 가하여 사용하는 것을 특징으로 하는 상기 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온의 제조방법.
  8. 제 6 항에 있어서,
    상기 수성층을 적어도 3회 이상의 반복 사용후에 상기 수성층을 핵산으로 추출하고 난 후, 잔여의 수성층을 다시 사용하는 것을 특징으로 하는 상기 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온의 제조방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    핵산으로 추출하고 난 후의 잔여의 수성층을 다시 1 내지 3회 사용하는 것을 특징으로 하는 상기 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온의 제조방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 수성층에 대한 상기 핵산의 사용량이 수성층을 기준으로 20% 용적인 것을 특징으로 하는 상기 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온의 제조방법.
  11. 제 9 항 또는 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    핵산으로의 추출공정을 포함하여 적어도 7회 반복 사용된 상기 메틸화된 사이클로덱스트린을 포함하는 상기 수성층을 클로로포름으로 상기 메틸화된 사이클로덱스트린을 추출하여 회수하는 것을 특징으로 하는 상기 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온의 제조방법.
  12. 제 9 항에 있어서,
    상기 수성층에 대한 클로로포름의 사용량이 수성층을 기준으로 20 내지 200% 용적인 것을 특징으로 하는 상기 9-알파-하이드록시-안드로스트-4-엔-3,17-디온의 제조방법.
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