KR20030003761A - 사람 수용체 단백질, 관련 시약 및 방법 - Google Patents

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Abstract

본원에는 포유류(예: 사람) 수용체, 정제된 수용체 단백질 및 이의 단편을 암호화하는 핵산이 제공된다. 폴리클로날 및 모노클로날 항체가 또한 제공된다. 당해 조성물을 진단 및 치료학적 용도에 사용하는 방법이 제공된다.

Description

사람 수용체 단백질, 관련 시약 및 방법{Human receptor proteins, related reagents and methods}
재조합 DNA 기술은 일반적으로, 공여원(donor source)으로부터의 유전 정보를, 예를 들면, 숙주 내로의 도입을 통한 후속 프로세싱을 위해 벡터 내로 통합시킴으로써, 이와 같이 전이된 유전 정보가 새로운 환경에서 복사되고/되거나 발현되는 기술을 지칭한다. 통상적으로, 이러한 유전 정보는 목적하는 단백질 생성물을 암호화하는 메신저 RNA(mRNA)로부터 유도된 상보성 DNA(cDNA)의 형태로 존재한다. 캐리어는 종종, 나중의 복제를 위해 cDNA를 숙주 내로 혼입할 수 있는 능력을 지니고 있고, 몇몇 경우에는, cDNA의 발현을 실제적으로 제어함으로써 숙주 내에서 암호화된 생성물을 직접 합성할 수 있는 능력을 지니고 있는 플라스미드이다.
얼마 동안, 포유류 면역 반응이 "면역 네트워크(immune network)"로 불리우는 일련의 복잡한 세포성 상호작용에 근거하는 것으로 공지되었다. 최근의 연구 결과는 이러한 네트워크의 내부 기구(workings)에 관한 새로운 관점을 제기하였다. 많은 면역 반응에서는, 실제로, 림프구, 매크로파아지(macrophage), 과립구 및 기타 세포의 네트워크형 상호작용이 주기적으로 일어나는 것이 명백하긴 하지만, 현 면역학자들은 대체로, 림포킨, 사이토킨 또는 모노킨(monokine)으로서 공지된 가용성 단백질이 이들 세포성 상호작용을 제어하는데 결정적인 역할을 한다는 견해를 현재 고수하고 있다. 따라서, 세포 조정 인자(modulatory factors)의 분리, 성상 확인 및 이의 작용 기전에 상당한 관심이 집중되고 있는데, 이를 완전히 이해함으로써, 수 많은 의학적 이상 징후들(abnormality), 예를 들면, 면역계 장애를 진단 및 치료하는데 있어 상당히 진일보할 것이다.
림포킨이 세포성 활성을 각종 방식으로 매개하는 것은 명백하다. 이들은 다능성 조혈 줄기 세포를, 복잡한 면역계를 구성하는 다양한 세포성 계통을 포함하는 상당 수의 기원세포(progenitor) 내로 증식, 성장 및/또는 분화시키는 것을 지지해주는 것으로 밝혀졌다. 세포성 성분들 간의 적절하고도 균형잡힌 상호작용이 건강한 면역 반응에 필요하다. 림포킨이 기타 제제와 연계해서 투여되는 경우에는, 상이한 세포성 계통이 종종 상이한 방식으로 반응한다.
면역 반응에 특히 중요한 세포 계통에는 다음 두 부류의 림프구가 포함된다:면역글로불린(이물질을 제거하기 위해 이러한 이물질을 인식하고 이와 결합할 수 있는 능력을 지니고 있는 단백질)을 생산 및 분비할 수 있는 B 세포; 및 림포킨을 분비하고, B 세포 및 면역 네트워크를 구성하는 각종 기타 세포(기타 T 세포 포함)을 유도 또는 억제하는 각종 서브세트(subset)의 T 세포. 이들 림프구는 기타 많은 세포 유형들과 상호작용한다.
또 다른 중요한 세포 계통은 (모든 포유류 종에서 양성적으로 동정된 바 없는) 비만 세포인데, 이는 전신 내의 모세혈관에 근접하여 위치한 과립 함유 연결 조직 세포이다. 이들 세포는 폐, 피부, 위장관 및 비뇨생식기에서 특히 고농도로 발견된다. 비만 세포는 알레르기 관련 장애, 특히 아나필락시(anaphylaxis)에서 다음과 같이 중추적인 역할을 한다: 선택된 항원이 비만 세포 표면 상의 수용체에 결합된 한 부류의 면역글로불린과 교차결합하는 경우에는, 이러한 비만 세포가 탈과립화되어, 알레르기성 반응(예: 아나필락시)를 유발시키는 매개인자, 예를 들면, 히스티딘, 세포토닌, 헤파린 및 프로스타글란딘을 방출한다.
면역계 세포를 시험관내에서 유지시킬 수 없다는 일반적인 사실로 인해, 각종 면역 장애를 보다 잘 이해하고 이를 치료하고자 한 연구 노력이 방해를 받아 왔다. 면역학자들은 다수의 림포킨을 포함한 각종 성장 인자를 함유하는 기타 세포 상등액과 T 세포를 사용함으로써, 이들 다수의 면역계 세포를 배양할 수 있다는 사실을 밝혀내었다.
인터루킨-1 계열의 단백질에는 IL-1α, IL-1β, IL-1RA가 포함되고, 최근에는 IL-1γ(이는 또한, 인터페론-감마 유도성 인자, IGIF로서 명명됨)가 포함된다. 이러한 관련 계열의 유전자는 광범위한 생물학적 기능과 연관이 있어 왔다[참조: Dinarello (1994)FASEBJ. 8:1314-1325; Dinarello (1991)Blood77:1627-1652; and Okamura et al. (1995)Nature378:88-91].
또한, 형태형성 발생을 조정하는 각종 성장 인자 및 조절 인자가 존재한다. 이에는, 예를 들어, IL-1 수용체의 구조적 및 기계적 특징을 공유하는 수용체와의 결합을 통하여 시그날링하는 Toll 리간드가 포함된다[참조: Lemaitre et al. (1996)Cell86:973-983; and Belvin and Anderson (1996)Ann. Rev. Cell & Devel. Biol.12:393-416].
전술한 내용으로부터 볼 때, 새로운 가용성 단백질 및 이의 수용체(림포킨과 유사한 것 포함)를 발견 및 개발하는 것이, 예를 들어, 면역계 및/또는 조혈 세포의 발생, 분화 또는 기능과 직접적으로 또는 간접적으로 관련이 있는 광범위한 변성 또는 비정상적인 질환에 대한 새로운 치료법을 제공해야 하는 것은 명백하다. 특히, 기타 림포킨의 유익한 활성을 증진 또는 증강시키는 림포킨-유사 분자에 대한 신규한 수용체을 개발 및 이해하는 것이 상당히 유리할 것이다. 본 발명은 인터루킨-1 유사 조성물 및 관련 화합물과의 유사성을 나타내는 리간드에 대한 새로운 수용체, 및 이들의 사용 방법을 제공한다.
본 발명은 형태형성 또는 면역계 기능을 포함한 포유류 생리학에 영향을 미치는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 발생 및/또는 면역계를 조절하는 핵산, 단백질 및 항체를 제공한다. 이들 물질의 진단 및 치료학적 용도가 또한 본원에 기재되어 있다.
도 1은 드로소필라(Drosophila), 캐노랍디티스(Caenorabditis) 및 사람 DTLRs의 단백질 구성, 및 이들과 척추동물 IL-1 수용체 및 식물 질병 내성 단백질과의 관계를 도시적으로 비교한 것이다. 3가지 드로포필라(Dm) DTLRs(Toll, 18w, 및 Mst ORF 단편)[참조: Morisato and Anderson (1995)Ann. Rev. Genet.29:371-399; Chiang and Beachy (1994)Mech. Develop.47:225-239; Mitcham et al.(1996)J. Biol. Chem.271:5777-5783; and Eldon et al. (1994)Develop.120:885-899]는 4가지 완전한(DTLRs 1-4) 및 하나의 부분(DTLR5) 사람(Hu) 수용체와 따로 배열되어 있다. PRINTS에 의해 플래그된 상기 수용체 엑토도메인(ectodomain) 내의 개개의 LRRs[참조: Attwood et al. (1997)Nucleic Acids Res.25:212-217]는 박스로 명확히 표시하였고; LRR 배열의 C- 또는 N-말단을 플랭크하는 '상부' 및 '바닥' Cys-풍부한 다발은 서로 마주보는 반원으로 각각 표시하였다. DTLRs 1-5 내의 내부 Cys-풍부한 영역이 상실되면, 이는 Toll 및 18w의 784 및 977aa 연장물과 비교해서 상기 DTLRs의 엑토도메인을 더 작게 만드는 원인이 된다(각각 558, 570, 690 및 652aa). DmMst 및 HuDTLR5의 불완전 쇄(각각 약 519 및 153aa 엑토도메인)는 점선으로 표시하였다. DTLRs, IL-1-유형 수용체(IL-1Rs)에 공통인 세포내 시그날링 모듈(module), 세포내 단백질 Myd88, 및 담배 질병 내성 유전자 N 생성물(DRgN)은 막 아래에 표시하였다[참조: Hardiman et al. (1996)Oncogene13:2465-2475; and Rock et al. (1998)Proc. Nat'l Acad. Sci. USA95:588-]. 부가의 도메인에는 IL-1Rs 내의 Ig-유사 모듈의 트리오(디설파이드-연결된 루프)가 포함되고; 상기 DRgN 단백질 양상과 NTPase 도메인(박스) 및 Myd88은 소멸(death) 도메인이다(검정색 타원형).
도 2A 내지 2C는 Toll- 및 IL-1-유사 사이토킨 수용체, 및 2개의 개산성 모듈라 단백질(divergent modular protein)의 시그날링 도메인에 보존된 구조 패턴을 도시한 것이다. 도 2A 내지 2B는 공통 TH 도메인의 서열 정렬을 도시한 것이다. DTLRs은 도 1에서와 같이 표지하였고; 사람(Hu) 또는 마우스(Mo) IL-1 계열수용체(IL-1R1-6)는 먼저 제안된 순서로 순차적으로 번호를 매겼으며[참조: Hardiman et al. (1996)Oncogen13:2467-2475]; Myd88, 및 담배(To) 및 아마(flax), 엘. 우시타티슘(L. usitatissium)(Lu)으로부터의 서열은 보다 큰 멀티도메인 분자의 C- 및 N-말단 도메인을 각각 나타낸다. 갭이 없는 서열 블록(1-10으로 번호매겨짐)은 박스 내에 표시하였다. 삼각형은 해로운 돌연변이를 지시하는 반면, 화살표의 N-말단 절단은 사람 IL-1R1에서의 생활성 제거를 표시한다[참조: Heguy et al. (1992)J. Biol. Chem.267:2605-2609]. α-나선(H), β-쇄(E) 또는 코일(L)의 PHD[참조: Rost and Sander (1994)Proteins19:55-72] 및 DSC[참조: King and Sternberg (1996)Protein Sci.5:2298-2310] 2차 구조 예상물을 표시하였다. 아미노산 명암 도식은 화학적으로 유사한 잔기를 묘사한 것이다: 소수성, 산성, 염기성, Cys, 방향족, 구조-파괴, 및 아주 작은 것. IL-1Rs, DTLRs 및 완전한 정렬물(ALL)에 대한 진단 서열 패턴은 75%의 엄격도에서 컨센서스(Consensus)에 의해 구동되었다. 아미노산 서브세트에 대한 부호는 다음과 같다(상세한 내역은 인터넷 사이트 참조): o, 알코올; l, 지방족; ·, 모든 아미노산; a, 방향족; c, 전하를 띰; h, 소수성; -, 음성; p, 극성; +, 양성; s, 작음; u, 아주 작음; t, 회전형. 도 2C는 제안된 TH β/α도메인 폴드의 위상(topology) 다이아그램이다. 나란히 놓인 β-시트(황색 삼각형으로서 β-쇄 A-E를 가짐)가 이의 C-말단에서 관찰되었고; α-나선(1 내지 5로 표지된 원)이 β쇄와 연결되고; 쇄 연결물은 정면(가시적임)이거나 후면(숨겨짐)에 대한 것이다. β-시트의 C-말단에서의 보존된, 전하를 띤 잔기는 회색(Asp)으로 표시되거나 단독의 검정색(Arg) 잔기로 표시된다(텍스트 참조).
도 3은 시그날링 도메인 슈퍼계열의 진화를 도시한 것이다. 도 2A 내지 2B의 다중 TH 모듈 정렬을 사용하여, 네이버-조이닝(Neighbor-Joining) 방법[참조: Thompson et al. (1994)Nucleic Acids Res.22:4673-4680]에 의해 계통발생 트리를 구동시켰다. 단백질을 정렬물에서와 같이 표지하였고; 상기 트리는 트리뷰(TreeView)를 이용하여 만들었다.
도 4A 내지 4D는 사람 DTLR 유전자의 FISH 염색체성 지도화를 도시한 것이다. 사람 림프구의 동시 발생 배양물로부터의 변성 염색체를, 국재시키기 위한 바이오티닐화 DTLR cDNA 프로브와 하이브리드화시킨다. FISH 지도화 데이터(좌측, 도 4A, DTLR2; 4B, DTLR3; 4C, DTLR4; 4D, DTLR5)를 염색체성 밴드와 정렬시키는 것은 FISH 시그날에 DAPI 밴드형성된 염색체(중앙 패널)를 겹쳐 놓음으로써 달성된다[참조: Heng and Tsui (1994)Meth. Molec. Biol.33:109-122]. 분석 결과는 사람 염색체 표의문자 형태로 요약되어 있다(우측 패널).
도 5A 내지 5F는 사람 DTLRs의 mRNA 블롯 분석 결과를 도시한 것이다. 레인당 대략 2㎍의 폴리(A)+RNA를 함유하는 사람 다중 조직 블롯(He, 심장; Br, 뇌; Pl, 태반; Lu, 폐; Li, 간; Mu, 근육; Ki, 신장; Pn, 췌장; Sp, 비장; Th, 흉선; Pr, 전립선; Te, 고환; Ov, 난소; SI, 소장; Co, 결장; PBL, 말초혈 림프구) 및 암 세포주(전골수구성 백혈병, HL60; 경부암, HELAS3; 만성 골수성 백혈병, K562; 림프아구성 백혈병, Molt4; 결장직장 선암종, SW480; 흑색종, G361; 버키트 림프종라지(Burkitt's Lymphoma Raji), Burkitt's; 결장직장 선암종, SW480; 폐 암종, A549)를, 기재된 바와 같이 DTLR1(도 5A-5C), DTLR2(도 5D), DTLR3(도 5E) 및 DTLR4(도 5F)를 암호화하는 방사성표지된 cDNA로 프로빙한다. 블롯을, 증감 스크린을 사용하여 -70℃에서 2일 동안(도 5A-5C) 또는 1주 동안(도 5D-5F) X선 필름에 노출시킨다. 변칙적인 0.3kB 종이 몇몇 레인에서 나타났고; 하이브리드화 실험은 DTLR 세포질성 단편을 암호화하는 메시지를 제외시켰다.
발명의 요약
본 발명은 DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 및 DTLR10으로 명명된, 9개의 신규한 포유류 관련 수용체, 예를 들면, 영장류, 사람, DNAX Toll 수용체 유사 분자 구조물, 및 이들의 생물학적 활성에 관한 것이다. 이에는 폴리펩티드 자체를 암호화하는 핵산, 및 이들의 생성 방법 및 사용 방법이 포함된다. 본 발명의 핵산은 부분적으로는, 본원에 제시된 클로닝된 상보성 DNA(cDNA) 서열과의 상동성에 근거하여 성상 확인된다.
특정 양태에서는, 본 발명이 다음 그룹 중에서 선택된 사항의 조성물을 제공한다: 약 12개 이상의 아미노산 길이에 걸쳐 서열 4와 동일성을 나타내는, 실질적으로 순수한 또는 재조합 DTLR2 단백질 또는 펩티드; 서열 4의 천연 서열 DTLR2; DTLR2 서열을 포함하는 융합 단백질; 약 12개 이상의 아미노산 길이에 걸쳐 서열 6과 동일성을 나타내는, 실질적으로 순수한 또는 재조합 DTLR3 단백질 또는 펩티드; 서열 6의 천연 서열 DTLR3; DTLR3 서열을 포함하는 융합 단백질; 약 12개 이상의 아미노산 길이에 걸쳐 서열 26과 동일성을 나타내는, 실질적으로 순수한 또는 재조합 DTLR4 단백질 또는 펩티드; 서열 26의 천연 서열 DTLR4; DTLR4 서열을 포함하는 융합 단백질; 약 12개 이상의 아미노산 길이에 걸쳐 서열 10과 동일성을 나타내는, 실질적으로 순수한 또는 재조합 DTLR5 단백질 또는 펩티드; 서열 10의 천연 서열 DTLR5; DTLR5 서열을 포함하는 융합 단백질; 약 12개 이상의 아미노산 길이에 걸쳐 서열 12, 28 또는 30과 동일성을 나타내는, 실질적으로 순수한 또는 재조합 DTLR6 단백질 또는 펩티드; 서열 12, 28 또는 30의 천연 서열 DTLR6; DTLR6 서열을 포함하는 융합 단백질; 약 12개 이상의 아미노산 길이에 걸쳐 서열 16, 18 또는 37과 동일성을 나타내는, 실질적으로 순수한 또는 재조합 DTLR7 단백질 또는 펩티드; 서열 16, 18 또는 37의 천연 서열 DTLR7; DTLR7 서열을 포함하는 융합 단백질; 약 12개 이상의 아미노산 길이에 걸쳐 서열 32 또는 39와 동일성을 나타내는, 실질적으로 순수한 또는 재조합 DTLR8 단백질 또는 펩티드; 서열 32 또는 39의 천연 서열 DTLR8; DTLR8 서열을 포함하는 융합 단백질; 약 12개 이상의 아미노산 길이에 걸쳐 서열 22 또는 41과 동일성을 나타내는, 실질적으로 순수한 또는 재조합 DTLR9 단백질 또는 펩티드; 서열 22 또는 41의 천연 서열 DTLR9; DTLR9 서열을 포함하는 융합 단백질; 약 12개 이상의 아미노산 길이에 걸쳐 서열 34, 43 또는 45와 동일성을 나타내는, 실질적으로 순수한 또는 재조합 DTLR10 단백질 또는 펩티드; 서열 34, 43 또는 45의 천연 서열 DTLR10; 및 DTLR10 서열을 포함하는 융합 단백질. 바람직하게는, 상기 실질적으로 순수한 또는 분리된 단백질은 DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 또는 DTLR10의 상응하는 부분과의 서열 동일성을 나타내는 세그먼트를 포함하는데, 이러한 동일성은 약 15개 이상의 아미노산; 바람직하게는 약 19개 이상의 아미노산; 보다 바람직하게는 약 25개 이상의 아미노산에 걸쳐서 이루어진다. 특정 양태에서는, 상기 사항의 조성물이 표 2의 성숙한 서열을 포함하거나 해독 후 변형이 결여된 DTLR2; 표 3의 성숙한 서열을 포함하거나 해독 후 변형이 결여된 DTLR3; 표 4의 성숙한 서열을 포함하거나 해독 후 변형이 결여된 DTLR4; 표 5의 성숙한 서열을 포함하거나 해독 후 변형이 결여된 DTLR5; 표 6의 성숙한 서열을 포함하거나 해독 후 변형이 결여된 DTLR6; 표 7의 성숙한 서열을 포함하거나 해독 후 변형이 결여된 DTLR7; 표 8의 성숙한 서열을 포함하거나 해독 후 변형이 결여된 DTLR8; 표 9의 성숙한 서열을 포함하거나 해독 후 변형이 결여된 DTLR9; 표 10의 성숙한 서열을 포함하거나 해독 후 변형이 결여된 DTLR10이거나, 또는 상기 사항의 조성물이 다음과 같은 단백질 또는 펩티드일 수 있다: 영장류(예: 사람)를 포함한 포유류 중에서 선택된 온혈 동물 기원이거나; 서열 4, 6, 26, 10, 12, 28, 30, 16, 18, 32, 22 또는 34의 하나 이상의 폴리펩티드 세그먼트를 포함하거나; 상기 동일성을 나타내는 다수의 부분을 갖거나; DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 또는 DTLR10의 천연 대립유전자성 변이체이거나; 길이가 약 30개 이상의 아미노산이거나; 영장류 DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 또는 DTLR10에 특이적인 2개 이상의 비-중복 에피토프를 나타내거나; 약 35개 이상의 아미노산 길이에 걸쳐 영장류 DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 또는 DTLR10과 서열 동일성을 나타내거나; 영장류 DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 또는 DTLR10에 특이적인 2개 이상의 비-중복 에피토프를 추가로 나타내거나; 약 20개 이상의아미노산 길이에 걸쳐 설치류 DTLR6과 동일성을 나나태거나; 글리코실화되거나; 천연 글리코실화를 나타내는 분자량이 100kD 이상이거나; 합성 폴리펩티드이거나; 고체 기질에 부착되거나; 또 다른 화학적 잔기에 접합되거나; 천연 서열로부터 5배 이하 치환되거나; 또는 천연 서열로부터의 결실 또는 삽입 변이체이다.
기타 양태에는 멸균성 DTLR2 단백질 또는 펩티드를 포함하거나, 또는 이러한 DTLR2 단백질 또는 펩티드와 담체를 포함하는(여기서, 상기 담체는 물, 식염수 및/또는 완충액을 포함한 수성 화합물이고/이거나 경구, 직장, 비내, 국소 또는 비경구 투여용으로 제형화된다) 조성물; 멸균성 DTLR3 단백질 또는 펩티드를 포함하거나, 또는 이러한 DTLR3 단백질 또는 펩티드와 담체를 포함하는(여기서, 상기 담체는 물, 식염수 및/또는 완충액을 포함한 수성 화합물이고/이거나 경구, 직장, 비내, 국소 또는 비경구 투여용으로 제형화된다) 조성물; 멸균성 DTLR4 단백질 또는 펩티드를 포함하거나, 또는 이러한 DTLR4 단백질 또는 펩티드와 담체를 포함하는(여기서, 상기 담체는 물, 식염수 및/또는 완충액을 포함한 수성 화합물이고/이거나 경구, 직장, 비내, 국소 또는 비경구 투여용으로 제형화된다) 조성물; 멸균성 DTLR5 단백질 또는 펩티드를 포함하거나, 또는 이러한 DTLR5 단백질 또는 펩티드와 담체를 포함하는(여기서, 상기 담체는 물, 식염수 및/또는 완충액을 포함한 수성 화합물이고/이거나 경구, 직장, 비내, 국소 또는 비경구 투여용으로 제형화된다) 조성물; 멸균성 DTLR6 단백질 또는 펩티드를 포함하거나, 또는 이러한 DTLR6 단백질 또는 펩티드와 담체를 포함하는(여기서, 상기 담체는 물, 식염수 및/또는 완충액을 포함한 수성 화합물이고/이거나 경구, 직장, 비내, 국소 또는 비경구 투여용으로 제형화된다) 조성물; 멸균성 DTLR7 단백질 또는 펩티드를 포함하거나, 또는 이러한 DTLR7 단백질 또는 펩티드와 담체를 포함하는(여기서, 상기 담체는 물, 식염수 및/또는 완충액을 포함한 수성 화합물이고/이거나 경구, 직장, 비내, 국소 또는 비경구 투여용으로 제형화된다) 조성물; 멸균성 DTLR8 단백질 또는 펩티드를 포함하거나, 또는 이러한 DTLR8 단백질 또는 펩티드와 담체를 포함하는(여기서, 상기 담체는 물, 식염수 및/또는 완충액을 포함한 수성 화합물이고/이거나 경구, 직장, 비내, 국소 또는 비경구 투여용으로 제형화된다) 조성물; 멸균성 DTLR9 단백질 또는 펩티드를 포함하거나, 또는 이러한 DTLR9 단백질 또는 펩티드와 담체를 포함하는(여기서, 상기 담체는 물, 식염수 및/또는 완충액을 포함한 수성 화합물이고/이거나 경구, 직장, 비내, 국소 또는 비경구 투여용으로 제형화된다) 조성물; 멸균성 DTLR10 단백질 또는 펩티드를 포함하거나, 또는 이러한 DTLR10 단백질 또는 펩티드와 담체를 포함하는(여기서, 상기 담체는 물, 식염수 및/또는 완충액을 포함한 수성 화합물이고/이거나 경구, 직장, 비내, 국소 또는 비경구 투여용으로 제형화된다) 조성물이 포함된다.
특정의 융합 단백질 양태에서는, 본 발명이 표 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10의 성숙한 단백질 서열; FLAG, His6 또는 Ig 서열을 포함한, 탐지 또는 정제용 태그; 또는 또 다른 수용체 단백질의 서열을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
각종 키트 양태에는 DTLR 단백질 또는 폴리펩티드; 이러한 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하는 구획; 및/또는 당해 키트내의 시약을 사용하거나 처리하는 것에 관한 지시 사항을 포함하는 키트가 포함된다.
결합성 화합물 양태에는 천연의 DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 또는 DTLR10 단백질과 특이적으로 결합되는, 항체로부터의 항원 결합성 부위를 포함하는 것이 포함되는데, 여기서 상기 단백질이 영장류 단백질이거나; 결합성 화합물이 Fv, Fab 또는 Fab2 단편이거나; 결합성 화합물이 또 다른 화학적 잔기에 접합되거나; 또는 상기 항체가 표 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10의 성숙한 폴리펩티드의 펩티드 서열에 대해 생성되거나; 성숙한 DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 또는 DTLR10에 대해 생성되거나; 정제된 사람 DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 또는 DTLR10에 대해 생성되거나; 면역선택되거나; 폴리클로날 항체이거나; 변성 DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 또는 DTLR10에 결합되거나; 항원에 대한 Kd가 30μM 이상이거나; 비드 또는 플라스틱 막을 포함한 고체 기질에 부착되거나; 멸균성 조성물 내에 있거나; 또는 방사성 또는 형광성 표지물로 탐지 가능하게 표지된다. 결합성 조성물 키트는 종종, 상기 결합성 화합물과; 이러한 결합성 화합물을 포함하는 구획; 및/또는 해당 키트 내의 시약을 사용하거나 처리하는 것에 관한 지시 사항을 포함한다. 종종, 상기 키트는 정성적 또는 정량적 분석을 만들 수 있다.
면역계를 면역원성 양의 영장류 DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 또는 DTLR10으로 면역시킴으로써, 항체를 생성시키는 단계를 포함하는 항체 제조 방법; 또는 이러한 항체를 포유류 DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 또는 DTLR10 단백질 또는 펩티드와 접촉시킴으로써,항원:항체 복합체를 형성시키는 단계를 포함하는, 상기 항원:항체 복합체의 생성 방법이 제공된다.
기타 조성물에는 멸균 결합성 화합물을 포함하거나, 또는 이러한 멸균 결합성 화합물과 담체를 포함하는(여기서, 상기 담체는 물, 식염수 및/또는 완충액을 포함한 수성 화합물이고/이거나 경구, 직장, 비내, 국소 또는 비경구 투여용으로 제형화된다) 조성물이 포함된다.
핵산 양태에는 DTLR2-10 단백질 또는 펩티드 또는 융합 단백질을 암호화하는 분리된 또는 재조합 핵산이 포함되는데, 여기서 상기 DTLR이 포유류 기원이거나; 또는 상기 핵산이 표 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10의 항원성 펩티드 서열을 암호화하거나; 표 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10의 다수의 항원성 펩티드 서열을 암호화하거나; 표 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10로부터의 17개 이상의 연속되는 뉴클레오티드를 포함하거나; 상기 세그먼트를 암호화하는 천연 cDNA와 약 80% 이상의 동일률을 나타내거나; 발현 벡터이거나; 복제 기점을 추가로 포함하거나; 천연 공급원으로부터의 것이거나; 탐지 가능한 표지물을 포함하거나; 합성 뉴클레오티드 서열을 포함하거나; 6kb 미만, 바람직하게는 3kb 미만이거나; 포유류(영장류 포함) 기원이거나; 천연의 완전한 길이의 암호화 서열을 포함하거나; 상기 DTLR을 암호화하는 유전자에 대한 하이브리드화용 프로브이거나; 또는 PCR 프라이머, PCR 생성물 또는 돌연변이 유발 프라이머이다. 이러한 재조합 핵산을 포함하는 세포, 조직 또는 기관이 또한 제공된다. 바람직하게는, 상기 세포가 원핵 세포; 진핵 세포; 세균 세포; 효모 세포; 곤충 세포; 포유류 세포; 마우스 세포; 영장류 세포; 또는 사람 세포이다. 상기 핵산과, 이러한 핵산을 포함하는 구획; 영장류 DTLR2, DTLR3, DTLR4 또는 DTLR5 단백질 또는 폴리펩티드를 추가로 포함하는 구획; 및/또는 해당 키트 내의 시약을 사용하거나 처리하는 것에 관한 지시 사항을 포함하는 키트가 제공된다.
기타 양태에는 30℃ 및 2M 미만 염에서의 세척 조건 하에 서열 3과 하이브리드화되거나; 30℃ 및 2M 미만 염에서의 세척 조건 하에 서열 5와 하이브리드화되거나; 30℃ 및 2M 미만 염에서의 세척 조건 하에 서열 7과 하이브리드화되거나; 30℃ 및 2M 미만 염에서의 세척 조건 하에 서열 9와 하이브리드화되거나; 30℃ 및 2M 미만 염에서의 세척 조건 하에 서열 11, 13, 27 또는 29와 하이브리드화되거나; 30℃ 및 2M 미만 염에서의 세척 조건 하에 서열 15, 17 또는 36과 하이브리드화되거나; 30℃ 및 2M 미만 염에서의 세척 조건 하에 서열 19, 31 또는 38과 하이브리드화되거나; 30℃ 및 2M 미만 염에서의 세척 조건 하에 서열 21 또는 40과 하이브리드화되거나; 30℃ 및 2M 미만 염에서의 세척 조건 하에 서열 23, 33, 42 또는 44와 하이브리드화되거나; 약 30개 이상의 뉴클레오티드 연장물에 걸쳐 영장류 DTLR2와 약 85% 이상의 동일률을 나타내거나; 약 30개 이상의 뉴클레오티드 연장물에 걸쳐 영장류 DTLR3과 약 85% 이상의 동일률을 나타내거나; 약 30개 이상의 뉴클레오티드 연장물에 걸쳐 영장류 DTLR4와 약 85% 이상의 동일률을 나타내거나; 또는 약 30개 이상의 뉴클레오티드 연장물에 걸쳐 영장류 DTLR5와 약 85% 이상의 동일률을 나타낸다. 바람직하게는, 상기 핵산에 있어서, 세척 조건이 45℃ 및/또는 500mM 염이거나; 동일률이 90% 이상이고/이거나 상기 연장물이 55개 이상의 뉴클레오티드이다.
보다 바람직하게는, 상기 세척 조건이 55℃ 및/또는 150mM 염이거나; 동일률이 95% 이상이고/이거나 상기 연장물이 75개 이상의 뉴클레오티드이다.
또한, 재조합 또는 합성적으로 생성된 단백질을 포함한, 실질적으로 순수한 영장류 DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 또는 DTLR10을 후보 Toll 리간드와 접촉시킴으로써, 리간드:수용체 복합체를 형성시키는 단계를 포함하는, 상기 리간드:수용체 복합체의 생성 방법이 제공된다.
본 발명은 또한, 특정 세포를, 포유류 DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 또는 DTLR10의 효능제 또는 길항제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 상기 세포 또는 조직 배양 세포의 생리 또는 발생을 조정하는 방법이 제공된다. 바람직하게는, 상기 세포가 DTLR10의 효능제 또는 길항제를 갖는 pDC2 세포이다.
개요
I. 총칙
II. 활성
III. 핵산
A. 암호화 단편, 서열, 프로브
B. 돌연변이, 키메라, 융합
C. 핵산 제조
D. 벡터, 이를 포함하는 세포
IV. 단백질, 펩티드
A. 단편, 서열, 면역원, 항원
B. 돌연변이 단백질(mutein)
C. 효능제/길항제, 기능적 등가물
D. 단백질 제조
V. 핵산, 단백질 제조
A. 합성
B. 재조합
C. 천연 공급원
VI. 항체
A. 폴리클로날
B. 모노클로날
C. 단편; Kd
D. 항-유전자형 항체
E. 하이브리도마 세포주
VII. DTLRs 2-10을 정량화하기 위한 키트 및 방법
A. ELISA
B. 암호화하는 mRNA 검정
C. 정성적/정량적
D. 키트
VIII. 치료학적 조성물, 방법
A. 조합 조성물
B. 단위 용량
C. 투여
IX. 리간드
I. 총칙
본 발명은 특별히 규정된 구조적 성질과 생물학적 성질 모두를 지닌, 포유류(본원에서는 영장류) DNAX Toll 유사 수용체 분자(DTLR)의 아미노산 서열 및 DNA 서열을 제공한다. 이들은 본원에서 각각 DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 및 DTLR10으로서 명명되었으며, 사람 Toll 유사 수용체 계열 1 내지 10의 구성원 수를 증가시킨다. 이들 분자를 암호화하는 각종 cDNA를 영장류(예: 사람) cDNA 서열 라이브러리로부터 수득하였다. 기타 영장류 또는 기타 포유류 대응물도 또한 요망될 것이다.
적용 가능한 몇몇 표준 방법이 다음 문헌에 기재되어 있다[참조: Maniatis, et al.(1982)Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press; Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2d ed.), vols. 1-3, CSH Press, NY; Ausubel etal.,Biology, Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY; or Ausubel, et al.(1987 and periodic supplements)Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York; 이들 각각이 본원에 참조문헌으로써 삽입됨].
사람 DTLR1 암호화 세그먼트의 완전한 뉴클레오티드(서열 1) 및 상응하는 아미노산 서열(서열 2)이 표 1에 제시되어 있다[참조: Nomura et al. (1994)DNA Res.1:27-35]. 사람 DTLR2 암호화 세그먼트의 완전한 뉴클레오티드(서열 3) 및 상응하는 아미노산 서열(서열 4)이 표 2에 제시되어 있다. 사람 DTLR3 암호화 세그먼트의 완전한 뉴클레오티드(서열 5) 및 상응하는 아미노산 서열(서열 6)이 표 3에 제시되어 있다. 사람 DTLR4 암호화 세그먼트의 완전한 뉴클레오티드(서열 7) 및 상응하는 아미노산 서열(서열 8)이 표 4에 제시되어 있다(또한, 서열 25 및 26 참조). 사람 DTLR5 암호화 세그먼트의 부분 뉴클레오티드(서열 9) 및 상응하는 아미노산 서열(서열 10)이 표 5에 제시되어 있다. 사람 DTLR6 암호화 세그먼트의 완전한 뉴클레오티드(서열 11) 및 상응하는 아미노산 서열(서열 12)이, 마우스 DTLR6의 부분 서열(서열 13, 14, 27, 28, 29 및 30)과 함께, 표 6에 제시되어 있다. 사람 DTLR7 암호화 세그먼트의 부분 뉴클레오티드(서열 15 및 17) 및 상응하는 아미노산 서열(서열 16 및 18)이 표 7에 제시되어 있는데; 이의 완전한 길이의 서열이 서열 36 및 37에 제시되어 있다. 사람 DTLR8 암호화 세그먼트의 부분 뉴클레오티드(서열 19) 및 상응하는 아미노산 서열(서열 20)이 상보적 서열(서열 31, 32, 38 및 39)와 함께, 표 8에 제시되어 있다. 사람 DTLR9 암호화 세그먼트의 부분 뉴클레오티드(서열 21) 및 상응하는 아미노산 서열(서열 22)이 표 8에 제시되어 있다(또한, 서열 40 및 41 참조). 사람 DTLR10 암호화 세그먼트의 부분 뉴클레오티드(서열 23) 및 상응하는 아미노산 서열(서열 24)이, 상보적 서열(서열 33, 34, 42 및 43) 및 설치류(예: 마우스) 서열(서열 35, 44 및 45)과 함께, 표 10에 제시되어 있다.
[표 1]
영장류(예: 사람) DNAX Toll 유사 수용체 1(DTLR1)의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열(서열 1 및 2 참조)
[표 2]
영장류(예: 사람) DNAX Toll 유사 수용체 2(DTLR2)의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열(서열 3 및 4 참조)
[표 3]
포유류(예: 사람) Toll 유사 수용체 3(DTLR3)의 뉴클레오티드 및 아미노산서열(서열 5 및 6 참조)
[표 4]
포유류, 예를 들면, 영장류(예: 사람) DNAX Toll 유사 수용체 4(DTLR4)의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열(서열 7 및 8 참조)
보충된 영장류(예: 사람) DTLR4 서열(서열 25 및 26); 주: A로 지정된 뉴클레오티드 81, 3144, 3205 및 3563은 각각 A, C, G 또는 T일 수 있고; G로 지정된 뉴클레오티드 3132, 3532, 3538 및 3553은 각각 G 또는 T일 수 있으며; A로 지정된 뉴클레오티드 3638은 A 또는 T일 수 있고; C로 지정된 뉴클레오티드 3677, 3685 및3736은 각각 A 또는 C일 수 있다;
[표 5]
포유류, 예를 들면, 영장류(예: 사람) DNAX Toll 유사 수용체 5(DTLR5)의 부분 뉴클레오티드 및 아미노산 서열(서열 9 및 10 참조)
[표 6]
포유류(예: 영장류) 또는 설치류 DNAX Toll 유사 수용체 6(DTLR6)의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열. 서열 11 및 12는 영장류(예: 사람)으로부터 기원된 것이고; 서열 13 및 14는 설치류(예: 마우스)로부터 기원된 것이다.
영장류:
설치류(서열 13 및 14):
부가의 설치류, 예를 들면, 마우스 서열:
상단(서열 27 및 28); C로 지정된 뉴클레오티드 186, 196, 217, 276 및 300은 각각 A, C, G 또는 T일 수 있다:
하단(서열 29 및 30); A로 지정된 뉴클레오티드 1643은 A 또는 G일 수 있고; C로 지정된 뉴클레오티드 1664는 A, C, G 또는 T일 수 있으며; G로 지정된 뉴클레오티드 1680 및 1735는 G 또는 T일 수 있고; C로 지정된 뉴클레오티드 1719는 C 또는 T일 수 있으며; A로 지정된 뉴클레오티드 1727은 A, G 또는 T일 수 있다:
[표 7]
포유류, 예를 들면, 영장류(예: 사람) DNAX Toll 유사 수용체 7(DTLR7)의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열
상단(서열 15 및 16):
하단(서열 17 및 18):
추가의 영장류(예: 사람) DTLR7 서열(서열 36 및 37):
[표 8]
포유류, 예를 들면, 영장류(예: 사람) DNAX Toll 유사 수용체 8(DTLR8)의 부분 뉴클레오티드 및 아미노산 서열(서열 19 및 20 참조)
부가의 영장류(예: 사람) 서열(서열 31 및 32); C로 지정된 뉴클레오티드 4 및 23은 A, C, G 또는 T일 수 있고; C로 지정된 뉴클레오티드 845는 C 또는 T일 수있다:
추가의 영장류(예: 사람) DTLR8(서열 38 및 39):
[표 9]
포유류, 예를 들면, 영장류(예: 사람) DNAX Toll 유사 수용체 9(DTLR9)의 부분 뉴클레오티드 및 아미노산 서열(서열 21 및 22 참조)
추가의 영장류(예: 사람) DTLR9(서열 40 및 41):
[표 10]
포유류, 예를 들면, 영장류(예: 사람) DNAX Toll 유사 수용체 10(DTLR10)의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열(서열 23 및 24 참조). A로 지정된 뉴클레오티드 54, 103 및 345는 각각 A 또는 G일 수 있고; G로 지정된 뉴클레오티드 313은 G 또는 T일 수 있으며; C로 지정된 뉴클레오티드 316, 380, 407 및 408은 각각 A, C, G또는 T일 수 있다.
부가의 영장류(예: 사람) DTLR10 서열(서열 33 및 34); A로 지정된 뉴클레오티드 854는 A 또는 T일 수 있고; C로 지정된 뉴클레오티드 1171 및 1172는 각각 A,C, G 또는 T일 수 있다:
추가의 영장류(예: 사람) DTLR10(서열 42 및 43):
부분 설치류(예: 마우스) DTLR10 뉴클레오티드 서열(서열 35):
추가의 설치류(예: 마우스) DTLR10(서열 44 및 45):
[표 11]
사람 DTLRs의 세포내 도메인 비교. DTLR1은 서열 2이고; DTLR2는 서열 4이며; DTLR3은 서열 6이고; DTLR4는 서열 8이며; DTLR5는 서열 10이고; DTLR6은 서열 12이다. 특히 중요한 보존된, 예를 들면, 특징적인 잔기는 DTLRs 전반에 걸쳐, 서열 18 잔기 tyr10-tyr13; trp26; cys46; trp52; pro54-gly55; ser69; lys71;trp134-pro135; 및 phe144-trp145에 상응한다.
막관통 세그먼트는 대략 영장류 DTLR7 서열 37의 802-818(791-823); DTLR8 서열 39의 559-575(550-586); DTLR9 서열 41의 553-569(549-582); DTLR10 서열 43의 796-810(790-814); 및 DTLR10 서열 45의 481-497(475-503)에 상응한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 DNAX Toll 유사 수용체 2(DTLR2)는 표 2에 제시된 아미노산 서열, 또는 이의 실재적 단편을 갖거나 공유하는 단백질 또는 펩티드 세그먼트를 포함하는 단백질을 서술하는데 사용될 것이다. 유사하게, DTLR3의 경우에는 표 3; DTLR4의 경우에는 표 4; DTLR5의 경우에는 표 5; DTLR6의 경우에는 표 6; DTLR7의 경우에는 표 7; DTLR8의 경우에는 표 8; DTLR9의 경우에는 표 9; 및 DTLR10의 경우에는 표 10에 제시된 아미노산 서열, 또는 이의 실재적 단편을 갖거나 공유하는 단백질 또는 펩티드 세그먼트를 포함하는 단백질을 지칭한다. 설치류(예: 마우스) DTLR11 서열은 예를 들어 EST AA739083에 제공되고; DTLR13 서열은 EST AI019567에 제공되며; DTLR14 서열은 ESTs AI390330 및 AA244663에 제공된다.
본 발명에는 또한, 이의 서열이 제공된 각각의 DTLR 대립유전자(allele)의 단백질 변이물, 예를 들면, 돌연변이 단백질 효능제 또는 길항제가 포함된다. 전형적으로, 이러한 효능제 또는 길항제는 서열 상이도가 약 10% 미만일 것이므로, 종종 1 내지 11배 치환도, 예를 들면, 2, 3, 5, 7배 등의 치환도를 나타낼 것이다. 본원에 기재된 단백질의 대립유전자성 및 기타 변이체, 예를 들면, 천연 다형체가 포괄되기도 한다. 전형적으로, 이는 이의 상응하는 생물학적 수용체와 고친화도, 예를 들면, 약 100nM 이상, 통상적으로 약 30nM 이상, 바람직하게는 약 10nM 이상, 보다 바람직하게는 약 3nM 이상으로 결합될 것이다. 상기 용어는 또한, 당해 포유류 단백질의 관련 천연 형태, 예를 들면, 대립유전자, 다형성 변이체 및 대사성 변이체 형태를 지칭하기 위해 본원에서 사용될 것이다.
본 발명은 또한, 표 2에 제시된 아미노산 서열과의 상당한 아미노산 서열 동일률을 나타내는 단백질 또는 펩티드를 포괄한다. 이에는 비교적 치환도가 낮은, 예를 들어, 약 3 내지 5배 미만의 치환도를 나타내는 서열 변이체가 포함될 것이다. 유사한 양상이 표 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10에 제공된 기타 DTLR 서열에도 적용된다.
실재적 폴리펩티드 "단편" 또는 "세그먼트"는 약 8개 이상의 아미노산, 일반적으로 10개 이상의 아미노산, 보다 일반적으로 12개 이상의 아미노산, 종종 14개 이상의 아미노산, 보다 종종 16개 이상의 아미노산, 전형적으로 18개 이상의 아미노산, 보다 전형적으로 20개 이상의 아미노산, 통상적으로 22개 이상의 아미노산, 보다 통상적으로 24개 이상의 아미노산, 바람직하게는 26개 이상의 아미노산, 보다바람직하게는 28개 이상의 아미노산, 특히 바람직하게는 약 30개 이상의 아미노산의 아미노산 잔기 연장물이다. 상이한 단백질의 세그먼트 서열은 적당한 길이의 연장물에 걸쳐 서로 비교할 수 있다.
아미노산 서열 상동률 또는 서열 동일률은 잔기 정합물(matches)을 최적화함으로써 결정하는데, 필요에 따라 갭을 도입할 수 있다[참조: Needleham et al., (1970)J. Mol. Biol. 48:443-453; Sankoff et al., (1983) chapter one in Time Warps, String Edits, and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparision, Addison-Wesley, Reading, MA; 및 IntelliGenetics(Mountain View, CA), the University of Wiscosin Genetics Computer Group(GCG)(Madison, WI) 및NCBI(NIH)로부터의 소프트웨어 패키지; 이들 각각은 본원에 참조문헌으로써 삽입됨]. 이는 보존적 치환물을 정합물로서 간주할 때 변한다. 보존적 치환물에는 전형적으로, 다음 그룹 내에서의 치환물이 포함된다: 글리신, 알라닌; 발린, 이소루이신, 루이신; 아스파르트산, 글루탐산; 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 리신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 티로신. 상동 아미노산 서열에는 사이토킨 서열의 천연 대립유전자성 및 종간 변이물이 포함된다. 전형적인 상동 단백질 또는 펩티드는 표 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10의 아미노산 서열 세그먼트와 50-100% 상동률(갭이 도입될 수 있는 경우) 내지 60-100% 상동률(보존적 치환이 포함되는 경우)을 나타낼 것이다. 상동률 측정치는 약 70% 이상, 일반적으로 76% 이상, 보다 일반적으로 81% 이상, 종종 85% 이상, 보다 종종 88% 이상, 전형적으로 90% 이상, 보다 전형적으로 92% 이상, 통상적으로 94% 이상, 보다 통상적으로 95% 이상, 바람직하게는 96% 이상, 보다 바람직하게는 97% 이상, 특히 바람직하게는 98% 이상일 것이다. 상동률은 비교된 세그먼트의 길이에 따라 다양할 것이다. 상동 단백질 또는 펩티드, 예를 들면, 대립유전자성 변이체는 표 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10에 기재된 양태와 대부분의 생물학적 활성을 공유할 것이다. 아미노산 또는 뉴클레오티드 수준에서 특히 관심있는 비교 영역은, 도 2A 내지 2B에 지시된 것에 상응하는, 각각의 블록 1-10 내에 존재하는 영역, 또는 블록내 영역에 상응한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "생물학적 활성"은 각각의 리간드에 의한 형태형성 발생, 염증성 반응 및/또는 선천적 면역에 대한 효과를 제한없이 기재하는데 사용된다. 예를 들면, 이들 수용체는 IL-1 수용체 처럼, 포스파타제 또는 포스포릴라제 활성을 매개해야 하는데, 이들 활성은 표준 과정에 의해 용이하게 측정한다[참조: Hardie et al., (eds.1995)The Protein Kinase FactBookvols. I and II, Academic Press, San Diego, CA; Hanks, et al.(1991)Meth. Enzymol.200:38-62; Hunter et al., (1992)Cell70:375-388; Lewin (1990)Cell61:743-752; Pines et al. (1991)Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.56:449-463; and Parker et al. (1993)Nature363:736-738]. 상기 수용체는 리간드 결합에 의해 조절된, 조절 가능한 효소와 훨씬 더 유사한 생물학적 활성을 나타낸다. 그러나, 상기 효소 대사회전(turnover) 수는 수용체 복합체 보다 효소에 더 근접하다. 더우기, 이러한 효소적 활성을 유도시키는데 필요한, 점유된 수용체의 수는 대부분의 수용체 시스템 보다 적으며, 세포당 수 천개의 수로 촉발되는 대부분의 수용체와 달리, 세포당 1다스(dozen)에 근접한 수일 수 있다. 상기 수용체 또는 이의 부분은 일반적 또는 특이적 기질을 표지하기 위한 포스페이트 표지화 효소로서 유용할 수 있다.
예를 들어, DTLR의 리간드, 효능제, 길항제 및 동족체에는 리간드-수용체 상호작용의 보다 표준 구조 결합성 경쟁 양상을 보유하고 있는 분자 뿐만 아니라, Toll 리간드 유사 단백질에 대한 특징적인 세포성 반응을 조정해주는 분자가 포함되는데, 이러한 경우 상기 수용체는 천연 수용체 또는 항체이다. 세포성 반응은 유형 I 또는 유형 II IL-1 수용체와 관련되지만, 가능하게는 이와 별개의 세포성 수용체에 대한 각종 Toll 리간드의 결합을 통하여 매개되는 것으로 예상된다[참조: Belvin and Anderson (1996)Ann. Rev. Cell Dev. Biol.12:393-416; Morisato andAnderson (1995)Ann. Rev. Genetics29:371-3991 and Hultmark (1994)Nature367:116-117].
또한, 리간드는 상기 수용체 또는 이의 동족체가 결합되는 천연 리간드로서 작용하는 분자이거나, 또는 이러한 천연 리간드의 기능성 동족체인 분자이다. 이러한 기능성 동족체는 구조적으로 변형된 리간드일 수 있거나, 또는 적당한 리간드 결합 결정기와 상호작용하는 분자 형태를 지닌, 완전히 무관한 분자일 수 있다. 상기 리간드는 효능제 또는 길항제로서 작용할 수 있다[참조: Goodman et al.(eds. 1990)Goodman & Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, Pergamon Press, New York].
합리적인 약물 고안은 수용체 또는 항체 및 기타 유효인자 또는 리간드의 분자 형태에 관한 구조적 연구를 기초로 하여 이루어질 수도 있다. 유효인자는 리간드 결합에 반응하여 기타 기능을 매개하는 기타 단백질, 또는 상기 수용체와 정상적으로 상호작용하는 기타 단백질일 수 있다. 특이적인 기타 단백질과 상호작용하는 부위를 결정하기 위한 한 가지 방법은 물리적 구조 결정법, 예를 들면, X선 결정학 또는 2차원 NMR 기술이다. 이들은 아미노산 잔기가 분자상 접촉 영역을 형성하는지에 관한 지침을 제공해줄 것이다. 단백질 구조 결정법에 관한 상세한 내역은 다음을 참조할 수 있다[참조: Blundell and Johnson (1976)Protein Crystallography, Academic Press, New York; 이는 본원에 참조문헌으로써 삽입됨].
II. 활성
Toll 유사 수용체 단백질은 예를 들어, 포스페이트 대사에 있어서 수 많은 상이한 생물학적 활성을 나타낼 것인데, 이러한 포스페이트는 특이적 기질, 전형적으로 단백질에 부가되거나 이로부터 제거된다. 이로 인해, 일반적으로 염증성 기능, 기타 선천적 면역 반응 또는 형태학적 효과가 조정될 것이다. 당해 DTLR2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 단백질은 기타 Toll 유사 수용체 단백질과 상동성이지만, 각각 구조적 차이점은 있다. 예를 들면, 사람 DTLR2 유전자 암호화 서열은 마우스 DTLR2의 뉴클레오티드 암호화 서열과 약 70%의 동일률을 나타내는 것으로 예상된다. 아미노산 수준에서, 합리적인 동일률이 존재하는 것으로 예상된다.
DTLRs의 생물학적 활성은 포스페이트 잔기를, 전형적으로 특이적 방식이긴 하지만 종종 비특이적 방식으로, 기질에 부가하거나 이로부터 제거하는 것과 관련이 있을 것이다. 기질을 동정할 수 있거나, 또는 효소적 활성에 대한 조건은, 예를 들어, 다음 문헌에 기재된 바와 같은 표준 방법에 의해 검정할 수 있다[참조: Hardie et al., (eds.1995)The Protein Kinase FactBookvols. I and II, Academic Press, San Diego, CA; Hanks, et al.(1991)Meth. Enzymol.200:38-62; Hunter et al., (1992)Cell70:375-388; Lewin (1990)Cell61:743-752; Pines et al. (1991)Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.56:449-463; and Parker et al. (1993)Nature363:736-738].
III. 핵산
본 발명은, 예를 들어, 상응하는 폴리펩티드, 바람직하게는 생물학적 활성의 폴리펩티드를 암호화하기 위한, 상기 단백질 또는 밀접하게 관련된 단백질, 또는이의 단편을 암호화하는 분리된 핵산 또는 단편의 용도를 포괄한다. 또한, 본 발명은, 예를 들어, 각각의 DTLRs의 특징적 서열을 개별적으로 또는 그룹으로서 갖는 상기 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 또는 재조합 DNA를 포괄한다. 전형적으로, 상기 핵산은 적당한 조건 하에서, 표 2-10에 제시된 핵산 서열 세그먼트와는 하이브리드화할 수 있지만, 바람직하게는 표 1의 상응하는 세그먼트와는 하이브리드화할 수 없다. 상기 생물학적 활성 단백질 또는 폴리펩티드는 완전한 길이의 단백질 또는 이의 단편일 수 있고, 전형적으로 표 2-10에 제시된 것과 고도로 상동성인 아미노산 서열 세그먼트를 지닐 것이다. 추가로, 본 발명은 DTLR2-10 단백질과 등가물인 단편을 갖는 단백질을 암호화하는, 분리된 또는 재조합 핵산 또는 이의 단편의 용도를 포괄한다. 이러한 분리된 핵산은 5' 및 3' 플랭크에 각각의 조절 서열, 예를 들면, 프로모터, 인핸서(enhancer), 폴리 A 부가 시그날, 및 천연 유전자로부터의 기타 서열을 지닐 수 있다.
"분리된" 핵산은 실질적으로 순수한, 예를 들면, 본래의 서열, 예를 들면, 기원 종으로부터의 리보솜, 폴리머라제 및 플랭킹 게놈 서열을 천연 상태 수반하는 기타 성분들로부터 분리된 핵산, 예를 들면, RNA, DNA 또는 혼합 중합체이다. 상기 용어는 이의 천연 환경으로부터 제거된 핵산 서열을 포괄하며, 이에는 천연의 조성물로부터 구별 가능한 재조합 또는 클로닝된 DNA 분리물, 및 화학적으로 합성된 동족체 또는 이종 시스템에 의해 생물학적으로 합성된 동족체가 포함된다. 실질적으로 순수한 분자에는, 완전히 순수하거나 실질적으로 순수한 해당 분자의 분리된 형태가 포함된다.
분리된 핵산은 일반적으로 분자의 동종 조성물일 것이지만, 몇몇 양태에서는, 이종성이 바람직하게는 아주 약간(소수) 포함될 것이다. 이러한 이종성은 전형적으로, 목적하는 생물학적 기능 또는 활성에 중요하지 않는 중합체 말단이나 부분에서 발견된다.
"재조합" 핵산은 전형적으로, 이의 생성 방법이나 이의 구조에 의해 규정된다. 이의 생성 방법을 참조하면, 예를 들어, 특정 공정에 의해 제조된 생성물을 참조하면, 상기 공정은 뉴클레오티드 서열을 사람이 간섭하여 조작하는 것을 포함하는 재조합 핵산 기술을 사용하는 것이다. 전형적으로 이러한 조작은 시험관내 조작과 관련이 있지만, 특정한 상황 하에서는 보다 전통적인 동물 사육 기술과 관련이 있을 수 있다. 또 다른 한편, 이는 천연상태로는 서로 연속되지 않는 2개 단편의 융합물을 포함하는 서열을 발생시킴으로써 제조된 핵산일 수 있지만, 천연 생상물, 예를 들면, 천연 상태에서 발견되는 바와 같은 천연 돌연변이체는 배제시킨다. 따라서, 모든 합성 올리고뉴클레오티드 프로세스를 사용하여 유도된 서열을 포함하는 핵산과 같이, 세포를 천연이 아닌 벡터로 형질전환시킴으로써 만들어진 생성물이 포괄된다. 이러한 프로세스는 종종, 제한 효소 서열 인식 부위를 전형적으로 도입하거나 제거하면서, 특정 코돈을 동일한 아미노산 또는 보존적 아미노산을 암호화하는 중복 코돈으로 대체하기 위해 수행된다. 또 다른 한편, 상기 프로세스는 통상적으로 이용 가능한 천연 형태에서는 발견되지 않는 기능, 예를 들면, 융합 단백질을 암호화하는 기능의 목적하는 조합을 나타내는 단일 유전자 실체를 생성시키기 위해, 목적하는 기능의 핵산 세그먼트를 함께 연결하여 수행한다. 제한 효소 인식 부위가 종종, 이러한 인공 조작의 표적이 되긴 하지만, 다른 부위 특이적 표적, 예를 들면, 프로모터, DNA 복제 부위, 조절 서열, 제어 서열 또는 기타 유용한 양상들을 고안하여 혼입시킬 수 있다. 유사한 개념이 재조합(예: 융합) 폴리펩티드에 적용된다. 이에는 이량체성 반복 서열이 포함될 것이다. 구체적으로는, 유전 암호 중복성으로 인해, 상이한 각종의 관련 분자, 예를 들면, 기타 IL-1 수용체 계열 구성원으로부터의 서열 융합물 및 DTLR2-5 단편에 대한 등가의 폴리펩티드를 암호화하는 합성 핵산이 포함된다.
핵산 맥락에서의 "단편"은 약 17개 이상의 뉴클레오티드, 일반적으로 21개 이상의 뉴클레오티드, 보다 일반적으로 25개 이상의 뉴클레오티드, 통상적으로 30개 이상의 뉴클레오티드, 보다 통상적으로 35개 이상의 뉴클레오티드, 종종 39개 이상의 뉴클레오티드, 보다 종종 45개 이상의 뉴클레오티드, 전형적으로 50개 이상의 뉴클레오티드, 보다 통상적으로 55개 이상의 뉴클레오티드, 통상적으로 60개 이상의 뉴클레오티드, 보다 통상적으로 66개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게는 72개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 79개 이상의 뉴클레오티드, 특히 바람직하게는 85개 이상의 뉴클레오티드의 연속되는 세그먼트이다. 전형적으로, 상이한 유전 서열의 단편을 적당한 길이의 연장물, 특별히 규정된 세그먼트, 예를 들면, 다음에 기재된 도메인에 걸쳐 서로 비교할 수 있다.
DTLR2-10를 암호화하는 핵산은 그 자체를 암호화하거나 밀접하게 관련된 단백질을 암호화하는 유전자, mRNA 및 cDNA 종 뿐만 아니라 상이한 개개인 또는 관련 종으로부터의 다형성, 대립유전자성 또는 기타 유전적 변이체를 암호화하는 DNA를동정하는데 특히 유용할 것이다. 이러한 스크린에 바람직한 프로브는 상이한 다향성 변이체들 간에 보존되거나 특이성이 결여된 뉴클레오티드를 함유하는 인터루킨의 영역이며, 이는 바람직하게는, 완전한 길이거나 거의 이에 가까운 길이일 것이다. 기타 상황하에서는, 다형성 변이체 특이적 서열이 보다 유용할 것이다.
본 발명은 추가로, 본원에 제시된 분리된 DNA와 동일하거나 이와 고도로 상동성인 핵산 서열을 갖는 재조합 핵산 분자 및 단편을 포괄한다. 특히, 상기 서열은 종종, 전사, 해독 및 DNA 복제를 제어하는 DNA 세그먼트와 작동적으로 연결될 것이다. 이들 부가의 세그먼트는 전형적으로, 목적하는 핵산 세그먼트의 발현을 촉진시켜 준다.
서로 비교했을 때 상동성이거나 고도로 동일한 핵산 서열, 또는 표 2-10 서열은 상당한 유사성을 나타낸다. 핵산 내의 상동률에 대한 표준치는 당해 분야에서 일반적으로 사용된 서열 비교에 의한 상동률 측정치, 또는 하이브리드화 조건에 근거한 상동률 측정치이다. 상대적인 하이브리드화 조건이 다음에 보다 상세히 기재되어 있다.
핵산 서열 비교 맥락에서의 실재적인 동일성은 해당 세그먼트 또는 이의 상보성 쇄가, 적당한 뉴클레오티드 삽입물 또는 결실물과 최적으로 정렬되었을 때 이와 비교해서, 상기 뉴클레오티드(이에는 구조적 도메인을 암호화하는 세그먼트, 예를 들면, 다음에 기재된 세그먼트가 포함된다)의 약 60% 이상, 일반적으로 66% 이상, 통상적으로 71% 이상, 종종 76% 이상, 보다 종종 80% 이상, 통상적으로 84% 이상, 보다 통상적으로 88% 이상, 전형적으로 91% 이상, 보다 전형적으로 약 93% 이상, 바람직하게는 약 95% 이상, 보다 바람직하게는 약 96% 내지 98% 이상, 특히 바람직하게는 약 99% 이상이 동일한 것을 의미한다. 또 다른 한편, 실재적인 동일성은 상기 세그먼트가 선택적인 하이브리드화 조건 하에서, 전형적으로 표 2-10으로부터 유도된 서열을 사용하여, 특정 쇄 또는 이의 보체와 하이브리드화할 때 존재할 것이다. 전형적으로, 선택적인 하이브리드화는 약 14개 이상의 뉴클레오티드의 연장물에 걸쳐 약 55% 이상, 보다 전형적으로는 약 65% 이상, 바람직하게는 약 75% 이상, 보다 바람직하게는 약 90% 이상의 상동률이 존재할 때 일어난다[참조: Kanehisa (1984)Nucl. Acids Res.12:203-213; 이는 본원에 참조문헌으로써 삽입됨]. 기재된 바와 같은 상동률 비교 길이는 보다 긴 연장물에 걸쳐질 수 있으며, 특정 양태에서는, 약 17개 이상의 뉴클레오티드, 일반적으로 약 20개 이상의 뉴클레오티드, 통상적으로 약 24개 이상의 뉴클레오티드, 통상적으로 약 28개 이상의 뉴클레오티드, 전형적으로 약 32개 이상의 뉴클레오티드, 보다 전형적으로 약 40개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 50개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 75 내지 100개 이상의 뉴클레오티드의 연장물에 걸쳐질 수 있다.
하이브리드화 맥락에서 상동률과 관련한 엄격한 조건이란, 염, 온도, 유기 용매, 및 하이브리드화 반응에서 전형적으로 제어되는 기타 파라미터의 엄격한 조합 조건을 지칭할 것이다. 엄격한 온도 조건에는 통상적으로 약 30℃ 초과 온도, 보다 통상적으로 약 37℃ 초과 온도, 전형적으로 약 45℃ 초과 온도, 보다 전형적으로 약 55℃ 초과 온도, 바람직하게는 약 65℃ 초과 온도, 보다 바람직하게는 약 70℃ 초과 온도가 포함될 것이다. 엄격한 염 조건에는 통상적으로 약 500nM 미만의 염, 통상적으로 약 400nM 미만의 염, 보다 통상적으로 약 300nM 미만의 염, 전형적으로 약 200nM 미만의 염, 바람직하게는 약 100nM 미만의 염, 보다 바람직하게는 약 80nM 미만의 염, 심지어 약 20nM 미만의 염이 포함될 것이다. 그러나, 어떠한 단일 파라미터의 측정치 보다도 파라미터의 조합치가 훨씬 더 중요하다[참조: Wetmur and Davidson (1968)J. Mol. Biol.31:349-370; 이는 본원에 참조문헌으로써 삽입됨].
또 다른 한편, 서열 비교를 위해, 전형적으로 1개 서열이, 시험 서열과 비교하기 위한 기준(reference) 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리듬을 사용하는 경우에는, 시험 서열과 기준 서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요에 따라 서브서열 좌표를 지정하며, 서열 알고리듬 프로그램 파라미터를 지정한다. 이때, 서열 비교 알고리듬은 지정된 프로그램 파라미터에 기초하여, 기준 서열과 비교한 시험 서열(들)에 대한 서열 동일률을 계산한다.
비교를 위해 서열을 광학적으로 정렬하는 것은, 예를 들어, 문헌[참조: Smith and Waterman (1981)Adv. Appl. Math.2:482]의 국부 상동률 알고리듬, 문헌[참조: Needlman and Wunshc (1970)J. Mol. Biol.48:443]의 상동률 정렬 알고리듬, 문헌[참조: Pearson and Lipman (1988)Proc. Nat'l Acad. Sci. USA85:2444]의 유사성 방법에 대한 조사, 컴퓨터에 의한 이들 알고리듬의 임플러먼테이션(implementation)[Wisconsin Genetics Software Package(Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) 내의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA], 또는 가시적 검사[Ausubel et al., 상기 참조]에 의해 수행할 수 있다.
유용한 알고리듬의 한 예는 PILEUP이다. PILEUP는 점진적으로 쌍을 이루는 정렬을 이용하여 관련 서열 그룹으로부터 다중 서열 정렬을 산출하여, 서열 동일률(%)과 관계를 나타낸다. 또한, 상기 정렬을 산출하기 위해 사용된 다발 관계를 보여주는 트리(tree) 또는 계통수를 플롯한다. PILEUP는 문헌[참조: Feng and Doolittle (1987)J. Mol. Evol.35:351-360]의 점진적 정렬 방법의 단일화를 이용한다. 사용된 상기 방법은 문헌[참조: Higgins and Sharp (1989)CABIOS5:151-153]에 기재된 방법과 유사하다. 상기 프로그램은 300개 서열 까지 정렬할 수 있는데, 이들 각각의 최대 길이는 5,000개 뉴클레오티드 또는 아미노산이다. 다중 정렬 과정은 2개의 가장 유사한 서열을 쌍으로 정렬함으로써 시작하여, 2개의 정렬된 서열 다발을 만든다. 이어서, 상기 다발을 그 다음의 가장 관련된 서열 또는 정렬된 서열 다발에 정렬시킨다. 2개의 서열 다발은 2개의 개개 서열을 쌍으로 정렬시킨 것을 단순히 확장시킴으로써 정렬시킨다. 일련의 점진적으로 쌍으로 정렬시킴으로써 최종 정렬을 달성한다. 이러한 프로그램은, 서열 비교 영역에 대한 특정 서열 및 이들의 아미노산 또는 뉴클레오티드 좌표를 지정하고 프로그램 파라미터를 지정함으로써 수행한다. 예를 들면, 다음 파라미터를 사용하여, 기준 서열을 기타 시험 서열과 비교하여, 서열 동일률(%) 관계를 결정할 수 있다: 생략성 갭 중량(3.00), 생략성 갭 길이 중량(0.10) 및 칭량된 말단 갭.
서열 동일률(%)과 서열 유사율(%)을 결정하는데 적합한 또 다른 예의 알고리듬은 BLAST 알고리듬인데, 이는 문헌[참조: Altschul et al. (1990)J. Mol. Biol.215:403-410]에 기재되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 다음으로부터 공개적으로 입수 가능하다[the National Center for Biotechnology Information(http:www.ncbi.nlm.nih.gov/)]. 이러한 알고리듬은 의문 서열 내의 길이 W의 반어(short word)를 확인함으로써 먼저 고 스코어링 서열 쌍(HSPs)을 확인하는 것을 포함하는데, 이는 데이터 베이스 서열 내의 동일한 길이의 단어로 정렬될 때 몇몇 양성치의 한계 스코어 T와 부합되거나 이를 충족시킨다. T는 인근(neighbohood) 단어 스코어 한계치로서 지칭된다[Altschul et al. 상기 참조]. 이들 초기 인근 단어 히트는, 이를 함유하는 보다 긴 HSPs를 발견하기 위해 조사를 개시하기 위한 시드(seed)로서 작용한다. 이어서, 상기 단어 히트를, 누적 정렬 스코어가 증가될 수 있는 한은, 이에 대한 각 서열을 따라 양 방향으로 연장된다. 각 방향으로의 단어 히트의 연장은 상기 누적 정렬 스코어가 이의 최대치로부터 양 X로써 떨어지거나; 하나 이상의 음성-스코어링 잔기 정렬로 인해, 누적 스코어가 0 이하로 되거나; 또는 어느 한 서열의 끝이 도달한 경우에 중지된다. BLAST 알고리듬 파라미터 W, T 및 X는 해당 정렬물의 민감도와 속도를 결정해준다. BLSAT 프로그램은 생략성물로서 11의 단어 길이(W), 50의 BLOSUM62 스코어링 매트릭스[참조: Henikoff and Henikoff (1989)Proc. Nat'l Acad. Sci. USA89:10915] 정렬물(B), 10의 기대치(E), M=5, N=4, 및 양 쇄의 비교치를 이용한다.
서열 동일률(%)을 계산하는 것 이외에도, BLSAT 알고리듬은 또한, 두 서열 간의 유사율을 통계적으로 비교해준다[참조: Karlin and Altschul (1993)Proc. Nat'l Acad. Sci. USA90:5873-5787]. BLAST 알고리듬에 의해 제공된 한 가지 유사율 측정치는 가장 작은 합 확률(P(N))인데, 이는 두 뉴클레오티드 또는 아미노산서열 간의 정합이 우연히 일어날 수 있다는 확률을 지시해준다. 예를 들면, 기준 핵산에 대한 시험 핵산의 비교에서 가장 작은 합 확률이 약 0.1 미만, 보다 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우에, 특정 핵산이 기준 핵산과 유사한 것으로 간주된다.
폴리펩티드의 두 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 추가의 지표는, 제1 핵산에 의해 암호화된 폴리펩티드가 다음에 기재되는 바와 같이, 제2 핵산에 의해 암호화된 폴리펩티드와 면역학적으로 교차 반응성이라는 것이다. 따라서, 특정 폴리펩티드는 전형적으로, 제2 폴리펩티드와 실질적으로 동일한데, 이러한 경우, 예를 들어, 두 펩티드는 보존적 치환에 의해서만 상이하다. 두 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 또 다른 지표는 두 분자가 다음에 기재되는 바와 같이, 엄격한 조건 하에서 서로 하이브리드화되는 것이다.
분리된 DNA는 뉴클레오티드 치환, 뉴클레오티드 결실, 뉴클레오티드 삽입 및 뉴클레오티드 연장물의 역위에 의해 용이하게 변형시킬 수 있다. 이들 변형으로 인해, 상기 단백질 또는 이의 유도체를 암호화하는 신규한 DNA 서열이 생성된다. 이들 변형된 서열을 사용하여, 돌연변이체 단백질(돌연변이 단백질)을 생성시키거나 변이체 종의 발현을 증진시킬 수 있다. 발현 증진은 유전자 증폭, 전사 증가, 해독 증가 및 기타 기전과 관련될 수 있다. 이러한 돌연변이체 DTLR-유사 유도체에는 상기 단백질 또는 이의 단편의 예정되거나 부위 특이적 돌연변이물(유전 암호 중복성을 이용한 침묵 돌연변이물 포함)이 포함된다. 본원에서 사용된 바와 같은 "돌연변이체 DTLR"은 상기 제시된 바와 같은 DTLR의 상동성 정의 내에 속하지만,결실, 치환 또는 삽입에 의해, 천연에서 발견된 바와 같은 기타 DTLR 유사 단백질과는 상이한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포괄한다. 특히, "부위 특이적 돌연변이체 DTLR"는 표 2-10의 단백질과 상당한 상동성을 나타내는 단백질을 포괄하고, 전형적으로 본원에 기재된 형태의 생물학적 활성 또는 효과의 대부분을 공유한다.
부위 특이적 돌연변이 부위가 예정된 것이긴 하지만, 돌연변이체가 반드시 부위 특이적일 필요는 없다. 포유류 DTLR 돌연변이 유발은 발현과 연계해서, 유전자 내에 아미노산 치환 또는 결실을 만듦으로써 달성할 수 있다. 치환, 결실, 삽입 또는 어떠한 조합을 발생시켜도 최종 작제물을 만들 수 있다. 삽입에는 아미노 또는 카복시 말단 융합이 포함된다. 무작위 돌연변이 유발은 표적 코돈에서 수행할 수 있고, 이어서 발현된 포유류 DTLR 돌연변이체를 대상으로 하여, 목적하는 활성에 대해 스크리닝할 수 있다. 공지된 서열을 갖는 DNA 내의 예정된 부위에서 치환 돌연변이물을 제조하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있는데, 예를 들면, M13 프라이머 돌연변이 유발 방법이 있다[참조: Sambrook et al. (1989) and Ausubel et al (1987 and periodic Supplements)].
DNA 내의 돌연변이물에는 판독 프레임으로부터의 암호화 서열이 통상 존재하지 말아야 하고, 이는 바람직하게는, 루프 또는 헤어핀 등의 2차적인 mRNA 구조물을 생성시키도록 하이브리드화될 수 있는 상보성 영역을 산출하지 않을 것이다.
문헌[참조: Beaucage and Carruthers (1981)Tetra. Letts.22:1859-1862]에 기재된 포스포르아미다이트 방법으로, 적합한 합성 DNA 단편이 생성될 것이다. 상보성 쇄를 합성하고, 이러한 쇄를 적당한 조건 하에서 함께 어닐링시키거나 적당한 프라이머 서열과 함께 DNA 폴리머라제를 사용하여 상기 상보성 쇄를 가함으로써, 이중 가닥 단편을 종종 수득할 것이다.
폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 기술을 종종 돌연변이 유발에 적용할 수 있다. 또 다른 한편으론, 예정된 부위에서의 규정된 돌연변이를 발생시키는 방법에 돌연변이 유발용 프라이머를 통상 사용한다[참조: Innis et al.(eds. 1990)PCR Protocols: A Guide to Methods and ApplicationsAcademic Press, San Diego, CA; and Dieffenbach and Dveksler (1995; eds.)PCR Primer: A Laboratory ManualCold Spring Harbor Press, CSH, NY].
IV. 단백질, 펩티드
상기 언급된 바와 같이, 본 발명은 이의 서열이 표 2-10에 제시되어 있고 상기 언급된 바와 같은 영장류 DTLR2-10을 포괄한다. 상기 서열의 일정 부분을, 에피토프 태그 및 기능성 도메인을 포함한 기타 서열 부분과 조합한 융합 단백질을 포함한, 대립유전자성 변이체 및 기타 변이체가 또한 고려된다.
본 발명은 또한, 이들 설치류 단백질로부터의 세그먼트를 사용하여 재조합 단백질, 예를 들면, 이종 융합 단백질을 제공한다. 이종 융합 단백질은 천연 상태에서는 통상 동일한 방식으로 융합되지 않는 단백질 또는 세그먼트의 융합물이다. 따라서, DTLR과 IL-1 수용체와의 융합 생성물은, 전형적으로 단일 해독 생성물로서 만들어진 특유의 펩티드 연결물 내에 융합된 서열을 갖고 각 공급원 펩티드로부터 유도된 특성, 예를 들면, 서열 또는 항원성을 나타내는 연속 단백질 분자이다. 유사한 개념이 이종 핵산 서열에 적용된다.
또한, 기타 관련 단백질, 예를 들면, IL-1 수용체 또는 기타 DTLRs(종 변이체 포함)로부터의 유사한 기능적 또는 구조적 도메인을 조합함으로써 새로운 작제물을 만들 수 있다. 예를 들면, 리간드 결합성 세그먼트 또는 기타 세그먼트를, 상이한 새로운 융합 폴리펩티드 또는 단편 사이에 "스와핑(swapped)"할 수 있다[참조: Cunningham et al. (1989)Science243:1330-1336; and O'Dowd et al.(1988)J. Biol. Chem.263:15985-15992; 이들 각각은 본원에 참조문헌으로써 삽입됨]. 따라서, 새로운 특이성 조합을 나타내는 신규한 키메릭 폴리펩티드가, 수용체-결합 특이성의 기능적 연결물로부터 생성될 것이다. 예를 들면, 상기 단백질 또는 관련 단백질의 기타 도메인에, 기타 관련 수용체 분자로부터의 리간드 결합성 도메인을 가하거나 이것으로 대체할 수 있다. 이로써 생성된 단백질은 종종, 하이브리드 기능과 특성을 지닐 것이다. 예를 들면, 융합 단백질은, 이러한 융합 단백질을 특정한 세포하 소기관(organelle)에 봉쇄시키는 작용을 할 수 있는 표적화 도메인을 포함할 수 있다.
각종 서열 데이터 베이스[예를 들면, GenBank, c/o IntelliGenetics, Mountain View, CA; and BCG, University of Wiscosin Biotechnology Computing Group, Madison, WI; 이들 각각은 본원에 참조문헌으로써 삽입됨]로부터 후보 융합 파트너 및 서열을 선별할 수 있다.
본 발명은 특히, Toll 리간드와 결합하고/하거나 시그날 형질도입에 영향을 미치는 돌연변이 단백질을 제공한다. 사람 DTLR1-10과 IL-1 계열의 기타 구성원과의 구조적 정렬은 보존된 양상/잔기를 나타낸다(도 3A 참조). 사람 DTLR 서열과 IL-1 계열의 기타 구성원과의 정렬은 각종의 구조적 및 기능적으로 공유된 양상들을 지시해준다[참조: Bazan et al. (1996)Nature379:591; Lodi et al. (1994)Science263:1762-1766; Sayle and Milner-White (1995)TIBS20:374-376; and Gronenberg et al. (1991)Protein Engineering4: 263-269].
IL-1α및 IL-1β리간드는 1차 수용체로서 IL-1 수용체 유형 I과 결합하고, 이어서 상기 복합체는 IL-1 수용체 유형 III과 고친화성 수용체 복합체를 형성한다. 이러한 수용체 소단위체는 새로운 IL-1 계열 구성원과 공유하는 것으로 예상된다.
DTLR2-10 서열의 기타 종 대응물, 예를 들면, 상응하는 영역에서의 유사한 변이물은 리간드 또는 기질과의 유사한 상호작용을 제공해야 한다. 마우스 서열 또는 사람 서열로의 치환이 특히 바람직하다. 역으로 말하면, 리간드 결합성 상호작용 영역으로부터 벗어난 보존적 치환이 대부분의 시그날링 활성을 유지하는 것으로 예상된다.
영장류 DTLR2-10의 "유도체"에는 아미노산 서열 돌연변이체, 글리코실화 변이체, 대사적 유도체, 및 기타 화학적 잔기와의 공유 또는 응집성 접합체가 포함된다. 공유 유도체는, 예를 들어, 당해 분야에 널리 공지된 수단에 의해, DTLR 아미노산 측쇄에서 발견되거나 N- 또는 C-말단에 있는 그룹에 관능기를 연결함으로써 제조할 수 있다. 이들 유도체에는 카복실 말단 또는 카복실 측쇄 함유 잔기의 지방족 에스테르 또는 아미드, 하이드록실 그룹 함유 잔기의 O 아실 유도체, 및 아미노 말단 아미노산 또는 아미노 그룹 함유 잔기, 예를 들면, 리신 또는 아르기닌의 N 아실 유도체가 포함될 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 아실 그룹은 알킬 잔기(C3 내지 C18 표준 알킬 포함)의 그룹 중에서 선택됨으로써, 알카노일 아로일 종을 형성한다.
특히, 예를 들어, 이의 합성 및 프로세싱 동안, 또는 추가의 프로세싱 단계에서 폴리펩티드의 글리코실화 패턴을 변형시킴으로써 만든 글리코실화 변형물이 포함된다. 이를 수행하는데 특히 바람직한 방법은 통상적으로 상기 프로세싱을 제공해주는 세포로부터 유도된 글리코실화 효소, 예를 들면, 포유류 글리코실화 효소에 상기 폴리펩티드를 노출시키는 것이다. 탈글리코실화 효소도 또한 고려된다. 인산화 아미노산 잔기, 예를 들면, 포스포티로신, 포스포세린 또는 포스포트레오닌을 포함한, 기타의 소수의 변형을 나타내는 동일한 1차 아미노산 서열의 변형물도 포괄된다.
주요 그룹의 유도체는 상기 수용체 또는 이의 단편과 폴리펩티드의 기타 단백질과의 공유 접합체이다. 이들 유도체는 N- 또는 C-말단 융합과 같은 재조합 배양으로 합성할 수 있거나, 또는 반응성 측쇄 그룹을 통하여 단백질을 가교결합시키는데 유용한 것으로 당해 분야에 공지된 제제를 사용함으로써 합성할 수 있다. 가교결합제와의 바람직한 유도체화 부위는 자유 아미노 그룹, 탄수화물 잔기 및 시스테인 잔기에 있다.
당해 수용체와 기타 동종 또는 이종 단백질 간의 융합 폴리펩티드가 또한 제공된다. 동종 폴리펩티드는 상이한 수용체들 간의 융합물일 수 있으며, 이로써,예를 들어, 다중의 상이한 Toll 리간드에 대한 결합 특이성을 나타내는 하이브리드 단백질, 또는 확대되거나 약화된 기질 효과 특이성을 지닐 수 있는 수용체가 생성된다. 마찬가지로, 상기 유도체 단백질의 특성 또는 활성 조합을 나타낼 수 있는 이종 융합물을 작제할 수 있다. 전형적인 예는 리포터(reporter) 폴리펩티드, 예를 들면, 루시퍼라제와 특정 수용체의 세그먼트 또는 도메인, 예를 들면, 리간드 결합성 세그먼트와의 융합물이므로, 목적하는 리간드의 존재 또는 위치를 용이하게 결정할 수 있다[참조: Dull et al. 미국 특허 제4,859,609호; 본원에 참조문헌으로써 삽입됨]. 기타 유전자 융합 파트너에는 글루타치온-S-트랜스퍼라제(GST), 세균성 β-갈락토시다제, trpE, 단백질 A, β-락타마제, 알파 아밀라제, 알코올 데하이드로게나제, 및 효모 알파 교배 인자가 포함된다[참조: Godowski et al. (1988)Science241:812-816].
문헌[참조: Beaucage and Carruthers (1981)Tetra, Letts.22:1859-1862]에 기재된 포스포르아미다이트 방법으로, 적합한 합성 DNA 단편이 생성될 것이다. 상보성 쇄를 합성하고, 이러한 쇄를 적당한 조건 하에서 함께 어닐링시키거나 적당한 프라이머 서열과 함께 DNA 폴리머라제를 사용하여 상기 상보성 쇄를 가함으로써, 이중 가닥 단편을 종종 수득할 것이다.
이러한 폴리펩티드는 인산화, 설폰화, 바이오티닐화, 또는 기타 잔기의 부가 또는 제거에 의해 화학적으로 변형시킨 아미노산 잔기, 특히 포스페이트 그룹과 유사한 분자 형태를 지닌 아미노산 잔기를 가질 수도 있다. 몇몇 양태에서는, 상기 변형물이 유용한 표지화 시약이거나, 또는 정제용 표적, 예를 들면, 친화 리간드로서 작용할 것이다.
전형적으로, 재조합 핵산 방법 또는 합성 폴리펩티드 방법에 의해 융합 단백질을 만든다. 핵산 조작 및 발현 기술이 일반적으로, 예를 들어, 다음 문헌에 기재되어 있다[참조: Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2d ed.), vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, and Ausubel et al.(eds. 1987 and periodic supplements)Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York; 이들 각각이 본원에 참조문헌으로써 삽입됨]. 폴리펩티드 합성 기술은 예를 들어, 다음 문헌에 기재되어 있다[참조: Merrifield (1963)J. Amer. Chem. Soc.85:2149-2156; Merrifield (1986)Science232:341-347; and Atherton et al. (1989)Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford; 이들 각각이 본원에 참조문헌으로써 삽입됨]. 보다 큰 폴리펩티드의 제조 방법은 다음 문헌을 참조할 수 있다[Dawson et al.(1994)Science266:776-779].
본 발명은 또한, 아미노산 서열 또는 글리코실화에 있어서의 변이 이외의 DTLR2-10의 유도체의 용도를 고려한다. 이러한 유도체는 화학적 잔기와의 공유 또는 응집성 연합을 포함할 수 있다. 이들 유도체는 일반적으로, 다음의 3부류로 나눈다: (1) 염, (2) 측쇄 및 말단 잔기 공유 변형물 및 (3) 예를 들면, 세포막과의 흡착 복합체. 상기 공유 또는 응집성 유도체는 면역원으로서 또는 면역검정용 시약으로서 유용하거나, 또는 수용체 또는 기타 결합성 분자(예: 항체)의 친화성 정제와 같은 정제 방법에 유용하다. 예를 들면, Toll 리간드를 공유 결합에 의해 고체 지지체(예: 시아노겐 브로마이드 활성화 세파로즈)에 고정화시키거나, 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해 고정화시키거나, 또는 글루타르알데히드 가교결합을 수반하거나 수반하지 않으면서 폴리올레핀 표면 상으로 흡착시켜, DTLR 수용체, 항체 또는 기타 유사한 분자의 검정 또는 정제에 사용할 수 있다. 상기 리간드는 또한, 탐지 가능한 그룹으로 표지, 예를 들면, 클로르아민 T 과정에 의해 방사성요오드화시키거나, 희토류 킬레이트에 공유적으로 결합시키거나, 또는 진단 검정에 사용하기 위해 또 다른 형광성 잔기에 접합시킬 수 있다.
본 발명의 DTLR은 이러한 DTLR 또는 이의 각종 단편에 특이적인, 예를 들면, 기타 IL-1 수용체 계열 구성원들 간을 구별할 수 있는 항혈청 또는 항체의 생성을 위한 면역원으로서 사용될 수 있다. 상기 정제된 DTLR을 사용하여, 상기 단백질을 함유하는 각종 형태의 불순한 제제로 면역시킴으로써 제조된 모노클로날 항체 또는 항원-결합성 단편을 스크리닝할 수 있다. 특히, "항체"란 용어는 천연 항체의 항원 결합성 단편, 예를 들면, Fab, Fab2, Fv 등을 포괄한다. 상기 정제된 DTLR는 또한, 상승된 발현 수준 존재에 반응하여 생성되는 항체, 또는 내인성 수용체에 대한 항체 생성을 유도시키는 면역학적 장애를 탐지하기 위한 시약으로서 사용될 수 있다. 부가적으로, DTLR 단편은 바로 다음에 기재된 바와 같이, 본 발명의 항체를 생성시키기 위한 면역원으로서 작용할 수도 있다. 예를 들면, 본 발명은 표 2-10에 제시된 아미노산 서열, 이의 단편 또는 각종 상동 펩티드에 대한 결합 치환도를 나타내거나 이에 대해 생성된 항체를 또한 고려한다. 특히, 본 발명은 본래의 DTLR의 외부 단백질 표면에 노출될 것으로 예상되거나 실제적으로 이에 노출되는특이적 단편에 대해 생성되거나 이에 대한 결합 친화성을 지니는 항체를 고려한다.
수용체 리간드에 대한 생리학적 반응을 차단시키는 것은 경쟁적 억제를 통하여, 상기 리간드가 수용체에 결합하는 것을 억제시킴으로써 비롯될 수 있다. 따라서, 본 발명의 시험관내 검정은 항체 또는 이들 항체의 항원 결합성 세그먼트, 또는 고체 상 기질에 부착된 단편을 종종 이용할 것이다. 이들 검정으로, 리간드 결합성 영역 돌연변이 및 변형, 또는 예를 들어, 시그날링 또는 효소적 기능에 영향을 미치는 기타 돌연변이 및 변형의 효과를 진단적으로 결정할 수 있을 것이다.
본 발명은 또한, 예를 들어, 상기 수용체 또는 단편에 대한 중화 항체가 리간드 또는 기타 항체와의 결합을 위해 시험 화합물과 경쟁하는 경쟁적 약물 스크리닝 검정의 용도를 고려한다. 이러한 방식으로, 상기 중화 항체 또는 단편을 사용하여, 수용체에 대한 하나 이상의 결합 부위를 공유하는 폴리펩티드의 존재 여부를 탐지할 수 있고, 리간드와 결합할 수도 있는 수용체 상의 결합 부위를 점유할 수도 있다.
V. 핵산 및 단백질 제조
당해 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 DNA는 화학적 합성, cDNA 라이브러리의 스크리닝, 또는 광범위한 세포주 또는 조직 샘플로부터 제조된 게놈 라이브러리의 스크리닝에 의해 수득할 수 있다. 본원에 제공된 서열(예: 표 2-10에 제시된 서열) 및 표준 방법을 사용하여 천연 서열을 분리할 수 있다. 서열 데이터 베이스(예: GenBank)를 검사하거나 이와 연계해서, 하이브리드화 기술 또는 각종 PCR 기술에 의해, 기타 종 대응물을 동정할 수 있다.
이러한 DNA는 광범위한 숙주 세포에서 발현될 수 있어, 예를 들어, 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 발생시키는데 사용될 수 있는 완전한 길이의 수용체 또는 단편을 합성하고; 결합성 연구를 수행하며; 변형된 리간드 결합성 또는 키나제/포스파타제 도메인을 작제 및 발현하고; 구조/기능 연구를 수행할 수 있다. 적당한 발현 벡터로 형질전환시키거나 형질감염시킨 숙주 세포에서 변이체 또는 단편을 발현할 수 있다. 이들 분자는 재조합 숙주로부터 유도된 것 이외의 단백질이나 세포성 오염물이 거의 존재하지 않으므로, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제와 조합될 때 약제학적 조성물에 특히 유용하다. 상기 단백질 또는 이의 부분은 기타 단백질과의 융합물로서 발현될 수 있다.
발현 벡터는 전형적으로, 적합한 숙주 세포에서 인식되는 적합한 유전적 제어 요소와 통상 작동적으로 연결된, 목적하는 수용체 유전자 또는 이의 단편을 함유하는 자가 복제성 DNA 또는 RNA 작제물이다. 이들 제어 요소는 적합한 숙주 내에서 발현될 수 있다. 발현을 수행하는데 필요한 특정 유형의 제어 요소는 사용된 최종 숙주 세포에 좌우될 것이다. 일반적으로, 이러한 유전적 제어 요소에는 원핵성 프로모터 시스템 또는 진핵성 프로모터 발현 제어 시스템이 포함될 수 있고, 전형적으로 전사 프로모터, 전사 개시를 제어하기 위한 임의의 작동인자, mRNA 발현 수준을 상승시키기 위한 전사 인핸서, 적합한 리보솜 결합 부위를 암호화하는 서열, 및 전사와 해독을 종결시키는 서열이 포함된다. 발현 벡터는 또한 통상적으로, 벡터가 숙주 세포와 독립적으로 복제할 수 있게 해주는 복제 기점을 함유한다.
본 발명의 벡터에는 언급된 바와 같은 단백질, 또는 생물학적 활성 등가의폴리펩티드를 암호화하는 이의 단편을 암호화하는 DNA를 함유하는 벡터가 포함된다. 상기 DNA는 바이러스성 프로모터의 제어하에 있을 수 있고, 선별 마커를 암호화할 수 있다. 본 발명은 원핵성 또는 진핵성 숙주에서 상기 단백질을 암호화하는 진핵성 cDNA를 발현할 수 있는 상기 발현 벡터의 용도를 추가로 고려하는데, 상기 벡터는 상기 숙주와 화합성이고, 당해 수용체를 암호화하는 진핵성 cDNA를 상기 벡터 내로 삽입하여, 이러한 벡터를 함유하는 숙주의 성장이 문제의 cDNA를 발현하도록 한다. 통상적으로, 발현 벡터는 이들의 숙주 세포에서 안정적으로 복제하도록 고안되거나, 또는 세포당 목적하는 유전자(들)의 총 복사수를 상당히 증가 증폭시키도록 고안된다. 발현 벡터가 숙주 세포에서 항상 반드시 복제될 필요는 없는데, 예를 들면, 숙주 세포에 의해 인식되는 복제 기점을 함유하지 않는 벡터를 사용하여 각종 숙주에서 상기 단백질 또는 이의 단편을 일시적으로 발현시키는 것이 가능하다. 또한, 해당 단백질 암호화 부분 또는 이의 단편을 재조합에 의해 숙주 DNA 내로 통합시키는 벡터를 사용하는 것도 가능하다.
본원에 사용된 바와 같은 벡터에는 플라스미드, 바이러스, 박테리오파아지, 통합 가능한 DNA 단편, 및 DNA 단편을 숙주의 게놈 내로 통합시킬 수 있는 기타 비히클이 포함된다. 발현 벡터는 작동적으로 연결된 유전자를 발현시키는 유전적 제어 요소를 함유하는 특수 벡터이다. 플라스미드가 가장 통상적으로 사용되는 형태의 벡터이지만, 등가의 기능을 제공하고 당해 분야에 공지된 기타 모든 형태의 벡터도 본원에서 사용하기에 적합한다[참조: Pouwels et al. (1985 and Supplements)Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y., and Rodriguez et al.(eds. 1988)Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Buttersworth, Boston; 이들 각각이 본원에 참조문헌으로써 삽입됨].
형질전환된 세포는 재조합 DNA 기술을 사용하여 작제된 수용체 벡터로 형질전환시키거나 형질감염시킨 세포, 바람직하게는 포유류 세포이다. 형질전환된 숙주 세포는 통상 목적하는 단백질 또는 이의 단편을 발현하지만, 이의 DNA를 클로닝, 증폭 및 조작할 목적이면, 당해 단백질을 발현시킬 필요가 없다. 본 발명은 추가로, 형질전환된 세포를 영양 배지에서 배양한 다음, 상기 수용체를 세포막에 축적시키는 것을 고려한다. 상기 단백질은 상기 배양물로부터 회수하거나, 또는 특정의 경우에는, 상기 배양 배지로부터 회수할 수 있다.
본 발명의 목적상, 핵산 서열은, 이들이 서로 기능적으로 관계가 있는 경우에 작동적으로 연결된다. 예를 들면, 서열원(presequence) 또는 분비 리더에 대한 DNA는, 이것이 단백질원(preprotein)으로서 발현되거나, 폴리펩티드를 세포 막으로 지시하는데 관여하거나 또는 폴리펩티드를 분비하는데 관여하는 경우에, 이러한 폴리펩티드와 작동적으로 연결된다. 프로모터는, 이것이 폴리펩티드의 전사를 제어하는 경우에 암호화 서열과 작동적으로 연결되고; 리보솜 결합 부위는, 이것이 해독을 허용해주는 위치에 있을 경우에 암호화 서열과 작동적으로 연결된다. 통상적으로, 작동적으로 연결된이란 연속되는 것을 의미하지만, 판독 프레임 내의 특정한 유전 요소, 예를 들면, 억제인자 유전자는 연속적으로 연결되지 않지만 발현을 제어하게 될 작동인자 서열과의 결합은 유지할 것이다.
적합한 숙주 세포에는 원핵생물, 하등 진핵생물 및 고등 진핵생물이 포함된다. 원핵생물에는 그람 음성 및 그람 양성 유기체, 예를 들면, 이. 콜라이(E. coli) 및 비. 서브틸리스(B. subtilis)가 포함되다. 하등 진핵생물에는 효모, 예를 들면, 에스. 세레비지애(S. cerevisiae) 및 피치아(Pichia), 및 딕티오스텔륨(Dictyostelium) 속 종이 포함된다. 고등 진핵생물에는 비-포유류 기원의 동물 세포(예를 들면, 곤충 세포 및 조류)와 포유류 기원의 동물 세포(예: 사람, 영장류 및 설치류) 모두로부터의 정착된 조직 배양 세포주가 포함된다.
원핵성 숙주-벡터 시스템에는 상이한 많은 종에 대한 광범위한 벡터가 포함된다. 본원에 사용된 바와 같이, 이. 콜라이 및 이의 벡터가 총칭적으로 사용되는데, 이에는 기타 원핵생물에 사용된 등가의 벡터가 포함될 것이다. DNA를 증폭시키기 위한 대표적인 벡터는 pBR322 또는 이의 많은 유도체이다. 당해 수용체 또는 이의 단편을 발현시키는데 사용될 수 있는 벡터에는 lac 프로모터를 함유하는 벡터(pUC 시리즈); trp 프로모터를 함유하는 벡터(pBR322-trp); Ipp 프로모터를 함유하는 벡터(pIN 시리즈); 람다-pP 또는 pR 프로모터를 함유하는 벡터(pOTS); 또는 하이브리드 프로모터(예: ptac)를 함유하는 벡터(pDR540)가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다[참조: Brosius et al. (1988) "Expression Vectors Employing Lambda-, trp-, lac-, and Ipp-derived Promoters", inVectors: A Survey of Melecular Cloning Vectors and Their Uses, (eds. Rodriguez and Denhardt), Buttersworth, Boston, Chapter 10, pp.205-236; 본원에 참조문헌으로써 삽입됨].
하등 진핵 생물, 예를 들면, 효모 및 딕티오스텔륨을, DTLR 서열 함유 벡터로 형질전환시킬 수 있다. 본 발명의 목적상, 가장 널리 통용되는 하등 진핵성 숙주는 제빵용 효모인 삭카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)이다. 수 많은 기타 균주와 종이 이용가능하긴 하지만, 이는 하등 진핵생물을 총칭적으로 나타내는데 사용될 것이다. 효모 벡터는 전형적으로, 복제 기점(통합 유형이 아닌 경우), 선별 유전자, 프로모터, 당해 수용체 또는 이의 단편을 암호화하는 DNA, 및 해독 종결, 폴리아데닐화 및 전사 종결을 위한 서열로 이루어진다. 효모에 적합한 발현 벡터에는 3-포스포글리세레이트 키나제 및 각종의 기타 당분해성 효소 유전자 프로모터와 같은 구성성 프로모터, 또는 알코올 데하이드로게나제 2 프로모터 또는 메탈로티오닌 프로모터와 같은 유도성 프로모터가 포함된다. 적합한 벡터에는 다음 유형의 유도체가 포함된다: 자가 복제성 저복사수(예: YRp 시리즈), 자가 복제성 고복사수(예: YEp 시리즈); 통합 유형(예: YIp 시리즈) 또는 미니 염색체(예: YCp 시리즈).
고등 진핵성 조직 배양 세포는 통상적으로, 기능적 활성의 인터루킨 단백질의 발현에 바람직한 숙주 세포이다. 원칙상, 어떠한 고등 진핵성 조직 배양 세포주, 예를 들면, 무척추동물 공급원 또는 척추동물 공급원으로부터의 곤충 바쿨로바이러스 발현 시스템이 작동 가능하다. 그러나, 포유류 세포가 바람직하다. 이러한 세포의 형질전환 또는 형질감염 및 증식은 통상적인 과정이 되었다. 유용한 세포주의 예에는 HeLa 세포, 중국산 햄스터 난소(CHO) 세포주, 어린 랫트 신장(BRK) 세포주, 곤충 세포주, 조류 세포주 및 원숭이(COS) 세포주가 포함된다. 이러한 세포주에 대한 발현 벡터에는 복제 기점, 프로모터, 해독 개시 부위, RNA 스플라이싱 부위(게놈 DNA가 사용된 경우), 폴리아데닐화 부위, 및 전사 종결 부위가 통상 포함된다. 이들 벡터는 선별 유전자 또는 증폭 유전자를 통상 함유한다. 적합한 발현 벡터는 아데노바이러스, SV40, 파보바이러스, 백시니아 바이러스 또는 사이토메갈로바이러스와 같은 공급원으로부터 유도된 프로모터를 수반하는 레트로바이러스, 바이러스 또는 플라스미드일 수 있다. 적합한 발현 벡터의 대표적인 예에는 pCDNA1; pCD[참조: Okayama et al. (1985)Mol. Cell Biol.5:1136-1142]; pMC1neo 폴리A[참조: Thomas et al.(1987)Cell51:503 512]; 및 pAC 373 또는 pAC 610 등의 바쿨로바이러스 벡터가 포함된다.
분비된 단백질의 경우, 개방 판독 프레임은 통상적으로, 이의 N-말단에서 시그날 펩티드와 공유적으로 연결된 성숙한 또는 분비된 생성물로 이루어진 폴리펩티드를 암호화한다. 이러한 시그날 펩티드는 성숙하거나 활성을 지닌 폴리펩티드를 분비하기에 앞서 절단시킨다. 절단 부위는, 예를 들어, 문헌[참조: von-Heijne(1986)Nucleic Acids Research14:4683-4690]의 실험 규칙으로부터의 고도의 정확성으로 예상할 수 있고, 시그날 펩티드의 정확한 아미노산 조성은 이의 기능에 결정적인 것으로 보이지 않는다[참조: Randall et al. (1989)Science243:1156-1159; Kaiser et al. (1987)Science235:312-317].
특이적 또는 규정된 글리코실화 패턴을 제공해주는 시스템에서 이들 폴리펩티드를 발현하는 것이 종종 요망될 것이다. 이러한 경우, 통상의 패턴은 상기 발현 시스템에 의해 천연상 제공되는 것일 것이다. 그러나, 상기 패턴은, 예를 들어, 글리코실화되지 않은 형태의 폴리펩티드를, 이종 발현 시스템 내로 도입된 적당한 글리코실화 단백질에 노출시킴으로써 변형시킬 수 있다. 예를 들면, 당해 수용체 유전자를, 포유류 또는 기타 글리코실화 효소를 암호화하는 하나 이상의 유전자로 공동 형질전환시킬 수 있다. 이러한 접근법을 사용하여, 원핵생물 또는 기타 세포에서 특정의 포유류 글리코실화 패턴을 달성할 수 있을 것이다.
DTLR의 공급원은 상기 언급된 바와 같은 재조합 DTLR를 발현하는 진핵성 또는 원핵성 숙주일 수 있다. 이러한 공급원은 특정 세포주, 예를 들면, 스위스산(Swiss) 마우스 3T3 섬유아세포일 수도 있지만, 기타 포유류 세포주도 본 발명에 의해 고려되며, 바람직한 세포주는 사람 종 기원이다.
서열이 공지되어 있기 때문에, 영장류 DTLRs, 이의 단편 또는 유도체는 통상적인 펩티드 합성 방법에 의해 제조할 수 있다. 이들에는 다음 문헌에 기재된 바와 같은 방법들이 포함된다[참조; Stewart and Young (1984)Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL; Bodanszky and Bodanszky (1984)The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, New York; and Bodanszky (1984)The Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, New York; 이들 각각은 본원에 참조문헌으로써 삽입됨]. 예를 들면, 아지드 방법, 산 클로라이드 방법, 산 무수물 방법, 혼합 무수물 방법, 활성 에스테르 방법(예를 들면, p-니트로페닐 에스테르, N-하이드록시석신이미드 에스테르 또는 시아노메틸 에스테르), 카보디이미다졸 방법, 산화 환원적 방법, 또는 디사이클로헥실카보디이미드(DCCD)/ 부가제 방법을 사용할 수 있다. 고체 상 합성과 용액 상 합성 모두를 전술한 방법에 적용할 수 있다. 부분 DTLR 서열을 이용한 유사한 방법을 사용할 수 있다.
당해 DTLR 단백질, 단편 또는 유도체는, 일반적으로 아미노산을 한 서열씩말단 아미노산에 축합시키는 것을 포함하는 소위 단계별 방법 또는 펩티드 단편을 말단 아미노산에 커플링시키는 방법에 의해, 펩티드 합성에서 전형적으로 이용되는 바와 같이 상기 방법들에 따라서 제조하는 것이 적합하다. 상기 커플링 반응에 사용되지 않는 아미노 그룹은 전형적으로, 부정확한 위치에서의 커플링을 방지하기 위해 보호시켜야만 한다.
고체 상 합성법을 채택한 경우에는, C-말단 아미노산을 이의 카복실 그룹을 통하여 불용성 담체 또는 지지체에 결합시킨다. 이러한 불용성 담체는 이것이 반응성 카복실 그룹과 결합할 능력이 있는 한은 특별히 제한되지 않는다. 상기 불용성 담체의 예로는 할로메틸 수지, 예를 들면, 클로로메틸 수지 또는 브로모메틸 수지, 하이드록시메틸 수지, 페놀 수지, 3급-알킬옥시카보닐하이드라지드화 수지 등이 있다.
아미노 그룹 보호된 아미노산은, 이의 활성화 카복실 그룹과, 미리 형성된 펩티드 또는 쇄의 반응성 아미노 그룹과의 축합을 통하여 서열 결합시켜, 해당 펩티드를 단계적으로 합성한다. 완전한 서열을 합성한 후, 상기 펩티드를 불용성 담체로부터 분리시켜 해당 펩티드를 제조한다. 이러한 고체 상 접근법은 일반적으로 문헌[참조: Merrifield et al. (1963)J. Am. Chem. Soc.85:2149-2156; 본원에 참조문헌으로써 삽입됨]에 기재되어 있다.
이로써 제조된 단백질 및 이의 단편은 펩티드 분리 방법, 예를 들면, 추출, 침전, 전기영동, 각종 형태의 크로마토그래피 등에 의해 반응 혼합물로부터 분리 및 정제할 수 있다. 본 발명의 수용체는 목적하는 용도에 따라서 다양한 순도로수득할 수 있다. 정제는 본원에 기재된(하기 참조) 단백질 정제 기술을 사용하거나, 또는 면역흡착 친화 크로마토그래피 방법에서 본원에 기재된 항체를 사용함으로써 달성할 수 있다. 이러한 면역흡착 친화 크로마토그래피는, 먼저 항체를 고체 지지체에 연결한 다음, 이와 같이 연결된 항체를, 적당한 세포의 가용화 용융물, 당해 수용체를 발현하는 기타 세포의 용융물, 또는 DNA 기술(하기 참조) 결과로서 해당 단백질을 생산하는 세포의 용융물 또는 상등액과 접촉시킴으로써 수행한다.
일반적으로, 상기와 같이 정제된 단백질은 순도가 약 40% 이상, 통상적으로 약 50% 이상, 통상 약 60% 이상, 전형적으로 약 70% 이상, 보다 전형적으로 약 80% 이상, 바람직하게는 약 90% 이상, 보다 바람직하게는 약 95% 이상, 특히 바람직하게는 97 내지 99% 이상일 것이다. 순도는 통상적으로 중량을 기준한 것이지만, 몰 기준한 것일 수도 있다. 경우에 따라, 상이한 검정을 적용할 것이다.
VI. 항체
항체는 천연 상태의 본래 형태와 재조합 형태 모두의, 각종 포유류(예: 영장류) DTLR 단백질 및 이의 단편에 대해 생성될 수 있는데, 그 차이점은 활성 수용체에 대한 항체가 본래 형태에만 존재하는 에피토프를 보다 잘 인식한다는 점이다. 변성 항원 탐지는, 예를 들어, 웨스턴(Western) 분석에 유용할 수도 있다. 천연 수용체 또는 항체의 효능제 또는 길항제로서 유용할 수도 있는 항-유전자형 항체가 또한 고려된다.
바람직한 항체는 친화성과 선택성 모두의 특성을 나타낼 것이다. 고친화성이 일반적으로 바람직한 반면, 선택성은 각종 양태의 서브세트들 간을 구별해줄 것이다. 특히, 관련 구성원의 각종 특이적 조합물과는 결합되지만, 다른 것과는 결합되지 않는 것을 특징으로 하는 항체 제제를 획득하는 것이 요망될 것이다. 이러한 각종 조합 서브세트는 특정하게는, 예를 들어, 면역친화, 선별 등의 표준 방법을 사용하여 이들 시약을 생성시키거나 선별할 수 있게 해준다.
당해 단백질의 예정된 단편에 대한 항체(결합성 단편 및 단일 쇄 변형물 포함)는, 상기 단편과 면역원성 단백질의 접합체로 동물을 면역시킴으로써 생성시킬 수 있다. 목적하는 항체를 분비하는 세포로부터 모노클로날 항체를 제조한다. 이들 항체를 대상으로 하여, 정상적인 단백질 또는 결함있는 단백질과 결합하는지에 대해 스크리닝하거나, 또는 효능 또는 길항 활성에 대해 스크리닝할 수 있다. 이들 모노클로날 항체는 통상적으로 약 1mM 이상, 보다 통상적으로 약 300μM 이상, 전형적으로 약 100μM 이상, 보다 전형적으로 약 30μM 이상, 바람직하게는 약 10μM 이상, 보다 바람직하게는 약 3μM 이상의 KD로 결합될 것이다.
본 발명의 항체(항원 결합성 단편 포함)는 중요한 진단 또는 치료학적 가치를 지닐 수 있다. 이들은 당해 수용체와 결합하고 리간드에 대한 결합을 억제시키거나 생물학적 반응을 유도하는, 즉 이의 기질 상에서 작용하는 수용체의 능력을 억제시키는 강력한 길항제일 수 있다. 이들은 또한, 비-중화 항체로서 유용할 수 있고, 독소 또는 방사성핵종과 커플링되어 생산 세포, 또는 인터루킨의 공급원에 국재된 세포와 결합할 수 있다. 추가로, 이들 항체는 약물 또는 기타 치료제와 직접 접합되거나 링커를 통하여 간접적으로 접합될 수 있다.
본 발명의 항체는 진단 적용 분야에 유용할 수도 있다. 포획 또는 비-중화 항체로서, 이들 항체는 리간드 또는 기질 결합을 억제하지 않고서도 수용체와 결합할 수 있다. 중화 항체로서, 이들은 경쟁적 결합 검정에 유용할 수 있다. 이들은 또한 리간드를 탐지 또는 정량화하는데 유용할 것이다. 이들은 웨스턴 블롯 분석용 시약, 또는 각각의 단백질의 면역침전 또는 면역정제용 시약으로서 사용될 수 있다.
단백질 단편을 기타 물질, 특히 폴리펩티드에 연결시킬 수 있는데, 융합되거나 공유적으로 연결된 폴리펩티드는 면역원으로서 사용될 수 있다. 포유류 DTLR 및 이의 단편을 각종 면역원, 예를 들면, 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), 소의 혈청 알부민, 파상풍 독소 등에 융합 또는 공유적으로 연결시킬 수 있다. 폴리클로날 항혈청의 제조 방법에 관한 기재는 다음 문헌을 참조할 수 있다[Microbiology, Hoeber Medical Division, Harper and Row, 1969; Landsteiner (1962)Specificity of Serological Reactions, Dover Publications, New York; and Williams et al. (1967)Methods in Immunology and Immunochemistry, Vol. 1, Academic Press, New York; 이들 각각이 본원에 참조문헌으로써 삽입됨]. 전형적인 방법은 동물을 특정 항원으로 초면역시키는 것을 포함한다. 이어서, 이러한 면역을 반복한 직후에 상기 동물의 혈액을 수집하고 감마 글로불린을 분리시킨다.
몇몇 경우에는, 각종 포유류 숙주, 예를 들면, 마우스, 설치류, 영장류, 사람 등으로부터 모노클로날 항체를 제조하는 것이 요망된다. 이러한 모노클로날 항체의 제조 기술에 관한 내용은 다음 문헌을 참조할 수 있다[Stites et al.(eds.)Basic and Clinical Immunology(4th ed.), Lange Medical Publications, Los Altos, CA, 및 이에 인용된 참조문헌; Harlow and Lane (1988)Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press; Goding ((1986)Monoclonal Antibodies: Principles and Practice(2d ed.) Academic Press, New York; Kohler and Milstein (1975)Nature256:495-497(이에는 모노클로날 항체를 생성하는 한 가지 방법이 기재되어 있다); 이들 문헌 각각은 본원에 참조문헌으로써 삽입됨]. 간략하게 요약하면, 상기 방법은 동물에게 면역원을 주사하는 것을 포함한다. 이어서, 상기 동물을 희생시키고, 이의 비장으로부터 세포를 취한 다음, 이를 골수종 세포와 융합시킨다. 그 결과, 시험관내에서 재생될 수 있는 하이브리드 세포 또는 "하이브리도마"가 생성된다. 이어서, 하이브리도마 집단을 스크리닝하여 개개의 클론을 분리시키는데, 이들 각각은 단일 항체 종을 상기 면역원으로 분비시킨다. 이러한 방식으로 수득된 개개의 항체 종은 면역원성 물질 상에서 인식된 특이적 부위에 반응하여 발생된 면역 동물로부터의 불멸화 및 클론된 단일 B 세포의 생성물이다.
기타 적합한 기술은 림프구를 항원성 폴리펩티드에 시험관내 노출시키거나, 또는 파아지 또는 유사한 벡터 내에서 항체 라이브러리를 선별하는 것을 포함한다[참조: Huse et al. (1989) "Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda,"Science246:1275-1281; and Ward et al. (1989)Nature341:544-546; 이들 각각이 본원에 참조문헌으로써 삽입됨]. 본 발명의 폴리펩티드 및 항체는 변형시키거나 변형시키지 않고 사용할 수 있으며, 이에는 키메릭 또는 사람 적응화(humanized) 항체가 포함된다. 종종, 당해 폴리펩티드 및 항체를, 탐지 가능한 시그날을 제공해주는 물질과 공유적 또는 비공유적으로 연결시킴으로써 표지시킬 수 있다. 광범위한 표지물과 접합 기술이 공지되어 있고, 과학지와 특허지 모두에 광범위하게 보고되었다. 적합한 표지물로는 방사성핵종, 효소, 기질, 조인자, 억제제, 형광성 잔기, 화학발광성 잔기, 자기 입자 등이 있다. 이러한 표지물의 용도에 관해 보고된 특허로는 미국 특허 제3,817,837호; 제3,850,752호; 제3,939,350호; 제3,996,345호; 제4,277,437호; 제4,275,149호; 및 제4,366,241호가 있다. 또한, 재조합 또는 키메릭 면역글로불린을 생성할 수 있거나[Cabilly의 미국 특허 제4,816,567호 참조], 또는 형질전환된 마우스에서 만들 수 있다[참조: Mendez et al.(1997)Nature Genetics15:146-156]. 이들 문헌은 본원에 참조문헌으로써 삽입되어 있다.
본 발명의 항체는 또한, DTLRs를 분리하는데 있어 친화 크로마토그래피에 사용할 수 있다. 칼럼를 제조할 수 있는데, 여기서는 상기 항체를 고체 지지체, 예를 들면, 아가로즈 등의 입자, 세파덱스(Sephadex) 등에 연결시키고, 세포 용융물을 상기 칼럼 내로 통과시키며, 칼럼을 세척한 다음, 순한 변성제의 농도를 증가시킴으로써, 정제된 단백질이 방출되도록 한다. 상기 단백질을 사용하여 항체를 정제시킬 수 있다.
당해 항체를 사용하여, 특정한 발현 생성물에 대한 발현 라이브러리를 스크리닝할 수도 있다. 통상적으로, 이러한 과정에 사용된 항체는, 항체 결합에 의해 항원의 존재 여부를 용이하게 탐지해주는 잔기로 표지시킬 것이다.
DTLR에 대해 생성된 항체를 사용하여 항-유전자형 항체를 생성시킬 수도 있다. 이들은 상기 단백질의 발현과 관련된 각종 면역학적 상태, 또는 이러한 단백질을 발현하는 세포를 탐지 또는 진단하는데 유용할 것이다. 이들은 또한, 리간드의 효능제 또는 길항제로서 유용할 것인데, 이는 천연 리간드에 대한 대체물 또는 경쟁적 억제제일 수 있다.
규정된 면역원, 예를 들면, 서열 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 또는 24의 아미노산 서열로 이루어진 면역원에 대해 생성된 항체와 특이적으로 결합되거나 이러한 항체와 특이적으로 면역반응성인 DTLR 단백질은 전형적으로, 면역검정으로 결정한다. 이러한 면역검정은 전형적으로, 서열 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 또는 24의 단백질에 대해 생성된 폴리클로날 항혈청을 이용한다. 상기 항혈청은 바람직하게는 동일한 종으로부터의 기타 IL-1R 계열 구성원, 예를 들면, DTLR1에 대한 교차 반응성이 낮은 것으로 선별하는데, 이러한 교차 반응성은 면역검정에 사용하기에 앞서 면역흡착시켜 제거한다.
면역검정에 사용하기 위한 항혈청을 생성하기 위해, 서열 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 또는 24의 단백질, 또는 이의 조합물을 본원에 기재된 바와 같이 분리시킨다. 예를 들면, 재조합 단백질을 포유류 세포주에서 생성할 수 있다. 적당한 숙주, 예를 들면, 마우스(예: Balb/c)의 동계교배된 균주를, 전형적으로 표준 애쥬반트(adjuvant)(예: 프로인트 애쥬반트) 및 표준 마우스 면역 프로토콜[Harlow and Lane, 상기 참조]을 사용하여, 상기 선별된 단백질로 면역시킨다. 또 다른 한편으론, 본원에 기재된 서열로부터 유도되고 캐리어 단백질에 접합된 합성 펩티드를 면역원으로서 사용할 수 있다. 폴리클로날 혈청을 수집하고,면역검정, 예를 들면, 고체 지지체 상에 고정화된 면역원을 이용하는 고체 상 면역검정으로 상기 면역원 단백질에 대해 역가측정한다. 역가가 104이상인 폴리클로날 항혈청을 선별하고, 이를 대상으로 하여, 문헌[Harlow and Lane, pages 570-573 상기 참조]에 기재된 것과 같은 경쟁적 결합 면역검정을 사용하여 기타 IL-1R 계열 구성원, 예를 들면, 마우스 DTLRs 또는 사람 DTLR1에 대한 이들의 교차 반응성을 시험한다. 바람직하게는, 둘 이상의 DTLR 계열 구성원이 사람 DTLR2-10 중의 어느 하나 또는 이들 중의 몇몇과 연계해서 상기 결정에 사용된다. 이들 IL-1R 계열 구성원을 재조합 단백질로서 생성할 수 있고, 본원에 기재된 표준 분자 생물학 및 단백질 화학 기술을 사용하여 분리할 수 있다.
경쟁적 결합 포맷의 면역검정을 교차반응성 결정법에 사용할 수 있다. 예를 들면, 서열 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 및/또는 24의 단백질, 또는 이의 각종 단편을 고체 지지체에 고정화시킬 수 있다. 이러한 검정에 가해진 단백질은 고정화된 항원에 대한 항혈청의 결합과 경쟁한다. 상기 고정화된 단백질에 대한 항혈청의 결합과 경쟁하는 상기 단백질의 능력을 서열 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 및/또는 24의 단백질과 비교한다. 표준 계산법을 이용하여, 상기 단백질에 대한 교차 반응율(%)을 계산한다. 상기 열거된 각 단백질과의 교차 반응율이 10% 미만인 항혈청을 선별하고 풀링한다. 이어서, 상기 열거된 단백질과의 면역흡착에 의해, 상기 풀링된 항혈청으로부터 교차반응성 항체를 제거한다.
이와 같이 면역흡착되고 풀링된 항혈청을 상기 언급된 바와 같은 경쟁적 결합 면역검정에 사용하여, 면역원 단백질(예: 서열 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 및/또는 24의 IL-1R 유사 단백질)과 제2의 단백질을 비교한다. 이와 같이 비교하기 위해, 상기 두 단백질을 각각 광범위한 농도로 검정하고, 고정화된 단백질에 대한 항혈청의 결합을 50% 억제시키는데 요구되는 각 단백질의 양을 결정한다. 요구되는 제2 단백질의 양이 선별된 단백질 또는 요구되는 단백질의 양 보다 2배 미만인 경우에는, 제2 단백질이, 이러한 면역원에 대해 발생된 항체와 특이적으로 결합된다고 여겨진다.
이들 DTLR 단백질이, 지금까지 동정된 10개 이상의 유전자를 포함하는 동종 단백질 계열의 구성원이라는 것을 인지해야 한다. 특정의 유전자 생성물, 예를 들면, DTLR2-10의 경우에는, 상기 용어가 본원에 기재된 아미노산 서열 뿐만 아니라 대립유전자성, 비-대립유전자성 또는 종 변이체인 기타 단백질을 지칭한다. 또한, 상기 용어에는 통상적인 재조합 기술, 예를 들면, 단일 부위 돌연변이를 이용한 신중한 돌연변이에 의해 도입되거나, 각각의 단백질을 암호화하는 DNA의 짧은 절편을 절단함으로써 도입되거나, 또는 새로운 아미노산으로 치환하거나 새로운 아미노산을 부가함으로써 도입된 비-천연 돌연변이물이 포함된다는 것을 인지해야 한다. 이러한 소수의 변형물은 본래 분자의 면역동일성 및/또는 이의 생물학적 활성을 실질적으로 유지해야만 한다. 따라서, 이들 변형물에는 지정된 천연 IL-1R 관련 단백질, 예를 들면, 서열 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 또는 24에 제시된 DTLR 단백질과 특이적으로 면역반응성인 단백질이 포함된다. 이와 같이 변형된 단백질의 생물학적 특성은, 상기 단백질을 적당한 세포주에서 발현시키고, 림프구에대한 적당한 효과를 측정함으로써 결정할 수 있다. 소수인 것으로 간주된 특정한 단백질 변형물에는, 총괄하여 IL-1R 계열에 대해 상기 언급된 바와 유사한 화학적 특성을 지닌 아미노산의 보존적 치환물이 포함될 것이다. 특정 단백질을 DTLR2-10의 단백질과 최적으로 정렬시키고 면역동일성을 결정하기 위해 본원에 기재된 통상적인 면역검정을 이용함으로써, 당업자는 본 발명의 단백질 조성을 결정할 수 있다.
VII. 키트 및 정량화
본 발명의 IL-1R 유사 분자의 천연 형태와 재조합 형태 모두가 키트 및 검정 방법에 특히 유용하다. 예를 들면, 이들 방법은 결합 활성, 예를 들어, 이들 단백질에 대한 리간드를 스크리닝하는데 적용될 수도 있다. 매년 수 만개의 화합물을 스크리닝하기 위해, 몇 가지 자동화 검정법이 최근 수 년간 개발되었다[참조: BIOMEK 자동화 워크스테이션, Beckman Instruments, Palo Alto, California, and Fodor et al. (1991)Science251:767-773; 본원에 참조문헌으로써 삽입됨]. 후자 문헌에는 고체 기질 상에서 합성된 다수의 규정된 중합체에 의한 결합을 시험하는 수단이 기재되어 있다. 리간드 또는 효능제/길항제 상동 단백질을 스크리닝하는데 적합한 검정법의 개발로 인해, 본 발명에 의해 제공된 바와 같은 활성 상태의 정제된 가용성 사이토킨 DTLRs를 다량으로, 훨씬 더 용이하게 이용할 수 있게 되었다.
정제된 DTLR를, 전술된 리간드 스크리닝 기술에 사용하기 위해 판 위로 직접 도포할 수 있다. 그러나, 이들 단백질에 대한 비-중화 항체를 포획 항체로서 사용하여, 고체 상 위에 각각의 수용체를 고정화시킬 수 있는데, 이는 예를 들어, 진단용으로 유용하다.
본 발명은 또한, 당해 단백질 또는 이의 리간드의 존재 여부를 탐지하기 위해 각종 진단용 키트 및 방법에 있어서의, DTLR2-10, 이의 단편, 펩티드 및 이의 융합 생성물의 용도를 고려한다. 또 다른 한편, 또는 부가적으로, 상기 분자에 대한 항체를 상기 키트 및 방법에 혼입시킬 수 있다. 전형적으로, 당해 키트는 DTLR 펩티드 또는 유전자 세그먼트, 또는 이들 중 하나 또는 다른 것을 인식하는 시약을 함유하는 구획을 가질 것이다. 전형적으로, 펩티드의 경우에는 인식 시약이 수용체 또는 항체이며, 유전자 세그먼트의 경우에는, 통상 하이브리드화 프로브일 것이다.
특정 샘플 내의 DTLR의 농도를 결정하는데 바람직한 키트는 전형적으로, DTLR4에 대한 공지된 결합 친화성을 지닌 표지된 화합물(예: 리간드 또는 항체), 양성 대조군으로서의 DTLR의 공급원(천연 또는 재조합), 및 결합된 화합물을 자유 표지된 화합물, 예를 들어, 시험 샘플 내의 DTLR4를 고정화시키기 위한 고체 상으로부터 분리시키는 수단을 포함할 수 있다. 시약과 지시사항을 함유하는 구획이 통상 제공될 것이다.
포유류 DTLR, 또는 펩티드 단편 또는 수용체 단편에 특이적인 항체(항원 결합성 단편 포함)가, 상승된 수준의 리간드 및/또는 이의 단편의 존재 여부를 탐지하기 위한 진단 적용 분야에 유용하다. 진단용 검정은 동종(자유 시약과 항체-항원 복합체 간의 분리 단계가 없음) 또는 이종(분리 단계가 있음)일 수 있다. 각종의 시판용 검정, 예를 들면, 방사성면역검정(RIA), 효소 결합 면역흡착검정(ELISA), 효소 면역검정(EIA), 효소 다중화 면역검정 기술(EMIT), 기질 표지된 형광성 면역검정(SLFIA) 등이 있다. 예를 들면, DTLR4 또는 이의 특정한 단편에 대한 항체를 인식하는, 표지시킨 제2 항체를 사용함으로써, 표지시키지 않은 항체를 이용할 수 있다. 이들 검정은 또한, 다음 문헌에 광범위하게 언급되어 있다[참조: Harlow and Lane (1988)Antibodies: A Laboratory Manual, CSH., and Coligan (ed. 1991 and periodic supplements)Current Protocols In ImmunologyGreene/Wiley, New York].
항-유전자형 항체는 DTLR4의 효능제 또는 길항제로서 작용하는 유사한 용도를 지닐 수 있다. 이들은 적당한 상황 하에서 치료학적 시약으로서 유용해야 한다.
종종, 진단 검정용 시약을 키트에 제공하여, 해당 검정의 민감도를 최적화시킨다. 본 발명의 경우, 검정의 종류에 따라서, 해당 프로토콜, 및 표지물(표지되거나 표지되지 않은 항체) 또는 표지된 리간드를 제공한다. 이는 통상적으로, 기타 부가제, 예를 들면, 완충제, 안정화제, 시그날 생성에 필요한 물질, 예를 들면, 효소에 대한 기질 등과 연계해서 제공된다. 바람직하게는, 상기 키트는 적당한 사용과 사용 후의 내용물의 적절한 처리에 대한 지시 사항을 함유할 것이다. 전형적으로, 상기 키트는 각각의 유용한 시약에 대한 구획을 함유하고, 이러한 시약의 적절한 사용과 처리에 대한 지시 사항을 함유할 것이다. 바람직하게는, 상기 시약은 무수 동결건조된 분말로서 제공되는데, 이 시약은 해당 검정을 수행하기에 적당한 농도를 지닌 수성 매질에서 재구성될 수 있다.
진단용 검정의 전술된 구성분은 변형시키지 않고 사용할 수 있거나 또는 각종 방식으로 변형시킬 수 있다. 예를 들면, 탐지 가능한 시그날을 직접 또는 간접적으로 제공해주는 잔기를 공유 또는 비공유적으로 연결함으로써 표지화를 달성할 수 있다. 수 많은 이들 검정에 있어서, 시험 화합물, DTLR 또는 이에 대한 항체를 직접 또는 간접적으로 표지시킬 수 있다. 직접으로 표지화시킬 수 있는 수단에는 다음 표지물 그룹이 포함된다: 방사성 표지물, 예를 들면,125I; 효소(미국 특허 제3,645,090호), 예를 들면, 퍼옥시다제 및 알칼린 포스파타제; 및 형광 세기, 파장 이동 또는 형광 분극의 변화를 모니터할 수 있는 형광성 표지물(미국 특허 제3,940,475호). 이들 특허 모두가 본원에 참조문헌으로써 삽입된다. 간접적으로 표지화시킬 수 있는 수단에는 한 구성분을 바이오티닐화한 다음, 이를 상기 표지물 그룹 중의 하나와 커플링된 아비딘과 결합시키는 것이 포함된다.
결합물을 자유 리간드로부터 분리시키거나 또는 결합물을 자유 시험 화합물로부터 분리시키는 수 많은 방법이 있다. 당해 DTLR는 각종 매트릭스 상에 고정화시킨 다음 세척할 수 있다. 적합한 매트릭스에는 플라스틱, 예를 들면, ELISA 판, 필터 및 비드가 포함된다. 당해 수용체를 매트릭스에 고정화시키는 방법에는 플라스틱에 직접적으로 부착시키는 방법, 포획 항체를 사용하는 방법, 화학적으로 커플링시키는 방법, 및 바이오틴-아비딘을 사용하는 방법이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 접근법에서의 최종 단계는, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 등의 유기 용매 또는 황산암모늄 등의 염을 활용하는 것을 포함한 여러 방법에 의해 항체/항원 복합체를 침전시키는 것을 포함한다. 기타 적합한 분리 기술에는 문헌[참조: Rattle et al.(1984)Clin. Chem.30(9):1457-1461]에 기재된 플루오레세인 항체 자화 가능한 입자 방법, 및 미국 특허 제4,659,678호에 기재된 바와 같은 이중 항체 자기 입자 분리 방법이 포함된다[이들 문헌 각각이 본원에 참조문헌으로써 삽입된다].
단백질 또는 단편을 각종 표지물에 연결하는 방법이 당해 분야의 문헌에 광범위하게 보고되었으며, 이것을 본원에 상세히 기재할 필요는 없다. 이러한 많은 기술은 펩티드 결합을 형성하기 위해 카보디이미드 또는 활성 에스테르의 사용을 통하여 활성화 카복실 그룹을 사용하는 것; 연결을 위해, 머캅토 그룹과 활성화 할로겐(예: 클로로아세틸) 또는 활성화 올레핀(예: 말레이미드)과의 반응에 의해 티오에스테르를 형성하는 것 등을 포함한다. 융합 단백질이 이들 적용 분야에 사용될 수도 있다.
본 발명의 또 다른 진단 국면은 DTLR의 서열로부터 취한 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 사용을 포함한다. 이들 서열은, 면역학적 장애를 지닌 것으로 추정되는 환자 내에서 각각의 DTLR의 수준을 탐지하기 위한 프로브로서 사용될 수 있다. RNA와 DNA 뉴클레오티드 서열 모두의 제조, 이러한 서열들의 표지화, 및 이들 서열의 바람직한 크기는 당해 문헌에 상세히 기재 및 논의되어 있다. 통상적으로, 올리고뉴클레오티드 프로브는 약 14개 이상의 뉴클레오티드, 통상 약 18개 이상의 뉴클레오티드를 가져야 하며, 폴리뉴클레오티드 프로브는 수 킬로염기 이하일 수 있다. 각종 표지물, 가장 통상적으로는 방사성핵종, 특히32P를 이용할 수 있다. 그러나, 폴리뉴클레오티드 내로 도입하기 위해 바이오틴 변형된 뉴클레오티드를 사용하는 것과 같은 기타 기술을 이용할 수도 있다. 이때, 상기 바이오틴은 아비딘 또는 항체에 결합하기 위한 부위로서 제공되는데, 이는 광범위한 표지물, 예를 들어, 방사성핵종, 형광체, 효소 등으로 표지시킬 수 있다. 또 다른 한편, DNA 이중체, RNA 이중체, DNA-RNA 하이브리드 이중체 또는 DNA 단백질 이중체를 포함한 특이적 이중체를 인식할 수 있는 항체를 이용할 수 있다. 결국에는 상기 항체를 표지시킬 수 있으며; 상기 이중체를 표면에 결합시켜, 이러한 표면 상에 이중체가 형성되면, 상기 이중체에 결합된 항체의 존재 여부를 탐지할 수 있는 검정을 수행한다. 통상적인 기술, 예를 들면, 핵산 하이브리드화, 플러스 및 마이너스 스크리닝, 재조합적 프로빙, 하이브리드 방출된 해독(HRT), 및 하이브리드 억제된 해독(HART)을 이용하여, 신규한 안티센스 RNA에 대한 프로브의 사용을 수행할 수 있다. 이에는 또한, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)과 같은 증폭 기술이 포함된다.
기타 마커의 정성적 또는 정량적 존재를 시험하기도 하는 진단용 키트가 또하 고려된다. 진단 또는 예후는 마커로서 사용된 다중 지표물의 조합에 좌우될 수 있다. 따라서, 키트는 마커의 조합물에 대해 시험할 수 있다[참조: Viallet et al. (1989)Progress in Growth FactorRes. 1:89-97].
VIII. 치료학적 활용
본 발명은 중요한 치료학적 가치를 지닌 시약을 제공한다. 당해 DTLRs(천연 또는 재조합), 이의 단편, 돌연변이 단백질 수용체 및 항체는, 이러한 수용체 또는 항체에 대한 결합 친화성을 지닌 것으로서 동정된 화합물과 함께, 상기 수용체 또는 이들의 리간드의 비정상적인 발현을 나타내는 질환을 치료하는데 유용해야 한다. 이러한 비정상은 전형적으로, 면역학적 장애로써 나타난다. 부가적으로, 본 발명은 리간드에 대한 반응의 비정상적인 촉발 또는 비정상적인 발현과 연관된 각종 질병 또는 장애에 있어 치료학적 가치를 제공해야 한다. Toll 리간드가 형태학적 발생, 예를 들면, 배복 방향(dorso-ventral) 극성 결정, 및 면역 반응, 특히 원시적인 선천성 반응과 관련이 있는 것으로 보고되었다[참조: Sun et al. (1991)Eur. J. Biochem.196:247-254; Hultmark (1994)Nature367:116-117].
재조합 DTLRs, 돌연변이 단백질, 이에 대한 효능제 또는 길항제 항체, 또는 항체를 정제한 다음, 환자에게 투여할 수 있다. 이들 시약은 치료학적 용도를 위해, 생리학적으로 무해한 안정화제 및 부형제와 함께, 예를 들어, 약제학적으로 허용되는 통상적인 담체 또는 희석제 중에서 부가의 활성 성분과 조합할 수 있다. 이들 조합물을 멸균성 여과시킨 다음, 투여용 바이알에서 동결건조시키거나 안정화된 수성 제제에서 저장함으로써 투여형으로 만들 수 있다. 본 발명은 또한, 보체 결합성이 아닌 항체 또는 이의 결합성 단편의 사용을 고려한다.
DTLR 또는 이의 단편을 사용한 리간드 스크리닝을 수행하여, 이러한 수용체에 대한 결합 친화성을 지닌 분자를 동정할 수 있다. 이어서, 후속 생물학적 검정을 활용하여, 추정상의 리간드가 내재된 자극 활성을 차단시킬 수 있는 경쟁적 결합을 제공해줄 수 있는지를 결정할 수 있다. 수용체 단편을, 리간드의 활성을 차단시키는 차단제 또는 길항제로서 사용할 수 있다. 마찬가지로, 내재된 자극 활성을 지닌 화합물은 상기 수용체를 활성화시킬 수 있으므로, 리간드의 활성을 자극하는, 예를 들어, 시그날링을 유도시키는 효능제이다. 본 발명은 길항제로서 DTLRs에 대한 항체의 치료학적 용도를 추가로 고려한다.
효과적인 치료법에 필요한 시약의 양은 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태, 및 투여된 기타 약물을 포함한 많은 상이한 요인들에 따라 결정될 것이다. 따라서, 치료 투여량은 안전성과 효능을 최적화하도록 적정되어야 한다. 전형적으로, 시험관내에서 사용된 투여량은 이들 시약의 동일계 내에서의 투여에 유용한 양에 대한 유용한 지침을 제공해줄 수 있다. 특정 장애의 치료에 유효한 용량에 관한 동물 시험이, 사람 투여량에 대한 추가의 추정상 암시를 제공해줄 것이다. 각종의 고려 사항이, 예를 들면, 다음 문헌에 기재되어 있다[참조: Gilman et al. (eds. 1990)Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th Ed., Pergamon Press; andRemington's Pharmaceutical Sciences, (current edition), Mack Publishing Co., Easton, Penn.; 이들 각각이 본원에 참조문헌으로써 삽입됨]. 투여 방법, 예를 들면, 경구, 정맥내, 복강내 또는 근육내 투여, 경피 확산 등이 본원 및 다음에 논의되어 있다. 약제학적으로 허용되는 담체에는 물, 식염수, 완충액, 및 문헌[참조: theMerck Index, Merck & Co., Rahway, New Jersey]에 기재된 기타 화합물이 포함될 것이다. 결합 친화도가 높거나 추정상의 리간드와 이의 수용체 간의 대사회전(turnover) 수가 높을 것으로예상되기 때문에, 이들 시약의 낮은 투여량이 초기에 유효할 것으로 기대된다. 그리고, 시그날링 경로는 극도로 적은 양의 리간드가 효과적일 수 있다는 것을 제시해준다. 따라서, 투여량 범위는 적당한 담체와 함께, 통상적으로 1mM 미만 농도, 전형적으로 약 10μM 미만 농도, 통상 약 100nM 미만 농도, 바람직하게는 약 10pM(피코몰) 미만, 가장 바람직하게는 약 1fM(펨토몰) 미만 농도의 양인 것으로 기대될 것이다. 서방출 제형 또는 서방출 장치가 종종 연속적인 투여에 활용될 것이다.
DTLRs, 이의 단편, 및 항체 또는 이의 단편, 길항제 및 효능제는 치료하고자 하는 숙주에게 직접 투여하거나, 또는 화합물의 크기에 따라서, 이들을 캐리어 단백질, 예를 들면, 오브알부민 또는 혈청 알부민과 접합시킨 다음 투여하는 것이 요망될 수 있다. 치료학적 제형은 통상적인 어떠한 투여 제형으로도 투여할 수 있다. 활성 성분을 단독으로 투여하는 것이 가능하긴 하지만, 이것이 약제학적 제형으로서 제공되는 것이 바람직하다. 제형은 상기 규정된 바와 같은 하나 이상의 활성 성분을, 이에 허용되는 하나 이상의 담체와 함께 포함한다. 각 담체는 기타 성분들과 화합성이고 환자에게 해롭지 않다는 의미에서 약제학적이고도 생리학적으로 허용될 수 있어야만 한다. 제형에는 경구, 직장, 비내 또는 비경구(피하, 근육내, 정맥내 및 피내 포함) 투여에 적합한 것이 포함된다. 이러한 제형은 단위 투여 형태로 표시하는 것이 편리할 수 있고, 이는 약제 분야에 널리 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다[참조: Gilman et al. (eds. 1990)Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th Ed., Pergamon Press; andRemington's Pharmaceutical Sciences, (current edition), Mack Publishing Co.,Easton, Penn.; Avis et al. (eds. 1993)Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral MedicationsDekker, NY; Lieberman et al. (eds. 1990)Pharmaceutical Dosage Forms: TabletsDekker, NY; and Lieberman et al. (eds. 1990)Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse SystemsDekker, NY]. 본 발명의 치료법을 기타 치료제, 특히 기타 IL-1 계열 구성원의 효능제 또는 길항제와 조합하거나 이와 연합하여 사용할 수 있다.
IX. 리간드
본원에서의 Toll 수용체에 관한 기재는 상기 언급된 바와 같이, 리간드를 동정하기 위한 수단을 제공해준다. 이러한 리간드는 각각의 수용체와 상당히 고친화도로 특이적으로 결합해야 한다. 당해 수용체를 표지화하여 이의 리간드를 탐지시켜 주는 각종 작제물이 입수 가능하다. 예를 들면, DTLR에 2차적인 표지화용 마커, 예를 들면, FLAG 또는 기타 에피토프 태그 등을 융합시키면서, DTLR를 직접적으로 표지화시켜, 수용체를 탐지할 수 있을 것이다. 발현 클로닝 접근법에서의 표지화 또는 선별, 또는 생화학적 정제에 대한 친화 방법으로서 조직학적일 수 있다. 이용 가능한 DTLR 서열을 사용하여 적당한 작제물을 만드는 2개-하이브리드 선별 시스템을 적용할 수도 있다[참조: Fields and Song (1989)Nature340:245-246].
일반적으로, DTLRs에 대한 기재는 DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 및/또는 DTLR10 시약 및 조성물에 대한 개개의 특정한 양태에 유사하게 적용될 것이다.
본 발명의 넓은 범위는 다음 실시에를 참조로 하여 가장 잘 이해되지만, 본발명이 이들 특정 양태로 제한되지는 않는다.
I. 일반적인 방법
여러 표준 방법이, 예를 들어, 다음 문헌에 기재 또는 참조되어 있다[Maniatis, et al.(1982)Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press; Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2d ed.), vols. 1-3, CSH Press, NY; or Ausubel, et al.(1987 and periodic supplements)Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York]. 단백질 정제 방법에는 황산암모늄 침전, 칼럼 크로마토그래피, 전기영동, 원심분리, 결정화 등의 방법이 포함된다[참조: Ausubel et al. (1987 and periodic supplements); Coligan et al.(ed. 1996) and periodic supplements,Current Protocols In Protein SicnecGreene/Wiley, New York; Deutscher (1990) "Guide to Protein Purification" inMethods in Enzymology, vol. 182, 및 이러한 시리즈의 기타 권; 및 단백질 정제 생성물의 용도에 관한 제조업자의 문헌, 예를 들면, Pharmacia, Piscataway, N.J. 또는 Bio-Rad, Richmond, CA]. 재조합 기술과 조합하면, 적당한 세그먼트, 예를 들면, FLAG 서열, 또는 프로테아제-제거 가능한 서열을 통하여 융합될 수 있는 등가물과 융합될 수 있다[참조: Hochuli (1989)Chemische Industrie12:69-70; Hochuli (1990) "Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent" in Setlow(ed.)Genetic Engineering, Principles and Methods12:87-98, Plenum Press, N.Y.; and Crowe et al. (1992)QIAexpress: The High Level Expression & Protein Purification SystemQUIAGEN, Inc., Chatsworth, CA].
표준 면역학적 기술 및 검정이, 예를 들어, 다음 문헌에 기재되어 있다[참조: Hertzenberg et al. (eds. 1996)Weir's Handbook of Experimental Immunologyvols. 1-4, Blackwell Science; Colign (1991)Current Protocols in ImmunologyWiley/Greene, NY; andMethods in Enzymologyvolumes. 70, 73, 74, 84, 92, 93, 108, 116, 121, 132, 150, 162 and 163].
혈관성 생물학적 활성에 대한 검정법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 이는 종양, 또는 기타 조직에서의 혈관형성 및 지혈 활성, 예를 들면, 동맥 평활근 증식[참조: Koyoma et al. (1996)Cell87:1069-1078], 혈관성 상피 세포에 대한 단구 부착[참조: McEvoy et al. (1997)J. Exp. Med.185:2069-2077] 등을 포괄할 것이다[참조: Ross (1993)Nature362:801-809; Rekhter and Gordon (1995)Am. J. Pathol.147:668-677; Thyberg et al. (1990)Atherosclerosis10:966-990; and Gumbiner (1996)Cell84:345-357].
신경원 세포 생물학적 활성에 대한 검정법이 예를 들어, 다음 문헌에 기재되어 있다[참조: Wouterlood (ed. 1995) Neuroscience Protocols modules 10, Elsevier; Methods in Neurosciences Academic Press; and Neuromethods Humana Press, Totowa, NJ]. 발생학적 시스템의 방법론이 예를 들어, 문헌[참조: Meisami (ed.)Handbook of Human Growth and Developmental BiologyCRC Press; andChrispeels (ed.)Molecular Techniques and Approaches in Developmental BiologyInterscience]에 기재되어 있다.
GCG(U. Wisconsin) 및 GenBank 공급원으로부터의 프로그램을 포함한 입수 가능한 소프트웨어 프로그램을 사용하여, 컴퓨터 서열 분석을 수행한다. 예를 들어, GenBank, NCBI, EMBO 등으로부터의 공개 서열 데이터베이스를 사용하기도 한다. 막관통 및 기타 중요한 모티프의 결정은 이러한 생체 정보과학 도구를 사용하여 예견할 수 있다.
IL-10 수용체에 적용 가능한 많은 기술을, 예를 들어, 미국 특허원 제08/110,683호(IL-10 수용체)(본원에 참조문헌으로써 삽입됨)에 기재된 바와 같이 DTLRs에 적용할 수 있다.
II. 사람 수용체의 신규한 계열
약어: DTLR, DNAX Toll-유사 수용체; IL-1R, 인터루킨-1 수용체; TH, Toll 상동성; LRR, 루이신-풍부한 반복 서열; EST, 발현된 서열 태그; STS, 서열 태그된 부위; FISH, 형광성 원위치 하이브리드화.
드로소필라 Toll의 세포질성 도메인과 사람 인터루킨-1(IL-1) 수용체의 세포질성 도메인 간의 서열 상동성 발견으로 인해, 양 분자가 Rel-유형 전사 인자의 핵 전좌와 연결된 관련 시그날링 경로를 촉발시킨다는 확신을 갖게 되었다. 이러한 보존된 시그날링 도식이 곤충과 척추동물 모두에서 고대 면역 반응을 진화적으로 지배하고 있다. 본 발명자들은 세포내 및 세포외 세그먼트 모두에서 드로소필라 Toll과 밀접하게 유사한 단백질 구성을 갖는 신규한 부류의 추정상의 사람 수용체에 관한 분자 클로닝을 보고하였다. DTLRs 1-5로 명시된, 5가지 사람 Toll 유사 수용체가 상기 플라이(fly) 분자의 직접적인 상동체인 것으로 예상되며, 그 자체로서, 사람의 선천성 면역에 있어 중요하면서도 인식되지 않은 성분을 구성할 수 있으며; 흥미롭게도, DTLRs이 척추동물 내에 진화론적으로 보존된다는 것은 드로소필라 배아의 배측 방향의 Toll과 유사하게, 초기 형태형성 패턴화의 조절인자로서의 또 다른 역할을 지시해줄 수 있다. 다중 조직 mRNA 블롯은 사람 DTLRs에 대한 현저하게 상이한 발현 패턴을 지시해준다. 형광 원위치 하이브리드화 및 서열-태그된 부위 데이터베이스 분석을 사용하여, 본 발명자들은 또한, 동종 DTLR 유전자가 염색체 4(DTLRs 1, 2 및 3), 9(DTLR4) 및 1(DTLR5) 상에 존재한다는 사실을 밝혀내었다. 각종 곤충 및 사람 DTLRs, 척추동물 IL-1 수용체 및 MyD88 인자, 및 식물 질병 내성 단백질로부터의 정렬된 Toll-상동성(TH) 도메인에 관한 구조 예상 결과, 산성 활성 부위를 지닌 병렬 β/α폴드를 인식하였으며; 유사한 구조는, 세균 내에 감각 정보를 형질도입하는 것과 광범위하게 관련된 특정 부류의 반응 조절인자에서 인지 가능한 수준으로 반복된다.
플라이와 사람을 극적으로 분리시켜 주는 형태형성상의 현격한 차이가 친숙한 배아 외형과 패턴을 만들어 주지만, 매우 상이한 세포 복잡성을 유발시킨다[참조: DeRobertis and Dasai (1996)Nature380:37-40; and Arendt and Nubler-Jung (1997)Mech. Develop.61:7-21]. 이러한 곤충과 척추동물 간의 발생학적 플랜 개산성은 현저하게 유사한 시그날링 경로에 의해 진행되는데, 이는 동일하지 않는 유전자 레퍼토리로부터의 생화학적 기전과 단백질 네트워크을 보다 잘 보존시키는 배경이 된다[참조: Miklos and Rubin (1996)Cell86:521-529; and Chothia (1994)Develop.1994 Suppl., 27-33]. 이들 조절 경로의 진화론적 디자인을 계획하는 강력한 방식은 단백질 서열과 구조의 종 간 비교를 통하여 이들의 예상되는 분자 성분(및 생물학적 기능)을 부여하는 것이다[참조: Miklos and Rubin (1996)Cell86:521-529; Chothia (1994)Develop.1994 Suppl., 27-33(3-5); and Banfi et al. (1996)Nature Genet.13:167-174].
배아 발생에 있어서 보편적으로 중요한 단계는 선천적 비대칭으로부터 유래되거나 외부 신호에 의해 촉발되는, 신체 축의 특이성화이다[참조: DeRobertis and Sasai (1996)Nature380:37-40; and Arendt and Nubler-Jung (1997)Mech. Develop.61:7-21]. 모델 시스템으로서, 배복 방향 분극의 세포성 기전과 계통발생 기준에 특별한 관심이 집중되어 왔다[참조: DeRobertis and Sasai (1996)Nature380:37-40; and Arendt and Nubler-Jung (1997)Mech. Develop.61:7-21]. 이러한 형질전환에 대한 원형 분자상 전략이 드로소필라 배아로부터 출현되었는데, 여기서는 소수의 유전자의 순차적 작용으로 인해, 전사 인자의 배복 방향 구배가 야기된다[참조: St. Johnston and Nusslein-Volhard (1992)Cell68:201-219; and Morisato and Anderson (1995)Ann. Rev. Genet.29:371-399].
이러한 시그날링 경로는 Toll, 어머니로부터 분비된 복부 인자(Spatzle)를 Tube의 세포질성 진입 내로 결합하는 것을 형질도입시키는 막관통 수용체, 보조 분자 및 Pelle의 활성화, 억제인자 Cactus로부터의 Dorsal의 해리를 촉매하고 Dorsal에서 복부 핵으로의 이동을 허용해주는 Ser/Thr 키나제에 집중된다[참조: Morisatoand Anderson (1995)Ann. Rev. Genet.29:371-399; and Belvin and Anderson (1996)Ann. Rev. Cell Develop. Biol.12:393-416]. Toll 경로는 또한, 다자란 플라이에서 강력한 항미생물성 인자의 유도를 제어하고[참조: Lemaitre et al. (1996) Cell 86:973-983]; 이러한 드로소필라 면역 방어에서의 역할은 척추동물에서 면역 및 염증성 반응 숙주를 관리하는 IL-1 경로와 유사한 기계작용을 강화시킨다[참조: Belvin and Anderson (1996)Ann. Rev. Cell Develop. Biol.12:393-416; and Wasserman (1993)Molec. Biol. Cell4:767-771]. IL-1 수용체 내의 Toll-관련 세포질성 도메인은 Pelle-유사 키나제, IRAK의 결합, 및 Dorsal 및 Cactus의 포섭을 반영하는 잠복성 NF-κB/I-κB 복합체의 활성화를 지시한다[참조: Belvin and Anderson (1996)Ann. Rev. Cell Develop. Biol.12:393-416; and Wasserman (1993)Molec. Biol. Cell4:767-771].
본 발명자들은 척추동물 IL-1 수용체 보다는 드로소필라 Toll 상동체와 보다 밀접하게 연결된 수용체 계열인 것으로 밝혀진, DTLRs 2-5으로 명명된, 사람에게서 4가지 새로운 Toll-유사 분자의 클로닝과 분자상 성상 확인을 기재하고 있다. 이러한 DTLR 서열은 사람 ESTs로부터 유도된 것이며; 이들 부분 cDNA를 사용하여 상기 5가지 DTLRs에 대한 사람 조직 내에서의 완전한 발현 프로필을 유도하고, 동종 유전자의 염색체성 국재를 지도화하며, 완전한 길이의 cDNA 검색을 위한 cDNA 라이브러리의 선택을 좁게한다. 기타 노력들에 자극되어[참조: Banfi et al. (1996)Nature Genet.13:167-174; and Wang et al. (1996)J. Biol. Chem.271:4468-4476], 본 발명자들은 구조적 보존과 분자상 극도의 절약으로 인해, 드로소필라 내의 강력한 조절 도식의 대응물인 사람에게서의 생물학적 시스템을 어셈블링하였다. 또한, Toll 시그날링을 구동하는 생화학적 기전이, Toll-상동성(TH) 도메인의 제안된 3차 폴드, DTLRs에 의해 공유된 코어 모듈, 넓은 계열의 IL-1 수용체, 포유류 MyD88 인자 및 식물 질병 내성 단백질로써 제시되었다[참조: Mitcham et al. (1996)J. Biol. Chem.271:5777-5783; and Hardiman et al. (1996)Oncogene13:2467-2475]. 본 발명자들은 곤충, 식물 및 동물에서의 시그날링 경로 커플링 형태형성과 원시 면역[참조: Belvin and Anderson (1996)Ann. Rev. Cell Develop. Biol.12:393-416; and Wilson et al. (1997)Curr. Biol.7:175-178]이 세균성 2-성분 경로에 영향을 미칠 수 있다고 제안한다.
컴퓨터를 이용한 분석
곤충 DTLRs와 관계된 사람 서열은, BLAST 서버를 이용하여 다음 기관[National Center for Biotechnology Information(NCBI)]의 EST 데이터베이스(dbEST)로부터 확인하였다[참조: Altschul et al. (1994)Nature Genet.6:119-129]. 보다 민감한 패턴- 및 프로필-이용 방법[참조: Bork and Gibson (1996) Meth. Enzymol. 266:162-184]을 사용하여, 비중복 데이터베이스 내에 존재하는 척추동물 단백질과 식물 단백질과 공유하는 DTLR 계열의 시그날링 도메인을 분리하였다. DTLR 세포내 또는 세포외 도메인 서열의 점진적인 정렬은 ClustalW[참조: Thompson et al. (1994)Nucleic Acids Res.22:4673-4680]에 의해 수행하였는데; 이 프로그램은 네이버-조이닝 알고리듬(Neighbor-Joiningalgorithm)[트리 그룹핑에 대한 신뢰값 제공된 5000 부트스트랩(bootstrap) 레플리케이션]에 의해 정렬된 서열의 분지 순서를 또한 계산한다.
여러 엄격도에서 식별된, 보존된 정렬 패턴이 컨센서스 프로그램(인터넷 URL http://www.bork.embl-heidelberg.de/Alignment/consensus.html)에 의해 작성된다. 단백질 핑거프린트의 PRINTS 라이브러리(http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/dbbrowser/PRINTS/PRINTS.html)[참조: Attwood et al. (1997)Nucleic Acids Res.25:212-217]는 개산 LRRs의 N- 및 C-말단 특징에 신축성있게 부합되는 화합물 모티프(PRINTS code Leurichrpt)를 갖는 DTLRs의 세포외 세그먼트 내에 존재하는 각종 루이신-풍부한 반복 서열(LRRs)을 신뢰 가능한 수준으로 동정하였다. 이의 3-상태 정확도가 72% 이상인 2개의 예상 알고리듬을 사용하여, 인식 노력의 결과를 폴딩하기 위한 브릿지로서, 세포내 도메인 정렬에 대한 컨센서스 2차 구조를 유도하였다[참조: Fisher et al. (1996)FASEB J.10:126-136]. 신경원 네트워크 프로그램 PHD[참조: Rost and Sander (1994)Proteins19:55-72] 및 통계적 예상 방법 DSC[참조: King and Sternberg (1996)Proteins Sci.5:2298-2310]은 인터넷 서버를 갖는다[각각 URLs http://www.embl-heidelberg.de/predictprotein/phd_pred.html 및 http://bonsai.lif.icnet.uk/bmm/dsc/dsc_read_align.html]. 세포내 영역은 문헌[참조: Hardiman et al. (1996)Oncogene13:2467-2475; and Rock et al. (1998)Proc. Nat'l Acad. Sci. USA95:588-593; 이들 각각이 본원에 참조문헌으로써 삽입됨]에 논의된 THD 영역을 암호화한다. 이 도메인은 포스페이트 그룹을 기질에 전달하는, 당해 수용체에 의한 시그날링의 기전에 매우 중요하다.
완전한 길이의 사람 DTLR cDNA의 클로닝
Toll-유사 Humrsc786 서열(GenBank 수탁 코드 D13637)로부터 유도된 PCR 프라이머[참조: Nomura et al. (1994) DNA Res. 1:27-35]를 사용하여, 사람 적백혈병, TF-1 세포주-유도된 cDNA 라이브러리[참조: Kitamura et al. (1989)Blood73:375-380]를 프로빙하여 DTLR1 cDNA 서열을 수득하였다. 나머지 DTLR 서열을 dbEST로부터 플래그하고, 다음 기관[Research Genetics(Huntsville, AL)]을 통하여 I.M.A.G.E. 협회로부터 관련 EST 클론을 수득하였다[참조: Lennon et al. (1996) Genomics 33:151-152]: 클론 ID# 80633 및 117262(DTLR2), 144675(DTLR3), 202057(DTLR4) 및 277229(DTLR5). 사람 DTLRs 2-4에 대한 완전한 길이의 cDNA는 λgt10 파아지, 사람 성인 폐, 태반 및 태아 간 5'-연장물 플러스 cDNA 라이브러리(Clontech)를 각각 DNA 하이브리드화 스크리닝함으로써 클로닝하며; 이러한 DTLR 서열은 사람 다발성 경화증 플라크 EST로부터 유도된 것이다. 모든 양성 클론을 서열 분석하고 정렬하여 개개의 DTLR ORF를 동정하였다: DTLR1(2366bp 클론, 786aa ORF), DTLR2(2600bp, 784aa), DTLR3(3029bp, 904aa), DTLR4(3811bp, 879aa), 및 DTLR5(1275bp, 370aa). 유사한 방법을 DTLRs 6-10에 사용한다. DTLR3 및 DTLR4 하이브리드화용 프로브는, 주형으로서 각각 사람 태반(Stratagene) 및 성인 간(Clontech) cDNA 라이브리러를 사용하여 PCR함으로써 생성시키며; 프라이머 쌍을 각각의 EST 서열로부터 유도하였다. 다음 조건 하에서 티. 아쿠아티쿠스(T.aquaticus) Taqplus DNA 폴리머라제(Stratagene)을 사용하여 PCR 반응을 수행하였다: 1 x (94℃, 2분), 30 x(55℃, 20초; 72℃, 30초; 94℃, 20초), 1 x(72℃, 8분). DTLR2 완전한 길이의 cDNA 스크리닝을 위해, 제1 EST 클론(ID# 80633)을 EcoRI/XbaI 분해시킴으로써 생성된 900bp 단편을 프로브로서 사용하였다.
mRNA 블롯 및 염색체성 국재
레인당 대략 2㎍의 폴리(A)+RNA를 함유하는 암 세포주 블롯(Ca#7757-1) 및 사람 다중 조직(Ca#1,2)를 클론텍(Clontech; Palo Alto, CA)로부터 구입한다. DTLRs 1-4의 경우에는, 상기 분리된 완전한 길이의 cDNA를 프로브로서 제공하고, DTLR5의 경우에는, EST 클론(ID# 277229) 플라스미드 삽입물을 사용하였다. 간략하게 언급하면, 아머샴 레디프라임(Amersham Rediprime) 무작위 프라이머 표지화 키트(RPN1633)를 사용하여, 프로브를 [α-32P]dATP로 방사성표지시킨다. 0.5M Na2HPO4, 7% SDS, 0.5M EDTA(pH 8.0) 중의 65℃에서 예비하이브리드화 및 하이브리드화를 수행한다. 65℃하에, 2 x SSC, 0.1% SDS에서 40분 동안 초기 2회 세척을 수행한 다음, 0.1 x SSC, 0.1% SDS에서 20분 동안 후속 세척을 수행하면서, 모두 엄격한 세척을 수행한다. 이어서, 막을 증감 스크린의 존재 하에 -70℃에서 X선 필름(Kodak)에 노출시킨다. cDNA 라이브러리 서던(14)에 의한 보다 상세한 연구는 선별된 사람 DTLR 클론을 사용하여 수행하여, 조혈 세포 서브세트에서의 이들의 발현을 검사한다.
사람 염색체성 지도화는, 프로브로서 각종의 완전한 길이(DTLR 2-4) 또는 부분(DTLR5) cDNA 클론을 사용하여, 문헌[참조: Heng and Tsui (1994)Meth. Molec. Biol.33:109-122]에 기재된 바와 같이 형광 원위치 하이브리드화(FISH)의 방법에 의해 수행하였다. 이들 분석은 다음 업체[SeeDNA Biotech Inc.(Ontario, Canada)]에 의해 서비스로서 수행되었다. 상기 지도화 DTLR 유전자와 연관된 사람 증후군(또는 신테니좌(syntenc loci)에서의 마우스 결핍증)에 대한 연구 조사는 인터넷 서버(http://www.hgmp.mrc.ac.uk/DHMHD/hum_chromel.html)에 의해 Dysmorphic Human-Mouse Homology Database에서 수행하였다. 유사한 방법이 DTLRs 6-10에 적용될 수 있다.
곤충 및 사람 DTLR 엑토도메인의 보존적 구성
드로소필라 내의 Toll 계열은 4가지 이상의 독특한 유전자 생성물을 포함한다: Toll, 플라이 배아의 배복 방향 패턴화와 관련된 원형 수용체[참조: Morisato and Anderson (1995)Ann. Rev. Genet.29:371-399], 및 초기 배아 발생과 관련될 수도 있는 제2 명칭의 '18 휠러(Wheeler)'(18w)[참조: Chiang and Beachy (1994)Mech. Develop.47:225-239; Eldon et al. (1994)Develop.120:885-899]. 2개의 부가의 수용체는 숫컷-특이적 전사체(Mst) 유전자좌의 불완전한 Toll-유사 ORFs 하단부로써 예상되거나 또는 '서열-태그된-부위'(STS) Dm2245(GenBank 코드 G01378)에 의해 암호화된다[참조: Mitcham et al. (1996)J. Biol. Chem.271:5777-5783]. Toll 및 18w의 세포외 세그먼트는 불완전한 대략 24개 아미노산 LRR 모티프로 독특하게 구성된다[참조: Chiang and Beachy (1994)Mech. Develop.47:225-239; Eldonet al. (1994)Develop.120:885-899]. LRRs의 유사한 직렬 어레이는 통상적으로다양한 세포 표면 분자의 점착성 안테나를 형성하고, 이들의 유전적 3차 구조는 리보뉴클레아제 억제인자 폴드의 편자형 요람(horseshoe-shaped cradle)을 모방하는 것으로 추정되는데, 여기서 17개 LRRs는 반복되는 β/α-헤어핀, 28 잔기 모티프를 나타낸다[참조: Buchanan and Gay (1996) Prog. Biophys. Molec. Biol. 65:1-44]. 굽은 β-시트의 요면을 이용하여, S자형 수용체의 다중-LRR 엑토도메인에 의해 시스틴-노트(knot) 폴드 당단백질 호르몬을 결합하는 것으로 제안된 모델을 대상으로 하여, Toll에 의한 Spatzle의 특이적 인식을 수행할 수 있는데; 흥미롭게도, Spatzle, 및 오판 드로소필라 리간드, Trunk에서의 시스테인의 패턴으로, 유사한 시스틴-노트 3차 구조를 추정한다[참조: Belvin and Anderson (1996)Ann. Rev. Cell Develop. Biol.12:393-416; and Casanova et al. (1995)Genes Develop.9:2539-2544].
Toll 및 18w의 22 및 31 LRR 엑토도메인은 각각(Mst ORF 단편은 16 LRRs를 표시한다), 서열 및 패턴 분석 결과, DTLRs 1-4의 필적하는 18, 19, 24 및 22 LRR 어레이와 가장 밀접한 관계이다(불완전한 DTLR5 쇄는 현재, 4개의 막-근접 LRRs를 포함한다)[참조: Altschul et al. (1994)Nature Genet.6:119-129; and Bork and Gibson (1996)Meth. Enzymol.266:162-184](도 1). 그러나, 사람 DTLR 쇄에 있어서의 현저한 차이는 Toll, 18w 및 Mst ORF의 엑토도메인 내에 가변적으로 포매된(막 경계로부터 각각 4개, 6개 및 2개 LRRs 간격으로 떨어져 있음) 대략 90개 잔기 시스테인-풍부 영역이 공통적으로 상실된다는 것이다. 이들 시스테인 다발은 두갈래로 나눠지는데, 독특한 '상단'(LRR 종료)부와 '바닥'(LRR 적재 꼭대기)부로 절반씩 나눠진다[참조: Chiang and Beachy (1994)Mech. Develop.47:225-239; Eldon et al. (1994)Develop.120:885-899; and Buchanan and Gay (1996)Prog. Biophys. Molec. Biol.65:1-44]; 상기 '상단' 모듈은 드로소필라와 사람 DTLRs 모두에서 보존된 막근접 스페이서로서 반복된다(도 1). 본 발명자들은 '상단'과 '바닥'이 교배될 때, 드로소필라 수용체(및 기타 LRR 수용체) 내에 가요적으로 위치된 시스테인 다발이, DTLR 엑토도메인의 전반적인 폴드를 변화시키지 않으면서 어떠한 쌍의 LRRs 사이에도 삽입될 수 있는 짝형성 말단을 갖는 컴팩트 모듈(compact module)을 형성할 수 있다는 것을 제안하고 있다; 유사한 '돌출된' 도메인이 기타 단백질의 구조를 장식한다[참조: Russell (1994)Protein Engin.7:1407-1410].
TH 시그날링 도메인의 분자상 고안
Toll 및 IL-1 유형-I(IL-1R1) 수용체의 서열 비교 결과, 유사한 Rel-유형 전사 인자에 의한 시그날링을 매개하는 것으로 추정되는 대략 200개 아미노산 세포질성 도메인의 유사성이 먼것으로 밝혀졌다[참조: Belvin and Anderson (1996)Ann. Rev. Cell Develop. Biol.12:393-416; and (Belvin and Anderson (1996)Ann. Rev. Cell Develop. Biol.12:393-416; and Wasserman (1993)Molec. Biol. Cell4:767-771]. 보다 최근에, 이러한 기능적 범례에 부가된 것으로는 N-말단 TH 모듈에 이어 뉴클레오티드-결합성(NTPase) 및 LRR 세그먼트을 특징으로 하는 담배와 아마로부터의 한 쌍의 식물 질병 내성 단백질이 있는데[참조: Wilson et al. (1997)Curr. Biol. 7:175-178]; 이와 대조적으로, '소멸(death) 도메인'이 세포내 골수성 분화 마커인 MyD88의 TH 쇄 앞에 온다[참조: Mitcham et al. (1996)J. Biol. Chem.271:5777-5783; and Hardiman et al. (1996)Oncogene13:2467-2475](도 1). 새로운 IL-1-유형 수용체에는 IL-1R3, 보조 시그날링 분자, 및 오판 수용체 IL-1R4(ST2/Fit-1/T1으로서 지칭되기도 함), IL-1R5(IL-1R-관련 단백질) 및 IL-1R6(IL-1R-관련 단백질-2)이 포함된다[참조: Mitcham et al. (1996)J. Biol. Chem.271:5777-5783; and Hardiman et al. (1996)Oncogene13:2467-2475]. 이러한 새로운 사람 DTLR 서열을 사용하여, 본 발명자들은 공통의 TH 모듈의 입체구조를 분석함으로써 상기 진화론적 트레드(thread)를 구조적으로 규정하고자 하였는데: 128개 아미노산을 포함하는 보존된 서열의 10개 블록이 최소한의 TH 도메인 폴드를 형성하고; 상기 정렬 내의 갭이 예상되는 서열 및 길이-가변성 루프의 위치를 표시해준다(도 2A 내지 2B).
배가 정렬된 서열의 보존 및 가변 패턴의 이점을 취하는 2개의 예상 알고리듬, 즉 PHD[참조: Rost and Sander (1994)Proteins19:55-72] 및 DSC[참조: King and Sternberg (1996)Protein Sci.5:2298-2310]는 TH 시그날링 모듈에 대한 강력히 일치되는 결과를 나타내었다(도 2A 내지 2B). 각 블록은 별개의 2차 구조 요소를 함유하는데: 대체되는 β-쇄(A-E 표지됨) 및 α-나선(1-5로 번호매겨짐)의 날인이 평행한 β-시트의 양 면 상에 α-나선을 갖는 β/α-부류 폴드의 진단에 도움이 된다. 소수성 β쇄 A, C 및 D는 '내부' 단을 형성하는 것으로 추정되는 반면, 보다 짧은 양친매성 β쇄 B 및 E는 특유의 '에지(edge)' 단위와 유사하다(도 2A-2B).이러한 정렬은 코어 β시트 내의 B-A-C-D-E의 쇄 순서와 부합되고(도 2C); 폴드 비교('지도화') 및 인식('트레딩(threading)') 프로그램[참조: Fischer et al. (1996)FASEB J.10:126-136]은 이러한 이중으로 감겨진 β/α위상으로 강력히 되돌린다. 상기 TH 도메인에 대한 이러한 개략적인 구조의 놀라운 기능상의 예상은, 다중 정렬 내의 보존된 수 많은 전하를 띤 잔기가 β시트의 C-말단에 위치된다는 것이다: α3의 제1 턴 내의 βA, Arg39 및 Asp40에 이어 βB, Glu75의 말단에서 잔기 Asp16(블록 넘버링 도식 - 도 2A-2B), 및 βD-α4 루프 내에 또는 βE 다음에 보다 느슨하게 보존된 Glu/Asp 잔기(도 2A-2B). 4가지 기타 보존된 잔기(Asp7, Glu28 및 Arg57-Arg/Lys58 쌍)의 위치는 β시트의 반대편 N-말단에서의 염 브릿지 네트워크에 화합된다(도 2A-2B). 기타 DTLR 양태의 정렬은 유사한 특징을 나타내며, 이러한 특징을 포함하는 펩티드 세그먼트, 예를 들면, 이를 함유하는 20개 아미노산 세그먼트가 특히 중요하다.
시그날링 기능은 TH 도메인의 구조적 원형 보존에 좌우된다. IL-1R1 및 Toll을 대상으로 하여, 모듈 경계 내에서의 불활성화 돌연변이 또는 결실(도 2A-2B)의 목록을 만들었다[참조: Heguy et al. (1992)J. Biol. Chem.267:2605-2609; Croston et al. (1995)J. Biol. Chem.270:16514-16517; Schneider et al. (1991)Genes Develop.5:797-807; Norris and Manley (1992)Genes Develop.6:1654-1667; Norris and Manley (1995)Genes Develop.9:358-369; and Norris and Manley (1996)Genes Develop.10:862-872]. 최소한의 TH 도메인을 통과하여 연장하는 사람 DTLR1-5 쇄(각각 8, 0, 6, 22 및 18 잔기 길이)가 Mst ORF의 짧고 억센4aa '테일'과 가장 근접하게 유사하다. Toll 및 18w는 융합된 TH 도메인의 시그날링을 음성적으로 조절할 수 있는 무관한 102 및 207개 잔기 테일(도 2A-2B)을 표시한다[참조: Norris and Manley (1995)Genes Develop.9:358-369; and Norris and Manley (1996)Genes Develop.10:862-872].
TH 도메인을 수반하는 공통점이 없는 단백질들 간의 진화론적 유연 관계는 다중 정렬로부터 유도된 계통발생적 트리에 의해 가장 잘 식별될 수 있다(도 3). 4가지 주요 가지로 분리된다: 식물 단백질, MyD88 인자, IL-1 수용체 및 Toll-유사 분자. 후자 가지가 드로소필라 및 사람 DTLRs을 집중 발생시킨다.
사람 DTLR 유전자의 염색체성 분산
발생기 사람 DTLR 유전자 계열의 유전적 연결을 조사하기 위하여, 본 발명자들은 5개 유전자 중의 4개 유전자의 염색체좌를 FISH에 의해 위치시켰다(지도화하였다)(도 4). DTLR1 유전자는 사람 게놈 프로젝트에 의해 앞서 계획된 바 있는데; STS 데이터베이스 유전자좌(dbSTS 수탁 번호 G06709, STS WI-7804 또는 SHGC-12827에 상응함)가 Humrsc786 cDNA[참조: Nomura et al. (1994) DNA. Res. 1:27-35]에 대해 존재하고, 이 유전자는 염색체 4 마커 내부 D4S1587-D42405(50-56 cM) circa 4p14에 고정된다. 이러한 정렬은 최근에 FISH 분석에 의해 정식으로 확인되었다[참조: Taguchi et al. (1996)Genomics32:486-488]. 본 연구 작업에서, 본 발명자들은 나머지 DTLR 유전자를 염색체 4q32(DTLR2), 4q35(DTLR3), 9q32-33(DTLR4) 및 1q33.3(DTLR5) 상의 좌에 신뢰할만한 수준으로 할당하였다. 이러한 작업 과정동안, 모 DTLR2 EST(클론 ID #80633)에 대한 STS가 발생되었으며(STS SHGC-33147에 대한 dbSTS 수탁 번호 T57791), 본 발명자들의 발견에 따라서 4q32에서 염색체 4 마커 내부 D4S424-D4S1548(143-153cM)에 위치시켰다. 염색체 4의 긴 암(arm) 상의 DTLR2와 DTLR3 간에 대략 50cM 갭이 존재한다.
DTLR 유전자는 시차적으로 발현된다
Toll과 18w 모두는 드로소필라에서의 복잡한 공간 및 시간적 발현 패턴을 나타내는데, 이는 배아 패턴화를 벗어난 기능을 지적할 수 있다[참조: St. Johnston and Nusslein-Volhard (1992)Cell68:201-219; Morisato and Anderson (1995)Ann. Rev. Genet.29:371-399; Belvin and Anderson (1996)Ann. Rev. Cell Develop. Biol.12:393-416; Lemaitre et al. (1996)Cell86:973-983; Chiang and Beachy (1994)Mech. Develop.47:225-239; and Eldon et al. (1994)Develop.120:885-899]. 본 발명자들은 방사성표지된 DTLR cDNA를 사용하여, 다양한 사람 조직 및 암 세포주로 mRNA 블롯 분석함으로써 DTLR 전사체의 공간적 분포도를 검사하였다(도 5). DTLR1이 다른 수용체 보다는 높은 수준에서 편재 발현되는 것으로 밝혀졌다. 대체 스플라이싱인 '짧은' 3.0kB 및 '긴' 8.0kB DTLR1 전사체 형태를 반영하는 것이 난소와 비장에 각각 존재하는 것으로 추정된다(도 5, 패널 A 및 B). 암세포 mRNA 패널은 또한, 버키트 림프종 라지 세포주에서 DTLR1이 현저하게 과발현된다는 것을 보여준다(도 5, 패널 C). DTLR2 mRNA는 DTLR1 보다는 덜 광범위하게 발현되는데, 4.0kB 전사체가 폐에서 탐지되었고, 4.4kB 전사체가 심장, 뇌 및근육에서 명백히 탐지되었다. DTLR3의 조직 분포 패턴은 DTLR2의 조직 분포 패턴을 반영해준다(도 5, 패널 E). DTLR3은 또한, 크기가 대략 4.0 및 6.0kB인 2개의 주요 전사체로서 존재하며, 가장 높은 수준의 발현이 태반과 췌장에서 관찰되었다. 이와는 대조적으로, DTLR4 및 DTLR5 메시지는 극도로 조직 특이적인 것으로 보인다. DTLR4는 크기가 대략 7.0kB인 단일 전사체로서 태반에서만 탐지되었다. 희미한 4.0kB 시그날이 난소 및 말초혈 단구에서 DTLR5에 대해 관찰되었다.
진화론적 고대 조절 시스템의 성분
시그날링 경로의 본래 분자 블루프린트(blueprint) 및 개산 운명은 비교되는 게놈 접근법에 의해 재작제할 수 있다[참조: Miklos and Rubin (1996)Cell86:521-529; Chothia (1994)Develop.1994 Suppl., 27-33; Banfi et al. (1996)Nature Genet.13:167-174; and Wang et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:4468-4476]. 본 발명자들은 이러한 논리를 이용하여, Toll을 선두로 하는 드로소필라 유전자 계열의 직접적인 진화론적 대응물인, 현재 5가지 수용체 파라로그(paralog), 즉 DTLR 1-5를 암호화하는, 사람에게서의 새로운 유전자 계열을 동정하였다(도 1-3). 사람 및 플라이 DTLRs의 보존된 구성, 보존된 LRR 엑토도메인 및 세포내 TH 도메인(도 1)은 드로소필라에서 Toll과 연계된 강한 경로가 척추동물에서도 살아남는다는 것을 암시해준다. 가장 우수한 증거는 반복된 경로로부터 차용되는데: 다양한 IL-1 시스템 및 이의 수용체-융합된 TH 도메인, IPAK, NF-κB 및 I-κB 동족체의 레퍼토리[참조: Belvin and Anderson (1996)Ann. Rev.Cell Develop. Biol.12:393-416; Wasserman (1993)Molec. Biol. Cell4:767-771; Hardiman et al. (1996)Oncogene13:2467-2475; and Cao et al. (1996)Science271:1128-1131]; Tube-유사 인자가 또한 성상 확인되었다. DTLRs가 IL-1R 시그날링 조작에 생산적으로 연계될 수 있는지의 여부, 또는 대신, 병렬 세트의 단백질이 사용되는지의 여부는 공지되어 있지 않다. IL-1 수용체와는 상이하게, 사람 DTLR의 LRR 요람은 Spatzle/Trunk-관련된 시스틴-노트 인자에 대한 친화성을 보유하고 있는 것으로 예상되며; 이러한 몰드에 맞는 후보 DTLR 리간드(PENs로 지칭됨)를 분리하였다.
시그날 형질도입의 생화학적 기전은 특정 경로에서의 상호작용성 단백질 폴드의 보존성에 의해 평가될 수 있다[참조: Miklos and Rubin (1996)Cell86:521-529; Chothia (1994)Develop.1994 Suppl., 27-33]. 현재, Toll 시그날링 범례는 이의 역할이 이들의 구조, 작용 또는 운명에 의해 협소하게 규정되는 몇몇 분자를 포함하는데: Pelle는 Ser/Thr 키나제(인산화)이고, Dorsal은 NF-κB-유사 전사 인자(DNA-결합성)이며, Cactus는 안키린(ankyrin)-반복 서열 억제인자(Dorsal 결합성, 분해)이다[참조: Belvin and Anderson (1996)Ann. Rev. Cell Develop. Biol.12:393-416]. 이와는 대조적으로, Toll TH 도메인 및 Tube의 기능은 여전히 정체를 알 수 없다. 기타 사이토킨 수용체와 같이[참조: Heldin (1995) Cell 80:213-223], Toll의 리간드 매개된 이량체화는 촉발 사건인 것으로 여겨지는데; Toll의 막근접 영역 내의 자유 시스테인은 구성적으로 활성인 수용체 쌍[참조: Schneider et al. (1991)Genes Develop.5:797-807], 및 이량체로서의 키메릭 Torso-Toll 수용체 시그날[참조: Galindo et al. (1995)Develop.121:2209-2218]을 산출하지만; Toll 엑토도메인을 심각하게 절단하거나 전부 상실시키면, 불규칙한 세포내 시그날링 야기되고[참조: Norris and Manley (1995)Genes Develop.9:358-369; and Winans and Hashimoto (1995)Molec. Biol. Cell6:587-596], 이는 촉매적 도메인을 갖는 종양 발생 수용체를 상기시켜 준다[참조: Heldin (1995)Cell80:213-223]. Tube는 막 국재되고, Pelle의 N-말단(소멸) 도메인에 진입되며, 인산화되지만, 어떠한 Toll-Tube 또는 Toll-Pelle 상호작용도 2개-하이브리드 분석에 의해 등록되지 않는다[참조: Galindo et al. (1995)Develop.121:2209-2218; and Groβhans et al. (1994)Nature372:563-566]. 후자 결과는 Toll TH 도메인의 입체배치 '상태'가 인자 동원에 다소 영향을 미친다는 것을 제시해준다[참조: Norris and Manley (1995)Genes Develop.9:358-369; and Galindo et al. (1995)Develop.121:2209-2218].
이들 성가신 문제의 핵심은 Toll TH 모듈의 구조적 본성이다. 이러한 문제점에 역점을 두기 위해, 본 발명자들은 곤충, 식물 및 척추동물로부터 진화론적으로 다양한 TH 서열의 이점을 취하여, 사람 DTLR 쇄를 혼입하였고, 구조 예상 및 폴드 인식을 위해 최소의 보존된 단백질 코어를 추출하였다(도 2). 이의 산성 잔기의 비대칭 다발을 갖는 것으로 강력히 예상되는 (β/α)5TH 도메인 폴드가 세균성 2-성분 시그날링 경로에서 반응 조절인자의 구조와 위상학적으로 동일하다[참조: Volz (1993)Biochemistry32:11741-11753; and Parkinson (1993)Cell73:857-871](도 2A-2C). 원형 화학주성 조절인자 CheY는 코어 β시트의 C-말단에서 '아스파테이트 포켓' 내의 2가 양이온과 일시적으로 결합되는데; 이러한 양이온은 정전기적 안정성을 제공해주고 불변체 Asp의 인산화 활성화를 촉진시켜 준다[참조: Volz (1993)Biochemistry32:11741-11753]. 마찬가지로, TH 도메인은 이의 산성 네스트 안에 양이온을 포획할 수 있지만, 활성화, 및 하단 시그날링은 음성적으로 하전된 잔기의 특이적 결합에 의존할 수 있다: 음이온성 리간드는 정확한 수소-결합 네트워크 내로 가두어 둠으로써 음성 결합성 부위 포텐살을 집중적으로 극복할 수 있다[참조: Ledvina et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:6786-6791]. 흥미롭게도, TH 도메인은 Toll에 대한 Tube/Pelle 복합체의 어셈블리를 위한 능동 스캐폴드(scaffold)로서, 또는 식물 및 척추동물 내의 동종 시스템으로서 단순히 작용하지 않지만, 대신 시그날 형질도입 조작에서 진정한 입체구조상 촉발제로서 능동적으로 참여한다. Tube/Pelle 복합체의 조건적 결합을 설명하면, Toll 이량체화가 조절성 수용체 테일에 의해, 밝혀질 수 있거나[참조: Norris and Manley (1995)Genes Develop.9:358-369; and Norris and Manley (1996)Genes Develop.10:862-872], 또는 TH 포켓의 작은 분자 활성화제에 의한 결합이 증진질 수 있다. 그러나, 세포 내부의 '자유' TH 모듈[참조: Norris and Manley (1995)Genes Develop.9:358-369; Winans and Hashimoto (1995)Molec. Biol. Cell6:587-596]은 잘못된 Tube/Pelle 복합체로 활성화 및 도킹함으로써 촉매적, CheY-유사 촉발제로서 작용할 수 있다.
형태형성 수용체 및 면역 방어
곤충 면역계와 척추동물 면역계 간의 진화론적 연결 고리는 DNA에서 인지되는데; 곤충에서 항미생물성 인자를 암호화하는 유전자는 포유류에서 NF-κB 전사 인자와 결합하는 것으로 공지된 급성 상 반응 요소와 유사한 상단 모티프를 표시한다[참조: Hultmark (1993) Trends Genet. 9:178-183]. Dorsal 및 2개의 Dorsal-관련 인자인 Dif 및 Relish는 세균성 챌린지 후의 이들 방어 단백질 유도를 도와준다[참조: Reichhart et al. (1993)C.R. Acad. Scil. Paris316:1218-1224; Ip et al. (1993)Cell75:753-763; and Dushay et al. (1996)Proc. Natl. Acad. Sci. USA93:10343-10347]; Toll, 또는 기타 DTLRs은 마찬가지로, 성인 드로소필라에서 이들 신속한 면역 반응을 매개한다[참조: Lemaitre et al. (1996)Cell86:973-983; Rosetto et al. (1995)Biochem. Biophys. Res. Commun.209:111-116]. 척추동물에서 IL-1 염증성 반응에 대한 이들 기계적 대응물은 Toll 시그날링 경로의 기능적 다양성의 증거이고, 배아 패턴화 및 선천성 면역 간의 고대 시너지를 제안해준다[참조: Belvin and Anderson (1996)Ann. Rev. Cell Develop. Biol.12:393-416; Lemaitre et al. (1996)Cell86:973-983; Wasserman (1993)Molec. Biol. Cell4:767-771; Wilson et al. (1997) Curr. Biol. 7:175-178; Hultmark (1993) Trends Genet. 9:178-183; Reichhart et al. (1993)C.R. Acad. Scil. Paris316:1218-1224; Ip et al. (1993)Cell75:753-763; Dushay et al. (1996)Proc. Natl. Acad. Sci. USA93:10343-10347; Rosetto et al. (1995)Biochem. Biophys. Res. Commun.209:111-116; Medzhitov and Janeway (1997)Curr. Opin. Immunol.9:4-9; and Medzhitov and Janeway (1997)Curr. Opin. Immunol.9:4-9]. 곤충과 사람 DTLR 단백질의 보다 근접한 상동성은, IL-1 시스템에 대한 순수한 면역 대응물을 대신하는, 훨씬 더 강력한 생물학적 기능 중복물을 유도시키고, 배복 방향에 대한 잠재적인 분자상 조절인자 및 척추동물 배아의 기타 형질전환물을 가져다준다[참조: DeRobertis and Sasai (1996)Nature380:37-40; and Arendt and Nubler-Jung (1997)Mech. Develop.61:7-21].
사람에 있어서의 새로운 강력한 수용체 계열에 관한 본 명세 내용은, Wnt 패턴화 인자에 대한 척추동물 Frizzled 수용체가 최근에 발견된 것을 반영한 것이다[참조: Wang et al. (1996)J. Biol. Chem.271:4468-4476]. 수 많은 기타 사이토킨-수용체 시스템이 초기 발생에서 일정한 역할을 하였기 때문에[참조: Lemaire and Kodjabachian (1996)Trends Genet.12:525-531], 꽉찬 배아와 호리호리한 성인 간의 독특한 세포 전후관계로 인해 단순히, 친숙한 시그날링 경로가 야기되고, 상이한 시점에서 상이한 생물학적 결과, 예를 들어, DTLRs에 대한 형태형성 대 면역 반응을 나타내는 이들의 확산 가능한 촉발이 야기되는 것으로 예상된다. 곤충, 식물 및 사람 Toll-관련 시스템의 경우[참조: Hardiman et al. (1996)Oncogene13:2467-2475; Wilson et al. (1997) Curr. Biol. 7:175-178], 이들 시그날은, 흥미롭게도 세균성 형질도입성 엔진과 유사한 조절성 TH 도메인을 통하여 진행된다[참조: Parkinson (1993)Cell73:857-871].
특히, DTLR6은 해당 계열 내에서의 이의 멤버쉽을 확증해주는 구조적 특징을 나타낸다. 더우기, 이 계열의 구성원은 수 많은 중요한 발생학적 질병 상태와 연연관되어 있고 선천성 면역계 기능과 관련이 있다. 특히, DTLR6은 주요 발생학적 이상(abnormality)에 대한 도발 지점(hot spot)인 X 염색체에 그 유전자를 위치시켰다[참조: Sanger Center: human X chromosome website http://www.sanger.ac.uk/HGP/ChrX/index.shtml; and the Baylor College of Medicine Human Genome Sequencing website http://gc.bcm.tmc.edu:8088/cgi-bin/seq/home].
기탁된 PAC에 대한 수탁 번호는 AC003046이다. 이 수탁 번호는 다음 2개의 PACs로부터의 서열을 함유한다: RPC-164K3 및 RPC-263P4. 이들 두 PAC 서열을 STS 마커 DXS704 및 DXS7166 간의 Baylor 웹사이트에서 사람 염색체 Xp22 상에서 지도화하였다. 이러한 영역이 심각한 발생학적 이상에 대한 "도발 지점"이다.
III. PCR에 의한 DTLR 단편의 증폭
2개의 적당한 프라이머 서열을 선별한다(표 1 내지 10 참조). 메시지 존재를 알아보기 위해 선별된 적당한 mRNA 샘플 상에서 RT-PCR을 사용하여, 부분 또는 완전한 길이의 cDNA, 예를 들면, 해당 유전자를 발현하는 샘플을 생성시킨다[참조: Innis et al.(eds. 1990)PCR Protocols: A Guide to Methods and ApplicationsAcademic Press, San Diego, CA; and Dieffenbach and Dveksler (eds. 1995)PCR Primer: A Laboratory ManualCold Spring Harbor Press, CSH, NY]. 이로써, cDNA 라이브러리에서 완전한 길이의 유전자에 대해 프로빙하는데 유용한 서열을 결정할 수 있을 것이다. DTLR6은 게놈 내에서 연속되는 서열인데, 이는 다른 DTLRs도 또한 그렇다는 것을 제시해줄 수 있다. 따라서, 게놈 DNA에 대해 PCR함으로써, 완전한 길이의 연속되는 서열이 생성될 수 있으며, 이때 염색체 워킹 방법론을 적용할 수 있을 것이다. 또 다른 한편, 서열 데이터베이스는 상기 언급된 양태의 일정 부분에 상응하는 서열, 또는 밀접하게 관련된 형태, 예를 들면, 대체 스플라이싱 등을 함유할 것이다. 발현 클로닝 기술을 또한 cDNA 라이브러리에 적용할 수도 있다.
IV. DTLRs의 조직 분포도
이들 DTLRs를 암호화하는 각 유전자에 대한 메시지를 탐지하였다(도 5A-5F 참조). 적당한 방법, 예를 들면, PCR, 면역검정, 하이브리드화 등에 의해 기타 세포 및 조직을 검정할 것이다. 조직 및 기관 cDNA 제제는, 예를 들어, 다음 공급처[Clontech, Mountain View, CA]로부터 입수 가능하다. 기재된 바와 같이, 천연 발현 공급원을 동정하는 것이 유용하다.
서던 분석: 1차 증폭된 cDNA 라이브러리로부터의 DNA(5㎍)를 적당한 제한 효소로 분해하여 삽입물을 방출시키고, 1% 아가로즈 겔 상에서 수행한 다음, 나일론 막(Shleicher and Schuell, Keene, NH)로 옮긴다.
사람 mRNA 분리용 샘플은 다음을 포함할 수 있다: 말초혈 단핵 세포(단구, T 세포, NK 세포, 과립구, B 세포), 휴지기(T100); 말초혈 단핵 세포, 2, 6, 12시간 풀링되는 동안 항-CD3으로 활성화됨(T101); T 세포, TH0 클론 Mot 72, 휴지기(T102); T 세포, TH0 클론 Mot 72, 3, 6, 12시간 풀링되는 동안 항-CD28 및 항-CD3으로 활성화됨(T103); T 세포, TH0 클론 Mot 72, 2, 7, 12시간 풀링되는 동안 특이적 펩티드로 아네르기성 처리됨(T104); T 세포, TH1 클론 HY06, 휴지기(T107); T 세포, TH1 클론 HY06, 3, 6, 12시간 풀링되는 동안 항-CD28 및 항-CD3으로 활성화됨(T108); T 세포, TH1 클론 HY06, 2, 6, 12시간 풀링되는 동안 특이적 펩티드로 아네르기성 처리됨(T109); T 세포, TH2 클론 HY935, 휴지기(T110); T 세포, TH2 클론 HY935, 2, 7, 12시간 풀링되는 동안 항-CD28 및 항-CD3으로 활성화됨(T111); 항-CD28, IL-4 및 항-IFNγ에서 27일간 분극된 T 세포 CD4+CD45RO-T 세포, TH2 분극됨, 4시간 동안 항-CD3 및 항-CD28로 활성화됨(T116); T 세포 종양주 저캣(Jurkat) 및 Hut78, 휴지기(T117); T 세포 클론, AD130.2, Tc783.12, Tc783.13, Tc783.58, Tc782.69 풀링됨, 휴지기(T118); T 세포 무작위 γδT 세포 클론, 휴지기(T119); 비장 세포, 휴지기(B100); 비장 세포, 항-CD40 및 IL-4로 활성화됨(B101); B 세포 EBV 주, WT49, RSB, JY, CVIR, 721.221, RM3, HSY 풀링됨, 휴지기(B102); B 세포주 JY, 1, 6시간 풀링되는 동안 PMA 및 이오노마이신으로 활성화됨(B103); NK 20 클론 풀링됨, 휴지기(K100); NK 20 클론 풀링됨, 6시간 동안 PMA 및 이오노마이신으로 활성화됨(K101); NKL 클론, LGL 백혈병 환자의 말초혈으로부터 유도됨, IL-2 처리됨(K106); NK 세포독성 클론 640-A30-1, 휴지기(K107); 조혈 전구체 주 TF1, 1, 6시간 풀링되는 동안 PMA 및 이오노마이신으로 활성화됨(C100); U937 전단구주(premonocytic line), 휴지기(M100); U937 전단구주, 1, 6시간 풀링되는 동안 PMA 및 이오노마이신으로 활성화됨(M101); 깨끗이 씻은 단구, 1, 2, 6, 12, 24시간 풀링되는 동안 LPS, IFNγ, 항-IL-10으로 활성화됨(M102); 깨끗이 씻은 단구, 1, 2, 6, 12, 24시간 풀링되는 동안 LPS, IFNγ, IL-10으로 활성화됨(M103); 깨끗이 씻은 단구, 4, 16시간 풀링되는 동안 LPS, IFNγ, 항-IL-10으로 활성화됨(M106); 깨끗이 씻은 단구, 4, 16시간 풀링되는 동안 LPS, IFNγ, IL-10으로 활성화됨(M107); 깨끗이 씻은 단구, 1시간 동안 LPS로 활성화됨(M108); 깨끗이 씻은 단구, 6시간 동안 LPS로 활성화됨(M109); CD34+ GM-CSF로부터의 DC 70% CD1a+, TNFα12일, 휴지기(D101); CD34+ GM-CSF로부터의 DC 70% CD1a+, TNFα12일, 1시간 동안 PMA 및 이오노마이신으로 활성화됨(D102); CD34+ GM-CSF로부터의 DC 70% CD1a+, TNFα12일, 6시간 동안 PMA 및 이오노마이신으로 활성화됨(D103); CD34+ GM-CSF로부터의 DC 95% CD1a+, TNFα12일 FACS 분류됨, 1, 6시간 풀링되는 동안 PMA 및 이오노마이신으로 활성화됨(D104); CD34+ GM-CSF로부터의 DC 95% CD14+, TNFα12일 FACS 분류됨, 1, 6시간 풀링되는 동안 PMA 및 이오노마이신으로 활성화됨(D105); CD34+ GM-CSF로부터의 DC CD1a+ CD86+, TNFα12일 FAC 분류됨, 1, 6시간 풀링되는 동안 PMA 및 이오노마이신으로 활성화됨(K106); 단구 GM-CSF로부터의 DC, IL-4 5일, 휴지기(D107); 단구 GM-CSF로부터의 DC, IL-4 5일, 휴지기(D108); 단구 GM-CSF로부터의 DC, IL-4 5일, LPS로 활성화됨, 4, 16시간 풀링됨(D109); 단구 GM-CSF로부터의 DC, IL-4 5일, 4, 16시간 풀링되는 동안 TNFα, 단구 슈퍼로 활성화됨(D110); 평활근종 L11 양성 종양(X101); 정상 자궁근층 M5(O115); 악성 평활근육종 GS1(X103); 폐 섬유아세포 육종 주 MRC5, 1, 6시간 풀링되는 동안 PMA 및 이오노마이신으로 활성화됨(C101); 신장 상피 암종 세포주 CHA, 1, 6시간 풀링되는 동안 PMA 및 이오노마이신으로 활성화됨(C102); 28주생 숫컷 태아 신장(O100); 28주생 숫컷 태아 폐(O101); 28주생숫컷 태아 간(O102); 28주생 숫컷 태아 심장(O103); 28주생 숫컷 태아 뇌(O104); 28주생 숫컷 태아 담낭(O106); 28주생 숫컷 태아 소장(O107); 28주생 숫컷 태아 지방 조직(O108); 25주생 암컷 태아 난소(O109); 25주생 암컷 태아 자궁(O110); 28주생 숫컷 태아 고환(O111); 28주생 숫컷 태아 비장(O112); 28주생 성인 췌장(O113); 및 12세로부터의 염증에 걸린 편도(X100).
마우스 mRNA 분리용 샘플은 다음을 포함할 수 있다: 휴지기 마우스 섬유아세포성 L 세포주(C200); Braf:ER(에스트로겐 수용체에 대한 Braf 융합) 형질감염된 세포, 대조군(C201); T 세포, TH1 분극됨(비장으로부터의 Mel14 브라이트, CD4+ 세포, IFNγ 및 항-IL-4로 7일 동안 분극됨; T200); T 세포, TH2 분극됨(비장으로부터의 Mel14 브라이트, CD4+ 세포, IL-4 및 항-IFNγ로 7일 동안 분극됨; T201); T 세포, 고도로 TH1 분극됨[참조: Openshaw et al.(1995) J. Exp. Med. 182:1357-1367; 2, 6, 16시간 동안 풀링되는 동안 항-CD3으로 활성화됨; T202]; T 세포, 고도로 TH2 분극됨[참조: Openshaw et al.(1995) J. Exp. Med. 182:1357-1367; 2, 6, 16시간 동안 풀링되는 동안 항-CD3으로 활성화됨; T203]; 흉선으로부터 분류된, CD44-CD25+ 프리 T 세포(T204); 항원으로 마지막 자극시킨 후 3주 동안 휴지기인 TH1 T 세포 클론 D1.1(T205); 15시간 동안 자극된 10㎍/ml ConA인 TH1 T 세포 클론 D1.1(T206); 항원으로 마지막 자극시킨 후 3주 동안 휴지기인 TH2 T 세포 클론 CDC35(T207); 15시간 동안 자극된 10㎍/ml ConA인 TH2 T 세포 클론 CDC35(T208); 비장으로부터의 Mel14+ 본래의 T 세포, 휴지기(T209); 6, 12, 24시간 동안 풀링되는 동안 IFNγ/IL-12/항-IL-4을 이용하여 Th1로 분극된 Mel14+ T 세포(T210); 6,13, 24시간 동안 풀링되는 동안 IL-4/항-IFNγ을 이용하여 Th2로 분극된 Mel14+ T 세포(T211); 자극되지 않은 성숙한 B 세포 백혈병 세포주 A20(B200); 자극되지 않은 B 세포주 CH12(B201); 비장으로부터의 자극되지 않은 큰 B 세포(B202); 전체 비장으로부터의 B 세포, LPS 활성화됨(B203); 비장으로부터의 메트리즈아미드 증강된 수지상 세포, 휴지기(D200); 골수로부터의 수지상 세포, 휴지기(D201); LPS로 4시간 동안 활성화된 단구 세포주 RAW 264.7(M200); GM 및 M-CSF로 유도된 골수 매크로파아지(M201); 매크로파아지 세포주 J774, 휴지기(M202); 0.5, 1, 3, 6, 12시간 풀링될 때 매크로파아지 세포주 J774+LPS+항-IL-10(M203); 0.5, 1, 3, 5, 12시간 풀링될 때 매크로파아지 세포주 J774+LPS+IL-10(M204); 에어로솔 챌린지된 마우스 폐 조직, Th2 프라이머, 에어로솔 OVA 챌린지 7, 14, 23시간 풀링됨[참조: Garlisi et al. (1995) Clinical Immunology and Immunopathology 75:75-83; X206]; Nippostrongulus-감염된 폐 조직[참조: Coffman et al. (1989) Science 245:308-310; X200]; 전체 성인 폐, 정상(O200); 전체 폐, rag-1[참조: Schwarz et al. (1993) Immunodeficiency 4:249-252; O205]; IL-10 K.O. 비장[참조: Kuhn et al. (1991) Cell 75:263-274; X201]; 전체 성인 폐, 정상(O201); 전체 비장, rag-1(O207); IL-10 K.O. 페이어 패치(Peyer's patches)(O202); 전체 페이어 패치, 정상(O210); IL-10 K.O. 장간막 림프절(X203); 전체 장간막 림프절, 정상(O211); IL-10 K.O. 결장(X203); 전체 결장, 정상(O212); NOD 마우스 췌장[참조: Makino et al. (1980) Jikken Dobutsu 29:1-13; X205]; 전체 흉선, rag-1(O208); 전체 신장, rag-1(O209); 전체 심장, rag-1(O202); 전체 뇌, rag-1(O203); 전체 고환, rag-1(O204); 전체 간, rag-1(O206); 랫트 정상 관절 조직(O300); 및 랫트 관절염에 걸린 관절 조직(X300).
DTLR10은 전구체 수지상 세포 유형 2(pDC2)에서 고도로 발현되는 것으로 밝혀졌다[참조: Rissoan et al. (1999)Science283:1183-1186; and Siegal et al. (1999)Science284:1835-1837]. 그러나, 단구 상에서는 발현되지 않았다. DTLR10의 제한된 발현은 숙주 면역 방어에서의 상기 수용체에 대한 역할 제안을 강화시켜 준다. pDC2 세포는 천연의 인터페론 생산 세포(NIPC)인데, 이는 단순 포진 바이러스 감염에 대해 반응하여 다량의 IFNα를 생산한다.
V. DTLRs의 종 대응물의 클로닝
각종 전략을 사용하여, 바람직하게는 기타 영장류로부터 이들 DTLRs의 종 대응물을 수득한다. 한 가지 방법은 밀접하게 관련된 종 DNA 프로브를 사용하여 교차 하이브리드화시키는 것이다. 이는 중간 단계로서 진화적으로 유사한 종에 유용할 수 있다. 또 다른 방법은 특정한 종(예: 사람) 유전자들 간에 유사하거나 상이한 블록, 예를 들면, 고도로 보존적이거나 비-보존적인 폴리펩티드 또는 뉴클레오티드 서열 영역을 동정하는 것에 근거하여 특이적 PCR 프라이머를 사용하는 것이다. 또 다른 한편, 항체를 발현 클로닝에 사용할 수 있다.
VI. 포유류 DTLR 단백질의 생성
적당한, 예를 들어, GST 융합 작제물을, 예를 들어, 이. 콜라이에서의 발현을 위해 공학적으로 처리한다. 예를 들면, 마우스 IGIF pGex 플라스미드를 작제하고 이. 콜라이 내로 형질전환시킨다. 신선하게 형질전환된 세포를 예를 들어, 50㎍/ml 앰피실린을 함유하는 LB 배지에서 성장시키고, IPTG(Sigma, St. Louis, MO)로 유도시킨다. 밤새 유도시킨 후, 세균을 수거하고, 당해 DTLR 단백질을 함유하는 펠릿을 분리한다. 이 펠릿을 TE 완충액(50mM 트리스-기재 pH 8.0, 10mM EDTA 및 2mM 퍼파블록) 2리터 중에서 균질화시킨다. 상기 물질을 미세유동화기(Microfluidics, Newton, MA) 내로 3회 통과시킨다. 이와 같이 유동화된 상등액을 13,000rpm으로 1시간 동안 소발(Sorvall) GS-3 로토(rotor) 상에 회전시킨다. 이로써 생성된, 당해 DTLR 단백질을 함유하는 상등액을 여과시키고, 50mM 트리스-기재 pH 8.0에서 평형된 글루타치온-SEPHAROSE 칼럼 상으로 통과시킨다. DTLR-GST 융합 단백질을 함유하는 분획을 풀링하고, 트롬빈(Enzyme Research Laboratories, Inc., South Bend, IN)으로 절단시킨다. 이어서, 이와 같이 절단된 풀을 50mM 트리스-기재에서 평형된 Q-SEPHAROSE 칼럼 상으로 통과시킨다. DTLR를 함유하는 분획을 풀링하고, 찬 증류수에 희석시켜 전도도를 낮추며, 이를 신선한 Q-SEPHAROSE 칼럼 단독 상으로 다시 통과시키거나 또는 면역친화 항체 칼럼에 연속해서 상기 칼럼 상으로 다시 통과시킨다. 당해 DTLR 단백질을 함유하는 분획을 풀링하고, 등분하며, -70℃ 냉동고에서 저장한다.
CD 스펙트럼과 DTLR1 단백질과의 비교는, 상기 단백질이 정확하게 폴딩된다는 것을 제시해줄 수 있다[참조: Hazuda et al. (1969)J. Biol. Chem.264:1689-1693].
VII. DTLRs를 이용한 생물학적 검정
생물학적 검정은 일반적으로, 당해 단백질의 리간드 결합 특징 또는 상기 수용체의 키나제/포스파타제 활성에 대해 지시될 것이다. 상기 활성은 전형적으로, 많은 기타 효소 작용과 같이, 비가역적일 것이며, 포스파타제 또는 포스포릴라제 활성을 매개할 것이며, 이러한 활성은 표준 과정에 의해 용이하게 측정된다[참조: Hardie et al. (eds. 1995)The Protein Kinase FactBookvols. I and II, Academic Press, San Diego, CA; Hanks et al. (1991)Meth. Enzymol.200:38-62; Hunter et al. (1992)Cell70:375-388; Lewin (1990)Cell61:743-752; Pines et al. (1991)Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.56:449-463; and Parker et al. (1993)Nature363:736-738].
인터루킨 1s의 계열은 각각 염증성 질병의 중요한 매개제인 분자를 함유한다. 이해를 위해, 다음 문헌을 참조할 수 있다[Dinarello (1996) "Biologic basis for interleukin-1 in disease"Blood87:2095-2147]. 상기 문헌에는, 특정한 Toll 리간드가 질병, 특히 염증성 반응 개시에 있어 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 제안하고 있다. IL-1 계열과 관련된 신규한 단백질의 발견으로 인해, 질병 개시에 대한 분자상 기준을 제공해주고 증가된 범위와 효능의 치료학적 전략 개발을 허용해주는 분자를 추가로 동정할 수 있다.
VIII. DTLR4에 특이적인 항체의 제조
동계교배된 Balb/c 마우스를 재조합 형태의 당해 단백질, 예를 들면, 정제된 DTLR4 또는 안정하게 형질감염된 NIH-3T3 세포로 복강내 면역시킨다. 동물을 적당한 시점에서 부가의 애쥬반트의 존재하 또는 부재하에 단백질로 부스팅하여, 항체 생성을 추가로 자극한다. 혈청을 수집하거나, 수거된 비장을 이용하여 하이브리도마를 생성시킨다.
또 다른 한편, Balb/c 마우스를, 당해 유전자 또는 이의 단편, 내인성 또는 외인성 세포, 또는 항원 발현을 위해 증강된 분리된 막으로 형질전환시킨 세포로 면역시킨다. 혈청을 적당한 시점, 전형적으로 수 많은 추가의 투여 후에 수집한다. 면역 반응을 발생시키기 위해, 동일계 내에서 단백질을 생성하는데 있어 각종 유전자 치료법 기술이 유용할 수 있다.
모노클로날 항체를 만들 수 있다. 예를 들면, 비장 세포를 적당한 융합 파트너와 융합시키고, 표준 과정에 의해 성장 배지에서 하이브리도마를 선별한다. 하이브리도마 상등액을 대상으로 하여, 예를 들어, ELISA 또는 기타 검정에 의해 목적하는 DTLR과 결합하는 항체의 존재 여부를 스크리닝한다. 특이적 DTLR 양태를 특이적으로 인식하는 항체를 선별 또는 제조할 수 있다.
또 다른 방법에서는, 합성 펩티드 또는 정제된 단백질을 면역계에 표시하여 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 생성시킨다[참조: Coligan (ed. 1991)Current Protocols in ImmunologyWiley/Greene; and Harlow and Lane(1989)Antibodies: A Laboratory ManualCold Spring Harbor Press]. 적당한 상황하에서, 결합성 시약을 상기 언급된 바와 같은 표지시키는데, 예를 들어, 형광 등으로 표지시키거나, 또는 패닝 방법을 위해 기질에 고정화시킨다. 핵산을 또한 특정 동물 중의 세포 내로 도입하여 항원을 생성시킬 수 있는데, 이는 면역 반응을 유도시키는 작용을 한다[참조: Wang et al. (1993)Proc. Nat'l Acad. Sci.90:4156-4160; Barry et al. (1994)BioTechniques16:616-619; and Xiang et al., (1995)Immunity2:129-135].
IX. DTLR5을 이용한 융합 단백질의 생성
DTLR5를 사용하여 각종의 융합 작제물을 만든다. 이러한 유전자 부분을 에피토프 태그, 예를 들면, FLAG 태그, 또는 2개의 하이브리드 시스템 작제물에 융합시킨다[참조: Fields and Song (1989)Nature340:245-246].
상기 에피토프 태그를 발현 클로닝 과정에 사용하고 항-FLAG 항체로 탐지하여 결합 파트너, 예를 들면, 각각의 DTLR5에 대한 리간드를 탐지할 수 있다. 2개의 하이브리드 시스템을 사용하여, DTLR5와 특이적으로 결합되는 단백질을 분리할 수도 있다.
X. DTLRs의 염색체성 지도화
염색체 확산체를 제조한다. 72시간 동안 배양된 피토헤마글루티닌(phytohemagglutinin)-자극된 사람 림프구로부터 수득된 염색체 제제 상에서 동일계(원위치) 하이브리드화를 수행한다. 마지막 배양 7시간 동안에 5-브로모데옥시우리딘을 가하여(배지 1ml당 60㎍), 양질의 하이브리드화 후 염색체성 밴딩을 보장한다.
전체 B 세포 cDNA 주형 상에서 프라이머의 도움 하에 증폭된 적당한 단편, 예를 들면, PCR 단편을 적당한 벡터 내로 클로닝한다. 상기 벡터를3H로 닉-해독(nick-translation)시킴으로써 표지시킨다. 방사성 표지된 프로브를 문헌[참조: Mattei et al. (1985)Hum. Genet.69:327-331]에 기재된 바와 같이 중기 확산체와 하이브리드화한다.
핵 트랙 에멀션(nuclear track emulsion)(KODAK NTB2)으로 도포한 후, 슬라이드를, 예를 들어, 4℃에서 18일 동안 노출시킨다. 밴딩 과정 동안의 은 그레인의 어떠한 미끄러짐도 피하기 위해, 염색체 확산체를 먼저 완충 김사(Giemsa) 용액으로 염색하고, 중기 사진을 찍는다. 이어서, 형광색소-광분해-김사(FPG) 방법에 의해 R-밴딩을 수행하고, 중기 사진을 찍은 다음 분석한다.
또 다른 한편, 상기 언급된 바와 같이 FISH를 수행할 수 있다. 당해 DTLR 유전자를 상이한 염색체 상에 위치시킨다. DTLR2 및 DTLR3은 사람 염색체 4 위에 위치시키고; DTLR4는 사람 염색체 9 위에 위치시키며; DTLR5는 사람 염색체 1 위에 위치시킨다(도 4A-4D 참조).
XI. 구조 활성 유연 관계
특정한 잔기의 임계(criticality)에 관한 정보는 표준 과정 및 분석을 사용하여 결정한다. 예를 들어, 결정된 위치, 예를 들어, 상기 동정된 위치에서 상이한 많은 변이체를 생성시키고, 이러한 변이체의 생물학적 활성을 평가함으로써, 표준 돌연변이 유발 분석을 수행한다. 이는 활성을 변화시키는 위치를 결정하는 정도로 수행할 수 있거나, 생물학적 활성을 보존, 차단 또는 조정시키도록 치환될 수 있는 잔기를 결정하기 위해 특정 위치에 대해 초점을 맞출 수 있다.
또 다른 한편, 천연 변이체에 대한 분석은 어떠한 위치가 천연 돌연변이에 견딜 수 있는지를 지시해줄 수 있다. 이는 개개인들 중의 변이, 또는 균주 간의 변이 또는 종 간의 변이에 관한 집단 분석으로부터 비롯될 수 있다. 선별된 개개인으로부터의 샘플을, 예를 들어, PCR 분석 및 서열 분석으로 분석한다. 이로써 집단 다형성을 평가할 수 있다.
XI. DTLR에 대한 리간드의 분리
DTLR를 특이적 결합성 시약으로서 사용하여, 이의 결합 특이성 이점을 취함으로써 이의 결합 파트너를 동정할 수 있으며, 훨씬 더 많은 항체를 사용할 수 있을 것이다. 결합성 시약을 상기 언급된 바와 같은 표지시키는데, 예를 들어, 형광 등으로 표지시키거나, 또는 패닝 방법을 위해 기질에 고정화시킨다.
당해 결합성 조성물을 사용하여, 결합 파트너, 즉 리간드, 바람직하게는 막 연합된 리간드를 발현하는 세포주로부터 제조된 발현 라이브러리를 스크리닝한다. 표준 염색 기술을 사용하여, 표면 발현 리간드를 탐지 또는 분류하거나, 또는 형질전환된 세포를 발현하는 표면을 패닝으로 스크리닝한다. 각종 염색 또는 면역형광 과정에 의해 세포내 발현 스크리닝을 수행한다[참조: McMahan et al. (1991)EMBO J.10:2821-2832].
예를 들면, 0일째, 2개 챔버 퍼마녹스(permanox) 슬라이드를, PBS 중의 피브로넥틴 10ng/ml을 챔버당 1ml로 30분 동안 실온에서 예비도포한다. PBS로 1회 세정한다. 이어서, 1.5ml의 성장 배지에서 챔버당 2 내지 3 x 105개 세포로 COS 세포를 도말한다. 37℃에서 밤새 항온 배양한다.
각 샘플에 대한 1일째, 혈청 무함유 DME 중에 66㎍/ml DEAE-덱스트란, 66μM 클로로퀸, 및 4㎍ DNA의 0.5ml 용액을 준비한다. 각 세트에 대해, 예를 들어, 1및 1/200 희석율의 DTLR-FLAG cDNA의 양성 대조군, 및 음성 모사체를 제조한다. 세포를 혈청 무함유 DME로 세정한다. DNA 용액을 가하고, 37℃에서 5시간 동안 항온 배양한다. 상기 배지를 제거하고, DME 중의 0.5ml 10% DMSO를 2.5분 동안 가한다. 제거하고 DME로 1회 세척한다. 1.5ml 성장 배지를 가하고, 밤새 항온 배양한다.
2일째, 배지를 바꾼다. 3일 또는 4일째, 세포를 고정시키고 염색한다. 세포를 한크스 완충 식염수(HBSS)로 2회 세정하고, 4% 파라포름알데히드(PFA)/글루코즈에서 5분 동안 고정시킨다. HBSS로 3회 세척한다. 모든 액체를 제거한 후, 상기 슬라이드를 -80℃에서 저장한다. 각 챔버에 대해, 0.5ml 항온 배양물을 다음과 같이 수행한다: HBSS/사포닌(0.1%)을 32㎕/ml의 1M NaH3과 함께 20분 동안 가한다. 이어서, 세포를 HBSS/사포닌으로 1회 세척한다. 적당한 DTLR 또는 DTLR/항체 복합체를 세포에 가하고 30분 동안 항온 배양한다. 세포를 HBSS/사포닌로 2회 세척한다. 적당한 경우, 제1 항체를 30분 동안 가한다. 제2 항체, 예를 들면, 벡터 항-마우스 항체를 1/200 희석율로 가하고, 30분 동안 항온 배양한다. ELISA 용액, 예를 들면, 벡터 엘라이트 ABC 서양고추냉이 퍼옥시다제 용액을 제조하고, 30분 동안 예비항온 배양한다. 예를 들어, 2.5ml HBSS/사포닌당 용액 A(아비딘) 1방울과 용액 B(바이오틴) 1방울 사용한다. 세포를 HBSS/사포닌로 2회 세척한다. ABC HRP 용액을 가하고 30분 동안 항온배양한다. 세포를 HBSS로 2회 세척하고, 2분 동안 제2 세척을 수행한 후, 세포를 닫는다. 이어서, 벡터 디아미노벤조산(DAB)을 5 내지 10분 동안 가한다. 유리 증류수 5ml당 완충액 2방울 + DAB 4방울 + H2O22방울을 사용한다. 챔버를 조심스럽게 꺼내고 슬라이드를 수중에서 세정한다. 수 분 동안 공기 건조시킨 다음, 크리스탈 마운트 1방울을 커브 슬립에 가한다. 85 내지 90℃에서 5분 동안 굽는다.
풀의 양성 염색을 평가하고, 점진적으로 서브클로닝하여, 결합에 관여하는 단일 유전자를 분리시킨다.
또 다른 한편, DTLR 시약을 사용하여, 추정상의 리간드를 발현하는 세포를 친화 정제하거나 분류시킨다[참조: Sambrook et al. or Ausubel et al.].
또 다른 전략은 패닝에 의해 막 결합된 수용체를 스크리닝하는 것이다. 상기 수용체 DNA를 상기 언급된 바와 같이 작제한다. 이 리간드를 고정화시킨 다음, 이를 발현 세포를 고정화시키는데 사용할 수 있다. 고정화는, 예를 들어, DTLR 융합 작제물의 FLAG 서열을 인식하는 적당한 항체를 사용하거나, 또는 제1 항체에 대해 생성된 항체를 사용함으로써 달성할 수 있다. 선별과 증폭 주기를 반복하면, 적당한 클론이 증강되어 궁극적으로 수용체 발현 클론이 분리된다.
파아지 발현 라이브러리를 포유류 DTLRs에 의해 스크리닝할 수 있다. 적당한 표지 기술, 예를 들면, 항-FLAG 항체를 이용하여, 적당한 클론을 특이적으로 표지화할 수 있을 것이다.
본원의 모든 인용문헌은, 각각의 공보 또는 특허 문헌이 본원에 참조문헌으로써 삽입된다고 구체적으로 지시된 경우와 동일한 정도로 본원에 참조문헌으로써삽입된다.
본 발명의 많은 변형 및 변이가 본 발명의 요지 및 범위를 벗어나지 않고서도 만들어질 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 본원에 기재된 특정 양태는 단지 예이며, 본 발명은 첨부된 청구의 범위와, 이러한 청구의 범위와 등가의 전 범위로써만 제한되며; 본 발명은 본원에 예로써 제시된 특정 양태로 제한되지 않는다.
사람은 2개의 독특한 유형의 수지상 세포(DC) 전구체를 갖는다. 말초혈 단구(pDC1)는 GMCSF 및 IL-1와의 배양 후에 미숙한 골수성 DCs를 생성시킨다. 이들 미숙한 세포는, CD40 리간드(CD40L)로의 자극 후에 성숙한 골수성 DCs(DC1)로 된다. 혈액 또는 편도선으로부터의 CD4+CD3-CD11c- 형질세포계 세포(pDC2)는, IL-3과의 배양 후에 독특한 유형의 미숙한 DC를 생성시키고, CD40L 자극 후에, 성숙한 DCs(DC2)로 분화된다[참조: Rissoan et al. (1999)Science283:1183-1186].
문헌[참조: Siegal et al. (1999)Science284:1835-1837]에는 pDC2가 "천연 인터페론 생산 세포"(IPC)라는 것을 보여준다. 인터페론(IFNs)은 항바이러스성 면역 반응에 가장 중요한 사이토킨이다. 사람 혈액 내에서의 "천연 IFN-생산 세포"(NIPCs)는 CD4 및 주요 조직적합성 복합체 부류 II 단백질을 암호화하지만, 이들의 희소성, 신속한 세포소멸 및 계통 마커의 결여로 인해 분리되지 못하였고 추가로 성상 확인되지 못하였다. 정제된 NIPCs는, 미생물 챌린지 후에 기타 혈액 세포 보다 200 내지 1000배 더 많은 IFN을 생산하는 CD4(+)CD11c-유형 2 수지상 세포 전구체(pDC2s)인 것으로 밝혀졌다. 따라서, pCDs는 항미생물 및 항종양 면역 반응에 결정적인, 면역계의 유효인자 세포 유형이다. 이들은 HIV 감염된 환자에게서 중요한 세포로서 관련이 있다.
Toll-유사 수용체(TLR) 분자는 IL-1/Toll 수용체 계열에 속한다. TLR2 및 TLR4에 대한 리간드를 동정하였으며, 이들의 기능은 미생물성 항원 또는 상해에 대한 숙주 면역 반응과 관계가 있다[참조: Takeuchi et al. (1999)Immunity11:443-451; and Noshino et al. (1999)J. Immunol.162:3749-3752]. TLR의 발현 패턴은 제한되는 것으로 보인다[참조: Muzio et al. (2000)J. Immunol.164:5998-6004]. 이들 발견, 즉 i) TLR10이 pDC2s에서 고도로 발현되고 제한된다는 사실; 및 ii) pDC2가 NIPC라는 사실을 이용하면, TLR10이 숙주의 선천성 면역 반응에 중요한 역할을 할 것으로 예상된다.

Claims (21)

  1. a) 약 12개 이상의 아미노산 길이에 걸쳐 서열 4와 동일성을 나타내는, 실질적으로 순수한 또는 재조합 DTLR2 단백질 또는 펩티드;
    b) 서열 4의 천연 서열 DTLR2;
    c) DTLR2 서열을 포함하는 융합 단백질;
    d) 약 12개 이상의 아미노산 길이에 걸쳐 서열 6과 동일성을 나타내는, 실질적으로 순수한 또는 재조합 DTLR3 단백질 또는 펩티드;
    e) 서열 6의 천연 서열 DTLR3;
    f) DTLR3 서열을 포함하는 융합 단백질;
    g) 약 12개 이상의 아미노산 길이에 걸쳐 서열 8과 동일성을 나타내는, 실질적으로 순수한 또는 재조합 DTLR4 단백질 또는 펩티드;
    h) 서열 8의 천연 서열 DTLR4;
    i) DTLR4 서열을 포함하는 융합 단백질;
    j) 약 12개 이상의 아미노산 길이에 걸쳐 서열 10과 동일성을 나타내는, 실질적으로 순수한 또는 재조합 DTLR5 단백질 또는 펩티드;
    k) 서열 10을 포함하는 천연 서열 DTLR5;
    l) DTLR5 서열을 포함하는 융합 단백질;
    m) 약 12개 이상의 아미노산 길이에 걸쳐 서열 12, 28 또는 30과 동일성을 나타내는, 실질적으로 순수한 또는 재조합 DTLR6 단백질 또는 펩티드;
    n) 서열 12, 28 또는 30을 포함하는 천연 서열 DTLR6;
    o) DTLR6 서열을 포함하는 융합 단백질;
    p) 약 12개 이상의 아미노산 길이에 걸쳐 서열 16, 18 또는 37과 동일성을 나타내는, 실질적으로 순수한 또는 재조합 DTLR7 단백질 또는 펩티드;
    q) 서열 16, 18 또는 37을 포함하는 천연 서열 DTLR7;
    r) DTLR7 서열을 포함하는 융합 단백질;
    s) 약 12개 이상의 아미노산 길이에 걸쳐 서열 32 또는 39와 동일성을 나타내는, 실질적으로 순수한 또는 재조합 DTLR8 단백질 또는 펩티드;
    t) 서열 32 또는 39을 포함하는 천연 서열 DTLR8;
    u) DTLR8 서열을 포함하는 융합 단백질;
    v) 약 12개 이상의 아미노산 길이에 걸쳐 서열 22 또는 41과 동일성을 나타내는, 실질적으로 순수한 또는 재조합 DTLR9 단백질 또는 펩티드;
    w) 서열 22 또는 41을 포함하는 천연 서열 DTLR9;
    x) DTLR9 서열을 포함하는 융합 단백질;
    y) 약 12개 이상의 아미노산 길이에 걸쳐 서열 34, 43 또는 45와 동일성을 나타내는, 실질적으로 순수한 또는 재조합 DTLR10 단백질 또는 펩티드;
    z) 서열 34, 43 또는 45을 포함하는 천연 서열 DTLR10; 및
    zz) DTLR10 서열을 포함하는 융합 단백질
    로 이루어진 그룹 중에서 선택된 조성물.
  2. a) 제 1항의 DTLR2의 상응하는 부분과 서열 동일성을 나타내는 세그먼트를 포함하고, 이러한 동일성이
    a) 약 15개 이상의 아미노산;
    b) 약 19개 이상의 아미노산; 또는
    c) 약 25개 이상의 아미노산에 걸쳐 나타나거나;
    b) 제 1항의 DTLR3의 상응하는 부분과 서열 동일성을 나타내는 세그먼트를 포함하고, 이러한 동일성이
    a) 약 15개 이상의 아미노산;
    b) 약 19개 이상의 아미노산; 또는
    c) 약 25개 이상의 아미노산에 걸쳐 나타나거나;
    c) 제 1항의 DTLR4의 상응하는 부분과 서열 동일성을 나타내는 세그먼트를 포함하고, 이러한 동일성이
    a) 약 15개 이상의 아미노산;
    b) 약 19개 이상의 아미노산; 또는
    c) 약 25개 이상의 아미노산에 걸쳐 나타나거나;
    d) 제 1항의 DTLR5의 상응하는 부분과 서열 동일성을 나타내는 세그먼트를 포함하고, 이러한 동일성이
    a) 약 15개 이상의 아미노산;
    b) 약 19개 이상의 아미노산; 또는
    c) 약 25개 이상의 아미노산에 걸쳐 나타나거나;
    e) 제 1항의 DTLR6의 상응하는 부분과 서열 동일성을 나타내는 세그먼트를 포함하고, 이러한 동일성이
    a) 약 15개 이상의 아미노산;
    b) 약 19개 이상의 아미노산; 또는
    c) 약 25개 이상의 아미노산에 걸쳐 나타나거나;
    f) 제 1항의 DTLR7의 상응하는 부분과 서열 동일성을 나타내는 세그먼트를 포함하고, 이러한 동일성이
    a) 약 15개 이상의 아미노산;
    b) 약 19개 이상의 아미노산; 또는
    c) 약 25개 이상의 아미노산에 걸쳐 나타나거나;
    g) 제 1항의 DTLR8의 상응하는 부분과 서열 동일성을 나타내는 세그먼트를 포함하고, 이러한 동일성이
    a) 약 15개 이상의 아미노산;
    b) 약 19개 이상의 아미노산; 또는
    c) 약 25개 이상의 아미노산에 걸쳐 나타나거나;
    h) 제 1항의 DTLR9의 상응하는 부분과 서열 동일성을 나타내는 세그먼트를 포함하고, 이러한 동일성이
    a) 약 15개 이상의 아미노산;
    b) 약 19개 이상의 아미노산; 또는
    c) 약 25개 이상의 아미노산에 걸쳐 나타나거나; 또는
    i) 제 1항의 DTLR10의 상응하는 부분과 서열 동일성을 나타내는 세그먼트를 포함하고, 이러한 동일성이
    a) 약 15개 이상의 아미노산;
    b) 약 19개 이상의 아미노산; 또는
    c) 약 25개 이상의 아미노산에 걸쳐 나타나는,
    실질적으로 순수한 또는 분리된 단백질.
  3. 제1항에 있어서,
    a) DTLR2가
    i) 표 2의 성숙한 서열을 포함하거나; 또는
    ii) 해독 후 변형(post-translational modification)이 결여되거나;
    b) DTLR3이
    i) 표 3의 성숙한 서열을 포함하거나; 또는
    ii) 해독 후 변형이 결여되거나;
    c) DTLR4가
    i) 표 4의 성숙한 서열을 포함하거나; 또는
    ii) 해독 후 변형이 결여되거나;
    d) DTLR5가
    i) 표 5의 성숙한 서열을 포함하거나; 또는
    ii) 해독 후 변형이 결여되거나;
    e) DTLR6이
    i) 표 6의 성숙한 서열을 포함하거나; 또는
    ii) 해독 후 변형이 결여되거나;
    f) DTLR7이
    i) 표 7의 성숙한 서열을 포함하거나; 또는
    ii) 해독 후 변형이 결여되거나;
    g) DTLR8이
    i) 표 8의 성숙한 서열을 포함하거나; 또는
    ii) 해독 후 변형이 결여되거나;
    h) DTLR9가
    i) 표 9의 성숙한 서열을 포함하거나; 또는
    ii) 해독 후 변형이 결여되거나;
    i) DTLR10이
    i) 표 10의 성숙한 서열을 포함하거나; 또는
    ii) 해독 후 변형이 결여되거나; 또는
    j) 단백질 또는 펩티드가
    i) 영장류(예: 사람)를 포함한 포유류 중에서 선택된 온혈 동물 기원이거나;
    ii) 서열 4, 6, 26, 10, 12, 28, 30, 16, 18, 37, 39, 32, 22, 34, 43 또는 45의 하나 이상의 폴리펩티드 세그먼트를 포함하거나;
    iii) 상기 동일성을 나타내는 다수의 세그먼트를 갖거나;
    iv) DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 또는 DTLR10의 천연 대립유전자성 변이체이거나;
    v) 길이가 약 30개 이상의 아미노산이거나;
    vi) 영장류 DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 또는 DTLR10에 특이적인 2개 이상의 비-중복 에피토프를 나타내거나;
    vii) 약 35개 이상의 아미노산 길이에 걸쳐 영장류 DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 또는 DTLR10과 서열 동일성을 나타내거나;
    viii) 영장류 DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 또는 DTLR10에 특이적인 2개 이상의 비-중복 에피토프를 추가로 나타내거나;
    ix) 약 20개 이상의 아미노산 길이에 걸쳐 설치류 DTLR6과 동일성을 나타내거나;
    x) 글리코실화되거나;
    xi) 천연 글리코실화를 나타내는 분자량이 100kD 이상이거나;
    xii) 합성 폴리펩티드이거나;
    xiii) 고체 기질에 부착되거나;
    xiv) 또 다른 화학적 잔기에 접합되거나;
    xv) 천연 서열로부터 5배 이하 치환되거나; 또는
    xvi) 천연 서열로부터의 결실 또는 삽입 변이체
    인 조성물.
  4. a) 제1항의 멸균성 DTLR2 단백질 또는 펩티드;
    b) 상기 제1항의 DTLR2 단백질 또는 펩티드, 및 담체(여기서, 상기 담체는 i) 물, 식염수 및/또는 완충액을 포함한 수성 화합물이고/이거나 ii) 경구, 직장, 비내, 국소 또는 비경구 투여용으로 제형화된다);
    c) 제1항의 멸균성 DTLR3 단백질 또는 펩티드;
    d) 상기 제1항의 DTLR3 단백질 또는 펩티드, 및 담체(여기서, 상기 담체는 i) 물, 식염수 및/또는 완충액을 포함한 수성 화합물이고/이거나 ii) 경구, 직장, 비내, 국소 또는 비경구 투여용으로 제형화된다);
    e) 제1항의 멸균성 DTLR4 단백질 또는 펩티드;
    f) 상기 제1항의 DTLR4 단백질 또는 펩티드, 및 담체(여기서, 상기 담체는 i) 물, 식염수 및/또는 완충액을 포함한 수성 화합물이고/이거나 ii) 경구, 직장, 비내, 국소 또는 비경구 투여용으로 제형화된다);
    g) 제1항의 멸균성 DTLR5 단백질 또는 펩티드;
    h) 상기 제1항의 DTLR5 단백질 또는 펩티드, 및 담체(여기서, 상기 담체는 i) 물, 식염수 및/또는 완충액을 포함한 수성 화합물이고/이거나 ii) 경구, 직장, 비내, 국소 또는 비경구 투여용으로 제형화된다);
    i) 제1항의 멸균성 DTLR6 단백질 또는 펩티드;
    j) 상기 제1항의 DTLR6 단백질 또는 펩티드, 및 담체(여기서, 상기 담체는 i) 물, 식염수 및/또는 완충액을 포함한 수성 화합물이고/이거나 ii) 경구, 직장,비내, 국소 또는 비경구 투여용으로 제형화된다);
    k) 제1항의 멸균성 DTLR7 단백질 또는 펩티드;
    l) 상기 제1항의 DTLR7 단백질 또는 펩티드, 및 담체(여기서, 상기 담체는 i) 물, 식염수 및/또는 완충액을 포함한 수성 화합물이고/이거나 ii) 경구, 직장, 비내, 국소 또는 비경구 투여용으로 제형화된다);
    m) 제1항의 멸균성 DTLR8 단백질 또는 펩티드;
    n) 상기 제1항의 DTLR8 단백질 또는 펩티드, 및 담체(여기서, 상기 담체는 i) 물, 식염수 및/또는 완충액을 포함한 수성 화합물이고/이거나 ii) 경구, 직장, 비내, 국소 또는 비경구 투여용으로 제형화된다);
    o) 제1항의 멸균성 DTLR9 단백질 또는 펩티드;
    p) 상기 제1항의 DTLR9 단백질 또는 펩티드, 및 담체(여기서, 상기 담체는 i) 물, 식염수 및/또는 완충액을 포함한 수성 화합물이고/이거나 ii) 경구, 직장, 비내, 국소 또는 비경구 투여용으로 제형화된다);
    q) 제1항의 멸균성 DTLR10 단백질 또는 펩티드; 또는
    r) 상기 제1항의 DTLR10 단백질 또는 펩티드, 및 담체(여기서, 상기 담체는 i) 물, 식염수 및/또는 완충액을 포함한 수성 화합물이고/이거나 ii) 경구, 직장, 비내, 국소 또는 비경구 투여용으로 제형화된다)
    를 포함하는 조성물.
  5. a) 표 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10의 서열을 포함하는 성숙한 단백질;
    b) FLAG, His6 또는 Ig 서열을 포함한, 탐지 또는 정제용 태그; 또는
    c) 또 다른 수용체 단백질의 서열
    을 포함하는 제1항의 융합 단백질.
  6. 제1항의 단백질 또는 폴리펩티드와;
    a) 이러한 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하는 구획; 및/또는
    b) 해당 키트 내의 시약을 사용하거나 처리하는 것에 관한 지시 사항
    을 포함하는 키트.
  7. 제1항의 천연의 DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 또는 DTLR10 단백질과 특이적으로 결합되는, 항체로부터의 항원 결합성 부위를 포함하는 결합성 화합물로서,
    a) 상기 단백질이 영장류 단백질이거나;
    b) 결합성 화합물이 Fv, Fab 또는 Fab2 단편이거나;
    c) 결합성 화합물이 또 다른 화학적 잔기에 접합되거나; 또는
    d) 상기 항체가
    i) 표 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10의 성숙한 폴리펩티드의 펩티드 서열에 대해 생성되거나;
    ii) 성숙한 DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 또는 DTLR10에 대해 생성되거나;
    iii) 정제된 사람 DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 또는 DTLR10에 대해 생성되거나;
    iv) 면역선택되거나;
    v) 폴리클로날 항체이거나;
    vi) 변성 DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 또는 DTLR10에 결합되거나;
    vii) 항원에 대한 Kd가 30μM 이상이거나;
    viii) 비드 또는 플라스틱 막을 포함한 고체 기질에 부착되거나;
    ix) 멸균성 조성물 내에 있거나; 또는
    x) 방사성 또는 형광성 표지물로 탐지 가능하게 표지되는
    결합성 화합물.
  8. 제7항의 결합성 화합물과;
    a) 이러한 결합성 화합물을 포함하는 구획; 및/또는
    b) 해당 키트 내의 시약을 사용하거나 처리하는 것에 관한 지시 사항
    을 포함하는 키트.
  9. A) 면역계를 면역원성 양의
    a) 영장류 DTLR2;
    b) 영장류 DTLR3;
    c) 영장류 DTLR4;
    d) 영장류 DTLR5;
    e) 영장류 DTLR6;
    f) 영장류 DTLR7;
    g) 영장류 DTLR8;
    h) 영장류 DTLR9; 또는
    i) 영장류 DTLR10
    으로 면역시킴으로써, 해당 항체를 생성시키는 단계를 포함하여, 제7항의 항체를 제조하거나; 또는
    B) 제7항의 항체를
    a) 포유류 DTLR2 단백질 또는 펩티드;
    b) 포유류 DTLR3 단백질 또는 펩티드;
    c) 포유류 DTLR4 단백질 또는 펩티드;
    d) 포유류 DTLR5 단백질 또는 펩티드;
    e) 포유류 DTLR6 단백질 또는 펩티드;
    f) 포유류 DTLR7 단백질 또는 펩티드;
    g) 포유류 DTLR8 단백질 또는 펩티드;
    h) 포유류 DTLR9 단백질 또는 펩티드; 또는
    i) 포유류 DTLR10 단백질 또는 펩티드
    와 접촉시킴으로써, 항원:항체 복합체를 형성시키는 단계를 포함하여, 상기항원:항체 복합체를 생성하는 방법.
  10. a) 제7항의 멸균 결합성 화합물; 또는
    n) 상기 제7항의 결합성 화합물 및 담체(여기서, 상기 담체는
    i) 물, 식염수 및/또는 완충액을 포함한 수성 화합물이고/이거나
    ii) 경구, 직장, 비내, 국소 또는 비경구 투여용으로 제형화된다)
    를 포함하는 조성물.
  11. a) DTLR이 포유류 기원이거나; 또는
    b) 핵산이
    i) 표 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10의 항원성 펩티드 서열을 암호화하거나;
    ii) 표 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10의 다수의 항원성 펩티드 서열을 암호화하거나;
    iii) 상기 세그먼트를 암호화하는 천연 cDNA와 약 80% 이상의 동일성을 나타내거나;
    iv) 발현 벡터이거나;
    v) 복제 기점을 추가로 포함하거나;
    vi) 천연 공급원으로부터의 것이거나;
    vii) 탐지 가능한 표지물을 포함하거나;
    viii) 합성 뉴클레오티드 서열을 포함하거나;
    ix) 6kb 미만, 바람직하게는 3kb 미만이거나;
    x) 포유류(영장류 포함) 기원이거나;
    xi) 천연의 완전한 길이의 암호화 서열을 포함하거나;
    xii) 상기 DTLR을 암호화하는 유전자에 대한 하이브리드화용 프로브이거나;
    xiii) 표 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10으로부터의 17개 이상의 연속되는 뉴클레오티드를 포함하거나;
    xiv) 표 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10로부터의 17개 이상의 연속되는 뉴클레오티드의 다수의 비-중복 세그먼트를 포함하거나; 또는
    xv) PCR 프라이머, PCR 생성물 또는 돌연변이 유발 프라이머
    인, 제1항의 단백질 또는 펩티드 또는 융합 단백질을 암호화하는 분리된 또는 재조합 핵산.
  12. 제11항의 재조합 핵산을 포함하는 세포, 조직 또는 기관.
  13. 제12항에 있어서, 상기 세포가
    a) 원핵 세포;
    b) 진핵 세포;
    c) 세균 세포;
    d) 효모 세포;
    e) 곤충 세포;
    f) 포유류 세포;
    g) 마우스 세포;
    h) 영장류 세포; 또는
    i) 사람 세포
    인 세포.
  14. 제11항의 핵산과,
    a) 이러한 핵산을 포함하는 구획;
    b) 영장류 DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 또는 DTLR10 단백질 또는 폴리펩티드를 추가로 포함하는 구획; 및/또는
    c) 해당 키트 내의 시약을 사용하거나 처리하는 것에 관한 지시 사항
    을 포함하는 키트.
  15. A) 제11항의 핵산을 발현시킴으로써, 폴리펩티드를 생성시키는 단계를 포함하여, 상기 폴리펩티드를 제조하거나; 또는
    B) 제11항의 핵산을 상보성 핵산과 접촉시킴으로써, 이중체를 형성하도록 하는 단계를 포함하여, 상기 이중체 핵산을 제조하는 방법.
  16. a) 30℃ 및 2M 미만 염에서의 세척 조건 하에 서열 3과 하이브리드화되거나;
    b) 30℃ 및 2M 미만 염에서의 세척 조건 하에 서열 5와 하이브리드화되거나;
    c) 30℃ 및 2M 미만 염에서의 세척 조건 하에 서열 25와 하이브리드화되거나;
    d) 30℃ 및 2M 미만 염에서의 세척 조건 하에 서열 9와 하이브리드화되거나;
    e) 30℃ 및 2M 미만 염에서의 세척 조건 하에 서열 11, 27 또는 29와 하이브리드화되거나;
    f) 30℃ 및 2M 미만 염에서의 세척 조건 하에 서열 15, 17 또는 36과 하이브리드화되거나;
    g) 30℃ 및 2M 미만 염에서의 세척 조건 하에 서열 31 또는 38과 하이브리드화되거나;
    h) 30℃ 및 2M 미만 염에서의 세척 조건 하에 서열 21 또는 40과 하이브리드화되거나;
    i) 30℃ 및 2M 미만 염에서의 세척 조건 하에 서열 33, 35, 42 또는 44와 하이브리드화되거나;
    j) 약 30개 이상의 뉴클레오티드 연장물에 걸쳐 영장류 DTLR2와 약 85% 이상의 동일성을 나타내거나;
    k) 약 30개 이상의 뉴클레오티드 연장물에 걸쳐 영장류 DTLR3과 약 85% 이상의 동일성을 나타내거나;
    l) 약 30개 이상의 뉴클레오티드 연장물에 걸쳐 영장류 DTLR4와 약 85% 이상의 동일성을 나타내거나;
    m) 약 30개 이상의 뉴클레오티드 연장물에 걸쳐 영장류 DTLR5와 약 85% 이상의 동일성을 나타내거나;
    n)약 30개 이상의 뉴클레오티드 연장물에 걸쳐 영장류 DTLR6과 약 85% 이상의 동일성을 나타내거나;
    o) 약 30개 이상의 뉴클레오티드 연장물에 걸쳐 영장류 DTLR7과 약 85% 이상의 동일성을 나타내거나;
    p) 약 30개 이상의 뉴클레오티드 연장물에 걸쳐 영장류 DTLR8과 약 85% 이상의 동일성을 나타내거나;
    q) 약 30개 이상의 뉴클레오티드 연장물에 걸쳐 영장류 DTLR9와 약 85% 이상의 동일성을 나타내거나; 또는
    r) 약 30개 이상의 뉴클레오티드 연장물에 걸쳐 영장류 DTLR10과 약 85% 이상의 동일성을 나타내는 핵산.
  17. 제16항에 있어서,
    a) 세척 조건이 45℃ 및/또는 500mM 염이거나; 또는
    b) 동일성이 90% 이상이고/이거나 상기 연장물이 55개 이상의 뉴클레오티드인 핵산.
  18. 제17항에 있어서,
    a) 세척 조건이 55℃ 및/또는 150mM 염이거나; 또는
    b) 동일성이 95% 이상이고/이거나 상기 연장물이 75개 이상의 뉴클레오티드인 핵산.
  19. a) 재조합 또는 합성적으로 생성된 단백질을 포함한, 실질적으로 순수한 영장류 DTLR2를 후보 Toll 리간드와 접촉시키거나;
    b) 재조합 또는 합성적으로 생성된 단백질을 포함한, 실질적으로 순수한 영장류 DTLR3을 후보 Toll 리간드와 접촉시키거나;
    c) 재조합 또는 합성적으로 생성된 단백질을 포함한, 실질적으로 순수한 영장류 DTLR4를 후보 Toll 리간드와 접촉시키거나;
    d) 재조합 또는 합성적으로 생성된 단백질을 포함한, 실질적으로 순수한 영장류 DTLR5를 후보 Toll 리간드와 접촉시키거나;
    e) 재조합 또는 합성적으로 생성된 단백질을 포함한, 실질적으로 순수한 영장류 DTLR6을 후보 Toll 리간드와 접촉시키거나;
    f) 재조합 또는 합성적으로 생성된 단백질을 포함한, 실질적으로 순수한 영장류 DTLR7을 후보 Toll 리간드와 접촉시키거나;
    g) 재조합 또는 합성적으로 생성된 단백질을 포함한, 실질적으로 순수한 영장류 DTLR8을 후보 Toll 리간드와 접촉시키거나;
    h) 재조합 또는 합성적으로 생성된 단백질을 포함한, 실질적으로 순수한 영장류 DTLR9를 후보 Toll 리간드와 접촉시키거나; 또는
    i) 재조합 또는 합성적으로 생성된 단백질을 포함한, 실질적으로 순수한 영장류 DTLR10을 후보 Toll 리간드와 접촉시킴으로써,
    리간드:수용체 복합체를 형성시키는 단계를 포함하는, 상기 리간드:수용체 복합체의 생성 방법.
  20. 특정 세포 또는 조직배양 세포를, 포유류 DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 또는 DTLR10의 효능제 또는 길항제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 상기 세포 또는 조직 배양 세포의 생리 또는 발생을 조정하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 효능제 또는 길항제가 DTLR10의 효능제 또는 길항제이고, 상기 세포가 pDC2 세포인 방법.
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