KR20020012838A

KR20020012838A - 자궁 경부암 진단 키트

Info

Publication number: KR20020012838A
Application number: KR1020000046065A
Authority: KR
Inventors: 김성수; 강용구
Original assignee: 김성수; 주식회사 바이오그랜드
Priority date: 2000-08-09
Filing date: 2000-08-09
Publication date: 2002-02-20

Abstract

본 발명은 자궁 경부암을 정확하게 진단할 수 있는 진단 키트에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 MCM5와 사람 파필로마 바이러스(HPV) 16형과 18형의 E6, E7에 대한 항체를 결합시킨 라텍스 비드를 포함하는 진단키트에 관한 것으로 상기 진단키트는 자궁 경부암을 간편하고 정확하게 진단하여 발병률을 낮추는데 이용될 수 있다.

Description

자궁 경부암 진단 키트{A Diagnostic Kit for Cerbical Cancer}

자궁 경부암은 우리나라 여성에서 여성 생식기를 포함한 모든 장기에 발생하는 암 중 가장 발생빈도가 높다. 자궁 경부암의 발생원인은 아직까지도 정확히 밝혀져 있지 않으나 과거로부터 조혼이나 조기성교, 다수의 성교 대상자 등의 여러 역학적 요인들이 알려졌으며 특히 사람 파필로마 바이러스(Human Papilloma virus; 이하 "HPV"라 함) 감염에 의한 성병이 원인인자로 알려져 왔다.

자궁 경부암의 조기 진단법에는 1942년 개발된 팝 스미어 테스트(Pap smear test) 방법과 자궁경부 확대 촬영 검사 등 몇가지 방법이 있는데 일반적으로 팝 스미어 테스트를 가장 많이 사용하고 있다. 이 방법은 간단한 조치로 검사를 할 수 있지만 높은 위음성률을 보이는 것이 단점이다.

1942년 팝 스미어 테스트가 개발된 이래로 자궁 경부암을 예방할 수 있게 되어 공중보건에 대단한 성과를 가져왔다. 하지만 범국민적인 진단 프로그램에도 불구하고 자궁 경부암은 아직도 여성 암 중 최다 발병 및 사망률을 나타내고 있다. 최근에는 자궁암의 발생 빈도가 감소하고 있기는 하지만 여전히 가장 높은 빈도를보이고 있는 것이 현실이다. 여기에는 여러가지의 원인이 있겠지만 그 중 하나는 팝 스미어 테스트의 높은 위음성률일 것이다.

자궁 경부암의 경우 조기 발견시 완치가 가능하기 때문에 다른 암보다도 조기 진단이 아주 중요하다. 따라서, 간편하고 정확하게 자궁 경부암을 검사할 수 있게 된다면 자궁 경부암의 발병율을 획기적으로 낮출 수 있을 것이다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술이 가지는 문제점을 해결하여 정확도(fidelity)를 좀 더 높이며, 자궁 경부암을 간단한 방법으로 진단할 수 있도록 하여 조기에 자궁 경부암을 진단, 치료할 수 있도록 하는데 그 목적이 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 MCM5와 HPV 16형과 18형의 E6와 E7에 대한 항체를 결합시킨 라텍스 비드를 포함하는 진단시약을 제공한다.

즉, 본 발명은 MCM5 단백질, HPV 16형 E6, HPV 16형 E7, HPV 18형 E6, HPV 18형 E7 각각에 대한 폴리클론항체를 결합시킨 라텍스 비드, 50mM 인산 나트륨, 0.1% SDS, 10㎍/ml DNAseⅠ으로 구성된 시료 완충용액, 표준 양성시약, 표준 음성시약 및 마이크로 플레이트로 구성된 자궁 경부암 진단 키트를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 진단 키트에 있어서, MCM5 단백질, HPV 16형 E6, HPV 16형 E7, HPV 18형 E6, HPV 18형 E7 각각에 대한 폴리클론항체는 각각 1㎎/㎖의 농도로 라텍스 용액과 1:1(v/v)로 반응시키며, 폴리클론항체를 결합시킨 라텍스 비드는 최종농도가 2%가 되도록 하는 것을 특징으로 하는 자궁 경부암 진단 키트를 제공한다.

본 발명의 내용을 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 항원-항체 반응을 이용해 자궁 경부암을 조기 진단하기 위하여 MCM5에 대한 항체와 HPV 16형의 E6, E7 단백질과 18형의 E6, E7 단백질에 대한 항체를 결합한 라텍스 비드를 진단시약으로 사용한다.

라텍스 비드에 결합시키는 항체는 대장균에서 발현된 재조합 MCM5 단백질과 HPV 16형, 18형의 E6, E7 단백질을 토끼에 접종하여 만든 폴리클로날 항체 (polyclonal antibody)나 상업적으로 시판되고 있는 폴리클로날 항체를 이용한다. 라텍스 비드는 강한 소수성을 유지하여 항체와의 소수성 결합에 유리하기 때문에 폴리스티렌 라텍스가 바람직하며, 평균 직경이 0.05 - 5㎛인 것이 바람직하다.

항체를 라텍스 비드에 결합시키는 과정에서 항체의 양은 단백질 함량으로 1 mg/ml를 사용하는 것이 바람직하고 소 혈청 알부민이 포함된 트리스-염산(Tris-Cl) 완충용액을 사용하여 37℃에서 30분간 반응시키고 고속 원심분리하여 침전물을 인산염 완충용액으로 세척하여 항체가 결합된 라텍스 비드를 제조할 수 있다.

또한 본 발명은 상기 진단 시약을 포함하는 자궁암 진단 키트를 제공한다. 구체적으로 본 진단키트는 위의 항체들을 결합시킨 진단시약, 반응을 시키는 마이크로 타이트레이션 플레이트(96 well plate), 표준 양성 시약, 표준 음성 시약으로 구성된다.

본 발명은 여성의 자궁경부로부터 채취된 시료를 계면활성제와 디엔에이 분해효소가 포함된 인산염 완충용액에 넣어서 시료 용액을 만들고 이 시료용액을 진단시약과 반응시킨 후, 응집 반응을 표준 시약과 비교하여 판단하는 진단 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 실시예에서 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 내용이 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: MCM5에 대한 항체의 제조

1) HeLa 세포로부터 크로모좀(chromosomal) DNA 및 중합효소 연쇄반응

중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; 이하 "PCR"이라 함)에 사용할 세포 게놈 DNA(genomic DNA)는 다음과 같이 준비한다. 약 10⁶세포를 0.6 ml 마이크로튜브(microtube)에 원심분리로 수거해 0.2 x PBS 70 ㎕에 현탁한 후 55℃에서 1시간동안 프로티네이즈 K(proteinase K)로 분해시킨 다음 94℃에서 30분 처리로 프로티네이즈 K를 불활성화시키고 -20℃에서 보관한다.

2) 중합효소 연쇄반응(PCR)

10X 반응 완충용액(100 mM Tris-HCl, pH 8.3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl₂, 0.01% 젤라틴) 2㎕, 데옥시뉴클레오타이드 혼합물(각각 10mM) 4㎕, MCM5 개시체(10pmol/㎕) 각 2㎕, 주형 DNA 100ng, Taq DNA 폴리머라아제 (5unit/㎕)를 넣고 증류수를 전체 부피가 20㎕가 되도록 채우고 PCR을 수행한다. PCR 조건은 다음과 같다. 94℃에서 5분, 63℃에서 40초, 72℃에서 40초로 1 사이클, 94℃에서 40초, 63℃에서 40초, 72℃에서 40초로 35 사이클, 94℃에서 40초, 63℃에서 40초, 72℃에서 5분으로 1 사이클동안 수행한다. PCR 산물의 일부를 취하여 2% 아가로즈 젤에서 30 분간 전기이동하고 에티듐 브로마이드(ethidium bromide) 용액에서 염색하여 UV 하에서 DNA 증폭 여부를 확인한 후 다음 실험을 수행하기까지 -20℃에 보관한다.

3) 서브클로닝(Subcloning)

① 결찰(Ligation)

PCR 산물에 2㎕의 3M 아세트산 나트륨(sodium acetate)과 50㎕의 에탄올을 넣고 -20℃에 30분간 둔 후, 15,000rpm, 4℃로 30분간 원심분리시킨다. DNA 펠렛을 70% 에탄올로 세척하고 진공으로 건조시켜 증류수 30㎕에 녹인다. 이 중 5㎕를 새 튜브로 옮기고 여기에 10X 결찰 완충용액(ligation buffer; 0.5M Tris-Cl, pH7.6, 100mM MgCl₂, 100mM 다이티오쓰레이톨(dithiothreitol), 10mM ATP) 1㎕, TA 클로닝 벡터(Novagen) 1㎕를 넣고 증류수로 10㎕가 되도록 채운다. 16℃에서 밤새 반응시킨다.

② 형질전환(Transformation)

결찰시킨 DNA 5㎕를 이 콜리 DH5 형질전환용 세포(Novagen) 20㎕에 넣고 얼음에서 1시간동안 둔 후, 42℃에서 40초간 열 충격(heat shock)을 준다. 다시 얼음에 5분간 두고 LB 배지 1ml을 넣고 37℃에서 1시간동안 배양한다. 배양액을 앰피실린이 100㎍/ml 농도로 들어 있는 LB 플레이트에 골고루 덮어 37℃에서 밤새 배양한다.

③ 플라스미드 분리

배양한 LB 플레이트로부터 흰색 콜로니를 골라 LB-앰피실린 브로쓰(broth) 5ml에 접종하고 밤새 배양한다. 배양액 1ml을 튜브로 옮기고 원심분리하여 세포만을 모은다. 여기에 용액 I (50mM 글루코스, 25mM Tris-Cl, pH8.0, 10mM EDTA) 100 ㎕을 넣고 세포를 균질화시키고 용액 II (0.2N NaOH, 1% SDS) 200㎕을 넣어 두세번 흔들어 섞어준다. 용액 III (3M 아세트산 칼륨(potassium acetate), 5M 아세트산) 200㎕을 넣어 잘 섞어준 후, 15,000rpm, 4℃에서 30분간 원심분리한다. 상층액을 새 튜브로 옮기고 에탄올 1ml을 넣고 다시 15,000rpm, 4℃에서 30분간 원심분리한다. DNA 펠렛을 70% 에탄올로 세척하고 진공으로 건조시켜 증류수 100㎕에 녹인다. 1% 아가로즈 젤 전기이동을 수행하여 확인한다.

4) 서열결정(Sequencing)

서열결정은 Amersham-USB사의 Sequenase 버젼 2.0 키트를 이용하여 키트에서 제시한 방법으로 수행한다. 정제된 플라스미드 5㎍에 1/10부피의 알칼리 용액(2N NaOH, 2mM EDTA)을 넣고 37℃에서 30분간 두었다가 에탄올 침전시킨다. DNA 펠렛에 증류수 7㎕, 반응 완충액 2ℓ, 개시체 1㎕를 넣는다. 5배 희석된 표지 혼합물(labeling mix) 2㎕, 0.1M DTT 1㎕,³⁵S-dATP 0.5㎕, Sequenase DNA 폴리머라아제(polymerase) 2㎕를 넣고 상온에서 5분간 반응시킨다. 반응물을 미리 2.5㎕ 씩 덜어놓은 반응종료 혼합물(termination mix)에 3.5㎕씩 옮긴다. 37℃에서 10분간 반응시키고 멈춤 염색액(stop dye) 4㎕씩 넣어 반응을 종결시킨다. 7M 우레아가 함유된 6% 폴리아크릴아미드 젤에서 전기이동하고 젤을 진공 건조기(vacuum drier)로 건조시킨 후, X-선 필름에 감광시켜 결과를 판독한다.

5) 발현 벡터(Expression vector)로의 도입 및 발현

발현 벡터로는 pET28a(+)를 사용하는데, pET28a(+) 벡터는 6개의 히스티딘 태그(histidine tag)를 가지는 융합 단백질을 만든다. 이 6개의 히스티딘 태그는 니켈 이온(Nickel ion)과 결합하는 성질을 가지고 있고, Ni 이온을 가지는 수지(resin)를 이용하여 컬럼 크로마토그래피(column chromatography)를 수행하면 재조합 단백질만을 쉽게 정제할 수 있다.

PCR 생성물을 제한효소로 절단하고 pET28a(+) 벡터와 결찰(ligation)시킨다. 이 콜리 BL21에 형질전환시킨다. 50㎍/ml 카나마이신(kanamycin)이 들어 있는 5ml의 액체 배지에 형질전환된 균을 접종하여 37℃에서 밤새 배양한 다음, 다시 LB-카나마이신 배지에 1%로 접종하여 1시간 30분 동안 배양(약 A600=0.6) 한다. 여기에 IPTG를 1mM 되게 첨가하여 유도(induction)시킨 뒤, 3시간 더 배양한다. 배양한 균체를 원심분리하여 모으고 완충액(50mM 인산 나트륨(sodium phosphate), pH7.5, 200mM NaCl, 10mM 2-머캅토에탄올(mercaptoethanol))에 현탁시키고 초음파분쇄(sonication)를 실시한다. 원심분리하고 상층액(supernatant)을 모아서 10% SDS-폴리아크릴아미드 젤에서 전기이동하여 발현된 재조합 MCM5 단백질을 확인한다.

6) 발현된 재조합 단백질의 정제

LB-카나마이신 배지에서 세포를 배양하고 OD값이 0.6정도일때 IPTG를 1mM 농도로 넣어 유도시킨 후 3시간 더 배양한다. 세포를 4℃에서 원심분리하여 세포를 모으고 이 펠렛에 초음파 분쇄용 완충액을 가하여 재현탁시키고 얼음 위에서 초음파 분쇄시킨다. 원심분리하여 상층액을 Ni-NTA 아가로즈 수지(agarose resin; QIAGEN사)가 담긴 컬럼에 통과시켜 재조합 단백질을 수지에 결합시킨다. 초음파 분쇄용 완충액으로 씻어주고 세척 완충액 I (50mM 인산 나트륨, 200mM NaCl, 10 mM 2-머캅토에탄올, pH 6.0)과 세척 완충액 II (50mM 인산 나트륨, 1000mM NaCl, 10 mM 2-머캅토에탄올, pH 6.0)로 차례로 세척한 후, 용출 완충액(250mM 이미다졸, 50mM 인산 나트륨, pH 6.0, 200mM NaCl)를 통과시켜 단백질을 용출한다. 모아진 분획을 10% SDS-PAGE를 이용하여 분석하고 재조합 단백질이 있는 부분을 모아서 농축한다.

7) 폴리클론 항체(Polyclonal Antibody) 생성

① 면역화(Immunization)

토끼로부터 면역화하기 전에 혈액을 채취하고 혈청(serum)을 분리하여 보관한다(대조군으로 사용). 정제된 재조합 MCM5 단백질(1mg/ml) 2ml을 CFA(complete Freunds adjuvant) 2ml과 섞는다. 완전한 에멀젼이 되도록 섞어서 주사한다. 2주일 후 혈액을 채취하고 혈청을 분리해 보관하고 다시 면역화시킨다. 이때는 CFA 대신 IFA(incomplete Freunds adjuvant)를 사용한다. 2주나 4주 후에 또다시 boost시키고 2주일 후 혈액을 채취하고 혈청을 분리하여 보관한다.

② 혈청 분리 및 특이성(specificity) 측정

토끼로부터 혈액을 모두 모으고 4℃에서 혈액이 굳도록 방치한 후 4,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액의 혈청을 모아 여러개의 튜브에 나누어 -20℃에서 보관한다. 특이성은 ELISA 방법으로 측정한다.

재조합 MCM5 단백을 마이크로플레이트에 50㎕씩 나누어서 넣고 37℃에서 2시간 둔다. 플레이트를 증류수로 씻고 블라킹 완충액(blocking buffer; 0.25% BSA, 0.05% 트윈(tween) 20, 0.05% 소듐 아자이드, 1mM EDTA)을 채운 후 상온에서 30분간 둔다. 블라킹 완충액으로 희석된 항체 50㎕를 넣고 상온에서 2시간 이상 둔다. 물로 3번 씻고 블라킹 완충액을 채워 상온에서 10분 둔다. 50㎕의 현상 반응제(developing reagent; 항-Ig-알칼린 포스파타아제 콘쥬게이트)를 넣고 상온에서 2시간 이상 둔다. 물로 3번 씻고 75㎕의 MUP(4-methylumbelliferyl phosphate)를 넣고 상온에서 1시간 둔 후 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 측정한다. 0.5M NaOH 25㎕를 넣어 반응을 멈춘다.

실시예 2: 자궁경부암 진단시약의 제조

본 발명은 자궁 경부암 진단에 사용하는 항체로써, 상기 실시예 1과 같이 대장균에서 발현된 재조합 MCM5 단백질을 토끼에 주입하여 얻은 폴리클론 항체나 상업적으로 시판되는 항-MCM5 항체(Santa Cruz Biotechnology사), 그리고 HPV 16형과 18형의 E6, E7 단백질을 토끼에 주입하여 얻은 폴리클로날 항체나 상업적으로 시판되는 HPV 16형과 18형의 E6, E7 단백질에 대한 항체(Santa Cruz Biotechnology사)를 사용한다.

항체의 단백질 함량을 1 mg/ml의 농도로 맞춘다. 라텍스 비드(Sigma사, 직경 0.05∼5㎛)는 반응 완충용액(100 mM 트리스-염산 (pH 7.5), 200 mM 염화나트륨, 40mg/ml 소 혈청 알부민)에 최종 입자 함량이 2%가 되도록 한다. 항체 용액과 라텍스 용액을 1:1로 섞고 30℃에서 2시간 동안 반응시킨 다음 20,000g으로 원심분리하여 침전물을 완충용액(100mM 트리스-염산 (pH 7.5), 200mM 염화나트륨, 40mg/ml 소 혈청 알부민)으로 2번 세척하고 완충용액으로 최종농도 2%가 되도록 한다.

이 작업은 각각의 항체에 대해서 따로 수행한다. 즉, MCM5, HPV 16형의 E6, HPV 16형의 E7, HPV 18형의 E6, HPV 18형의 E7의 다섯가지 반응을 각각 수행한다.

실시예 3: 자궁 경부암 시료 용액의 제조

여성의 자궁 경부로부터 브러쉬 또는 면봉으로 채취한 시료를 시료 완충용액 (50mM 인산 나트륨, 0.1% SDS, 10㎍/ml DNAse Ⅰ) 5ml 에 현탁시킨다. 이를 37℃에서 10분동안 또는 상온에서 30분동안 반응시킨다.

실시예 4: 자궁 경부암의 진단

본 발명은 실시예 3에서 제조한 시료 용액과 실시예 2에서 제조한 진단 시약을 이용하여 다음과 같은 방법으로 반응시키고 그 결과를 판정하여 자궁 경부암 여부를 진단한다.

항체가 결합되어 있는 라텍스 비드가 함유되어 있는 각각의 진단 시약을 약하게 흔들어 균질화시키고 이중 25㎕씩을 마이크로 플레이트(96웰 플레이트)의 구멍에 각각 넣고 여기에 실시예 1에서 준비한 시료 용액 25㎕를 각각의 구멍에 넣어 준다. 실온에서 1시간동안 반응시켜 라텍스 응집반응을 유발시킨 다음 그 응집 여부를 관찰한다. 5개의 구멍중 어느 하나라도 응집이 일어났으면 양성으로 판정하고, 모두 응집이 일어나지 않았으면 음성으로 판정한다.

본 발명은 기존의 검사가 결과를 얻기까지 수일이 소요되는 불편함을 없애고 짧은 시간에 보다 정확하게 검사가 가능하기 때문에 여러 가지 장점을 가질 수 있다. 우선 환자가 검사 결과를 보기 위해 병원을 다시 방문해야 하는 불편이 사라지게 되어 경제적으로도 도움이 될 수 있으며, 양성으로 판정된 경우 그 자리에서 조직 검사를 수행할 수 있어 즉각적인 대응이 가능해진다.

또한, 본 발명은 자궁 경부암 진단의 정확도를 높였다.

따라서 본 키트의 사용으로 자궁 경부암의 조기 검진률이 훨씬 높아질 것이며 그 결과 자궁 경부암의 발병율을 감소시킬 수 있다.

Claims

MCM5 단백질, HPV 16형 E6, HPV 16형 E7, HPV 18형 E6, HPV 18형 E7 각각에 대한 폴리클론항체를 결합시킨 라텍스 비드, 50mM 인산 나트륨, 0.1% SDS, 10㎍/ml DNAseⅠ으로 구성된 시료 완충용액, 표준 양성시약, 표준 음성시약 및 마이크로 플레이트로 구성된 자궁 경부암 진단 키트.
제1항에 있어서, MCM5 단백질, HPV 16형 E6, HPV 16형 E7, HPV 18형 E6, HPV 18형 E7 각각에 대한 폴리클론항체는 각각 1㎎/㎖의 농도로 라텍스 용액과 1:1(v/v)로 반응시키며, 폴리클론항체를 결합시킨 라텍스 비드는 최종농도가 2%가 되도록 하는 것을 특징으로 하는 자궁 경부암 진단 키트.