KR20020081824A - 아까시재목버섯에서 유래된 렉틴의 제조방법 - Google Patents

아까시재목버섯에서 유래된 렉틴의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 구멍장이버섯과에 속하는 담자균류의 일종인 아까시재목버섯의 자실체 또는 인공배양 균사체로부터, 항암면역활성이 우수한 렉틴을 제조하는 방법 및 전기 방법으로 제조된 렉틴에 관한 것이다. 본 발명의 아까시재목버섯에서 렉틴을 제조하는 방법은 아까시재목버섯 자실체 또는 인공배양 균사체에 용매를 가하고 분쇄하여, 추출물을 수득하는 단계; 전기 추출물을 감압농축하고, 황산암모늄을 가하여, 1차 침전물을 수득하는 단계; 전기 1차 침전물을 용매에 용해시키고, 저급알콜을 첨가하여, 2차 침전물을 수득하는 단계; 및, 2차 침전물을 용매에 용해시키고, 투석 또는 한외여과하여 렉틴을 수득하는 단계를 포함한다. 본 발명의 아까시재목버섯에서 유래된 렉틴은 우수한 항암활성 및 면역활성을 가지고 있으므로, 항암치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

아까시재목버섯에서 유래된 렉틴의 제조방법{Process for Preparing Lectin Drived from Fomitella fraxinea}
본 발명은 아까시재목버섯(Fomitella fraxinea)에서 유래된 렉틴(lectin)의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 구멍장이버섯과(Polyporaceae)에 속하는 담자균류의 일종인 아까시재목버섯의 자실체 또는 인공배양 균사체로부터, 항암면역활성이 우수한 렉틴을 제조하는 방법 및 전기 방법으로 제조된 렉틴에 관한 것이다.
렉틴이란 특정 당과 결합하는 단백질 또는 약간의 당이 결합된 당단백질(glycoprotein)로서 비면역계에 의해 생성되는 물질군을 칭하는 용어로서, 주로, 콩과 식물에서 많이 발견되나, 최근에는 버섯류, 미생물, 동물 등으로부터도새로운 렉틴이 발견되고 있다(참조: Kilpatrick, D. C., Methods in Molecular Medicine, 9:385-392, 1995). 일반적으로, 렉틴은 적혈구 표면의 당단백(glycoprotein)의 당부분과 특이하게 결합함으로써 적혈구를 응집시키기 때문에, 응집소(agglutinin) 또는 적혈구응집소(haemagglutinin)로 불려지기도 했으나, 적혈구 응집 이외에도 백혈구 응집 효과, 백혈구 증식 자극 효과 등 다양한 생리활성이 관찰되고 있는 바, 일부 렉틴은 항암면역요법제(antitumor immunotherapeutic agent)로서의 활용가능성이 연구되고 있다.
항암면역요법(antitumor immunotherapy) 또는 면역요법(immunotherapy)이란 암의 치료법의 하나로서, 수술요법, 화학요법, 방사선요법과는 달리 체내에 존재하는 면역반응을 이용하기 때문에 일명 "생물학적 암치료법(biologic therapy of cancer)"이라고도 지칭된다. 항암면역요법은 정상조직에 대한 손상을 최소화하면서도 최대의 치료 효과를 기대할 수 있기 때문에 많은 연구자들에 의해 활발히 연구되고 있으며, 구체적으로 암백신, 단클론항체, 사이토카인류, 미생물산물 등에 대한 연구가 진행되고 있다.
버섯류의 단백다당체는 이중 미생물산물에 속하며, 구름버섯(Coriolus versicolor) 배양균사체로부터 분리한 크레스틴(Krestin, PS-K)은 1970년대말에 개발되어 현재까지 사용되고 있고, 국내에서도 구름버섯 자실체로부터 코포랑(Copolang)이 개발되어 사용되고 있다. 뿐만 아니라, 1990년대에는 국내 연구진에 의해 상황버섯(Phellinus linteus) 균사배양 추출물이 "메시마-엑스"라는 의약품으로 허가를 얻어 암의 치료에 사용되고 있다. 이처럼 버섯의 항암면역활성성분에 관한 연구는 주로 단백다당체에 집중되어 이루어졌음을 알 수 있는데, 버섯의 단백다당체는 세포벽 구성 성분으로서, 분자량이 통상 10만 이상 수백만에 달하는 거대 분자로서 열에 매우 안정하고 유기용매에 녹지 않으며 물에 대해서도 상온에서는 추출이 되지 않기 때문에, 일반적으로 시료를 상압 또는 고압하에 1∼10 시간 가열하고 추출하는 열탕추출법이 사용된다.
그러나, 전기 열탕추출법으로는 렉틴 성분이 모두 파괴되므로, 버섯류의 항암면역활성 성분에 관한 그 동안의 연구는 대개 렉틴을 근본적으로 배제한 연구로 볼 수 있다. 그러나, 단백다당체가 10∼100㎍/㎖ 안팎의 농도에서 백혈구를 자극하여 활성화시키는 반면, 렉틴류는 이보다 훨씬 낮은 농도에서 활성을 나타내는 등 매우 우수한 활성을 나타내므로, 1990년대 부터는 버섯류의 렉틴 성분에 관한 연구가 활발히 이루어지고 있다.
아까시재목버섯은 봄부터 가을에 걸쳐 벚나무, 사과나무, 아카시아 등 살아있는 활엽수의 그루터기에 발생하는 1년생 백색 목재 부후성 버섯으로, 외관상 영지버섯과 혼동을 일으키기도 하나 영지버섯과는 달리 대(stipe)가 없으며 평활한 유구형의 포자를 가지며, 다른 버섯보다 우수한 항종양활성을 나타낸다. 아까시재목버섯의 항종양 성분으로는 다당체(polysaccharide)가 알려져 있으며, 최근에는 조수묵 등에 의해 다당체의 면역활성에 관한 연구결과가 보고되기도 했다(참조: 한국균학회지 23(4):340-347, 1995). 이러한, 아까시재목버섯의 다당체는 면역활성화를 통하여 항종양 활성을 나타낼 것으로 기대되고 있으나, 아까시재목버섯에 포함된 실질적인 유효물질의 규명에 대하여는 아직까지는 별다른 연구결과가 보고되지 않고있는 실정이다.
따라서, 아까시재목버섯의 우수한 항종양활성을 나타내는 물질을 규명하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.
이에, 본 발명자들은 아까시재목버섯의 우수한 항종양활성을 나타내는 물질을 규명하고자 예의 연구노력한 결과, 아까시재목버섯에서 추출된 렉틴이 우수한 면역활성화 효과와 항종양효과를 나타냄을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 아까시재목버섯으로부터 렉틴을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 전기 방법으로 제조된 아까시재목버섯으로 부터 유래된 렉틴을 제공하는 것이다.
도 1은 각종 버섯에서 수득한 렉틴희석액의 적혈구 응집활성을 비교한 사진이다.
본 발명의 아까시재목버섯에서 렉틴을 제조하는 방법은 아까시재목버섯 자실체 또는 인공배양 균사체에 용매를 가하고 분쇄하여, 추출물을 수득하는 단계; 전기 추출물을 감압농축하고, 황산암모늄을 가하여, 1차 침전물을 수득하는 단계; 전기 1차 침전물을 용매에 용해시키고, 저급알콜을 첨가하여, 2차 침전물을 수득하는 단계; 및, 2차 침전물을 용매에 용해시키고, 투석 또는 한외여과하여 렉틴을 수득하는 단계를 포함한다.
이하, 본 발명의 아까시재목버섯에서 렉틴을 제조하는 방법을 보다 구체적으로 설명하기로 한다.
제 1단계: 추출물의 수득
아까시재목버섯 자실체 또는 인공배양 균사체에 용매를 가하고 분쇄하여, 추출물을 수득한다: 이때, 용매로는 물, pH 7.0 내지 9.0의 4mM 내지 1M Tris 완충용액, 0.001 내지 1.0N NaOH 용액, 0.001 내지 1.0N HCl 용액 또는 0.1 내지 5.0%(w/v) NaCl 용액을 사용함이 바람직하다. 아까시재목버섯 자실체 또는 인공배양 균사체를 전기 추출용매에 침지하고, 0℃ 내지 상온에서 1시간 내지 2일동안 교반한 후, 여과 또는 원심분리하여 추출물을 수득한다.
제 2단계: 1차 침전물의 수득
전기 추출물을 감압농축하고, 황산암모늄을 가하여, 1차 침전물을 수득한다: 이때, 렉틴의 활성을 유지하기 위하여 감압농축은 5 내지 60℃에서 수행함이 바람직하다: 전기 감압농축된 추출물에 황산암모늄을 150 내지 250g/L의 농도로 용해시키고, 0℃ 내지 상온에서 수분 내지 하룻밤동안 정치한 다음, 원심분리하여 상층액을 수득한다. 이어, 상층액에 황산암모늄을 400 내지 450g/L의 농도가 되도록 첨가하고, 다시 0℃ 내지 상온에 수분 내지 하룻밤동안 정치한 다음 원심분리하여, 1차 침전물을 수득한다.
제 3단계: 2차 침전물의 수득
전기 수득한 1차 침전물을 용매에 용해시키고, 저급알콜을 혼합하여, 2차 침전물을 수득한다: 이때, 사용한 용매는 제 1단계에서 사용한 용매와 동일하고, 저급알콜로는 에탄올 또는 메탄올을 사용함이 바람직하며, 용매와 저급알콜의 혼합비율은 1:1 내지 1:5(v/v)가 바람직하다.
제 4단계: 불순물의 제거
2차 침전물을 용매에 용해시키고, 투석 또는 한외여과하여 렉틴을 제조한다: 제 3단계에서 수득한 2차 침전물에는 렉틴의 활성을 억제하는 불순물이 포함되어 있으므로, 이를 제거하기 위하여, 투석 또는 한외여과방법으로 불순물을 제거하여, 렉틴을 제조한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 아까시재목버섯에서 유래된 렉틴의 제조
아까시재목버섯 40g에 500㎖의 Tris 완충용액(10mM, pH 7.5)을 가하고, 믹서기로 2분간 분쇄한 후, 4℃에서 하룻밤 동안 정치한 다음, 감압여과하여 추출물을 수득하였다. 추출물에 황산암모늄을 210g/L의 농도로 용해시키고, 원심분리(4℃, 14,000rpm)하여 상등액을 수득한 다음, 상등액에 황산암모늄을 420g/L의 농도로 추가로 용해시키고, 4℃에서 하룻밤 동안 정치한 다음, 원심분리(4℃, 14,000rpm)하여 1차 침전물을 수득하였다. 전기 1차 침전물을 50㎖의 Tris 완충용액(pH 7.5)에 용해시키고, 200㎖의 95%(v/v) 에탄올을 혼합하여, 4℃에서 1시간 동안 방치시킨 후, 원심분리하여 2차 침전물을 수득하였다. 2차 침전물을 동일한 50㎖의 Tris 완충용액에 용해시키고, 투석막에 넣어 7일간 투석하는데, 투석 외액은 Tris 농도를 점차 낮추어 최종적으로는 증류수로 투석을 완료하여 렉틴수용액(50㎍/㎖)을 수득하였다. 전기 렉틴수용액을 동결 건조하여 아까시재목버섯의 렉틴 500㎎을 제조하였다.
실시예 2: 아까시버섯에서 유래된 렉틴의 화학분석
전기 제조된 렉틴에 함유된 총당함량과 총단백함량을 측정하였다. 즉, 총당함량은 안쓰론(Anthrone)법에 따라 포도당을 표준당으로 하여 안쓰론시약과 반응시켜 나타나는 발색도를 625nm에서 측정하여 검량곡선에 의거하여 분석하고(참조: Norris J.R. et al.,Methods in Microbiology. 5B: Academic Press, New York, 209-339, 1971), 총단백함량은 쿠마씨에 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue)법을 변형시켜서, 소 혈청 알부민(bovine serum albumin)을 표준단백질로 사용하여 620nm에서 측정하였다(참조: Sedmark J.J. et al.,Anal. Biochem., 79: 544-553, 1977). 그 결과, 렉틴의 총당함량은 11 내지 14%(w/w)이고, 총단백함량은 35 내지 60%(w/w)이므로, 당과 단백질의 함량비율이 1:2.5 내지 1:5.5(w/w)임을 알 수 있었다.
실시예 3: 아까시재목버섯에서 유래된 렉틴의 적혈구 응집효과
일반적으로 알려진 랙틴의 적혈구 응집효과를 이용하여, 아까시버섯에서 유래된 랙틴의 활성을 다른 버섯에서 유래된 렉틴의 활성과 비교하였다. 아까시재목버섯 대신에 큰눈물버섯, 노랑난버섯, 족제비눈물버섯, 밀버섯, 조개껍질버섯 또는 암회색광대버섯을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 각 버섯의 렉틴수용액을 50㎍/㎖의 농도로 수득하였다. 이어, 실시예 1에서 수득한 렉틴수용액과 전기 수득한 각 버섯의 렉틴수용액을 1, 2, 4, 8 또는 16배로 희석하여 렉틴희석액을 준비하고, 적혈구 응집효과를 위하여, CR계 생쥐의 말초혈액을 5IU/㎖ 헤파린-생리식염수로 10배 희석한 혈액 희석액을 준비하였다. 그런 다음, 혈액 희석액을 96웰 배양용기에 25㎕씩 넣고, 각각의 렉틴희석액 25㎕를 가하여 37℃ 배양기 내에서 2시간 동안 반응시킨 후, 적혈구의 응집효과를 비교하였다(참조: 도 1). 도 1은 각종 버섯에서 수득한 렉틴희석액의 적혈구 응집활성을 비교한 사진으로, C는 렉틴희석액이 첨가되지 않은 대조군, FF는 아까시재목버섯의 렉틴희석액, PV는 큰눈물버섯의 렉틴희석액, PL은 노랑난버섯의 렉틴희석액, PC는 족제비눈물버섯의 렉틴희석액, CC는 밀버섯의 렉틴희석액, LB는 조개껍질버섯의 렉틴희석액, AP는 암회색광대버섯의 렉틴희석액을 처리한 경우를 나타낸다. 도 1에서 보듯이, 아까시재목버섯의 렉틴희석액은 16배로 희석되어도 강력한 적혈구 응집현상을 나타내므로, 다른 버섯의 렉틴보다 우수한 렉틴활성을 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 4: 아까시재목버섯에서 유래된 렉틴의 비장세포 활성화 효과
BALB/c계 생쥐의 비장을 적출하고, 100메쉬 금속망을 통과시켜 단세포로 분리한 다음, 2 ×106cell/㎖의 농도로 RPMI1640 배지에 현탁하여 플라스틱 시험관에 500㎕ 씩 분주하였다. 이어, 아무것도 첨가되지 않은 대조군, RPMI1640 배지에 용해시킨 콘카나발린 A(Concanavalin A)를 2.5㎍/㎖의 농도가 되도록 첨가한 비교군, 실시예 1에서 제조한 렉틴을 RPMI1640 배지에 용해시킨 렉틴 용액을 2.5㎍/㎖의 농도가 되도록 첨가한 실험군1과 10㎍/㎖의 농도가 되도록 첨가한 실험군2를 준비하고, 각 군을 18시간 동안 37℃, 5%(v/v) CO2상태에서 배양하였다. 배양 후, 세포현탁액 300㎕에 25㎍/㎖가 되도록 프로피디움아이오다이드(propidium iodide)를 가하고, 유세포분석기(FACSCalibur, Beckton Dickinson, USA)를 이용하여, 세포생존률, 세포직경, 세포직경 증가율, 생존세포수 및 생존증가율을 분석하였다(참조: 표 1).
아까시재목버섯에서 유래된 렉틴의 비장 임파구 활성화 효과
비교항목 대조군 비교군 실험군1 실험군2
세포생존률(%) 88.6 89.6 93.1 93.9
세포직경(FSB) 279.6 ±0.5 327.8 ±0.4** 314.0 ±0.4** 337.3 ±0.3**
세포직경 증가율(%) - 17.2 12.3 20.6
생존세포수 6,061 ±262 6,371 ±118 7,759 ±168* 7,712 ±62*
생존증가율(%) - 5.1 28.0 27.2
* : p < 0.01,
** : p < 0.001
상기 표 1에서 보듯이, 아까시재목버섯에서 유래된 렉틴은 BALB/c계 생쥐 비장의 세포직경을 12.3%(2.5㎍/㎖) 및 20.6%(10.0㎍/㎖) 증가시킴으로써, 현저한 비장세포 자극효과를 나타내었다. 뿐만 아니라, 생존 세포수를 28.0%(2.5㎍/㎖) 및 27.2%(10.0㎍/㎖) 증가시키고 세포생존율도 현저히 증가시킴으로써 세포에 나쁜 영향을 주지 않고, 활성을 유지 또는 향상시키는 활성을 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 5: 아까시재목버섯에서 유래된 렉틴의 항암효과
대조군의 생쥐는 ICR계 생쥐에 생리식염수 5㎖을 1일 1회씩 3일간 복강주사하고, 제 5일째, 생쥐의 육종암 세포(sarcoma 180, 5 ×104cells/mouse)를 복강내 이식한 다음, 생리식염수 5㎖을 복강주사하고, 제 6일째 다시 생리식염수 5㎖을 복강주사하였다. 실험군의 생쥐는 생리식염수 대신 렉틴을 10㎎/㎖의 농도로 용해시킨 생리식염수를 사용하여 2㎎/㎏의 양을 복강주사하는 것을 제외하고는, 대조군과 동일하게 처리하였다. 제 7일째에 생쥐를 죽여, 5㎖의 5 IU/㎖ 헤파린-생리식염수를 복막에 주사하고 2 분간 고르게 마사지한 후, 200㎕의 복수액을 수득하였다. 또한, 비장을 적출하고, 100-mesh 체를 통과시켜서 비장을 세절하여, 비장세포를 수득하였다. 전기 수득한 복수액에 포함된 세포과 비장세포를 3%(v/v) 태아송아지혈청(fetal bovine serum)이 첨가된 인산완충용액(phosphate buffered saline, pH 7.2)으로 세척하였다. 세척된 비장세포는 각 세포의 평균무게를 측정하여 비교하였다. 또한, 세척된 복수액에 포함된 세포는 빙욕상에서 20분 동안 피코에리트린(phycoerythrin, PE)이 결합된 항-마우스 CD4 항체, PE가 결합된 항-마우스 CD8 항체, 플루오레신이소티오사이아네이트(fluoresceinisothiocyanate, FITC)이 결합된 항-마우스 CD45 항체 및 FITC가 결합된 항-마우스 CD25 항체로 면역형광 염색시키고, 3%(v/v) 태아송아지혈청(fetal bovine serum)이 첨가된 인산완충용액으로 세척한 다음, 프로피디움아이오다이드(propidium iodide)를 25㎍/㎖의 농도로 첨가하였다. 그런 다음, 유세포분석기(FACSCalibur, Beckton Dickinson,U.S.A.)를 이용하여 복강으로 유입된 종양세포의 수를 측정하고, 실험군과 대조군의 결과를 비교하였다(참조: 표 2). 이때, 종양저지율은 대조군의 종양세포수에 대하여, 실험군에서 감소된 종양세포수의 비율을 나타낸다.
렉틴의 항암활성 측정
비장의 무게(㎎) 종양세포의 수(×102세포) 종양저지율(%)
대조군 127 ±9 583.4 ±244.5 -
실험군 175 ±13** 30.6 ±5.6* 94.8
*: p< 0.01
**: p< 0.001
상기 표 2에서 보듯이, 아까시재목버섯에서 유래된 렉틴은 매우 낮은 투여용량(2㎎/㎏)에서도 강력한 항암효과를 발휘하여 sarcoma 180 육종암의 복강유입을 94.8% 억제하였을 뿐만 아니라, 비장중량을 증가시키는 등 면역활성이 탁월함을 알 수 있었다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 구멍장이버섯과에 속하는 담자균류의 일종인 아까시재목버섯의 자실체 또는 인공배양 균사체로부터, 항암면역활성이 우수한 렉틴을 제조하는 방법 및 전기 방법으로 제조된 렉틴을 제공한다. 본 발명의 아까시재목버섯에서 유래된 렉틴은 아까시재목버섯 자실체 또는 인공배양 균사체의 추출물로부터 황산암모늄 및 알코올침전물을 수득하고, 이를 수용액에 용해시켜 불순물을 제거함으로써 제조한다. 본 발명의 아까시재목버섯에서 유래된 렉틴은 우수한 항암활성을 가지고 있으므로, 항암치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Claims (6)

  1. (ⅰ) 아까시재목버섯 자실체 또는 인공배양 균사체에 용매를 가하고 분쇄하여, 추출물을 수득하는 단계;
    (ⅱ) 전기 추출물을 감압농축하고, 황산암모늄을 가하여, 1차 침전물을 수득하는 단계;
    (ⅲ) 전기 1차 침전물을 용매에 용해시키고, 저급알콜을 첨가하여, 2차 침전물을 수득하는 단계; 및,
    (ⅳ) 2차 침전물을 용매에 용해시키고, 투석 또는 한외여과하여 렉틴을 제조하는 단계를 포함하는 아까시재목버섯에서 유래된 렉틴의 제조방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    용매는 물, 중성 내지 약 알칼리성 Tris 완충용액, 0.001 내지 1.0N
    NaOH 용액, 0.001 내지 1.0N HCl 용액, 0.1 내지 5.0%(w/v) NaCl 용액
    또는 pH 4.0 내지 9.0의 완충액인 것을 특징으로 하는
    아까시재목버섯에서 유래된 렉틴의 제조방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    감압농축은 5 내지 60℃에서 수행하는 것을 특징으로 하는
    아까시재목버섯에서 유래된 렉틴의 제조방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    1차 침전물은 감압농축된 추출물에 황산암모늄을 150 내지 250g/L의
    농도로 용해시키고, 0℃ 내지 상온에서 수분 내지 하룻밤동안 정치한
    다음, 원심분리하여 상층액을 수득하고, 상층액에 황산암모늄을 400
    내지 450g/L의 농도로 용해시킨 후, 0 ℃ 내지 상온에 수분 내지 하룻
    밤동안 정치하고 원심분리하여, 수득하는 것을 특징으로 하는
    아까시재목버섯에서 유래된 렉틴의 제조방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    저급알콜은 에탄올 또는 메탄올이고, 용매와 저급알콜의 혼합비율은
    1:1 내지 1:5(v/v)인 것을 특징으로 하는
    아까시재목버섯에서 유래된 렉틴의 제조방법.
  6. 제 1항의 방법으로 제조되며, 다음과 같은 이화학적 특징을 가지는 아까시재목버섯에서 유래된 렉틴:
    (ⅰ) 안쓰론(Anthrone)법에 따라 포도당을 표준당으로 하여 안쓰론(Anthrone)시약과 반응시켜 나타나는 발색도를 625nm에서 측정하고, 검량곡선에 의거하여 분석한 결과, 총당함량이 11 내지 14%(w/w)이고; 및,
    (ⅱ) 쿠마씨 브릴리언트 블루법을 변형시켜서, 소 혈청 알부민을 표준단백질로 사용하여 620nm에서 측정한 결과, 총단백함량은 35 내지 60%(w/w)이다.
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