KR20020007575A - 다이옥신 및 다이옥신 유사물질을 흡착·제거하는 신규미생물 바실러스 퍼밀러스 ｂｓ-０１９ 및 이를 이용한다이옥신 및 다이옥신 유사물질의 흡착·제거방법 - Google Patents

다이옥신 및 다이옥신 유사물질을 흡착·제거하는 신규미생물 바실러스 퍼밀러스 ｂｓ-０１９ 및 이를 이용한다이옥신 및 다이옥신 유사물질의 흡착·제거방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다이옥신 및 다이옥신 유사물질을 흡착·제거할 수 있는 신규 미생물인 바실러스 퍼밀리스 BS-019(Bacillus pumilusBS-019) 및 이를 이용한 다이옥신(dioxin) 및 다이옥신 유사물질의 흡착·제거방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 인체 및 다른 생물체에 유독한 영향을 미치는 환경 호르몬인 다이옥신 화합물을 흡착·제거할 수 있는 신규 미생물인 바실러스 퍼밀리스 BS-019를 분리·동정하고, 상기 미생물을 이용하여 1,2,3,4-사염화디벤조-파라-다이옥신(1,2,3,4-tetrachlorodibenzo-p-dioxin ,1,2,3,4-TCDD), 다염화디벤조-파라-다이옥신 (polychlorinated dibenzo-p-dioxin, PCDDs), 다염화디벤조퓨란(polychlorinated dibenzofurans, PCDFs) 및 1,2,3,4-사염화디벤조퓨란(1,2,3,4-tetrachlorodibenzofuran, 1,2,3,4-TCDF) 등의 다이옥신 및 다이옥신 유사물질을 효과적으로 흡착·제거하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 바실러스 퍼밀리스 BS-019는 소각로, 화학공장 및 자연재해 등으로 인해 다이옥신 및 다이옥신 유사물질이 오염된 환경으로부터 미생물을 이용한 생흡착 과정을 통하여 효과적으로 다이옥신 화합물을 제거할 수 있는 폐수, 하수, 하천 또는 토양 처리제로 이용되어 2차 환경오염을 유발하지 않으면서 환경을 정화, 복원하는데 유용하게 사용할 수 있다.

Description

다이옥신 및 다이옥신 유사물질을 흡착·제거하는 신규 미생물 바실러스 퍼밀러스 ＢＳ-０１９ 및 이를 이용한 다이옥신 및 다이옥신 유사물질의 흡착·제거방법{A novel microorganism Bacillus pumilus BS-019 absorbing dioxin and dioxin-like compounds and a biosorption method of the same}
본 발명은 다이옥신 및 다이옥신 유사물질을 흡착·제거할 수 있는 신규 미생물인 바실러스 퍼밀리스 BS-019(Bacillus pumilusBS-019) 및 이를 이용한 다이옥신(dioxin) 및 다이옥신 유사물질의 흡착·제거방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 인체 및 다른 생물체에 유독한 영향을 미치는 환경 호르몬인 다이옥신 화합물을 흡착·제거할 수 있는 신규 미생물인 바실러스 퍼밀리스 BS-019를 분리·동정하고, 상기 미생물을 이용하여 1,2,3,4-사염화디벤조-파라-다이옥신(1,2,3,4-tetrachlorodibenzo-p-dioxin ,1,2,3,4-TCDD), 다염화디벤조-파라-다이옥신 (polychlorinated dibenzo-p-dioxin, PCDDs), 다염화디벤조퓨란(polychlorinated dibenzofurans, PCDFs) 및 1,2,3,4-사염화디벤조퓨란(1,2,3,4-tetrachlorodibenzofuran, 1,2,3,4-TCDF) 등의 다이옥신 및 다이옥신 유사물질을 효과적으로 흡착·제거하는 방법에 관한 것이다.
다이옥신은(dioxin)은 인류가 만들어 낸 환경 호르몬 중 그 독성 및 위험성에 있어서 최악의 독물로 꼽히고 있다. 보통 다이옥신이라는 말을 사용할 때는 다이옥신과 다이옥신 유사물질들을 총칭해서 말하게 되는데, 다이옥신과 구조적으로유사하고 비슷한 특성 및 독성을 가지고 있는 화합물에는 다염화디벤조퓨란(polychlorinated dibenzofurans, PCDFs) 및 다염화비페닐(polychlorinated biphenyls, PCBs), 다염화디페닐 에테르 및 다염화나프탈렌 등이 있다. 다이옥신은 인위적으로 제조되거나 사용되는 물질이 아니며, 염소나 브롬을 함유하는 산업공정에서 화학적인 오염물로서 발생하거나 염소가 함유되어 있는 화합물을 소각하는 과정에서 생성된다.
일단 자연계 내에 생성된 다이옥신은 환경정화 작용에 의한 자연적인 분해가 이루어지지 않고 환경 내에 안정적으로 존재하여 축적된다. 일반적으로, 다이옥신은 공기와 물속에 존재하는 입자(먼지)에 가장 잘 결합하는데, 토양이나 폐수, 하수, 하천 및 해수 침전물에 존재할 경우에는 유기물과 결합한 형태로 존재한다. 한번 입자와 결합한 다이옥신은 쉽게 용해되거나 씻겨 나가지 않기 때문에 분해가 어려우며, 가스 형태로 잘 기화되지도 않는다. 이와 같이 토양 및 침전물 속에 축적된 다이옥신이 여러 경로를 통하여 생물체 내로 유입되면 수 십년 혹은 수 백년까지도 분해되지 않고 생물체 내에 존재하게 된다. 생물체 내로 유입된 다이옥신은 물에 잘 용해되지 않고 높은 옥타놀 물 분해계수를 가지고 있어 오줌으로도 잘 배설되지 않는 반면, 지방에는 잘 용해되기 때문에 생물체의 지방조직에 잘 축적된다. 최근 산모의 모유에서 다량의 다이옥신이 검출된 사례는 지방에 용해되어 축적되기 쉬운 다이옥신의 이러한 특성에 기인한다. 다이옥신은 생물계의 먹이사슬이 진행됨에 따라 생물체 내에 계속 축적되는데, 어류, 조류, 포유류 및 인간은 물을 마시거나 호흡을 하거나 음식물을 섭취함으로써 다이옥신을 섭취하게 된다. 하지만, 인간은 먹이사슬의 가장 높은 자리에 위치하고 있기 때문에 어류, 조류 및 포유류 등의 모든 동물들이 섭취한 다이옥신이 최종적으로 축적되는 곳이 인간의 몸 속이며, 일단 인간의 체내에 유입된 다이옥신은 좀처럼 분해되거나 배설되지 않고 인체 내에 축적되면서 장기적으로 건강 장애를 유발하게 된다.
다이옥신은 청산가리보다 1천 배나 강한 독성을 지니고 있다고 알려져 있는데, 다이옥신 1 g으로 몸무게 50 Kg의 사람 2만 명을 사망시킬 수 있을 정도로 매우 강한 독성을 나타낸다. 체내에 유입된 다이옥신 분자는 세포 조직 내에 존재하는 특이적인 수용체 부위에 결합하게 된다. 다이옥신이 존재하지 않는 경우에 상기 수용체의 결합부위는 인체 내 호르몬이나 효소들이 우리 몸의 특정한 활동들을 정상적으로 조절하기 위해 결합하는 부위이지만, 다이옥신이나 그 유사물질들이 유입되어 인체 내 호르몬이나 효소들 대신에 상기 수용체 결합부위에 결합하게 되면 정상적인 세포기능을 제대로 수행할 수 없게 되고, 이로 인해 호르몬의 작용, 발육과 생식, 면역기능 등이 저하되어 심각한 건강장애를 유발한다. 다이옥신의 인체 내 축적으로 인하여 유발되는 질병으로는 선천적인 기형아의 출산, 유방암, 고환암 및 전립선암 등의 호르몬 관련암, 폐암, 간암, 임파선암 및 혈액암, 반복되는 자궁출혈과 통증, 불임, 정자수의 감소, 남성호르몬의 분비감소, 면역기능의 저하, 반복되는 감염증세, 피부질환, 발육부전, 말초신경질환, 중추신경계질환, 그 외 당뇨 및 갑상선 질환 등이 유발되는 것으로 알려져 있다. 또한, 생태계의 먹이사슬을 따라 인체 내에 유입된 다이옥신은 수년 혹은 수십년 동안 인체 내에 축적되어 암을 유발하거나 기형을 유발하는 등의 치명적 손상을 입히게 된다.
이처럼 인체에 치명적 손상을 유발하는 다이옥신은 전구물질이 되는 유기물이나 목재 내의 목질소 또는 이와 유사구조를 갖는 화학물질을 염소와 함께 소각하는 과정에서 주로 발생되며, 쓰레기를 소각할 때 가장 많이 발생된다. 특히, PVC 제제, 플라스틱랩, 염화용제, 농약 등과 같이 염소 함유물이 다량 포함된 병원 폐기물과 도시 쓰레기를 소각할 때 제일 많이 발생된다. 이외에도, 다이옥신은 자동차 배기가스, 화력발전소, 제지 및 펄프산업, 철강산업 등과 같이 염소 및 브롬을 사용하는 산업공정에서 발생될 수 있으며, PVC, 염화용제, 농약 등과 같이 염소함유 제품을 생산하는 화학공장, 농약이 살포된 수풀이나 산림의 화재 및 자동차 매연에 의해 다이옥신이 발생될 수 있고, 심지어는 흡연 시의 담배 연기에서도 다이옥신이 발생될 수 있다.
상기의 다양한 오염원들로부터 발생된 다이옥신과 그 유사물질들은 환경속에서 매우 안정적으로 존재하여 이들의 분해가 쉽지 않고 박테리아에 의해서 대사되지도 않는다. 또한, 일단 환경 속으로 유입된 다이옥신은 광분해에 의한 자연적 제거에 의해 분해되기도 하지만 이러한 과정은 매우 느리게 진행되어 다이옥신의 분해에 효과적이지 못하다. 공기 중에 존재하는 다이옥신은 광분해, 비에 의한 세척, 먼지에 의한 흡착 등으로 제거될 수 있으며, 토양 중에 존재하는 다이옥신은 땅속에 묻히거나 토양침식에 의해서 지하수 등으로 유입되어 호수나 강, 해양 밑바닥의 침전물에 저장된다. 하지만, 이와 같이 호수나 강, 해양 밑바닥의 침전물과 같은 환경 속에 다이옥신을 저장하는 방법은 영구적인 제거방법이 되지 못하고, 결국에는 생물계의 먹이사슬을 통해서 인체 내에 유입된다.
이와 같이 자연정화에 의한 제거를 거의 기대할 수 없는 다이옥신을 처리하는 방법은 현재까지 열분해, 촉매분해, 활성탄흡착 등과 같은 물리화학적인 방법이 주류를 이루고 있고 미생물에 의한 처리에 관해서는 그 연구가 매우 미진한 상태이다. 이는 아직까지 다이옥신을 효과적으로 분해 또는 제거한다고 밝혀진 미생물이 극히 드물고, 그로 인해 이를 이용한 생물공정 역시 개발되지 않고 있기 때문이다.
이에 본 발명자들은 다이옥신을 효과적으로 분해 또는 제거할 수 있는 미생물을 탐색한 결과, 다이옥신 분석을 위한 전용 후드로부터 다이옥신을 흡착·제거하는 능력이 뛰어난 신규한 바실러스 속 미생물을 분리·동정하였으며, 상기 균주가 다염화디벤조-파라-다이옥신(polychlorinated dibenzo-p-dioxins, PCDDs) 및 다염화디벤조퓨란(polychlorinated dibenzofurans, PCDFs) 등의 다이옥신 화합물에 대하여 매우 우수한 흡착·제거효율을 나타냄을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. 따라서, 본 발명의 신규한 바실러스 속 미생물은 다이옥신 및 다이옥신 유사물질을 효율적으로 흡착·제거하기 위한 폐수, 하수, 해수, 하천 및 토양 처리제에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 목적은 쓰레기 소각 및 다양한 산업활동 과정에서 발생하여 자연환경에 유출되는 인체 및 모든 생물체에 유독한 물질인 다이옥신 및 다이옥신 유사물질을 효과적으로 흡착·제거하는 신규한 미생물을 제공하는 것이다.
도 1은 본 발명의 바실러스 퍼밀러스 BS-019의 생균체(live biomass)와 사균체(dead biomass)를 이용하여 1,2,3,4-사염화디벤조-파라-다이옥신(1,2,3,4-tetrachlorodibenzo-p-dioxin ,1,2,3,4-TCDD)의 흡착·제거 효과를 비교한 결과이고,
도 2는 본 발명의 바실러스 퍼밀러스 BS-019의 생균체와 사균체를 이용하여 다염화디벤조퓨란(polychlorinated dibenzofurans, PCDFs)의 흡착·제거 효과를 비교한 결과이고,
도 3은 본 발명의 바실러스 퍼밀러스 BS-019의 생균체와 사균체의 제균시료를 이용하여 1,2,3,4-사염화디벤조퓨란(1,2,3,4-tetrachlorodibenzofuran, 1,2,3,4-TCDF)의 흡착·제거 효과를 비교한 결과이고,
도 4는 본 발명의 바실러스 퍼밀러스 BS-019의 생균체와 사균체의 제균시료를 이용하여 가열조건에서 1,2,3,4-사염화디벤조퓨란의 흡착·제거 효과를 비교한결과이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다이옥신 및 다이옥신 유사물질을 효과적으로 흡착·제거할 수 있는 바실러스 속의 신규한 미생물인 바실러스 퍼밀러스 BS-019(Bacillus pumilusBS-019)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 미생물을 이용하여 다이옥신 및 다이옥신 유사물질을 효과적으로 흡착·제거하는 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 미생물을 함유하는 폐수, 하수, 하천, 해수 또는 토양 처리제를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 다이옥신을 효과적으로 흡착·제거할 수 있는 바실러스 속의 신규한 미생물 바실러스 퍼밀러스 BS-019(Bacillus pumilusBS-019)를 제공한다.
본 발명자들은 다이옥신을 효과적으로 흡착·제거할 수 있는 미생물을 분리하기 위하여, 다염화디벤조다이옥신(polychlorinated dibenzo-p-dioxins, PCDDs) 및 다염화디벤조퓨란(polychlorinated dibenzofurans, PCDFs) 등의 다이옥신 화합물이 오염된 환경으로부터 시료를 채취하여 다이옥신 흡착 미생물의 분리에 사용하였다. 상기 시료를 탄소원으로 디벤조퓨란(DBF)을 포함하는 분리용 최소배지에 접종하여 배양한 후 여기에서 생장하는 균주 중에서 디벤조퓨란을 흡착·제거하는 활성이 우수한 균주를 선별하고 이를 분리·동정하였다.
본 발명에서 제공하는 신규 미생물인 바실러스 퍼밀러스 BS-019의 형태 생리학적 특성, 화학 분류학적 특성 및 분자 생물학적 특성을 중심으로 한 균학적 성질은 하기와 같다.
1) 형태 생리학적 특성
바실러스 퍼밀러스 BS-019는 그람양성의 호기성 세균으로 포자를 형성하지 않으며 운동성이 없고, 세포의 형태는 성장 초기에는 간균 또는 가지 형태이며 성장이 진행됨에 따라 단간균 또는 구균으로 분획화된다. 상기 균주의 성장 조건으로는 30 내지 37℃, pH 6.0 내지 9.0이 바람직하며, 특히 30℃, pH 7.0 내지 8.5가 더욱 바람직하다.
효소활성에 있어서는 옥시다제(oxidase) 음성 및 카탈라제(catalase) 양성으로 나타났으며, 트윈 80(tween 80), 에스쿨린(esculin), 알부틴(arbutin), 요소(urea) 및 타이로신(tyrosine) 등을 가수분해할 수 있고, 녹말(starch), 카제인(casein), 핵산(DNA), 잔틴(xanthine) 및 하이포잔틴(hypoxanthine)을 가수분해하지 못한다. 또한, 탄소원의 분해능력에 있어서는 D-프럭토오스(D-fructose), 글리세롤(glycerol), D-만니톨(D-mannitol), D-만노오스(D-mannose), D-리보오스(D-ribose), 살리신(salicin), D-솔비톨(D-sorbitol) 및 녹말(starch)을 분해하여 산을 생성하지만, L-아라비노오스(L-arabinose), D-셀로비오스(D-cellobiose), D-갈락토오스(D-galactose), D-글루코오스(D-glucose), 이눌린(inulin), 유당(lactose), 말토오스(maltose), D-라피노오스(D-raffinose), L-람노오스(L-rhamnose), 트레할로오스(trehalose) 및 D-자일로오스(D-xylose)는 분해할 수 없어 산을 생성하지 않는다.
2)화학 분류학적 특성
바실러스 퍼밀러스 BS-019는 세포벽에 meso형의 DAP(diaminopimelic acid)를 가지고 있으며, 이소프레노이드 퀴논으로서는 주로 메나퀴논(menaquinone, (MK)-8(H2))을 가지고 있다. 또한, 바실러스 퍼밀러스 BS-019에 존재하는 미콜산(mycolic acid)의 탄소수는 36개에서 46개 사이이고, 주요 지방산은 iso-C15:0(54.4%), anteiso-C15:0(24.8%) 이며 지방산 종류 및 조성 패턴은 바실러스 퍼밀러스 (Bacillus pumilus)에 가장 높은 유연관계를 보여 주었다.
3) 분자 생물학적 특성
바실러스 퍼밀러스 BS-019의 16S rRNA 유전자의 염기 서열은서열번호 1로 기재된다.
또한, 바실러스 퍼밀러스 BS-019의 DNA-DNA 상동성을 조사한 결과, 바실러스 퍼밀러스 BS-019는 16S rRNA 염기서열 분석에 의해 계통분류학적으로 바실러스 속에 속하는 균주로서 바실러스 퍼밀러스(Bacillus pumilus)의 표준균주에 99.4%의 상동성을 나타내어 가장 높은 유연관계를 보여주는 균주로 동정되었다.
이에 본 발명자들은 상기 신규 종을 바실러스 퍼밀러스 BS-019(Bacillus permilusBS-019)로 명명하고, 한국 미생물 보존센터에 2000년 6월 8일자로 기탁하였다(수탁번호 : KCCM-10190).
또한, 본 발명은 바실러스 퍼밀러스 BS-019를 이용하여 다이옥신 및 다이옥신 유사물질을 흡착·제거하는 방법을 제공한다.
특히, 본 발명은 바람직한 실시예로서 바실러스 퍼밀러스 BS-019를 이용하여 다이옥신 화합물의 대부분을 차지하고 유독성이 강한 다염화디벤조-파라-다이옥신 및 다염화디벤조퓨란 등을 효과적으로 흡착·제거할 수 있는 최적조건을 제공한다.
본 발명의 바실러스 퍼밀러스 BS-019가 다이옥신 및 다이옥신 유사물질을 흡착하는 활성을 조사하기 위해서, 다양한 다이옥신 화합물이 첨가된 최소배지에 상기 균주의 균체를 접종하여 그 흡착정도를 측정하였다. 이때, 바실러스 퍼밀러스 BS-019는 배양액을 제거하고 균체만을 회수하여 농축시킨 생균체(live biomass) 및 상기 생균체 시료의 반을 가열하여 준비한 사균체(dead biomass)를 사용하였다.
상기와 같이 준비한 생균체와 사균체의 농도를 달리하여 최종농도 100 ng/㎖으로 다염화디벤조다이옥신(polychlorinated dibenzo-p-dioxins, 이하 "PCDDs"라 약칭함), 다염화디벤조퓨란(polychlorinated dibenzofurans, 이하 "PCDFs"라 약칭함) 또는 1,2,3,4-사염화디벤조퓨란(1,2,3,4-tetrachlorodibenzofurans, 이하 "1,2,3,4-TCDF"라 약칭함) 등의 다이옥신 화합물이 첨가된 배지에 접종한 후 다이옥신 화합물에 대한 이들의 흡착정도를 대조구(control)와 비교하였다.
본 발명의 바실러스 퍼밀러스 BS-019의 생균체와 사균체를 이용하여 1,2,3,4-TCDD의 흡착·제거효율을 비교한 결과, 사균체는 첨가된 균체농도 모두에서 1,2,3,4-TCDD의 흡착·제거 효율이 대조군에 비하여 50% 이상 우수하며, 이러한흡착·제거 효율은 농도에 비례하지 않는다(도 1참조).
다양한 형태의 다염화디벤조퓨란(PCDFs)에 대한 본 발명의 바실러스 퍼밀러스 BS-019의 흡착·제거효율을 측정한 결과, 상기 미생물의 사균체는 염소기가 4개 결합한 테트라(tetra)형, 5개 결합한 펜타(penta)형 및 6개 결합한 헥사(hexa)형의 모든 PCDFs에 대하여 대조구나 생균체보다 2배 이상의 우수한 흡착·제거효율을 나타내어 본 발명의 바실러스 퍼밀러스 BS-019가 다양한 다이옥신 유사물질의 흡착·제거에도 유용함을 확인하였다(도 2참조).
또한, 상기 미생물의 사균체 및 생균체의 제균시료를 이용하여 1,2,3,4-TCDF의 흠착·제거효율을 비교한 결과, 1,2,3,4-TCDF는 대조군에 비하여 상기 미생물의 생균체 및 사균체의 제균시료에 의해 감소하며, 특히, 사균체의 제균시료에 의해 50% 정도 감소함을 확인하였다(도 3참조). 이러한 결과를 통하여, 본 발명의 바실러스 퍼밀러스 BS-019에 의해 생산된 생화합물에 의해서 다이옥신 및 다이옥신 유사물질이 효과적으로 흡착·제거됨을 알 수 있다.
아울러, 본 발명의 바실러스 퍼밀러스 BS-019의 사균체가 열분해에도 효과적으로 사용될 수 있는 지를 확인하기 위하여, 가열조건에서의 흡착·제거효율을 조사하였다. 그 결과, 가열시간이 증가할수록 1,2,3,4-TCDF의 흡착·제거효율이 비례적으로 증가함을 알 수 있는데, 이러한 결과는 가열시간의 증가에 따른 사균체 농도의 증가에 기인하는 것으로 사료된다(도 4참조).
상기의 다이옥신 화합물의 흡착·제거 방법에서, 바실러스 퍼밀러스 BS-019가 다이옥신 화합물을 흡착·제거하기 위한 최적조건으로는 25 내지 30℃, pH 6.5내지 7.5가 바람직하며, 30℃, pH 7.0이 더욱 바람직하다. 본 발명의 바실러스 퍼밀러스 BS-019는 상기 흡착·제거방법을 이용하여 1,2,3,4-사염화디벤조-파라-다이옥신, 다염화디벤조-파라-다이옥신, 1,2,3,4-사염화디벤조퓨란, 1,2,3,4-사염화디벤조다이옥신 및 다염화비페닐과 같은 다이옥신 및 유사물질들을 효과적으로 흡착·제거한다.
또한, 본 발명은 바실러스 퍼밀러스 BS-019를 함유하는 폐수, 하수 또는 토양 처리제를 제공한다.
본 발명의 처리제는 다이옥신 화합물로 오염된 폐수, 하수 또는 토양을 정화하기 위해 사용할 수 있으며, 본 발명의 미생물 및 제법적으로 가능한 첨가물을 포함한다. 본 발명의 미생물 및 첨가물을 포함한 처리제는 상기 미생물의 배양액으로 직접 도말, 살포하거나, 상기 미생물의 배양액을 규조토, 퍼라이트 등에 흡착시켜 살포하는 방법을 이용할 수 있다. 이 밖에도 미생물을 이용한 공지의 폐수 정화 방법도 이용될 수 있다. 상기 처리제는 본 발명의 신규 균주인 바실러스 퍼밀러스 BS-019를 유효성분으로 포함하는데, 첨가물에 포함된 채로 공급될 수도 있으나 장기간 보존을 위해 별도로 보관하다가 사용직전에 혼합하여 사용할 수도 있다. 이를 위해 상기 처리제에 사용될 미생물은 장기간 안정적으로 보존하기 위해 글리세롤 성분을 포함하여 -80℃에 보관하거나 멸균된 10% 탈지유에 현탁하여 동결건조하여 보관한다. 상기 처리제에 포함되는 기타 첨가물은 일반적으로 미생물을 이용한 생물학적 처리제 제조 분야에서 알려진 부형제, 안정제 및 첨가제를 포함하거나규조토, 퍼라이트, 황토 등의 흡착제를 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 다이옥신을 흡착하는 미생물의 분리
다이옥신을 효과적으로 흡착·제거할 수 있는 미생물을 분리하기 위하여, 포항공과대학에 설치된 다염화디벤조다이옥신(polychlorinated dibenzo-p-dioxins, PCDDs) 및 다염화디벤조퓨란(polychlorinated dibenzofurans, PCDFs)의 분석에 사용되고 있는 실험실 후드로부터 시료를 채취하여 다이옥신 흡착 미생물의 분리에 사용하였다. 탄소원으로 디벤조퓨란(DBF)을 포함하는 분리용 최소배지 MSM(minimal salts medium, 2.2g Na2HPO4, 0.8g KH2PO4,3g NH4NO3, 0.01g MgCl2·6H2O/liter)에 접종한 후 30℃에서 진탕배양하였다. 일정시간이 지난 후 상기 배양액으로부터 유기용매 톨루엔을 이용하여 디벤죠퓨란을 용출하고 가스 크로마토그래피(gas chromatography, Fison 8000 series) 및 저분해능 질량분석기(Platform II)를 사용하여 분석하여 디벤조퓨란이 완전히 흡착·제거되었는지 확인하였다. 디벤죠퓨란이 흡착·제거된 배양액 10 ml을 다시 신선한 배지에 옮겨 배양하였다. 상기 과정을 3회 연속적으로 시행한 후, 마지막 배양액을 모두 0.1% 디벤조퓨란이 들어있는 고체 배지에 도말·배양하여 생장하는 균주중에서 디벤조퓨란을 흡착·제거하는 활성이 우수한 균주를 선별하였다.
<실시예 2> 분리한 바실러스 퍼밀러스 BS-019의 동정
실시예 1에서 분리된 바실러스 퍼밀러스 BS-019 균주를 동정하기 위하여, 상기에서 선별된 균주를 영양배지(tripticase soy medium, BBL사 제품)에 접종하여 30℃ 온도조건으로 배양하였다. 지방산 종류 및 구아닌·시토신 조성분석의 화학분류학적 특성과 16S rDNA 유전자의 염기서열 결정 및 분석은 윤 등(Yoonet al.,Int. J. Syst. Bacteriol.,47, 933, 1997)의 방법을 사용하였다.
바실러스 퍼밀러스 BS-019의 형태 및 성장 조건을 조사한 결과, 바실러스 퍼밀러스 BS-019는 그람양성의 호기성 세균으로 포자를 형성하지 않으며 운동성을 가지고 있지 않았다. 또한, 세포의 형태는 성장 초기에는 간균 또는 가지 형태이며 성장이 진행됨에 따라 단간균 또는 구균으로 분획화된다. 상기 균주의 성장 조건으로는 25 내지 30℃, pH 6.5 내지 7.5의 생장조건에서 가장 잘 생장하였다.
세포벽의 펩티도글리칸을 이루는 DAP의 종류, 이소프레노이드 퀴농의 종류, 지방산의 종류 및 구아닌·시토신의 조성 등 바실러스 퍼밀러스 BS-019의 화학 분류학적 특성을 조사한 결과, 본 발명의 바실러스 퍼밀러스 BS-019는 세포벽에 meso형의 DAP를 가지고 있으며 이소프레노이드 퀴논으로서는 주로 메나퀴논(menaquinone, (MK)-8(H2))을 가지고 있다. 또한, 바실러스 퍼밀러스 BS-019에 존재하는 미콜산(mycolic acid)의 탄소수는 36개에서 46개 사이였다. 하기 표 1에 나타난 바와 같이, 주요 지방산은 Iso-C15:0 및 anteiso-C15:0의 형태였으며 DNA의 구아닌·시토신의 조성은 54.4% 및 24.8% 였다.
<표 1> 바실러스 퍼밀러스 BS-019의 지방산 조성
지방산 종류 조성 (%)
iso C13:0 0.57
iso C14:0 0.90
C14:0 1.59
iso C15:0 54.40
anteiso C15:0 24.94
C15:0 0.21
C16:1 w7c alcohol 0.53
iso C16:0 1.27
C16:1 w11c 1.80
C16:0 4.31
iso C15:0 3OH 0.31
iso C17:1 w10c 1.64
iso C17:0 4.16
anteiso C17:0 2.95
iso C171 I/anteiso C17:1 B 0.53
본 발명의 바실러스 퍼밀러스 BS-019의 16S rDNA 염기서열을 분석하기 위하여, 상기 균주의 DNA를 윤 등(Yoon et al.,Int. J. Syst. Bacteriol., 46, 502, 1996)의 방법을 이용하여 추출하였고, 16S rRNA 유전자의 염기서열 결정 및 분석도 윤 등(Yoon et al.,Int. J. Syst. Bacteriol., 47, 933, 1997)의 방법을 사용하여 수행하였다.
그 결과, 바실러스 퍼밀러스 BD-019의 16S rRNA 유전자 염기서열 중 약 96%에 해당하는서열번호 1로 기재되는 1504 개의 염기서열을 결정하였다. 상기의 16S rRNA 염기서열 분석에 의해 본 발명의 바실러스 퍼밀러스 BS-019는 계통분류학적으로 바실러스 속에 속하는 균주로서 바실러스 퍼밀러스(Bacillus pumilus)의 표준균주에 99.4%의 상동성을 나타내어 가장 높은 유연관계를 보여주는 균주로 동정되었다.
이에 본 발명자들은 상기의 균체 지방산 종류 및 구아닌·시토신 조성을 이용한 화학분류학적 특성 및 분자계통학적 특성에 근거하여 선별된 미생물을 바실러스 퍼밀러스 BS-019(Bacillus purmilusBS-019)로 명명하고, 한국 미생물 보존센터에 2000년 6월 8일자로 기탁하였다(수탁번호 : KCCM-10190).
<실시예 3> 바실러스 퍼밀러스 BS-019의 다이옥신 및 다이옥신 유사물질 흡착성 조사
실시예 1 및 실시예 2에서 분리·동정한 바실러스 퍼밀러스 BS-019가 다이옥신 및 다이옥신 유사물질을 흡착할 수 있는 지 조사하기 위해서, 상기 실시예 1의 분리용 최소배지 MSM에 다양한 다이옥신 화합물을 최종 농도가 100 ng/ml이 되도록 첨가한 후 본 발명의 바실러스 퍼밀러스 BS-019의 균체를 접종하여 그 흡착정도를 측정하였다. 이때, 바실러스 퍼밀러스 BS-019 균체는 생균체(live biomass)와 사균체(dead biomass)를 사용하였다. 생균체는 사전 배양된 바실러스 퍼밀러스 BS-019 균주 100 ㎕를 영양배지(nutrient broth) 100 ㎖에 접종하여 12시간 동안 배양한 후 원심분리하여 회수한 균체를 동일한 MSM 배지로 3 회 세척하고 3000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 회수한 후 10 ㎖의 MSM 배지에 현탁하여 준비하였다. 반면, 사균체(dead biomass)는 상기와 같이 준비된 생균체 시료의 반을 90℃에서 20분간 가열하여 준비하였다.
다이옥신의 흡착정도를 측정하기 위해서, 상기 균체의 농도과 종류를 달리한 시료 6 개와 상기 균체를 포함하지 않는 대조구(control) 1개를 준비하였다. 각 시료의 부피를 5 ㎖로 맞춘 후 6개의 시료 중 각각 3개의 시료에 생균체와 사균체가 농축 균체/MSM = 0.1/4.9, 0.3/4.7 및 0.5/4.5의 비율로 포함되도록 첨가하였다. 최종농도가 100 ng/㎖이 되도록 각각 500 ng의 다염화디벤조다이옥신(PCDDs), 다염화디벤조퓨란(PCDFs) 또는 1,2,3,4-사염화디벤조퓨란(1,2,3,4-TCDF)을 아세톤에 용해시킨 후 이를 상기 모든 시료에 첨가하였다. 대조구를 제외한 모든 시료를 1분 동안 혼합한 후, 광분해를 막기 위하여 알루미늄 호일로 배양기를 씌워 외부로부터의 광 유입을 차단하고 30℃에서 40분 동안 진탕배양 하였다. 배양이 끝난 후 원심분리로 균체를 제거한 상등액을 주사기용 필터(구경 ; 0.25 ㎛)를 이용하여 완전히 제균하였다. 상기 상등액에 6 ㎖의 톨루엔을 첨가하고 2분 동안 진탕혼합하여 PCDDs, PCDFs 또는 1,2,3,4-TCDF를 용출하였다. 상기 용출용액을 30분 동안 정치하여 톨루엔 층을 완전히 분리하고, 상등액(톨루엔 층)을 5 ㎖ 취하여 남아있는 톨루엔을 질소가스를 이용하여 완전히 제거하고, 다시 100 ㎕의 톨루엔을 첨가하여 잔사(residue)를 용해시켰다. 상기 시료에 내부 표준물질(internal standard)로 50 ng/㎕의 농도로 디벤조퓨란을 분석직전에 첨가하였다. 시료에 잔존하는 PCDDs, PCDFs 또는 1,2,3,4-TCDF를 측정하기 위하여, 가스 크로마토그래피(gas chromatography, Fison 8000 series) 및 저흡착제거능 질량분석계(Platform II)를 사용하여 분석하였다. 시료내 PCDDs, PCDFs 또는 1,2,3,4-TCDF의 증감은 내부 표준물질로 분석전에 첨가한 디벤조퓨란의 피크와 비교하여 결정하였다.
그 결과, 본 발명의 균주 바실러스 퍼밀러스 BS-019는 사균체가 생균체에 비하여 PCDDs, PCDFs 또는 1,2,3,4-TCDF에 대한 흡착력이 현저하게 우수하였다.
구체적으로, 본 발명의 바실러스 퍼밀러스 BS-019의 생균체와 사균체를 이용하여 1,2,3,4-TCDD의 흡착·제거효율을 비교한 결과,도 1에 나타난 바와 같이, 사균체는 첨가된 균체농도 100, 300 및 500 ㎕ 모두에서 1,2,3,4-TCDD의 흡착·제거 효율이 0.3 내지 0.4로 나타나 대조군에 비하여 50% 이상 우수한 흡착·제거효율을 나타내었으며, 이러한 흡착·제거 효율이 농도에 비례하지는 않음을 확인하였다.
도 2는 다양한 형태의 다염화디벤조퓨란(PCDFs)에 대한 본 발명의 바실러스 퍼밀러스 BS-019의 흡착·제거효율을 나타내는데, 상기 미생물의 사균체는 염소기가 4개 결합한 테트라(tetra)형, 5개 결합한 펜타(penta)형 및 6개 결합한헥사(hexa)형의 모든 PCDFs에 대하여 대조구나 생균체보다 2배 이상의 우수한 흡착·제거효율을 나타내어 본 발명의 바실러스 퍼밀러스 BS-019가 다양한 다이옥신 유사물질의 흡착·제거에도 유용함을 알 수 있다.
또한, 본 발명의 바실러스 퍼밀러스 BS-019 균체에서 생산되는 미지의 생화합물이 다이옥신 및 다이옥신 유사물질의 흡착·제거에 관여하는 지를 확인하기 위하여, 상기 미생물의 사균체 및 생균체의 제균시료를 이용하여 1,2,3,4-TCDF의 흡착·제거효율을 비교하였다. 그 결과, 1,2,3,4-TCDF는 대조군에 비하여 상기 미생물의 생균체 및 사균체의 제균시료에 의해 감소하였으며, 특히, 사균체의 제균시료에 의해 50% 정도 감소함을 확인하였다(도 3). 이러한 결과는 본 발명의 바실러스 퍼밀러스 BS-019에 의해 생산된 생화합물에 의해서 다이옥신 및 다이옥신 유사물질이 효과적으로 흡착·제거됨을 알 수 있다.
상기의 결과들로부터, 본 발명의 바실러스 퍼밀러스 BS-019의 사균체가 다이옥신 및 다이옥신 유사물질의 흡착·제거에 효과적임을 확인하고, 다이옥신이 주로 소각과정에서 발생한다는 점을 감안하여 가열조건에서의 흡착·제거효율을 조사하였다.도 4에 나타난 바와 같이, 가열시간이 증가할수록 1,2,3,4-TCDF의 흡착·제거효율이 비례적으로 증가함을 알 수 있는데, 이러한 결과는 가열시간의 증가에 따른 사균체 로부터 분비되는 단백질 등의 생화합물 농도가 증가하기 때문인 것으로 사료된다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 바실러스 속 신규한 미생물인 바실러스 퍼밀러스 BS-019(Bacillus permilus BS-019)는 인간의 활동과정에서 발생하는 다양한 쓰레기 소각과정 또는 산업활동 과정 및 자연재해에 의해서 자연환경에 유출되어 인체 및 생물체에 매우 유해한 영향을 끼치고 나아가서는 환경오염을 일으키는 내분비계 장애물질인 다이옥신 및 다이옥신 유사물질을 흡착·제거할 수 있는 특징을 가지고 있어, 다이옥신 및 다이옥신 유사물질에 오염된 폐수, 하수, 하천, 해수 또는 토양, 기타 자연 환경 등에 적용시 미생물을 이용한 흡착 과정을 통하여 환경의 2차 오염 문제를 일으키지 않고 다이옥신 및 다이옥신 유사물질을 효율적으로 정화하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (6)

  1. 다이옥신 및 다이옥신 유사물질을 흡착·제거하는 바실러스 퍼밀러스 BS-019(Bacillus pumilusBS-019)(수탁번호 : KCCM-10190).
  2. 제 1항에 있어서,서열번호 1로 기재되는 16S rDNA의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 바실러스 퍼밀러스 BS-019.
  3. 제 1항의 바실러스 퍼밀러스 BS-019을 이용하는 다이옥신 및 다이옥신 유사물질의 흡착·제거방법.
  4. 제 3항에 있어서, 바실러스 퍼밀러스 BS-019는 30℃에서 배양되는 것을 특징으로 하는 흡착·제거방법.
  5. 제 3항에 있어서, 바실러스 퍼밀러스 BS-019의 생균체(live biomass) 또는 사균체(dead biomass)를 이용하는 것을 특징으로 하는 흡착·제거방법.
  6. 제 1항의 바실러스 퍼밀러스 BS-019을 유효성분으로 함유하는 폐수, 하수, 하천, 해수 및 토양 처리제 또는 기타 자연환경 처리제.
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