KR20020041550A

KR20020041550A - 인간 자궁경부암 2 원암 유전자 및 이에 의해 코딩되는단백질, 이를 포함하는 발현벡터 및 이 벡터로 형질전환된세포

Info

Publication number: KR20020041550A
Application number: KR1020000071202A
Authority: KR
Inventors: 김진우
Original assignee: 김진우
Priority date: 2000-11-28
Filing date: 2000-11-28
Publication date: 2002-06-03
Also published as: DE60118382T2; US6905844B2; DE60118382D1; CA2430331A1; CN1246458C; ATE321858T1; ES2261429T3; EP1346039B1; EP1346039A4; US20040029199A1; WO2002044370A1; JP2004514446A; KR100426453B1; EP1346039A1; AU2001269584A1; JP3730623B2; CN1476478A

Abstract

본 발명은 신규 원암 유전자 및 이에 의해 코드되는 단백질에 관한 것으로, 본 발명의 원암 유전자는 기존의 보고된 원암 유전자와는 전혀 상동성을 나타내지 않는 신규 유전자로서 유방암, 백혈병, 림프종, 신장암, 난소암, 위암, 폐암, 자궁암을 비롯한 암의 진단, 형질전환 동물의 제조 및 안티-센스(anti-sense) 유전자치료 등에 효과적으로 이용될 수 있다.

Description

인간 자궁경부암 2 원암 유전자 및 이에 의해 코딩되는 단백질, 이를 포함하는 발현벡터 및 이 벡터로 형질전환된 세포{HUMAN CERVICAL CANCER 2 PROTOONCOGENE AND PROTEIN ENCODED BY SAME, EXPRESSION VECTOR CONTAINING SAME, AND CELL TRANSFORMED BY SAID VECTOR}

인간을 포함한 고등동물들은 약 100,000 개의 유전자들을 갖고 있으나 이들중 약 15% 만이 각각의 개체에서 발현된다. 따라서, 어떠한 유전자가 선택되어 발현되느냐에 따라서 생명의 모든 현상 즉 발생, 분화, 항상성(homeostasis), 자극에 대한 반응, 세포분열 주기조절, 노화, 및 아폽토시스(apoptosis; programmed cell death)등이 결정된다(Liang, P. and A. B. Pardee,Science, 257 ,967-971(1992)).

종양발생과 같은 병리학적 현상은 유전자 변이과정으로 유발되어 결국에는 유전자 발현의 변화를 유도하게 된다. 따라서 상이한 세포들 사이에서 나타나는 유전자 발현들의 비교는 여러 생물학적 현상을 이해하는데 기본적이고 효과적인 접근방법이라고 할 수 있다.

예를 들면, 리앙과 파디(Liang and Pardee, 상기 문헌 참조)에 의해 제안된mRNA 감별전개(differential display) 방법은 현재 종양억제 유전자나 세포분열 주기(cell cycle)에 관련된 유전자 및 아폽토시스에 관련된 전사조절 유전자(transcriptional regulatory gene) 등의 탐색에 효과적으로 이용되고 있으며 또한 하나의 세포에서 일어나는 다양한 유전자들의 상호 관련성의 규명에도 다양하게 활용되고 있다.

종양발생에 대한 여러 연구결과들을 종합하여 보면 특정 염색체부위의 소실(loss of chromosomal heterozygosity), 원암 유전자들의 활성화 및 p53 유전자를 포함한 다른 종양억제 유전자들의 불활성화 등과 같은 여러 가지 유전적 변화들이 종양조직에 축적되어 인간종양을 일으킨다고 보고되었다(Bishop, J. M.,Cell, 64, 235-248(1991); 및 Hunter, T.,Cell, 64, 249-270(1991)). 또한, 암의 10 내지 30%는 원암유전자가 증폭됨으로써 원암 유전자가 활성화되어 일어난다고 보고되어 있다.

원암유전자의 활성화는 많은 암의 병인학 연구에 중요한 역할을 하며, 이를 밝히는 것이 요구되고 있다.

이에 본 발명자들은 자궁경부암의 발생기전을 원암 유전자 수준에서 접근한 결과, 인간 자궁경부암 2(HCCR-2)으로 명명된 원암유전자가 암세포에서만 특이하게 발현된다는 것을 밝혀내었다. 상기 원암유전자는 유방암, 백혈병, 림프종, 신장암, 위암, 난소암, 폐암 및 자궁경부암과 같은 다양한 암의 진단, 예방 및 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 신규 원암 유전자 및 그의 단편을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 유전자에 의해 코딩되는 원암 단백질 및 그의 단편을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 원암 유전자 또는 그 단편을 포함하는 발현벡터 및 이로 형질전환된 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 원암 유전자 또는 그 단편을 포함하는 암 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 원암 단백질 또는 그 단편을 포함하는 암 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 원암 유전자 또는 그의 단편으로부터 유도되는 mRNA에 상보적인 염기서열을 지닌 안티센스 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 안티센스 유전자를 포함하는 항암 조성물을 제공하는 것이다.

도 1은 정상 자궁경부 조직, 초기 자궁경부암 조직, 전이 임파절 조직 및 자궁경부암 세포주(CUMC-6)들에서 HCCR-2 원암 유전자의 단편인 206 bp 크기의 cDNA 발현여부를 감별전개 방법으로 확인한 결과를 나타낸 것이며;

도 2는 정상 자궁경부 조직, 자궁경부암조직 및 자궁경부암 세포주(CaSki 및 CUMC-6)들에서 HCCR-2 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블랏 분석 결과를 나타낸 것이며;

도 3a는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 HCCR-2 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블랏 분석 결과를 나타낸 것이며;

도 3b는 도 3A와 동일한 샘플을 β-액틴으로 하이브리드시켜 얻은 결과를 나타낸 것이며;

도 4a는 인간 암 세포주들에서 HCCR-2 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블랏 분석 결과를 나타낸 것이며;

도 4b는 도 4a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 하이브리드시켜 얻은 결과를 나타낸 것이며;

도 5a는 인간 신장암, 유방암, 폐암, 난소암, 위암 조직 및 각각의 정상 세포들에서 HCCR-2 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블랏 분석 결과를 나타낸 것이며;

도 5b는 도 5A와 동일한 샘플을 β-액틴으로 하이브리드시켜 얻은 결과를 나타낸 것이며;

도 6은 야생형 NIH/3T3 섬유모세포를 단층배양시킨 후 그 성장양상을 위상차 현미경으로 관찰한 것이며;

도 7은 HCCR-2 원암 유전자가 형질도입된 NIH/3T3 섬유모세포(HCCR-2M 세포)를 단층배양시킨 후 그 성장양상을 위상차 현미경으로 관찰한 것이며;

도 8은 HCCR-2 원암 유전자가 형질도입된 NIH/3T3 섬유모세포를 단층배양한 후 헤마톡실린-에오신으로 염색하여 세포의 형태학적 특성을 관찰한 것이며;

도 9는 누드마우스에서 HCCR-2 원암 유전자가 형질도입된 NIH/3T3 섬유모세포의 종양형성능을 확인한 것이며;

도 10은 누드마우스에서 HCCR-2 원암 유전자가 형질도입된 NIH/3T3 섬유모세포에 의해 형성된 종괴를 헤마톡실린-에오신으로 염색한 후 형태학적 특성을 관찰한 것이며;

도 11은 원암 유전자가 형질도입된 NIH/3T3 섬유모세포에 의해 누드마우스에서 형성된 종괴로부터 확립된 HCCR-2MN 세포주를 단층배양시킨 후 성장양상을 위상차 현미경으로 관찰한 것이며;

도 12는 HCCR-2 원암 유전자를 대장균에 형질도입시킨후 IPTG 유도 이전 및 이후에 발현되는 단백질의 크기를 나트륨 도데실 설페이트(SDS) 아가에서 전기영동한 결과이며;

도 13은 야생형 NIH/3T3 섬유모세포, pcDNA3 벡터만을 형질 도입시킨 NIH/3T3 섬유모세포(pcDNA3) 및 HCCR-2 원암 유전자가 형질도입된 NIH/3T3 섬유모세포(HCCR-2 세포)의 웨스턴 블랏 분석 결과를 나타낸 것이며;

도 14는 신장, 유방, 폐, 난소 및 위에서 암조직 및 각각의 정상 조직의 웨스턴 블랏 분석 결과를 나타낸 것이며;

도 15는 야생형 인간 태생신(human embryonic kidney) 293 상피세포를 단층배양시킨 후 그 성장양상을 위상차 현미경으로 관찰한 것이며;

도 16은 HCCR-2 원암 유전자가 형질도입된 293 상피세포(HCCR-2H 세포)를 단층배양시킨 후 그 성장양상을 위상차 현미경으로 관찰한 것이며;

도 17은 HCCR-2 원암 유전자가 형질도입된 293 상피세포를 단층배양한 후 헤마톡실린-에오신으로 염색하여 세포의 형태학적 특성을 관찰한 것이며;

도 18은 누드마우스에서 HCCR-2 원암 유전자가 형질도입된 293 상피세포의 종양형성능을 확인한 것이며;

도 19는 누드마우스에서 HCCR-2 원암 유전자가 형질도입된 293 상피세포에 의해 형성된 종괴를 헤마톡실린-에오신으로 염색한 후 형태학적 특성을 관찰한 것이며;

도 20은 원암 유전자가 형질도입된 293 상피세포에 의해 누드마우스에서 형성된 종괴로부터 확립된 HCCR-2HN 세포주를 단층배양시킨 후 성장양상을 위상차 현미경으로 관찰한 것이며;

도 21은 야생형 293 상피세포와 HCCR-2 원암 유전자가 형질도입된 5종류(A, B, C, D, E)의 293 상피세포(HCCR-2H 세포)의 노던 블랏 분석 결과를 나타낸 것이다.

상기 목적에 따라, 본 발명에서는 서열번호: 1의 염기 서열을 갖는 원암 유전자 또는 그의 단편을 제공한다.

상기 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는원암단백질 또는 그의 단편을 제공한다

상기 또다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 원암 유전자 또는 그의 단편을 포함하는 발현벡터 및 이에 의해 형질전환된 미생물을 제공한다.

상기 또다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 원암 유전자 또는 그의 단편을 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.

상기 또다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 원암 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.

상기 또다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 원암 유전자 또는 그의 단편으로부터 전사되는 mRNA의 서열의 전부 또는 일부와 상보적인 염기서열을 지니고, 상기 mRNA에 결합하여 상기 원암 유전자 또는 단편의 발현을 억제하는 안티-센스 유전자를 제공한다.

상기 또다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 안티-센스 유전자를 활성성분으로서 포함하는 함암 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 원암(原癌)유전자(protooncogene)인 인간 자궁경부암 2(Human Cervical Cancer 2, HCCR-2, 이후 "HCCR-2 원암유전자"로 지칭함)은 서열번호: 1의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AF315598 호로 등록되었으며(공개예정일: 2001년 11월 1일) 이 데이터베이스에 등록된 다른 염기서열과는 유사성이 거의 없는 신규 유전자이다.

서열번호: 1의 염기서열에는 63 내지 977 번째의 염기부위에 해당하는 오픈리딩 프레임(open reading frame)이 포함되며 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 2를 가지고, 321 내지 380번째 염기부위는 단일 막통과 도메인(single transmembrane domain)을 코딩하며 이는 서열번호: 2에서 87 내지 106 번째 아미노산 잔기에 해당된다. 이로부터, 본 발명의 유전자는 막 수용체(membrane receptor) 유전자일 것으로 판단된다. 또한, 단일 N-글리코실화 부위가 서열번호: 1의 831 내지 839 번째 염기부위에 해당하는 것으로 보이고 이로부터 HCCR-2 단백질의 C-말단 부근에 위치하는 서열번호: 2의 257 내지 259 번째에 해당하는 아미노산 잔기가 추정되므로, HCCR-2 단백질은 II형 막단백질인 것으로 보인다. 폴리아데닐화 시그널은 서열번호: 1의 1894 내지 1898 번째의 염기부위에 해당한다.

그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암 유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 1의 원암 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 유전자 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 원암 유전자로부터 발현되는 단백질은 304개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 2의 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 45 kd이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 원암 유전자 및 단백질은 사람의 암 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩타이드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자는 서열번호: 1의 염기서열 정보를 토대로 통상적인 방법에 따라 스크린닝 및 클로닝하여 얻을 수 있다. 다른 예로는 정상 조직과, 암 조직 또는 세포주로부터 추출한 총 RNA에 대해 서열번호: 3의 임의 프라이머 및 서열번호: 5의 H-T11C 고정 올리고-dT 프라이머(anchored oligo-dT primer)를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT PCR)을 수행하여 암 조직 또는 세포주에서는 발현되지 않으면서 정상 조직에서만 차별적으로 발현되는 206 bp cDNA 단편을 얻고, 이 단편을 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리와 플라크 하이브리드화시켜 전장(full length) cDNA 클론을 얻을 수 있다. 본 발명자들은 이 전장 cDNA 클론을 발현벡터 pCEV-LAC(Miki, T.et al.,Gene,83, 137-146(1989))에 삽입한 후 대장균 JM109에 형질전환시켰으며, 얻어진 형질전환체를 대장균 JM109/HCCR2로 명명하고 생명공학연구소 부설 유전자 은행에 1999년 10월 14일자로 기탁번호 제 KCTC 0668BP 호로서 기탁하였다.

또한, 이렇게 제조된 유전자를 당 분야에 공지된 미생물 또는 동물 세포 발현용 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 제조한 후 이를 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 또는 효모 세포 등에 도입시킬 수 있다. 벡터의 제작시에는, 상기 원암 유전자 또는 단백질을 생산하고자 하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터, 터미네이터 등과 같은 발현 조절서열, 자가복제서열 및 분비 시그날 등을 적절히 선택하고 조합할 수 있다.

본 발명의 유전자는 노던 블랏(Northern blot) 등의 분석방법에서 정상 자궁경부조직에서는 발현이 거의 확인되지 않은 반면 자궁경부암 조직과 자궁암 세포주들에서는 그 과발현이 확인되므로 자궁암을 유발시키는 강력한 발암 유전자로 판단된다. 정상 섬유모세포(fibroblast)(NIH/3T3)에 이 유전자를 형질도입(transfection)시키면 정상 섬유모세포의 형태 즉 섬유모세포가 기원하는 간엽조직 (mesenchymal tissue)과는 전혀 다른 크기와 모양을 나타내는 형태의 세포 모양을 나타낸다. 새로운 형태의 세포들을 광학 현미경과 전자현미경으로 분석하면 종양세포의 형태학적 소견을 확인할 수 있다.

또한, 본 발명의 원암 유전자를 형질도입시킨 정상 섬유모세포를 누드 마우스의 둔위 부위에 접종시 약 28일이 경과하면서부터 종괴의 형성소견이 보이면서 약 40일이 경과시 1 cm X 1 cm 크기의 종양이 형성된다. 형성된 종괴는 헤마톡실린-에오신 염색시에 암종(carcinoma)이 확인되었다.

자궁경부암과 같은 상피성 조직외에도, 본 발명의 원암 유전자는 유방암, 백혈병, 림프종, 신장암, 난소암, 폐암 및 위암과 같은 많은 다른 암 종양에서 발현된다. 따라서, 본 발명의 원암유전자는 다양한 암의 발생에 공통된 발암유전자일 것으로 판단되며, 다양한 암의 진단, 형질전환된 동물의 제조 및 안티-센스(anti-sense) 유전자 치료 등에 효과적으로 이용될 수 있다.

상기 원암 유전자를 이용한 암의 진단 방법은, 예를 들어, 상기 원암 유전자의 전부 또는 일부를 프로브로서 사용하여 대상자의 체액으로부터 분리한 핵산과 하이브리드화한 후 당 분야에 공지된 다양한 방법으로 이를 검출하므로써 대상자가 본 발명의 원암 유전자를 가지고 있는지를 판단하는 과정을 포함한다. 상기 프로브를 방사선 동위원소 또는 효소 등으로 표지하면 용이하게 유전자의 존재를 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명에서는 상기 원암 유전자의 전부 또는 일부를 포함하는 암 진단용 키트를 역시 제공한다.

형질전환 동물은 본 발명의 원암 유전자를 포유동물, 예를 들어, 래트 등의 설치류 동물에 도입함으로써 제조할 수 있으며, 이 유전자를 적어도 8세포기 이전의 수정란 단계에서 도입하는 것이 바람직하다. 이렇게 제조된 형질전환 동물은 발암성 물질 또는 항산화제와 같은 항암성 물질의 탐색 등에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 유전자 치료에 효과적인 안티-센스 유전자를 제공한다. 본원에서, "안티센스 유전자(anti-sense gene)"는 서열번호: 1의 원암 유전자 또는 그의 일부로부터 전사되는 mRNA의 일부 또는 전부와 상보적인 서열을 가지는 염기서열로서, 상기 mRNA의 단백질 결합부위에 결합하여 원암유전자의 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)을 파괴할 수 있는 서열을 갖는 DNA 서열을 환자의 체내로 도입함으로써 상기 원암 유전자의 발현으로 인한 암을 예방 또는 치료할 수 있다.

본 발명은 또한 그 범위내에 본 발명의 안티센스 유전자의 치료 효과량을 환자에게 투여하여 암을 치료 또는 예방하는 방법을 포함한다.

본 발명의 안티센스 유전자 치료에서, 본 발명의 안티센스 유전자는 통상적인 방법으로 환자에게 투여되어 원암유전자의 발현을 예방한다. 예를 들면, 문헌[J.S. Kimet al., J. Controlled Release,53, 175-182(1998)]의 방법에 따라 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN)를 폴리-L-리신 유도체와 정전기적 인력에 의하여 혼합시키고, 이 혼합체를 환자에게 정맥투여한다.

본 발명의 범위에는 또한, 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 경우에 따라 다른 첨가제와 함께 본 발명의 안티센스 유전자를 활성성분으로 포함하는 항암조성물을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물을 주사제로 제제화하는 것이 바람직하다.

실제로 투여되는 안티센스 유전자의 양은 치료되는 증상, 투여 경로, 환자의 연령 및 체중, 증상의 중증도와 같은 다양한 관련되는 인자를 고려하여 결정한다.

본 발명의 원암 유전자로부터 유도되는 단백질은 진단 도구로서 항체를 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 항체는, 본 발명의 원암 유전자로부터 발현된 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 그의 단편을 이용하여당 분야에 공지된 통상의 방법에 따라 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체로서 제조할 수 있으며, 이러한 항체들을 이용하여 당분야에 공지된 효소 면역측정법(enzyme linked immunosorbent assay; ELISA), 방사선면역측정법(radioimmunoassay; RIA), 샌드위치 측정법(sandwich assay), 폴리아크릴 겔상의 웨스턴 블랏 또는 면역 블랏 등의 방법에 의해 대상자의 체액 시료중에 상기 단백질이 발현되었는지를 확인함으로써 암을 진단할 수 있다.

또한, 본 발명의 원암 유전자를 이용하여 지속적으로 증식할 수 있는 암 세포주를 확립할 수 있으며, 이러한 세포주는 예를 들어, 상기 원암 유전자가 형질도입된 섬유모세포를 이용하여 누드 마우스 등에 형성시킨 종양조직으로부터 제조할 수 있다. 이러한 암 세포주는 항암제 등의 탐색에 유용하게 이용될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

참조예: 총 RNA의 분리

신선한 조직 또는 배양된 세포로부터 총 RNA 분리 키트(RNeasy total RNA kit, Qiagen Inc., Germany)를 사용하여 총 RNA를 분리한 후, 키트(message clean kit, GenHunter Corp., MA)를 사용하여 RNA에 오염된 DNA를 제거하였다.

실시예 1: 종양세포 배양, 총 RNA의 분리 및 mRNA의 감별 전개

정상 자궁경부 조직, 원발성 자궁경부암 조직 및 자궁경부암 세포주에서 유전자 발현의 차별 패턴을 다음과 같이 조사하였다.

자궁 근종 환자로부터 자궁적출술(hysterectomy) 중에 정상 자궁경부(exocervical) 조직 시료를 얻었으며, 수술적 처치전에 방사선 또는 항암 치료를 받지 않은 환자의 근치 자궁절제술(radical hysterectomy) 중에 원발성 자궁경부암 조직 및 전이성 장골 림프절 조직 시료를 얻었다. 인간 자궁경부암 세포주로는 CUMC-6(Kim, J.W.et al.,Gynecol. Oncol.,62, 230-240(1996))을 사용하였다. 이들 조직 및 세포로부터 각각 참조예의 방법과 동일하게 실시하여 총 RNA를 분리하였다.

상기 수득된 조직 및 CUMC-6 세포주로부터 얻은 세포를 2 mM 글루타민, 100 IU/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 10% 우태아 혈청(Gibco, USA)이 함유된 웨이마우쓰(Waymouth's) MB 752/1 배양액(Gibco)에서 증식시켰다. 실험에 사용한 배양 세포들은 지수적 증식 도중의 세포들로서 트리판 블루(trypan blue) 염료로 염색할 때 95% 이상의 생존도를 보이는 세포를 이용하였다(프레쉬니(Freshney), "Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique" 2nd Ed., A. R. Liss, New York(1987) 참조).

각 조직 및 세포의 총 RNA 시료를 사용하여 문헌(Liang, P. and Pardee, A. B.,Science,257, 967-971(1992); 및 Liang, P.et al.,Cancer Res.,52, 6966-6968(1993))의 방법을 일부 변형하여 다음과 같이 RT-PCR을 수행하였다. 0.2㎍의총 RNA에 서열번호 : 4 내지 6 중의 하나의 고정 올리고-dT 프라이머와 함께 키트(RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA)를 사용하여 역전사한 후, 동일한 고정 올리고-dT 프라이머 및, 임의 프라이머 5'13mer인 H-AP 1 내지 32(RNAimage primer sets 1-4, H-AP 1-32) 중의 하나의 프라이머를 사용하여 0.5mM [α-³⁵S]-표지된 dATP(1,200 Ci/mmole) 존재하에서 PCR을 수행하였다. PCR은 95℃에서 40초, 40℃에서 2분, 72℃에서 40초로 이루어진 반응을 모두 40회 반복한 후 72℃에서 5 분간 더 반응시켰다. PCR-증폭된 단편을 6% 폴리아크릴아미드 염기서열 겔에서 전기영동시킨 후 오토래디오그래피하였다.

도 1은 서열번호: 3의 5'13mer 임의 프라이머와 서열번호: 5의 H-T11C 고정 올리고-dT 프라이머를 사용한 PCR 결과이다. 도 1에서 제 1 열은 정상 자궁경부 조직이며, 제 2 열은 자궁경부암 조직이고, 제 3 열은 전이성 장골 림프절 조직이며, 제4열은 자궁경부암 세포주 CUMC-6이다. 도 1에서 보듯이, 정상 자궁경부암 조직, 전이성 장골 림프절 조직 및 자궁경부암 세포주 CUMC-6에서는 206 bp cDNA 단편이 확인되었으나, 정상 자궁경부 조직에서는 발현되지 않았다. 이 cDNA 단편을 CC214로 명명하였다.

건조된 겔로부터 CC214 단편인 206 bp 밴드를 잘라내고 15 분간 가열하여 CC214 cDNA를 용출시킨후, [α-³⁵S]-표지된 dATP 및 20μM dNTP를 사용하지 않는 상태에서 상기와 동일한 프라미머 쌍을 사용하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.

재증폭된 재증폭된 cDNA 단편 CC214를 클로닝 시스템(TA cloning system, Promega)을 사용하여 발현 벡터 pGEM-T Easy에 클로닝하였으며, 염기서열 결정 키트(Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System, United States Biochemical Co.)를 사용하여 염기서열을 결정하였다. cDNA 단편 CC214는 BLAST 및 FASTA 프로그램을 이용하여 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에서 검색한 결과, 이 데이터베이스에 등록된 염기서열과는 유사성이 거의 없었다.

실시예 2: cDNA 라이브러리 스크린닝

실시예 1에서 얻은 cDNA 단편 CC214를 문헌(Feinberg, A.P. and Vogelstein, B.,Anal. Biochem.,132, 6-13(1983))의 방법에 따라 표지하여 얻은³²P-표지된 CG373 cDNA 프로브를 박테리오파지 λgt11 인간 폐 배 섬유아세포(human lung embryonic fibroblast) cDNA 라이브러리(한양 대학교 정 일엽 교수로부터 얻음)와 문헌(Sambrook, J.et al.,Molecular Cloning: A Laboratory mannual,New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 플라크 하이브리드화시켜, 인간 자궁경부암 억제 유전자 HCCR-2의 전장 cDNA 클론을 얻었다.

이 전장 cDNA의 염기서열을 결정하였으며, 그 결과는 서열번호: 1과 같았다. 이 염기서열에는 63 내지 977 번째의 염기부위에 해당하는 304 개 아미노산 잔기를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이로부터 유추된 아미노산 서열은 서열번호: 2와 같다. 321 내지 380 번째의 염기부위는 단일 막통과 도메인(singletransmembrane domain)을 코딩하며, 이로부터는 서열번호: 2에서의 87 내지 106 번째의 아미노산 잔기가 예측된다. 이로부터, 본 발명의 원암 유전자는 막 결합 유전자일 것으로 판단된다. 또한, 단일 N-글리코실화 부위가 서열번호: 1의 831 내지 839 번째 염기부위에 해당하는 것으로 보이고, 이로부터 HCCR-2 단백질의 C-말단 부근에 위치하는 서열번호: 2의 257 내지 259 번째의 아미노산 잔기가 추정되므로, HCCR-2 단백질은 II형 막단백질인 것으로 보인다. 폴리아데닐화 시그널은 서열번호: 1의 1894 내지 1898 번째 염기부위에 해당한다.

얻어진 HCCR-2 전장 cDNA 클론을 원핵생물용 발현벡터 pCEV-LAC(Miki, T.et al.,Gene,83, 137-146(1989))에 삽입한 후 대장균 JM109에 형질전환시켰으며, 얻어진 형질전환체를 대장균 JM109/HCCR2로 명명하고 생명공학연구소 부설 유전자 은행에 1999년 10월 14일 자로 기탁번호 제 KCTC 0668BP 호로서 기탁하였다.

실시예 3: HCCR-2 유전자의 노던 블랏

HCCR-2 유전자의 발현 수준을 조사하기 위해, 노던 블랏을 다음과 같이 실시하였다.

실시예 1에서 얻은 정상 자궁경부 조직 시료 3개, 원발성 자궁경부암 조직 시료 3개 및 자궁경부암 세포주(CaSki(입수처:미국 세포주 은행, American type Cell Collection ) 및 CUMC-6) 시료 2개의 총 RNA 20 ㎍을 각각 변성시킨 후 1% 포름알데히드 아가로스 겔에 전기영동한 다음 나일론 막(Boehringer-Mannheim, Germany)에 전이시켰다. 이어서 나일론 막을, 실시예 1에서 얻은 HCCR-2 전장cDNA를 사용한³²P-표지 무작위 프라임 프로브와 42 ℃에서 하룻밤 동안 하이브리드화시켰다. 노던 블랏 과정을 동일하게 2회 반복하여 하나는 덴시토미터로 정량하였으며, 다른 하나는 β-액틴 프로브와 하이브리드화시켜 mRNA 총량을 확인하였다.

도 2는 정상 자궁경부 조직, 원발성 자궁경부암 조직 및 자궁경부암 세포주에서 HCCR-1 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과 및 β-액틴의 발현을 보여주는 노던 블랏 결과이다. 도 2에서, 제 1 열 내지 제 3 열은 정상 자궁경부 조직 시료이며, 제 4 열 내지 제 6 열은 자궁경부암 조직 시료이고, 제 7 열은 자궁경부암 세포주 CaSki 시료이며, 제 8 열은 자궁경부암 세포주 CUMC-6 시료이다. 도 2에서 보듯이, HCCR-2 유전자의 발현 수준은 자궁경부암 조직 및 자궁경부암 세포주인 CaSki와 CUMC-6 세포주들에서는 현저히 관찰되었으나, 정상조직에서는 발현 정도가 매우 낮거나 관찰되지 않았다.

정상 인간 다중 조직(Clontech)과 인간 암 세포주(Clontech) 노던 블랏을 수행하였다. 즉, 정상 조직으로서 정상 뇌, 심장, 골격근, 결장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직과, 암 세포주로서 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 Raji, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포로부터 참조예의 방법에 따라 총 RNA 시료를 분리한 후 상기와 동일하게 노던 블랏을 실시하였다.

도 3a는 여러 정상 조직에서 HCCR-2 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이며 도 4b는 β-액틴의 발현을 나타내는 노던 블랏 결과이다. 도 4a 및 4b에서 제 1 열 내지 제 12 열은 각각 정상 뇌, 심장, 골격근, 결장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직 시료이다. 도 3a에서 보듯이, HCCR-2 mRNA(약 2.0 kb)은 여러 정상조직들에서는 약하게 발현되거나 또는 거의 발현을 확인할 수 없었으나, 정상 신장 조직에서는 그 발현이 높았다.

도 4a는 인간 암세포주들에서 HCCR-1 유전자의 차별 발현 수준을 나타내는 노던 블랏 결과이고 도 4b는 β-액틴의 발현을 나타내는 노던 블랏 결과이다. 도 4a 및 4b에서 제 1 열 내지 제 8 열은 각각 전 골수성 백혈병 HL-60, HeLa 자궁경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포주 K-562, 림프아세포 백혈병 MOLT-4, 버킷 림프종 Raji, SW480 결장암 세포, A549 폐암 세포 및 G361 흑색종 세포 시료이다. 도 4a 및 4b에서 보듯이, HCCR-2는 만성 골수 백혈병 세포주인 K-562, 버키트(Burkitt) 림프종 세포주인 Raji, 임파아구 백혈병 세포주인 MOLT-4 및 전골수세포 백혈병 세포주인 HL-60 및 HeLa 세포와 같은 인간 백혈병 및 림프종 세포주에서 높은 수준으로 발현됨을 알 수 있다. 특히, K-562, MOLT-4 및 HL-60은 정상 백혈구에 비하여 각각 약 190, 90 및 70배 정도 더 높은 전사 수준을 나타낸다.

또한, 암 환자로부터 얻은 신장, 유방, 폐, 난소 및 위암 조직 및 이들 각각의 정상 조직에 대한 노던 블랏 분석을 실시하였다. 도 5a에 나타낸 바와 같이, HCCR-2는 인간 암 조직에서 높은 수준으로 전사되는 반면, 정상 조직에서는 HCCR-2 유전자의 발현은 거의 관찰되지 않았다. 도 5b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.

실시예 4: 발현 벡터 및 형질전환된 설치류 동물세포의 제조

(단계 1) HCCR-2를 함유하는 벡터의 제조

HCCR-2의 코딩 부위를 함유하는 발현 벡터를 다음과 같이 제조하였다.

먼저, 실시예 2에서 수득한 전체 HCCR-2 cDNA를 원핵 발현벡터인 pCEV-LAC의SalI 제한부위에 삽입하였다(문헌[Miki, T.et al.,Gene, 83, 137-146(1989)] 참조). 이어서, 상기 pCEV-LAC/HCCR-2 벡터로부터SalI 단편을 분리하였다.

이어서, pcDNA3 발현 벡터(Invitrogen)을XhoI로 처리하여SalI과 상용성인 말단을 제조하였다. 전체 HCCR-2 코딩 서열을 지닌SalI 단편을XhoI로 처리된 pcDNA3에 삽입하였다. 생성된 pcDNA3/HCCR-2 발현 벡터를 리포펙타민(Gibco BRL)을 사용하여 NIH/3T3 정상 설치류 섬유모세포(ATCC CRL 1658)내로 형질도입시키고 G418(Gibco)을 포함하는 배지에서 선택하였다. HCCR-2로 형질도입된 NIH/3T3 세포를 "HCCR-2M 세포"로 지칭하였다. pcDNA3 만을 포함하는 NIH/3T3 세포를 대조군으로 제조한 후, 이를 "pcDNA3 세포"로 지칭하였다.

(단계 2) HCCR-2 원암유전자를 형질도입시킨 NIH/3T3 섬유모세포

도 6의 위상차 현미경 관찰 결과에서 볼 수 있는 바와 같이, 분화된 섬유모세포인 야생형 정상 NIH/3T3 세포는 길고 가느다란 핵과 빈약한 세포질을 지닌 방추형 세포이다. 단계 1에서 얻은 HCCR-2를 발현하는 NIH/3T3 세포(HCCR-2M 세포)에서 HCCR-2가 발현되는 경우, 세포의 형태는 도 7에 나타낸 바와 같이 난형의 핵 및 다량의 세포질을 지닌 다각형 모양으로 변화되었다.

HCCR-2 형질도입된 NIH/3T3을 헤마톡실린-에오신(hematoxylin-eosin, H & E) 염색을 한 후 관찰한 결과, 핵의 다형성, 뚜렷한 핵소체, 및 과립상 염색질 소견 및 종양 거대세포들을 보여주었고, 비정형 유사분열이 관찰되었다(도 8 참조).

실시예 5: 동물에서 HCCR-2 원암유전자의 종양 형성능 유무 조사

생후 5 주된 10 마리의 누드마우스(athymic nu/nu on BALB/c background; 대덕 화학연구소)를 대상으로 원암 유전자 HCCR-2를 형질감염시킨 설치류 NIH/3T3 세포(HCCR-2M 세포) 5 x 10⁶개를 각각 둔위 부위의 피하에 주입하였다. 피하 종양의 크기가 1.5 내지 2.5㎝가 되었을 때 누드 마우스를 희생시켰다.

도 9에 나타낸 바와 같이, HCCR-2M 세포를 주입한 10마리의 마우스 모두가 21일 후 뚜렷한 종양을 나타내었다.

HCCR-2M 세포가 이식된 누드 마우스는 상피성 암종의 특성을 나타낸다. 도 10은 누드마우스에서 HCCR-2 원암 유전자가 형질도입된 NIH/3T3 섬유모세포에 의해 형성된 종괴를 헤마톡실린-에오신으로 염색한 후 형태학적 특성을 관찰한 것으로, 섬유상 간질 조직에 의해 분리된 전형적인 상피성 세포소를 나타낸다.

실시예 6: HCCR-2 원암 유전자에 의해 유도된 종양조직으로부터 새로운 암 세포주의 확립

상기 실시예 5의 종양 조직으로부터 얻은 세포는 20%의 우태아 혈청을 사용하여 통상적인 방법으로 배양하였다. HCCR-2M 세포를 접종하여 형성된 종괴로부터 다시 배양된 세포는 "HCCR-2MN" 세포로 명명하였다. 도 11에 나타낸 바와 같이 시험관내에서 각각의 세포들은 모세포들인 HCCR-2M과 유사한 세포학적 특성을 나타내었다.

실시예 7: HCCR-2 원암유전자를 대장균에 형질감염시킨후 발현되는 단백질의 크기 결정

서열번호: 1의 HCCR-2 원암유전자의 전체를 pET-32b(+) 벡터(Novagen)의 다중 클로닝 부위에 삽입한 후, pET-32b(+)/HCCR-2 벡터를 대장균 BL21(ATCC 47092)에 형질감염시켰다. 형질감염된 대장균을 LB 브로쓰에서 진탕 배양한 후, 이를 1/100로 희석시켜 다시 3시간동안 배양하였다. 여기에 1 mM의 이소프로필 β-D-티오갈락토피라노사이드(Isopropyl beta-D-thiogalacto-pyranoside(IPTG), Sigma)를 첨가하여 단백질 생산을 유도하였다.

IPTG 유도 전후의 배양액 중의 대장균 세포를 초음파분쇄한 후, 12% 나트륨 도데실설페이트(SDS)-폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동하였다(SDS-PAGE). 도 12는 pET-32b(+)/HCCR-2 벡터로 형질감염된 대장균 BL21 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, IPTG 유도 후에 약 65kDa의 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 65kDa 융합단백질은 pET-32b(+) 벡터의 유전자로부터 발현된 약 20kDa 크기의 Trix·Tag 티오레독신 단백질을 함유하고 있다.

실시예 8: 항체 생산

실시예 7의 pET-32b(+)/HCCR-2 벡터로 형질감염된 대장균 BL21 균주로부터 분리된 45kDa의 융합단백질을 His-Hind 키트(Novagen)으로 정제하였다. 정제된 펩티드를 면역 블랏팅한 결과 45kDa의 단백질이 다량 함유되어 있음을 확인하였다.

이어서, 2 마리의 6주령 스프라그-돌리 래트(체중 약 150g)에 상기에서 얻은 펩티드 1㎎을 1주일에 1회씩 3회 복강내 투여하였다. 이와 같이 면역화된 래트로부터 혈액 시료를 취하여 원심분리시켜 폴리클로날 혈청을 얻었다. 상기 폴리클로날 항체의 항 HCCR-2 활성은 효소면역측정법(ELISA)으로 확인하였다(1:10,000)

실시예 9: 항체 특이성 확인을 위한 면역 블랏팅

웨스턴 블랏 분석을 위하여, 램리(Laemmli)의 문헌[Nature, 227, 680-685(1970)]에 기술된 방법에 따라 도 7에서 확인된 세포를 수확하고 용해시켰다. 세포 단백질을 10% SDS-PAGE로 분리시키고, 니트로셀룰로즈 막에 전기적으로 이동시켰다. 상기 막을 실시예 8에서 제조한 래트 폴리클로날 항HCCR-2 혈청과 함께 16 시간 동안 반응시켰다. 상기 막을 세척한 후, 1:1,000 비율로 희석된 퍼옥시다제-결합된 염소 항-래트 면역글로불린(Jackson ImmunoResearch)을 2차 항체로 포함하는 블로킹 용액과 반응시켰다. ECL-웨스턴 블랏 검출 키트(Western blot detection kit, Amersham)을 사용하여 단백질을 확인하였다.

도 13에 나타낸 바와 같이, HCCR-2 단백질은 HCCR-2 세포에서 과발현되었으며, 야생형 및 pcDNA3만으로 형질감염된 NIH/3T3 세포(pcDNA)에서는 희미한 밴드만이 검출되었다. 이는 폴리클로날 항체중의 항-HCCR-2 항체의 특이성을 나타내는 것이다.

또한, 폴리클로날 항체 중의 HCCR-2 항체는 다양한 조직으로부터의 인간 단백질 추출물 중에서 약 45kDa의 단백질을 인식하였다. 도 14에 나타낸 바와 같이, 신장, 유방, 폐, 난소 및 위암을 비롯한 인간 암 조직은 이들 각각의 정상 조직과 비교하였을 때, 증가된 HCCR-2 단백질의 발현을 나타내었다.

실시예 10: 형질전환된 인간세포의 제조

(단계 1) HCCR-2를 함유하는 벡터의 제조

먼저, 전체 HCCR-2 cDNA를 원핵 발현벡터인 pCEV-LAC의SalI 제한부위에 삽입하였다(문헌[Miki, T.et al.,Gene, 83, 137-146(1989)] 참조). 이어서, 상기 pCEV-LAC/HCCR-2 벡터로부터SalI 단편을 분리하였다.

이어서, pCDNA3 발현 벡터(Invitrogen)을XhoI로 처리하여SalI과 상용성인 말단을 제조하였다. 전체 HCCR-2 코딩 서열을 지닌SalI 단편을XhoI로 처리된 pcDNA3에 삽입하였다. 생성된 pcDNA3/HCCR-2 발현 벡터를 리포펙타민(Gibco BRL)을 사용하여 인간 태생신(human embryonic kidney) 293 상피세포(ATCC CRL 1573)내로 형질도입시키고 G418(Gibco)을 포함하는 배지에서 선택하였다. HCCR-2로 형질도입된 293 세포를 "HCCR-2H 세포"로 지칭한다.

(단계 2) HCCR-2 원암유전자를 형질도입시킨 293 상피세포의 특성

야생형 인간 태생신 293 상피세포를 단층배양시킨 후 그 성장양상을 위상차 현미경으로 관찰한 도 15에 나타낸 바와 같이, 분화된 섬유모세포인 야생형 정상 293 세포는 길고 가느다란 핵과 빈약한 세포질을 지닌 방추형 세포이다. 단계 1에서 얻은 HCCR-2를 발현하는 293 세포(HCCR-2H 세포)에서 HCCR-2가 발현되는 경우, 세포의 형태는 도 16에 나타낸 바와 같이 난형의 핵 및 다량의 세포질을 지닌 다각형 모양으로 변화되었다.

HCCR-2 형질도입된 293 세포를 헤마톡실린-에오신(hematoxylin-eosin, H & E) 염색을 한 후 관찰한 결과, 핵의 다형성, 뚜렷한 핵소체, 및 과립상 염색질 소견 및 종양 거대세포들을 보여주었고, 비정형 유사분열이 관찰되었다(도 17 참조).

실시예 11: 동물에서 HCCR-2H 인간세포의 종양 형성능 유무 조사

생후 5 주된 10 마리의 누드마우스(athymic nu/nu on BALB/c background; 대덕 화학연구소)를 대상으로 5 x 10⁶개의 원암 유전자 HCCR-2를 형질감염시킨 인간 293 세포 (HCCR-2H 세포)를 각각 둔위 부위의 피하에 주입하였다. 피하 종양의 크기가 1.5 내지 2.5㎝가 되었을 때 누드 마우스를 희생시켰다.

도 18에 나타낸 바와 같이, HCCR-2H 세포를 주입한 9마리의 마우스 모두가 20일 후 뚜렷한 종양을 나타내었다. HCCR-2H 세포가 이식된 누드 마우스는 상피성 암종의 특성을 나타낸다. 도 19는 누드마우스에서 HCCR-2H 세포에 의해 형성된 종괴를 헤마톡실린-에오신으로 염색한 후 형태학적 특성을 관찰한 것으로, 섬유상 간질 조직에 의해 분리된 전형적인 상피성 세포소를 나타낸다.

실시예 12: HCCR-2H 인간세포에 의해 유도된 종양조직으로부터 새로운 암 세포주의 확립

상기 종양 조직으로부터 얻은 세포는 20%의 우태아 혈청을 사용하여 통상적인 방법으로 배양하였다. HCCR-2H 세포를 접종하여 형성된 종괴로부터 다시 배양된 세포는 "HCCR-2HN" 세포로 명명하였다. 도 20에 나타낸 바와 같이 시험관내에서 각각의 세포들은 모세포들인 HCCR-2H와 유사한 세포학적 특성을 나타내었다. HCCR-2H 세포들에서 5개의 클론들을 대상으로 HCCR-2 유전자의 발현유무를 노던 블랏팅으로 확인한 결과 이들 모두에서 야생형 293에 비하여 높은 HCCR-2 유전자의 발현을 나타내었다(도 21).

본 발명의 원암 유전자는 기존의 보고된 발암유전자와는 전혀 상동성을 나타내지 않는 신규 유전자로서 유방암, 백혈병, 림프종, 신장암, 난소암, 위암, 폐암, 자궁암 등을 비롯한 암의 진단, 형질전환 동물의 제조 및 안티-센스(anti-sense) 유전자치료 등에 효과적으로 이용될 수 있다.

Claims

서열번호: 1의 염기서열을 갖는 인간 자궁경부암 2 원암 유전자 또는 그의 단편.
제 1 항에 있어서,

서열번호: 1의 염기 번호 63 내지 977에 해당하는 염기서열을 지닌 인간 자궁경부암 2 원암 유전자 또는 그의 단편.
서열 번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 그의 단편.
제 1 항의 원암 유전자 또는 그의 단편을 포함하는 벡터.
제 4 항의 벡터에 의해 형질전환된 미생물.
제 5 항에 있어서,

대장균 JM109/HCCR-2(기탁번호: KCTC 0668BP)인 미생물.
제 5 항 또는 제 6 항의 미생물을 이용하여 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 그의 단편을 제조하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항의 원암 유전자 또는 그의 단편을 포함하는 암 진단용 키트.
제 3 항의 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 암 진단용 키트.
제 1 항 또는 제 2 항의 원암 유전자 또는 그의 단편으로부터 전사되는 mRNA의 서열의 전부 또는 일부와 상보적인 염기서열을 지니고, 상기 mRNA에 결합하여 상기 원암 유전자 또는 단편의 발현을 억제하는 안티-센스 유전자.
제 10 항의 안티-센스 유전자를 활성성분으로서 포함하는 항암 조성물.