KR20020014004A - 정상 임신과 자궁외 임신을 진단하는 장치 및 이의제조방법 - Google Patents

정상 임신과 자궁외 임신을 진단하는 장치 및 이의제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 정상 임신과 자궁외 임신을 동시에 구별할 수 있는 원스텝 임신 진단장치 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 본 발명에 따르면 임산부의 뇨로 분비되는 융모성선 자극호르몬(hCG)의 형태차이를 면역학적 방법으로 감지하게 하므로써 정상 임신과 자궁외 임신을 초기에 신속하고 정확하게 판단 할 수 있다.

Description

정상 임신과 자궁외 임신을 진단하는 장치 및 이의 제조방법{Diagnostic Device For Distinguishing Between Normal And Ectopic Pregnancy And Process For Preparing The Same}
자궁외 임신이란 수정란이 정상자궁 내막 이외에 착상된 임신을 말하며, 착상된 부위에 따라 난관임신, 자궁경관 임신, 난소 임신, 복강 임신이라 칭하며, 이중 약 95%는 난관임신으로 보통 난관임신이 자궁외 임신의 통칭으로 사용되고 있다. 자궁외 임신의 발병원인은 과거의 난관 결찰술(피임수술), 골반염, 배란 약제투여, 성병 등이 주요 원인이 되어 임산부의 약 64∼241명당 1 명 꼴로 매우 높은 발생빈도를 나타내고 있다.
자궁외 임신은 산부인과 영역에서 가장 빈번한 응급질환으로서 그 발생빈도는 매년 증가하는 추세이다. 또한 자궁외 임신으로 인한 난관파열시 하복부통증과 무월경 혹은 질출혈, 혈압저하로 인한 어지러움증, 위장관증상으로 인한 메스꺼움과 구토 등의 증상이 나타나고, 방치하면 복강내 출혈로 인하여 임신 전반기 임산부 사망의 가장 큰 원인으로 등장하고 있다. 이와 같이 자궁외임신을 조기에 발견하지 못할 경우에는 난관이 파열되고 출혈에 의한 쇼크 상태로 발전되어 사망에 이르게 된다. 그러나 아직까지 자궁외 임신에만 적용되는 독특한 증상과 진단법이 없어 조기진단에는 어려움이 있었다. 이에 따라 본 발명자들은 자궁외 임신을 조기에 발견함으로써 모성 사망률을 감소시킬 수 있으며, 정상 임산부의 경우에는 자궁외 임신에 대한 불안감을 해소 시킬 수 있다는 판단하에 예의 연구를 거듭한 결과 자궁외 임신을 조기에 진단할 수 있는 장치를 발명하게 되었다.
인간 융모성선 자극호르몬(human chorionic gonadotropin; 이하 hCG라 칭함)은 태반의 융모세포영양막(syncytiotrophoblast)에서 생성되어 임신초기에 프로게스테론(progesterone)을 계속 생산하도록 하여 태반기능이 완성되는 임신 10주까지 착상을 유지시켜 주는 기능을 한다. 또 태아고환에서 테스토스테론(testosterone)의 생성을 촉진하여 남아 내성기의 남성분화에 중요한 역할을 하며 모체 갑상선의자극 등 다양한 기능을 가지고 있다. 임신(또는 수정)후 8일이면 혈액 및 뇨에서 25mIU/ml의 농도로 검출된다. 그리고 임신 5주 부터 일정한 속도로 급속하게 증가하여 임신 6주에는 1 IU/ml , 그리고 임신 10주에는 100∼120 IU/ml 까지 증가한 다음, 임신 10∼18주에서는 감소하여 임신 20주에서는 20 IU/ml 의 일정한 농도가 유지된다. hCG는 알파와 베타의 두 개의 서브 유니트로 구성된 당단백질로서 탄수화물이 30%이며, 분자량은 약 36,700 달톤이다. 그리고 알파-서브유니트는 92개의 아미노산으로 구성되어 황체형성호르몬 및 갑상선자극호르몬의 알파-서브유니트와 같은 구조로 이루어져 있으며, 베타-서브유니트는 145개의 아미노산으로 구성(hCG에 고유한 구조)되어 있다.
일반적으로 hCG는 사람의 체액에서 다양한 형태로 존재하는데 즉, 완전형 hCG(intact hCG; I-hCG), 단편화 hCG(nicked hCG; N-hCG), 다당쇄 hCG(hyperglycosylated hCG), 유리베타 hCG(free β-hCG), 유리베타 코어 절편(free β-core fragment) 등으로 존재한다. 이와 같이 다양한 형태의 hCG들은 임신, 뇌하수체, 융모성질환(trophoblast disease) 및 융모성 종양(choriocarcinoma)등에서 생성된다. 정상 임신의 임산부 체액에는 완전형의 hCG가 90%정도를 차지하며, 10% 이하의 단편화 hCG와 1% 이하의 유리베타 hCG가 검출되는 특징을 가지고 있다.
이에 반하여 자궁외 임신의 경우에는 일정 비율의 단편화 hCG와 유리 베타 hCG가 혼합되어 있는 정상 임신과는 달리 완전형 hCG가 대부분을 차지하고 매우 소량의 분해산물 즉, 단편화 hCG, 유리베타 hCG, 베타코어 절편이 존재하는 특징을 가지고 있다. 또한 전체 hCG분비량과 증가폭이 정상 임신보다 매우 낮게 나타나고 있다. 즉, 임신 6주에는 정상임신의 약 1/5까지 감소되고, 임신8주에서는 약 1/50까지 감소하여 15 IU/ml 정도의 hCG 분비량을 보인다.
미국특허 제 5,786,220호는 정상임신과 비정상 임신을 구별하는 원스텝 진단시약의 제조방법에 관하여 개시하고 있는데, 여성체액 중의 프로게스테론과 hCG의 농도를 동시에 측정함으로써 정상임신, 유산, 자궁외 임신, 암 등을 진단할 수 있다고 공지하고 있다. 즉, 혈액중의 프로게스테론의 농도가 25ng/ml 이하인 동시에 hCG의 농도가25∼2,500 mIU/ml 일 때에는 자연 유산 및 자궁외 임신으로 진단하며, 프로게스테론의 농도가 25ng/ml 이상이고 hCG 의 농도가 2,500 mIU/ml 이상일 때에는 정상 자궁내 임신으로 진단하는 방법을 공지하고 있다. 데닐 등(Fertility & Sterility. 1999. Vol. 72. 1013∼1017)은 유리베타 hCG의 경우에 정상 임신에서는 30∼170 IU/ml 이며, 비정상 자궁내 임신은 1∼70 IU/ml이고, 자궁외 임신의 경우에 0.059∼29 IU/ml로서 자궁외 임신일 경우에 hCG 분해 산물이 정상 임신보다 매우 낮은 농도로 분비된다고 공지하였다.
상기한 바와 같이 hCG는 임신의 진단에 가장 중요한 호르몬으로서 특히 임신초기에 hCG의 값과 초음파 소견을 함께 고려하여 초기의 임신, 유산, 자궁외 임신 등의 감별진단에 유용하게 사용되고 있다. 임신 진단에 있어서 hCG의 활용은 먼저 초기에 임신 여부를 확인할 수 있으며, 유산 및 자궁외 임신의 진단은 낮은 수치의 hCG 농도와 배가시간(doubling time, 임신 5∼9주사이에 hCG의 혈중농도가 1.4∼2일 마다 2배로 증가됨)등을 통하여 진단하고 정상보다 높은 수치의 hCG 농도일 경우에는 다태임신(多胎姙娠) 및 포상기태(胞狀奇胎)로 진단하고 있다. 자궁외 임신은 임산부 혈청 및 뇨의 hCG 농도 측정 이외에 초음파 촬영, 진단적 복강경 등에 의하여 진단하고 있다. 즉 초음파검사와 hCG 농도 측정을 병행하여 진단하는데 초음파 검사 결과 태낭이 보이면서 hCG수치가 1,000 mIU/mL 이하일 때에는 임신 지속가능성이 희박하며 매 48시간마다 hCG가 정량적으로 65% 이상 증가하지 않으면 그 임신의 예후는 매우 불량하다고 진단하고 있다.
하기 표1은 hCG분포에 따른 임신증상의 분류를 나타낸 것이다.
표 1. 증상(병명)에 따른 hCG의 분포도
증상(병명) hCG의 분포
정상 임신 임신 8주(완전형 hCG 150 IU/ml, 유리베타hCG 1.5 IU/ml, 단편화 hCG 15 IU/ml), 베타코어 절편 전체 hCG의 1/5
자궁 외 임신 임신 8주(완전형 hCG 3 IU/ml),완전형 hCG가 대부분 차지
다운증후군 유리베타 hCG가 정상임신의 2배
다태임신 완전형 hCG(2,000IU/ml), 유리베타 hCG(20∼200IU/ml)
융모성 질환 정상임신보다 높은 유리베타 hCG(완전형 hCG의 2∼10%)
융모성 종양 대부분 단편화 hCG 및 다당쇄hCG이나 일부 융모성종양은 매우 높은 유리베타hCG 분비(완전형 hCG의 5∼40%)
기타 암 매우 낮은 농도의 유리베타 hCG(<100mIU/ml) 및 베타코어 절편
상기와 같이 공지되어 있는 hCG 농도의 배가 시간을 측정하는 방법과 임산부 체액중의 유리베타 hCG 농도를 측정하는 자궁외 임신 진단법은 반복적인 채혈 과정을 거쳐야하는 단점을 가지고 있으며, 미국특허 제 5,786,220호의 임신진단법은 hCG의 농도측정과 함께 프로게스테론의 농도측정을 병행해야 한다는 점에서 본발명과 진단원리가 상이하고 또한 정상임신과 비정상임신의 구별은 가능하지만 임산부에게 매우 위험한 질환인 자궁외 임신과 일반적인 자연유산을 초기단계에 효과적으로 구별하기 어렵다는 문제점을 가지고 있다.
이에 본 발명자들은 임산부의 조기 임신진단을 실시함에 있어서 정상 임신진단 뿐만 아니라 자궁 외 임신을 동시에 진단할 수 있는 원스텝 동시 진단키트의 제조방법에 관하여 연구를 거듭하였다. 그 결과 정상 임신의 경우에는 25mIU/ml의 hCG 농도까지 감지하여 임신여부를 판단할 수 있으며, 자궁외 임신은 상대적으로 과 발현되는 완전형-hCG를 검출하므로써 원스텝 동시진단장치를 발명하게 되었다.
본 발명은 정상 임신과 자궁외 임신을 원스텝으로 조기에 동시 진단할 수 있는 진단장치 및 이의 제조방법을 제공함을 목적으로 한다 .
또한 본 발명은 임산부의 혈액 및 뇨 중에 존재하는 완전형-hCG와 변형-hCG를 각각 감지하기 위하여 항 완전형-hCG 단일클론항체와 항 알파-hCG 단일클론항체가 짝이 되도록 하고, 항 변형-hCG 단일클론항체는 항 베타-hCG 단일클론항체와 짝이 되도록 구성하는 것을 특징으로 한다.
도1(a)는 본 발명에 따른 정상 임신 및 자궁외 임신 동시 진단장치의 모형도이다.
1과 4는 진단키트의 판독창을 나타내며, 2와 5는 시험의 종료를 나타내는 표식이다(C). 또 3은 자궁외 임신선(Ectopic Pregnancy ; 이하 EP)을 나타내고 6은 정상 임신선(Normal Pregnancy; 이하 NP)을 나타낸다. 그리고 7은 임산부의 체액을 투입하는 시료 점적구를 나타낸다.
도1(b)는 도1(a)의 내부 스트립에 사용된 항체 점적 멤브레인의 결과선(NP,EP)과 종료선(C)의 점적형태를 모식화한 그림이다. 11은 니트로셀룰로오스 멤브레인이며, 8과 12는 토끼 항-쥐 면역글로블린 다가항체가 점적된 시험종료선을 나타낸다. 그리고 9는 항 베타-hCG 단일클론항체를 그리고 13은 항 알파-hCG 단일클론항체를 점적한 시험 결과선이다. 10은 항 변형-hCG 단일클론항체 결합 착색미립자 패드를 나타내며, 14는 항 완전형-hCG 단일클론항체 결합 착색미립자 패드를 표시하고 있다.
도2(a)는 본 발명에 따른 정상 임신 및 자궁외 임신 동시진단장치의 또 다른모형도이다. 15는 시험의 종료를 나타내는 표식이며(C), 16은 자궁외 임신선(EP)을 그리고 17은 정상 임신선(NP)을 나타낸다. 18은 진단장치의 판독창을 나타내며,19는 임산부의 체액을 투입하는 시료 점적구를 표시하고 있다.
도2(b)는 도2(a)의 내부 스트립에 사용된 항체 점적 멤브레인의 결과선(NP,EP)과 종료선(C)의 점적 형태를 모식화한 그림이다. 20은 니트로셀룰로오스 멤브레인이며, 21은 토끼 항-쥐 면역글로블린 다가항체가 점적된 시험종료선을 나타낸다. 그리고 22는 항 알파-hCG 단일클론항체를 점적한 자궁외 임신선(EP)이며, 23은 항 베타-hCG 단일클론항체를 점적한 정상 임신 결과선(NP)이다. 24는 항 변형-hCG 단일클론항체 결합 착색미립자와 항 완전형-hCG 단일클론항체 결합 착색미립자를 혼합한 착색미립자 패드를 나타내고 있다.
도3은 본 발명의 정상임신 및 자궁외 임신 동시진단장치의 내부스트립의 패드구성을 나타내고 있다. 25는 체액 흡수패드를 나타내고 있으며, 26은 항체점적 니트로셀룰로오스 멤브레인을, 그리고 27은 착색미립자 패드를 나타내고 있고, 28은 체액 점적 패드를 나타내고 있으며, 이들 패드는 각각 일부씩 중첩되어 결합된 형태를 나타낸다.
본 발명의 기본 원리는 면역학적 분석 방법 중 샌드위치(sandwich) 방법을 이용한 분석 방법이며, 이러한 분석 방법에 사용되는 항체는 분석하고자 하는 시료의 민감도 및 특이도를 결정하기 때문에 항체의 선별 사용이 매우 중요하다. 샌드위치 분석법에는 주로 두 종의 단일클론항체를 사용하게 되는데 이 두 종의 항체는 항원에 대한 결합 위치가 각기 다른 곳에 존재해야만 그 민감도를 유지할 수 있다. 예를 들어 여성의 임신 시 혈액 및 뇨로 분비되는 hCG를 샌드위치 방법을 이용하여분석하기 위하여는 두 종의 단일클론항체가 필요하며 이 두 종의 항체는 항원(hCG)과의 결합 부위가 각기 다른 곳에 있어야 한다. 만약 사용되는 두 항체와 항원(hCG)과의 결합 부위가 유사하거나 근접된 곳에 있으면 구조적 방해(steric hindrance)로 인하여 민감도가 떨어지게 된다. 본 발명은 면역학적 분석 방법 중 샌드위치 분석법을 기본으로 한 면역크로마토그라피법을 이용한 것이다. 즉, 특성 분석이 끝난 단일클론항체 한 종을 유색의 미세한 입자(착색미립자)에 공유 또는 비공유 결합으로 고정시켜 이동상으로 사용하고, 역시 특성 분석이 끝난 단일클론항체 한 종을 고정상이 되는 니트로셀룰로오스 멤브레인에 점적하여 고정 시킨다. 분석 하고자 하는 시료를 이동상과 혼합하여 고정상인 멤브레인을 통해 전개 시키면 모세관 현상에 의해 이동상이 전개되다. 이때 시료중에 항원이 포함되어 있으면 항원을 매개로 고정상과 이동상이 서로 결합하게 되어 고정상 부위에서 착색미립자가 선으로 나타나게 된다. 이러한 선의 출현 유무로 시료중 항원의 존재 여부를 육안으로 판단하는 것이다. 본 발명에 사용되는 단일클론항체는 상품화 되어 있는 단일클론항체를 구입하여 사용할 수 있으며 공지된 세포 융합 방법으로 제조하여 사용할 수 있다. 본 발명에 사용된 항체는 공지된 단일클론항체 제조 방법을 이용하여 제조하였으며 그 제조 과정에서 완전형-hCG와 반응을 보이는 항체와 변형-hCG와 반응을 보이는 항체를 선별하였고, 이와 짝이 되는 항 알파-hCG항체 및 항 베타-hCG항체 역시 표준 hCG로 그 민감도를 분석 하였을 때 민감도가 우수하게 유지되는 단일클론항체를 선별하여 사용하였다.
상술한 바와 같이 초기 정상 임신 및 자궁외 임신여성의 뇨에 존재하는 융모성선 자극호르몬(hCG)은 다양한 형태로 존재하며 특히 자궁외 임신 시 발견되는 hCG의 대부분은 완전형의 hCG이며, 정상 임신 시에는 완전형-hCG외에 변형-hCG(단편화 hCG , 유리 베타-hCG)등이 일정 비율로 혼합되어 있다. 본 발명은 이러한 차이점을 이용하여 완전형-hCG와 변형-hCG를 각각 감지하여 육안으로 비교하므로써 임신여부 및 정상 또는 자궁외 임신 여부를 동시에 판정할 수 있게 하였다. 즉, 진단키트의 구조는 시료 중에 완전형-hCG가 존재할 때 유색의 선이 출현하는 EP부위(Ectopic Pregnancy)와 변형-hCG가 존재할 때 유색의 선이 출현하는 NP부위(Normal Pregnancy)를 각기 도안하여 본 발명의 진단장치를 완성 하였다. 결국 자궁외 임신일 경우에 대부분의 hCG는 완전형-hCG로 존재하는데, 이러한 경우에는 완전형-hCG와 반응하여 EP에서만 유색의 선이 출현하거나, NP선이 나타나더라도 이보다 강한 EP선이 출현하게 된다. 정상 임신일 경우 체액중에는 완전형-hCG 뿐만 아니라 10% 정도의 변형-hCG가 존재한다. 따라서 본 발명의 진단장치에서는 변형-hCG와의 반응민감도를 높이기 위해 시료와 반응하는 항체를 결합시킨 착색미립자의 농도를 2∼10배 높게 사용하거나 결합 항체의 농도를 높이므로써 두 부위(EP,NP)에 출현하는 유색 선의 강도를 유사하게 하여 정상 임신으로 판정하게 하였다.
이하 본 발명에 따른 임신 진단장치의 구성을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.
자궁외 임신시 과발현되는 완전형-hCG와 반응하는 단일클론항체를 공지된 방법으로 제조한 다음 이 단일클론항체를 착색미립자와 결합시켜 결합체를 유리섬유패드에 고정한 후 건조시켜 착색미립자 패드를 제조하였다. 다른 한편으로 변형-hCG와 반응하는 단일클론항체를 공지된 방법으로 제조하고 단일클론항체를 착색미립자와 결합시켜 결합체를 유리섬유패드에 고정한 다음 건조시켜 착색미립자 패드를 제조하였다. 본 발명에 사용될 수 있는 착색미립자는 폴리스티렌 입자, 콜로이달 골드 등 다양한 미립자가 사용 가능한데, 이들 중에서 콜로이달 골드가 바람직하며, 더욱 바람직하게는 20 내지 60나노미터 크기의 콜로이달 골드이다.
진단장치의 민감도를 유지하기 위해 착색미립자에 고정된 항체와는 항원(hCG) 결합 부위가 각기 다른 단일클론항체를 멤브레인의 고정상으로 사용하였다. 이 때 사용된 단일클론항체는 항 베타-hCG 단일클론항체와 항 알파-hCG 단일클론항체 두 종이 사용되었는데 각 항체를 각기 다른 니트로셀룰로오스 멤브레인에 직선이 되도록 점적하여 고정하거나(도1), 하나의 멤브레인 안에 교차 또는 두 선이 되도록 점적하여 고정하였다(도2) 그리고 멤브레인의 단일클론항체 고정부위의 상단에는 항-쥐 면역글로블린 다가항체를 점적하여 시험의 종료선으로 나타나게 하였다.
상기와 같이 제조된 항체점적 멤브레인은 접착제가 도포되어 있는 폴리에스테르 지지판에 접합시키고 그 위에 길이방향으로 단일클론항체-착색미립자 점적패드를 접합시켰다. 그리고 임산부의 체액이 직접 점적되는 시료 점적패드 및 여분의 체액이 흡수되는 시료흡수패드를 서로 겹치도록 길이방향으로 접합시켜 정상임신 및 자궁외 임신 동시진단키트의 내부 스트립을 완성하였다(도3)
상기와 같이 제조된 동시진단 장치를 사용하여 정상 임신 및 자궁외 임신을 조기진단하는 방법은 다음과 같다.
시료점적패드에 임산부의 체액(혈액, 뇨)을 가하면 시료가 흡수되어 모세관 현상에 의한 이동에 의하여 착색미립자 패드에 고정되어 있는 단일클론항체 결합 착색미립자와 반응하는데, 정상 임신일 경우에는 시료 중에 존재하는 완전형-hCG 및 그외의 변형-hCG가 각각 착색미립자에 고정된 단일클론항체들과 결합하여 니트로셀룰로오스 멤브레인 상을 이동하며, 멤브레인 상에 고정되어 있는 2가지 종류의 단일클론항체 부위에서 각각 샌드위치 형태로 결합하여 멤브레인 상에는 착색미립자에 의하여 유사한 민감도를 가진 2개의 결과선(NP/EP)이 나타나게 된다.
자궁외 임신일 경우 체액에는 대부분 완전형-hCG가 차지한다. 따라서 완전형-hCG와 결합된 단일클론 항체 및 착색미립자 결합체는 멤브레인 상을 이동하여 항 알파-hCG 단일클론항체와 결합하여 강한 EP밴드가 나타나지만, 변형-hCG와 반응하는 단일클론항체가 결합된 착색미립자 결합체는 시료 중의 완전형-hCG와 반응하지 못해 멤브레인 상에 고정된 항 베타-hCG 단일클론항체와 결합하지 못하고 그대로 이동하게 되거나, 시료중에 존재하는 극소량의 변형-hCG와 반응하여 매우 약한 강도의 NP밴드가 나타난다. 결국 자궁외 임신일 경우에는 하나의 EP밴드가 나타나거나, 두개의 밴드를 비교하였을 때 서로 선의 강도가 다른 2개의 밴드(NP 밴드보다 EP밴드가 강함)를 나타내게 된다.
만일 임신이 아니면 시료 중에 hCG가 존재 하지 않기 때문에 착색미립자 패드의 단일클론항체-착색미립자 결합체가 멤브레인의 결과선(NP/EP)에 고정된 hCG 단일클론항체와 결합하지 않고 그대로 이동하게 되어, 항 쥐-면역글로블린 다가클론항체가 점적된 종료선(C)에만 착색미립자 밴드가 나타난다.
본 발명의 정상 임신 및 자궁외 임신 동시진단 장치의 형태 및 구조의 예는 도1 및 도2와 같다.
한편 이러한 결과는 착색미립자패드와 멤브레인에 고정되는 항체를 상호 교환하여 사용하여도 동일 한 결과를 나타낸다. 즉, 항 알파-hCG 단일클론항체와 항 베타-hCG 단일클론항체를 각각 착색미립자에 결합시키고, 항 완전형-hCG 단일클론항체, 항 변형-hCG 단일클론항체 및 항 쥐-면역글로블린 다가클론항체를 니트로셀룰로오스 멤브레인에 고정시켜 상기와 같은 방법으로 진단키트를 제조한 후 임산부의 체액을 시료점적패드에 점적하였을 경우 1)정상 임신일 경우에는 시료 중에 존재하는 완전형-hCG 및 그외의 변형-hCG가 각각 착색미립자에 고정된 항 알파-hCG단일클론항체 및 항 베타-hCG단일클론항체와 결합하여 니트로셀룰로오스 멤브레인 상을 이동하며, 멤브레인 상에 고정되어 있는 항 완전형-hCG단일클론항체 및 항 변형-hCG단일클론항체 부위에서 각각 샌드위치 형태로 결합하여 멤브레인 상에는 유사한 민감도를 가진 2개의 결과선(NP/EP)이 나타나게 되며 2) 자궁외 임신일 경우에는 체액에 존재하는 완전형-hCG가 착색미립자패드에 존재하는 항 알파-hCG와 결합하여 멤브레인 상을 이동하여, 멤브레인상의 항 완전형-hCG 단일클론항체와 결합하여 강한 EP밴드만 나타나거나 , 시료중에 존재하는 극소량의 변형-hCG에 의하여 매우 약한 강도의 NP밴드가 나타나게 되고 3) 만일 임신이 아니면 시료 중에 hCG가 존재 하지 않기 때문에 착색미립자 패드의 단일클론항체-착색미립자 결합체가 멤브레인의 결과선(NP/EP)에 고정된 hCG 단일클론항체와 결합하지 않고 그대로 이동하게 되어, 항 쥐-면역글로블린 다가항체가 점적된 종료선(C)에만 착색미립자밴드가 나타난다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하는 것으로, 이들 실시예에 의해 본 발명의 범위가 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자들에게 있어서 자명 할 것이다.
실시예 1: 항 완전형-hCG 단일클론항체 및 항 알파-hCG단일클론항체의 제조 및 정제
가. 면역 및 세포융합
완전형-hCG와 반응하는 단일클론항체를 제조하기 위해 공지된 세포 융합(cell fusion) 방법(Galfre, G 등 1981, Methods Enzymol. 73:3-46)을 사용하였다. 먼저 8주령의 Balb/C 마우스를 준비하여 Zymed(미국)사에서 구입한 완전형-hCG 20㎍/100㎕와 Freund's 완전 보조액 100㎕를 완전히 유화시켜 1차 복강 주사하고 같은 방법으로 3주 뒤 Freund's 불완전 보조액 100㎕와 유화하여 2차 복강 주사하였다. 1주일 후 마우스로부터 채혈하여 항체 형성 여부를 ELISA법으로 확인한 다음 20㎍의 hCG를 꼬리에 정맥주사하였다. 3일 뒤 마우스의 비장 세포를 취하여 미리 배양된 Sp2/O 세포와 PEG를 이용하여 융합시킨다. 융합된 세포를 HAT 배양액을 첨가하여 96 well에서 배양 하면서 완전형-hCG와 반응하는 항체를 분비하는 세포와 알파-hCG와 반응하는 항체를 분비하는 세포만을 선별하여 대량 배양을 실시하였다.
나. 단일클론항체의 정제
대량으로 배양된 배양액을 원심분리하여 침전물을 제거하고 상층액을 모아proteion A-sepharose(FF)에 통과 시키고 인산염 완충액으로 세척한 다음 0.1M glycine 완충액으로 용출 시켰다. 용출액은 인산염 완충액으로 투석하고 농도를 조정하여 진단키트 제조에 사용하였다.
실시예 2: 항 변형-hCG 단일클론항체 및 항 베타-hCG 단일클론항체의 제조 및 정제
실시예 1의 가항과 같은 방법으로 Zymed사에서 구입한 베타-hCG 항원을 3회에 거쳐 면역시키고 마우스의 비장 세포를 취하여 Sp2/O 세포와 혼합하고 PEG를 이용하여 세포 융합을 실시하였다. 융합된 세포를 HAT 배양액을 첨가하여 96 well에서 배양하면서 베타-hCG와 반응하는 항체를 분비하는 세포와 완전형-hCG와는 반응성이 없으며 변형-hCG와 반응성이 있는 항체를 분비하는 세포를 선별하여 대량 배양을 실시하였다. 대량으로 배양된 배양액은 실시예 1의 나항과 같은 정제방법으로 단일클론항체를 정제하고 인산염 완충액으로 투석하여 농도를 조정한 다음 진단장치 제조에 사용하였다.
실시예 3: 콜로이달 골드(착색미립자)의 제조
본 발명에 사용된 착색미립자는 20 ∼ 60나노미터 크기의 콜로이달 골드(Colloidal gold)를 사용하였다. 콜로이달 골드를 제조하기 위하여 먼저 500ml 라운드 플라스크에 2차 증류수 220ml을 첨가하였다. 그 다음 플라스크를 핫 플레이트(Corning 사, 미국)에 위치시키고 수증기의 증발을 막기 위하여 리프럭스 장치(Pyrex 사, 미국)를 설치하였다. 핫 플레이트를 작동시켜 현탁시키면서 100℃까지 가열하였다. 증류수의 온도가 100℃ 이상 증가하였을 때, 2% 골드클로라이드(Sigma 사, 미국) 1.0ml을 가하여 완전히 혼합한 다음 1% 소디움 싸이트리트(Sigma 사, 미국) 2.0ml을 가하여 격렬하게 혼합하였다. 그 다음 30분간 계속 가열하여 콜로이달 골드의 생성을 유도하였다. 이와 같이 제조된 콜로이달 골드는 불순물 및 응집체를 제거하기 위하여 0.45㎛여과지로 여과하여 본 발명의 진단장치 제조에 사용하였다.
실시예 4: 단일클론항체 결합 착색미립자가 고정된 착색미립자 패드의 제조
단일클론항체 결합 착색미립자를 제조하기 위해 실시예 3에서 제조된 착색미립자 50ml씩을 각각의 비이커에 넣어 교반하면서 실시예 1 및 2에서 제조된 각각의 단일클론항체를 착색미립자 1ml 당 1∼15㎍이 되도록 첨가하여 2∼30분간 계속 반응시켰다. 반응이 끝난 다음 1∼10% 소혈청 알부민이 포함된 차단(blocking) 용액을 최종농도 0.1∼1%의 알부민 농도로 각각의 비이커에 첨가하고 2∼30분간 반응시켰다.
이 반응액을 50ml 원심분리튜브(Corning 사, 미국)에 담아 초원심분리기(Backman 사, 미국)에서 10,000rpm으로 15분간 원심분리하였다. 원심분리 후 상등액을 제거하고 침전물을 취하여 안정액(0.5∼2% 소혈청 알부민, 1∼5% 슈크로오스, 50∼100mM 트리스 완충액(pH 7.5∼9.0))에 현탁하였다. 이러한 현탁액을 일정한 농도로 조정하여 착색미립자 패드에 적신 다음 건조시켰다. 특히 실시예 2에서 획득한 항 변형-hCG 단일클론항체를 결합시킨 착색미립자의 농도는 실시예 1에서 획득한 항 완전형-hCG단일클론항체를 결합시킨 착색미립자의 농도보다 2∼10배 높게 첨가하여 제조하거나, 항 변형-hCG 단일클론항체 농도를 2∼10배 높게 결합 시켜 사용함으로써 검사 시료에 상대적으로 적게(10%) 포함된 변형-hCG를 확연히 감지할 수 있게 하였다.
또한 실시예 2에서 획득한 항 베타-hCG 단일클론항체 및 실시예 1에서 획득한 항 알파-hCG 단일클론항체를 착색미립자패드로 제조 할 경우에는, 멤브레인에 고정되는 항 변형-hCG 단일클론항체의 농도를 항 완전형-hCG 단일클론항체의 농도보다 2-10배 높게하여 고정시킴으로써 변형-hCG를 확연히 감지할 수 있도록 하였다.
실시예 5: 항체 고정 멤브레인의 제조(결과 표시판)
항체가 고정된 부위에서 정상 임신 및 자궁외 임신에 반응하는 결과선을 만들기 위하여 먼저 알파-hCG를 인식하여 결합하는 단일클론항체와 베타-hCG를 인식하여 결합하는 단일클론항체를 니트로셀룰로오스 멤브레인에 각각 일직선이 되게 점적하였다. 본 발명에 사용된 항체는 1∼4.0 mg/ml 농도로 만들어 최종 멤브레인 상에 0.5-5㎍/cm가 되도록 점적하여 고정하였으며, 점적용액은 0.1∼2%의 슈크로오스를 포함한 5∼50mM 인산염완충액을 사용하였다. 그리고 단일클론항체의 점적부위 상단에는 반응 종료선(도1a 및 도2b의 C)을 점적하였는데 0.5∼2 mg/ml 농도의 토끼 항-쥐 면역글로블린(IgG) 다가항체를 사용하였으며, 점적용액은 0.1∼2%의 슈크로오스를 포함한 5∼50mM 인산염완충액을 사용하였다. 점적이 끝난 항체 점적 멤브레인은 실온에서 2시간 동안 건조하였다. 나타내고자 하는 결과선의 표시 형태에 따라 점적 항체와 점적 형태를 달리할 수 있다. 도1에 나타낸 진단키트는 각기 다른 멤브레인에 항 알파-hCG 단일클론항체와 항 베타-hCG 단일클론항체를 점적하여 고정시켜 제조한 키트이다. 도2에 나타낸 진단키트는 결과선이 한 멤브레인에 표시되도록 하기 위하여 두 항체를 직선이 되도록 하여 한 멤브레인에 점적하여 고정시켜 제조한 키트이다. 특히 도1과 같은 진단키트의 경우 원하는 결과를 얻기 위하여는 멤브레인에 고정된 항체와 착색미립자에 결합된 항체의 선정이 매우 중요하다. 즉, 항 알파-hCG 단일클론항체가 고정된 멤브레인을 사용할 경우에는 항 완전형-hCG 단일클론항체가 결합된 착색미립자패드를 사용함이 바람직하며, 항 베타-hCG단일클론항체가 고정된 멤브레인을 사용할 경우에는 항 변형-hCG 단일클론항체가 결합된 착색미립자 패드를 사용함으로서 변형-hCG를 감지할 수 있도록 함이 바람직하다. 만약 항 변형-hCG 단일클론항체가 고정된 멤브레인을 사용할 경우에는 항 베타-hCG 단일클론항체가 결합된 착색미립자패드를 사용하고, 항 완전형-hCG 단일클론항체가 고정된 멤브레인을 사용할 경우는 항 알파-hCG 단일클론항체가 결합된 착색미립자패드를 사용함이 바람직하다.
실시예 6: 시료 점적패드 및 시료 흡수패드
시료 점적패드는 유리섬유(Millipore사, 미국) 또는 셀룰로오스 종이(Whatman 사, 미국)를 사용하였다. 그리고 시료 흡수패드는 셀룰로오스 종이(Whatman 사,미국)를 사용하였다.
실시예 7: 임신 및 자궁외 임신 동시진단 스트립의 제조
도3과 같이 실시예 5에서 제조된 항체점적 멤브레인을 접착성 폴리에스테르 지지판에 접착시킨 다음 그 위에 실시예 4에서 제조한 항체 결합 착색미립자 패드를 1∼3mm 겹치도록 접착시켰다. 그 다음 시료 점적 패드를 길이방향으로 1∼10mm 겹치도록 접착시키고, 시료 흡수패드를 1∼5mm 겹치도록 접착시켜 동시진단 스트립을 제조하였다. 이와 같이 제조된 동시진단스트립은 도 1(a) 및 도2(a) 에서와 같은 플라스틱 하우징에 넣고 조립하여 정상 임신 및 자궁외 임신 동시진단키트를 완성하였다.
시험예 1: hCG 표준용액을 이용한 동시진단키트의 평가
상기 실시예에 따라 제조된 진단키트의 특이도를 조사하기 위해 Zymed사에서 시판하고 있는 완전형-hCG(cat.No. 14-1401)와 베타-hCG(cat.No. 14-1402-1)를 구입하여 hCG 표준용액을 제조하고 이를 이용하여 동시진단키트를 평가하였다.키트는 완전형-hCG와 반응하는 단일클론항체 및 변형-hCG와 반응하는 단일클론항체를 각각 실시 예 4와 같은 방법으로 착색미립자에 결합시켜 착색미립자 패드를 제조하였다. 그리고 항 알파-hCG 단일클론항체 및 항 베타-hCG 단일클론항체를 각각 실시예 5에서와 같이 니트로셀룰로오스 멤브레인에 점적하여 항체 고정 멤브레인을 제조하였다. 이와 같이 제조된 항체 점적 멤브레인 2종, 착색미립자 패드 2종을 각각 서로 교차하여 조립한 다음 시료 점적패드 및 시료 흡수패드를 각각 접착시켜 동시진단스트립을 제조하였다.
표준 용액은 아래와 같이 음성 표준액과 양성 표준액을 제조하여 시험에 사용하였다.
음성 표준액: 50mM 인산염 완충액(pH 7.2)
양성 표준액1: 완전형-hCG 50mIU/ml 인산염 완충액(pH 7.2)
양성 표준액2: 베타-hCG 10 mIU/ml 인산염 완충액 (pH 7.2)
양성 표준액3: 완전형 hCG 50mIU + 베타 hCG 10mIU/ml 인산염
완충액(pH 7.2)
위 표준 용액을 키트의 시료 투입구에 약 500㎕를 투입한 다음 3분간 관찰하여 결과선의 출현 유무로 음성과 양성의 결과를 판정하였다.
시험결과는 아래 표 2와 같다.
표 2에 나타난 바와 같이 hCG가 포함되지 않은 음성 표준액에서는 멤브레인에 항체 1 과 2가 고정되어 있는 부위에 아무런 선이 나타나지 않아 음성으로 판정하게 된다. 완전형-hCG인 양성 표준액 1에서는 항 완전형-hCG 단일클론항체가 결합된 착색미립자와 항 알파-hCG 단일클론항체 2가 고정된 부위에서 강한 반응성을 보였으며, 그외 단일클론항체를 이용한 키트에서는 약한 반응성을 나타내었다. 베타-hCG 표준액인 양성 표준액 2에서는 항 변형-hCG 단일클론항체가 결합된 착색미립자와 항 베타-hCG 단일클론항체 1이 고정된 부위에서 강한 반응성을 보였다. 특히 항 완전형-hCG 단일클론항체가 결합된 착색미립자를 사용한 키트에서는 멤브레인에 고정된 어떠한 항체와도 반응성을 보이지 않아 항 완전형 단일클론항체는 베타-hCG와는 전혀 반응성이 없음을 알 수 있었다. 완전형-hCG와 베타-hCG가 일정 비율 혼합되어 있는 양성 표준액 3에서는 항 완전형-hCG 단일클론항체가 결합된 착색미립자와 항 알파-hCG 단일클론항체 2가 고정된 부위에서 강한 반응성을 보였으며, 또한 항 변형-hCG 단일클론항체가 결합된 착색미립자와 항 베타-hCG 단일클론항체 1이 고정된 부위에서 강한 반응성을 보였다. 이러한 결과로 볼 때 항 완전형-hCG 단일클론항체는 항 알파-hCG 단일클론항체와 짝이 되어 완전형-hCG를 감지할 수 있으며, 변형-hCG의 감지는 항 변형-hCG 단일클론항체와 항 베타-hCG 단일클론항체를 이용하였을 때 가능하다는 것을 알 수 있었다.
이러한 결과는 착색미립자와 멤브레인에 고정되는 항체를 교체하여 사용하여 도 유사하게 나타나 사용하는 항체의 짝이 중요하다는 것을 확연히 알 수 있 었다. 표3은 항 알파-hCG 단일클론항체와 항 베타-hCG 단일클론항체를 착 색미립자에 결합시키고 항 완전형-hCG 단일클론항체 및 항 변형-hCG 단일클 론항체를 멤브레인에 고정시켜 동시 진단키트를 제조하여 표준 hCG 용액으로 시험하였을 때의 결과를 나타낸 것이다.
위 시험예에 나타난 바와 같이 결국 시료속에 포함되어 있는 hCG의 형태에 따라 출현하는 선의 위치와 선의 강도가 다르게 나타나 정상 임신과 자궁외 임신의 결과를 육안으로 판정할 수 있었다.
시험예 2: 정상 임신 및 자궁외 임신 동시진단키트를 사용한 임산부 뇨의 분석정상 임신 및 자궁외 임신에서 특이하게 발견되는 완전형-hCG 및 변형-hCG를 분석하기 위한 시료로서 비 임신뇨, 정상 임신뇨, 자궁외 임신뇨를 각각 본 발명의 동시진단키트에 적용한 결과는 표 4와 같다. 이때 사용된 진단키트는 도1(a) 형태의 키트를 사용하였다.
표 4에 나타난 바와 같이 비 임신뇨에서는 NP 및 EP의 결과 판독선에 아무런 선이 출현하지 않았으며, 정상 임신뇨에서는 NP 및 EP의 결과 판독선이 유사한 강도로 출현하였다. 특히 자궁외 임신뇨에서는 NP에서 보다 EP의 결과 판독선에서 강한 선이 출현하여 정상 임신과 자궁외 임신을 확연히 구별하여 판독할 수 있었다.
표 4. 동시 진단키트의 임상 정확도 측정
시료 수분류 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
비임신 뇨 NP - - - - - - - - - -
EP - - - - - - - - - -
정상임신뇨 NP +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
EP +++ +++ +++ +++ ++ +++ +++ ++ +++ +++
자궁외 임신뇨 NP + - + + - - + - - +
EP +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
기호 : - (반응하지 않음), + (매우 소량 반응함), +++ (강하게 반응함)
본 발명은 정상 임신과 자궁외 임신을 동시에 판단할 수 있는 원스텝 임신 진단장치에 관한 것이다. 임산부의 체액은 임신의 형태에 따라 hCG의 형태 또한 달리 하고 있어 본 발명은 이를 면역학적 방법으로 감지하므로써 정상 임신과 자궁외 임신을 초기에 신속하고 정확하게 판단 할 수 있다. 특히 본 발명은 임산부의 뇨 중에 존재하는 완전형-hCG와 변형-hCG를 각각 감지하기 위하여 항 완전형-hCG 단일클론항체는 항 알파-hCG 단일클론항체와 짝이 되도록 하고, 항 변형-hCG 단일클론항체는 항 베타-hCG 단일클론항체와 짝이 되도록 구성하여, 자궁외 임신을 조기에 발견함으로써 모성 사망률을 감소시킬 수 있는 효과가 있다.

Claims (11)

  1. 항체점적멤브레인과 항체결합착색미립자패드를 포함하는 면역크로마토그래피법에 의한 임신진단장치에 있어서, 항체가 항 알파-hCG 단일클론항체, 항 베타-hCG 단일클론항체, 항 완전형-hCG 단일클론항체 및 항 변형-hCG 단일클론항체를 조합하여 구성된 것을 특징으로 하는 임신진단장치.
  2. 제 1항에 있어서, 시료점적패드와 시료흡수패드를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 임신진단장치
  3. 제 1항에 있어서, 상기 항체는 항-쥐 면역글로블린 다가항체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 임신진단장치
  4. 제 1항에 있어서, 상기 항체점적멤브레인은 항 알파-hCG 단일클론항체 및 항 베타-hCG 단일클론항체로 구성하고, 상기 항체결합착색미립자패드는 항 완전형-hCG 단일클론항체, 항 변형-hCG 단일클론항체 및 착색미립자로 구성된 된 것을 특징으로 하는 임신진단장치.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 항체점적멤브레인은 항 완전형-hCG 단일클론항체 및 항 변형-hCG 단일클론항체로 구성하고, 상기 항체결합착색미립자패드는 항 알파-hCG 단일클론항체 , 항 베타-hCG 단일클론항체 및 착색미립자로 구성된 것을 특징으로 하는 임신진단장치.
  6. 제 4항 또는 제 5항에 있어서, 상기 착색미립자는 셀레늄, 골드 및 폴리스티렌중에서 1종이상을 선택하여 사용하는 것을 특징으로 하는 임신진단장치.
  7. 제 4항 또는 제5항에 있어서 , 상기 항 완전형-hCG 단일클론항체와 항 변형-hCG 단일클론항체가 농도비 1: 2-10으로 구성된 것을 특징으로 하는 임신진단장치.
  8. 제 1항에 있어서, 자궁외 임신선, 정상임신선, 시험종료선으로 구성되어 있고, 비임신일 경우 시험종료선만 나타나고;
    정상임신일 경우 시험종료선 및 동등한 강도의 자궁외 임신선과 정상임신선이 나타나고;
    자궁외 임신일 경우 시험종료선 및 자궁외 임신선만 나타나거나, 시험종료선, 자궁외 임신선 및 낮은 강도의 정상임신선이 나타나는 것을 특징으로 하는 임신진단장치.
  9. 제 8항에 있어서, 자궁외 임신선은 항 알파-hCG 단일클론항체, 정상 임신선은 항 베타-hCG단일클론항체 및 시험종료선은 항- 쥐면역글로블린 다가항체로 구성된 것을 특징으로 하는 임신진단장치.
  10. 제 8항에 있어서, 자궁외 임신선은 항 완전형-hCG 단일클론항체, 정상 임신선은 항 변형-hCG단일클론항체 및 시험종료선은 항- 쥐면역글로블린 다가항체로 구성된 것을 특징으로 하는 임신진단장치
  11. 제 9항에 있어서, 항 알파-hCG 단일클론항체 및 항 베타-hCG 단일클론항체는 슈크로오즈 0.1%-0.2%, 인산염완충액 5-50mM의 고정 완충액에 녹인 후 멤브레인상에 0.5-5㎍/cm가 되도록 고정하는 것을 특징으로 하는 임신진단장치.
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