JP2002531062A - 挿入突然変異の作製方法 - Google Patents
挿入突然変異の作製方法Info
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Abstract
(57)【要約】
標的細胞中の染色体又は染色体外核酸のランダム又は準ランダムな部位に挿入突然変異を作製する方法であって、対合複合体と該標的細胞とを、該細胞性核酸への転位を媒介する条件下で組み合わせる工程を含み、該対合複合体は、（ａ）Ｔｎ５トランスポザーゼタンパク質及び（ｂ）該Ｔｎ５トランスポザーゼと動作可能に相互作用するのに適合したヌクレオチド配列対及び該ヌクレオチド対間にある転位性ヌクレオチドを含むことを特徴とする方法。前記方法において、対合複合体は、前記対合複合体が生産的転位を受けることを嫌う又は阻止する条件下、in vitroにて形成する。
Description
【０００１】関連出願のクロスリファレンス 適用なし政府委託研究又は開発に関する記載 適用なし発明の背景 細胞の染色体核酸及び染色体外核酸へ外来性核酸を効率的に挿入し、ペプチド
及びタンパク質の発現又は調節に関連する染色体領域を同定することが、分子生
物学分野において望まれている。同一の技術は、新規な治療薬及び薬物の開発に
おいても有利に使用される。 １つの一般的方法は、in vivoでのＴｎ５突然変異誘発に依存し、興味の対象
となるポリヌクレオチドを細胞ＤＮＡに挿入して、挿入ポリヌクレオチドをラン
ダム又は準ランダムな部位に含む細胞のライブラリーを構築する。現存のin viv
o Ｔｎ５突然変異誘発法は、天然又は導入した発現構築物いずれかにより標的細
胞がトランスポザーゼをコードすることを要求する。したがって、各標的細胞の
タイプに適切な発現系を構築することが必要になる。これには時間がかかり、か
つ、各標的細胞のタイプの要求についての広範な知識が要求される。 多くの場合、トランスポザーゼをコードする遺伝子は活性トランスポゾンによ
りコードされている。活性トランスポゾンは初期の所望の突然変異誘発仮定の後
、標的細胞内で転位を続けることができる。このような望ましくない残留性転位
は、挿入突然変異体ライブラリーの分析を複雑にする点で好ましくない。 更に、in vivo Ｔｎ５突然変異誘発についての多数の技術は、外来性ＤＮＡの
標的細胞への導入するための複雑な生物学的メカニズム、例えばバクテリオファ
ージλ形質導入ファージ又はコンジュゲートプラスミドなどに依存している。 Shoji-Tanaka, A.ら（B.B.R.C. 203:1756-1764 (1994)）は、精製レトロウイ
ルスインテグラーゼを使用してマウス細胞への遺伝子伝達を媒介することを記載
している。 Kuspa, A. 及び W.F. Loomis（P.N.A.S. U.S.A. 89:8803 8807 (1992)）らは
、切断酵素と共に酵素切断核酸を標的細胞へエレクトロポレーションすることに
よる、制限酵素を用いて線状にしたプラスミドのゲノム制限部位への組み込みを
詳細に記載している。
及びタンパク質の発現又は調節に関連する染色体領域を同定することが、分子生
物学分野において望まれている。同一の技術は、新規な治療薬及び薬物の開発に
おいても有利に使用される。 １つの一般的方法は、in vivoでのＴｎ５突然変異誘発に依存し、興味の対象
となるポリヌクレオチドを細胞ＤＮＡに挿入して、挿入ポリヌクレオチドをラン
ダム又は準ランダムな部位に含む細胞のライブラリーを構築する。現存のin viv
o Ｔｎ５突然変異誘発法は、天然又は導入した発現構築物いずれかにより標的細
胞がトランスポザーゼをコードすることを要求する。したがって、各標的細胞の
タイプに適切な発現系を構築することが必要になる。これには時間がかかり、か
つ、各標的細胞のタイプの要求についての広範な知識が要求される。 多くの場合、トランスポザーゼをコードする遺伝子は活性トランスポゾンによ
りコードされている。活性トランスポゾンは初期の所望の突然変異誘発仮定の後
、標的細胞内で転位を続けることができる。このような望ましくない残留性転位
は、挿入突然変異体ライブラリーの分析を複雑にする点で好ましくない。 更に、in vivo Ｔｎ５突然変異誘発についての多数の技術は、外来性ＤＮＡの
標的細胞への導入するための複雑な生物学的メカニズム、例えばバクテリオファ
ージλ形質導入ファージ又はコンジュゲートプラスミドなどに依存している。 Shoji-Tanaka, A.ら（B.B.R.C. 203:1756-1764 (1994)）は、精製レトロウイ
ルスインテグラーゼを使用してマウス細胞への遺伝子伝達を媒介することを記載
している。 Kuspa, A. 及び W.F. Loomis（P.N.A.S. U.S.A. 89:8803 8807 (1992)）らは
、切断酵素と共に酵素切断核酸を標的細胞へエレクトロポレーションすることに
よる、制限酵素を用いて線状にしたプラスミドのゲノム制限部位への組み込みを
詳細に記載している。
【０００２】発明の簡単な要約 本発明は、転位性ポリヌクレオチドを標的細胞の染色体又は染色体外の核酸の
ランダム又は準ランダムな部位に効率的に挿入する方法に要約される。前記方法
は細胞性核酸と対合複合体（cynaptic complex）とを、細胞性ＤＮＡへの転位を
媒介する条件下、標的細胞内で組み合わせる工程を含み、前記対合複合体は（ｂ
）ポリヌクレオチドと複合体化した（ａ）Ｔｎ５トランスポザーゼタンパク質を
含み、前記（ｂ）ポリヌクレオチドはＴｎ５トランスポザーゼとの動作可能な相
互作用に適合したヌクレオチド配列対及び前記ヌクレオチド対間の転位性ヌクレ
オチド配列を含んでいる。本発明の方法の対合複合体は、転位する態勢（poise
）にある対合複合体が生産的（productive）転位を実際に受けることを嫌う（di
sfavor）又は阻止する条件下、in vitroにて形成する。転位性ヌクレオチド配列
の標的核酸への生産的転位の頻度は、過剰活性化トランスポザーゼ又はＴｎ５ト
ランスポザーゼの存在下での効率的な転位に特に十分に適合した配列を含む転位
性ポリヌクレオチドのいずれか又は両方を使用することにより増強することがで
きる。 更に本発明は挿入突然変異を含む細胞のライブラリーの作製方法に要約される
。前記方法は、複数の標的細胞の中で、細胞性核酸と対合複合体とを前記と同様
にして組み合わせる工程及び挿入突然変異を含む細胞をスクリーニングする工程
を含んでいる。 別の側面において本発明は、前記方法にしたがい形成した挿入突然変異を含む
細胞のライブラリーとして要約される。ランダムかつ独立した突然変異性挿入を
ゲノムに含む細胞集団をスクリーニングして、挿入突然変異誘発に付されなかっ
た細胞に対する表現型又は遺伝子型の変化を誘導する挿入突然変異を含む細胞を
選択することができる。 対合複合体の形成に使用する転位性ポリヌクレオチドを、全てのフランキング
配列から離れた転位性ＤＮＡから構成することができることは、本発明の利点で
ある。これは、分子内転位の可能性を減少させ、標的ゲノムへの転位の可能性を
増大させる点においても利点である。更に、ポリヌクレオチドからドナーバック
ボーン（donor backbone）（ＤＢＢ）配列を除去することにより、本発明の方法
に使用することができるトランスポゾン配列の調製を単純化する。 対合複合体を非生産的分子内転位事象を嫌う条件下で形成することができるこ
とは、本発明の別の利点である。これは、実質的に全ての対合複合体が細胞性Ｄ
ＮＡと組み合わされたときに転位を受けることができる点で有利である。対合複
合体中の核酸が不活性であることはほとんどない。 転位を促進する条件は、対合複合体が標的細胞内で標的核酸の存在下に存在し
た後にのみ遭遇することは本発明の特徴である。本発明のその他の対象、利点及
び特徴は、下記の詳細な説明を考慮して明らかになるだろう。
ランダム又は準ランダムな部位に効率的に挿入する方法に要約される。前記方法
は細胞性核酸と対合複合体（cynaptic complex）とを、細胞性ＤＮＡへの転位を
媒介する条件下、標的細胞内で組み合わせる工程を含み、前記対合複合体は（ｂ
）ポリヌクレオチドと複合体化した（ａ）Ｔｎ５トランスポザーゼタンパク質を
含み、前記（ｂ）ポリヌクレオチドはＴｎ５トランスポザーゼとの動作可能な相
互作用に適合したヌクレオチド配列対及び前記ヌクレオチド対間の転位性ヌクレ
オチド配列を含んでいる。本発明の方法の対合複合体は、転位する態勢（poise
）にある対合複合体が生産的（productive）転位を実際に受けることを嫌う（di
sfavor）又は阻止する条件下、in vitroにて形成する。転位性ヌクレオチド配列
の標的核酸への生産的転位の頻度は、過剰活性化トランスポザーゼ又はＴｎ５ト
ランスポザーゼの存在下での効率的な転位に特に十分に適合した配列を含む転位
性ポリヌクレオチドのいずれか又は両方を使用することにより増強することがで
きる。 更に本発明は挿入突然変異を含む細胞のライブラリーの作製方法に要約される
。前記方法は、複数の標的細胞の中で、細胞性核酸と対合複合体とを前記と同様
にして組み合わせる工程及び挿入突然変異を含む細胞をスクリーニングする工程
を含んでいる。 別の側面において本発明は、前記方法にしたがい形成した挿入突然変異を含む
細胞のライブラリーとして要約される。ランダムかつ独立した突然変異性挿入を
ゲノムに含む細胞集団をスクリーニングして、挿入突然変異誘発に付されなかっ
た細胞に対する表現型又は遺伝子型の変化を誘導する挿入突然変異を含む細胞を
選択することができる。 対合複合体の形成に使用する転位性ポリヌクレオチドを、全てのフランキング
配列から離れた転位性ＤＮＡから構成することができることは、本発明の利点で
ある。これは、分子内転位の可能性を減少させ、標的ゲノムへの転位の可能性を
増大させる点においても利点である。更に、ポリヌクレオチドからドナーバック
ボーン（donor backbone）（ＤＢＢ）配列を除去することにより、本発明の方法
に使用することができるトランスポゾン配列の調製を単純化する。 対合複合体を非生産的分子内転位事象を嫌う条件下で形成することができるこ
とは、本発明の別の利点である。これは、実質的に全ての対合複合体が細胞性Ｄ
ＮＡと組み合わされたときに転位を受けることができる点で有利である。対合複
合体中の核酸が不活性であることはほとんどない。 転位を促進する条件は、対合複合体が標的細胞内で標的核酸の存在下に存在し
た後にのみ遭遇することは本発明の特徴である。本発明のその他の対象、利点及
び特徴は、下記の詳細な説明を考慮して明らかになるだろう。
【０００３】発明の詳細な説明 国際出願第PCT/US97/15941号（国際公開 第WO 98/10077号）（参照することに
よりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される修飾Ｔｎ５トランスポザ
ーゼを使用したin vitro転位系において、本件出願人は、修飾突然変異体Ｔｎ５
トランスポザーゼ及び転位性ヌクレオチドに隣接する修飾Ｔｎ５ポリヌクレオチ
ド配列を使用したin vitroでの転位性ポリヌクレオチドの生産的転位を証明する
。 本発明は、in vitro転位が実質的に存在しないにもかかわらず対合複合体がin
vitroで形成される点で従来の系とは異なる。対合複合体は標的細胞へ導入され
、そこでin vivo転位が容易に起こる。図１は、標的細胞の染色体核酸又は染色
体外核酸におけるランダム又は準ランダムな部位に挿入突然変異を効率的に導入
する本発明のＴｎ５をベースとする方法の１つの側面の概略図を提供する。本発
明の方法において、標的細胞内の細胞性核酸と対合複合体とを、細胞性ＤＮＡへ
の転位を媒介する条件下で組み合わせる。前記対合複合体は（ａ）Ｔｎ５トラン
スポザーゼタンパク質（図１では隣接する円の対として示される）並びに（ｂ）
ポリヌクレオチドであって、Ｔｎ５トランスポザーゼとの動作可能な相互作用に
適合した逆方向（inverted）のヌクレオチド配列対（図１では矢印として示され
る）及び該ヌクレオチド配列対間の転位性ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド
を含んでいる。対合複合体の構造は、転位性ポリヌクレオチドの細胞性核酸への
転位における中間体である。対合複合体がポリヌクレオチド鎖移動（transfer）
反応に関与する能力に干渉することにより、対合複合体形成を転位から分離する
ことができることが本明細書にて開示される。本発明の方法において対合複合体
は、対合複合体が生産的転位を受けることを嫌う又は防ぐ条件下、in vitroで形
成される。本発明は、Ｔｎ５突然変異誘発法の使用を、例えばプロモーター及び
その他の調節配列の構造及び要件についてほとんど知られていない大腸菌（E.co
li）系統に近くない細菌へと拡張することができる。そのような細胞では、トラ
ンスポザーゼは適切な量で発現しないか、又は不安定であろう。本発明は、内在
性トランスポザーゼ分子の生産の必要性を回避する。更に、導入されるトランス
ポザーゼはトランスポゾンポリヌクレオチドと完全に複合体化するので、該トラ
ンスポザーゼは全ての標的ＤＮＡの存在下で機能する態勢にあり、かつ該トラン
スポザーゼが複合体化するポリヌクレオチドの転位を促進するのに十分に安定で
ある。本発明者等により開発された、対合複合体がポリヌクレオチド鎖移動を受
けることを防ぐ１つの方法は、反応混合物からマグネシウムイオン（Ｍｇ++）を
減少又は除去することにより達成される。したがって、本発明の好ましい態様で
は、適切なトランスポザーゼ及び適切な転位性ＤＮＡ要素を、反応混合物がポリ
ヌクレオチド鎖の移動を支持するのに不十分なレベルのマグネシウムを含んでい
る、好ましくはマグネシウムイオンを含んでいないin vitro反応において組み合
わせる。対合複合体を形成するのに適切な反応緩衝液は、本明細書に組み込まれ
た前記国際出願の１９頁に記載の反応緩衝液を改変して酢酸マグネシウムを除去
したものであることができる。反応緩衝液からＢＳＡ及びスペルミジンを除去す
ることもできる。反応中にヌクレアーゼが存在しない場合には、ｔＲＮＡを緩衝
液から除去することができる。この場合、ｔＲＮＡを添加することができる。反
応緩衝液を更に単純化することが可能であるかもしれない。典型的な反応は後述
の実施例に記載する。
よりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される修飾Ｔｎ５トランスポザ
ーゼを使用したin vitro転位系において、本件出願人は、修飾突然変異体Ｔｎ５
トランスポザーゼ及び転位性ヌクレオチドに隣接する修飾Ｔｎ５ポリヌクレオチ
ド配列を使用したin vitroでの転位性ポリヌクレオチドの生産的転位を証明する
。 本発明は、in vitro転位が実質的に存在しないにもかかわらず対合複合体がin
vitroで形成される点で従来の系とは異なる。対合複合体は標的細胞へ導入され
、そこでin vivo転位が容易に起こる。図１は、標的細胞の染色体核酸又は染色
体外核酸におけるランダム又は準ランダムな部位に挿入突然変異を効率的に導入
する本発明のＴｎ５をベースとする方法の１つの側面の概略図を提供する。本発
明の方法において、標的細胞内の細胞性核酸と対合複合体とを、細胞性ＤＮＡへ
の転位を媒介する条件下で組み合わせる。前記対合複合体は（ａ）Ｔｎ５トラン
スポザーゼタンパク質（図１では隣接する円の対として示される）並びに（ｂ）
ポリヌクレオチドであって、Ｔｎ５トランスポザーゼとの動作可能な相互作用に
適合した逆方向（inverted）のヌクレオチド配列対（図１では矢印として示され
る）及び該ヌクレオチド配列対間の転位性ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド
を含んでいる。対合複合体の構造は、転位性ポリヌクレオチドの細胞性核酸への
転位における中間体である。対合複合体がポリヌクレオチド鎖移動（transfer）
反応に関与する能力に干渉することにより、対合複合体形成を転位から分離する
ことができることが本明細書にて開示される。本発明の方法において対合複合体
は、対合複合体が生産的転位を受けることを嫌う又は防ぐ条件下、in vitroで形
成される。本発明は、Ｔｎ５突然変異誘発法の使用を、例えばプロモーター及び
その他の調節配列の構造及び要件についてほとんど知られていない大腸菌（E.co
li）系統に近くない細菌へと拡張することができる。そのような細胞では、トラ
ンスポザーゼは適切な量で発現しないか、又は不安定であろう。本発明は、内在
性トランスポザーゼ分子の生産の必要性を回避する。更に、導入されるトランス
ポザーゼはトランスポゾンポリヌクレオチドと完全に複合体化するので、該トラ
ンスポザーゼは全ての標的ＤＮＡの存在下で機能する態勢にあり、かつ該トラン
スポザーゼが複合体化するポリヌクレオチドの転位を促進するのに十分に安定で
ある。本発明者等により開発された、対合複合体がポリヌクレオチド鎖移動を受
けることを防ぐ１つの方法は、反応混合物からマグネシウムイオン（Ｍｇ++）を
減少又は除去することにより達成される。したがって、本発明の好ましい態様で
は、適切なトランスポザーゼ及び適切な転位性ＤＮＡ要素を、反応混合物がポリ
ヌクレオチド鎖の移動を支持するのに不十分なレベルのマグネシウムを含んでい
る、好ましくはマグネシウムイオンを含んでいないin vitro反応において組み合
わせる。対合複合体を形成するのに適切な反応緩衝液は、本明細書に組み込まれ
た前記国際出願の１９頁に記載の反応緩衝液を改変して酢酸マグネシウムを除去
したものであることができる。反応緩衝液からＢＳＡ及びスペルミジンを除去す
ることもできる。反応中にヌクレアーゼが存在しない場合には、ｔＲＮＡを緩衝
液から除去することができる。この場合、ｔＲＮＡを添加することができる。反
応緩衝液を更に単純化することが可能であるかもしれない。典型的な反応は後述
の実施例に記載する。
【０００４】 対合複合体は効率的な転位を媒介する態勢にあり、必要とされるまで低温貯蔵
下に有利に置くことができる。対合複合体を、転位に都合のよい条件を提供する
ことができる適切な標的細胞へ導入することができる。そこでは効率的な転位が
起こる。対合複合体を複数の適切な標的細胞へ導入し、挿入突然変異を含む細胞
を選択することにより、ランダム又は準ランダムな挿入突然変異を含む細胞のラ
イブラリーを作製することができる。挿入突然変異体のライブラリーを調製する
ために、転位性核酸配列は、好ましくは便利な選択可能なマーカー、例えば抗生
物質耐性を与え、細胞性ＤＮＡにて挿入突然変異を欠く細胞を生産的転位が起き
ている細胞から容易に区別することを可能にする遺伝子を含んでいる。本発明に
したがい形成したライブラリーを、転位後の遺伝子型又は表現型の変化について
スクリーニングすることができる。分子遺伝学のレベルにおいて、ハイブリダイ
ゼーション、制限酵素断片マッピング、ヌクレオチド配列決定及びこれらの組み
合わせ又は遺伝子変化を同定するその他の方法を含む標準的な分析方法を使用す
ることができる。表現型レベルにおいて、変化した増殖特性又はその他の表現型
を有する個々の突然変異体について転位突然変異体のライブラリーメンバーを評
価することができる。 所望の特徴を有する転位性ポリヌクレオチド配列を含む対合複合体のキット、
例えば後述のキットを商品化して、後述するように挿入配列が特定の目標を達成
するように設計されている挿入突然変異を含むライブラリーの迅速な作製を促進
することができる。本発明の対合複合体は、生産的転位を受けるポリヌクレオチ
ド分子を実質的に含まない。更に、対合複合体はin vitro反応で作製されるので
、前記複合体をその他のタンパク質、遺伝物質等が除かれた実質的に純粋な調製
物として提供することができる。 対合複合体中のＴｎ５トランスポザーゼは、対合複合体をin vitroで効率的に
作製するＴｎ５トランスポザーゼ（例えば、約２５％以上のトランスポゾンＤＮ
Ａをトランスポザーゼを有する対合複合体へと転換するもの）であることができ
る。トランスポザーゼは、国際出願第PCT/US97/15941号に開示される過剰活性化
Ｔｎ５であることができる。好ましい変異体Ｔｎ５トランスポザーゼは、野生型
Ｔｎ５トランスポザーゼに対して修飾した変異体Ｔｎ５トランスポザーゼである
。前記変異体Ｔｎ５トランスポザーゼは部位５４及び部位３７２に突然変異を含
み、かつ、ドナーＤＮＡのＴｎ５外側端（outside end）反復配列に対する高い
結合活性を有し、野生型Ｔｎ５トランスポザーゼよりも低い多量体形成能力を有
する。Ｔｎ５外側端反復配列に対する高い結合活性を与える部位５４における突
然変異は、野生型のグルタミン酸からリジンへの変異である。非生産的多量体形
成能力の低下を引き起こす部位３７２における突然変異は、野生型のリジンから
プロリンへの変異である。
下に有利に置くことができる。対合複合体を、転位に都合のよい条件を提供する
ことができる適切な標的細胞へ導入することができる。そこでは効率的な転位が
起こる。対合複合体を複数の適切な標的細胞へ導入し、挿入突然変異を含む細胞
を選択することにより、ランダム又は準ランダムな挿入突然変異を含む細胞のラ
イブラリーを作製することができる。挿入突然変異体のライブラリーを調製する
ために、転位性核酸配列は、好ましくは便利な選択可能なマーカー、例えば抗生
物質耐性を与え、細胞性ＤＮＡにて挿入突然変異を欠く細胞を生産的転位が起き
ている細胞から容易に区別することを可能にする遺伝子を含んでいる。本発明に
したがい形成したライブラリーを、転位後の遺伝子型又は表現型の変化について
スクリーニングすることができる。分子遺伝学のレベルにおいて、ハイブリダイ
ゼーション、制限酵素断片マッピング、ヌクレオチド配列決定及びこれらの組み
合わせ又は遺伝子変化を同定するその他の方法を含む標準的な分析方法を使用す
ることができる。表現型レベルにおいて、変化した増殖特性又はその他の表現型
を有する個々の突然変異体について転位突然変異体のライブラリーメンバーを評
価することができる。 所望の特徴を有する転位性ポリヌクレオチド配列を含む対合複合体のキット、
例えば後述のキットを商品化して、後述するように挿入配列が特定の目標を達成
するように設計されている挿入突然変異を含むライブラリーの迅速な作製を促進
することができる。本発明の対合複合体は、生産的転位を受けるポリヌクレオチ
ド分子を実質的に含まない。更に、対合複合体はin vitro反応で作製されるので
、前記複合体をその他のタンパク質、遺伝物質等が除かれた実質的に純粋な調製
物として提供することができる。 対合複合体中のＴｎ５トランスポザーゼは、対合複合体をin vitroで効率的に
作製するＴｎ５トランスポザーゼ（例えば、約２５％以上のトランスポゾンＤＮ
Ａをトランスポザーゼを有する対合複合体へと転換するもの）であることができ
る。トランスポザーゼは、国際出願第PCT/US97/15941号に開示される過剰活性化
Ｔｎ５であることができる。好ましい変異体Ｔｎ５トランスポザーゼは、野生型
Ｔｎ５トランスポザーゼに対して修飾した変異体Ｔｎ５トランスポザーゼである
。前記変異体Ｔｎ５トランスポザーゼは部位５４及び部位３７２に突然変異を含
み、かつ、ドナーＤＮＡのＴｎ５外側端（outside end）反復配列に対する高い
結合活性を有し、野生型Ｔｎ５トランスポザーゼよりも低い多量体形成能力を有
する。Ｔｎ５外側端反復配列に対する高い結合活性を与える部位５４における突
然変異は、野生型のグルタミン酸からリジンへの変異である。非生産的多量体形
成能力の低下を引き起こす部位３７２における突然変異は、野生型のリジンから
プロリンへの変異である。
【０００５】 トランスポザーゼと部分的に重複する配列においてコードされかつトランスポ
ザーゼ活性を妨害することができるタンパク質、いわゆるタンパク質性インヒビ
ターを、トランスポザーゼが含まないことも好ましい。本発明の方法では、トラ
ンスポザーゼは精製された又は部分的に精製された形態で使用される。トランス
ポザーゼ酵素が細胞から（通常の方法を用いて）得られる場合、本発明での使用
の前にトランスポザーゼをタンパク質性インヒビターを分離することができるだ
ろう。しかしながら、トランスポザーゼをコードする遺伝子からタンパク質性イ
ンヒビターの開始コドンを単純に除去することにより、すべての混入タンパク質
性インヒビター存在の可能性を遺伝子的に除去することができる。 トランスポザーゼの部位５６のアミノ酸であるメチオニンをコードする野生型
Ｔｎ５トランスポザーゼ遺伝子におけるＡＵＧは、タンパク質性インヒビターの
最初のコドンである。しかしながら、部位５６のメチオニンの置換はトランスポ
ザーゼ活性に対して明白な影響を与えず、同時にタンパク質性インヒビターの翻
訳を阻止し、結果として転位率がやや高くなることが既に示されている（Wygand
, T. W. 及び W. S. Reznikoff, "Characterization of Two Hypertransposing
Tn5 Mutants," J. Bact. 174:1229-1239 (1992)、参照することにより本明細書
に組み込まれる）。特に、本発明者等は好ましい態様においてメチオニンをアラ
ニンで置換した（メチオニンをコードするＡＵＧコドンを、アラニンをコードす
るＧＣＣで置換した）。それゆえ、この改変は単に技術的に有利である（なぜな
ら、in vitro系にタンパク質性インヒビターが存在しないことを保証するからで
ある）と考えることができ、本発明に必須ではない（なぜなら、その他の手段を
使用してタンパク質性インヒビターをin vitro系から除去することができるから
である）けれども、本発明の好ましいトランスポザーゼは、アミノ酸の部位５６
にメチオニン以外のアミノ酸を含んでいる。図２に模式的に示されるのは、野生
型Ｔｎ５トランスポザーゼに対して部位５４、５６及び３７２に突然変異を有す
る好ましいトランスポザーゼ酵素である。
ザーゼ活性を妨害することができるタンパク質、いわゆるタンパク質性インヒビ
ターを、トランスポザーゼが含まないことも好ましい。本発明の方法では、トラ
ンスポザーゼは精製された又は部分的に精製された形態で使用される。トランス
ポザーゼ酵素が細胞から（通常の方法を用いて）得られる場合、本発明での使用
の前にトランスポザーゼをタンパク質性インヒビターを分離することができるだ
ろう。しかしながら、トランスポザーゼをコードする遺伝子からタンパク質性イ
ンヒビターの開始コドンを単純に除去することにより、すべての混入タンパク質
性インヒビター存在の可能性を遺伝子的に除去することができる。 トランスポザーゼの部位５６のアミノ酸であるメチオニンをコードする野生型
Ｔｎ５トランスポザーゼ遺伝子におけるＡＵＧは、タンパク質性インヒビターの
最初のコドンである。しかしながら、部位５６のメチオニンの置換はトランスポ
ザーゼ活性に対して明白な影響を与えず、同時にタンパク質性インヒビターの翻
訳を阻止し、結果として転位率がやや高くなることが既に示されている（Wygand
, T. W. 及び W. S. Reznikoff, "Characterization of Two Hypertransposing
Tn5 Mutants," J. Bact. 174:1229-1239 (1992)、参照することにより本明細書
に組み込まれる）。特に、本発明者等は好ましい態様においてメチオニンをアラ
ニンで置換した（メチオニンをコードするＡＵＧコドンを、アラニンをコードす
るＧＣＣで置換した）。それゆえ、この改変は単に技術的に有利である（なぜな
ら、in vitro系にタンパク質性インヒビターが存在しないことを保証するからで
ある）と考えることができ、本発明に必須ではない（なぜなら、その他の手段を
使用してタンパク質性インヒビターをin vitro系から除去することができるから
である）けれども、本発明の好ましいトランスポザーゼは、アミノ酸の部位５６
にメチオニン以外のアミノ酸を含んでいる。図２に模式的に示されるのは、野生
型Ｔｎ５トランスポザーゼに対して部位５４、５６及び３７２に突然変異を有す
る好ましいトランスポザーゼ酵素である。
【０００６】 対合複合体内の転位性ポリヌクレオチドは、in vitro Ｔｎ５転位系にて機能
することができる長さ１８又は１９塩基の配列を含む逆方向ポリヌクレオチド対
により隣接されるヌクレオチド配列として特徴付けられる。ポリヌクレオチド（
又はそのあらゆる部分）は、当業者に周知の方法により合成することができ、又
、核酸フラグメントの遺伝子操作法を使用して作製することができる。図３につ
いて言及すると、野生型Ｔｎ５トランスポゾン配列の外側端（ＯＥ）末端配列の
既知の核酸配列（5'-CTGACTCTTATACACAAGT-3'）を隣接ポリヌクレオチドとして
使用することができ、同様に野生型Ｔｎ５トランスポゾン配列の内側端（inside
end）（ＩＥ）末端配列（5'-CTGTCTCTTGATCAGATCT-3'）も使用することができ
る。野生型ＯＥ末端配列を使用することができるけれども、構築物中の末端がＯ
ＥとＩＥ配列との間のモザイク中間体である場合、野生型ＯＥと少なくとも同等
、通常は野生型ＯＥよりも有意に高い転位頻度を達成することができることを証
明している。好ましいモザイク末端配列は、部位１０、１１及び１２においてそ
れぞれＡ、Ｔ、Ａを含み、更に野生型ＯＥ及びＩＥに共通のヌクレオチド（例え
ば、部位１〜３、５〜９、１３，１４、１６及び適宜１９）を含んでいる。部位
４、１５、１７及び１８におけるヌクレオチドは、野生型ＯＥ又は野生型ＩＥの
いずれかにおいて対応の部位に見いだされるヌクレオチドに対応することができ
る。部位４のヌクレオチドがＴであり、前記のヌクレオチドと組み合わせた場合
、転位頻度を野生型ＯＥよりも増強させることができることが注目される。同一
でない端の組み合わせも用いることができる。
することができる長さ１８又は１９塩基の配列を含む逆方向ポリヌクレオチド対
により隣接されるヌクレオチド配列として特徴付けられる。ポリヌクレオチド（
又はそのあらゆる部分）は、当業者に周知の方法により合成することができ、又
、核酸フラグメントの遺伝子操作法を使用して作製することができる。図３につ
いて言及すると、野生型Ｔｎ５トランスポゾン配列の外側端（ＯＥ）末端配列の
既知の核酸配列（5'-CTGACTCTTATACACAAGT-3'）を隣接ポリヌクレオチドとして
使用することができ、同様に野生型Ｔｎ５トランスポゾン配列の内側端（inside
end）（ＩＥ）末端配列（5'-CTGTCTCTTGATCAGATCT-3'）も使用することができ
る。野生型ＯＥ末端配列を使用することができるけれども、構築物中の末端がＯ
ＥとＩＥ配列との間のモザイク中間体である場合、野生型ＯＥと少なくとも同等
、通常は野生型ＯＥよりも有意に高い転位頻度を達成することができることを証
明している。好ましいモザイク末端配列は、部位１０、１１及び１２においてそ
れぞれＡ、Ｔ、Ａを含み、更に野生型ＯＥ及びＩＥに共通のヌクレオチド（例え
ば、部位１〜３、５〜９、１３，１４、１６及び適宜１９）を含んでいる。部位
４、１５、１７及び１８におけるヌクレオチドは、野生型ＯＥ又は野生型ＩＥの
いずれかにおいて対応の部位に見いだされるヌクレオチドに対応することができ
る。部位４のヌクレオチドがＴであり、前記のヌクレオチドと組み合わせた場合
、転位頻度を野生型ＯＥよりも増強させることができることが注目される。同一
でない端の組み合わせも用いることができる。
【０００７】 転位性ポリヌクレオチドは好ましくは、Ｔｎ５転位に必要な逆方向ポリヌクレ
オチド配列をその末端に含む線状ポリヌクレオチドである。線状であるが、転位
性核酸及び逆方向ポリヌクレオチド配列以外の配列を含む転位性ポリヌクレオチ
ドを使用することも可能であるが、好ましくはない。そのような追加の配列は転
位性ポリヌクレオチドのいずれかの側に位置づけることができるが、トランスポ
ゾンＤＮＡの調製を複雑にすることからこのような配置は好ましくない。転位性
ポリヌクレオチドが環状、スーパーコイルＤＮＡ分子として提供されるとき、転
位は起こることができるが、転位頻度は転位性配列が線状分子であるとき程は高
くない。 必須の末端配列間の転位性核酸配列は、標的ゲノムへ挿入することが望ましい
全ての配列を含むことができる。図４は、いわゆるモザイク端及びその間の転位
性ポリヌクレオチドを有する概略的なトランスポゾンを示している。当業者は所
望の転位性核酸配列を容易に構築して特定の目的を達成することができる。本発
明は、逆方向ポリヌクレオチド配列間のあらゆる特定の核酸に限定されるもので
はない。むしろ配列は、全ての検出可能な配列、又は、当業者に既知の方法を用
いて検出することができる生成物をコードする配列であることができる。非限定
的な例により、転位性核酸配列は標的に選択可能なマーカーを提供することがで
きる。前記のマーカーは前記転位性核酸配列によりコードされるペプチド又はタ
ンパク質であることができる。前記配列は、細胞へ抗生物質耐性を与えるタンパ
ク質をコードすることができる。代替として転位性ポリヌクレオチドは、標的細
胞においてその存在を検出することができる配列を含むことができる。そのよう
な配列には、希な制限酵素に対する切断配列又はプローブが存在する全ての配列
を含むことができる。 更に転位性ポリヌクレオチドは、近くの配列の発現（転写又は翻訳）を調節す
る配列を含むことができる。調節配列は、転位性ポリヌクレオチド内のコード配
列によりコードされるタンパク質又はペプチドの発現を促進することができる。
代替として、転位性ポリヌクレオチドは、全てのコード配列から離れた調節配列
又は全ての調節配列から離れたコード配列を含むことができる。前者の場合、ゲ
ノムのコード配列上流の転位事象は、内在性コード配列の転写及び／又は翻訳の
調節に必要な調節要素を提供することができる。後者の場合、転位した配列は、
マーカー遺伝子であって、当該遺伝子が細胞性核酸の調節配列に隣接する部位に
転位したときにのみ生成物を生じる遺伝子を導入することにより、ゲノム内の未
知の調節配列を明らかにすることができる。
オチド配列をその末端に含む線状ポリヌクレオチドである。線状であるが、転位
性核酸及び逆方向ポリヌクレオチド配列以外の配列を含む転位性ポリヌクレオチ
ドを使用することも可能であるが、好ましくはない。そのような追加の配列は転
位性ポリヌクレオチドのいずれかの側に位置づけることができるが、トランスポ
ゾンＤＮＡの調製を複雑にすることからこのような配置は好ましくない。転位性
ポリヌクレオチドが環状、スーパーコイルＤＮＡ分子として提供されるとき、転
位は起こることができるが、転位頻度は転位性配列が線状分子であるとき程は高
くない。 必須の末端配列間の転位性核酸配列は、標的ゲノムへ挿入することが望ましい
全ての配列を含むことができる。図４は、いわゆるモザイク端及びその間の転位
性ポリヌクレオチドを有する概略的なトランスポゾンを示している。当業者は所
望の転位性核酸配列を容易に構築して特定の目的を達成することができる。本発
明は、逆方向ポリヌクレオチド配列間のあらゆる特定の核酸に限定されるもので
はない。むしろ配列は、全ての検出可能な配列、又は、当業者に既知の方法を用
いて検出することができる生成物をコードする配列であることができる。非限定
的な例により、転位性核酸配列は標的に選択可能なマーカーを提供することがで
きる。前記のマーカーは前記転位性核酸配列によりコードされるペプチド又はタ
ンパク質であることができる。前記配列は、細胞へ抗生物質耐性を与えるタンパ
ク質をコードすることができる。代替として転位性ポリヌクレオチドは、標的細
胞においてその存在を検出することができる配列を含むことができる。そのよう
な配列には、希な制限酵素に対する切断配列又はプローブが存在する全ての配列
を含むことができる。 更に転位性ポリヌクレオチドは、近くの配列の発現（転写又は翻訳）を調節す
る配列を含むことができる。調節配列は、転位性ポリヌクレオチド内のコード配
列によりコードされるタンパク質又はペプチドの発現を促進することができる。
代替として、転位性ポリヌクレオチドは、全てのコード配列から離れた調節配列
又は全ての調節配列から離れたコード配列を含むことができる。前者の場合、ゲ
ノムのコード配列上流の転位事象は、内在性コード配列の転写及び／又は翻訳の
調節に必要な調節要素を提供することができる。後者の場合、転位した配列は、
マーカー遺伝子であって、当該遺伝子が細胞性核酸の調節配列に隣接する部位に
転位したときにのみ生成物を生じる遺伝子を導入することにより、ゲノム内の未
知の調節配列を明らかにすることができる。
【０００８】 対合複合体が前記の同定された成分からin vitroで形成されると、これを当業
者に既知の方法を使用して標的細胞へ導入することができる。代替として対合複
合体を使用前に−４０℃で保存することができる。対合複合体を細胞へ導入する
好ましい方法はエレクトロポレーションであり、例えば、Dauer, W.J.ら, Nucle
ic Acids Research, 16:6127 (1988)（参照することによりその全体が本明細書
に組み込まれる）の例を使用する。転位は、追加の処置なしに、細胞性核酸への
送達へと続く。対合複合体が数μｌより多い量で存在する場合は、エレクトロポ
レーション反応における使用の前に、対合複合体を低塩緩衝液、例えば、限定さ
れるものではないが、7〜10％ グリセロールを含む6mM Tris、pH 7.5に対して透
析して、電極間のアーク放電が起こらない程十分に低いレベルまで反応混合物中
の塩を減少させることも好ましい。対合複合体を標的細胞へ導入するためのその
他の適切な方法は既知であり、これには形質転換、形質移入及びリポソーム媒介
法を含むことができる。 本発明の系は、突然変異を細胞へ迅速かつ効率的に導入する方法を提供する。
転位性ポリヌクレオチド配列が提供されるので、この系は宿主特異的ではなく、
全ての標的細胞において機能するだろう。本発明は、細胞、特にトランスポザー
ゼをコードしない細菌細胞において特別の有用性を見いだす。なぜなら、必要な
トランスポザーゼ分子が対合複合体の一部として直接提供されるからである。本
発明の方法は、無核標的系、例えば細菌細胞において機能することが証明される
。特に対合複合体を、大腸菌細胞（ＭＧ１６５５株）へ導入したとき、生産的な
転位が観察された。本発明の方法を有核細胞、例えば古細菌、植物及び動物細胞
、特に線虫、両生類並びにげっ歯類及びヒト（ただし、これらに限定されるもの
ではない）を含む哺乳類において使用することを妨げる科学的障害の存在は知ら
れていない。対合複合体の有核細胞への導入方法では、対合複合体に核局在化シ
グナルを、好ましくは遺伝子修飾されたトランスポザーゼタンパク質の一部とし
て提供することが好ましいだろう。 本発明は以下の実施例を考慮することにより容易に理解されるだろう。但し、
実施例は例示であり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
者に既知の方法を使用して標的細胞へ導入することができる。代替として対合複
合体を使用前に−４０℃で保存することができる。対合複合体を細胞へ導入する
好ましい方法はエレクトロポレーションであり、例えば、Dauer, W.J.ら, Nucle
ic Acids Research, 16:6127 (1988)（参照することによりその全体が本明細書
に組み込まれる）の例を使用する。転位は、追加の処置なしに、細胞性核酸への
送達へと続く。対合複合体が数μｌより多い量で存在する場合は、エレクトロポ
レーション反応における使用の前に、対合複合体を低塩緩衝液、例えば、限定さ
れるものではないが、7〜10％ グリセロールを含む6mM Tris、pH 7.5に対して透
析して、電極間のアーク放電が起こらない程十分に低いレベルまで反応混合物中
の塩を減少させることも好ましい。対合複合体を標的細胞へ導入するためのその
他の適切な方法は既知であり、これには形質転換、形質移入及びリポソーム媒介
法を含むことができる。 本発明の系は、突然変異を細胞へ迅速かつ効率的に導入する方法を提供する。
転位性ポリヌクレオチド配列が提供されるので、この系は宿主特異的ではなく、
全ての標的細胞において機能するだろう。本発明は、細胞、特にトランスポザー
ゼをコードしない細菌細胞において特別の有用性を見いだす。なぜなら、必要な
トランスポザーゼ分子が対合複合体の一部として直接提供されるからである。本
発明の方法は、無核標的系、例えば細菌細胞において機能することが証明される
。特に対合複合体を、大腸菌細胞（ＭＧ１６５５株）へ導入したとき、生産的な
転位が観察された。本発明の方法を有核細胞、例えば古細菌、植物及び動物細胞
、特に線虫、両生類並びにげっ歯類及びヒト（ただし、これらに限定されるもの
ではない）を含む哺乳類において使用することを妨げる科学的障害の存在は知ら
れていない。対合複合体の有核細胞への導入方法では、対合複合体に核局在化シ
グナルを、好ましくは遺伝子修飾されたトランスポザーゼタンパク質の一部とし
て提供することが好ましいだろう。 本発明は以下の実施例を考慮することにより容易に理解されるだろう。但し、
実施例は例示であり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【０００９】実施例 １μｇの反応において、０．０５μｇの精製した過剰活性化トランスポザーゼ
(EK45/MA56/LP372)（アミノ酸配列は、本明細書に組み込まれた国際出願第PCT/U
S97/15941号に報告されている）と、標的細胞にカナマイシン耐性を与えるタン
パク質をコードする発現カセットを含む０．１μｇの転位性ポリヌクレオチドと
を混合した。発現カセットは、本明細書に組み込まれた前記国際出願に記載され
、図３に示すモザイク端により隣接されていた。ポリヌクレオチドを、別々の反
応において、スーパーコイルしたプラスミド、線状プラスミド又はＴｎ５トラン
スポザーゼにより媒介される転位に必要な逆方向配列をその末端に含むポリヌク
レオチドとして提供した。 混合物を前記の反応緩衝液中、マグネシウムイオン（Ｍｇ++）の存在下又は非
存在下で１時間インキュベートした。マグネシウムイオンの非存在下では対合複
合体が形成したが、in vitro転位は起こらなかった。 インキュベート後、反応混合物を４０μｌの大腸菌株ＭＧ１６５５と混合し、
本明細書に組み込まれるDauerの方法にしたがいエレクトロポレーションに付し
た。細胞（１．４×１０9）をＬＢ−Ｋａｎプレート上に置き、カナマイシン耐
性コロニーを計数した。１０μｌの反応混合物を使用したとき、混合物を適切な
緩衝液に対して透析して、電極間のアーク放電を防止した。
(EK45/MA56/LP372)（アミノ酸配列は、本明細書に組み込まれた国際出願第PCT/U
S97/15941号に報告されている）と、標的細胞にカナマイシン耐性を与えるタン
パク質をコードする発現カセットを含む０．１μｇの転位性ポリヌクレオチドと
を混合した。発現カセットは、本明細書に組み込まれた前記国際出願に記載され
、図３に示すモザイク端により隣接されていた。ポリヌクレオチドを、別々の反
応において、スーパーコイルしたプラスミド、線状プラスミド又はＴｎ５トラン
スポザーゼにより媒介される転位に必要な逆方向配列をその末端に含むポリヌク
レオチドとして提供した。 混合物を前記の反応緩衝液中、マグネシウムイオン（Ｍｇ++）の存在下又は非
存在下で１時間インキュベートした。マグネシウムイオンの非存在下では対合複
合体が形成したが、in vitro転位は起こらなかった。 インキュベート後、反応混合物を４０μｌの大腸菌株ＭＧ１６５５と混合し、
本明細書に組み込まれるDauerの方法にしたがいエレクトロポレーションに付し
た。細胞（１．４×１０9）をＬＢ−Ｋａｎプレート上に置き、カナマイシン耐
性コロニーを計数した。１０μｌの反応混合物を使用したとき、混合物を適切な
緩衝液に対して透析して、電極間のアーク放電を防止した。
【００１０】 表１．Ｔｎ５対合複合体のエレクトロポレーション／転位 ＤＮＡ Ｔｎｐ Ｍｇ++ 容量 Ｋａｎ4 ＣＦＵ スーパーコイル* − ＋ １μｌ なし スーパーコイル* ＋ ＋ １μｌ １．６×１０3 線状* ＋ ＋ １μｌ ６．９×１０3 遊離要素 ＋ ＋ １μｌ ３．９×１０3 （ＰｖｕＩＩ切断） 遊離要素 ＋ − １μｌ ５．３×１０4 遊離要素 ＋ − １μｌ（透析） ４．０×１０4 遊離要素 ＋ − １０μｌ（透析） ５．５×１０5 * ドナーのバックボーン配列を含む
【００１１】 反応混合物をマグネシウムイオンの非存在下でインキュベートしたとき、カナ
マイシン耐性を与える転位性ポリヌクレオチドの細胞における転位が高いことが
表より明らかである。転位性ポリヌクレオチドが転位性部分に隣接する配列を含
まないとき（表中、「遊離要素」）に優れた転位が観察された。マグネシウムを
反応混合物へ添加したとき、カナマイシン耐性ＣＦＵにおける１０倍をこえる減
少が観察された。これは、マグネシウムイオンの存在下で起こることができる非
生産的分子内転位の結果であると考えられる。 ライブラリーの構築において、完全な範囲（すなわち、各ＯＲＦへの挿入）の
９９％の可能性を達成するために、約２００００の転位事象が要求される。転位
がＯＲＦ標的選択に関して真にランダムであること及び各ＯＲＦが同一の大きさ
であることをこの計算では仮定している。Ｔｎ５挿入物は探求した全ての遺伝子
において見いだされたが、Ｔｎ５は、遺伝子分布に関するランダム性をゆがめる
（skew）ことができる標的配列の偏りを有している。核様体の凝縮／組織化によ
り転位に課される未知の偏りが存在するかもしれない。更に、全てのＯＲＦが同
じ大きさではなく、大腸菌中では、例えば１００コドン以下から２３８３コドン
の範囲である。一方、前記の対合複合体のエレクトロポレーション／転位の結果
は、不要な機能への挿入を示した。なぜなら、生存可能なコロニー形成単位のみ
が形成されたからである。このことは、完全な転位挿入プールを示している。し
たがって、十分に代表的なライブラリーを形成するために、５００００〜５００
０００の実行可能な転位事象のプールが探求されるべきである。本明細書に記載
の発明は、この大きさのライブラリーを作製するのに十分に効率的である。 本発明は前記の記載に限定されるものではなく、全ての改変及び修飾が請求の
範囲内にあることが意図される。
マイシン耐性を与える転位性ポリヌクレオチドの細胞における転位が高いことが
表より明らかである。転位性ポリヌクレオチドが転位性部分に隣接する配列を含
まないとき（表中、「遊離要素」）に優れた転位が観察された。マグネシウムを
反応混合物へ添加したとき、カナマイシン耐性ＣＦＵにおける１０倍をこえる減
少が観察された。これは、マグネシウムイオンの存在下で起こることができる非
生産的分子内転位の結果であると考えられる。 ライブラリーの構築において、完全な範囲（すなわち、各ＯＲＦへの挿入）の
９９％の可能性を達成するために、約２００００の転位事象が要求される。転位
がＯＲＦ標的選択に関して真にランダムであること及び各ＯＲＦが同一の大きさ
であることをこの計算では仮定している。Ｔｎ５挿入物は探求した全ての遺伝子
において見いだされたが、Ｔｎ５は、遺伝子分布に関するランダム性をゆがめる
（skew）ことができる標的配列の偏りを有している。核様体の凝縮／組織化によ
り転位に課される未知の偏りが存在するかもしれない。更に、全てのＯＲＦが同
じ大きさではなく、大腸菌中では、例えば１００コドン以下から２３８３コドン
の範囲である。一方、前記の対合複合体のエレクトロポレーション／転位の結果
は、不要な機能への挿入を示した。なぜなら、生存可能なコロニー形成単位のみ
が形成されたからである。このことは、完全な転位挿入プールを示している。し
たがって、十分に代表的なライブラリーを形成するために、５００００〜５００
０００の実行可能な転位事象のプールが探求されるべきである。本明細書に記載
の発明は、この大きさのライブラリーを作製するのに十分に効率的である。 本発明は前記の記載に限定されるものではなく、全ての改変及び修飾が請求の
範囲内にあることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、対合複合体の標的細胞への転位、続く挿入突然変異体の選択を示し
ている。
ている。
【図２】 図２は、本発明における使用に好ましいトランスポザーゼ酵素を示している
。
。
【図３】 図３は、本発明において、転位性ポリヌクレオチド配列にて使用することが
できるトランスポゾン末端配列を示している。
できるトランスポゾン末端配列を示している。
【図４】 図４は、モザイク端及びその間の転位性核酸配列を有するトランスポゾン又
は転位性ポリヌクレオチド配列を示している。
は転位性ポリヌクレオチド配列を示している。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年１０月４日（２００１．１０．４）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００６】 対合複合体内の転位性ポリヌクレオチドは、in vitro Ｔｎ５転位系にて機能
することができる長さ１８又は１９塩基の配列を含む逆方向ポリヌクレオチド対
により隣接されるヌクレオチド配列として特徴付けられる。ポリヌクレオチド（
又はそのあらゆる部分）は、当業者に周知の方法により合成することができ、又
、核酸フラグメントの遺伝子操作法を使用して作製することができる。図３につ
いて言及すると、野生型Ｔｎ５トランスポゾン配列の外側端（ＯＥ）末端配列の
既知の核酸配列（5'-CTGACTCTTATACACAAGT-3'）を隣接ポリヌクレオチドとして
使用することができ、同様に野生型Ｔｎ５トランスポゾン配列の内側端（inside
end）（ＩＥ）末端配列（5'-CTGTCTCTTGATCAGATCT-3'）も使用することができ
る。野生型ＯＥ末端配列を使用することができるけれども、構築物中の末端がＯ
ＥとＩＥ配列との間のモザイク中間体である場合、野生型ＯＥと少なくとも同等
、通常は野生型ＯＥよりも有意に高い転位頻度を達成することができることを証
明している。好ましいモザイク末端配列は、部位１０、１１及び１２においてそ
れぞれＡ、Ｔ、Ａを含み、更に野生型ＯＥ及びＩＥに共通のヌクレオチド（例え
ば、部位１〜３、５〜９、１３，１４、１６及び適宜１９）を含んでいる。部位
４、１５、１７及び１８におけるヌクレオチドは、野生型ＯＥ又は野生型ＩＥの
いずれかにおいて対応の部位に見いだされるヌクレオチドに対応することができ
る。部位４のヌクレオチドがＴであり、前記のヌクレオチドと組み合わせた場合
、転位頻度を野生型ＯＥよりも増強させることができることが注目される。好ま しいモザイク配列には、CTGTCTCTTATACACATCT-3'及びCTGTCTCTTATACAGATCT-3'が 含まれる。 同一でない端の組み合わせも用いることができる。
することができる長さ１８又は１９塩基の配列を含む逆方向ポリヌクレオチド対
により隣接されるヌクレオチド配列として特徴付けられる。ポリヌクレオチド（
又はそのあらゆる部分）は、当業者に周知の方法により合成することができ、又
、核酸フラグメントの遺伝子操作法を使用して作製することができる。図３につ
いて言及すると、野生型Ｔｎ５トランスポゾン配列の外側端（ＯＥ）末端配列の
既知の核酸配列（5'-CTGACTCTTATACACAAGT-3'）を隣接ポリヌクレオチドとして
使用することができ、同様に野生型Ｔｎ５トランスポゾン配列の内側端（inside
end）（ＩＥ）末端配列（5'-CTGTCTCTTGATCAGATCT-3'）も使用することができ
る。野生型ＯＥ末端配列を使用することができるけれども、構築物中の末端がＯ
ＥとＩＥ配列との間のモザイク中間体である場合、野生型ＯＥと少なくとも同等
、通常は野生型ＯＥよりも有意に高い転位頻度を達成することができることを証
明している。好ましいモザイク末端配列は、部位１０、１１及び１２においてそ
れぞれＡ、Ｔ、Ａを含み、更に野生型ＯＥ及びＩＥに共通のヌクレオチド（例え
ば、部位１〜３、５〜９、１３，１４、１６及び適宜１９）を含んでいる。部位
４、１５、１７及び１８におけるヌクレオチドは、野生型ＯＥ又は野生型ＩＥの
いずれかにおいて対応の部位に見いだされるヌクレオチドに対応することができ
る。部位４のヌクレオチドがＴであり、前記のヌクレオチドと組み合わせた場合
、転位頻度を野生型ＯＥよりも増強させることができることが注目される。好ま しいモザイク配列には、CTGTCTCTTATACACATCT-3'及びCTGTCTCTTATACAGATCT-3'が 含まれる。 同一でない端の組み合わせも用いることができる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００９】実施例 １μｇの反応において、０．０５μｇの精製した過剰活性化トランスポザーゼ
(EK54/MA56/LP372)（アミノ酸配列は、本明細書に組み込まれた国際出願第PCT/U
S97/15941号に報告されている）と、標的細胞にカナマイシン耐性を与えるタン
パク質をコードする発現カセットを含む０．１μｇの転位性ポリヌクレオチドと
を混合した。発現カセットは、本明細書に組み込まれた前記国際出願に記載され
、図３に示すモザイク端により隣接されていた。ポリヌクレオチドを、別々の反
応において、スーパーコイルしたプラスミド、線状プラスミド又はＴｎ５トラン
スポザーゼにより媒介される転位に必要な逆方向配列をその末端に含むポリヌク
レオチドとして提供した。 混合物を前記の反応緩衝液中、マグネシウムイオン（Ｍｇ++）の存在下又は非
存在下で１時間インキュベートした。マグネシウムイオンの非存在下では対合複
合体が形成したが、in vitro転位は起こらなかった。 インキュベート後、反応混合物を４０μｌの大腸菌株ＭＧ１６５５と混合し、
本明細書に組み込まれるDauerの方法にしたがいエレクトロポレーションに付し
た。細胞（１．４×１０9）をＬＢ−Ｋａｎプレート上に置き、カナマイシン耐
性コロニーを計数した。１０μｌの反応混合物を使用したとき、混合物を適切な
緩衝液に対して透析して、電極間のアーク放電を防止した。
(EK54/MA56/LP372)（アミノ酸配列は、本明細書に組み込まれた国際出願第PCT/U
S97/15941号に報告されている）と、標的細胞にカナマイシン耐性を与えるタン
パク質をコードする発現カセットを含む０．１μｇの転位性ポリヌクレオチドと
を混合した。発現カセットは、本明細書に組み込まれた前記国際出願に記載され
、図３に示すモザイク端により隣接されていた。ポリヌクレオチドを、別々の反
応において、スーパーコイルしたプラスミド、線状プラスミド又はＴｎ５トラン
スポザーゼにより媒介される転位に必要な逆方向配列をその末端に含むポリヌク
レオチドとして提供した。 混合物を前記の反応緩衝液中、マグネシウムイオン（Ｍｇ++）の存在下又は非
存在下で１時間インキュベートした。マグネシウムイオンの非存在下では対合複
合体が形成したが、in vitro転位は起こらなかった。 インキュベート後、反応混合物を４０μｌの大腸菌株ＭＧ１６５５と混合し、
本明細書に組み込まれるDauerの方法にしたがいエレクトロポレーションに付し
た。細胞（１．４×１０9）をＬＢ−Ｋａｎプレート上に置き、カナマイシン耐
性コロニーを計数した。１０μｌの反応混合物を使用したとき、混合物を適切な
緩衝液に対して透析して、電極間のアーク放電を防止した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/566 Ｘ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｕ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ， ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，Ｌ Ｃ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ， ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，Ｔ Ｊ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ゴリシン イゴール ワイ アメリカ合衆国 ウィスコンシン州 53705 マディソン ユニヴァーシティー ハウジズ 23−＃ディー Ｆターム(参考） 2G045 AA35 AA40 CB01 DA12 DA13 DA20 FB01 FB02 4B024 AA20 CA01 CA06 CA11 GA14 GA25 HA01 4B050 CC02 CC04 GG03 LL10 4B063 QA05 QQ05 QQ12 QQ98 QR31 QR74 QR80 QS38
Claims (18)
- 【請求項１】 標的細胞中の細胞性核酸のランダム又は準ランダムな部位に
挿入突然変異を作製する方法であって、 対合複合体を、該細胞性核酸への転位を媒介する条件下で、該標的細胞へ導入
する工程を含み、 該対合複合体は、（ａ）Ｔｎ５トランスポザーゼタンパク質及び（ｂ）該Ｔｎ
５トランスポザーゼと動作可能に相互作用して該対合複合体を形成するのに適合
したヌクレオチド配列対及び該ヌクレオチド対間にある転位性ヌクレオチドを含
むポリヌクレオチドを含むことを特徴とする方法。 - 【請求項２】 更に、該Ｔｎ５トランスポザーゼタンパク質と該ポリヌクレ
オチドとを、対合複合体を形成するポリヌクレオチド鎖の移動を嫌う条件下、in
vitroで組み合わせる工程を含む、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 該Ｔｎ５トランスポザーゼタンパク質と該ポリヌクレオチド
とを、ポリヌクレオチド鎖の移動を支持するには不十分なレベルのマグネシウム
イオンを含む反応において、in vitroで組み合わせる、請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 該反応がマグネシウムイオンを欠いている、請求項３記載の
方法。 - 【請求項５】 該トランスポザーゼが野生型Ｔｎ５トランスポザーゼに対し
て修飾された突然変異体Ｔｎ５トランスポザーゼであり、該突然変異体トランス
ポザーゼが、 部位５４における変異、及び、 部位３７２における変異 を含み、該突然変異体トランスポザーゼはドナーＤＮＡのＴｎ５外側端反復配列
に対する高い結合活性を有し、かつ、野生型Ｔｎ５トランスポザーゼよりも低い
多量体形成能力を有する、請求項１記載の方法。 - 【請求項６】 部位５４における突然変異が置換突然変異である、請求項５
記載の方法。 - 【請求項７】 部位５４がリジンである、請求項６記載の方法。
- 【請求項８】 部位３７２における突然変異が置換突然変異である、請求項
５記載の方法。 - 【請求項９】 部位３７２がプロリンである、請求項８記載の方法。
- 【請求項１０】 該Ｔｎ５トランスポザーゼが、部位５６における置換突然
変異を更に含み、該突然変異体トランスポザーゼがインヒビター活性を欠いてい
る、請求項５記載の方法。 - 【請求項１１】 部位５６がアラニンである、請求項１０記載の方法。
- 【請求項１２】 該Ｔｎ５トランスポザーゼとの動作可能な相互作用に適合
したヌクレオチド配列が、部位１０にヌクレオチドＡ、部位１１にヌクレオチド
Ｔ及び部位１２にヌクレオチドＡを含む１８又は１９塩基対のポリヌクレオチド
配列である、請求項１記載の方法。 - 【請求項１３】 該ヌクレオチド配列が配列：5'-CTGTCTCTTATACACATCT-3'
を有している、請求項１２記載の方法。 - 【請求項１４】 該ヌクレオチド配列が配列：5'-CTGTCTCTTATACAGATCT-3'
を有している、請求項１２記載の方法。 - 【請求項１５】 （ａ）Ｔｎ５トランスポザーゼタンパク質及び（ｂ）該Ｔ
ｎ５トランスポザーゼと動作可能に相互作用して該対合複合体を形成するのに適
合したヌクレオチド配列対及び該ヌクレオチド対間にある転位性ヌクレオチドを
含むポリヌクレオチドの間の対合複合体を形成する方法であって、 （ａ）と（ｂ）とを、対合複合体を形成するポリヌクレオチド鎖の移動を嫌う
条件下、in vitroで組み合わせる工程、 を含む方法。 - 【請求項１６】 該Ｔｎ５トランスポザーゼタンパク質と該ポリヌクレオチ
ドとを、ポリヌクレオチド鎖の移動を支持するには不十分なレベルのマグネシウ
ムイオンを含む反応においてin vitroで組み合わせる、請求項１５記載の方法。 - 【請求項１７】 該反応がマグネシウムイオンを欠いている、請求項１６記
載の方法。 - 【請求項１８】 複数の標的細胞内の細胞性核酸のランダム又は準ランダム
な部位に挿入突然変異を有するライブラリーを作製する方法であって、 対合複合体を、該細胞性核酸への転位を媒介する条件下で該標的細胞へ導入す
る工程であって、該対合複合体は、（ａ）Ｔｎ５トランスポザーゼタンパク質及
び（ｂ）該Ｔｎ５トランスポザーゼと動作可能に相互作用して該対合複合体を形
成するのに適合したヌクレオチド配列対及び該ヌクレオチド対間にある転位性ヌ
クレオチドを含むポリヌクレオチドを含み、該転位性ヌクレオチド配列が選択可
能なマーカーを含んでいる工程、及び、 該選択マーカーを含む細胞についてスクリーニングする工程 を含むことを特徴とする方法。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4809213B2 (ja) * | 2003-04-14 | 2011-11-09 | フィンザイムス オイ | Ｉｎｖｉｔｒｏで構築されたＭｕ転位複合体を用いて真核生物ゲノムに核酸を送達する方法 |
Families Citing this family (121)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6159736A (en) * | 1998-09-23 | 2000-12-12 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Method for making insertional mutations using a Tn5 synaptic complex |
| US6406896B1 (en) * | 1999-08-02 | 2002-06-18 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Transposase enzyme and method for use |
| DE60139249D1 (de) * | 2000-03-21 | 2009-08-27 | Univ Erasmus Medical Ct | Methode zur herstellung von transgene säugetiere mittels transposons |
| AU2001271912A1 (en) * | 2000-07-07 | 2002-01-21 | Maxygen, Inc. | Molecular breeding of transposable elements |
| US20020061861A1 (en) * | 2000-08-17 | 2002-05-23 | Hans Herweijer | Nucleic acid expression from linear nucleic acids |
| EP1339863A2 (en) * | 2000-12-05 | 2003-09-03 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Double transposition methods for manipulating nucleic acids |
| US7138267B1 (en) * | 2001-04-04 | 2006-11-21 | Epicentre Technologies Corporation | Methods and compositions for amplifying DNA clone copy number |
| US20030143740A1 (en) * | 2001-10-15 | 2003-07-31 | Christine Wooddell | Processes for transposase mediated integration into mammalian cells |
| US7262056B2 (en) * | 2001-11-08 | 2007-08-28 | Mirus Bio Corporation | Enhancing intermolecular integration of nucleic acids using integrator complexes |
| US7101713B1 (en) * | 2002-05-16 | 2006-09-05 | Epicentre Technologies Corporation | DNA transformation efficiency by inhibiting host cell restriction |
| US7527966B2 (en) | 2002-06-26 | 2009-05-05 | Transgenrx, Inc. | Gene regulation in transgenic animals using a transposon-based vector |
| US20040172667A1 (en) | 2002-06-26 | 2004-09-02 | Cooper Richard K. | Administration of transposon-based vectors to reproductive organs |
| US7083980B2 (en) * | 2003-04-17 | 2006-08-01 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Tn5 transposase mutants and the use thereof |
| WO2005062881A2 (en) | 2003-12-24 | 2005-07-14 | Transgenrx, Inc. | Gene therapy using transposon-based vectors |
| WO2005100585A2 (en) * | 2004-03-30 | 2005-10-27 | Epicentre | Methods for obtaining directionally truncated polypeptides |
| US7608434B2 (en) * | 2004-08-04 | 2009-10-27 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Mutated Tn5 transposase proteins and the use thereof |
| EP1752532A1 (en) | 2005-08-09 | 2007-02-14 | Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH | Extracellular polyhydroxyalkanoates produced by genetically engineered microorganisms |
| US9157097B2 (en) | 2008-09-25 | 2015-10-13 | Proteovec Holding, L.L.C. | Vectors for production of growth hormone |
| US9150880B2 (en) | 2008-09-25 | 2015-10-06 | Proteovec Holding, L.L.C. | Vectors for production of antibodies |
| CA2750054C (en) | 2008-10-24 | 2018-05-29 | Epicentre Technologies Corporation | Transposon end compositions and methods for modifying nucleic acids |
| US9080211B2 (en) | 2008-10-24 | 2015-07-14 | Epicentre Technologies Corporation | Transposon end compositions and methods for modifying nucleic acids |
| WO2010118360A1 (en) | 2009-04-09 | 2010-10-14 | The Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College | Production of proteins using transposon-based vectors |
| US20190300945A1 (en) | 2010-04-05 | 2019-10-03 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially Encoded Biological Assays |
| CN105385756B (zh) | 2010-04-05 | 2020-12-25 | 普罗格诺西斯生物科学公司 | 空间编码的生物学测定 |
| US10787701B2 (en) | 2010-04-05 | 2020-09-29 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays |
| GB201106254D0 (en) | 2011-04-13 | 2011-05-25 | Frisen Jonas | Method and product |
| JP6367196B2 (ja) | 2012-08-14 | 2018-08-01 | テンエックス・ジェノミクス・インコーポレイテッド | マイクロカプセル組成物および方法 |
| US10323279B2 (en) | 2012-08-14 | 2019-06-18 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| US10273541B2 (en) | 2012-08-14 | 2019-04-30 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| US9951386B2 (en) | 2014-06-26 | 2018-04-24 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| US10752949B2 (en) | 2012-08-14 | 2020-08-25 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| US10221442B2 (en) | 2012-08-14 | 2019-03-05 | 10X Genomics, Inc. | Compositions and methods for sample processing |
| US9701998B2 (en) | 2012-12-14 | 2017-07-11 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| US10400280B2 (en) | 2012-08-14 | 2019-09-03 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| US11591637B2 (en) | 2012-08-14 | 2023-02-28 | 10X Genomics, Inc. | Compositions and methods for sample processing |
| EP2909337B1 (en) | 2012-10-17 | 2019-01-09 | Spatial Transcriptomics AB | Methods and product for optimising localised or spatial detection of gene expression in a tissue sample |
| US10533221B2 (en) | 2012-12-14 | 2020-01-14 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| EP3567116A1 (en) | 2012-12-14 | 2019-11-13 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| US9644204B2 (en) | 2013-02-08 | 2017-05-09 | 10X Genomics, Inc. | Partitioning and processing of analytes and other species |
| EP2999792B1 (en) | 2013-05-23 | 2018-11-14 | The Board of Trustees of The Leland Stanford Junior University | Transposition into native chromatin for personal epigenomics |
| DK3013984T3 (da) | 2013-06-25 | 2023-06-06 | Prognosys Biosciences Inc | Metode til bestemmelse af spatiale mønstre i biologiske targets i en prøve |
| CN105358715B (zh) | 2013-07-03 | 2018-09-18 | 伊鲁米那股份有限公司 | 正交合成测序 |
| WO2015157567A1 (en) | 2014-04-10 | 2015-10-15 | 10X Genomics, Inc. | Fluidic devices, systems, and methods for encapsulating and partitioning reagents, and applications of same |
| TWI682997B (zh) * | 2014-04-15 | 2020-01-21 | 美商伊路米納有限公司 | 用於改善插入序列傾向及增加ｄｎａ輸入耐受度之經修飾的轉位酶 |
| US10526601B2 (en) | 2014-05-23 | 2020-01-07 | Digenomix Corporation | Haploidome determination by digitized transposons |
| KR102531677B1 (ko) | 2014-06-26 | 2023-05-10 | 10엑스 제노믹스, 인크. | 개별 세포 또는 세포 개체군으로부터 핵산을 분석하는 방법 |
| US10093955B2 (en) * | 2014-10-14 | 2018-10-09 | Covaris, Inc. | Acoustic energy mediation of genetic fragmentation |
| AU2015339148B2 (en) | 2014-10-29 | 2022-03-10 | 10X Genomics, Inc. | Methods and compositions for targeted nucleic acid sequencing |
| US9975122B2 (en) | 2014-11-05 | 2018-05-22 | 10X Genomics, Inc. | Instrument systems for integrated sample processing |
| EP3244992B1 (en) | 2015-01-12 | 2023-03-08 | 10X Genomics, Inc. | Processes for barcoding nucleic acids |
| US11274343B2 (en) | 2015-02-24 | 2022-03-15 | 10X Genomics, Inc. | Methods and compositions for targeted nucleic acid sequence coverage |
| EP4286516A3 (en) | 2015-02-24 | 2024-03-06 | 10X Genomics, Inc. | Partition processing methods and systems |
| ES2972835T3 (es) | 2015-04-10 | 2024-06-17 | 10X Genomics Sweden Ab | Análisis multiplex de especímenes biológicos de ácidos nucleicos espacialmente distinguidos |
| US10844428B2 (en) | 2015-04-28 | 2020-11-24 | Illumina, Inc. | Error suppression in sequenced DNA fragments using redundant reads with unique molecular indices (UMIS) |
| US11155822B2 (en) | 2015-05-14 | 2021-10-26 | Universidad De Los Andes | Transposon that promotes functional DNA expression in episomal DNAs and method to enhance DNA transcription during functional analysis of metagenomic libraries |
| US11155864B2 (en) | 2015-07-30 | 2021-10-26 | Illumina, Inc. | Orthogonal deblocking of nucleotides |
| WO2017025594A1 (en) | 2015-08-12 | 2017-02-16 | Cemm Forschungszentrum Für Molekulare Medizin Gmbh | Methods for studying nucleic acids |
| DK3882357T3 (da) | 2015-12-04 | 2022-08-29 | 10X Genomics Inc | Fremgangsmåder og sammensætninger til analyse af nukleinsyrer |
| WO2017123758A1 (en) * | 2016-01-12 | 2017-07-20 | Seqwell, Inc. | Compositions and methods for sequencing nucleic acids |
| ES2634802B1 (es) * | 2016-03-28 | 2018-07-03 | Victor Manuel GALVEZ JEREZ | Molécula de ácido nucleico y método para modificar de forma bialélica un gen diana o locus presente en el material genético de una célula |
| WO2017197338A1 (en) | 2016-05-13 | 2017-11-16 | 10X Genomics, Inc. | Microfluidic systems and methods of use |
| CN106222164B (zh) * | 2016-07-28 | 2020-04-21 | 元码基因科技（北京）股份有限公司 | 利用转座子酶进行体外核酸单向扩增的方法、组合物和试剂盒 |
| US10011872B1 (en) | 2016-12-22 | 2018-07-03 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| US10550429B2 (en) | 2016-12-22 | 2020-02-04 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| US10815525B2 (en) | 2016-12-22 | 2020-10-27 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| SG11201906428SA (en) | 2017-01-18 | 2019-08-27 | Illumina Inc | Methods and systems for generation and error-correction of unique molecular index sets with heterogeneous molecular lengths |
| WO2018140966A1 (en) | 2017-01-30 | 2018-08-02 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for droplet-based single cell barcoding |
| SG11201909697TA (en) | 2017-05-01 | 2019-11-28 | Illumina Inc | Optimal index sequences for multiplex massively parallel sequencing |
| EP3622089B1 (en) | 2017-05-08 | 2024-07-17 | Illumina, Inc. | Method for sequencing using universal short adapters for indexing of polynucleotide samples |
| US10914729B2 (en) | 2017-05-22 | 2021-02-09 | The Trustees Of Princeton University | Methods for detecting protein binding sequences and tagging nucleic acids |
| CN109526228B (zh) | 2017-05-26 | 2022-11-25 | 10X基因组学有限公司 | 转座酶可接近性染色质的单细胞分析 |
| US10844372B2 (en) | 2017-05-26 | 2020-11-24 | 10X Genomics, Inc. | Single cell analysis of transposase accessible chromatin |
| US11447818B2 (en) | 2017-09-15 | 2022-09-20 | Illumina, Inc. | Universal short adapters with variable length non-random unique molecular identifiers |
| JP7241069B2 (ja) | 2017-09-25 | 2023-03-16 | フレッド ハッチンソン キャンサー センター | 高効率標的ｉｎ ｓｉｔｕゲノムワイドプロファイリング |
| WO2019084043A1 (en) | 2017-10-26 | 2019-05-02 | 10X Genomics, Inc. | METHODS AND SYSTEMS FOR NUCLEIC ACID PREPARATION AND CHROMATIN ANALYSIS |
| WO2019089959A1 (en) | 2017-11-02 | 2019-05-09 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Transposase-based genomic analysis |
| EP3625361A1 (en) | 2017-11-15 | 2020-03-25 | 10X Genomics, Inc. | Functionalized gel beads |
| US10829815B2 (en) | 2017-11-17 | 2020-11-10 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for associating physical and genetic properties of biological particles |
| WO2019157529A1 (en) | 2018-02-12 | 2019-08-15 | 10X Genomics, Inc. | Methods characterizing multiple analytes from individual cells or cell populations |
| WO2019195166A1 (en) | 2018-04-06 | 2019-10-10 | 10X Genomics, Inc. | Systems and methods for quality control in single cell processing |
| US11932899B2 (en) | 2018-06-07 | 2024-03-19 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for characterizing nucleic acid molecules |
| US11519033B2 (en) | 2018-08-28 | 2022-12-06 | 10X Genomics, Inc. | Method for transposase-mediated spatial tagging and analyzing genomic DNA in a biological sample |
| WO2020047010A2 (en) | 2018-08-28 | 2020-03-05 | 10X Genomics, Inc. | Increasing spatial array resolution |
| WO2020123311A2 (en) | 2018-12-10 | 2020-06-18 | 10X Genomics, Inc. | Resolving spatial arrays using deconvolution |
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| US11467153B2 (en) | 2019-02-12 | 2022-10-11 | 10X Genomics, Inc. | Methods for processing nucleic acid molecules |
| EP3924505A1 (en) | 2019-02-12 | 2021-12-22 | 10X Genomics, Inc. | Methods for processing nucleic acid molecules |
| EP3976820A1 (en) | 2019-05-30 | 2022-04-06 | 10X Genomics, Inc. | Methods of detecting spatial heterogeneity of a biological sample |
| JP2022547106A (ja) | 2019-09-06 | 2022-11-10 | チェム－フォルシュングスツェントルン フュル モレクラーレ メディツィン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | Ｒｎａオリゴヌクレオチドをシークエンシングする方法 |
| EP4025711A2 (en) | 2019-11-08 | 2022-07-13 | 10X Genomics, Inc. | Enhancing specificity of analyte binding |
| FI3891300T3 (fi) | 2019-12-23 | 2023-05-10 | 10X Genomics Inc | Menetelmät spatiaalista analyysiä varten rna-templatoitua ligaatiota käyttäen |
| EP4081656A1 (en) | 2019-12-23 | 2022-11-02 | 10X Genomics, Inc. | Compositions and methods for using fixed biological samples in partition-based assays |
| US11732299B2 (en) | 2020-01-21 | 2023-08-22 | 10X Genomics, Inc. | Spatial assays with perturbed cells |
| US11702693B2 (en) | 2020-01-21 | 2023-07-18 | 10X Genomics, Inc. | Methods for printing cells and generating arrays of barcoded cells |
| US12076701B2 (en) | 2020-01-31 | 2024-09-03 | 10X Genomics, Inc. | Capturing oligonucleotides in spatial transcriptomics |
| US12110541B2 (en) | 2020-02-03 | 2024-10-08 | 10X Genomics, Inc. | Methods for preparing high-resolution spatial arrays |
| US11898205B2 (en) | 2020-02-03 | 2024-02-13 | 10X Genomics, Inc. | Increasing capture efficiency of spatial assays |
| US11732300B2 (en) | 2020-02-05 | 2023-08-22 | 10X Genomics, Inc. | Increasing efficiency of spatial analysis in a biological sample |
| US12129516B2 (en) | 2020-02-07 | 2024-10-29 | 10X Genomics, Inc. | Quantitative and automated permeabilization performance evaluation for spatial transcriptomics |
| US11891654B2 (en) | 2020-02-24 | 2024-02-06 | 10X Genomics, Inc. | Methods of making gene expression libraries |
| ES2965354T3 (es) | 2020-04-22 | 2024-04-12 | 10X Genomics Inc | Métodos para análisis espacial que usan eliminación de ARN elegido como diana |
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| US11981958B1 (en) | 2020-08-20 | 2024-05-14 | 10X Genomics, Inc. | Methods for spatial analysis using DNA capture |
| US11926822B1 (en) | 2020-09-23 | 2024-03-12 | 10X Genomics, Inc. | Three-dimensional spatial analysis |
| US11827935B1 (en) | 2020-11-19 | 2023-11-28 | 10X Genomics, Inc. | Methods for spatial analysis using rolling circle amplification and detection probes |
| WO2022140028A1 (en) | 2020-12-21 | 2022-06-30 | 10X Genomics, Inc. | Methods, compositions, and systems for capturing probes and/or barcodes |
| US20240093290A1 (en) | 2021-01-29 | 2024-03-21 | 10X Genomics, Inc. | Method for transposase mediated spatial tagging and analyzing genomic dna in a biological sample |
| CN113136420A (zh) * | 2021-05-20 | 2021-07-20 | 阿吉安(福州)基因医学检验实验室有限公司 | 一种检测病原微生物的方法及试剂盒 |
| EP4347879A1 (en) | 2021-06-03 | 2024-04-10 | 10X Genomics, Inc. | Methods, compositions, kits, and systems for enhancing analyte capture for spatial analysis |
| EP4196605A1 (en) | 2021-09-01 | 2023-06-21 | 10X Genomics, Inc. | Methods, compositions, and kits for blocking a capture probe on a spatial array |
| WO2023172514A1 (en) | 2022-03-07 | 2023-09-14 | Catamaran Bio, Inc. | Engineered immune cell therapeutics targeted to her2 and methods of use thereof |
Family Cites Families (6)
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|---|---|---|---|---|
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| US5965443A (en) * | 1996-09-09 | 1999-10-12 | Wisconsin Alumni Research Foundation | System for in vitro transposition |
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-
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4809213B2 (ja) * | 2003-04-14 | 2011-11-09 | フィンザイムス オイ | Ｉｎｖｉｔｒｏで構築されたＭｕ転位複合体を用いて真核生物ゲノムに核酸を送達する方法 |
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