NO843094L

NO843094L - Iga-bindende antistoff

Info

Publication number: NO843094L
Application number: NO843094A
Authority: NO
Inventors: Milan Blake; Emil Gotschlich; Gregory J Russell-Jones
Original assignee: Univ Rockefeller
Priority date: 1982-12-02
Filing date: 1984-08-01
Publication date: 1984-08-01
Also published as: AU563317B2; AU2430784A; JPS60500029A; EP0127681A4; EP0127681B1; CA1221626A; EP0127681A1; WO1984002194A1; JPH074267B1

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for separering av IgA-bindende antigener isolerbare fra gruppe B streptokokker.

IgA slik det er kjent, er et immunoglobulin eller en klasse av antistoffer som er beslektet ved immunitet mot infeksjoner med bakterier og vira ved glukosaloverflater. De er tilstede i alle pattedyrs sekresjoner innbefattende mel, spinalvæske og vaginalutskillinger.

Som alle humane antistoffer omfattes IgA av tunge og lette kjeder, og erkarakterisert veden krystallinsk fraksjon, Fc, og en antistoff-fraksjon, Fab. Det er to underklasser av IgA. Disse er IgA^og IgA2»De adskiller seg i strukturen av de tunge kjeder. I tillegg eksisterer antistoffer i monomerform (molekylvekt ca. 160.000) og dimerform i serum. Bare dimer-formen eksisterer i pattedyrsekreter, og denne er forbundet til en ekstradel kjent som sekretoriske stykker. IgA-antistoffer, som alle antistoffer, er dannet av lymfocytter av immunsystemet. Det sekretoriske området er dannet av epitelceller som forer overflaten av legemsstrukturer sånn som bryst, tarmkanalen, spyttkjertler eller kjønnskanalen. IgA produsert av lymfocytter opptas i epitelceller fra siden i kontakt med det sirkulerende blod, sekretoriske områder tilføres, og det sekreterende IgA utskilles i den ytre overflate av epitelcellen.

Oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte for separering av et IgA-bindende protein fra overflaten av gruppe B streptokokker, idet proteinet har en molekylvekt på 132.000 bestemt med natrlumdodecylsulfatpolyacrylamidgelelektroforese, og er i stand til å binde til humant IgA ved reaksjon spesielt med Fc-delen herav, Idet fremgangsmåten er kjennetegnet ved ekstrahering av streptokokker i logfasen med et vandig medium inneholdende et material som vil ødelegge bindingen mellom celleoverflaten og proteinet for å danne en oppløsning inneholdende proteinet og tilsetning av et proteinutfellende reagens for å utfelle det ønskede produkt, eventuelt

A. l. ekstraherlng av streptokokker i logfasen med en vandig buf f eroppløsning av 1% til 1056 polyetylenglykol-p-isooktylfenyleter eller polyoksyetylensor-bitanmonooleat som ikke-ionisk detergent i 36 til 72 timer ved pH 6 til 9,

2. separering av den faste delen fra den resulterende bakteriesuspensjon, og 3. tilsetning av 60$ til 90% etanol som et proteinutfellende reagens ved 0°C til 10°C for å utfelle det IgA-bindende protein, eventuelt B. l. ekstraherlng av streptokokker i logfase med en kokende vandig bufferoppløsning av 1% til 10% natrlumdodesylsulfat som anionisk detergent i 10 minutter til 2 timer ved pH 6 til 9 2. separering av den faste del fra den resulterende bakterielle suspensjon, og 3. tilsetning av b0% til 90% etanol som et proteinutfel-lingsmiddel ved 0°C for å utfelle det IgA-bindende protein, eventuelt C. ekstraherlng av streptokokker i logfase med 0,5 til 0,25 molar saltsyre som vandig mineralsyre ved 50" C til 60°C i 1,5 til 2,5 timer, nøytralisering av oppløsningen med natriumhydroksyd som fortynnet alkalisk reagens, separering av den faste del fra den resulterende bakterielle suspensjon og tilsetning av trikloredikksyre som proteinutfellende reagens, for å utfelle IgA-bindende protein.

Gruppe B streptokokker er en klasse mikroorganismer som er utstrakt undersøkt og klassifisert. Ingen fra denne klasse har tidligere vært kjent for å binde IgA. Det er nå oppdaget at visse av disse streptokokker, generelt av lb eller lc serotypen vil binde til IgA. Videre er det blitt funnet fremgangsmåter for å separere et IgA-bindende protein (IgABP) fra overflaten av gruppe B streptokokker hvor det opptrer.

En slik metode er å oppvarme streptokokker i fortynnet vandig mineralsyre ved 50-60°C fra 1,5 til 2,5 timer. Den foretrukne syre er fortynnet hydrokloridsyre, dvs. 0,5 til 0,25 M, men andre fortynnede mineralsyrer kan anvendes. Den foretrukne metode er å oppvarme i 2 timer ved 56" C i 0,2 M saltsyre. Oppløsningen nøytraliseres med fortynnet alkalisk reagens, f.eks. 0,2 M natriumhydroksyd. Det ønskede produkt kan utfelles ved tilsetning av trikloreddiksyre eller andre reagenser og deretter renses.

En alternativ metode er å blande streptokokker i en fortynnet oppløsning av et ikke-ionisk detergent for en periode fra ca. 36 til 72 timer, fortrinnsvis 40-50 timer. Proteinet utfelles i et valgt reagens som etanol. Det kan ytterligere renses.

Den foretrukne metode for isolering av IgABP ifølge oppfinnelsen er ved koking I et anionisk detergent.

Egnede ikke-ioniske detergenter for bruk ifølge oppfinnelsen Innbefatter også en "Triton X-100" og "Tween 20". Begge er velkjent og kommersielt tilgjengelige. Førstnevnte er en polyetylenglykol p-isooktylfenyleter. Sistnevnte er polyok-syetylensorbitanmonooleat. Det foretrukkede anioniske detergent er det kommersielt tilgengelige natriumdodecylsulfat. Andre er kjent og kan benyttes.

Den nå foretrukne metode for å isolere IgABP under anvendelse av anionisk detergent er følgende: 10 ml av gruppe B streptokokkarten H36B 5 ble dyrket til siste log-fase 1 Todd-Hewitt buljong. Bakteriene ble sammenpresset til små kuler ved sentrifugering og deretter kokt i 1 ml av 2% SDS i vann i 10 minutter.

Bakteriene ble fjernet ved sentrifugering, og proteinene i supernatanten ble utfelt ved tilsetning av 0,5 ml 30% trikloreddiksyre. Pelleten oppnådd ved sentrifugering ble vasket en gang med etanol og en gang med aceton.

Den gjenværende pellet ble suspendert i 25 ml av standard SDS-PAGE kokeoppløsning og utsatt for elektroforese i en 10% polyakrylamidklump-gel. Etter farging med "Coomassie brilliant blue" og avfarging besto SDS-PAGE mønsteret overveiende av et enkeltbånd med SDS-PAGE mobilitet tilsvarende til et protein på 132.000 molekylvekt. Et antall mindre bånd med molekylvekter fra 40.000 til 132.000 var også synlig.

Et annet preparat av proteinet var også utsatt for SDS-PAGE etterfulgt av "western blotting" på nitrocellulosestrimler. Strimmelen ble deretter dyppet i 0,05$ Tween i 20-30 minutter, hvoretter det ble tilsatt 1 xIO<7>cpm av<l25>i-markert IgA ved en konsentrasjon på 4 mg/ml til strimmelen i 4 timer. Strimmelen var deretter vasket godt med 0,05$ "Tween 20" og benyttet til å eksponere fotografisk film. Ved denne teknikk kunne det sees at hovedproteinbåndet som sees i SDS-PAGE pluss de fleste av de mindre proteiner var også i stand til å binde<125>I-IgA og derved eksponere den fotografiske film.

Molekylvektmarkerere som benyttes i bestemmelsen av molekyl-vektene IgABP var følgende: beta galaktosldase (136K), human overføring (80K), ovalbumin (45K), cytokrom C (12,5K).

SDS-PAGE er en velkjent og utbredt benyttet fremgangsmåte for adskillelse av proteinmaterialer og benyttende natriumdodecylsulfat og polyakrylamidgelelektroforese. Fremgangsmåte for separering av IgABP ifølge oppfinnelsen fra gruppe B streptokokker omfatter alle ekstraherlng av produktene i et vandig medium Inneholdende et materiale som flytter forbind-elsen av proteinet til celleoverflaten som fortynnet syre eller en detergent. Ekstraheringer finner fortrinnsvis sted mens veksten er i log-fasen. Det utledede materiale separeres fra ekstrakter ved utfelling med et protein-utfellende reagens, fortrinnsvis etanol. Når materialet er separert fra streptokokksubstratet, kan det isoleres og renses som omtalt her. Alternativt kan det benyttes oppløsninger av produktene i relativt fortynnet eller uren tilstand.

Tre fremgangsmåter er blitt omtalt for isolering av produktene. I den sist omtalte metode hadde produktet en molekylvekt på 132.000 på SDS-PAGE elektroforese. Dette er et karakteristisk trekk for IgABP-produkt. Når det utsettes for SDS-page elektroforese, er den åpenbare molekylvekt 132.000.

Hvis produktene omtalt ovenfor som utfelt med trikloreddiksyre eller etanol ble kokt i 2% SDS og deretter behandlet som i den foretrukne fremgangsmåte, vil det være andre større og mindre bånd når det utsettes for SDS-PAGE elektroforese. Disse bånd vil indikere forskjellige molekylvekter. Imidler-tid vil de være i stand til å binde IgA.

Det er derfor klart at produktene separert ifølge oppfinnelsen, dvs. de IgA-bindende proteiner, er kjennetegnet ved en fiksert fraksjon som binder proteinet og en variabel fraksjon som kan være av forskjellig lengde, men alltid er forbundet med en bindende del. Det er tilsvarende en serie piler, alle av forskjellige lengder, men alle anvendelige for det samme formål, da skaftene med forskjellig lengde alle bærer pilhode.

Intet IgA-bindende protein har tidligere blitt omtalt eller isolert fra en gruppe B streptokokker.

Hovedtrekkene av det nye IgABP separert ifølge oppfinnelsen kan anvendes i to bestemte fastfasesystemer. I et slikt system absorberes det bindende protein på en fast fasebærer som i kolonnekromatografi. En annen hovedanvendelse er å binde IgABP til en absorberende overflate som en plastlkk-plate, mer spesielt en prøvebeholder og for bruk i en klasse av prøver vanligvis kjent som en enzymforbindende immunosor-bentprøve eller ELISA.

Anvendelsen av første type av bærer er:

1. IgA-bindende protein som en fastfaseabsorbent kan benyttes til å fjerne IgA av alle klasser fra serum eller et hvilket som helst annet humant fluidum. Eluatet vil være fritt for IgA. Dette er av verdi når man selektivt ønsker å fjerne antistoffer og IgA-klassen fra et sektret eller serum. På den annen side kan IgA immunoglobuliner fjernes fra fastfasebæreren i meget ren form for et hvilket som helst ønsket formål. 2. Det IgA-bindende protein som fast faseabsorbent kan benyttes til å bestemme antigenspesifisiteten av IgA-antistoff. Antigenblandingen som er merket med radioaktivitet, utsettes for serum eller sekretinneholdende IgA-antistoff. Etter antlgen-antistoffbindingen er forettatt, tilsettes den faste bærer og binder bare IgA-antistoff på et hvilket som helst antigen som kan være spesielt bundet til IgA. Den faste bærer vaskes godt, og mengden antigen som er bundet identifiseres ved radioaktivitet. Naturen av det bundede antigen kan undersøkes ved å utføre en gel-elektro-foretisk analyse etterfult av autoradiografi eller fluoro-graf 1.

Anvendelsen for annen type av bærer (plastplate) er:

1. Det IgA-bindende protein kan benyttes for å bestemme konsentrasjonen av IgA i serum eller i et sekret. En metode er å benyttet et polysteren eller annen plastplate og absorbere det IgA-bindende protein til overflaten. Etter egnet vasking utsettes platen for forskjellige fortynninger av fluidum som skal undersøkes, og etter hensiktsmessig inkubasjon vaskes. IgA som er bundet, finnes på et antistoff spesifikt for L-kjeder (lette kjeder) som er blitt konjugert til enzymet alkalisk fosfatase. Nærværet av dette enzym og følgelig L-kjeder bestemmes ved frigjøring av kromoforen para-nitrofenol fra para-nitrofenylfosfat. 2. IgA-bindingsproteinet kan benyttes som et påvisningssystem for nærvær av gonore. Prinsippet er at den patogene gonococcus utformer et system i stand til å spalte humant IgA fra IgA^underklassen i midten av molekylet i et område kjent som "hinge"-regionen. Dette resulterer i dannelse av tre fragment, Fc-delen av molkylet og to identiske Fab fragmenter. Sistnevnte inneholder L-kjeder av det intakte IgA^molekylet. Prøven utføres ved å belegge en plastplate med IgA-bindende protein. Platen utsettes etter vasking for humant IgA^immunoglobulin. Etter vasking settes sekret av vaginal spyl ing til prøvebeholderne og inkuberes. Etter vasking utsettes platene for alkalisk fosfatasekon-jugert anti-lettkjedeantistoff og fremkaller med fosfatase-substratet p-nitrofenylfosfatase, Hvis sekresjonen inneholdt aktiv IgA-protease, ville Fab-delene være skilt fra molekylet og lettkjedene tapt fra prøvebeholderen. Et lavt fargeutbytte er således en indikasjon for nærvær av IgA^protease. 3. IgA-bindende protein kan benyttes til å bestemme nærvær av bakteriell meningitis bevirket av Neisseria meningitidis, Haemophllus influenzae og Diplococcus pneumoniae. Alle disse organismer produserer et tilsvarende IgA^-splittende protease. Prøven vil utføres nøyaktig som angitt under punkt 2 bortsett fra at nærværet av enzymene vil bli oppnådd i spinalvæske oppnådd ved lumbar punktering som utføres rutinemessig på pasienter som mistenkes for å ha meningitis. 4. IgA-bindende protein kan benyttes til å bestemme spesifikk reaktivitet av antistoffer av IgA-klassen. Da IgA er hovedbeskyttelses-antlstoff funnet på den eplteliale overflate av det menneskelige legeme, er det av stor viktighet å være i stand til å måle IgA som er reaktiv med spesielle bakterielle eller vlrale antigener. Dette kan utføres ved å benytte IgA-bindende proteiner til å belegge platene. Platene tillates å binde. Etter vasking ble et forholdsvis nytt system for nærvær av antigen benyttet, som eksempelvis et antistoff til det bakterielle produkt eller angjeldende virus, og dette kobles til et enzym eller radioaktivt påvisningssystem. 5. IgA-bindende proteiner kan benyttes for å bestemme IgA-antistoffer spesielt i hver av de to underklasser IgA^og IgA2>Måten hvorpå dette utføres, er at det benyttes samme prøve angitt i punkt 4 bortsett fra at før det spesifikke antigen tilsettes, ødelegges IgA^-antistoffene fiksert oppå platen ved å rense gonococcal eller annen IgA^-protease. Forskjellig reaktivitet mellom prøvene ifølge protokoll 3 og 4 muliggjør å bestemme bidrag av antistoffer i hver under-klasse .

Fagfolk, etter å ha forstått fremgangsmåten for isolering og identifisering av IgABP ifølge oppfinnelsen, vil lett forstå hvorledes produktene kan benyttes i hver av de ovennevnte metoder. Det vil selvsagt være klart at det ikke er vesentlig å isolere og rense IgABP for å praktisere de forskjellige utførelsesformer av oppfinnelsen. Det vil for det meste alltid være mest hensiktsmessig å anvende sammensetningene inneholdende det bindende protein i forskjellige konsentra-sjoner, f.eks. utløpet fra en kromatisk kolonne inneholdende det bindende protein i oppløsning. En slik oppløsning kan fremstilles ved følgende fremgangsmåte.

En suspensjon av gruppe B streptokokker undersøkes først for å sikre at den vil binde til IgA. Dette kan bestemmes ved å inkubere en sammenpresset kule av streptokokker med radiomer-ket IgA ved vaerelsestemperatur i ca. 20 minutter, og deretter ved vanlige metoder undersøke nærvær av konjugert IgA. Spesifikt kjente arter av gruppe B streptokokker som er kjent og som er kommersielt tilgjengelige, kan anvendes ved utførelse av denne oppfinnelsen og er A 909, F 345-3 og H 36B-5. De første to arter er lc serotyp. Den siste art er lb serotyp.

En suspensjon av den valgte art i log-fasen ekstraheres ved koking i 1% til 10$ vandig natriumdodecylsulfat i 10 minutter til 2 timer med en pH fra ca. 6 til 9. pH er Ikke avgjørende, men det er vanlig å opprettholde den i dette området med en egnet buffer som 0,1 M tris-HCl. Bakteriene adskilles eksempelvis ved sentrifugering. Proteinet blir tilbake i oppløsningen og kan utfelles ved vanlig metoder innbefattende f.eks. tilsetning av ammoniumssulfat, etanol eller andre proteinutfellende stoffer.

Det er mest hensiktsmessig å utføre utfellingen ved tilsetning av etanol ved en temperatur på 0°C til 10°C for å danne en blanding som er 60 til 90%, fortrinnsvis 65 til 75% etanol.

Det utfelte materialet resuspenderes i vann ved en pH fra 5,5 til 6,5 opprettholdt ved egnet buffer som glycinsaltsyre, natriumacetateddiksyre eller en sitratbuffer. En 10 mM citratbuffer ved pH 5,5 er mest egnet. For å fjerne forurens-ningene DNA eller RNA, ved at begge er negativt ladet ved denne pH, føres oppløsningen over en DEAE-Sepharose-kolonne som er blitt ekvilibrert med samme buffer anvendt i oppløs-ning av utfellingen. Absorbent er positivt ladet og binder hurtig DNA og RNA. Utløpet fra kolonnen inneholder bind-ingsprotein i oppløsning i forskjellig konsentrasjon som er anvendelig for forskjellige formål angitt ovenfor. DEAE-Sepharose er tilgjengelig fra Farmacia Fine Chemicals. Det er en lagringsformet gel formet av agarose og overført til dietylaminoetyl (DEAE) derivater. Andre kationiske utvekslinsharpikser kan benyttes.

For ytterligere å forklare oppfinnelsen skal fremgangsmåten for bestemmelse av Neisseria gonore eller meningitidis-infeksjon beskrives mer detaljert.

Et konstitutivt ekstracellulært enzym IgA^protease frigjøres fra den patogene Neisseria, N. Meningitidis og gonore, respektivt. Dette enzym spalter humant IgA^i to fragmenter, Fc-fragmentet og Fab-fragmentet. En ELISA-prøve som anvender IgABP isolert fra gruppe B streptokokker, er blitt utviklet og muliggjør påvisning av protease og følgelig nærvær av Nelsserial-patogenet.

I denne prøve benyttes IgABP (bundet til en ELISA-plate) til å binde Fc-delen av IgA. IgA^protease kan deretter spalte IgA og frigjøre Fab-fragmentene som inneholder L-kjeder. Nærvær eller fravær av de lette kjeder (svarende til fravær eller nærvær av enzymet) kan deretter bestemmes ved å benytte et egnet reagens.

Prøven er som følger:

1. IgABP (1-5 mp g/ml i 0,1 M Tris HC1 pH 9,8) benyttes til å belegge overflaten av en ELISA-plate med 100 mjj 1/prøvebeholder med en pH fra 6 til 11 ved omgivelsestemperatur (20-40°C) for ca. 10 til 16 timer. 2. Platen vaskes 6 ganger med en oppløsning av 0,02 og 0, 2% Bris i 0, 9% NaCl, dvs. lsotonlsk natriumklorid. 3. IgA (0,2 til 250 mp g/ml 1 10 mM Tris HC1 pH 7,5 pluss 10 mM MgCl20,05$ Bris 35) settes til hver prøvebe-holder. pH kan være fra 5 til 10. Etter 1 time tilsettes oppløsninger inneholdende IgA^protease (eksempelvis: vaginalsekreter) til IgA, og dette reagerer i 15 minutter til 4 timer ved omgivelsestemperatur.

4. Platen vaskes som angitt ovenfor.

5. Alkalifosfotasekonjugert antihumant lettkjede-sera tilsettes deretter til hver prøvebeholder og inkuberes I minst 30 minutter og fortrinnsvis 1 til 2 timer ved omgivelsestemperatur .

6. Platen vaskes som under punkt 2.

7. Alkaliske fosfotasesubstrat, paranitrofenolfos-fatet hensiktsmessig i en buffer med en pH på minst 7 og fortrinnsvis 7 til 9,. settes til hver prøvebeholder og Inkuberes 1 minst 30 minutter, hensiktsmessig opp til 2 timer ved omgivelsestemperatur.

8. 0<D>405er deretter bestemt.

IgAjprotease negative prøvebeholdere inneholder ennå intakt IgA og gir således gul farge ved reaksjon med substratet. IgAiprotease positive prøvebeholdere Inneholder lkke-intakt IgA og gir således Ingen fargereaksjon ved tilsetning av substratet.

Bris 35 er en ikke-ionisk detergent omfatttende polyok-syetylen-etere av fettsyrer. Den benyttes til å beksytte den absorberende overflate fra ikke-spesifikk absorpsjon av fremmede proteiner. Magnesiumklorid er Ikke vesentlig, men foretrekkes, spesielt hvis det anvendes fosfatbuffere, da IgAi protease krever spormengder av magnesiumioner for optimalaktiviteter.

Det er klart at i hvert trinn av metoden kan variasjoner utføres i silke parametere som konsentrasjon, temperatur og inkubasjonstid uten vesentlig å påvirke prøven. Ekvivalente buffere kan anvendes.

Claims

Fremgangsmåte for separering av et IgA-bindende protein fra overflaten av gruppe B streptokokker, idet proteinet har en molekylvekt på 132 000 bestemt med natrlumdodecylsulfat-polyakrylamldgelelektroforese, og er istand til å binde til humant IgA ved reaksjon spesielt med Fc-delen herav,

karakterisert ved ekstraherlng av streptokokker i logfasen med et vandig medium inneholdende et

material som vil ødelegge bindingen mellom celleoverflaten og proteinet for å danne en oppløsning inneholdende proteinet og tilsetning av et propteinutfellende reagens for å utfelle det ønskede produkt, eventuelt

A. l. ekstraherlng av streptokokker i logfasen med en vandig bufferoppløsning av 156 til 1056 polyetylenglykol-p-isooktylfenyleter eller polyoksyetylensor-bitanmonooleat som lkke-ionisk detergent i 36 til 72 timer ved pH 6 til 9,
2. separering av den faste delen fra den resulterende bakterlesuspensjon, og
3. tilsetning av 6056 til 9056 etanol som et proteinutfellende reagens ved CC til 10"C for å utfelle det IgA-bindende protein, eventuelt

B. l. ekstraherlng av streptokokker i logfase med en kokende vandig buf f eroppløsning av 156 til 1056 natriumdodesylsulfat som anionisk detergent i 10 minutter til 2 timer ved pH 6 til 9

2. separering av den faste del fra den resulterende bakterielle suspensjon, og

3. tilsetning av 6056 til 9056 etanol som et proteinutfel- lingsmiddel ved 0°C for å utfelle det IgA-bindende protein, eventuelt

C. ekstraherlng av streptokokker i logfase med 0,5 til 0,25 molar saltsyre som vandig mineralsyre ved 50°C til 60°C i 1,5 til 2,5 timer, nøytralisering av oppløsningen med natriumhydroksyd som fortynnet alkalisk reagens, separering av den faste del fra den resulterende bakterielle suspensjon og tilsetning av trikloredikksyre som proteinutfellende reagens, for å utfelle IgA-bindende protein.