KR20030011802A

KR20030011802A - 로진과 효소를 포함하는 방오 도료 조성물

Info

Publication number: KR20030011802A
Application number: KR1020027012611A
Authority: KR
Inventors: 올러만너드; 슈네이더아이브
Original assignee: 바이오로커스 에이피에스
Priority date: 2000-03-24
Filing date: 2001-03-23
Publication date: 2003-02-11
Also published as: US20030166237A1; AU2001242318A1; WO2001072911A1; JP2003528967A; KR100760270B1; EP1272570A1

Abstract

본 발명은 엔도펩티다제인 서브틸리신(EC 3.4.21.62) 및 Alcalase

Description

로진과 효소를 포함하는 방오 도료 조성물{ANTIFOULING PAINT COMPOSITION COMPRISING ROSIN AND ENZYME}

모든 수중 환경의 표면은 박테리아, 원생동물, 해조류 및 무척추동물에 의한 맹렬한 부착 압박을 받는다. 이 과정을 부착이라 지칭한다. 부착의 방지는 해양 운송 작업 및 해양 공학(앞바다 건설, 열교환기, 해양 감지기, 수중 삽입물, 양식장 건설 등)에서 특히 관심이 있다. 선박의 덮개 상의 부착은 예를 들어 마찰성 끌림을 증가시켜서 대응하는 속도와 이동성의 감소 및 연료 소모와 부착의 제거와 연관된 유지비의 증가를 가져온다. 더욱이, 배의 프로펠러에 부착된 생체의 아주 작은 수 조차도 프로펠러의 효율을 유의하게 감소시키거나 부식의 문제를 일으킨다.

부착 과정에서 유의하게 기여하는 해양 생체의 중요한 군은 만각류로 통칭되는 갑각류에 속하는 생체이다. 이들 생체는 시프리페디아(Cirripedia) 아강, 크러스타시(Crustacea) 목에 속한다. 시프리페디아(Cirripedia)의 일반적인 성질은 성체 시기에 고착성이고 제 1 더듬이 상의 시멘트샘의 분비에 의하여 고형의 표면에 부착하게 된다. 시프리페디아(Cirripedia) 아강은 네개의 목: 토라식(Thoracic), 아크로토라시카(Acrothoracica), 아스코토리카(Ascothorica) 및 리조세팔라(Rhizocephala)를 포함한다. 이들 중, 따개비 또는 암만각류로도 불리우는 발라누스(Balanus) 속에 속하는 토라식(Thoracic)의 생체는, 선박 덮개같이 잠긴 표면의 부착에 일반적으로 관여한다.

현재, 방오 도료 조성물의 대부분은, 예를 들어, 해수와 서서히 반응하여 수용성 염을 배출하고 도료의 모체로부터 삼출되는 중금속 같은 독성 물질을 함유한다. 그러나, 해양 환경에서 이들 독성 물질의 지속적 축적은 해양 생물에 악영향을 끼쳤다. 그러므로, 이같은 독성 물질은 전세계적 공해 위험을 환경에 가하고, 따라서 그것의 사용에 제한이 적용되어 왔고, 적용되고 있으며 그들 중 다수가 이미 다수의 국가에서 사용 금지되었다. 또한, 현재 알려진 방오도료 조성물의 대부분은 매일 도료 조성물과 함께 작업하는 페인트공 같은 사람에게 심각한 건강문제를 가할 수 있는 합성 바인더 성분에 기초한다.

따라서, 환경에게 유의한 해를 가하거나 인간에 건강에 위험 가하지 않는 방식이 되도록, 독성 첨가체 또는 바인더를 사용하지 않는 방오 방법 및 조성물의 필요가 있다. 이러한 필요는 효소의 사용을 포함하는, 대안적 환경친화적이고 무공해성인 방오 방법을 개발하여 상기 문제를 해결하려는 시도를 결과하였다.

그러므로, US 5,998,20는 화학적으로 결합된 효소를 갖는 불활성 모체를 함유하는 조성물을 적용함으로써 수중생체에 의한 수중 환경과 접촉하는 수중 기구의부착을 방지하는 방법을 기재한다. 모체 또는 바인더는 바람직하게는 친수성 폴리우레탄 프리폴리머 같은 폴리우레탄 폴리머이고, 프로테아제 같은 화학적으로 결합된 효소는 박테이라, 균류, 해조류, 절지동물 및 연체동물 같은 수중 생체의 부착을 방해할 수 있다.

US 5,770,188는 6 내지 30 개의 탄소 원자를 갖는 지질 및 도료 수지와의 피복의 결과로 유기 용매에서 고활성 지질-피복 효소를 포함하는 방오 도료 조성물을 기재한다. 유기 용매 도료에 대한 도료 수지 및 수성 도료가 적용가능함이 기재된다.

US 5,919,689는 에폭시, 폴리우레탄, 폴리에스테르, 유리섬유, 실리콘 또는 아크릴계 물질 같은 염기성 물질, 및 아밀로스 분해 또는 단백질 분해 효소와 아밀로스 분해 또는 단백질 분해 효소를 생산하는 미생물을 포함하며, 효소와 미생물은 조성물로 피복된 해양 표면의 부착을 감소시키거나 방지하는 결과를 가져오는 해양 방오 조성물 또는 도료를 기재한다.

그러나, 본 발명자에게 알려진 종래 기술 방법 또는 도료 조성물의 어느 것도 해양 표면 같은 표면의 부착 감소 또는 방지를 위한 방오 도료 조성물에서 효소와 천연 기원의 로진 화합물의 조합의 사용을 개시하거나 시사하지 않는다.

본 발명에 따르면, 적어도 하나의 효소와 적어도 하나의 로진 화합물을 포함하는 방오 도료 조성물로서, 상기 조성물로 피복된 표면의 부착을 감소 또는 방지하는 관점에서 효과적인 양으로 효소가 존재하고 로진 화합물은 천연기원인 것을 특징으로 하는 방오 도료 조성물을 이제 제공한다. 또한, 천연 기원의 로진 화합물을 바인더로 사용함으로써, 본 발명의 방오도료 조성물은 합성 바인더와 비교하여 건강위험에 대하여 고도로 이롭다.

본 발명은 선박 덮개 및 해양 구조물 같이 때때로 또는 연속적으로 물에 잠기는 구조물 표면의 부착(fouling: 오염)을 방지하거나 감소시키는 분야에 관한 것이다. 더 구체적으로, 수생 생체, 특히 만각류의 부착 및 정착을 저해하는 관점에서 효과적인, 로진과 효소를 포함하는 방오 도료 조성물이 제공된다.

(발명의 개요)

따라서, 본 발명은 한 양태에서 적어도 하나의 효소와 적어도 하나의 로진 화합물을 포함하는 방오 도료 조성물로서, 상기 조성물로 피복된 표면의 부착을 감소 또는 방지하는 관점에서 효과적인 양으로 효소가 존재하는 것을 특징으로 하는 방오 도료 조성물과 관련된다.

표면에 유효량의 본 발명에 따른 방오 도료 조성물을 도포함으로써 수중 생물에 의한 표면의 부착을 방지하기 위한 방법이 또한 제공된다.

더 나아간 양태에서, 적어도 하나의 서브틸리신(EC 3.4.21.62)을 포함하는 방오 도료 조성물로서, 상기 서브틸리신은 다음 특징: (i) pH 범위 약 7-10에서 최적 활성 및 (ii) 온도 범위 55-65 ℃에서 최적 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 방오 도료 조성물이 제공된다.

더욱 더 나아간 양태에서, 본 발명은 방오 도료 조성물에서의 서브틸리신(EC 3.4.21.62)의 사용과 관련되며, 상기 서브틸리신은 다음 특징: (i) pH 범위 약 7-10에서 최적 활성 및 (ii) 온도 범위 55-65 ℃에서 최적 활성을 가진다.

(본 발명의 상세한 개시)

본 발명의 주요 목적은 방오 도료 조성물을 제공하는 것이다. 그러므로, 본 발명에 따른 조성물로 피복된 해양 표면의 부착을 효과적으로 감소 또는 방지하는조성물이 제공된다.

본 발명에 따른 방오 조성물은 냉각탑 시스템, 담수 배관 시스템, 해수 배관 시스템, 연못, 호수, 항구 및 염분제거 시스템을 포함하는 담수, 해수 또는 염분있는 물 같은 수성 환경에 유용하다.

용어 "부착"은 여기에서 박테리아, 원생동물, 해조류, 및 만각류와 조개를 포함하는 무척추동물 같은 수성환경에 일시적 또는 영구적으로 잠기는 구조물의 표면에 수생 생체가 부착하는 것을 지칭하기 위하여 사용된다.

본 발명에 따른 방오 도료 조성물은 적어도 하나의 효소와 적어도 하나의 로진 화합물을 포함하는데, 효소는 조성물로 피복된 표면의 부착을 감소시키거나 방지하기 효과적인 양으로 존재한다.

본 발명의 한 양태에서, 적어도 하나의 효소는 단백질 분해, 헤미셀룰로스 분해, 셀룰로스 분해, 지질 분해 및 아밀로스 분해 활성 효소로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.

본 문맥에서 "단백질 분해 활성"은 단백질을 분해하는 능력을 가진 어떤 효소와 관련된다. "헤미셀룰로스 분해 활성"은 엔도-1,4-β-크실라나제(E. C. 3.2.1.8), 크실란 엔도-1,3-β-크실로시다제(E. C. 3.2.1.32), 글루쿠로노아라비노크실란 엔도-1,4-β-크실라나제(E. C. 3.2.1.136), β-만노시다제(E. C. 3.2.1.25), 만난 엔도-1,4-β-만노시다제(E. C. 3.2.1.78) 및 만난 엔도-1,6-β-만노시다제(E. C. 3.2.1.101) 같은 크실란 및 만난을 포함하는 일반적으로 헤미셀룰로스로 지칭되는 화합물의 군에 속하는 적어도 한가지 물질을 분해하는 능력이 있는 크실라나제 같은 어떤 효소와 관련된다.

"셀룰로스 분해 활성"을 가지는 효소는 또한 일반적으로 셀룰라제라고도 지칭되고, 여기서는 어떤 셀룰로스 가수분해 효소를 나타내기 위하여 사용된다.

"지질 분해 활성" 효소는 또한 리파제라고도 일반적으로 지칭되고, 여기에서 짧은, 중간 및 긴 사슬 길이의 지방산을 절단시킬 수 있는 효소를 포함하는 어떤 트리아실글리세롤 가수분해 효소를 나타낸다. 본 발명에 의하여 포괄되는 지질 분해 활성을 가진 다른 효소는 포스포리파제, 리소포스포리파제, 아크릴글리세롤 리파제 및 갈락토리파제를 포함한다.

"아밀로스 분해활성" 효소는 본 문맥에서 α- 및 β- 아밀라제같은 아밀라제, 아밀로글루코시다제, 풀룰라나제, α-1,6-엔도글루카나제, α-1,4-엑소글루카나제 및 이소아밀라제를 포함한다.

본 발명의 한 양태에서 적어도 한 효소는 엔도펩티다제 서브틸리신(EC 3.4.21.62) 같은 엔도펩티다제를 포함하는 프로테아제이다.

프로테아제의 유리한 방오 효과는, 정착을 위한 접착제로서 만각류로부터 분비되는 단백질성 물질을 분해하는 프로테아제의 능력 때문으로 믿어지고 있다.

본 발명에 따라서 엔도펩티다제 서브틸리신(EC 3.4.21.62)은 Alcalase같은 시중구입가능한 효소 제제를 적용함으로써 유리하게 사용될 수 있다. 현재 바람직한 구체예에서 효소 제제 Alcalase 2.5 L, Type DX가 적용된다. 그러나, Alcalase 2.0 T, Alcalase 3.0 T, Alcalase 2.5 L, Type DX를 포함하는 다른Alcalase제품이 본 발명에 따라 적용될 수 있다는 것이 또한 고려된다. 이 같은 Alcalase효소 제제는 Novozymes(Novozymes, Novo Alle, 2880 Bagsvaerd, Denmark)로부터 구입가능하다. Alcalase는 고온 및 중간정도의 염기성에서 양호한 성능을 특징으로 하는 세린형 프로테아제이다. 예를 들어 다양한 Alcalase 제품의 활성 특성에 대한 더 나아간 정보는 Novozyme A/S (B259f-GB)로부터의 제품 목록에 기재된다.

그러나, Alcalase의 프로테아제로서의 동일한 특성을 본질적으로 가지는 다른 프로테아제가 본 발명에 따라 성공적으로 적용될 수 있다는 것은 본 발명의 범위 내에 있다. 그러므로, 본질적으로 알칼라제와 동일한 온도 및 pH 프로필을 가지는 서브틸리신 같은 다른 프로테아제가 사용될 수 있다는 점이 고려될 수 있다. 알칼라제의 온도와 pH 프로필은 Novozyme A/S (B259f-GB)로부터의 제품목록상에서 발견될 수 있다. 따라서, 다음의 특징: (i)pH 범위 7-10에서 최적 활성 및 (ii) 온도 55-65 ℃에서 최적활성을 갖는 서브틸리신(EC 3.4.21.62)이 유리하게 적용되는 본 발명의 범위 안에 있다.

또한, 하나 초과의 프로테아제가, 예를 들어, 몇몇 프로테아제를 포함하는 복합 효소 제제의 사용에 의하여 사용될 수 있다는 것 또한 본 발명의 범위 안에 있다.

상기 언급된 바와 같이, 본 발명에 따른 방오 도료 조성물의 중요한 성분은 로진 화합물이다. 로진은 예를 들어 소나무의 송진에서 천연적으로 존재하는 고체상 물질이고, 살아있는 나무의 올레오레진 삼출물, 오래된 기부 및 크라프트지 제조의 부산물로서 제조되는 톨유로부터 전형적으로 유래한다.

로진 화합물은 예를 들어 인간에게 완전히 무독성이고, 다수의 다른 바인더와 견줄만하고, 상대적으로 저가이고 천연 원료로부터 이용가능한 것과 같이, 방오 도료에서 바인더로서 용도에서 고도로 바람직한 성질을 가진다.

그러므로, 로진은 도료에서 바인더로서 사용되고, 그것에 의하여 예를 들어 에폭시, 폴리비닐아세테이트, 폴리비닐 부티레이트 및 폴리비닐클로라이드 아세테이트 같은 중합성 바인더 성분과 같은 합성 및 더 독성인 바인더에 대한 무독성 대체물을 제공한다.

로진은 그 공급원을 나타내는 고무 로진, 목재 로진, 또는 톨유 로진으로 전형적으로 분류된다. 로진 물질은 비변형, 폴리히드릭 알콜의 에스테르 형태, 분자 고유 불포화성을 통하여 중합된 로진의 형태 또는 수소 첨가된 로진 형태로 사용될 수 있다. 그러므로, 로진은 예를 들어, 수소 첨가, 탈수소화, 중합, 에스테르화, 및 다른 후처리 공정에 의하여 더 처리될 수 있다. 또한, 예를 들어 유리 카르복실산기를 가지는 로진은 금속과 반응할 수 있고, 그것에 의하여 로진 금속염을 형성할 수 있다.

따라서, 본 발명의 방오 도료 조성물의 로진 화합물은 로진, 로진 유도체 및 로진 금속염으로부터 선택된 적어도 하나이다. 로진의 예는 톨 로진, 고무 로진, 및 목재 로진을 포함한다. 로진 유도체의 예는 수소 첨가 로진, 로진을 말레산 무수물과 반응시켜 얻어진 변형 로진, 포르밀화 로진, 및 중합화된 로진을 포함한다.로진 금속염의 예는 로진 아연염, 로진 칼슘염, 로진 구리염, 로진 마그네슘염, 및 로진을 다른 금속의 화합물과 반응시킨 산물을 포함한다.

다음 예에 의하여 설명될 바와 같이, 천연 기원의 로진은 효소와 조합하여 사용될 때, 비-천연 기원의 합성 바인더로 제조된 도료 조성물에서의 효소와 비교할 때 효소 활성이 로진에 의하여 실질적으로 영향받지 않는다는 유리한 효과를 갖는다. 따라서, 프로테아제와 비-천연 기원의 합성 바인더를 포함하는 도료 조성물에서 효소 활성이 없는 것이 발견되었다.

로진은 효소에 고정화 효과를 가지고, 따라서 효소가 도료 조성물로부터 환경으로 배출되는 것을 방지하는 것으로 더 믿어진다.

본 발명에 따르는 조성물은 로진 화합물의 함량이 약 5 내지 60 중량% 범위인 로진 화합물을 포함한다. 로진 화합물의 양은 약 20 중량% 까지 같이 약 10 % 보다 높은 것이 바람직하다. 그러나, 조성물 내의 로진 화합물의 양은, 약 30 % 까지, 약 40 % 까지, 약 50 % 까지, 및 약 55 % 까지와 같을 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르는 착색된 조성물은 약 10-30 중량% 범위의 로진 조성물의 양을 유리하게 포함할 수 있고, 래커 조성물은 로진 조성물의 약 60 중량%까지 포함할 수 있다.

본 발명에 따라서 본발명의 화합물에 포함되는 적어도 하나의 효소는 화합물로 피복된 표면에서 부착을 감소시키거나 방지하는 유효량으로 존재한다. 본 문맥에서 용어 "유효량"은 적어도 부분적으로 박테리아, 원생동물, 해조류 및 무척추 동물과 같은 수생 생체의, 본 발명에 따른 조성물로 피복된 표면상의 정착을 감소시키거나 방해하기 충분한 양을 의미한다. 부착을 충분히 감소시키거나 방지하기위하여 필요한 프로테아제 양을 시험하기 위하여, Willemsen (1994)에 의하여 기재된 정착 분석을 포함한 어떤 유형의 표준 또는 변형된 방오 생물학분석이 적용될 수 있다.

현재 바람직한 구체예에서 효소의 양은 약 0.5-1 중량% 같은 약 0.2-5 중량% 범위를 포함하는 약 0.1-10 중량% 범위내이다.

상기 언급된 바와 같이, 본 발명에 따른 조성물은 하나 이상의 효소를 유리하게 포함한다. 서브틸리신 같은 프로테아제를 아밀로글루코시다제 및/또는 크실라나제와 조합함에 의하여 추가적 방오 효과가 얻어짐이 본 발명자에 의하여 발견되었다. 그러므로, 아밀로글루코시다제 및/또는 크실라나제의 첨가가 해수에 잠긴 표면의 해조류에 의한 부착을 감소시키거나 방지하는 것이 발견되었다. 따라서, 한 유용한 구체예에서, 본 발명에 따른 조성물은 AMG 300 L, Novozyme A/S, Denmark 같은 아밀로글루코시다제(글루칸 1,4-α-글루코시다제; E. C. 3.2.1.3)를 포함한다. 더 유용한 한 구체예에서, 본 발명에 따르는 조성물은 엔도-1,4-β-크실라나제(E. C. 3.2.1.8) 같은 크실라나제를 포함한다. 이 같은 엔도-1,4-β-크실라나제(E. C. 3.2.1.8)의 유용한 예는 시중구입 가능한 펄프자임 HC, Novozyme A/S, Denmark이다.

상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 조성물은 조성물로 표면을 피복시킴으로써 표면의 부착을 방지하거나 감소시키기 위하여 유리하게 적용될 수 있다. 이 같은 표면은, 보트나 선박을 포함하는 배의 표면과 같은 물에 일시적으로 또는 연속적으로 잠기는 구조물의 어떤 표면이 될 수도 있다. 따라서, 본 발명의 한 구체예에서 그와 같은 표면은 선박 덮개이다. 그러나, 앞바다 장치, 파이프, 교각과 부두의 하부구조물, 생선 사육그물을 포함하는 양식장 기구의 표면의 부착은 효과적으로 감소되거나 방지될 수 있다는 것 또한 고려되어야 한다.

본 발명의 방오 도료 조성물의 효과를 개선하기 위하여, 조성물은 해양 생물의 정착을 억제하는 것으로 알려진 생물학적 활성제와 더 조합된다. 그러므로, 한 구체예에서 본 발명에 따르는 조성물은 적어도 하나의 살조제, 제초제, 살균제, 연체동물제거제 또는 방오 활성을 나타내는 다른 화합물을 추가하여 포함한다.

본 발명에 따라서, 방오 도료 조성물은 종래 제조 기술에 따라 제조될 수 있고, 조성물은 프로테아제와 로진 화합물에 추가하여, 바인더 조성물, 안료, 충전제, 분산제, 용매 가소제 및 다른 첨가제 같은 도료 조성물에서 통상적인 성분을 더 함유하고, 조성물은 예를 들어 용매-기제 또는 수중 부유물일 수 있다.

그러므로, 본 발명의 조성물은, 천연 기원의 바인더 성분인 로진 조성물에 추가하여 하나 또는 다수의 폴리비닐아세테이트를 포함하는 합성 중합 바인더 성분 같은 더 나아간 합성 바인더 성분을 더 포함할 수 있음이 고려되어야 한다. 그러나, 첨부된 실시예에서 또한 나타난 바와 같이, 더 나아간 합성 바인더 성분은 효소와 공존가능하다는 점, 즉, 효소는 합성 바인도와 조합하였을 때 효소적으로 활성이라는 점이 중요하다.

본 발명에 따르는 조성물은 실란 화합물 같은 바인더 성분을 포함하는 것이 더 고려된다. 이 같은 실란은 유용한 구체예에서 실란 에스테르, 비닐 실란, 메타크릴록시 실란, 에폭시 실란, 술프 실란, 아미노 실란 및 이소시아노 실란으로부터선택된다.

또한, 방오 도료 조성물은 카올린, 실리카 및 돌로마이트 같은 하나 이상의 충전제를 포함한다.

표면에 유효량의 본 발명의 방오 도료 조성물을 도포하는 단계를 포함하는, 수성 생체에 의한 표면의 부착을 방지하는 방법을 제공하는 것이 본 발명의 더 나아간 목적이다. 본 발명의 방법을 적용함으로써, 박테리아, 원생동물, 균류, 해조류 및 무척추 동물의 군에 속하는 것과 같은 수생 생물이 표면에 부착하는 것이 효과적으로 방지될 수 있다는 것이 고려된다.

그러나, 한 구체예에서 본 방법에 의하여 표면에 부착하는 것이 효과적으로 방지될 수 있는 생체는 만각류와 조개류이다. 이같은 만각류는 발라누스 갈리아투스(Balanus galeatus), 발라누스 앰피트라이트(Balanus amphitrite), 엘미니우스 모데스투스(Elminius modestus), 발라누스 임프로비수스(Balanus improvisus) 및 발라누스 발라노이데(Balanus balanoides)를 포함하는 시프리페디아(Cirripedia) 아강이 될 수 있다.

상기 언급된 바와 같이, 더 나아간 양태에서 본 발명은 적어도 하나의 서브틸리신(EC 3.4.21.62)을 포함하는 방오 도료 조성물로서, 상기 서브틸리신은 다음 특징: (i) pH 범위 약 7-10에서 최적 활성 및 (ii) 온도 범위 55-65 ℃에서 최적 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 방오 도료 조성물과 관련된다. 한 구체예에서 서브틸리신은 Alcalase 2.5 L, Type DX를 포함하는 Alcalase이다.

본 발명을 이제 다음의, 이에 제한되지 않는 실시예에서 더욱 상세히 기술하기로 한다.

실시예 1

만각류를 시험 유기체로 선택하였는데 이것이 배 밑 부착물 군서의 중요 구성원이기 때문이다. 따라서, 만각류인 줄무늬 따개비(Balanus amphrite)의 덩어리로 사육된 사이프리드 유생을 Willemsen (1994)에 의해 기술된 것과 같은 정착 분석법을 위해 사용하였다.

성장한 만각류는 제어된 온도(27±1℃) 및 광 조건(15시간 명기 9시간 암기)에서 폭기하의 용기에서 유지시켰고, 규조인 스켈레토네마 코스타튬(Skeletonema costatum)의 식이와 바다 새우인 알테미아 살리나(Artemia salina)의 유생을 먹이로 주었다. 이어서 덩어리로 산란된 노플리우스 유생을 피펫으로 수집하여 8리터 카보이에 옮기고 스켈레토네마 코스타튬으로 사육하였다. 용기를 27±1℃의 일정한 온도와 15/9h 명/암 광주기에서 유지시켰다. 세균의 성장을 막기 위해 항생제(스트렙토마이신 36.5 mg/l,및 페니실린 21.9 mg/1)를 용기에 첨가하였다.

유생은 4일 후 사이프리드 단계에 이르렀다. 이들 사이프리드를 정착 분석법에 사용하기에 앞서 5일간 (어두운 곳에서 5-6℃에서) 노화시켰다.

세가지 다른 프로테아제 제제의 효율을 시험하기 위해,실험을 이하와 같이 수행하였다. 여기서,효소는 10-1000 ㎍/ml의 농도 범위에서 시험하였다. 시험한 효소 알칼라제(Alcalase),SP 234 및 SP 249는 모두 Novozyme (Novozyme A/S,Novo Alle,2880 Bagsvaerd,Denmark)에 의해 제공되었다. SP 234 및 SP 249는 높은 함유량의 프로테아제 및 다른 비단백질분해 효소를 갖는 실험용 제제이다.

시험을 Steriline Ltd.로부터의 폴리스티렌 멀티 웰(2×3)플레이트에서 4벌로 수행하였다. 25 내지 40개의 사이프리드를 2 ml의 여과된 해수(대조표준) 또는 효소 용액을 함유하는 접시에 (파스테르 피펫을 사용하여) 주입하였다. 0.25 ㎛로 여과된 천연 해수에 효소를 직접 용해시킴으로써 시험용액을 제조하였다. 접시를 27±1℃의 온도에서 15:9 명/암 주기로 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 사이프리드를 해부 현미경을 사용하여 독성의 신호에 대해 스크리닝하였다. 다음에, 40% 포름알데히드의 첨가에 의해 시험을 종결하고, 영구적으로 부착되지 않은 유생의 수를 계수하였다.

이 실험의 결과를 이하 표 1에 요약하였다.

사이프리드 정착
분량(㎍/ml)	10	50	100	500	1000
대조표준	80%	80%	80%	80%	80%
알칼라제	50%	0%	0%	0%	0%
SP 234	85%	88%	75%	10%	0%
SP 249	50%	70%	40%	20%	20%

상기 표 1에서 보는 바와 같이,알칼라제는 50, 100, 500 및 1000 ㎍/ml에서 만각류 정착을 완전히 방지하였다. 두가지 실험용 제제는 알칼라제 만큼 효율적으로 정착을 방지하지 못했다. SP 234만이 1000 ㎍/ml의 비교적 높은 농도에서 사이프리드 부착을 완전히 방지할 수 있었음을 알 수 있다. 또한 1000㎍/ml의 농도로 도포한 SP 249는 사이프리드의 20%를 정착시켰는 바, 사이프리드 정착을 완전히 방지하지 못했음을 알 수 있다.

실시예 2

실시예 1에서 적용된 효소들을 더 비교하기 위하여, 특이적 효소 활성에 기초한 실험을 수행하였다. 원래의 효소 샘플은 다음의 효소 활성(HUT: 티로신 기준의 헤모글로빈 단위)을 지녔다. 프로테아제의 HUT 활성은 예를 들면, Food Chemicals CODEX, 3rd ed., (1981), pp.496-497, National Academy Press, Washington,D.C.에 기술된 바와 같이 구해질 수 있다.

알칼라제: 약 1,300,000 HUT/g

SP 234: 약 500,000 HUT/g

SP 249: 약 600 HUT/g

모든 효소들을 6,000 HUT/I 및 60,000 HUT/I에 해당하는 농도에서 시험하였고, 정착 분석법을 실시예 1에서 앞서 기술한 바와 같이 수행하였다.

이 시험으로부터의 결과를 이하 표 2에 나타내었다.

처리	HUT/I	ppm (㎍/ml)	%사이프리드 정착	G-시험 (ns= 유의하지 않음
대조표준	0	0	63	-
알칼라제	6,000	4.6	34	19.37; p < 0.005
알칼라제	60,000	46	0.8	124.1; p < < 0.005
SP 234	6,000	12	62	0.005; ns
SP 234	60,000	120	52	2.665; ns
SP 249	6,000	1,000	52	2.702; ns
SP 249	60,000	10,000	0	134.6; p < < 0.005

상기 표 2로부터 알칼라제는 6,000 HUT/I (4.6 ppm)에서 정착을 유의하게 저해하고 60,000 HUT/I (46 ppm)에서 정착을 완전히 방지함을 분명히 알 수 있다. SP 234는 6.000 HUT/I 및 60,000 HUT/I 모두에서 정착에 유의한 영향이 없다. SP249는 60,000 HUT/I에서 정착을 완전히 억제하나, 6,000 HUT/I에서 유의한 영향이 없었다.

모든 용액에서, 6,000 HUT/I에서 SP 249를 제외하고는, 사이프리드는 인큐베이션 24시간 후 건강하게 보였고, 용액의 비독성의 특성을 가리킨다. SP 249에서 유생은 6,000 HUT/I용액에서 여전히 살아 있었으나, 그것들은 정상적인 수영 및 정착 작용을 나타내지 않았다.

실시예 3

상기 정착실험에 기초하여, 알칼라제를 더 나아간 연구를 위한 후보로서 선택하였다. 개개의 전형적인 도료 바인더 성분들에서 알칼라제 효소 활성을 시험하기 위하여, 이하의 실험을 수행하였다. 따라서, 알칼라제 (Alcalase 2.5 L Type DX,Novozyme)를 36℃에서 24시간의 인큐베이션 후 잔류 효소 활성을 시험함으로써 방오도료에서 통상 사용되는 7 가지의 다른 전형적인 바인더와의 적합성에 대해 시험하였다.

7 가지의 다른 바인더들은 개질 로진, 수소 첨가 로진, 폴리비닐아세테이트 에멀션, 폴리비닐 메틸 에테르, 폴리염화비닐 공중합체, 아크릴 수지 공중합체 및 실리콘 바인더이었다. 상기 시험한 바인더들은 Hempel Marine Paints A/S (Hempel Marine Paints A/S,Lundtoftevej 150,2800 Lyngby,Denmark)로부터 얻었다.

알칼라제를 4가지 다른 효소 농도(0.25 중량%, 0.50 중량%, 1.0 중량%, 및 2 중량%)에서 상기 바인더들에 첨가 및 혼합하였다. 효소의 첨가량은 다른 바인더들의 건조 물질 함유량을 기준으로 하였다. 알칼라제를 함유하는 다른 바인더 샘플들의 소적들을 만들어 건조하도록 두었다. 충분히 두꺼운 층의 소적들을 만들기 위하여, 추가의 소적들을 효소/바인더 혼합물의 건조된 소적들상에 도포하였다. 건조된 소적들의 중량은 대략 소적 당 0.1-0.15 g의 범위이었다.

다른 양의 효소를 함유하는 효소/바인더 혼합물의 건조된 소적들을 효소 없는 대조표준과 함께 36℃에서 20일 동안 탈지유 한천 플레이트에서 인큐베이션하였다.

효소활성 (투명한 구역, 시각으로 검출됨)
효소량(%)	0.25	0.5	1.0	2
개질 로진, 건조물질 55%	+	+	+	+
수소 첨가 로진, 건조물질 50%	+	+	+	+
폴리비닐아세테이트 에멀션, 건조물질 55%	-	-	+	+
폴리비닐 메틸 에테르, 건조물질 35%	-	-	-	-
폴리염화비닐 공중합체, 건조물질 40%	-	-	-	-
아크릴 수지 공중합체, 건조물질 40%	-	-	-	-
실리콘 바인더, 건조물질 63%	-	-	-	-

표 3으로부터, Alcalase 2.5 L Type DX의 프로테아제 활성은 바인더의 유형에 크게 영향을 받음을 분명히 알 수 있다. 따라서, 천연 유래의 로진 유형, 즉 개질 로진 및 수소 첨가 로진과 조합하였을 때, 프로테아제는 활성임을 알 수 있다. 이와 반대로, 알칼라제를 비천연 유래의 합성 바인더, 즉 폴리비닐 메틸 에테르, 폴리염화 비닐 공중합체, 아크릴 로진 공중합체 및 실리콘 바인더와 조합하였을 때, 프로테아제 활성은 검출되지 않음을 알 수 있다.

따라서, Alcalase 2.5 L Type DX의 프로테아제는 천연 유래의 로진 유형을 갖는 해양 도료에서 방오제의 목적에 크게 효율적일 수가 있다고 결론지을 수 있다.

실시예 4

두가지 다른 시판 효소제제 (아밀로글루코시다제 및 크실라나제 제제)와 조합하여 Alcalase 2.5 L Type DX의 프로테아제를 포함하는 도료 조성물의 효율을 시험하기 위하여 해수에서 현장 실험을 수행하였다. 따라서, 효소들을 함유하는 두가지 도료를 제조하였다. 도료는 그것들이 용매-기제 (BioB)인지 또는 수기제 (BioS)인지에 따라 BioB 및 BioS라 칭하였다.

용매-기제 도료(BioB)는 다음 성분들: 수소 첨가된 천연 로진 (20 wt%), 아크릴 수지(20 wt%), 분산제(0.75 wt%), 티탄디옥시드, 돌로미트(10 wt%), 활석 분말(1.25 wt%), 방향족 탄화수소(3 wt%) 및 폴리비닐메틸에테르(5.0 wt%)을 함유하였다.

수기제 도료(BioS)는 다음 성분들: 폴리비닐아세테이트(13 wt%), 분산제(0.75 wt%), 티탄디옥시드(10.0 wt%), 돌로미트(40.0 wt%), 활석 분말(1.25 wt%), 천연 로진(13.0 wt%) 및 물(11.0 wt%)을 함유하였다.

다음 효소들:

알칼라제 : (Alcalase 2.5 L Type DX,Novozyme)

AMG: (AMG 300 L,Novozymes A/S,Denmark)

펄프자임 : (Pulpzyme HC,Novozymes A/S,Denmark)을 도포하였다.

효소들을 표 4A에 주어진 다른 양들로 두가지 다른 해양 도료에 첨가하였다.

도료	효소(%중량)	총 효소 농도(%중량)
A 0.5	알칼라제(0.5%)	0.5
A 2.0	알칼라제(2.0%)	2.0
B 0.5	AMG(0.5%)	0.5
B 2.0	AMG(2.0%)	2.0
C 0.5	펄프자임(0.5%)	0.5
C 2.0	펄프자임(2.0%)	2.0
D 2.0	알칼라제(1%) + AMG (1 %)	2.0
E 2.0	알칼라제(1%) + 펄프자임 (1%)	2.0
F 2.0	알칼라제(2/3%)+ AMG (2/3%) +펄프자임(2/3%)	2.0

샌드-블라스팅한 아크릴 플레이트(10×20×0.5cm)들을 두가지 해양도료 중 한가지로 표면 층이 대략 130㎠이고 막 두께가 각각 BioB에 대해 100미크론 및 BioS에 대해 100미크론으로 도포하였다.

건조 후, 판넬들은 5×3판넬들을 갖는 뗏목으로 올려 놓았다. 뗏목을 덴마크의 두 다른 항구(물이 괴어 있고 흐르지 않는 Jyllinge와 물이 크게 교체되는 Ellsinore)에서 6개월간 (2000년 5월 5일부터 2000년 11월 13일까지) 해수에 침지시켰다. 뗏목을 매달 검사하였다.

뗏목을 판넬의 상부가 수면에서 대략 1 미터 아래에 있도록 하는 방법으로 침지시켰다.

기간이 끝났을 때 판넬들을 실험실로 가져오고 부착된 만각류의 수를 평가하였다. 식물상 부착도 또한 평가하였다. 도료를 칠한 판넬들의 표면도 또한 구조적인 변화(균열 또는 구멍)에 대해 평가하였다.

Ellsinore에서 수행한 실험의 결과를 이하 표 4B에서 볼 수 있다.

판넬번호	판넬번호에 대한 설명	만각류의 수
블랭크	도료없는 판넬	66
0-0	효소없는 BioB	17
D 2.0	BioB + 알칼라제+ AMG	4
E 2.0	BioB + 알칼라제+ 펄프자임	9
F 2.0	BioB + 알칼라제+ AMG +펄프자임	7
W-0-0	효소없는 BioS	38
W-D 2.0	BioS +알칼라제+ AMG	30
W-E 2.0	BioS +알칼라제+펄프자임	45
W-F 2.0	BioS +알칼라제+ AMG +펄프자임	44
기준 1	Bravo,Hempel A/S	0
기준 2	Seatech,Hempel A/S	0

표 4B로부터, 효소 없는 BioB로 도포한 판넬들과 비교할 때 효소를 포함하는 BioB로 도포한 판넬들에는 단지 매우 적은 만각류가 부착되었음을 분명히 알 수 있다. 따라서, BioB + 알칼라제+ AMG의 조합은 효소 없는 BioB(만각류의 수 17)와 비교할 때 부착된 만각류의 수의 상당한 감소를 가져옴을 알 수 있다. 따라서, BioB + 알칼라제+ AMG의 조합은 만각류의 부착의 거의 완전한 억제를 가져왔다. 비교용으로, 살생물제인 Irgarol과 Diuron을 함유하는 두가지 시판 방오 제품은 만각류의 부착을 완전히 억제하였다.

BioB 및 BioS 판넬로부터 선택된 샘플들을 확대경(4배)을 사용하여 검사하였고 부착물은 효소를 함유하는 도료로 도포된 판넬상에서 만각류이외의 어떤 다른 동물도 함유하지 않았다. 식물상에 관해서는, 효소만을 갖는 BioB 판넬들에는 규산 해조인 스키조네마(Schizonema)를 우점종으로 하는 두세 유형의 해조만이 부착된 반면에, 대조표준을 해조로 완전히 덮히어 있었다. 효소를 갖는 BioB 판넬상의 해조 부착물은 나중에 젖은 스폰지로 판넬로부터 쉽게 제거되었다. 따라서, AMG 및/또는 펄프자임과 조합한 알칼라제의 사용은 해조 부착을 유의하게 감소시켰다.

BioB 및 BioS 판넬들을 확대경(4배)으로 균열과 구멍에 대해 검사하였다.BioB 판넬의 표면들은 해수에서 6개월 후에도 여전히 완전히 원래대로이었다. 균열이나 구멍도 검출되지 않았다. 그러나, BioS 판넬들은 일부 균열과 구멍이 나타났고 거기에서 부착물이 검출되었다.

참고문헌

Willemsen P.R.Antifoulants from marine invertebrates-Sponges. In: Proceedings Workshop "생물부착: 문제 및 해결책" University of New South Wales, Syney, Australia, 13-14 April 1994.

Claims

적어도 하나의 효소와 적어도 하나의 로진 화합물을 포함하는 방오 도료 조성물로서, 효소는 상기 조성물로 피복된 표면의 부착을 감소시키거나 방지하는 유효량으로 존재하는 것을 특징으로 하는 방오 도료 조성물.
제 1 항에 있어서, 적어도 하나의 효소는 단백질 분해, 헤미셀룰로스 분해, 셀룰로스 분해, 지질 분해, 및 아밀로스 분해 활성 효소로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 2 항에 있어서, 적어도 하나의 단백질 분해 활성 효소는 프로테아제인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 3 항에 있어서, 프로테아제는 엔도펩티다제인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 4 항에 있어서, 엔도펩티다제는 서브틸리신(EC 3.4.21.62)인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 5 항에 있어서, 서브틸리신(EC 3.4.21.62)은 다음 특징: (i) pH 범위 약7-10에서 최적 활성, 및 (ii) 온도 범위 55-65 ℃에서 최적 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 6 항에 있어서, 서브틸리신(EC 3.4.21.62)은 Alcalase인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 7 항에 있어서, Alcalase는 Alcalase 2.5 L, Type DX인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 로진 화합물은 로진, 로진 유도체 및 로진 금속염으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 9 항에 있어서, 로진은 톨 로진, 고무 로진 및 목재 로진으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 9 항에 있어서, 로진 유도체는 수소 첨가 로진, 로진을 말레산 무수물과 반응시킴으로써 얻어지는 개질 로진, 포르밀화된 로진, 및 중합화된 로진으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 9 항에 있어서, 로진 금속염은 로진 아연염, 로진 칼슘염, 로진 구리염및 로진 마그네슘염으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 로진 화합물의 함량은 5-60 중량% 범위내인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 적어도 하나의 효소의 양은 0.1-10 중량% 범위내인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 14 항에 있어서, 적어도 하나의 효소의 양은 0.2-5 중량% 범위내인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 15 항에 있어서, 적어도 하나의 효소의 양은 0.5-1 중량% 범위내인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 2 항에 있어서, 아밀로스 분해 활성 효소는 α- 및 β- 아밀라제같은 아밀라제, 아밀로글루코시다제, 풀룰라나제, α-1,6-엔도글루카나제, α-1,4-엑소글루카나제 및 이소아밀라제로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 17 항에 있어서, 아밀로글루코시다제(E.C. 3.2.1.3)는 AMG 300 L인 것을특징으로 하는 조성물.
제 2 항에 있어서, 헤미셀룰로스 분해 활성 효소는 펄프자임 HC를 포함하는 엔도-1,4-β-크실라나제인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 표면은 적어도 때때로 물에 잠기는 표면이고, 상기 물은 담수, 해수 또는 염분있는 물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 20 항에 있어서, 표면은 보트와 선박을 포함하는 배, 선박 덮개, 앞바다 장치, 파이프, 교각과 부두의 하부구조물 및 생선 사육망을 포함하는 양식장 기구의 표면으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 적어도 하나의 살조제, 제초제, 살균제, 연체동물제거제 또는 방오 활성을 나타내는 다른 화합물을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 해양 도포에 적당한 바인더 성분 및 안료를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 따르는 방오 도료 조성물의 유효량을 표면에 도포하는 단계를 포함하는, 수생 생물에 의한 표면 부착을 방지하는 방법.
제 24 항에 있어서, 수생 생물은 박테리아, 원생생물, 균류, 해조류 및 무척추동물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 24 항에 있어서, 수생 생물은 만각류와 조개류로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 26 항에 있어서, 수생생물은 발라누스 갈리아투스(Balanus galeatus), 발라누스 앰피트라이트(Balanus amphitrite), 엘미니우스 모데스투스(Elminius modestus), 발라누스 임프로비수스(Balanus improvisus) 및 발라누스 발라노이데(Balanus balanoides)를 포함하는 시프리페디아(Cirripedia) 아강의 것임을 특징으로 하는 방법.
다음 특징: (i) pH 범위 약 7-10에서 최적 활성, 및 (ii) 온도 범위 55-65 ℃에서 최적 활성을 가지는 적어도 하나의 서브틸리신(EC 3.4.21.62)을 포함하는 방오 도료 조성물.
제 28 항에 있어서, 서브틸리신은 Alcalase인 것을 특징으로 하는 방오 도료 조성물.
제 29 항에 있어서, Alcalase는 Alcalase 2.5 L, Type DX인 것을 특징으로 하는 방오 도료 조성물.
방오 도료 조성물에서 다음 특징: (i) pH 범위 약 7-10에서 최적 활성, 및 (ii) 온도 범위 55-65 ℃에서 최적 활성을 가지는 서브틸리신(EC 3.4.21.62)의 사용.
제 31 항에 있어서, 서브틸리신은 Alcalase인 것을 특징으로 하는 사용.
제 32 항에 있어서, Alcalase는 Alcalase 2.5 L, Type DX인 것을 특징으로 하는 사용.