KR20030027028A - 개선된 살충성 박테리아, 및 그의 제조 및 이용 방법 - Google Patents

개선된 살충성 박테리아, 및 그의 제조 및 이용 방법 Download PDF

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KR20030027028A
KR20030027028A KR10-2003-7002212A KR20037002212A KR20030027028A KR 20030027028 A KR20030027028 A KR 20030027028A KR 20037002212 A KR20037002212 A KR 20037002212A KR 20030027028 A KR20030027028 A KR 20030027028A
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박현우
윌스마가렛씨
황성혜
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더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
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Abstract

본 발명은, BtI 또는 BtII 프로모터, 또는 BtI 및 BtII 프로모터의 조합, 박테리아 STAB-SD 서열의 6 개 이상의 인접하는 뉴클레오티드 및 바실러스 스패리쿠스 (B. sphaericus) ("Bs") 이원성 독소의 41.9 kD 단백질과 80% 이상의 서열 동일성을 가지며, 그의 독성이 서열 번호 9 의 41.9 kD 독소 단백질의 50% 이상인 제 1 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열을 제공한다. 임의로는, 상기 서열은 Bs 이원성 독소의 51.4 kD 단백질과 80% 이상의 서열 동일성을 가지며, Bs 41.9 kD 독소 단백질의 결합 도메인으로서 기능할 수 있는 제 2 폴리펩티드를 추가로 코딩한다. 핵산 서열이 바실러스 투린지엔시스 (B. thuringiensis) ("Bt") 또는 Bs 세포에서 발현되는 경우, 형질전환되지 않은 Bs 세포의 10 배 이상의 Bs 2 원 단백질을 생산한다. 본 발명은 핵산 서열, 발현 벡터, 숙주 세포, 및 본 발명의 핵산 서열로 박테리아를 형질전환시켜 살충성 박테리아의 독성을 증가시키는 방법을 제공한다. 더욱이, 본 발명은 Bt 아종 이스라엘렌시스 (israelensis) ("Bti") 의 Cyt1Aa1 단백질이 Bs 내성 모기의 유충에서 Bs 이원성 독소에 대한 내성을 역전시킨다는 발견에 관한 것이다. 본 발명은 Bti Cyt1Aa1 단백질을 발현하는 Bs 세포, 및 Cyt1Aa1 단백질 및 Bs 이원성 독소의 공동 투여로 Bs 이원성 독소에 대한 내성을 감소시키는 방법을 제공한다.

Description

개선된 살충성 박테리아, 및 그의 제조 및 이용 방법{IMPROVED INSECTICIDAL BACTERIA, AND METHODS FOR MAKING AND USING THEM}
관련된 출원에 관한 상호 참조
본 출원은 참고문헌으로 포함되는 U.S. 특허 출원 제 09/639,576 (2000 년 8 월 14 일 출원) 을 우선권으로 청구한다.
연방에서 지원한 연구 및 개발 하에 이룩된 발명의 권리에 대한 문서
의과학 및 신규 약물의 진보에도 불구하고, 말라리아, 사상충증, 뎅기 및 바이러스성 뇌염은, 이들이 풍토병인 지역에서 거주하는 인구가 2 백만명으로 추산되는, 인류의 주요 질병으로 남아있다 (The World Health Report - 1999, World Health Organization, 스위스, 제네바 (1999)). 상기 질병의 병원은 모기에 의해 전염되며, 따라서, 질병 방제 방법은 모기의 개체수를 감소시키기 위한 광범위한 화학물질 살충제에 주로 의존해 왔다. 그러나, 화학물질 살충제 사용은 다수의 나라에서 모기 개체군에서의 살충 내성 발생을 일으켰다. 더욱이, 다수의 정부는 환경, 특히 목적하지 않는 익충, 및 식품 및 물 공급지의 오염으로 인한 척추동물 상의 그들의 영향을 염려하여 상기 화학물질의 사용을 제한한다.
상기 문제들의 결과로서, 국제 보건 기구는 박테리아계 살충제에 대한 등록 및 사용에 대한 표준을 개발하여 화학물질을 박테리아계 살충제로 대체하는 것을촉구했다 (Guideline specifications for bacterial larvicides for public health use, WHO 문건 WHO/CDS/CPC/WHOPES/99.2, World Health Organization, 스위스, 제네바 (1999)). 박테리아 기재의 일부 제품이 모기 유충을 방제하도록 고안되었는데, 이들 중 가장 널리 사용되는 2 가지는 Vectobac및 Teknar로서, 이들 모두는 바실러스 투린지엔시스 (Bacillus thuringiensis) 아종 이스라엘렌시스 (israelensis) 기재이다. 또한, 바실러스 스패리쿠스 (B. sphaericus) 기재의 신규한 제품인 Vectolex는, 사상충증 및 바이러스성 질병의 모기 병원이동체 방제를 위해 시판되었다. 상기 제품들은 양호한 상업적 성공을 달성했으나, 고가 및 다수의 화학물질 살충제에 비해 낮은 약효는 다수의 개발도상국에서 더 집중적으로 사용되는 것을 제한한다. 또한, 인도, 브라질 및 프랑스에서 집모기 (Culex) 야생 개체군에서 바실러스 스패리쿠스에 대해 이미 보고된 내성 때문에 이들의 장기간 사용에 대한 우려가 일어났다 (Sinegre 등, First field occurrence ofCulexpipiens resistance toBacillus sphaericusin southern France, VII European Meeting, Society for Vector Ecology, 5-8 Sept. Barcelona, Spain (1994); Rao 등, J Am. Mosq. Control Assoc. 11:1-5 (1995); Silva-Filha 등, J. Econ. Entomot 88: 525-530 (1995)).
상기 박테리아의 살충 특성은 일차적으로 포자 형성 동안 생성되는 살충 단백질에 기인한다. 바실러스 투린지엔시스 (Bacillus thuringiensis) 아종 이스라엘렌시스 (israelensis) (Bti) 에서, 주요 단백질은 Cyt1A (27 kDa), Cry11A (72 kDa), Cry4A (128 kDa) 및 Cry4B (134 kDa) 인 한편, 여기서 바실러스 스패리쿠스(B. sphaericus) (Bs) 는 각각 독소 및 단일인 이원성 독소의 결합 도메인으로서 각각 제공되는 41- 및 52-kDa 단백질을 생산한다 (Federici 등, Bacterial Control of Mosquitoes and Blackflies, 편저: de Barjac & Sutherland, D.J, 11-44 (Rutgers University Press, New Brunswick, NJ) (1990); Baumann 등, Microbiot Rev. 55: 425-436 (1991)).
Bti 및 Bs 독소에서의 생화학적 및 독성학적 상이점은, 이들 독소를 단일 박테리아에 조합하여 개선된 박테리아를 구축할 수 있음을 제안했다. 상기 접근 방법을 사용하여 원하는 독성을 가진 재조합 박테리아를 고안하기 위한 다수의 시도가 지난 십여년 간 계속되었다. 다수의 군에서는, 예를 들어 Bti 독소 유전자를 Bs 에 도입한다. 예를 들어, 문헌 [Bar 등, J. Invertebrate Pathol. 57:149-1 58 (1991)] 에서는 Bti 내독소 유전자를 Bs 2362 에 클로닝했으나, 재조합 유기체의 생물학적 활성이 문헌 [Bti. Poncet 등, FEMS Microbiol Lett. 117:91-96 (1994), Bti 의 cry4B 및 cry11A 유전자를 Bs 2297 에 클로닝함] 및 [Poncet 등, Appl Environ. Microbiol. 63:4413-4420 (1997), cry11A 유전자를 동일한 균주에 동종 재조합으로 도입함] 의 것보다 낮았다. 문헌 [Thiery 등, Appl. Environ. Microbiol. 64: 3910-3916 (1998)] 에서는 Bt cyt1Ab1 유전자를 Bs 에 도입했으나, cytAb1 유전자의 발현 정도는 독성 상에서 임의의 특별한 효과를 갖지 않을 정도로 매우 낮았다. 문헌 [Servant 등, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3021-3026 (1999)] 에서는 Cry11A 및 Cry11 Ba Bt 독소를 Bs 2297 에 생체 내 재조합으로 도입함으로써, 숙주 범위가 확대될 수 있음을 보였다. 문헌 [Borgouin 등, Appl.Environ Microbiol. 56: 340-344 (1990] 에서는 Bs 독소를 Bti 에 도입했으나, 모기 유충에 대한 독소들 사이의 상승적 또는 부가적 효과가 발견되지 않았다. 다른 방법으로 Bs 및 Bt 의 장점을 조합하려는 시도도 상업적으로 유용한 것으로 명확히 판명된 것은 아니다. 예를 들어, Bs 및 Bt 의 조직을 단순히 배양한 후, 두 유기체를 조합하는 것은, 두 유기체의 포자가 적합한 독성을 제공할 독소의 중량에 비해 생성된 혼합물의 비율이 너무 크므로 효과적이지 않다.
신규한 바이오살충제의 상업적인 개발은, 부분적으로는 집중적인 시험을 필요로 하는 EPA 규칙 때문에 비용이 많이 들고, 이익은, 예를 들어 약제학적 제제에 비해 낮다. 지난 십여년 동안 보고된 임의의 재조합 유기체도 모기 방제에 상업적으로 사용하기 위한 개발을 보증할, 현재 시판되는 Bti 또는 Bs 균주보다도 충분한 개선을 나타내는 것이 나타나지 않았다.
발명의 요약
본 발명은 Bs 이원성 독소의, 특히 바실러스 (Bacillus) 종 세포에서, 특히 Bs 및 Bt 세포에서의 높은 발현 수준을 달성하기 위한 뉴클레오티드 서열, 발현 벡터, 숙주 세포 및 방법을 제공한다.
특히, 본 발명은 하기를 순서대로 함유하는 핵산을 하기 순서대로 함유하는 핵산 서열을 제공한다: BtI 프로모터, BtII 프로모터, 및 BtI 및 BtII 프로모터의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 바실러스 투린지엔시스 (B. thuringiensis) 프로모터, 박테리아 STAB-SD 서열의 6 개 이상의 인접하는 뉴클레오티드, 리보좀 결합 부분, 및 바실러스 스패리쿠스 이원성 독소의 41.9 kD 독소단백질 (서열 번호 9) 에 대해 80% 이상의 서열 동일성을 가지며, 그의 독성이 서열 번호 9 의 41.9 kD 독소 단백질의 50% 이상인 제 1 폴리펩티드를 코딩하는 서열. 더욱 바람직한 구현예에서, 제 1 폴리펩티드는 서열 번호 9 와 90% 이상의 서열 동일성을 가지며, 가장 바람직한 구현예에서는, 제 1 폴리펩티드는 서열 번호 9 의 서열을 갖는다. 제 1 폴리펩티드를 코딩하는 서열은, 바실러스 스패리쿠스 이원성 독소의 51.4 kD 단백질 (서열 번호 8) 과 80% 이상의 서열 동일성을 가지며, 서열 번호 9 의 41.9 kD 독소 단백질의 결합 도메인으로서 기능하는 제 2 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 제 2 폴리펩티드는, 서열 번호 8 과 90% 이상의 서열 동일성을 가지며, 가장 바람직한 구현예에서는 서열 번호 8 의 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 핵산은 박테리아 STAB-SD 서열의 6 개 이상의 인접하는 뉴클레오티드인 제 2 서열을 추가로 포함한다. 특히 바람직한 구현예에서는, 2 개의 서열은 모두 9-머 박테리아 STAB-SD 서열이며, 특히더 바람직한 구현예에서는, STAB-SD 서열들은 30-40 뉴클레오티드 떨어져 있다.
박테리아 STAB-SD 서열의 6 개 이상의 인접하는 뉴클레오티드는 9 개의 뉴클레오티드인 박테리아 STAB-SD 서열의 6, 7, 또는 8 개의 인접하는 뉴클레오티드일 수 있다. 바람직한 구현예에서, STAB-SD 서열에서의 6 개 이상의 인접하는 뉴클레오티드는 9 개의 뉴클레오티드인 박테리아 STAB-SD 서열이다. 일부의 바람직한 구현예에서, 박테리아 STAB-SD 서열은 GAAAGGAGG (서열 번호 1), GAAGGGGGG (서열 번호 2), GAGGGGGGG (서열 번호 3), GAAAGGGGG (서열 번호 4), GAAAGGAGG (서열 번호 5), 및 GAAAGGGGT (서열 번호 6) 로 구성되는 군으로부터 선택된다. 바실러스 투린지엔시스 프로모터는cry프로모터이며, 구체적으로는cry1프로모터 일 수 있다. 더욱이, 바실러스 투린지엔시스 프로모터는cry1Aa1, cry1Aa2, cry1Aa3, cry1Aa4, cry1Aa5, cry1Aa6, cry1Ba1, cry1Ba2, cry1Ca1, cry1Ca2, cry1Ca3, cry1Ca4, cry1Ca5, cry1 Ca6, cry1Ca7, cry1Fa1, cry1Fa2, cyt1Aa1, cyt1Aa2, cyt1Aa3또는cyt1Aa4일 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 바실러스 투린지엔시스 프로모터는cyt1Aa1프로모터이다. 핵산은 BtI 프로모터 및 BtII 프로모터를 모두 가질 수 있으며, 2 개의 프로모터는 겹쳐질 수 있다.
본 발명은 또한 상기 기재된 핵산을 함유하는 발현 벡터, 및 상기 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포는 또한 Bticry11A오페론에 의해 코딩되는 20 kD 단백질을 함유할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 숙주 세포는 바실러스 투린지엔시스 세포 또는 바실러스 스패리쿠스 세포이다.
본 발명은 또한 하기 순서대로, 시그마 인자 A 단백질에 결합하는 바실러스 투린지엔시스 프로모터, 박테리아 STAB-SD 서열의 6 개 이상의 인접하는 뉴클레오티드, 리보좀 결합 부분, 및 바실러스 스패리쿠스 이원성 독소의 41.9 kD 독소 단백질 (서열 번호 9) 과 80% 이상의 서열 동일성을 가지며, 독성이 서열 번호 9 의 41.9 kD 독소 단백질의 50% 이상인 제 1 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열을 제공한다. 더욱 바람직한 구현예에서, 제 1 폴리펩티드는 서열 번호 9 와 90% 이상의 서열 동일성을 가지며, 가장 바람직한 구현예에서, 제 1 폴리펩티드는 서열 번호 9 의 서열을 갖는다. 제 1 폴리펩티드를 코딩하는 서열은,추가로 바실러스 스패리쿠스 이원성 독소 51.4 kD 단백질 (서열 번호 8) 과 80% 이상의 서열 동일성을 가지며, 서열 번호 9 의 41.9 kD 독소 단백질에 대한 결합 도메인으로서 기능하는 제 2 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 제 2 폴리펩티드는, 서열 번호 8 과 90% 이상의 서열 동일성을 가지며, 가장 바람직한 구현예에서는 서열 번호 8 의 서열을 갖는다. 박테리아 STAB-SD 서열의 6 개 이상의 인접하는 뉴클레오티드는 9 개의 뉴클레오티드인 박테리아 STAB-SD 서열의 6, 7 또는 8 개의 인접하는 뉴클레오티드일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 박테리아 STAB-SD 서열의 6 개 이상의 인접하는 뉴클레오티드는 9 개의 뉴클레오티드인 박테리아 STAB-SD 서열이다. 일부 바람직한 구현예에서, 박테리아 STAB-SD 서열은 GAAAGGAGG (서열 번호 1), GAAGGGGGG (서열 번호 2), GAGGGGGGG (서열 번호 3), GAAAGGGGG (서열 번호 4), GAAAGGAGG (서열 번호 5) 및 GAAAGGGGT (서열 번호 6) 로 구성되는 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 핵산은 박테리아 STAB-SD 서열의 6 개 이상의 인접하는 뉴클레오티드인 제 2 서열을 추가로 함유한다. 특히 바람직한 구현예에서, 2 개의 서열은 모두 9-머 (mer) 박테리아 STAB-SD 서열이며, 특별히 더 바람직한 구현예에서, STAB-SD 서열은 30-40 뉴클레오티드 떨어져 있다.
본 발명은 하기 단계를 포함하는, 숙주 세포에서의 바실러스 스패리쿠스 이원성 독소의 생산 증진 방법을 제공한다: (a) 하기 순서대로, BtI 프로모터, BtII 프로모터, 및 BtI 및 BtII 프로모터의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 바실러스 투린지엔시스 프로모터, 박테리아 STAB-SD 서열의 6 개 이상의 인접하는 뉴클레오티드, 리보좀 결합 부위, 및 바실러스 스패리쿠스 이원성 독소의 41.9 kD 단백질 (서열 번호 9) 과 80% 이상의 서열 동일성을 가지며, 독성이 서열 번호 9 의 41.9 kD 독소 단백질의 50% 이상인 제 1 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열로 숙주 세포를 형질전환하는 단계; 및 (b) 상기 핵산 서열을 숙주 세포에서 발현시킴으로써; 상기 핵산 서열의 발현이 상기 핵산 서열로 형질전환되지 않은 야생형 바실러스 스패리쿠스의 이원성 독소 생산에 비해 바실러스 스패리쿠스 이원성 독소의 생성을 증진시키는 단계. 바람직한 구현예에서, 제 1 폴리펩티드는 서열 번호 9와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는다. 특히 바람직한 구현예에서, 제 1 폴리펩티드는 서열 번호 9 의 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 제 1 폴리펩티드를 코딩하는 서열은, 추가로 바실러스 스패리쿠스 이원성 독소의 51.4 kD 단백질 (서열 번호 8) 과 80% 이상의 서열 동일성을 가지며, 서열 번호 9 의 41.9 kD 독소 단백질에 대한 결합 도메인으로서 기능하는 제 2 폴리펩티드를 코딩한다. 더욱 바람직한 구현예에서, 제 2 폴리펩티드는 서열 번호 8 과 90% 이상의 서열 동일성을 가지며, 특히 바람직한 구현예에서 제 2 폴리펩티드는 서열 번호 8 의 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 핵산은 박테리아 STAB-SD 서열의 6 개 이상의 인접하는 뉴클레오티드인 제 2 서열을 포함한다. 특히 바람직한 구현예에서, 2 개의 서열은 모두 9-머 박테리아 STAB-SD 서열이며, 특히 바람직한 구현예에서, STAB-SD 서열은 30-40 뉴클레오티드 떨어져 있다.
바람직한 구현예에서, 박테리아 STAB-SD 서열의 6 개 이상의 인접하는 뉴클레오티드는 9 개의 뉴클레오티드인 박테리아 STAB-SD 서열이며, 특히 바람직한 구현예에서, 박테리아 STAB-SD 서열은 GAAAGGAGG (서열 번호 1), GAAGGGGGG (서열 번호 2), GAGGGGGGG (서열 번호 3), GAAAGGGGG (서열 번호 4), GAAAGGAGG (서열 번호 5) 및 GAAAGGGGT (서열 번호 6) 로 구성되는 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 숙주 세포는 바실러스 투린지엔시스 세포 또는 바실러스 스패리쿠스 세포이다. 바람직한 구현예에서, 박테리아 숙주 세포는 추가로cry11A유전자의 20 kD 생성물을 발현한다.
구현예의 또다른 군에서는, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 재조합 박테리아 제조 방법을 제공한다: (a) 하기를 순서대로 포함하는 핵산 서열로 재조합 박테리아를 형질전환하는 단계: BtI 프로모터, BtII 프로모터, 및 BtI 및 BtII 프로모터의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 바실러스 투린지엔시스 프로모터, 박테리아 STAB-SD 서열의 6 개 이상의 인접하는 뉴클레오티드, 리보좀 결합 부위, 및 바실러스 스패리쿠스 이원성 독소의 41.9 kD 단백질 (서열 번호 9) 과 80% 이상의 서열 동일성을 가지며, 그의 독성이 서열 번호 9 의 41.9 kD 독소 단백질의 50% 이상인 제 1 폴리펩티드를 코딩하는 서열: 및 (b) 숙주 세포에서 핵산 서열을 발현시키는 단계. 바람직한 구현예에서, 제 1 폴리펩티드가 서열 번호 9 와 90% 이상의 서열 동일성을 가지며, 특히 바람직한 구현예에서는 서열 번호 9 의 서열을 갖는다. 제 1 폴리펩티드를 코딩하는 서열은, 바실러스 스패리쿠스 이원성 독소의 51.4 kD 단백질 (서열 번호 8) 과 80% 이상의 서열 동일성을 가지며, 서열 번호 9 의 41.9 kD 독소 단백질에 대한 결합 도메인으로서 기능할 수 있는 제 2 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 제 2 폴리펩티드는 서열 번호 8 과 90% 이상의 서열 동일성을 가지며, 특히 바람직한 구현예에서는 서열 번호 8 의 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 박테리아 STAB-SD 서열의 인접하는 6 개 이상의 뉴클레오티드는 9 개의 뉴클레오티드인 박테리아 STAB-SD 서열을 갖는다. 더욱 바람직한 구현예에서, 박테리아 STAB-SD 서열은 GAAAGGAGG (서열 번호 1), GAAGGGGGG (서열 번호 2), GAGGGGGGG (서열 번호 3), GAAAGGGGG (서열 번호 4), GAAAGGAGG (서열 번호 5) 및 GAAAGGGGT (서열 번호 6) 로 구성되는 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 핵산은 박테리아 STAB-SD 서열의 6 개 이상의 인접하는 뉴클레오티드인 제 2 서열을 추가로 포함한다. 특히 바람직한 구현예에서, 상기 두 서열은 모두 9-머 박테리아 STAB-SD 서열이며, 특별히 더 바람직한 구현예에서, STAB-SD 서열들은 30-40 뉴클레오티드 떨어져 있다. 바람직한 구현예에서, 재조합 박테리아는 바실러스 투린지엔시스 또는 바실러스 스패리쿠스 및 Bti 또는 Bs 이외의 바실러스 (Bacillus) 종의 원으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 모기 유충에 대한 바실러스 투린지엔시스 박테리아의 독성을 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기 단계들을 포함한다: (a) 하기 순서대로, BtI 프로모터, BtII 프로모터, 및 BtI 및 BtII 프로모터의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 바실러스 투린지엔시스 프로모터, 박테리아 STAB-SD 서열의 인접하는 6 개 이상의 뉴클레오티드, 리보좀 결합 부위, 및 바실러스 스패리쿠스 이원성 독소의 41.9 kD 단백질 (서열 번호 9) 과 80% 이상의 서열 동일성을 가지며, 그의 독성이 41.9 kD 인 서열 번호 9 의 독소 단백질의 50%이상인 제 1 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열로 상기 박테리아를 형질전환하는 단계; 및 (b) 상기 핵산 서열을 박테리아에서 발현시킴으로써; 상기 핵산 서열의 발현이 상기 핵산 서열로 형질전환되지 않은 야생형 바실러스 스패리쿠스 세포보다 상기 박테리아가 상기 유충에 대해 더욱 독성이 되도록 하는 단계. 바람직한 구현예에서, 상기 제 1 폴리펩티드는 서열 번호 9 와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는다. 특히 바람직한 구현예에서, 제 1 폴리펩티드는 서열 번호 9 의 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 박테리아 STAB-SD 서열의 인접하는 6 개 이상의 뉴클레오티드인 제 2 서열을 추가로 포함한다. 특히 바람직한 구현예에서, 6 개 이상의 뉴클레오티드인 2 개의 서열은 모두 9-머 박테리아 STAB-SD 서열이며, 특히 바람직한 구현예에서, STAB-SD 서열들은 30-40 뉴클레오티드 떨어져 있다.
바람직한 구현예에서, 제 1 폴리펩티드를 코딩하는 서열은, 바실러스 스패리쿠스 이원성 독소의 51.4 kD 단백질 (서열 번호 8) 과 80% 이상의 서열 동일성을 가지며, 서열 번호 9 의 41.9 kD 독소 단백질에 대한 결합 도메인으로서 기능할 수 있는 제 2 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함한다. 더욱 바람직한 구현예에서, 제 2 폴리펩티드는 서열 번호 8 과 90% 이상의 서열 동일성을 가지며; 특히 바람직한 구현예에서 제 2 폴리펩티드는 서열 번호 8 의 서열을 갖는다. 추가적으로, 바람직한 구현예에서, 상기 박테리아 STAB-SD 서열의 6 개 이상의 인접하는 뉴클레오티드는 9 개의 뉴클레오티드인 박테리아 STAB-SD 서열이며, 특히 바람직한 구현예에서, 9 개의 뉴클레오티드인 박테리아 STAB-SD 서열은 GAAAGGAGG (서열 번호1), GAAGGGGGG (서열 번호 2), GAGGGGGGG (서열 번호 3), GAAAGGGGG (서열 번호 4), GAAAGGAGG (서열 번호 5), 및 GAAAGGGGT (서열 번호 6) 로 구성되는 군으로부터 선택된다. 특히 바람직한 구현예에서 박테리아는cry11A유전자의 20 kD 생성물을 추가로 함유한다.
구현예의 또다른 군에서는, 본 발명은 바실러스 스패리쿠스의 재조합 세포를 제공하며, 상기 세포는, 하기 순서대로 BtI 프로모터, BtII 프로모터, 및 BtI 및 BtII 프로모터로 구성되는 군으로부터 선택되는 바실러스 투린지엔시스 프로모터, 박테리아 STAB-SD 서열의 인접하는 6 개 이상의 뉴클레오티드, 리보좀 결합 부위, 및 바실러스 스패리쿠스 이원성 독소의 41.9 kD 단백질 (서열 번호 9) 과 80% 이상의 서열 동일성을 가지며, 그의 독성이 41.9 kD 인 서열 번호 9 의 독소 단백질의 50% 이상인 제 1 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 제 1 폴리펩티드는 서열 번호 9 와 90% 이상의 서열 동일성을 가지며, 더욱 바람직한 구현예에서 서열 번호 9 의 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 핵산은 박테리아 STAB-SD 서열의 인접하는 6 개 이상의 뉴클레오티드인 제 2 서열을 포함한다. 특히 바람직한 구현예에서, 2 개의 6 개 이상인 뉴클레오티드 서열은 모두 9-머 박테리아 STAB-SD 서열이며, 특히 바람직한 구현예에서, STAB-SD 서열들은 30-40 뉴클레오티드 떨어져 있다.
바람직한 구현예에서, 제 1 폴리펩티드를 코딩하는 서열은, 바실러스 스패리쿠스 이원성 독소의 51.4 kD 단백질 (서열 번호 8) 과 80% 이상의 서열 동일성을 가지며, 서열 번호 9 의 41.9kD 독소 단백질에 대한 결합 도메인으로서 기능할 수있는 제 2 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 더욱 바람직한 구현예에서, 제 2 폴리펩티드는 서열 번호 8 의 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 가지며, 특히 바람직한 구현예에서는 서열 번호 8 의 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 박테리아 STAB-SD 서열의 인접하는 6 개 이상의 뉴클레오티드는 9 개의 뉴클레오티드인 박테리아 STAB-SD 서열이며, 바람직한 구현예에서, 9 개의 뉴클레오티드인 박테리아 STAB-SD 서열은 GAAAGGAGG (서열 번호 1), GAAGGGGGG (서열 번호 2), GAGGGGGGG (서열 번호 3), GAAAGGGGG (서열 번호 4), GAAAGGAGG (서열 번호 5) 및 GAAAGGGGT (서열 번호 6) 로 구성되는 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서는, 바실러스 투린지엔시스 프로모터는cry프로모터이다. 더욱 바람직한 구현예에서, 바실러스 투린지엔시스 프로모터는cry1Aa1, cry1Aa2, cry1Aa3, cry1Aa4, cry1Aa5, cry1Aa6, cry1Ba1, cry1Ba2, cry1Ca1, cry1Ca2, cry1Ca3, cry1Ca4, cry1Ca5, cry1Ca6, cry1Ca7, cry1Fa1, cry1Fa2, cyt1Aa1, cyt1Aa2, cyt1Aa3및 cyt1Aa4로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있으며, 특히 바람직한 구현예에서,cyt1Aa1프로모터이다. 특히 더욱 바람직한 구현예에서 세포는cry11A오페론의 20kD 생성물을 추가로 발현한다.
더욱이, 본 발명은 바실러스 스패리쿠스 세포의 독성을 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기 단계들을 포함한다: a) 하기 순서대로, BtI 프로모터, BtII 프로모터, 및 BtI 및 BtII 프로모터의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 바실러스 투린지엔시스 프로모터, 박테리아 STAB-SD 서열의 6 개 이상의 인접하는 뉴클레오티드, 리보좀 결합 부분, 및 바실러스 스패리쿠스 이원성 독소의 41.9kD 단백질 (서열 번호 9) 과 80% 이상의 서열 동일성을 가지며, 그의 독성이 서열 번호 9 의 41.9 kD 독소 단백질의 50% 이상인 제 1 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열로 세포를 형질전환하는 단계; 및 (b) 상기 핵산 서열을 숙주 세포에서 발현시킴으로써; 상기 핵산 서열의 발현이, 상기 핵산 서열로 형질전환되지 않은 야생형 바실러스 스패리쿠스 세포에 비해 상기 세포의 독성을 증가시키는 단계. 바람직한 구현예에서, 제 1 폴리펩티드는, 서열 번호 8 과 90% 이상의 서열 동일성을 가지며, 더욱 바람직한 구현예에서 서열 번호 9 의 서열을 갖는다. 바람직한 구현예에서, 상기 제 1 폴리펩티드를 코딩하는 서열은, 바실러스 스패리쿠스 이원성 독소의 51.4 kD 단백질 (서열 번호 8) 과 80% 이상의 서열 동일성을 가지며, 서열 번호 9 의 41.9 kD 독소 단백질에 대한 결합 도메인으로서 기능할 수 있는 제 2 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 더욱 바람직한 구현예에서, 제 2 폴리펩티드는 서열 번호 8 과 90% 이상의 서열 동일성을 가지며, 더욱 바람직한 구현예에서 서열 번호 8 의 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 박테리아 STAB-SD 서열의 인접하는 6 개 이상의 뉴클레오티드인 제 2 서열을 추가로 포함한다. 특히 바람직한 구현예에서, 2 개의 6 개 이상인 뉴클레오티드 서열은 모두 9-머 박테리아 STAB-SD 서열이며, 특히 바람직한 구현예에서, STAB-SD 서열들은 30-40 뉴클레오티드 떨어져 있다.
바람직한 구현예에서, 박테리아 STAB-SD 서열의 6 개 이상의 인접하는 뉴클레오티드는 9 개의 뉴클레오티드인 박테리아 STAB-SD 서열이며, 특히 바람직한 구현예에서, 9 개의 뉴클레오티드인 박테리아 STAB-SD 서열은 GAAAGGAGG (서열 번호1), GAAGGGGGG (서열 번호 2), GAGGGGGGG (서열 번호 3), GAAAGGGGG (서열 번호 4), GAAAGGAGG (서열 번호 5) 및 GAAAGGGGT (서열 번호 6) 로 구성되는 군으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, 바실러스 투린지엔시스 프로모터는cry프로모터이다. 더욱 바람직한 방법에서 바실러스 투린지엔시스 프로모터는cry1Aa1, cry1Aa2, cry1Aa3, cry1Aa4, cry1Aa5, cry1Aa6, cry1Ba1, cry1Ba2, cry1Ca1, cry1Ca2, cry1Ca3, cry1Ca4, cry1Ca5, cry1Ca6, cry1Ca7, cry1Fa1, cry1Fa2, cyt1Aa1, cyt1Aa2, cyt1Aa3, 및 cyt1Aa4로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있으며, 특히 바람직한 구현예에서, 바실러스 투린지엔시스 프로모터는cyt1Aa1프로모터이다.
또다른 구현예의 군에서, 본 발명은 바실러스 스패리쿠스 이원성 독소에 대한 내성을 감소시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 바실러스 투린지엔시스 아종 이스라엘렌시스 ("Bti") Cyt1Aa1 단백질을 상기 이원성 독소을 발현하는 바실러스 스패리쿠스 세포에서 발현시키는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 바실러스 스패리쿠스 이원성 독소에 대한 내성을 감소시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 Bti Cyt1Aa1 단백질을 상기 이원성 독소을 발현하는 바실러스 투린지엔시스 세포에서 발현시키는 단계를 포함하며, 바실러스 스패리쿠스 이원성 독소에 대한 내성을 감소시키는 위해서는, 상기 방법은 상기 이원성 독소와 함께 Bti Cyt1Aa1 단백질을 투여하는 단계를 포함한다. Bti Cyt1Aa1 단백질은 용해 및 동결건조된 Bti 세포의 분말일 수 있으며; 정제된 단백질일 수 있다. Cyt1Aa1 단백질 대(:) Bs 의 비를 약 1:2 내지 약 1:50 에서 선택하여 Bti Cyt1Aa1단백질을 투여할 수 있다. 바람직하게는, Cyt1Aa1 단백질 대(:) Bs 비를 약 1:10 이 되도록 하여 Bti Cyt1Aa1 단백질을 투여된다.
[도면에 대한 간단한 설명]
도 1 은 Bs 이원성 독소을 플라스미드에 클로닝할 때 사용된 단편의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 7) 및 코딩되는 아미노산 서열을 나타낸다. "Sigma E" 및 "Sigma K" 는 각각 시그마 인자 E 및 K 에 대한 결합 부분을 나타낸다. 뉴클레오티드 537 내지 660 사이의 밑줄친 서열은, 밑줄 부분의 대문자 및 어깨의 "STAB-SD" 로 나타낸 서열 모두 STAB-SD 서열의 도입을 위해, PCR 로 서열에 클로닝한 부분을 나타낸다. Bs 이원성 독소의 51.4 kD 단백질 (서열 번호 8) 및 41.9 kD 단백질 (서열 번호 9) 의 개시 및 정지 코돈은 아미노산 서열에서 표시했다. "RBS" 로 표시된, 뉴클레오티드 725 내지 730, 및 2245 내지 2250 은 리보좀 결합 부분을 나타낸다.
1. 서론
본 발명은 재조합 박테리아 세포 내에서 바실러스 스패리쿠스 ("Bs")의 이원성 독소를 고수준으로 합성하기 위한, 핵산 서열, 벡터, 숙주 세포, 및 방법을 제공한다. Bs 독소는 매우 강력하지만, 야생형 Bs 세포에 의해서는 낮은 수준으로 생산된다. 이는, 오직 단일 독소인 것과 결부되어 (예를 들어, 독소들의 복합물을 생산하는 Bt 와 대조적임), 독소에 내성인 곤충이 급속히 발생하도록 한다. 세포 당 생산되는 독소의 양이 증가하면, 제조된 바이오살충제 제형물의 살생력이증가하고, 바이오살충제를 섭취한 유충이 생존할 가능성이 감소된다. 또한, 세포 당 독소의 양이 증가하면, 박테리아 독소 제형물 제조 공정의 효율이 크게 증가되고, 곤충 방제를 달성하기 위해 적용되어야 하는 박테리아 제품의 양이 감소된다. 따라서, 본 발명은 제조 및 사용 비용을 현저하게 감소시켜, 효과적일 수 있지만 환경에 더 많은 손상을 입히는 화학물질 살충제에 비해 바이오살충제가 더욱 경쟁적이도록 한다.
본 발명의 핵산은 STAB-SB 핵산 서열을 Bt 유전자로부터의 강한 프로모터와 리보좀 결합 부위 사이에 삽입시키고, 이러한 구축물을 Bs 독소의 결합 단백질 또는 독소 단백질 또는 상기 두가지 모두를 코딩하는 핵산 서열과 조합시킴으로써 제조되는 이종성 서열이다. 바람직한 구현예에서, 두 단백질이 모두 존재한다. 놀랍게도, 강한 Bt 프로모터를 STAB-SD 핵산 서열과 커플링시킴으로써, 변형되지 않은 (야생형) 바실러스 스패리쿠스의 표준 균주에 의해 생산된 단백질 양보다 적어도 10 배, 일반적으로 15 내지 20 배로, Bs 독소의 생산이 극적으로 증가한다. 이어서 Bs 이원성 독소의 존재로 재조합 세포의 독성은 놀랍게 증가한다. 예를 들어, 집모기 (Culex) 속 모기의 유충에 대한 재조합 세포의 독성이 재조합되지 않은 세포에 비해 10배 이상 증가된다.
임의로, 재조합 세포는cry11A오페론의 20 kD 샤페론형 산물을 추가로 함유한다. 놀랍게도, 이러한 단백질의 존재는 상기 기술된 핵산 서열로부터의 Bs 단백질의 합성을 추가적으로 50 % 내지 100 % 증가시키고, 따라서 Bs 독소의 생산을 Bs의 표준 균주로부터 생산된 것보다 약 20 내지 30 배 증가시킨다.
신규 살충제에 대한 법적 승인을 수득하는 비용 등으로 인해, 투자 확보를 위한 관심 대상인 유기체에 대해 약 5 배 이상 박테리아 세포의 독성을 증가시키는 것이 일반적으로 바람직하다. Bs 및 바실러스 투린지엔시스 ("Bt")에서 Bs 독소를 생산하기 위한 10년 이상 동안의 다른 이들의 노력의 결과로 독소 생산량이 2, 3 또는 4 배 증가하였지만, 상업적인 생산 또는 야외에의 사용에 흥미롭기에는 별로 많지 않다. 따라서, Bs 독소가 Bs의 표준 균주에서 생산되는 것보다 적어도 10 배, 더욱 일반적으로 15 배, 더 높게는 20 배, 25 배 또는 심지어 30 배의 양으로 Bs 독소가 생산되도록 하는 본 발명의 능력은 당업계에서 상당하고 놀라운 발전이다. 동시에 놀랍게도, 인간 질환의 상당한 병원 이동체인 집모기속 모기에 대한 시험에서, 본 발명의 핵산으로 형질전환된 Bt 세포의 독성은, 다른 속의 모기에 대한 세포의 독성을 감소시키지 않으면서, 적어도 10 배 개선되었다.
Bt와 같은 바이오살충제는 생물반응기에서 상업적으로 생산된다. Bt 또는 Bs와 같은 박테리아 세포의 독성을 증가시키는 본 발명에 의해 제공되는 능력은 배양 배지의 유닛 당 생산되는 독소의 양이 증가하여, 적절하게는 더 적은 양이 배양되도록 하고, 배양 배지에 사용되는 원료가 감소된다는 것을 의미한다. 따라서, 본 발명은 바이오살충제의 제조 비용을 감소시키고, 이는 바이오살충제를 화학적 살충제 대신 사용하기에 비용적으로 효율적인 상황을 확장시킨다. 더욱이, 본 발명은 일반적으로 비독성인 박테리아 종, 특히 일반적으로는 곤충의 유충에 비독성인 바실러스 종에 Bs 독소를 기재로 하는 독성을 부여하는 능력을 또한 제공한다. 이러한 다른 박테리아 종의 속성, 예컨대 특정 환경에서의 지속성은 지금까지 바이오살충제로 사용되었던 Bt 및 Bs 의 것과 다를 것이므로, 본 발명은 현재 이용가능한 것 보다 상이한 범위의 속성을 갖는 바이오살충제를 또한 제공한다. 따라서 본 발명은 해충을 제거하기 위해 노력하는 공중보건 공무원 및 농업 과학자에게 선택의 범위를 확장시킨다.
고수준의 Bs 독소를 생산하는 능력은 Bt 아종, 예컨대 모기 및 흑파리 유충과 같은 쌍시류 해충의 방제에 유용한 아종 이스라엘렌시스 (israelensis) (Bt의 이러한 균주는 이하 "Bti"로 명명함), 예를 들어, 옥수수밤나방 (Heliothis zia), 양배추자나방 (Trichoplusia ni) 및 배추밤나방 (Spodoptera frugiperda)이 포함되는 모충 해충의 방제에 현재 유용한 아종 쿠르스타키 (kurstaki), 및 예를 들어, 콜로라도감자잎벌레 (Leptinotarsa decemlineata) 및 목화잎벌레 (Chrysomela scripta) 와 같은 딱정벌레목에 대해 활성인 아종 모리소니 (morrisoni), 뿐만 아니라 아종 테네브리오니스 (tenebrionis), 및 아종 아이자와이 (aizawai) 의 독성을 증가시키는데 특히 유용하다.
게다가, 본 발명은 바이오살충제의 숙주 범위가 확장되도록 한다 (즉, 바이오살충제가 독성인 유기체를 확장시킨다). Bs 독소는 집모기 (Culex) 및 얼룩날개모기 (Anopheles) 종의 유충에 대해 주로 독성인 반면, Bti는 집모기 및 숲모기 (Aedes) 종에 더욱 활성이다. 따라서, Bti 세포 내에서의 고수준의 Bs 독소의 발현은 집모기에 대한 독성을 증가시킬 뿐만 아니라, 또한 세포가 얼룩날개모기 종에 대해 더욱 유용한 제제이도록 한다. 얼룩날개모기 종은 말라리아의 주요 병원 이동체이므로, 이러한 증가된 숙주 범위는 단독으로 본 발명을 공중 보건 아스날(arsenal)에 주요하게 추가되도록 한다.
추가적으로 본 발명은 Bti 의 Cyt1Aa1 ("Cyt1A" 로도 공지됨) 단백질이 Bs 독소에 대해 매우 내성인 모기에 대해 Bs 의 독성을 복원시킬 수 있다는 발견에 관한 것이다. 이전에 다른 군들은 Bs 에 대한 내성의 메카니즘이 곤충 중장 내 수용체로의 결합의 손실임을 나타냈다. 이론에 구애받지 않고, Cyt1Aa1 이 Bs 독소가 중장 미세융모막 내로 삽입되도록 하여 독성을 복원시키는 것으로 나타났다.
바실러스 스패리쿠스 2362 에 대해 적어도 30,000 배 내성인 쿨렉스 퀸퀘파스시아투스 (Culex quinquefasciatus) 개체군을 사용한 연구에서, 바실러스 스패리쿠스와 Bti Cyt1Aa1을 조합시킨 바이오살충제 제형물 내에서 사용된 균주는 내성을 완전히 억제시켰다. 이전에, 내성의 일부 억제는 바실러스 투린지엔시스 아종 메델린 ("Btm")으로부터의 상이한 Cyt 단백질인 Cyt1Ab 를 사용해 나타났다 [Thiery 등, Appl. Environ. Microbiol. 64: 3910-3916 (1998)]. 그러나, 놀랍게도, Bti Cyt1A 에 의한 내성 억제는 Btm Cyt1Ab 로 달성된 것보다 수배 더 높다. 또한, Bs 2362 는 시판되어 사용되는 균주이고, 이에 대해 표적 모기 개체군에서 이미 상당한 내성이 발생했으므로, 이러한 균주에 대한 내성을 억제시키는 것이 특히 중요하다. 따라서, Bti Cyt1Aa1 단백질이 Bs 2362 에 대한 독성을 복원시킨다는 발견은 Bs를 바이오살충제로서 지속적으로 사용하는 것을 방해하는 주요 문제에 대한 해결책을 제공한다.
이러한 발견은 Bs 독소를 생산하는 박테리아 세포, 예컨대 Bs 세포 또는 Bs 독소를 생산하도록 재조합 변형된 Bt 세포 내에서 Bti Cyt1Aa1 을 생산함으로써 개발될 수 있다. Bs 독소가 Bti Cyt1Aa1 을 발현하도록 재조합 변형된 Bs 세포 내에서 생산된다면, cry11A오페론에 의해 코딩되는 20 kD 샤페론형 단백질을 발현하도록 세포를 또한 형질전환시키는 것이 바람직하다.cyt1Aa1의 서열은 GenBank 로부터 등록번호 X03182 로 입수할 수 있고, 문헌 [Waalwijk 등, Nucl. Acids Res. 13:8207-8217 (1985)] 에 공개되었다.cry11A오페론 및 코딩되는 20 kD 단백질은 하기에 추가로 논의된다.
대안적으로, Bti Cyt1Aa 단백질 또는 Cyt1Aa 를 생산하는 Bti 세포 (또는 Bti Cyt1Aa 를 생산하도록 재조합 변형된 다른 바실러스 종의 세포) 가 Bs 로부터 생산된 세포, 과립 또는 분말에 첨가되어, 그렇지 않으면 내성일 생물에 대해 과립이 독성이도록 할 수 있다.
하기 실시예에서 나타나는 바와 같이, 비교적 소량의 Cyt1Aa1 단백질이 내성을 극적으로 억제시키거나 또는 심지어는 제거시키는데 충분하다. 바람직한 구현예에서, Cyt1Aa1 단백질은 Bs 혼합물에 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9 또는 1:10 으로부터 선택된 비로 첨가될 수 있고, 비교적 낮은 양의 첨가된 물질로 내성의 상당한 반전을 제공하므로 1:10 이 가장 바람직하다. 더 낮은 비는 다소 낮은 내성 억제를 제공할 수 있다는 이해와 함께, 예를 들어, Cyt1Aa1 단백질을 첨가하는 비용을 감소시키는 것이 바람직하다면, 1:12, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:55, 1:60, 1:65, 또는 1:70 과 같은 더 높은 비 또한 사용될 수 있다. 원하는 내성 반전도를 제공하는지를 분별하기 위해, 실시예 5에 교시된 분석을 사용하여 임의의 특정 비를 평가할 수 있다. 1:100 미만의Cyt1Aa1 대 (:) Bs 의 비는 바람직하지 않다.
Cyt1Aa 단백질은 정제된 과립으로서 첨가될 수 있다; 그러나, Cyt1Aa 를 생산하는 Bti 세포의 형태로 Cyt1Aa 를 첨가하는 것이 일반적으로 더욱 용이하다. 편리하게는, Bti 세포를 용해 및 동결건조시켜, Bs와의 혼합 전에 분말을 형성시킨다. 바람직한 구현예에서, Bs는 균주 2362이다.
출원인의 발견을 기초로, Bti로부터의 다른 Cyt1 단백질이 동일한 방식으로 작동하여 Bs 이원성 독소에 대한 내성을 반전시킬 것이다.
당업자는 Bs 및 Bt 세포가 일반적으로 함께 투여되지 않음을 인식할 것이다. 이론에 의존하지 않고, 이는 독소에 관련된 각각의 종에 의해 생성된 포자의 중량이 표적 유충이 섭취할 수 있는 독소의 유효량을 감소시킬 수 있다는 우려때문일 수 있다. 그러나, 내성의 억제를 달성하기 위해 첨가될 필요가 있는 Bti의 최적량은 한 인자로서의 이러한 우려를 제거시켰다. 실시예에서 보고된 연구에서는 Bti 세포가 Bs 와 혼합되었을 때 충분한 독성을 나타낸다.
Bt는 약 20 년 동안 바이오살충제로서 시판되어 사용되어 왔고, Bs는 약 5 년 동안 시판되어 사용되어 왔다. 야외에서의 Bti 및 Bs 의 사용은, 예를 들어, [Mulla, M. S., "Activity, field efficacy, and use ofBacillus thuringiensis israelensisagainst mosquitoes," pp. 134-160] 및 [Yap, H.-H., "Field trials ofBacillus sphaericusfor mosquito control" pp. 307-320 in H. de Barjac 및 D. J. Sutherland. [편저] Bacterial control of mosquitoes and blackflies. Rutgers University Press (New Brunswick, NJ, 1990)]에서 재고되었다. 따라서당업자는 다량의 Bt 및 Bs 유기체를 배양하는 것, 이러한 생물들로부터 바이오살충제를 제형화하는 것, 및 제형물을 야외에 적용하는 것에 익숙할 것이다. 본원에 기술된 재조합 생물 및 방법은 Bt 및 Bs 세포로부터 바이오살충제를 제형화하는 당업계에 공지된 임의의 방법으로 사용될 수 있다.
본 발명의 재조합 Bs 세포는 Bs 바이오살충제가 현재 사용되는 임의의 방법에서 사용될 수 있지만, 현재 시판되어 사용되는 균주에 비해 증가된 독성에 비례하여 더 낮은 적용률로 적용될 수 있다. 예를 들어, 재조합 Bs의 독성이 현재 균주의 독성의 10 배라면, 현재 사용되는 중량의 1/10 중량의 물질을 적용하여 동일한 살생력을 수득할 수 있다. 또한, Cyt1Aa1 을 발현하는 재조합 세포를 야생형 Bs 이원성 독소에 내성이 된 모기 개체군에 대해 사용할 수 있다.
Bs 이원성 독소를 생산하는 본 발명의 재조합 Bt 세포는 Bt에 의해 일반적으로 방제되는 생물의 방제에 사용될 수 있고, 추가적으로 얼룩날개모기 종에 대해서 사용될 수 있다. 재조합 Bs와 관련하여 상기 논의된 바와 같이, 고수준의 Bs 독소를 발현하는 재조합 Bt 는 현재 시판되어 사용되는 균주와 비교하여 표적 유기체에 대한 재조합형의 증가된 독성에 비례해 더 낮은 적용률로 적용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 더 적은 물질을 사용할 수 있도록 한다. Bt 또는 Bs의 양을 감소시키는 것은 더 적은 Bt 또는 Bs 가 배양되어야 한다는 것을 의미하므로, 동일한 양의 살생력을 수득하기 위해 더 적은 원료가 필요하고, 따라서 소정의 면적을 처리하기에 충분한 물질의 생산 순비용이 감소된다.
하기의 단락들은 본 명세서에서 사용되는 용어들을 정의한다. 이어서 Bt및 Bs 박테리아 및 이들의 독소, 본 발명에서 사용하기에 적절한 Bt 프로모터, STAB-SD 서열, 본 발명의 핵산 서열의 어셈블리, 및 20 kD 샤페론형 단백질, 뿐만 아니라 본 발명의 핵산, 벡터, 숙주 세포 및 박테리아의 제조 및 용도가 논의된다.
II. 정의
달리 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 의미를 갖는다. 하기의 참조문헌들은 당업자에게 본 발명에서 사용된 다수의 용어들의 일반적인 정의를 제공한다: [Singleton 등, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (제 2 판. 1994)]; [The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker 편저, 1988)]; 및 [Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)]. 본원에 기술된 것들과 유사 또는 동등한 임의의 방법 및 물질을 본 발명의 실행 또는 시험에서 사용할 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 기술된다. 본원에서 사용되는 하기의 용어들은 달리 명시되지 않는 한 이들에 속하는 의미를 갖는다.
"바실러스 투린지엔시스" 및 "Bt" 는 포자형성 동안 결정질의 포자체를 생산하는 능력을 특징으로 하는, 그램 양성 토양 박테리아이다. 봉입체는 살충성 내독소를 포함한다. 봉입체는 플라스미드가 지니는 유전자에 의해 코딩되는 살충성 단백질 (종종 "결정 단백질" 로 명명됨) 을 함유한다. 박테리아는 이들을 상승된 온도에서 성장시킴으로써 플라스미드가 "큐어링"될 수 있고, 그 결과 결정 단백질을 생산하지 않는 세포가 생성된다. 이같은 박테리아를 "비결정성" 또는 "결정 마이너스" 세포로 명명한다.
"바실러스 스패리쿠스" 또는 "Bs" 는 또한 특정 곤충에게 독성인 단백질의 부포자 (parasporal) 결정을 생산하는 그램 양성 토양 박테리아를 지칭한다.
"이원성 독소"는 Bs에 의해 생산되는 독소를 가리킨다. 독소는 2 개의 단백질로 구성되고, 그중 하나는 결합부로, 다른 하나는 독소로 작용한다. 두 단백질은 용액 내에서 회합되어 기능성 독소를 형성할 수 잇다. 단백질의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 [Baumann 등, J. Bacteriol. 170:2045-2050 (1988)]에 보고되어 있다. 51.4 kD 단백질 (서열 번호 8)은 결합 도메인으로 기능하고, 41.9 kD 단백질 (서열 번호 9)은 독소 도메인으로 기능한다. 본원에서, 단백질에 대한 언급에는, 독소 단백질이 결합되도록 하는 단백질의 능력이 (a) 41.9 kD 독소 단백질에 대한 단백질의 독성, 또는 (b) 51.4 kD 결합 단백질에 대한 단백질의 독성을 50 % 초과로 감소시키지 않는 합성 변이체 및 천연 변이체가 포함된다. 아미노산이 보존적으로 치환된, 예컨대 글루탐산이 아스파르트산으로 치환되거나 아스파르트산이 글루탐산으로 치환된 합성 변이체가 구체적으로 구현된다.
"Cry" 및 "Cyt"는 바실러스 투린지엔시스에 의해 생산된 단백질의 두 부류의 원을 가리킨다. 당업계의 명명법은 다양한 Cry 단백질을 로마 숫자로 명명하는 것 (단백질이 독성인 생물의 명백한 범위를 표시히기 위해) 에서 아라비아 숫자로 명명하는 것으로 최근 변경되었다. 일부 130 개의 Cry 및 Cyt 단백질에 대한 기존의 호칭과 현재의 호칭의 명명법을 상호 관련시킨 포괄적인 표는 [Crickmore 등, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-813 (1998)]에 설명되어 있다.
"Cyt1Aa1"으로 명명된 단백질은 때때로 "CytA" 또는 "Cyt1A"로 종래에 명명되었다; 본원에서의 CytA 또는 Cyt1A에 대한 언급은 Cyt1Aa1 을 지칭한다.
당업계에서의 표준 용법에 따라, "Cry" 또는 "Cyt"는 단백질을 표시하는 반면, 이탤릭체로 표시된 소문자 용어 "cry" 또는 "cyt"는 유전자를 지칭한다.
"프로모터"는 핵산 제어 서열의 배열, 예를 들어, 바실러스 투린지엔시스로부터의cry1Ac1프로모터이고, 이는 이종성 또는 천연 폴리뉴클레오티드일 수 있는 회합된 폴리뉴클레오티드의 전사를 지시한다. 프로모터에는 전사 개시 부위에 인접한 핵산 서열, 예컨대 중합효소 결합 부위가 포함된다. 또한 프로모터에는 전사 개시 부위로부터 수천 염기쌍 정도로 멀리 위치할 수 있는 원위(遠位) 인핸서 또는 리프레서가 임의로 포함될 수 있다.
"시그마 인자"는 DNA 내의 특정 서열을 인식하고, RNA 중합효소에 의한 DNA의 전사 개시를 촉진시키는 단백질 복합물의 일부를 형성하는 단백질을 가리킨다. 당업계에 공지된 바와 같이, 시그마 인자 단백질의 서열은 바실러스 서브틸리스에서의 연구로부터 결정되었고, 다른 바실러스 종에서 동일한 기능을 수행하는 단백질은 바실러스 서브틸리스의 시그마 인자에 대해 약 80-95 % 서열을 갖는다. 따라서, Bt에서 바실러스 서브틸리스의 시그마 인자와 동일한 역할을 수행하는 인자는 바실러스 서브틸리스의 패러다임 단백질의 것과 약간 상이한 서열을 갖는다. 본원에서의 용어 "시그마 인자" 는 바실러스 서브틸리스의 시그마 인자와 동일한 기능을 수행하고, 이러한 단백질에 대해 약 80-95 % 이상의 서열 상동성을 갖는 Bt 내의 단백질을 지칭한다. 이러한 단백질들이 바실러스 서브틸리스 단백질에 상응하지만 서열이 동일한 필요는 없음을 주장하기 위해, 이들은 본원에서 종종 "시그마형" 인자 또는 단백질로도 명명된다.
"BtI 프로모터"는 시그마 인자-E 에 의해 인식되는 프로모터를 지칭한다. "BtII 프로모터"는 시그마 인자 K 에 의해 인식되는 프로모터를 지칭한다.
"강한 BtI 또는 BtII 프로모터" 는 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 작동적으로 연결되고 Bt 세포에서 발현되는 경우, 단백질이 세포의 건조 중량의 적어도 5 %, 더욱 바람직하게는 10 %, 가장 바람직하게는 15 % 이상을 구성하는 프로모터를 가리킨다.
"폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은 포스포디에스테르 결합을 통해 연결된 뉴클레오티드 단위 (리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 관련된 천연 발생 구조 변이체, 및 천연 발생이 아닌 이들의 합성 유사체) 로 구성되는 중합체, 관련된 천연 발생 구조 변이체, 및 천연 발생이 아닌 이들의 합성 유사체를 가리킨다. 따라서, 이러한 용어에는 뉴클레오티드 및 이들 사이의 연결에 천연 발생이 아닌 합성 유사체가 포함되는 뉴클레오티드 중합체가 포함된다. 문맥에서 요구되는 경우, 뉴클레오티드 서열이 DNA 서열 (즉, A, T, G, C) 로 표시될 때, "U"가 "T"를 대신하는 RNA 서열 (즉, A, U, G, C) 또한 포함된다는 것이 이해될 것이다.
"재조합"은 시험관 내에서 처리 또는 합성된 폴리뉴클레오티드 ("재조합 폴리뉴클레오티드"), 및 재조합 폴리뉴클레오티드를 사용하여 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 유전자 산물을 세포 또는 기타 생물학적 시스템 내에서 생산하는 방법을 가리킨다. 예를 들어, 클로닝된 폴리뉴클레오티드를 적절한 발현 벡터, 예컨대 박테리아 플라스미드 내로 삽입할 수 있고, 플라스미드를 사용하여 적절한숙주 세포를 형질전환시킬 수 있다. 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 "재조합 숙주 세포" 또는 "재조합 박테리아" 로 칭한다. 이어서 재조합 숙주 세포 내에서 유전자가 발현되어, 예를 들어, "재조합 단백질" 이 생산된다. 재조합 폴리뉴클레오티드는 또한 코딩하지 않는 기능 (예를 들어, 프로모터, 복제 기원, 리보좀 결합 부위 등) 을 수행할 수 있다.
"이종성 폴리뉴클레오티드 서열" 또는 "이종성 핵산" 은, 또다른 폴리뉴클레오티드, 예컨대 프로모터 서열에 두 폴리펩티드 서열이 천연에서와 동일한 관계로 서로 배열되지 않도록 기능적으로 연결된 폴리뉴클레오티드를 지칭하는 관련 용어이다. 이종성 폴리뉴클레오티드 서열에는, 예를 들어, 이종성 핵산에 작동적으로 연결된 프로모터, 및 재조합 숙주 세포 내로의 형질전환을 위해 이종성 벡터로 삽입된 천연 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 이종성 폴리뉴클레오티드 서열은 형질전환 기술을 통해 숙주 세포 내에 도입되므로 "외인성" 인 것으로 간주된다. 그러나, 이종성 폴리뉴클레오티드는 외래 공급원 또는 동일한 공급원으로부터 유래될 수 있다. 이종성 폴리뉴클레오티드 서열을, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드를 제한효소로 처리하여 조절 요소에 작동적으로 연결될 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 생성시킴으로써 개질시킬 수 있다. 부위 지정 돌연변이유발과 같은 기술에 의해 개질될 수도 있다.
용어 "내인적으로 발현된" 은 숙주 세포에 대해 천연적이고 숙주 세포 내에서 천연적으로 발현되는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.
"발현 카세트" 는 유전자가 숙주 세포 내에서 전사되도록 하는 일련의 폴리뉴클레오티드 요소를 지칭한다. 전형적으로, 발현 카세트에는 프로모터 및 전사되는 이종성 또는 천연 폴리뉴클레오티드 서열이 포함된다. 발현 카세트에는, 예를 들어, 전사 종결 신호, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서 요소가 또한 포함될 수 있다.
용어 "작동적으로 연결된" 은 한 부분의 활성 (예를 들어, 전사를 조절하는 능력) 의 결과로 다른 부분이 작용 (예를 들어, 서열의 전사) 되는 2 개 부분 간의 기능적 관계를 가리킨다. 따라서, 폴리뉴클레오티드 발현 조절 서열 (예컨대 프로모터 또는 기타 전사 제어 서열) 과 제 2 폴리뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 천연 또는 이종성 폴리뉴클레오티드) 사이에 기능적 연결이 존재하여, 발현 조절 서열이 폴리뉴클레오티드의 전사를 지시할 때, 폴리뉴클레오티드는 "프로모터에 작동적으로 연결된다".
"살충성 내독소" 는 결정 단백질로도 공지된, 살충 활성을 나타내는 내독소 단백질, 예를 들어, Cry2A, Cry3A, Cry1B, Cry1C 및 Bs 이원성 독소을 코딩하는 유전자의 부류를 가리킨다 (Hofte & Whiteley, Microbiol. Rev. 53: 242-255 (1989) 참조). 이같은 살충성 내독소는 바실러스 투린지엔시스에 의해 생산되고, 곤충, 특히 곤충의 유충에 독성이다.
살충성 내독소의 "살충 유효량" 은 식물, 토양 또는 기타 "소재지", 예를 들어, 현장 또는 구획에 적용되는 경우 살충 활성을 제공하는 단위 용량이다.
"cry11A오페론 20 kDa 단백질을 코딩하는 유전자" (20 kDa 단백질 유전자)는 약 20 kDa의 단백질을 코딩하는cry11A오페론 내의 유전자를 지칭한다([Frutos 등, Biochem. Sys. and Ecol. 19:599-609 (1991)]에 기술됨; [뉴클레오티드 및 아미노산 서열에 대해 Frutos 등의 도 4 참조).
"증강 생산" 은 숙주 세포 내의 살충성 내독소와 같은 제 2 단백질의 순량(純量)을 증가시키는cry11A오페론 20 kDa 단백질과 같은 제 1 단백질의 활성을 지칭한다.
"발현에 대한 수용성(受容性)"은 내인성 및/또는 외인성 폴리뉴클레오티드의 발현에 충분한 세포 환경을 제공하는 숙주 세포를 가리킨다.
2 개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 상황에서, 용어 "동일한" 또는 백분율 "동일성"은 하나 이상의 하기 서열 비교 알고리즘을 사용하여 또는 시각적인 점검에 의해 측정시, 최대 일치를 위해 비교 및 정렬되었을 때, 동일하거나, 또는 지정된 백분율의 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 갖는 2 개 이상의 서열 또는 부분서열 (subsequence) 을 지칭한다.
2 개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 상황에서, 용어 "실질적으로 동일한"은 하나 이상의 하기 서열 비교 알고리즘을 사용하여 또는 시각적인 점검에 의해 측정시, 최대 일치를 위해 비교 및 정렬되었을 때, 60 % 이상, 바람직하게는 80 % 이상, 가장 바람직하게는 90-95 % 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 동일성을 갖는 2 개 이상의 서열 또는 부분서열을 지칭한다.
서열 비교를 위해, 전형적으로 한 서열을 기준 서열로 두고, 시험 서열을 이와 비교한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우, 시험 및 기준 서열을 컴퓨터에 입력하고, 부분서열 좌표를 고안하고, 필요하다면, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터를 고안한다. 이어서 서열 비교 알고리즘이, 고안된 프로그램 파라미터를 기초로, 기준 서열에 대한 시험 서열(들)의 백분율 서열 동일성을 계산한다.
비교를 위한 서열의 최적 정렬은, 예를 들어, [Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)]의 국소적 상동성 알고리즘, [Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)]의 상동성 정렬 알고리즘, [Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)]의 유사성 방법에 대한 조사, 이러한 알고리즘들의 컴퓨터화 실행 (GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA, Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), 또는 시각적인 점검에 의해 수행될 수 있다 (일반적으로, Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel 등 편저, Current Protocols, Greene Publishing Associates, Inc.와 John Wiley & Sons, Inc. 간의 합작 벤처 (1995 증보) ("Ausubel") 참조).
백분율 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하기에 적절한 알고리즘의 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘으로, 이들은 [Altschul 등 (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410] 및 [Altschuel 등 (1977) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402] 에 각각 기술되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 에서 공개적으로 입수가능하다. 이러한 알고리즘에는 먼저 질의 서열 내의 길이 W의 짧은 워드 (word) 를 동정하여 하이 스코어링 서열쌍 (high scoring sequence paris: HSP)을 동정하는 것이 수반되고, 이는 데이타베이스 서열 내의 동일한 길이의 워드와 정렬되는 경우 일부 양성값 역치 스코어 T 와 매치되거나 이를 만족시킨다. T 는 이웃 워드 스코어 역치로 칭해진다 (Altschul 등, 상기문헌). 이러한 초기 이웃 워드 히트 (hit) 는 이들을 포함하는 더 긴 HSP 를 찾기 위한 조사를 개시시키는 시드 (seed) 로 작용한다. 이어서 워드 히트는 누적 정렬 스코어가 증가될 수 있는 한 각각의 서열을 따라 양 방향으로 확장된다. 누적 스코어는 뉴클레오티드 서열에 대해서는 파라메터 M (한쌍의 매치되는 잔기에 대한 리워드 스코어: 항상 > 0) 및 N (매치되지 않은 잔기에 대한 페널티 스코어; 항상 < 0) 을 사용하여 계산한다. 아미노산 서열에 대해서는, 스코어링 매트릭스를 사용하여 누적 스코어를 계산한다. 각각의 방향에서의 워드 히트의 확장은 누적 정렬 스코어가 최대 달성값으로부터의 값 X 만큼 떨어지는 경우; 누적 스코어가 하나 이상의 음성-스코어링 잔기 정렬로 인해 0 이하로 가는 경우; 또는 서열의 말단에 도달되는 경우에, 정지된다. BLAST 알고리즘 파라메터 W, T 및 X 는 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램 (뉴클레오티드 서열에 대해) 은 디폴트로서 워드길이 (W) 11, 기대치 (E) 10, M=5, N=-4, 및 양 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열에 대해, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 워드길이 (W) 3, 기대치 (E) 10, 및 BLOSUM62 스코어링 매트릭스를 사용한다 (Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989) 참조).
백분율 서열 동일성의 계산에 더하여, BLAST 알고리즘은 두 서열 간의 유사성의 통계적인 분석을 또한 수행한다 (예를 들어, Karlin & Altschul, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993) 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 한 측정은 최소 합계 가능성 (P(N))이고, 이는 두 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 간의 매치가 우연히 일어날 가능성의 지표를 제공한다. 예를 들어, 기준 핵산에 대한 시험 핵산의 비교에서 최소 합계 가능성이 약 0.1 미만, 더욱 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만이면, 핵산은 기준 서열과 유사한 것으로 간주된다.
두 핵산 서열 또는 폴리펩티드가 실질적으로 동일하다는 추가적인 지표는, 하기 기술되는 바와 같이, 제 1 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드가 제 2 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드와 면역학적으로 교차 반응성이라는 것이다. 따라서, 예를 들어, 두 펩티드가 보존적 치환에 의해서만 상이하다면, 폴리펩티드는 전형적으로 제 2 폴리펩티드와 실질적으로 동일하다. 두 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 추가적인 지표는, 하기 기술되는 바와 같이, 엄격한 조건 하에 두 분자가 서로 혼성화한다는 것이다.
용어 "엄격한 혼성화 조건" 또는 "엄격한 조건"은 핵산 서열이 상보물에는 혼성화하지만, 다른 서열과는 어떠한 의미있는 정도로 혼성화하지 않는 조건을 지칭한다. 핵산 혼성화의 문맥에서 엄격한 조건은 서열 의존적이고, 상이한 환경 파라미터에 따라 상이하다. 더 긴 서열이 더 높은 온도에서 특이적으로 혼성화한다. 핵산의 혼성화에 대한 광범위한 지침은 [Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, New York, (1993)]에서 발견된다(Tijssen 의 전문은 본원에 참고 문헌으로 포함된다). 매우 엄격한 조건은 특정 프로브에 대한 TM값과 동일하도록 선택된다. 반면에, 덜 엄격한 조건은 핵산 서열이 불완전하게 매치되는 서열에 결합하는 조건이다. 엄격성은 온도, 염 농도, 포름아미드 또는 DMSO 와 같은 유기 화합물의 존재, 또는 이들 모두에 의해 조절될 수 있다. 이러한 파라미터들을 변화시키는 것의 효과는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 포름아미드 농도 변화의 Tm에 대한 효과는 하기 등식으로 감소된다: Tm= 81.5 + 16.6 (log Na+) + 0.41 (% G+C) - (600/올리고 길이) - 0.63 (% 포름아미드). TMAC로 인한 Tm의 감소 및 염 농도 변화의 효과 또한 공지되어 있다. 온도의 변화가 편리함, 제어 용이성 및 가역성으로 인해 일반적으로 바람직한 엄격성 조절 수단이다.
"보존성 치환" 은 아미노산의 폴리펩티드에서의 기능적으로 유사한 아미노산으로의 치환을 가리킨다. 하기의 6개 군이 서로에 대해 보존성 치환인 아미노산을 각각 포함한다:
1) 알라닌 (A), 세린 (S), 트레오닌 (T);
2) 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E);
3) 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q);
4) 아르기닌 (R), 라이신 (K);
5) 이소류신 (I), 류신 (L), 메티오닌 (M), 발린 (V); 및
6) 페닐알라닌 (F), 타이로신 (Y), 트립토판 (W).
또한 [Creighton, PROTEINS, W.H. Freeman and Company, New York (1984)] 참조.
III. BTI 및 BS 독소
Bti 및 Bs 는 포자형성 도중 단백질성 결정성 봉입체 (inclusion) 를 생성하는 호기성, 그람 양성 포자형성 토양서식 개체이다. Bt 아종의 결정은 매우 다양한 인시류 (leipdopteran), 딱정벌레류 (coleopteran) 및 쌍시류 (dipteran) 종들의 유충에게 독성을 띈다. 상이한 Bt 아종에 대항하는 일부 곤충의 소개 리스트가 최근 사용되고 있다. Bt 는 사용되는 모든 바이오살충제의 약 90% 를 차지한다. [Agaisse 및 Lereclus. J. Bacteriol. 177:6027- 6033 (1995)].
cry및cyt유전자는 Bt 에 의해 생성되는 다양한 살충성 단백질을 코딩한다. 다수의 상기 유전자가 동정 및 서열분석되어, 당 분야에 널리 알려져 있다. 예를 들어, 문헌 [Crickmore 등, Microbiol Mol Biol Rev., 62:807-813 (1998) (Crickmore 등의 전문이 본원에 참고문헌으로 포함된다)] 에서는 120 여개의 동정된 Btcry유전자 및 9 개의 Btcyt유전자 서열에 대한 GenBank 등록 번호를 나타내는 표가 제공된다.
이름에서 추정할 수 있듯이, 이원성 독소 Bs 는 2 개 단백질 (51.4 kD 의 하나 및 41.9 kD 의 하나) 로 구성된다. 단백질들의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 10 여년에 걸쳐 공지되어 왔으며, 문헌 [Baumann 등, J. Bacteriol. 170:2045-2050 (1988)] 에 보고되어 있다. 51.4 kD 단백질 (서열 번호 8) 은 결합 도메인으로서 작용하며, 41.9 kD 단백질 (서열 번호 9) 은 독소 도메인으로서 작용하므로,최대 독소 기능을 위해서는 일반적으로 동일 몰량의 두 단백질이 존재해야 한다. 편리하게는, 이는 본 발명의 프로모터-STAB-SD 구축물의 하류에 두 단백질 모두를 코딩하는 핵산 서열을 갖도록 하여, 두 단백질이 동시에 및 적절하게는 동량으로 발현되게 함으로써 달성될 수 있다. 두 개의 Bs 독소 단백질의 단 하나의 핵산 서열만이 본 발명의 프로모터-STAB-SD 서열의 조절 하에 놓이는 경우, 다른 Bs 독소 단백질을 코딩하는 서열이 유사한 프로모터 구축물의 전사 조절 하에 있는 2 개 단백질이 동일몰량으로 또는 대략 동일몰량으로 생성되는 것이 바람직하다.
숙련자는, 서열번호 8 및 9 의 서열에 변화를 줄 수 있고, 일상적인 유전자 조작 기법을 이용하여 Bs 독소와 같은 기능을 수행하는 단백질을 얻을 수 있음을 인지할 것이다. 예를 들어, 아미노산의 보존적 치환이 Bs 이원성 독소 단백질의 서열 (서열번호 9) 에서 수행되어, 높은 서열 동일성을 가지며, 천연 단백질의 독성의 일부 이상을 보유하는 단백질 또는 폴리펩티드를 얻을 수 있고, 또한 독소 단백질을 위한 결합 단백질로서 작용하는 단백질을 얻을 수 있는 유사한 변형이 Bs 이원성 독소 결합 단백질 (서열번호 8) 에도 일어날 수 있다. 바람직하게는, 상기 단백질 또는 폴리펩티드는 천연 Bs 41.9 kD 또는 51.4 kD 단백질과 약 75% 이상, 보다 바람직하게는 서열번호 8 또는 서열번호 9 와 80% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상, 더욱 더 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 갖는다. 천연 Bs 독소 대신에 작용할 임의의 특정 폴리펩티드의 기능은 당분야에 공지되고 본원에 나타낸 분석법들에 의해 용이하게 평가될 수 있다. 천연 41.9 kD 독소 단백질 (서열번호 9) 대신에 제공되는 폴리펩티드가 천연 Bs 독소의 독성의 50% 이상, 보다 바람직하게는 천연 Bs 독소의 독성의 60% 이상, 더욱 바람직하게는 70% 이상, 더욱 더 바람직하게는 약 80% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 90% 이상의 독성을 갖는 것이 바람직하다. Bs 이원성 독소의 천연 51.4 kD 결합 단백질 (서열번호 8) 대신에 제공되는 폴리펩티드가 상기 결합 단백질의 곤충 수용체에 결합할 수 있는 것이 바람직하다. 상기 결합은, 예를 들어 면역조직화학 (정성적임) 또는 브러시 보더 막 결합 분석법 (brush border membrane binding assays; 상기 분석법은 또한 상대 결합능의 정량적 평가를 제공하는 "브러시 보더 막 소포 결합 분석법"으로 알려져 있음) 에 의해 결정될 수 있다. 상기 분석법은 당 분야에 널리 공지되어 있다.
놀랍게도, Bt 로부터의 Cyt1A 단백질이 Bs 이원성 독소의 결합 단백질에 대한 수용체를 소실한 유충에 대해 독소의 독성을 복구시킬 수 있음을 발견하였다. 따라서, 필요하다면 Cyt1A 단백질을 51.4 kD 결합 도메인 단백질의 일부 또는 전체 대신에 Bs 이원성 독소의 41.9 kD 독소 단백질을 발현하는 세포 중에 공동발현시킬 수 있고, 단백질은 세포 또는 세포로부터 만들어진 바이오살충제를 먹는 표적 유충에게 독성을 나타낼 것이다. 따라서, 예를 들어 Bti 와 같은 Bt 세포를, 대략 유사한 양의 Bs 41.9 kD 단백질을 발현시킬 프로모터와 함께 Cyt1A 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 도입시켜 형질전환시킬 수 있다. 이와는 달리, Cyt1A 단백질 및 Bs 이원성 독소를 개별적으로 제조 및 혼합하여, Bs 독소 내성 모기를 독소에 민감하게 만들 수 있다. 상기 용도의 변형에서, Cyt1A 단백질은 41.9 kD Bs 독소 단백질 (예를 들어 재조합적으로 발현된 것) 및 Bs 독소에 내성을 나타내는 모기 개체군에 대해 사용되는 혼합물에 첨가될 수 있다. 작용 기전이 51.4 kD 결합 도메인 단백질에서와 동일하지 않을 수 있으므로, Cyt1A 단백질의 양이 전체 독성 효과를 달성하기 위해 51.4 kD Bs 결합 단백질에서와 같이 독소 단백질의 양에 근접하게 대응될 필요는 없다.
IV. BT 프로모터
본 발명은 Bs 독소의 발현을 유도하기 위해 Btcry또는cyt유전자 유래의 프로모터를 사용한다. 상기 유전자는 Bt 에 의해 생성되는 다양한 살충성 단백질을 코딩한다. 선행 부분에서 주지된 바와 같이, 문헌 [Crickmore 등, Microbiol Mol Biol Rev., 62:807-813 (1998)] 의 표 1 에는 120 개 Btcry유전자 및 9 개 Btcyt유전자의 서열에 대한 명칭 및 GenBank 등록 번호의 편리한 목록이 나타나있다. 당분야의 숙련자는 각각의 상기 유전자 목록에 기재되어 있는 코딩 영역에 대한 개시 코돈에 선행하는 5' 서열에 프로모터 영역이 포함됨을 인지할 것이다.
숙련자가 인지하듯이, Cry 및 Cyt 단백질의 유전자 전사는 시그마 인자로 공지된 단백질이 결합하는 서열의 존재에 의해 시간적으로 조절된다. 시그마 인자는 다른 단백질을 규합해서, RNA 폴리머라아제가 DNA 의 전사를 개시할 수 있게 하는 복합체를 형성한다.cry또는cyt유전자의 프로모터는 일반적으로 이들에 결합하는 시그마 인자에 따라, 3 종류로 분류된다. 이들은 시그마-E 프로모터, 시그마-K 프로모터, 및 시그마-A 프로모터이다.
시그마-E 프로모터는 또한 BtI 프로모터로도 알려져 있고, 시그마-K 프로모터는 또한 BtII 프로모터로도 공지되어 있다 (본원에서 프로모터의 논의와 관련하여, "시그마-E" 및 "BtI" 라는 용어는 상호교환가능하며, "시그마-K" 및 "BtII" 라는 용어도 마찬가지이다). 여러cry유전자는 포자형성 도중에 활성을 나타내며, 일반적으로 BtI 또는 BtII 프로모터에 의해 유도되고, BtI 프로모터는 BtII 프로모터에 비해 포자형성 초기에 활성을 나타낸다. 일반적으로, 문헌 [Agaisse 및 Lereclus, J. Bacteriol. 177:6027-6032 (1995) ("Agaisse 및 Lereclus 1995")] 를 참고. 대부분의cry유전자를 인지하는 시그마 인자가 공지되어 있다. 예컨대, [Agaisse 및 Lereelus 1995]. 예를 들어,cry4A및B는 BtI 프로모터에 의해 인지된다.
다수의cry유전자는 2 가지 프로모터 (하나는 BtI 및 다른 하나는 BtII) 를 갖는다. 상기 이중 프로모터의 조합으로 포자형성 과정의 장기간에 걸쳐 유전자 발현이 연장된다. 일부 경우, 2 가지 프로모터가 겹친다. 포자형성 비의존성cry유전자는 또다른 시그마 인자, 시그마-A 에 의해 인지되는 또다른 세트의 프로모터를 갖는다. 예컨대 [Agaisse 및 Lereclus 1995] 참고.
임의의 강력한 BtI 또는 BtII 프로모터가 본 발명의 핵산 서열 및 방법에 사용될 수 있다. 이중 BtI 및 BtII 프로모터, 특히 겹치는 BtI 및 BtII 프로모터는 단백질 발현의 강력한 프로모터인 경향이 있으며, 본 발명의 핵산 구축용 프로모터의 바람직한 형태이다. 이중 프로모터를 갖는 하기 군에 속하는 유전자 멤버들이 특히 바람직하다:cry1A, cry1B, cry1 1A및cyt1Aa.
본 발명의 목적을 위해, 무결정성 (acrystalliferrous) Bti 세포의 건조 중량의 5% 이상, 보다 바람직하게는 10%, 가장 바람직하게는 15% 이상을 차지하는Cyt1Aa1 단백질의 발현을 유도할 수 있는 임의의 BtI 또는 BtII 프로모터는 강력한 프로모터로 간주되며, 본 발명의 목적을 위해 적절한 BtI 또는 BtII 프로모터이다. 이중 BtI 및 BtII 프로모터 또는 프로모터 영역이 바람직하다.
바람직한 구현예에서, BtI 또는 BtII 프로모터는cry1프로모터 또는cyt1Aa1(또한 cyt1A 로 알려져 있음) 프로모터이다.cry1프로모터의 가까운 계통발생학적 상관관계 및 높은 서열 동일성으로 인해 (Crickmore 등, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-813 (1998) 참고), Crickmore 등에서cry1유전자로 지정된 유전자의 임의 프로모터는 Bs 이원성 독소의 고수준 발현을 유도할 수 있을 것으로 여겨진다. 특히 바람직한 구현예는cry1Aa1(종래cry1A(a) 로 명명됨),cry1Ba1 (종래cry1B로 명명됨),cry1 Ca1(종래cry1C로 명명됨), 및cry1Fa1(종래cry1F로 명명됨) 이다. 각각의 상기 유전자는 가까이 인접한 다른 유전자를 갖는 것을 주지해야 한다. 예를 들어,cry1Fa1은cry1Fa2에 가까이 인접한다. 동일한 대문자 및 동일한 소문자로 지정되는cry1유전자 군으로 명명되는 다른 원들은 군에서 제 1 기재 유전자와 거의 동일하게 바람직한 것으로 여겨진다 (즉,cry1Fa2는cry1Fa1과 거의 동일하게 바람직하다).
또다른 특히 바람직한 구현예에서, 프로모터는 BtI 및 BtII 프로모터 둘 다를 포함하는cyt1Aa1유래 프로모터일 수 있고, 따라서 때때로 이중 프로모터로 불린다. 프로모터 영역에 2 개 프로모터가 포함되므로, 상기 유전자의 프로모터 영역은 또한 "cyt1A프로모터들" 로 불린다. 계통발생학적 분석 및 서열 동일성에 근거하여, 다른cyt1Aa유전자의 프로모터도 또한 본 발명의 조성물 및 방법에 사용될 충분히 강력한 BtI 또는 BtII, 또는 조합된 BtI 및 BtII 프로모터이다.
포자형성 비의존성cry유전자 프로모터는 시그마-A 프로모터이며, 변형된 세트의 조건 하를 제외하고는 일반적으로 만족스럽지 못하다. Bt 의 비포자형성 형태는 또한 이들의 대사 자원을 포자 생산에 전달하지 않고, 포자형성 형태에 비해 더 장기간에 걸쳐 독소를 축적할 수 있다. 따라서, 비포자형성 형태에서, 시그마-A 프로모터는 고수준의 독소 축적에 사용될 수 있다. 따라서, BtI 및 BtII 프로모터는 Bt 및 Bs 를 포함하는 바실러스에서의 사용에 바람직하다. 바실러스의 비포자형성 형태에서는, 시그마-A 프로모터를 사용할 수 있다.
V. STAB-SD 서열
바실러스 투린지엔시스의 결정성 단백질 mRNA 는 포자형성 도중 10 분의 반감기를 갖는 반면, 다른 mRNA 의 평균 반감기는 1 내지 2 분이다. 이러한 긴 반감기는 부분적으로, 포자형성 세포의 건조중량의 20-30% 만큼일 수 있는 결정성 단백질의 매우 높은 생산에 기인할 수 있다.
상기 단백질의 긴 반감기는 유전자의 2 개 미번역 영역에 관련된다. 첫번째로, 일반적으로 프로모터 및 코딩 영역 사이에서 발견되는 5' 미번역 영역 중의 서열은, 번역 개시에는 관여하지 않지만 mRNA 의 안정성 결정인자이다. 이 서열은 공통 샤인-달가노 (Shine-Dalgarno-("SD")) 유사 서열이다. 두번째로,cry1Aa와 같은cry유전자의 3' 말단 절편은 mRNA 전사물의 반감기를 2 내지 3 배 증가시킨다. [Agaisse 및 Lereclus, Mol. Microbiol., 20:633-643 (1996)] (이후 "Agaisse 1996").
5' SD-유사 서열은 단백질의 생산 안정화에 관여하는 것으로 나타났다. 따라서, "STAB-SD" 서열로 명명되었다. Agaisse 1996. Agaisse 1996 에서는 STAB-SD 가 16S 리보좀 RNA 의 3' 말단과의 상호작용에 관여하는 것으로 제안되었고, 상보성을 제거시킬 것으로 추정되는 STAB-SD 서열의 돌연변이는 논의되는 안정성에 영향을 미치는 것으로 발견되었다. 흥미롭게도, 종래 cryIIIA 로 명명되었던 (현재는 cry3A 로 명명됨) 단백질의 STAB-SD 서열은 바실러스 서브틸리스 (B. subtilis) 16S rRNA 의 3' 말단과 추정되는 상호작용을 나타내었다. 이론에 구애되지 않고, STAB-SD 서열의 폴리퓨린 (G 및 A) 뉴클레오티드는 리보좀의 16S rRNA 서브유닛의 3' 말단의 피리미딘 뉴클레오티드 상보 서열과 염기쌍을 형성하며, 상기 염기쌍 결합은 mRNA 의 5' 말단으로의 5' 엔도리보뉴클레아제의 접근을 억제하여 전사물의 반감기를 증가시켜 코딩되는 단백질의 생산을 증강시키는 것으로 나타났다. 따라서, STAB-SD 서열은 특정한 박테리아 종에 제한되지 않는 것으로 나타났으며, 다른 바실러스 종 및 다른 박테리아 속의 상기 STAB-SD 서열을 이용하여, 바실러스 투린지엔시스 및 바실러스 스패리쿠스의 단백질 생산을 안정화시킬 수 있다.
Agnisse 1996 에서는 Bt 의 4 개cry유전자, 바실러스 브레비스 (B. brevis) 의cwp유전자위, 및 리스테리스 모노시토게네스 (Listeria monocytogenes) 의inIAB유전자위를 포함하는, 5' 미번역 영역 ("UTR") 중 추정되는 STAB-SD 서열의 동정된 다수의 예 및 데이타베이스가 개론되어 있다. 강력한 바실러스 프로모터 및 리보좀 결합 부위 사이에 위치하는 경우, 임의의 상기 STAB-SD 서열은, 바실러스에서 고수준의 Bs 독소를 생산할 수 있다. 동정된 STAB-SD 서열은 서로 매우 높은 상동성을 공유한다.
바람직한 구현예에서, STAB-SD 서열은 GAAAGGAGG (cry3A서열, 서열번호 1), GAAGGGGGG (cry3B서열, 서열번호 2), GAGGGGGGG (cry3B2서열, 서열번호 3), GAAAGGGGG (cry3D서열, 서열번호 4), GAAAGGAGG (바실러스 브레비스 (B. brevis) 유래의cwp서열, 서열번호 5), 및 GAAAGGGGT (리스테리아 모노시토게네스 (L. monocytogenes) 유래의in1AB, 서열번호 6) 로 구성된 군으로부터 선택된다.cry3A, cry3B, cry3B2및cry3D서열이 특히 바람직하다.Cry3A가 가장 바람직한 구현예이다. 필요하다면, 2 개 이상의 STAB-SD 서열을 나란히 사용할 수 있다. 다중 STAB-SD 서열이 사용되는 경우, 서열은 바람직하게는 약 30 내지 40 뉴클레오티드 떨어져서, STAB-SD 서열이 여러 30S 리보좀 서브유닛과 상호작용할 수 있다. 리보좀 서브유닛의 범위 길이는 약 30 뉴클레오티드이다. 사용되는 다중 STAB-SD 서열의 수는 STAB-SD 서열과 바실러스 서브틸리스 (B. subtilis) 의 16S rRNA 3' 의 3' 말단의 상호작용을 방해할 만큼 길어서는 안된다. 너무 많은 STAB-SD 서열의 존재는 하나 적은 STAB-SD 서열을 갖는 구축물과 비교하여 단백질 생산에서의 감소를 감안하여 결정될 수 있다. 1 내지 2 개 STAB-SD 서열이 가장 바람직하다. 유사하게, 2 개의 STAB-SD 서열이 임의의 편리한 거리 (전형적으로, 3 - 300 개 뉴클레오티드) 로 구분될 수 있지만, 구분의 효과는 33 내지 40 개 뉴클레오티드로 구분된 유사 구축물과의 비교해, 평가되는 구분 구축물에 의한 단백질의 생산을 결정함으로써 평가될 수 있다.
상기 나타낸 STAB-SD 서열 중 하나와 높은 서열 동일성을 가지며, STAB-SD 서열로서 기능하는 다른 서열을 본 발명의 핵산 및 방법에 사용할 수 있다. 상기 서열은 상기 나타낸 STAB-SD 서열 중 하나와 85% 이상의 서열 동일성을 갖고, 단백질 생산을 개선시키는 기능을 해야 한다. 바람직한 형태에서, 서열은 약 90% 이상의 서열 동일성, 더욱더 바람직하게는 약 95% 이상의 서열 동일성을 갖는다. 또한, Agaisse 1996 에는 안정성에 유해하게 작용할 수 있는 추정 STAB-SD 서열 상의 변화에 대한 지침이 제공된다. 일반적으로, STAB-SD 서열과 바실러스 서브틸리스 16S rRNA 3' 의 3' 말단의 상호작용을 제거할 뉴클레오티드의 임의 변화는 단백질 생산을 감소시킬 수 있고, 바람직하지 않다.
놀랍게도, 전체 STAB-SD 서열이 단백질 생산의 증강에 사용되지 않는 것도 발견되었다. STAB-SD 서열 6 개인 적은 수의 인접 뉴클레오티드가 안정성 개선에 작용할 수 있다. 전체 9 개 뉴클레오티드 STAB-SD 서열만큼 단백질 생산 안정화에 강력하지는 않지만, 6-머 (여러 뉴클레오티드 또는 아미노산의 서열은 당분야에서 그 수 및 접미어 "-머 (mer)" 로서 불릴 수 있다) 없이 단백질이 생산되는 것보다 더 나은 결과가 수득된다. 따라서, 필요하다면 상기 STAB-SB 서브서열 중 하나를 전체 STAB-SD 서열 대신에 사용할 수 있다. 그러나, 더 긴 서열이 16S rRNA 리보좀 서브유닛의 해당 피리미딘 서열에 보다 강력히 결합하므로, 보다 바람직하게는, STAB-SD 서열의 7 개 인접 뉴클레오티드가 사용되며, 더욱 바람직하게는 STAB-SD 서열의 8 개 인접 뉴클레오티드가 사용된다. 전체 길이 9 개 뉴클레오티드 STAB-SD 서열의 사용이 가장 바람직하다. 또한 2 개의 6-머와 같은 상기 구축물 2 개를연속으로 사용하여 더 나은 결과를 달성할 수 있다. 본 명세서의 다른 부분에서의 논의를 쉽게 하기 위해, "STAB-SD 서열" 이라는 용어에는 명세서에서 달리 요구되지 않는 한, STAB-SD 서열의 6, 7, 또는 8 개 인접 뉴클레오티드 서브서열이 포함된다.
임의의 추정 핵산 서열, 또는 공지된 STAB-SD 서열에 대한 임의의 목적 변형물은 하기 분석법 및 Agaisse 1996 에서 교시하는 기타 방법에 따라 갈락토시다아제 코딩 서열을 포함하는 플라스미드 중에 본 서열을 위치시키거나, 또는 하기 실시예에 나타낸 절차에서 STAB-SD 서열 서열에 대해 고려되는 서열을 치환하고, 본원에 나타낸 STAB-SD 서열을 사용한 구축물로부터의 동일 단백질 생산에 대해, 수득되는 단백질 생산을 비교하여, STAB-SD 단백질로서의 그의 기능에 대해 편리하게 평가할 수 있다. Coomassie blue 로 염색된 SDS-PAGE 겔의 밀도측정 분석으로 측정 시, 야생형 Bs 세포에 비해 약 8 배 적게 Bs 이원성 독소의 생산을 감소시키는 서열은 덜 바람직하다.
VI. 본 발명의 핵산의 어셈블리
프로모터의 구축에 관해 당분야에 상당한 정보가 개발되어 왔다; 이와 관련하여, 숙련자가 강력한 Bt 프로모터의 시그마 인자 결합 부위 및 리보좀 결합 부위 사이의 STAB-SD 서열 배치를 최적화할 때 필요할 수 있는 특정 정보를 제공하기 위해, 하기 논의가 제공된다.
도 1 은 본 발명의 핵산 서열의 예시적 어셈블리를 나타낸다. 본 구현예에서,cyt1A프로모터에는 뉴클레오티드 1 - 537 이 포함된다 (cyt1A유전자가 2 개프로모터 (하나는 BtI 프로모터 및 다른 하나는 BtII 프로모터) 를 포함하므로, 유전자의 프로모터 영역은 때때로 당분야에서 "cyt1A프로모터들" 로 명명된다). 시그마 E-유사 인자 및 시그마 K-유사 인자에 대한 결합 부위를 각각 "SIGMA E" 및 "SIGMA K" 라는 명칭으로 적절한 영역에 걸쳐, 특정 결합 부위를 나타내는 밑줄친 서열 및 "-35" 및 "-10" 이라는 용어와 함께 나타낸다. 뉴클레오티드 726 내지 730 및 2246 내지 2249 에서 "RBS" 라는 글자와 함께 밑줄친 뉴클레오티드는 리보좀 결합 부위를 나타낸다.
538 내지 659 의 밑줄친 뉴클레오티드는cry3A프로모터에서 클로닝된 서열을 나타낸다. 상기 서열은 9 개 뉴클레오티드 STAB-SD 서열을 도입하기 위해 클로닝되었다; 9 개 뉴클레오티드 서열로 클로닝하기가 비교적 더 어려워 더 긴 서열의cry3A프로모터를 사용하였다. 위치 660 에서 시작되는 서열은 코딩 영역이 뒤따르는 코딩 영역의 상류의 이원성 독소 서열의 일부이다 (Baumann 등, J. Bacteriol. 170:2045-2050 (1988) 에 공개된 바와 같음). "+1" 로 표시된 위치에서 개시 코돈 상류의 특정 부분은 편리한 절단 부위의 존재로 인해 간단히 선택되었다. 더 짧거나 더 긴 부분을 사용할 수 있고, 실제로 필요하다면 이원성 독소 유전자의 전체 프로모터 영역을 사용할 수 있다. 그러나 일반적으로, 더 짧은 서열의 사용이 조작의 용이성 뿐만 아니라, 존재하게 될 수 있는 리프레서 (repressor) 서열 등의 우연한 도입을 회피하기 위해서도 바람직하다. 또한 STAB-SD 서열 후에 상이한 서열이 사용되는 경우, 리보좀 결합 부위는 STAB-SD 서열 및 개시 코돈 사이에 놓여야 한다. 바람직하게는, 리보좀 결합 부위는 개시 코돈의약 6 내지 약 10 개 뉴클레오티드 상류에 놓인다. 51.4 kD 및 41.9 kD 의 Bs 이원성 독소 단백질의 개시 및 정지 부위도 또한 나타낸다.
상기 예시적 서열 성분이 결합되는 방식은 상당히 다양할 수 있고, 여전히 고수준의 Bs 이원성 독소를 생산하는데 잘 작용하는 서열을 얻을 수 있다. 상기 서열에서,cry3A서열 유래의 일부 121 개 뉴클레오티드를 STAB-SD 서열의 클로닝에 사용할 수 있다. 이는 클로닝의 용이성을 위해 간단히 수행되었다; 9 개 뉴클레오티드 STAB-SD 서열 (또는 선행 부분에서, 이들의 6, 7, 또는 8 개 연속 뉴클레오티드 서브서열로 설명된 것들) 자체를 도입할 수 있다. 그러나, 클로닝의 용이성을 위해, 보통 STAB-SD 서열을 포함하고, 약 20 내지 약 130 개 뉴클레오티드 길이의 서열을 사용하는 것이 바람직하다. STAB-SD 서열 자체는 개시 코돈의 약 6 내지 약 10 염기 상류여야 하는 RBS 서열 직전의 시그마 인자 결합 부위의 약 10 개 염기 하류의 임의 위치에 놓일 수 있다. 즉, 프로모터의 RBS 가 제거된다면 Bs 이원성 독소 유래의 또다른 RBS 가 개시 코돈의 약 6 내지 약 10 개 염기 상류에 위치해야 한다는 이해 하에, 시그마 인자 결합 부위 하류의 모든 또는 일부 프로모터가 제거될 수 있다. 주지된 바와 같이, 도 1 에 나타낸 서열에서, 위치 660 부터의 서열은 천연 Bs 이원성 독소 유전자 유래의 것이다. 임의의 특정 서열은 실시예에 교시된 분석법에 이를 대체시켜, 이것이 독소 생산에 유해하거나 유익한 효과를 갖는지 여부를 결정하여 용이하게 평가할 수 있다.
VII. 20 KD 샤페론 (CHAPERONE) 형 단백질
본 발명의 방법에서, 숙주 세포는 Bs 이원성 독소의 생산을 증강시키기 위해, 공지된 단백질을 코딩하는 20 kDa 단백질 유전자를 코딩하는 유전자 (Frutos 등, 상기; Visick & Whitely, 상기) 로 형질전환된다. 20 kDa 단백질 유전자는, 예를 들어 바실러스 투린지엔시스의 2 개 아종으로부터 단리 및 서열분석될 수 있다 (Frutos 등, Biochem. Syst. and Ecol. 19: 599-609 (1991)). 20 kDa 단백질의 발현 수준은 20 kDa 단백질 유전자로 형질전환된 세포를 특징으로 한다. 본원 및 국제 특허 공보 WO97/39623 에 기재된 방법 및 서열 정보를 이용하여, 당분야의 숙련자는 20 kDa 단백질 유전자를 단리하여, 숙주 세포의 형질전환용 재조합 발현 벡터의 구축에 사용할 수 있다.
20 kD 단백질 유전자로 형질전환된 숙주 세포는 Bs 이원성 독소의 발현에 수용성이어야 한다. 세포는 Bs 이원성 독소를 발현할 수 있거나, 세포는 외인성 이원성 독소 발현 벡터로 형질전환될 수 있다. 미리 주지된 바와 같이, Bs 이원성 독소의 두 단백질의 서열이 공지되어 있다. 당분야의 숙련자는 본원에 기재된 방법과 함께 상기 서열 정보를 이용하여, 20 kD 단백질을 코딩하는 유전자로 Bs 세포와 같은 숙주 세포의 형질전환용 재조합 벡터를 구축할 수 있다. 편리하게는, 20 kD 단백질용 유전자를 고수준의 Bs 독소 발현용 핵산 서열로서 동일한 플라스미드 상에 배치될 수 있다.
VIII. 핵산 서열 및 벡터
숙주 세포의 형질전환용 재조합 발현 벡터는 일차로, 본원에서 논의되는 바와 같은 구성 폴리뉴클레오티드 서열을 단리하여 제조된다. 이어서, 폴리뉴클레오티드 서열, 예컨대 상기에 논의된 바와 같이 프로모터에 의해 유도되는 Bs 이원성독소를 코딩하는 서열이 접합되어, 숙주 세포의 형질전환에 적합한 재조합 발현 벡터가 생성된다. 재조합 폴리뉴클레오티드의 단리 및 제조 방법은 당분야의 숙련자에게 널리 공지되어 있다. 문헌 [Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual (제 2 판. 1989); Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology (1995)] 에서는 여러 클로닝 실습을 통해 숙련자로 만들기 충분한 정보를 제공하고 있다.
특정 폴리뉴클레오티드를 수득하기 위해 바람직한 하나의 방법은 mRNA 또는 DNA 주형 상에 폴리머라아제 신장 또는 접합과 함께 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머의 사용을 조합한다. 상기 방법, 예컨대 RT, PCR, 또는 LCR 은 목적하는 뉴클레오티드 서열을 증폭시킨다 (미국 특허 4,683,195 및 4,683,202 참고). 절단 엔도뉴클레아제 부위를 프라이머 내로 혼입시킬 수 있다. 증폭된 폴리뉴클레오티드는 정제 및 접합되어 발현 카세트를 형성한다. 천연 유전자 서열의 변형은 시험관 내 돌연변이화 및 적절한 돌연변이를 도입시키기 위해 고안된 프라이머를 이용하는 PCR 과 같은 기법에 의해 도입될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열 단리의 또다른 바람직한 방법은 플라스미드로부터 핵산 절편을 단리하기 위해, 공지된 절단 엔도뉴클레아제 부위를 이용한다. 관심 유전자는 또한 공지된 유전자 서열을 근거로 하는 프라이머를 이용하여, 당업자에 의해 단리될 수 있다.
선택된 단리 폴리뉴클레오티드 서열, 예컨대 상기 논의된 프로모터 서열에 의해 유도되는 Bs 이원성 독소는 "발현 벡터," "클로닝 벡터," 또는 "벡터" 내로 삽입되며, 그 용어는 보통 선택된 숙주 세포 내에서 복제할 수 있는 플라스미드 또는 기타 핵산 분자를 나타낸다. 발현 벡터는 자가복제하거나, 숙주 세포의 게놈 내로 삽입되어 복제할 수 있다. 종종, 하나 이상의 숙주 세포에서 사용가능한, 예컨대 클로닝 및 구축을 위해 에스케리키아 콜라이 (E. coli) 에서, 및 발현을 위해 바실러스 투린지엔시스에서 사용가능한 벡터가 바람직하다. 벡터의 추가 성분에는, 예를 들어 선택 마커, 예컨대 목적 폴리뉴클레오티드 서열로 형질전환된 세포의 검출 및/또는 선택을 허용하는 테트라사이클린 내성 또는 히그로마이신 내성이 포함될 수 있다 (예컨대, 미국 특허 4,704,362 참고). 세포 내로 유전 정보를 전달하기 위해 사용되는 특정 벡터는 또한 특별히 결정적인 것은 아니다. 숙주 세포 중 재조합 단백질의 발현을 위해 사용되는 임의의 적합한 벡터를 사용할 수 있다. 바람직한 벡터는 에스케리키아 콜라이 (E. coli)-바실러스 투린지엔시스 (B. thuringiensis) 셔틀 벡터인 pHT3101 이다 (Lereclus 등, FEMS Microbiol. Lett. 60: 211-218 (1989)).
발현 벡터는 전형적으로 숙주 세포 중에서, 선택된 폴리뉴클레오티드의 발현에 필요한 모든 성분을 포함하는 발현 카세트를 갖는다. 전형적인 발현 카세트에는 선택 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터가 포함된다. Bs 이원성 독소의 발현을 지시하기 위해 사용되는 프로모터는 상기에 기재된 바와 같고, Bs 이원성 독소 단백질의 하나 또는 두 개를 코딩하는 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 프로모터는 이종성 전사 개시 부위부터, 바람직하게는 그 자연적 위치에서 전사 개시 부위로부터의 거리와 거의 같은 거리로 놓인다. 그러나 당분야에 공지된 바와 같이, 상기 거리의 일부 변화는 프로모터 기능의 소실 없이 수반될수 있다.cry11A오페론에 의해 코딩되는 20 kD 단백질의 발현을 위해, 표준 발현 카세트에서 전형적으로 사용되는 것들, 예컨대 β-갈락토시다아제 프로모터를 포함하는, 숙주 세포에서 이종성 유전자의 발현을 유도하기에 적합한 기타 프로모터가 사용될 수 있다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 20 kD 단백질 유전자는cryIAc 유전자의 BtI 및 BtII 프로모터 ("cryIAc 프로모터") 에 작동가능하게 연결되어, 프로모터에 작동가능하게 연결된 이종성 핵산을 생성한다.cryIAc 프로모터는 포자형성을 유도하는 성장 조건 하에서 크게 활성을 나타낸다.
IX. 단백질의 발현
재조합 발현 벡터는 구축 및 단리 후, Bs 이원성 독소의 발현용 숙주 세포를 형질 전환하는데 사용된다. 단백질의 발현용 숙주 세포 내로 유전 물질을 도입하는데 사용되는 특정 절차는 결정적인 것이 아니다. 숙주 세포 내로 외부 폴리뉴클레오티드 서열을 도입하기 위해 널리 공지된 임의 절차를 사용할 수 있다. 전기천공법, 염화칼슘, 염화루비듐, 인산칼슘, DEAE-덱스트란, 또는 기타 물질을 사용하는 트랜스펙션; 미세추진 충격; 리포펙션; 인펙션 (벡터가 감염제인 경우); 및 기타 방법을 포함하는, 숙주 세포의 유형에 따라 다양한 형질전환 방법이 사용된다 (일반적으로 Sambrook 등, 상기; Ausubel 등, 상기를 참고). 일부 구현예에서, 숙주 세포는 [Poncet 등, Appl Environ Microbiol. 63:4413-4420 (1997)] 에 기재된 바와 같이 동종 재조합에 의해 형질전환될 수 있다. 바실러스 투린지엔시스 형질전환의 바람직한 방법은 [Wu 등, Mol. Microbiol. 13: 965-972 (1994)] 에 기재된 바와 같은 전기천공법이다.
Bs 이원성 독소 유전자로의 형질전환용 숙주에는 단백질 발현에 수용성인 임의의 숙주 박테리아 세포, 특히 바실러스 속의 원들이 포함된다. 특히 바람직한 구현예에서, 세포는 Bs 또는 Bt 세포이다. Bs 이원성 독소로 형질전환되는 숙주는 살충제로서 유용한 재조합 박테리아이다. 바실러스 투린지엔시스의 바람직한 아종에는, 예컨대 바실러스 투린지엔시스 아종 쿠르스타키 (kurstaki), 바실러스 투린지엔시스 아종 아이자와이 (aizawai), 바실러스 투린지엔시스 아종 이스라엘렌시스 (israelensis), 및 바실러스 투린지엔시스 아종 테네브리오니스 (tenebrionis) 가 포함된다. 바람직한 균주는 Bti IPS82 이다.
숙주 세포를 Bs 이원성 독소 유전자로 형질전환시킨 후, 독소 발현에 적합한 조건 하에서 숙주 세포를 인큐베이션한다. 전형적으로, 숙주는 살충성 내독소 유전자의 발현 및 포자형성을 촉진하는 조건 하에서 성장할 것이다. 숙주 세포는 당분야의 숙련자에게 공지된 표준 배지 중의 접종물 발효에 필요한 임의 양으로 제조될 수 있다. 배지는, 예를 들어 일반적으로 질소원 및 탄수화물원, 예컨대 글루코오스를 포함할 것이다. 인큐베이션에 적합한 조건에는 15-45℃ 범위, 바람직하게는 30℃ 의 온도 및 적절한 중성 pH 가 포함된다. 인큐베이션은 회분식으로, 전형적으로 3-5 일의 기간 동안 편리하게 수행될 수 있다.
Bt 및 Bs 세포 배양을 위한 다양한 배지가 당분야에 공지되어 있다. 일부의 바람직한 구현예에서, 스톡 숙주 세포 배양물로부터의 접종물은 실시예에 기재된 바와 같이 25 ㎍/ml 농도의 에리트로마이신과 함께 펩톤화 밀크 (1% 펩톤화 밀크[BBL Microbiology Systems], 1% 덱스트로오스, 0.2% 효모 추출물, 1.216 mM MgSO4, 0.072 mM FeSO4, 0.139 mM ZnSO4, 0.118 mM MnSO4) 또는 영양 아가 (BBL Microbiology Systems) 상에서 배양될 수 있다.
Bs 이원성 독소의 증강된 생산은 Bs 이원성 독소 유전자 발현에 수용성인 숙주 세포가 유전자로 형질전환되고, 세포가 적합한 조건 하에서 배양된 후 관찰된다. Bs 이원성 독소의 증강된 생산은 당분야의 숙련자에게 공지된 표준 방법에 의해 관찰될 수 있다. 예를 들어, 살충성 내독소의 부포자 봉입체 (parasporal inclusion) 를 정제하고 (Wu & Federici, Appl. Microbiol. Biotechnol. 42: 697-702 (1995) 참고 (이하에서 "Wu 및 Federici 1995")), 용해된 배양물로부터 원심분리에 의해 회수하거나 현미경으로 검사할 수 있다 (Wu & Federici 1995, 상기 참고). 원심분리에 의해 회수되거나 정제된 부포자 봉입체는 당분야에 공지된 표준 방법, 예를 들어 크로마토그래피, 면역침강, ELISA, 바이오검정, 웨스턴 분석 또는 겔 전기영동을 이용하여 분리될 수 있다 (예컨대, Wu & Federiei 1995, 상기; Ausubel, 상기 참고). 단백질의 양은 염색된 밴드의 폭 및 강도, 밀도측정, 생활성 및 형광도를 포함하는 적합한 수단에 의해 정량된다. 형질전환된 Bt 세포 또는 이들의 비형질전환 상태에서 Bs 이원성 독소를 합성하지 않는 것으로 공지된 기타 세포에 대해, Bs 이원성 독소의 모든 생산은 본 발명의 방법에 의한 증강을 나타내는 것으로 간주된다. Bs 세포가 본 발명의 핵산으로 형질전환되는 경우, 형질전환된 세포에 의해 생성되는 독소의 전량은 유사한 비형질전환 세포와 비교될 수 있다. 독소의 전량은 부포자체 또는 결정 중 Bs 이원성 독소의 양을 나타낸다. 이와는 달리, 대조군 숙주는 형질전환된 숙주와 유전적으로 동일하고, 대조 배지 상에서 배양된다. 증강은 Bs 이원성 독소 생산에 있어서, 임의의 통계학적으로 유의미한 증가이다. 바람직한 구현예에서, 부포자체는 용해된 배양물로부터의 원심분리에 의해 단리되어, Coomassie blue 로 염색된 SDS-PAGE 겔에 의해 검사된다.
실시예 1
Bti 프로모터, STAB-SD 서열 및 독소 코딩 서열을 이용하여 Bti 에서 생산된 Bs 이원성 독소의 발현 수준
바실러스 스패리쿠스 2362 이원성 독소 유전자를cyt1A프로모터 및 플라스미드 pHT3101 내에 위치한 STAB-SD 서열을 이용하여 바실러스 투린지엔시스 아종 이스라엘렌시스 (Bti) 의 무결정성 균주 (4Q7) 내로 도입하였다. 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)에 의해 생성된 겔의 농도 스캐닝으로 평가했을 때, 구축물은 동일한 배지 상에서 키운 부모 (야생형) 바실러스 스패리쿠스 균주를 이용하여 수득된 것보다 배양 배지의 단위 당 15 배 이상 많은 이원성 독소를 생산하였다.
Bs 2362 이원성 독소 유전자 오페론의 발현을 유도하기 위해cyt1A프로모터 및 STAB-SD 서열을 이용하여 수득된 수율 증가
균주 이원성 독소의 증가 Bti 독소의 감소
Bs 2362 (야생형) 1 -
Bti IPS82 (야생형) - 1
Bti4Q7/Bs 이원성 독소 > 15 ×
Bti IPS82 + Bs 이원성 독소 > 20 × .15 - .35
실시예 2
Bs 이원성 독소를 발현하도록 조작된 비독성 Bti의 독성
Bs 2362 이원성 독소를 생산하기 위해 형질전환된 무결정성 4Q7 Bti 균주의 독성을 쿨렉스 퀸쿠에파시아투스 (Culex quinquefasciatus) 의 4령 유충 ("L4")에서 시험하고, 동일한 배지상에서 키운 야생형 Bs 2362 균주와 비교하였다 (Bti 균주 4Q7 은 정상에서는 Bs 또는 Bti 독소를 생산하지 않는다). LC50은 시험 동안 시료 내에 존재하는 유충의 50% 를 죽이는데 필요한 독소의 양이다.
하기 표 2에 보여준 바와 같이, 집모기의 4 령 유충의 50%를 죽이는데 필요한 야생형 Bs2362의 양 ("LC50")은 15.0 ng/ml 이었다. Bs 독소를 발현하기 위해 본 발명의 핵산에 의해 형질전환된 4Q7 Bti 균주의 LC50가 1.4 이거나, 또는 변경되지 않은 Bs의 것보다 대략 10 배 더 좋은 독성을 가졌다.
실시예 3
Bs 이원성 독소를 발현하도록 조작된 Bti의 독성
Bs2362 이원성 독소를 생산하는 실시예 1 에 기재된 플라스미드를 이용하여 바실러스 투린지엔시스 아종 이스라엘렌시스의 형질전환으로 부모 균주 (Bs 또는 Bti)와 비교하여 집모기 종에 대해 10 배 이상으로 독성이 증가하였다.
Bti IPS82 는 시판되는 바이오농약으로서 사용되는 Bti 균주이다. 표 2 로부터 알 수 있는 바와 같이, 집모기의 4 령유충 ("L4")의 50%를 죽이는데 필요한 상기 균주의 양 ("LC50")은 19.5 ng/ml 이었다. 야생형 Bs 균주 2362 의 LC50은 15 ng/ml 이었다. Bs 독소를 발현하기 위해 본 발명의 핵산에 의해 형질전환된 Bti IPS82 균주는 LC50이 1.5 이거나, 또는 변경되지 않은 Bs의 것보다 대략 13 배 더 좋은 독성을 가졌다.
L4쿨렉스 퀸쿠에파시아투스에 대한 Bti/Bs2362 재조합체의 독성
균주 LC50(ng/ml) 비율BtiBti/Bs 비율BsBti/Bs
Bti IPS82 19.5 1.0 -
Bs 2362 15.0 - 1.0
Bti4Q7/Bs 이원성 독소 1.4 - 10.0
Bti IPS82 +Bs 이원성 독소 1.5 13.0 -
실시예 4
실시예 1-3 에 사용된 재료 및 방법
A. 박테리아 균주, 유전자, 플라스미드 및 형질전환
바실러스 스패리쿠스 균주 2362 를 Abbott Laboratories (North Chicago, IL) 로부터 친절하게 제공된 분말 제제로부터 수득하였다. 에스케리키아 콜라이-바실러스 투린지엔시스 셔틀 발현 벡터 pHT3103 (Lereclus 등, FEMS Microbiol. Lett. 51:211-7 (1989)) 을 사용하여 에스케리키아 콜라이 DH5α내에 플라스미드 구축물 (pPHSP-1)을 제조하여 증폭하였다. pPHSP-1 구축물은 오하이오 주립 대학교 (Columbus, OH)에 있는 바실러스 스톡 센터 (Bacillus stock Center) 로부터 수득된 바실러스 투린지엔시스 아종 이스라엘렌시스의 무결정성 균주 4Q7 또는 바실러스 투린지엔시스 아종 이스라엘렌시스 IPS82 (Abbott Laboratories) 에서 발현되었다. cyt1A 프로모터 및 STAB-SD 서열을 갖는 660 bp 절편을 포함하는 변형된 pHT3101 기재 벡터 (pSTAB-SD) (Agaisse and Lereclus, Mol. Microbiol., 20:633-643 (1996)) 는 이전에 기재되었다 (Park 등, FEMS Microbiol Lett 181:319-327 (1999)). 플라스미드를 QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen Inc.)를 이용하여 정제하였다. 바실러스 균주를 [Park 등, App Environ. Microbiol 64:3932-3938 (1998)]에 기재된 전기천공법에 의해 형질전환하였다.
B. 바실러스 스패리쿠스 살충 (entomocidal) 단백질을 코딩하는 유전자의 PCR 증폭
미정제 플라스미드 제제를 알카리 용해법 (Sambrook 등, 1989) 을 이용하여 바실러스 스패리쿠스 2362 로부터 제조하였다. 바실러스 스패리쿠스의 54.1 kDa 단백질 및 41.9 kDA 살충 단백질을 코딩하는 유전자 (Baumann 등, J. Bacteriol. 170:2045- 2050 (1988), GenBank M20390) 를 Vent (Exo+) DNA 중합효소 (Biolabs) 및 프라이머 BSP-1 (5'-aactgcagCTTGTCAACATGTGAAGATTAAAGGTAACTTTCAG-3' (서열 번호 10)) 및 BSP-2 (5'-aactgcagCCAAACAACAACAGTTTACATTCGAGTGTAAAAGTTC-3' (서열 번호 11)) (Genosys) 를 이용하여 PCR 에 의해 수득하였다. 3.4 kbp PCR 생성물을PstI 으로 절단하고, pHT3101 내의 동일한 자리에 클로닝하여, pHBS 를 생성하였다. pHBS 내의 3.0 kbpHpaI-PstI 절편을 pSTAB-SD 내의 채워진XbaI 및PstI자리에 클로닝하여 pPHSP-1 을 생성하였다.
C. 박테리아 균주의 생장
균주 바실러스 투린지엔시스 아종 이스라엘렌시스 4Q7/pPHSP-1 및 바실러스 투린지엔시스 아종 이스라엘렌시스 IPS82/pPHSP-1 을 한천 배지 (BBL Microhiology Systems) 또는 펩톤화 밀크 (peptonized milk) (1% 펩톤화 밀크 [BBL Microbiology Systems], 1% 덱스트로스, 0.2% 효모 추출물, 1.216 mM MgSO4, 0.072 mM FeSO4, 0.139 mM ZnSO4, 0.118 mM MnSO4) 에서 25 ㎍/ml 농도의 에리트로마이신과 함께 배양했다. 곤충 바이오검정을 위해, 바실러스 투린지엔시스 아종 이스라엘렌시스 IPS82/pPHSP-1을 28℃, 250 rpm/분으로 설정된 진탕 배양기에서 6 일 동안 에리트로마이신 (25 ㎍/ml) 의 존재 하에 25 ml 의 펩톤화 밀크에서 키웠고, 그 시간 동안 세포의 98% 이상이 발아하여 용해되었다. 포자 및 결정을 4℃, 6,000 ×g 에서 15 분 동안 원심분리에 의해 수집하였다. 펠렛을 물에 2 회 세척하고, 진공 체임버에서 건조시켰다.
D. 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)
펩톤화 밀크에서 6 일간 배양 후에, 1 ml 의 용해된 배양액을 수집하고, 10,000 ×g 에서 5 분 동안 원심분리하였다. 배지를 버리고, 150 ㎕ 의 TE 완충액 (10 mM Tris-Cl, pH 7.5, 1 mM EDTA) 및 150 ㎕ 의 2 ×시료 완충액 (Laemmli, 1970) 을 첨가하였다. 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분획화하였다 (Laemmli, 1970).
E. 바이오검정
바이오검정을 위해, 20 개 군의 초기 4 령 유충을 237 ml의 플라스틱 컵에 담긴 100 ml의 탈이온수에 동결건조한 포자/결정 분말의 농도 범위에 노출시켰다. 7 내지 9 개의 상이한 농도의 분말을 상이한 5 일에서 반복했다.
F. 현미경 검사
발아하는 배양물을 100 ×오일 유침 대물렌즈를 이용하여 Zeiss Photomicroscope III 를 이용한 광학 현미경 검사에 의해 모니터링하였다. 투과전자현미경 검사를 위해, 펩톤화 밀크 배양물에서 발아한 세포를 용해 직전에 수집하고, 2 시간 동안 3% 인산염 완충 글루타르알데히드 및 0.25% 수크로스에서 고정하고, 1% OsO4에서 후고정하고, 에탄올-프로필렌 옥시드에서 탈수하고, Epon-Araldite 에 끼워 넣었다 (Ibarra and Federici, J. Bacteriol. 165:527-533 (1986)). 발아된 세포의 초박형 섹션을 검사하고, 75 kV 의 가속 전압에서 작동하는 Hitachi 600 전자 현미경에서 촬영하였다.
실시예 5
Cyt1A 단백질은, 상기 독소에 매우 내성인 모기에 대한 BS 독소에 대한 감수성을 회복시킨다.
A. 재료 및 방법
박테리아 균주 및 독소
본 연구에서 사용된 독소 제제는 바실러스 스패리쿠스 2362 및 Cyt1Aa 만을 생산하는 바실러스 투린지엔시스 아종 이스라엘렌시스의 재조합 균주의 용해된 배양물의 동결건조된 분말이었다 (Wu and Federici, J. Bacteriol. 175:5276-5280 (1993)). 상기 분말은 동결건조에서 생기는 세포 찌꺼기 및 배지 고형물과 함께 포자 및 결정 (즉, 부포자체 (parasporal body)) 을 포함하였다. 시험한 특정 분말은 (1) Abbott Laboratories (North Chicago, IL) 의 공업용 분말로서 수득된 바실러스 스패리쿠스 균주 2362; (2) 상기 언급한 BTI 의 재조합 균주인 Cyt1Aa; 및 (3) 임의의 내독소를 생산하지 않는 상기 아종의 무결정성 균주인 BTI 4Q7 이었다. 상기 균주는 바실러스 스톡 센터 (오하이오 주립 대학교, Columbus, OH) 로부터 수득하고, 대조군 중의 하나로서 사용하였다. 정제된 Cyt1A 결정의 동결건조된 분말 (Wu 및 Federici, 이하 동일) 을 또한 사용하였다.
독소 분말 생산 및 저장
다양한 독소를 생산하는 박테리아 균주를 전술한 고체 또는 액체 배지에서 키웠다 (Wirth 등, Proc Natl. Acad. Sci USA, 94:10536-10540 (1997), Park 등, Appl Environ Miorobiol. 64:3932-3938 (1998)). 발아된 세포를 증류수에서 세척하고, 침전시키고, 생성된 펠렛을 동결건조하였다. 모기 선별 및 바이오검정을 위해, 분말의 스톡 현탁액을 증류수에서 제조하고, 약 25 개의 유리 구슬의 보조로 균질화하였다. 스톡을 매월 제조하고, 10 배 연속 희석액을 매주 제조하였다. 모든 스톡 및 희석액을 사용하지 않을 때는 -20℃에서 동결하였다.
모기 균주
쿨렉스 퀸쿠에파시아투스의 두 종류의 균주를 사용하였다; 바실러스 스패리쿠스 2362에 대한 내성 균주인 BS-R, 및 선별되지 않은 비내성 균주인 Syn-P.BS-R 은 1992년 이후로 바실러스 스패리쿠스 2362 을 이용하여 선별되었고, 감수성 참고 (reference) 균주인 Syn-P의 50% 를 죽이는 농도보다 149,000 배 더 높은 농도인 1000 ㎍/ml 농도에 48 시간 노출해도 통상 생존한다. Syn-P 는 남부 캘리포니아의 3 군데의 상이한 지리학적 위치로부터 1995년에 수집된 유충 개체군으로부터 유래된 쿨렉스 퀸쿠에파시아투스의 "합성" 집단이다. 상기 콜로니는 바실러스 스패리쿠스에 노출시키지 않고 실험실내에서 유지되었다.
선발 및 바이오검정 절차
전술한 바와 같이, BS-R 균주는 1992 년 이후로 바실러스 스패리쿠스 2362 를 이용한 선별압 하에 유지되었다. 선별은 약 1,000 마리의 초기 4 령 군을 48-96 시간 동안 약 1 L 의 탈이온수 중에 에나멜화 금속 팬에서 100-120㎍/ml 범위의 바실러스 스패리쿠스의 농도에 노출시키는 것으로 구성되었다. 선발하의 유충의 평균 치사율은 선별 당 10% 이하이었고, 생존자는 콜로니를 지속시키기 위해 사용되었다.
바이오검정을 위해, 20 마리의 초기 4 령 군을 237 ml 플라스틱 컵에 담긴 100 ml의 탈이온수 중에 동결건조된 포자/결정 분말의 농도의 범위에 노출시켰다. 7 내지 9 개의 상이한 농도의 분말을 상이한 5 일에서 반복하여, 48 시간 후에 2 내지 98%의 치사율을 초래했다. Cyt1A 및 바실러스 스패리쿠스 2362의 상이한 조합을 시험한 바이오검정에 대해, 상기 독소의 상이한 비율은 박테리아 균주의 동결건조된 분말의 중량 기준이다.
정제된 Cyt1A 결정의 양이 제한되었기 때문에, 상기 분말을 이용한 바이오검정은 30 ml 플라스틱 컵의 10 ml의 탈이온수 중에 담긴 10 마리의 초기 4 령 군을 이용하였고, 상이한 2-3 일에서 반복했다. 바실러스 스패리쿠스 2362 공업용 분말 및 Cyt1A 정제된 결정을 10:1 비율 (10 부의 바실러스 스패리쿠스 2362 : 1 부의 Cyt1A 결정) 로 조합하는 바이오검정은 바실러스 스패리쿠스 2362 및 Cyt1A 의 동결건조된 분말의 중량을 기준으로 했다.
모든 데이타를 PC 용 프로그램을 이용하여 프로빗 분석을 하였다. 중복되는 신뢰 한계를 갖는 투여-반응치는 현저히 상이하지 않은 것으로 간주되었다. 내성비는 BS-R 균주에 대한 각각의 치사 농도치를 Syn-P 균주의 것으로 나눔으로써 계산되었다. 신뢰 한계가 숫자 1 을 포함하는 내성비는 유의하지 않은 것으로 고려되었다.
상승 효과의 평가
바실러스 스패리쿠스 2362 및 Cyt1A 사이의 상승 작용을 [Tabashnik, Appl Environ Entomol 58:3343-3346 (1992)]의 방법을 이용하여 평가하였다. Cyt1A 및 바실러스 스패리쿠스 2362 의 상이한 혼합물에 대한 이론적인 치사 농도치를 상기 독소에 대한 개개의 조화 중량 평균치로부터 계산하였다. 바실러스 스패리쿠스 2362 분말은 시험한 임의의 농도에서도 BS-R 균주에 대해 무독성이었기 때문에, Cyt1A 및 바실러스 스패리쿠스 2362의 조합의 이론적인 독성의 계산은 상기 균주에 대한 Cyt1A 단독의 독성 및 비율을 기준으로 했다. 관찰된 치사 농도치에 대한 이론적인 치사 농도치의 비로서 정의되는 상승 인자 (SF) 는 바실러스 스패리쿠스 2362 및 Cyt1A 균주의 조합 뿐만 아니라, 바실러스 스패리쿠스 2362 및 정제된Cyt1A 결정의 조합에 대해 측정되었다. 비율이 1 을 초과하는 경우, 독성이 개개의 누적된 독성으로부터 예상되는 값을 초과했기 때문에 독소 상호작용은 상승효과적인 것으로 고려되었다. 비율이 1 미만인 경우에, 상호작용은 길항적인 것으로 고려되었고, 1 의 비율은 값이 누적된 것을 나타냈다.
B. 결과
내성 및 감수성 모기 균주에 대해 표준 조건 하에 독소 기준치를 측정하기 위한 바이오검정에서, 쿨렉스 퀸쿠에파시아투스 (Culex quinquefasciatus) 의 내성 균주인 BS-R 를 바실러스 스패리쿠스 2362 1000 ㎍/ml 에 노출시켜도 치사를 초래하지 않았다. 상기 농도는 감수성 균주인 Syn-P 에 대해 수득된 LC50(0.0067 ㎍/ml) 보다 149,000 배 높았다. 바이오검정을 100 ml 중에 20 마리의 유충을 이용하는 것보다 컵 당 10 마리의 유충을 이용하여 10 ml의 물에서 수행할 경우에, BS-R에 대해서는 어떠한 치사율도 수득되지 않았으나, BS 2362의 독성은 Syn-P 에 대해서는 낮았다 (LC50, 0.032 ㎍/ml). 유충 밀도를 증가시키는 것은 낮은 밀도에서 관찰된 동일한 수준의 치사율을 유도하기 위해 소량의Bti독소를 필요로 하는 것으로 이전에 나타났다 (Aly 등 1988). 더 작은 바이오검정 시스템을 이용한 BS-R 및 Syn-P 의 감수성 평가 차이는 31,000 배였다.
Cyt1A 박테리아 균주는 표준 바이오검정 시스템에서 Syn-P (LC50, 11.7 ㎍/ml) 보다 BS-R 균주 (LC50, 32.5 ㎍/ml) 에 대해 약간 덜 독성이었다. 그러나, 더 작은 바이오검정 시스템에서 Cyt1A 결정을 이용한 시험에서, BS-R 및 Syn-P 사이에 감수성의 차이 (LC50, 약 20 ㎍/ml) 는 관찰되지 않았다.
바실러스 스패리쿠스 2362 제제에 Cyt1A 를 첨가하는 것은 쿨렉스 퀸쿠에파시아투스 (Culex quinquefasciatus) 균주에 내성인 BS-R 에 대한 이의 독성의 대부분을 회복하였다. 10:1 인 바실러스 스패리쿠스 2362 대(:) Cyt1A 의 비율은 내성 및 감수성 모기 균주 모두에 대해 매우 독성이었다. 상기 조합에 대한 독성 수준은 LC95값이 각각 0.442 및 36.6 ㎍/ml 로서, BS-R 보다 Syn-P 에 대해 더 높았고, BS-R 에 대한 내성비 (LC95)는 82.9 였다. 5:1 비율은 Syn-P 및 BS-R 에 대해 더욱 독성이었고, LC95수준에서 내성비는 34.4배 감소하였다. 3:1 인 바실러스 스패리쿠스 2362 : Cyt1A 의 비율에서, 혼합물은 BS-R 에 대해 현저하게 더욱 독성 (LC50, 1.99 ㎍/ml) 이었고, 내성비는 LC95수준에서 15.4 배로 감소하였다. BS-R 에 대한 1:1 비율의 독성은 3:1의 독성비와는 현저하게 상이하지는 않았다. 전체적으로, Cyt1A 에 대한 바실러스 스패리쿠스 2362 의 비율이 증가할 때, 독성은 내성 및 감수성 모기 균주 모두에 대해 증가하였다. 그러나, BS-R 에 대한 LC95값에서 내성비는 1:3, 1:5 및 1:10의 비율에 대해 미미한 수준으로 감소하였는데, 여기에서 Cyt1A 가 주요 성분이었다.
상기 조합에 대한 SF의 계산값은 BS-R 균주에 대한 Cyt1A 및 바실러스 스패리쿠스 2362 사이의 현저한 상승효과를 나타냈으나, Syn-P 에 대해서는 그렇지 않다는 것을 나타냈다. SF 값은 BS-R 에 대해 LC95수준에서 10-137의 범위였다.상승효과의 최고 수준은 Cyt1A 가 가장 낮은 비율 (10:1, 5:1, 3:1) 로 존재하는 조합에서 관찰되었다. 상기 조합은 1:10, 1:5 및 1:3 의 비율의 LC95수준에서 Syn-P 에 대해 길항적이었고, 1:1, 3:1, 5:1 및 10:1 의 비율에서는 누적적 또는 약간 상승효과적었는데, 즉, 바실러스 스패리쿠스가 우세한 성분이 되었다.
10:1 의 비율로 정제된 Cyt1A 결정과 조합된 바실러스 스패리쿠스 2362 를 이용한 바이오검정으로, 상기 조합이 BS-R (LC95, 4.96 ㎍/ml) 및 Syn-P (LC95, 2.37 ㎍/ml) 모두에 대해 매우 독성인 것으로 증명되었다. BS-R 균주가 혼합물에 대해 약간 덜 독성이었지만, 독성 수준은 현저히 상이하지는 않았다. 중요하게, 278의 높은 SF 값을 갖는 상기 조합에 대해 BS-R 균주에 대해서는 어떠한 내성도 검출되지 않았다.
C. 고찰
Cyt1A 와 BS 2362 의 조합은 쿨렉스 퀸쿠에파시아투스 (Culex quinquefasciatus) 의 매우 내성인 균주에 대해 후자의 독성을 회복시켰다. 더욱이, Cyt1A 결정의 치사농도 이하를 이용하여 독성을 완전히 회복할 수 있었으므로, BS-R 모기 균주에서 바실러스 스패리쿠스에 대한 내성을 억제할 수 있었다. 내성 모기 집단에 대해 관찰된 높은 수준의 활성과 대조적으로, 비내성 참고 균주인 Syn-P 에 대한 상기 동일한 혼합물에 대해서는 활성이 거의 증진되지 않았다.
내성 모기에 대한 바실러스 스패리쿠스 2362 의 높은 독성을 회복시키기 위한 낮은 농도의 Cyt1A 의 능력은 집모기 개체군의 제어에 대한 실질적인 의미를 가지며, 이의 작용 방식에 대한 이해를 제공한다. 바실러스 스패리쿠스에 기초한 박테리아 유충살충제를 수 개 나라에서 사용하였고, 쿨렉스 퀸쿠에파시아투스의 야외 개체군에서의 내성은 이미 프랑스, 브라질 및 인도에서 보고되었다. 우리의 연구 결과는 바실러스 스패리쿠스 유충살충제에 1:10 의 낮은 비율로 Cyt1A 를 첨가하는 것은 쿨렉스 퀸쿠에파시아투스의 심한 내성 집단에 대해서도 독성의 대부분을 회복한다는 것을 나타낸다. 그러므로, Cyt1A 는 바실러스 스패리쿠스 내성을 다루는 실질적인 도구를 제공한다. 더욱이, 바실러스 스패리쿠스 제제에 소량의 Cyt1A 를 첨가하는 것은 아직 발생되지 않은 모기 개체군에서 내성을 지연시킬 수 있다.
다른 연구자들은 바실러스 투린지엔시스 아종 메델린 (medellin) 과 상이한 Cyt 단백질인 Cyt1Ab 가 쿨렉스 피피엔스 (Cx. pipiens) 에서 큰 독소 결정을 생산하는 상기 박테리아의 모기살충 균주인 바실러스 스패리쿠스 2297 에 대한 내성을 억제할 수 있다는 것을 보여주었다 (Thiery 등, 1998). 그러나, 바실러스 스패리쿠스 2297 에 대한 Cyt1Ab 의 내성의 억제는 바실러스 스패리쿠스에 대한 Cyt1A 의 내성의 억제보다 훨씬 덜 효과적이었다. 바실러스 스패리쿠스 2297에 대한 내성을 억제하는 Cyt1Ab 의 감소된 능력은, Cyt1A 에 비해 5 배 낮은 쿨렉스 피피엔스에 대한 상기 Cyt 독소의 독성에 기인한 것일 수 있다 (Thiery 등, Appl Environ Microbiol 63:468-473 (1997)).
Cyt1A 가 바실러스 스패리쿠스 2362 의 독성을 회복시키는 방법은 공지되어 있지 않다. 그러나, 쿨렉스 퀸쿠에파시아투스의 본 BS-R 균주에서의 내성 기작및 Cyt1A 의 결합 성질에 대한 선행 연구는 Cyt1A 가 미세융모막내로 독소의 결합 및 삽입을 도운다는 것을 제안한다. 쿨렉스 퀸쿠에파시아투스의 본 내성 균주는 바실러스 스패리쿠스 2362 독소에 대한 기능성 수용체가 없으므로, 중장 미세융모에 효과적으로 결합할 수 없다. Cyt1A 의 연구는 이것이 지질 부분에 결합함으로써 막을 교란하고, 또한 Cry 독소에 결합한다는 것을 보여주었다. 더욱이, BTI Cry 독소의 존재하에, Cyt1A 는 모기 유충의 위 맹낭 (gastric caeca) 및 후 중장에서 세포의 미세융모에 결합한다. 상기 관찰은 바실러스 스패리쿠스 독성을 회복하는 몇 가지 기작을 제안한다. Cyt1A 및 바실러스 스패리쿠스 독소는 용해 후에 함께 결합할 수 있고, 이어서 Cyt1A 의 친유성 성질에 기인하여 복합체로서 막 내로 삽입할 수 있다. 또 다른 가능성은 바실러스 스패리쿠스 독소가 Cyt1A 에 결합한 후에 막에 먼저 결합하고, 막 내로 삽입한다는 것이다. 결국, Cyt1A 는 바실러스 스패리쿠스 독소가 원래의 표적에 접근을 허용하도록 하는 손상을 야기하는 막을 투과할 수 있다.
Cyt1A 및 바실러스 스패리쿠스 2362 의 조합을 이용하여 수득된 상승효과는 또한 Cyt1A가 모기 미세융모막으로의 결합에서 다른 단백질 독소, 특히 효과적으로 결합하지 않는 것들을 보조함으로써 독성을 증진시킨다는 부가적인 증거를 제공한다. 이전의 연구에서 우리는 Cyt1A 가 내성 모기에 대한 바실러스 투린지엔시스 의 모기살충 균주로부터 Cry4 및 Cryl1 독소의 효과를 상승시킬 수 있다는 것을 증명하였다. 그러나, 비내성 모기에서의 상승효과는 단지 BTI의 Cry4 및 Cry11A 독소에 대해 관찰되었으나, Cry11A 보다 훨씬 더 독성인 바실러스 투린지엔시스 아종제가테산 (jegathesan) 유래의 Cryl1B 독소에 대해서는 관찰되지 않았다. 상승효과의 유사한 패턴이 현재의 연구에서 관찰되었는데, 여기에서 Cyt1A 는 내성 BS-R 균주에 대한 바실러스 스패리쿠스 2362 의 독성에 대해 상승효과를 나타내지만, 감수성 Syn-P 균주에 대해서는 그렇지 않았다. 상기 인용한 이전의 연구에서 수득된 것과 함께 상기 결과의 의미는 Cry11B 또는 바실러스 스패리쿠스 2362 이원성 독소와 같은 매우 독성이거나 또는 높은 결합 친화성을 가지는 독소는 Cyt1A 에 의한 보조 결합으로부터 거의 가치를 수득하지 못한다는 것이다. 그러나, 독소 수용체가 내성을 통해 변성되거나 상실될 경우에, 미세융모막에 결합하고, 교란시키는 Cyt1A 의 능력은, 막 내로 삽입하여 독성을 발하는 상기 독소의 능력을 회복시킨다. Cyt1A 및 바실러스 스패리쿠스 독소 모두 모기 중장 루멘에서 용해될 때, 이들은 루멘뿐만 아니라 미세융모막 표면에서 용해 후에 즉시 결합될 수 있다. 상기 결과의 의미는, Cyt1A 및 기타 Cyt 단백질이 비 Cyt 단백질 독소의 살충 스펙트럼을 다른 곤충 종으로 확장할 수 있다는 것이다.
실시예 6
6-머 폴리퓨린 서열 및 탠덤 STAB-SD 서열의 용도
전체 길이 STAB-SD 서열보다 짧은 폴리퓨린 서열의 단백질 생산을 증가시키는 능력을 개발하였다. 상기 STAB-SD 서열에 관한 부분에서 언급한 바와 같이,유전자의 비번역 부위의 STAB-SD 서열은 5' 엔도리보뉴클레아제의 작용으로부터 mRNA를 보호함으로써 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 생산을 증가시키는 것으로 믿어진다. STAB-SD 서열로 규명되는 경향이 있는 폴리퓨린 서열은 16S rRNA의 3' 말단에서 폴리피리미딘 서열과 염기쌍을 이루는 것으로 또한 믿어진다.
cry3A의 전체 길이 9-머 STAB-SD 서열, GAAAGGAGG (서열 번호 1)로 출발하여, 두 개의 6-머 서열을 생성하였다: "폴리퓨린 서열-I (PPS-I)" 로 명명되는 AGGAGG (서열 번호 12, STAB-SD 서열의 최종 6 개의 뉴클레오티드로 구성됨) 및 PPS-III 로 명명되는 GAAAGG (서열 번호 13, STAB-SD 서열의 최초 6 개의 뉴클레오티드로 구성됨). 각각의 PPS 를cyt1A유전자의 Bt 프로모터를 갖는 구축물 내에 위치시키고, 5' 안정화제로서의 각각의 PPS 의 효율을 리포터로서cry3A를 이용하여 측정하였다. 이중 STAB-SD 서열을 또한 시험하였다.
일련의 구축물을 제조하여 일부 퓨린을 피리미딘으로 변화시키기 위해 폴리퓨린 서열을 변성시키는 PPS-I, PPS-III 의 단백질 생산에 관한 효과, 다중 STAB-SD 서열을 가지는 효과, 및 다중 STAB-SD 서열을 상이한 거리로 분리시키는 효과를 시험하였다. 모든 다른 성분 (즉, 상류 부위, UTR 부위, 스템-루프 구조 및 코딩 부위) 은 모든 구축물에서 동일하였다.
pCI-10 은 단지 폴리퓨린 서열 또는 다른 안정화 서열이 없는 BtI 프로모터를 포함하였다. pCI-20은 BtI 프로모터 및 PPS-I을 포함하였다. pCI-21에서, PPS-I은 5'-AGGAGG-3' 에서 서열 5'-ATTATT-3' 으로 변형되어, 더 이상 폴리퓨린 서열을 포함하지 않았다. pCI-30에서, PPS-I의 3' 상류 뉴클레오티드는 5'-TTT-3'에서 5'-GAA-3'로 변형되어, 6-머가 천연 STAB-SD 서열로 되돌려졌다. 그러므로, pCI-20 내의 PPS-I (5'-TTTAGGAGG-3') 을 pCI-30 내의 STAB-SD (5'-GAAAGGAGG-3')로 변화시켰다. pCIII-10 은 이중 Bt 프로모터를 포함하나, PPS 서열을 포함하지 않는 반면, pCIII-20 은 이중 Bt 프로모터 및 PPS-III 를 포함하였다. pCI-50 은 8 개의 뉴클레오티드에 의해 분리된 두 개의 STAB-SD 서열을 포함하였다. pCI-60 은 또한 두 개의 STAB-SD 서열을 포함하나, 이 구축물에서, 이들은 33 개의 뉴클레오티드에 의해 분리되었다.
시험한 구축물의 일부의 Cry3A 단백질 생산의 상대적인 양은 하기에 설명된다:
pCI-10 (BtI 프로모터): 10%
pCI-20 (BtI 프로모터+ PPS-I): 100% (표준 물질로서 사용됨)
pCI-21 (BtI 프로모터 + 폴리퓨린 서열이 없는 PPS-I): 7%
pCIII-10 (이중 Bt 프로모터, PPS 없음): 14%
pCIII-20 (이중 Bt 프로모터 + PPS-III): 37%
pCI-30 (BtI 프로모터 + STAB-SD): 162%
pCI-50 (BtI 프로모터+ 8 개의 뉴클레오티드에 의해 분리된 이중 STAB-SD): 198%
pCI-60 (BtI 프로모터 + 33 개의 뉴클레오티드에 의해 분리된 이중 STAB-SD): 334%
그리하여, PPS-I 및 PPS-III (9-머 STAB-SD 서열의 최초 6 개 뉴클레오티드및 동일한 서열의 최종 6 개 뉴클레오티드의 인접한 6-머) 양자는 상기 서열이 없는 구축물로부터 달성된 것보다 더욱 많은 단백질을 발현하였다. 전체 길이 STAB-SD 서열은 현저하게 나은 결과를 제공하였다. 또한, 33 개의 뉴클레오티드에 의해 분리된 이중 STAB-SD 서열이 단일 STAB-SD 서열을 갖는 구축물의 단백질 생산의 대략 두배를 초래하면서, 이중-STAB-SD 서열 모두 더욱 높은 수준의 단백질을 생산하였다. 이론에 구속되기를 바라지 않으면서, pCI-50 및 pCI-60 구축물에 의해 나타난 상이한 단백질 발현량은, 30S 리보좀 서브유닛의 전체 길이가 약 30 뉴클레오티드인 사실에 기인할 수 있다. 이것은 약 30 이상의 뉴클레오티드에 의해 분리된 STAB-SD 서열로 하여금 동시에 두 개의 30S 서브유닛과 상호작용하게 할 수 있다.
각각의 개개의 공보 또는 특허출원이 참고 문헌으로서 구체적으로, 개별적으로 포함되는 것으로 나타난 것처럼, 상기 명세서에 인용된 모든 공보 및 특허출원은 본원에 참고 문헌으로 포함된다.
상기 발명이 이해의 명료를 목적으로 예시 및 실시예를 통해 상세히 기재되었지만, 첨부된 청구범위의 의도 또는 범주를 벗어나지 않으면서도 본 발명에 특정 변화 및 변형이 행해질 수 있다는 것이, 본 발명의 교시의 면에서 당업자에게 이의없이 명백할 것이다.

Claims (100)

  1. 하기를 순서대로 포함하는 핵산 서열:
    (a) BtI 프로모터, BtII 프로모터, 및 BtI 및 BtII 프로모터의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 바실러스 투린지엔시스 (Bacillus thuringiensis) 프로모터,
    (b) 박테리아 STAB-SD 서열의 6 개 이상의 인접하는 뉴클레오티드,
    (c) 리보좀 결합 부위, 및
    (d) 바실러스 스패리쿠스 (B. sphaericus) 이원성 독소의 41.9 kD 독소 단백질 (서열 번호 9) 과 80% 이상의 서열 동일성을 가지며, 그의 독성이 서열 번호 9 의 41.9 kD 독소 단백질의 50% 이상인 제 1 폴리펩티드를 코딩하는 서열.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 제 1 폴리펩티드가 서열 번호 9 와 90% 이상의 서열 동일성을 가지며, 그의 독성이 서열 번호 9 의 41.9 kD 독소 단백질의 50% 이상인 핵산 서열.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 제 1 폴리펩티드가 서열 번호 9 의 서열을 갖는 핵산 서열.
  4. 제 1 항에 있어서, (d) 원의 서열이, 바실러스 스패리쿠스 이원성 독소의51.4 kD 단백질 (서열 번호 8) 과 80% 이상의 서열 동일성을 가지며, 서열 번호 9 의 41.9 kD 독소 단백질에 대한 결합 도메인으로서 기능하는 제 2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 제 2 폴리펩티드가 서열 번호 8 과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열.
  6. 제 4 항에 있어서, 상기 제 2 폴리펩티드가 서열 번호 8 의 서열을 갖는 핵산 서열.
  7. 제 1 항에 있어서, 박테리아 STAB-SD 서열의 6 개 이상의 인접하는 뉴클레오티드가 9 개의 뉴클레오티드인 박테리아 STAB-SD 서열인 핵산 서열.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 9 개의 뉴클레오티드인 박테리아 STAB-SD 서열이 GAAAGGAGG (서열 번호 1), GAAGGGGGG (서열 번호 2), GAGGGGGGG (서열 번호 3), GAAAGGGGG (서열 번호 4), GAAAGGAGG (서열 번호 5) 및 GAAAGGGGT (서열 번호 6) 로 구성되는 군으로부터 선택되는 핵산 서열.
  9. 제 1 항에 있어서, 바실러스 투린지엔시스 (B. thuringiensis) 프로모터가cry프로모터인 핵산 서열.
  10. 제 1 항에 있어서, 바실러스 투린지엔시스 프로모터가cry1프로모터인 핵산 서열.
  11. 제 1 항에 있어서, 바실러스 투린지엔시스 프로모터가cry1Aa1, cry1Aa2, cry1Aa3, cry1Aa4, cry1Aa5, cry1Aa6, cry1Ba1, cry1Ba2, cry1Ca1, cry1Ca2, cry1Ca3, cry1Ca4, cry1Ca5, cry1Ca6, cry1Ca7, cry1Fa1, cry1Fa2, cyt1Aa1, cyt1Aa2, cyt1Aa3및 cyt1Aa4로 구성되는 군으로부터 선택되는 핵산 서열.
  12. 제 11 항에 있어서, 바실러스 투린지엔시스 프로모터가cyt1Aa1프로모터인 핵산 서열.
  13. 제 1 항에 있어서, BtI 프로모터 및 BtII 프로모터를 가지며, 여기서 BtI 프로모터 및 BtII 프로모터가 겹쳐지는 핵산 서열.
  14. 제 1 항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  15. 제 2 항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  16. 제 3 항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  17. 제 4 항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  18. 제 5 항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  19. 제 6 항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  20. 제 7 항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  21. 제 8 항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  22. 제 9 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  23. 제 14 항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  24. 제 15 항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  25. 제 16 항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  26. 제 17 항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  27. 제 18 항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  28. 제 19 항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  29. 제 20 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 따른 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  30. 제 23 항에 있어서,cry11A20 kD 단백질을 추가로 포함하는 숙주 세포.
  31. 제 29 항에 있어서,cry11A20 kD 단백질을 추가로 포함하는 숙주 세포.
  32. 제 23 항에 있어서, 세포가 바실러스 투린지엔시스 세포인 숙주 세포.
  33. 제 24 항에 있어서, 세포가 바실러스 투린지엔시스 세포인 숙주 세포.
  34. 제 25 항에 있어서, 세포가 바실러스 투린지엔시스 세포인 숙주 세포.
  35. 제 26 항에 있어서, 세포가 바실러스 투린지엔시스 세포인 숙주 세포.
  36. 제 27 항에 있어서, 세포가 바실러스 투린지엔시스 세포인 숙주 세포.
  37. 제 28 항 또는 제 29 항에 있어서, 세포가 바실러스 투린지엔시스 세포인 숙주 세포.
  38. 하기 순서대로, 시그마 인자 A 단백질에 결합하는 바실러스 투린지엔시스 프로모터, 박테리아 STAB-SD 서열의 6 개 이상의 인접하는 뉴클레오티드, 리보좀 결합 부위, 바실러스 스패리쿠스 이원성 독소의 41.9 kD 단백질 (서열 번호 9) 과 80% 이상의 서열 동일성을 가지며, 그의 독성이 서열 번호 9 의 41.9 kD 독소 단백질의 50% 이상인 제 1 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열.
  39. 하기 단계를 포함하는, 박테리아 숙주 세포에서 바실러스 스패리쿠스 이원성 독소의 생산을 증진시키는 방법:
    (a) 하기를 순서대로 포함하는 핵산 서열로 숙주 세포를 형질전환하는 단계: BtI 프로모터, BtII 프로모터, 및 BtI 및 BtII 프로모터의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 바실러스 투린지엔시스 프로모터, 박테리아 STAB-SD 서열의 6 개 이상의 인접하는 뉴클레오티드, 리보좀 결합 부위, 및 바실러스 스패리쿠스 이원성 독소의 41.9 kD 단백질 (서열 번호 9) 과 80% 이상의 서열 동일성을 가지며, 그의 독성이 서열 번호 9 의 41.9 kD 독소 단백질의 50% 이상인 제 1 폴리펩티드를 코딩하는 서열; 및
    (b) 숙주 세포에서 상기 핵산 서열을 발현시킴으로써; 상기 핵산 서열의 발현이, 상기 핵산 서열로 형질전환되지 않은 야생형 바실러스 스패리쿠스 세포에서의 바실러스 스패리쿠스 이원성 독소의 생성보다 바실러스 스패리쿠스 이원성 독소의 생성을 증진시키는 단계.
  40. 제 39 항에 있어서, 상기 제 1 폴리펩티드가 서열 번호 9 와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 방법.
  41. 제 39 항에 있어서, 상기 제 1 폴리펩티드가 서열 번호 9 의 서열을 갖는 방법.
  42. 제 39 항에 있어서, 상기 제 1 폴리펩티드를 코딩하는 서열이, 바실러스 스패리쿠스 이원성 독소의 51.4 kD 단백질 (서열 번호 8) 과 80% 이상의 서열 동일성을 가지며, 서열 번호 9 의 41.9 kD 독소 단백질에 대한 결합 도메인으로서 기능하는 제 2 폴리펩티드를 추가적으로 코딩하는 방법.
  43. 제 42 항에 있어서, 상기 제 2 폴리펩티드가 서열 번호 8 과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 방법.
  44. 제 42 항에 있어서, 상기 제 2 폴리펩티드가 서열 번호 8 의 서열을 갖는 방법.
  45. 제 39 항에 있어서, 상기 박테리아 STAB-SD 서열의 인접하는 6 개 이상의 뉴클레오티드가 9 개의 뉴클레오티드인 박테리아 STAB-SD 서열인 방법.
  46. 제 45 항에 있어서, 박테리아 STAB-SD 서열이 GAAAGGAGG (서열 번호 1), GAAGGGGGG (서열 번호 2), GAGGGGGGG (서열 번호 3), GAAAGGGGG (서열 번호 4), GAAAGGAGG (서열 번호 5) 및 GAAAGGGGT (서열 번호 6) 로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
  47. 제 39 항에 있어서, 상기 숙주 세포가 바실러스 투린지엔시스 세포인 방법.
  48. 제 39 항에 있어서, 상기 숙주 세포가 바실러스 스패리쿠스 세포인 방법.
  49. 제 39 항에 있어서, 상기 박테리아 숙주 세포가cry11A유전자의 20 kD 생성물을 추가로 발현하는 방법.
  50. 하기 단계를 포함하는, 재조합 박테리아의 제조 방법:
    (a) 하기를 순서대로 포함하는 핵산 서열로 재조합 박테리아를 형질전환하는 단계:
    BtI 프로모터, BtII 프로모터, 및 BtI 및 BtII 프로모터의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 바실러스 투린지엔시스 프로모터,
    박테리아 STAB-SD 서열의 6 개 이상의 인접하는 뉴클레오티드,
    리보좀 결합 부위, 및
    바실러스 스패리쿠스 이원성 독소의 41.9 kD 독소 단백질 (서열 번호 9) 과 80% 이상의 서열 동일성을 가지며, 그의 독성이 서열 번호 9 의 41.9 kD 독소 단백질의 50% 이상인 제 1 폴리펩티드를 코딩하는 서열;
    (b) 상기 핵산 서열을 숙주 세포에서 발현시키는 단계.
  51. 제 50 항에 있어서, 상기 제 1 폴리펩티드가 서열 번호 9 와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 방법.
  52. 제 50 항에 있어서, 상기 제 1 폴리펩티드가 서열 번호 9 의 서열을 갖는 방법.
  53. 제 50 항에 있어서, 제 1 폴리펩티드를 코딩하는 서열이, 바실러스 스패리쿠스 이원성 독소의 51.4 kD 단백질 (서열 번호 8) 과 80% 이상의 서열 동일성을 가지며, 서열 번호 9 의 41.9 kD 독소 단백질에 대한 결합 도메인으로서 기능할 수 있는 제 2 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 추가로 포함하는 방법.
  54. 제 53 항에 있어서, 상기 제 2 폴리펩티드가 서열 번호 8 과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 방법.
  55. 제 53 항에 있어서, 제 2 폴리펩티드가 서열 번호 8 의 서열을 갖는 방법.
  56. 제 50 항에 있어서, 상기 박테리아 STAB-SD 서열의 6 개 이상의 인접하는 뉴클레오티드가 9 개의 뉴클레오티드인 박테리아 STAB-SD 서열인 방법.
  57. 제 50 항에 있어서, 상기 박테리아 STAB-SD 서열이 GAAAGGAGG (서열 번호 1), GAAGGGGGG (서열 번호 2), GAGGGGGGG (서열 번호 3), GAAAGGGGG (서열 번호 4), GAAAGGAGG (서열 번호 5) 및 GAAAGGGGT (서열 번호 6) 로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
  58. 제 50 항에 있어서, 재조합 박테리아가 바실러스 투린지엔시스, 바실러스 스패리쿠스, 및 Bti 또는 Bs 이외의 바실러스 (Bacillus) 종의 원으로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
  59. 하기 단계를 포함하는, 모기 유충에 대한 바실러스 투린지엔시스 박테리아의 독성을 증가시키는 방법:
    (a) 하기를 순서대로 포함하는 핵산 서열로 상기 박테리아를 형질전환하는단계:
    BtI 프로모터, BtII 프로모터, 및 BtI 및 BtII 프로모터의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 바실러스 투린지엔시스 프로모터,
    박테리아 STAB-SD 서열의 6 개 이상의 인접하는 뉴클레오티드,
    리보좀 결합 부위, 및
    바실러스 스패리쿠스 이원성 독소의 41.9 kD 단백질 (서열 번호 9) 과 80% 이상의 서열 동일성을 가지며, 그의 독성이 서열 번호 9 의 41.9 kD 독소 단백질의 50% 이상인 제 1 폴리펩티드를 코딩하는 서열; 및
    (b) 박테리아에서 상기 핵산 서열을 발현시킴으로써; 상기 핵산 서열의 발현이 상기 박테리아를, 상기 핵산 서열로 형질전환되지 않은 야생형 바실러스 스패리쿠스 세포보다 상기 유충에 대해 더욱 독성이 되도록 하는 단계.
  60. 제 59 항에 있어서, 상기 박테리아가cry11A유전자의 20 kD 생성물을 추가적으로 포함하는 방법.
  61. 제 59 항에 있어서, 상기 제 1 폴리펩티드가 서열 번호 8 과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 방법.
  62. 제 59 항에 있어서, 상기 제 1 폴리펩티드가 서열 번호 9 의 서열을 갖는 방법.
  63. 제 59 항에 있어서, 상기 제 1 폴리펩티드를 코딩하는 서열이, 바실러스 스패리쿠스 이원성 독소의 51.4 kD 단백질 (서열 번호 8) 과 80% 이상의 서열 동일성을 가지며, 서열 번호 9 의 41.9 kD 독소 단백질에 대한 결합 도메인으로서 기능할 수 있는 제 2 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 추가적으로 포함하는 방법.
  64. 제 63 항에 있어서, 상기 제 2 폴리펩티드가 서열 번호 8 과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 방법.
  65. 제 63 항에 있어서, 제 2 폴리펩티드가 서열 번호 8 의 서열을 갖는 방법.
  66. 제 59 항에 있어서, 상기의 박테리아 STAB-SD 서열의 6 개 이상의 인접하는 뉴클레오티드가 9 개의 뉴클레오티드인 박테리아 STAB-SD 서열인 방법.
  67. 제 66 항에 있어서, 상기 9 개의 뉴클레오티드인 박테리아 STAB-SD 서열이 GAAAGGAGG (서열 번호 1), GAAGGGGGG (서열 번호 2), GAGGGGGGG (서열 번호 3), GAAAGGGGG (서열 번호 4), GAAAGGAGG (서열 번호 5) 및 GAAAGGGGT (서열 번호 6) 로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
  68. 하기 순서대로, BtI 프로모터, BtII 프로모터, 및 BtI 및 BtII 프로모터의조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 바실러스 투린지엔시스 프로모터, 박테리아 STAB-SD 서열의 6 개 이상의 인접하는 뉴클레오티드, 리보좀 결합 부위, 및 바실러스 스패리쿠스 이원성 독소의 41.9 kD 단백질 (서열 번호 9) 과 80% 이상의 서열 동일성을 가지며, 그의 독성이 서열 번호 9 의 41.9 kD 독소 단백질의 50% 이상인 제 1 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열을 포함하는 바실러스 스패리쿠스의 재조합 세포.
  69. 제 68 항에 있어서, 상기 제 1 폴리펩티드가 서열 번호 8 의 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 재조합 세포.
  70. 제 68 항에 있어서, 상기 제 1 폴리펩티드가 서열 번호 9 의 서열을 갖는 재조합 세포.
  71. 제 68 항에 있어서, 상기 제 1 폴리펩티드를 코딩하는 서열이, 바실러스 스패리쿠스 이원성 독소의 51.4 kD 단백질 (서열 번호 8) 과 80% 이상의 서열 동일성을 가지며, 서열 번호 9 의 41.9 kD 독소 단백질에 대한 결합 도메인으로서 기능할 수 있는 제 2 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 추가로 포함하는 재조합 세포.
  72. 제 68 항에 있어서, 상기 제 2 폴리펩티드가 서열 번호 8 과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 재조합 세포.
  73. 제 68 항에 있어서, 상기 제 2 폴리펩티드가 서열 번호 8 의 서열을 갖는 재조합 세포.
  74. 제 68 항에 있어서, 상기 박테리아 STAB-SD 서열의 6 개 이상의 인접하는 뉴클레오티드가 9 개의 뉴클레오티드인 박테리아 STAB-SD 서열인 재조합 세포.
  75. 제 42 항에 있어서, 상기 9 개의 뉴클레오티드인 박테리아 STAB-SD 서열이 GAAAGGAGG (서열 번호 1), GAAGGGGGG (서열 번호 2), GAGGGGGGG (서열 번호 3), GAAAGGGGG (서열 번호 4), GAAAGGAGG (서열 번호 5) 및 GAAAGGGGT (서열 번호 6) 로 구성되는 군으로부터 선택되는 재조합 세포.
  76. 제 68 항에 있어서, 바실러스 투린지엔시스 프로모터가cry프로모터인 재조합 세포.
  77. 제 68 항에 있어서, 바실러스 투린지엔시스 프로모터가cry1Aa1, cry1Aa2, cry1Aa3, cry1Aa4, cry1Aa5, cry1Aa6, cry1Ba1, cry1Ba2, cry1Ca1, cry1Ca2, cry1Ca3, cry1Ca4, cry1Ca5, cry1Ca6, cry1Ca7, cry1Fa1, cry1Fa2, cyt1Aa1, cyt1Aa2, cyt1Aa3및 cyt1Aa4로 구성되는 군으로부터 선택되는 재조합 세포.
  78. 제 68 항에 있어서, 바실러스 투린지엔시스 프로모터가cyt1Aa1프로모터인 재조합 세포.
  79. 제 68 항에 있어서, 상기 세포가cry11A오페론의 20 kD 생성물을 추가로 발현하는 재조합 세포.
  80. 하기 단계를 포함하는, 바실러스 스패리쿠스 세포의 독성을 증가시키는 방법:
    (a) 하기를 순서대로 포함하는 핵산 서열로 세포를 형질전환하는 단계: BtI 프로모터, BtII 프로모터, 및 BtI 및 BtII 프로모터의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 바실러스 투린지엔시스 프로모터, 박테리아 STAB-SD 서열의 6 개 이상의 인접하는 뉴클레오티드, 리보좀 결합 부위, 및 바실러스 스패리쿠스 이원성 독소의 41.9 kD 단백질 (서열 번호 9) 과 80% 이상의 서열 동일성을 가지며, 그의 독성이 서열 번호 9 의 41.9 kD 독소 단백질의 50% 이상인 제 1 폴리펩티드를 코딩하는 서열; 및
    (b) 숙주 세포에서 상기 핵산 서열을 발현시킴으로써; 상기 핵산 서열의 발현이 상기 핵산 서열로 형질전환되지 않은 야생형 바실러스 스패리쿠스 세포보다 상기 세포의 독성을 증가시키는 단계.
  81. 제 80 항에 있어서, 상기 제 1 폴리펩티드가 서열 번호 8 과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 방법.
  82. 제 80 항에 있어서, 상기 제 1 폴리펩티드가 서열 번호 9 의 서열을 갖는 방법.
  83. 제 80 항에 있어서, 상기 제 1 폴리펩티드를 코딩하는 서열이, 바실러스 스패리쿠스 이원성 독소의 51.4 kD 단백질 (서열 번호 8) 과 80% 이상의 서열 동일성을 가지며, 서열 번호 9 의 41.9 kD 독소 단백질에 대한 결합 도메인으로서 기능할 수 있는 제 2 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 추가로 포함하는 방법.
  84. 제 80 항에 있어서, 상기 제 2 폴리펩티드가 서열 번호 8 과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 방법.
  85. 제 80 항에 있어서, 제 2 폴리펩티드가 서열 번호 8 의 서열을 갖는 방법.
  86. 제 80 항에 있어서, 상기 박테리아 STAB-SD 서열의 6 개 이상의 인접하는 뉴클레오티드가 9 개의 뉴클레오티드인 박테리아 STAB-SD 서열인 방법.
  87. 제 80 항에 있어서, 상기 9 개의 뉴클레오티드인 박테리아 STAB-SD 서열이 GAAAGGAGG (서열 번호 1), GAAGGGGGG (서열 번호 2), GAGGGGGGG (서열 번호 3),GAAAGGGGG (서열 번호 4), GAAAGGAGG (서열 번호 5) 및 GAAAGGGGT (서열 번호 6) 로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
  88. 제 80 항에 있어서, 바실러스 투린지엔시스 프로모터가cry프로모터인 방법.
  89. 제 80 항에 있어서, 바실러스 투린지엔시스 프로모터가cry1Aa1, cry1Aa2, cry1Aa3, cry1Aa4, cry1Aa5, cry1Aa6, cry1Ba1, cry1Ba2, cry1Ca1, cry1Ca2, cry1Ca3, cry1Ca4, cry1Ca5, cry1Ca6, cry1Ca7, cry1Fa1, cry1Fa2, cyt1Aa1, cyt1Aa2, cyt1Aa3및 cyt1Aa4로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
  90. 제 89 항에 있어서, 바실러스 투린지엔시스 프로모터가cyt1Aa1프로모터인 방법.
  91. 바실러스 투린지엔시스 (Bacillus thuringiensis) 아종 이스라엘렌시스 (israelensis) ("Bti") Cyt1Aa1 단백질을 상기 이원성 독소을 발현하는 바실러스 스패리쿠스 세포에서 발현시키는 것을 포함하는, 바실러스 스패리쿠스 이원성 독소에 대한 내성의 감소 방법.
  92. Bti Cyt1Aa1 단백질을 상기 이원성 독소을 발현하는 바실러스 투린지엔시스세포에서 발현시키는 것을 포함하는 바실러스 스패리쿠스 이원성 독소에 대한 내성의 감소 방법.
  93. 상기 이원성 독소와 함께 Bti Cyt1Aa1 단백질을 투여하는 것을 포함하는 바실러스 스패리쿠스 이원성 독소에 대한 내성의 감소 방법.
  94. 제 93 항에 있어서, 상기 Bti Cyt1Aa1 단백질이 용해 및 동결건조된 Bti 세포의 분말 중에 있는 방법.
  95. 제 93 항에 있어서, 상기 Bti Cyt1Aa1 단백질이 정제된 단백질인 방법.
  96. 제 93 항에 있어서, Cyt1Aa1 단백질 대(:) Bs 의 비를 약 1:2 내지 약 1:50 에서 선택하여 상기 Bti Cyt1Aa1 단백질을 투여하는 방법.
  97. 제 96 항에 있어서, Cyt1Aa1 단백질 대(:) Bs 의 비가 약 1:10 이 되도록 상기 Bti Cyt1Aa1 단백질을 투여하는 방법.
  98. 제 1 항 또는 제 38 항에 있어서, 박테리아 STAB-SD 서열의 6 개 이상의 인접하는 뉴클레오티드인 제 2 서열을 추가로 포함하는 핵산.
  99. 제 39 항, 제 50 항, 제 59 항 및 제 80 항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아 STAB-SD 서열의 6 개 이상의 인접하는 뉴클레오티드인 제 2 서열을 추가로 포함하는 방법.
  100. 제 68 항에 있어서, 박테리아 STAB-SD 서열의 6 개 이상의 인접하는 뉴클레오티드인 제 2 서열을 추가로 포함하는 재조합 세포.
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