KR20020018672A - 재조합 박테리아 피타제 및 이것의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 이.콜리 B로부터 유래한 정제된 재조합 피타제 효소에 관한 것이다. 이 효소는 약 47.1 킬로달톤의 분자량을 가지며 피타제 활성을 갖는다. 이 효소는 천연 또는 재조합 숙주 세포로부터 생산될 수 있으며 필요한 경우 피테이트의 소화를 돕기 위해 이용될 수 있다. 특히, 본 발명의 피타제는 피테이트가 풍부한 성분들의 사료 가치를 개선하기 위해 음식물에 이용될 수 있다.

Description

재조합 박테리아 피타제 및 이것의 용도{RECOMBINANT BACTERIAL PHYTASES AND USES THEREOF}
2.1.1-간단한 요약:무기물은 모든 유기체의 성장을 위한 기본적 요소이다. 식이성 무기물은 다수의 원료 물질, 예컨대 식물로부터 유래될 수 있다. 예를 들면, 식물 종자는 무기물의 풍부한 원료이며, 이는 피트산 분자의 인산기로 착화된 이온을 포함하기 때문이다. 이들 피테이트-결합된 무기물은 농장 동물의 일부 종, 예를 들면, 다수의 위를 갖는 반추 동물의 영양요구를 만족시킨다. 따라서, 반추 동물은 무기 인산 및 무기물을 갖는 영양 보충을 요구하지 않으며, 이는 혹위내 미생물이 피테이트(미오-이노시톨-헥사포스페이트)를 이노시톨 및 무기 인산염으로 전환시키는 것을 촉매하는 효소를 생산하기 때문이다. 이러한 과정에서, 피테이트와 착화된 무기물은 방출된다. 그러나, 농장 동물의 대다수 종은 피테이트-결합된무기물을 효과적으로 이용할 수 없다. 따라서, 예컨대, 단일 위장 동물(예, 돼지, 새 및 어류)의 양육시, 사료는 소비하는 동물의 소화기 세균총 환경을 변형시키는 무기물 및/또는 항생제 물질로 통상 보충되어 성장율을 촉진한다.
이와 같이, 다수의 용도에서 피테이트의 불완전한 가수분해와 결합하여, 영양, 생체외 처리 단계, 건강 및 의학, 환경 보존 및 원료 관리와 관계되는 다수의 문제가 존재한다. 다음은 이러한 문제를 비제한적으로 열거한다:
1) 무기물로의 영양 보충은 비용이 많이 든다.
2) 가수분해되지 않은 피테이트의 존재는 다수의 생체외 용도에서 바람직하지 않고 문제가 있다(예, 바람직하지 않는 슬러지의 존재를 야기).
3) 항생제로의 영양 보충은 인간 및 동물에 항생제 내성 병원균을 무수히 증가시키는 것과 같은 의학적 위협을 야기한다.
4) 흡수되지 않은 대소변 무기물을 환경으로 방출하면 주변 토양, 어류 양식장 수질 및 수면 등의 생태계를 파괴하고 손상시킨다.
5) 다수의 잠재적 음식물을 가치있는 영양 공급으로 별로 개발되지 못하고 남아있거나 낭비된다.
2.1.2- 영양 문제:다수의 감재적 영양 식물, 예를 들면 특히 이들의 종자는 인산염과 같은 상당량의 영양소를 포함한다. 이것은 상기 영양분이 소비시 자유롭게 이용할 수 없는 방식으로 피테이트와 결합된다. 이러한 영양분의 이용불가능은 일부 동물, 예를 들면 소화관내 공생적 생명체의 존재로부터 유래되는 피테이트를 가수분해하고 결합된 영양분을 유리시키는 충분한 소화능을 가진 소 및 기타 반추동물에 의하여 극복된다. 그러나, 농장 동물의 대다수, 예를 들면 돼지, 어류, 닭, 칠면조 및 인간을 포함한 기타 비-반추동물 유기체는 이들 영양분을 섭취후 효과적으로 분해시킬 수 없다.
결과적으로, 피테이트-함유 음식물은 다양한 다수 종의 유기체에 의하여 소비시 결핍 영양분의 공급을 수정하기 위하여 피테이트 활성의 천연원 및/또는 외부 영양분의 보충을 요구한다.
2.1.3- 생체외 처리 문제:그러나 다른 측면에서, 가수분해되지 않은 피테이트의 존재는 음식물의 처리와 같은(이에 제한되지 않는) 생체외 처리시 문제성 결과를 야기한다. 그러나 단지 하나의 예시에서, EP0321004-B1(Vaara 등)에 제시된 바와 같이, 단단한 종자를 연질시키기 위하여 이를 물에 침지시킴으로써 옥수수 및 수수 종자를 처리한다. 상기 단계중 여과하는 수용성 물질은 증발에 의하여 농축되는 옥수수 침지액의 일부가 된다. 옥수수 침지액 중 가수분해되지 않은 피트산은, 대개 칼슘염 및 마그네슘염의 형태이고, 인과 결합하여, 단백질 및 금속 이온과 함께 바람직하지 않은 슬러지를 침전시킨다. 이러한 슬러지는 옥수수 침지액의 증발, 이동 및 저장시 문제가 된다. 따라서, 본원에 개시된 피타제 분자-단독 또는 기타 반응제(프로테아제와 같은 효소를 포함하나 이에 한정되지 않음)과의 배합-는 상기 용도(예, 바람직하지 않은 슬러지의 저해)뿐 아니라 피테이트 가수분해가 바람직한 기타 용도에서 이용가능하다.
2.1.4-의학 문제:항생물질로의 영양분 보충은 가축 생산에서 다수의 이로운 결과를 갖는다. 예를 들면, 질병을 피하기 위한 예방적 수단의 역할뿐 아니라, 외부 항생제의 투여는 3-5% 이상까지 성장율을 증가시키는 것으로 보여진다. 이러한 작용의 메카니즘은 또한 농장 동물의 소화기 세균총 환경내 -부분적- 변화와 관련있으며 영양 흡수를 위한 최적의 미생물세균총의 균형을 야기한다.
그러나, 항생제의 남용과 관련된 상당한 부정적 효과는 병원성 항생제-내성 미생물 균주의 집적소를 생성하는 위험이 있다. 이러한 위험은 절박하며, 인간에서 약물-내성 병원균의 증가는 이미 가축내 항생제의 사용과 관련이 있다. 예를 들면, 동물 사료에 사용되는 항생제 아보파르신은 1997년 다수의 장소에서 금지되었으며, 현재 동물에 또다른 항생제, 즉, 인간의 바노마이신을 대체하는데 사용되는 신약 시너시드(synercid)에 매우 유사한 버지니아마이신을 투여한다. 그러나, 연구에 의하면 농장 동물의 일부 장구균이 시너시드에 내성이 있는 것으로 이미 보고되었다. 결과적으로, 예를 들면 아보파르신 및 반코마이신에서 이미 나타난 것과 같은 바람직하지 않은 내성 결과는 농장 동물에 있어서 포괄적 예방책으로서 사용되는 신규한 항생제가 무엇이든간에 재발될 것이다. 따라서, 연구원들은 산업상 약물의 용도를 엄중하게 조절할 것을 요구하고 있다.
본원에서 개시된 피타제 분자로 보충된 음식물로 사육한 동물의 성장율 증가는 아보파르신과 같은 항생제를 사용하여 달성된 것과 맞먹었다. 따라서, 본원에서 공개된 피타제 분자-단독 또는 기타 반응제(프로테아제와 같은 효소를 포함하나 이에 제한되지 않음)과의 배합-는 상기 용도(예, 농장 동물에서 성장율 증가) 및 피테이트 가수분해가 바람직한 기타 용도에서 이용가능하다.
2.1.5-환경 문제:환경 결과는 음식물이 무기물로 보충되는지와 관계없이 피타제 결핍된 유기물 종에 의한 피테이트-함유 음식물의 소비는 흡수되지 않은 무기물의 배출로부터 야기되는 분뇨 오염을 유도하는 환경 결과를 일으킨다. 이러한 오염은 직접적 서식지 및 주위 수질에 부정적인 효과를 나타낸다. 환경 변화는 먹이사슬의 바닥에서 일차적으로 발생하며, 따라서 생태계를 통하여 위로 투과 가능하기 때문에 특히 수년간의 계속적인 오염후에 영속적이고 재앙적인 손상을 초래한다. 이러한 문제는 농축된 피테이트 처리-생체내(예, 가축 생산, 동물원 우리, 야생동물 보호소 등의 동물) 및 시험관내(예, 시판 옥수수 습식 제분, 곡류 침강 가공 등)-가 일어나는 임의의 지역에서 나타날 가능성이 있다.
2.1.6-재정적 문제:외부에서 첨가된 피테이트 분자의 이용을 결정하기 위해서는(외부에서 투여된 무기물 및/또는 항생제의 용도를 완전히 대체 또는 증강) 가축 사육과 같은 적절한 응용에 생계를 의존하는 사용자에 의하여 재정적 실행가능성 및 비용의 시험을 통과할 필요가 있다.
결과적으로, 다양한 용도에서 피테이트의 효과적이고 비용 효율적인 가수분해를 달성하기 위한 수단이 요구된다. 특히, 상업적 용도에서 피테이트의 가수분해를 최적화하기 위한 수단이 요구된다. 특정한 측면에서, 인간 및 사육 동물이 소비하기 위한 피테이트-함유 음식물의 영양 공급을 향상시키는 상업적 처리 방법을 최적화할 필요가 있다.
재조합 피타제의 기존 연구 보고는 사용할 수 있지만, 이들의 열등한 활성은 본 발명의 신규한 피타제 분자에 의하여 무용해졌다. 따라서, 본 발명에서 공개된 피타제 분자는 이미 동정된 피타제 분자, 예를 들면 진균 기원의 피타제 분자보다실질적으로 우수한 상업적 성능을 제공하는 것으로 생각된다.
2.2-피테이트 및 피테이트 가수분해의 일반적 개론
2.2.1-피테이트 가수분해에 의한 영양분의 방출 유도:피테이트는 실질적으로 모든 식물 사료에서 저장된 인의 공급원이다(Graf(Ed.), 1986). 피트산은 곡류 및 콩류에서 종자의 정상적인 부분을 형성한다. 이것은 종자에서 나타난 바와 같이 신규한 식물에 필수적인 영양 무기물에 결합하는 기능을 한다. 피트산의 인산기는 종자 효소 피타제로부터 분리되는 경우, 금속 이온을 결합하는 능력이 결실되고, 무기물은 식물이 이용가능하게 된다. 가축 사료 곡물에서, 피트산에 의하여 결합된 미량의 무기물은 피타제 활성이 결핍된 단일 위장 동물에 의한 흡수가 통상 용이하지 않다.
피테이트의 일부 가수분해는 대장에서 일어나지만, 대부분의 피테이트는 단일 위장 동물의 위장관을 통하여 지나가고 배출되어 가축 생산의 밀집 지역에서 분료 인산염의 오염 문제를 야기하게 된다. 대장에서 방출되는 무기 인은 가축에서 상당히 감소된 영양 가치를 나타내며, 이는 소장에서 무기인이 대부분(실제로 전부는 아니지만) 흡수되기 때문이다. 따라서, 피테이트 중 영양태 중요한 식이 무기물의 상당량은 단일 위장 동물에서는 이용할 수 없다.
요컨대, 피테이트-결합 영양분은 피테이트에 공유적으로 결합된 인산염 및 피테이트에 의하여 킬레이트화되는 기타 무기물로 구성된다. 또한, 흡수시 가수분해되지 않은 피테이트는 부가적 무기물과 만나서 결합하게 된다. 무기물의 킬레이트화는 이러한 무기물이 공-인자로 작용하는 효소의 활성을 저해할 것이다.
2.2.2-미생물 효소는 피테이트를 가수분해할 수 있다:피테이트에서 이노시톨 및 무기인으로의 전환은 피타제로서 널리 명명되는 미생물 효소에 의하여 촉매될 수 있다. 피타제 #EC3.1.3.8과 같은 피타제는 D-미오-이노시톨1,2,4,5,6-펜타포스페이트 및 오소포스페이트로의 미오-이노시톨 헥사포스페이트 가수분해를 촉매할 수 있다. 특정 진균 피타제는 테트라-, 트리- 및 저차 인산염으로 이노시톨 펜타포스페이트를 가수분해하는 것으로 보고되었다. 예를 들면 A. ficuum 피타제는 미오이노시톨 디- 및 모노-포스페이트의 혼합물을 생성하는 것으로 보고되었다(Ullah, 1988). 피타제-생성 미생물은 바실러스 서브틸리스(Powar and Jagammathan, 1982)와 슈도모나스(Cosgrove, 1970)같은 박테리아; 및 사카로마이세스 세레비지에(Nayini and Markakis, 1984)와 같은 효모; 및 아스페르길러스 테레우스(Yamada 등, 1968)과 같은 진균류로 구성된다.
산 포스파타아제는 다양한 포스파타아제 에스테르를 촉매적으로 가수분해하고, 최적 pH가 통상 6.0 이하를 나타내는 효소이다(Igarashi & Hollandes, 1968). 예를 들면, #EC3.1.3.2 효소는 오소포스페이트를 생성하는 오소포스포릭 모노에스테르의 가수분해를 촉매한다. 산 포스파타아제는 A. ficuum으로부터 정제되었음이 보고되었다. 산 포스파타아제의 비당화 형태는 명확한 분자량 32.6 kDa을 갖는다(Ullah 등, 1987).
피타제 및 특이성이 덜한 산 포스파타아제는 세포외 효소로서 진균류 아스퍼길러스 피컴(Aspergillus ficuum)에 의하여 생성된다(Shieh 등, 1969). Ullah는 명확한 분자량 61.7 kDa(SDS-PAGE; 당화에 대하여 정정됨); pH 최적 pH 2.5 및 pH5.5; 약 40 um의 Km; 및 약 50 U/mg의 비활성(specific activity)을 갖는 야생형 A.ficuum으로부터 정제된 것으로 보고되었다(Ullah, 1988). PCT 특허 출원 WO 91/05053은 또한 최적 pH 2.5 및 pH 5.5, 약 250 um의 Km 및 약 100 U/mg 단백질의 비활성인 아스퍼길러스 피컴으로부터 피타제의 분리 및 분자 클로닝을 개시하였다.
요약하면, 이러한 이미 보고된 미생물 효소에 대하여 제시된 비활성은 약 50-100 U/mg 단백질의 범위이다. 반대로, 본 발명에서 개시된 피타제 활성은 약 4400 U/mg인 것으로 측정되었다. 이것은 활성이 약 40-배 또는 그 이상의 향상을 의미한다.
2.3-피테이트의 불충분한 가수분해의 문제 해결
2.3.1-상업적 용도에서 효소 첨가제:단일 위장 동물용 사료 첨가제로서 피타제를 제조할 수 있는 미생물의 사용가능성은 이미 보고되었다(USPN 3,297,548 Shieh and Ware; Nelson 등, 1971). 상기 방법의 비용-효율성은 이것 및 기타 상업적 용도에서 주된 제한 요인이었다. 따라서 피타제 분자의 향상은 매우 바람직하다.
미생물 피타제는 또한 특정 산업적 공정,예를 들면, 밀 및 옥수수 폐기 생성물로부터 동물 사료를 생산하는데 유용한 것으로 보고되었다. 한 양태로서, 옥수수의 습식 제분 공정은 동물 사료로서 시판되는 글루텐을 생산한다. 피타제의 첨가는 사료 생성물의 영양적 가치를 향상시키는 것으로 보고되었다. 예를 들면, 진균류 피타제 효소 및 공정 조건(t~50℃ 및 pH~5.5)의 이용이 이미 보고되었다(예, EP 0 321 004). 간단히, 통상적 침지 방법, 즉 외부의 피타제 효소를 첨가하지 않는 방법을 사용하여 대두 밀의 가공시, 비가수분해된 피테이트의 존재는 곡물과 폐기물을 어류, 가금류 및 기타 비-반추동물 및 젖소를 사육하는데 사용되는 사료로서 비적절하게 만드는 것으로 보고되었다. 피타제는 이러한 높은 단백질 대두 물질의 영양적 상업적 가치를 향상시키는데 사용되는 것으로 보고된다(참조, Finace Enzymes, 핀란드의 Alko Rajamaki). 진균류 피타제 및 pH 2.5 최적의 산 포스파타아제 형태 A. niger의 배합은 이들의 피트산 감성 생성물 피나스(Finas) F 및 피나스 S에서 동물 사료 보충물로서 Alko, Ltd에 의하여 사용되었다. 그러나, 이러한 방법의 비용-효율성이 더 광범위한 용도를 저해하는 주된 제한 요인이다. 따라서, 피타제의 비용-효율성의 원인은 대두 밀의 동물 사료로서의 가치를 상당히 향상시킬 것이다(Shieh, et al. 1969).
2.3.2-효소 첨가제의 최적화 요구:개시된 문제를 해결하기 위하여, 외부의 피타제 효소로 음식물을 처리하는 것이 제안되었다. 그러나, 이러한 접근은 특히 실행가능성 및 비용 효율면에서 충분히 최적화되지 않았다. 이러한 최적화는 광범위한 용도의 존재, 특히 대량 생산을 위한 고려가 요구된다. 예를 들면, 음식물, 이것의 제조 방법 및 수용 동물의 종이 광범위하다.
특정 예시에서, 수중에서 미리(예, 소비 전에) 용해되지 않고/않거나 분해되지 않는 펠렛을 생성하기 위하여, 어류 사료 펠렛의 제조는 높은 온도 및/또는 압력에서 이 성분을 방치하는 단계를 필요로 한다. 따라서, 높은 온도 및/또는 압력 조건에서 안정한 첨가제 효소를 얻기 위하여 상기 제조 공정이 바람직할 것이다. 따라서, 별개의 피타제는 별개의 용도를 위하여 상이하게 바람직하거나 또는 최적화될 것이다.
또한, 효소적 과정을 최적화하는 중요한 방법은 중추적인 촉매적 효소의 개질 및 향상을 통한 것으로 인식된다. 예를 들면, 형질전환 식물이 피타제 분자를 발현하기 위한 발현계로 구성될 수 있다. 발현 수준처럼 적절한 발현 분자의 활성에 직접 관련되지 않는 인자를 향상시키도록 시도함으로써, 단지 한정된-및 잠재적으로 불충분한-최적화 수준이 최대로 달성될 수 있을 것으로 평가된다. 따라서, 향상된 특성을 갖는 분자를 획득하는 것이 필요하다.
분자의 특성을 향상시키기 위한 특정 방법은 용어 DirectEvolution(등록상표)을 주조하고 등록하기 위한 Diversa Corporation의 특허적 접근법을 포함하여, 지정된 진화(directed evolution)로 불리는 기술적 접근을 통한 것이다. 이러한 접근법은 Diversa의 공유 특허(미국 특허 5,830,696) 및 공계류중인 특허 출원에서 추가로 설명된다. 간단히, DirectEvolution(등록상표)는 a) 신규한 분자를 생성하기 위하여 하나 이상의 분자 주형을 돌연변이유발법에 노출; 및 b) 상기 자손 중에서 더욱 바람직한 특성을 갖는 신규한 분자의 선택을 포함한다.
그러나, 지정된 진화의 힘은 출발 주형의 출발 선택 및 선택된 스크린 방법(들) 및 선택된 돌연변이유발법(들)에 따라 좌우된다. 예를 들면, 임의적으로 선택된 분자 주형에서 및/또는 전체적으로 하위 최적화 성질을 갖는 초기 분자 주형에서 전장 돌연변이성 치환을 일으키고 이를 평가하는 접근법은 종종 금지할 정도로 대형 업무이다. 이러한 주형의 용도는 기껏해야 우회적 하위 최적 경로를 제공하고, 충분히 향상된 자손 분자 산출에 대한 매우 불량한 예측을 제공한다. 또한, 우리의 최근 지식 내용은 이로운 개질을 엄격하게 예측하는 능력의 관점에서 매우 제한되는 것으로 평가된다.
결과적으로, 자연에서 전-진화된 성질-바람직하게는 전-진화된 효소적 이점을 갖는 분자를 발견하고 이용하는 것이 바람직한 방법이다. 따라서, 자연은 상업적 응용에서 직접 사용될 수 있는 분자 또는 대안으로는 지정된 진화에 노출되어 훨씬 더 향상될 분자를 ("자연 진화"로 불리는 것을 통하여) 제공한다는 것이 본 발명의 개시에서 이해된다.
요약하면, 신규하고, 고도로 활성이며, 생리적으로 효과적이고 경제적인, 피타제 활성의 원료가 필요하다. 구체적으로는, a) 하나 이상의 특정 용도하에서 우수한 활성을 가지며, 따라서 이러한 특정 용도를 최적화하도록 작용가능한 신규한 피타제; b) 매우 향상된 신규한 분자를 달성하도록 지정된 진화를 위한 주형으로서 이용가능한 신규한 피타제; c) 혼성화-기초한 접근법과 같은 수단에 의하여 추가적으로 관련된 분자의 동정을 위한 기법으로서 이용가능한 신규한 피타제를 동정하는 것이 필요하다. 본 발명은 신규한 방식으로 이러한 요구를 충족한다.
본 발명의 요약
본 발명은 피타제 활성을 갖는 피타제 효소로서 동정된 폴리뉴클레오티드 및 이에 의하여 암호화되는 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명의 한 양태에 따라서, 신규한 재조합 효소 및 이것의 활성 단편, 유사체 및 유도체가 제공된다.
더욱 구체적으로는, 본 발명은 피테이트-함유 음식물의 영양 가치를 향상시키기 위하여 사용할 수 있는 박테리아 기원의 재조합 피타제 분자의 용도에 관한것이다. 기존 간행물은 진균 피타제의 용도를 개시하였지만, 본 발명의 목적을 위한 박테리아 피타제의 사용은 신규하다.
더욱 구체적으로는 여전히, 본 발명은 피테이트- 함유 음식물의 영양 가치를 향상시키기 위하여 사용할 수 있는 신규하게 동정된 E.coli의 재조합 피타제 분자에 관한 것이다.
이러한 용도는 음식물중 피테이트를 가수분해하기 위하여 신규하게 동정된 분자를 이용하는 것을 포함한다. 가수분해는 피테이트의 흡수 이전 또는 이후 또는 이전 및 이후 모두에서 발생한다. 이러한 응용은 비반추동물 유기체에 특히 적절하며, 이에 한정되지 않는다. 또한 형질전환된 숙주내에서 기새된 신규한 피타제 분자의 발현, 음식물 및 기타 물질내에서 개시된 신규한 피타제 분자의 접촉 및 개시된 신규한 피타제 분자로 동물 소화계의 처리를 포함한다.
추가적으로, 가수분해는 예를 들면 반응 용기와 같은 시험관내 응용에서의 소비와 독립적으로 발생할 것이다. 따라서, 피테이트-함유 물질의 처리는 광범위한 물질의 처리, 예를 들면 음식물을 목적으로 하지 않는 것, 예를 들면 배설물(또는 대변) 물질의 처리를 포함한다.
본 발명의 바람직한 분자는 이전에 동정된 진균 피타제와 비교시 피테이트 및 피트산의 염으로부터 인의 방출 효율을 향상시키는 에슈리키아 콜리 B로부터 분리된 재조합 피타제를 포함한다.
본 발명의 한 양태에 따라, 음식물로 통합될 수 있는 피타제 효소를 제공한다. 더욱 구체적으로는, 피테이트-함유 음식물의 영양 가치를 향상시키기 위하여사용할 수 있는 피타제 효소를 제공할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 피테이트-함유 음식물에 적용되는 경우, 이것을 소비한 유기체의 성장 성능을 측정 가능할 정도로 향상시키는 피타제 효소를 제공한다. 피테이트의 가수분해가 상당히 실질적이지 않다면 이론적으로 피타제 활성 작용의 이로운 메커니즘이 상당히 포함된다. 이로운 작용이 피테이트-함유 음식물의 흡수전 또는 이와는 달리 흡수후 또는 이와는 달리 흡수의 전 및 후 모두에서 일어날 수 있다. 이로운 작용이 흡수후 일어나는 경우, 본 발명의 목적은 비반추동물에 의하여 소비시 유지되는 활성을 갖는 피타제 효소를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 양태에 따르면, 본 발명의 효소를 암호화하는 핵산 분자 분리물, 예를 들면, mRNA, DNA, cDNA, 게놈 DNA-및 이 효소의 활성 유도체, 유사체 및 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가적 양태에 따르면, 본 발명의 효소를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 원핵세포 및/또는 진핵세포를 상기 효소의 발현 및 이후 상기 효소의 회수를 촉진하는 조건하에서 배양하는 단계를 포함하는 재조합 기술에 의하여 상기 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 양태에 따르면, 형질전환 식물 또는 식물기관에서 상기 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 효소를 발현하는 방법, 및 이러한 식물의 생성을 위한 방법을 제공한다. 이것은 상기 피타제 효소를 암호화하는 핵산 서열로 구성된 발현 작제물을 식물내로 도입함으로써 달성된다.
본 발명의 추가적 양태에 따르면, 시험관내 방법, 즉 사료 처리 방법 또는생체내 방법, 즉 효소를 동물에 투여함으로써 식물 물질내에서 피테이트로부터 무기물을 유리시키는 공정과 같은 상업적 공정에서 상기 효소 또는 상기 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 이용하는 방법을 제공한다.
본 발명의 추가적 양태에 따라서, 개시된 사료 처리 방법에 의하여 제조된 음식물을 제공한다.
본 발명의 추가적 양태에 따라서, 연구, 발견 및 개발에 관련된 시험관내 목적용으로 상기 효소, 또는 상기 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 이용하는 방법을 제공한다. 비한정적인 예시로서, 상기 방법은 기타 유기체로부터 유사한 효소를 암호화할 수 있는 유사한 서열을 동정하고 분리하기 위한 프로브를 생성하는 단계를 포함한다.
특정의 비한정적인 예시로서, 본 발명의 핵산 서열을 특이적으로 혼성화하기에 충분한 길이의 핵산 분자를 포함하는 핵산 프로브를 생성하는 단계를 제공한다. 바람직한 예시를 통하여, 상기 프로브의 혼성화-기초한 용도는 PCR, 노던 및 서던 유형의 혼성화, RNA 보호 분석 및 동일계 유형의 혼성화를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 본원에서 개시된 분자의 용도는 추가로 진단적 용도를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
비한정적인 예시에 따르면, 이러한 방법은 개시된 분자에 대한 항체의 생성, 이러한 항체의 용도, 예를 들면 기타 유기체로부터 효소의 유사한 서열의 동정 및 분리를 포함한다. 또다른 비한정적인 예시로서, 이러한 방법은 향상된 성질을 갖는 자손 분자의 발견을 위한 스크린-기초한 방법이 뒤따르는 신규한 분자의 생성을 포함하는 지정화된 진화를 위한 주형으로서 본 발명의 효소의 용도를 포함한다.
또한, 피타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함하는 게놈의 트랜스제닉 비인간 유기체를 제공한다. 상기 트랜스제닉은 피타제 폴리펩티드의 발현을 야기한다.
본 발명의 상기 및 기타 양태는 본원의 교시로부터 당업자에게 명백할 것이다.
4. 도면의 간단한 설명
다음 도면은 본 발명의 구체예의 예시이나, 청구항에 의하여 포함되는 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
도1a 및 b는 본 발명의 효소의 뉴클레오티드 및 추론된 아미노산 서열을 나타낸다. 서열 결정은 378 자동화 DNA 서열결정기를 사용하여 수행되었다(Applied Biosystems, Inc).
도2는 본 발명의 피타제 효소를 위한 pH 및 온도 프로필 및 안정성 데이터를 나타낸다. 피타제 활성의 검색을 위하여 상기 분석에 사용된 분석 방법은 다음과 같다: 피타제 활성은 37℃에서 30분 동안 1 mM CaCl2로 보충된, 100 mM 트리스 HCl 완충액 pH7.5중에 2mM 나트륨 피테이트 600 ul을 갖는 효소 제제의 150 ul를 항온처리함으로써 측정된다. 항온처리 한후, 반응은 5% 트리클로로아세트산 750 ul를 첨가함으로써 정지시킨다. 방출된 포스페이트는 발색 시약 1500 ul(5.5 % 황산중 1.5 % 암모늄 몰리브데이트 4 부피 및 2.7% 황산철의 1 부피; Shimizu, 1992)를 첨가한 후 700 nm에서 포스페이트 표준 분광측정기에 대하여 측정하였다. 700 nm에서 OD는 도2에서 그래프의 Y-축상에 나타난다. 온도 또는 pH는 그래프의 X-축에서 나타난다.
용어의 정의
본원에서 제공된 실시예의 이해를 용이하게 하기 위하여, 자주 나타나는 특정 방법 및/또는 용어가 설명될 것이다. 또한, 본원에서 사용된 머리글 및 하위-머리글은 독자의 편리함을 위하여 제공되고, 어느 방식으로든 본 발명을 제한하도록 해석되지는 않는다.
본원에서 사용된 용어 "항체"는 피타제 폴리펩티드의 에피토프에 결합할 수 있는 면역글로블린 분자의 단편, 예를 들면, Fab, Fab', (Fab')2, Fv 및 SCA 단편 및 고유의 면역글로블린 분자를 의미한다. 이러한 항체 단편은, 이들이 유래하는 항체의 항원(예, 피타제 항원)에 선택적으로 결합하는 능력을 보유하고, 당업계(예, Harlow and Lane, 상기문헌 참조)의 공지된 기술을 사용하여 제조될 수 있으며, 다음과 같이 추가적으로 설명된다.
(1) Fab 단편은 항체 분자의 1가 항원 결합 단편으로 구성되며, 효소 파파인으로 전체 항체 분자를 분해하여 생성되어, 고유의 경쇄 및 주쇄 일부로 구성된 단편을 생성할 수 있다.
(2) 항체의 Fab' 단편은 펩신으로 전체 항체 분자를 처리함으로써 생성될 수 있으며, 이는 고유의 경쇄 및 중쇄 일부로 구성된 분자를 생성하게 된다. 이러한방식으로 처리된 항체 분자당 2개의 Fab' 단편이 생성된다.
(3) 항체의 (Fab')2 단편이 효소 펩신으로 전체 항체 단편을 처리함으로써 후속 환원없이 생성될 수 있다. (Fab')2단편은 2개의 이황화 결합에 의하여 함께 연결된 2개의 Fab' 단편의 이량체이다.
(4) Fv 단편은 2개 쇄로 발현되는 중쇄의 가변부 및 경쇄의 가변부를 함유하는 유전 공학적으로 제조된 단편으로서 정의된다.
(5) 단일쇄 항체("SCA")는 적절한 가변성 폴리펩티드 링커에 의하여 연결된 경쇄의 가변부 및 중쇄의 가변부를 함유하는 유전공학적으로 제조된 단일쇄 분자이다.
용어 "분해성 유효"량은 효소와 비접촉하는 피테이트에 비하여 피테이트의 50% 이상을 분해시키는데 요구되는 효소의 양으로 정의된다. 피테이트의 80% 이상이 분해되는 것이 바람직하다.
DNA의 "분해"는 DNA 중 특정 서열에서만 작용하는 제한 효소에 의한 DNA의 촉매적 절단을 의미한다. 본원에서 사용된 다양한 제한 효소는 시판되며 이들의 조건, 공인자 및 기타 요구는 당업자에게 공지된 바와 같이 사용되었다. 분석적 목적으로, 통상 1 ug의 플라스미드 또는 DNA 단편은 완충 용액의 약 20 ul중 약 2 유니트의 효소와 함께 사용된다. 플라스미드 작제를 위한 DNA 단편 분리를 목적으로, 통상 DNA 5 ~ 50 ㎍을 큰 용기에서 효소 20 ~ 250 유니트로 분해한다. 특정 제한 효소에 대한 적절한 완충액 및 기질의 양은 제조자에 의하여 특정된다. 37℃에서약 1 시간 동안의 항온처리가 통상 사용되지만, 공급자의 지시에 따라 달라질 수 있다. 분해 후, 반응은 바람직한 단편을 분리하기 위하여 겔에 직접 전기영동시켰다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 "에피토프"는 항체의 파라토프, 예를 들면 피타제-특이성 항체가 결합하는 항원, 예를 들면 피타제 폴리펩티드 상에서 항원 결정기를 의미한다. 항원 결정기는 통상 분자의 화학적으로 활성인 표면 기들, 예를 들면 아미노산 또는 당 측쇄로 구성되며, 특이적 3차원 구조 특성 및 특이적 전하 특성을 가질 수 있다.
도1a와 1b의 효소를 말할때 용어 "단편", "유도체" 및 "유사체"는 기준 효소의 것과 적어도 실질적으로 동일한 1 이상의 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 효소를 포함한다. 나아가, 용어 "단편", "유도체" 또는 "유사체"는 "프로-형태(pro-form)" 분자로 예시화된다. 이러한 낮은 활성 프로단백질은 상당히 높은 활성을 갖는 성숙한 효소를 생성하기 위하여 절단에 의하여 개질될 수 있다.
용어 "유전자"는 폴리펩티드 쇄를 생성하는데 관여하는 DNA 단편을 의미한다; 이것은 코딩 영역(리더 및 트레일러), 및 각 코딩 영역(엑손)간의 중재 영역(인트론)의 앞에 또는 뒤에 위치하는 영역을 포함한다.
용어 "분리물"은 이것의 최초 환경(예, 천연 발생한다면 천연 환경)으로부터 분리된 물질을 의미한다. 예를 들면, 살아있는 동물에 존재하는 천연-발생적인 폴리뉴클레오티드 또는 효소는 분리되지 않으나, 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 효소가 자연계에서 공존하는 물질의 일부 또는 전부로부터 분리된다. 상기 폴리뉴클레오티드는 벡터의 부분일 수 있으며/있거나 상기 폴리뉴클레오티드 또는 효소는 조성물의 일부일 수 있고, 상기 벡터 또는 조성물은 이것의 천연 환경의 일부가 아니기 때문에 여전히 분리될 수 있다.
"핵산 분리물"은 이것이 유래하는 유기체의 자연 발생적인 게놈에 존재하는 경우 이것이 통상 바로 인접하는 서열의 5' 및 3' 측면에 인접하는 서열과 바로 인접하지 않는 핵산, 예를 들면 DNA 또는 RNA 분자를 의미한다. 따라서, 이 용어는 예를 들면, 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 같은 벡터에 통합되는 핵산; 이종 세포의 게놈(또는 동종 세포의 게놈, 그러나 자연 발생적인 것과는 다른 부위에 있음)내로 통합되는 핵산; 및 분리된 분자로서 존재하는 핵산, 예를 들면 PCR 증폭 또는 제한 효소 분해에 의하여 생성되는 DNA 단편 또는 시험관내 전사에 의하여 생성되는 RNA 분자를 설명한다. 이 용어는 또한 예를 들면 융합 단백질의 생성시에 사용될 수 있는 추가적 폴리펩티드 서열을 암호화하는 하이브리드 유전자의 일부를 형성하는 재조합 핵산을 설명한다.
"결찰"은 2개의 이본쇄 핵산 단편 사이의 포스포다이에스터 결합을 형성하는 과정을 의미한다(Sambrook 등, 1989). 상기와 다른 방식으로 제공되지 않는다면, 결찰은 결찰될 DNA 단편의 약 동몰량 0.5 ug당 T4 DNA 리가아제("리가아제") 10 유니트와 함께 공지된 완충액 및 조건을 사용하여 수행될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "핵산 분자"는 단일쇄 또는 이본쇄에 따라 각각 적어도 하나의 뉴클레오티드 염기 또는 하나의 뉴클레오티드 염기쌍으로 구성된다. 나아가, 핵산 분자는 다음의 핵산 분자 군에 의하여 비제한적으로 예시화됨으로써임의의 군의 뉴클레오티드-함유 분자에 배타적으로 또는 화학적으로 속할 수 있다: RNA, DNA, 게놈 핵산, 비게놈 핵산, 자연발생적인 핵산 및 비자연발생적인 핵산 및 합성 핵산. 이들은 비제한적으로 임의의 세포소기관, 예를 들면 미토콘드리아, 리보좀 RNA, 및 천연 발생적 성분과 함께 천연적으로 발생하지 않는 하나 이상의 성분을 화학적으로 포함하는 핵산 분자와 결합된 핵산을 포함한다.
또한, "핵산 분자"는 아미노산 및 당을 비제한적 예로서하는 하나 이상의 비-뉴클레오티드-기초한 성분을 포함할 수 있다. 따라서, 비제한적인 예로, 일부 뉴클레오티드-기초하고 일부 단백질 기초한 리보좀은 "핵산 분자"로 생각된다.
또한, 비제한적인 예로서, 방사능 또는 이와는 달리 비방사능 표지와 같은 검색가능한 부분으로 표지된 핵산 분자는 "핵산 분자"로 생각된다.
용어 특정 효소를 "암호화하는 핵산" 또는 "DNA 코딩 서열" 또는 "암호화하는 뉴클레오티드 서열" 및 기타 유사한 용어는 적절한 조절 서열의 조절하에 놓여지는 경우 효소로 전사되고 번역되는 DNA 서열을 의미한다. "프로모터 서열"은 세포내 RNA 폴리머라아제에 결합하고 하류(3' 방향) 코딩 영역의 전사를 개시할 수 있는 DNA 조절 영역이다. 프로모터는 DNA 서열의 일부이다. 이러한 서열은 이것의 3' 말단에 개시 코돈을 갖는다. 프로모터 서열은 배경 이상으로 검출가능한 수준에서 전사를 개시하는데 필요한 인자가 결합할 수 있는 최소 수의 염기를 포함한다. 그러나, RNA 폴리머라아제가 서열에 결합하고 전사가 개시 코돈(프로모터의 3' 말단)에서 개시된 후, 전사는 3'방향 하류로 진행된다. 프로모터 서열내에서 RNA 폴리머라아제의 결합을 가능하게 하는 전사 개시 부위(뉴클레아제 S1으로 맵핑함으로써 용이하게 정의됨) 및 단백질 결합 도메인(콘센서스 서열)이 발견될 것이다.
용어 "효소(단백질)을 암호화하는 핵산" 또는 "효소(단백질)을 암호화하는 DNA" 또는 "효소(단백질)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드" 및 기타 유사한 용어는 추가적 코딩 및/또는 논코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 효소를 위한 코딩 서열만을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
바람직한 구체예에서, "특정 핵산 분자 종"은 이것의 일차 서열에 의하여 예시되는 이것의 화학적 구조에 의하여 정의된다. 또다른 바람직한 구체예로서, 특이적 "핵산 분자 종"은 핵산 종으로부터 유래되는 생성물의 기능에 의하여 또는 핵산 종의 기능에 의하여 정의된다. 따라서, 비제한적인 예로서, "특이적 핵산 분자 종"은 이것의 발현되는 생성물에 기인하는 활성 또는 성질을 포함하여 이에 기인하는 하나 이상의 활성 또는 성질에 의하여 정의될 수 있다.
"작동성 핵산 표본을 핵산 라이브러리로의 조립"의 본원에서의 정의는 예컨대, 벡터로의 결찰 및 숙주의 형질전환에 의하여 핵산 표본을 벡터에 기초한 수집물로 통합시키는 단계를 포함한다. 적절한 벡터, 숙주 및 기타 반응제 및 이들의 비제한적 특정 예의 설명은 본원의 이하에서 제공한다. "작동성 핵산 표본을 라이브러리로의 조립"이라는 용어는 또한 어답터에 결찰시킴으로써 핵산 표본을 비-벡터-기초한 수집물로 통합시키는 단계를 포함한다. 어답터는 PCR에 의한 증폭을 용이하게 하기 위해 PCR 프라이머에 어닐될 수 있는 것이 바람직하다.
따라서, 비제한적 구체예로, "핵산 라이브러리"는 하나 이상의 핵산 분자의 벡터에 기초한 수집물로 구성된다. 또다른 구체예로서, "핵산 라이브러리"는 핵산분자의 비-벡터에 기초한 수집물로 구성된다. 그러나, 또다른 바람직한 구체예로서, "핵산 라이브러리"는 일부 벡터에 기초하고 일부 벡터에 기초하지 않는 핵산 분자의 배합된 수집물로 구성된다. 라이브러리를 구성하는 분자의 수집물은 각 핵산 분자 종에 따라 조사가능하고 분리가능한 것이 바람직하다.
본 발명은 "핵산 작제물" 또는 이와는 달리 "뉴클레오티드 작제물" 또는 이와는 달리 "DNA 작제물"을 제공한다. 용어 "작제물"은 본원에서 벡터 또는 벡터의 일부와 같은 하나 이상의 추가적 분자 부분에 선택적으로 화학 결합될 수 있는, 폴리뉴클레오티드(예, 피타제 폴리뉴클레오티드)와 같은 분자를 설명하는 것으로 사용된다. 비제한적인 특정 양태로서, 뉴클레오티드 작제물은 숙주 세포의 형질전환에 적합한 DNA 발현 작제물에 의하여 예시된다.
"올리고뉴클레오티드"는 화학적으로 합성될 수 있는 단일쇄 폴리데옥시뉴클레오티드 또는 2개의 상보적 폴리데옥시뉴클레오티드 쇄를 의미한다. 이러한 합성 올리고뉴클레오티드는 5' 포스페이트를 가질 수도 있고 갖지 않을 수도 있다. 5' 포스페이트가 없는 올리고뉴클레오티드는 키나아제의 존재하에 ATP와 함께 포스페이트를 추가하지 않으면 또다른 올리고뉴클레오티드에 연결되지 않을 것이다. 합성 올리고뉴클레오티드는 인산화되지 않는 단편에 결찰할 것이다.
코딩 서열은 RNA 폴리머라아제가 2개의 코딩 서열을 단일 mRNA로 전사하고, 이것이 양 코딩 서열로부터 유래되는 이미노산을 갖는 단일의 폴리펩티드로 번역되는 경우 또다른 코딩 서열에 "작동적으로 연결"된다. 발현되는 서열이 바람직한 단백질을 생성하도록 궁극적으로 처리되는 한 코딩 서열은 서로 인접할 필요가 없다.
본 발명의 내용에서, 용어 "피타제-특이적 프로브"는 기타 효소를 암호화하는 핵산 또는 이것의 상보적 서열에 대해서 보다 훨씬 더 검색가능한 정도로 피타제 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 이것의 상보적 서열에 결합하는 프로브를 의미한다.
엄격한 의미로, 용어 "피테이트", "피트산" 및 "피틴"은 다음과 같이 분별할 수 있다:"피테이트"는 피트산의 음이온 형태를 의미하고, "피트산"은 이노시톨 헥사포스페이트, 특히 식물잎을 포함하는 식물에서 천연적으로 발생하는 화합물, 및 효소 피타제를 위한 기질로서 작용할 수 있는 화합물을 의미하며; 및 "피틴"은 피트산의 칼슘-마그네슘 염과 같은 피트산의 염을 의미한다. 따라서, "피테이트", "피트산" 및 "피틴"은 화학적으로 결합되고 공유적 화학 구조를 갖는 상호변환가능한 형태이다. 따라서, 본원에서 사용된 바와 같이, "피테이트", "피트산" 및 "피틴"은 매우 관련된, 유사한, 화학적으로 상호변환가능한 정도의 상호교환가능한 용어이고, 본원에서 공개된 신규한 피타제 효소에 의하여 모두(상기 화학 상호변환가능에 관계없이) 분해될 수 있다. 따라서, 용어 "피테이트", "피트산" 또는 "피틴"은 본원에서 공개된 방법의 설명에 사용되는 경우, "피테이트", "피트산" 및 "피틴"을 포함하는 효소 피타제의 임의의 기질을 추가로 의미하는 대표적 용어로서 기능하는 것으로 이해된다.
"폴리뉴클레오티드"는 2 이상의 뉴클레오티드 염기 또는 뉴클레오티드 염기쌍으로 구성된 분자이다.
"프리-형태" 또는 "프로-형태"를 갖는 분자는 기준 프로-형태 분자와 비교하여 성질 변화(예, 활성의 증가)를 갖는 더욱 성숙한 분자 형태를 얻기 위하여, 도중에 1 이상의 공유 및 비공유 화학 변형(예, 당화, 단백질분해성 절단, 이량체화 또는 올리고머화, 온도-유도 또는 pH-유도되는 배치 변형, 공인자와 결합 등)의 임의의 조합을 거치는 분자를 의미한다. "프로-형태" 또는 "프리-형태"의 전구체 분자가 성숙한 분자의 생성을 위하여 도중에 2 이상의 변형(예, 2개의 단백질분해성 절단 또는 단백질 분해성 절단 및 당화의 변화)이 일어날 수 있는 경우, 용어 "프리-프로-형태"는 또한 전구체 분자에 대한 기준으로 사용될 수 있다. 따라서, 프리-프로-효소는 "프리-프로-형태"의 효소이다. 유사하게, 프로-프로 호르몬은 "프리-프로-형태"의 호르몬이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어"반응제"은 본 발명의 피타제 분자를 포함한다. 바람직하게는, 상기 피타제 분자는 피트산 착물로부터 무기물의 방출과 함께 피테이트를 이노시톨 및 유리 인산염으로의 가수분해를 촉매한다. 예시적 피타제 분자는 에슈리키아 콜리 B로부터 유래되는 피타제이다. 이러한 예시적 효소는 서열번호 2의 도1a와 1b에서 나타난다. 부가적으로, 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "반응제"은 본 발명의 기질 반응제 분자, 예를 들면 피타제 분자를 포함한다. 바람직하게는, 상기 피테이트 분자는 음식물, 가능한 음식물, 음식물의 부산물(시험관내 부산물 및 생체내 부산물, 예컨대 생체회 반응 생성물 및 동물 배변 생성물), 음식물 전구체 및 임의의 기타 피테이트 원료에서 발견된다.
"재조합" 효소는 재조합 DNA 기술에 의하여 생성되는 효소, 즉 바람직한 효소를 암호화하는 외인성 DNA 작제물에 의하여 형질전환되는 세포로부터 제조되는것을 의미한다. "합성" 효소는 화학 합성에 의하여 제조되는 것이다.
공지된 바와 같이 2가지 효소간의 "유사성"은 제1 효소의 아미노산 서열 및 그 보존적 아미노산 치환을 제2 효소의 서열과 비교함에 의하여 결정된다. 유사성은 공지의 공정, 예를 들면 BLAST 프로그램(Basic Local Alignment Search Tool, 생물 정보용 국립 센터)에 의하여 결정될 수 있다.
분자 쌍의 일원(예, 항체-항원 쌍 또는 핵산 쌍)이 기타, 비특이적 분자보다 더 강한 친화성을 가지고 서로 결합한다면, 서로 "특이적 결합"이라고 한다. 예를 들면, 비특이적 단백질에 대해서 보다 더 효율적으로 결합하는 항원에 대하여 생성된 항체는 항원에 특이적으로 결합하는 것으로 설명할 수 있다(염기 쌍 상호작용에 의하여 표적과 핵산 프로브가 특정 이중 나선구조를 형성할 수 있다면, 핵산 프로브가 핵산 표적에 특이적으로 결합하는 것으로 설명할 수 있는 것과 유사하다).
"엄격한 혼성화 조건"은 혼성화가 90 % 이상의 동일성, 바람직하게는 95% 이상의 동일성 및 더욱 바람직하게는 97% 이상의 동일성이 존재하는 경우에만 일어나는 것을 의미한다. 참조, Sambrook 등, 1989, 본원에서 전체가 참고로 인용됨.
본 발명은 또한 피타제 폴리펩티드의 서열, 예를 들면 서열번호 1에 "실질적으로 동일한" 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. "실질적으로 동일한" 아미노산 서열은 한 아미노산을 동일한 부류의 다른 아미노산으로의 치환(예, 이소류신, 발린, 류신 또는 메티오닌과 같은 하나의 소수성 아미노산을 또다른 소수성 아미노산으로의 치환, 또는 하나의 극성 아미노산을 또다른 극성 아미노산으로의 치환, 예를 들면 아르기닌을 라이신으로 치환, 글루탐산을 아스파르트산으로 치환, 또는 글루타민을 아스파라긴으로 치환)과 같은 보존적 아미노산 치환에 의하여 기준 서열 또는 기준 서열들과 상이한 서열이다.
또한, "실질적으로 동일한" 아미노산 서열은 비보존적 치환이 활성 부위 분자가 아닌 부위에서 일어나는 경우 및 폴리펩티드가 이것의 행위적 성질을 실질적으로 보유하는 경우에만, 하나 이상의 비보존적 치환, 결실 또는 삽입에 의하여 기준 서열 또는 기준 서열들과 상이한 서열이다. 예를 들면, 하나 이상의 아미노산은 피타제 폴리펩티드로부터 결실될 수 있으며, 이는 폴리펩티드의 생물학적 활성에 상당한 변형을 가하지 않으면서 폴리펩티드의 구조의 변형을 야기한다. 예를 들면, 피타제 생물학적 활성에 필요하지 않는 아미노 말단 또는 카르복시 말단 아미노산이 제거될 수 있다. 상기 변형은 소형의 활성 피타제 폴리펩티드를 개발할 수 있다.
본 발명은 "실질적으로 순수한 효소"를 제공한다. 용어 "실질적으로 순수한 효소"는 분자, 예를 들면 단백질, 지질, 탄수화물, 핵산 및 천연적으로 결합되는 기타 생물질이 실질적으로 부재하는 폴리펩티드(예, 피타제 폴리펩티드 또는 이것의 단편)를 설명하는 것으로 본원에서 사용된다. 예를 들면, 실질적으로 순수한 분자, 예를 들면, 폴리펩티드는 목적하는 분자의 60 건조 중량% 이상일 수 있다. 폴리펩티드의 순도는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(예, SDS-PAGE), 컬럼 크로마토그래피(예, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)), 및 아미노-말단 아미노산 서열 분석을 포함하는 표준 방법을 사용하여 결정할 수 있다.
본 발명은 신규하게 동정된 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드에 의하여 암호화되는 폴리펩티드, 상기 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 용도, 및 상기 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 생산 및 분비에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는, 본 발명의 폴리펩티드는 피타제, 특히 피타제 활성을 갖는 미생물 효소로서 동정되었다.
6.1- 신규한 피타제
6.1.1-신규한 피타제-일반적 개론:본 발명은 도1a와 1b에 나타난 바와 같은 정제된 재조합 피타제 효소를 제공한다. 또한, 본 발명은 도1a와 1b의 추론된 아미노산 서열을 갖는 성숙한 효소를 암호화하는 핵산 분자(폴리뉴클레오티드) 분리물을 제공한다.
본 발명의 피타제 분자(특히 재조합 효소 및 이것을 암호화하는 폴리뉴클레오티드)는 이것의 구조적 관점 및 기원적 관점에서 특허가능하게 신규하다. 또한, 본 발명의 피타제 분자는 활성의 관점에서 특허가능하게 신규하다. 예를 들면, 분석법(Food Chemicals Codex 4판에 기재)을 사용하여, 본 발명의 피타제 효소의 활성은 진균류(아스퍼길러스) 피타제 대조군과 비교하여 매우 우수한 것으로 측정되었다. 구체적으로, 다수의 실험은 약 4400 unit/mg의 활성을 갖는 E.coli 피타제 및 약 105 unit/mg의 활성을 갖는 아스퍼길러스 피타제를 보여주었다. 이것은 활성이 약 40배 차이가 난다.
6.1.2-피타제 폴리펩티드:본 발명은 피트산 착물로부터 무기물의 방출과 함께 피테이트를 이노시톨 및 유기 인산염으로 가수분해를 촉매하는 정제된 재조합 효소를 제공한다. 정제된 효소의 예시는 에슈리티아 콜리 B로부터 유래하는 피타제이다. 이러한 효소의 예시는 도1a와 1b, 서열번호 2에 제시된다.
본 발명의 효소는 도1a와 1b의 효소(특히 성숙한 효소) 및, 서열번호 1과 같은 피타제 폴리펩티드의 서열에 "실질적으로 동일한" 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
한 구체예에서, 본 발명의 서열번호 2의 피타제 효소는 유전자의 뉴클레오티드 서열로부터 추론되고 SDS-PAGE에 의하여 측정되는 바와 같이 약 47,056 킬로달톤의 분자량을 갖는다. pI는 6.70이다. 상기 효소의 pH 및 온도 프로필 및 안정화 데이터는 도2에 나타난다. 이 정제된 효소는 필요한 경우 피테이트를 이노시톨 및 유리 인산염으로 가수분해를 촉매하기 위하여 사용될 수 있다. 본 발명의 피타제 효소는 고도의 열안정성을 갖는다; 따라서, 물에서 미리 분해되지 않는 음식물 펠렛의 제조를 포함하는(이에 한정되는 것은 아님) 상승된 온도 및/또는 압력 적용에 특히 사용가능하다.
피타제 폴리펩티드는 도1a와 1b(서열번호 2)에 제시된 피타제의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 피타제 폴리펩티드, 예를 들면 E.coli B로부터 분리되는 것은 피트산 착물로부터 무기물의 방출과 함께 피테이트를 이노시톨 및 유리 인산염으로 가수분해를 촉매함으로써 특징지어 질 수 있다.
기타 피타제 폴리펩티드는 서열번호 2의 임의의 피타제와 같은 피타제 폴리펩티드의 아미노산 서열에 약 50% 이상의 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다. 아미노산 서열 상동성을 결정하는 비교에서 길이는 예컨대 15 아미노산 이상, 예컨대 20, 25 또는 35 이상의 아미노산일 수 있다.
상동성 또는 동일성은 종종 서열 분석 소프트웨어(예, 위스콘신 153705, 메디슨, 1710 유니버시티 에비뉴, 위스콘신 바이오테그놀로지 센터의 유니버시티, 제네틱 컴퓨터 그룹의 서열 분석 소프트웨어 패키지)를 사용하여 측정된다. 이러한 소프트웨어는 다양한 결실, 치환 및 기타 변형에 대한 상동정의 정도를 할당함으로써 유사한 서열을 매치한다. 본 문맥에서 2 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 "상동성" 및 "동일성"은 수동 배열 및 시각 조사에 의하여 또는 다수의 서열 비교 알고리즘을 사용하여 측정할때 지정된 영역 또는 비교 윈도우에 대하여 최대 상응을 위하여 배열 및 비교되는 경우 동일하거나 또는 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 특정 백분율을 갖는 2 이상의 서열, 또는 하위 서열을 말한다. 동일한 뉴클레오티드를 의미한다.
서열 비교를 위하여, 통상 한 서열은 비교되는 시험 서열에 대한 기준 서열로서 작용한다. 그러나, 기준 서열의 데이터베이스가 사용될 수 있다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우, 시험 및 기준 서열을 컴퓨터내로 입력하고 필요하다면 서열 좌표를 지정하고, 서열 알고리즘 프로그램 매개변수를 지정한다. 디폴트 프로그램 매개변수를 사용할 수 있으며, 또는 대안적 매개변수를 지정할 수 있다. 이어서 서열 비교 알고리즘은 프로그램 매개변수에 기초하여, 기준 서열에 비하여 시험 서열을 위한 백분율 서열 동일성을 계산한다.
본원에서 사용된 "비교 윈도우"는 2 서열을 최적으로 배열한 후, 동일한 수의 인접 위치의 기존 서열에 비교될 수 있는 서열 중 20 내지 600, 통상 약 50 내지 약 200, 바람직하게는 약 100 내지 약 150으로 구성된 군에서 선택되는 인접 위치의 수 중 임의의 하나의 단편을 포함한다. 비교를 위한 서열의 배열 방법은 공지되어 있다. 예를 들면, Smith & Waterman의 국소 상동성 알고리즘(Adv. Appl. Math. 2:482, 1981), Needleman & Wunsch의 상동성 배열 알고리즘(J. Mol. Biol 48:443, 1970), person & Lipman의 유사성 방법 서치(Proc, Nat'l. Acad. Sci. USA85:2444, 1988), 이러한 알고리즘의 컴퓨터에 의한 실행(GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA, 위스콘신, 메디슨, 575 사이언스, 제네틱 컴퓨터 그룹, 위스콘신 제네틱 소프트웨어 패키지) 또는 수동 배열 및 시각 조사에 의하여, 비교를 위한 서열의 최적 배열을 수행할 수 있다. 상동성 또는 동일성을 결정하기 위한 기타 알고리즘은 BLAST 프로그램(생물 정보를 위한 국립 센터에서 기초 국소 배열 서치 기구), ALIGN, AMAS(다중 배열된 서열의 분석), AMPS(단백질 다중 서열 배열), ASSET(배열된 단편 통계 평가 기구), BANDS, BESTSCOR, BIOSCAN(생물 서열 비교 분석 노드), BLIMPS(BLocks IMProved Searcher), FASTA, Intervals & Points, BMB, CLUSTAL V, CLUSTAL W, CONSENSUS, LCONSENSUS, WCONSENSUS, Smith-Waterman 알고리즘, DARWIN, 라스 베가스 알고리즘, FNAT(강화된 뉴클레오티드 배열 기구), 프레임라인, 프레인서치, DYNAMIC, FILTER, FSAP(Fristensky 서열 분석 패키지), GAP(글로벌 배열 프로그램), GENAL, GIBBS, GenQuest, ISSC(감응 서열 분석), LALIGN(국소 서열 분석), LCP(국소 콘텐트 프로그램), MACAW(다중 배열 작제 & 분석 워크벤치), MAP(다중 배열 프로그램), MBLKP, MBLKN, PIMA(양태-유도적 다중-서열 배열), SAGA(제네틱 알고리즘에 의한 서열 분석) 및 WHAT-IF를 포함한다. 상기 배열 프로그램은 또한 게놈 데이터베이스를 스크린하는데 사용되어 실질적으로 동일한 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 동정할 수 있다. 다수의 게놈 데이터베이스가 이용가능하고, 예를 들면 인간 게놈의 실질적인 부분이 인간 게놈 서열분석 프로젝트(J. Roach, http://weber.u.Washington.edu/~roach/human_genome_progress 2.htlm)의 일부로서 이용가능하다(Gibbs, 1995). 21 이상의 기타 게놈이 이미 서열결정되었다. 즉,예를 들면, M. genitalium(Fraser 등, 1995), M. jannaschii(Bult 등, 1996), H. influenzae(Fleischmann 등, 1995), E. coli(Blattner 등, 1997) 및 효모(S. cerevisiae)(Mewes 등, 1997), 및 D. melanogaster(Adams 등, 2000)을 포함한다. 상당한 방법이 또한 마우스, C.엘레간스 및 아라바돕시스 에스피와 같은 대표 유기체의 게놈의 서열결정시 수행되었다. 일부 기능성 정보로 주석을 단 게놈 정보를 함유하는 수개의 데이터베이스는 상이한 기관에 의하여 보관되며, 인터넷을 통하여 접근할 수 있다[예, http://wwwtigr.org/tdb; http://www.genetics.wise.edu; http://genome-www.stanford.edu/~ball; http://hiv-web.land.gov; http://www.ncbi.nlm.nih.gov; http://www.ebi.ac.uk; http://Pasteur.fr/other/biology; 및http://www.genome.wi.mit.edu].
유용한 알고리즘의 한 예는 BLAST와 BLAST 2.0 알고리즘이며, 이는 Altschul et al.,Nuc.Acids Res. 25:3389-3402, 1977 및 Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403-410,1990에 각각 개시되어 있다. BLAST 분석을 실행하는 소프트웨어는 생물 공학 정보를 위한 국립 센터(http://www.ncbi.nml.nih.gov/)를 통해 구할 수 있다. 이 알고리즘은 먼저 대상 서열중의 길이 W의 짧은 단어를 확인하여 높은 점수의 서열쌍(HSP)을 동정하는 것에 관련되며, 이는 데이타베이스 서열내의 같은 길이의 단어와 배열될 때 일부 양성값 역치 점수 T에 매치되거나 충족시키는 것이다. T는 이웃 단어 점수 역치로 칭해진다(Altschul et al.,상기).이들 초기 이웃 단어 히트(hit)는 그들을 함유한 보다 긴 HSP를 찾기 위한 조사를 개시하기 위한 출발점으로 작용한다. 단어 히트는 축적 배열 점수가 증가될 수 있는 한 각 서열을 따라 양 방향으로 연장된다. 축적 점수는 뉴클레오티드 서열의 경우, 매개변수 M(한 쌍의 매칭 잔기에 대한 보상 점수;항상 0보다 큼)을 이용하여 계산된다. 아미노산 서열의 경우, 축적 점수 계산을 위해 점수 매트릭스가 이용된다. 각 방향에서 단어 히트의 연장은, 축적 배열 점수가 그 최대 도달 값으로부터 양 X만큼 떨어질 때; 축적 점수가 하나 이상의 음성-점수 잔기 배열의 축적때문에 0 또는 그 이하로 갈때;또는 어느 한 서열의 말단에 도달할 때 멈춰진다. BLAST 알고리즘 매개변수 W,T,및 X는 배열의 민감성과 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열을 위함)은 11의 단어길이(W), 10의 예상치(E), M=5, N=-4 및 두 가닥의 비교를 디폴트로 이용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 3의 단어길이, 및 10의 예상치(E), 및 50의 BLOSUM62 점수 매트릭스(Henikoff&Henikoff, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915, 1989) 배열, 10의 예상치(E), M=5, N=-4 및 두 가닥의 비교를 디폴트로 이용한다.
BLAST 알고리즘은 또한 두 서열 사이의 유사성의 통계적 분석을 수행한다(예를 들어, Karlin & Altschul, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873, 1993). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 한 가지 척도는 최소의 합 확률(P(N))이며, 이는 두 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열 사이의 매치가 우연히 일어날 확률의 지표를 제공한다. 예를 들어, 핵산은 시험 핵산을 기준 핵산과 비교할 때 최소 합 확률이 약 0.2 미만, 바람직하게는 약 0.01 미만, 및 가장 바람직하게는 약 0.001 미만이면 기준 서열에 유사한 것으로 간주된다.
한 가지 구체예에서, 단백질과 핵산 서열 상동성은 Basic Local AlignmentSearch Tool("BLAST")을 이용하여 평가된다. 구체적으로, 다섯 개의 특정 BLAST 프로그램이 다음 작업을 수행하기 위해 이용된다:
(1)BLASTP와 BLAST3은 단백질 서열 데이타베이스에 대해 문제의 아미노산 서열을 비교한다;
(2)BLASTN은 뉴클레오티드 서열 데이타베이스에 대해 문제의 뉴클레오티드 서열을 비교한다;
(3)BLASTX는 단백질 서열 데이타베이스에 대해 문제의 뉴클레오티드 서열(양 가닥)의 6-프레임 개념적 번역 산물을 비교한다;
(4)TBLASTN은 모든 6 리딩 프레임(양 가닥)으로 번역된 뉴클레오티드 서열 데이타베이스에 대해 문제의 단백질 서열을 비교한다;
(5)TBLASTX는 뉴클레오티드 서열 데이타베이스의 6-프레임 번역에 대해 문제의 뉴클레오티드 서열의 6-프레임 번역을 비교한다.
BLAST 프로그램은 문제의 아미노산 또는 핵산 서열과 바람직하게는 단백질 또는 핵산 서열 데이타베이스에서 얻어지는 시험 서열 사이에서 "고-점수 단편 쌍"으로 칭해지는 유사 단편을 동정하여 상동성 서열을 확인한다. 고-점수 단편 쌍은 바람직하게는 당업계에 다수가 알려져 있는 점수 매트릭스를 이용하여 동정한다(즉, 배열된다). 바람직하게는, 이용되는 점수 매트릭스는 BLOSUM62 매트릭스(Gonnet et al.,Science 256:1443-1445,1992;Henikoff&Henikoff,Proteins 17:49-61, 1993)이다. 덜 바람직하게는, PAM 또는 PAM250 매트릭스가 또한 이용될 수도 있다(예를 들어, Schwarts and Dayhoff,eds.,1978, Matrices for DetectingDistance Relationships:Atlas of Proteins Sequence and Structure, Washington:National Biomedical Research Foundation).BLAST 프로그램은 미국 국립 의학 도서관을 통해, 예를 들어 www.ncbi.nlm.nih.gov에서 접근가능하다.
상기 알고리즘에 이용되는 매개변수는 서열 길이와 연구되는 상동성 정도에 따라 조절될 수 있다. 일부 구체예에서는, 매개변수는 사용자로부터의 지시가 없을 때 알고리즘에 의해 사용되는 디폴트 매개변수일 수도 있다.
본 발명은 추가로 도1a와 1b의 유추된 아미노산 서열을 갖는 효소와 그러한 효소의 유사체, 유도체, 및 단편에 관한 것이다.
도1a와 1b의 효소의 유사체, 유도체, 또는 단편은 (a) 유전자 코드에 의해 암호되지 않는 아미노산 잔기에 의해 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환된 것, 또는 (b) 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환기를 포함하는 것, 또는 (c) 성숙 효소가 효소의 반감기를 증가(예, 폴리에틸렌 글리콜)시키거나 또는 (d)6xHis 태그 또는 녹색 형광 단백질 태그와 같은 태그 또는 표지를 제공하기 위한 화합물과 같은 다른 화합물과 융합된 것, (e) 성숙 효소 또는 프로단백질 서열의 정제를 위해 이용되는 서열 또는 리더 또는 분비 서열과 같은 부가의 아미노산이 성숙 효소에 융합된 것일 수도 있다. 그러한 유사체, 유도체, 및 단편은 본원 명세서로부터 당업자의 기술 수준 범위내인 것으로 간주된다.
변이체, 예를 들어 "단편", "유사체", 또는 "유도체" 효소와 기준 효소는 임의의 조합으로 존재할 수도 있는 하나 이상의 치환, 부가, 결실, 융합 및 절단에 의해 아미노산 서열에서 다를 수 있다.
바람직한 변이중에는 보존적 아미노산 치환에 의해 기준과 다른 것들이 있다. 그러한 치환은 폴리펩티드내의 하나의 주어진 아미노산을 유사한 특성의 다른 아미노산에 의해 치환하는 것이다. 일반적으로 보여지는 보존적 치환은 지방족 아미노산 Ala,Val,Leu, 및 Ile간의 서로의 치환; 히드록실 잔기 Ser과 Thr의 상호 교환, 산성 잔기 Asp와 Glu의 교환, 아미드 잔기 Asn과 Gln사이의 치환, 염기성 잔기 Lys과 Arg의 교환 및 방향족 잔기 Phe,Tyr간의 대체이다.
따라서, 구체적인 비제한적 예에서, 치환은 하나의 아미노산의 유사한 특성의 다른 아미노산에 의한 치환으로 구성될 수 있다. 다른 구체의 비제한적 예에서, 치환은 아미노산의 비유사 아미노산에 의한 치환으로 구성될 수 있으며, 이때 치환은 적어도 하나의 효소 특성에 대해 비저해성이거나 침묵성이거나 또는 개선시키는 것이다.
부가적으로, 비제한적 예에서, 부가는 단백질의 아미노 또는 카르복시 말단또는 말단부 사이에서의 부가로 구성될 수 있으며, 이때 변화는 적어도 하나의 효소 특성에 대해 비저해성이거나 침묵성이거나 또는 개선시키는 것이다.
다른 구체적인 비제한적 예에서, 변화는 치환, 부가, 결실, 융합 및/또는 절단을 포함한, 기준 폴리뉴클레오티드(서열 번호 1)에 의해 암호되는 효소에서의 다수의 변형으로 구성되어, 개개의 변형의 효과에 상관없이 전체로 판단될 때 그 변형의 효과가 적어도 하나의 효소 특성에 대해 비저해성이거나 침묵성이거나 또는 개선시키는 것이다.
가장 바람직한 변이체는 기준 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 생물학적 기능과 활성을 보유하는 것이다.
"변이체" 용어는 하나 이상의 염기쌍, 코돈, 인트론, 엑손 또는 아미노산 잔기(각각)에서 변형되나 본 발명 피타제의 생물 활성은 보유한 본 발명 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 가리킨다. 변이체는 예를 들어, 하기에서 보다 상세히 설명되는 에러가 쉬운(error-prone) PCR, 셔플링, 올리고뉴클레오티드-지시된 돌연변이, 조립 PCR, 성(sexual) PCR 돌연변이, 생체내 돌연변이, 카세트 돌연변이, 귀납적 앙상블 돌연변이, 지수적 앙상블 돌연변이, 부위-특이적 돌연변이, 결찰 재조립, GSSM 및 이들의 임의의 조합과 같은 방법을 포함한 수단에 의해 생산될 수 있다.
6.1.3 - 피타제 폴리뉴클레오티드: 본 발명의 한 양태에 따라, 도1a와 1b의 유추된 아미노산 서열을 갖는 성숙 효소를 암호하는 분리된 핵산 분자(폴리뉴클레오티드)가 제공된다.
서열 번호 2를 암호하는 폴리뉴클레오티드는 하기하는 바와 같이 이.콜리로부터 회수된 게놈 DNA로부터 처음에 분리되었다. 이는 432 아미노산 잔기의 단백질을 암호하는 오픈 리딩 프레임을 함유한다.
본 발명의 다른 양태에 따라, 도1a와 1b의 DNA를 포함하는 본 발명의 예시 효소를 암호하는 분리된 폴리뉴클레오티드(서열 번호 1)가 제공된다.
본 발명은 또한 예를 들어 폴리뉴클레오티드에 의해 암호되는 아미노산 서열을 바꾸지 않는 변화와 같은 침묵성 변화가 되도록 기준 폴리뉴클레오티드와 다른 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 기준 폴리뉴클레오티드(서열 번호 1)에 의해 암호되는 효소에서 아미노산 치환, 부가, 결실, 융합 및 절단으로 귀결되는 뉴클레오티드 변화에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 양태에서 이들 효소는 기준 폴리뉴클레오티드에 의해 암호되는 효소와 대략 동일한 생물학적 작용을 보유한다.
본 발명은 또한 전술한 피타제 폴리펩티드를 암호하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 예를 들어, 서열 번호 2를 암호하는 핵산이 본 발명에 포함된다. 이들 핵산은 자연 발생 뉴클레오티드 서열, 또는 피타제를 암호하는 자연 발생 핵산과 다르지만 유전자 코드의 축퇴성때문에 동일한 아미노산을 암호하는 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 핵산은 DNA 또는 RNA 뉴클레오티드 또는 그 조합 또는 변형을 함유할 수 있다. 본 발명의 예시적인 핵산은 서열 번호 1에 나타난다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 cDNA, 게놈 DNA, 및 합성 DNA를 포함하는 DNA 형태일 수도 있다. DNA는 이중쇄 또는 단일쇄일 수도 있으며, 만일 단일쇄라면 암호쇄 또는 비암호(안티-센스)쇄일 수 있다. 성숙 효소를 암호하는 암호 서열은 도1a와 1b에 나타난 및/또는 기탁 클론 암호 서열(서열 번호 1)과 동일할 수도 있고 또는 유전자 코도의 축퇴성의 결과로서 도1a와 1b의 DNA(예, 서열 번호 1)와 동일한 성숙 효소를 암호하는 상이한 암호 서열일 수도 있다.
도1a와 1b의 성숙 효소(예, 서열 번호 2)를 암호하는 폴리뉴클레오티드는 성숙 효소를 위한 암호 서열만; 성숙 효소를 위한 암호 서열과 리더 서열 또는 프로단백질 서열과 같은 부가의 암호 서열;성숙 효소를 위한 암호 서열(그리고 선택적으로 부가의 암호 서열)과 인트론 또는 성숙 효소를 위한 암호 서열의 비암호 서열5' 및/또는 3'과 같은 비-암호 서열을 포함할 수도 있으며 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 추가로 도1a와 1b의 유추된 아미노산 서열(예, 서열 번호 2)을 갖는 효소의 단편, 유사체 및 유도체를 암호하는 전술한 폴리뉴클레오티드의 변이체에 관한 것이다. 폴리뉴클레오티드의 변이체는 폴리뉴클레오티드의 자연 발생 대립유전자 변이체 또는 폴리뉴클레오티드의 비천연 발생 변이체일 수도 있다.
따라서, 본 발명은 도1a와 1b에 나타난 것과 동일한 성숙 효소를 암호하는 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라 도1a와 1b의 효소의 단편, 유도체 또는 유사체를 암호하는 폴리뉴클레오티드 변이체를 포함한다. 그러한 뉴클레오티드 변이체는 결실 변이체, 치환 변이체 및 부가 또는 삽입 변이체를 포함한다.
전술한 대로, 폴리뉴클레오티드는 도1a와 1b에 나타난 암호 서열의 자연 발생 대립 유전자 변이체인 암호 서열을 가질 수도 있다. 당업계에 알려진 바처럼, 대립유전자 변이체는 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 결실 또는 부가를 가질 수도 있으며 암호된 효소의 기능을 실질적으로 바꾸지 않는 다른 형태의 폴리뉴클레오티드 서열이다.
본원에서 개시되는 대로, 변이체는 예를 들어, 에러가 쉬운 PCR, 셔플링, 올리고뉴클레오티드-지시된 돌연변이, 조립 PCR, 성 PCR 돌연변이, 생체내 돌연변이, 카세트 돌연변이, 귀납적 앙상블 돌연변이, 지수적 앙상블 돌연변이, 부위-특이적 돌연변이, 결찰 재조립, GSSM 및 이들의 임의의 조합과 같은 방법을 포함한 수단에 의해 생산될 수 있다.
한 가지 양태에서, 확률적인 셔플링에 다소 관련되며 합성 결찰 재조립(SLR)이라고 불리는 비-확률적 방법은 핵산 빌딩 블록이 임의로 셔플되거나 사슬처럼 연결되거나 또는 키메라화되지 않고 비확률적으로 조립되어 변이체 생성에 이용될 수 있도록 한다.
SLR 방법은 셔플될 폴리뉴클레오티드간의 높은 상동성의 존재에 의존하지 않는다. 본 발명은 10100이상의 다른 키메라들로 구성된 자손 분자 라이브러리(또는 세트)를 비확률적으로 생성시키기 위해 이용될 수 있다. 가능하게는, SLR은 101000이상의 다른 자손 키메라들로 구성된 라이브러리를 생성시키기 위해 이용될 수 있다.
따라서, 한 가지 양태에서, 본 발명은 고안에 의해 선택되는 전체적인 조립 순서를 갖는 최종 키메라 핵산 분자 세트를 생성하는 비확률적인 방법을 제공하며, 이 방법은 작용가능한 상호적 양립성 결찰 말단을 가진 다수의 특이적 핵산 빌딩 블록을 고안에 의해 생성시키는 단계와 이들 핵산 빌딩 블록을 조립하여 고안된 전체 조립 순서가 이루어지도록 하는 단계로 구성된다.
조립될 핵산 빌딩 블록의 상호 양립성 결찰 말단은 이들이 빌딩 블록이 미리 결정된 순서대로 연결될 수 있도록 하면 이러한 형태의 순차적 조립에 작용가능한 것으로 생각된다. 따라서, 한 가지 양태에서, 핵산 빌딩 블록이 연결될 수 있는 전체 조립 순서는 결찰 말단의 고안에 의해 특정되며, 만일 하나 이상의 조립 단계가 이용되면, 핵산 빌딩 블록이 연결될 수 있는 전체 조립 순서는 또한 조립 단계의 순차적인 순서에 의해 특정된다. 본 발명의 한 가지 구체예에서, 어닐된 빌딩 블록은 리가제(예, T4 DNA 리가제)와 같은 효소로 처리하여 빌딩 블록의 공유 결합을 이룬다.
다른 구체예에서, 핵산 빌딩 블록의 고안은 최종 키메라 핵산 분자의 자손 세트를 생산하기 위한 기초로 작용할 선구(progenitor) 핵산 주쇄 세트의 서열 분석시 얻어진다. 이들 선구 핵산 주쇄는 돌연변이될, 즉 키메라화되거나 셔플될 핵산 빌딩 블록의 고안을 도와줄 서열 정보의 공급원으로 작용한다.
한 예에서, 본 발명은 관련 유전자 군과 그들이 암호하는 관련 산물 군의 키메라화를 제공한다. 특정예에서, 암호화된 산물은 효소이다. 본 발명의 효소와 폴리펩티드는 본원에 개시된 방법에 따라 돌연변이될 수 있다.
따라서 본 발명의 한 양태에 따라, 다수의 선구 핵산 주쇄의 서열은 상동성 영역에 위치될 수 있는 하나 이상의 구분점을 선별하기 위해 배열된다. 구분점은 생성될 핵산 빌딩 블록의 경계를 긋기 위해 이용될 수 있다. 따라서, 선구 분자에서 확인되고 선별된 구분점은 자손 분자의 조립에서 가능한 키메라화 지점으로 작용한다.
일반적으로, 작용 가능한 구분점은 적어도 둘의 선구 주쇄에 의해 공유되는 상동성 영역(적어도 하나의 상동성 뉴클레오티드 염기로 구성됨)이지만, 구분점은 선구 주쇄의 적어도 반, 선구 주쇄의 적어도 2/3, 선구 주쇄의 적어도 3/4, 및 바람직하게는 선구 주쇄의 거의 모두에 의해 공유되는 상동성 영역일 수 있다. 더욱 바람직하게는 작용 가능한 구분점은 모든 선구 주쇄에 의해 공유되는 상동성 영역이다.
한 가지 구체예에서, 결찰 재조립 과정은 전체적인 라이브러리를 생성하기 위해 전체적으로 수행된다. 즉 다시 말하면, 핵산 빌딩 블록의 모든 가능한 순서의 조합이 최종 키메라 핵산 분자 세트에서 나타난다. 동시에, 각 조합에서 조립 순서(즉, 각 최종 키메라 핵산의 5'에서 3'으로의 서열의 각 빌딩 블록의 조립 순서)는 고안(또는 비확률적)에 의한다. 이 방법의 비확률적 특성때문에, 원치않는 부산물의 가능성이 크게 감소된다.
다른 구체예에서, 이 방법은 예를 들어 하나씩 체계적으로 검색될 수 있는 구획을 가진, 체계적으로 구획된 라이브러리를 생성하기 위해 체계적으로 수행된다. 다시 말하면, 본 발명은 순차적으로 단계를 밟는 조립 반응을 선택적이고 신중하게 이용하면서 특이적 핵산 빌딩 블록을 선택적이고 신중하게 이용함으로써, 몇 가지 반응 용기 각각에서 특이적인 자손 산물 세트가 만들어지도록 하는 실험적 고안이 이루어질 수 있다. 이에 의해 체계적인 검사와 검색 과정이 수행되도록 한다. 따라서, 이는 매우 많은 수의 자손 분자가 작은 군내에서 체계적으로 검사되도록 한다.
매우 유연성있으면서도 전체적이고 체계적인 방식으로 키메라화를 수행하는 능력때문에, 특히 선구 분자들 사이에 상동성이 낮을 때, 본 발명은 많은 수의 자손 분자로 구성된 라이브러리(또는 세트)의 생성을 제공한다. 본 결찰 재조립 발명의 비확률적 특성때문에, 생성된 자손 분자는 고안에 의해 선택된 전체적인 조립 순서를 갖는 최종 키메라 핵산 분자 라이브러리를 포함하는 것이 바람직하다. 특정구체예에서, 그러한 생성된 라이브러리는 103이상 내지 101000이상의 다른 자손 분자 종으로 구성된다.
한 가지 양태에서, 전술한 대로 생성된 최종 키메라 핵산 분자 세트는 폴리펩티드를 암호하는 폴리뉴클레오티드로 구성된다. 한 가지 구체예에 따라, 이 폴리뉴클레오티드는 유전자이며, 이는 사람이 만든 유전자일 수도 있다. 다른 구체예에 따라, 이 폴리뉴클레오티드는 유전자 경로이고, 이는 사람이 만든 유전자 경로일 수도 있다. 본 발명은 본 발명에 의해 생성된 하나 이상의 인공 유전자가 진핵 유기체(식물 포함)에서 작동할 수 있는 경로와 같은 인공 유전자 경로내로 혼입될 수도 있도록 한다.
다른 구체예에서, 빌딩 블록이 생성되는 단계의 합성적 특성은 추후에 선택적으로 생체외 과정(예, 돌연변이) 또는 생체내 과정(예,숙주 유기체의 유전자 스플라이싱 능력을 이용)에서 제거될 수 있는 뉴클레오티드(예를 들어, 코돈 또는 인트론 또는 조절 서열일 수도 있는 하나 이상의 뉴클레오티드)의 고안과 도입을 허용한다. 많은 경우 이들 뉴클레오티드의 도입이 또한 작용 가능한 구분점을 생성시키는 가능한 잇점에 더해 많은 다른 이유로 바람직할 수도 있다는 것이 이해된다.
따라서, 다른 구체예에 따라, 본 발명은 핵산 빌딩 블록이 인트론을 도입시키기 위해 이용될 수 있도록 한다. 따라서, 본 발명은 기능성 인트론이 본 발명의 인공 유전자내로 도입될 수도 있도록 한다. 본 발명은 또한 기능성 인트론이 본 발명의 인공 유전자 경로내로 도입될 수 있도록 한다. 따라서, 본 발명은 하나 이상의 인공적으로 도입된 인트론을 함유하는 인공 유전자인 키메라 폴리뉴클레오티드의 생성을 제공한다.
따라서, 본 발명은 또한 하나 이상의 인위적으로 도입된 인트론을 함유하는 인공 유전자 경로인 키메라 폴리뉴클레오티드의 생성을 제공한다. 바람직하게는, 인공적으로 도입된 인트론은 천연 발생 인트론이 유전자 스플라이싱에서 작용하는 방식으로 유전자 스플라이싱에 대해 하나 이상의 숙주 세포에서 기능성이다. 본 발명은 재조합 및/또는 스플라이싱을 위해 숙주 유기체내로 도입될 인공 인트론 함유 폴리뉴클레오티드를 생산하는 과정을 제공한다.
본 발명을 이용하여 생성된 인공 유전자는 다른 핵산과의 재조합을 위한 기질로서 작용할 수 있다. 유사하게, 본 발명을 이용하여 생성된 인공 유전자 경로는 다른 핵산과의 재조합을 위한 기질로서 작용할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 재조합은 인공 인트론 함유 유전자와 재조합 파트너로 작용하는 핵산 사이의 상동성 영역에 의해 촉진되거나 그 영역에서 일어난다. 특히 바람직한 예에서, 재조합 파트너는 또한 인공 유전자 또는 인공 유전자 경로를 포함하는 본 발명에 의해 생성된 핵산일 수도 있다. 재조합은 인공 유전자내의 하나 이상의 인위적으로 도입된 인트론에 존재하는 상동성 영역에 의해 촉진되거나 그 영역에서 일어날 수도 있다.
본 발명의 합성 결찰 재조립 방법은 다수의 핵산 빌딩 블록을 이용하며 이들 각각은 바람직하게는 두 개의 결찰 말단을 갖는다. 각 핵산 빌딩 블록의 두 개의 결찰 말단은 두 개의 블런트(blunt) 말단(즉, 각각 0개의 뉴클레오티드의 오버행(overhang)을 가짐)일 수도 있고, 또는 바람직하게는 하나의 블런트 말단과하나의 오버행, 또는 더욱 바람직하게는 두 개의 오버행일 수도 있다.
이 목적을 위해 작용 가능한 오버행은 3' 오버행 또는 5' 오버행일 수 있다. 따라서, 핵산 빌딩 블록은 3' 오버행 또는 다르게는 5' 오버행 또는 다르게는 두 개의 3' 오버행 또는 다르게는 두 개의 5' 오버행을 가질 수도 있다. 핵산 빌딩 블록이 조립되어 최종 키메라 핵산 분자를 형성하는 전체적인 순서는 목적성 실험 고안에 의해 결정되며 임의적이지 않다.
한 가지 구체예에 따르면, 핵산 빌딩 블록은 두 개의 단일쇄 핵산(단일쇄 올리고라고도 함)의 화학 합성 및 그들을 접촉시켜 그들이 어닐링하여 이중쇄 핵산 빌딩 블록을 형성하도록 함으로써 생성된다.
이중쇄 핵산 빌딩 블록은 다양한 크기일 수 있다. 이들 빌딩 블록의 크기는 작거나 클 수 있다. 빌딩 블록을 위한 바람직한 크기는 1 염기쌍(오버행 포함 안함) 내지 100,000 염기쌍(오버행 포함 안함) 범위이다. 1 염기쌍 내지 10,000 염기쌍(그 사이의 모든 정수값을 포함)의 저 한계와 2 염기쌍 내지 100,000 염기쌍(그 사이의 모든 정수값을 포함)의 고 한계를 갖는 다른 바람직한 크기 범위도 또한 제공된다.
본 발명에 작용 가능하며 이중쇄 핵산 빌딩 블록이 생성될 수 있는 많은 방법이 존재하며, 이들은 당업계에 공지이고 당업자가 용이하게 수행할 수 있다.
한 구체예에 따르면, 이중쇄 핵산 빌딩 블록은 먼저 두 개의 단일쇄 핵산을 생성하고 그들이 어닐링시켜 이중쇄 핵산 빌딩 블록을 형성하도록 함으로써 생성된다. 이중쇄 핵산 빌딩 블록의 두 쇄는 오버행을 형성하는 임의의 뉴클레오티드를제외한 모든 뉴클레오티드마다 상보적일 수도 있으며, 따라서 오버행을 제외하고는 미스매치를 전혀 안 가질 수도 있다. 다른 구체예에 따르면, 이중쇄 핵산 빌딩 블록의 두 쇄는 오버행을 형성하는 임의의 뉴클레오티드를 제외한 모든 뉴클레오티드보다 적은 뉴클레오티드에서 상보적일 수도 있다. 따라서, 이 구체예에 따르면, 이중쇄 핵산 빌딩 블록은 코돈 축퇴성을 도입하기 위해 이용될 수 있다. 바람직하게는 코돈 축퇴성은 본원에서 개시된 부위-포화 돌연변이를 이용하여 하나 이상의 N,N,G/T 카세트를 이용하거나 또는 하나 이상의 N,N,N 카세트를 이용하여 도입된다.
본 발명의 생체내 재조합 방법은 미지의 하이브리드 또는 특정 폴리뉴클레오티드 또는 서열의 대립 유전자의 풀에서 무작위로 이루어질 수 있다. 하지만, 특정 폴리뉴클레오티드의 실제 DNA 또는 RNA 서열을 알 필요는 없다.
유전자의 혼합 집단내에서 재조합을 이용하는 접근법은 임의의 유용한 단백질, 예를 들어 인터루킨 I, 항체, tPA 및 성장 호르몬 생성에 유용할 수 있다. 이 접근은 바뀐 특이성 또는 활성을 갖는 단백질을 생성하기 위해 이용될 수도 있다. 이 접근은 또한 하이브리드 핵산 서열, 예를 들어, 프로모터 영역, 인트론, 엑손, 인핸서 서열, 유전자의 31 비번역 영역 또는 51 비번역 영역의 생성에 유용할 수도 있다. 따라서, 이 접근은 증가된 발현율을 갖는 유전자를 생성하기 위해 이용될 수도 있다. 이 접근은 또한 반복적 DNA 서열의 연구에 유용할 수도 있다. 마지막으로 이 접근은 리보자임 또는 앱타머(aptamer)를 돌연변이시키는 데 유용할 수도 있다.
한 가지 양태에서 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드와 폴리펩티드의 변이체는감소적 재분류, 재조합 및 선별을 반복 순환하여 이용하여 얻어지며 이는 재조합을 통하여 DNA, RNA 또는 단백질과 같은 고도로 복잡한 선형 서열의 분자적 진화를 지시할 수 있도록 한다.
분자의 생체내 셔플링은 변이체를 제공하는 데 유용하며 세포의 천연 특성을 이용하여 수행되어 다량체를 재조합할 수 있다. 생체내 재조합이 분자적 다양성에 대한 주요 자연 경로를 제공해 온 반면, 유전자 재조합은 1)상동성의 인식; 2)쇄 절단, 쇄 침입, 및 재조합 키아즈마(chiasma) 생성으로 이끄는 대사적 단계; 및 3)분리된 재조합 분자로의 키아즈마의 분리에 관계되는 상대적으로 복잡한 과정으로 남아 있다. 키아즈마의 형성은 상동성 서열의 인식을 요구한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 적어도 첫 번째 폴리뉴클레오티드와 두 번째 폴리뉴클레오티드로부터의 하이브리드 폴리뉴클레오티드를 생산하는 방법을 포함한다. 본 발명은 적어도 하나의 부분적 서열 상동성 영역을 공유하는 적어도 첫 번째 폴리뉴클레오티드와 두 번째 폴리뉴클레오티드를 적절한 숙주 세포내로 도입하여 하이브리드 폴리뉴클레오티드를 생산하기 위해 이용될 수 있다. 부분적 서열 상동성 영역은 하이브리드 폴리뉴클레오티드를 생산하는 서열 재조직화로 귀결되는 과정을 촉진한다. 본원에서 "하이브리드 폴리뉴클레오티드"는 본 발명 방법에서 얻어지는 임의의 뉴클레오티드 서열이며 적어도 두 개의 기원 폴리뉴클레오티드 서열로부터의 서열을 함유한다. 그러한 하이브리드 폴리뉴클레오티드는 DNA 분자간 서열 통합을 촉진하는 분자간 재조합 사건으로부터 생길 수 있다. 더욱이, 그러한 하이브리드 폴리뉴클레오티드는 DNA 분자내에서 뉴클레오티드 서열을 바꾸기 위해 반복서열을 이용하는 분자내 감소성 재분류 과정으로부터 생성될 수 있다.
본 발명은 생물학적 활성 하이브리드 폴리펩티드(예, 하이브리드 피타제)를 암호할 수도 있는 하이브리드 폴리뉴클레오티드를 생성하는 수단을 제공한다. 한 가지 양태에서, 원래의 폴리뉴클레오티드는 생물학적 활성 폴리펩티드를 암호한다. 본 발명 방법은 원래의 폴리뉴클레오티드의 서열을 통합시켜 생성되는 하이브리드 폴리뉴클레오티드가 원래의 생물학적 활성 폴리펩티드로부터 유래된 활성을 보여주는 폴리펩티드를 암호하도록 하는 세포 과정을 이용함으로써 새로운 하이브리드 폴리펩티드를 생산한다. 예를 들어, 원래의 폴리뉴클레오티드는 다른 미생물로부터의 특정 효소를 암호할 수도 있다. 한 유기체로부터의 첫 번째 폴리뉴클레오티드에 의해 암호되는 효소 또는 변이체는 예를 들어 특정 환경 조건, 예, 고염도하에서 효과적으로 작용할 수도 있다. 다른 유기체로부터의 두 번째 폴리뉴클레오티드에 의해 암호되는 효소 또는 변이체는 초고온과 같은 다른 환경 조건하에서 효과적으로 작용할 수도 있다. 첫 번째와 두 번째 원래 폴리뉴클레오티드로부터의 서열을 함유하는 하이브리드 폴리뉴클레오티드는 원래 폴리뉴클레오티드에 의해 암호되는 두 효소의 특성을 보여주는 효소를 암호할 수도 있다. 따라서, 하이브리드 폴리뉴클레오티드에 의해 암호되는 효소는 첫 번째와 두 번째 폴리뉴클레오티드에 의해 암호되는 효소 각각에 의해 공유되는 환경 조건, 예를 들어 고염성과 극한 온도하에서 효과적으로 작용할 수도 있다.
원래의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호되는 효소는 피타제를 포함하며 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 방법에 의해 생성되는 하이브리드 폴리펩티드는 원래효소에서는 나타나지 않는 특정 효소 활성을 보일 수도 있다. 예를 들어, 히드롤라제 활성을 암호하는 폴리뉴클레오티드의 재조합 및/또는 감소적 재분류에 이어, 하이브리드 폴리뉴클레오티드에 의해 암호되는 생성 하이브리드 폴리펩티드는 원래 효소 각각으로부터 얻어지는 특정 히드롤라제 활성에 대해 검색될 수 있는 바, 즉, 히드롤라제가 작용하는 결합 유형 및 히드롤라제가 작용하는 온도에 대해 검색될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 히드롤라제는 하이브리드 히드롤라제를 원래의 히드롤라제와 구별하는 화학적 기능성, 예를 들어 (a)아미드(펩티드) 결합, 즉 프로테아제; (b)에스테르 결합, 즉, 에스테라제와 리파제; (c) 아세탈, 즉 글리코시다제 및 예를 들어 하이브리드 폴리펩티드가 작용하는 온도, pH, 또는 염 농도를 확인하기 위해 검색될 수도 있다.
원래의 폴리뉴클레오티드의 공급원은 별개의 유기체("분리물"), 한정된 배지에서 성장한 유기체 군락("풍부 배양물"), 또는 미배양 유기체("환경 시료")로부터 분리될 수도 있다. 환경 시료로부터 신규의 생물활성을 암호하는 폴리뉴클레오티드를 유도하기 위한 배양물-비의존성 접근의 이용은 미개발의 생물 다양성 자원에 대한 접근을 허용하므로 가장 바람직하다.
"환경적 라이브러리"는 환경 시료로부터 생성되며 적절한 원핵 숙주에서 증식될 수 있는 클로닝 벡터에 보관된 천연 발생 유기체의 집합적 게놈을 나타낸다. 클론된 DNA가 처음에 환경 시료로부터 직접 추출되기 때문에, 라이브러리는 순수 배양에서 자랄 수 있는 원핵 생물의 작은 분획에 제한되지 않는다. 부가적으로, 이들 시료에 존재하는 환경 DNA의 표준화는 원래 시료에 존재하는 모든 종으로부터의DNA의 보다 동등한 대표를 허용할 수 있다. 이는 우성 종과 비교하여 몇 차수 정도의 양만큼 덜 표현될 수도 있는 시료의 소수 구성 성분으로부터의 관심 유전자를 발견하는 효율을 극적으로 증가시킬 수 있다.
예를 들어, 하나 이상의 미배양 미생물로부터 생성된 유전자 라이브러리는 관심의 활성에 대해 검색된다. 관심의 생물활성 분자를 암호하는 가능한 경로는 먼저 유전자 발현 라이브러리 형태로 원핵 세포에서 포획된다. 관심 활성을 암호하는 폴리뉴클레오티드는 그러한 라이브러리로부터 분리되고 숙주 세포내로 도입된다. 숙주 세포는 신규하거나 증가된 활성을 가진 잠재적 활성 생물분자를 생성하는 재조합 및/또는 감소적 재분류를 촉진하는 조건하에서 성장된다.
폴리뉴클레오티드가 제조될 수 있는 미생물은 크산토박터, 유박테리아 및 알키박테리아와 같은 원핵 미생물, 및 균류, 일부 조류 및 원생 동물과 같은 하위 진핵 미생물을 포함한다.
폴리뉴클레오티드는 유기체 배양없이 또는 하나 이상의 배양된 유기체로부터 핵산이 회수될 수도 있는 환경 시료로부터 분리될 수도 있다. 한 가지 양태에서, 그러한 미생물은 초고온균, 저온성균, 내냉성균, 호염성균, 호압성균 및 호산균과 같은 호극성균일 수도 있다. 호극성 미생물로부터 분리된 효소를 암호하는 폴리뉴클레오티드가 특히 바람직하다. 그러한 효소는 육지 온천과 심해 열통기구에서 100℃ 이상의 온도에서, 북극수에서 0℃ 이하의 온도에서, 사해의 포화 염 환경에서, 석탄층과 지열 유황온천에서 0 주위의 pH 값에서, 또는 하수 폐수에서 11 이상의 pH 값에서 작용할 수도 있다. 예를 들어, 호극성 유기체로부터 클론되고 발현된 몇몇 에스테라제와 리파아제는 광범위한 온도와 pH에서 높은 활성을 보여준다.
전술한 대로 선택되고 분리된 폴리뉴클레오티드는 적절한 숙주 세포내로 도입된다. 적절한 숙주 세포는 재조합 및/또는 감소적 재분류를 촉진할 수 있는 임의의 세포이다. 선택된 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 적절한 조절 서열을 포함한 벡터내에 있다. 숙주 세포는 포유류 세포와 같은 고등 진핵 세포일 수 있으며, 효모 세포와 같은 하등 진핵 세포일 수 있고, 또는 바람직하게는 숙주 세포는 박테리아 세포같은 원핵 세포일 수 있다. 그 구조물을 숙주 세포에 도입하는 것은 칼슘 포스페이트 형질감염, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 또는 일렉트로포레이션(Davis et al.,1986)에 의해 이루어질 수 있다.
적절한 숙주의 대표적 예는 이.콜리, 스트렙토마이세스, 살모넬라 티피미리윰같은 박테리아 세포;효모같은 균류 세포;드로소필라 S2와 스포돕테라 Sf9와 같은 곤충 세포; CHO, COS 또는 Bowes 흑색종같은 동물 세포;아데노바이러스; 및 식물 세포 등이다. 적절한 숙주의 선택은 당업자가 본원의 개시로부터 할 수 있는 것이다.
재조합 단백질을 발현하기 위해 이용될 수 있는 다양한 포유동물 세포 배양 시스템을 구체적으로 언급하면서, 포유동물 발현 시스템의 예는 "SV40-형질전환된 원숭이 세포는 초기 SV40 돌연변이의 복제를 지지한다"(Gluzman, 1981)에 개시된 원숭이 신장 섬유아세포의 COS-7 주, 및 C127, 3T3,CHO,HeLa와 BHK 세포주와 같은, 양립성 벡터를 발현할 수 있는 다른 세포주들을 포함한다. 포유동물 발현 벡터는 복제 오리진, 적절한 프로모터와 인핸서, 그리고 또한 임의의 필요한 리보솜 결합부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 공여부와 수용부, 전사 종결 서열, 및 5' 인접 비전사 서열을 포함할 것이다. SV40 스플라이스로부터 유래된 DNA 서열, 및 폴리아데닐화 부위는 요구되는 비전사 유전 요소를 제공하기 위해 이용될 수도 있다.
관심의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 숙주 세포는 프로모터를 활성화시키기고, 형질전환체를 선별하거나 유전자를 증폭시키기에 적합하게 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양될 수 있다. 온도, pH, 등과 같은 배양 조건은 발현을 위해 선택된 숙주 세포에 대해 이전에 사용되던 것들이며, 당업자에게 명백할 것이다. 특정 효소 활성을 갖는 것으로 확인된 클론은 이어서 서열 결정되어 증가된 활성을 갖는 효소를 암호하는 폴리뉴클레오티드 서열을 동정할 것이다.
다른 양태에서, 하나 이상의 오페론 또는 유전자 군 또는 그 부분으로부터 생화학적 경로를 암호하는 신규의 폴리뉴클레오티드를 생성하기 위한 방법들이 이용될 수 있다. 예를 들어, 박테리아와 많은 진핵 생물은 생성물이 관련 과정에서 관계되는 유전자를 조절하기 위한 조절된 기작을 갖는다. 유전자는 하나의 염색체상에 또는 서로 바로 이웃하여 "유전자 군(gene cluster)"이라고 하는 구조로 모여 있으며, 이들은 전체 군의 전사를 개시하는 단일 프로모터를 포함한 단일 조절 서열의 조절하에서 함께 전사된다. 따라서, 유전자 군은 일반적으로 그 기능에 있어서 동일하거나 관련된 이웃한 유전자 그룹이다. 유전자 군에 의해 암호되는 생화학 경로의 예는 폴리케티드이다. 폴리케티드는 항생제(예, 테트라사이클린과 에리트로마이신), 항암제(다우노마이신), 면역억제제(FK506과 라파마이신), 및 수의 제품(모넨신)을 포함한 매우 풍부한 생물 활성원인 분자이다. 많은 폴리케티드(폴리케티드 신타제에 의해 생산)는 치료제로서 가치있다. 폴리케티드 신타제는 길이 및 기능성과 고리화 패턴이 다른 매우 다양한 탄소 쇄의 생합성을 촉매하는 다기능성 효소이다. 폴리케티드 신타제 유전자는 유전자 군에 속하고 적어도 한 유형(유형 I)의 폴리케티드 신타제가 큰 크기의 유전자와 효소를 가져 이들 유전자/단백질의 유전적 조작과 생체외 연구를 복잡하게 한다.
유전자 군 DNA는 다른 유기체로부터 분리되어 벡터, 특히 결찰된 유전자 군으로부터 검출가능한 단백질 또는 단백질-관련 배열 활성의 생성을 조절할 수 있는 발현 조절 서열을 함유한 벡터에 결찰될 수 있다. 외인성 DNA 도입에 대해 예외적으로 큰 수용 능력을 갖는 벡터를 사용하는 것이 그러한 유전자 군의 사용에 특히 적합하며 이.콜리의 f-인자(또는 가임성 인자)를 포함하는 것으로 본원에서 예시로 설명된다. 이.콜리의 이 f-인자는 접합동안 그 자체의 고-빈도 전이에 영향을 주는 플라스미드이며, 혼합 미생물 시료로부터의 유전자 군과 같은 큰 DNA 단편을 안정하게 증폭시키는 데 이상적이다. 일단 적절한 벡터에 결찰되면, 다른 피타제 유전자 군을 함유한 둘 이상의 벡터는 적절한 숙주 세포에 도입될 수 있다. 유전자 군에 의해 공유되는 부분적 서열 상동성 영역은 하이브리드 유전자 군으로 귀결되는 서열 재조직화를 일으키는 과정을 촉진할 것이다. 이어서 신규한 하이브리드 유전자 군은 원래의 유전자 군에서는 발견되지 않는 증가된 활성에 대해 검색될 수 있다.
그래서, 한 가지 구체예에서, 본 발명은 생물학적으로 활성인 하이브리드 폴리펩티드를 생성하고 그러한 폴리펩티드를 증가된 활성에 대해 하기에 의해 검색하는 방법에 관한 것이다.
1) 작동가능하게 연결된 적어도 첫 번째 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결된 두번째 폴리뉴클레오티드를 적절한 숙주 세포내로 도입함(이때 적어도 첫 번째 폴리뉴클레오티드와 두 번째 폴리뉴클레오티드는 부분적 서열 상동성 영역을 적어도 하나 공유함);
2) 작동가능하게 연결된 하이브리드 폴리뉴클레오티드로 귀결되는 서열 재조직화를 촉진하는 조건하에서 숙주 세포를 성장시킴;
3) 하이브리드 폴리뉴클레오티드에 의해 암호되는 하이브리드 폴리펩티드를 발현시킴;
4) 증가된 생물 활성의 확인을 촉진하는 조건하에서 하이브리드 폴리펩티드를 검색함; 및
5) 하이브리드 폴리펩티드를 암호하는 폴리뉴클레오티드를 분리함.
다양한 효소 활성을 위한 검색 방법은 당업계에 공지되어 있으며 본 명세서 전반에서 설명된다. 그러한 방법은 본 발명의 폴리펩티드와 폴리뉴클레오티드를 분리할 때 이용될 수 있다.
본원에서 이용될 수 있는 발현 벡터의 대표적인 예는 바이러스 입자, 바큘로바이러스, 파아지, 플라스미드, 파아지미드, 코스미드, 포스미드, 박테리아 인공 염색체, 바이러스 DNA(예, 백시니아, 아데노바이러스, 파울 폭스 바이러스, 가성광견병 및 SV40 유도체), P1-계 인공 염색체, 효모 플라스미드, 효모 인공 염색체, 및 관심 숙주(예, 바실러스, 아스퍼질러스 및 효모)에 대해 특이적인 임의의 다른벡터일 수 있다. 따라서, 예를 들어, DNA는 폴리펩티드 발현을 위한 다양한 발현 벡터중의 임의의 하나에 포함될 수도 있다. 그러한 벡터는 염색체, 비염색체 및 합성 DNA 서열을 포함한다. 많은 수의 적절한 벡터가 당업계에 공지되어 있으며 시판되고 있다. 하기의 벡터가 예로서 제공된다; 박테리아성:pQE 벡터(Qiagen), pBluescript 플라스미드, pNH 벡터(람다-ZAP 벡터(Stratagene);ptrc99a,pKK223-3,pDR540,pRIT2T(Pharmacia);진핵성:pXT1,pSG5(Stratagene),pSVK3,pBPV,pMSG,pSVLSV40(Pharmacia). 하지만, 숙주내에서 복제가능하고 생존가능하면 임의의 다른 플라스미드 또는 다른 벡터가 이용될 수 있다. 낮은 카피수 또는 높은 카피수 벡터가 본 발명에 이용될 수 있다.
본 발명에 이용하기에 바람직한 유형의 벡터는 f-인자 오리진 복제를 함유한다. 이.콜리의 f-인자는 접합동안 그 자신의 고빈도 전이를 일으키고 박테리아 염색체 자체의 저빈도 전이를 일으키는 플라스미드이다. 특히 바람직한 구체예는 "포스미드(fosmid)"로 불리는 클로닝 벡터 또는 박테리아 인공 염색체(BAC) 벡터를 이용하는 것이다. 이들은 게놈 DNA의 큰 단편을 안정하게 통합시킬 수 있는 이.콜리 f-인자로부터 유래된다. 혼합 미배양 환경 시료로부터의 DNA와 통합될 때, 이것은 안정한 "환경 DNA 라이브러리" 형태로 큰 게놈 단편을 이루는 것을 가능하게 한다.
본 발명에 사용하기 위한 다른 형태의 벡터는 코스미드 벡터이다. 코스미드 벡터는 게놈 DNA의 큰 단편을 클론하고 증식시키기 위해 처음에 고안되었다. 코스미드 벡터로의 클로닝은 "Molecular Cloning:A Laboratory Manual"(Sambrook et al.,1989)에 상세히 개시된다.
발현 벡터내의 DNA 서열은 RNA 합성을 지시하기 위한 적절한 발현 조절 서열(프로모터)에 작동적으로 연결된다. 구체적으로 언급되는 박테리아 프로모터는 lacI, lacZ, T3, T7, gpt, 람다 PR,PL및 trp를 포함한다. 진핵성 프로모터는 CMV 중간 초기, HSV 티미딘키나제, 초기 및 후기 SV40, 레트로바이러스로부터의 LTR, 및 마우스 메탈로티오네인-I을 포함한다. 적절한 벡터와 프로모터의 선택은 당업자의 기술 범위내이다. 발현 벡터는 또한 번역 개시와 전사 종결을 위한 리보솜 결합 부위를 함유한다. 벡터는 또한 발현 증가를 위한 적절한 서열을 포함할 수도 있다. 프로모터 영역은 CAT(클로람페니콜 전이효소) 벡터 또는 선별 표지를 가진 다른 벡터를 이용하여 임의의 원하는 유전자로부터 선택될 수 있다. 더욱이, 발현 벡터는 진핵 세포 배양물을 위해서는 디하이드로폴레이트 환원효소 또는 네오마이신 내성, 또는 이.콜리에서의 테트라사이클린 또는 암피실린 내성과 같은 하나 이상의 선별 표지 유전자를 함유하여 형질전환된 숙주 세포의 선택을 위한 표현형적 형질을 제공한다.
생체내 재분류는 총체적으로 "재조합"이라고 불리는 "분자간" 과정에 집중되며 이는 박테리아에서는 일반적으로 "RecA-의존성" 현상으로 생각된다. 본 발명은 숙주 세포가 서열을 재조합하고 재분류하는 재조합 과정, 또는 세포가 감소적 과정을 매개하여 결실에 의해 유사-반복 서열의 복잡성을 감소시키는 능력에 의존할 수 있다. "감소적 재분류"의 이 과정은 "분자내", RecA-비의존성 과정에 의해 일어난다.
그래서, 본 발명의 다른 양태에서, 변이 폴리뉴클레오티드는 감소적 재분류 과정에 의해 생성될 수 있다. 이 방법은 연속 서열(원래의 암호 서열)을 함유하는 구조물의 생성, 적절한 벡터로 그들의 삽입, 및 적절한 숙주 세포로 그들의 도입에 관련된다. 개개의 분자 정체의 재분류는 상동성 영역을 보유한 구조물내의 연속 서열들 사이 또는 유사 반복 단위 사이의 조합적 과정에 의해 일어난다. 재분류 과정은 반복되는 서열의 복잡성과 정도를 재조합하고/하거나 감소시켜, 신규의 분자종의 생산이 이루어진다. 재분류의 속도를 증진시키기 위해 다양한 처리가 가해질 수 있다. 이들은 자외선, 또는 DNA 손상 화학물질로의 처리, 및/또는 증가된 "유전적 불안정성"을 나타내는 숙주 세포주의 이용을 포함한다. 따라서, 재분류 과정은 그들 자신의 진화를 지시하는 상동성 재조합 또는 유사-반복 서열의 천연 특성에 관계된다.
반복되는 또는 "유사-반복되는" 서열은 유전적 불안정성에서 역할을 한다. 본 발명에서, "유사-반복"은 그들의 원래 단위 구조에 제한되지 않는 반복이다. 유사-반복 단위는 구조물내의 서열 배열;유사 서열의 연속 단위로 나타내질 수 있다. 일단 결찰되면, 연속 서열간의 연결은 필수적으로 비가시적이며 생성되는 구조물의 유사-반복 특성은 분자 수준에서 연속적이다. 생성되는 구조물의 복잡성을 감소시키기 위해 세포가 수행하는 결실 과정은 유사 반복 서열간에 작동한다. 유사 반복 단위는 미끄러짐(slippage)이 일어날 수 있는 실질적으로 무한한 주쇄 레파토리를 제공한다. 유사 반복을 함유한 구조물은 결실(및 가능한 삽입)이 실질적으로 유사 반복 단위내의 어디서든 일어날 수 있는 충분한 분자적 탄성을 효과적으로 제공한다.
유사-반복 서열이 모두 같은 배향으로 결찰될 때, 예를 들어 헤드 대 테일로 또는 역으로, 세포는 각 단위를 구별할 수 없다.
결과적으로, 감소성 과정은 서열 전체에서 일어날 수 있다. 대조적으로, 예를 들어 그 단위가 헤드 대 테일보다는 헤드 대 헤드로 나타내질 때, 역위는 이웃한 단위의 종점을 나타내어 결실 형성은 다른 단위의 손실을 선호할 것이다. 따라서, 서열이 같은 배향인 것이 본 발명에 바람직하다. 유사-반복 서열의 임의 배향은 재배열 효율의 손실을 일으킬 것이고, 반면에 서열의 일치 배향은 가장 높은 효율을 제공할 것이다. 하지만, 같은 배향의 연속 서열을 적게 가지면, 효율은 감소하지만 신규한 분자의 효과적인 회수를 위한 충분한 탄성을 제공할 수 있다. 더 높은 효율성을 허용하기 위해 구조물은 같은 배향의 유사-반복 서열로 만들어질 수 있다.
서열은 하기를 포함하여 다양한 임의의 방법을 이용하여 헤드 대 테일 배향으로 조립될 수 있다:
a) 단일쇄가 만들어질 때 배향을 제공할 폴리-A 헤드와 폴리-T 테일을 포함하는 프라이머가 이용될 수 있다. 이것은 프라이머의 처음 몇 염기가 RNA로부터 만들어지도록 하여 쉽게 RNAseH에 의해 제거되도록 함으로써 이루어진다.
b) 독특한 제한 절단 부위를 포함하는 프라이머가 이용될 수 있다. 복수 부위, 독특한 서열의 배터리, 및 반복 합성과 결찰 단계가 요구될 것이다.
c) 프라이머의 내부 몇 염기가 티올화되고 엑소뉴클레아제가 적절히 테일된분자 생성을 위해 이용될 수 있다.
재분류된 서열의 회수는 감소된 RI를 가진 클로닝 벡터를 동정하는 것에 의존한다. 재분류된 암호 서열은 증폭에 의해 회수될 수 있다. 생성물은 재클론되고 발현된다. 감소된 RI를 갖는 클로닝 벡터의 회수는 하기에 의해 이루어질 수 있다. 1)구조물이 복잡성이 감소될 때만 안정하게 유지되는 벡터의 사용, 2)물리적 과정에 의한 짧아진 벡터의 물리적 회수. 이 경우, 클로닝 벡터는 표준 플라스미드 분리 과정을 이용해 회수되고 표준 방법을 이용하여 낮은 분자량 컷오프(cut off)를 가진 아가로즈젤, 또는 칼럼에서 크기 분획된다. 3)삽입물 크기가 감소할 때 선택될 수 있는 방해된 유전자를 함유한 벡터의 회수. 4)발현 벡터와 적절한 선별로 직접 선별하는 기술 이용.
관련 유기체로부터의 암호 서열(예, 유전자)은 고도의 상동성을 증명하고 꽤 다양한 단백질 산물을 암호할 수 있다. 이러한 유형의 서열은 본 발명에서 유사-반복물로 특히 유용하다. 하지만, 하기에 예시되는 실시예는 거의 동일한 원래의 암호 서열(유사-반복물)의 재분류를 보여주며, 이 과정은 그러한 거의 동일한 반복에 한정되지 않는다.
하기 실시예는 본 발명의 방법을 보여준다. 세 개의 독특한 종으로부터 유래된 암호 핵산 서열(유사-반복)이 개시된다. 각 서열은 다른 특성들을 갖는 단백질을 암호한다. 서열 각각은 서열의 독특한 위치에서 하나 또는 몇개의 염기쌍에 의해 다르며 이는 "A", "B", 및 "C"로 표시된다. 유사 반복 서열은 별도로 또는 총체적으로 증폭되고 임의 조립체로 결찰되어 모든 가능한 순열과 조합을 결찰된 분자집단에서 구할 수 있다. 유사 반복 단위의 수는 조립 조건에 의해 조절할 수 있다. 구조물내의 유사 반복 단위의 평균수는 반복 지수(RI)로 정의된다.
일단 형성되면, 구조물은 공지된 프로토콜에 따라 아가로즈 젤에서 크기 분획될 수도 그렇지 않을 수도 있으며, 클로닝 벡터에 삽입되고, 적절한 숙주 세포내로 형질감염될 수도 있다. 이어서 세포는 증식되고 "감소성 재분류"가 이루어진다. 감소성 재분류 과정의 속도는 필요하다면 DNA 손상의 도입에 의해 자극될 수도 있다. RI의 감소가 "분자내" 기작에 의해 반복 서열간의 결실 형성에 의해 매개되는지, 또는 "분자간" 기작에 의해 재조합과 유사한 일에 의해 매개되는지 여부는 중요하지 않다. 최종 결과는 모든 가능한 조합으로의 분자의 재분류이다.
선택적으로, 이 방법은 결합하거나 또는 상호작용하거나, 또는 특정 반응을 촉매(예, 할로알칸의 가수분해의 촉매)하는 능력을 갖는 개개의 셔플된 라이브러리 멤버를 동정하기 위해 셔플된 풀의 라이브러리 멤버를 검색하는 부가의 단계를 포함한다.
그러한 라이브러리로부터 확인되는 폴리펩티드는 치료, 진단, 연구 및 관련 목적(예, 촉매, 수용액의 삼투압 증가를 위한 용질 등)을 위해 이용되고/거나 셔플링 및/또는 선택의 하나 이상의 부가 사이클에 노출될 수 있다.
다른 양태에서, 재조합 또는 재분류에 앞서 또는 그동안, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 폴리뉴클레오티드는 원래의 폴리뉴클레오티드내로 돌연변이 도입을 증진시키는 제제 또는 과정에 노출될 수 있다. 그러한 돌연변이의 도입은 생성되는 하이브리드 폴리뉴클레오티드와 그로부터암호되는 폴리펩티드의 다양성을 증가시킬 것이다. 돌연변이를 증진하는 제제 또는 과정은 (+)-CC-1065, 또는 (+)-CC-1065-(N3-아데닌)(Sun and Hurley, 1992)와 같은 합성 유사체; DNA 합성을 저해할 수 있는 N-아세틸화 또는 탈아세틸화된 4'-플루오로-4-아미노비페닐 부가물(예, van de Poll et al.,1992); 또는 DNA 합성을 저해할 수 있는 N-아세틸화 또는 탈아세틸화된 4-아미노비페닐 부가물(예, van de Poll et al.,1992, pp.751-758);3가 크로뮴, 3가 크로뮴염, DNA 복제를 저해할 수 있는 폴리시클릭 방향족 탄화수소("PAH") DNA 부가물(예, 7-브로모메틸-벤즈[a]안트라센("BMA"),트리스(2,3-디브로모프로필)포스페이트("Tris-BP"), 1,2-디브로모-3-클로로프로판("DBCP"), 2-브로모아크로레인(2BA), 벤조[a]피렌-7,8-디하이드로디올-9-10-에폭시드("BPDE"), 플래티늄(II) 할로겐염, N-히드록시-2-아미노-3-메틸이미다조[4,5-f]-퀴놀린("N-히드록시-IQ"), 및 N-히드록시-2-아미노-1-메틸-6-페닐이미다조[4,5-f]-피리딘("N-히드록시-PhIP")를 포함할 수 있으며 이에 제한되지 않는다. PCR 증폭을 늦추거나 중단시키기 위해 특히 바람직한 수단은 자외선(+)-CC-1065, 또는 (+)-CC-1065-(N3-아데닌)으로 구성된다. 구체적으로 포함되는 수단은 DNA 부가물 또는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 풀로부터의 DNA 부가물을 포함하는 폴리뉴클레오티드이며, 부가물은 추가의 공정에 앞서 폴리뉴클레오티드를 포함하는 용액을 가열하는 것을 포함하는 과정에 의해 분리 또는 제거될 수 있다.
다른 양태에서 본 발명은 하이브리드 또는 재분류된 폴리뉴클레오티드 생성을 제공하는 본 발명에 따른 조건하에서 야생형 단백질을 암호하는 이중쇄 주쇄 폴리뉴클레오티드를 포함하는 시료를 처리하여 생물 활성을 갖는 재조합 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 폴리뉴클레오티드에 점 돌연변이를 도입하여 총 범위의 단일 아미노산 치환이 각 아미노산 위치에서 나타내지는(유전자 부위 포화 돌연변이(GSSM)) 후손 폴리펩티드 세트를 생성시키기 위해 독점적인(proprietary) 코돈 프라이머(축퇴 N,N,N 서열을 함유)를 이용하는 것을 제공한다. 이용되는 올리고는 첫 번째 상동성 서열, 축퇴 N,N,N 서열, 및 바람직하게는 그러나 필수적은 아닌 두 번째 상동성 서열로 연속적으로 구성된다. 그러한 올리고의 사용으로부터 하류 후손 번역 산물은 폴리펩티드를 따라 각 아미노산 부위에서 모든 가능한 아미노산 변화를 포함하며, 이는 N,N,N 서열의 축퇴성이 모든 20 아미노산을 위한 코돈을 포함하기 때문이다.
한 가지 양태에서, 하나의 그러한 축퇴성 올리고(하나의 축퇴 N,N,G/T 카세트로 구성)는 모 폴리뉴클레오티드 주쇄내의 각 원래 코돈을 총 범위의 코돈 치환에 노출시키는데 이용된다. 다른 양태에서는, 모 폴리뉴클레오티드 주쇄의 적어도 두 개의 원래 코돈을 총 범위의 코돈 치환에 노출시키기 위해 적어도 두 개의 축퇴 N,N,G/T 카세트가 동일한 올리고에서 또는 다른 올리고로 이용된다. 따라서, 하나 이상의 N,N,G/T 서열이 하나 이상의 부위에서 아미노산 돌연변이를 도입하기 위해 하나의 올리고에 함유될 수 있다. 이러한 다수의 N,N,G/T 서열은 직접 연속성이거나, 또는 하나 이상의 부가의 뉴클레오티드 서열에 의해 분리될 수도 있다. 다른 양태에서, 부가 및 결실을 도입하기 위해 작용 가능한 올리고는 단독으로 또는N,N,G/T 서열을 함유한 코돈과 함께 사용되어 아미노산 부가, 결실 및/또는 치환의 조합 또는 순열을 도입할 수 있다.
구체예에 있어서, 인접 N,N,G/T 트리플렛, 즉 축퇴 (N,N,G/T)n서열을 함유하는 올리고를 사용하여 2 이상의 인접 아미노산 위치에서 동시에 돌연변이를 유발시킬 수 있다.
다른 실시양태에 있어서, 본 발명은 N,N,G/T 서열 이하의 축퇴를 가지는 축퇴 카세트(cassettes)의 용도를 제공한다. 예를 들어, 하나의 N만으로 이루어진 축퇴 트리플렛 서열을 사용하는 것은(예: 올리고에 있어서) 몇몇 경우에 바람직한데, 여기서 상기 N은 트리플렛의 제1, 제2 또는 제3 위치에 있을 수 있다. 임의의 다른 염기(그것의 임의의 조합 및 순열을 포함)는 트리플렛 중 남은 두 위치에 사용할 수 있다. 대안으로, 축퇴 N,N,N 트리플렛 서열 또는 N,N,G/C 트리플렛 서열을 사용하는 것은(예: 올리고에 있어서) 몇몇 경우에 바람직할 수 있다.
그러나, 본 발명에 기재된 바와 같이 축퇴 트리플렛(예: N,N,G/T 또는 N,N,G/C 트리플렛 서열)을 사용하는 것은 몇 가지 이유 잇점이 있다고 평가된다. 일 실시양태에 있어서, 본 발명은 전범위의 가능한 아미노산(총 20개의 아미노산의 경우)의 폴리펩티드내 각각의, 그리고 모든 아미노산 위치로의 치환을 체계적으로, 그리고 매우 용이하게 야기시키는 수단을 제공한다. 따라서, 100개의 아미노산 폴리펩티드의 경우, 본 발명은 2000개의 별개 종(즉, 100개의 아미노산 위치의 배열 위치 당 20개의 가능한 아미노산)을 체계적으로, 그리고 매우 용이하게 생성시키는방법을 제공한다. 축퇴 N,N,G/T 또는 N,N,G/C 트리플렛 서열을 함유하는 올리고를 사용하면, 20개의 가능한 아미산을 암호화하는 32개의 개별 서열을 제공한다고 평가된다. 따라서, 모(母) 폴리뉴클레오티드 서열이 하나의 상기 올리고를 사용하는 포화 돌연변이에 노출되는 반응 용기 내에서는, 20개의 개별 폴리펩티드를 암호화하는 32개의 개별 자손 폴리뉴클레오티드가 생성된다. 이와 대조적으로, 부위 특이적(site-directed) 돌연변이 유발에서 비축퇴 올리고의 사용은 반응 용기 당 단 하나의 자손 폴리펩티드를 산출시킨다.
또한, 본 발명은 전술한 축퇴 프라이머와 함께 임의로 사용될 수 있는 비축퇴 올리고의 용도를 제공한다. 몇몇 경우에 있어서, 비축퇴 올리고를 사용하여 작동 폴리뉴클레오티드 내의 특이적 점 돌연변이를 유발시키는 것이 잇점이 있다고 평가된다. 이는 특이적 잠재성 점 돌연변이, 상응하는 아미노산 변화를 야기시키는 점 돌연변이, 및 정지 코돈의 생성 및 이에 상응하는 폴리펩티드 단편의 발현을 야기시키는 점 돌연변이를 유발시키는 수단을 제공한다.
따라서, 일 실시태양에 있어서, 각각의 포화 돌연변이 반응 용기는, 모든 20개의 아미노산이 모 폴리뉴클레오티드 내에서 돌연변이가 유발된 코돈 위치에 상응하는 하나의 특정 아미노산 위치에 나타나도록 20개 이상의 자손 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유한다. 각각의 포화 돌연변이 반응 용기로부터 생성된 32배 축퇴 자손 폴리펩티드는 클론 증폭되거나[예: 발현 벡터를 사용하여 적당한 대장균(E. coli) 숙주에 클로닝됨] 발현 스크리닝될 수 있다. 특성에 있어서의 양호한 변화(모 폴리펩티드와 비교할 경우)를 나타내는지를 스크리닝하여 별개의 자손 폴리펩티드를 동정하면, 본 명세서에 포함된 당해 양호한 아미노산 치환을 동정하기 위해 서열 결정될 수 있다.
본 명세서에 기술된 바와 같이 포화 돌연변이를 사용하여 모 폴리펩티드내 각각의, 그리고 모든 아미노산 위치에 돌연변이를 유발시키는 경우, 하나 이상의 아미노산 위치에서 양호한 아미노산 변화가 동정될 수도 있다. 상기 양호한 아미노산 치환의 전부 또는 일부의 조합을 함유하는 하나 이상의 새로운 자손 분자를 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드내 3개의 아미노산 위치 각각에서, 2개의 양호한 특이성 아미노산 변화를 동정하는 경우, 순열은 각각의 위치(본래의 아미노산으로부터의 변화는 없고, 2개의 양호한 변화가 각각 있음) 및 3개의 위치에 3개의 가능성을 포함한다. 따라서, 사전에 검사한 7개[6개의 단일 점 돌연변이(즉, 3개의 위치에서 각각 2개) 및 기타 임의의 위치에서의 무변화]를 비롯하여 총 3 ×3 ×3, 즉 27개의 가능성이 있다.
또 다른 실시양태에 있어서, 스크리닝에 더하여, 셔플링, 키메라화, 재조합 및 기타 돌연변이 유발 방법과 함께 부위-포화 돌연변이를 사용할 수 있다. 본 발명은 반복적 방식으로 포화 돌연변이를 비롯한 임의의 돌연변이 유발 방법의 용도를 제공한다. 일 구체예에 있어서, 임의의 돌연변이 유발 방법의 반복적 사용은 스크리닝과 함께 사용된다.
따라서, 무한정의 구체예에 있어서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는, 포화 돌연변이 및 추가의 돌연변이 유발 방법(예: 하이브리드 폴리뉴클레오티드가 재조합 및 감소적 재분류에 의해 생성되도록 2 이상의 관련 폴리뉴클레오티드를 적당한 숙주 세포에 도입하는 방법)에 의해 유도될 수 있다.
전체 유전자 서열에 따른 돌연변이 유발의 수행 이외에, 돌연변이 유발은 폴리뉴클레오티드내 임의의 수의 염기를 대체하는데 사용할 수 있는데, 여기서 돌연변이화되는 염기의 수는 15 내지 100,000의 모든 정수임이 바람직하다. 따라서, 분자를 따라 모든 위치를 돌연변이화하는 대신에, 모든 수의 염기 또는 불연속 수의 염기(총 15 내지 100,000의 부분 집합이 바람직함)에 돌연변이를 유발시킬 수 있다. 별도의 뉴클레오티드가 폴리뉴클레오티드 서열을 따라 각각의 위치 또는 위치 군에 돌연변이를 유발시키는데 사용되는 것이 바람직하다. 돌연변이화되는 3개의 위치의 군은 코돈일 수 있다. 돌연변이는, 돌연변이 카세트라고도 일컫는 이종 카세트를 함유하는 돌연변이 프라이머를 사용하여 도입시킬 수 있다. 바람직한 카세트는 1개 내지 500개의 염기를 가질 수 있다. 상기 이종 카세트내 각 뉴클레오티드 위치는 N, A, C, G, T, A/C, A/G, A/T, C/G, C/T, G/T, C/G/T, A/G/T, A/C/T, A/C/G 또는 E이고, 여기서 E는 A, C, G 또는 T가 아닌 임의의 염기이다[E는 디자이너 올리고(designer oligo)라 칭할 수 있음].
일반적인 의미로, 포화 돌연변이 유발은 돌연변이화되는 한정된 폴리뉴클레오티드 서열내(여기서, 돌연변이화되는 서열은 그 길이가 약 15개 내지 100,000개의 염기임이 바람직함) 일련의 돌연변이 카세트 세트(여기서, 각 카세트는 그 길이가 약 1개 내지 500개의 염기임이 바람직함)를 돌연변이화하는 것으로 구성된다. 따라서, 돌연변이 군(약 1개 내지 100개 범위의 돌연변이)은 돌연변이화되는 각 카세트에 도입시킬 수 있다. 1회의 포화 돌연변이 유발 기간 중, 하나의 카세트에도입되는 돌연변이 군은 제2 카세트에 도입되는 제2 돌연변이 군과 상이하거나 동일할 수 있다. 상기 분류는 결실, 부가, 특정 코돈의 분류, 및 특정 뉴클레오티드 카세트의 분류에 의해 설명된다.
돌연변이화되는 한정된 서열은 전체 유전자, 경로, cDNA, 전체 오픈 리딩 프레임(ORF), 및 전체 프로모터, 인핸서, 억제 유전자/전이 활성제 (transactivator) , 복제 인핸서, 인트론, 작동 유전자, 또는 임의의 폴리뉴클레오티드 작용기를 포함한다. 일반적으로, 이러한 목적을 위한 "한정된 서열"은 15개의 염기-폴리뉴클레오티드 서열, 및 15개의 염기 내지 15,000개의 염기 길이의 폴리뉴클레오티드 서열(본 발명은 구체적으로 15 내지 15,000의 모든 정수를 지정함)을 가지는 임의의 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 코돈 군의 선택에 있어서 고려할 사항은 축퇴 돌연변이 카세트에 의해 암호화되는 아미노산 유형을 포함한다.
돌연변이 카세트에 도입될 수 있는 돌연변이 군의 특히 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명은 각 위치에서 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 및 20개의 아미노산을 암호화하는 축퇴 코돈 치환(축퇴 올리고를 사용함) 및 이로써 암호화된 폴리펩티드 라이브러리를 구체적으로 제공한다.
또한, 본 발명은 폴리뉴클레오티드를 포함하는데, 여기서 성숙 효소에 대한 암호 서열은 숙주 세포로부터의 효소의 발현 및 분비를 돕는 폴리뉴클레오티드 서열, 예컨대 세포로부터의 효소의 수송을 조절하도록 작용하는 리더 서열에 동일한 해독 프레임으로 융합될 수 있다. 리더 서열을 가지는 효소는 예비 단백질의 예이고, 숙주 세포에 의해 리더 서열이 절단되어 효소의 성숙 형태를 형성시킬 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드는 성숙 단백질과 추가의 5' 아미노산 잔기에 의해 예시되는 전구(前驅) 단백질(proprotein)을 암호화할 수 있다. 전구 서열을 가지는 다른 성숙 단백질은 단백질의 불활성 형태인 전구 단백질에 의해 예시된다. 일단 전구 서열이 절단되면, 활성 성숙 단백질이 잔존한다.
따라서, 예컨대 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 성숙 효소, 또는 전구 서열을 가지는 효소, 또는 전구 서열 및 예비 서열(예: 리더 서열)을 모두 가지는 효소를 암호화할 수 있다.
6.1.4 - 분리 방법:본 발명의 피타제(phytase) 효소에 대한 암호 서열은, 예컨대 E.coli B 게놈 DNA를 제조하고, 게놈 DNA로부터 (예컨대, PCR 증폭을 통하여) 피타제 활성을 암호화하는 DNA를 회수함으로써 동정하였다. 상기 회수 방법은 당업계에 주지되어 있다. 예를 들어, 한 방법은 증폭 프라이머를 설계하여 암호 서열을 회수하는 단계, 게놈 DNA로부터 유전자를 증폭시키는 단계, DNA를 벡터로 서브클로닝하는 단계, 그 결과 생성되는 구조물을 숙주 균주에 형질전환시키는 단계, 및 검측을 위해 피타제 효소를 발현시키는 단계를 포함한다. 상기 방법은 당업계에 주지되어 있으며, 본 명세서에 전체 내용이 참고로 인용된 문헌[Sambrook 등, 1989]은 그 방법을 제공한다.
바람직한 실시태양에 있어서, 본 발명의 효소는 하기 기법에 의해 E.coli B 게놈 DNA로부터 분리하였다:
시판용 E.coli B 게놈 DNA(시그마: 카탈로그 # D-2001, 미국 뉴저지주 세인트 루이스)를 구입하였다. 게놈 DNA로부터 유전자를 직접 증폭시키는데 하기 프라이머를 사용하였다:
5' 프라이머 gtttctgaattcaaggaggaatttaaATGAAAGCGATCTTAATCCCATT(SEQ ID NO: 3); 및
3' 프라이머 gtttctggatccTTACAAACTGCACGCCGGTAT(SEQ ID: 4).
Pfu 중합효소는 제조업체의 프로토콜(미국 캘리포니아주 라 졸라 소재 Stratagene Cloning systems, Inc)에 따라 사용하였다.
PCR 생성물 및 pQE60 벡터(Qiagen)은 모두 제조업체의 프로토콜에 따라 EcoRI 및 BglII 제한 엔도뉴클레아제(New England Biolabs)로 분해시켰다. 결찰 및 M15 pREP4 숙주 세포(Qiagen)에서의 형질전환 및 발현은 c-term 6X-His 태그된 단백질을 제조한다.
6.1.5 - 활성 측정:이어서, 예컨대 효소 피타제 활성을 검출하는 분석에서 본 발명의 효소에 특징적인 생물학적 활성의 보유 여부를 분리된 핵산 서열 및 기타 효소에서 측정하였다(Food Chemicals Codex, 제4판). 상기 효소는 절단된 형태의 피타제 및 변이체(예: 결실 및 삽입 변이체)를 포함한다.
상기 분석의 시험관내 실시예는 하기 피타제 활성 검출 분석이다: 1 mM CaCl2로 보충된, pH 7.5의 100 mM 트리스 HCl 완충액 중의 2 mM 나트륨 피타제 600 ㎕와 함께 150 ㎕의 효소 제조물을 37 ℃에서 30분 동안 항온 배양함으로써, 피테이트 활성을 측정할 수 있다. 항온 배양 후, 5% 트리클로로아세트산 750 ㎕를 첨가함으로써 반응을 정지시켰다. 1500 ㎕의 발색제(color reagent)(5.5% 황산 중의 1.5% 암모늄 몰리브데이트 4 분량, 및 2.7% 황산제1철 1 분량; Shimizu, 1992)를 첨가함으로써, 700 nm 에서 분광광도법으로 인산염 표준에 대해 방출된 인산염을 측정하였다. 효소 활성 1 단위는 분석 조건 하에서 분 당 1 μmol Pi를 유리시키는데 필요한 효소의 양으로 정의한다. 비활성(specific activity)은 단백질 ㎎ 당 효소 활성 단위로 표현할 수 있다.
본 발명의 효소는 피테이트의 이노시톨 및 유리 인산염으로의 가수분해에 대하여 효소적 활성을 가진다.
6.2 - 신규 피타제의 제조
6.2.1 - 제조 방법 - 총설:본 발명의 효소 및 폴리뉴클레오티드는, 분리된 형태로 제공하는 것이 바람직하고, 균질성있게 정제하는 것이 바람직하다. 본 발명의 피타제 폴리펩티드는 임의의 몇몇 표준 방법을 사용하여 수득할 수 있다. 예를 들어, 피타제 폴리펩티드는 표준 재조합 발현 시스템(하기 참조)으로 제조하거나, 화학적으로 합성하거나(이 방법은 소량의 피타제 펩티드 단편에 한정될 수 있음) 또는 자연적으로 발현된 생물체로부터 정제할 수 있다. 유용한 재조합 발현 방법은 포유동물 숙주, 미생물 숙주 및 식물 숙주를 포함한다.
본 발명의 피타제 분자의 재조합 발현은, 예컨대 다른 효소와 같은 하나 이상의 추가 분자와 함께 달성할 수 있다. 이 방법은 본 피타제 분자뿐만 아니라 하나 이상의 추가 분자를 함유하는 식물 또는 식물의 일부와 같은 조합형 생성물을 제조하는데 유용하다 - 바람직하게는, 상기 피타제 분자 및 상기 추가 분자가 조합처리에 유용하다. 그 결과 생성된, 재조합 방식으로 발현된 분자는 균질화되고/균질화되거나 정제된 형태로, 또는 대안으로서 상대적으로 미정제된 형태(예: 피테이트 분해를 촉매하기 위해 다른 식료품과 혼합할 때 유용한 소모성 식물 부분)로 사용할 수 있다.
요컨대, 무제한의 실시태양에 있어서, 본 발명은 숙주 내에서 발현되는 재조합 효소를 제공한다. 다른 무제한의 실시태양에 있어서, 본 발명은 실질적으로 순수한 피타제 효소를 제공한다. 따라서, 본 발명의 효소는 재조합 효소, 천연 효소 또는 합성 효소일 수 있고, 바람직하게는 재조합 효소일 수 있다.
6.2.2 - 재조합 발현:또한, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 ㅠㅗ함하는 벡터, 본 발명의 벡터로써 유전적으로 조작된 숙주 세포, 및 재조합 기술에 의한 본 발명의 효소의 제조에 관한 것이다.
숙주 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터로 유전적으로 조작된다(예: 형질도입하거나, 형질전환하거나 또는 형질감염한다). 상기 벡터는 예컨대 클로닝 벡터 또는 발현 벡터일 수 있다. 벡터는 예컨대 플라스미드, 바이러스 입자, 파지, 프리온 등의 형태일 수 있다. 조작된 숙주 세포는 프로모터를 활성화시키고/활성화시키거나, 형질전환체를 선택하거나 또는 본 발명의 유전자를 증폭시키는데 적당하게 개질된 종래의 영양 배지에서 배양할 수 있다. 배양 조건(예: 온도, pH 등)은 발현용으로 선택된 숙주 세포에 따라 사용되는 조건이고, 당업자에 자명할 것이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 재조합 기술에 의해 효소를 제조하는데 사용할 수 있다. 따라서, 예컨대, 폴리뉴클레오티드는 효소를 발현시키는 각종 발현 벡터 중 어느 하나에 포함될 수 있다. 상기 벡터는 염색체, 비염색체 및 합성 DNA 서열(예: SV 40 유도체); 박테리아 플라스미드; 파지 DNA; 바큘로바이러스; 효모 플라스미드; 플라스미드 및 파지 DNA, 바이러스 DNA(예: 백시니아, 아데노바이러스, 계두바이러스 및 가성광견병 바이러스)의 조합으로부터 유도된 벡터를 포함한다. 그러나, 숙주 내에서 복제가능하고, 생존가능한 한 임의의 다른 벡터를 사용할 수 있다.
다양한 방법에 의해 벡터에 적당한 DNA 서열을 삽입할 수 있다. 일반적으로, 공지의 방법에 의해 적당한 제한 엔도뉴클레아제 부위(들)에 DNA 서열을 삽입할 수 있다. 이러한 의미에서, 제한 분해와 무관한 방법뿐만 아니라 제한 분해의 사용에 의해 생성될 수 있는 블런트-말단 분자의 사용을 포함한다. 대안으로, 삽입체는 소위 "리가제와 무관한" 방법에 의해 벡터에 혼입시킬 수 있다. 구체적인 실시양태에 있어서, "리가제와 무관한" 방법은 예컨대 TOPO-TA Cloning(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재 Invitrogen Corporation)이라 칭하는 시판 키트에 따라 실온에서의 토포이소머라제 매개 결찰의 사용에 의해 구현된다. 또한, 토포이소머라제의 이성질체 및 보다 밀접하지 않은 재조합 효소(예: 리콤비나아제)를 비롯한 대안의 효소는 이러한 유형의 "리가제와 무관한" 혼입을 매개하는데 유용하다. 다른 구체적인 실시양태에 있어서, "리가제와 무관한" 방법은 숙주 수복 메카니즘의 사용에 의해 구현된다. 상기 방법 및 기타 방법은 당업자의 범위내에 있다고 간주된다.
발현 벡터 내의 DNA 서열은 적당한 발현 조절 서열(들)(프로모터)에 작동적으로 연결되어 mRNA 합성을 지시한다. 상기 프로모터의 대표적인 예로서, 다음과 같은 것을 언급할 수 있다: LTR 또는 SV40 프로모터, E.coli. lac 또는 trp, 파지 람다 PL프로모터, 및 원핵생물이나 진핵생물의 세포 또는 바이러스 내의 유전자 발현을 조절하는 것으로 공지된 다른 프로모터. 또한 발현 벡터는 번역 개시 및 전사 종결인자에 대한 리보솜 결합 부위를 함유한다. 또한, 벡터는 발현을 증폭시키는 적당한 서열을 포함할 수 있다.
또한, 발현 벡터는 하나 이상의 선택가능한 표지 유전자를 함유하여, 형질전환된 숙주 세포의 선택을 위한 표현형 특성(예: 진핵생물 세포 배양의 경우, 디히드로폴레이트 환원효소 또는 네오마이신 내성, 또는 E.coli 내의 테트라사이클린 또는 암피실린 내성)을 제공한다.
적당한 프로모터 또는 조절 서열뿐만 아니라 전술한 바와 같은 적당한 DNA 서열을 함유하는 벡터는, 적당한 숙주를 형질전환시켜 단백질을 발현하도록 하는데 이용할 수 있다.
적당한 숙주의 대표적인 예로서 다음과 같은 것을 언급할 수 있다: 박테리아 세포(예: 대장균, 스트렙토마이세스, 바실루스 서브틸리스); 진균 세포(예: 효모); 곤충 세포(예: 초파리 S2 및 스포도프테라 Sf9); 동물 세포(예: CHO, COS, 또는 Bowes 흑색종); 아데노바이러스; 식물 세포 등. 적당한 숙주의 선택은 본 명세서에서의 기재 사항으로부터 당업자의 범위내에 있다고 간주된다.
보다 구체적으로는, 본 발명은 이상에서 광범위하게 기술한 바와 같은 하나이상의 서열을 포함하는 재조합 구조물도 포함한다. 상기 구조물은 본 발명의 서열이 정방향 또는 역방향에서 삽입된 벡터(예: 플라스미드 또는 바이러스 벡터)를 포함한다. 상기 실시태양의 바람직한 실시양태에 있어서, 상기 구조물은 조절 서열(예컨대 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함함)을 추가로 포함한다. 또한, 하나 이상의 추가 분자(예: 다른 피타제 또는 프로테아제 효소)의 발현을 야기하는 하나 이상의 추가 삽입물을 혼입시키는데, 상기 하나 이상의 추가 분자는 조합 처리에 있어서 본 피타제와 함께 작용할 수 있는 것임이 바람직하다.
다수의 적당한 벡터 및 프로모터는 당업자에게 공지되어 있으며, 시판된다. "플라스미드"는 선행하는 소문자 p, 및/또는 이에 수반되는 대문자 및/또는 숫자에 의해 나타낸다. 본 명세서의 출발 플라스미드는 무제한으로 공공연하게 시판되거나 또는 공지된 방법에 따라 시판 플라스미드로부터 구성될 수 있다. 또한, 당업자에게 공지된 플라스미드와 균등한 플라스미드는 당업자에게 자명할 것이다.
하기 벡터는 예시를 목적으로 제공한다: 박테리아 벡터[pQE70, pQE60, pQE-9(Qiagen), pBluscript II(Stratagene); pTRC99a, pKK223-3, pDR540, pRIT2T (Pharmacia)], 진핵생물 벡터[pXT1, pSG5(Strategene)pSVK3, pBPV, pMSG, pSVLSV40(Pharmacia)]. 그러나, 임의의 다른 플라스미드 또는 기타 벡터는 숙주 내에서 복제가능하고, 생존가능한 한 사용할 수 있다.
CAT(클로로암페니콜 전이효소) 벡터 또는 선택가능한 표지를 가지는 기타 벡터를 사용하여, 임의의 바람직한 유전자로부터 프로모터 영역을 선택할 수 있다. 2가지 적당한 벡터는 pKK232-8 및 pCM7이다. 특히 유명한 박테리아 프로모터는lacI, lacZ, T3, T7, gpt, 람다 PR, PL및 trp를 포함한다. 진핵생물 프로모터는 최초기(immediate early) CMV, HSV 티미딘 키나아제, 초기 및 후기(early and late) SV40, 레트로바이러스로부터의 LTRs, 및 마우스 메탈로티오네인-I을 포함한다. 적당한 벡터 및 프로모터의 선택은 당업자의 수준 범위 내에 있다.
추가의 실시태양에 있어서, 본 발명은 전술한 구조물을 함유하는 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 고등 진핵생물 세포(예: 포유동물 세포) 또는 하등 진핵생물 세포(예: 효모 세포)이거나, 원핵생물 세포(예: 박테리아 세포)일 수 있다. 숙주 세포에의 구조물의 도입은 인산칼슘 형질감염, DAEA-D 덱스트란 매개 형질감염 또는 일렉트로포레이션(electroporation)에 의해 이루어질 수 있다(Davis, 1986).
종래의 방법으로 숙주 세포 내의 구조물을 사용하여, 재조합 서열에 의해 암호화되는 유전자 생성물을 제조할 수 있다. 대안으로, 본 발명의 효소는 종래의 펩티드 합성 장치(synthesizer)에 의해 합성하여 제조할 수 있다.
성숙 단백질은 적당한 프로모터의 조절 하에서 포유동물 세포, 효모, 박테리아 또는 기타 세포 내에 발현시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 DNA 구조물로부터 유래된 RNA를 사용하여 상기 단백질을 제조하는데 무세포 번역 시스템을 이용할 수 있다. 원핵생물 및 진핵생물 숙주와 함께 사용하기 위한 적당한 클로닝 및 발현 벡터가 기술되어 있다(예컨대, Sambrook 등, 1999, 본 명세서에 참고로 인용한 명세서).
벡터에 인핸서 서열을 삽입시킴으로써, 고등 진핵생물에 의한 본 발명의 효소를 암호화하는 DNA의 전사를 증가시킨다. 인핸서는 프로모터에 작용하여 그 전사를 증가시키는, 통상 약 10 bp 내지 300 bp의 DNA cis-작용 요소이다. 그 예로는 복제 오리진 후측 100 bp 내지 270 bp의 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 오리진 후측 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서를 들 수 있다.
일반적으로, 재조합 발현 벡터는 복제 인핸서, 및 숙주 세포의 형질전환을 허용하는 선택가능 표지(예: 대장균의 암피실린 내성 유전자 및 S. 세레비시아 TRP1 유전자), 및 하류 구조 서열의 전사에 관여하도록 고도로 발현된 유전자로부터 유도된 프로모터를 포함한다. 상기 프로모터는 특히 해당(解糖) 효소[예: 3-포스포글리세레이트 키나아제(PGK)], Å-인자, 산 포스파타아제, 또는 열 충격 단백질을 암호화는 오페론으로부터 유래할 수 있다. 이종 구조 서열은 번역 개시 및 종결 서열, 바람직하게는 번역된 효소의 분비에 관여할 수 있는 리더 서열과 적당한 상(相)으로 조립된다. 임의로, 이종 서열은 바람직한 특성(예: 발현된 재조합 생성물의 안정화 또는 단순화 정제)을 부여하는 N-말단 확인 펩티드를 비롯한 융합 효소를 암호화할 수 있다.
박테리아의 사용에 유용한 발현 벡터는, 적당한 번역 개시 및 종결 신호와 함께 소정의 단백질을 암호화하는 구조 DNA 서열을 작용성 프로모터와 작동가능한 해독 상으로 삽입함으로써 구성한다. 벡터는 하나 이상의 표현형 선택 표지 및 복제 오리진을 포함하여, 벡터의 유지를 보장하고, 바람직하다면 숙주 내의 증폭을제공한다. 형질전환용으로 적당한 원핵생물 숙주는 대장균, 바실루스 서브틸리스, 살모넬라 타이피모리움 및 슈도모나스 속, 스트렙토마이세스 속, 및 스타필로코쿠스 속 내의 다양한 종을 포함하지만, 다른 것들도 선택적으로 이용할 수 있다.
대표적이나 이에 한정되지 않는 예로서, 박테리아의 사용에 유용한 발현 벡터는 주지의 클로닝 벡터 pBR322(ATCC 37017)의 유전 요소를 포함하는 시판용 플라스미드로부터 유도된 박테리아의 복제 오리진 및 선택 표지를 포함할 수 있다. 상기 상업용 벡터는, 예컨대 pKK223-3(스웨덴 우프살라 소재 Pharmacia Fine Chemicals) 및 GEM1(미국 위스콘신주 매디슨 소재 Promega Biotec)을 포함한다. 이들 pBR322 "골격" 절편(sections)은 적당한 프로모터 및 발현될 구조 서열과 결합된다.
숙주 균주의 형질전환 및 적당한 세포 밀도까지의 숙주 균주의 성장에 이어서, 적당한 방법(예: 온도 변화 또는 화학적 유발)에 의해 선택된 프로모터를 유발하고, 추가의 기간 동안 세포를 배양한다.
일반적으로, 세포는 원심분리에 의해 수확되고, 물리적 또는 화학적 방법에 의해 분쇄되며, 그 결과로 생성되는 조(粗)추출물은 추가 정제를 위해 보류된다.
단백질 발현에 이용된 미생물 세포는 동결-융해(freeze-thaw), 음파 처리, 기계적 분쇄 또는 세포 용균제의 사용을 비롯한 임의의 편리한 방법에 의해 분쇄시키는데, 상기 방법은 당업자에게 주지되어 있다.
또한, 재조합 단백질을 발현시키는데 각종 포유동물 세포 배양 시스템을 이용할 수 있다. 포유동물 발현 시스템의 예로는 문헌(Gluzman, 1981)에 기술되어 있는 바와 같은 원숭이 신장 섬유아세포의 COS-7계, 및 상용성 벡터를 발현시킬 수 있는 기타 세포계(예: C127, 3T3, CHO, HeLa 및 BHK 세포계)를 들 수 있다. 포유동물 발현 벡터는 복제 오리진, 적당한 프로모터 및 인핸서를 포함하고, 또한 임의의 필수 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 공여 및 수용 부위, 전사 종결 서열 및 5' 인접(flanking) 비전사 서열도 포함한다. SV40 스플라이스 및 폴리아데닐화 부위로부터 유도된 DNA 서열은 필수 비전사 유전 요소를 제공하는데 사용할 수 있다.
황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로오스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 히드록실아파티트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하는 방법에 의해 재조합 세포 배양으로부터 효소를 회수하고 정제할 수 있다. 성숙 단백질의 입체배치(configuration)의 완결시 필요하다면 단백질 재접힘 (refolding) 공정을 사용할 수 있다. 마지막으로, 최종 정제 공정을 위해 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용할 수 있다.
본 발명의 효소는 자연히 정제된 생성물 또는 화학 합성 방법에 의한 생성물일 수 있거나, 원핵생물 또는 진핵생물 숙주(예를 들어, 배양 내의 박테리아, 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유동물 세포에 의한)로부터 재조합 기술에 의해 제조될 수 있다. 재조합 제조 방법에 이용된 숙주에 따라, 본 발명의 효소는 글리코실화되거나 비글리코실화될 수 있다. 또한, 본 발명의 효소는 최초 메티오닌 아미노산 잔기를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
바람직한 실시태양에 있어서, 본 발명의 효소는 열에 안정하고, 열에 내성이 있으며, 피테이트의 효소적 가수분해를 촉매하는 피타제 효소, 즉 최대 약 50 ℃ 또는 50 ℃를 약간 상회하는 온도에 단기간 또는 장기간(예: 수 분 또는 수 시간) 노출 후, 활성을 복원하거나 되찾을 수 있는 효소이다.
본 발명은 본 명세서에 포함된 실시예에서 추가로 기술되어 있다: 그러나, 본 발명은 그와 같은 실시예에 한정되지 않는다는 것을 이해할 수 있다. 특별한 언급이 없는 한, 모든 부(parts) 및 양은 중량에 의한다.
본 발명의 일 실시양태에 있어서, 본 발명은 도1a와 1b에 도시된 바와 같은 피타제 효소의 제조 방법을 제공한다. 상기 방법은 핵산의 발현을 가능하게 하는 조건 하에서 효소(예: SEQ ID NO: 1)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 숙주 세포를 성장시키고, 임의로 핵산에 의해 암호화된 효소를 분리시키는 것을 포함한다. 숙주 세포를 배양하는 방법은 실시예에 기재되어 있으며, 당업자에 공지되어 있다.
6.2.3 - 트랜스제닉 식물 및 식물 기관의 용도:특정 실시태양에 있어서, 본 발명은 트랜스제닉 식물 또는 식물 기관에서의 피타제의 발현 및 그 제조 방법을 제공한다. 피타제의 발현을 조종할 수 있는 조절 서열의 영향 하에 피타제를 암호화하는 유전자로 식물을 형질전환시키기 위한 DNA 발현 구조물을 제공한다. 상기 조절 서열은 구성적으로, 또는 단계적으로, 및/또는 조직 특이적 방식으로 식물 내의 전사를 조절할 수 있는 서열을 포함한다.
발현 방식은 식물 또는 식물의 부분의 사용에 일부 의존한다. 본 발명에 의해 제공되는 트랜스제닉 식물 및 식물 기관은 직접적으로(예: 동물 사료로) 각종 공업용 방법에 적용될 수 있으며, 또는 대안으로 발현된 피타제는 추출되고, 경우에 따라 적용되기 이전에 정제될 수 있다.
대안으로, 재조합 숙주 식물 또는 식물의 부분은 직접 사용가능하다. 구체적인 실시양태에 있어서, 본 발명은 증강된 양의 피타제를 함유하는 종자를 사용하여 피테이트 가수분해 반응을 촉매하는 방법을 제공한다. 이 방법은 형질전환한 비야생형 종자[바람직하게는 분쇄된(ground) 형태 또는 저작된 형태]를 피테이트 함유 기질과 접촉시키는 단계, 및 종자 내의 효소가 반응 속도를 증가시키도록 하는 단계를 포함한다. 피테이트 함유 기질에 종자를 직접 첨가함으로써, 본 발명은 효소를 추출 및 정제하는, 고가이고 문제점이 있는 방법에 대한 해결책을 제시한다. 구체예(이에 한정되는 것은 결코 아님)에 있어서, 본 발명은 처리 방법도 제공하는데, 이로써 효소의 충분한 공급이 부족한 생물체에 증강된 양의 효소를 함유하는 종자 형태로 효소가 투여된다. 바람직한 실시태양에 있어서, 생물체에의 효소의 투여 시간은 피테이트 함유 식료품의 소비와 조절된다.
식물 내의 피타제의 발현은 각종 방법에 의해 달성할 수 있다. 구체적으로는, 예컨대 상기 기법은 쌍떡잎성 종[예: 담배, 감자, 토마토, 피튜니아, 브라시카]를 비롯한 다수의 식물 종을 형질전환시키는데 유용하다. 또한, 예컨대 식물 내에 외부 유전자를 발현시키는 전략도 유용하다. 또한, 식물 및 식물 세포 내에 기능적으로 발현될 수 있는 키메라 유전자의 구성에 유용한, 식물 유전자로부터의 조절 서열이 동정되었다(예: Klee 등 1987; Clark 등, 1990; Smith 등, 1990).
식물 내로의 유전자 구조물의 도입은 아그로박테리움 투메파시엔스 또는 아그로박테리움 리조겐스로 형질전환시키는 기법을 비롯한 몇몇 기법을 사용하여 달성할 수 있다. 따라서, 형질전환가능한 식물 조직의 무제한의 예는 원형질체, 소포자 또는 화분, 및 외식편(예: 잎, 줄기, 뿌리, 하배축 및 배축)을 포함한다. 또한, 미세주사, 일렉트로포레이션, 입자충격 및 직접 DNA 획득에 의해 원형질체, 및 식물 세포 또는 조직에 직접 DNA를 도입할 수 있다.
각종 발현 시스템에 의해 식물 내에서 단백질을 제조할 수 있다. 예를 들어, 구성 프로모터[예: 꽃양배추 모자이크 바이러스(Guilley 등, 1982)의 35S 프로모터]의 사용은 트랜스제닉 식물의 거의 모든 기관 내에서 발현된 단백질의 축적에 유용하다. 대안으로, 고도의 조직 특이성 및/또는 단계 특이성인 프로모터의 사용은 소정의 조직 및 또는 소정의 발육 단계에 치우친 발현을 위해 본 발명에 유용하다(Higgins, 1984; Shortwell 1989). 본 발명의 피타제 분자의 식물 내의 발현에 관련된 보다 자세한 사항은 예컨대 USPN 5,770,413(Van Ooijen 등) 및 USPN 5,593,963(Van Ooijen 등)에 기재되어 있지만, 이들 참고 문헌은 본 발명의 분자에 대한 것이 아니고 진균 피타제의 사용에 대한 것이다.
요컨대, 트랜스제닉 식물 또는 식물의 부분 내의 피타제의 재조합 발현을 달성하는데 각종 방법을 사용할 수 있다는 것은 본 발명과 관련이 있다. 상기 트랜스제닉 식물 및 식물의 부분은 피테이트 함유 공급원에 직접 첨가될 수 있는 재조합 발현 피타제 공급원으로서 유용하다. 대안으로, 재조합 식물-발현 피타제는 식물 공급원으로부터 추출할 수 있고, 경우에 따라 피타제 기질에 접촉시키기 전에 정제할 수 있다.
6.2.4 - 유용한 식물의 예 :본 발명의 범위 내에서, 선택되는 식물은 식용 꽃[예컨대, 꽃양배추(브라시카 올레라세아), 아티초크(사이나라 스콜리무스)]; 열매[예컨대, 사과(말루스, 예: 도메스티쿠스), 바나나(무사, 예: 아쿠미나타), 장과(예컨대, 건포도, 리베스, 예: 루브룸), 체리(예컨대, 스위트 체리, 프루누스, 예: 아비움), 오이(쿠쿠미스, 예: 사티부스), 포도(비티스, 예: 비니페라), 레몬(시트루스 리몬), 멜론(쿠쿠미스 멜로), 견과(예컨대, 호두, 주글란스, 예:레기아; 땅콩, 아라키스 히포게아), 오렌지(시트루스, 예: 막시마), 복숭아(프루누스, 예: 페르시카), 배(파이라, 예: 코뮤니스), 플럼(프루누스, 예: 도메스티카), 스트로베리(프라가리아, 예: 모스차타), 토마토(라이코페르시콘, 예: 에스쿨렌툼)]; 잎[예컨대, 자주개자리(메디카고, 예: 사티바), 양배추(예: 브라시카 올레아세아), 엔디브(시콜레움, 예:엔디비아), 부추(알리움, 예: 포룸), 상추(락투카, 예: 사티바), 시금치(스피나시아, 예: 올레라세아), 담배(니코티아나, 예: 타바쿰)]; 뿌리[예컨대, 칡(마란타, 예: 아룬디나세아), 비트(베타, 예: 불가리스), 당근(다우쿠스, 예: 카로타), 카사버(마니호트, 예: 에스쿨렌타), 순무(브라시카, 예: 라파), 무(라파누스, 예: 사티부스), 고구마(디오스코레아, 예: 에스쿨렌타), 스위트 포테이토(이포모에아 바타타스)]; 종자[예컨대, 강낭콩(파세올루스, 예: 불가리스), 완두콩(피숨, 예: 사티붐), 콩(글리신, 예: 막스), 밀(트리티쿰, 예: 아에스티붐), 보리(호르데움, 예: 불가레), 옥수수(제아, 예: 메이스), 쌀(오리자, 예: 사티바), 평지의 씨(브라시카 나푸스), 기장(파니쿰 엘), 해바라기(헬리안투스 아누스), 귀리(아베나 사티바)] 및 괴경[예컨대, 구경 양배추(브라시카, 예: 올레아세아), 감자(솔라눔, 예: 투베로숨)] 등을 제조하는 농작물을 포함하나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
비식물 발현 시스템뿐만 아니라 추가의 식물도 본 발명의 범위 내에서 사용가능하다는 것이 이해된다. 식물 종의 선택은 의도한 식물 또는 식물 부분의 용도, 및 식물 종의 형질전환에 대한 순응도에 의해 주로 결정된다.
6.2.5 - 시물 형질전환 방법:몇몇 기법은 표적 식물 내에 피타제 암호화 DNA 서열을 함유하는 발현 구조물의 도입에 유용하다. 상기 기법은 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법, 일렉트로포레이션, 및 미세주사 또는 (코팅된) 입자 충격법을 사용하는 원형질체의 형질전환을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다(Potrykus, 1990). 이들 소위 직접 DNA 형질전환 방법뿐만 아니라, 바이러스 벡터[예: 꽃양배추 모자이크 바이러스(CaMV) 벡터] 및 박테리아 벡터[예: 아그로박테리움 속의 벡터]와 같은 벡터를 포함하는 형질전환 시스템이 유용하다(Potrykus, 1990). 선택 및/또는 스크리닝 후, 형질전환된 원형질체, 세포 또는 식물의 부분은 당업계에 공지된 방법(Horsch 등, 1985)을 사용하여 완전한 식물로 재생시킬 수 있다. 형질전환 및/또는 재생 기법의 선택은 본 발명에 있어서 중요하지 않다.
6.2.6 - 쌍떡잎식물용 방법:쌍떡잎식물의 경우, 본 발명의 바람직한 실시태양은, 병원성(virulence) 유전자를 가지는 비르 플라스미드(vir plasmid), 및 이입되는 유전자 구조물을 함유하는 상용성 플라스미드를 함유하는 아그로박테리움 균주가 사용되는 바이나리 벡터(binary vector) 시스템(Hoekema 등, 1983; EP0120516, Schilperoort 등)의 원리를 사용한다. 이 벡터는 대장균 및 아그로박테리움 둘다에서 복제될 수 있고, 본 발명과 관계없는 세부 사항에 변경이 있는 바이나리 벡터 Bin19로부터 유도된다. 본 실시예에 사용된 바와 같은 바이나리 벡터는 T-DNA의 좌경계과 우경계 서열 사이에, 카나마이신 내성(Bevan, 1984)을 암호화하는 동일 NPTII-유전자 및 필요한 유전자 구조물 내에 클로닝시키기 위한 다중 클로닝 부위를 함유한다.
6.2.7 - 외떡잎식물용 방법:외떡잎식물인 농작물의 형질전환 및 재생은 표준 방법이 아니다. 그러나, 최근의 과학 발달은 원칙적으로 외떡잎식물은 형질전환에 순응할 수 있고, 수정능력이 있는 트랜스제닉 식물이 형질전환된 세포로부터 재생될 수 있다는 것을 보여 준다. 식물 세포에의 유전 물질의 도입을 위한 강력한 방법과 함께 이들 농작물용 재생성 조직 배양 시스템의 발달은 형질전환을 촉진시킨다. 현재, 외떡잎식물의 형질전환을 위한 선택 방법은 외식편 또는 현탁 세포의 미세주사 충격, 직접 DNA 흡수 또는 원형질체의 일렉트로포레이션이다. 예를 들어, 형질전환 벼(rice) 식물은 선택 표지로서 하이그로마이신 내성을 암호화하는 박테리아 hph 유전자를 사용하여 성공적으로 수득하였다. 일렉트로포레이션에 의해 유전자를 도입하였다(Shimamoto 등, 1993). 형질전환 옥수수 식물은 미립자 충격에 의한 옥수수 현탁 배양의 배형성 세포 내에 포스피노트리신 아세틸 전이효소(제초제 포스피노트리신을 불활성화하는 효소)를 암호화하는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 바(bar) 유전자를 도입함으로써 수득하였다(Gordon-Kamm 등, 1990). 다른 외떡잎식물인 농작물(예: 밀, 보리)의 알레우론 원형질체에의 유전 물질의 도입이 보고되었다(Lee 등, 1989). 밀 식물은 배형성 현탁 배양의 확립을 위해 노화된 밀집성(compact) 및 결절성 배형성 칼루스 조직만을 선택함으로써 배형성 현탁 배양으로부터 재생하였다 (Vasil 등, 1972; Vasil 등, 1974). 이들 농작물용 형질전환 시스템의 조합은 본 발명의 외떡잎식물에의 적용을 가능하게 한다. 또한, 이들 방법은 쌍떡잎식물의 형질전환 및 재생에 응용될 수 있다.
6.2.8 - 식물 내에서의 발현 방법:피타제 구조물의 발현은 재조합 DNA 기술 분야의 당업자에게 공지된, 식물 중합효소에 의한 유전자의 전사, mRNA의 번역 등과 같은 세부적인 것을 포함한다. 본 발명의 적당한 이해와 관련된 세부 사항만을 아래에 언급한다. 피타제의 발현을 야기시키는 것으로 공지되거나 밝혀진 조절 서열은 본 발명에 사용가능하다. 사용되는 조절 서열의 선택은 표적 작물 및/또는 관심 표적 기관에 달려 있다. 상기 조절 서열은 식물 또는 식물 바이러스로부터 수득하거나 화학적으로 합성할 수 있다. 상기 조절 서열은 식물 또는 식물의 부분의 용도에 따라, 식물 내의 전사를 구성적으로 또는 단계 및/또는 조직 특이적으로 조정하는 경우에 활성이 있는 프로모터이다. 이들 프로모터는 구성 발현을 나타내는 프로모터[예: 꽃양배추 모자이크 바이러스(CaMV)의 35S 프로모터(Guilley 등, 1982)], 잎 특이성 발현용 프로모터[예: 리불로오스 비스포스페이트 카르복실라제 소단위 유전자의 프로모터(Coruzzi 등, 1984)], 뿌리 특이성 발현용 프로모터[예: 글루타민 합성효소 유전자로부터의 프로모터(Tingey 등, 1987)], 종자 특이성 발현용 프로모터[예: 브라시카 나푸스로부터의 크루시페린 A 프로모터(Ryan 등, 1989)], 괴경 특이성 발현용 프로모터[예: 감자로부터의 클라스-I 파타틴(patatin)프로모터(Koster-Topfer 등, 1989; Wenzler 등, 1989)] 또는 열매 특이성 발현용 프로모터[예: 토마토로부터의 폴리갈락투로나제(PG) 프로모터(Bird 등, 1988)]를 포함하나 이들에 한정되는 것은 아니다.
다른 조절 서열(예: 종결인자 서열 및 폴리아데닐화 신호)는 식물 내에서 그러한 작용을 하는 임의의 상기 서열을 포함하며, 그 선택은 당업자의 수준 범위 내에 있다. 상기 서열의 예는 아그로박테리움 투메파시엔스의 노팔린 합성효소(nos) 유전자의 3' 인접 영역이다(Bevan, 상기 참조). 또한, 조절 서열은 CaMV의 35S 프로모터 내에서 밝혀진 서열과 같은 인핸서 서열, 및 자주개자리 모자이크 바이러스(AlMV) RNA4의 리더 서열과 같은 mRNA 안정화 서열(Brederode 등, 1980) 또는 유사 방식으로 작용하는 임의의 다른 서열을 포함할 수 있다.
피타제는 발현된 단백질의 안정성을 고려한 환경에서 발현시켜야 한다. 세포 구획(예: 세포질졸, 소포체, 액포, 단백질체 또는 세포주변강)의 선택은, 피타제의 생물물리학적 매개변수에 따라, 상기 안정한 환경을 산출하기 위해 본 발명에 사용할 수 있다. 상기 매개변수는 최적 pH, 프로테아제에 대한 감수성, 또는 바람직한 구획의 몰농도에 대한 감수성을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
세포의 세포질 내의 발현을 수득하기 위해, 발현된 효소는 분비 신호 펩티드 또는 임의의 다른 표적 서열을 함유해서는 안된다. 엽록체 및 미토콘드리아 내의 발현의 경우, 발현된 효소는 이들 기관 내로의 수송을 위해 특이적인 소위 트랜싯 펩티드(transit peptide)를 함유해야 한다. 이를 달성하기 위해 중요 효소에 부착될 수 있는 표적 서열은 공지되어 있다(Smeekens 등, 1990; van den Broeck 등,1985; Wolter 등, 1988). 액포 내의 효소 활성을 바란다면, 효소를 상기 액포로 보내는 특이적 표적 서열뿐만 아니라 분비 신호 펩티드가 있어야 한다(Tague 등, 1990). 종자 내의 단백질체의 경우도 마찬가지이다. 관심 효소를 암호화하는 DNA 서열은 효소가 세포내의 필요한 장소에서 스스로 작용할 수 있도록 하는 방법으로 조절하여야 한다.
피타제의 세포외 발현을 달성하기 위해, 본 발명의 발현 구조물은 분비 신호 서열을 사용한다. 식물 숙주 종과 동종인(미변성인) 신호 서열이 바람직하지만, 이종 신호 서열, 즉 다른 식물 종으로부터 기원하는 신호 서열 또는 미생물 기원의 신호 서열도 사용할 수 있다. 상기 신호 서열은 당업자에게 공지되어 있다. 본 발명의 범위 내에서 사용될 수 있는 적당한 신호 서열은 문헌들[Blobel 등, 1979; Garcia 등, 1987; Sijmons 등, 1990; Ng 등, 1994; Powers 등, 1996]에 기재되어 있다.
경우에 따라, 본 발명의 DNA 구조물(프로모터, 조절 서열, 분비 서열, 안정화 서열, 표적 서열 또는 종결 서열)의 모든 부분은 당업자에 공지된 방법을 사용하여 조절 특성에 영향을 미치도록 조절할 수 있다. 본 발명에 의해 수득된 피타제를 함유하는 식물은 고농도의 피타제를 가지는 식물 또는 식물 기관을 수득하는데 사용할 수 있다는 것을 지적한다. 예를 들어, 소모클로날 변이 기법의 사용에 의해 또는 교차 육종 기법에 의해 상기 식물 또는 식물 기관을 수득할 수 있다. 상기 기법은 당업자에 공지되어 있다.
6.2.9 - 신규 피타제 및 기타 분자의 이중 발현:일 실시태양에 있어서, 본발명은 피타제 및 기타 분자의 고효율 과발현 시스템을 달성하는 방법(및 그 생성물)을 제공한다. 바람직한 실시태양에 있어서, 본 발명은 트리코데르마 내의 피타제 및 pH 2.5의 산 포스파타제의 고효율 과발현 시스템을 달성하는 방법(및 그 생성물)을 제공한다. 이 시스템은 동물 사료 산업에 특히 유용한 효소 조성물을 산출한다. 이 방법에 관한 추가의 세부 사항은 간행물에 기재되어 있고/있거나 당업자에 공지되어 있다. 무제한의 구체예에 있어서, 상기 공개된 간행물은 EP 0659215(WO 9403612 A1)(Nevalainen 등)을 포함하지만, 이들 참고 문헌은 본 발명의 분자들을 가르치는 것은 아니다.
6.2.10 - 신규 피타제의 가용성 제제 및 이의 안정화된 액제
일 실시태양에 있어서, 본 발명은 효소 활성의 열 불활성화에 대한 증가된 내성을 나타내는 피타제 활성을 가지며, 연장된 저장 기간 중 그러한 피타제 활성을 보유하는 안정화된 수성 액제의 제조 방법(및 그 생성물)을 제공한다. 안정화제로서의 우레아 및/또는 폴리올(예: 소르비톨 및 글리세롤)의 첨가에 의해 상기 액제를 안정화시킨다. 또한, 본 발명은 상기 안정화된 수성 액제의 사용에 기인하는 단위동물(monogastric animal)의 사료 제제 및 그 제조 방법을 제공한다. 이 방법에 관한 추가의 세부 사항은 간행물에 기재되어 있고/있거나 당업자에게 공지되어 있다. 무제한의 구체예에 있어서, 상기 공개된 간행물은 EP 0626010(WO 9316175 A1)(Barendse 등)을 포함하지만, 이들 참고 문헌은 본 발명의 분자들을 가르치는 것은 아니다.
6.3 - 신규 피타제의 용도
6.3.1 - 일반 용도, 피테이트의 가수분해, 및 이노시톨의 생성:일 실시태양에 있어서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 하나 이상의 신규 피타제 분자와 피테이트를 접촉시키는 단계를 포함하는 피테이트 가수분해 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 피트산(phytic acid) 복합체로부터의 미네랄의 방출과 함께 피테이트의 이노시톨 및 유리 인산염으로의 가수분해를 촉매하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 분해 유효량의 본 발명의 효소(예: SEQ ID NO:2에 나타난 효소)와 피테이트 기질을 접촉시키는 단계를 포함한다. 용어 "분해 유효"량은 효소와 접촉하지 않은 피테이트와 비교할 경우 피테이트의 50% 이상을 분해시키는데 필요한 효소의 양을 의미한다. 피테이트의 80% 이상이 분해되는 것이 바람직하다.
다른 실시태양에 있어서, 본 발명은 피테이트 내의 포스포-모노-에스테르 결합의 가수분해 방법을 제공한다. 이 방법은 유효량의 본 발명의 피타제 분자(예: SEQ ID NO:2)를 투여하여 이노시톨 및 유리 인산염을 제조하는 단계를 포함한다. "유효"량은 효소와 접촉하지 않은 피테이트와 비교할 경우 포스포-모노-에스테르 결합의 50% 이상을 가수분해하는데 필요한 효소의 양을 의미한다. 결합의 80% 이상이 가수분해되는 것이 바람직하다.
구체적인 실시양태에 있어서, 경우에 따라 피타제 분자는, 피테이트 분자내 및/또는 기질 공급원(들)의 다른 분자내의 화학적 변화(예: 가수분해)에 영향을 미치기 위해 다른 반응제(예: 다른 촉매)과 함께 사용할 수 있다. 이 실시양태에 따라, 피타제 분자 및 추가의 반응제(들)은 상호 억제하지 않는 것이 바람직하고, 전체적인 부가 효과를 가지는 것이 보다 바람직하며, 전체적인 상승 효과를 가지는것이 가장 바람직하다.
기질 피테이트 분자의 관련 공급원은 식료품, 잠재성 식료품, 식료품의 부산물(생체내 및 생체외 부산물 모두, 예컨대 생체외 반응 생성물 및 동물 배설 생성물), 식료품의 전구체 및 임의의 다른 피테이트 공급원을 포함한다.
6.3.2 - 생물체에의 투여:무제한의 실시양태에 있어서, 재조합 피타제는 생물체에 의해 소비되고, 소비될 때 활성을 보유할 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 재조합 피타제의 발현을 달성하는데 형질전환 방법을 사용할 수 있다[바람직하게는, 조절 방식으로(이 방법은 시간 특이성 및 조직 특이성 방식으로 형질전환 분자의 발현을 조절하는데 유용하다)].
특정 구체예에 있어서, 원료 물질(예: 트랜스제닉 식물 공급원 또는 재조합 원핵생물 숙주)의 피타제 활성은 소비시 증가할 수 있다; 상기 활성의 증가는 예컨대 전구 형태(pro-form)의 전구체 피타제 분자가 유의적으로 보다 활성이 있는 보다 성숙한 형태의 효소로 전환시에 일어날 수 있는데, 상기 전환은 예컨대 피타제 공급원의 섭취 및 소화에 기인할 수 있다. 피테이트와 피타제가 접촉할 경우, 언제든지 피테이트 기질의 가수분해가 일어날 수 있다; 예를 들어, 상기 가수분해는 기질, 효소, 또는 기질과 효소의 섭취 전, 섭취 후, 또는 섭취 전후에 일어날 수 있다. 피테이트 기질은 (피타제뿐만 아니라) 하나 이상의 추가 반응제(예: 상기 원료 물질로부터 직접 또는 정제 후 적용될 수도 있는 다른 효소)과 접촉할 수 있다고 추가로 평가된다.
피타제 원료 물질(들)은 피테이트 원료 물질(들)과 직접 접촉할 수 있다고평가된다[예컨대, 피타제 공급원(들), 피테이트 공급원(들), 또는 피타제 공급원(들)과 피테이트 공급원(들)의 생체내 또는 생체외 분쇄 또는 저작시]. 대안으로, 피테이트 기질과 피타제 효소를 접촉시키기 이전에 원료 물질(들)로부터 피타제 효소를 정제하거나, 원료 물질(들)로부터 피테이트 기질을 정제하거나, 또는 원료 물질(들)로부터 피타제 효소와 피테이트 기질을 정제할 수 있다. 정제 및 미정제 반응제의 배합물[효소(들), 기질(들), 또는 효소(들)과 기질(들)을 포함함]을 사용할 수 있다.
피타제 활성의 공급원으로서 하나 이상의 원료 물질을 사용할 수 있다고 평가된다. 이는 원료 물질(들)로부터 반응제(들)의 지효성 방출을 달성하는 한가지 방법으로서 유용한데, 각각의 원료 물질들로부터의 상이한 반응제들의 방출은 예컨대 섭취된 원료 물질들이 생체내에서 소화될 때 또는 원료 물질들이 시험관 내에서 처리될 때, 차등적으로 일어난다. 또한, 피타제 활성이 있는 하나 이상의 원료 물질의 사용은, 예컨대 상이한 처리 공정 중에 일어날 수 있는 일정 범위의 조건 및 그 변동(예: 일정 범위의 pH 값, 온도, 염분 및 시간 간격) 하에서 피타제 활성을 수득하는데 유용하다. 또한, 상이한 원료 물질의 사용은, 피타제 및/또는 피테이트 및/또는 다른 물질의 하나 이상의 형태 또는 이성질체에 의해 예시된 바와 같이 상이한 반응제을 수득하는데 유용하다. 트랜스제닉 식물 종(또는 그 식물의 부분)과 같은 단일 원료 물질은 피타제 및 피테이트 둘다의 원료 물질일 수 있고; 효소 및 기질은 상기 단일 원료 물질의 범위내에서 분별 구획될 수 있다(예컨대, 상이한 식물 부분, 기관 또는 조직내, 또는 동일한 식물 부분, 기관 또는 조직 내의 세포하구획내에서의 분비 대 비분비의, 차등적으로 발현되고/발현되거나 차등적인 존재비를 가짐)고 평가된다. 본 명세서에 포함된 피타제 분자의 정제는 하나 이상의 바람직한 식물 부분, 기관, 조직 또는 세포하 구획의 분리 및/또는 추가 처리를 포함할 수 있다.
구체적인 실시양태에 있어서, 본 발명은 증가된 양의 효소를 함유하는 종자를 사용하여 생체내 및/또는 생체외 반응을 촉매하는 방법을 제공한다. 이 방법은 반응 혼합물에 형질전환된 비야생형 종자(바람직하게는 분쇄 형태로)를 첨가하는 단계, 및 종자 내의 효소가 반응 속도를 증가시키도록 하는 단계를 포함한다. 반응 혼합물에 종자를 직접 첨가함으로써, 이 방법은 보다 고가이고 장애가 되는 효소의 추출 및 정제 공정에 대한 해결책을 제시한다. 또한, 이 방법은 효소의 충분한 공급이 부족한 생물체에 증강된 양의 효소를 함유하는 하나 이상의 식물 종, 바람직하게는 트랜스제닉 식물 종의 종자 형태로 효소를 투여하는 처리 방법을 제공한다. 이 방법에 관한 추가의 세부 사항은 간행물에 기재되어 있고/있거나 당업자에 공지되어 있다. 무제한의 구체예에 있어서, 상기 공개된 문헌은 USPN 5,543,576(Van Ooijen 등) 및 USPN 5,714,474(Van Ooijen 등)을 포함하지만, 이들 참고 문헌은 본원 발명의 분자를 가르치는 것이 아니라, 진균 피타제의 용도를 가르친다.
특정 무제한의 실시양태에 있어서, 본 발명의 피타제 분자는 재조합 소화 시스템 생물형(또는 미생물 또는 식물)의 생성, 및 동물에의 상기 재조합 소화 시스템 생물형의 투여에 유용하다. 투여는 단독으로, 또는 소화 시스템(여기서, 다른 효소 및 생물형은 재조합형이거나 재조합형이 아닐 수 있음) 내에 효소 활성을 제공할 수 있는 다른 효소 및/또는 다른 생물형과 함께 임의로 수행할 수 있다. 예를 들어, 투여는 크실란용균성(xylanolytic) 박테리아와 함께 수행할 수 있다.
6.3.3 - 곡물류의 침지:무제한의 실시양태에 있어서, 본 발명은 1종 이상의 피틴 분해 효소(옥수수 또는 수수에 존재하는 피틴이 거의 분해될 정도의 양)을 침지시키는 방법을 제공한다. 효소 제제는 피타제 및/또는 산 포스파타제를 포함하고, 기타 식물 물질 분해 효소를 임의로 포함한다. 침지 시간은 12 시간 내지 18 시간일 수 있다. 침지 시간을 단축시키는 중간의 제분(milling) 공정에 의해 침지가 방해될 수 있다. 바람직한 실시태양에 있어서, 1종 이상의 피틴 분해 효소(예: 피타제 및 산 포스파타제)를 포함하는 효소 제제의 존재하에 이산화황 함유 온수 중에 옥수수 또는 수수 낟알의 존재하에 이산화황 함유 온수 중에 옥수수 또는 수수 낟알을 침지시켜, 피트산 및 피트산 염을 제거하거나 현저히 감소시킨다. 이 방법에 관한 추가의 세부 사항은 간행물에 기재되어 있고/있거나 당업자에 공지되어 있다. 무제한의 구체예에 있어서, 상기 공개된 문헌은 USPN 4,914,029 (Caransa 등) 및 EP 0321004(Vaara 등)을 포함하지만, 이들 참고 문헌은 본원 발명의 분자를 가르치는 것은 아니다.
6.3.4 - 빵 반죽의 제조:무제한의 실시양태에 있어서, 본 발명은 빵 반죽에 피타제 분자를 첨가하는 것을 포함하는, 바람직한 물리적 특성(예: 무점착성 및 탄력성)을 갖는 빵 반죽 및 우수한 품질(예: 비체적)의 빵 생성물을 수득하는 방법을 제공한다. 바람직한 실시태양에 있어서, 본원 발명의 피타제 분자를 가공 중인 빵 반죽 제제에 첨가하고, 연이어 상기 제제를 형성시키고 구웠다. 이 방법에 관한 추가의 세부 사항은 간행물에 기재되어 있고/있거나 당업자에 공지되어 있다. 무제한의 구체예에 있어서, 상기 공개된 문헌은 JP 03076529(Hara 등)을 포함하지만, 이 참고 문헌은 본원 발명의 피타제 분자를 가르치는 것은 아니다.
6.3.5 - 콩 함유 식료품의 제조:무제한의 실시양태에 있어서, 본 발명은 개선된 콩 식료품을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 피타제 분자와 콩을 배합하여 콩으로부터 피트산을 제거함으로써, 소비하는(consuming) 생물체에 필수적인 미량 영양소의 공급 및 단백질 소화율이 개선된 콩 식료품을 제조한다. 바람직한 실시태양에 있어서, 두유를 제조할 경우, 콩에 본원 발명의 피타제 분자를 첨가하거나 또는 접촉시켜 피트산 함량을 감소시킨다. 무제한의 구체예에 있어서, 가열 하에 효소와 함께 두유를 교반함으로써, 또는 부동화 효소를 사용하여 교반 용기 내에서 혼합형 반응을 수행함으로써 본 출원의 공정을 가속화시킬 수 있다. 이 방법에 관한 세부 사항은 간행물에 기재되어 있고/있거나 당업자에 공지되어 있다. 무제한의 구체예에 있어서, 상기 공개된 문헌은 JP 59166049(Kamikubo 등)을 포함하지만, 이 참고 문헌은 본원 발명의 피타제 분자를 가르치는 것은 아니다.
6.3.6 - 청주를 비롯한 액상 식료품의 제조:일 실시양태에 있어서, 본 발명은 유체 형태의 음료수 또는 동물 사료용 혼합 생성물을 제조하는 방법을 제공하는데, 미네랄 혼합물, 비타민 혼합물, 및 본 발명의 신규 피타제 분자를 사용하는 것을 포함한다. 바람직한 실시태양에 있어서, 본 발명은 중요 미네랄/비타민의 침전 및 파괴의 위험없이 소비하는 생물체에 필수적인 영양소가 정확하게 나뉘어 구성된 혼합물을 달성하며, 동시에 사료 내에 피틴 결합 인산염을 최적 이용한다. 이방법에 관한 세부 사항은 간행물에 기재되어 있고/있거나 당업자에 공지되어 있다. 무제한의 구체예에 있어서, 상기 공개된 문헌은 EP 0772978(Bendixen 등)을 포함하지만, 이 참고 문헌은 본원 발명의 분자를 가르치는 것은 아니다.
또한, 사상균 및/또는 곡물 및/또는 다른 식물의 사용에 기초한 알콜성 및 비알콜성 가음성 식품(또는 음료)에 본원 발명의 피타제 분자를 사용할 수 있다고 평가된다. 이들 가음성 식품은 증류주, 와인, 혼합된 알콜성 음료(예: 청량 음료, 아일랜드 커피와 같은 다른 알콜성 커피 등), 맥주, 니어비어(near-beer), 쥬스, 추출물, 균질화물 및 퓌레(puree)를 포함한다. 바람직한 구체예에 있어서, 본원 명세서에 개시된 피타제 분자는 상기 가음성 식품에 유용한 사상균 및/또는 곡물 및/또는 다른 식물의 형질전환체를 야기시키는데 사용한다. 다른 바람직한 구체예에 있어서, 본원 명세서에 개시된 피타제 분자는 제조 방법 및/또는 상기 최종 함량의 가음성 식품에서 추가 성분으로 사용한다. 이 방법에 관한 세부 사항은 간행물에 기재되어 있고/있거나 당업자에 공지되어 있다. 그러나, 본 발명의 신규성으로 인하여 상기 공개된 문헌 내의 참고 사항은 본원 명세서에 개시된 발명의 분자를 가르치는 것은 아니다.
다른 무제한의 구체예에 있어서, 본 발명은 감소된 양의 피틴 및 증가된 함량의 이노시톨을 함유하는 정제된 청주를 수득하는 방법을 제공한다. 상기 청주는 직접 효과 및/또는 심인성 효과를 통해 간장 질환, 동맥경화증 및 기타 질환에 대한 예방 작용을 가질 수 있다. 바람직한 실시태양에 있어서, 미가공 물질로서 높은 피타제 활성을 가지는 쌀 코지(Koji) 사상균을 증식시킴으로써 쌀 코지로부터 청주를 제조한다. 본 발명의 피타제 분자는 증강된 활성을 가지는 유용한 사상균(바람직하게는 형질전환 사상균)을 제조하는데 사용하고/사용하거나, 코지 사상균의 효과를 증강시키도록 외인성으로 첨가시킬 수 있다. 끓인 쌀에 균주를 첨가하고, 종래의 방법에 의해 코지를 제조한다. 바람직한 구체예에 있어서, 제조된 코지를 사용하고, 2 단계로 완전(whole) 쌀을 제조하며, 15 ℃의 일정한 청주 온도로 청주를 제조하여, 감소된 양의 피틴 및 증가된 양의 이노시톨을 함유하는 목적하는 정제된 청주를 제공한다. 이 방법에 관한 세부 사항은 간행물에 기재되어 있고/있거나 당업자에 공지되어 있다. 무제한의 구체예에 있어서, 상기 공개된 문헌은 JP 06153896(Soga 등) 및 JP 06070749(Soga 등)을 포함하지만, 이들 참고 문헌은 본원 발명의 분자를 가르치는 것은 아니다.
6.3.7 - 미네랄 흡수 촉진제의 제조:무제한의 실시양태에 있어서, 본 발명은 저비용으로 위액 또는 장액에 의한 소화없이 섭취된 칼슘을 비롯한 미네랄의 흡수를 촉진시킬 수 있는 흡수 촉진제를 수득하는 방법을 제공한다. 바람직한 실시태양에 있어서, 상기 미네랄 흡수 촉진제는 활성 성분으로서 피트산의 부분적인 가수분해물을 함유한다. 피트산의 가수분해물은 본 발명의 신규 피타제 분자를 사용하여 피트산 또는 그 염을 가수분해시킴으로써 제조한다. 상기 피타제 분자로의 처리는 단독으로 및/또는 조합형 처리(최종 효과를 억제하거나 증강시키는)로 일어날 수 있고, 인산염 라디칼을 모두 유리시키지는 않도록 하는 범위 내에서 가수분해를 억제하는 것을 수반한다. 이 방법에 관한 세부 사항은 간행물에 기재되어 있고/있거나 당업자에 공지되어 있다. 무제한의 구체예에 있어서, 상기 공개된 문헌은 JP04270296(Hoshino 등)을 포함하지만, 공개된 문헌 내의 참고 사항은 본원 발명의 분자를 가르치는 것은 아니다.
6.3.8 - 다른 피타제 및/또는 산 포스파타제와 함께 사용:무제한의 실시양태에 있어서, 본 발명은 부가 피테이트 가수분해 활성, 또는 바람직하게는 상승 피테이트 가수분해 활성을 가지는 효소 조성물을 제조하는 방법(및 그 생성물)을 제공하는데, 상기 조성물은 조합형 처리에 유용한 조성물을 달성하도록 본 발명의 신규 피타제 분자 및 1종 이상의 추가 반응제을 포함한다. 바람직한 실시태양에 있어서, 본 발명의 조합형 처리는 상이한 위치 특이성의 2 이상의 피타제의 사용, 즉 1-, 2-, 3-, 4-, 5- 및 6-피타제의 임의의 조합으로 달성한다. 상이한 위치 특이성의 피타제를 조합함으로써, 부가 또는 상승 효과를 얻는다. 또한, 상기 조합된 피타제를 포함하는 조성물(예: 식품 사료 또는 식품 사료 첨가제)은 그 제조 방법과 함께 본 발명에 포함된다. 이 방법에 관한 추가의 세부 사항은 간행물에 기재되어 있고/있거나 당업자에 공지되어 있다. 무제한의 구체예에 있어서, 상기 공개된 문헌은 WO 9 830681(Ohmann 등)을 포함하지만, 이들 공개 문헌 내의 참고 사항은 본원 발명의 분자를 가르치는 것은 아니다.
다른 바람직한 실시태양에 있어서, 본 발명의 조합형 처리는, pH 2.5 내지 5.0에서 0.1:1.0 내지 10:1, 바람직하게는 0.5:1.0 내지 5:1, 보다 바람직하게는 0.8:1.0 내지 3:1, 보다 더 바람직하게는 0.8:1 내지 2:1의 활성 프로필에 상응하는 낮은 비율로 pH 2.5에서 피테이트 가수분해 활성을 가지는 산 포스파타제의 사용으로 달성한다. 상기 효소 조성물은 열 처리를 통해 고도의 상승 피테이트 가수분해 효율을 나타낸다. 상기 효소 조성물은 피테이트 가수분해를 향상시키도록 식료품[가음성 식품 및 고형 식품, 사료 및 사료 생성물(fodder product)]을 처리하는데 유용하다. 이 방법에 관한 세부 사항은 공개된 문헌에 기재되어 있고/있거나 당업자에 공지되어 있다. 무제한의 구체예에 있어서, 상기 공개된 문헌은 USPN 5,554,399(Vanderbeke 등) 및 USPN 5,443,979(Vanderbeke 등)을 포함하지만, 이들 참고 문헌은 본원 발명의 분자의 용도를 가르치는 것이 아니고, 오히려 진균(특히, 아스퍼길루스) 피타제의 용도를 가르치는 것이다.
6.3.9 - 다당류(예: 크실라나제)에 작용하는 효소와 함께 사용:무제한의 실시양태에 있어서, 본 발명은 다당류에 작용하는 1종 이상의 추가 효소와 함께 본 발명의 신규 피테이트 작용 효소로 구성된 조성물을 제조하는 방법(및 그 생성물)을 제공한다. 상기 다당류는 아라비난, 프룩탄, 푸칸, 갈락탄, 갈락투로난, 글루칸, 만난, 크실란, 레반, 푸코이단, 카라지난, 갈락토카롤로스, 펙틴, 펙트산, 아밀로스, 풀루란, 글리코겐, 아밀로펙틴, 셀룰로스, 카르복실메틸셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 덱스트란, 푸스툴란, 키틴, 아가로스, 케라탄, 콘드로이틴, 더마탄, 히알루론산, 알긴산, 및 에리트로스, 트레오스, 리보스, 아라비노스, 크실로스, 릭소스, 알로스, 알트로스, 글루코스, 만노스, 굴로스, 이도스, 갈락토스, 탈로스, 에리트룰로스, 리불로스, 크실룰로스, 프시코스, 프룩토스, 소르보스, 타가토스, 글루쿠론산, 글루콘산, 글루카르산, 갈락투론산, 만누론산, 글루코사민, 갈락토사민 및 뉴라민산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 알도스, 케토스, 산 또는 아민을 함유하는 다당류로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
구체적인 실시양태에 있어서, 본 발명은 1종 이상의 본 발명의 신규 피타제 분자, 셀룰라제(크실라제를 포함하는 것이 바람직하지만 반드시 포함해야 하는 것은 아님)를 포함하고, 임의로 프로테아제 및 1종 이상의 추가 반응제을 포함하는, 상승 피테이트 가수분해 활성을 가지는 조성물을 제조하는 방법(및 그 생성물)을 제공한다. 바람직한 실시태양에 있어서, 상기 조합형 처리는 식료품, 목재 생성물(예: 제지 생성물)의 처리, 및 용액과 고체를 세정할 경우에 유용하다.
무제한의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 피타제 분자는 셀룰로솜 (cellulosome) 구성 성분과 함께 유용하다. 다수의 셀룰로용균 박테리아의 셀룰라제는 별개의 다중 효소 복합체, 이른바 셀룰로솜 내에 조직화된다고 공지되어 있다. 셀룰로솜의 다중 서브유닛은 다수의 작용성 도메인들로 구성되는데, 이들간에 상호작용을 하며, 이들은 셀룰로스 기질과도 상호작용을 한다. 상기 서브유닛 중 하나는 부착성 복합체 내에 각종 셀룰라제 및 크실라나제를 선택적으로 편입시키는 별개의 신규 비촉매성 비계(scaffolding) 폴리펩티드 군을 포함한다. 셀룰로솜 도메인의 키메라 구조물 및 셀룰로솜 하이브리드를 잘 활용하면, 보다 많은 셀룰로스 생물 자원을 사용할 수 있고, 연구, 의약 및 산업에 있어서의 광범위한 신규 용도를 제공할 수 있다.
다른 무제한의 구체예에 있어서, 본 발명의 피타제 분자는, 펄프 및 제지 산업에 일반적으로 사용되는 환경에 유해한 화학물질의 사용의 감소가 바람직한 생체펄프화(biopulping) 및 생체표백(biobleaching) 분야에 유용하다(단독으로 또는 조합형 처리로). 폐수 처리는, 생물학적 효소가 퇴색(color removing)뿐만 아니라 잠재적 유해 물질의 유용한 생물제품(bioproduct)으로의 생체전환에 효과적이라고 밝혀진 다른 광범위한 응용 분야를 나타낸다.
다른 무제한의 구체예에 있어서, 본 발명의 피타제 분자는 생물체의 소화 시스템의 처리에 있어서의 하나 이상의 효소 활성(단독으로 또는 조합형 처리에 있어서)을 제공할 수 있는 생물형을 생성시키는데 유용하다. 처리되는 특정 관련 생물체는 비반추 생물체를 포함한다. 구체적으로는, 이 방법은 단독으로 또는 다른 생물학적 분자(예: 크실라나제)와 함께 수행하여 다수의 생물학적 분자를 발현시키는 재조합 숙주를 생성시킬 수 있다고 평가된다. 또한, 본 발명의 피타제 분자, 및/또는 본 발명의 피타제 분자를 발현시키는 재조합 숙주의 투여는 단독으로, 또는 다른 생물학적 분자, 및/또는 소화 시스템에 효소 활성을 제공할 수 있는 생물형과 함께 수행할 수 있다(상기 다른 효소 및 상기 생물형은 재조합체이거나 다른 것일 수 있다). 예를 들어, 상기 투여는 크실란용균 박테리아와 함께 수행할 수 있다.
예를들면, 피테이트외에, 다수의 유기체들은 헤미셀룰로오즈를 적절히 소화할 수 없다. 헤미셀룰로오즈 또는 크실란은 식물 물질의 주요 성분(35%)이다. 반추동물의 경우, 약 50%의 식용 크실란이 분해되고, 비반추동물 및 사람의 하부 장에서는 오직 소량의 크실란만이 분해된다. 혹위에서, 주요 크실라놀리틱 종은 부티리비브리오 피브리솔벤스(Butyrivibrio fibrisolvens) 및 박테로이데즈 루미니콜라(Bacteroides ruminicola)이다. 사람 결장에서, 박테로이데즈 오바터스(Bacteroides ovatus) 및 박테로이데즈 프라질리스(Bacteroides fragilis) 아종 "a"는 주요 크실라놀리틱 박테리아이다. 크실란은 화학적으로 복잡하며, 분해하기 위해 다수의 효소가 필요하다. 장 박테리아에 의한 이들 효소의 발현은 종내에서 매우 다양하다. 부티리비브리오 피브리솔벤스는 세포외 크실라나제를 생산하나, 박테로이데즈 종은 세포-결합형 크실라나제 활성을 갖는다. 장 박테리아로부터 나온 크실라놀리틱 효소의 생화학적 특성은 완전히 규정된 것은 아니다. 크실로시다제 유전자는 B. 피브로솔벤스 113으로부터 클로닝되어왔다. B. 피브로솔벤스 49로부터 클로닝된 크실라나제 유전자를 사용한 DNA 하이브리드화의 데이타에 의하면, 이 유전자가 다른 B. 피브리솔벤스 균주에 존재할 수 있다는 것을 제시한다. 박트. 루미니콜라 유래의 클로닝된 크실라나제를 박트. 프라질리스 및 박트. 유니포르미스로 전이시키고 여기서 높은 수준으로 발현시켰다. 박트. 오바터스 유래의 아리비노시다제 및 크실로시다제 유전자를 클로닝하였으며, 양 활성은 신규의 이작용성 단일 효소에 의해 촉매되는 것으로 보여진다.
따라서, 본 발명의 피타제 분자는 1) 적절한 숙주(예, 박트. 프라질리스 또는 박트. 유니포르미스)로 이전시키고; 2) 그 결과물인 재조합 숙주에서 적절히 발현시키고; 3) 상기 재조합 숙주를 유기체에 투여하여 처리되는 유기체의 피테이트 분해 활성을 향상시키기에 유용하다. 유전적 그리고 생화학적 영역에서의 계속적인 연구는 장 수준에서의 소화 조작에 대한 지식 및 통찰을 제공할 것이고 결장 섬유 소화의 이해를 향상시킬 것이다.
이러한 접근법에 대한 부가적인 자세한 설명은 공개된 문헌에 있으며/있거나 당업자에게 알려져 있다. 비제한적인 특정 실례에서, 이러한 공개 입수가능한 문헌은 USPN 5,624,678(Bedford et al.). USPN 5,683,911(Bodie et al.), USPN5,720,971(Beauchemin et al.), USPN 5,759,840(Sung et al.), USPN 5,770,012(Cooper), USPN 5,786,316(Baeck et al.), USPN 5,817,500(Hansen et al.) 및 저널 논문(Jeffries, 1996; Prade, 1996; Bayer et al., 1994; Duarte et al., 1994; Hespell & Whitehead, 1990; Wong et al., 1988)을 포함하나, 이들 문헌은 본 출원의 본 발명의 피타제 분자를 전혀 교시하지 않으며 또한 식품, 목재 생산물(예, 종이 생산물), 세척액 및 고형 세척제의 생산에 피타제 분자를 첨가하는 것을 전혀 교시하고 있지 않다. 이에 반해, 본 발명은 피타제 분자-바람직하게는 본 출원의 본 발명의 피타제 분자-를 부가적인 피타제 활성을 갖는 제제를 수득하기 위해 개시된 반응제(들)에 첨가할 수 있다. 바람직하게는, 상기 반응제(들)에서 부가적인 피타제 분자는 서로 억제하지 않을 것이고, 더욱 바람직하게는 상기 반응제(들)에서 부가적인 피타제 분자는 전체적인 첨가 효과를 보유할 것이며, 더 바람직하게는 상기 반응제(들)에서 부가적인 피타제 분자는 전체적인 상승 효과를 보유할 것이다.
6.3.10 - 비타민 D와의 병용: 비제한적인 일면에서, 본 발명은 동물에게 수산화된 비타민 D3유도체 함유의 사료 조성물을 투여함으로써 피테이트 인(phosphorus) 이용을 강화하는 방법 및 동물 특히 가금류의 정강쪽 연골발육형성부전증을 치료 및 예방하는 방법을 제공한다. 비타민 D3유도체는 바람직하게는 피테이트 인 이용을 강화하기 위해 감소된 수준의 칼슘 및 인을 함유하는 먹이로 동물에게 투여된다. 따라서, 비타민 D3유도체는 피테이트 인 이용을 더 강화하기 위해 본 발명의 신규 피타제 분자와 병용하여 투여하는 것이 바람직하다. 이러한 접근법에 대한 부가적인 자세한 설명은 공개된 문헌에 있으며/있거나 당업자에게 알려져 있다. 비제한적인 특정 실례에서, 이러한 공개 입수가능한 문헌은 USPN 5,516,525(Edwards et al.) 및 USPN 5,366,736(Edwards et al.), USPN 5,316,770(Edwards et al.)을 포함하나, 이들 문헌은 본 출원의 본 발명의 분자를 전혀 교시하지 아니한다.
6.3.11- 락트산-생산 박테리아와의 병용: 비제한적인 일면에서, 본 발명은 1) 유기체의 신체에 이노시톨의 형태로 용이하게 흡수 및 이용되는 피틴을 포함하고; 2) 배설물에서 인을 감소시킬 수 있으며; 3) 따라서 환경 오염을 개선시키기에 유용한 식품을 얻기 위한 방법(및 이로부터 나온 생산물)을 제공한다. 상기 식품은 피틴-함유 곡물, 락트산-생산 미생물 및 본 발명의 신규 피타제 분자의 혼합물로 구성되어 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 식품은 피틴-함유 곡물(바람직한 예로, 벼 왕겨)을, 호산성이며 부티르산의 생산 없이 락트산을 생산하고 병발생을 일으키지 않는 유효한 미생물 군 및 피타제와 배합함으로써 생산된다. 유효한 미생물 군의 예는 예컨대, 액티노미세스 군에 속하는 스트렙토미세스. sp.(ATCC 3044) 및 락토바실리 군에 속하는 락토바실러스 sp.(IFO 3070)을 포함한다. 나아가, 유효한 미생물 군의 바람직한 부가량은 곡물 물질에 기초하여 박테리아 몸무게의 의미로서 0.2중량%이다. 게다가, 피타제의 부가량은 곡물 물질 내 피틴에 기초하여 1-2중량%가 바람직하다. 이러한 접근법에 대한 부가적인 자세한 설명은 공개된 문헌에 있고/있거나 당업자에게 알려져 있다. 비제한적 특정 실례에서 이렇게 공개 입수가능한 문헌은 JP 08205785(Akahori et al)을 포함하나, 공개 입수가능한 문헌은 본 출원의 본 발명의 분자에 대해 전혀 교시한 바 없다.
6.3.12 - 단백분해효소와 병용한 단백질의 용해화:비제한적인 일면에서, 본 발명은 채소 단백질의 용해도를 향상시키는 방법을 제공한다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 채소 단백질 공급원에서 단백질을 용해화하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 채소 단백질 공급원을 유효량의 하나이상의 피타제 효소-본 발명의 피타제 분자를 포함-로 처리하는 단계 및 채소 단백질 공급원을 유효량의 하나이상의 단백분해효소로 처리하는 단계를 포함한다. 다른 일면에서, 본 발명은 피타제와 하나 이상의 단백분해효소를 포함하는 동물 사료 참가물을 제공한다. 이 접근법에 관한 부가적인 자세한 설명은 공개된 문헌에 있고/있거나 당업자에게 알려져 있다. 비제한적인 특정 실례에서, 이렇게 공개적으로 입수가능한 문헌은 EP 0756457(WO 9528850 A1)(Nielsen and Knap)을 포함하나, 공개적으로 입수가능한 문헌에 있는 어떠한 언급도 본 출원의 본 발명 분자를 교시하지 않는다.
비제한적 일면에서, 본 발명은 식물 단백질 제제를 생산하는 방법으로서 채소 단백질 공급원 물질을 2 내지 6 범위의 pH에서 물에 분산시키는 단계 및 여기에 본 발명의 피타제 분자를 혼합하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 가용성 단백질을 함유하는 산성 추출물을 분리 및 건조시켜 원하는 특성의 고형 단백질을 수득한다. 하나 이상의 단백분해효소는 또한 단백질의 특성을 향상시키는데 사용될 수 있다. 이 접근법에 관한 부가적인 자세한 설명은 공개된 문헌에 있고/있거나 당업자에게 알려져 있다. 비제한적인 특정 실례에서, 이렇게 공개적으로 입수가능한 문헌은 USPN 3,966,971(Morehouse et al.)을 포함하나, 공개적으로 입수가능한 문헌에 있는 어떠한 언급도 본 출원의 본 발명 분자를 교시하지 않는다.
6.3.13- 신규의 피타제, 사포닌 및 키토산을 사용한 비료의 3중 처리:비제한적인 일면에서, 본 발명은 3개의 반응제인 피타제, 사포닌 및 키토산을 비료에 첨가함으로써, 토양 및/또는 비료 내 불활성 인을 활성화시키고, 질소 화합물의 이용 속도를 개선시키며, 병원성 곰팡이의 증식을 억제하는 방법(및 이로부터 나온 생산물)을 제공한다. 비제한적 구체예에서 상기 방법은 1) 배지중의 피타제-함유 미생물을 -바람직하게는 본 발명의 신규 피타제 분자를 과발현하는 재조합 숙주- 예를들면 100㎖ 배지/100㎏ 습윤 비료로 첨가하는 것; 2) 별법으로 피타제 함유 식물 공급원-예, 밀 왕겨-를 예를들어 0.2 내지 1㎏/100㎏ 습윤 비료로 첨가하는 것; 3) 사포닌 함유 공급원-예, 이탄, 쑥 및 유카 식물-을 예를 들어 0.5 내지 3.0g/㎏으로 첨가하는 것; 4) 키토산 함유 물질-예, 새우, 게 등의 분말화된 외피-를 예를들어 100 내지 300g/㎏ 습윤 비료로 첨가하는 것에 의해 비료를 처리하는 단계를 포함할 수 있다. 또다른 비제한적인 구체예에서, 재조합 공급원은 3개의 반응제인 피타제, 사포닌 및 키토산을 사용한다. 이 접근법에 관한 부가적인 자세한 설명은 공개된 문헌에 있고/있거나 당업자에게 알려져 있다. 비제한적인 특정 실례에서, 이렇게 공개적으로 입수가능한 문헌은 JP 07277865(Toya Taisuke)을 포함하나, 공개적으로 입수가능한 문헌에 있는 어떠한 언급도 본 출원의 본 발명 분자를 교시하지 않는다.
6.3.14- 하이브리드화 프로브 및 증폭 주형으로서의 용도:본 발명의 전길이 유전자의 단편을 cDNA 또는 게놈성 라이브러리에 대한 하이브리드화 프로브로 사용하여 전길이 DNA를 분리하고 상기 유전자와 높은 서열 유사성을 갖거나 유사한 생물학적 활성을 갖는 다른 DNA들을 분리할 수 있다. 이 유형의 프로브는 10개이상, 바람직하게는 15개 이상, 더욱 바람직하게는 30개이상의 염기를 갖으며 예를 들면 50개 이상의 염기를 함유할 수 있다. 또한, 상기 프로브를 사용하여 전길이 전사체에 해당하는 DNA 클론, 및 조절 영역 및 프로모터 영역, 엑손 및 인트론을 포함하는 완전한 유전자를 함유하는 게놈성 클론(들)을 동정할 수 있다.
본 발명은 서열번호 1 외에 피타제 폴리펩티드 부류의 일원들을 암호화하는 핵산 분자를 동정하는 방법을 제공한다. 이들 방법에서, 피타제 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 함유하는 샘플, 예컨대 cDNA 라이브러리 같은 핵산 라이브러리를 피타제-특이 프로브(예, 피타제-특이 핵산 프로브)로 스크리닝한다. 피타제-특이 핵산 프로브는 피타제 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 또는 이의 상보성 서열과 특이적으로 하이브리드화하는 핵산 분자(예, DNA 또는 RNA 뉴클레오티드, 이들의 조합물 또는 변형물)이다. 본 발명의 방법의 내용에서 "피타제-특이 프로브"는, 다른 효소를 암호화하는 핵산 또는 그 상보성 서열 보다 검출가능하게 더 큰 정도로 피타제 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 또는 이의 상보성 서열에 결합하는 프로브를 의미한다.
본 발명은 피타제-특이 핵산 프로브의 생산을 용이하게 한다. 이러한 프로브를 수득하는 방법은 도1a와 1b에 도시된 아미노산 서열에 기초하여 설계될 수 있다. 12개 이상(예, 15, 25, 35, 50, 100 또는 150개 이상)의 뉴클레오티드를 함유할 수 있는 프로브는 임의의 몇몇 표준 방법(Ausubel et al., 상기문헌 참조)을 이용하여 생산될 수 있다. 예를들면, 프로브는 PCR 증폭 방법을 사용하여 생성시키는 것이 바람직하다. 이들 방법에서, 피타제의 보존성 서열(도1a와 1b 참조)에 해당하며 피타제-특이 아미노산을 포함할 수 있는 프라이머를 설계하여, 그 결과 생성된 PCR 산물을 프로브로 사용하여 cDNA 라이브러리 같은 핵산 라이브러리를 스크리닝한다.
본 발명을 사용하여, 도1a와 1b(서열번호 1)에 개시된 피타제 효소를 암호화하는 분리된 핵산 분자와 실질적으로 유사한 핵산 서열을 분리할 수 있다. 분리된 핵산 서열이 (i) 하기 기술하는 엄격한 조건하에 서열번호 1과 하이브리드화할 수 있거나 또는 (ii) 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 서열번호 2에 설명된 피타제 폴리펩티드를 암호화한다(예, 서열번호 1과 축퇴성 관계에 있다)면 실질적으로 유사하다.
축퇴된 DNA 서열은 서열번호 2의 아미노산 서열을 암호화하나, 뉴클레오티드 암호화 서열에는 차이가 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "실질적으로 유사한"은 본 발명의 서열과 유사한 동일성을 갖는 서열을 의미한다. 실질적으로 유사한 뉴클레오티드 서열은 하이브리드화 또는 서열 비교에 의해 확인될 수 있다. 실질적으로 유사한 효소 서열은 단백분해성 소화, 겔 전기영동 및/또는 미세서열화 중 하나 이상을 사용하여 확인될 수 있다.
피타제 효소를 암호화하는 핵산 분자를 분리하는 방법은, 당업계에서 인정된 공정(예, Ausubel et al., 상기 문헌 참조)을 사용하여 천연 또는 인위적으로 설계된 프로브로 게놈성 유전자 라이브러리를 탐침하는 것이다. 당업자는 서열번호 1 또는 그 단편(15개 이상의 인접 뉴클레오티드로 구성됨)이 특히 유용한 프로브라는 것을 알고 있다. 이 목적으로 유용한 다른 특정 프로브는 서열번호 1의 서열과 하이브리드할 수 있는 단편(즉, 15개 이상의 인접 뉴클레오티드로 구성됨)이다.
이러한 프로브는 프로브 확인을 용이하게 하는 분석적으로 검출가능한 반응제로 표지할 수 있으며 표지하는 것이 바람직하다고 이해된다. 유용한 반응제는 비제한적으로 방사능, 형광 염료, 검출가능한 생성물 형성을 촉매할 수 있는 효소를 포함한다. 따라서, 프로브는 다른 동물 공급원으로부터 DNA 상보성 카피를 분리하거나 이러한 공급원에서 관련 서열을 스크리닝하는데 유용하다.
본 명세서에 개시된 특정 핵산 서열과 하이브리드화하는 핵산 서열에 있어서, 하이브리드화는 감소된 엄격 조건, 중간정도의 엄격 조건 또는 엄격한 조건 하에서 수행될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 하이브리드화의 예로서, 고정되고 변성된 핵산을 함유하는 중합체 막을 0.9M NaCl, 50mM NaH2PO4, pH7.0, 5.0mM Na2EDTA, 0.5% SDS, 10X Denhardt's 및 0.5㎎/㎖ 폴리리보아데닐산으로 구성된 용액에서 45℃에서 30분간 먼저 예비하이브리드화한다. 이어서, 약 2×107cpm(비활성 4-9×108cpm/㎍)의32P 단부-표지된 올리고뉴클레오티드 프로브를 용액에 첨가한다. 12-16시간 항온처리한 후, 0.5% SDS를 함유하는 1×SET(150mM NaCl, 20mM 트리스 염산염, pH7.8, 1mM Na2EDTA)에서 실온에서 30분동안 막을 세척하고나서, 올리고뉴클레오티드 프로브에 대해 Tm-10℃에서 새로운 1×SET에서 30분 세척한다. 이어서 막을 방사선사진 필름에 노출하여 하이브리드화 신호를 검출한다.
본 발명의 핵산 분자는 피타제 유전자 생성물(예, 피타제 RNA 및 피타제 폴리펩티드)을 생산하는 표준 방법에 있어서 주형으로 사용될 수 있다. 게다가, 피타제 폴리펩티드(및 그 단편)를 암호화하는 핵산 분자 및 관련된 핵산 - 예컨대 (1) 피타제 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 또는 그 단편(예, 12, 15, 20 또는 25개 이상의 뉴클레오티드를 함유하는 단편)과 상보성이 있거나 또는 하이브리드하는 서열을 함유하는 서열; 및 (2) 피타제 폴리펩티드를 암호화하는 핵산과 상보적인 서열 또는 그 단편과 하이브리드하는 서열을 함유하는 핵산-을 그 하이브리드화 특성에 촛점을 둔 방법에 사용할 수 있다. 예를들면, 본 명세서에 더욱 자세히 기술한 바와 같이, 이러한 핵산 분자는 하기 방법에 사용할 수 있다: 피타제 핵산을 합성하는 PCR 방법, 샘플 내 피타제 핵산의 존재를 검출하는 방법, 신규 피타제 부류 일원을 암호화하는 핵산을 확인하기 위해 스크리닝하는 방법. 하이브리드화에 기초한 용도는 서던-타입, 노던-타입, RNA 보호 및 임의의 하이브리드화 공정을 포함하며, 핵산은 하이브리드화 파트너로서 사용한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드의 단편 또는 일부를 사용하여 본 발명의 전길이 폴리뉴클레오티드를 합성할 수 있다. 따라서, 본 발명의 효소의 단편 또는 일부를 사용하여 펩티드 합성에 의한 해당 전길이 효소를 생산할 수 있다; 따라서, 단편은 전길이 효소를 생산하기 위한 중간체로서 사용할 수 있다. 문헌(예, Goeddel et al., 1980)에 기술된 바와 같이 절단된 단편의 크기별 분리는 통상 8% 폴리아크릴아미드 젤을 사용하여 수행한다.
6.3.15- 지정 진화에서의 용도:본 발명은 지정 진화에서 사용하는 효소, 그 단편, 다른 유도체 및 유사체 및 해당 뉴클레오티드를 제공한다. 본 명세서에 기술된 바와 같은 다수 주형의 발견 및 사용은 단일 주형 단백질의 지정 진화와 비교하여 지정 진화의 가능성 있는 수율을 상당히 증가시킬 수 있다. 따라서, 발견 필요성은 자연이 분자 분류들 중 구별되나 관련있는 일원들에 있어서 잠재적으로 성취할 수 없거나 예상할 수 없는 특성들의 보고를 제공하여 이들 특성의 개발이 훨씬 지정 진화를 용이하게 한다라는 전제에 기초한 것이다. 따라서, 일면에서, 관련있으나 구별되는 분자는 원하는 특성의 지정 진화에 유일한 시작 주형으로서 역할을 할 수 있다. 또다른 일면에서, 이들은 비제한적으로 다양한 공통 모티프들을 포함하는 구조-기능 정보의 저장실로서 역할할 수 있다. 양 유용성은 임의의 주어진 분자 상에서 과도하게 광범위한 돌연변이성 치환을 동시 개발하는 논리적으로 비현실적인 작업을 제거하도록 조력한다. 예를들면, 100개의 아미노산 단백질 상에서의 전범위 돌연변이성 치환은 (각 위치에 20개의 아미노산 가능성이 있다는 것을 가정하면) 10130이상의 가능성을 포함하며, 이 수는 너무 커서 현실적으로 고려될 수 없다.
따라서, 특히 논리적 그리고 기술적 제한 때문에, 이전에 진화된 차이를 보유하는 다수의 관련 시작 주형을 발견하고 이용하는 것은 "지정 진화"를 수행하는데 있어서 바람직한 접근법이다. 이어서, 이들 주형은 비제한적인 예로서 DNA 돌연변이유발 및 순열조합의 효소 발달을 포함하는 다양한 돌연변이유발 조작을 수행할 수 있으며, 이 접근법은 공계류중인 USPN 5,830,696(Short et al.)에 자세히 설명되어 있다.
이어서, 비제한적인 예로서 a) 분자 생물학적패닝(biopanning); b) 재조합 클론 스크리닝; 및 c) 추출물 스크리닝을 포함하는 각종 방법에 의해 생성된 신규 분자의 효소 활성을 스크리닝할 수 있다.
6.3.16- 항체 생산에서의 용도:본 발명은 항체를 생산하기 위한 면역원으로서 사용할 수 있는 효소, 그 단편, 이들의 다른 유도체 및 유사체 및 이들을 발현하는 세포를 제공한다. 이들 항체는 예를들면, 다클론성 항체 또는 단클론성 항체일 수 있다. 또한, 본 발명은 키메라, 단일쇄, 및 인간화된 항체들 뿐만아니라, Fab 단편 또는 Fab 발현 라이브러리의 산물을 포함한다. 당업계에 알려진 다양한 공정을 사용하여 이러한 항체 및 단편을 생산할 수 있다.
본 발명의 서열에 해당하는 효소에 대해 형성된 항체는 효소를 동물에 직접 주입하거나 효소를 동물(바람직하게는 비인간)에게 투여함으로써 얻을 수 있다. 이렇게 얻은 항체는 이어서 그 자체가 효소에 결합할 것이다. 이러한 방식으로, 효소의 오직 한 단편만을 암호화하는 서열조차도 전체 천연 효소에 결합하는 항체를 생성시키는데 사용할 수 있다. 이러한 항체는 이어서 이 효소를 발현하는 세포로부터 효소를 분리하기 위해 사용할 수 있다.
단클론성 항체를 제조하기 위해, 연속적인 세포계 배양에 의해 생산되는 항체들을 제공하는 임의의 기법을 사용할 수 있다. 예로는 하이브리드도마기법(Kohler and Milstein, 1975), 트리오마 기법, 사람 B-세포 하이브리도마 기법(Kozbor et al., 1983), 및 사람 단클론성 항체를 생산하는 EBV-하이브리도마 기법(Cole et al., 1985, pp.77-96)을 포함한다.
단일 쇄 항체의 생산에 대해 기술된 기법(USPN 4,946,778 Ladner et al.)을 응용하여 본 발명의 면역원성 효소 산물에 대한 단일 쇄 항체를 생산할 수 있다. 또한, 트랜스제닉 마우스를 사용하여 본 발명의 면역원성 효소 산물에 대한 인간화된 항체를 발현시킬 수 있다.
본 발명의 효소에 대해 생성된 항체는 다른 유기체 및 샘플로부터 유사한 효소를 스크리닝하는데 사용할 수 있다. 이러한 스크리닝 기법은 당업계에 잘 알려져 있다. 또한, 항체는 동일 또는 다른 유기체로부터 생성된 유전자 라이브러리를 스크린하기 위한 프로브로 사용하여, 이것 또는 교차 반응 활성을 확인할 수 있다.
전술한 시스템에서 생산되는 폴리펩티드는 특정 시스템에 적당한 종래 방법을 사용하여 분리 및 정제할 수 있다. 예를들면, 제조성 크로마토그래피 및 항체(단클론성 또는 다클론성 항체)를 사용한 면역학적 분리법을 사용할 수 있다.
전술한 바와 같이, 피타제-특이 항체를 생산하는데 사용할 수 있는 항원은 피타제 폴리펩티드, 예컨대 도1a와 1b에 도시된 임의의 피타제, 폴리펩티드 단편을 포함한다. 동물을 면역시키기 위해 사용된 폴리펩티드 또는 펩티드는 표준 재조합, 화학적 합성 또는 정제 방법에 의해 수득할 수 있다. 당업계에 잘 알려진 바와 같이, 면역원성을 증가시키기 위해, 항원을 담체 단백질에 접합시킬 수 있다. 통상 사용되는 담체는 키홀 림펫헤모시아닌(KLH), 티로글로불린, 소혈청 알부민(BSA),및 파상풍 유독소를 포함한다. 쌍을 이룬 펩티드는 이어서 동물(예, 마우스, 래트, 또는 토끼)을 면역화하기 위해 사용한다. 이러한 담체에 부가하여, 잘 알려진 보조체를 항체와 함께 투여하여 강한 면역 반응 유도를 용이하게 할 수 있다.
피타제-특이 다클론성 및 단클론성 항체는 예를들면, 피타제 폴리펩티드(예 항체가 형성된 피타제 폴리펩티드 또는 그 단편)를 함유한 매트릭스에 결합시키고 이 매트릭스로부터 추출시킴으로써 정제할 수 있다. 항체 정제 및 농축화에 대한 부가적인 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 본 발명의 피타제-특이 항체와 함께 수행할 수 있다(예, Coligan et al., 1996 참조).
피타제-특이 항원에 대응하는 항-이디오타입 항체도 본 발명에 포함되어 있으며, 표준 방법을 사용하여 생산할 수 있다. 이들 항체는 피타제-특이 항체에 대해 생성되고 따라서 피타제-특이 에피토프를 모방한다. 본 발명은 또한 하나이상의 피타제-특이 활성 또는 에피토프를 보유하는 피티제 폴리펩티드 단편의 부가적인 사용을 포함한다. 피타제 활성은 이노시톨 및 유리 인에 대한 피테이트의 촉매반응을 검사함으로써 분석할 수 있다. 이러한 단편은 도1a와 1b에 나타난 피타제의 서열과 비교함으로써 쉽게 확인될 수 있다.
비제한적 실례에서, 예컨대 8-10개 이상의 아미노산을 함유하는 피타제 폴리펩티드 단편을 피타제-특이 항체 생산에 있어서 면역원으로 사용할 수 있다. 이 단편은 예를들면, 피타제에 보존되어 있는 아미노산을 함유할 수 있으며, 이 아미노산 서열은 피타제에 보존되어 있는 아미노산을 함유할 수 있다. 또다른 비제한적 실례에서, 전술한 피타제 단편은 샘플 내 피타제-특이 항체의 존재를 검출하기 위한 ELISA와 같은 면역분석법에 사용할 수 있다.
6.3.17- 트랜스유전학에서의 용도
본 발명의 트랜스제닉 마우스를 생산하기 위해 각종 방법을 사용할 수 있다. 일반적으로 말하자면, 3가지 방법이 사용될 수 있다. 제1 방법은 전핵 단계에서의 배("단세포 배")를 여성으로부터 수집하고 트랜스유전자를 배 안으로 미세주입하면, 이 경우 트랜스유전자가 결과물인 성숙한 동물의 생식세포 및 체세포 모두의 염색체로 삽입될 것이다. 제2 방법에서, 배 간세포를 분리하고 여기에 일렉트로포레이션, 혈장 형질감염 또는 미세주입을 통해 트랜스유전자를 삽입시킨 후, 간세포를 배 내로 다시 도입시켜, 여기서 전이증식되고 배선에 기여한다. 포유류 종의 미세주입 방법은 미국특허 제4,873,191호에 기술되어 있다. 제3 방법에서, 배 세포를 트랜스 유전자 함유 레트로바이러스로 감염시키면, 여기서 배의 초기배세포는 트랜스유전자가 그 염색체내로 삽입된다. 트랜스젠화할 동물이 조류일 때, 조류의 수정된 난자는 통상 처음 20시간동안 난관에서 세포분열하기 때문에, 수정된 난자의 전핵 안으로 미세주입하는 것은 전핵의 불근접성 때문에 문제가 있다. 따라서, 전술한 통상의 트랜스젠 동물의 생산 방법 중 레트로바이러스 감염이 조류 종에서는 바람직하다. 예를들면, 미국특허 제5,162,215호에 기재되어 있다. 그러나, 조류 종에 미세 주입을 사용한다면, 문헌[Love et al., Biotechnology, 12, Jan 1994]에 의해 공개된 공정을 이용할 수 있으며, 여기서 배는 이전에 낳은 난자를 산란하고 대략 2.5 시간 후에 희생된 암탉에게서 얻으며, 트랜스 유전자는 초기배 디스크의 원형질 안으로 미세주입하고 성숙할 때까지 숙주 외피 내에서 배를 배양한다. 트랜스젠화할 동물이 소 또는 돼지인 경우, 미세주입은 난자의 불투명성에 의해 저지되어, 종래 감별 간섭-대조 현미경(differential interference-contrast microscopy)에 의해 핵을 확인하기 어렵게 할 수 있다. 이러한 문제점을 극복하기 위해 난자는 먼저 원심분리하여 더 우수한 가시화를 위해 전핵을 분리시킬 수 있다.
본 발명의 "비사람 동물"은 소(bovine), 돼지(porcine), 양(ovine) 및 조류(avian) 동물을 포함한다(예, 소(cow), 돼지(pic), 양(sheep), 닭(chicken)). 본 발명의 "트랜스젠 비사람 동물"은 "트랜스유전자"를 비사람 동물의 배선 안으로 도입시킴으로서 생산된다. 다양한 발달 단계에서의 배 표적 세포를 사용하여 트랜스유전자를 도입할 수 있다. 배 표적 세포의 발달 단계에 좌우되어 상이한 방법을 사용한다. 접합체는 미세주입을 위한 최선의 표적이다. 유전자 전이의 표적으로 접합체를 사용하는 것은 주입될 DNA가 최초 난할 이전에 숙주 유전자 안으로 삽입될 대부분의 경우 주요 장점을 갖는다(Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4438-4442, 1985). 결론적으로, 트랜스젠 비사람 동물의 모든 세포는 삽입된 트랜스유전자를 운반할 것이다. 이것은 일반적으로 50%의 생식세포가 트랜스유전자를 보유하기 때문에 시조의 자손으로 트랜스유전자가 효과적으로 전파되는 것을 반영할 것이다.
"트랜스제닉"의 용어는 외인성 유전자 물질을 모든 세포 안에 포함하는 동물을 기술할 때 사용한다. "트랜스제닉" 동물은 재생산에 사용된 세포 내에 외인성 유전자 물질을 포함하는 2개의 키메라 동물을 교배함으로써 생산할 수 있다. 그 결과 형성된 자손 중 25%가 트랜스제닉, 즉 양 대립유전자에 모든 세포 내 외인성 유전자 물질이 포함된 동물일 것이고, 그 결과 형성된 동물 중 50%는 하나의 대립유전자 안에 외인성 유전자 물질이 포함될 것이며, 25%는 어떠한 외인성 유전자 물질을 포함하지 않을 것이다.
본 발명의 수행에 유용한 미세주입 방법에 있어서, 트랜스유전자를 분해시키고, 예컨대 젤 전기영동을 통해 임의의 벡터 DNA로부터 유리 형태로 정제한다. 트랜스유전자는 전사에 관여하는 세포성 단백질과 상호작용하는 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 것이 바람직하며, 결국 구성적으로 발현된다. 이러한 관점에서 유용한 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV), 몰로니 백혈병 바이러스(MLV) 및 헤르페스 바이러스로부터 나온 프로모터 뿐만아니라, 메탈로티오닌, 골격 액틴, P-엔올피루베이트 카르복실라제(PEPCK), 포스포글리세레이트(PGK), DHFR 및 티미딘 키나제를 암호화하는 유전자들로부터 나온 프로모터를 포함한다. 루우스 사르코마 바이러스 같은 바이러스의 말단의 긴 반복서열(LTR)용 프로모터를 포함할 수 있다. 트랜스젠화될 동물이 조류인 경우, 프로모터는 닭 β-글로빈 유전자, 닭 리소자임 유전자 및 조류 백혈증 바이러스용 프로모터가 바람직하다. 배 간세포의 플라스미드 형질감염에 유용한 구조물는 전사를 자극하는 인헨서 요소, 스플라이스 수용체, 종결 및 폴리아데닐화 신호 및 번역할 수 있게 하는 리보좀 결합 부위와 같은 당업계에 잘 알려진 부가적인 조절성 요소를 사용할 것이다.
또한, 레트로바이러스 감염을 사용하여 전술한 비사람 동물에게 트랜스유전자를 도입할 수 있다. 발달된 비사람 배를 포배 단계로 시험관내 배양할 수 있다. 이 기간 동안, 할구는 레트로바이러스 감염의 표적일 수 있다(Jaenich, R., Proc.Natl. Acad. Sci USA 73:1260-1264, 1976). 할구의 효과적인 감염은 투명대(zona pellucida)를 제거하는 효소 처리에 의해 수득된다(Hogan, et al.(1986) in Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). 트랜스유전자를 도입하는데 사용되는 바이러스 벡터 시스템은 통상 트랜스유전자를 운반하는 복제-불능의 레트로바이러스이다(Jahner, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6927-6931, 1985; Van der Putten, et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 82:6148-6152, 1985). 바이러스 생산 세포의 단층 상에 할구를 배양함으로써 용이하고 효과적으로 형질감염시킬 수 있다(Van der Putten, 상기문헌; Stewart, et al., EMBO J. 6:383-388, 1987). 별법으로, 감염은 후기 단계에서 수행될 수 있다. 바이러스 또는 바이러스-생산 세포를 포배강 안으로 주입할 수 있다(D. Jahner et al., Nature 298:623-628, 1982). 대부분의 시조는 트랜스유전자가 모자이크일 것이다. 왜냐하면, 트랜스젠닉 비사람 동물을 형성하는 삽입은 오직 한 서브세트의 세포들에서만 발생하기 때문이다. 게다가, 시조는 통상 자손에서 분리될 게놈 안에 상이한 위치에서 트랜스유전자의 다양한 레트로바이러스 삽입체를 함유할 수 있다. 게다가, 효율이 낮기는 하지만 임신중기(midgestation) 배아를 자궁내 레트로바이러스 감염시킴으로써 배선 안으로 트랜스유전자를 도입시킬 수 있다(D. Jahner et al., 상기 문헌).
트랜스유전자 삽입의 표적 세포의 제3유형은 배 간세포(ES)이다. ES 세포는 시험관내 배양된 사전-이식 배로부터 수득하고 배와 융합된다(M.J.Evans et al., Nature 292:154-156, 1981; M.O.Bradley et al., Nature 309:255-258, 1984;Gossler, et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 83:9065-90069, 1986; 및 Robertson et al., Nature 322:445-448, 1986). 트랜스유전자는 DNA 형질감염 또는 레트로바이러스-매개성 형질도입에 의해 ES 세포내로 효과적으로 삽입될 수 있다. 이렇게 형질전환된 ES 세포는 이후 비사람 동물로부터 나온 포배와 결합될 수 있다. ES 세포는 이후 배를 전이증식하고 결과로 형성되는 키메라 동물의 배선에도 영향을 준다(Jaenisch, R., Science 240:1468-1474, 1988 참조).
"형질전환(transformed)"이란 재조합 핵산 기법에 의해 이질성 핵산 분자가 삽입된 세포(또는 그 선조 세포에 이질성 핵산 분자가 삽입된 세포)를 의미한다. "이질성"이란 다른 종으로부터 유래한 핵산서열이나, 원래형태 또는 세포내 본래 발현되는 형태를 변형시킨 핵산을 의미한다.
"트랜스유전자"는 책략에 의해 세포내 삽입되고 그 세포로부터 발달된 유기체의 게놈의 일부가 되는(즉, 안정하게 삽입되거나 또는 안정한 염색체외 요소로서) 임의 조각의 DNA를 의미한다. 이러한 트랜스유전자는 트랜스제닉 유기체에 부분 또는 전부가 이질성(즉, 외래성)인 유전자를 포함할 수 있거나 유기체의 내인성 유전자와 유전자 동종성을 나타낼 수 있다. DNA로 전사되고 이어서 게놈 안으로 삽입되는 RNA 서열을 제공함으로써 생성된 트랜스유전자는 이 정의의 범위 내에 포함된다. 본 발명의 트랜스유전자는 피타제 또는 피타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열을 포함하며, 트랜스제닉 비사람 동물에서 발현될 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 명세서에 사용된 "트랜스제닉" 용어는 부가적으로 초기 배또는 수정된 난자의 시험관내 조작에 의해 또는 특이 유전자 녹아웃을 유도하는 임의의 트랜스제닉 기법에 의해 변경된 게놈을 갖는 임의의 유기체를 포함한다. 본 명세서에 사용된 "유전자 녹아웃"은 당업계에 익숙한 임의의 트랜스제닉 기법에 의해 달성되는 것으로 기능이 완전히 상실되도록 유전자를 표적화하여 생체내 파괴하는 것을 의미한다. 일 구체예에서, 유전자가 녹아웃된 트랜스제닉 동물은 표적 유전자가 동종성 재조합에 의해 비기능화시키고자 하는 유전자에 표적화된 삽입에 의해 유전자가 비기능화되어진 동물이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "트랜스제닉" 용어는 삽입된 트랜스유전자를 운반하는 유기체 또는 내인성 유전자가 비기능화 또는 "녹아웃"된 것을 운반하는 유기체를 생산할 수 있는, 당업자에게 익숙한 임의의 트랜스제닉 기법을 포함한다.
본 발명의 실행에서 사용된 트랜스유전자는 피타제 또는 피타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는 DNA 서열이다. 일 구체예에서, 서열번호 1에 설명한 서열 또는 서열번호 2에 설명한 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드는 본 명세서에서 정의된 용어와 같은 트랜스유전자이다. 적절한 경우, 피타제 활성을 갖는 단백질을 암호화하나 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 핵산 서열이 상이한 DNA 서열도 본 명세서에서 사용할 수 있으며, 끝이 절단된 형태, 대립유전자 변이체 및 종간 동종체도 사용할 수 있다.
배를 미세주입하거나, 형질감염된 배 간세포로 전이증식하거나 트랜스유전자를 함유하는 레트로바이러스로 감염시킨(본 명세서에서 소개한 조류 종에 있어서 본 발명의 실행은 제외) 후, 가임신된 암컷의 난관 안으로 배를 이식한다. 형성된 자손은 트랜스유전자 특이 프로브를 사용하여 혈액 또는 조직 샘플에 대해 서던블럿 분석함으로써 트랜스유전자의 삽입에 대해 시험한다. 특히 이러한 관점에서 PCR이 유용하다. 양성 자손(G0)을 교배하여, 조직 샘플의 노던블럿 분석에 의해 트랜스유전자 발현에 대해 분석할 자손(G1)을 생산한다.
따라서, 본 발명은 트랜스제닉 동물에서 인 섭취를 증가시키고/시키거나 트랜스제닉 유기체의 분뇨에서 오염물질의 양을 약 15%, 통상 약 20%, 더욱 일반적으로 약 20% 내지 약 50% 감소시키는 방법을 포함한다.
본 발명의 실행에 사용되는 것으로 예상되는 동물은 애완 동물(예, 개, 고양이, 조류 종 등)을 포함하는 가축용 동물로 통상 여겨지는 동물 또는 식품 프로세싱에 유용한 동물(예, 육류제공용으로 키우고 산란하는 닭 및 칠면조와 같은 조류, 양과 같은 양류, 소고기용 소 및 젖소와 같은 소, 물고기, 돼지)이다. 본 발명의 목적을 위해, 이들 동물은 이질성 DNA 서열 또는 상기 동물에 정상적으로 내인성인 하나이상의 부가적인 DNA 서열(본 명세서에서는 총체적으로 "트랜스유전자"로 지칭함)을 동물의 생식세포 내 염색체로 삽입한 동물일 때 "트랜스제닉"으로 지칭된다. 트랜스제닉 동물(그 자손도 포함)은 또한 체세포의 염색체 안으로 트랜스유전자가 우발적으로 삽입될 것이다.
6.3.18- 유전자 운반에서의 용도.
몇몇 예의 경우, 본 발명의 피타제 서열을 국부적으로(예, 특정 조직 또는 세포 유형에서) 운반 및 발현시키는 것이 이로울 수 있다. 예를들면, 동물 장 내 피타제 또는 소화 효소의 국부적인 발현은 예컨대, 피타제 및 인 각각의 소화 및 섭취에 조력할 것이다. 핵산 서열은 직접 예컨대 침샘, 침 조직 및 세포에 및/또는장 표면 상피세포에 운반할 수 있다. 이러한 운반은 당업계에 알려져 있으며 일렉트로포레이션법, 바이러스 벡터 및 직접적인 DNA 섭취를 포함한다. 피타제 활성을 갖는 임의의 폴리펩티드를 본 발명의 방법(예, 본 명세서 중 서브섹션 6.3.18뿐만아니라 본 발명 중 다른 섹션에서 특별히 기술한 것들)에 사용할 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 핵산 구조물는 숙주 조직 내 표적 세포 안으로 섭취하는데 적절한 형태의 핵산 분자를 포함할 것이다. 핵산은 나체(bare) DNA 또는 RNA 분자의 형태로 있을 수 있으며, 여기서 분자는 하나이상의 구조 유전자, 하나이상의 조절성 유전자, 안티센스 가닥, 삼중 가닥을 형성할 수 있는 가닥 등을 포함할 수 있다. 통상, 핵산 구조물는 적절한 조절성 영역의 전사 및 번역 조절 하에 하나이상의 구조 유전자를 포함할 것이다. 더욱 일반적으로, 본 발명의 핵산 구조물는 형질감염 효율을 향상시키기 위한 운반 매체에 핵산이 삽입되어 있을 것이며, 여기서 운반 매체는 건조 소수성 부형제 물질을 포함하는 더큰 입자 내에 분산될 것이다.
이러한 운반 매체는 바이러스 벡터(예, 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노 관련 바이러스)를 포함하여, 이 바이러스 벡터는 자가복제가 방해되도록 불활성화되어 있으나 표적 숙주 세포에 결합하고 표적 숙주 세포의 세포질 내로 유전 물질을 운반하며 입자 내로 혼입된 구조 유전자 또는 다른 유전자의 발현을 촉진하는 본래의 바이러스 능력을 유지한다. 매개성 유전자 전이에 적절한 레트로바이러스 벡터는 문헌[Kahn et al.(1992) CIRC. RES. 71:1508-1517, 본 명세서에 인용되어 있음]에 기재되어 있다. 적절한 아데노바이러스 유전자 운반은 문헌[Rosenfeldet al.(1991) SCIENCE 252:431-434, 본 명세서에 인용되어 있음]에 기재되어 있다. 레트로바이러스 및 아데노바이러스 운반 시스템은 모두 문헌[Friedman (1989) SCIENCE 244:1275-1281, 본 명세서에 인용되어 있음]에 기재되어 있다.
핵산 운반 매체의 제2 유형은 리포좀 형질감염 소포를 포함하며, 이 매체는 음이온 및 양이온 리포좀 구조물 모두를 포함한다. 음이온 리포좀의 사용시 핵산은 리포좀 내 포획되어야 한다. 양이온 리포좀은 핵산 포획화가 필요하지 않으며, 대신 핵산 및 리포좀을 단순히 혼합함으로써 형성될 수 있다. 양이온 리포좀은 왕성하게 음전하를 띤 핵산 분자(DNA 및 RNA 모두 포함)에 결합하여, 많은 세포 유형에서 적당한 형질감염 효율을 제공하는 복합체를 산출한다. 문헌[Farhood et al.(1992) BIOCHEM. BIOPHYS. ACTA. 1111:239-246, 본 명세서에 인용되어 있음]을 참조. 리포좀 소포를 형성하는데 특히 바람직한 물질은 문헌[Felgner and Ringold(1989) NATURE 337:387-388, 본 명세서에 인용되어 있음]에 기술된 디올레일포스파티딜 에탄올아민(DOPE) 및 디올레일옥시프로필-트리에틸암모늄(DOTMA)의 동몰 혼합물로 구성된 리포펙틴이다.
또한, 이들 두 유형의 운반 시스템을 결합할 수 있다. 예를들면, 문헌[Kahn et al.(1992), 상기 문헌]은 레트로바이러스 벡터가 양이온 DEAE-덱스트란 소포에 결합하여 형질전환 효율을 더 강화시킬 수 있다는 것을 교시한다. 또한, 바이러스 및/또는 리포좀 운반 소포 안으로 핵 단백질을 삽입시켜 형질감염 효율을 더욱 향상시킬 수 있다. 문헌[Kaneda et al.(1989) SCIENCE 243:375-378, 본 명세서에 인용되어 있음]을 참조.
6.3.19 - 음식 보조제에서의 용도.
또다른 구체예에서, 단독의 활성 성분으로써 또는 하나이상의 제제 및/또는 효소와의 조합물로서 효소를 함유하는 소화 보조제를 제공한다(공계류중인 미국특허출원 제--호, 제목 "Dietary Aids and Methods of Use Thereof", 2000. 5. 25. 출원. 본 명세서에 인용되어 있음). 가축 동물의 소화 보조제에 효소 및 다른 제제를 사용하면, 동물의 건강 및 수명을 향상시킬 뿐만아니라 가축의 건강 증진 및 가축으로부터 식품 생산을 보조한다.
현재, 몇몇 유형의 가축용 먹이(예, 특정 돼지 먹이)는 다수의 미네랄(예, 무기 인), 효소, 성장 인자, 약물 및 가축에의 운반을 위한 다른 제제가 매우 높게 보충되어 있다. 이들 보충물은 예를 들면, 다수의 칼로리 및 곡물 내 존재하는 천연 영양분을 대체한다.
무기 인 보충물 및 기타 보충물(예, 미량의 미네랄 염, 성장 인자, 효소, 항생제)을 먹이로부터 감소 또는 제거함으로써, 먹이는 더 많은 영양분 및 에너지를 운반할 수 있다. 따라서, 잔여 음식물이 더 유용한 에너지를 함유한다. 예를들면, 곡물-오일종자(oilseed) 음식물은 통상 음식물 1kg 당 약 3,200kcal 대사가능 에너지를 함유하고, 미네랄 염은 대사가능한 에너지를 제공하지 않는다. 불필요한 미네랄을 제거하고 곡물로 대체함으로써 음식물 내 유용한 에너지를 증가시키다. 따라서, 본 발명은 통상 사용되는 피타제 함유 먹이와 구별될 수 있다. 예를들면, 일 구체예에서, 생물학적 적합성이 있으며 유기체의 위장관에 의한 소화에 내성이 있는 물질을 사용할 수 있다.
예컨대, 돼지 또는 새(예, 닭, 칠면조, 거위, 오리, 앵무새, 공작, 타조, 꿩, 메추라기, 비둘기(pigeon), 에뮤, 키위, 아비, 코카틸 앵무새, 코카투, 카나리아, 펭귄, 홍학 및 비둘기(dove)를 포함하는 다수의 유기체에서, 소화관은 생물학적 적합성이 있는 견고한 물체(예, 바위 또는 갑각류의 껍질)를 저장 및 사용하는 내장(gizzard)을 포함하여, 종자 또는 새들에 의해 소비되는 다른 종자를 소화시키는데 도움을 줄 수 있다. 이러한 일반적인 부류의 유기체의 통상적인 소화관은 모이주머니라고 지칭되고 낭을 함유하는 식도를 포함하며, 여기서 음식이 단기간동안 저장된다. 모이주머니로부터 음식이 진정한 위 또는 전위 안으로 하방이동하고, 여기서 염산 및 펩신은 소화 공정을 시작한다. 다음, 음식은 타원형이고 강력한 근육으로 두터운 벽을 갖는 내장으로 이동한다. 내장의 주요 기능은 음식물 입자들을 갈고 부수는 것이다 - 소량의 미세자갈 또는 모래알을 삼키는 새에 의해 보조되는 프로세스. 내장으로부터 음식물은 십이지장으로 이동한다. 새의 소장은 포유류와 유사하다. 두개의 블라인드 낭 또는 맹장이 있으며 소장과 대장의 연결점에 약 4-6인치의 길이이다. 대장은 짧고, 대부분 길이가 약 3-4인치인 직장으로 구성되어 있다. 직장은 배설강안으로 비우고 대소변은 항문을 통해 배출된다.
내장에 존재하고 내장에서 소비(또는 도입)되는 생물학적 적합성 있는 견고한 물체는 다양한 효소학적, 화학적, 치료적 및 항생제 제제를 운반하는 유용한 벡터를 제공한다. 이들 견고한 물질은 몇 시간 내지 몇일의 수명을 갖으며 일정 기간 이후 통과된다. 따라서, 본 발명은 유기체에 유용한 소화 또는 치료 제제를 운반하는 피복 및 주입형(예, 주입된 매트릭스 및 막)의 변형 소화 보조제를 제공한다.이러한 소화 보조제는 통상 유기체에 의해 섭취되어 내장 안에서 소화를 보조하는 물체(예, 돌 또는 모래알)를 포함한다. 본 발명은 유기체의 소화 보조에 유용하거나 치료 또는 의학 제제 또는 화학물질을 운반하는 제제를 그 위에 피복되거나 그 안에 주입된 생물학적 적합성이 있는 물체를 제공한다.
제1 구체예에서, 본 발명은 식사 보조제를 제공하며, 이는 소화를 도와주는 제제의 방출을 위해 고안된 생물학적 적합성이 있는 조성물이고, 이때 생물학적 적합성이 있는 조성물은 유기체의 소화관(예, 내장)에서 경구적 소비 및 방출하도록 고안된다. "생물학적 적합성이 있는"은 숙주 유기체(예, 새)와 접촉시 물질이 물질에 대한 거부반응을 산출하거나 물질을 실시불가능하게 하기에 충분한 유해 반응을 나타내지 않는다는 의미이다. 이러한 실시불가능은 예를들면, 숙주 유기체에 주입된 제제가 확산되는 것을 제한하는 물질 또는 독성이나 감염 때문에 유기체 내 사망율 또는 이환율의 증가를 산출하는 물질 주위에 섬유(fibrotic) 구조를 형성시킴으로써 일어날 수 있다. 생물학적 적합성이 있는 물질은 생분해가능하지않거나 생분해가능할 수 있다. 일 구체예에서, 생물학적 적합성이 있는 조성물은 위장관에 의한 분해 또는 소화에 내성이 있다. 또다른 구체예에서, 생물학적 적합성이 있는 조성물은 돌 또는 암석의 굳기를 갖는다.
본 발명에 유용한 생분해가능하지 않은 물질은 음식 제제의 부착 또는 주입을 허여하는 물질이다. 이렇게 생분해가능하지 않은 물질은 예를들면 아크릴, 모다크릴, 폴리아미드, 폴리카보네이트, 폴리에스테르, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리술폰, 폴리에테르술폰 및 폴리비닐이덴 플루오라이드 같은 열가소성수지를 포함한다. 엘라스토마 또한 유용한 물질이며, 예를들면 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리우레탄, 폴리비닐 알콜 및 실리콘(예 실리콘계 또는 실리콘 함유 실리카)을 포함한다. 본 발명은 생물학적 적합성이 있는 조성물이 다수의 이러한 물질들을 함유할 수 있으며, 예를들면, 혼합 또는 층분리되어 혼합물, 공중합체 또는 이의 조합물일 수 있다는 것을 제공한다.
본 명세서에 사용된 "생분해가능한" 물질은 조성물이 생체내 침식 또는 분해되어 더 작은 화학물질 종을 형성한다는 것을 의미한다. 분해는 예를들면, 효소학적, 화학적 또는 물리적 프로세스에 의해 발생할 수 있다. 본 발명에 사용되는 것으로 생각될 수 있는 적절한 생분해가능한 물질은 폴리(락티드), 폴리(글리콜리드), 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 폴리무수물, 폴리오르토에스테르, 폴리에테르에스테르, 폴리카프로락톤, 폴리에테르아미드, 폴리카보네이트, 폴리시아노아크릴레이트, 폴리우레탄, 폴리아크릴레이트를 포함한다. 이러한 물질은 혼합 또는 층분리되어 혼합물, 공중합체 또는 이의 조합물을 형성할 수 있다.
생물학적 적합성이 있는 다수의 상이한 물질들이, 동일한 유기체에 동시에 또는 각종 조합으로(예, 한 물질씩 차례로) 섭취 또는 제공될 수 있다. 게다가, 생물학적 적합성이 있는 물질은 소화관을 느린속도로 통과하도록 고안할 수 있다. 예를들면, 큰 물질이나 지방성 물질은 소화관을 더 느리게 이동하는 경향이 있으므로, 소화관에서 신속한 통과를 저해하는 크기가 큰 생물학적 적합성이 있는 물질을 사용할 수 있다. 이러한 큰 물질은 생분해가능하지않거나 생분해가능한 물질의 조합일 수 있다. 예를들면, 작은 크기의 생분해가능하지 않은 물질은 생분해가능한물질에 의해 포위되어 일정기간에 걸쳐 생분해가능한 부위가 분해되어 생분해가능하지 않은 부위가 소화관을 통과하도록 할 수 있다. 게다가, 임의의 다수 향신료를 제공하여 생물학적 적합성이 있는 물질의 소비에 조력할 수 있다.
임의의 다수 제제는 단독 또는 다른 제제와의 조합물로, 폴리펩티드(예, 효소, 항체, 사이토킨 또는 치료 소분자) 및 항생제를 예로 포함하는 생물학적 적합성이 있는 물질 상에 피복될 수 있다. 특히 유용한 제제의 예는 하기 표 1 및 2에 나열되어 있다. 또한 세포는 본 발명의 생물학적 적합성이 있는 물질 안으로 포획되고 효소 또는 치료제를 운반하는데 사용될 수 있다고 예상된다. 예를들면, 다공성 물질은 세포가 그 안에서 성장하기에 충분한 크기의 공극을 갖고 이들 다공성 물질이 이어서 소화관에 흡수되도록 고안될 수 있다. 예를들면, 생물학적 적합성이 있는 물질은 다수의 세포 유형에 지원을 제공하는 다수의 미생물상 환경(예 상이한 다공성, pH 등)으로 구성될 수 있다. 세포는 유전적으로 조작되어 특정 약물, 효소 또는 화학물질을 유기체로 운반시킬 수 있다. 세포는 진핵세포 또는 원핵세포일 수 있다.
치료분류 화학물질 설명
항생제 아목시실린 및 그 배합물마스톡스 주사제 (아목시실린 및 클록사실린) 그램+ 및 그램- 박테리아에 의해 유발된 박테리아성 질병에 대한 치료.
앰피실린 및 그 배합물비올록스 주사제(앰피실린 및 클록사실린) 그램+ 및 그램- 박테리아에 의해 유발된 박테리아성 질병에 대한 치료.
니트로푸라존 + 우레아네프리아 볼러스 생식기 감염 치료.
트리메토프림 + 설파메톡사졸트리아졸 불러스 기도 감염, 위장관 감염, 요-생식 감염의 치료.
메트로니다졸 및 푸라졸리돈메토푸르 볼러스 박테리아 및 원충류 질병의 치료
프탈릴술파티아졸,펙틴 및 카올린펙톨린 볼러스 현탁액 박테리아 및 비특이적 설사, 세균성 이질 및 송아지 전염성설사증의 치료
항구충제 외기생충박멸제저멕스 연고(감마 벤젠 헥사클로라이드, 프로플라빈 헤미설페이트 및 세트리마이드) 외기생충박멸제 및 소독제
내기생충박멸제알벤다졸 및 그 배합물알벤(알벤다졸)현탁액(알벤다졸 2.5 %)플러스 현탁액(알벤다졸 5 %)포르테 볼러스(알벤다졸 1.5 g)정제(알벤다졸 600 Mg)분말(알벤다졸 5 %, 15 %) 회충, 촌충 및 흡충 감염의 예방 및 치료
알프라즈(알벤다졸 및 프라지퀀텔)정제 개와 고양이의 회충 및 촌충 감염의 예방 및 치료
옥시클로자나이드 및 그 배합물클로잔(옥시클로자나이드) 볼러스, 현탁액 흡충 감염의 예방 및 치료
테트잔(옥시클로자나이드 및 테트라미솔 염산) 볼러스, 현탁액 회충 및 흡충 감염의 예방 및 치료
풀루잔(옥시클로자나이드 및 레바미솔 염산) 볼러스, 현탁액 회충 감염의 예방 및 치료, 및 면역성 증가
레바미솔네마솔 주사제.웜닐 분말 회충 감염의 예방 및 치료, 면역성 증가
팬벤다졸펜졸정제(펜벤다졸 150 Mg)볼러스(펜벤다졸 1.5 g)분말(펜벤다졸 2.5 % w/w) 회충 및 촌충 감염의 예방 및 치료
강장제 비타민 B 복합체, 아미노산 및 간추출물 헵토젠 주사제 식욕부진, 간염, 무기력증, 신경발작, 쇠약 및 성장저해의 예방 및 치료
비타민 B12, 및 비타민 D3를 갖는 칼슘 레벌리네이트하이락틴 주사제 저칼슘혈증의 예방 및 치료, 질병 상태에서의 보조적 치료(특히 저온증) 및 구루병의 초기 단계 치료
동물 사료 보충물 필수 미네랄, 셀레늄 및 비타민 E지노락틴 볼러스 불임증을 유발하는 비발정기 치료 및 낙농 동물 및 말의 반복 교배
필수 미네랄, 비타민 E, 및 요오드하이락틴 주사제 불임, 부적합한 수유, 감소된 면역, 성장저해 및 무기력증
비타민 C 를 갖는 필수 전해질엘렉트라 - C 분말 설사, 탈수, 수송 전후, 극저온 또는 극고온 및 다른 스트레스 상황
피레녹스 플러스(디클로페낙 나트륨 + 파라세타몰)볼러스, 주사제 유방염의 치료, 외과적 통증 및 염증 후의 발열, 자궁의 탈출, 절름발이 및 관절염
치료용 제제
제품 내용
Acutrim(등록상표명)(페닐프로판올아민) 1일 1회 복용의 식욕 억제 정제
The Baxter(등록상표명)침제 항응고제, 항생제, 화학치료제 및 기타의 광범위한 용도의 약제의 조절된 정맥내 전달 용도
Catapres-TTS(등록상표명)(클로니딘 경피 치료 방식) 고혈압 치료용 주 1회의 경피 방식
Covera HSTM(베라파밀 염산) 고혈압 및 협심증 치료를 위한 1일 1회 (COER-24)조절-개시 연장- 방출 정제
DynaCire CR(등록상표명)(이스라디핀) 고혈압 치료를 위한 1일 1회 연장 방출 정제
Efidac 24(등록상표명)(클로페니라민 말레이트) 알러지 증후의 완화를 위한 1일 1회 연장 방출 정제
Estraderm(등록상표명)(에스트라디올 경피 방식) 특정 폐경기후 증후를 치료하고 골다공증을 예방하기 위한 1주당 2회의 경피 방식
Glucotrol XL(등록상표명)(글리피지드) 비-인슐린 의존성 당뇨병이 있는 환자의 과혈당증의 조절을 위한 섭생의 보조물로 사용되는 1일 1회의 연장 방출 정제
IVOMECSR(등록상표명)볼러스(이버멕틴) 소의 주요 내부 및 외부 기생충의 계절 지속형 조절을 위한 반추동물의 전달 방식
Minipress XL(등록상표명)(프라조신) 고혈압을 치료하기 위한 1일 1회의 연장 방출 정제
NicoDerm? CQTM(니코틴 경피 방식) 니코틴 제거 증후를 완화하기 위한 흡연 휴지기의 1일 1회 보조물로서 사용되는 경피 방식
Procardia XL(등록상표명)(니페디핀) 안지나 및 고혈압을 치료하기 위한 1일 1회의 연장 방출 정제
Sudafed(등록상표명) 24시 (수도에페드린) 감기, 정맥동염, 건초열 및 기타의 호흡기 알러지의 완화를 위한 1일 1회의 비강 충혈제거제
Transderm-Nitro(등록상표명)(니트로글리세린 경피 방식) 관상동맥증에 기인한 협심증의 예방을 위한 1일 1회의 경피 방식
Transderm-Scop(등록상표명)(스코폴아민 경피 방식) 운동 질환과 연관된 오심 및 구토를 예방하기 위한 경피 방식
Volmax(알부테롤) 복구성 장애 기도 질환이 있는 환자의 기관지경련의 완화를 위한 연장 방출 정제
Actisite(등록상표명) (테트라사이클린염산), 포켓 깊이를 감소시키기 위한 스칼링 및 루트 플래닝의 보조물 및 성인 치근막염이 있는 환자의 프로빙에 대한 출혈의 보조물로 사용되는 치근막 섬유
ALZET(등록상표명) 실험실 연구용 삼투압 펌프
Amphotec(등록상표명)(주사용 암포테리신 B 콜레스테릴 설페이트 복합체 ) AMPHOTEC(등록상표명)은 신장 손상 또는 비허용성 독성이 유효량의 암포테리신 B의 사용을 방해하는 경우의 환자에서 또한 사전적 암포테리신 B 치료가 실패한 경우의 침투성 아스페르질루스증이 있는 환자에서 침투성 아스페르질루스증에 대한 살진균성 치료법이다.
Bicitra(등록상표명)(시트르산나트륨 및 시트르산) 알칼리성 뇨의 장기간 유지가 바람직한 경우의 상태에 사용되는 알칼리화제
Ditropan(등록상표명)(옥시부티닌 클로라이드) 방해받지 않은 신경성 또는 반사 신경성 방광과 연관된 방광 불안정성의 증후를 완화하기 위하여(즉, 긴급성, 빈번성, 뇨의 누출, 압박 실금, 배뇨곤란)
Ditropan(등록상표명)XL(옥시부티닌 클로라이드) 압박 뇨실금, 긴급성 및 빈번성 증후가 있는 과활성 방광의 치료를 위한 1일 1회의 조절 방출 정제
DOXIL(등록상표명)(독소루비신 염산 리포좀 주사제)
Duragesic(등록상표명)(펜타닐 경피 방식)CII 아세토아미노펜-아편양 배합물, 비-스테로이드성 진통제 또는 단기 활성 아편양 제제의 PRN 복용과 같은 약한 수단으로는 처리되지 않는 진통으로 인하여 지속적인 아편양 진통제를 필요로 하는 환자에 서의 만성 통증을 처리하기 위한 72시간 경피 방식
Elmiron(등록상표명)(펜토산 폴리설페이트 나트륨) 방광 통증 또는 간질성 방광염과 관련된 불쾌감의 완화를 위한 것
ENACT AirWatchTM 천식 모니터링 및 처리 시스템
Ethyol(등록상표명)(아미포스틴) 진행된 난소암 또는 비-소세포폐암이 있는 환자에게 시스플라틴의 반복적 투여와 관련한 누적된 독성을 감소시키기 위해 적용.방사선 포트가 이하선의 주요 부분을 포함하는 머리 및 목 암을 치료하는 수술 후 방사선 치료를 실시하는 환자에서의 보통에서 극심한 정도의 구강 건조증상 발생을 감소시키기 위해 적용
Mycelex(등록상표명) Troche(클로트리마졸) 구강인두칸디다증의 국소 치료용. 또한 백혈병, 고형 종양 또는 신장 이식 치료에 이용되는 화학요법, 방사선요법 또는 스테로이드 요법을 포함하는 상황하에서 면역타협된 환자의 구강인두 칸디다증의 발생을 감소시키기 위하여 예방적으로 적용
Neutra-Phos(등록상표명)(칼륨 및 인산나트륨) 식이/영양 보조제
PolyCitra(등록상표명)-K 경구용 용액 및 PolyCtra(등록상표명)-K 결정(칼륨시트레이트 및 시트르산) 알칼리성 뇨를 장기간 유지하는 것이 바람직한 상태, 즉 나트륨염의 투여가 바람직하기 못하거나 금기시 되는 요산 및 요로의 시스틴 결석이 있는 환자와 같은 상태에 유용한 알칼리화제
Polycitra(등록상표명)-K시럽 및 LC(트리시트레이트) 알칼리성 뇨를 장기간 유지하는 것이 바람직한 상태, 즉 요산 및 요로의 시스틴 결석이 있는 환자와 같은 상태에 유용한 알칼리화제
Progestasert(등록상표명)(프로게스테론) 자궁내 프로게스테론 피임 방식
Testoderm(등록상표명), 접착제가 있는 Testoderm(등록상표명), 및 Testoderm(등록상표명)TTS CIII 테스토스테론 경피 방식Testoderm(등록상표명)제품은 내인성 테스토스테론의 결핍 또는 부재와 관련된상태에 대해 남성의 대체 치료로 적용함:(1) 제1 성기능저하(선천성 또는 후천성) 또는 (2) 과고나도트로핀성 성기능 저하증(선천성 또는 후천성)
ViadurTM(루프롤리데 아세테이트 이식) 전립선 암의 일시적인 치료를 위한 1년 1회의 이식
특정 제제는 특정 조건하에서(예컨대, 특정 pH, 활성화제제의 존재 등)활성화되거나 불활성화되도록 고안될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물에 전효소를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들면, 전효소는 프로테아제(예컨대, 소화관에 존재하거나 생물체의 소화관내에 인공적으로 삽입된 타액 프로테아제)에 의해 활성화될 수 있다. 본 발명의 생체적합성 조성물에 의해 전달된 제제가 생물체에 의해섭취되거나 생물체로 전달될 수 있는 활성화제의 첨가로 인하여 활성화되거나 불활성화될 수 있다는 것이 관찰되었다. 소화관내의 제제 조절을 위한 다른 메카니즘은 적합한 소화 구획에서 활성화되는 환경 민감성 제제이다. 예를 들면, 어떤 제제는 낮은 pH에서 불활성화되지만 중성 pH에서 활성화될 수 있다. 따라서, 상기 제제는 소화관에서 불활성이 되겠지만 장관에서는 활성이 될 것이다. 다르게는, 상기 제제는 미생물의 특정 인자(예컨대, 대장에 존재하는 미생물)의 존재에 반응하여 활성이 될 수 있다.
요약하면, 본 발명의 잠재적인 장점은 예를 들어 (1)매일의 사료 또는 곡식으로부터 동물용(물고기 포함) 치료약제, 효소, 또는 미네랄 보충물(예컨대, 무기 인산 보충물)의 필요성을 감소시키거나 가능한한 제거함으로써 사료에 존재하는 칼로리 및 영양분의 양을 증가시키는 것, 및 (2) 예를 들어, 가금, 돼지, 소, 말, 개 및 고양이를 비롯한 가축 및 비-가축의 증진된 건강 및 성장을 포함한다.
다수의 효소가 본 발명 조성물 및 방법에 사용될 수 있다. 이들 효소는 소비된 식품의 적합한 소화, 또는 적합한 대사작용, 화학물질, 전구약 또는 기타 제제의 활성 및 유도, 또는 소화관을 통하는 동물에 전달되는 화합물을 필요로 하는 효소를 포함한다. 본 발명의 조성물에 전달되거나 혼입될 수 있는 효소의 예들은 예를 들어 α-갈락토시다제, β-갈락토시다제, 특히, 락타제, 피타제, β-글루카나제, 특히, 엔도-β-1,4-글루카나제 및 엔도-β-1,3(4)-글루카나제, 셀룰라제, 크실로시다제, 갈락타나제, 특히, 아라비노갈라탄 엔도-1,4-β-갈락토시다제 및 아라비노갈락탄 엔도-1,3-β-갈락토시다제, 엔도글루카나제, 특히, 엔도-1,2-β-글루카나제, 엔도-1,3-α-글루카나제, 및 엔도-1,3-글루카나제, 펙틴 분해 효소, 특히,펙티나제, 펙틴에스테라제, 펙틴 리아제, 폴리갈락투로나제, 아라비나나제, 람노갈락투로나제, 람노갈락투로난 아세틸 에스테라제, 람노갈락투로난-α-람노시다제, 펙테이트 리아제, 및 α-갈락투로니시다제, 만나나제, β-만노시다제, 만난 아세틸 에스테라제, 크실란 아세틸 에스테라제, 프로테아제, 크실라나제, 아라비노크실라나제 및 리파제, 포스포리파제 및 쿠티나제와 같은 리포리틱 효소로 구성된 군으로부터 선택된 사료 강화 효소를 포함한다. 서열 번호 1과 2 및 후술할 표3에 기술된 피타제가 바람직하다. 표3에 나타낸 서열은 아미노산 치환체 및 그 안에 나타낸 뉴클레오디트 치환체를 갖는 서열 번호 1 및 2 이다.
수탁번호 공급원 아미노산 서열 뉴클레오티드 서열
E.coli B(기준) E.coli B S10; P26; D176;M298; A299; G312; 1428
868PH1 아메리카들소 E.coli 1428T
872PH1 캥거루 쥐 E.coli D176G; G312SM298K; A299T GAC(176)GGC; GGT(312)AGT;ATG(298)AAG; GCA(299)ACA
875PH2 E.coli W A160S; D176G;M298K; A299T GCG(160)TCG; GAC(176)GGC;ATG(298)AAG; GCA(299)ACA
873PH1 송아지 E.coli I428R
E.coli B E.coli B K298M; T299A AAG(298)ATG; ACA(299)GCA
K12 appA E.coli K12 M298K; A299T ATG(298)AAG; GCA(299)ACA
본 발명에서 사용되는 효소는 그들의 활성, 전달, 활성화 및 분해를 강화시키도록 변형될 수 있다. 그러한 변형은 생체내 또는 시험관내에서 수행될 수 있으며 아래에서 상술하는 바와 같이 당업계에서 공지된 일반적인 방법 및 공정을 이용할 수 있다. 그러한 방법은 일반적으로 자동화 기계에 의해 합성되거나 재조합 DNA기술에 의해 클로닝, 발현 또는 조작된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열을 사용한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물에 사용되는 효소(예컨대, 식이보조제)는 열에 안정하고 내열성이 있는 피타제 효소이며, 피테이트의 효소적 가수분해를 촉매한다. 즉, 효소가 50 ℃ 이상의 온도에 짧은 시간(즉, 5 내지 30초) 또는 긴 시간(예컨대, 수 분 또는 수 시간) 노출된 후 재생하여 활성을 다시 얻을 수 있다.
"사료" 및 "식품"은 각각 천연의 또는 인공적 음식, 식사 등 또는 동물 및 인간에게 각각 섭취되고 흡수하여 소화되기에 적합한 그러한 의도의 식사 성분을 의미한다. 본원에서 언급한 식이보조제는 동물 또는 생물체에 치료제 또는 소화제를 제공하는 제제를 함유하는 성분을 의미한다. "식이보조제"는 통상 생물체의 칼로리 흡수 공급원이 아니며, 다시 말해 식이보조제는 통상 생물체의 에너지 공급원이 아니라, 통상의 "사료" 또는 "식품"에 추가적으로 흡수되는 조성물이다.
제제 또는 효소(예컨대, 피타제)는 시험관내 또는 생체내, 즉 흡수전 또는 생물체의 위장 또는 내장 내에서 각각 그 효과를 나타낼 수 있다. 또한 조합하여 적용하는 것도 가능하다.
임의의 효소가 식이보조제에 혼입될 수 있음에도, 본 발명의 방법 및 조성물의 예로서 피타제에 대한 기준을 제조하였다. 본 발명의 식이보조제는 효소(예컨대 피타제)를 포함한다. 일반적으로, 피타제 조성물을 포함하는 식이보조제는 액체 또는 건조물이다.
액체 조성물은 효소(예컨대, 피타제) 이외의 것을 포함할 필요가 없으며, 매우 정제된 형태가 바람직하다. 그러나, 통상 글리세롤, 소르비톨 또는 모노 프로필렌 글리콜과 같은 안정화제가 또한 첨가된다. 액체 조성물은 염, 설탕, 방부제, pH- 조절제, 단백질, 피타제(피타제 기질)와 같은 다른 첨가제도 포함할 수 있다. 통상적인 액체 조성물은 수성 또는 유성 슬러리이다. 액체 조성물은 느린 방출용 생체적합성 조성물에 첨가될 수 있다. 효소는 생체적합성 물질(예컨대, 생분해성 또는 비-생분해성)인 식이 보조 조성물에 첨가되며 제조합 세포를, 예컨대 다공성 마이크로비드 내로 추가하는 것을 포함한다.
건조 조성물은 분무 건조 조성물이 될 수 있으며, 이런 경우 조성물은 건조 형 효소 이외의 것을 포함할 필요가 없다. 그러나, 통상 건조 조성물은 소위 식품 또는 사료 성분과 용이하게 혼합될 수 있는 과립형이고, 보다 바람직하게는 전-혼합물의 성분을 형성한다. 효소 과립의 입경은 혼합물의 다른 성분의 크기에 적합하다. 이는 효소를 동물 사료에 혼입시키는 안정하고 편리한 수단을 제공한다. 과립은 생체적합성인 것이 바람직하고, 생체적합성 과립이 비-생분해성인 것이 보다 바람직하다.
효소에 의해 피복된 과립 집괴는 고전단 혼합기에서 집괴 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 흡수 과립은 효소에 의해 피복된/효소를 흡수한 담체의 핵을 보유함으로써 제조된다. 담체는 동물의 내장내의 모래알 또는 돌의 역할과 유사한 생체적합성 비-생분해성 물질이 바람직하다. 집괴 기술에서 사용되는 통상의 충전재는 염, 황산2나트륨과 같은 염을 포함한다. 다른 충전재로는 카올린, 탈크, 마그네슘,알루미늄, 실리케이트 및 셀룰로스 섬유가 있다. 임의로, 덱스트린과 같은 결합재가 또한 집괴 과립에 포함될 수 있다. 담체는 생분해성 및 비-생분해성 재료(예컨대, 바위, 돌, 세라믹, 다양한 중합체)를 비롯한 생체적합성 재료일 수 있다. 임의로, 과립은 피복 혼합물로 피복된다. 그러한 혼합물은 피복제, 바람직하게는 예컨대 수소화팜유, 우지와 같은 소수성의 피복제, (필요하다면) 탄산칼슘 또는 카올린과 같은 다른 첨가제를 포함한다.
또한, 식이 보조 조성물(예컨대, 피타제 식이 보조 조성물)은 착색제, 방향제 화합물, 안정화제, 비타민, 미네랄, 기타 사료 또는 식품 강화 효소 등과 같은 다른 치환물을 포함할 수 있다. 통상적인 첨가제는 대개 비타민, 미네랄 또는 사료 강화 효소 및 적합한 담체 및/또는 부형제와 같은 1 이상의 화합물을 포함한다.
한 구체예에서, 본 발명의 식이 보조 조성물은 추가적으로 1 이상의 사료 강화 효소를 유효량 포함하며, 특히, α-갈락토시다제, β-갈락토시다제, 특히, 락타제, 기타 피타제, β- 글루카나제, 특히, 엔도-β-1,4-글루카나제 및 엔도-β-1,3(4)-글루카나제, 셀룰라제, 크실로시다제, 갈락타나제, 특히 아라비노갈락탄 엔도-1,4-β-갈락토시다제 및 아라비노갈락탄 엔도-1,3-β-갈락토시다제, 엔도글루카나제, 특히, 엔도-1,2-β-글루카나제, 엔도-1,3-α-글루카나제, 및 엔도-1,3-β글루카나제, 펙틴 분해 효소, 특히, 펙티나제, 펙틴에스테라제, 펙틴리아제, 폴리갈라투로나제, 아라비나나제, 람노갈라투로나제, 람노갈락투로난 아세틸에스테라제, 람노갈락투로난-α-람노시다제, 펙테이트 리아제, 및 α-갈락투로니시다제, 만나나제, β-만노시다제, 만난 아세틸에스테라제, 크실란아세틸에스테라제, 프로테아제,크실라나제, 아라비노크실라나제 및 리파제, 포스포리파제, 및 쿠티나제와 같은 리포리틱 효소로 구성된 군 중에서 선택된 사료 강화 효소를 포함한다.
본 발명의 동물 식이보조제는 단일-위(gastric) 동물에 식사 전 또는 식사와 동시에 보충시킨다. 한 구체예에서 본 발명의 식이보조제는 단일-위 동물에 식사와 동시에 보충시킨다. 다른 구체예에서, 식이보조제는 과립 또는 안정화 액체의 형태로 음식에 첨가된다.
본 발명의 식이보조제의 효소 유효량은 약 10-20,000; 바람직하게는 약 10 내지 15,000, 보다 바람직하게는 10 내지 10,000, 특히 약 100 내지 5,000, 특히 약 100 내지 약 2,000 FYT/식이보조제(kg) 이다.
본 발명 피타제의 다른 용도 예로는 대두 가공 및 이노시톨 또는 그들의 유도체를 생산하는 데 있다.
본 발명은 동물 비료의 피타제 농도를 감소시키는 방법에 관한 것이며, 이때 동물은 본 발명의 피타제를 유효량 포함하는 식이보조제를 공급받는다. 본 발명의 명세서 초반부에서 언급한 바와 같이, 이들의 주요 효과는 인산 환경 공해를 감소시키는 것이다.
다른 구체예에서 식이보조제는 자석 담체이다. 예를 들어, 자석 담체(예를 들어 다공성 자석 비드)내에 또는 담체 상에 또는 담체 전체에 분포되어 있는 효소(예를 들어 피타제)를 포함하는 상기 담체는 피타제내에 높은 위치에 걸쳐 분포될 수 있으며, 일정 시간 후에 자석에 의해 회수될 수 있다. 그러한 비드의 분포 및 회수는 추가적인 공해 문제를 감소시키며 비드의 재사용을 가능하게 한다. 추가로, 그러한 자석 비드의 사용은 생체내에서 예를 들어 피타제의 활성이 일어날 수 있는 소화관내의 한 지점으로 식이보조제를 국한시킬 수 있다. 예를 들어, 소화 효소(예컨대, 피타제)를 포함하는 본 발명의 식이보조제는, 동물이 자석 담체의 식이보조제를 소비한 후, 동물의 내장 옆에 자석을 병치시킴으로써 동물의 내장에 국한시킬 수 있다. 식이보조제가 소화관을 통과할 수 있는 시간 후에 상기 자석을 제거할 수 있다. 추가로, 자석 담체는 희생 후 또는 회수를 돕기 위해 생물체로부터 제거하는 것이 바람직하다.
식이보조제가 다공성 입자인 경우, 그 입자는 통상 서방 입자를 형성하기 위해 서서히 방출하도록 어떤 물질에 의해 주입된다. 그러한 서방 입자는 다공성 입자를 방출용 물질로 함침시킴으로써 제조될 뿐 아니라, 우선 필요 물질을 제1 분산 상(phase)에 용해시킴으로써 제조될 수 있다. 이런 경우, 방출되는 물질이 제1 분산 상에 먼저 용해되는 방법에 의하여 제조된 서방정 또한 본 발명의 범위 및 사상에 속하는 것이다. 다공성의 공(hollow)입자는 예를 들어 의약, 농업용 화학물질, 또는 효소와 같은 서방 물질에 의해 주입될 수 있다. 특히, 효소에 의해 주입되는 다공성의 공입자가 생분해성 중합체로 제조되는 경우, 입자 그 자체는 농업용 화학물질 또는 비료로서 사용될 수 있으며, 환경에 악영향도 없다. 한 구체예로서 다공성 입자는 자연에서 자석이다.
다공성 공입자는 생반응기 서포트로서 사용될 수 있으며, 특히 효소 서포트로서 사용될 수 있다. 따라서, 예컨대 리포좀과 같은 미소운반체에서 제제의 효소를 밀봉시킴으로써 투여량이 수일간 방출되는 것, 바람직하게는 약 3일 내지 20일간 서서히 방출시키는 방법을 이용하여 식이보조제를 제조하는 것이 유리하다. 또 다른 방법으로는 제제(예를 들어, 효소)를 제제(효소) 투여량이 수일, 예를 들어 2일 내지 30일에 걸쳐 방출되며, 동물의 일생에 걸쳐 방출되는 서방형 중합체내로 혼입시키는 것과 같이 서서히 방출시키도록 제제화할 수 있다.
당업계에 공지된 바와 같이, 리포좀은 통상 인지질 또는 다른 지질 성분으로부터 유래될 수 있다. 리포좀은 수성 매질에서 분산되는 모노- 또는 멀티 아멜라 수화 액정으로 제제화된다. 리포좀을 형성할 수 있는 비독성, 생리학적으로 허용가능하고 대사가능한 어떠한 지질도 사용할 수 있다. 리포좀 형태내의 본 조성물은 제제 외에 안정화제, 방부제, 부형제 등을 포함할 수 있다. 바람직한 지질은 인지질및 포스파티딜 콜린(레시틴), 천연품 및 합성품 모두를 들 수 있다. 리포좀을 형성하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어 Prescott, Ed., Methods in Cell Biology, Volume XIV, Academic Press, New York, N.Y.(1976), 33 면 등을 참조하기 바란다.
또한, 식품 또는 사료 제제 또는 첨가제의 제조 동안의 본 발명의 피타제 사용도 본 발명의 범위내에 속한다. 즉, 이 경우 피타제는 제조 동안만 피타제 활성을 나타내고 최종 식품 또는 사료 제품에는 활성을 나타내지 않는다. 이러한 측면은 밀가루 반죽 덩어리를 제조하고 굽는 경우와 관련되어 있다. 따라서 피타제 또는 제조합 효모 발현 피타제는 자석 담체내, 담체상, 담체 전체를 통해 주입될 수 있고 반죽 또는 식품 매체에서 분산되며, 자석에 의해 회수될 수 있다.
본 발명의 식이보조제는 단독으로 생체적합성(예컨대, 생분해성 또는 비-생분해성) 담체로 동물에게 투입되거나 다른 소화 첨가제와 배합하여 투입될 수 있다. 본 발명의 식이보조제는 상부 드레싱으로, 또는 그것을 직접 동물 사료에 혼합하거나 사료와는 별도로 공급하거나, 별도의 경구 투여로, 주사제로, 경피 수단으로, 다른 성장 관련 식용 화합물과 배합하여 용이하게 투여할 수 있으며, 각 배합물의 화합물 조성비는 특정 생물체에 따라 좌우되거나 문제점이 부각되고 반응도가 요구된다. 특정 경우에서 투여된 구체적인 식이투여량이 투여될 특정 화합물, 치유될 문제점, 목적하는 반응이나 유효 성분의 활성을 개질할 수 있는 목적 상태 및 기타 관련 사실에 맞추어 조절될 수 있다는 것을 이해해야 하며, 이러한 것은 당업자에게 이미 공지되어 있다. 통상, 1일 1회 복용량 또는 나누어 놓은 매일의 복용량을 사용할 수 있으며, 이것은 당업계에 공지되어 있다.
동물 사료와 따로 투여시킨다면, 식이보조제의 형태는 그들을 비독성의 약학적으로 허용가능한 식용 담체와 배합하여 제조함으로써 속출형 또는 서방형 제제 모두를 만들 수 있으며, 이러한 것은 당업계에 공지되어 있다. 이러한 식용 담체는 예컨대, 옥수수 녹말, 락토스, 수크로스, 대두 플레이크, 땅콩유, 올리브유, 참기름 및 프로필렌글리콜과 같이 고형 또는 액체형 모두가 될 수 있다. 고형 담체가 사용되면 화합물의 투여형태가 정제, 캡슐, 분말, 구내정 또는 약용 박하 드롭스 또는 미세 분산 형태의 상부 드레싱이 될 수 있다. 액체 담체가 사용되면 연질 젤라틴 캡슐, 또는 시럽 또는 액체 현탁액, 에멀션 또는 용액이 투여형태가 될 수 있다. 투여 형태는 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 에멀션화제, 용액프로모터 등과 같은 보조제를 포함할 수도 있다. 이들은 다른 치료학적으로 가치있는 물질을 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명 특유의 장점은 예컨대, (1) 생체적합성 조성물에 부여된 활성 성분의 제조 용이성; (2) 이용될 수 있는 활성 성분 및/또는 중합체 류와 관련된 가변성; (3) 높은 수율 및 부가 효율; (4) 생체내에서 활성의 온전한 활성제제를 방출하는 지속 방출 제제의 공급을 포함하며, 따라서, 장시간 동안 활성제제를 조절 방출할 수 있도록 한 것이다. 추가로, 다른 장점은 생물체의 소화관(내장)내에서 제제를 국소 전달하는 것에 기인한다. 본원에서 "내부에 포함된"이라는 문구는 장기간에 걸쳐 제제를 조절 방출하기에 유용한 조성물로 제제화하기 위한 방법을 의미한다.
본 발명의 지속 방출형 또는 느린 방출형 조성물에 있어서, 제제(예컨대, 효소 또는 항생제)의 유효량을 사용할 것이다. 본원에서 언급한 지속 방출형 또는 느린 방출형은 제제를 생체적합성 물질로부터 장기간에 걸쳐 서서히 방출하는 것을 의미한다. 지속 방출형은 연속적일 수도 비연속적일 수도 있고, 선형이거나 비선형일 수도 있으며, 이것은 1 이상의 생체분해성 또는 비-생체분해성 조성물, 의약 부가, 부형제의 선택 또는 다른 변형 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 그러나, 이것을 생물체에 의해 한번에 소비되는 신속한 방출을 제공하는 "속출형" 조성물에 공급하는 것이 바람직할 것이라는 것을 알아야 할 것이다. 또한 "방출"이 제제가 생체적합성 담체로부터 방출되는 것을 반드시 의미하는 것은 아니라는 것을 이해해야할 것이다. 오히려 한 구체예에서, 느린 방출은 생체적합성 조성물상에 존재하는 제제의 느린 활성화 또는 지속적인 활성화의 의미를 포함한다. 예를 들어, 피타제는 생체적합성 조성물로부터 유효하게 방출될 필요가 없다. 이 구체예에서, 피타제는 생체적합성 조성물상에 고정되어 있다.
동물 사료는 동물의 식이 필요 조건에 부합되는 통상 사용하는 임의의 단백질-함유 유기 밀(meal)이 될 수 있다. 그러한 다수의 단백질-함유 밀은 보통 옥수수, 대두 밀, 또는 옥수수/대두 밀 혼합물로 주로 구성된 것이다. 예를 들어, 가금을 사육하는 통상의 시판중인 제품은 Land O'Lakes AG Services의 가금 사료 제품인 Egg Maker Complete 뿐 아니라 Agwa, Inc.사의 제품인 Country Game & Turkey Grower를 포함한다(Phillip Minnaar와 Maria Minnaar의 Emu Farmer's Handbook 참조). 이들 시판중인 제품 모두는 동물 사료의 전형적인 예이고, 본 식이보조제 및/또는 효소 피타제는 상기 조성물에서 필요로 하는 보충적 인, 아연, 망간 및 철의 흡수량을 감소 또는 없애기 위하여 상기 제품에 혼입될 수 있다.
본 발명은 많은 동물의 음식에 적용될 수 있으며, 본원에서는 포유류(인간 포함), 가금 및 물고기를 포함하는 것으로 규정하고 있다. 특히, 음식은 돼지, 소, 양, 염소, 실험실용 설치류(래트, 마우스, 햄스터 및 게르빌루스), 밍크 및 여우와 같은 모피 동물, 및 멍키 및 에이프와 같은 동물원의 동물과 같은 판매용 포유류 뿐 아니라, 고양이 및 개와 같은 가축류에 사용할 수 있다. 전형적인 판매용 조류 종들은 닭, 칠면조, 오리, 거위, 꿩, 에뮤, 타조, 아비, 키위, 비둘기, 앵무새, 코카틸 앵무새, 코카투 앵무새, 카나리, 펭귄, 플라밍고 및 메추라기를 포함한다. 송어와 같은 판매용 양어에는 본원에서 개시한 식이보조제가 이로울 것이다. 이로운 다른 물고기로는 예를 들어 물고기(특히 수족관 또는 양식어업에서, 예컨대 열대어), 금붕어 및 다른 화려한 잉어, 메기, 송어, 연어, 상어, 가오리, 도다리, 틸라피아, 메다카, 구피, 몰리, 플라티피쉬(platyfish), 검상꼬리송사리, 제브라피쉬(zebrafish) 및 미꾸라지를 들 수 있다.
달리 설명하지 않는다면, 현질전환은 Sambrook, Fritsch and Maniatus, 1989 에 기재된 방법에 따라 실시된다. 다음의 실시예들은 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐 한정하고자 하는 것은 아니다. 실시예에 기재된 방법은 본 발명의 임의의 예들을 실시하고자 사용될 수 있는 전형적인 것들이지만, 당업자들에게 공지된 다른 방법 또한 사용할 수 있다.
실시예 1
피타제의 분리, 박테리아 발현, 및 정제
E.coli B 게놈의 DNA 는 미국, 뉴저지, 세인트루이스 소재의 시그마(카탈로그 D-2001번)에서 구득하였다.
다음의 프라이머는 게놈의 DNA로부터 직접 유전자를 PCR 증폭하는 데 사용된다:
5'프라이머 gtttctgaattcaaggaggaatttaaATGAAAGCGATCTTAATCCCATT(서열번호 3); 및
3'프라이머 gtttctggatccTTACAAACTGCACGCCGGTAT(서열 번호 4)
PCR 반응에서 Pfu 폴리머라제 및 증폭은 제조자의 프로토콜에 따라 수행된다(Stratagene Cloning Systems, Inc., La Jolla, CA).
PCR 제품을 정제하고, 정제된 제품 및 pQE60 벡터(Qiagen)을 제조자의 프로토콜에 따라 EcoRI 및 BglII제한 엔도뉴클레아제(New England Biolabs)로 소화시켰다. pQE60을 수득하기 위하여, 표준 프로토콜을 이용하여 밤새 결찰하였다.
증폭된 서열을 RBS 암호화 서열로 프레임에 삽입하였다. 이후 결찰 혼합물을 일렉트로포레이션에 의해 E.coli 균주 M15/pREP4(Qiagen, Inc.)를 형질전환하는 데 이용하였다. M15/pREP4는 lacI 억제자를 발현하며 카나마이신 내성(Kanr) 을 나타내는 플라스미드 pREP4의 다중 복제물을 포함한다. 플라스미드 DNA를 제한 분석에 의해 분리하고 확인하였다. 목적 구조를 포함하는 클론을 Amp(100 ug/ml) 및 Kan(25 ug/ml)로 보충된 LB 배지의 액체 배양물내에서 밤새(O/N) 성장시켰다. 밤샘 배양물을 1:100 내지 1:250의 비율로 대규모 배양물을 접종하는데 이용하였다. 세포를 광학 밀도 600(O.D.600) 0.4 내지 0.6으로 성장시켰다. 이후 IPTG("이소프로필-B-D-티오갈락토피라노시드")를 최종 농도 1mM에 첨가하였다. IPTG는 lacI 억제자를 불활성화하고, 유전자 발현을 증진시키는 P/O 를 청정화함으로써 유도하였다. 세포를 추가로 3 시간 내지 4 시간 성장시켰다. 이후 세포를 원심분리에 의해 수득하였다.
전술한 바와 같이 얻어진 프라이머 서열은 전술한 바와 같은 하이브리드화 기술에 의해 축적된 물질로부터 목적 유전자를 분리하기 위하여 또한 사용할 수 있다.
첨부된 특허청구범위내에서 본 발명의 다양한 변형 및 변경이 전술한 기술에 비추어 가능하므로, 본 발명은 명시적으로 기재된 것 외에도 달리 실시될 수 있다.또한, 본 발명이 전술한 상세한 설명에서 기술된 것은 단지 설명을 위한 것이며, 본원 발명의 범위를 한정하기 위한 것은 아니라는 것을 이해해야 한다. 본 발명의 다른 측면들, 장점 및 변형은 다음의 청구범위의 내에 포함되는 것이다. 본원에서 언급한 모든 간행물, 특허 출원서, 특허 명세서, 기타의 다른 참고 문헌은 그 전체가 참고로 인용되어 있다.
본 발명은 박테리아 뿐 아니라, 기타의 모든 E.coli 균주로부터 (독성 또는 비-독성, K12, W, C 포함)피타제 분자(핵산 및 그에 의해 암호화된 피타제 효소)를 분리하고 사용하게 한다. 이들은 모두 공지된 종들이고 그 균주는 다음에 해당한다:
써머토갈스(Thermotogales)
그린 논설퍼 박테리아(Green Nonsulfur Bacteria)
시아노박테리아 및 클로로플라스트(Cyanobacteria & chloroplasts)
저 G+C 그램 양성세균(Low G+C Gram-Positive Bacteria)
푸소박테리아(Fusobacteria)
고 G+C 그램 양성세균(High G+C Gram-Positive Bacteria)
기토파가/플렉시박터/박테로이드 군(Gytophaga/Flexibacter/Bacteroides group)
피브로박테리아(Fibrobacteria)
스프리오케테스(Spriochaetes)
플라토마이시스/클라미디아 군(Planctomyces/Chlamydia group)
퍼플 박테리아(프로테오박테리아)(Purple bacteria(Proteobacteria)), 다음의 세부분류를 포함한다:
델타 & 엡실론(Delta & Epsilon)으로서, 다음을 포함한다:
데설퍼로모나스 아세톡시단스(Desulfuromonas acetoxidans)
데설포사르시나 배리어빌리스(Desulfosarcina variabilis)
델로비브리오 스톨피(Bdellovibrio stolpii)
난노시스티스 엑세덴스(Nannocystis exedens)
스티그마텔라 우란티아카(Stigmatella aurantiaca)
믹소코커스 크산터스(Myxococcus xanthus)
데설포비브리오 데설푸리칸스(Desulfovibrio desulfuricans)
티로불럼 sp.(Thiovulum sp.)
캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)
울리넬라 숙시노젠(Wolinella succinogenes)
헬리코박터 피로리(Helicobacter pylori)
알파(Alpha)로서, 다음을 포함한다:
메틸로박테리움 엑스토르켄(Methylobacterium extorquens)
베이저린키아 인디카(Beijerinckia indica)
히포미크로비움 불가레(Hyphomicrobium vulgare)
로도미크로비움 바니엘리(Rhodomicrobium vannieli)
아그로박테리움 툼파시엔(Agrobacterium tumefaciens)
브루셀라 아보르투스(Brucella abortus)
로칼리메아 퀸타나(Rochalimaea quintana)
로돕수도모나스 마리나 아종 아길리스(Rhodopseudomonas marina subsp. agilis)
지아 메이스-미토콘드리아(Zea mays - mitochondrion)
리켓챠 리켓치(Rickettsia rickettsii)
에리키아 리스티시(Ehrlichia risticii)
울바키아 피피엔티스(Wolbachia pipientis)
아나플라스마 마르기날(Anaplasma marginale)
에리스로박터 롱거스(Erythrobacter longus)
로도스피릴럼 살렉시젠스(Rhodospirillum salexigens)
로도박터 캅슐라터스(Rhodobacter capsulatus)
아조스피릴럼 리포페럼(Azospirillum lipoferum)
로도스피릴럼 루드럼(Rhodospirillum rubrum)
감마(Gamma)로서, 다음을 포함한다:
엑토티오혼도스피라 사포시니코비(Ectothiorhodospira shaposhnikovii)
크로마튬 비노섬(Chromatium vinosum)
메틸모나스 메타니카(Methylomonas methanica)
카르디오박테리움 호미니스(Cardiobacterium hominis)
크산토모나스 말토필리아(Xanthomonas maltophilia)
콕시엘라 버네티(Coxiella burnetii)
레기오넬라 뉴모필라 아종 뉴모필라(Legionella pneumophila subsp. pneumophila)
오세아노스피릴럼 리넘(Oceanospirillum linum)
아시네토박터 칼코아세티쿠스(Acinetobacter calcoaceticus)
슈도모나스 에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)
해모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)
비브리오 파라새몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus)
프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris)
어위니아 카로토보라(Erwinia carotovora)
에체리키아 콜라이(Echerichia coli)로서, 다음을 포함한다:
베타(Beta)로서, 다음을 포함한다:
에이케넬라 코로덴스(Eikenella corrodens)
네이세리아 고노로에아(Neisseria gonorrhoeae)
비트레오실라 스터코라리아(Vitreoscilla stercoraria)
크로모박테리움 비올라세움(Chromobacterium violaceum)
알칼리제네스 파칼리스(Alcaligenes faecalis)
루브리비박스 젤라티노서스(Rubrivivax gelatinosus)
수도모나스 테스토스테로니(Pseudomonas testosteroni)
니트로소모나스 유로파(Nitrosomonas europae)
스피릴럼 볼루탄스(Spirillum volutans)
상기 피타제 분자는 라이브러리 스크리닝법, 예컨대 발현 스크리닝, 하이브리드화법, PCR(예컨대, Sammbrook, 1989)을 비롯한 공지의 방법으로 이들 박테리아로부터 분리할 수 있다.
7. 참고문헌
(본 명세서에서 인용한 모든 참고문헌의 교시는 달리 언급하지 않으면 전체가 참고문헌으로 여기에 인용되어 있다.)

Claims (40)

  1. 피테이트-함유 음식물을 서열 번호 2로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 거의 순수한 피타제 효소와 접촉시켜 거의 순수한 피타제 효소가 상기 피테이트-함유 음식물에 있는 피테이트로부터 무기 인산을 배출시키는 것을 촉매하도록 하는 단계를 포함하는 피테이트-함유 음식물의 영양적 가치를 증진시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 거의 순수한 피타제 효소가
    a) 서열 번호 1 및
    b) 서열 번호 1(이때 T도 U일 수 있다)
    로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 피타제-암호화 핵산을 포함하는 재조합 발현계에 의해 제조되며, 이때 피타제-암호화 핵산이 발현되어 상기 거의 순수한 피타제 효소가 제조되는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 수용 생물체에 의한 상기 피테이트-함유 음식물의 섭취 이전에 상기 피테이트-함유 음식물에서 피테이트로부터 무기 인산이 배출되는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 수용 생물체에 의한 상기 피테이트-함유 음식물의 섭취 이후에 상기 피테이트-함유 음식물에서 피테이트로부터 무기 인산이 배출되는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 피테이트-함유 음식물에서 피테이트로부터 무기 인산의 배출이 수용 생물체에 의하여 상기 피테이트-함유 음식물을 섭취하기 이전에 일부 및 섭취한 이후에 일부 일어나는 것인 방법.
  6. 제조합 발현계가 숙주 세포에 포함되고 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 피타제 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 발현시키며, 이때 상기 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 상기 숙주 세포에서 작동 가능한 전사 조절 서열에 작동적으로 연결되는 것인 제2항의 방법에서 이용하기 위한 재조합 발현계.
  7. 제6항의 발현계를 포함하는 벡터.
  8. 제6항에 있어서, 조절 서열이 구성형 프로모터를 포함하는 것인 발현계.
  9. 제6항에 있어서, 조절 서열이 조직-특이적 프로모터를 포함하는 것인 발현계.
  10. 제6항에 있어서, 상기 숙주 세포가 원핵생물 세포인 것인 발현계.
  11. 제6항에 있어서, 상기 숙주 세포가 진핵생물 세포인 것인 발현계.
  12. 제6항에 있어서, 상기 숙주 세포가 식물 세포인 것인 발현계.
  13. 제6항에 있어서, 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 시그널 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열이 상기 뉴클레오티드 서열보다 선행되는 것인 발현계.
  14. 제13항에 있어서, 상기 시그널 펩티드가 담배로부터 PR 단백질 PR-S 시그널 펩티드인 것인 발현계.
  15. 제6항의 발현계를 포함하는 변형된 원핵생물 세포.
  16. 제6항의 발현계를 포함하는 변형된 진핵생물 세포.
  17. 제6항의 발현계를 포함하는 변형된 식물 세포, 식물 부분 또는 식물.
  18. a) 제17항의 식물 세포, 식물 부분 또는 식물을 상기 뉴클레오티드 서열이 발현되는 조건하에서 배양하는 단계; 및
    b) 상기 식물 세포, 식물부 또는 식물을 동물 사료에 적합한 조성물로 전환하는 단계
    를 포함하는 미생물 피타제를 포함하는 동물 사료 제조 방법.
  19. 제17항의 식물 종자, 식물 세포, 식물 부분 또는 식물을 피테이트-함유 음식물과의 혼합물에 포함하는 동물용 사료 조성물.
  20. 외인성 피타제 효소의 활성에 의한 소화 강화로 인하여 유익이 될 수 있는 동물 또는 인간 치료법으로서,
    인간 또는 동물의 소화관내에 피타제 활성을 제공하기 위하여 유효량의 피타제 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 발현시키는 발현계를 포함하도록 변형된 트랜스제닉 식물의 다량의 식물 종자, 식물 세포, 식물 부분 또는 식물을 상기 인간 또는 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  21. 인간이 아닌 트랜스제닉 생물체의 게놈이 피타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 이종의 핵산 서열을 포함하며, 이때 트랜스유전자가 피타제 폴리펩티드를 발현시키는 것인 상기 생물체.
  22. 서열번호 1, 그와 거의 동일한 서열, 그에 상보적인 서열, 그의 30개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 단편, 및 서열 번호 1에 상보적인 서열의 30개이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 단편을 포함하는 핵산을 수득하는 단계; 및
    상기 서열의 1 이상의 뉴클레오티드를 다른 뉴클레오티드로 변형시키거나, 상기 서열의 1 이상의 뉴클레오티드를 결실시키거나 상기 서열에 1 이상의 뉴클레오티드를 추가하는 단계
    를 포함하는 변이체 제조 방법.
  23. 제22항에 있어서, 변형이 에러-프론 PCR법, 셔플링법, 올리고뉴클레오티드-지정된 돌연변이유발법, 조립 PCR법, 성 PCR 돌연변이유발법, 생체내 돌연변이유발법, 카세트 돌연변이유발법, 회귀 앙상블 돌연변이유발법, 지수 앙상블 돌연변이유발법, 위치 특이적 돌연변이유발법, 결찰 재조합법, GSSM 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의해 도입되는 것인 방법.
  24. 제22항에 있어서, 변형이 에러-프론 PCR법에 의해 도입되는 것인 방법.
  25. 제22항에 있어서, 변형이 셔플링법에 의해 도입되는 것인 방법.
  26. 제22항에 있어서, 변형이 올리고뉴클레오티드-지정된 돌연변이유발법인 것인 방법.
  27. 제22항에 있어서, 변형이 조립 PCR법에 의해 도입되는 것인 방법.
  28. 제22항에 있어서, 변형이 성 PCR 돌연변이유발법에 의해 도입되는 것인 방법.
  29. 제22항에 있어서, 변형이 생체내 돌연변이유발법에 의해 도입되는 것인 방법.
  30. 제22항에 있어서, 변형이 카세트 돌연변이유발법에 의해 도입되는 것인 방법.
  31. 제22항에 있어서, 변형이 회귀 앙상블 돌연변이유발법에 의해 도입되는 것인 방법.
  32. 제22항에 있어서, 변형이 지수 앙상블 돌연변이유발법에 의해 도입되는 것인 방법.
  33. 제22항에 있어서, 변형이 위치 특이적 돌연변이유발법에 의해 도입되는 것인 방법.
  34. 서열 번호 1에 기재된 핵산 서열 및 그와 거의 동일한 서열, 또는 서열 번호 2에 기재된 폴리펩티드 서열, 그와 거의 동일한 서열을 그 위에 저장한 컴퓨터 판독 매체.
  35. 서열 번호 1에 기재된 핵산 서열 및 그와 거의 동일한 서열, 또는 서열 번호 2에 기재된 폴리펩티드 서열, 그와 거의 동일한 서열을 그 위에 저장한 데이타 저장 장치 및 프로세서를 포함하는 컴퓨터 시스템.
  36. 제35항에 있어서, 서열 비교 알고리즘 및 저장된 1 이상의 기준 서열을 갖는 데이터 저장 장치를 더 포함하는 컴퓨터 시스템.
  37. 제36항에 있어서, 서열 비교 알고리즘이 다형현상(polymorphism)을 나타내는 컴퓨터 프로그램을 포함하는 컴퓨터 시스템.
  38. 제35항에 있어서, 상기 서열에서 특징을 동정하는 동정자(identifier)를 더 포함하는 컴퓨터 시스템.
  39. 서열 번호 1에 기재된 핵산 서열 및 그와 거의 동일한 서열, 또는 서열 번호 2에 기재된 폴리펩티드 서열 및 그와 거의 동일한 서열인 제1서열을 기준 서열 또는 서열 데이터베이스와 비교하기 위한 방법으로서,
    서열을 비교하는 컴퓨터 프로그램의 사용을 통해 서열의 데이터베이스 또는 기준 서열과 제1 서열을 판독하는 단계; 및
    컴퓨터 프로그램에 의해 제1서열과 기준 서열 또는 서열의 데이터베이스의 차이를 판단하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  40. 제39항에 있어서, 제1서열과 기준 서열간의 차이를 판단하는 것이 다형현상을 동정하는 단계를 포함하는 것인 방법.
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