KR20020011139A

KR20020011139A - 저 복제수 플라스미드의 클로닝 및 발현을 개선시키기위한 벡터

Info

Publication number: KR20020011139A
Application number: KR1020017016220A
Authority: KR
Inventors: 그로스만트루디; 맥네일아이안; 어거스트폴
Original assignee: 게리 디. 스트리트, 스티븐 엘. 네스비트; 아벤티스 파마슈티칼스 인크.
Priority date: 1999-06-18
Filing date: 2000-06-16
Publication date: 2002-02-07
Also published as: WO2000078977A1; EP1196613A1; BR0011765A; NO20016153L; NO20016153D0; MXPA01012406A; CA2375821A1; ZA200109441B; JP2003503029A; AU5496600A; IL147125A0; NZ515502A

Abstract

(1) 대형 삽입단편의 BAC 플라스미드내로의 클로닝, (2) (플라스미드 복제수 증가에 의한) 대량의 BAC DNA의 분리 및 (3) (플라스미드 복제수 증가 및/또는 삽입단편내로 프로모터의 도입에 의한) BAC 플라스미드 삽입단편로부터의 이종 발현의 증가를 용이하게 하는 방법. 본 발명에 의해 목표 플라스미드로의 시험관내 전위가 가능한 중간 또는 고 복제수 복제 오리진을 함유하는 전위 인자를 포함하는, 플라스미드의 복제수를 증가시키기 위한 벡터가 제공된다. 목표 플라스미드는 DNA의 대형 조각을 클로닝하는데 유용한, 단일 플라스미드 또는 저 복사체 플라스미드, 예를 들어, BAC 벡터이다. 트랜스포존 플라스미드는 이. 콜라이와 같은 세균 숙주와 양립할 수 있는 어떠한 중간 또는 고 복사체 복제 오리진도 함유할 수 있다. 따라서, 예시적 ori는 pBR322로부터의 colE1이다.

Description

저 복제수 플라스미드의 클로닝 및 발현을 개선시키기 위한 벡터{Novel vectors for improving cloning and expression in low copy number plasmids}

BAC 플라스미드는 게놈 지도화, 위치 클로닝(positional cloning) 및 DNA 서열화용으로 가장 널리 사용된다. 또한 BAC 삽입단편에 의해 암호화되는 이종 활성 발현을 분석할 수 있다. BAC 벡터의 단일 복사체 성질이 삽입 안정성에는 유리한 반면, 통상적으로는 이러한 동일한 성질은 BAC DNA를 정제하고 서열화는데는 불리하다. 통상의 용도를 위한 충분한 플라스미드 DNA를 수득하기 위해서는 대용량의 배양이 필요한다. 대용량은 플라스미드 제조의 현저한 염색체 DNA 오염을 유도하는데, 이는 흔히 DNA 서열화 반응을 포함하는 후속적인 벡터 조작을 방해한다. 염색체 DNA의 동시-정제를 최소화하기 위해, 통상의 DNA 분리 프로토콜은 상당히 변형되어야하기 때문에 플라스미드 DNA 분리 및 서열화용 고처리량 프로토콜이 되도록 용이하게 변형시킬 수 없다.

단일 복사체 BAC 벡터의 추가의 잠재적 경향은 이. 콜라이의 이종 DNA 발현과 관련된다. 발현은, 특히 발현이 이종 삽입단편에 존재하는 외래 프로모터에 의해 좌우되는 경우에 단일 플라스미드 복제수에 의해 국한될 수 있다.

코스미드, 효모 인공 염색체(YACs) 및 세균 인공 염색체(BACs)와 같은 벡터로 대형 삽입단편 게놈 DNA 라이브러리를 작제할 수 있다. 이러한 라이브러리는 세균, 원시세균 및 포유동물 등을 포함하는 다양한 유기체로부터 중요한 게놈 영역 및 유전자를 분리 및 확인하는데 중요한 역활을 해왔다. 세균 인공 염색체(BAC) 시스템은 300킬로베이스 이하의 DNA 삽입단편으로 라이브러리를 작제하기 위한 선택적 시스템으로서 각광받고 있다. BACs의 주요 잇점은 대형 삽입단편을 함유하는 플라스미드를 전기천공시켜 효율적으로 형질전환시고 이. 콜라이(E. coli.)내에서 증식시킬수 있다는 것이다. BAC 벡터의 저 복제수(세포당 1 내지 2개)는 다-복사체 벡터와 비교하여, 많은 세대에 걸쳐 대형 BAC의 안정성에 기여할 것으로 사료된다[참조 문헌: Kim et al., NAR, 20(5):1083-1085]. 대중적인 BAC 벡터인 pBeloBAC11(공급원: Research Genetics)은 내인성 이. 콜라이 F 플라스미드로부터 유래된다. F 골격은 플라스미드 안정성 및 복제수에서 중요한 역활을 하는 4개의 필수 영역을 함유한다. parA 및 parB 둘다는 분배 및 플라스미드 안정성 기능에 필수적이다. parB는 또한 기타 F 인자와 관련하여 비양립성에 필수적이다. oriS는 일방향성인 F 플라스미드 DNA 복제의 오리진이다. repE는 oriS로부터의 복제 및 복제수 조절에 필수적인 단백질 E를 암호화한다. 클로람페니콜(chloramphenicol) 내성 유전자는 형질전환체를 항생제 선별하기 위해 혼입한다. pBeloBAC11은 lacZ 유전자를 암호화하기 때문에, 재조합 DNA 클론의 동정은 청색/백색 선별로 단순화된다. BAC 클로닝용으로 가장 광범위하게 사용되는 이. 콜라이 균주는 DH10B이다[참조문헌: Grant et al. 1990. PNAS 87:4645]. 상기 균주의 주요 특징에는 (1) 내인성 제한 엔도뉴클레아제(hsdRMS)에 의한 외래 DNA의 제한, (2) 메틸화 DNA(5' 메틸 시토신 또는 메틸 아데닌 잔기 및 5' 하이드록시메틸 시토신)를 함유하는 DNA(mcrA, mcrB, mcrC 및 mrr)의 제한 또는 (3) 재조합(recA1)을 차단하는 돌연변이가 포함된다.

도 1. 플라스미드 pGPS1. 시판되는 트랜스포존 플라스미드(공급원: England Biolabs).

도 2. 플라스미드 pTRANS-SacB. 전위 영역은 T7 프로모터, lacⅠ 유전자, pBR322 복제 오리진 및 가나마이신 내성 유전자를 함유한다. 플라스미드 pTRANS-SacB는 또한 전위 영역의 외부에 위치하는 대비선별가능한 마커인 비. 서브틸러스 sacB 유전자를 암호화한다. 5%의 수크로스 존재하에, 효소 레반수크라제(levansucrase)를 암호화하는 sacB의 발현은 이. 콜라이에 대해 치명적이다. T7 프로모터인 P_T7; lac 억제 유전자인 lacⅠ; 플라스미드 pBR322로부터의 복제 오리진인 pBR322 ori; 비. 서브틸러스 sacB 유전자인 SacB.

도 3. 플라스미드 pTRANS. 전위 영역은 T7 프로모터, lacⅠ 유전자, pBR322 복제 오리진 및 가나마이신 내성 유전자를 함유한다. 플라스미드 pTRANS는대비선별가능한 마커 및 비. 서브틸러스 sacB 유전자의 부재라는 점을 제외하고는 pTRANS-SacB와 동일하다. T7 프로모터인 P_T7; lac 억제 유전자인 lacⅠ; 플라스미드 pBR322로부터의 복제 오리진인 pBR322 ori; 비. 서브틸러스 sacB 유전자인 SacB.

도 4. pTRANS-SacB(트랜스포존 공여체) 및 pBeloBACⅡ(수여체, 또는 DNA 삽입단편을 함유하는 목표 플라스미드)를 포함하는 시험관내 전위 반응을 위한 프로토콜 도식. 수크로스-R(5% 수크로스에 대해 내성); 수크로스-S(5% 수크로스에 대해 민감성); kan-R(가나마이신 50㎍/㎖에 대해 내성); kan-S(가나마이신 50㎍/㎖에 대해 민감성); chlor-R(클로람페니콜 10㎍/㎖에 대해 내성); chlor-S(클로람페니콜 10㎍/㎖에 대해 민감성); T7 프로모터인 P_T7; lac 억제 유전자인 lac Ⅰ; 플라스미드 pBR322로부터의 복제 오리진인 pBR322 ori; 비. 서브틸러스 sacB 유전자인 SacB.

도 5. pTRANS-SacB를 사용한 복제수 증가에 의한 BAC 클론으로부터의 리파제 발현 증폭.

도 6. pTRANS-SacB를 사용한 복제수 증가에 의한 BAC 클론으로부터의 색소 발현 증폭.

도 7. BACTAPUC1(pBTP1)- 변형된 pBeloBAC11의 도식. 본래의 벡터를 고-복사체 PUC 벡터가 삽입된 폴리링커 영역을 포함하도록 변형시킨다. 또한, 특징적인 올리고뉴클레오타이드 어댑터(adaptor)를 사용하여 단일 염기 연장에 기초하여 클로닝을 이용하는 능력을 도입하였다.

도 8. pBTP2- 당해 벡터를 추가로 반복 사용하는 것은 폴리링커 외부의 EcoRⅠ 부위를 제거하고 폴리링커에 EcoRI을 첨가한다.

도 9. pBTP3- 바람직하게 변형된 삽입단편(상보적인 어댑터와 연결됨)만이 연결되도록 보다 효율적인 연결 BstXI 제한 부위를 벡터내로 조작할 수 있게 하는 어댑터 시스템의 도식.

도 10. 변형된 tn5 트랜스포존을 사용하는 메타게놈 라이브러리(metagenomic library)내로의 프로모터 무작위적 삽입의 도식. 하단의 박스내 도면은 최적의 삽입 패턴을 나타낸다.

정의

편의를 위해, 본원에서 사용되는 특정 용어 및 어구의 의도하는 의미를 하기에 기재한다.

"항생제 내성 유전자"는 세포에 하나 이상의 특이적 항생제에 대한 내성을 부여하는 단백질을 암호화하는 유전자이다.

"암호화 서열", 또는 특정 폴리펩타이드 또는 RNA를 "암호화하는" 서열은 바람직한 발현 조절 서열의 조절하에 위치하는 경우에 시험관내 또는 생체내에서 전사되고(DNA의 경우) 폴리펩타이드로 해독되는(mRNA의 경우) 핵산 서열이다. 암호화 서열의 경계는 통상적으로 5' (아미노) 말단의 출발 코돈 및 3' (카복시) 말단의 종결 코돈의 전사 종결에 의해 측정한다. 암호하 서열은 원핵 또는 진핵 mRNA로부터의 cDNA, 원핵 또는 진핵 DNA로부터의 게놈 DNA 및 합성 DNA 서열을 포함할 수 있으나 이에 국한되지는 않는다. 전사 종결 서열은 암호화 서열의 3'에 위치한다.

"작제물", 예를 들어 "핵산 작제물" 또는 "DNA 작제물"은 핵산 또는 핵산 서열을 지칭한다.

"복제수"는 세포내에 존재하는 벡터의 복사체의 수를 지칭하며, 벡터의 복제 오리진으로 측정한다. 저 복제수를 갖는 벡터는 세포내에서 5개 이하의 복사체로 존재하며, 대개는 단일 복사체로서 존재하여 pBR322 ori를 갖는 벡터는 세포당 약 20 내지 40개의 복사체, 통상적으로는 약 30개의 복사체로 존재한다. 고 복제수 벡터, 예를 들어, pUC계 벡터는 세포당 약 100개 이상의 복사체로 존재한다.

"대비선별가능한 마커"는 세포 성장에 치사성이거나 억제성인 성질을 암호화하는 유전자 또는 유전자들이다. 치사 또는 성장 억제는, 예를 들어 (1) 유전자 또는 유전자들 발현의 유도, (2) 특정 성장 조건하에 독성인 유전자(들)의 구성적 발현 및 (3) 독성 약물 또는 화학 약품 존재(내성 유전자 부재)하의 성장의 결과이다. 대비선별가능한 마커의 예는 다음과 같다: 5%의 수크로스 존재하에 이. 콜라이의 성장을 억제하는 sacB 유전자; 파지 용균 유전자: 파지 용균 유전자(예: 람다 파지 용균 유전자)의 발현은 이. 콜라이를 치사시킨다; F-플라스미드 ccdB 유전자: ccdB 유전자의 발현은 DNA 선회효소를 억제하여 이. 콜라이를 치사시킨다; 콜리신 방출 유전자(예; 콜리신 E1에 대한 kil 유전자): kil 유전자의 발현은 이. 콜라이를 치사시킨다.

"유전자"는 핵산 분자, 또는 개방 판독 프레임을 포함하고 하나 이상의 엑손 및 (임의로) 하나 이상의 인트론 서열을 포함하는 서열을 지칭한다.

"핵산"은 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어, 데옥시리보핵산(DNA) 및 경우에 따라서는 리보핵산(RNA)을 지칭한다. 상기 용어는 또한 뉴클레오타이드 유사체로부터 유래된 RNA 또는 DNA 어느 하나의 유도체, 변이체 및 유사체를 포함하며, 기술되는 양태에 해당되는 경우에는 일본쇄(센스 또는 안티센스) 및 이본쇄 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

"복제 오리진" 또는 "ori"는 복제가 개시되는 DNA의 서열이다.

"셔틀 벡터"는 숙주 세포중의 한가지 이상의 유형에에서 복제될 수 있는 벡터이다. 통상의 셔틀 벡터는 2개의 복제 오리진을 함유한다.

"목표 플라스미드"는 당해 용어가 본원에서 사용되는 경우에 전위 인자의 수여체이며 고 복사체 ori를 도입하여 고 복사체로 복제할 수 있는 저 복사체 플라스미드, 예를 들어, BAC 벡터를 지칭한다.

"전사 조절 서열"은 개시 시그널, 인핸서(enhancer), 프로모터 및 사일런서(silencer)과 같은 DNA 서열을 지칭하는 것으로서, 이들이 작동적으로 연결되어 있는 DNA 서열의 전사를 유도 또는 조절한다. 유전자의 조절 인자는 인트론, 엑손, 암호화 영역 및 3' 플랭킹(flanking) 서열내에 위치될 수 있다. 일부 조절 인자가 "조직 특이적", 즉 우선적으로 특이적 세포(예: 특이적 조직의 세포)에서 선택된 DNA 서열의 발현에 영향을 미치는 반면에, 기타 조절 인자는 많은 또는 대다수 세포 유형에서 활성이다. 유전자 발현은, 특이적 세포 유형에서의 발현이 기타 세포 유형에서의 발현보다 식별할 수 있을 정도로 높은 경우에 이러한 특이적 세포에서 우선적으로 발생한다. 조절 인자는, 우선적으로 하나의 세포에서의 선택된 DNA의 발현을 조절하지만 기타 조직에서의 발현도 또한 야기하는, 이른바 "누출(leaky)" 프로모터를 포함한다. 또한, 조절 인자는 구성적으로 또는 유도적으로 기능할 수 있다. 예를 들어, 유도 프로모터는 명백하게 자극의 부재보다 자극에 반응하여 활성이다. 자극은 호르몬, 사이토킨, 중금속, 포르볼 에스테르, 사이클릭 AMP(cAMP), 레티노산 또는 이의 유도체 등을 포함할 수 있다.

"전위 인자" 또는 "트랜스포존"은 본래 위치로부터 새로운 DNA 서열내의 새로운 위치로 이동 또는 "도약(hopping)"할 수 있는 DNA 서열을 지칭한다. 새로운 삽입 부위는 상기 인자와 동일성을 갖지 않는 염기 서열이다. 도약(전위)은 세균 재조합 기능에 의해 좌우되지 않는다.

용어 "벡터"는 핵산 분자로서, 연결된 또 다른 핵산을 전달할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 한가지 유형의 벡터는 에피솜, 즉 염색체외 복제할 수 있는 핵산이다. 흔히, 연결된 핵산의 자율적 복제 및/또는 발현이 가능한 발현 벡터를 사용한다. 발현 조절 서열에 작동적으로 연결되어 있는 포함된 유전자의 발현을 지시할 수 있는 벡터는 "발현 벡터"로 지칭할 수 있다. 통상적으로, 발현 벡터는 일반적으로 벡터 형태에서 염색체에 결합되어 있지 않은 환상 이본쇄 DNA 루프를 지칭하는 "플라스미드"의 형태이다. 본원에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 가장 통상적으로 사용되는 벡터 형태인 경우에 서로 교환하여 사용한다. 그러나, 본 발명은 동등한 기능을 제공하며 당해 분야에 공지되어 있거나 공지되고있는 이러한 기타 형태의 벡터를 포함하고자 한다.

트랜스포존의 중간 또는 고 복사체 복제 오리진을 암호화하는 플라스미드

본 발명의 플라스미드는 대형 cDNA 또는 게놈 삽입단편을 벡터내로 클로닝해야 하는 연구에 유용한 BAC 벡터 및 기타 저 복제수 벡터의 사용을 용이하게 한다. 예를 들어, 게놈 연구에서, 게놈의 대형 단편은 서열화 또는 발현을 위해 벡터내로 클로닝한다. 본 발명의 목적을 위해 목표 플라스미드로서 사용할 수 있는 저 복사체 벡터는 매우 낮은 복사체 ori를 함유하는 벡터(1 내지 2개의 복사체/세포), 예를 들어, 박테리오파지 P1, F 플라스미드 및 R1 플라스미드, 또는 낮은 복제 ori를 함유하는 벡터, 예를 들어, 플라스미드 pSC101(세포당 약 5개의 복사체), 플라스미드 p15A(세포당 10 내지 12개의 복사체) 또는 플라스미드 RK2(세포당 약 4 내지 7개의 복사체)이다.

본 발명의 한가지 목적은 목표 플라스미드내로 무작위 시험관내 전위시킬 수 있는 전위 인자를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다. 본 발명의 플라스미드는 전위 서열내에서 중간 또는 고 복제수 복제 오리진(이후에는 ori로 언급함)을 함유한다. 트랜스포존 플라스미드는 당해 분야에 공지되어 있다. 이러한 플라스미드는 목표 플라스미드의 무작위적 부위로 "도약"함으로써 서열화 반응을 용이하게 하기 위해 사용하였다. 트랜스포존 말단을 사용하여 서열화 반응을 개시할 수 있기 때문에, 서열화를 위해 필요한 프라이머의 수를 감소시키고, 새로운 세트의 프라이머를 생성시키 위한 서열화 중복 말단의 필요성을 제거한다. 트랜스포존 벡터를 사용함으로써, 단일 세트의 프라이머를 사용하여 다수의 클론을 동시에 서열화할 수있다. 그러나, 서열화를 위해 사용되는 시판중인 트랜스포존 플라스미드가 통상적으로 야생형 세균 세포내에서는 복제할 수 없는 복제 결실 오리진을 함유하는 반면에, 본 발명의 플라스미드는 전위 서열내에서 고 복사체 복제 오리진을 함유한다. 고 복사체 ori의 목표 플라스미드로의 전위는 목표 플라스미드가 숙주 세포내에서 고 복제수로 복제할 수 있도록 한다. 생체내 클로닝과 관련되는 특정한 용도로서 유용한 전위성 ori를 함유하는 기타 플라스미드가 공지되어 있다. 이러한 경우에, 트랜스포존은 고 복사체 ori를 함유한 상태로 염색체내로 도약한다. 유전자 및 고 복사체 ori는 제한 효소로 절단하거나 파지에 패킹된다. 이어서 절단되거나 팩킹된 조각의 재순환은 고 복제수로 복제할 수 있는 플라스미드를 제공하는데 요구된다. 또한, 실험자가 이들 트랜스포존 플라스미드를 사용하여 클로닝된 유전자를 서열화하고자 하는 경우, 유전자는 서열화 벡터내로 아클로닝해야 한다. 이와 달리, 본 발명의 플라스미드는 시험관내에서 저 복제수 벡터로 전위되어 중간 또는 고 복사체 ori를 삽입한다. 이러한 개선은 하기에서 기술하는 바와 같은 수많은 매우 중요한 적용에 있어 중요하다. 이들 플라스미드를 사용함으로써, 제2 재순환 단계는 필요하지 않다: 트랜스포존을 단독으로 삽입하는 것은 목표 플라스미드에 고 복제수로 복제하는 능력을 제공하여 추가로 아클로닝할 필요없이 서열화할 수 있다.

벡터의 성분

본 발명의 플라스미드에서 사용되는 복제 오리진은 중간 복사체, 예를 들어, pBR322(세포당 15 내지 20개의 복사체) 또는 R6K 플라스미드(세포당 15 내지 20개의 복사체)로부터의 colE1 ori일수 있거나, 고 복사체, 예를 들어, pUC ori(세포당 500 내지 700개의 복사체), pGEM ori(세포당 300 내지 400개의 복사체), pTZ ori(세포당 1000개를 초과하는 복사체) 또는 pBluescript ori(세포당 300 내지 500개의 복사체)일 수 있다. 트랜스포존내의 복제 오리진은 이. 콜라이 또는 임의 기타 진핵 세포형, 예를 들어, 간균(예: 비. 서브틸러스) 또는 스트렙토마이세스(Streptomycetes)내에서 기능성일 수 있다.

플라스미드는 항생제-함유 평판상의 선별을 위해 전위 서열내에 항생제 내성 유전자를 추가로 함유할 수 있다. 통상적으로 사용되는 항생제 내성 유전자는 암피실린, 가나마이신, 테트라사이클린 또는 클로람페니콜 등에 대한 내성 유전자이다. 플라스미드는 이러한 항생제 내성 유전자중의 하나 이상을 포함할 수 있다.

또한, 플라스미드는 하나 이상의 전사 조절 서열을 함유할 수 있다. 이러한 하나의 서열은 트랜스포존이 목표 플라스미드로 도약하는 경우에 전사 조절 서열도 함께 이동하도록 전위 서열내에서 발견되어야 한다. 예시적 서열은 T7 프로모터이나, 진핵 세포에서 기능성인 어떠한 프로모터 또는 인핸서도 사용할 수 있다. 유용한 프로모터는 lac(이. 콜라이), trp(이. 콜라이), araBAD(이. 콜라이), tetA(이. 콜라이), 하이브리드인 tac(이. 콜라이), 하이브리드인 trc(이. 콜라이), lpp-lac 하이브리드(이. 콜라이), PL(?), T7-lac 오퍼레이터(T7) 및 ?_PL, PT7(?, T7)을 포함한다.

플라스미드는 또한 전위 서열의 외부에 위치하는 대비선별가능한 마커를 함유할 수 있다. 대비선별 마커의 존재는 대비선별가능한 마커는 숙주 세포에서의 치사를 야기할 수 있기 때문에 본래의 트랜스포존 플라스미드를 수용한 임의 형질전환체를 대조 선별할 수 있음을 확실하게 한다. 예를 들어, 대비선별가능한 마커는 비. 서브틸러스로부터의 sacB 유전자일 수 있다. sacB를 발현하는 세포를 수크로스 함유 배지에서 성장시키는 경우, 세포에 독성인 수크로스 고분자가 형성된다. 본 발명에 유용한 기타 대비선별가능한 마커는 파지 용균 유전자(예: 람다 파지 용균 유전자), F-플라스미드 ccdB 유전자(DNA 선회효소를 억제함으로써 기능함) 및 콜리신 방출 유전자(예: 콜리신 E1에 대한 kil 유전자)이다.

바람직한 양태에서, 트랜스포존 플라스미드는 pTRANS-sacB(도 2)이다. pTRANS-sacB 작제시 출발점으로서 시판되는 트랜스포존 플라스미드인 pGPS1(공급원: New England Biolabs; 도 1)를 사용한다. pGPS1은 야생형 이. 콜라이에서 비기능성인 복제 결실 오리진을 함유한다. 또한 상기 플라스미드는 전위 인자의 양말단에 DNA 서열화용 만능 프라이머 부위도 함유한다. pTRANS-sacB를 작제하기 위해 pGPS1를 일부 변형시킨다. 중간 복사체 복제 오리진(pBR322 ori)를 트랜스포존("trans")에 도입하였다. DNA 서열화용 만능 프라이머 부위(pGPS1 유래)는 trans의 양말단에 암호화되어 있으며, "외부방향(즉, 전위 인자로부터 멀어지는 방향)"으로 지시된 T7 프로모터는 한 말단에 암호화되어 있다. 상기 플라스미드는 또한 대비선별을 위한 비. 서브틸러스 sacB 유전자를 함유한다. trans의 단일 복사체 BAC 벡터로의 시험관내 전위는 중간 복사체 ori를 도입하여 목표 BAC 벡터의 복제수를 증가시킨다.

전위 인자를 함유하는 벡터의 용도

pTRANS-sacB를 사용하는 트랜스포존 돌연변이 유발은 BAC 벡터 복제수를 증가시키고 자동 DNA 분리 및 서열화를 용이하게 한다.

(a) 서열화 DNA 삽입단편의 일반적 용도. DNA 서열화를 위해 저 복사체 플라스미드를 분리하는 것은 다수의 이. 콜라이 세포로부터의 플라스미드 정제를 요한다. 그 결과, DNA는 빈번하게 "오염된(dirty)", 즉 후속적인 DNA 서열화 반응을 방해할 수 있는 단편화된 염색체 DNA로 오염된다. 저 복사체 플라스미드 DNA 분리 프로토콜은 신중한 기술적 조작을 요하기 때문에, 이러한 프로토콜은 고 복사체 플라스미드용으로 통상적으로 사용되는 자동 "고처리량" 방법에는 적합하지 않다. 고 복사체 복제 오리진을 관심대상의 특이적 BAC 플라스미드로 전위시키는 것은 BAC 복제수를 증가시킨다. 따라서, 필요한 양의 DNA를 수득하기 위해 소수의 세포만이 필요하므로, 자동 DNA 분리 및 서열화를 용이하게 한다.

trans를 단일 복사체 BAC 플라스미드내로 전위시키는 것은 복제수를 증가시켜 플라스미드 분리를 용이하게 하는 것으로 나타났다. pTRANS-SacB는 자동화 DNA 분리 및 서열화 방법을 사용하여 30kb를 초과하는 DNA를 함유하는 대형 토양 BAC 플라스미드를 서열화하는데 성공적으로 사용하였다. 자동 플라스미드 분리 및 자동 서열화는 단일 복사체 플라스미드를 사용해서는 불가능하기 때문에, pTRANS-SacB와 같은 본 발명의 플라스미드는 대형 삽입단편을 함유하는 단일 또는 저 복사체 플라스미드의 자동화 DNA 서열화를 위한 유용한 도구이다.

(b) 대형 BAC 삽입단편내에 함유된 특정 유전자의 서열화.

저 복사체 BAC 플라스미드상에 암호화되어 있는 특정 활성은 본 발명의 트랜스포존 플라스미드를 사용하여 "녹아웃(knock-out)"시킬 수 있다. 녹아웃은 전위 인자 그 자체가 BAC 벡터에 함유된 유전자의 암호화 영역으로 삽입되는 경우에 발생한다. 이러한 전위는 자동 DNA 분리 및 서열화를 위해 전위 인자를 활성을 암호화하는 DNA에 물리적으로 연결시키고 동시에 플라스미드 복제수를 증가시킨다.

(2) 기존의 BAC 플라스미드 또는 수집된 BAC 라이브러로부터의 이종 유전자 발현을 증가시키기 위한 도구로서의 플라스미드 pTRANS-sacB.

(a) 플라스미드 복제수 증가를 통한 발현의 증가.

기존의 BAC 플라스미드 또는 BAC 라이브러리의 복제수를 증가시키는 것은 이종 유전자 발현을 증가시키는 한가지 방법이며, 단일 복사체 플라스미드로부터 검출할 수 없을 정도로 낮은 새로운 활성을 검출할 수 있도록 한다. 본원에서 기술하는 트랜스포존 플라스미드를 사용하여 기존의 BAC 클론 또는 수집된 BAC 라이브러리를 트랜스포존 돌연변이유발시키는 것은 BAC 플라스미드의 복제수를 증가시킬 수 있다. 수집된 BAC 라이브러리의 경우, 무작위 trans 삽입단편을 함유하는, 수득되는 DNA 라이브러리는 후속적으로 이. 콜라이내로 형질전환시킬 수 있으며 수득되는 형질전환체는 새로운 활성에 대하여 선별할 수 있다.

trans를 기존의 BAC 플라스미드로 전위시키는 것은 BAC 플라스미드로부터의 이종 발현을 증가시키는 것으로 나타났다. 본 발명자들은 복제수 증가에 의해 야기되는, 항세균 활성, 리파제 활성 및 색소를 암호화하는 플라스미드로부터의 이종 발현 증가를 입증하였다. 이종 활성의 발현 증가는 플라스미드가 활성을 과생산하도록 하여 활성의 생화학적 분석을 매우 용이하게 한다.

하나의 양태에서, 라이브러리는 다수의 유기체로부터의 DNA 삽입단편을 함유한다. 예를 들어, trans를 토양으로부터 분리된 DNA의 BAC 라이브러리내로 전위시키고 이어서 이. 콜라이내로 형질전환시키는 것은 필수적으로는 증가된 복제수를 갖는 새로운 라이브러리를 생성시키며, 잠재적으로는 라이브러리의 저 복사체 형태로부터 검출할 수 없는 새로운 활성을 검출할 수 있도록 한다. 상기 과정은 바람직한 경우에, 첫째로 보다 안정한 저 복사체 벡터내에서 대형 삽입단편 라이브러리를 클로닝한 다음, 복제수를 증가시킨다.

생합성 유전자 클러스터(cluster)를 암호화하는 기존의 클론내로의 trans의 전위는 새로운 생물학적 활성을 생성시키는 방식으로 유전자 클러스터를 파괴할 수 있다. 폴리펩타이드와 같은 천연 산물의 생합성은 단계적인 효소적 과정이기 때문에, 중간 단계를 암호화하는 유전자의 파괴는 신규한 생물학적 활성(이와 달리 클러스터가 손상되지 않은 경우에는 결코 볼 수 없음)을 갖을 수 있는 생합성 중간체를 축적시킬 수 있다. 복제수 증가는 실시예 4 및 5에서 기술하는 바와 같이 이러한 활성의 과생산을 야기할 수 있어 이의 검출을 용이하게 한다.

(b) 프로모터 삽입을 통한 발현 증가

상기에서 기술한 바와 같이, 고 복사체 복제 오리진의 트랜스포존 지시된 삽입은 플라스미드 복제수, 숙주 이용, 및 외래 DNA 삽입단편내에 암호화된 분자의 생산 수준을 변형시킬 수 있다. 그러나, 이. 콜라이 균주와 계통발생적으로 관계가 먼 기타 유기체로부터의 유전자의 전사 및 발현은 후속적인 선별시 이. 콜라이의 검출 수준 이하일 수 있다. 또한, 많은 천연 산물은 양방향으로 작동하는 프로모터(도 5 참조)를 갖는 다유전자 클러스터(multi-gene cluster)내에 암호화되어 있다. 당해 시스템의 추가의 적용은 이. 콜라이내에서 기능하는 다중 세균 프로모터의 무작위 도입을 위한 제2 트랜스포존계 시스템를 사용한다. 상기 기술된 트랜스 포존 시스템은 Tn-7 세균 트랜스포존에 기반한 것이다. 상기 시스템은 DNA의 연속된 쇄 190kb내의 하나 이상의 전위 인자를 억제하는 "목표 면역성"이라고 명명되는 특징을 갖는다[참조 문헌: Anne E. Stellwagen and Nancy L. Craig Avoiding self: two Tn7-encoded proteins mediate target immunity in Tn7 transposition. EMBO J. 1997 16: 6823-6834.]. 반대로, Tn-5에 기반한 트랜스포존 시스템은 이러한 면역 시스템을 갖지 않는다[참조 문헌: Igor Yu Goryshin and William S. Reznikoff Tn5 in Vitro Transposition J. Biol. Chem. 1998 273: 7367-7374]. 이러한 시스템에 기반한 트랜스포존의 작제 및 강력한 이방향성 세균 프로모터(선별가능한 마커를 함유하거나 함유하지 않음)의 혼입으로 토양으로부터 분리된 DNA의 BAC 라이브러리내의 무작위 부위에 다중 트랜스포존을 도입할 수 있다. 트랜스포존/목표 비를 조절하여 단일 플라스미드 삽입단편당 트랜스포존 삽입단편의 한정된 범위를 수득할 수 있다. 이와 관련된 변형은 GFT와 같은 리포터 유전자(reporter gene)를 트랜스포존내에 첨가하고, 추가의 모든 GFT 유전자가 표준 유량 세포계측법을 사용하여 형광 검출가능한 증량성 증가를 야기하는 경우에 (형광에 기반하여) 세균을 선별하여 최적의 삽입단편 수를 수득한다. 다수의 삽입은 전사를 파괴할 수 있으나, 무작위적으로 삽입된 프로모터의 대형 풀(pool)을 수득하기 위해서는하나의 라이브러에 대해 여러번의 전위가 이루어져야 한다.

(3) pTRANS를 사용하는, 전장 게놈 클로닝의 용이화:

BAC 벡터는 대형 DNA 삽입단편을 안정하게 수용하기 때문에, 게놈 클로닝용 벡터로서 흔히 선택된다. 그러나, 클로닝을 위한 충분한 양의 DNA을 공급하기 위해 다수의 세포가 필요하기 때문에, 플라스미드의 저 복제수는 전장 클론의 분리를 어렵게 한다. 복제수를 증가시키는 벡터, 예를 들어, pTRANS의 사용으로 BAC 벡터에서의 라이브러리 작제를 가능하게 함으로써 전장 클로닝을 용이하게 할 수 있다. 라이브러리 수득시, 복제수는 pTRANS, 또는 게놈 DNA의 전장의 대형 조각의 클로닝할 수 있는 유사 벡터를 사용하여 증가시킬 수 있다.

(4) 셔틀 벡터의 작제:

본 발명의 플라스미드는 클로닝의 필요 없이 셔틀 벡터의 작제를 용이하게 한다. 트랜스포존 플라스미드를 사용하여 셔틀 벡터를 작제하기 위해, 트랜스포존 플라스미드는 목표 플라스미드가 복제할 수 있는 숙주 이외의 숙죽에서의 발현을 위한 ori를 함유해야 한다. 예를 들어, 트랜스포존은 비. 서브틸러스 ori를 함유할 수 있으며, 목표 플라스미드는 이. 콜라이 ori를 함유할 수 있다. 시험관내 전위 반응 후, 수득되는 벡터는 비. 서브틸러스 및 이. 콜라이 둘다에서 복제할 수 있다.

개선된 BAC 벡터

비록 BAC 벡터가 대형 DNA 단편(25kb 초과)의 클로닝용으로 광범위하게 사용된다 해도, 이러한 대형 삽입단편을 클로닝하는 것은 여전히 어렵다. 본 발명의개선된 BAC 벡터는 클로닝을 개선시키며 유전체학 조사에 있어 벡터를 보다 더욱 유용한 도구로 만드는, 통상의 BAC 벡터에 대한 변형을 포함한다. 구체적으로, 본발명의 클로닝 벡터는 고 복사체 ori를 함유하여 벡터의 대량 제조를 촉진한다. 고복사체 ori는, 삽입단편의 벡터내 클로닝으로 고복사체 ori를 제거하여 벡터를 이의 본래 저 복제수로 복원시키고 대형 DNA 삽입단편의 안정성을 개선하도록 제한 자리의 측면에 위치시킨다. 또한, 고 복사체 ori를 제거하는, 제한 효소를 사용한 당해 백터 절단은 벡터에 단일 염기 연장부를 제공한다. 이러한 연장부는 게놈 DNA의 대형 단편의 클로닝을 용이하게 한다. 또 다른 변형은 BST X1 부위의 첨가를 포함한다. 상기 부위의 존재로 실험자는 BST X1 링커를 첨가하여 게놈 단편상의 돌출 길이를 증가시킬 수 있다. 통상적으로, 보다 긴 돌출부를 갖는 DNA 단편은 단일 염기 연장부를 갖는 DNA 단편보다 클로닝을 용이하게 한다.

예시적 클로닝 벡터는 이. 콜라이 F-플라스미드 레플리콘에 기반하는 플라스미드를 사용한다. F-인자 레플리콘은 클론의 엄격한 복제수 조절을 가능하게 하여 클론은 세포당 1 내지 2개의 복사체로서 안정하게 유지된다. 이. 콜라이내에서의 증식 동안, 클로닝된 DNA의 안정성은 다-복사체 벡터보다 저 복제수 벡터에서 현저하게 높다[참조 문헌: Kim et al, NAR, 20(5):1083-1085]. BAC 벡터의 안정화 효과는 고복제수 벡터에서 일반적으로 불안정한 특정 게놈 DNA에 대하여 특히 주지할만 하다. 이는 원시세균, 포유동물 또는 기타 기원으로부터의 게놈을 포함한다.

pBeloBAC11 벡터(시판되는 플라스미드)는 라이브러리 작제시 클로닝 부위에 삽입단편 DNA를 갖는 BAC 클론의 lacZ에 기반한 양성 색상 선택을 가능하게 한다.상기 벡터에 대한 일부 중요한 결점이 있다. 첫째, 벡터는 이. 콜라이내에서 단일 복사체로서 존재하기 때문에, DNA를 대량으로 정제하는 것은 약간의 노력을 요한다. 또한, 입수된 클로닝 부위는 최소량이며 대안적 클로닝 전략이 불가능하다.

따라서, 본 발명의 개선된 BAC 벡터는 pBeloBAC11에 대한 다음의 몇가지 중요한 변형을 함유하는 벡터 pBacTA.pUC2를 예로 들수 있다: (1) 고복사체 pUC 복제 오리진을 벡터에 첨가하여 이. 콜라이내에서 대량의 벡터를 정제할 수 있다; (2) 제한 효소 부위를 pUC ori의 측면에 위치시켜 상기 부위내로 클로닝된 대형 삽입단편이 고복사체 ori를 제거하고 대형 DNA 단편이 저 복사체 벡터내에 안정하게 삽입될 수 있다; (3) 추가의 클로닝 부위를 도입하였다 및 (4) 단일 염기 연장부를 첨가하여 클로닝을 용이하게 하였다.

본 특허에서 언급되는, 과학 문헌, 허여된 특허 및 공개특허공보를 포함하는 모든 문헌의 전문은 특별히 본원에서 참조로 인용된다.

하기 실시예는 본 발명의 양태 및 이의 등가물에서 본 발명의 실행하는데 적합화시킬 수 있는 중요한 부가 정보, 예증 및 지침을 포함한다. 본 실시예는 단지 설명 방식으로 제공되며 어떠한 방식으로도 제한하면서 해석되지 않아야 한다. 본 특허를 통하여 주지한 바와 같이, 본 발명은 광범위하게 적용할 수 있으며 실험자가 광범위한 디자인을 선택할 수 있도록 한다.

본 발명의 실행은 달리 명시하지 않는한 당해 분야의 기술 범위내의 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 형질전환 생물학, 재조합 DNA, 면역학, 바이러스학, 약리학, 화학, 및 약제학적 제형 및 투여의 통상의 기술을 사용한다. 이러한기술은 다음의 참조 문헌에 충분히 설명되어 있다[참조 문헌: Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis(Cold Spring Habor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, Volumes Ⅰ and Ⅱ(D. N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis(M.J. Gait ed., 1984); Mullis et al. U.S. Patent NO:4,683,195; Nucleic Acid Hybridization(B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation(B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells(R.I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning(1984); the treatise, Methods In Enzymology(Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H. Miller and M.P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155(Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV(D.M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986); Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986).

본 발명은 (1) 대형 삽입단편의 BAC 플라스미드내로의 클로닝, (2) (플라스미드 복제수 증가에 의한) 대량의 BAC DNA의 분리 및 (3) (플라스미드 복제수 및/또는 삽입단편내로 프로모터의 도입에 의한) BAC 플라스미드 삽입단편으로부터의 이종 발현의 증가를 용이하게 하는 방법을 제공한다.

발명의 요약

대형 DNA 단편의 클로닝 및 서열화는 연구자들이 유전체학 분야에 참여함에 따라 보다 필수적인 것이 되었다. 비록 많은 벡터 및 도구가 이러한 작업에 유용하다 해도, 이러한 벡터는 주로 대형 DNA 삽입단편이 벡터내에서 안정하게 유지되도록 하는 저 복사체이다. 저 복제수 벡터 사용에 대한 주요한 장애는 클로닝 및 서열화를 위해 대량의 벡터를 제조하는 어려움이다. 특히, 자동 서열화 기술은 저 복사체 벡터와의 사용을 위해 개조되지 않는다. 대형 DNA 삽입단편에 의해 암호화되는 유전자 산물의 발현 또한 벡터의 저 복제수로 인해 불리할 수 있다. 본원에서 기술하는 발명은 저 복사체 벡터내에서의 DNA 삽입단편의 클로닝, 서열화 및 발현을 개선하기 위한 신규한 벡터를 제공한다. 하나의 양태에서, 본 발명은 목표 플라스미드내로의 시험관내 전위가 가능한 중간 또는 고 복제수 복제 오리진을 함유하는 전위 인자(transposable element)를 포함하는, 플라스미드의 복제수를 증가시키기 위한 벡터를 제공한다. 목표 플라스미드는 DNA의 대형 조각을 클로닝하는데 유용한 단일 또는 저 복사체 플라스미드, 예를 들어, BAC 벡터이다. 트랜스포존(transposon) 플라스미드는 이. 콜라이와 같은 세균 숙주와 양립될 수 있는 어떠한 중간 또는 고 복제 오리진도 함유할 수 있다. 따라서, 예시적 ori는 pBR322로부터의 colE1이다. DNA 삽입단편에 의해 암호화되는 유전자 산물의 발현은 전사 조절 서열을 전위 인자에 첨가함으로써 용이하게 한다. 특정 양태에서, 전사 조절 서열은 T7 RNA 폴리머라제를 발현하는 세포내에서 기능성인 T7 프로모터이다. 클로닝된 유전자의 발현을 증가시키는데 유용한 기타 프로모터에는 내인성 세균 프로모터가 포함된다.

벡터는 추가로 하나 이상의 항생제 내성 유전자, 예를 들어, 암피실린(ampicillin), 테트라사이클린(tetracycline) 또는 가나마이신(kanamycin)에 대한 내성 유전자를 포함한다. 또한, 이들 벡터는 목표 플라스미드를 받아들인 형질전환체만이 생존함을 확인하기 위한 대비선별가능한(counterselectable) 마커, 예를 들어, 비. 서브틸러스(B. subtilis)로부터의 sacB 유전자를 함유할 수 있다.

상기 기술한 벡터 성분을 수많은 방식으로 결합시켜 신규한 벡터를 제공할 수 있다. 예를 들어, 하나의 이러한 벡터 중 하나는 (a) 고 복제수 복제 오리진을 함유하는 전위 인자, (b) 항생제 내성 유전자 및 (c) 대비선별가능한 마커를 포함할 수 있다. 기타 벡터는 상기 성분 이외에 전사 조절 서열을 함유할 수 있다. 하나의 예시적 벡터는 (a) pBR322 복제 오리진을 함유하는 전위 인자, (b) 가나마이신 내성 유전자, (c) 비. 서브틸러스 sacB 유전자 및 (d) T7 프로모터를 함유하는 pTRANS-sacB이다.

또 다른 가능한 성분 조합은 (a) 고 복제수 복제 오리진을 함유하는 전위 인자, (b) 항생제 내성 유전자 및 (c) 전사 조절 서열을 포함하는 벡터에서 찾을 수 있다. 이러한 유형의 예시적 벡터는 pBR322 복제 오리진을 함유하는 전위 인자, (B) 가나마이신 내성 유전자 및 (c) T7 프로모터를 함유하는 pTRANS이다.

본 발명은 또한 이러한 트랜스포존 플라스미드를 사용하기 위한 방법을 제공한다.

예를 들어, 본 발명은, 시험관내에서 목표 플라스미드와 상기 기술한 벡터중의 어느 하나를 고 복제수 복제 오리진이 목표 플라스미드내로 도입되도록 하는 조건하에 혼합함을 포함하여, 목표 플라스미드의 복제수를 증가시키는 방법을 제공한다.

언급한 바와 같이, 서열화를 위한 충분한 양의 DNA를 수득하기 위해 다수의 세포를 사용하는 것이 필수적이기 때문에, BAC 및 기타 저 복사체 벡터로부터의 서열화는 어렵다. 따라서 본 발명은, 시험관내에서 목표 플라스미드를 본 발명의 트랜스포존 벡터와 혼합하고, 혼합물을 형질전환시키고 선별된 형질전환체로부터 분리된 유전자의 서열을 측정함을 포함하는, 저 복제수 플라스미드내의 유전자를 서열화하는 방법을 제공한다. 목표 플라스미드내의 유용한 좌위로 도입된 트랜스포존을 갖는 형질전환체는 BAC만으로 형질전환된 클론에 대해, 당해 혼합물로 형질전환된 클론에서의 표현형 변화를 검출함으로써 선별할 수 있다. 관찰될 수 있는 표현형 변화는 유전자 발현의 증가 또는 감소를 포함한다.

전사 조절 서열을 함유하는 벡터는 이러한 벡터를 시험관내에서 목표 플라스미드와 혼합한 다음, 혼합물을 전사 조절 인자를 인식할 수 있는 세포내로 형질전환시키고 유전자를 발현시킴으로써 목표 플라스미드내의 유전자 발현을 증가시는데 사용할 수 있다. 예를 들어, T7 프로모터를 함유하는 트랜스포존이 도입된 목표 플라스미드는 T7 폴리머라제를 발현하는 세포내로 형질전환시킬 수 있다.

본 발명의 플스미드는 유전자, 예를 들어, 다수의 유기체 또는 게놈 공급원으로부터 분리된 유전자의 전장 클로닝을 또한 용이하게 할 수 있다. 유전자를 전장 클로닝하는 방법은 BAC 라이브러리를 본 발명의 트랜스포존 플라스미드와 혼합하여 플라스미드의 복제수를 증가시킨 다음, 대량의 DNA를 분리하고 전장 유전자를 클로닝함을 포함한다.

이들 플라스미드의 또 다른 용도는 클로닝하지 않고 셔틀 벡터를 작제하는 것이다. 본 발명은, 시험관내에서 목표 플라스미드와 목표 플라스미드의 복제 오리진과 상이한, 숙주용 복제 오리진을 함유하는 전위 인자를 포함하는 벡터를 ori가 목표 플라스미드내로의 전위되도록 하는 조건하에 혼합함을 포함하는, 셔틀 벡터의 작제방법을 제공한다. 경우에 따라서, ori는 중간 또는 고 복제수 ori일 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 대형 DNA 단편의 저 복사체 벡터내로의 클로닝을 용이하게 하는, 개선된 BAC 벡터를 제공한다. 이러한 개선된 BAC 벡터는 제한 효소에 대한 절단 부위의 측면에 위치하는 고 복사체 복제 오리진을 포함하며, 이때 제한 효소로 벡터를 절단하는 경우 클로닝용 단일 염기 연장부(single base extensions)가 제공되고 고 복제수 복제 오리진이 제거된다. 일부 양태에서, 벡터는 BSTX1 부위를 추가로 포함한다. 이러한 유형의 예시적 벡터는 pBacTA.PUC2이다.

실시예

실시예 1: pTRANS 벡터의 작제

플라스미드 pTRANS-sacB. pET-22b로부터의 Scal/Xbal 단편 4.2kb를 SpeⅠ 및 SwaⅠ로 선형화된 플라스미드 pGPS1내로 클로닝한다. 수득되는 가나마신-내성 플라스미드인, pTRANS(도 3)은 고복사체 ori, 및 pET-22b로부터의 T7 프로모터를 함유한다. PCR에 의해 증폭시킨, 비. 서브틸러스 168 염색체로부터의 sacB 유전자 1.7kb를 pTRANS내의 특징적인 SacⅠ 부위내로 클로닝한다. 수득되는 플라스미드인 pTRANS-sacB(도 2)는 5% 수크로스의 존재하에 대비선별할 수 있다. 시험관내 전위 반응에서, pTRANS-sacB 및 목표 BAC 플라스미드를 뉴잉글랜드 바이오랩(New Eangland Biolaps)의 플로토콜에 따라서 트랜스포사제와 함께 혼합하고, 전위 반응 후에, 수득되는 DNA를 이. 콜라이 DH10B로 형질전환시키고 가나마이신(전위체를 선별하기 위함), 클로람페니콜(BAC 플라스미드를 선별하기 위함) 및 5% 수크로스(수크로스의 존재하에 치사성인 pTRANS-sacB를 대비선별하기 위함)을 함유하는 배지에 도말한다. 수득되는 가나마이신/클로람페니콜/수크로스-내성 플라스미드는 trans를 함유하는 BAC 플라스미드이다.

균주 DH10B(DE3). 균주 DH10B(DE3)는 DE3 용원균 키트(제조원: Novagen)를 사용하여 작제한다. 균주 DH10B(DE3)은 염색체 용원균에 의해 암호화되는 T7 RNA 폴리머라제를 발현하며 T7 프로모터로부터의 이종성 발현을 유발하는 플라스미드용 발현 숙주이다.

실시예 2: BAC 벡터의 작제

1.BACTAPUC1(pBTP1)벡터의 제1 형태인, pBTP1은 pBeloBAC를 고복사체 PUC계 벡터와 결합시킨다. 도 1에서 보는 바와 같이, 전체 PUC 플라스미드를 클로닝 부위로 삽입하여 몇가지 목적을 성취한다. 첫째, 복제수가 100개의 복사체/세포를 초과하도록 유도하는 PUC 삽입단편내의 고복사체 ori로 인해, 클로닝 전의 벡터 정제가 단순화된다. 둘째, 특징적인 올리고뉴클레오타이드 어댑터를 사용하여 본 발명자들은 추가의 클로닝 부위를 도입하였다. 이는 단일 염기 연장부에 기반하는 클로닝을 활용하는 능력을 포함한다. Taq와 같은 열안정성 폴리머라제는 단일 데옥시아데노신(A)를 DNA의 3' 말단에 첨가하는 비주형-의존 활성을 갖는다. DNA를 확장시킨 상기 단일 염기는 상응하는 데옥시티미딘(T) 말단을 갖는 벡터와 효율적으로 연결시킬 수 있다. 내부 축퇴 내부 염기를 갖는 제한 부위, 예를 들어, AhdI(GACNNNNNGTC)를 혼입하여, AhdI를 절단하는 경우에 각 말단에 단일 T가 남겨지는 벡터를 생성시킬 수 있다. 게놈 DNA를 일련의 폴리머라제(평활말단화용 폴리머라제 T4 및 클레노우(Klenow)에 이어서 단일 A를 첨가하는 Taq)로 처리함으로써 DNA를 부분적인 제한 분해의 필요없이 직접 클로닝할 수 있다. 상기 후자의 사항은 부분적인 제한 분해에 의한 클로닝은 라이브러리의 평균 삽입단편 크기를 반 이상으로 감소시키 때문에 중요하다(하기 참조).

2.pBTP2당해 벡터(도 2)를 추가로 반복 사용하는 것은 폴리링커 외부의 EcoRⅠ 부위를 제거하고 EcoRI을 폴리링커에 첨가한다. 모든 경우에서 DNA를 클로닝용 제한 효소로 절단하는 것은 PUC 삽입단편와 함께 이의 고복사체 ori를 제거하며 대형 삽입단편 DNA를 저복사 벡터내로 삽입시킨다.

3.pBTP3상기에서 언급된 바와 같이, 클로닝 이전에 게놈 DNA를 제한 분해하는 것은 최종 라이브러리의 평균 삽입단편 크기를 감소시킬 것이다. 또한, 투입 DNA의 평균 크기가 분해 전에 150kb의 범위이며 부분적인 분해 후에는 75kb로 감소되기 때문에, 증가 성향은 80 내지 100kb 이상의 단편을 클로닝하려고 시도하는 경우에 나타날 수 있다. 이는 분해에 사용되는 효소 및 DNA내의 부위 수에 의해 좌우될 것이다. 따라서, 클로닝을 위한 대안적 전략은 양질의 라이브러리 작제에 있어 직접적으로 주요 사항이 된다(표 1 참조). 상기 언급한 단일 염기 연장 클로닝 시스템이 이러한 문제를 모면하는 한가지 방법이다. 그러나, 비록 클로닝 효율이 평활 말단 클로닝보다 높다 해도, 다중 염기 연결보다는 높지 않다. 또한, A 테일(tail)의 첨가가 100% 효율적이지 않기 때문에, 모든 DAN가 연결가능할 수 없다. 대안적 방법은 클로닝 효율성을 크게 증가시킬 4개의 염기쌍 돌출부를 갖는 비-팔린드롬 어댑터를 혼입하는 것이다. 도 9(pBTP3)는 제2 축퇴 제한 효소인, BstXI(CCANNNNNNTGG)를 사용하는 하나의 이러한 시스템의 한가지 예를 도시한 것이다. 상기 시스템에서, 비상동성 말단(5' CACA 3')를 갖는 어댑터를 평활 말단 게놈 DNA에 연결시킨다. 이들 어댑터는 자가-연결할 수는 없지만 바람직한 BstXI 제한 부위(5' GTGT 3')를 삽입함으로써 벡터내에서 생성되는 상응하는 말단과 단지 어닐링(annealing)할 수 있다.

	장점	단점
제한 분해	양립성 점착성 말단, 고효율	2개의 점착성 말단이 필요함, 100kb를 초과하는 DNA가 이중 절단될 확률이 통상의 더트 DNA 크기 범위의 경우보다 낮음,라이브러리의 성향은 사용되는 효소에 의해 좌우됨
평활 클로닝	크기 분포의 손실이 없음	소형 단편의 경우에도 비효율적임,연마(평활 말단)가 필요함
단일 염기쌍	크기 분포의 손실이 없음	말단의 변형을 요함
연장 클로닝	단일 염기쌍 돌출부가 클로닝 효율을 증가시킴	공지되지 않은 효율,벡터:삽입 비율이 효율적인 클로닝을 위해 결정적일 수 있음
축퇴 제한 부위를 사용하는, 링커 첨가	크기 분포에 있어 상실 없음 양립성 점착성 말단	공지되지 않은 효율의 연마 및 링커 첨가를 요함

실시예 3: 트랜스포존 반응

도 4의 도식에서 나타낸 바와 같은 트랜스포존 반응은 GPS-1 게놈 프라이밍 시스템 키트(Genome Priming System kit, 공급원: 뉴잉글랜드 바이오랩)중에 공급된 완충액 및 효소를 사용한다. 트랜스포존 반응에서, pTRANS-SacB 0.05㎍을 BAC 목표 플라스미드 0.2㎍과 혼합한다. 전체 최종 용적을 20㎕으로 하여 1×GPS1 완충액 속에서 반응을 수행한다. TnsABC^*트랜스포사제 1㎕를 플라스미드 혼합물에 첨가하고, 반응물을 혼합하고 37℃에서 10분 동안 배양한다. 이어서 출발 용액 1㎕를 첨가하고 37℃에서 10분 동안 배양한다. 트랜스포사제는 반응물을 75℃에서 10분 동안 배양함으로써 불활성화시킨다. 불활성화된 반응물을 1시간 동안 물에 대하여 투석한다. 반응물 5㎕를 전기천공시켜 DH10B 또는 DH10B(DE3)와 같은 이.콜라이 세포내로 형질전환시킨다. 가나마이신(50㎍/㎖), 클로람페니콜(10㎍/㎖) 및 수크로스(5%)를 함유하는 LB 한천상에서 형질전환체를 선별한다.

실시예 4: BAC 클론으로부터의 리파제 발현을 증가시키는 pTRANS의 용도

본 실시예에서, 고복사체 ori는 토양 DNA로부터 분리된 리파제 유전자를 함유하는 BAC 플라스미드로 도약시킨다. 당해 활성은 본질적으로 매우 낮은 수준이며 검출하는데 1주일 이하의 배양 기간이 소요된다. 토양 샘플로부터 분리된 리파제 활성을 암호화하는 DNA 약 25kb를 함유하는 BAC 플라스미드를 실시예 3에서 기술한 바와 같이 pTRANS-SacB를 사용하는 트랜스포존 반응에 도입한다. 반응물을 전기천공시켜 DH10B 세포내로 형질전환시키고, 가나마이신(50㎍/㎖), 클로람페니콜(10㎍/㎖), 수크로스(5%) 및 디프코(Difco) 지질 시약(3%)를 함유하는 LB 한천상에서 형질전환체를 선별한다. 리파제 활성은 배지에서 세균 콜로니 주위의 지질 분해를 나타내는 투명한 윤상(輪狀)에 의해 (도 4에서 나타낸 바와 같이) 검출한다. 리파제를 발현하는 몇개의 트랜스포존 도약 클론을 선별하고 새로운 LB 클로람페니콜 지질 한천 평판에 재도말하여, 음성 대조군(1번)에 대하여 고 복사체 리파제 과생산체(클론 3번, 4번, 5번, 6번), 리파제 녹아웃 클론(7번) 및 본래의 저복사 리파제-생산 BAC(2번)를 비교한다. 고 복사체 ori의 경우, 리파제 활성은 단지 2일 이내에 즉시 검출가능하며 발현 증가에 있어서의 트랜스포존의 유용성을 입증한다.

실시예 5: BAC 클론으로부터의 홍색 색소의 발현을 증가시키는 pTRANS의 용도

본 실시예에서, 고 복사체 ori를 토양 DNA로부터 분리된, 홍색 색소에 대한 유전자를 함유하는 BAC 플라스미드내로 도약시킨다. 토양 샘플로부터 분리된, 홍색 색소을 암호화하는 DNA 약 25kb를 함유하는 BAC 플라스미드를 실시예 3에서 기술한 바와 같이 pTRANS-SacB를 사용하는 트랜스포존 반응에 도입한다. 반응물을 전기천공시켜 DH10B 세포내로 형질전환시키고, 가나마이신(50㎍/㎖), 클로람페니콜(10㎍/㎖) 및 수크로스(5%)를 함유하는 LB 한천상에서 형질전환체를 선별한다.

도 6은 착색된 천연 산물을 생산하는 것으로 나탄난 단일 라이브러리 클론인, MG1.1내의 2개의 독립적인 전위 결과를 도시한 것이다. 비교를 위해, 비착색된 대조군 및 본래의 모(侮) 클론을 또한 나타낸다. 도면으로부터 명백한 바와 같이, 고복사체 pTRANS의 도입은 복제수를 증가시키기 때문에 단일 클론내에서 유전자 생산을 증가시킬 수 있다. 이는 색소의 전체 수준뿐 아니라 색소 생성 속도의 가속화 둘다에 영향을 미친다.

Claims

목표 플라스미드내로의 시험관내 전위가 가능한 중간 또는 고 복제수 복제 오리진을 함유하는 전위 인자를 포함하는, 플라스미드의 복제수를 증가시키기 위한 벡터.
제1항에 있어서, 전위 인자가 전사 조절 서열을 추가로 포함하는 벡터.
제2항에 있어서, 전사 조절 서열이 T7 프로모터인 벡터.
제1항에 있어서, 복제 오리진이 colE1 ori인 벡터.
제1항 또는 제2항에 있어서, 항생제 내성 유전자를 추가로 포함하는 벡터.
제5항에 있어서, 항생제 내성 유전자가 가나마이신 내성 유전자인 벡터.
제1항 또는 제2항에 있어서, 대비선별가능한(counterselectable) 마커를 추가로 포함하는 벡터.
제7항에 있어서, 대비선별가능한 마커가 비. 서브틸러스(B. Subtilis)로부터의 sacB 유전자인 벡터.
(a) 중간 또는 고 복제수 복제 오리진을 함유하는 전위 인자,

(b) 항생제 내성 유전자 및

(c) 대비선별가능한 마커를 포함하는, 플라스미드의 복제수를 증가시키기 위한 벡터.
제9항에 있어서, 전위 인자가 전사 조절 서열을 추가로 포함하는 벡터.
(a) pBR322 복제 오리진을 함유하는 전위 인자,

(b) 가나마이신 내성 유전자 및

(c) 비. 서브틸러스 sacB 유전자를 포함하는, 플라스미드의 복제수를 증가시키기 위한 벡터.
제11항에 있어서, T7 프로모터를 추가로 포함하는 벡터.
제12항에 있어서, pTRANS-SacB인 벡터.
(a) 중간 또는 고 복제수 복제 오리진을 함유하는 전위 인자,

(b) 항생제 내성 유전자 및

(c) 전사 조절 서열을 포함하는, 플라스미드의 복제수를 증가시키기 위한 벡터.
제14항에 있어서, pTRANS인 벡터.
제한 효소에 대한 절단 부위가 측면에 위치하는 고 복사체 복제 오리진을 포함하는 개선된 BAC 벡터로서, 제한 효소로 당해 벡터의 절단시 클로닝용 단일 염기 연장부가 제공되고 고 복사체 복제 오리진이 제거되는 벡터.
제16항에 있어서, BST X1 부위를 추가로 포함하는 벡터.
제17항에 있어서, pBacTA.PUC2인 벡터.
시험관내에서 목표 플라스미드와 제1항, 제2항, 제9항, 제11항, 제13항 또는 제14항 중의 어느 한 항에 따르는 벡터를 중간 또는 고 복제수 복제 오리진이 목표 플라스미드내로 도입되도록 하는 조건하에 혼합하는 단계를 포함하여, 목표 플라스미드의 복제수를 증가시키는 방법.
(a) 시험관내에서 목표 플라스미드와 제1항, 제2항, 제9항, 제11항, 제13항 또는 제14항 중의 어느 한 항에 따르는 벡터를 중간 또는 고 복제수 복제 ori가 목표 플라스미드내로 도입되도록 하는 조건하에 혼합하는 단계,

(b) 혼합물을 세포내로 형질전환시키는 단계,

(c) 서열화용 형질전환체를 선별하는 단계 및

(d) 유전자의 서열을 측정하는 단계를 포함하여, 저 복제수 플라스미드의 유전자를 서열화하는 방법.
(a) 시험관내에서 BAC 클론과 제1항, 제2항, 제9항, 제11항, 제13항 또는 제14항 중의 어느 한 항에 따르는 벡터를 중간 또는 고 복제수 복제 ori가 목표 플라스미드내로 도입되도록 하는 조건하에 혼합하는 단계,

(b) 혼합물을 세포내로 형질전환시키는 단계 및

(c) BAC 벡터만으로 형질전환된 클론에 대해 당해 혼합물로 형질전환된 클론의 표현형 변화를 검출하는 단계를 포함하여, 전위 인자를 함유하는 BAC 클론을 선별하는 방법.
제21항에 있어서, 표현형 변화가 유전자 발현의 증가인 방법.
제21항에 있어서, 표현형 변화가 유전자 발현의 감소인 방법.
(a) 시험관내에서 목표 플라스미드와 제2항, 제10항 또는 제12항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 따르는 벡터를 중간 또는 고 복제수 복제 ori가 목표 플라스미드내로 도입 되도록 하는 조건하에 혼합하는 단계 및

(b) 혼합물을 전사 조절 인자를 인식할 수 있는 세포내로 형질전환시키고 유전자를 발현시키는 단계를 포함하여, 목표 플라스미드의 유전자 발현을 증가시키는 방법.
제24항에 있어서, 전사 조절 인자가 T7 프로모터이며 세포가 T7 폴리머라제를 발현하는 방법.
(a) BAC 라이브러리를 제공하는 단계,

(b) 시험관내에서 라이브러리와 제2항, 제10항 또는 제12항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 따르는 벡터를 혼합하는 단계,

(c) 혼합물을 세포내로 형질전환시키는 단계 및

(d) 세포로부터 전장 유전자를 분리하는 단계를 포함하여, 유전자를 전장 클로닝하는 방법.
시험관내에서 목표 플라스미드와 목표 플라스미드의 복제 오리진과 상이한, 숙주용 복제 오리진을 함유하는 전위 인자를 포함하는 벡터를 ori가 목표 플라스미드내로 전위되도록 하는 조건하에 혼합하는 단계를 포함하여, 셔틀 벡터를 작제하는 방법.