KR20020089390A - 아폽토시스를 유발하는 폴리펩티드 - Google Patents

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츠치야마사유키
오에다마사요시
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츄가이 세이야꾸 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은 Integrin Associated Protein(IAP)을 갖는 유핵혈액세포의 아폽토시스를 유발하고, 적혈구 응집을 일으키지 않는 특성을 갖는 재구성 폴리펩티드에 관한 것이다. 상기 재구성 폴리펩티드는 IAP를 갖는 유핵혈액세포의 아폽토시스를 유발하는 모노크로날 항체의 H쇄 V영역을 2개 이상 및 L쇄 V영역을 2개 이상 함유하는 재구성 폴리펩티드이다. 상기 재구성 폴리펩티드는 백혈병 등의 혈액질환용 치료제로서 유용하다.

Description

아폽토시스를 유발하는 폴리펩티드{POLYPEPTIDE INDUCING APOPTOSIS}
일본특허공개 평 9-67499호 공보에는 비장간질세포를 인식할 수 있는 특정의 항체를 개발하는 예민한 항원을 목적으로서 비장간질 세포주를 사용하는 특정 모노크로날 항체의 제작 및 항원으로서 mouse Integrin Associated Protein(mouse IAP)을 인식하는 새로운 모노크로날 항체의 제조방법이 개시되어 있다. 일본특허공개 평 9-67499호 공보에도 모노크로날 항체가 골수세포의 아폽토시스를 유발할 수 있는 것이 개시되어 있다.
WO99/12973은 인간 Intergrin Associated Protein(이하, 인간 IAP로 함; J.Cell Biol., 123, 485-496,1993에 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열이 기재; Journal of Cell Science, 108, 3419-3425, 1995)를 항원으로 하는 모노크로날 항체로서, 상기 인간 IAP를 갖는 인간유핵혈액세포(골수세포 및 림프구)의 아폽토시스를 유발할 수 있는 모노크로날 항체가 개시되어 있다. 이 모노크로날 항체를 항체 MABL-1 및 항체 MABL-2으로 언급하고, 이들 항체를 생성하는 하이브리도마를 MABL-1(FERM BP-6100) 및 MABL-2(FERM BP-6101)으로 언급하고 있다.
일본특허공개 평 11-63557에는 인간 IAP를 항원으로 하는 모노크로날 항체로부터 단일쇄 Fv영역을 갖는 단일쇄 Fv의 제작이 기재되어 있다. 상기 단일쇄 Fv는 인간 IAP를 갖는 유핵혈액세포의 아폽토시스를 유발할 수 있다.
항원으로서 IAP를 인식하는 모노크노날 항체는 인간 IAP를 갖는 유핵혈액세포의 아폽토시스를 유발하지만, 그것은 또한in vitro에서 적혈구 응집을 일으킨다. 항원으로서 IAP를 인식하는 모노크로날 항체의 다량의 투여는 적혈구 응집 등의 분작용의 결과로 나타내어진다.
본 발명은 Integrin Associated Protein(IAP)를 갖는 유핵혈액세포의 아폽토시스를 유발하고, 적혈구 응집을 일으키지 않는 특성을 지닌 재구성 폴리펩티드에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명은 IAP를 갖는 유핵혈액세포의 아폽토시스를 유발하는 모노크로날 항체의 2개 이상의 H쇄 V영역과 2개 이상의 L쇄 V영역을 함유하는 재구성 폴리펩티드에 관한 것이다. 재구성 폴리펩티드는 백혈병 등의 혈액질환용 치료제로서 유용하다.
도 1은, 인간 IgG 항체가 인간 IAP를 발현하는 L1210세포(IAP/L1210)에 결합하지 않는 것을 표시하는 유동세포 분석법의 결과를 나타내는 도면이다.
도 2는, 키메라 MABL-1 항체가 인간 IAP를 발현하는 L1210세포(IAP/L1210)에 특이적으로 결합되는 것을 표시하는 유동세포 분석법의 결과를 나타내는 도면이다.
도 3은, 키메라 MABL-2 항체가 인간 IAP를 발현하는 L1210세포(IAP/L1210)에 특이적으로 결합되는 것을 표시하는 유동세포 분석법의 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는, 본 발명에 따른 단일쇄 Fv 제작방법을 개략적으로 나타내는 도면이다.
도 5는, 본 발명의 단일쇄 Fv를 코드하는 DNA를 대장균내에서 발현시키기 위해 사용될 수 있는 발현 플라스미드의 구조를 나타내는 도면이다.
도 6은, 본 발명의 단일쇄 Fv를 코드하는 DNA를 포유동물세포내에 발현시키기 위해 사용될 수 있는 발현 플라스미드의 구조를 나타내는 도면이다.
도 7은, 실시예 5.4에서 얻어진 웨스턴 블러팅의 결과를 나타내는 사진으로서, 좌측으로부터, 분자량 마커(위로부터 97.4, 66, 45, 31, 21.5, 및 14.5kDa를 나타냄), pCH01도입된 COS7세포의 배양상청, 및 pCH0M2도입된 COS7세포의 배양상청이다. 항체 MABL-2의 재구성 단일쇄 Fv가 pCH0M2도입 세포의 배양상청에 함유되는 것을 나타낸 도면이다.
도 8은, 대조로서 pCHO1/COS7세포의 배양상청내 항체가 대조로서 pCOS1/L1210 세포에 결합되지 않은 것을 표시하는 유동세포 분석법의 결과를 나타내는 도면이다.
도 9는, MABL2-scFv/COS7세포의 배양상청내 항체가 대조로서 pCOS1/L1210세포에 결합되지 않은 것을 표시하는 유동세포 분석법의 결과를 나타내는 도면이다.
도 10은, 대조로서 pCOS1/COS7세포의 배양상청내 항체가 hIPA/L1210 세포에 결합되지 않은 것을 표시하는 유동세포 분석법의 결과를 나타내는 도면이다.
도 11은, MABL2-scFv/COS7세포의 배양상청내 항체가 hIPA/L1210세포에 특이적으로 결합되지 않은 것을 표시하는 유동세포 분석법의 결과를 나타내는 도면이다.
도 12는, 실시예 5.6에서 나타내는 비교 ELISA의 결과를 나타내는 도면으로서, 본 발명의 단일쇄(Fv)의 항원에 대한 결합활성이, 비교로서 pCHO1/COS7세포의 배양상청과 비교하여, 지표로서 항원에 대한 마우스 모노크로날 항체(MABL-2)의 저해로서 설명되는 도면이다.
도 13은, 실시예 5.7에서의 아폽토시스(apoptosis) 유발효과의 결과를 나타내는 도면으로서, 대조로서 pCHO1/COS7세포의 배양상청내 항체가 대조로서 pCOS1/L1210세포의 아폽토시스를 유발하지 않는 것을 나타내는 도면이다.
도 14는, 실시예 5.7에서의 아폽토시스 유발효과의 결과를 나타내는 도면으로서, MABL2-scFv/COS7세포의 배양상청내 항체가 대조로서 pCOS1/L1210 세포의 아폽토시스를 유발하지 않는 것을 나타내는 도면이다.
도 15는, 실시예 5.7에서의 아폽토시스 유발효과의 결과를 나타내는 도면으로서, 대조로서 pCH01/COS7세포의 배양상청내 항체가 hIPA/L1210 세포의 아폽토시스를 유도하지 않는 것을 나타내는 도면이다.
도 16, 실시예 5.7에서의 아폽토시스 유발효과의 결과를 나타내는 도면으로서, MABL2-scFv/COS7세포의 배양상청내 항체가 hIPA/L1210세포의 아폽토시스를 특이적으로 유도하지 않는 것을 나타내는 도면이다.
도 17은, 실시예 5.7에서의 아폽토시스 유발효과의 결과를 나타내는 도면으로서, 대조로서 pCHO1/COS7세포의 배양상청내 항체가 CCRF-CEM 세포의 아폽토시스를 유발하지 않는 것을 나타내는 도면(최후농도 50%)이다.
도 18은, 실시예 5.7에서의 아폽토시스 유발효과의 결과를 나타내는 도면으로서, MABL2-scFv/COS7세포의 배양상청내 항체가 CCRF-CEM 세포의 아폽토시스를 특이적으로 유도하지 않는 것을 나타내는 도면(최후농도 50%)이다.
도 19는, 실시예 5.9에서의 CHO세포에 의해 생성된 항체 MABL-2 유래 단일쇄 Fv의 정제에서 얻어진 크로마토그램으로서, 블루세파로제(Blue-Sepharose) 컬럼으로부터의 부분이 히드록시아파타이트(hydroxyapatite) 컬럼으로 정제될 때, 부분(A)과 부분(B)가 주요 피크로서 얻어진 것을 나타내는 도면이다.
도 20은, 실시예 5.9-(2)에서 얻어진 부분(A)와 부분(B)의 겔여과에 의해 정제된 결과를 나타내는 도면으로서, 주요 피크(각각 AI 및 BI)가, 외관상의 분자량 약 36kD에서 부분(A)으로부터, 약 76kD에서 부분(B)으로부터 용출되는 것을 나타내는 도면이다.
도 21은, 실시예 5.9의 CHO세포에 의해 생성된 항체 MABL-2 유래 단일쇄 Fv의 정제에서 얻어진 부분의 SDS-PAGE상의 분석을 나타내는 도면으로서, 분자량 약 35kD의 단일결합이 양쪽 부분에서 관찰되는 것을 나타내는 도면이다.
도 22는, CHO세포에 의해 생성된 항체 MABL-2 유래 단일쇄 Fv의 정제 중 겔여과에 의해 얻어진 부분 AI 및 BI의 분석결과를 나타내는 도면으로서, 부분(AI)은 모노모를 함유하고, 부분(BI)는 다이머를 함유하고 있는 것을 나타내는 도면이다.
도 23은, 대장균내에서 본 발명의 단일쇄 Fv를 코드하는 DNA를 발현시키기 위해 사용될 수 있는 발현 플라스미드의 구조를 나타내는 도면이다.
도 24는, 실시예 5.12에서 얻어진 대장균에 의해 생성된 항체 MABL-2 유래 단일쇄 Fv 폴리펩티드(polypeptid)의 조생성물의 겔여과 컬럼상의 정제결과를 나타내는 도면으로서, 각 피크는 대장균에 의해 생성된 단일쇄 Fv의 모노모 또는 다이머를 각각 나타낸 도면이다.
도 25는, 실시예 5.13에서의 아폽토시스(apoptosis) 유발효과의 결과를 나타내는 도면으로서, 대조로서 마우스 IgG 항체가 hIPA/L1210 세포의 아폽토시스를 유발하지 않는 것을 나타내는 도면(3㎛/ml의 최후농도)이다.
도 26은, 실시예 5.13에서의 아폽토시스 유발효과의 결과를 나타내는 도면으로서, CHO세포에 의해 생성된 MABL2-scFv의 다이머가 hIPA/L1210 세포의 아폽토시스를 현저하게 유발하는 것을 나타내는 도면(3㎛/ml의 최후농도)이다.
도 27은, 실시예 5.13에서의 아폽토시스 유발효과의 결과를 나타내는 도면으로서, 대장균에 의해 생성된 MABL2-scFv의 다이머가 hIPA/L1210 세포의 아폽토시스를 현저하게 유발하는 것을 나타내는 도면(3㎛/ml의 최후농도)이다.
도 28은, 실시예 5.13에서의 아폽토시스 유발효과의 결과를 나타내는 도면으로서, CHO세포에 의해 생성된 MABL2-scFv 모노머에 의해 hIAP/L1210으로의 아폽토시스 유발이 대조의 것과 동일한 레벨인 것을 나타내는 도면(3㎍/ml의 최후농도)이다.
도 29는, 실시예 5.13에서의 아폽토시스 유발효과의 결과를 나타내는 도면으로서, 대장균에 의해 생성된 MABL2-scFv 모노머의 hIAP/L1210으로의 아폽토시스 유도가 대조의 것과 동일한 레벨인 것을 나타내는 도면(3㎍/ml의 최후농도)이다.
도 30은, 실시예 5.13에서의 아폽토시스 유발효과의 결과를 나타내는 도면으로서, 대조로서 사용된 마우스 IgG 항체가, 항-FLAG 항체를 첨가한 경우에도, hIAP/L1210의 아폽토시스를 유발하지 않는 것을 나타내는 도면(3㎍/ml의 최후농도)이다.
도 31은, 실시예 5.13에서의 아폽토시스 유발효과의 결과를 나타내는 도면으로서, CHO세포에 의해 생성된 MABL2-scFv 모노머가, 항-FLAG 항체를 첨가한 경우, hIAP/L1210세포의 아폽토시스를 현저하게 유발하는 것을 나타내는 도면(3㎍/ml의 최후농도)이다.
도 32는, 인간 골수종세포주KPMM2 전이 마우스의 혈청 중 인간IgG의 양측정 결과를 나타내는 도면으로서, 마우스내 인간골수종 세포에 의해 생성된 인간 IgG의 양을 나타낸다. scFv/CHO의 다이머가 KPMM2세포의 생성을 현저하게 억제하는 것을 나타내는 도면이다.
도 33은, 종양의 이식 후, 마우스의 생존시간을 나타내는 도면으로서, scFv/CHO 다미머가 투여된 군이 생존시간이 현저하게 연장된 것을 나타내는 도면이다.
도 34는, 항체 MABL-2 유래 두개의 H쇄 V영역과 두개의 L쇄 V영역을 함유하는 재구성 폴리펩티드[sc(Fv)2]를 발현하는 발현 플라스미드의 구조를 나타내는 도면이다.
도 35는, scFv(HL형식)를 발현하는 플라스미드 구조를 나타내는 도면으로서, V영역이 펩티드 연결기 없이 [H쇄]-[L쇄] 연결 방식으로 연결되어 있는 도면이다.
도 36은, HL형 폴리펩티드의 구조 및 펩티드 연결기의 아미노산 서열을 나타내는 도면이다.
도 37은, scFv(LH형)을 발현하는 플라스미드 구조를 나타내는 도면으로서, V영역이 펩티드 연결기 없이 [L쇄]-[H쇄]의 방식으로 연결되어 있는 도면이다.
도 38은, LH형의 폴리펩티드의 구조 및 펩티드 연결기의 아미노산 서열 나타내는 도면이다.
도 39는, 실시예 6.4에서의 웨스턴 블로팅(western blotting)의 결과를 나타내는 도면으로서, 두개의 H쇄 V영역과 두개의 L쇄 V영역을 함유하는 재구성 폴리펩티드 sc(FV)2및 길이가 다른 펩티드 연결기를 갖는 MABL2-scFv가 발현되고 있는 도면이다.
도 40a 및 40b는, 실시예 6.3(1)에서 제작된 COS7세포의 배양상청을 사용하는 유동세포 분석법의 결과를 나타내는 도면으로서, MABL2-scFv 및 다른 길이의 펩티드 연결기를 갖는 sc(FV)2가 인간 IAP에 대한 높은 친화성을 갖는 것을 나타내는 도면이다.
도 41은, 실시예 6.6에서의 아폽토시스 유발효과의 결과를 나타내는 도면으로서, scFv < HL3, 4, 6, 7, LH3, 4, 6, 및 7 > 및 sc(FV)2가 hIAP/L1210세포의 세포사멸을 현저하게 유도하는 것을 나타내는 도면이다.
도 42는, 실시예 6.10에서의 항원결합성의 평가 결과를 나타내는 도면으로서, scFv<HL5>의 다이머 및 인간 IAP에 대한 높은 친화성을 갖는 sc(FV)2를 나타내는 도면이다.
도 43은, 실시예 6.11에서의 in vitro 아폽토시스 유발효과의 결과를 나타내는 도면으로서, scFv<HL5>의 다이머 및 sc(FV)2가 농도 의존성법에서 hIAP/L1210세포와 CCRF-CEM세포의 아폽토시스를 유발하는 것을 나타내는 도면이다.
도 44는, 인간 골수종 세포 전이 마우스의 혈청 중에 인간 골수종 세포주KPMM2에 의해 생성된 M단백질의 양측정의 결과를 나타낸 도면이다. scFv<HL5>의 다이머 및 sc(FV)2가 KPMM2세포의 성장을 현저하게 억제시키는 것을 나타낸다.
도 45는, 종양 이식 후 마우스의 생존시간(날짜)을 나타내는 도면으로서, scFv<HL5> 투여군의 생존시간이 현저하게 길어진 것을 나타내는 도면이다.
도 46은, 종양 이식 후 마우스의 생존시간(날짜)를 나타내는 도면으로서, sc(Fv)2투여군의 생존시간이 현저하게 길어진 것을 나타내는 도면이다.
본 발명의 목적은 Integrin Associated Protein(IAP)을 갖는 유핵혈액세포의 아폽토시스를 유발하는 특성을 향상시키고, 적혈구 응집을 일으키는 특성을 감소 또는 완전히 제거한 재구성 폴리펩티드를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 얻어진 Integrin Associated Protein(IAP)를 갖는 유핵혈액세포에 아폽토시스를 유발하는 물질을 함유하는 혈액질환용 치료제를 제공하는 것에 있다.
따라서, 본 발명은 Integrin Associated Protein(IAP)에 결합하고, IAP를 갖는 유핵혈액세포의 아폽토시스를 유발하고, 적혈구 응집을 일으키지 않는 재구성 폴리펩티드에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 새로운 형태의 항쇄 재구성 폴리펩티드에 관한 것이다.
새로운 형태의 항체는 IAP바람직하게는 인간 IAP를 갖는 유핵혈액세포의 아폽토시스를 유발하는 항체 MABL-1, 항체 MABL-2 등의 모노크로날 항체 유래 L쇄 V영역 및 H쇄 V영역을 함유하는 재구성 폴리펩티드를 함유하고, 상기 폴리펩티드는 IAP, 바람직하게는 인간 IAP를 갖는 유핵혈액세포의 아폽토시스를 유발하고, 적혈구 응집을 일으키지 않는다. 또한, 본 발명은 V영역의 아미노산 서열을 부분적으로 변화시킨 재구성 폴리펩티드도 함유된다.
또한, 본 발명은 재구성 폴리펩티드의 인간형화에 관련한 것이다. 인간형화 재구성 폴리펩티드는 인간형화 L쇄 V영역 및/또는 인간형화 H쇄 V영역을 함유한다. 구체적으로는 본 발명의 인간형화 폴리펩티드는 인간 모노크로날 항체의 L쇄 V영역유래 프레임워크 영역(FR)과 인간 모노크로날 항체의 H쇄 V영역 유래 FR과 마우스 모노크로날 항체의 H쇄 V영역 유래 CDR을 함유하는 마우스 모노크로날 항체 및/또는 인간형화 H쇄 V영역의 L쇄 V영역 유래 CDR을 함유하는 인간형화 L쇄 V영역으로 구성된다. 이 경우, FR 또는 CDR의 아미노산 서열은 삭제, 치환, 또는 첨가 등, 부분적으로 개변되어도 좋다.
또한, 본 발명은 인간 항체의 L쇄 C영역 및 마우스 모노크로날 항체의 L쇄 V영역 및/또는 인간 항체의 H쇄 C영역과 마우스 모노크로날 항체의 H쇄 V영역을 함유하는 폴리펩티드인 인간 IAP를 갖는 유핵혈액세포의 아폽토시스를 유발할 수 있는 재구성 폴리펩티드에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 상기 마우스 CDR에 상당하는 인간, 쥐, 소, 양 등과 같은마우스 이외의 다른 포유동물의 모노크로날 항체 유래 CDR, 또는 상기 CDR을 함유하는 L쇄 V영역 및 H쇄 V영역을 함유하는 폴리펩티드인 인간 IAP를 갖는 유핵혈액세포의 아폽토시스를 유발하는 재구성 폴리펩티드에 관한 것이다. 이런 CDR, L쇄 V영역 및 H쇄 V영역은 트랜스제닉 마우스(transgenic mouse)와 같은 것으로부터 제작된 인간 모노크로날 항체 유래 CDR과 상기 CDR을 함유하는 인간 모노크로날 항체로 유래 L쇄 V영역 및 H쇄 V영역을 함유해도 좋다.
본 발명은 또한, 상기 다양한 재구성 폴리펩티드를 코드하는 DNA와 DNA를 함유하는 재조합 벡터를 제조하는 유전자 공학적 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 재조합 벡터에 의해 형질전환된 숙주세포에 관한 것이다.숙주세포의 예로는 인간세포, 마우스 세포 등과 같은 포유류 세포와 대장균, 간균, 고초균, 효모 등과 같은 미생물을 들 수 있다.
본 발명은 상기 숙주를 배양하고, 그것의 배양물로부터 재구성 폴리펩티드를 추출하여 함유하는 재구성 폴리펩티드를 제조하기 위한 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 무혈청 배지에서 단일쇄 Fv를 생성하는 숙주동물세포를 배양하여, 상기 배지에서 단일쇄 Fv를 분비시키고, 상기 배지 중에 형성된 단일쇄 Fv의 다이머를 분리하는 것을 포함하는 단일쇄 Fv의 다이머를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 Integrin Associated Protein(IAP)을 갖는 유핵혈액세포의 아폽토시스를 유발하는 상기에서 얻어진 재구성 폴리펩티드 활성성분을 함유하는 혈액질환용 치료제에 관한 것이다. 상기 본 발명의 혈액질환용 치료제는 예컨대, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 성인 T-세포 백혈병, 다발성 골수종, 혼합 백혈병 및 모상세포 백혈병 등의 백혈병, 악성 림프종(호지킨 병, 비호지킨 임파종), 재생불량성 빈형, 골수이형성 증후군 및 진성다혈구증 등의 혈액질환의 치료용으로 유용하다.
본 발명의 재구성 폴리펩티드는 모노크로날 항체 유래 H쇄 V영역을 2개 및 L쇄 V영역을 2개 함유하는 것이 바람직하다. 재구성 폴리펩티드의 구조는 한개의 H쇄 V영역과 한개의 L쇄 V영역을 함유하는 단일쇄 Fv의 다이머, 또는 두개의 H쇄 V영역 및 두개의 L쇄 V영역을 함유하는 폴리펩티드이어도 좋다. 본 발명의 재구성 폴리펩티드에 있어서, H쇄 V영역 및 L쇄 V영역은 1개 이상의 아미노 산으로 구성된 펩티드 연결기를 통하여 연결되어 있는 것이 바람직하다. 상기 얻어진 재구성 폴리펩티드는 모체 항체의 가변 영역을 함유하고, 그것의 상보성결정영역 (complementarity determining region(CDR))을 유지하고, 따라서, 모체 모노크로날 항체의 동일한 특이성에 의해 항원에 결합한다.
H쇄 V영역
본 발명에 있어서, 모노크로날 항체 유래 H쇄 V영역은 IAP를 갖는 유핵혈액세포의 아폽토시스를 유발하는 모노크로날 항체의 H쇄 V영역, 또는 H쇄 V영역의 아미노산 서열을 일부 변형할 수 있고, 바람직하게는 인간 IAP를 인식하고 IAP를 갖는 유핵혈액세포의 아폽토시스를 유발하는 모노크로날 항체의 H쇄 V영역 또는 H쇄 V영역의 아미노산 서열을 부분적으로 변형시킨다. 항체 MABL-1 또는 MABL-2 유래 H쇄 V영역, H쇄 V영역의 아미노산 서열을 부분적으로 변형시킨 H쇄 V영역이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 인간 모노크로날 항체의 H쇄 V영역에서 FR 및 마우스 모노크로날 항체의 H쇄 V영역에서 CDR을 함유하는 인간형화 H쇄 V영역이다. 또한, H쇄 V영역은 재조합 기술에 의해 생성될 수 있는 마우스 모노크로날 항체의 상기 H쇄 V영역에 상당하는 인간 모노크로날 항체 유래 H쇄 V영역을 사용할 수 있다. 본 발명의 H쇄 V영역은 항원결합성을 유지하는 상기 H쇄 V영역의 단편일 수 있다.
L쇄 V영역
본 발명의 L쇄 V영역은 IAP를 갖는 유핵혈액세포의 아폽토시스를 유발하는 모노크로날 항체의 L쇄 V영역 또는 L쇄 V영역의 아미노산 서열을 일부 변형시킨 L쇄 V영역, 바람직하게는 인간 IAP를 인식하고, IAP를 갖는 유핵혈액세포의 아폽토시스를 유발하는 모노크로날 항체의 L쇄 V영역 또는 아미노산 서열을 일부 변형시킨 L쇄 V영역일 수 있다. 보다 바람직하게는 항체 MABL-1 또는 항체 MABL-2 유래 L쇄 V영역이고, 또는 그것의 L쇄 V영역의 아미노산 서열을 일부 변형시킨 L쇄 V영역이다. 더욱 바람직하게는 인간 모노크로날 항체의 L쇄 V영역 유래 FR 및 마우스 모노크로날 항체의 L쇄 V영역 유래 CDR을 함유하는 인간형화 L쇄 V영역이다. 또한, L쇄 V영역은 재조합 기술에 의해 생성될 수 있는 마우스 모노크로날 항체의 상기 L쇄 V영역에 상당하는 인간 모노크로날 항체 유래 L쇄 V영역일 수 있다. 본 발명의 L쇄 V영역은 단편을 항원 결합성을 유지시키는 L쇄 V영역의 단편일 수 있다.
상보성 결정 영역(CDR)
L쇄 및 H쇄의 각 V영역은 항원결합 부위를 형성한다. L 및 H쇄의 가변 영역은 비교적 보존된 4개의 공통 프레임 워크 영역이 3개의 초가변 또는 상보성 결정영역(CDR)에 연결되어 구성되어 있다(Kabat, E.A. et al.,"Sequences of Protein of Immunological Interest", US Dept. Health and Human Services,1983).
4개의 프레임워크 영역(FR)에 있어서, 다수의 부분은 β-시트 구조를 형성하고, 그것의 3개의 CDR은 루프를 형성한다. CDR은 경우에 따라서, β-시트 구조의 부분을 형성할 수 있다. 3개의 CDR은 FR에 의해 서로 입체적으로 가까운 위치에 유지되고, 그것은 3개의 CDR과 함께 항원결합 부위의 형성에 기여한다.
이들 CDR은 얻어진 항체의 V영역의 아미노산 서열과 알려진 항체의 V영역의 알려진 아미노산 서열의 비교를 Kabat, E.A. et al., "Sequences of Protein of Immunological Interest"의 경험식에 의해 확인할 수 있다.
단일쇄 Fv
단일쇄 Fv는 모노크로날 항체 유래의 서로 결합된 H쇄 V영역 및 L쇄 V영역을 함유하는 폴리펩티드 모노머이다. 얻어진 단일쇄 Fv는 모체 모노크로날 항체의 가변 영역을 함유하고, 그것의 상보성 결정 영역을 유지하고, 따라서, 단일쇄 Fv는 모체 모노크로날 항체와 동일한 특이성에 의해 항원에 결합한다(일본특허공개 평 11-63557). 본 발명의 단일쇄 Fv의 가변 영역 및/또는 CDR의 일부분, 또는 그것의 아미노산 서열의 일부분은 삭제, 치환 또는 첨가 등으로, 부분적으로 변화시킬 수 있다. 본 발명의 단일쇄 Fv를 구성하는 H쇄 V영역 및 L쇄 V영역은 상기와 같고, 직접 또는 연결기를 통하여, 바람직하게는 펩티드 연결기로 연결될 수 있다. 상기 단일쇄 Fv의 구성은 [H쇄 V영역]-[L쇄 V영역] 또는 [L쇄 V영역]-[H쇄 V영역]일 수 있다. 본 발명에 있어서, 단일쇄 Fv는 다이머, 트리머 또는 테트라머를 형성시키고,본 발명의 재구성 폴리펩티드를 함유한다.
단일쇄 재구성 폴리펩티드
본 발명의 단일쇄 재구성 폴리펩티드는 상술한 바와 같이 H쇄 V영역 및 L쇄 V영역을 2개 이상 함유하는 2개 이상의 H쇄 V영역 및 2개 이상의 L쇄 V영역을 2개 이상 함유한다. 상기 펩티드의 각 영역은 상기 단일쇄 재구성 폴리펩티드가 특정의 입체구조, 구체적으로 단일쇄 Fv의 다이머에 의해 형성되는 입체구조를 모방할 수 있도록 배치시킬 필요가 있다. 예컨대, V영역은 하기 방법의 순서로 배치된다:
[H쇄 V영역]-[L쇄 V영역]-[H쇄 V영역]-[L쇄 V영역]; 또는
[L쇄 V영역]-[H쇄 V영역]-[L쇄 V영역]-[H쇄 V영역],
이들 영역에 있어서, 각각 펩티드 연결기를 통하여 연결된다.
연결기
본 발명에 있어서, H쇄 V영역 및 L쇄 V영역 사이 연결을 위한 연결기는 유전 공학적 방법에 의해 도입될 수 있는 펩티드 연결기 또는 화학적 합성 연결기 중 어느 것이어도 좋다. 예를 들면, 문헌 Protein Engineering, 9(3), 299-305, 1996에 기재되어 있는 연결기를 본 발명에서 사용할 수 있다. 펩티드 연결기의 예로는;
Ser
Gly-Ser
Gly-Gly-Ser
Ser-Gly-Gly
Gly-Gly-Gly-Ser
Ser-Gly-Gly-Gly
Gly-Gly-Gly-Glky-Ser
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly
Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly
Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly
(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n및
(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)n
등을 열거할 수 있다.
여기서, n은 1 이상의 정수이다. 펩티드 연결기의 길이는 아미노산 1∼15의 범위이고, 2∼12아미노산이 바람직하고, 3∼10아미노산이 더욱 바람직하다. 이들 연결기를 도입하는 방법은 본 발명의 재구성 폴리펩티드를 코드하는 DNA의 설명에서 언급된다.
본 발명에 따른 화학 교차 연결제 등의 화학적 합성 연결기는 펩티드의 연결기용으로 통상적으로 사용되고 있는 어느 것이어도 좋다. 연결기의 예로는 N-히드록시 숙신이미드(NHS), 디숙신이미딜 슈베레이트(DSS), 비스(술포숙신이미딜)슈베레이트(BS3), 디티오비스(숙신이미딜 프로피오네이트)(DSP), 디티오비스(술포숙신이미딜 프로피오네이트)(DTSSP), 에틸렌 글리콜비스(숙신이미딜 숙시네이트)(EGS),에틸렌 글리콜비스(술포숙신이미딜 숙시네이트)(sulfo-EGS), 디숙신이미딜 타르트레이트(DST), 디술포숙신이미딜 주석산염(sulfo-DST), 디술포숙신이미딜 주석산염(sulfo-DST), bis[2-(숙신이미도 옥시카르보닐옥시)에틸]술폰(BSOCOES), 비스[2-(술포숙신이미도 옥시카르보닐옥시)에틸]술폰(술포-BSOCOES) 등을 들 수 있다. 이들은 시판되고 있다.
단일쇄 Fv의 다이머를 형성하기 위해, 숙주세포에서 생산된 단일쇄 Fv를 배양액 등의 용액 중에서 20% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 가장 바람직하게는 90% 이상 다이머화하는 데 적당한 연결기를 선택하는 것이 바람직하다. 구체적으로는 2∼12아미노산, 보다 바람직하게는 3∼10아미노산, 또는 거기에 상당하는 이외의 연결기가 바람직하다.
재구성 폴리펩티드의 제조
인간 IAP를 갖는 세포에 결합하는 재구성 폴리펩티드는 인간 IAP에 대한 모노크로날 항체 유래의 H쇄 V영역과 L쇄 V영역을 상술의 연결기를 통하여 연결하는 것에 의해 얻어진다. 단일쇄 Fv의 예는 항체 MABL-1 유래 H쇄 V영역 및 L쇄 V영역을 함유하는 MABL1-scFv와, 항체 MABL-2 유래 H쇄 V영역 및 L쇄 V영역을 함유하는 MABL2-scFv이다.
재구성 폴리펩티드의 제조를 위해, 시그날 펩티드는 폴리펩티드가 분비펩티드인 것을 소망하는 경우는 폴리펩티드의 N-터미널에 부착할 수 있다. FLAG배열과 같은 폴리펩티드의 정제를 위해 유용한 공지된 아미노산 서열은 폴리펩티드의 효율적인 정화를 위해 부착할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 항FLAG 항체에 의해 효율적으로 정제할 수 있다.
본 발명의 재구성 폴리펩티드의 제조를 위해, 단일쇄 Fv를 코드하는 DNA 또는 재구성 폴리펩티드 모노머를 코드하는 DNA 등의 재구성 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 얻을 필요가 있다. 이들 DNA는 MABL1-scFv 및/또는 MABL2-scFv의 H쇄 V영역 및 L쇄 V영역을 코드하는 DNA로부터 얻을 수 있다. 또한, 그들은 주형으로서 DNA를 사용하고, 그것의 양쪽 말단에 상당하는 프라이머쌍을 사용하는 것에 의해 상기 서열내의 요구되는 아미노산 서열을 코드하는 DNA를 증폭하는 것에 의해 얻을 수 있다.
V영역에 있어서, 아미노산 배열의 일부 변형을 소망하는 경우에는 PCR법을 사용하는 공지의 방법에 의하여, 1개 이상의 아미노산을 삭제, 치환 또는 첨가 등으로 변형된 아미노산 배열을 갖는 V영역을 얻을 수 있다. 변형인 V영역은 PCR을 사용하는 공지의 방법에 의해 얻을 수 있다. V영역에 있어서, 아미노산 서열의 일부분은 특정항원에 대한 효율적인 활성을 갖는 재구성 폴리펩티드을 제조를 위한 공지의 기술인 PCR에 의해 변형되는 것이 바람직하다.
PCR증폭을 위한 프라이머의 결정을 위해, 항체 MABL-1 및/또는 항체 MABL-2의 H쇄 및 L쇄 형으로 결정할 필요가 있다. 그러나, 보고된 바에 의하면, 그 항체 MABL-1은 k형 L쇄 및 γ1형 H쇄를 갖고, 항체 MABL-2는 k형 L쇄 및 γ2a형 H를 갖는다(일본특허공개 평 11-63557). 항체 MABL-1 및/또는 항체 MABL-2의 H쇄 및 L쇄 를 코드하는 DNA의 PCR증폭을 위해 Jones, S.T. et al.,Bio/Technology, 9, 88-89, 1999에 기재된 프라이머를 사용할 수 있다.
폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 사용하는 항체 MABL-1 및 항체 MABL-2의 L쇄 V영역의 증폭을 위해, 5'-말단 및 3'-말단 올리고뉴클레오티드 프라이머가 상기와 같이 결정된다. 동일한 방법으로 5'-말단 및 3'-말단 올리고뉴클레오티드 프라이머가 항체 MABL-1 및 항체 MABL-2의 H쇄 V영역의 증폭을 위해 결정된다.
본 발명의 실시예에 있어서, 5'-말단 프라이머는 그것의 5'-말단 근방에서 제한효소 Hinf I 절단부위를 제공하는 서열 "GANTC"를 함유하여 사용하고, 3'-말단 프라이머는 그것의 5'-말단의 근방에 XmaI 절단부위를 제공하는 뉴클레오티드 서열 "CCCGGG"를 함유하여 사용한다. 다른 제한효소 절단부위를 요구되는 DNA단편을 클로닝 벡터에서 서브클로닝을 위해 그들을 사용하는 한, 이들 부위 대신에 사용할 수 있다.
구체적으로, 설계된 PCR프라이머는 cDNA가 발현벡터에 즉시 삽입되고, 발현벡터내에서 적절하게 기능하도록, 항체 MABL-1 및 MABL-2의 V영역을 코드하는 cDAN의 5'-말단 및 3'-말단에서 적당한 뉴클레오티드 서열을 제공하여 사용한다(e.g. 본 발명은 Kozak 서열의 삽입에 의해 전사 효율이 증가하는 발명이다). 이들 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 증폭으로 얻어지는 항체 MABL-1 및 MABL-2의 V영역은 요구되는 인간 C영역을 함유하는 HEF발현벡터에 삽입한다(WO92-19759 참조). 클론화된 DNA는 적당한 벡터에 삽입되고, 자동 DNA 배열기(Applied Biosystems사 제작)를 사용하여 서열하는 것 등을 포함한 통상의 방법 중 어느 하나를 사용하여 서열할 수 있다.
펩티드 연결기와 같은 연결기를 하기 방법으로 본 발명의 재구성 폴리펩티드에 도입할 수 있다. 프라이머는 상기와 같이 H쇄 V영역 및 L쇄 V영역을 위해 프라이머를 갖는 일부 상보서열을 갖고, 연결기의 N-말단 또는 C-말단을 위한 코드를 설계한다. 그런 후, PCR방법은 요구되는 아미노산 서열 및 길이를 갖는 펩티드 연결기를 코드하는 DNA를 제조하기 위해 이들 프라이머를 사용하여 수행할 수 있다. 소망하는 펩티드 연결기를 갖는 본 발명의 재구성 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 제조하기 위해, H쇄 V영역 및 L쇄 V영역을 코드하는 DNA는 얻어진 DNA를 통해 연결될 수 있다. 재구성 폴리펩티드 중 어느 하나를 코드하는 DNA를 제작하면, 소망하는 펩티드 연결기를 갖고 있거나, 또는 갖고 있지 않는 재구성 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 연결기를 위한 다양한 프라이머를 설계하는 것에 의해 즉시 제조할 수 있고, 프라이머 및 주형으로서 상기 DNA를 사용하여 PCR을 수행하였다.
본 발명의 재구성 폴리펩티드의 각각 V영역은 종래의 기술을 사용하여 인간형화할 수 있다(예컨대, Sato,K.et al.,Cancer Res., 53, 851-856(1993)). 인간형화 Fv를 코드하는 DNA를 제작하면, 인간형화 단일쇄 Fv, 인간형화 단일쇄 Fv의 단편, 인간형화 모노크로날 항체 및 인간형화 모노크로날 항체의 단편을 종래의 방법에 따라서 용이하게 제조할 수 있다. 바람직하게는 필요에 따라서, 그것의 V영역의 아미노산 서열을 부분적을 변형시킬 수 있다.
또한, 인간의 DNA와 같은 다른 포유류 유래 DNA는 상기 언급된 마우스 유래 H쇄 V영역 및 L쇄 V영역을 코드하는 DNA를 제작하기 위해 사용되는 동일한 방법으로 제조할 수 있다. 얻어진 DNA는 다른 포유류, 특히 인간 유래 단일쇄 Fv 및 그것의 단편의 H쇄 V영역 및 L쇄 V영역과 인간 유래의 모노크로날 항체와 그것의 단편을 제작하기 위해 사용할 수 있다.
상기와 같이, 목적으로 하는 재구성 폴리펩티드의 V영역 및 재구성 인간형화 폴리펩티드 V영역을 코드하는 DNA를 제조할 때, 그것을 함유하는 발현벡터 및 벡터에 의해, 형질전환된 숙주를 통상의 방법에 따라서 얻을 수 있다. 또한, 숙주를 통상의 방법에 따라서, 배양하고, 재구성 단일쇄 Fv, 재구성 인간형화 단일쇄 Fv, 인간형화 모노크로날 항체 및 그것의 단편을 제조할 수 있다. 그들은 세포 또는 배지로부터 분리시킬 수 있고, 균일한 질량으로 정제시킬 수 있다. 이 목적을 위해, 크로마토그래피, 한외여과, 염석 및 투석, 필요에 따라서, 이들을 조합시키는 것과 같은 단백질에 대해 사용되는 통상의 분리 및 정제방법을 사용하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 재구성 단일쇄 Fv를 무혈청 배지에서 COS7 세포 또는 CHO세포, 바람직하게는 CHO세포와 같은 동물세포 배양에 의해 제조할 때, 상기 재구성 단일쇄 Fv는 배지에서 효율적으로 다이머화 된다. 상기와 같은 단일쇄 Fv의 다이머는 안정적으로 효율적으로 분리되고, 다이머 형태를 오랜기간 동안 보존할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 무혈청 배지는 재조합 단백질의 제조에 통상 사용되는 배지 중 어떤 것이어도 좋고, 그들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 인간 IAP를 갖는 세포에 결합하는 재구성 폴리펩티드의 제조를 위해, 임의의 발현계, 예컨대, 진핵세포, 예컨대 동물세포, 예컨대 수립된 포유류 세포계, 사상균 및 효모, 및 대장균 세포 등의 박테리아 세포와 같은 원핵세포를 사용할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 재구성 폴리펩티드는 COS7세포 또는 CHO세포 등과 같은 포유류 세포 중에서 발현된다.
이런 경우에 있어서, 포유류 세포 중에서 발현하기 위해 유용한 촉진제를 사용할 수 있다. 바람직하게는, 인간 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus, HCMW)전기 촉진제가 사용된다. HCMV 촉진제를 함유하는 발현벡터는 pSV2neo 유래의 HCMV-VH-HCγ1, HCMV-VL-HCK 등이 열거된다(WO92-19759참조).
또한, 본 발명에서 사용할 수 있는 포유류 중에서 유전자 발현을 위한 다른 촉진제는 레트로 바이러스, 폴리오마 바이러스, 아데노 바이러스 및 시미안 바이러스 40(SV40)유래 바이러스 프로모우터 및, 인간 폴리펩티드형상 연신률 인자-1α(HEF-1α)등의 포유류 유래 프로모우터 등을 들 수 있다. SV40프로모우터는 Mulligen, R.C.,et al.(Nature 277, 108-114(1979))의 방법에 따라서 용이하게 사용할 수 있고, HEF-1α촉진제는 Mizushima, S. et al.(Nucleic Acids Research, 18, 5322(1990))의 방법에 따라서 사용할 수도 있다.
본 발명에서 사용할 수 있는 복제기원(ori)은 SV40, 폴리오마 바이러스, 아데노 바이러스, 소 유두종 바이러스(BPA) 등으로부터 유래된 ori가 열거된다. 숙주세포계 등에 있어서 유전자 카피수의 증폭 목적을 위해, 발현벡터는 선택마커로서 포스포트랜스페라아제 APH(3')II 또는 I(neo)유전자, 티미딘 키나아제(TK)유전자, 대장균 크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스페라아제(Ecogpt)유전자 또는 디히드로폴산 환원효소(DHFR)유전자를 함유할 수 있다.
상기와 같이 제작된 재구성 폴리펩티드의 항원결합 활성은 지표로서 인간 IAP에 대한 마우스 항체, MABL-1 및 MABL-2의 결합억제능력을 사용하여 평가할 수있다. 구체적으로, 상기 활성은 지표로서 인간 IAP항원에 대한 마우스 항체 MABL-2의 결합의 농도 의존적 저해의 유무로서 평가한다.
더욱 상세하게는 본 발명의 재구성 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 함유하는 발현벡터로 형질전환된 COS7세포 또는 CHO세포 등의 동물세포를 배양시킨다. 배양된 세포 및/또는 그 배양상청, 또는 그들로부터 정제된 재구성 폴리펩티드를 사용하여, 항원에 결합하여 측정한다. 대조로서, 발현벡터만으로 형질전환된 세포의 배양 상청을 사용한다. 본 발명의 재구성 폴리펩티드의 실험시료 또는 대조의 배양상청을 인간 Integrin Associated Protein(IAP)에 발현하는 마우스 백혈병 세포 주, L1210 세포에 부가한 후, 유동세포 분석법(flow cytometry) 등의 분석을 실시하고, 그 항원 결합 활성을 평가하였다.
in vitro에서의 아폽토시스 유발 효율은 하기 방법으로 평가하였다 : 상기 재구성 폴리펩티드의 실험시료는 인간 IAP유전자가 도입된 세포에 유전자를 도입시켜 첨가하고, 그것의 세포 중에서 인간 IAP-특이적인 세포사멸의 유발을 평가하였다.
in vivo에서의 아폽토시스를 유발 효율은 하기 방법으로 평가하였다: 인간 골수종의 마우스 모델을 제작하였다. 상기 마우스에게 IAP를 갖는 유핵혈액세포에 아폽토시스를 유발하는 모노크로날 항체, 또는 본 발명의 재구성 폴리펩티드를 정맥에 투여한다. 대조군의 마우스에게는 PBS만을 투여한다. 아폽토시스 유발을 항종양 효과로서 마우스 혈청에 함유되는 인간 IgG의 변화 및 그것의 생존 기간에 기초하여 평가한다.
적혈구 응집 효과는 하기 방법으로 실험된다: 적혈구의 부유액을 건강한 제공자의 혈액으로부터 제작한다. 다른 농도의 실험시료를 부유액에 첨가하여, 인큐베이션하고, 적혈구 응집을 측정한다.
본 발명의 재구성 폴리펩티드는 2개 이상의 H쇄 V영역 및 2개 이상의 L쇄 V영역을 함유하는 것이고, 1개의 H쇄 V영역 및 1개의 L쇄 V영역을 함유하는 단일쇄 Fv의 다이머, 트리머 또는 테트라머, 또는 2개 이상의 H쇄 V영역 및 2개 이상 L쇄 V영역이 연결된 폴리펩티드 이어도 좋다. 이와 같은 구성에 기인한 펩티드는 모체 모노크로날 항체의 항원결합 부위의 인체구조를 모방하여, 그것의 우수한 항원 결합성을 유지하는 것이라 생각된다.
본 발명의 폴리펩티드는 whole IgG에 대해서 넘어서 조직 또는 종양의 유동성이 우수하고, 적혈구 응집의 부작용의 현저하게 감소되거나 발생하지 않는다. 따라서, 본 발명의 펩티드는 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 성인 T-세포 백혈병, 다발성 골수종, 혼합 백혈병 및 모상세포 백혈병 등의 백혈병, 악성 림프종(호지킨 병, 비호지킨 임파종), 재생불량성 빈형, 골수이형성 증후군 및 진성다혈구증 등의 혈액질환 치료용으로서 사용할 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 본 발의 펩티드는 RI-표시에 의해 조영제로서 사용할 수 있을 것으로도 기대된다. 펩티드의 효과는 RI-화합물 또는 독소의 첨가에 의해 강화될 수 있다.
본 발명은 하기 실시예를 참고로 더욱 상세하게 설명되지만, 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 재구성 폴리펩티드의 제작 방법의 설명은 생성 단일쇄 Fv의 예로 하기에 설명된다. 인간 IAP, MABL-1 및 MABL-2에 대한 마우스 항체는 재구성 폴리펩티드 생성의 구체예로 사용된다. 그것을 생성하는 하이브리도마스 MABL-1 및 MABL-2는 각각 National Institute of Bioscience 및 Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Minister of International Trade and Industry(1-3 Higasi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-Ken, Japan), an authorized depository for microorganisms, 1997, 9, 11에 의해 FERM BP-6100 및 FERM BP-6101로서 국제적으로 보고되고 있다.
실시예 1(인간 IAP에 대한 마우스 모노크로날 항체의 V영역을 코드하는 DNA의 클로닝)
인간 IAP, MABL-1 및 MABL-2에 대한 마우스 모노크로날 항체의 가변 영역을 코드하는 DNA는 하기와 같이 클론되었다.
1.1 메신저 RNA(mRNA)의 제작
하이브리도마 MABL-1 및 MABL-2의 mRNA는 mRNA Purification Kit(파마시아 바이오테크사 제작)를 사용하여 얻었다.
1.2 이중사슬 cDNA의 합성
이중사슬 cDNA는 Marathon cDNA Amplification Kit(CLONTECH)를 사용하여 mRNA의 약 1㎍으로부터 합성되고, 어댑터는 거기에 연결되었다.
1.3 항체의 가변 영역을 코드하는 유전자의 PCR에 의한 증폭
PCR은 Thermal Cycler(PERKIN ELMER)를 사용하여 수행되었다.
(1) MABL-1의 L쇄 V영역을 코드하는 유전자의 증폭
PCR법에 사용되는 프라이머는 어댑터의 부분서열에 대해 혼성화되는 서열번호 1에서 나타낸 Adapter Primer-1(CLONTECH), 및 마우스 카파형 Lm쇄 V영역에 대해 혼성화되는 서열번호 2에서 나타낸 MKC(Mouse Kappa Constant)프라이머 (Bio/Technology, 9, 88-89, 1991)이다.
PCR용액 50㎕는 10 ×PCR Buffer II 5㎕, 2mM MgCl2, 0.16mM dNTPs(dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP), DNA 폴리머라제 2.5유닛, AmpliTaq Gold(PERKIN ELMER), 서열번호 1의 어댑터 프라이머 0.2μM, 서열번호2의 MKC 프라이머 0.2μM 및 MABL-1 유래의 이중사슬 cDNA 0.1㎍을 함유하였다. 상기 용액은 9분 동안 최초온도 94℃에서 예열한 후, 1분 동안 94℃, 1분 동안 60℃ 및 1분 20초 동안 72℃의 이 순서로 예열시켰다. 이 온도사이클을 35번 반복한 후, 그 반응 혼합물을 72℃에서 10분간 더 가열하였다.
(2) MABL-1의 H쇄 V영역을 코드하는 cDNA의 증폭
서열번호 1에서 나타낸 어댑터 프라이머-1과 서열번호 3에서 나타낸 MHC-γ1(Mouse Heavy Constant)프라이머(Bio/Technology, 9, 88-89, 1991)를 PCR용 프라이머로서 사용하였다.
cDNA의 증폭은 MKC 프라이머의 0.2μM 대신에 NHC-γ1프라이머의 0.2μM를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1.3-(1)에 기재된 L쇄 V영역 유전자의 증폭 방법에 따라서 수행되었다.
(3) MABL-2의 L쇄 V영역을 코드하는 cDNA의 증폭
서열번호 1의 어댑터 프라이머-1 및 서열번호 2의 MKC프라이머를 PCR용 프라이머로서 사용하였다.
cDNA의 증폭은 MABL-2 유래 이중사슬 0.1㎍ 대신에 MABL-2 유래 이중사슬 cDNA 0.1㎍을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1.3-(1)에 기재된 MABL-1의 L쇄 V영역 유전자의 증폭 방법에 따라서 실시하였다.
(4) MABL-2의 H쇄 V영역을 코드하는 cDNA의 증폭
서열번호 1의 어댑터 프라이머-1 및 서열번호 4의 MHC-γ2a프라이머 (Bio/Technology, 9, 88-89, 1991)를 PCR용 프라이머로서 사용하였다.
cDNA의 증폭은 MKC 프라이머 0.2μM 대신에 MHC-γ2a프라이머 0.2μM을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1.3-(3)에 기재된 L쇄 V영역 유전자의 증폭 방법에 따라서 수행하였다.
1.4 PCR생성물의 정제
상기 기재된 PCR에 의해 증폭된 DNA 단편을 QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN)을 사용하여 정제하고, 1mM EDTA를 함유하는 10mM Tris-HCl(pH 8.0)에 용해시켰다.
1.5 연결 및 형질전환
상기와 같이 하여 제작된 MABL-1유래 마우스 카파 형 L쇄 V영역을 코드하는유전자를 함유하는 DNA단편의 약 140ng을 30mM Tris-HCl(pH 7.8), 10mM MgCl2, 10mM 디치오스레이톨, 1mM ATP 및 15℃에서 3시간 동안 T4 DNA 리가제(Promega사 제품)의 3유닛을 함유하는 완충액 중에서 pGEM-T Easy vector(Promega사 제작)의 50ng을 연결시켰다.
다음에, 반응 혼합물의 1㎕를 대장균 DH5α캄피턴트 세포(Toyobo Inc.사 제작)의 50㎛에 부가하였고, 상기 세포를 30분 동안 얼음에 넣고, 1분 동안 42℃에서 인큐베이션하고, 다시 2분 동안 얼음에 넣었다. SOC 배지(GIBCO BRL사 제작)의 100㎕에 부가하였다. 상기 대장균의 세포를 100㎍/ml의 앰피실린(SIGMA)을 함유하는 LB(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)한천배지 위에 도포하고, 37℃에서 하룻밤 배양하여, 대장균의 형질전환체를 얻었다.
상기 형질전환체를 50㎍/㎖의 앰피실린을 함유하는 LB배지의 3ml로 37℃에서 하룻밤 배양시키고, 그 플라스미드 DNA를 QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN)을 사용하여 배양물로부터 제작하였다.
하이브리도마 MABL-1유래 마우스 카파형 L쇄 V영역을 코드하는 유전자를 함유하는 얻어진 플라스미드를 pGEM-M1L로서 나타내었다.
상기와 같은 방법에 따라서, 하이브리도마 MABL-1 유래 마우스 H쇄 V영역을 코드하는 유전자를 함유하는 플라스미드를 정제시킨 DNA 단편에서 제작하고, pGEM-M1H로서 나타내었다.
하이브리도마 MABL-2유래 마우스 카파형 L쇄 V영역을 코드하는 유전자를 함유하는 플라스미드를 정제된 DNA단편으로부터 제작하고, pGEM-M2L로서 나타내었다.
하이브리도마 MABL-2유래 마우스 H쇄 V영역을 코드하는 유전자를 함유하는 플라스미드를 정제된 DNA단편으로부터 제작하고, pGEM-M2H로서 나타내었다.
실시예 2(DNA 서열)
상기 플라스미드에 있어서, 영역을 코드하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 Auto DNA 서열기(Biosystem사 제품) 및 ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit(Biosystem 사)를 사용하고, 제조업자의 프로토콜에 따라서, 결정하였다.
플라스미드 pGEM-M1L에 함유되는 마우스 항체 MABL-1로부터 L쇄 V영역을 코드하는 유전자의 뉴클레오티드 서열을 서열번호5로 나타내었다.
플라스미드 pGEM-M1H에 함유되는 마우스 항체 MABL-1로부터 H쇄 V영역을 코드하는 유전자의 뉴클레오티드 서열을 서열번호7로 나타내었다.
플라스미드 pGEM-M2L에 함유되는 마우스 항체 MABL-2로부터 L쇄 V영역을 코드하는 유전자의 뉴클레오티드 서열을 서열번호9로 나타내었다.
플라스미드 pGEM-M2H에 함유되는 마우스 항체 MABL-2로부터 H쇄 V영역을 코드하는 유전자의 뉴클레오티드 서열을 서열번호8로 나타내었다.
실시예 3(CDR의 결정)
일반적인 L쇄 및 H쇄의 V영역의 구조는 유사점을 갖고, 그 점에서 각 4개의 프레임워크는 상보성 결정 영역(CDR)과 같은 3개의 초가변영역에 의해 연결되었다.프레임워크의 아미노산 서열은 비교적 잘 보존되는 반면에, CDR의 아미노산 서열은 극히 높은 가변성을 갖고 있다(Kabat, E.A.,et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Dept. Health and Human Service, 1983).
이런 사실에 기초하여, 인간 IAP에 대한 마우스 모노크로날 항체로부터 가변 영역의 아미노산 서열은 Kabat et al.에 의해 제조된 항체의 아미노산 서열의 데이타베이스에 적용시키고, 그 상동성을 조사하였다. 상기 CDR의 영역은 표 1에 나타낸 바와 같은 상동성에 기초하여 결정되었다.
플라스미드 서열번호 CDR(1) CDR(2) CDR(3)
pGEM-M1L 5 43-58 74-80 113-121
pGEM-M1H 7 50-54 69-85 118-125
pGEM-M2L 9 43-58 74-80 113-121
pGEM-M2H 11 50-54 69-85 118-125
실시예 4(클론화 cDNA 발현의 확인(키메라 MABL-1항체 및 키메라 MABL-2항체의 제작))
4.1 키메라 MABL-1항체 발현벡터의 제작
키메라 MABL-1항체 발현벡터를 제작하기 위해, 마우스 항체 MABL-1의 L쇄 및 H쇄의 V영역을 코드하는 각각의 cDNA클론, pGEM-M1L 및 pGEM-M1H을 PCR법에 의해 개변시키고, HEF 발현벡터(WO92/19759)로 도입시켰다.
L쇄 V영역을 위한 전방 프라이머 MLS(서열번호13)와 H쇄 V영역을 위한 전방 프라이머 MHS(서열번호15)를 각 V영역의 리더 서열의 최초를 코드하는 DNA에 혼성화하고, Kozak consensus sequence(J.Mol.Biol.,196, 947-950, 1987) 및 HindIII 제한효소부위를 함유하도록 설계하였다. L쇄 V영역을 위한 후방 프라이머 MLAS(서열번호16)와 H쇄 V영역을 위한 후방 프라이머 MHAS(서열번호17)를 J영역의 말단을 코드하는 DNA를 혼성화하고, 스플라이스 도너 서열 및 BamHI 제한효소부위를 함유하도록 설계하였다.
10×PCR Buffer II 10㎕, 2mM MgCl2, 0.16mM dNTPs(dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP), DNA폴리머라제 AmpliTaq Gold 5 유닛, 각각의 프라이머 0.4μM 및 주형 DNA(pGEM-M1L 또는 pGEM-M1H) 8ng을 함유하는 PCR 용액 100㎕를 처음 온도 94℃에서 9분 동안 예열하고, 이어서 94℃에서 1분 동안, 60℃에서 1분 동안, 72℃에서 1분 20초 동안 이 순서로 가열하였다. 이 온도사이클을 35회 반복한 후, 상기 반응 혼합물을 72℃에서 10분 동안 더 가열하였다.
PCR생성물을 QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN사 제작)을 사용하여 정제한 후, HindIII 및 BamHI로 소화하였다. L쇄 V영역에서의 생성물을 HEF 발현벡터로 클론화시키고, HEF-k 및 H쇄 V영역에서의 생성물을 HEF표현벡터, HEF-γ로 클론화시켰다. DNA 서열 후, 조정 DNA 서열을 갖는 DNA단편을 함유하는 플라스미드를 각각 HEF-M1L 및 HEF-M1H로서 나타내었다.
4.2 키메라 MABL-2 항체 발현벡터의 제작
cDNA의 변형 및 클로닝은 주형 DNA로서 pGEM-M1L 및 pGEM-M1H 대신에 pGEM-M2L 및 pGEM-M2H를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 4.1에 기재된 방법과 동일하게 수행하였다. DNA 서열 후, 조정 DNA 서열을 갖는 DNA단편을 함유하는 플라스미드를 각각 HEF-M2L 및 HEF-M2H로서 나타내었다.
4.3 COS7세포로의 트랜스펙션
상기 발현벡터는 상기 키메라 MABL-1 및 MABL-2항체의 일시적 발현을 관찰하기 위해 COS7세포에서, 실험하였다.
(1) 키메라 MABL-1항체를 위한 유전자를 갖는 트랜스펙션
COS7 세포를 Gene Pulser 장치(BioRad사 제품)을 사용하여 일렉트로포레이션에 의해 HEF-M1L 및 HEF-M1H벡터로 동시 형질전환 시켰다. 각 DNA(10㎍) 및 1×107세포/ml를 갖는 PBS 0.8ml를 큐벳으로 부가하였다. 상기 혼합물은 전기용량 1.5kV, 25μF에서 펄스로 처리하였다.
실온에서 10분 동안 복원한 후, 일렉트로포레이션 처리된 세포를 10% γ-글루블린 프리 소태아 혈청을 함유하는 DMEM배양 배지(GIBCO BRL사 제작)로 이식시켰다. 72시간 동안 배양한 후, 그 상청을 수집하고, 원심분리에 의해 세포 파편을 제거하여 회수하였다.
(2) 키메라 MABL-2항체를 위해 코드하는 유전자를 갖는 트랜스펙센
키메라MABL-2항체를 위해 코드하는 유전자를 갖는 COS7세포로의 동시형질 전환은 HEF-M1L과 HEF-M1H벡터를 대신해서 HEF-M2L과 HEF-M2H벡터를 사용한 점을 제외하고, 실시예 4.3-(1)에 기재된 것과 동일한 방법으로 수행하였다.
4.4 유동세포 분석법(Flow Cytometry)
유동세포 분석법을 항원으로의 결합을 측정하기 위해서, 상기 COS7 세포의 배양상청을 사용하여 수행하였다. 키메라 MABL-1 항체를 발현하는 COS7세포 또는키메라 MABL-2항체를 발현하는 세포의 배양상청 또는 대조로서 인간 IgG항체(SIGMA사 제작)를 인간 IAP를 발현하는 마우스 백혈병 세포주L1210의 세포 4×105세포를 첨가하고, 얼음에서 인큐베이션 하였다. 세정 후, FITC 표식된 항인간 IgG항체(Cappel사 제작)를 거기에 부가하였다. 인큐베이션 및 세정 후, FACScan장치(BECTON DICKINSON사 제작)를 사용하여 그것의 형광강도를 측정하였다.
키메라MABL-1 및 키메라MABL-2항체는 인간 IAP를 발현하는 L1210세포에 특이적으로 결합하기 때문에, 이들 키메라 항체가 마우스 모노크로날 항체 MABL-1 및 MABL-2의 각각의 V영역의 올바른 구조를 갖는 것이 확인되었다(도 1~3).
실시예5 (항체 MABL-1 및 항체 MABL-2의 재구성 단일쇄 Fv(scFv)의 제작)
5.1 항체 MABL-1의 재구성 단일쇄 Fv의 제작
항체 MABL-1의 재구성 단일쇄 Fv를 하기와 같이 제작하였다. 항체 MABL-1의 H쇄 V영역과 L쇄 V영역, 및 연결기는 각각 PCR법에 의해 증폭되고, 연결되어서, 항체 MABL-1의 재구성 단일쇄 Fv를 제작하였다. 상기 제작 방법을 도 4에 모식적으로 나타낸다. 6개의 프라이머(A-F)를 항체 MABL-1의 단일쇄 Fv의 제작을 위하여 사용하였다. 프라이머 A, C 및 E는 센스서열을 갖고, 프라이머 B, D 및 F는 안티센스서열을 갖는다.
H쇄 V영역을 위한 전방 프라이머 VHS(프라이머 A, 서열번호 17)는 H쇄 V영역의 N말단을 코드하는 DNA에 혼성화되고, NcoI제한효소 인식부위를 함유하도록 설계되었다. H쇄 V영역을 위한 후방 프라이머 VHAS(프라이머 B, 서열번호18)는, H쇄 V영역의 C말단을 코드하는 DNA에 혼성화되고, 상기 연결기와 겹치도록 설계하였다.
연결기를 위한 전방 프라이머 LS(프라이머 C, 서열번호 19)는, 연결기의 N말단을 코드하는 DNA에 혼성화되고, 또한 H쇄 V영역의 C말단을 코드하는 DNA와 겹치도록 설계하였다. 연결기를 위한 후방 프라이머 LAS(프라이머 D, 서열번호20)는, 연결기의 C말단을 코드하는 DNA에 혼성화되고, 또한 L쇄 V영역의 N단말을 코드하는 DNA와 겹치도록 설계하였다.
L쇄 V영역을 위한 전방 프라이머 VLS(프라이머 E, 서열번호 21)는 연결기의 C말단을 코드하는 DNA에 혼성화되고, 또한 L쇄 V영역의 N말단을 코드하는 DNA에 겹치도록 설계하였다. L쇄 V영역을 위한 후방 프라이머 VLAS-FLAG(프라이머F, 서열번호 22)는 L쇄 V영역의 C말단을 코드하는 DNA에 혼성화되고, 또한 FLAG펩티드를 코드하는 서열(Hopp, T. P. et al., Bio/Technology, 6, 1204-1210, 1988), 2개의 종결코돈 및 EcoRI제한효소 인식부위를 갖도록 설계하였다.
제1PCR단계에 있어서 3개의 반응 A-B, C-D 및 E-F를 수행하고, 또한 그것의 PCR생성물을 정제하였다. 제1PCR단계로부터 얻어진 3개의 PCR생성물을 그들의 상보성에 의해 조합시켰다. 다음에, 상기 프라이머 A 및 F를 부가하고, 항체 MABL-1의 재구성 단일쇄 Fv를 코드하는 DNA 전체 길이를 확장시켰다(두번째 PCR법). 제1PCR법에 있어서, 항체 MABL-1의 H쇄 V영역을 코드하는 플라스미드 pGEM-M1H(실시예 2참조), Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser(서열번호 23)를 함유하는 연결기 영역을 코드하는 DNA를 함유하는 플라스미드 pSC-DP1(Huston, J.S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5879-5883, 1988) 및항체 MABL-1(실시예 2참조)의 L쇄 V영역을 코드하는 상기 플라스미드 pGEM-M1L을 각각 주형으로서 사용하였다.
제1PCR단계를 위한 용액 50㎕는 10×PCR Buffer II 5㎕, 2mM MgCl2, 0.16mM dNTPs, DNA 폴리머라제 2.5유닛, AmpliTaq Gold(PERKIN ELMER사 제작), 각각의 프라이머 0.4μM 및 각각의 주형 DNA 5ng를 함유한다. PCR용액을 최초의 온도 94℃에서 9분 동안 예열시키고, 이어서 94℃에서 1분 동안, 65℃에서 1분 동안 및 72℃에서 1분 20초 동안의 이 순서로 가열하였다. 이 온도 사이클을 35회 반복한 후, 상기 반응 혼합물을 72℃에서 7분 동안 더 가열하였다.
PCR생성물 A-B(371bp), C-D(63bp) 및 E-F(384bp)를 QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN사 제품)을 사용하여 정제시키고, 제 2PCR방법으로 조합시켰다. 제2PCR법에 있어서, 제1PCR 생성물A-B 120ng, PCR 생성물C-D 20ng 및 PCR 생성물E-F 120ng, 10×PCR Buffer II 10㎕, 2mM MgCl2, 0.16mM dNTPs, DNA 폴리머라제 AmpliTaq Gold(PERKIN ELMER사 제작)5유닛을 함유하는 PCR용액 98㎕를 최초 온도 94℃에서 8분 동안 예열한 후, 94℃에서 2분 동안, 65℃에서 2분동안, 72℃에서 2분 동안의 이 순서로 가열하였다. 이 온도사이클을 2번 반복한 후, 각 프라이머 A 및 F 0.4μM를 상기 반응에 각각 부가하였다. 상기 혼합물을 최초 온도 94℃에서 1분 동안 예열한 후, 65℃에서 1분 동안, 72℃에서 1분 20초 동안의 이 순서로 가열하였다. 이 온도 사이클을 35회 반복한 후, 상기 반응 혼합물을 72℃에서 7분 동안 더 가열하였다.
제 2PCR법에 의해 생성된 843bp의 DNA 단편을 정제시키고, NcoI 및 EcoRI에 의해 소화시켰다. 상기 얻어진 DNA파편을 pSCFVT7 벡터로 클론화하였다. 상기 발현벡터 pSCFVT7는 대장균 페리플라즘 발현계를 위해 적당한 pelB 시그날 서열을 함유한다(Lei,S.P.,et al.,J. Bacteriology, 169, 4379-4383, 1987). DNA 서열 후, 항체 MABL-1의 재구성 단일쇄 Fv의 정정 아미노산 서열을 코드하는 DNA단편을 함유하는 상기 플라스미드 "pscM1"으로 나타낸다(도5 참조). 플라스미드 pscM1 내에 함유된 뉴클레오티드 서열 및 항체 MABL-1의 재구성 단일쇄 Fv의 아미노산 서열은 서열번호24으로 나타내어진다.
상기 pscM1벡터는 포유동물 세포 중의 항체 MABL-1의 재구성 단일쇄 Fv를 발현하는 벡터를 제작하는 PCR법에 의해 개변되었다. 얻어진 DNA단편은 pCH01 발현벡터로 도입되었다. 이 발현벡터 pCH01은 항체 유전자를 제거하기 위해, EcoRI 및 SmaI를 갖는 DHFR-ΔE-rvH-PM1-f(WO92/19759)로 소화하고, 거기에 EcoRI-NotI-BamHI어댑터를 연결하는 것에 의해 조합되었다.
PCR을 위한 전방 프라이머로서, 서열번호 26에 나타낸 Sal-VHS프라이머는 H쇄 V영역의 N-말단을 코드하는 DNA에 혼성화되고, SalI제한 효소 인식 부위를 함유하도록 설계된다. PCR을 위한 후방 프라이머로서, 서열번호27에서 나타낸 FRH1 anti 프라이머는 제1프레임워크 서열의 말단을 코드하는 DNA에 혼성화되도록 설계된다.
10×PCR Buffer II 10㎕, 2mM MgCl2, 0.16mM dNTPs, DNA 폴리머라제 5유닛,AmpliTaq Gold, 각각의 프라이머 0.4μM 및 주형 DNA 8ng를 함유하는 PCR용액 100㎕를 최초 온도 95℃에서 9분 동안 예열시키고, 이어서 95℃에서 1분 동안, 60℃에서 1분 동안 및 72℃에서 1분 20초동안의 이 순서로 가열하였다. 이 온도 사이클을 35회 반복한 후, 상기 반응 혼합물을 72℃에서 7분 동안 더 가열하였다.
PCR생성물을 QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN사 제품)을 사용하여 정제시키고, SalI 및 MboII에 의해 소화되고, 항체 MABL-1의 재구성 단일쇄 Fv의 N-말단을 코드하는 DNA단편이 얻어진다. 상기 pscM1 벡터는 MboII 및 EcoRI에 의해 소화되고, 항체 MABL-1의 재구성 단일쇄 Fv의 C-말단을 코드하는 DNA단편을 얻었다. 상기 Sal1-MboII DNA단편 및 MboII-EcoRI DNA단편을 pCH01-Igs벡터로 클론화 되었다. DNA 서열 후, 소망되는 DNA 서열을 함유하는 플라스미드는 "pCHOM1"으로 나타내었다(도6 참조). 발현벡터 pCH01-Igs는 포유동물 세포에 있어서 분비발현계를 위해 저당한 마우스 IgG1 시그날 서열을 함유한다(Nature, 322, 323-327, 1988). 상기 플라스미드 pCHOM1에 함유된 뉴클레오티드 서열 및 항체 MABL-1의 재구성 단일쇄 Fv의 아미노산 서열은 서열번호28으로 나타내어진다.
5.2 항체 MABL-2의 재구성 단일쇄 Fv의 제작
항체 MABL-2의 재구성 단일쇄 Fv를 상기 실시예 5.1에 따라서 제작하였다. 제1PCR단계에 있어서는 pGEM-M1H 대신에 MABL-2의 H쇄 V영역을 코드하는 플라스미드 pGEM-M2H(실시예 2참조), 및 pGEM-M1L 대신에 MABL-2의 L쇄 V영역을 코드하는 플라스미드 pGEM-M2L(실시예 2참조)을 사용하고, 항체 MABL-2의 단일쇄 Fv의 소망되는 아미노산 서열을 코드하는 DNA단편을 함유하는 플라스미드 pscM2를 얻었다.상기 플라스미드 pscM2에 함유된 뉴클레오티드 서열 및 항체 MABL-2의 재구성 단일쇄 Fv의 아미노산 서열은 서열번호30으로 나타내어진다.
상기 pscM2벡터는 PCR법에 의해 개변되고, 항체 MABL-2의 재구성 단일쇄 Fv의 정정 아미노산 서열을 코드하는 DNA 단편을 함유하는 포유동물 세포에 있어서, 발현 을 위한 pCHOM2 벡터를 제작하였다. 플라스미드 pCHOM2에 함유되는 뉴클레오티드 서열 및 항체 MABL-2의 재구성 단일쇄 Fv의 아미노산 서열은 서열번호32으로 나타내어진다.
5.3 COS7세포로의 트랜스펙션
pCHOM2 벡터는 COS7세포에서 실험되고, 항체 MABL-2의 재구성 단일쇄 Fv의 일시적 발현을 관찰하였다.
상기 COS7세포는 Gene Pulser 장치(BioRad사 제품)를 사용하여 일렉트로포레이션으로 pCHOM2에 의해 형질전환되었다. DNA(10㎍) 및 1×107세포/ml를 갖는 PBS 0.8ml를 큐벳으로 부가하였다. 상기 혼합물은 전기용량 1.5kV, 25μF에서 펄스로 처리되었다.
실온에서 10분 동안 복원한 후, 일렉트로포레이션 처리된 세포를 10%소태아 혈청을 함유하는 IMDM배양 배지(GIBCO BRL사 제작)에서 형질전환시켰다. 72시간 동안 배양한 후, 그 상청을 수집하고, 원심분리에 의해 세포 파편을 제거하여 회수하였다.
5.4 COS7 세포의 배양상청 중에 항체 MABL-2의 재구성 단일쇄 Fv의 검출
pCHOM2 벡터에 의해 형질전환된 COS7세포의 배양 상청 중에서 항체 MABL-2의 단일쇄 FV의 존재를 웨스턴 블로팅 법(Western Blotting Method)에 의해 확인하였다.
pCHOM2 벡터에 의해 형질전환된 COS7세포의 배양 상청 및 대조로서 pCHO1에 의해 형질전환된 COS7세포의 배양 상청을 SDS전기영동을 수행하고, REINFORCED NC막(Schleicher&Schuell사 제작)에 전사시켰다. 상기 막을 5%탈지우유(Morinaga Nyu-gyo사 제작)로 블로킹하고, 0.05% Tween 20-PBS로 세정하고, 항FLAG 항체(SIGMA사 제작)를 혼합하였다. 상기 막을 실온에서 인큐베이션하고, 세정하고 알칼리 포스파타제 결합 마우스IgG항체(Zymed사 제작)로 혼합하였다. 실온에서 인큐베이션 및 세정한 후, 기질용액(Kirakegaard Perry Laboraories)을 첨가하여, 발색시켰다(도7)
FLAG-펩티드-특정 단백질은 상기 pCHOM2 벡터 도입 COS7 세포의 배양 상청 중에서만 검출되었고, 이렇게 하여, 항체 MABL-2의 재구성 단일쇄 Fv는 이 배양상총 중에서 분비되는 것임을 확인하였다.
5.5 유동세포 분석법
유동세포 분석법은 항원으로의 결합을 측정하기 위해서, 상기 COS7의 세포 배양상청을 이용하여 수행하였다. 항체 MABL-2의 재구성 단일쇄 Fv를 발현하는 COS7세포의 배양 상청 또는 대조로서 pCHO1에 의해 형질전환된 COS7세포의 배양상청을 인간 Integrin Associate Protein(IAP)을 발현하는 마우스 백혈병 세포주L1210 또는 대조로서 pCOS1 벡터를 형질전환시킨 세포주 L1210의 2×105세포를 부가하였다. 얼음에서 인큐베이션하고, 세정 후, 마우스 항-FLAG 항체(SIGMA사 제작)를 부가하였다. 다음에, 상기 세포를 인큐베이션 및 세정하였다. 이어서, FITC표시 항-마우스 IgG항체(BECTON DICKINSON)를 거기에 부가시키고, 상기 세포를 다시 인큐베이션 및 세정시켰다. 그 후에, 형광강도를 FACScan장치(BECTON DICKINSON사 제작)를 사용하여 측정하였다.
항체 MABL-2의 단일쇄 Fv는 인간 IAP를 발현하는 L1210세포에 특이적으로 결합하기 때문에, 항체 MABL-2의 재구성 단일쇄 Fv는 인간 Integrin Associated Protein(IAP)대하여, 친화성을 갖는 다는 것이 확인되었다(도 8-11참고)
5.6 경쟁적 효소면역학적 검정법(Competitive ELISA)
항체 MABL-2의 재구성 단일쇄 Fv의 결합 활성을 항원으로의 마우스 모노크로날의 결합에 대한 저해활성을 기준으로 측정하였다.
항 1㎍/ml로 조정된 항-FLAG 항체를 96-웰플레이트의 각 웰에 부가하고, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이트하였다. 세정 후, 블로킹을 1%BSA-PBS로 수행하였다. 실온에서, 인큐베이션 및 세정한 후 분비형 인간 IAP 항원 유전자(서열번호34)를 도입한 COS7세포의 배양 상청을 PBS로 2배 희석하고, 각 웰에 부가하였다. 실온에서 인큐베이트 및 세정 후, 100ng/ml로 조정한 비오틴화 MABL-2 항체 50㎕와 항체 MABL-2의 재구성 단일쇄 Fv를 표현하는 COS7세포의 희석된 상청액 50㎕의 혼합물을 각 웰에 부가하였다. 실온에서 인큐베이트 및 세정한 후, 알카리 포스파타제 결합스트렙토아비딘(Zymed사 제작)을 각 웰에 부가하였다. 실온에서 인큐베이트 및 세정한 후, 상기 기질용액(SIGMA 제작)을 부가하고, 각 웰 중의 상기 반응 혼합물의 흡광도를 405nm에서 측정하였다.
그 결과, 항체 MABL-2의 재구성 단일쇄 Fv(MABL2-scFv)는 대조로서 pCHOI도입 COS7세포 배양상청에 비교하여, 명백하게 농도 의존적으로 마우스 항체 MABL-2의 인간 IAP항원으로의 결합을 저해하였다(도 12). 따라서, 항체 MABL-2의 재구성 단일쇄 Fv는 마우스 모노크로날 항체 MABL-2에서 각 V영역의 정정 구조를 갖는 것이라 생각된다.
5.7 in vitro에서의 아폽토시스 유발효과
항체 MABL-2의 재구성 단일쇄 Fv의 아폽토시스 유발작용은 인간 IAP유전자로 트렌스펙션된 L1210세포, 대조로서 pCOS1 벡터로 트랜스펙션된 L1210세포 및 CCRF-CEM세포를 사용한 Annexin-V염색(Boehringer Mannheim)에 의해 검사하였다.
상기 각 세포의 1×105세포를 항체 MABL-2의 재구성 단일쇄 Fv를 발현하는 COS7세포의 배양 상청 또는 대조로서 pCHO1벡터로 트랜스펙션된 COS7세포의 배양 상청을 최종 농도 50%로 부가하고, 그 혼합물을 24시간 동안 배양하였다. 그런 후, Annexin-V염색을 수행하였고, 그 형광강도를 FACScan 장치(BECTON DICKINSON사 제작)를 사용하여 측정하였다.
Annexin-V염색의 결과를 각각 도 13∼18에 나타내었다. 왼쪽 아래 영역에 있는 도트는 살아있는 세포를 나타내고, 오른쪽 아래 영역의 도트는 아폽토시스 초기의 세포를 나타내며, 오른쪽 위의 영역에 있는 도트는 아폽토시스 후기의 세포를 나타낸다. 그 결과, 항체 MABL-2의 재구성 단일쇄 Fv(MABL2-scFv)는 L1210세포에 있어서, 인간IAP항원 특이적으로 현저하게 세포의 사멸을 유발시켰고(도13∼16) CCRF-CEM세포에 있어서도, 대조에 비교하여 현저하게 세포의 사멸을 유발시켰다(도 17∼18).
5.8 CHO세포에 있어서의 단일쇄 Fv유래 MABL-2의 발현
CHO세포를 항체 MABL-2 유래 단일쇄 Fv(폴리펩티드)를 계속 발현하는 CHO세포주를 수립하는 pCHOM2로 트랜스펙션시켰다.
CHO세포를 Gene Pulser 장치(BioRad사 제작)를 사용하여 일렉트로포레이션에 의해 pCHOM2벡터로 형질전환시켰다. DNA(10㎍) 및 CHO 세포(1×107세포/ml)를 갖는 PBS 0.7ml의 혼합물을 큐벳으로 부가하였다. 상기 혼합물은 전기용량 1.5kV, 25μF에서 펄스로 처리하였다. 실온에서 10분 동안 복원한 후, 일렉트로포레이션 처리된 세포를 10%소태아 혈청을 함유하는 무헥산 α-MEM배양 배지(GIBCO BRL사 제작)에 부가하여, 배양하였다. 얻어진 클론에 있어서, 소망되는 단백질의 발현을 SDS-PAGE에 의해 확인하고, 높은 발현 레벨을 갖는 클론을 항체 MABL-2 유래 단일쇄 Fv를 생성하는 세포주로서 선택하였다. 세포주를 10nM 메토트렉사이트(SIGMA사 제작)를 함유하는 무혈청 배지 CHO-S-SFM II(GIOBCO BRL사 제작)에서 배양시켰다. 그런 후, 배양 상청을 수집하고, 원심분리에 의해 세포 파편을 제거하여 회수하였다.
5.9 CHO세포에서 생성된 단일쇄 Fv 유래 MABL-2의 정제
실시예 5.8에서 얻어진 단일쇄 Fv발현 CHO세포주의 배양 상청을 인공투석용 카트리지(PAN130SF, ASAHI MEDICALS)를 사용하여 20배까지 농축하였다. 농축액은 -20℃에서 보존하고, 정제시 해동하였다.
CHO세포의 배양 상청으로부터 단일쇄 Fv의 정제는, 3종류의 크로마토그래피, 즉, Blue-sepharose, 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite) 및 겔 여과를 사용하여 수행하였다.
(1)Blue-sepharose 칼럼 크로마토그래피
배양상청의 농축액을 20mM초산 완충액(pH6.0)으로 10배 희석하고, 원심분리하여 불용성 물질을 제거하였다(10000 ×rpm, 30분). 상청을 동일한 완충액으로 평형화한 Blue-sepharose 칼럼(20ml)에 첨가하였다. 동일한 완충액으로 칼럼을 세정한 후, 동일한 완충액내의 NaCl농도를 0.1, 0.2, 0.3, 0.5 및 1.0M까지 단계적으로 높임으로써, 칼럼에 흡착된 단백질을 용출하였다. SDS-PAGE에 의해 통과부분 및 각 용출부분을 분석하였다. 단일쇄 Fv가 확인된 부분(0.1∼0.3M NaCl용출부분)을 모아서, CentriPrep-10(AMICON)을 사용하여 약 20배까지 농축하였다.
(2)하이드록시아파타이트
(1)에서 얻어진 농축액을 10mM 인산 완충액(pH 7.0)으로 10배 희석하고, 하이드록시아파타이트 칼럼(20ml, BIOARD)에 첨가하였다. 상기 칼럼은 10mM 인산 완충액(pH 7.0)의 60ml로 세정하였다. 그 후, 컬럼 내에서 흡수된 단백질을 인산 완충액 농도를 200mM까지 직선적으로 높임으로써, 용출시켰다(도 19 참조). SDS-PAGE에 의해 각 부분을 분석한 결과, 부분A 및 부분B에 단일쇄 Fv가 확인되었다.
(3)겔 여과
(2)의 부분A 및 B를 각각 CentriPrep-10으로 농축하고, 0.15M NaCl을 함유하는 20mM 초산 완충액(pH 6.0)으로 평형화한 TSKgelG3000SWG 칼럼(21.5 ×600mm)에 첨가하였다. 크로마토그램을 도 20에 나타낸다. 얻어진 부분을 SDS-PAGE로 분석한 결과, 모든 주요피크(AI 및 BI)가 목적으로 하는 단일쇄 Fv인 것을 확인하였다. 겔 여과 분석결과, 부분A에서는 외관상의 분자량 약 36kD, 부분B에서는 76kD로 용출하였다. 정제된 단일쇄 Fv(AI, BI)를 15% SDS 폴리아크릴아미드 겔로 분석하였다. 샘플을 환원제 첨가, 비첨가로 처리하여, Laemmli의 방법에 따라서 전기영동을 수행하였다. 영동 후, 단백질을 Coomassie Brilliant Blue 염색하였다. 도 21에 나타내는 바와 같이, AI, BI 전부 환원제의 첨가의 유무에 관계없이, 외관상 분자량 약 35kD로 단일결합을 부여하였다. 이상의 결과로부터, AI는 단일쇄 Fv의 단량체이고, BI는 단일쇄 Fv의 비공유결합성 다이머라 생각된다. 부분AI 및 BI를 TSKgel G3000SW 칼럼(7.5 ×60mm)을 사용한 겔 여과에 의해 분석한 결과, 상기 모노모의 피크는 부분AI에 있어서만 검출되고, 상기 다이머의 피크는 부분B1에 있어서만 검출되었다(도 22참조). 다이머 부분(부분BI)은, 전체 단일쇄 Fv의 약 4%이었다. 이 다이머 부분에 있어서, 다이머의 90%이상은 4℃에서 1개월 이상 안정적으로 유지되었다.
5.10 대장균 세포에서의 항체 MABL-2 유래 단일쇄 Fv를 발현하는 벡터의 구축
pscM2 벡터는 대장균 세포내에 있어서, 항체 MABL-2 유래 단일쇄 Fv를 효율적으로 발현하는 벡터를 제작하기 위해, PCR법에 의해 변형되었다. 얻어진 DNA단편을 pSCFVT7 발현벡터에 도입하였다.
PCR용 전방 프라이머로서 서열번호 36로 나타내어지는 Nde-VHSm02 프라이머는 H쇄 V영역의 N말단을 코드하는 DNA에 혼성화되고, 개시코돈 및 NdeI제한효소인식부위를 함유하도록 설계된다. PCR용 후방 프라이머로서, 서열번호 37에 나타내어지는 VLAS프라이머는 L쇄 V영역의 C말단을 코드하는 DNA에 혼성화되고, 2개의 정지코돈 및 EcoRI제한효소 인식부위를 함유하도록 설계된다. 상기 전방 프라이머 Nde-VHSm02는 대장균에서 효율적으로 발현하기 위한 H쇄 V영역의 N-말단을 코드하는 DNA를 혼성화하는 부분에 있어서, 5지점의 변이를 포함한다.
10×PCR Buffer #1 10㎕, 1mM MgCl2, 0.2mM dNTPs, KOD DNA 폴리머라제 5유닛(TOYOBO사 제작), 각 프라이머1μM 및 주형 DNA(pscM2) 100ng을 함유하는 PCR용액 100㎕를 98℃에서 15초, 65℃에서 2초, 및 74℃에서 30초 동안을 이 순서로 가열하였다. 이 온도 사이클을 25회 반복하였다.
PCR생성물을 QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN사 제작)을 사용하여 정제시키고, NdeI 및 EcoRI로 소화시킨 후, 얻어진 DNA단편은 pelB시그날 서열이 NdeI 및 EcoRI로 소화되는 것에 의해 제거되고 있는 pSCFVT7벡터로 클론화되었다. DNA 서열 후, 소망하는 DNA 서열을 갖은 DNA파편을 함유하여 얻어지는 상기 플라스미드는 "pscM2DEm02"라 나타내어진다(도 23참조). 상기 뉴클레오티드 서열 및 플라스미드 pscM2DEm02에 있어서, 함유된 항체 MABL-2 유래 단일쇄 Fv의 아미노산 서열을 서열번호38로 나타낸다.
5.11 대장균 세포에 있어서, 항체 MABL-2유래 단일쇄 Fv의 발현
대장균 BL21(DE3)pLysS(STRATAGENE사 제작)는 항체 MABL-2유래 단일쇄 Fv를 표현하는 대장균의 균주를 얻기 위해 pscM2DEm02로 형질전환되었다.
얻어진 클론은 SDS-PAGE를 사용하여 소망하는 단백질의 발현을 위해 검사되고, 높은 발현 레벨을 갖는 클론은 항체 MABL-2 유래 단일쇄 Fv를 생성하는 균주로서 선택되었다.
5.12 대장균 세포에서, 생성된 항체 MABL-2 유래 단일쇄 Fv의 정제
형질전환에 의해 얻어진 대장균의 단일 콜로니(single colony)를 28℃에서 7시간 동안 LB배지 3ml에서 배양시키고, 이어서, LB배지 70ml에서 28℃로 하룻밤 배양하였다. 이 예비배양(pre-culture)을 LB배지의 7L로 이식시키고, 28℃에서 단지 발효기(Jar-fermenter)를 사용하여 300rpm으로 교반하여 배양하였다. O.D.=1.5의 흡수일 때, 상기 박테리아는 1mM IPTG로 유발된 후, 3시간 동안 배양되었다.
배양액을 원심분리(10000×g, 10분)하고, 침전된 박테리아를 회수하였다. 상기 박테리아에 5mM EDTA, 0.1M NaCl 및 1% Triton X-100를 함유하는 50mM Tris-HCl 완충액(pH 8.0)을 부가하고, 상기 박테리아를 초음파(out put:4, duty cycle:70%, 1분×10회)에 의해 분리시켰다. 분리된 박테리아의 상청은 봉입체를 침전시키기 위해 원심분리되었다(12000×g, 10분). 분리된 봉입체를 5mM EDTA, 0.1M NaCl 및 4% Triton X-100를 함유하는 50mM Tris-HCl 완충액(pH 8.0)에 혼합시키고, 초음파(out put:4, duty cycle:50%, 30초×2회)로 처리하고, 침전체로서 소망되는 단백질을 분리하고, 상청 중에 함유된 오염 단백질을 제거하기 위해, 또 원심분리(12000×g,10분)하였다.
소망하는 단백질을 함유하는 봉입체는 6M Urea, 5mM EDTA 및 0.1M NaCl을 함유하는 50mM Tris-HCl 완충액(pH 8.0)에 용해되었고, 높은 분자량을 갖는 연결된 단일쇄 Fv를 제거하기 위해, 5ml/분의 유속으로 4M Urea, 5mM EDTA, 0,1M Nacl 및 10mM 메르캅토에탄올을 함유하는 50mM Tris-HCl 완충액(pH 8.0)으로 평형된 Sephacryl S-300겔 여과 컬럼에 부가되었다. 상기 얻어진 부분을 SDS-PAGE로 분석하였고, 단백질의 높은 순도를 갖는 부분을 O.D280=0.25까지 겔 여과를 사용하여 완충액으로 희석하였다. 그런 후, 상기 부분을 5mM EDTA, 0.1M NaCl, 0.5 M Arg, 환원된 형태인 2mM 글루타치온 및 단백질을 재결합하기 위해 산화된 형태의 글루타치온 0.2mM을 함유하는 50mM Tris-HCl 완충액(pH 8.0)에 대해 3회 투석하였다. 또한, 상기 부분을 완충액으로 교환하기 위해, 0.15 M NaCl을 함유하는 20mM 초산 완충액(pH 6.0)에 대해 3번 투석하였다.
투석 생성물을 S-S결합에 의해 분자간 교차된 높은 분자량 단백질의 소량을 제거하기 위해, 0.15M NaCl을 함유하는 20mM 초산 완충액(pH 6.0)으로 평형화된 Superdex 200pg 겔 여과 컬럼(2.6×60cm, Amersharm Pharmacia사 제작)에 부가하였다. 도 24에 나타낸 바와 같이, 주요 및 부차 피크인 2개 피크는 높은 분자량의 회합체라 생각되는 넓은 피크 후에 용출된다. SDS-PAGE(도면 21참조)에 의해 분석되고, 상기 겔 여과 분석 중에 2개 피크의 용출 위치는, 주요 피크가 단일쇄 Fv의 모노머이고, 부차 피크가 단일쇄 Fv의 비공유 결합성 다이머라 생각된다. 상기 비공유 결합성 다이머는 전체 단일쇄 Fv의 4퍼센트이었다.
5.13 항체 MABL-2 유래 일체쇄 Fv의 in vitro에서 아폽토시스 유발 활동
CHO세포 및 대장균에 의해 생성된 항체 MABL-2(MABL-2scFv)로부터 단일쇄 Fv의 아폽토시스 유발 활동은 인간 IAP 유전자가 도입된 L1210세포(hIAP/L1210)를 사용한 Annexin-V 염색(Boehringer Mannheim사 제작)에 의한 2개의 프로토콜에 따라서 검사되었다.
3㎍/ml의 최종 농도에서 제1프로토콜 시료 항체를 hIAP/L1210세포주의 5×104세포를 부가하고, 24시간 동안 배양시켰다. 실시예 5.9에서 얻은 CHO세포로부터 MABL-2의 단일쇄 Fv의 모노머 및 다이머, 실시예 5.12에서 얻은 대장균으로부터 MABL-2의 단일쇄 Fv의 모노머 및 다이머, 및 대조로서 마우스 IgG항체 등의 시료 항체를 분석하였다. 배양 후, Annexin-V 염색을 수행하였고, 그들의 형광강도를 FACScan 장치(BECTON DICKINSON사 제작)를 사용하여 측정하였다.
3㎍/ml의 최종 농도에서 제2프로토콜 시료 항체를 hIAP/L1210세포주의 5×104세포를 부가하고, 2시간 동안 배양시키고, 15㎍/ml의 최종 농도에서 항-FLAG 항체(SOGMA사 제작)와 혼합되어, 22시간 동안 더 배양시켰다. 실시예 5.9에서 얻은 CHO세포로부터 MABL-2의 단일쇄 Fv의 모노머 및 대조로서 마우스 IgG항체 등의 시료 항체를 분석하였다. 배양 후, Annexin-V 염색을 수행하였고, 그들의 형광강도를 FACScan 장치를 사용하여 측정하였다.
Annexin-V 염색에 의해 분석결과를 도25-31에 나타내었다. 그 결과 CHO세포 및 대장균 생성 MABL-2의 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 다이머는 대조(도 25)와 비교하여 세포사멸이 현저하게 유발되지만, 아폽토시스 유발 작용은 CHO세포 및 대장균에서 생성된 MABL-2의 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 단량체를 관찰할 수 없었다(도 28, 29). 항-FLAG항체를 함께 사용할 때, CHO세포에서 생성된 항체 MABL-2 유래 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 모노머는 대조(도 30)와 비교하여 세포사멸이 현저하게 유발되었다(도 30).
5.14 scFv/CHO 폴리펩티드의 모노머 및 다이머의 인간 골수종의 마우스 모델에 대한 항종양 효과
(1)마우스 혈청에서 인간 IgG의 정량법
마우스 혈청에 있어서, 인간 골수종 세포에 의해 생성된 인간 IgG(M 단백질)의 측정법은 하기 ELISA에 의해 수행되었다. 0.1% 중탄산 완충액(pH9.6)으로 1㎍/mL로 희석한 염소 항-인간 IgG항체(BIOSOURCE, Lot#7902)의 100μL를 각 96웰 플레이트 상에 부가하고, 항체가 고정되도록 4℃에서 하루동안 인큐베이트하였다. 블로킹 후, 단계희석된 마우스 혈청 또는 표준으로서 인간 IgG(CAPPEL LoT#00915)의 100μL를 각 웰에 부가하고, 실온에서 2시간 동안 인큐베이트하였다. 세정 후, 5000배 희석된 알칼리성 포스파타제 표시 항-인간 IgG항체 100μL를 부가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이트를 수행하였다. 세정 후, 기질용액을 첨가하였다. 인큐베이션 후, MICROPLATE READER Model 3550(BioRad사 제작)를 사용하여 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 마우스 혈청에서 인간 IgG의 농도를 표준의 인간 IgG의 흡광도에서 얻은 검량선을 기초로 산출하였다.
(2) 투여용 항체의 제작
scFv/CHO폴리펩티드의 모노머 및 다이머를 투여당일 살균 여과된 PBS(-)로 각각 0.4mg/mL 또는 0.25mg/mL로 희석하여, 투여를 위한 시료를 제작하였다.
(3) 인간 골수종의 마우스 모델의 제작
인간 골수종의 마우스 모델을 하기와 같이 제작하였다. SCID 마우스(Japan Clare)에 의해 in vivo(일본특허공개 평7-236475호 공보)에서 배양된 KPMM2세포를 10%태아소 혈청(GIBCO-BRL)을 함유하는 RPMI1640 배지에서 부유시키고, 3×107개/mL로 조정하였다. KPMM2세포 부유액 200㎛(6×106세포/마우스)를 이식 하루 전에 아시아로 GM1 항체(WAKO JUNYAKU, 5mL로 용해된 1병)가 피하투여된 마우스의 꼬리 정맥을 통하여 SCID마우스(수컷, 6주령)로 이식시켰다.
(4)항체의 투여
(2)에서 제작된 항체의 시료, 모노머(250μL) 및 다이머(400μL)를 (3)에서 제작된 인간 골수종의 모델 마우스에게 꼬리 정맥을 통해 투여하였다. 투여는 KPMM2세포의 이식 후 3일로부터 시작하였고, 3일 동안 하루에 2번씩 수행되었다. 대조로서, 살균 여과된 PBS(-) 200μL를 꼬리 동맥을 통해 3일 동안 하루에 두번씩 마찬가지로 투여하였다. 각 군은 7마리의 마우로 구성된다.
(5)scFv/CHO 폴리펩티드의 모노모 및 다이머의 인간 골수종의 마우스 모델에 대한 항종양 효과의 평가
scFv/CHO 폴리펩티드의 모노모 및 다이머의 인간 골수종의 마우스 모델에 대한 항종양 효과는 인간 IgG(M 단백질)의 마우스 혈청 중의 농도 및 마우스의 생존시간을 기준으로 하여 평가하였다. 인간 IgG 농도의 변화는, 상기 (1)에 기재된 ELISA를 사용하여, KPMM2세포 이식후 24일째에 채취한 마우스 혈청 중에서 측정함으로써 결정된다. PBS(-)-투여군(배양군)의 혈청에 있어서의 혈청 인간 IgG(M 단백질)의 양은 약 8500㎍/mL까지 상승하는 반면, scFv/CHO 다이머-투여군의 인간 IgG의 양은 현저히 낮았는데, 즉, 배양군의 1/10이하 정도로 낮았다. 따라서, 이 결과는 scFv/CHO의 다이머는 KPMM2 세포의 성장을 강하게 억제한다는 것을 나타낸다(도 32). 도 33에 나타낸 바와 같이, PBS(-)-투여군에 비해서, scFv/CHO 다이머-투여군에서 현저한 생존시간의 연장이 관찰되었다.
이상으로부터, scFv/CHO의 다이머는 인간 골수종 모델 마우스에 대해 항종양 효과를 갖는다는 것이 확인된다. 본 발명의 재구성 폴리펩티드인 scFv/CHO의 다이머의 항종양 효과는 재구성 폴리펩티드의 아폽토시스 유발작용으로부터 기인된다고 생각된다.
5-15. 적혈구 응집 시험
적혈구 응집 시험 및 적혈구 응집의 판정은 조쿠-세아카가쿠 지켄 코자의 "면역생화학 연구법"(일본생화학회편, 도쿄가가쿠 도진 발행)에 따라 수행하였다.
혈액을 건강한 제공자로부터 헤파린 처린 주사기를 사용하여 채혈하고, PBS(-)로 3회 세정한 다음, PBS(-) 중에서의 최종 농도가 2%인 적혈구 부유액을 조제하였다. 시험샘플은 MABL-2 항체, CHO 세포에 의해 생성된 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 모노머 및 다이머, 및 대장균에 의해 얻어진 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 모노머 및 다이머로 하였고, 그 대조로는 마우스 IgG(ZYMED사 제작)로 하였다. 적혈구 응집작용의 연구를 위해, 팔콘사 제품의 둥근 바닥 96웰플레이트를 사용하였다. 상기 항체 샘플을 웰당/50μL첨가하고, 2% 적혈구 부유액 50μL을 첨가하고, 혼합하였다. 37℃에서 2시간 인큐베이션한 후, 이 반응혼합물을 4℃에서 하룻밤 보존하고, 그것의 적혈구 응집을 판정하였다. 대조로서, PBS(-)를 웰당 50μL 사용하였고, 적혈구 응집시험을 동일한 방법으로 수행하였다. 마우스 IgG 및 항체 MABL-2는, 항체의 최종농도 0.01, 0.1, 1.0, 10.0 또는 100.0㎍/mL로 사용하였다. 단일쇄 Fv는, 최종농도 0.004, 0.04, 0.4, 4.0, 40.0 또는 80.0㎍/mL로 사용하였고, 대장균에 의해 얻어진 폴리펩티드의 다이머의 경우에만 160㎍/mL 더 사용하였다. 그 결과를 표2에 나타낸다. 항체 MABL-2의 경우에 있어서, 0.1㎍/mL 이상의 농도에서 적혈구 응집이 관찰되었고, 반면 단일쇄 Fv의 모노머 및 다이머 둘 다에 대해서는 적혈구 응집이 관찰되지 않았다.
적혈구 응집시험
mIgGMABL-2(intact) 대조 0.01 0.1 1 10 100 ㎍/mL- - - - - -- - + +++ +++ ++
scFv/CHO 모노머scFv/CHO 다이머 대조 0.004 0.04 0.4 4 40 80 ㎍/mL- - - - - - -- - - - - - -
scFv/대장균 모노머scFv/대장균 다이머 대조 0.004 0.04 0.4 4 40 80 160 ㎍/mL- - - - - - -- - - - - - - -
실시예 6 2개의 H쇄 V영역 및 2개의 L쇄 V영역을 함유하는 재구성 폴리펩티드 sc(Fv)2및 길이가 다른 연결기를 가진 항체 MABL-2 scFv
6.1 MABL-2항체 sc(Fv) 2 를 발현하느 플라스미드의 구축
항체 MABL-2항체 유래 2개의 H쇄 V영역 및 2개의 L쇄 V영역을 함유하는 재구성 폴리펩티드 [sc(Fv)2]를 발현하는 플라스미드를 제조하기 위해서, 상기 MABL-2 유래 scFv를 코드하는 DNA를 함유하는 상기 pCHOM2를 하기와 같은 PCR법으로 개변하고, 얻어진 DNA단편을 pCHOM2에 도입하였다.
PCR에 사용하는 프라이머들로는 센스 프라이머로서 EFIα를 코드하는 DNA에 혼성화되도록 설계된 EFI프라이머(서열번호:40), L쇄 V영역의 C단말을 코드하는 DNA에 혼성화되고, 연결기영역을 코드하는 DNA배열을 함유하도록 설계된 안티센스 프라이머(서열번호:29), 및 SalI제한효소 재구축부위를 함유하는 VLLAS 프라이머(서열번호:41)이었다.
PCR용액 100㎕은 10㎕의 10 ×PCR Buffer #1, 1mM MgCl2, 0.2mM dNTPs(dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP), 5유니트의 KOD DNA 폴리머라제(도요보사 제품), 1㎛의 각각의 프라이머 및 100ng의 주형 DNA(pCHOM2)을 함유한다. PCR용액을 94℃에서 30초간, 50℃에서 30초간, 및 74℃에서 1분간의 이 순서로 가열하였다. 이 온도 사이클을 30회 반복하였다.
PCR생성물을 QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN)을 사용하여 정제하고, SalI로 소화시켰다. 얻어진 DNA단편을 pBluescript KS+벡터(도요보사 제품)에 클로닝하였다. DNA서열 후, 소정의 DNA 서열을 함유하는 플라스미드를 SalI로 소화시키고, Rapid DNA Ligation Kit(베링거 만하임사 제품)을 사용하여 얻어진 DNA단편을 SalI로 소화된 pCHOM2에 연결하였다. DNA서열 후, 소정의 DNA서열을 함유하는 플라스미드를 "pCHOM2(Fv)2"로 나타내었다(도34 참조). 플라스미드 pCHOM2(Fv)2에 함유되는 뉴클레어티드 서열 및 항체 MABL-2 sc(Fv)2의 아미노산 서열을 서열번호(42)에 나타내었다.
6.2 각종 길이의 연결기를 가진 항체 MABL-2 scFv를 발현하는 플라스미드의 제작
길이가 다른 연결기를 함유하는 scFv 및 [H쇄]-[L쇄](이하, "HL") 또는 [L쇄]-[H쇄](이하, "LH")의 순서로 설계된 V영역을 MABL-2 유래 H쇄 및 L쇄를 코드하는 cDNA를 주형으로서 사용하여 하기와 같이 제작하였다.
HL형 scFv를 제작하기 위해서, pCHOM2(Fv)2를 주형으로서 사용하여 PCR법을 수행하였다. PCR단계에서, 한 쌍의 CFHL-F1 프라이머(서열번호:43)와 CFHL-R2 프라이머(서열번호:45) 또는 한 쌍의 CFHL-F2 프라이머(서열번호:46)와 CFHL-R1(서열번호:47) 및 KOD 폴리머라제를 사용하였다. 94℃에서 30초간, 60℃에서 30초간 및 72℃에서 1분간의 순서로 이루어진 온도 사이클을 30회 반복하여 PCR법을 수행하여, 그것의 5'-말단에 리더서열 을 함유하는 H쇄의 cDNA 또는 3'-말단에 FLAG서열을 함유하는 L쇄의 cDNA를 얻었다. 얻어진 H쇄 및 L쇄의 cDNA를 혼합하고, 이 혼합물을 주형으로서 사용하고, KOD폴러머라제를 사용하여 94℃에서 30초간, 60℃에서 30초간 및 72℃에서 1분간의 순서로 이루어진 온도 사이클을 5회 반복하여 PCR법을 수행하였다. 이 반응혼합물에, CFHL-F1 및 CFHL-R1 프라이머를 첨가한 다음, 상기 온도 사이클을 30회 반복하여 PCR반응을 수행하여, 연결기가 없는 HL-O형의 cDNA를 제조하였다.
LH형 scFv 제조하기 위해서, 항체 MABL-2로부터의 L쇄 V영역 및 H쇄 V영역을 코드하는 cDNA를 함유한 pGEM-M2L 및 pGEM-M2H를 주형으로서 사용하여 PCR반응을 각각 수행하였다(일본 특허 평11-63557 참조). 한 쌍의 T7 프라이머(서열번호:48)과 CFLH-R2(서열번호:49) 또는 한 쌍의 CFLH-F2 프라이머(서열번호:50)와 CFLH-R1(서열번호:51) 및 KOD 폴리머라제(도요보사 제품)를 사용하였다. 94℃에서 30초간, 60℃에서 30초간 및 72℃에서 1분간의 순서로 이루어진 온도 사이클을 30회 반복하여 PCR법을 수행하여, 그것의 5'-말단에 리더서열을 함유하는 L쇄의 cDNA 또는 3'-말단에 FLAG서열을 함유하는 H쇄의 cDNA를 얻었다. 얻어진 L쇄 및 H쇄의 cDNA를 혼합하고, 이 혼합물을 주형으로서 사용하고, KOD폴러머라제를 사용하여 94℃에서 30초간, 60℃에서 30초간 및 72℃에서 1분간의 순서로 이루어진 온도 사이클을 5회 반복하여 PCR법을 수행하였다. 이 반응혼합물에, T7 및 CFHL-R1 프라이머를 첨가하고, 상기 온도 사이클을 30회 반복하여 반응을 수행하였다. 반응생성물을 주형으로서 사용하고, 한 쌍의 CFHL-F4 프라이머(서열번호:52)와 CFHL-R1 프라이머를 사용하여, 94℃에서 30초간, 60℃에서 30초간 및 72℃에서 1분간의 순서로 이루어진 온도 사이클을 30회 반복하여 PCR법을 수행하여, 연결기가 없는 LH-O형의 cDNA를 제조하였다.
얻어진 LH-O 및 HL-O형의 cDNA를 제한효소 EcoRI 및 BamHI(다카라 쇼조)로 소화시키고, 그 소화된 cDNA를 포유동물 세포의 발현 플라스미드 INPEP4에 Ligation High(Toyobo Inc.사 제품)를 사용하여 각각 도입하였다. 적격 대장균 JM109(니폰 젠사 제품)을 각각의 플라스미드를 사용하여 형질전환하고, 이 형질전환된 대장균으로부터 QIAGEN Plasmid Maxi Kit(QUIAGEN)을 사용하여 소정의 플라스미드를 분리하였다. 이렇게 하여 플라스미드 pCF2LH-O 및 pCF2HL-O을 제조하였다.
사이즈가 다른 연결기를 함유하는 HL형 발현 플라스미드를 제조하기 위해서, 주형으로서 pCF2HL-O, 센스 프라이머로서 CFHL-X3(서열번호:53), CFHL-X4(서열번호:54), CFHL-X5(서열번호:55), CFHL-X6(서열번호:45) 또는 CFHL-X7(서열번호:57) 및 안티센스 프라이머로서, 벡터서열에 상보적인 BGH-1(서열번호:58) 프라이머를 사용하였다. KOD폴러머라제를 사용하여 94℃에서 30초간, 60℃에서 30초간 및 72℃에서 1분간의 순서로 이루어진 온도 사이클을 30회 반복하여 PCR법을 수행하고, 이 반응생성물을 제한효소 Xhol 및 BamHI(다카라 슈조)로 소화시켰다. 그 소화된 단편을 Ligation High(도요보사 제품)을 사용하여 pCF2HL-O의 Xhol와 BamHI 사이트사이에 각각 도입하였다. 적격 대장균 JM109(니폰 젠사 제품)을 각각의 플라스미드를 사용하여 형질전환하고, 이 형질전환된 대장균으로부터 QIAGEN Plasmid Maxi Kit를 사용하여 소정의 플라스미드를 분리하였다. 이렇게 하여, 발현 플라스미드 pCF2HL-3, pCF2HL-4, pCF2HL-5, pCF2HL-6 및 pCF2HL-7을 제작하였다.
COS7세포 내에서 일시적 발현용 발현 플라스미드를 구성하기 위해서, 상기 플라스미드 pCF2HL-0, pCF2HL-3, pCF2HL-4, pCF2HL-5, pCF2HL-6, 및 pCF2HL-7은 제한효소 EcoRI 및 BamHI(Takark Shuzo)에 의해 소화되고, 약 800bp의 얻어진 단편을 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다. 상기 얻어진 단편을 Ligation High(Toyobo Inc.제작)을 사용하여 포유동물 세포내에서 발현을 하는 발현 플라스미드 pCOS1에 EcoRI 및 BamHI사이의 부위에 각각 도입하였다. 적격 대장균DH5α(Toyobo Inc.제작)은 각 플라스미드로 형질전환되고, 목적 플라스미드는 Qiagen Plasmid Maxi Kit를 사용하여 형질전환된 대장균으로부터 분리하였다. 이와 같이 하여, 발현 플라스미드 CF2HL-0/pCOS1, CF2HL-3/pCOS1, CF2HL-4/pCOS1, CF2HL-5/pCOS1, CF2HL-6/pCOS1 및 CF2HL-7/pCOS1를 제작하였다.
이들 플라스미드의 전형적인 예로서, 플라스미드 CF2HL-0/pCOS1의 구성을 도 35에 나타내었고, 상기 플라스미드에 함유되는 MABL2-scFv<HL-0>의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열을 서열번호48에 나타내었다. 이 플라스미드에 있어서, 연결기 영역의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열도 도 36에 나타내었다.
다른 크기의 연결기를 함유하는 LH형의 발현 플라스미드를 구성하기 위해, 주형으로서 pCF2LH-0, 센스 프라이머로서, CFLH-X3(서열번호:61), CFLH(서열번호 :62), CFLH-X5(서열번호:63), CFLH-X6(서열번호:64) 또는 CFLH-X7(서열번호:65), 벡터 서열에 의해 상보의 안티센스 프라이머로서 BGH-1프라이머를 사용하였다. PCR반응을 94℃에서 30초 동안, 60℃에서 30초 동안 및, 72℃에서 1분 동안의 순서로 구성되는 온도 사이클을 30회 반복하는 것에 의해 KOD폴리머라제를 사용하여 수행하고, 상기 반응 생성물은 XhoI 및 BamHI제한 효소에 의해 소화되었다. 소화된 단편은 각각 Ligation High를 사용하여 Xhol 및 BamHI사이로 pCF2LH이 도입되었다. 적당한 대장균 DH5α(Toyobo Inc.)은 각 플라스미드로 형질전환되고, 목적 플라스미드는 Qiagen Plasmid Maxi Kit를 사용하여 형질전환된 대장균으로부터 분리하였다. 이와 같이 하여, 발현 플라스미드 pCF2LH-3, pCF2LH-4, pCF2LH-5, pCF2LH-6 및 pCF2LH-7을 제작하였다.
COS7세포 내에서 일시적 발현하는 발현 플라스미드를 구성하기 위해서, 상기 플라스미드 pCF2HL-0, pCF2HL-3, pCF2HL-4, pCF2HL-5, pCF2HL-6, 및 pCF2HL-7은 제한효소 EcoRI 및 BamHI(Takark Shuzo)에 의해 소화되고, 약 800bp의 얻어진 단편을 아가로스 겔 전기영동에서 정제되었다. 상기 얻어진 단편을 Ligation High(Toyobo Inc.)을 사용하여 포유동물 세포내에서 발현하는 발현 플라스미드 pCOS1에 EcoRI 및 BamHI사이의 부위에 각각 도입하였다. 적격 대장균 DH5α(Toyobo Inc.사 제작)은 각 플라스미드로 형질전환되고, 목적 플라스미드는 Qiagen Plasmid Maxi Kit를 사용하여 형질전환된 대장균으로부터 분리하였다. 이와 같이 하여, 발현 플라스미드 CF2LH-0/pCOS1, CF2LH-3/pCOS1, CF2LH-4/pCOS1, CF2LH-5/pCOS1, CF2LH-6/pCOS1 및 CF2LH-7/pCOS1를 제작하였다.
이들 플라스미드의 전형적인 예로서, 플라스미드 CF2LH-0/pCOS1의 구성을 도 37에 나타내었고, 상기 플라스미드에 함유되는 MABL2-scFv<LH-0>의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열을 서열번호66에 나타내었다. 이 플라스미드에 있어서, 연결기 영역의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열도 도 38에 나타내었다.
6.3 COS7세포에 있어서, scFvs 및 sc(Fv) 2 의 발현
(1) 혈청함유 배양액을 사용하는 배양 상청의 제작
scFvs 및 sc(Fv)2의 HL형 및 LH형을 COS7세포 내에서 일시적으로 발현시켰다(JCRB9127, Japan Health Sciences Foundation). COS7세포를 37℃의 이산화 탄소 분위기 인큐베이터 내에서 10%소 태아 혈청(HyClone사 제작)을 함유하는DMEM배지(GOBCO BRL사 제작)에서 2차 배양하였다. COS7세포를 실시예 6.2에서 제작된 CF2HL-0, 3∼7/pCOS1, 또는 CF2LH-0, 3∼7/pCOS1 또는 Gene Pulser장치(BioRad사 제작)를 사용하여 일렉트로포레이션에 의한 pCHOM2(Fv)2로 트렌스펙션하였다.
10%FBS 및 5mM BES(SIGMA사 제작)를 함유하는 DMEM배양액에 있어서, DNA(10㎍) 및 2×107세포/ml 0.25ml를 큐벳으로 부가하였다. 상기 혼합물 10분 동안 정치한 후, 전기용량 0.17kV, 950μF에서 펄스로 처리하였다. 실온에서 10분 동안 복원한 후, 일렉트로포레이션된 세포를 DMEM배양액(10%FBS)에 혼합하고, 75cm3플라스크에 부가하였다. 72시간 동안 배양한 후, 상기 배양상청을 수집하고, 원심분리하여, 세포 단편을 제거하였다. 상기 배양상청(이하, "CM")을 얻기 위해, 0.22㎛보틀탑필터(bottle top filter,(FALCON사 제작))을 사용하여 여과를 실시하였다.
(2) 무혈청 배양약을 사용하는 배양 상청액의 제작
(1)과 동일한 방법으로 트랜스펙션한 세포를 DMEM배지(10% FBS)에 부가하고, 75cm3플라스크에서 하룻밤 배양하였다. 배양 후, 상기 상청액을 버리고, 그 세포를 PBS로 세정한 후, CHO-S-SFM II배지(GIBCO BRL사 제작)에 부가하였다. 72시간 동안 배양한 후, 배양 상청을 수집하고, 원심분리하여, 세포 파편을 제거하고, CM을 얻기 위해, 0.22㎛보틀탑필터를 사용하여 여과하였다.
6.4 COS7의 CM에서 scFvs 및 sc(Fv) 2 의 검출
상기 실시예 6.3(2)에 있어서, 제작된 COS7의 CM에서 다양한 MABL2-scFVs 및sc(Fv)2을 웨스턴 블로팅법으로 검출하였다.
각 COS7의 CM을 SDS-PAGE전기영동을 실시하고, REINFORCED NC막에 부가하였다(Schleicher&Schuell). 상기 막을 5%탈지우유로 블로킹하고, TBS로 세정하였다. 이어서, 항-FLAG 항체(SIGMA사 제작)를 거기에 부가하였다. 상기 막을 실온에서 인큐베이트하고, 세정하였다. 퍼옥시다제 표시 마우스 IgG항체(Jackson Immuno Research)를 부가하였다. 실온에서 인큐베이션 및 세정 후, 그 기질용액(Kirkegaard Perry Laboratories)을 첨가하여 발색시켰다(도 39).
6.5 유동세포 분석법
유동세포 분석법은 인간 Integrin Associated Protein(IAP)항원에 대한 MABL2-scFVs 및 sc(Fv)2의 결합을 측정하기 위해서, 실시예 6.3에서 제작된 COS7세포의 배양상청을 이용하여 수행하였다. 배양 상청 또는 대조로서 COS7세포의 배양상청을 인간IAP를 발현하는 마우스 백혈병 세포주 2×105세포를 부가하였다. 얼음에서 인큐베이션하고, 세정 후, 마우스 항-FLAG 항체(SIGMA사 제작)10㎍/mL를 부가한 후, 상기 세포를 인큐베이션 및 세정하였다. 이어서, FITC표시 항-마우스 IgG항체(BECTON DICKINSON사 제작)를 거기에 부가시키고, 상기 세포를 다시 인큐베이션 및 세정시켰다. 그 후에, 형광강도를 FACScan장치(BECTON DICKINSON사 제작)를 사용하여 측정하였다. 유동세포 분석법의 결과는 다른 길이로 연결기를 갖는 MABL2-scFvs 및 COS7의 배양 상청에서 sc(Fv)2은 인간 IAP에 대한 높은 친화성을 갖는 것을 나타내었다(도 40a 및 40b 참고).
6.6 in vitro에서 아폽토시스 유발 효과
실시예 6.3(1)에서 제작된 COS7의 배양 상청의 아폽토시스 유발 작용을 인간 IAP유전자를 갖는 트랜스펙션된 L1210세포를 사용하여 Annexin-V 염색(Boehringer Mannheim)검사하였다.
hIAP/L1210세포의 5×104세포에 각 벡터를 형질전환시킨 COS7세포배양 상청 또는 대조로서 COS7세포 배양 상청을 최종농도 10%로 첨가하여, 그 혼합물을 24시간 동안 배양하였다. 그런 후, Annexin-V/PI 염색을 수행하고, 형광강도를 FACScan장치(BECTON DICKINSON사 제작)를 사용하여 측정하였다. 그 결과, COS7의 CM에서 scFvs<HL3, 4, 6, 7, LH3, 4, 6, 7> 및 sc(Fv)2는 hIAP/L1210세포의 세포사멸이 현저하게 유발되었다. 그 결과는 도 41에 나타내어진다.
6.7 CHO세포에서 scFv 및 sc(Fv) 2 의 발현을 위한 벡터의 구성
배양 상청으로부터 MABL2-scFv 및 sc(FV)2을 분리 및 정제하기 위해, CHO세포에서 발현하는 발현벡터를 하기와 같이 구성하였다.
실시예 6.2에서 제작된 pCF2HL-0, 3∼7, 및 pCF2LH-0, 3∼7의 EcoRI-BamHI단편을 Ligation High를 사용하여 CHO세포의 발현 벡터 pCH01에 있어서, EcoRI 및 BamHI사이로 도입시켰다. 적당한 대장균 DH5α를 형질전환시켰다. 상기 플라스미드는 발현 플라스미드 pCHOM2HL-0,3∼7, 및 pCHOM2LH-0, 3∼7을 제작하기 위해, QIAGEN Plasmid Midi Kit(QIAGEN)를 사용하여 형질전환된 대장균으로부터 분리하였다.
6.8 MABL2-scFvs<HL-0, 3∼7>, MABL2-scFvs<LH-0, 3∼7> 및 sc(Fv) 2 을 발현하는 CHO세포의 제작, 및 그것의 배양 상청의 조제
실시예 6.7로 구성된 발현 플라스미드 pCHOM2HL-0, 3∼7, 및 pCHOM2LH-0, 3∼7 및 pCHOM2(Fv)2벡터를 이하와 같이 CHO세포에 형질전환하고, 각 재구성 폴리펩티드를 계속발현하는 CHE세포를 제작하였다. 그것의 전형적인 예로서, MABL2-scFV<HL-5> 또는 sc(Fv)2를 계속적으로 발현하는 CHO세포의 제작을 하기와 같이 설명하였다.
발현 플라스미드 pCHOM2HL-5 및 pCHOM2(Fv)2를 제한효소 PvuI로 소화시키는 것에 의해 직쇄상으로 하고, Gene Pulser 장치(BioRad사 제작)를 사용하여 일렉트로포레이션에 의해 CHO세포에 트랜스펙션을 실시하였다. DNA(10㎍) 및 1×107세포/ml를 갖는 PBS 0.75ml의 혼합물을 큐벳으로 부가하였고, 전기용량 1.5kV, 25μF에서 펄스로 처리하였다. 실온에서 10분 동안 복원한 후, 일렉트로포레이션 처리된 세포를 10%소태아 혈청을 함유하는 헥산 함유 α-MEN배양 배지(GIBCO BRL사 제작)에 부가하였다. 하룻밤 배양 후, 상청을 버렸다. 상기 세포를 PBS로 세정하고, 10%소태아 혈청을 함유하는 무헥산α-MEN배양 배지(GIBCO BRL사 제작)에 부가하였다. 2주일 동안 배양한 후, 상기 세포를 10nm(종말 농도)메토트렉사이트(SIGMA사 제작)를 함유하는 배지에서 배양한 후, 50nm, 100nm 메토트렉사이트로 배양하였다. 얻은 세포를 롤러보틀안에서 무혈청 CHO-S-SFM II배지(GIBCOBRL)에서 배양시켰다. 배양 상청을 수집하고, 원심분리에 의해 세포 파편을 제거하고, 0.20㎛필터를 사용하여 여과하여, 각각의 CM을 얻었다.
상기와 같이하여, 계속 발현하는 MABL2-scFvs<HL-0, -3, -4, -6, -7> 및 <LH-0, -3, -4, -5, -6, -7>인 CHO세포 및 그것의 CM을 얻었다.
6.9 MABL2-scFv<HL-5> 및 sc(Fv) 2 의 다이머의 정제
MABL2-scFv<HL-5> 및 sc(Fv)2을 하기와 같은 2형태의 정제법에 의해 실시예 6.8에서 제작된 CM으로부터 정제시켰다.
<정제법1>
HL-5 및 sc(Fv)2을 폴리펩티드의 C말단에 위치한 FLAG서열을 사용한 항FLAG 항체 친화성 컬럼 크로마토그래피 및 겔 여과로 정제를 하였다. 6.8에서 얻어진 것과 같은 CM의 1리터를 150mM NaCl을 함유하는 50mM Tris-HCl완충액(TBS, pH7.5)으로 평형화된 항-FLAG M2 Affinity 겔(SIGMA사 제작)로 제작된 컬럼(7.9ml)에 부가하였다. TBS로 컬럼을 세정한 후, scFv를 pH 3.5의 0.1M 글리신-HCl완충액으로 용출시켰다. 얻어진 부분을 SDS-PAGE로 분석하고, scFv의 용출을 확인하였다. scFv부분을 최종 농도 0.01%까지 TWeen 20으로 혼합시키고, Centricon-10(MILIPORE사 제작)을 사용하여 농축하였다. 상기 농축물을 150mM NaCl을 함유하는 20mM 초산 완충액(pH 6.0) 및 0.01%Tween으로 평형화시킨 TSKgel G3000SWG 컬럼에 부가하였다. 0.4mL/분 유속에서 scFv를 280nm의 흡광도에 의해 검출시켰다. HL-5를 주요부분으로서 다이머의 위치에서 용출시키고, sc(Fv)2을 모노머의 위치에서 용출시켰다.
<정제법2>
HL-5 및 sc(Fv)2를 이온교환크로마토그래피, 하이드록시아파타이트 및 겔 여과를 포함하는 3단계를 사용하여 정화시켰다. 이온크로마토그래피에서, Q sepharose fast flow컬럼(Pharmacia사 제작)를 HL-5용으로 사용하였고, SP-sepharose fast flow컬럼을 sc(FV)2용으로 사용하였다. 제2단계 후에 있어서는 HL-5 및 sc(Fv)2을 동일한 방법으로 처리하였다.
HL-5용 제1단계
HL-5의 CM을 0.02%Tween 20을 함유하는 20mM Tris-HCl 완충액(pH 9.0)으로 2배 희석한 후, pH를 1M Tris로 9.0으로 조정하였다. 상기 용액을 0.02% Tween20을 함유하는 20mM Tris-HCl완충액(pH8.5)로 평형화된 Q sepharose fast flow컬럼에 부가하였다. 컬럼에 흡착된 폴리펩티드를 동일한 완충액 중의 0.1∼0.55M까지의 NaCl 의 직선농도구배로 용출시켰다. SDS-PAGE에 의해 용출된 부분을 모니터링하고, HL-5를 함유하는 부분을 수집하고, 제 2단계의 하이드록시아파타이트를 실시하였다.
sc(Fv) 2 용 제1단계
sc(Fv)2의 CM을 0.02%Tween 20을 함유하는 20mM 초산 완충액(pH 5.5)으로 2배 희석한 후, pH를 1M초산으로 5.5로 조정하였다. 상기 용액을 0.02% Tween20을 함유하는 20mM 초산 완충액(pH5.5)로 평형화된 SP-sepharose fast flow컬럼에 부가하였다. 컬럼에 흡착된 폴리펩티드를 완충액 중 0∼0.5M까지의 의 NaCl의 직선농도구배로 올려서 용출시켰다. SDS-PAGE에 의해 용출된 부분을 모니터링하고, sc(Fv)2를 함유하는 부분을 수집하고, 제 2단계의 하이드록시아파타이트를 실시하였다.
제2단계:HL-5 및 sc(Fv)2의 하이드록시아파타이트 크로마토그래피
제1단계에서 얻은 HL-5 및 sc(Fv)2의 부분을 0.02% Tween20을 함유하는 10mM 인산 완충액, pH 7.0으로 평형화된 하이드록시아파타이트 컬럼에 부가하였다. 동일한 완충액으로 컬럼을 세정 후, 컬럼에 흡착된 폴리펩티드를 인산 완충액 0.5M까지 직선적으로 올려서 용출시켰다. SDS-PAGE에 의해 용출된 부분을 모니터링하고, 목적 폴리펩티드를 함유하는 부분을 수집하였다.
3단계:HL-5 및 sc(Fv)2의 겔 여과
제2단계에서 얻은 각 부분을 CentriPrep-10(MILIPORE사 제작)로 농축하고, 0.02%Tween 20 및 0.15M Nacl을 함유하는 20mM 초산 완충액(pH 6.0)으로 평형화된 Superdex 200 컬럼(2.6×60cm, 파마시아사 제작)에 부가하였다. HL-5를 다이머의 위치에서 용출시키고, sc(Fv)HL-5 및 sc(Fv)2를 각가 주요 피크로서 모노머의 위치에서 용출시켰다.
HL-5의 모노머는 이 두개의 정제법에 의해 검출되기 어렵기 때문에, 단일쇄 Fv의 다이머는 5개 정도의 아미도 산을 함유하는 단일쇄 Fv를 위한 연결기 일 때, 높은 효율로 형성되는 것이 증명되었다. 또한, HL-5 및 sc(Fv)2의 다이머를 정제 후 4℃에서 한달 동안 안정되게 보존하였다.
6.10 항원에 대한 scFv<HL-5> 및 sc(FV) 2 의 정제된 다이머의 결합활성 평가
유동세포 분석법을 인간 IAP항원에 대한 결합의 평가를 위해, MABL2-scFv<HL-5> 정제된 다이머 및 정제된 sc(Fv)2을 사용하여, 수행하였다. MABL2-scFv<HL-5>의 정제된 다이머 10㎍/ml, 정제된 sc(FV)2, 양성 대조로서 항체 MABL-2 또는 음성 대조로서 마우스 IgG(Zymed사 제작)을 인간 IAP(hIAP/L1210)를 발현하는 마우스 백혈병 세포주 L1210 또는 대조로서 pCOS1(pCOS1/L1210)으로 형질전환된 세포주 L1210을 2×105세포를 부가하였다. 얼음에서 인큐베이트한 후, 세정하고, 마우스 항-FLAG항체(SIGMA사 제작) 10㎍/mL를 부가한 후, 세포를 인큐베이트하고 세정하였다. FIFC 표시된 항-마우스 IgG항체(BECTON DICKINSON사 제작)를 거기에 첨가시키고, 그 세포를 다시 인큐베이트하고 세정하였다. 그런 후, 형광강도를 FACScan 장치(BECTON DICKINSON사 제작)를 사용하여, 측정하였다.
MABL2-scFv<HL-5>의 정제된 다이머 및 정제된 sc(Fv)2은 hIAP/L1210에 특이적으로 결합하기 때문에, scFv<HL-5> 및 sc(Fv)2의 다이머는 인간 IAP에 대해 높은 친화성을 갖는다고 확인되었다(도 42 참조).
6.11 scFv<HL-5> 및 sc(Fv) 2 의 정제된 다이머의 in vitro에서 아폽토시스 유발활성
MABL2-scFv<HL-5>의 정제된 다이머 및 정제된 sc(Fv)2의 아폽토시스 유발작용은 인간 IAP유전자가 도입된 L1210세포(hIAP/L1210) 및 인간 백혈병 세포주CCRF-CEM의 세포를 사용하여 Annexin-V염색에 의해 검사되었다.
MABL2-scFv<HL-5>의 정제된 다이머, 정제된 MABL2-sc(Fv)2의 다양한 농도를 양성 대조로서 항체 MABL-2, 또는 음성 대조로서 마우스 IgG를 hIAP/L1210 세포주 5×104세포 또는 CCRF-CEM 세포주 1×105세포를 첨가하였다. 24시간 동안 배양 후, Annexin-V염색을 수행하였고, 그것의 형광강도를 FACScan 장치(BECTON DICKINSON)를 사용하여 측정하였다. 그 결과로서, MABL2-scFv<HL-5>의 다이머 및 MABL2-sc(Fv)2은 농도 의존법으로 hHIAP/L1210 및 CCRF-CEM의 세포사멸을 현저하게 유발시켰다.
6.12 scFv<HL-5>의 정제된 다이머 및 sc(Fv) 2 의 적혈구응집실험
적혈구응집실험을 실시예 5.15를 따라서, scFv<HL-5>의 정제된 다이머 및 정제된 sc(Fv)2의 다른 농도를 사용하여 수행하였다.
적혈구 응집은 양성 대조로서 항체 MABL-2에 의해 관찰된 반면에, 일체쇄 항체 MABL2-sc(Fv)2 및 MABL2-scFv(HL-5)에서는 관찰되지 않았다. 또한, 거기에서는 항체 MABL-2로 사용된 2개의 완충액 간의 헤모글로빈 응집에 있어서, 거의 다르지 않았다. 이 결과를 표 3에 나타낸다.
6.13 인간 골수종의 모델 마우스에 대한 scFv<HL-5>의 정제된 다이머 및 sc(Fv) 2 의 항종양 효과
항종양 효과를 실시예 6.8 및 6.9에 제작되고, 정제된 scFv<HL-5>의 정제된 다이머 및 sc(Fv)2에 대해 실험하였다. 그 실험은 실시예 5.1에서 제작된 인간 골수종에 대한 마우스 모델을 사용하고, ELISA를 사용한 마우스 혈청에 있어서, 인간 골수종 세포에 의해 생성된 M단백질의 양을 측정하고, 마우스의 생존시간을 측정함으로써 수행되었다. 그런 후, scFv<HL-5>의 다이머 및 sc(Fv)2의 항종양 효과를 마우스 혈청에 있어서, M단백질의 양의 변환 및 마우스의 생존시간의 기간으로 측정하였다.
실험에 있어서, HL-5 및 sc(Fv)2를 150mM NaCl, 0.02% Tween 및 20mM 초산, pH 6.0으로 구성된 전파체로 0.01, 0.1 또는 1mg/mL의 용액으로 사용하고, 투여량을 0.1, 1 또는 10mg/kg을 마우스에게 투여하였다. 마우스의 대조군은 전파체만 투여되었다.
마우스 혈청을 인간 골수종 세포에 이식한 후 26일 후에 채취하고, 혈청에 있어서, M단백질의 양을 실시예 5.14를 따라서 ELISA를 사용하여 측정하였다. 그 결과, HL-5로 투여된 두개의 마우스 군의 혈청, 다이머 및 sc(Fv)2에 있어서, M단백질의 양은 투여량 의존법으로 감소되었다(도 44참조). 또한, 생존시간의 상당한 신장은 전파체로 투여된 대조군과 비교하여 HL-5(도 45) 및 sc(Fv)2(도 46)으로 투여된 군에서 관찰되었다. 이들 결과는 본 발명의 HL-5 및 sc(Fv)2이 in vivo에서 우수한 항종양 효과를 갖고 있는 것을 나타낸다.
본 발명의 재구성 폴리펩티드는 Integrin Associated Protein(IAP)을 갖는 유핵혈액세포의 아폽토시스를 유발하고, 적혈구 응집을 일으키지 않는 특성을 갖고, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 성인 T-세포 백혈병, 다발성 골수종, 혼합 백혈병 및 모상세포 백혈병 등의 백혈병, 악성 림프종(호지킨 병, 비호지킨 임파종), 재생불량성 빈형, 골수이형성 증후군 및 진성다혈구증 등의 혈액질환 치료용으로서 유용하다.

Claims (16)

  1. Integrin Associated Protein(IAP)에 결합되고, 유핵혈액세포의 아폽토시스를 유발하고, 적혈구 응집을 일으키지 않는 것을 특징으로 하는 재구성 폴리펩티드.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 재구성 폴리펩티드는 개변항체인 것을 특징으로 하는 재구성 폴리펩티드.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 개변항체는 모노크로날 항체의 H쇄 V영역을 2개 이상 그리고, L쇄 V영역을 2개 이상 함유하는 것을 특징으로 하는 재구성 폴리펩티드.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 재구성 폴리펩티드는 1개의 H쇄 V영역 및 1개의 L쇄 V영역을 함유하는 단일쇄 Fv의 다이머인 것을 특징으로 하는 재구성 폴리펩티드.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재구성 폴리펩티드는 단일쇄 Fv의 정제된 다이머인 것을 특징으로 하는 재구성 폴리펩티드.
  6. 제 3항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 2개의 H쇄 V영역 및 2개의 L쇄 V영역을 함유하는 단일쇄 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 재구성 폴리펩티드.
  7. 제 5항 또는 제 6항에 있어서, H쇄 V영역 및 L쇄 V영역은 1개 이상의 아미노산을 함유하는 연결기에 의해 연결되는 것을 특징으로 하는 재구성 폴리펩티드.
  8. 제 4항, 제 5항 및 제 7항 중 어느 한 항에 기재된 단일쇄 Fv를 코드하는 것을 특징으로 하는 DNA.
  9. 제 6항 또는 제 7항에 기재된 폴리펩티드를 코드하는 것을 특징으로 하는 DNA.
  10. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, H쇄 V영역 및/또는 L쇄 V영역은 인간형화인 것을 특징으로 하는 재구성 폴리펩티드.
  11. 제 10항에 기재된 폴리펩티드를 코드하는 것을 특징으로 하는 DNA.
  12. 제 1항 내지 제 7항 및 제 10항 중 어느 한 항에 기재된 재구성 폴리펩티드를 생성하는 것을 특징으로 하는 동물세포.
  13. 제 1항 내지 제 7항 및 제 10항 중 어느 한 항에 기재된 재구성 폴리펩티드를 생성하는 것을 특징으로 하는 미생물.
  14. 활성성분으로서, 제 1항 내지 제 7항 및 제 10항 중 어느 한 항에 기재된 재구성 폴리펩티드를 함유하는 것을 특징으로 하는 혈액질환용 치료제.
  15. 제 14항에 있어서, 혈액질환은 백혈병인 것을 특징으로 하는 치료제.
  16. 제 14항에 있어서, 상기 활성성분은 제 4항, 제 5항 및 제 7항 중 어느 한 항에 기재된 단일쇄 Fv인 것을 특징으로 하는 치료제.
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