KR20030009649A

KR20030009649A - Ν-알키닐옥시카르보닐-5-플루오로시토신 유도체, 그제조방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 항암제

Info

Publication number: KR20030009649A
Application number: KR1020010044193A
Authority: KR
Inventors: 김관희; 김윤철; 김지영; 이경호; 박영석; 박호진
Original assignee: 주식회사 코오롱
Priority date: 2001-07-23
Filing date: 2001-07-23
Publication date: 2003-02-05

Abstract

본 발명은 신규 N-알키닐옥시카르보닐-5-플루오로시토신 유도체, 그의 제조방법 및 이를 유효성분으로 하는 항암제에 관한 것으로서, 종래의 항암제에 비해 우수한 항암효과를 갖는 약제를 제공한다.

Description

Ν-알키닐옥시카르보닐-5-플루오로시토신 유도체, 그 제조방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 항암제 {N-ALKYNYLOXYCARBONYL-5-FLUOROCYTOSINE DERIVATIVES, THEIR PREPARATION METHOD, AND ANTICANCER AGENT COMPRISING THE SAME}

본 발명은 신규 N-알키닐옥시카르보닐-5-플루오로시토신 유도체, 그의 제조방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 항암제에 관한 것이다.

암은 후천성 면역결핍증(AIDS)과 더불어 현대의학이 해결해야할 과제로 남아있는 난치병중의 하나이다. 국내에서도 암의 발생종류 및 빈도가 해마다 증가하고 있으나, 암은 그 치유율이 매우 낮아 주요 사망원인이 되고 있다. 암을 치유하기 위해서 전세계가 엄청난 투자를 하고 있지만 아직 만족할 만한 치료제가 개발되지 못하고 있는 실정이다. 따라서, 보다 효율적이고 효과적인 치유를 위하여 약효가 우수하고 부작용이 적은 암치료제의 개발은 필수적이다.

현재 암을 치료하는데 있어서 수술요법, 방사선 치료등의 국소요법과, 화학요법, 및 면역요법 등의 전신요법이 이용되고 있다. 이들 중 화학요법은 위장, 간, 및 폐 등을 위시하여 각종 장기에 원발성으로 발생하는 고형종양 등과 각종 혈액암 또는 종양의 전이시에 국소요법의 보조약물로서 또는 단독요법으로 많이 사용되고있다.

암에 대한 연구가 많은 학자들에 의해 여러 관점에서 수행되어, 5-플루오로 우라실(5-Fluorouracil, 5-FU), 메토트렉세이트(Methotrexate), 프루트라풀 (Frutraful), 시스플라틴(Cisplatin) 등 여러 가지 항암제가 개발되었을 뿐만 아니라 현재도 새로운 항암제 개발에 연구가 계속되고 있다. 그러나, 아직 완전히 암을 안정하게 치유할 수 있는 제제는 개발되어 있지 않다.

최근에는 피리미딘 뉴클레오시드 계열의 대표적인 항암제인 5-플루오로우라실의 유도체를 이용한 항암제 개발연구가 활발히 진행되어 왔다. 항암제로서 널리 알려져 있는 5-FU는 세포내에서 대사가 활성화되어 피리미딘 뉴클레오타이드의 합성을 저해함으로써 종양의 치료에 사용되고 있지만, 위장 독성이 있어 그 부작용이 심각하다. 따라서 이를 감소시키기 위한 연구가 많이 진행되고 있는 중이나, 개발된 일부 5-FU 유도체는 경구 투여후 장벽에서 활성화되어 그 부작용으로 설사를 유발한다.

최근 유럽특허 제 6025454호, 일본특허 제 94-211891호 및 미국특허 제 5,472,949호에 하기 화학식 1로 표시되는 N⁴-알킬옥시카르보닐-5-플루오로시티딘 유도체의 제조방법이 개시되어 있다.

상기 식에서 R^a는 포화 또는 불포화 탄화수소이고, R^b는 수소, 또는 생리조건에서 쉽게 가수분해 가능한 원자단 또는 쉽게 제거 가능한 보호기이다. 그러나, 상기 유도체는 장이 아닌 간에서 효소에 의해 활성화되어 그 부작용이 많이 감소된 것으로 알려져 있지만, 아직 완전히 암을 안전하게 치유할 수 있는 상태는 아니다.

따라서, 항암효과가 우수한 새로운 항암제의 개발이 시급하다.

이에 따라 본 발명자들은 우수한 항암효과를 갖는 항암제를 개발하고자, 본 발명의 N⁴-알키닐옥시카르보닐-5-플루오로시토신 유도체을 제공하고자 한다.

본 발명의 또다른 목적은 N⁴-알키닐옥시카르보닐-5-플루오로시토신 유도체의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 N⁴-알키닐옥시카르보닐-5-플루오로시토신 유도체를유효성분을 포함하는 항암제를 제공하는 것이다.

본 발명은 항암 효과가 뛰어난 항암제용 N⁴-알키닐옥시카르보닐-5-플루오로시티딘 유도체, 그의 제조방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 항암제에 관한 것이다.

본 발명은 하기의 화학식 2의 화합물, 약학적으로 허용가능한 그의 염 또는 용매화물을 제공한다.

상기식에서, R¹은 수소, C₁-C₇알킬 또는 C₁-C₇알케닐, R²는 생리조건하에서 쉽게 가수분해 가능한 원자단 또는 쉽게 제거가능한 보호기이고, 바람직하게는 수소 또는 아세틸기이고, R³는 C₂-C₇알키닐기를 나타낸다.

본 발명은 또한 하기 화학식 3의 화합물, 약리적으로 허용가능한 그의 염 또는 용매화물을 제공한다.

상기 식에서, R²는 생리조건하에서 쉽게 가수분해 가능한 원자단 또는 쉽게 제거가능한 보호기이고, 바람직하게는 수소 또는 아세틸기이고, R³는 C₂-C₇알키닐기를 나타내고, R⁴는 히드록시메틸기 또는 보호기가 부착된 히드록시메틸기이다.

이하에서, 본 발명의 화학식 2 및 화학식 3의 화합물의 제조방법에 관한 것이다. 자세하게는,

(1)염기의 존재하에 화학식 4 및 화학식 5의 화합물을 반응시켜 화합물 3b를 제조하고,

(2) 상기 화합물 3b와 염기를 반응시켜 화학식 3a의 화합물을 제조하고,

(3) 상기 화합물 3a의 화합물을 산화시키는 것을 포함하는 상기 화학식 2 도는 3의 화합물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

또한, 상기 제조방법은 추가로 (4) 상기 화합물 2a를 에스테르화시켜 화학식 2b을 제조하는 단계를 포함할 수 있다.

(상기식에서, R¹은 수소, C₁-C₇알킬 또는 C₁-C₇알케닐, R³는 C₂-C₇알키닐기를 나타낸다.)

이하에서 반응식 1을 참고로 하여 화학식 2 화합물의 제조방법을 단계별로 상세히 설명하고자 한다.

염화메틸렌 또는 피리딘과 같은 용매의 존재하에, 화합물(4)(한국출원번호 제 10-2000-46179)와 화합물(5)를 적당한 염기, 예컨대 피리딘, 트리에틸아민, 디이소프로필에틸아민 등을 첨가하여 교반시킴으로써 화합물(3b)를 제조한다.

이어서, 메탄올 또는 에탄올과 같은 알콜용매의 존재하에서 탄소수 1-2의 소디움알콕시드 또는 소디움 히드록시드를 사용하여 상기 화합물 3b를 환원시켜 화합물 3a를 얻는다.

이 화합물 3a는 적당한 촉매를 이용하여 실온 내지 120 ℃에서 산소와 반응시켜 본 발명의 목적 화합물(2a)를 얻을 수 있다.

[화학식 3a][화학식 2a]

또한 본 발명의 화합물 2a를 -30 ℃ 내지 실온에서 탄소수 1-7의 알킬알콜 또는 알케닐알콜과 티오닐클로라이드를 적가하여 교반함으로써, 에스테르 유도체인 화합물 2b를 얻을 수 있다.

[화학식 2a][화학식 2b]

본 발명은 또한 N⁴-알키닐옥시카르보닐-5-플루오로시토신 유도체를 유효성분으로 포함하는 항암제 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 화합물은 여러 가지 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 이때 활성성분으로 화학식 2의 화합물, 이의 약리적으로 허용가능한 염, 및 용매화물을 포함할 수 있다. 본 발명의 항암제 조성물을 약리학적으로 허용가능한 액체 또는 고체 담체를 포함할 수 있다.

고체형태의 제제는 분말, 정제, 분산가능한 과립 또는 캡슐을 포함하며, 이중에서도 경구 투여에 적합한 고체 투약형태로는 정제, 분말 또는 캡슐을 들 수 있다. 적합한 부형제는 희석제, 향미제, 가용화제, 윤활제, 현탁제, 결합제, 및/또는 정제팽화제를 포함할 수 있다. 분말 또는 캡슐의 경우에는, 담체는 미분된 활성성분을 5 내지 70%, 바람직하게는 10 내지 70%를 함유할 수 있다. 적합한 고체 담체또는 부형제로는 옥수수 전분, 스테아린산 마그네슘, 필름, 폴리에틸렌글리콜, 탈크, 설탕, 락토오스, 펙틴, 덱스트린, 전분, 젤라틴, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 메틸셀룰로서, 소디움카르복시메틸셀룰로스, 이산화티타늄, 저융점 왁스, 코코아버터등을 포함할 수 있다.

액체형태의 제제는 용액, 현탁액 또는 유탁액일 수 있다. 예를 들면, 비경구 주사액의 경우에는 물 또는 물-프로필렌글리콜의 혼합용액이 사용될 수 있는데, 그러한 용액은 등장성, pH 등이 생체계에 적합하도록 제조된다. 액상 제제는 또한 폴리에틸렌글리콜 수용액으로 형성할 수도 있다. 경구용으로 적합한 수용액은 활성성분을 물에 녹이고 적당한 향미제, 착색제, 안정제 및 농후제를 부가하여 제조할 수도 있다. 경구용으로 적당한 수성 현탁제로는 미분된 활성성분을 천연 또는 합성검, 수지, 메틸셀룰로스, 소디움 카르복시메틸셀룰로스 및 공지의 현탁제와 같은 점성 물질에 분산시켜 제조될 수 있다.

바람직한 약학적 제제는 단위 투약형태이다. 그러한 형태에서, 제제는 적당양의 활성성분을 포함하는 단위 투여형태로 세분된다. 단위 투약형태는 제제의 분리된 양을 함유하는 포장된 제제일 수 있으며, 예를 들면, 바이알 또는 앰플내의 포장된 정제, 캡슐 또는 분말이다.

이하에서, 하기의 실시예를 들어 본 발명의 더욱 자세히 설명할 것이나, 본 발명의 보호범위를 하기 실시예로 한정하려는 의도는 아니다.

[실시예]

실시예 1:2',3',5'-트리-O-아세틸-N⁴-프로파질옥시카르보닐-5-플루오로시티딘(R³=프로파질, 화합물 3b)의 제조

2',3',5'-트리-O-아세틸-N⁴-프로파질옥시카르보닐-5-플루오로시티딘 18.1g에염화메틸렌 150 ml와 피리딘 9ml을 가한 후 프로파질 클로로포르메이트 8.0 g을 0℃에서 적가하고 실온에서 30분간 교반시켰다. 얻어진 반응 결과물에 탄산수소나트륨 수용액을 가하고 염화메틸렌 300ml으로 세 번 추출하고 무수 마그네슘 설페이트로 건조 및 여과하였다. 그리고 나서, 얻어진 산물을 감압증류시켜 농축한 다음 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 표제 화합물을 21.9g(수율 88%)를 수득하였다.

¹H NMR(CDCl₃, ppm) δ11.45 (br.s, 1H), 8.20 (t, 1H), 6.01 (s, 1H), 5.43 (m, 1H), 5.26 (m, 1H), 4.79 (dd, 2H), 4.42 (m, 1H), 4.36 (m, 2H), 2.52 (t,1H), 2.10 (s, 3H), 2.01 (s, 3H)

실시예 2:N⁴-(프로파질옥시카르보닐)-5-플루오로시티딘 (R³= 프로파질, 화합물 3a)의 제조

2',3',5'-트리-O-아세틸-N⁴-프로파질옥시카르보닐-5-플루오로시티딘 19.1g에 메탄올 150 ml를 가하여 용해시켰다. 반응 결과물에 1N 소디움 메톡시드 150ml를 가하여 1시간 동안 교반시킨 후에 1N 염산으로 중화시키고 이를 감암증류시켜 농축하였다. 물 100ml를 첨가한 후에 염화메틸렌/메탄올(95:5)용액으로 여러 번 추출하고 무수 마그네슘설페이트로 건조, 여과한 후 감압증류시켜 농축하였다. 그리고 나서, 이를 아세틸산에틸로 재결정시켜 표제화합물을 12.3g(수율 80%)를 수득하였다.

¹H NMR(CD₃OD, ppm) δ8.15 (d, 1H), 5.93 (d, 1H), 4.77 (d, 2H), 4.11 (m,1H), 3.95 (m, 1H), 3.72 (m, 3H), 2.50 (t, 1H)

실시예 3:5'-데옥시-N⁴-(프로파질옥시카르보닐)-5-플루오로시토신-5'-카르복시산(R³= 프로파질, 화합물 2a)의 제조

N⁴-프로파질옥시카르보닐-5-플루오로시티딘 10.25g에 pH 8-10의 탄산수소나트륨 완충용액 600 ml를 가하고, 여기에 산화백금 촉매를 가하고 90℃에서 산소기체를 12시간 동안 가한 후 촉매를 여과시킨 후 염화메틸렌/메탄올(95/5)용액으로 여러 번 추출하고 무수 마그네슘설페이트로 건조 여과한 후 감압증류시켜 농축한 다음 아세틸산 에틸을 이용한 재결정을 통해 표제화합물을 6.50g(수율 66%)를 수득하였다.

¹H NMR(CD₃OD, ppm) δ10.43 (br.s, 1H), 8.01 (br.s, 1H), 5.75 (d, 1H), 4.95 (d, 1H), 4.80 (d, 2H), 4.63 (m, 1H), 4.28 (m, 1H), 2.55 (t, 1H)

실시예 4: 에틸 5'-데옥시-N⁴-(프로파질옥시카르보닐)-5-플루오로시토신-5'-카르복실레이트(R¹=에틸, R³=프로파질, 화합물 2b)의 제조

5'-데옥시-N⁴-(프로파질옥시카르보닐)-5-플루오로시토신-5'-카르복시산 1.0g에 에탄올 100ml를 가하고, -30℃ 내지 0℃에서 티오닐클로라이드 0.6ml를 적가하고 실온에서 6 내지 12시간동안 교반시킨 후 여과하고 에탄올로 세척한 후 감압증류시켜 농축하였다. 이 결과물에 탄산수소나트륨 수용액을 가하여 고체를 석출시킨후 물과 에탄올로 세척한 후 건조시켜 표제 화합물 1.21g (수율 88%)를 수득하였다.

¹H NMR(CDCl₃, ppm) δ10.35 (br.s, 1H), 8.01 (br.s, 1H), 5.77 (d, 1H), 4.88 (d, 1H), 4.81 (d, 1H), 4.29 (m, 2H), 4.12 (q, 2H), 2.50 (t, 1H), 1.24 (t,3H)

실시예 5:5'-데옥시-N⁴-(프로파질옥시카르보닐)-5-플루오로시토신-5'-카르복시산 (화합물 2a) 유도체의 시험관내 항암활성 평가

5-FU를 대조 약제로 하여, 본 발명에 따른 화학식 2의 화합물인 5'-데옥시-N⁴-프로파질옥시카르보닐-5-플루오로시토신-5'-카르복시산(R³=프로파질, 화합물 IIa)의 시험관내 항암활성을 측정하기 위하여 사람의 암세포에 대한 세포독성을 측정하였다. 이때 사람의 암세포는 A549 (폐암), HCT15 (대장암), SK-OV-3(난소암), SK-MEL-2(피부암)를 사용하여 비교하였다.

먼저 암세포를 37℃, 5% CO₂항온항 습기에서 배양하였으며, 이때 사용한 배지는 RPMI를 기본배지로 하여 10% 소태아 혈청을 첨가하였다. 세포독성능을 측정하기 위하여 대수증식기에 있는 암세포를 96-웰 플레이트의 한 웰당 2-5 X 10⁴세포가 되도록 분주하여 24간 배양하였다. 5-FU와 5'-데옥시-N⁴-프로파질옥시카르보닐-5-플루오로시토신-5'-카르복시산을 단계별로 희석한 시료용액을 가하여 72시간 배양하였다. 배양된 플레이트의 각 웰에 생리식염수에 5mg/ml 농도로 녹인 MTT 반응액을 20 ㎕를 첨가하여 4시간동안 배양하였다. 배양후에 형성된 포르마잔(formazan)결정을 디메틸술폭시드로 용해시켜 540 nm의 파장에서 각 웰의 흡광도를 측정함으로써 생존세포수를 측정하였다. 세포를 포함하지 않는 배지만 함유된 웰의 흡광도를 0%, 시료를 가하지 않은 웰의 흡광도를 100%로 하였을 때 50%의 흡광도를 나타내는 농도를 각 항암제의 IC₅₀(㎍/ml)값으로 계산하였다. 그 결과를 표 1에 나타냈다.

농도(㎍/ml)	A549	SK-OV-3	HCT15	SK-MEL2
5-FU	0.26	0.03	0.11	0.63
실시예 4의 화합물	0.005	0.005	0.040	0.007

상기 표1에서 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 화학식 (II)의 화합물이 각각의 암세포에 대하여 약 0.04-0.007 ㎍/ml 정도로 항암활성을 확인하였고, 이 값은 대조구보다 훨씬 더 좋은 항암활성을 나타냄을 알 수 있다.

실시예 6:5'-데옥시-N⁴-(프로파질옥시카르보닐)-5-플루오로시토신-5'-카르복시산 (화합물 2a) 유도체의 생체내 항암활성 평가

유럽특허 제 602454호에 발표된 5'-데옥시-N-알킬옥시카르보닐-5-플루오로시티딘 유도체중 가장 좋은 항암효과를 나타내고 있는 카페시타빈(capecitabine=5'-데옥시-5-플루오로-N4-(펜틸옥시카르보닐)시티딘(화학식 1에서 Ra=펜틸, Rb=수소인 화합물)을 대조약제로 하여, 본 발명에 따른 화합물인 5'-데옥시-N⁴-프로파질옥시카르보닐-5-플루오로시토신-5'-카르복시산(화합물2a)의 쥐 종양세포주 L1210에 대한생체내 항암활성을 측정하여 비교하였다.

실험동물은 일본 찰스 리버(charles River Japan)에서 수입한 5주령(19내지 20g) BDF1수컷 마우스를 1주 동안 순화기간을 거쳐 공시하였다. 실험동물의 사육조건은 온도 24±2 ℃, 습도 50±1 ℃ 였다. 음수는 정수된 물을 주 2회 교환하여 주었고, 깔집 및 케이지 교환은 주 1회로 하였다. 실험은 각 군당 2마리로 하였다. 종양 세포주는 L1210 마우스 혈액종양세포주로 하였고, 팔콘(Falcon)배양 플라스크에서 2, 3회 계대배양하여 활성화시킨 세포주를 수집하여 인산완충액(pH 7.2)으로 세척한 후, 현미경하에서 계수하여 1 x 10⁷/ml 이 되도록 세포현탁액을 만들어 일회용 멸균 1 ml 주사기를 이용하여 100 (1 x 10⁶)씩 마우스의 복강내로 이식하였다. 약물의 투여는 세포 이식 24시간 후부터 경구로 투여하였다. 약물의 투여농도는 대조약물인 카페시타빈은 마리당 1.2, 5.7, 28.8, 144 및 720 mg/kg/100㎕ 이 되도록 조제하였고, 본 발명의 화합물 2a는 마리당 1.2, 5.8, 28.8 mg/kg/100㎕이 되도록 조제하였다. 카페시타빈은 디메틸술폭사이드에 녹인 후, 0.5% 카르복시메틸 셀룰로스에 현탁시키고, 화합물 2a는 증류수에 녹였다. 시료는 종양세포 이식 24시간 후부터 시작하여 3주간 5회씩 총 15회를 투여하였다. 항종양효과 평가는 생명연명율로 하였다. 그 결과를 표 2에 나타냈다.

화합물	투여량(mg/kg/day)	평균생존일(day)	생명연명율(%)
대조	-	17.8	-
카페시타빈	72014428.85.81.2	22.820.120.219.218.9	30151486
화합물 2a	28.85.81.2	21.920.620.1	23118

상기 표2에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 화학식 2a의 화합물의 동물실험을 통한 생체내 항암활성이 매우 우수함을 확인하였다.

이상에서 살펴본 바와같이, 본 발명에 따른 화학식 2의 N4-알키닐옥시카르보닐-5-플루오로시토신 및 이들의 유도체들은 매우 유용한 항암제로 사용될 수 있다.

본 발명은 신규 N-알키닐옥시카르보닐-5-플루오로시토신 유도체 및 그의 제조방법을 제공하여, 항암효과가 뛰어난 항암제로 유용한 화합물을 제공한다.

Claims

하기 화학식 2의 화합물, 약리적으로 허용가능한 그의 염 또는 용매화물:

[화학식 2]

상기식에서, R¹은 수소, C₁-C₇알킬 또는 C₁-C₇알케닐, R²는 생리조건하에서 쉽게 가수분해 가능한 원자단 또는 쉽게 제거가능한 보호기이고, 바람직하게는 수소 또는 아세틸기이고, R³는 C₂-C₇알키닐기를 나타낸다.
하기 화학식 3의 화합물, 약리적으로 허용가능한 그의 염 또는 용매화물:

[화학식 3]

상기 식에서, R²는 생리조건하에서 쉽게 가수분해 가능한 원자단 또는 쉽게 제거가능한 보호기이고, 바람직하게는 수소 또는 아세틸기이고, R³는 C₂-C₇알키닐기를 나타내고, R⁴는 히드록시메틸기 또는 보호기가 부가된 히드록시메틸기를 나타낸다.
[반응식 1]

(1)염기의 존재하에 화학식 4 및 화학식 5의 화합물을 반응시켜 화합물 3b를 제조하고,

(2) 상기 화합물 3b와 염기를 반응시켜 화학식 3a의 화합물을 제조하고,

(3) 상기 화합물 3a의 화합물을 산화시키는 것을 포함하는

제 1항의 화합물을 제조하는 방법.
제 3 항에 있어서, 상기 방법에 추가로 (4) 상기 화합물 2a를 에스테르화시켜 화학식 2b을 제조하는 단계를 포함하는 방법.
제 3 항에 있어서, 상기 염기는 피리딘, 트리에틸아민 또는 디이소프로필에틸아민인 방법.
제 1항의 화합물을 유효성분으로 포함하는 항암제 조성물.