BACTERIAS INSECTICIDAS MEJORADAS, Y MÉTODOS PARA SU PREPARACIÓN Y USO
REFERENCIAS CRUZADAS A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud de Patente de E.U. No. 09/639,576, presentada en Agosto 14, de 2000, cuyos contenidos se incorporan mediante la referencia. DECLARACIÓN REFERENTE A LOS DERECHOS A INVENCIONES HECHAS BAJO INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO PATROCINADOS FEDERALMENTE No aplicable. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN No obstante los avances en la ciencia médica y las nuevas drogas, la malaria, la filariasis, el dengue, y la encefalitis viral permanecen como enfermedades importantes en humanos, con un estimado de dos mil millones de personas alrededor del mundo que viven en áreas donde éstas son endémicas (The World Health Report - 1999, World Health Organization, Ginebra, Suiza (1999) ) . Los agentes causales de estas enfermedades se transmiten por mosquitos, y en consecuencia los métodos de control de enfermedad se han apoyado fuertemente en los insecticidas químicos de amplio espectro para reducir la población de mosquitos. Sin embargo, el uso de insecticidas químicos esta siendo excluido en muchos países debido al desarrollo de resistencia a insecticidas en las poblaciones de mosquitos. Además, muchos gobiernos restringen el uso de esos químicos debido a la preocupación sobre sus efectos en el medio ambiente, especialmente en insectos benéficos no-objetivo, y en vertebrados a través de la contaminación en alimentos y suministros de agua. Como resultado de estos problemas, la World Health Organization facilita el reemplazo de químicos con insecticidas con base bacterial a través del desarrollo de estándares para su registro y uso (Guideline specificationa for bacterial larvicides for public health use, (Especificaciones guía para larvicidas bacteriales para uso en la salud pública) Documento WHO, WHO/CDS/CPC/WHOPES/99.2 , World Health Organization, Ginebra, Suiza (1999) ) . Algunos de los productos a base de bacterias están diseñados para controlar las larvas de mosquito, los dos más ampliamente utilizados son Vectobac" y TeknarR, ambos basados en el Bacillus thuringiensí s, subespecie israelensis . Además, el VectolexR, un nuevo producto en base a la B. sphaericua ha entrado al mercado recientemente para el control de vectores de mosquito de filariasis y enfermedades virales. Estos productos han logrado un moderado éxito comercial, pero su alto costo y ba a eficacia en comparación con muchos pesticidas químicos evitan que se utilicen más ampliamente en muchos países en desarrollo. Además, ha surgido la preocupación acerca de su utilidad a largo plazo debido a la resistencia, que ya se ha reportado para B. sphaericus en poblaciones de campo de los mosquitos Culex en India, Brasil, y Francia (Sinégre, et al., First field occurence of Culex pipiens resistance to Bacíllus sphaericus in southern France, (Primera ocurrencia de campo de resistencia de Culex pipiens para Bacillus sphaericus en el sur de Francia) , VII European eeting, Society for Vector Ecology, 5-8 de Septiembre, Barcelona, España (1994); Rao, et al., J. Am. Mosg. Control Assoc. 11:1-5 (1995); Silva-Filha, et al., J. Econ . ¦ Ento ot . 88 : 525-530 (1995) ) . Las propiedades insecticidas de estas bacterias se deben principalmente a las proteínas insecticidas producidas durante la esporulación . En la de Bacillus thuringiensis, subespecie israelensis (Bti) , las proteínas clave son CytlA (27 kDa) , CryllA (72kDa) , Cry4A (128 kDa) y Cry4B (134 kDa), mientras que el B. sphaericus (Bs) produce las proteínas 41-y 52 -kDa que sirven, respectivamente, como los dominios de toxina y de unión de una toxina binaria única (Federici et al., en Bacterial Control of Mosquitoes and Blackflies, (Control Bacterial de Mosquitos y Jejenes) ed.: de Barjac & Sutherland, D.J., 11-44 (Rutgers University Press, New Brunswick, NJ) (1990); Baumann et al., Microbiot. Rev. 55 :425-436 (1991) ) . Las diferencias bioquímicas y toxicológicas en las toxinas Bti y Bs sugieren que puede ser posible construir una bacteria mejorada combinando sus toxinas en una sola bacteria. Se han efectuado numerosos intentos utilizando este procedimiento en la década pasada para crear una bacteria recombinante con la toxicidad deseada. Varios grupos, por ejemplo, han introducido genes de toxina Bti en Bs . Por ejemplo, en Bar et al., J. Invertebrate Pathol . 57:149-158 (1991) se clonaron genes de endotoxina Bti en Bs 2362, pero se encontró que la actividad biológica del organismo recombinante fue más baja que la del Bti. En Poncet et al., FEMS Microbiol. Lett. 117:91-96 (1994) se clonaron los genes cry4B y cryllA de Bti en Bs 2297, y en Poncet et al., Appl . Environ. Microbiol. 63:4413-4420 (1997) se introdujo el gen cryllA en la misma cepa mediante recombinación homóloga. En Thiéry et al., Appl. Environ. Microbiol . 64:3910-3916 (1998) se introdujo un gen Bt cytlAbl en Bs, pero se reportó que el nivel de expresión del gen cytlAbl fue probablemente demasiado bajo para tener algún efecto significativo en la toxicidad. En Servant et al., Ap l. Environ. Microbiol. 65:3021-3026 (1999) se introdujeron toxinas CryllA y CryllBa de Bt en Bs 2297 mediante recombinación in vivo, y se mostró que el rango de huésped podría aumentar por este medio. En Bourgouin et al., Appl. Environ. Microbiol. 56:340-344 (1990) se introdujo la toxina Bs en Bti, pero no se encontraron efectos sinergísticos o aditivos entre las toxinas contra las larvas de mosquito. Los intentos para combinar las ventajas de Bs y Bt en otras maneras, aparentemente tampoco resultaron comercialmente útiles. Cultivar simplemente los cultivos de Bs y Bt y después combinarlos en dos organismos, por ejemplo, no es efectivo debido a que se considera que las esporas de los dos organismos forman una proporción demasiado grande de la mezcla resultante en proporción al peso de las toxinas para proporcionar la toxicidad adecuada. El desarrollo comercial de nuevos biopesticidas es costoso, en parte debido a que las normas de la EPA requieren análisis extenso, y los márgenes son bajos en relación por ejemplo, a los agentes farmacéuticos. No parece que algunos de los organismos recombinantes reportados en la década pasada hayan mostrado una mejora suficiente sobre las especies comerciales actuales de Bti o Bs para garantizar el desarrollo para su uso comercial en el control de mosquitos. SUMARIO DE LA INVENCIÓN La invención proporciona secuencias de nucleótidos, vectores de expresión, células huésped y métodos para lograr un alto nivel de expresión de la toxina binaria Bs, particularmente en células de especies Bacillus y especialmente en células Bs y Bt . En particular, la invención proporciona secuencias de ácidos nucleicos que comprenden, en el siguiente orden, una secuencia de ácidos nucleicos que comprende, en el siguiente orden, un promotor de B. thuringiensis seleccionado del grupo que consiste de un promotor de Btl, un promotor de Btll y una combinación de un promotor Btl y uno Btll, 6 o más nucleótidos contiguos de una secuencia STAB-SD bacterial, un sitio de unión de ribosoma, y una secuencia que codifica un primer polipéptido con al menos el 80% de identidad de secuencia para una proteína de toxina de 41.9 kD (SEQ ID NO: 9) de una toxina binaria B. sphaericus, cuyo primer polipéptido es al menos 50% tan tóxico como la proteína de toxina de 41.9 kD de la SEQ ID NO: 9. En modalidades más preferidas, el primer polipéptido tiene al menos un 90% de identidad de secuencia a la SEQ ID NO: 9 y en modalidades de mayor preferencia, el primer polipéptido tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 9. La secuencia que codifica el primer polipéptido puede comprender además una secuencia que codifica el segundo polipéptido con al menos el 80% de identidad de secuencia a una proteína de 51.4 kD de una toxina binaria de B. sphaericus (SEQ ID NO: 8) , cuyo polipéptido funciona como un dominio de unión para la proteína de toxina de 41.9 kD de la SEQ ID NO: 9. En modalidades preferidas, el segundo polipéptido tiene al menos el 90% de identidad de secuencia a la SEQ ID NO : 8 y en la modalidad de mayor preferencia, tiene la secuencia de la SEQ ID NO : 8. En algunas modalidades, los ácidos nucleicos comprenden además una segunda secuencia de al menos 6 nucleótidos contiguos de una secuencia bacterial STAB-SD. En modalidades particularmente preferidas, las dos secuencias son secuencias 9-mer bacteriales STAB-SD y, en modalidades especialmente preferidas, las secuencias STAB-SD se encuentran separadas 30-40 nucleótidos. Los 6 o más nucleótidos contiguos de una secuencia bacterial STAB-SD pueden ser 6, 7, u 8 nucleótidos contiguos de una secuencia bacterial STAB-SD de 9 nucleótidos. En modalidades preferidas, los 6 o más nucleótidos contiguos de una secuencia bacterial STAB-SD son una secuencia bacterial STAB-SD de 9 nucleótidos. En algunas modalidades preferidas, la secuencia bacterial STAB-SD se selecciona del grupo que consiste de GAAAGGAGG (SEQ ID NO: 1), GAAGGGGGG (SEQ ID NO: 2), GAGGGGGGG (SEQ ID NO: 3), GAAAGGGGG (SEQ ID NO: 4), GAAAGGAGG (SEQ ID NO: 5), y GAAAGGGGT (SEQ ID NO: 6). El promotor de B . thuríngiensis es un promotor cry, y en particular puede ser un promotor cryl . Además, el promotor de B. thuringiensis puede ser crylAal , crylAa2, crylAa.3 , crylAa4 , crylAaS, crylAa.6, crylBal, crylBa.2, crylCal, crylCa2, crylCa3 , crylCa4 , crylCaB, crylCaG, crylCa7, crylFal, crylFa2 , crtlAal, cytlAa2, cytlAa3 , o cytlAa . En algunas modalidades preferidas, el promotor de B. thuringiensis es un promotor cytlAal . El ácido nucleico puede tener ambos, un promotor Btl y un promotor BTII, y los dos promotores pueden estar sobrepuestos. La invención proporciona además vectores de expresión que comprenden los ácidos nucleicos arriba descritos, y células huésped que comprenden los vectores de expresión. Las células huésped pueden comprender además la proteína de 20 kD codificada por el operon cryllA de Bti. En modalidades preferidas, la célula huésped es una célula de B. thuringiensis o una célula de B. sphaericus. La invención proporciona además una secuencia de ácidos nucleicos que comprende, en el siguiente orden, un promotor de B. thuringiensis que se une a una proteína de factor sigma A, 6 o más nucleótidos contiguos de una secuencia bacterial STAB-SD, un sitio de unión de ribosoma, y una secuencia que codifica un primer polipéptido con al menos un 80% de identidad de secuencia a una proteína de toxina de 41.9 kD (SEQ ID NO: 9) de una toxina binaria de B . sphaericus, cuyo primer polipéptido es al menos 50% tan tóxico como la proteína de toxina de 41.9 kD de la SEQ ID NO: 9. En modalidades más preferidas, el primer polipéptido tiene al menos el 90% de identidad de secuencia a la SEQ ID NO: 9 y en las modalidades de mayor preferencia, el primer polipéptido tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 9. La secuencia que codifica el primer polipéptido puede comprender además una secuencia que codifica un segundo polipéptido con al menos el 80% de identidad de secuencia a una proteína de 51.4 kD de una toxina binaria de B . sphaericus (SEQ ID NO: 8) , cuyo polipéptido funciona como un dominio de unión para la proteína de toxina de 41.9 kD de la SEQ ID NO: 9. En modalidades preferidas, el segundo polipéptido tiene al menos el 90% de identidad de secuencia a la SEQ ID NO: 8, y en la modalidad de mayor preferencia, tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 8. Los 6 o más nucleótidos contiguos de una secuencia bacterial STAB-SD pueden ser de 6 , 7 u 8 nucleótidos contiguos de una secuencia bacterial STAB-SD de 9 nucleótidos. En modalidades preferidas, los 6 o más nucleótidos contiguos de una secuencia bacterial STAB-SD son una secuencia bacterial STAB-SD de 9 nucleótidos. En algunas modalidades preferidas, la secuencia bacterial STAB-SD se selecciona del grupo que consiste de GAAAGGAGG (SEQ ID NO: 1) , GAAGGGGGG (SEQ ID NO: 2) , GAGGGGGGG (SEQ ID NO: 3) , GAAAGGGGG (SEQ ID NO: 4) , GAAAGGAGG (SEQ ID NO: 5) , y GAAAGGGGT (SEQ ID NO: 6) . En algunas modalidades, los ácidos nucleicos comprenden además una segunda secuencia de al menos 6 nucleótidos contiguos de una secuencia bacterial STAB-SD. En modalidades particularmente preferidas, las dos secuencias son ambas secuencias bacteriales STAB-SD de 9-mer y, en modalidades especialmente preferidas, las secuencias STAB-SD se encuentran separadas 30-40 nucleótidos. La invención proporciona además métodos para mejorar la producción de la toxina binaria de S. sphaericus en una célula bacterial huésped, dicho método comprende: (a) transformar la célula huésped con una secuencia de ácidos nucleicos que comprende, en el siguiente orden, un promotor de B. thuringiensis seleccionado del grupo que consiste de un promotor Btl, un promotor BtlI, y una combinación de un promotor Btl y uno BtlI; al menos 6 nucleótidos contiguos de una secuencia bacterial STAB-SD, un sitio de unión de ribosoma, y una secuencia que codifica un primer polipéptido con al menos el 80% de identidad de secuencia a una proteína de 41.9 kD (SEQ ID NO: 9) de una toxina binaria de B . sphaericus, cuyo primer polipéptido es al menos 50% tan tóxico como la proteína de toxina de 41.9 kD de la SEQ ID NO: 9; y (b) expresar dicha secuencia de ácidos nucleicos en la célula huésped; con lo cual la expresión de dicha secuencia de ácidos nucleicos incrementa la producción de la toxina binaria de B. sphaericus en comparación con la producción de la toxina binaria de B. sphaericus en una célula de B . sphaericus de tipo silvestre que no se transforma con dicha secuencia de ácidos nucleicos. En modalidades preferidas, el primer polipéptido tiene al menos el 90% de identidad de secuencia a la SEQ ID NO: 9. En modalidades particularmente preferidas, el primer polipéptido tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 9. En algunas modalidades, la secuencia que codifica dicho primer polipéptido codifica además un segundo polipéptido con al menos el 80% de identidad de secuencia a una proteína de 51.4 kD de una toxina binaria de B. sphaericus (SEQ ID NO: 8), cuyo polipéptido funciona como un dominio de unión para la proteína de toxina de 41.9 kD de la SEQ ID NO: 9. En modalidades preferidas, el segundo polipéptido tiene al menos el 90% de identidad de secuencia a la SEQ ID NO: 8, y en modalidades particularmente preferidas, el segundo polipéptido tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 8. En algunas modalidades, los ácidos nucleicos comprenden además una segunda secuencia de al menos 6 nucleótidos contiguos de una secuencia bacterial STAB-SD. En modalidades particularmente preferidas, las dos secuencias son ambas secuencias bacteriales STAB-SD de 9-mer y, en modalidades especialmente preferidas, las secuencias STAB-SD se encuentran separadas 30-40 nucleótidos. En modalidades preferidas, los 6 o más nucleótidos contiguos de una secuencia bacterial STAB-SD son una secuencia bacterial STAB-SD de 9 nucleótidos. En modalidades particularmente preferidas, la secuencia bacterial STAB-SD se selecciona del grupo que consiste de GAAAGGAGG (SEQ ID NO: 1), GAAGGGGGG (SEQ ID NO: 2), GAGGGGGGG (SEQ ID NO: 3), GAAAGGGGG (SEQ ID NO: 4), GAAAGGAGG (SEQ ID NO: 5), y GAAAGGGGT (SEQ ID NO: 6) . De preferencia la célula huésped es una célula de B . thuringiensis o una célula de B. sphaericus . En modalidades preferidas, la célula bacterial huésped expresa además un producto de 20 kD de un gen cryllA.
En otro grupo de modalidades, la invención proporciona métodos para crear una bacteria recombinante , dicho método comprende las etapas de: (a) transformar la bacteria recombinante con una secuencia de ácidos nucleicos que comprende, en el siguiente orden, un promotor de B. thuringiensis seleccionado del grupo que consiste de un promotor Btl, un promotor BtlI, y una combinación de un promotor Btl y uno BtlI; al menos 6 nucleótidos contiguos de una secuencia bacterial STAB-SD, un sitio de unión de ribosoma, y una secuencia que codifica un primer polipéptido con al menos el 80% de identidad de secuencia a una proteína de 41.9 kD (SEQ ID NO: 9) de una toxina binaria de B . aphaericus, cuyo primer polipéptido es al menos 50% tan tóxico como la proteína de toxina de 41.9 kD de la SEQ ID NO: 9; y (b) expresar la secuencia de ácidos nucleicos en la célula huésped. En modalidades preferidas, el primer polipéptido tiene al menos el 90% de identidad de secuencia a la SEQ ID NO: 9, y en modalidades particularmente preferidas, tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 9. La secuencia que codifica el primer polipéptido puede comprender además una secuencia que codifica un segundo polipéptido, cuyo segundo polipéptido tiene al menos el 80% de identidad de secuencia a una proteína de 51.4 kD de una toxina binaria de B. sphaericus (SEQ ID NO: 8), y puede funcionar como un dominio de unión para la proteína de toxina de 41.9 kD de la SEQ ID NO: 9. En modalidades preferidas, el segundo polipéptido tiene al menos el 90% de identidad de secuencia a la SEQ ID NO: 8, y en modalidades particularmente preferidas, tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 8. En algunas modalidades, los 6 o más nucleótidos contiguos de una secuencia bacterial STAB-SD son una secuencia bacterial STAB-SD de 9 nucleótidos. En modalidades más preferidas, la secuencia bacterial STAB-SD se selecciona del grupo que consiste de GAAAGGAGG (SEQ ID NO: 1), GAAGGGGGG (SEQ ID NO: 2), GAGGGGGGG (SEQ ID NO: 3), GAAAGGGGG (SEQ ID NO: 4), GAAAGGAGG (SEQ ID NO: 5), y GAAAGGGGT (SEQ ID NO: 6). En algunas modalidades, los ácidos nucleicos comprenden además una segunda secuencia de al menos 6 nucleótidos contiguos de una secuencia bacterial STAB-SD. En modalidades particularmente preferidas, las dos secuencias son ambas secuencias bacteriales STAB-SD de 9-mer y, en modalidades especialmente preferidas, las secuencias STAB-SD se encuentran separadas 30-40 nucleótidos. En modalidades preferidas, la bacteria recombinante se selecciona del grupo que consiste de B. thuringiensis, B. sphaericus, y un miembro de una especie de Bacillus diferente a Bti o Bs. Aún en otro grupo de modalidades, la invención proporciona además un método para incrementar la toxicidad de una bacteria de B. thuringiensis para una larva de mosquito, dicho método comprende las etapas de: (a) transformar dicha bacteria con una secuencia de ácidos nucleicos que comprende, en el siguiente orden, un promotor de B. thuringiensis seleccionado del grupo que consiste de un promotor Btl, un promotor BtlI, y una combinación de un promotor Btl y uno Btll; 6 o más nucleótidos contiguos de una secuencia bacterial STAB-SD, un sitio de unión de ribosoma, y una secuencia que codifica un primer polipéptido con al menos el 80% de identidad de secuencia a una proteína de 41.9 kD (SEQ ID NO: 9) de una toxina binaria de B . sphaericus, cuyo primer polipéptido es al menos 50% tan tóxico como la proteína de toxina de 41.9 kD de la SEQ ID NO: 9; y (b) expresar dicha secuencia de ácidos nucleicos en la bacteria; con lo cual la expresión de dicha secuencia de ácidos nucleicos hace a dicha bacteria más tóxica a dicha larva que la célula de B . sphaericus tipo silvestre que no se transforma con dicha secuencia de ácidos nucleicos. En modalidades preferidas, el primer polipéptido tiene al menos el 90% de identidad de secuencia a la SEQ ID NO: 9. En modalidades particularmente preferidas, el primer polipéptido tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 9. En algunas modalidades, la secuencia de ácidos nucleicos comprende además una segunda secuencia de al menos 6 nucleótidos contiguos de una secuencia bacterial STAB-SD. En modalidades particularmente preferidas, las dos secuencias de al menos 6 nucleótidos son ambas secuencias bacteriales STAB-SD de 9-mer y, en modalidades especialmente preferidas, las secuencias STAB-SD se encuentran separadas 30-40 nucleótidos . En modalidades preferidas, la secuencia que codifica el primer polipéptido comprende además una secuencia que codifica un segundo polipéptido, cuyo segundo polipéptido tiene al menos el 80% de identidad de secuencia a una proteína de 51.4 kD de una toxina binaria de B. sphaericus (SEQ ID NO: 8) , y puede funcionar como un dominio de unión para la proteína de toxina de 41.9 kD de la SEQ ID NO: 9. En modalidades más preferidas, el segundo polipéptido tiene al menos el 90% de identidad de secuencia a la SEQ ID NO: 8, y en modalidades particularmente preferidas, el segundo polipéptido tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 8. Adicionalmente , en modalidades preferidas, dichos 6 o más nucleótidos contiguos de una secuencia bacterial STAB-SD son una secuencia bacterial STAB-SD de 9 nucleótidos, y en modalidades particularmente preferidas, la secuencia bacterial STAB-SD de 9 nucleótidos se selecciona del grupo que consiste de GAAAGGAGG (SEQ ID NO: 1), GAAGGGGGG (SEQ ID NO: 2), GAGGGGGGG (SEQ ID NO: 3), GAAAGGGGG (SEQ ID NO: 4), GAAAGGAGG (SEQ ID NO : 5), y GAAAGGGGT (SEQ ID NO: 6). En modalidades especialmente preferidas, la bacteria comprende además un producto de 20 kD del gen cryllA. Aún en otro grupo de modalidades, la invención proporciona células recombinates de B . sphaericus , dichas células comprenden la secuencia de ácidos nucleicos que comprende, en el siguiente orden, un promotor de B. thuringiensis seleccionado del grupo que consiste de un promotor Btl, un promotor BtlI, y una combinación de un promotor Btl y uno BtlI; al menos 6 nucleótidos contiguos de una secuencia bacterial STAB-SD, un sitio de unión de ribosoma, y una secuencia que codifica un primer polipéptido con al menos el 80% de identidad de secuencia a una proteína de 41.9 kD (SEQ ID NO: 9) de una toxina binaria de B. sphaericus, cuyo primer polipéptido es al menos 50% tan tóxico como la proteína de toxina de 41.9 kD de la SEQ ID NO: 9. En modalidades preferidas, el primer polipéptido tiene al menos el 90% de identidad de secuencia a la SEQ ID NO: 9 y en modalidades más preferidas, tiene la secuencia de la SEQ ID NO : 9. En algunas modalidades, la secuencia de ácidos nucleicos comprende además una segunda secuencia de al menos 6 nucleótidos contiguos de una secuencia bacterial STAB-SD. En modalidades particularmente preferidas, las dos secuencias de al menos 6 nucleótidos son ambas secuencias bacteriales STAB-SD de 9-mer y, en modalidades especialmente preferidas, las secuencias STAB-SD se encuentran separadas 30-40 nucleótidos . En modalidades preferidas, la secuencia que codifica el primer polipéptido comprende además una secuencia que codifica un segundo polipéptido, cuyo segundo polipéptido tiene al menos el 80% de identidad de secuencia a una proteína de 51.4 kD de una toxina binaria de B. sphaericus (SEQ ID NO: 8), y puede funcionar como un dominio de unión para la proteína de toxina de 41.9 kD de la SEQ ID NO: 9. En modalidades más preferidas, el segundo polipéptido tiene al menos el 90% de identidad de secuencia a la SEQ ID NO: 8, y en modalidades especialmente preferidas, tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 8. En algunas modalidades, los 6 o más nucleótidos contiguos de la secuencia bacterial STAB-SD son una secuencia bacterial STAB-SD de 9 nucleótidos, y en modalidades preferidas, la secuencia bacterial STAB-SD de 9 nucleótidos se selecciona del grupo que consiste de GAAAGGAGG (SEQ ID NO: 1), GAAGGGGGG (SEQ ID NO: 2), GAGGGGGGG ( SEQ ID NO: 3), GAAAGGGGG (SEQ ID NO : 4), GAAAGGAGG (SEQ ID NO: 5), y GAAAGGGGT (SEQ ID NO : 6) . En algunas modalidades preferidas, el promotor de B. thuringiensis es un promotor cr . En modalidades más preferidas el promotor B. thuringiensis se selecciona del grupo que consiste de crylAal, crylAa.2, crylAa3, crylAal, crylAaS, crylAa6, crylBal, crylBa2, crylCal, crylCa2, crylCa3 , crylCa4 , crylCaB, crylCaS, crylCal, crylFal , crylFa2, cytlAal , cytlAa2, cytlAa3 , y cytlAa4 y, en modalidades particularmente preferidas, es un promotor cytlAal. En modalidades particularmente preferidas, la célula expresa además un producto de 20 kD de un operón cryl1A . Además, la invención proporciona métodos para incrementar la toxicidad de una célula de B. sphaericus, dichos métodos comprenden: (a) transformar la célula con una secuencia de ácidos nucleicos que comprende, en el siguiente orden, un promotor de B. thuringiensis seleccionado del grupo que consiste de un promotor Btl, un promotor BtlI, y una combinación de un promotor Btl y uno BtlI; al menos 6 nucleótidos contiguos de una secuencia bacterial STAB-SD, un sitio de unión de ribosoma, y una secuencia que codifica un primer polipéptido con al menos el 80% de identidad de secuencia a una proteína de 41.9 kD (SEQ ID NO: 9) de una toxina binaria de B . sphaericus, cuyo primer polipéptido es al menos 50% tan tóxico como la proteína de toxina de 41.9 kD de la SEQ ID NO: 9; y (b) expresar dicha secuencia de ácidos nucleicos en la célula huésped; con lo cual la expresión de dicha secuencia de ácidos nucleicos incrementa la toxicidad de dicha célula en comparación con una célula de B . sphaericus de tipo silvestre que no se transforma con dicha secuencia de ácidos nucleicos. En modalidades preferidas, el primer polipéptido tiene al menos el 90% de identidad de secuencia a la SEQ ID NO: 8 y, en modalidades particularmente preferidas, tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 9. En modalidades preferidas, la secuencia que codifica dicho primer polipéptido comprende además una secuencia que codifica un segundo polipéptido, cuyo segundo polipéptido tiene al menos el 80% de identidad de secuencia a una proteína de 51.4 kD de una toxina binaria de B. sphaericus (SEQ ID NO: 8) , y puede funcionar como un dominio de unión para una proteína de toxina de 41.9 kD de la SEQ ID NO: 9. En modalidades más preferidas, el segundo polipéptido tiene al menos el 90% de identidad de secuencia a la SEQ ID NO : 8, y en modalidades particularmente preferidas, tiene la secuencia de la SEC. ID. NO. 8. En algunas modalidades, la secuencia de ácidos nucleicos comprende además una segunda secuencia de al menos 6 nucleótidos contiguos de una secuencia bacterial STAB-SD. En modalidades particularmente preferidas, las dos secuencias de al menos 6 nucleótidos son ambas secuencias bacteriales STAB-SD de 9-mer y, en modalidades especialmente preferidas, las secuencias STAB-SD se encuentran separadas 30-40 nucleótidos. En modalidades preferidas, los 6 o más nucleótidos contiguos de una secuencia bacterial STAB-SD son una secuencia bacterial STAB-SD de 9 nucleótidos y, en modalidades particularmente preferidas, la secuencia bacterial STAB-SD de 9 nucleótidos se selecciona del grupo que consiste de GAAAGGAGG (SEQ ID NO: 1) , GAAGGGGGG (SEQ ID NO: 2), GAGGGGGGG (SEQ ID NO: 3), GAAAGGGGG (SEQ ID NO : 4), GAAAGGAGG (SEQ ID NO : 5), y GAAAGGGG (SEQ ID NO: 6). En modalidades preferidas de los métodos, el promotor de B . thuringiensis es un promotor cry. En métodos más preferidos, el promotor de B. thuringiensis se selecciona del grupo que consiste de crylAal, crylAa2, crylAa.3 , crylAa , crylAaS, crylAa6, crylBal , crylBa2, crylCal, crylCa2, crylCa3, crylCa4,. crylCa5, crylCaS, crylCa7, crylFal , crylFa2, cytlAal, cytlAa2, cytlAa3, y cytlAa4. En el método de mayor preferencia, el promotor de B. thuringíensis es un promotor cytlAal . Aún en otro grupo de modalidades, la invención proporciona métodos para reducir la resistencia a una toxina binaria de B. sphaericus, dichos métodos comprenden expresar una proteína CytlAal de B . thuringíensis, subespecie israelensis ("Bti") en una célula de B. sphaericus que expresa dicha toxina binaria. La invención proporciona también métodos para reducir la resistencia a una toxina binaria de B. sphaericus, dicho método comprende expresar una proteína CytlAal de Bti en una célula de B . thuringíensis que expresa dicha toxina binaria y para reducir la resistencia a una toxina binaria de B . sphaericus, dicho método comprende administrar una proteína CytlAal de Bti con dicha toxina binaria. La proteína CytlAal de Bti puede encontrarse en un polvo de lisado, liofilizado de célula de Bti; puede ser también una proteína purificada. La proteína CytlAal de Bti puede administrarse en una proporción de proteína CytlAal a Bs seleccionada desde aproximadamente 1:2 hasta aproximadamente 1:50. De preferencia, la proteína CytlAal de Bti se administra en una proporción de proteína CytlAal a Bs de aproximadamente 1:10. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 establece la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 7) y la secuencia de aminoácido codificada de un fragmento utilizado para clonar la toxina binaria de Bs en un plásmido. "Sigma E" y "Sigma K" denotan los sitios de unión para los factores sigma E y K, respec ivamente. La secuencia subrayada entre los nucleótidos 537 y 660 denota una porción clonada dentro de la secuencia mediante PCR para introducir una secuencia STAB-SD, que se denota tanto por letras mayúsculas en la porción subrayada, como el superíndice "STAB-SD" . Los codones de inicio y detención de la proteína de 51.4 kD (SEQ ID NO: 8) y de la proteína de 41.9 kD (SEQ ID NO: 9) de la toxina binaria de Bs se anotan bajo la secuencia de aminoácidos. Las secciones subrayadas entre los nucleótidos 725 y 730, y entre 2245 y 2250, marcados "RBS" , representan los sitios de unión de ribosoma. DESCRIPCIÓN DETALLADA I . INTRODUCCIÓN La invención proporciona secuencias de ácidos nucleicos, vectores, células huésped, y métodos para obtener altos niveles de síntesis de la toxina binaria de Bacillus sphaericus ("Bs") en células bacteriales recombinantes . La toxina de Bs es muy potente, pero se produce mediante células de Bs tipo silvestre a bajos niveles. Esto, unido a que es solo una toxina única (en contraste, por ejemplo, con la Bt , que produce un complejo de toxinas) , permite el rápido desarrollo de insectos resistentes a la toxina. Al incrementar la cantidad de toxina producida por célula aumenta el poder de eliminación de la formulación biopesticida resultante y disminuye la posibilidad de que las larvas que ingieren el biopesticida sobrevivan. Además, el incremento en la cantidad de toxina por célula aumenta en gran medida la eficiencia del proceso de producción de fermentación de la toxina bacterial, y reduce la cantidad del producto bacterial que debe aplicarse para lograr el control de insectos. De este modo, la invención reduce marcadamente el costo de producción y uso y hace a los biopesticidas más competitivos con los pesticidas químicos, que pueden ser efectivos, pero ambientalmente más dañinos. Los ácidos nucleicos de la invención son secuencias heterólogas producidas mediante la inserción de una secuencia de ácidos nucleicos STAB-SD entre un fuerte promotor a partir de un gen de Bt y el sitio de unión de ribosoma, y la combinación de esta construcción con una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la proteína de unión de la toxina de Bs, o de la proteína de toxina, o ambas. En modalidades preferidas, se encuentran presentes ambas proteínas. Sorprendentemente, la unión de un fuerte promotor de Bt con la secuencia de ácidos nucleicos STAB-SD da como resultado un dramático incremento en la producción de la toxina Bs, por al menos 10, y comúnmente 15 a 20 veces sobre la cantidad de proteína producida mediante cepas estándar de B. sphaeric s no alterado (tipo silvestre) . La presencia de la toxina binaria Bs, a su vez, da como resultado un incremento sorprendente en la toxicidad de las células recombinantes . Por ejemplo, la toxicidad de las células recombinantes contra las larvas de mosquito del género Culex aumenta por más de 10 veces en comparación con las células no-recombinantes . Opcionalmente , la célula recombinante contiene además un producto similar a un acompañante de 20 kD de un operón cryllA. Sorprendentemente, la presencia de esta proteína aumenta la síntesis de la proteína de Bs a partir de la secuencia de ácidos nucleicos antes descrita por un 50% a 100% adicional, y de este modo incrementa la producción de la toxina Bs por aproximadamente 20 a 30 veces más que la producida por cepas estándar de Bs . Debido a los costos para obtener la aprobación regulatoria para nuevos pesticidas y lo similar, es generalmente deseable que la toxicidad de las células bacteriales se incremente en al menos aproximadamente 5 veces contra un organismo de interés para garantizar la inversión. Los esfuerzos de otros por más de una década para producir la toxina de Bs en Bs y en Bacillua thuringiensia ("Bt") han dado como resultado incrementos en las cantidades de producción de toxinas de 2 , 3, o 4 veces, demasiado modestos para ser de interés para la producción comercial o el uso en el campo. De este modo, la capacidad de la invención para permitir la producción de la toxina Bs en cantidades de al menos 10, más comúnmente 15, y tanto como de 20, 25 o incluso 30 veces tan altas como las producidas en cepas estándar de Bs es un significativo y sorprendente avance en la técnica. Igualmente de manera sorprendente, en pruebas contra mosquitos Culex, un vector significativo de enfermedad humana, mejoró la toxicidad de las células Bt transformadas con los ácidos nucleicos de la invención por al menos 10 veces, sin disminuir la toxicidad de las células a otros géneros de mosquito. Los biopesticidas tales como Bt se producen comercialmente en biorreactores . La capacidad proporcionada por la invención para incrementar la toxicidad de las células bacteriales tales como Bt o Bs significa que la cantidad de toxina producida por unidad del medio de cultivo aumentará, permitiendo el cultivo de menores cantidades, y una conmensurable disminución en los materiales en bruto utilizados para el medio de cultivo. De este modo, la invención reduce el costo de producción de los biopesticidas, lo cual extenderá las situaciones en las cuales su uso es efectivo en costo, en lugar de los pesticidas químicos.
Además, la invención proporciona también la capacidad para conferir toxicidad a base de toxina Bs en especies bacteriales normalmente no-tóxicas, y especialmente en especies de bacilos que no son normalmente tóxicas a las larvas de insectos. Debido a que es probable que los atributos de estas otras especies bacteriales, tales como la persistencia en ambientes particulares, sean diferentes a los de Bt y Bs que han servido como biopesticidas , la invención proporciona también biopesticidas con un rango de atributos diferentes a los actualmente disponibles. La invención expande así el rango de opciones para científicos oficiales de salud pública y agricultura para combatir las plagas de insectos . La capacidad para producir altos niveles de toxina de Bs es particularmente útil para incrementar la toxicidad de las subespecies Bt , tales como la subespecie, israelensis, que es útil para el control de plagas de dípteras tales como larvas de mosquito y jején (esta cepa de Bt se refiere de aquí en adelante como "Bti" ) , la subespecie kurstakí , que actualmente es útil para controlar plagas de orugas, incluyendo, e.g., la polilla del maíz {Heliothis ?ia) , la oruga de la col (Trichoplusia ni), y la oruga militar tardía [Spodoptera frugiperda) , y la subespecie morrísoni, que es activa, e.g., contra las plagas de coleópteros tales como el escarabajo de la papa de Colorado (Leptinotarsa decemlineata) , y el escarabajo de la hoj de algodón {Chrysomela scripta) , así como la subespecie tenebrionis, y la subespecie aizawai. Además, la invención permite la extensión del rango huésped del biopesticida (es decir, extiende los organismos contra los cuales el biopesticida es tóxico) . La toxina de Bs es tóxica principalmente para las larvas de las especies Culex y Anopheles, mientras que Bti es más activa contra las especies Culex y Aedes. En consecuencia, la expresión de altos niveles de toxina de Bs en células Bti no solo incrementa su toxicidad a Culex, sino también hace a las células agentes más útiles contra las especies Anopheles. Dado que las especies Anopheles son un principal vector de malaria, este rango de huésped incrementado sólo hace de la invención una gran adición para el arsenal público de salud. La invención se refiere además al descubrimiento de que la proteína CytlAal (también conocida como "CytlA") de Bti puede restaurar la toxicidad de Bs para mosquitos que fueron altamente resistentes a la toxina de Bs . Otros grupos han mostrado previamente que el mecanismo de resistencia a Bs es una pérdida de la unión a los receptores en el intestino medio del insecto. Sin el deseo de unirse a una teoría, parece que la CytlAal permite la inserción de la toxina Bs a la membrana microvilar del intestino medio, restaurando la toxicidad- Al trabajar con una población de Culex quinquefasciatus al menos 30,000-veces resistente a B . sphaericus 2362, la cepa utilizada en formulaciones biopesticidas comerciales, combinando CytlAal de Bti con B. sphaericus se suprimió completamente la resistencia. Alguna supresión de resistencia se había mostrado previamente con una proteína Cyt diferente, CytlAb del B. thuringiensis, subespecie medellin ("Btm") . Thiery, et al., Appl . Environ. Microbiol. 64:3910-3916 (1998) . Sin embargo, sorprendentemente la supresión de resistencia por CytlA de Bti es varias veces más alta que la lograda con CytlAb de Btm. Además, debido a que Bs 2362 es la cepa utilizada comercialmente y a la cual las poblaciones objetivo de mosquitos ya han desarrollado una resistencia significativa, es particularmente importante suprimir la resistencia a esta cepa. En consecuencia, el descubrimiento de que la proteína CytlAal de Bti restaura la toxicidad a Bs 2362 ofrece una solución a un problema principal que ha desanimado el uso continuado del Bs como biopesticida . Este descubrimiento puede explotarse produciendo CytlAal de Bti en una célula bacterial que produce toxina de Bs , tal como una célula de Bs o una célula de Bt recombinantemente alteradas para producir la toxina de Bs. Si la toxina de Bs se produce en una célula de Bs recombinantemente alterada para expresar CytlAal de Bti, se prefiere transformar también la célula para expresar la proteína de 20 kD similar a un acompañante codificada por el operon cryllA. La secuencia de cytlAal se encuentra disponible del GenBank bajo el número de acceso X03182, y se publicó por Waalwijk, et al., Nucí. Acids Res. 13:8207-8217 (1985) . El operon cryllA y la proteína de 20 kD codificada se tratan adicionalmente más adelante. Alternativamente, la proteína CytlAa de Bti o las células de Bti que producen CytlAa (o células de otras especies de Bacilos recombinantemente alteradas para producir CytlAa de Bti) pueden agregarse a células, gránulos o polvos producidos a partir de Bs para hacer a los gránulos tóxicos para organismos que de otra manera serían resistentes. Como se muestra en los Ejemplos, a continuación, cantidades relativamente modestas de proteína CytlAal son suficientes para suprimir dramáticamente o incluso eliminar la resistencia. En modalidades preferidas, la proteína CytlAal puede agregarse a una mezcla de Bs en una proporción seleccionada de 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, o 1:10, siendo 1:10 la más preferida debido a que proporciona un aumento inverso de resistencia con cantidades relativamente bajas de material agregado. Pueden utilizarse proporciones más altas, tales como 1:12, 1:15, 1:20, 1:25,
1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:55, 1:60, 1:65, O 1:70 si, por ejemplo, se desea reducir el costo al agregar proteína CytlAal, en el entendimiento de que las proporciones más bajas pueden proporcionar de algún modo supresión más b a de la resistencia. Los análisis mostrados en el Ejemplo 5 pueden utilizarse para probar cualquier proporción particular para discernir si proporcionará el grado de inversión resistencia deseado. Las proporciones de CytlAal a Bs de menos de 1:100 no se prefieren. La proteína CytlAal puede agregarse como granulos purificados, sin embargo, es normalmente más fácil agregar CytlAa en forma de células Bti que producen CytlAa. De manera conveniente, las células de Bti se lisan y se l ofilizan para formar un polvo previo a mezclarse con el Bs . En modalidades preferidas, el Bs es la cepa 2362. En base a nuestros resultados, otras proteínas Cytl de Bti funcionarán de la misma manera para invertir la resistencia a la toxina binaria de Bs . Las personas expertas en la técnica están conscientes de que las células de Bs y Bt generalmente no se administran juntas. Sin el deseo de unirse a alguna teoría, esto puede ser debido a la preocupación de que el peso de las esporas producidas por cada especie en relación a la toxina puede reducir la cantidad efectiva de toxina que la larva objetivo puede ingerir. Sin embargo, las cantidades modestas de Bti que necesitan agregarse para lograr la supresión de resistencia, retiran esta preocupación como un factor. Los estudios reportados en los Ejemplos muestran una amplia toxicidad cuando se mezclan células de Bti con Bs . El Bt se ha utilizado comercialmente como un biopesticida durante aproximadamente 20 años, y el Bs se ha utilizado comercialmente durante aproximadamente 5 años. El uso de Bti y Be en el campo se ha revisado, por ejemplo, en Mulla, M.S., "Activity, field efficacy, and use of Bacillus thuringiensis israelensis against mosquitoes" ("Actividad, eficacia en el campo y uso del Bacillus thuringiensis israelensis contra los mosquitos"), pag. 134-160 y en Yap, H.-H., "Field triáis of Bacillus sphaericus for mosquito control" ("Pruebas de campo del Bacillus sphaericus para el control del mosquito") pag. 307-320, en H. de Barjac y D.J. Sutherland [ed.] Bacterial control of mosquitoes and blackflies. Rutgers University Press (New Brunswick, NJ, 1990) . Las personas expertas en la técnica en consecuencia están familiarizadas con el cultivo de grandes cantidades de Bt y de organismos Bs, con la formulación de biopesticidas a partir de esos organismos, y con la aplicación de las formulaciones en el campo. Los organismos recombinantes y los métodos descritos en la presente pueden utilizarse en cualquiera de los métodos conocidos en la técnica para formular biopesticidas a partir de células Bt y Bs. Las células Bs recombinantes de la invención pueden utilizarse en cualquiera de los métodos en los cuales se utilizan actualmente biopesticidas Bs, pero pueden aplicarse en proporciones de aplicación más baja en proporción a su aumentada toxicidad en comparación con la cepa que se utiliza actualmente en el comercio. Por ejemplo, si el Bs recombinante tiene una toxicidad de 10 veces la de la cepa actual, entonces puede aplicarse una décima parte del peso del material actualmente utilizado para obtener el mismo poder de eliminación. Además, las células recombinantes que expresan CytlAal pueden utilizarse contra poblaciones de mosquitos que se han vuelto resistentes a la toxina binaria Bs tipo silvestre. Las células Bt recombinantes de la invención que producen toxina binaria Bs pueden utilizarse para controlar los organismos normalmente controlados por Bt , y en adición pueden utilizarse contra especies Anopheles . Como se trató en relación con el Bs recombinante, anteriormente, el Bt recombinante que expresa altos niveles de toxina Bs puede aplicarse en proporciones de aplicación más baja en proporción a la toxicidad aumentada del recombinante al organismo objetivo en comparación con la cepa actualmente utilizada comercialmente . De este modo, la invención permite el uso de menos material. Dado que la reducción de la cantidad de Bt o Bs significa que debe cultivarse menos Bt o Bs, se necesita menos material en bruto para producir la misma cantidad de poder de eliminación y de este modo disminuye el costo neto para producir material suficiente para tratar una cantidad dada de área. Las siguientes secciones definen los términos utilizados en esta especificación. Se tratan entonces las bacterias Bt y Bs y sus toxinas, los promotores de Bt adecuados para su uso en la invención, las secuencias STAB-SD, la instalación de las secuencias de ácidos nucleicos de la invención, y la proteína similar a un acompañante de 20 kD, así como la producción y uso de los ácidos nucleicos, vectores, células huésped y bacterias de la invención. II . DEFINICIONES A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el significado comúnmente comprendido por un experto en la técnica a la cual pertenece esta invención. Las siguientes referencias proporcionan al experto una definición general de muchos de los términos utilizados en esta invención. Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2* ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); y Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991) . Aunque cualquier método y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente pueden utilizarse en la práctica o pruebas de la presente invención, se describen los métodos y materiales preferidos. Como aquí se utilizan, los siguientes términos tienen los significados adscritos a los mismos a menos que se especifique de otra manera. "Bacillus thuringiensis" , "B. thuringiensis" , y "Bt" se refiere a una bacteria de suelo gram positiva caracterizada por su capacidad para producir inclusiones cristalinas durante la esporulación . Las inclusiones incluyen endotoxinas insec icidas. Las inclusiones comprenden proteínas insecticidas (algunas veces referidas como "proteínas cristal") codificadas por genes portados sobre plásmidos. Las bacterias pueden "curarse" del plásmido cul ivándolas a temperaturas elevadas, dando como resultado células que no producen proteínas cristal . Tales bacterias se refieren como células "acristalíferas" o "minus cristal" . "Bacillus sphaericus" , o "Bs" se refiere a una bacteria de suelo gram positiva que produce también un cristal paraesporal de proteínas tóxico para ciertos insectos . "Toxina binaria" se refiere a la toxina producida por Bs . La toxina se encuentra comprendida de dos proteínas, una de las cuales sirve como un residuo de unión y una de las cuales sirve como la toxina. Las dos proteínas son capaces de asociarse en una solución para formar una toxina funcional . Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de las proteínas se reportan en Baumann et al., J. Bacteriol . 170:2045-2050 (1988) . La proteína de 51.4 kD (SEC. ID. NO.: 8) funciona como el dominio de unión y la proteína de 41.9 kD (SEC. ID. NO. : 9) funciona como el dominio de toxina. Como aquí se utilizan, las referencias a cualquiera de las proteínas incluyen las variantes naturales y las variantes sintéticas que no reducen por más de 50% (a) con respecto a la proteína de toxina de 41.9 kD, la toxicidad de la proteína, o (b) con respecto a la proteína de unión de 51.4 kD, la capacidad de la proteína para permitir la unión de la proteína de toxina. Específicamente contempladas se encuentran las variantes sintéticas en las cuales las sustituciones conservadoras de aminoácidos se producen, tal como sustituyendo un ácido glutámico por un ácido aspártico, o viceversa. "Cyr" y "Cyt" se refieren a miembros de dos familias de proteínas producidas por B. thuringiensis . La nomenclatura en la técnica ha cambiado recientemente de referirse a las diversas proteínas Cry por medio de números romanos (que pretenden denotar los rangos aparentes de los organismos a los que las proteínas son tóxicas) a números arábigos; las proteínas Cry se redesignaron también. Una tabla de comprensión que se correlaciona a la nomenclatura de las designaciones anteriores y las designaciones actuales para unas 130 proteínas Cry y Cyt se establece en Crickmore et al., icrobiol . Mol. Biol . Rev. 62:807-813 (1998) . La proteína ahora llamada "CytlAal" algunas veces ae refirió previamente como "CytA" o "CytlA"; las referencias en la presente a CytA o a CytlA se refieren a CytlAal. Siguiendo el uso estándar en la técnica, el uso de los términos "Cry" o "Cyt" en la presente denota la proteína, mientras que en el caso de minúsculas, los términos italizados "cry" o "cyt" se refieren a los genes. Un "promotor" es un ordenamiento de secuencias de control de ácidos nucleicos, e.g., el promotor crylAcl de B. thuringiensis , que dirige la transcripción de . un polinucleótido asociado, que puede ser un polinucleótido heterólogo o nativo. Un promotor incluye secuencias de ácidos nucleicos cercanas al sitio de inicio de la transcripción, tal como un sitio de unión de polimerasa. El promotor incluye también opcionalmente elementos de aurnentador o represor distal que pueden localizarse a tanto como varios miles de pares de bases del sitio de inicio de la transcripció . "Factores sigma" se refiere a las proteínas conocidas por reconocer secuencias particulares en el ADN y que forman parte de un complejo de proteínas que facilitan el inicio de la transcripción del ADN por medio de la polimerasa de ARN. Como se conoce en la técnica, la secuencia de las proteínas de factor sigma se determinó mediante estudios en B. subtilis , las proteínas que llevan a cabo las mismas funciones en otras especies de Bacilos tienen aproximadamente el 80-95% de secuencia a los factores sigma de B. subtilis . De acuerdo a esto, los factores en los cuales el Bt lleva a cabo el mismo rol que los factores sigma de B. subtilis tienen secuencias ligeramente diferentes que aquellas de las proteínas paradigma de B. subtilis . El término "factor sigma" en la presente se refiere a las proteínas en Bt que llevan a cabo la misma función que los factores sigma de B. subtilis y que tienen aproximadamente el 80-95% o mayor de homología de secuencia a aquellas proteínas. Para asentar el punto de que estas proteínas corresponden, pero no son necesariamente idénticas en secuencia a las proteínas de B. subtilis, se refieren también algunas veces como factores o proteínas "similares a sigma" . Un promotor "Btl" se refiere a un promotor reconocido por el factor sigma E. Un promotor "BtlI" se refiere a un promotor reconocido por el factor sigma K. Un "fuerte promotor Btl o BtlI" se refiere a un promotor que, cuando está operablemente enlazado a una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína, y expresado en una célula Bt , da como resultado la proteína que comprende al menos 5%, más preferentemente 10%, y de mayor preferencia 15% o más del peso en seco de la célula. "Polinucleótido" y "ácido nucleico" se refieren a un polímero compuesto de unidades de nucleótido ( ibonucleótidos , desoxiribonucleótidos , variantes estructurales relacionadas que se presentan de manera natural, y análogos sintéticos de los mismos que no se presentan de manera natural) enlazados a través de enlaces de fosfodiéste , variantes estructurales relacionadas que se presentan de manera natural, y análogos sintéticos de los mismos que no se presentan de manera natural. De este modo, el término incluye polímeros de nucleótido en los cuales los nucleótidos y los enlaces entre ellos incluyen análogos sintéticos que no se presentan de manera natural. Se entenderá que, cuando se requiera por el contexto, cuando una secuencia de nucleótidos se representa por una secuencia de ADN (i.e., A, T, G, C) , éste incluye también una secuencia de ARN (i.e., A, U, G, C) en la cual la "U" reemplaza a "T" . "Recombinante" se refiere a polinucleótidos sintetizados o de otra manera manipulados ir¡ vi tro ( "polinucleótidos recorabinantes" ) y a métodos para utilizar polinucleótidos recombinantes para producir productos del gen codificados por aquellos polinucleótidos en las células u otros sistemas biológicos. Por ejemplo, un polinucleótido clonado puede insertarse en un vector de expresión adecuado, tal como un plásmido bacterial, y el plásmido puede utilizarse para transformar una célula huésped adecuada. Una célula huésped que comprende el polinucleótido recombinante se refiere como una "célula huésped recombinante" o una "bacteria recombinante" . El gen se expresa entonces en la célula huésped recombinante para producir, e.g., una "proteína recombinante" . Un polinucleótido recombinante puede servir también a una función no-codificada (e.g., promotor, origen de replicación, sitio de unión de ribosoma, etc . ) . Una "secuencia heteróloga de polinucleótido" o un "ácido nucleico heterólogo" es un término relativo que se refiere a un polinucleótido funcionalmente relacionado con otro polinucleótido, tal como una secuencia de promotor, de modo tal que las dos secuencias de polinucleótidos no se encuentran dispuestas en la misma relación entre sí como en la naturaleza. Las secuencias heterólogas de polinucleótidos inclyen, e.g., un promotor operablemente enlazado a un ácido nucleico heterólogo, y un polinucleótido que incluye su promotor nativo que se encuentra insertado dentro de un vector heterólogo para la transformación en una célula huésped recombinante. Las secuencias heterólogas de polinucleótido se consideran "exógenas" debido a que están introducidas a la célula huésped a través de técnicas de transformación. Sin embargo, el polinucleótido heterólogo puede originarse de una fuente externa o de la misma fuente. La modificación de la secuencia heteróloga de polinucleótido puede ocurrir, e.g., tratando el polinucleótido con una enzima de restricción para generar una secuencia de polinucleótidos que pueda enlazarse operablemente a un elemento regulatorio. La modificación puede presentarse también mediante técnicas tales como mutagénesis dirigida al sitio . El término "expresado de manera endógena" se refiere a los polinucleótidos que son nativos a la célula huésped y se expresan de manera natural en la célula huésped. Un "c sete de expresión" se refiere a una serie de elementos de polinucleótido que permiten la transcripción de un gen en una célula huésped. Típicamente, el cásete de expresión incluye un promotor y una secuencia de polinucleótidos heteróloga o nativa que se transcribe. Los casetes de expresión pueden incluir también, e.g.; señales de terminación de transcripción, señales de poliadenilación, y elementos m oradores. El término "operablemente enlazado" se refiere a una relación funcional entre dos partes en las cuales la actividad de una parte (e.g., la capacidad para regular la transcripción) da como resultado una acción en la otra parte (e.g., la transcripción de la secuencia) . De este modo, un polinucleótido está "operablemente enlazado a un promotor" cuando existe un enlace funcional entre una secuencia de control de expresión de polinucleótido (tal como un promotor u otras secuencias de regulación de transcripción) y una segunda secuencia de polinucleótidos (e.g., un polinucleótido nativo o heterólogo) , en donde la secuencia de control de expresión dirige la transcripción del polinucleótido . Una "endotoxina insecticida" se refiere a una familia de genes que codifican proteínas de endotoxina que exhiben actividad insecticida, también conocidas como proteínas cristal, e.g., Cry2A, Cry3A, CrylB, CrylC y toxina binaria de Bs (ver, Hof e & Whiteley, Microbiol. Rev. 53:242-255 (1989)) . Tales endotoxinas insecticidas se producen por Bacillua thuringiensis y son tóxicas a insectos, particularmente a larvas de insectos. Una "cantidad insecticidamente efectiva" de una endotoxina insecticida es una cantidad de dosis unitaria que proporciona actividad insecticida al aplicarse a una planta, suelo, u otro "sitio", e.g., sitio o ubicación. El "gen que codifica la proteína de 20 kDa del operon cryllA" (gen de proteína de 20 kDa) se refiere al gen en el operon cryllA que codifica una proteína de aproximadamente 20 kDa (como se describe en Frutos, et al., Biochem. Sys . and Ecol . 19:599-609 (1991), ver Frutos et . al . , Figura 4 para la secuencia de nucleotidos y aminoácidos) . "Producción mejorada" se refiere a una actividad de una primera proteína, tal como la proteína de 20 kDa del operon cryllA, que incrementa la cantidad neta de una segunda proteína, tal como una endotoxina insecticida, en una célula huésped . "Competente para expresión" se refiere a una célula huésped que proporciona un ambiente celular suficiente para la expresión de pol inucleótidos endógenos y/o exógenos . Los términos "idéntico" o porcentaje de "identidad" , en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias de polipéptidos , se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que son la misma o tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son el mismo, al compararse y alinearse para máxima correspondencia, según se mide utilizando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencia o mediante inspección visual . La frase "sustancialmente idénticos" , en el contexto de dos ácidos nucleicos o polipéptidos, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que tienen al menos el 60%, de preferencia el 80%, de mayor preferencia de 90-95% de identidad de residuos de nucleótido o aminoácido, al compararse y alinearse para máxima correspondencia, según se mide utilizando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencia o mediante inspección visual . Para la comparación de secuencia, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, a la cual se comparan las secuencias de prueba. Al utilizar un algoritmo de comparación de secuencia, las secuencias de prueba y de referencia se introducen en una computadora, se diseñan las coordenadas de subsecuencia , si es necesario, y se diseñan los parámetros del programa de algoritmo de secuencia. El algoritmo de comparación de secuencia calcula entonces el porcentaje de identidad de secuencia para la(s) secuencia (s) de prueba en relación a la secuencia de referencia, en base a los parámetros diseñados del programa. La alineación óptima de las secuencias para comparación puede conducirse, e.g., por medio del algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl . Math. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman & Wunsch, J". Mol. Biol . 48:443 (1970), mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson & Lipman, Proc . Nati. Acad. Sci . EUA 85:2444 (1988), medíante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y FAS A en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr. Madison, WI) , o mediante inspección visual (ver en general, Current Protocola in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., ed. , Current Protocols, una sociedad entre Greene Publishing Associates, Inc., y John Wiley & Sons, Inc., (Suplemento 1995) ( "Ausubel" ) ) . Ejemplos de algoritmos adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 y Altschul et al., (1977) Nucleic Acida Res. 25:3389-3402, respectivamente. El software para llevar a cabo los análisis BLAST está disponible públicamente a través del National Center for Biotechnology Information
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica primero identificar pares de secuencia de alto puntaje (HSPs) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta, la cual ya sea iguala o satisface algún puntaje T del umbral valorado positivo al alinearse con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. T se refiere como el umbral de puntaje de palabra vecina (Altschul et al., supra.) . Estas pulsaciones de la palabra vecina inicial actúan como semillas para iniciar las búsquedas para encontrar los HSPs m s largos que los contienen. Las pulsaciones de palabra se extienden entonces en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia durante tanto como pueda incrementarse el puntaje acumulativo de alineación. Los puntajes acumulativos se calculan utilizando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntaje de recompensa para un par de residuos de igualación; siempre > 0) y N (puntaje de penalizacion para residuos que no se igualan; siempre < 0) . Para secuencias de aminoácidos, se utiliza una matriz de puntaje para calcular el puntaje acumulativo. La extensión de las pulsaciones de palabra en cada dirección se detiene cuando: el puntaje acumulativo de alineación cae por la cantidad X desde su valor máximo alcanzado; el puntaje acumulativo va hasta cero o menor, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de residuo de puntaje negativo; o se alcanza el final de cualquiera de las secuencias. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T, y X determinan la sensibilidad y la velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para las secuencias de nucleótidos) utiliza como predeterminados una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M=5, N=4, y una comparación de ambas cuerdas. Para las secuencias de aminoácido, el programa BLASTP utiliza como predeterminada una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10, y la matriz de puntaje BL0SUM62 (ver, Henikoff & Henikoff, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)). Además de calcular el porcentaje de identidad de secuencia, el algoritmo BLAST también lleva a cabo un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (ver e.g., Karlin & Altschul, Proc. Nati. Acad, Sci. USA 90:5873-5787 (1993)). Una medida de similitud provista por el algoritmo BLAST es la probabilidad de la suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad mediante la cual es posible que se presente una igualdad entre dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de la suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia es menor que aproximadamente 0.1, más preferentemente menor que aproximadamente 0.01, y de mayor preferencia menor que aproximadamente 0.001. Una indicación adicional de que dos secuencias de ácido nucleico o polipéptidos son sustancialmente idénticas es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico es inmunológicamente reactivo cruzado con el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico, como se describe abajo. De este modo, un polipéptido es típicamente sustancialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, cuando los dos péptidos difieren solo por sustituciones conservativas. Otra indicación de que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es que las dos moléculas se hibridizan entre sí bajo condiciones rígidas, como se describe abajo. Los términos "condiciones rígidas de hibridización" O "condiciones rígidas" se refieren a condiciones en las que una secuencia de ácido nucleico se hibridizará a su complemento, pero no a otras secuencias en algún grado significativo. Las condiciones rígidas en el contexto de hibridizaciones de ácido nucleico son secuencia dependientes y son diferentes bajo diferentes parámetros ambientales. Las secuencias más largas se hibridizan específicamente a más altas temperaturas. Una extensa guía para la hibridización de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology Hibridization ith Nucleic Acid Probes, Parte 1, Capítulo 2 "Overview of principies of hibridization and the strategy of nucleic acid probé assays," Elsevier, New York, (1993) (Tijssen en su totalidad se incorpora en la presente como referencia) . Se seleccionan condiciones muy rígidas que sean iguales al punto TM para una sonda en particular. En contraste, las condiciones menos rígidas, son aquellas en las cuales una secuencia de ácido nucleico se fijará a secuencias igualadas de manera imperf cta. La rigidez puede controlarse cambiando la temperatura, la concentración salina, la presencia de compuestos orgánicos, tales como formamida o DMSO, o todas estas. Los efectos del cambio de estos parámetros son bien conocidos en la técnica. El efecto en los cambios TM en la concentración de formamida, por ejemplo, se reducen a la siguiente ecuación: TM = 81.5 + 16.6 (log Na+) + 0.41 (%G:C)- (longitud 600/oligo) - 0.63 (%formamida) . Las reducciones en TM debido al TMAC y a los efectos del cambio de concentraciones salinas son también bien conocidos. Los cambios en la temperatura son generalmente un medio preferido para controlar la rigidez por conveniencia, facilidad de control, y reversibilidad. "Sustitución conservativa" se refiere a la sustitución en un polipéptido de un aminoácido con un aminoácido de funcionalidad similar. Los siguientes seis grupos contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservativas uno del otro: 1) Alanina(A)( Serina (S) , Treonin (T) ; 2) Ácido aspártico (D) , ácido glutámico (E) ; 3) Asparagina (N) , Glutamina (Q) ; 4) Arginina (R) , Lisína (K) ; 5) Isoleucina (I) , Leucina (L) , Metionina (M) , Valin (V) ; y 6) Fenilalanina (F) , Tirosina (Y) , Triptofan ( ) . Ver también Creighton, PROTEINS, W.H. Freeman and
Company, New York (1984) . III. LAS TOXINAS BTI Y BS Bti y Bs son organismos de suelo aeróbicos, gramo positivos formadores de esporas que producen inclusiones critalinas proteináceas durante la esporulación . Los cristales de subespecies de Bt son tóxicas para las larvas de una amplia variedad de especies leipdópteras , coleópteras y dípteras. La Introducción lista algunos de los insectos contra los cuales se utilizan diferentes especies de Bt . Bt comprende aproximadamente el 90% de todos los biopesticidas utilizados. Agaisse and Lereclus . J. Bacteriol . 177:6027-6033 (1995) . Los genes cry y cyt codifican las varias proteínas insecticidas producidas por Bt . Un gran numero de estos genes se ha identificado y secuenciado y son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, Crickmore et al., Microbiol Mol Biol Rv. 62:807-813 (1998) (la totalidad de Crickmore et al., se incorpora en la presente como referencia) proporciona una tabla que detalla el número de acceso del GenBank para las secuencias de sobre 120 genes cry de Bt y 9 genes cyt de Bt identificados . Como puede esperarse por el nombre, la toxina binaria de Bs se compone de dos proteínas, una de 51.4 kD y una de 41.9 kD . Las secuencias de nucleótido y de aminoácido de las proteínas se han conocido por más de una década y se reportan en Baurnann et al., J. Bacteriol . 170:2045-2050 (1988). La proteína de 51.4 kD (SEC. ID. N0.:8) funciona como el dominio de unión y la proteína de 41.9 kD (SEC. ID. NO.: 9) funciona como el dominio de toxina, en consecuencia, comúnmente estarán presentes cantidades equimolares de ambas proteínas para máxima función de la toxina. Convenientemente, esto puede completarse teniendo una secuencia de ácido nucleico que codifique ambas proteínas en corriente descendente de la estructura promotor- STAB-SD de la invención a modo que ambas proteínas se expresen al mismo tiempo y en aproximadamente las mismas cantidades. Si la secuencia de ácido nucleico de solo una de las dos proteínas de toxina de Bs se coloca bajo el control de una secuencia promotor-STAB-SD de la invención, es deseable que una secuencia que codifica la otra proteína de toxina de Bs se coloque bajo el control transcripcional de una estructura similar al promotor a modo que las dos proteínas se produzcan en cantidades equimolares o casi equimolares. Las personas expertas apreciarán que es posible hacer cambios en las secuencias de las SEC. ID. NO. :8 y 9 y aún tener una proteína que funciona como una toxina de Bs utilizando técnicas de rutina de ingeniería genética. Por ejemplo, las sustituciones conservativas de aminoácidos pueden hacerse en la secuencia de la proteína de toxina binaria de Bs (SEC. ID. NO. :9) para dar como resultado una proteína o polipéptido que tiene alta identidad de secuencia y que retiene al menos una porción de la toxicidad de la proteína nativa, y pueden hacerse alteraciones similares en la proteína de unión de la toxina binaria de Bs (SEC. ID. NO.: 8) mientras no obstante se permita que la proteína funcione como una proteína de unión para la proteína de toxina. De preferencia tales proteínas o polipéptidos tienen al menos aproximadamente el 75% de identidad con las proteínas nativas de 41.9 kD o 51.4 kD de Bs, más preferentemente en 80%, aún más preferentemente 85%, incluso más preferentemente 90%, y de mayor preferencia 95% o mayor identidad a la SEC. ID. NO . : 8 o la SEC. ID. NO . : 9. La función de cualquier polipéptido en particular para srvir en lugar de la toxina nativa de Bs puede probarse fácilmente mediante análisis conocidos en la técnica y como se detalla en la presente. Es preferible que los polipéptidos que sirven en lugar de la proteína nativa de toxina de 41.9 kD (SEC. ID. NO.: 9) tengan al menos 50% de la toxicidad de la toxina nativa de Bs, más preferentemente 60%, aún más preferentemente 70% o más, incluso más preferentemente aproximadamente 80% o más, aún más preferentemente 90% o más de la toxicidad de la toxina nativa de Bs . Es preferible que los polipéptidos que sirven en lugar de la proteína nativa de unión de 51.4 kD (SEC. ID. NO . : 8 ) de la toxina binaria de Bs puedan fijarse a receptores de insectos para esa proteína de unión. Tal unión puede determinarse por ejemplo, mediante inmunohistoquímica (que es cualitativa) o análisis de unión en membrana de borde cepillado (estos análisis, que se conocen también como "análisis de unión de vesícula en membrana de borde cepillado" proporcionan la unión cuantitativa de una relativa habilidad de unión) . Tales análisis son bien conocidos en la técnica. Sorprendentemente, hemos encontrado que la proteína CytlA del Bt puede restaurar la toxicidad de la toxina para larvas que han perdido receptores para la proteína de unión de la toxina binaria de Bs . De acuerdo a esto, si se desea, la proteína CytlA puede co-expresarse en una célula que expresa la proteína de toxina de 41.9 kD de la toxina binaria de Bs en lugar de algo o toda la proteína de dominio de unión de 51.4 kD y las proteínas serán tóxicas a las larvas objetivo que ingieran la célula o los biopesticidas hechos a partir de la célula. De este modo, por ejemplo, una célula Bt , tal como la Bti, puede transformarse introduciendo una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína CytlA con un promotor que expresará cantidades casi similares a la cantidad de proteína Bs de 41.9 kD. Alternativamente, la proteína CytlA y la toxina binaria de Bs pueden producirse por separado y mezclarse para hacer que los mosquitos resistentes a la toxina Bs sean sensibles a la toxina. En una variación de este uso, la proteína CytlA puede agregarse a la proteína de toxina de Bs de 41.9 kD (que, por ejemplo, se ha expresado de manera recombinante) y la mezcla utilizada contra las poblaciones de mosquitos resistentes a la toxina de Bs . Debido a que el mecanismo de acción puede no ser el mismo que el de la proteína de dominio de unión de 51.4 kD, parece que la cantidad de la proteína CytlA no necesita ser tan cercanamente igual a la cantidad de la proteína de toxina como sería verdadero para que la proteína de unión de Bs de 51.4 kD lograra un total efecto tóxico. IV. PROMOTORES DE BT La invención utiliza promotores de los genes cry y cyt de Bt para conducir la expresión de la toxina de Bs . Estos genes codifican las varias proteínas insecticidas producidas por Bt . Como se anotó en la sección previa, la Tabla 1 de Crickmore et al., Microbiol Mol Biol Rev, 62:807-813 (1998) publica una lista conveniente de los nombres y números de acceso del GenBank para las secuencias de 120 genes cry de Bt y 9 genes cyt de Bt . Las personas expertas en la técnica apreciarán que la secuencia 5' que precede el codon de inicio para la región de codificación descrita en la lista para cada uno de estos genes comprende la región promotora . Como notarán las personas expertas, la transcripción del gen de las proteínas Cry y Cyt se regula temporalmente por la presencia de secuencias a las cuales se fijan las proteínas conocidas como factores sigma. Los factores sigma abastecen otras proteínas que forman un compuesto permitiendo que la polimerasa de RNA inicie la transcripción del DNA. Los promotores de los genes cry o cyt se clasifican generalmente en tres categorías, en base a los factores sigma que se fijan a ellos. Estos son los promotores sigma E, los promotores sigma-K, y los promotores sígma-A. Los promotores sigma-E se conocen también como promotores Btl y los promotores sigma-K se conocen también como promotores Btll (con referencia a lo que trata en la presente de los promotores, los términos "sigma-E" y "Btl" se utilizan de manera intercambiable, y son los términos "sigma-K" y "Btll") . Un número de genes cry son activos durante la esporulación y se conducen generalmente por medio de los promotores Btl o BtlI, con promotores BTI activos más tempranamente en la esporulación que los promotores BtlI. Ver generalmente, Agaisse and Lereclus, J. Bactriol . 177:6027-6032 (1995) (Agaisse and Lereclus 1995") . Los factores sigma que reconocen la mayoría de los genes cry son conocidos. E.g., Agaisse and Lereclus 1995. Por ejemplo, cry4A y B son reconocidos por los promotores Btl . Un número de genes cry tienen dos promotores, uno Btl y uno BtlI. La combinación de estos promotores duales sirve para extender la expresión del gen sobre un período más largo del proceso de esporulación. En algunos casos, los dos promotores se superponen. Los genes cry no dependientes de la esporulación tienen aún otro conjunto de promotores, que son reconocidos por aún otro factor sigma, sigma-A. Ver, e.g., Agaisse and Lereclus 1995. Puede utilizarse cualquier promotor Btl o BtlI en las secuencias de ácido nucleico y en los métodos de la invención. Los promotores duales Btl y BtlI, y en particular los promotores Btl y BtlI que se superponen, tienden a ser fuertes promotores de la expresión de proteína y son formas preferidas de promotores para estructurar los ácidos nucleicos de la invención. Los miembros de los genes que entran en los siguientes grupos que tienen promotores duales son especialmente preferidos: crylA, crylB, cryllA, y crylAa. Para los propósitos de la invención, cualquier promotor Btl o BtlI que pueda conducir la expresión de la proteína CytlAal para comprender al menos 5%, más preferentemente 10%, y de mayor preferencia 15% o más del peso en seco de una célula acristalí fera de Bti, se considera un fuerte promotor y es un promotor Btl o BtlI apropiado para los propósitos de la invención. Los promotores duales Btl y BtlI o las regiones promotoras son preferidos. En modalidades preferidas, el promotor Btl o BtlI es un promotor cryl o un promotor cytlAal (también conocido como cytlA) . Debido a la cercana relación patogenética y a la alta identidad de secuencia de los promotores cryl (ver, Crickmore et al., Microbiol . Mol. Biol . Rev. 62:807-813 (1998) , cualquiera de los promotores de los genes designados en Crickmore et al . , como un gen cryl se considera capaz de conducir altos niveles de expresión de la toxina binaria de Bs . Las modalidades particularmente preferidas son crylAal (anteriormente llamado crylA(a)) , crylBal (anteriormente llamado crylB) , crylCal (anteriormente llamado crylC) , y cryFal anteriormente llamado crylF) . Debe notarse que cada uno de estos genes tiene otros genes cercanamente relacionados. Por ejemplo, crylFal se relaciona cercanamente a crylFa2. Los otros miembros de los grupos de genes cryl nombrados designados por la misma letra mayúscula y la misma letra minúscula se consideran casi tan preferidos como el primer gen listado en el grupo (es decir, crylFa2 es casi tan preferido como crylFal) . En otra modalidad particularmente preferida, el promotor puede ser el promotor de cytlAal, que comprende ambos promotores, Btl y BtlI, y de acuerdo a esto se refiere algunas veces como promotor dual . Debido a que la región promotora contiene dos promotores, la región promotora de este gen se llama también "promotores cytlA" . En base al análisis patogenético y a la identidad de secuencia, los promotores de los otros genes cytlAa son también promotores Btl o BtlI o Btl y BtlI combinados su icientemente fuertes para utilizarse en las composiciones y métodos de la invención . Los promotores del gen cry no dependiente de la esporulación son promotores sigma-A y no son generalmente satisfactorios, excepto bajo un conjunto de condiciones modificadas. Las formas no esporuladoras de Bt, por supuesto, no desvían sus recursos metabólicos para la producción de esporas, y pueden acumular toxinas sobre un período más largo que las formas esporuladoras. En las formas no-esporuladoras , en consecuencia, los promotores sigma-A pueden utilizarse para acumular altos niveles de toxina. De acuerdo a esto, los promotores Btl y BtlI son prefetidos para su uso en Bacillus, incluyendo Bt y Bs . En las formas no-esporuladoras de Bacillus, pueden utilizarse promotores sigma-A.
V. SECUENCIAS STAB-SD Los ARNms de proteína cristal de B. thuringiensis tienen un promedio de vida media de 10 minutos durante la esporulación, mientras que el promedio de vida media de otros ARNms es de entre 1 a 2 minutos. Esta larga vida media puede ser responsable en parte de la muy alta producción de proteínas cristal, que pueden ser tanto como 20-30% del peso en seco de las células esporuladas. La larga vida media de estas proteínas se relaciona a dos regiones no traducidas de los genes. Primero, existe una scuencia en la región no traducida 5', comúnmente encontrada entre el promotor y la región de codificación, que no está implicada en el inicio de la translación pero que es determinante de la estabilidad para ARJSTm. La secuencia es una secuencia de consenso similar a Shine-Dalgarno ("SD") . Segundo, el fragmento terminal 3' de los genes cry, tal como crylAa, incrementa la vida media de las transcripciones AR m en dos a tres pliegues. Agaisse and Lereclus, Mol. Microbiol . 20:633-643 (1996) (en adelante "Agaisse 1996") . La secuencia 5' similar a SD parece estar implicada en la estabilización de la producción de proteínas. De acuerdo a esto, se ha llamado una secuencia "STAB-SD" . Agaisse 1996. Agaisse 1996 sugiere que la STAB-SD está implicada en interacciones con el extremo 3' del RNA ribosomal 16?, y encontró que las mutaciones de la scuencia STAB-SD que se esperaba que se abolieran afectaron complementariamente la estabilidad conferida. De manera interesante, la secuencia STAB-SD de la proteína entonces llamada cryIIIA (ahora llamada cry3A) mostró interacciones putativas con el extremo 3' del ARNr 16S de B. subtilis. Sin el deseo de unirse a una teoría, parece que los nucleótidos de polipurina (G y A) se aparejan en base de la secuencia STAB-SD con una secuencia complementaria de nucleótidos de pirimidina en el extremo 3' de la unidad ARNr 16S del ribosoma, y que este apare amiento de base inhibe el acceso de la 5' endoribonucleasa al extremo 5' del ARNm, incrementando la vida media del mensaje, y en consecuencia aumentando la producción de la proteína codificada. De este modo, parece que las secuencias STAB-SD no son específicas para especies particulares de bacterias, y que las secuencias STAB-SD de otras especies Bacillus, y de otros géneros de bacteria, pueden utilizarse para estabilizar la producción de proteínas en B. thuringiensis y B. sphaericus. Agaisse 1996 revisó las bases de datos e identificó numerosos ejemplos de secuencias STAB-SD putativas en regiones 5' no traducidas ( "UTR" ) , incluyendo aquellas de cuatro genes cry de Bt, el sitio cwp de B. brevis, y el sitio inlAB de Listeria monocytogenes . Cualquiera de estas secuencias STAB-SD puede utilizarse para producir altos niveles de toxina Bs en Bacillus al colocarse entre un fuerte promotor de Bacillus y un sitio de unión de ribosoma. Las secuencias STAB-SD identificadas comparten de manera justa una alta homología entre sí. En modalidades preferidas, la secuencia STAB-SD se selecciona del grupo que consiste de GAAAGGAGG (la secuencia cry3A, SEC. ID. NO . : 1 ) , GAAGGGGGG (la secuencia cry3B, SEC . ID. N0.:2), GAGGGGGGG (la secuencia cry3B2, SEC. ID. NO . : 3 ) , GAAAGGGGG (la secuencia cry3D, SEC. ID. N0.:4), GAAAGGAGG (el cwp de B. brevis, SEC. ID. N0.:5), y GAAAGGGGT (el inlAB de L. Monocytogenes , SEC. ID. NO.: 6) . Las secuencias cry3A, cry3B, cry3B2 , y cry3D son particularmente preferidas. Cry3A es la modalidad de mayor preferencia. Si se desea, pueden utilizarse dos o más secuencias STAB-SD en lotes. Si se utilizan secuencias STAB-SD múltiples, las secuencias se separan de preferencia por aproximadamente 30 a 40 nucleótidos a fin de que las secuencias STAB-SD puedan interactuar con unidades ribosomales 30S múltiples. La longitud de extensión de la subunidad ribosomal es de aproximadamente 30 nucleótidos. El número de secuencias STAB-SD múltiples utilizadas no debe ser tan grande que interfiera con la interacción entre las secuencias STAB-SD y el extremo 3' de B . subtilis 16SARNr 3' . La presencia de demasiadas secuencias STAB-SD puede determinarse al notar una disminución en la producción de proteínas en comparación a una estructura con menos secuencia STAB-SD. Una o dos secuencias STAB-SD son de mayor preferencia. De manera similar, mientras que dos secuencias STAB-SD pueden separarse por cualquier distancia conveniente (típicamente 3-300 nucleótidos) , el efecto de la separación puede probarse determinando la producción de proteína por medio de una estructura probando la separación en comparación a una estructura similar con la separación de 33 a 40 nucleótidos. Otras secuencias con alta identidad de secuencia para una de las secuencias STAB-SD arriba detalladas y que funcionan como secuencia STAB-SD pueden utilizarse en los ácidos nucleicos y en los métodos de la invención. La secuencia debe tener al menmos 85% de identidad de secuencia con una de las secuencias STAB-SD antes detalladas y debe funcionar para mejorar la producción de proteínas. En formas preferidas, la secuencia tiene al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia, e incluso más preferentemente tiene aproximadamente 95% o mayor identidad de secuencia. En adición, Agaisse 1996 proporciona una guía de los cambios a secuencias STAB-SD putativas que pueden afectar dañinamente la estabilidad. En general, es probable que cualquier cambio en un nucleótido que aboliera la interacción entre la secuencia STAB-SD y el extremo 3' de B . subtilis 16SARNr 3' reduzca la producción de proteína y no se prefiere. Sorprendentemente, también se ha descubierto que la secuencia STAB-SD completa no tiene que utilizarse para aumentar la producción de proteínas. Tan pocos como 6 nucleótidos contiguos de una scuencia STAB-SD pueden funcionar para aumentar la estabilidad. Mientras que no es tan poderoso para estabilizar la producción de proteínas como una secuencia STAB-SD completa de 9 nucleótidos, se obtienen mejores resultados que si la proteína se produce sin 6-mer (una secuencia de un número de nucleótidos o aminoácidos puede ser referido en la técnica como el número y el sufijo "-raer") . De este modo, si se desea, puede utilizarse una de estas subsecuencias STAB-SD en lugar de una secuencia STAB-SD completa. Sin embargo, debido a que las secuencias más largas se fijan más fuertemente a la secuencia pirimidina correspondiente de la subunidad ribosomal 16SARJSJr, más preferentemente, se utilizan 7 nucleótidos contiguos de una secuencia STAB-SD y, aún más preferentemente, se utilizan 8 nucleótidos contiguos de una secuencia STAB-SD. El uso de una secuencia STAB-SD completa de 9 nucleótidos es el de mayor preferencia. Pueden lograrse mejores resultados utilizando dos de estas estructuras en lotes, tal como de dos a 6-mers. Para facilitar lo tratado en otras secciones de esta especificación, el término "secuencia STAB-SD" incluye una subsecuencia de 8 nucleótidos contiguos de una secuencia STAB-SD, a menos que se requiera de otra manera por contexto. Cualquier secuencia putativa de ácido nucleico, o cualquier modificación deseada a una secuencia STAB-SD conocida, puede probarse convenientemente para su función como una proteína STAB-SD colocando la secuencia en un plásmido que contiene una secuencia que codifica galactosidasa siguiendo los análisis y otros métodos mostrados por Agaisse 1996, o sustituyendo la secuencia bajo consideración para la secuencia STAB-SD en el procedimiento publicado en los Ejemplos, abajo, y comparando la producción de proteína resultante con la producción de la misma proteína de la estructura utilizando la secuencia STAB-SD detallada en la presente. Las secuencias que reducen la producción de toxina binaria de Bs a menos que aproximadamente 8 veces la de las células de Bs de tipo silvestre calculando mediante análisis densiométrico de geles Coomassie SDS-PAGE de tinte azul son menos preferidas. VI . INSTALACIÓN DE LAS SECUENCIAS DE ÁCIDO NUCLEICO DE LA INVENCIÓN Se ha desarrollado considerable información en la técnica acerca de la construcción de promotores; en este contexto, se ofrece el siguiente tratado para proporcionar la información específica que puedan necesitar las personas expertas para optimizar la colocación de la secuencia STAB-SD entre el sitio de unión de factor sigma de un fuerte promotor de Bt y el sitio de unión del ribosoma. La Figura 1 demuestra una instalación ejemplar de una secuencia de ácido nucleico de la invención. En esta modalidad, los promotores cytlA comprenden los nucleótidos 1-537. (dado que el gen cytlA contiene dos promotores, uno un promotor de Btl y el otro un promotor de BtlI, la región promotora del gen se refiere algunas veces en la técnica como los "promotores cytlA") . Los sitios de unión para el factor similar a E y el factor similar a K se muestran con las anotaciones "SIG A E" y SIG A K" , respectivamente, colocadas sobre las regiones apropiadas, con los términos "-35" y "-10" y las secuencias subrayadas que designan los sitios de unión específicos. Los nucleótidos subrayados con las letras "RBS" en los nucleótidos 726 a 730 y 2246 a 2249 denotan sitios de unión de ribosoma. Los nucleótidos subrayados del 538 al 659 denotan una secuencia clonada en forma del promotor cry3A. Esta secuencia se clonó para introducir la secuencia STAB-SD de 9 nucleótidos; la secuencia más larga del promotor cry3A se utilizó debido a que es relativamente más difícil de clonar en una secuencia de 9 nucleótidos. La secuencia comenzando en la posición 660 es una porción de la secuencia de la toxina binaria en corriente ascendente de la región de codificación, seguida por la región de codificación (como se publicó por Baumann et al., J. Bacteriol . 170:2045-2050 (1988)) . La porción particular en corriente ascendente del codon de inicio en la posición marcada "+1" se seleccionó simplemente debido a la presncia de un sitio de restricción conveniente. Pueden utilizarse porciones más cortas o más largas, y por supuesto, puede utilizarse la región promotora completa del gen de toxina binaria si se desea. En general, sin embargo, se prefiere el uso de secuencias más cortas, no solo para facilitar la manipulación sino también para evitar la inclusión accidental de secuencias represoras o lo similar que puede ocurrir que estén presentes. Adicionalmente , si se utiliza una secuencia diferente después de la secuencia STAB-SD, un sitio de unión de ribosoma debe colocarse entre la secuencia STAB-SD y el codón de inicio. De preferencia, el sitio de unión de ribosoma se coloca aproximadamente de 6 a aproximadamente 10 nucleótidos en corriente ascendente del codón de inicio. Los sitios de inicio y paro de las proteínas de toxina binaria de 51.4 kD y 41.9 kD se muestran también. La manera en que los elementos de esta secuencia ejemplar se unen puede variar sustancialmente y aún dar como resultado una secuencia que funcione bien para la producción de altos niveles de toxina binaria de Bs . En esta secuencia, aproximadamente 121 nucleótidos de la secuencia cry3A se utilizaron para clonarse en la secuencia STAB-SD. Esto se hizo simplemente para facilitar la clonación la secuencia STAB-SD de 9 nucleótidos (o, como se explicó en la sección precedente, una subsecuencia de 7 u 8 nucleótidos contiguos de la misma) puede introducirse por sí misma. Para facilitar la clonación, sin embargo, es comúnmente preferible utilizar una secuencia que abarque la secuencia STAB-SD y que sea de aproximadamente 20 hasta aproximadamente 130 nucleótidos de longitud. La secuencia STAB-SD en sí puede colocarse en cualquier sitio desde aproximadamente 10 bases en corriente descendente del sitio de unión sigma hasta justo antes de una secuencia RBS, que a su vez debe estar a aproximadamente 6 a aproximadamente 10 bases en corriente ascendente del codón de inicio. Es decir, que puede suprimirse toda o una porción del promotor en corriente descendente del sitio de unión de factor sigma, con el entendimiento de que si se suprime el RBS del promotor, debe colocarse otro RBS, tal como el de la toxina binaria de Bs, a aproximadamente 6 hasta aproximadamente 10 bases en corriente ascendente del codón de inicio. Como se anotó, en la secuencia ilustrada en la Figura 1, las secuencias de la posición 660 en adelante son del gen de la toxina binaria de Bs . Cualquier secuencia en particular puede probarse fácilmente sustituyéndola en los análisis mostrados en los Ejemplos para determinar si ha tenido un efecto dañino o ventajoso en la producción de la toxin . VII. PROTEÍNA SIMILAR A UN ACOMPAÑANTE DE 20 kD En los métodos de la presente invención, las células huésped se transforman con un gen que codifica un gen de proteína de 20 kDa, que codifica una proteína conocida (Frutos et al., supra; Visick & Whitely, supra) , para aumentar la producción de la toxina binaria de Bs . El gen de proteína de 20 kDa puede aislarse y secuenciarse , por ejemplo, a partir de dos subespecies de B. thuringiensis (Frutos et al., Biochem. Syst . And Ecol . 19:599-609 (1991)) . El nivel de expresión de la proteína de 20 kDa se ha caracterizado en células transformadas con el gen de proteína de 20 kDa. Utilizando los métodos y secuencia descritos en la presente y en la Solicitud Internacional de Patnte W097/39623, el gen de proteína de 20 kDa puede ser aislado por los expertos en la técnica y utilizarse para construir vectores de expresión recombinantes para la transformación de una célula huésped. Las células huésped transformadas con el gen de proteína de 20 kD deben ser competentes para expresar la toxina binaria de Bs . Las células pueden expresar la toxina binaria de Bs, o las células pueden transformarse con vectores de expresión exógenos de toxina binaria. Como se anotó anteriormente, se conoce la secuencia de ambas proteínas de la toxina binaria de Bs . Esta información de secuencia puede ser utilizada por el experto en la técnica, junto con los métodos descritos en la presente, para estructurar vectores recombinantes para la transformación de una célula huésped, tal como una célula Bs, con el gen que codifica la proteína de 20 kD . Convenientemente, el gen para la proteína de 20 kD puede colocarse sobre el mismo plásmido que la secuencia de ácido nucleico para expresar altos niveles de la toxina de Bs . VIII. SECUENCIAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS Y VECTORES Un vector de expresión recombinante para la transformación de una célula huésped se prepara al aislar primero las secuencias constituyentes de polinucleótidos , como se trata en la presente. Las secuencias de polinucleótidos, e.g., una secuencia que codifica la toxina binaria Bs accionada por un promotor como se trató anteriormente, se ligan entonces para crear un vector de expresión recombinante adecuado para la transformación de una célula huésped. Los métodos para aislar y preparar los polinucleótidos recombinantes se conocen bien por aquellos de experiencia en la materia. Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual (2a. Ed. 1989); Ausubel et al., Current Protocole in Molecular Biology (1995) , proporcionan información suficiente para dirigir a las personas de experiencia a través de muchos ejercicios de clonación. Un método preferido para obtener polinucleótidos específicos combina el u3o de iniciadores de olinucleótidos sintéticos con la extensión o ligación de polimerasa en un modelo de ARNm o ADN. Tal método, e.g., RT, PCR o LCR, amplifican la secuencia de nucleotidos deseada (ver las Patentes de E.U. 4,683,195 y 4,683,202). Los sitios de endonucleasa de restricción pueden incorporarse en los iniciadores. Los polinucleótidos amplificados se purifican y ligan para formar un cásete de expresión. Las alteraciones en la secuencia genómica natural pueden introducirse por técnicas tales como mutagénesis in vitro y PCR utilizando iniciadores que ha sido diseñados para incorporar mutaciones apropiadas . Otro método preferido para aislar secuencias de polinucleótidos utiliza sitios de endonuleasa de restricción conocidos para aislar fragmentos de ácido nucleico a partir de plásmidos. Los genes de interés también pueden aislarse por alguien de experiencia en la materia utilizando iniciadores en base a secuencias genómicas conocidas. Las secuencias aisladas de polinucleótidos de elección, e.g., la toxina binaria Bs accionada por las secuencias promotoras anteriormente descritas, se insertan en un "vector de expresión", "vector de clonación" o "vector", términos que usualmente se refieren a plásmidos u otras moléculas de ácidos nucleicos que son capaces de replicarse en una célula huésped seleccionada. Los vectores de expresión pueden replicarse de manera autónoma, o pueden replicarse al insertarse en el genoma de la célula huésped. Con frecuencia, es deseable para el vector utilizarse en más de una célula huésped, e.g., en E. coli para clonación y construcción y en B. thuringiensis para expresión. Los elementos adicionales del vector pueden incluir, por ejemplo, marcadores seleccionables , e.g., resistencia a la tetraciclina o resistencia a la higromicina, que permiten la detección y/o selección de aquellas células transformadas con las secuencias de polinucleótidos deseadas (ver, e.g., la Patente de E.U. 4,704,362) . El vector particular utilizado para transportar la información genética hacia la célula tampoco es particularmente crítico. Puede utilizarse cualquier vector adecuado utilizado para la expresión de proteínas recombinantes en células huésped. Un vector preferido es pHT3101, que es un vector lanzadera de E. coli-B. thurinhiensis (Lereclus et al., FEMS Microbiol. Lett. 60 :211-218 (1989) ) . Los vectores de expresión típicamente tienen un c sete de expresión que contiene todos los elementos requeridos para la expresión del polinucleótido de selección en una célula huésped. Un cásete de expresión típico contiene un promotor operablemente enlazado a la secuencia de polinucleótidos de selección. El promotor utilizado para dirigir la expresión de la toxina binaria Bs es como se describió anteriormente, y se encuentra operablemente enlazado a una secuencia que codifica una o ambas de las proteínas de la toxina binaria Bs . El promotor se encuentra preferentemente colocado aproximadamente a la misma distancia del sitio de inicio de transcripción heterólogo como se encuentra desde el sitio de inicio de transcripción en su medio ambiente natural. Sin embargo, como se conoce en la materia algunas variaciones en esta distancia pueden acomodarse sin la pérdida de la función del promotor. Para la expresión de la proteína de 20 kD codificada por el operón cryllA, pueden utilizarse otros promotores adecuados para accionar la expresión del gen heterólogo en una célula huésped, incluyendo aquellos utilizados típicamente en los casetes de expresión estándar, e.g., el promotor ß-galactosidas . En una modalidad de la invención, el gen de la proteína de 20 kD se enlaza de manera operable a los promotores Btl y BtlI ("el promotor cryIAc") del gen cryIAc, creando un ácido nucleico heterólogo operablemente enlazado a un promotor. El promotor cryIAc es altamente activo en condiciones de crecimiento que induce a la esporulación. IX. EXPRESIÓN DE PROTEÍNA Después de la construcción y aislamiento del vector de expresión recombinante , se utiliza para la transformación una célula huésped para la expresión de la toxina binaria Bs . El procedimiento particular utilizado para introducir el material genético en la célula huésped para la expresión de una proteína no es particularmente crítico. Puede utilizarse cualquiera de los procedimientos bien conocidos para introducir secuencias de polinucleótidos externas en células huésped. Los métodos de trans ormación, los cuales varían dependiendo del tipo de célula huésped, incluyen electroporación; transfección empleando cloruro de calcio, , fosfato de calcio de cloruro de rubidio, DEAE-dextran u otras sustancias; bombardeo por microproyectiles ; 1 ipofección; infección (cuando el vector es un agente infeccioso) ; y otros métodos (ver en generaL Sambrook et al., supra; Ausubel et al., supra) . En algunas modalidades las células huésped pueden transformarse mediante recombinación homóloga, como se describe en Poncet et ai., Appl Environ Microbiol . 63:4413-4420 (1997) . Un método preferido para transformar B. thuringiensis es la electroporación, como se describe en WU et al., Mol. Microbiol. 13:965-972 (1994) . Los huéspedes para la transformación con el gen de la toxina binaria Bs incluyen cualquier componente celular de bacteria huésped adecuado para expresar la proteína, especialmente membranas del género Bacillus. En modalidades particularmente preferidas, las células son células de Bs o Bt . Los huéspedes que se transforman con la toxina binaria Bs son bacterias recombinantes útiles como insecticidas. Las subespecies preferidas de B. thuringiensis incluyen, e.g., B. thuringiensis subesp . kurstaki, B. thuringiensis subesp. aizawai, B. thuringiensis subesp. israelensis y B. thuringiensis subesp. tenebrionis. Una cepa preferida es Bti IPS82. Después que la célula huésped se transforma con el gen de toxina binaria Bs, la célula huésped se incuba bajo condiciones adecuadas para la expresión de la toxina. Típicamente, el huésped crecerá bajo condiciones que promueven la esporulación y expresión de genes de endotoxina insecticidas. Las células huésped pueden prepararse en cualquier cantidad requerida al fermentar un inoculo en medio estándar conocido por aquellos de experiencia en la materia. El medio contendrá generalmente, por e emplo, una fuente de nitrógeno y una fuente de carbohidrato, e.g., glucosa. Las condiciones adecuadas para la incubación incluyen una temperatura en el rango de 15-45°C, preferentemente 30°C y un pH aproximadamente neutro. La incubación puede llevarse a cabo de manera conveniente en lotes, típicamente por un periodo de 3-5 días. En la materia se conocen varios medios de crecimiento para células Bt y Bs . En algunas modalidades preferidas, un inoculo a partir de un cultivo de célula huésped de existencias crece en agar nutriente (BBL Microbiology Systems) o leche peptonizada (leche peptonizada al 1% [BBL Microbiology Systems], dextrosa al 1%, extracto de levadura al 0.2%, MgS0 1.216 mM, FeS04 0.072 mM, ZnS04 0.139 mM, MnS04 0.118 mM) con eritromicina a una concentración de 25 µg/ml, como se describe en los Ejemplos. La producción mejorada de toxina binaria Bs se observa después que las células huésped competentes para expresar el gen de toxina binaria Bs se transforman con el gen y las células crecen bajo condiciones adecuadas. La producción mejorada de la toxina binaria BSspuede observarse por métodos estándar conocidos por aquellos de experiencia en la materia. Por ejemplo, las inclusiones paraesporales de endotoxinas insecticidas pueden purificarse (ver Wu & Federici, Appl Microbiol . Biotechnol . 42:697-702 (1995) (de aquí en adelante "Wu y Federici 1995") , cosechados por centrifugación a partir de cultivos lisados o examinados con microscopio (ver Wu & Federici 1995, supra) . Las inclusiones paraesporales que se han cosechado por centrifugación o purificado pueden separarse utilizando métodos estándar conocidos en la materia, por ejemplo. cromatografía, inmunoprecipitación, ELISA, bioensayo, análisis western o electroforesis de gel (ver, e.g., Wu & Federici 1995, supra; Ausubel, supra) . Las cantidades de proteína se cuantifican por medios adecuados, incluyendo amplitud e intensidad de bandas de tinción, densitometría, bioactividad y fluorescencia. Para células Bt transformadas u otras células conocidas no para toxina binaria Bs sintetizada en su estado no transformado, toda la producción de toxina binaria Bs se considera que representa el mejoramiento por los métodos de la invención. En donde las células Bs se transforman con los ácidos nucleicos de la invención, la cantidad neta de toxina producida por las células transformadas puede compararse a células no transformadas similares. La cantidad neta de toxina se refiere a la cantidad de toxina binaria Bs en cuerpos paraesporales o cristales . Los huéspedes de control de otro modo son genéticamente idénticos con los huéspedes transformados y el crecimiento en el medio competitivo. El mejoramiento es cualquier incremento estadísticamente significativo en la producción de toxina binaria Bs . En una modalidad preferida, los cuerpos paraesporales se asilan por centrifugación a partir de cultivos lisados y se examinan por geles SDS-PAGE teñido con azul Coomassie. EJEMPLOS Ejemplo 1 Niveles de Expresión de Toxina Binaria Bs Producida en Bti Utilizando un Promotor Bti, Secuencia STAB-SD y Secuencia de Codificación para la Toxina Un gen de toxina binaria 2362 de Bacillus sphaericus se introdujo en una cepa acristaloferosa (4Q7) de Bacillus thuringiensis subesp. israelensis (Bti) utilizando promotores cytIA y secuencia STAB-SD colocada en el plásmido pHT3101. La construcción dio como resultado la producción de toxina binaria que parece ser 15 veces o más, mayor por unidad de medio de cultivo que las obtenidas con la cepa original de B. sphaericus (tipo silvestre) desarrollada en el mismo medio, según se valoró por exploración densiométríca de geles producida por electroforesis de gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) . Tabla 1. Incrementos de Producción Obtenidos Utilizando Promotores cytIA y la Secuencia STAB-SD para Accionar la Expresión del Operón Qenétlco de la Toxina Binaria Bs 2362
Ejemplo 2 Toxicidad de Bti no Tóxica Diseñada para Expresar la Toxina Binaria Bs La toxicidad de la cepa 4Q7 Bti acristaliferosa , transformada para producir toxina binaria Bs 2362, se probó en larvas de cuarta fase ("L4") de Culex quinquéfaseiatus y se comparó a la cepa Bs 2362 tipo silvestre desarrollada en el mismo medio. (La cepa Bti 4Q7 no produce de manera natural las toxinas Bs o Bti) . LC50 es la cantidad de toxina requerida para eliminar el 50% de las larvas presentes en una muestra durante una prueba. Como se muestra en la Tabla 2, de abajo, la cantidad de Bs2362 tipo silvestre necesaria para eliminar el 50% ("LC50") de las larvas de cuarta fase de los mosquitos Culex fue 15.0 ng/ml. La cepa 4Q7 Bti, transformada por los ácidos nucleicos de la invención para expresar la toxina Bs, tuvo un LC50 de 1.4, o aproximadamente 10 veces mejor toxicidad que la Bs no alterada. Ejemplo 3 Toxicidad de Bti Diseñada para Expresar la Toxina Binaria Be. La transformación de Bacillus thuringiensis subesp. israelensis con el plásmido descrito en el Ejemplo 1 que produce la toxina binaria Bs2362 incrementa la toxicidad por al menos 10 veces contra las especies Culex comparadas a cualquiera de las cepas originales (Bs o Bti) . Bti IPS82 es la cepa de Bti utilizada como un biopesticida comercial. Como puede observarse a partir de la Tabla 2, la cantidad de esta cepa necesaria para eliminar el 50% ("LC50") de larvas de cuarta fase ("L4") de mosquitos Culex fue de 19.5 ng/ml. La cepa Bs tipo silvestre 2362 tuvo un LC50 de 15 ng/ml. La cepa Bti IPS82, transformada por los ácidos nucleicos de la invención para expresar la toxina Bs , tuvo un LC50 de 1.5, o aproximadamente 13 veces mejor toxicidad que la de Bs no tratada. Tabla 2. Toxicidad de un Bti/Bs2362 Recombinante para Culex quinquéfasciatus L4 Proporción Proporción LC50 B i Bs
Cepa (ng/ml) Bti/Bs Bti/Bs
Bti IPS82 19.5 1.0 Bs 2362 15.0 1.0 Toxina binaria Bti4Q7/Bs 1.4 - 10.0
Toxina Binaria Bti IPS82 + Bs 1.5 13.0
Ejemplo 4 Materiales y Métodos Utilizados en los Ejemplos 1-3 A. Cepas bacteriales, genes, plásmldos y transformación La cepa 2362 de Bacillus sphaericus se obtuvo de una preparación en polvo que se proporcionó amablemente por Abbott Laboratories (North Chicago, IL) . El vector de expresión de lanzadera pHT3103 Escherichia coli-B . thuringiensis (Lereclus et al., FEMS Microbiol . Lett . 51:211-7 (1989)) se utilizó para elaborar y amplificar la construcción de plásmido (pPHSP-1) en E. coli DH5a. La construcción pPHSP-l se expresó en una cepa acriataliferosa, 4Q7 de B. thuringiensis subesp. israelensis obtenida del Bacillus Stock Center en la Universidad del Estado de Ohio
(Columbus, OH), o en B. thuringiensis subesp. israelensis IPS82 (Abbott Laboratories) . El vector a base de pHT3101 modificado (?????-SD) que contiene el fragmento de 660 pares de bases con los promotores cytIA y la secuencia STAB-SD
(Agaisse y Lereclus, Mol. Microbiol., 20:633-643 (1996)) se describió previamente (Park et al., FEMS Microbiol Lett 181:319-327 (1999)). Los plásmldos se purificaron utilizando el Equipo QIAprep Spin Miniprep (Qiagen Inc.) . Las cepas de bacilos se transformaron por electroporacion como se describe por Park et al., App Environ. Microbiol 64:3932-3938 (1998) .
B. Amplificación PCR del gen que codifica las proteínas entomocidalTT de B aphaericue Se elaboró una preparación cruda de plásmido a partir de B. sphaericus 2362 utilizando el método de lisia alcalina (Sambrook et al., 1989) . El gen que codifica la proteína de 54.1 kDa y la proteína entomocidal de 41.9 kDa de B . sphaericus (Baumann et al., J. Bacteriol . 170:2045-2050 (1988) , GenBank M20390) se obtuvo por PCR utilizando polimerada de ADN Vent (Exo+) (Biolabs) y los iniciadores BSP-1 (5 ' actgcagCTTGTCAACATGTGAAGATTAAAGGTAACTTTCAG-3 ' (SEQ ID NO:
10) ) y BSP-2 (5'-aactgcagCCAAACAACAACAGTTTACATTCGAGTGTAAAAGTTC- 3 ' (SEQ ID NO:
11) ) (Genosys) . El producto de PCR de 3.4 kbp se digirió con PstI y se clonó en el mismo sitio en pHT3101 para generar pHBS. El fragmento Hpal-Psti de 3.0 kbp en pHBS se clonó en los sitios Xbal y PstI llenos en pSTAB-SD para generar pPHSP-1. C. Crecimiento de cepas bacteriales Las cepas B . thuringiensis subesp. israelensis
4Q7/pPHSP-l y B . thuringiensis subesp. isrelensis IPS82/pPHSP-l se desarrollaron en agar nutriente (BBL icrobiology Systems) o leche peptonizada (leche peptomizada al 1% [BBL Microbiology Systems], dextrosa al 1%, extracto de levadura al 2%, MgS04 1.216 mM, FeS0 0.072 mM, ZnS04 0.139 mM, ???04 0.118 mM con eritromicina en una concentración de 25 9/p?1. Para bioensayos de insecto B. thuringiensis subesp. isrelensis IPS82/pPHSP-l se desarrolló en 25 mi de leche peptonizada con eritromicina (25 µ^/ta?) en un incubador agitador establecido a 28CC, 250 rpm/min durante 6 días, tiempo durante el cual >98% de las células se esporularon y lisaron. Las esporas y cristales se cosecharon por centrifugación a 4°C, 6,000 x g durante 15 min. Los pelleta se lavaron dos veces en agua y se secaron en una cámara de vacío. D. Electroforesis de dodecilsulfato sódico/gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) Después de 6 días de crecimiento en leche peptonizada, se recolectó 1 mi del cultivo lisado y se centrifugó a 10,000 x g durante 5 minutos. El medio se desechó y se agregaron 150 µ? de amortiguador TE (Tris-Cl 10 mM, pH 7.5, EDTA 1 mM) y 150 de amortiguador muestra 2X (Laemmli, 1970) . Las proteínas se fraccionaron por SDS-PAGE (Laemmli, 1970) . E. Bioensayos Para los bioensayos, los grupos de 20 estados larvarios de cuarta temprana se expusieron a un rango de concentraciones de espora liofilizada/polvos de cristal en 100 mi de agua desionizada mantenidos en recipientes de plástico de 237 mi. Se replicaron de siete a 9 diferentes concentraciones de loa polvos en 5 días diferentes. F. Microscopía Los cultivos de esporulación se monitorearon por microscopía de luz con un Fotomicroscopio Zeiss III, utilizando un objetivo de inmersión de aceite 100X. Para la microscopía electrónica de transmisión, las células esporuladas de los cultivos de leche peptonizada se recolectaron justo antes de la lisis, se fijaron durante 2 horas en glutaraldehído amortiguado con fosfato al 3% y sacarosa al 0.25%, se post-fijaron en 0s04 al 1%, se deshidrataron en etanol -óxido de propileno, y se incluyeron en Epon-Araldite (Ibarra y Federici, J. Bacteriol . 165:527-533 (1986) ) . Las secciones ultradelgadas de células esporuladas se examinaron y se fotografiaron en un microscopio electrónico Hitachi 600 que opera en un voltaje de aceleración de 75 kV. Ejemplo 5 La Proteína cytlA Restablece la Susceptibilidad a la Toxina Bs de los Mosquitos Altamente Resistentes a esa Toxina . A. Materiales y Métodos Cepas y toxinas bacteriales Las preparaciones de toxina utilizadas en este estudio fueron polvos liofilizados de cultivos lisados de J3. sphaericus 2362 y una cepa recombinante de B. thuríngiensis subesp. israelensis que sólo produce CytlAa ( u y Federici, J. Bacteriol. 175:5276-5280 (1993)) . Estos polvos contenían la espora y el cristal (es decir, el cuerpo paraesporal) junto con residuos celulares y sólidos del medio resultantes de la liofilización . Los polvos específicos probados fueron (1) B. sphaericus cepa 2362, obtenida como un polvo técnico de la cepa tipo silvestre de Abbott Laboratories (North Chicago, IL) ; (2) CytlAa, una cepa recombinante de BTI anteriormente anotada; y (3) BTI 4Q7, una cepa acristaliferosa de estas subespecies que no producen ninguna endotoxina. Esta cepa se obtuvo del Bacillus Stock Center (Universidad del Estado de Ohio, Columbus, OH) y se utilizó como uno de los controles. También se utilizaron los polvos liofilizados de cristales de CytlA purificados (Wu y Federici, supra) , Producción y almacenamiento de polvos de toxina Las cepas bacteriales que producen las diversas toxinas se desarrollaron en medio sólido o líquido como se describió previamente (Wirth et al., Proc . Nati. Acad. Sci USA, 94:10536-10540 (1997) , Park et al., Appl Environ Microbiol. 64:3932-3938 (1998)) . Las células esporuladas se lavaron en agua destilada, se sedimentaron y los pellets resultantes se liof ilizaron. Para las selecciones de mosquitos y bioensayos se prepararon suspensiones de existencias de los polvos en agua destilada y homogenizada con la ayuda de aproximadamente 25 perlas de vidrio. Las existencias se prepararon mensualmente y se prepararon semanalmente diluciones seriales de 10 veces. Todas las existencias y diluciones se congelaron a -20°C cuando no se utilizaban. Cepas de mosquito Se utilizaron dos cepas de Cx quinquefasciatus; BS-R, una cepa resistente a B. sphaericus 2362 y Syn-P, una cepa no resistente, no seleccionada. BS-R se seleccionó con B. sphaericus 2362 desde 1992 y sobrevive de manera rutinaria 48 horas de exposición a 1000 µ9/t?1, una concentración mayor 149,000 veces que la concentración que elimina el 50% de Syn-P, la cepa sensible de referencia. Syn-P es una "población sintética" de Cx quinquefasciatus derivada de las poblaciones larvales recolectadas en 1995 de 3 diferentes áreas geográficas en el sur de California. Estas colonias se han mantenido en el laboratorio sin exponerse al B. sphaericus . Procedimientos de selección y bioensayo Como se anotó arriba, la cepa BS-R se ha mantenido bajo presión de selección con B. sphaericus 2362 desde 1992. La selección consistió de exponer grupos de ca. de 1,000 estados larvales de cuarta temprana a concentraciones de B. sphaericus que varían entre 100-120 µg/ml en recipientes metálicos esmaltados en aproximadamente 1 litro de agua desionizada durante 48-96 horas. La mortalidad promedio de la larva bajo selección fue del 10% o menos por selección, y los sobrevivientes se utilizaron para continuar la colonia. Para los bioensayos se expusieron grupos de 20 estados larvales de cuarta temprana a un rango de concentraciones de espora liofilizada/polvos de cristal en 100 mi de agua desionizada mantenida en recipientes de plástico de 237 mi. Siete a 9 diferentes concentraciones de los polvos, que producen mortalidad entre 2 y 98% después de 48 horas, se replicaron en 5 diferentes días. Para el bioanálisis en las que se probaron diferentes combinaciones de CytlA y B . sphaericus 2362, diferentes proporciones de estas toxinas se basaron en los pesos de los polvos liofilizados de la cepa bacteriana. Debido a que se limitó la cantidad de cristales de CytlA purificados, los bioensayos con estos polvos utilizaron 10 estados larvarios de cuarta temprana mantenidas en 10 mi de agua desionizada en recipientes de plástico de 30 mi y se replicaron en 2-3 días diferentes. Los bioensayos que combinan el polvo técnico de B . sphaericus 2362 y los cristales purificados de CytlA en una proporción 10:1 (10 partes de B . sphaericus 2362:1 parte de cristales CytlA) se basaron en los pesos de los polvos liofilizados de B. sphaericus 2362 y CytlA. Todos los datos se sometieron a análisis probit utilizando un programa para la PC. Los valores de respuesta a la dosis con límites confiables de sobreposición no se consideraron ser significativamente diferentes. Las proporciones de resistencia se calcularon al dividir el valor de concentración letal respectivo para las cepas BS-R entre el de la cepa Syn-P. Las proporciones de resistencia cuyos límites confiables contenían el número 1 no se consideraron ser significativas. Evaluación de sinergismo Las interacciones sinergísticas entre B. sphaericus 2362 y CytlA se evaluaron utilizando el método de Tabashnik, Appl Environ Entomol 58:3343-3346 (1992) . Los valores de concentración letal teóricos para las diferentes mezclas de CytlA y B. sphaericus 2362 se calcularon a partir de los medios armónicos ponderados de los valores individuales para esas toxinas. Debido a que el polvo de B. sphaericus 2362 no fue tóxico para la cepa BS-R en ninguna de las concentraciones probadas, el cálculo de la toxicidad teórica de una combinación de CytlA y B. sphaericus 2362 se basó en la toxicidad y proporción de CytlA sola para esta cepa. El factor de sinergismo (SF) , definido como la proporción del valor de concentración letal teórico para el valor de concentración letal observado, se determinó por las combinaciones de cepas B. sphaericus 2362 y CytlA así como por las combinaciones de B. sphaericus 2362 y cristales CytlA purificados. Cuando la proporción fue mayor de 1, las interacciones de toxina se consideraron sinergísticas debido a que la toxicidad excedió el valor predicho a partir de la toxicidad aditiva individual. Cuando la proporción fue menor de 1 , la interacción se consideró antagonista, considerando que una proporción de 1 indica que los valores fueron aditivos . B. Resultados En los bioenaayos para determinar los valores de línea basal de la toxina bajo condiciones estándar contra las cepas de mosquitos resistentes y sensibles, ninguna mortalidad resultó de la exposición de BS-R, la cepa resistente de Cx. quínquefasciatus, a 1000 g/ml de B. sphaericus 2362. Esta concentración fue 149,000 veces mayor que la LCS0 (0.0067 µg/ml) obtenida contra Syn-P, la cepa sensible. Cuando el bioensayo se llevó a cabo en 10 mi de agua con 10 larvas por recipiente en lugar de 20 larvas en 100 mi, no se obtuvo mortalidad contra BS-R, pero la toxicidad de BS 2362 fue menor (LC50, 0.032 µ9/p?1) contra Syn-P. El incremento de densidad larval se ha mostrado previamente para requerir cantidades más bajas de toxina Btí para inducir el mismo nivel de mortalidad observada en densidades menores (Aly et al., 1988) . La diferencia estimada en la sensibilidad de BS-R y Syn-P utilizando el sistema de ensayo más pequeño fue 31,000 veces. La cepa bacterial CytlA fue ligeramente menos tóxica para la cepa BS-R (LC50, 32.5 µ9/p?1) que para Syn-P (LC50, 11.7 9/p?1) en el sistema de bioensayo estándar. Sin embargo, en las pruebas que utilizan cristales CytlA en el sistema de bioeensayo más pequeño, ninguna diferencia en la sensibilidad se observó (LC50s, ca. 20 µ9/t?1) entre BS-R y Syn-P. Agregar CytlA a las preparaciones de B . sphaericus 2362 restablece la mayoría de su toxicidad contra la cepa de Cx quinquefascíatus resistente a BS-R. Una proporción de B . sphaericus 2362 a CytlA de 10:1 fue elevadamente tóxica para las cepas de mosquitos tanto resistentes como sensibles. Los niveles de toxicidad para esta combinación fueron mayores contra Syn-P que para BS-R, con valores de LC9S de 0.442 y 36.6 µ9/p?1, respectivamente, y una proporción de resistencia (LC95) de 82.9 para BS-R. La proporción 5:1 fue más tóxica hacia Syn-P y BS-R, y la proporción de resistencia en el nivel LC95 se redujo a 34.4 veces. A una proporción de 3:1 de B. sphaericus 2362:CytlA, la mezcla fue de nuevo significativamente más tóxica para BS-R (LC50, 1.99 µ9 p?1), y la proporción de resistencia disminuyó a 15.4 veces en el nivel de LC95. La toxicidad en una proporción de 1:1 contra BS-R no fue significativamente diferente de esa de la proporción 3:1. En general, como la proporción del B. sphaericus 2362 al CytlA se incrementó, la toxicidad se incrementó hacia las cepas de mosquito tanto resistentes cómo sensibles. Sin embargo, las proporciones de resistencia en los valores de LC95 para BS-R declinaron a niveles insignificantes para las proporciones 1:3, 1:5 y 1:10, en las cuales CytlA fue el componente principal. El cálculo de SF para estas combinaciones revela sinergismo significativo entre CytlA y B. sphaericus 2362 contra las cepas BS-R, pero no contra Syn-P. Los valores SF varían de 10 - 137 en el nivel LC95 para BS-R. Los niveles más altos de sinergismo se observaron en las combinaciones en las que CytlA estuvo presente en la proporción más baja (10:1, 5:1 y 3:1) . Estas combinacioes fueron antagónicas hacia Syn-P en el nivel LC95 a proporciones de 1:10, 1:5 y 1:3, y aditivos o ligeramente sinergísticos a proporciones de 1:1, 3:1, 5:1 y 10:1, i. e., en donde B. sphaericus se volvió el componente predominante. Los bioensayos que utilizan B. sphaericus 2362 combinado con los cristales CytlA purificados a una proporción de 10:1 demostró que esta combinación fue altamente tóxica tanto para BS-R (LC95, 4.96 µ9/?t?1) como para Syn-P (LC95 2.37 µg/ml) . Aunque la cepa BS-R fue ligeramente menos sensible a la mezcla, los valores de toxicidad no fueron significativamente diferentes. De manera importante, no se detectó resistencia contra la cepa BS-R con esta combinación, que tuvo un elevado valor SF de 278. C. Discusión Combinar CytlA con BS 2362 restableció la toxicidad de este último contra una cepa altamente resistente de Cx quinquéfasciatus . Además fuimos capaces de restablecer completamente la toxicidad con concentraciones subletales de cristales CytlA, y por lo tanto suprimir la resistencia para B. sphaericus en la cepa de mosquito BS-R. En contraste a los elevados niveles de actividad observada contra la población de mosquito resistente, poca o ninguna actividad mejorada resultó con estas mismas mezclas contra la cepa de referencia no resistente, Syn-P. La capacidad de CytlA a concentraciones bajas para restablecer la elevada toxicidad para fl. sphaericus 2362 contra los mosquitos resistentes tiene implicaciones prácticas para el control de poblaciones de Culex ? proporcionar discernimiento en este modo de acción. Los larvicidas bacteriales basados en B. sphaericus se utilizan en varios países y la resistencia en poblaciones de campo de Cx quinquéfas iatus ya se ha reportado en Francia, Brasil e India. Los resultados de nuestros estudio indican que agregar CytlA a una proporción tan baja como 1:10 a larvas de B. sphaericus restablece la mayoría de la toxicidad contra aún poblaciones altamente resistentes de Cx. quinquefasciatus. Por lo tanto, CytlA proporciona una herramienta práctica para manejar la resistencia de B. sphaericus. Además, agregar una pequeña cantidad de CytlA a preparaciones de B. sphaericus puede retrasar la resistencia en las poblaciones de mosquitos en las que ya no se ha desarrollado . Otros han mostrado que una proteína Cyt diferente, CytlAb de B. thuringiensis subespecie edellin, pude suprimir la resistencia a B. sphaericus 2291, una cepa mosquitocida de estas bacterias que producen un gran cristal de toxina, en Cx pípiens (Thiéry et al., 1998) . Sin embargo, la supresión de CytlAb de la resistencia a B . sphaericus 2297 fue mucho menos efectiva que la supresión de CytlA de la resistencia a B. sphaericus. La capacidad reducida de CytlAb para suprimir la resistencia a B . sphaericus 2297 puede deberse a la toxicidad 5 veces menor de esta toxina Cyt para Cx pipiens en comparación a CytlA (Thiéry et al., App Environ Microbiol 63 :468-473 (1997) ) . Se desconoce cómo CytlA solo restablece la toxicidad de B. sphaericus 2362. Sin embargo, estudios previos del mecanismo de resistencia en nuestra cepa BS-R de Cx quinquefasciatus y las propiedades de unión de CytlA sugieren que CytlA ayuda en la unión e inserción de la toxina en la membrana microvilar. Nuestra cepa resistente de Cx quínquefasciatus no tiene receptor funcional para la toxina de B. sphaericus 2362 y por lo tanto no puede unirse de manera efectiva a las microvellocidades del intestino medio. Los estudios de CytlA han mostrado que perturba las membranas al unirse a la porción lípida, y que también se une a las toxinas Cry. Además, en la presencia de las toxinas BTI Cry, CytlA se une a las microvellocidades de las células en el caeca gástrico y el intestino medio posterior de la larva del mosquito. Estas observaciones sugieren varios mecanismos para restaurar la toxicidad de B. sphaericus. Las toxinas de CytlA y B. sphaericus pueden unirse juntas después de la disolución, y después insertarla en la membrana como un complejo debido a las propiedades lipofílicas de CytlA. Otra posibilidad es que CytlA pueda unirse primero a la membrana después que la toxina de B. sphaericus se une a CytlA y se inserta en la membrana. Finalmente, CytlA puede penetrar la membrana causando lesiones que permiten a la toxina de B. sphaericus ganar acceso al objetivo original. El sinergísmo que obtuvimos con las combinaciones de CytlA y B . sphaericus 2362 también proporciona evidencia adicional que CytlA mejora la toxicidad al asistir a otras toxinas de proteína en la unión a la membrana microvilar del mosquito, especialmente aquellas que no se unen eficientemente- En estudios previos demostramos que CytlA puede sinergizar las toxinas de Cy4 y Cryll a partir de cepas mosquitocidales de B. thuringiensis contra mosquitos resistentes. Sin embargo, el sinergísmo en mosquitos no resistentes se observó sólo con las toxinas de Cry4 y CryllA de BTI, no con la toxina de CryllB de B. thuringiensis subes . jegathesan que es mucho más tóxica que CryllA. Se observó un patrón similar de sinergismo en estudios actuales en donde CytlA sinergizó la toxicidad de B. sphaericus 2362 contra la cepa resistente BS-R, pero no contra la cepa sensible Syn-P. La implicación de estos resultados, en conjunto con aquellos obtenidos en los estudios previos anteriormente citados, es que las toxinas que son altamente tóxicas o tienen alta afinidad de unión, tal como CryllB o la toxina de unión de B. sphaericus 2362, gana poco o ningún valor a partir de la unión asistida por CytlA. Pero cuando los receptores de toxina se modifican o pierden completamente la resistencia, la capacidad de CytlA para unirse y perturbar la membrana microvilar restablece la capacidad de estas toxinas para insertarlas en la membrana y ejercer la toxicidad. Como, tanto las toxinas de CytlA como las de B. sphaericus se disuelven en el lumen del intestino medio del mosquito, ellas pueden asociarse inmediatamente después de la disolución en el lumen así como en la superficie de la membrana microvilar. Una implicación de estos resultados es que CytlA, y posiblemente otras toxinas de Cyt , pueden extender el espectro insecticida de las toxinas de proteína no Cyt a otras especies de insectos.
Tabla 3. Toxicidad del polvo técnico B. sphaericus (cepa 2362), polvo de CytlA cristal/espora a partir de B. t, subesp. israelensis y varias combinaciones de B. sphaericus y CytlA contra (Syn-P) susceptible y C. guinguefasciacus resistente a B. sphaericus (BS- )
LC!0 ig/ml) LC95 ^g/ml) Inclina Pro . de Resist . SF ción Toxina (s) Cepa No. (limites ( limitea (± SE) xJ LC.l0 (PL) LC ( FL) LC50 LC95 confiables) confiables ) B.sphaerlcue (cepa 2362) Syn- 1, 100 0.00671 0.466 0.89 13.1 1.0 1.0 (0.0O55- (0.300- (0.045) 0.0082) 0.790) BS-R 600 Sin -149, 000 mortalidad CytlA Syn- 600 11.7 59.8 2.3 7.3 1.0 1.0 (10.2-13.4) (47.7- (0.16) 79.7) BS-R 700 32.5 222 2.0 4.1 2.7 3.7 (23.3-37.6) (172-304) (0.12) (2.3- (2.6- 3.3) 5.3 B. sphaerlcua + CytlA (10 :1)° Syn- 900 0.0288 0.0422 1.4 22.8 1.0 1.0 0.26 1.2 (0.0163- (0.162- (0.21) 0.0508) 1.23) BS-R 800 2.47 36.6 1.4 25.4 85. B 82.9 132 61 (1.46- .20) (14.0- (0.17) (56. T- (39- 97.4) 129) 174) B. sphA ricuB + CytlA (5 :1) Syn- 700 0.0274 0.278 1.6 2.4 1.0 1.0 0.29 2.0 p (0.0232- (0.209- (0.10) 0.0322) 0.397) BS-R 1, 000 1.23 9.58 1.8 12.5 45.0 34.4 155.9 136.8 (1.05-1. 3) (7.49- (0.11) (38.1- (25.2- 12.9) 53.2) 46.9) B. ephaericuB + Cy lA (3 :1) Syn- 800 0.0147 0.652 1.0 27.1 1.0 1.0 0.6 1.0 p (0.0086- (0.177- (0.12) 0.0354) 2.40) BS-R 600 1.99 7.17 2.9 6.0 297 15.4 65 124 (1.80-2.22) (5.87- (0.22) (255- (10.9- 9.31) 347) 1.7) B. sphaericus + CytlA (1 :1) Syn- 1, 000 0.03T1 0.464 1.5 10.1 1.0 1.0 0.35 2.0 p (0.0323- (0.34B- (0.08) 0.0449) 0.655) BS-R 1, 000 0.735 6.49 1.7 5.8 19.3 14.0 B8 69 (0.632 - (5.06- (0.09) (16.5- (10.5- 0.853) 8.73) 22.5) 1B .7) B. sphx ricus + CytlA (1 :3) Syn- 900 0.234 7 - 54 1.1 11 - 5 1 - 0 1.0 0.11 0.24 p (0.191- (5.00- (0.06) 0.287) 12.5) BS-R 900 1.71 18.4 1.6 6.5 7.3 2.4 25 16 (1.45-2.00) (1 .1- (0.09) (6.3- (1 -8- 25.5) 8. 5) 3. 2) sphaericus + CytlA (1 : 5) Syn- 1, 000 0.169 6.74 1 .1 13 .5 1 .0 1 .0 0.21 0.39 (0 - 149- (4-66- (0. 06) 0.236) 10.6) BS-R 900 1.56 11.8 1 .9 8. 9 8 .2 1 .8 25.3 23.0 (1 .34-1. Bl) (9.23- (0. 11) (6 .9- (1 .3- 15.9) 9. 6) 2. 3) aphaericus + CytlA (1: 10) Syn- 900 1.06 25.9 1 .2 4. 8 1 .0 1 .0 0.10 0.17 (0. B59- (18.1- (0. 07) 1.23) 40.1) BS-R 900 4.72 24.6 2 .3 13 .0 4 .4 1 .0 7.7 10 - 0 (4 .12-5.38) (19.8- (0. 15) (3 .7- (0. 69- 32.0) 5. 2) 1. 3) SF, factor de sinergismo Las proporciones en paréntesis representan la proporción relativa del polvo técnico de B. aphaericus al polvo de CytlA espora/cristal (BS:CytA) . Todas las proporciones se basaron en el peso de cada uno de los polvos respectivos.
Ejemplo 6 Uso de las Secuencias 5-mer Polipurina y Secuencias STAB-SD en Serie Se exploró la capacidad de las secuencias de polipurina más cortas que las secuencias STAB-SD de longitud completa para incrementar la producción de la proteína. Como se anotó en esta sección en las secuencias STAB-SD, supra, se considra que las secuencias STAB-SD en la porción no traducida de un gen mejora la producción de la proteína codificada por el gen mediante la protección del ARNm a partir de la acción de la endoribonucleasa 5' . Además se considera que las secuencias de polipurina tienden a caracterizar los pares de bases de las secuencias STAB-SD con una secuencia de polipirimidina en el extremo 3' del ARNr 16S . Al iniciar con la longitud completa de la secuencia 9-mer STAB-SD de cry3A, GAAAGGAGG (SEQ ID NO: 1) , se crearon dos subsecuencias 6-mer: AGGAGG (SEQ ID NO: 12 compuesta de los últimos seis nucleótidos de la secuencia STAB-SD) la cual se llamó PPS-I para la "secuencia- 1 de polipurina" y GAAAGG (SEQ ID NO: 13, compuesta de los primeros seis nucleótidos de la secuencia STAB-SD) , la cual se nombró PPS-III. Cada PPS se colocó en una construcción con los promotores Bt del gen cytlA y la eficiencia de cada PPS como un estabilizador 5' se determinó utilizando la proteína cry3A como un informador. Las secuencias STAB-SD duales también se probaron. Se hicieron una serie de construcciones para probar el efecto sobre la producción de la proteína de PPS-I del PPS-III, de modificar una secuencia de polipurina para cambiar algunas purinas a pirimidinas y el efecto de tener múltiples secuencias STAB-SD y el efecto de separar las múltiples secuencias STAB-SD por diferentes distancias. Todos los otros componentes, (es decir la región corriente arriba, la región UTR, la estructura de ciclo troncal y la región de codificación) fueron las mismas en todas las construcciones . El pCI-10 contuvo solamente un promotor Btl sin una secuencia de polipurina u otra secuencia estábil i zador . El pCI-20 contuvo un promotor Btl y PPS-I. En pCI-21, PPS-I se modificó a partir de 5'-AGGAGG-3' hacia la secuencia 5'-ATTATT- 3 ' , de manera que ya no se contuvo una secuencia de polipurina. En pCI-30, 3 nucleótidos corriente arriba de PPS-I se modificaron a partir de 5'-TTT-3' hasta 5'-GAA-3' para regresar al 6-mer a la secuencia nativa STAB-SD. Por lo tanto, el PPS-I en pCI-20 ( 5 ' TTTAGGAGG-3 ' ) se cambió a STAB-SD en pCI-30 ( 5 ' -GAAAGGAGG- 3 ' ) , pCIII-10 contuvo promotores Bt duales pero no una secuencia PPS, mientras que pClll-20 contuvo promotores Bt duales y PPS-III. pCI-50 contuvo dos secuencias STAB-SD que se separaron por 8 nucleótidos. pCI-60 también contuvo dos secuencias STAB-SD, pero en esta construcción, se separaron por 33 nucleótidos. Las cantidades relativas de la producción de la proteína Cry3A de algunas de las construcciones probadas se establecen abajo: pCI-10 (promotor Btl) : 10% pCI-20 (promotor Btl+PPS-I) : 100% (utilizados como un estándar) pCI-21 (promotor Btl + PPS-I sin secuencia de polipurina) : 7% pCIII-10 (promotores Bt duales, sin PPS) : 14% pCIII-20 (promotores Bt duales + PPS-III) : 37% pCI-30 (promotor Btl + STAB-SD) : 162% pCI -50 (promotor Btl + STAB-SD dual separada por 8 nucleótidos) : 198% pCI-60 (promotor Btl + STAB-SD dual separada por 33 nucleótidos) : 334% De este modo, tanto PPS-I como PPS-III (6-mers contiguos de los primeros 6 nucleótidos de una secuencia STAB-SD de 9-mer y de los últimos 16 nucleótidos a partir de la misma secuencia) resultaron en más expresión de la proteína que la lograda a partir de construcciones sin las secuencias. La secuencia STAB-SD de longitud completa dio marcadamente mejores resultados. Además, tanto las secuencias STAB-SD duales dieron como resultado aún mayores niveles de la producción de proteína con las secuencias STAB-SD duales separadas por 33 nucleótidos dándo como resultado aproximadamente el doble de la producción de la proteína de la construcción con una sola secuencia STAB-SD. Sin desear limitarse por la teoría, las diferentes cantidades de la expresión de la proteína exhibidas por las construcciones pCI-50 y pCI-60 pueden deberse al hecho de la longitud de separación de las subunidades ribosomales 3 OS es de aproximadamente 30 nucleótidos. Esto puede permitir que las secuencias STAB-SD de aproximadamente 30 o más nucleótidos se aparten para interactuar con dos subunidades 3 OS al mismo tiempo . Todas las publicaciones y solicitudes de patente citadas en esta especificación se incorporan en la presente mediante la referencia como si cada publicación o solicitud de patente individual se indicara específica e individualmente para incorporarse mediante la referencia. Aunque la invención anterior se ha descrito en algún detalle a manera de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad del entendimiento, será fácilmente aparente para el experto ordinario en la materia a la luz de las enseñanzas de esta invención que ciertos cambios y modificaciones pueden hacerse a la misma sin apartarse del espíritu y alcance de las reivindicaciones anexas.