KR20020000674A - 붉은자루동충하초 자실체의 대량생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 붉은자루동충하초 자실체의 대량생산방법에 관한 것으로, 본 발명은 붉은자루동충하초 균주를 탄소원, 질소원 및 물을 함유하는 배양액에서 배양하여 잡균의 오염없이 활력이 우수한 액체종균을 제조하는 뛰어난 효과가 있고 상기 제조한 액체종균을 곡립과 누에번데기 작은 조각을 함유하는 배지에서 배지의 표면에 자실체가 완전히 덮히도록 생육시켜 붉은자루동충하초를 대량으로 생산하는 뛰어난 효과가 있다.

Description

붉은자루동충하초 자실체의 대량생산방법{Process for mass production of Cordyceps pruinosa}

본 발명은 붉은자루동충하초 자실체의 대량생산방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 붉은자루동충하초의 액체종균을 배양한 후 곡립에 누에번데기 작은 조각을 첨가한 배지에서 배양하는 인공적인 방법으로 자실체를 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.

동충하초(冬蟲夏草)란 겨울에는 곤충의 몸에 있다가 여름에는 풀처럼 나오는 모습에서 연유되어 명명된 일종의 버섯이다. 상기와 같이 곤충에 침입하여 이를 기주로 곤충체 위에 자실체를 형성하는 동충하초 중 일부 종들은 고대로부터 중국에서 불로장생의 비약으로 결핵, 천식, 황달의 치료 및 아편중독의 해독제, 병후의 보양 및 강장제, 면역 기능 강화제로서 이용되어 온 고가의 한방약재이다.〔Yiang, J., Mao, X., Ma. Q., Zong, Y. and Wen, H. 1989. Icons of medicinal fungi from China. Science Press. China. p. 575; Kobayasi, Y. 1940. The genusCordycepsand its allies. Sci. Rept. Tokyo Bunrika Daikaku, Sect. B., 5: 53-260; Shimizu, D. 1994. Color iconography of vegetable wasps and plant worms. Seibundo Shinkosha. Japan. pp. 381〕. 그리고 전통적으로 약용으로 이용되고 있는 대표적인 동충하초로는 곤충의 유충을 기주로 자실체를 형성하는 붉은자루동충하초(C. pruinosa)가 현재 중국에서 약용으로 이용되고 있다.

동충하초는 주로 유아기 경련, 간질, 뇌일혈의 치료와 강장제로서 이용되어 왔고, 자실체의 주성분이기도 한 우스파린(oosparin;C₁₄H₁₀O₈)인 항균 물질이 생성되는 것으로 밝혀졌다.〔Yiang, J., Mao, X., Ma. Q., Zong, Y. and Wen, H. 1989. Icons of medicinal fungi from China. Science Press. China. p. 575〕그러나, 자연 상태에서 자실체의 채집은 상당히 어려워 공급이 한정되고 있으며 최근 생태계 파괴 및 공해로 인한 이상 기후현상 등으로 자실체의 자연 채취가 점점 어려워짐에 따라 자실체의 안정적 인공 생산 기술이 요구되고 있으나 이제까지는 대량자실체를 생산한 예가 없었다.

상기와 같이 붉은자루동충하초를 배양하는 방법으로는 자연상태에서는 채집하기가 어려워 번데기를 이용하여 종균배양 후 재배하는 방법 또는 현미 등을 이용한 인공 배지를 이용하여 대량으로 배양하는 방법으로 크게 나눌 수 있으나 아직 붉은자루동충하초의 대량생산은 어려운 실정이다.

본 발명자들은 상기와 같은 점에 착안하여 자연에서 분리한 붉은자루동충하초 균을 액체로 배양하여 액체종균을 제조한 후 곡립에 누에번데기 작은 조각을 첨가한 배지에서 상기 액체종균을 접종하여 배양함으로써 붉은자루동충하초 자실체를 대량으로 생산함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 붉은자루동충하초의 균을 이용하여 액체종균을 제조한 후 곡립과 누에번데기 작은 조각을 첨가한 배지에서 배양하여 인공적으로 붉은자루동충하초 자실체를 대량 생산하는 방법을 제공함에 있다.

본 발명의 상기 목적은 자연에서 분리한 붉은자루동충하초 원균을 샤레에서 배양한 후 탄소원, 질소원, 무기염 및 증류수가 함유된 배양액에서 배양하여 붉은자루동충하초 액체종균을 제조한 후 상기 액체종균을 곡립과 누에번데기 작은 조각을 함유하는 배지에서 20℃ 온도 조건을 유지하면서 배양하여 대량으로 붉은자루동충하초 자실체를 생산함으로써 달성하였다.

이하, 본 발명의 구성을 설명한다.

도 1은 본 발명 붉은자루동충하초 자실체 생산방법을 나타낸 공정도이다.

본 발명은 자실체 형성이 우수한 붉은자루동충하초 균사체를 자연에서 분리하는 단계; 자연에서 분리한 붉은자루동충하초 원균을 샤레에서 배양한 후 탄소원, 질소원, 무기염 및 증류수가 함유된 배양액에서 배양하여 붉은자루동충하초 액체종균을 제조하는 단계; 붉은자루동충하초 자실체 생산을 위해 현미와 같은 곡립에 누에번데기 작은 조각을 함유시킨 자실체 재배용 배지를 제조하는 단계; 상기와 같이 제조된 자실체 재배용 배지에 붉은자루동충하초 액체종균을 접종하고 배양한 후 생육실에서 자실체를 성장시키는 단계로 구성된다.

본 발명에서 붉은자루동충하초의 종균은 고체종균과 액체종균을 사용하는 것이 모두 가능하지만, 고체종균보다는 액체종균을 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 이는 종래의 고체종균을 통상의 방법대로 이용할 경우, 고체종균이 상기의 배양배지의 표면에 접종된 후 균사체를 뻗어 성장하는데 많은 시간이 걸리고 배양이 잘 되지 않기 때문이다. 또한, 본 발명에서 사용되는 붉은자루동충하초의 액체종균을 통상적으로 제조된 액체종균을 사용할 수도 있으나, 본 발명자가 개발한 방법으로 제조한 붉은자루동충하초의 액체종균을 사용하면 잡균의 혼입을 방지하고 활력을 유지할 수 있는 장점이 있다.

본 발명에서 붉은자루동충하초 자실체 재배용 배지는 곡물 대 번데기가 3 : 2 ∼ 4:1의 비율로 첨가되어 있으며 곡물은 현미를 단독으로 사용하거나 상기 현미에다가 보리, 밀, 옥수수, 콩, 율무, 수수 중의 어느 하나를 부가적으로 첨가할 수 있다. 따라서 종래 배지와는 달리 주변에서 쉽게 구할 수 있는 곡립을 주재료로 사용하므로 배양원료의 구입이 용이하고 배양원료의 확보가 용이한 장점이 있다.

본 발명에서 붉은자루동충하초 액체종균의 접종 및 자실체를 생산할 때, 균사가 자랄 때에는 24℃전후의 온도를 유지하고, 자실체 형성할 때에는 20℃의 온도를 유지하여야 가장 많고 질이 좋은 붉은자루동충하초 자실체를 생산할 수 있다.

본 발명 붉은자루동충하초의 액체종균을 자실체 재배용 배지에 접종할 때는 재배용 배지 표면을 붉은자루동충하초의 자실체가 완전히 덮히도록 접종하여 배양하여야 대량 생산할 수 있으며 이때, 자실체 형태는 자연상태에서 발견되는 것과 유사한 비교적 건실한 자실체를 생산할 수 있는 장점이 있다.

본 발명 붉은자루동충하초 자실체 재배용 배지로 사용한 곡립은 배양기내 곡립과 곡립 사이에 존재하는 공간이 균사의 생장을 용이하게 하고 배지내 수분과 통기를 상당기간 유지시켜줌으로써 자실체의 형성을 용이하게 하는 장점이 있다. 또한 자실체 재배용 배지 내에는 균사의 생육에 좋은 영향을 주는 정도로 적당한 수분을 함유시키지만 배지 내 수분이 너무 많은 경우는 배지 내 간극이 줄어들어 통기를 적절하게 유지시켜주지 못하므로 표면의 균사는 생장이 촉진되나 자실체의 생산은 저해되므로 곡립의 종류에 따라 각각 수분 배합을 달리해야 한다.

본 발명에 의해 생산된 붉은자루동충하초의 자실체는 배양용기에서 채취한 후에, 커피포트 또는 주전자 등에 넣고 물을 부어 직접 끓여서 마실 수 있다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시 예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시 예에만 한정되는 것은 아니다.

실시 예 1: 붉은자루동충하초의 대량 생산

제 1 공정: 붉은자루동충하초의 균사체 분리

본 발명에 의한 붉은자루동충하초 자실체 생산은 원균을 자연으로부터 채집하여 분리한 원균을 평판 배양시키고 확대 배양시켜 붉은자루동충하초 종균을 준비하였다. 즉, 붉은자루동충하초의 종균준비단계는 통상의 방법으로 진행될 수 있으며, 곡립 등의 고체배지를 이용하여 배양한 고체종균과, 물에 소정의 영양물질을 용해시켜 배양한 액체종균을 모두 사용할 수 있으나 본 공정에서는 액체종균을 준비하였다.

붉은자루동충하초는 1999년 8월 29일 풀쐐기 번데기에서 형성된 것을 경기도 용문산에서 채집하였다. 채집된 상기 동충하초는 샤레의 뚜껑에 테이프를 사용하여 부착시키고 하루를 경과시켜 포자를 배지 위에 떨어지게 하였다. 떨어진 포자가 발아를 하면 감자한천배지와 누에번데기 분말을 혼합한 배지(기본 배지) 위에 떼어 넣고 자란 것을 공시균주로 사용하였다. 붉은자루동충하초는 감자한천배지와 누에번데기 분말을 혼합한 상기 기본 배지에서 다시 자실체 형성이 우수한 균주를 선발하였으며 이때, 선발한 붉은자루동충하초는 표 1에 나타낸 바와 같은 자실체를 형성하였다. 공시 균주는 누에번데기와 현미 상에 접종하여 20℃ 항온기에서 자실체형성을 유도한 결과 자실체를 형성하였다. 균사가 배지 표면에 걸쳐 생장되기까지는 1주일이 소요되며 일단 배지표면에 생장된 균사는 하얀색을 나타내다가 점차 붉은색을 나타내게 되었다. 자좌 발생이 되는 날은 접종 후 25일째부터 자좌의 발생이 시작되었다. 자좌인 버섯이 완전히 성숙 할 때까지는 접종 후 60일 정도 걸렸다.

감자한천배지와 누에번데기 분말을 혼합한 배지에서의 자실체형성 우수균주 선발

균 주	자좌형성일	자낭각 형성일	자좌성숙일	자실체길이(cm)	60일 후 자실체건중량(g)/병당
붉은자루동충하초	25	36	60	5.6	52 g

제 2 공정: 본 발명 붉은자루동충하초의 액체종균 배지 준비

상기 제 1 공정에서 분리한 붉은자루동충하초의 액체종균을 제조하기 위해 액체종균 배양배지성분으로 붉은자루동충하초의 균사생장에 필요한 탄소원, 질소원 및 무기염류를 조사하였다. 즉, 다양한 종류의 탄소원, 질소원 및 무기염류를 함유하는 배양액에서 붉은자루동충하초 균사체를 배양하면서 생장정도를 조사하였다. 이어서 조사한 결과를 토대로 붉은자루동충하초 균사체의 액체종균을 제조하기 위한 최적의 액체종균 배양배지를 제조하였다. 실험결과, 표 2에 나타낸 바와 같이 붉은자루동충하초 균사생장에 탄소원으로써 황백당이 가장 큰 영향을 미침을 알 수 있었다. 표 3에는 붉은자루동충하초 균사생장에 질소원으로써 대두분이 가장 큰 영향을 미침을 나타냈고 표 4에는 무기염류 자체가 균사생장에 커다란 영향을 미치지 않음을 나타냈다. 따라서, 상기 표 2 ∼ 4의 결과를 토대로 표 5에 나타낸 바와 같은 붉은자루동충하초 액체종균 배양을 위한 배지를 제조할 수 있었다.

붉은자루동충하초 균사생장에 대한 탄소원의 영향

탄소원 종류	갈락토스	만니톨	황백당	글루코스	덱스트로스	프락토스	락토스	말토스
균사생장	+++	+++	++++	+++	++	++	+++	+++
[주] ++++ : 매우 우수, +++ : 우수, ++ : 보통, + : 저조

붉은자루동충하초 균사생장에 대한 질소원의 영향

질소원 종류	소디움나이트레이트	펩톤	대두분	효모즙
균사생장	++	+++	++++	+++
[주] ++++ : 매우 우수, +++ : 우수, ++ : 보통, + : 저조

붉은자루동충하초 균사생장에 대한 무기염류의 영향

무기염 종류	대조구	염화칼슘	황산칼슘	인산칼슘	황산마그네슘
균사생장	+++	+++	+++	+++	+++
[주] ++++ : 매우 우수, +++ : 우수, ++ : 보통, + : 저조

붉은자루동충하초의 액체종균 배양용 조성비

성 분	접종원(500mL)	액체배지(10ℓ)
황 백 당	15	300
대 두 분	1.5	30
증 류 수	나머지	나머지
[주] 단위 g

제 3 공정: 붉은자루동충하초 액체종균 제조

상기 제 1 공정에서 분리한 붉은자루동충하초의 균사체를 상기 제 2 공정에서 준비한 표 5에 나타낸 바와 같은 조성비의 평판배지에 접종하고 22 ∼ 30℃, 80∼200rpm에서 7∼10일간 진탕 배양시켜 배양한 후 배양한 접종원을 역시 표 5에 나타낸 바와 같은 조성비의 액체배지에 접종하여 22 ∼ 28℃, 다른 잡균이 제거된 공기 0.1 ∼ 1.0 vvm의 양으로 5 ∼ 12일간 통기 배양하여 액체종균을 얻었다. 즉, 상기 배양공정 중 배양할 때 사용한 배양액에 함유된 영양성분으로 탄소원은 2 ∼ 7%(w/v), 질소원은 0.1 ∼1.0%(w/v), KH₂PO₄는 0 ∼ 0.15%(w/v), MgSO₄ㆍ7H₂O는 0 ∼ 0.15%(w/v), 그리고 나머지 증류수를 함유하였다. 평판 배양된 붉은자루동충하초 균류를 상기 배양액에 접종하고, 접종된 배양액을 80 ∼ 200 rpm, 22 ∼ 30℃의 진탕 배양기에서 7일 ∼ 10일간 배양시키는 과정을 수행한 후 액체배양을 실시하였다. 액체배양시 사용한 배양액은 영양성분으로 탄소원은 2 ∼ 7%(w/v), 질소원은 0.1 ∼ 1.0%(w/v), KH₂PO₄는 0 ∼ 0.15%(w/v), MgSO₄ㆍ7H₂O는 0 ∼ 0.15 %(w/v), 그리고 나머지 증류수를 함유하며 이 액체배양액에 배양한 붉은자루동충하초 균사 배 양접종원을 무균적으로 자동 접종시켰으며 상기 액체배양액 대 상기 배양접종원을 20 ∼ 200 : 1 의 비율로 접종이었다. 이렇게 접종된 액체배양액을 22∼28℃에서 0.1 ∼ 1.0 vvm 정도의 다른 균이 제거된 공기로 5일 ∼ 12일 동안 통기 배양시켰다.

상기 배양 및 액체배양 할 때에 사용한 배양액내 탄소원은 탄소원으로는 황백당, 글루코스, 갈락토스, 락토스, 말토스, 덱스트로스, 프락토스 중에서 하나 또는 둘 이상을 선택적으로 사용할 수 있고, 질소원으로는 대두분 및 펩톤 중에서 하나 또는 둘을 함께 사용할 수가 있다.

제 4 공정: 붉은자루동충하초 자실체 재배용 배지준비

본 공정에서 붉은자루동충하초 자실체 생산을 위해 배양배지를 종래와 같이 누에번데기 분말과 수분공급용 배지를 사용하지 않고, 현미 등과 같은 곡립에 누에번데기 분말을 첨가한 배지를 사용하였다. 표 6에 나타낸 바와 같이 누에번데기 분말에 현미를 첨가한 것이 균사의 생장도 빠르고 자실체의 형성도 좋으며 물을 가한 것도 균사생장 및 자실체가 양호한 점에 착안하여 배지를 제조하였다. 즉, 800mL의 투명 플라스틱용기에 곡립 80g과 누에번데기 조각 20g을 넣고, 곡립이 현미일 경우에는 현미 : 수분함량이 1 : 1.25의 비율로 수분을 조절한 후, 이를 121℃에서 20분간 멸균하여 배양배지로 삼았다.

누에번데기배지에서의 붉은자루동충하초균사생장과 자실체 형성시험

배 지	균사생장	자실체형성
누에번데기20g + 현미 80g	++++	+++
누에번데기40g + 현미 60g	+++	+++
누에번데기 80g	++	++
[주] ++++: 매우 우수, +++ : 우수, ++ : 보통, + : 저조

제 5 공정: 붉은자루동충하초의 액체종균 접종

상기 제 4 공정에서 준비한 붉은자루동충하초 자실체 재배를 위해 준비한 배양배지에 제 3 공정에서 제조한 붉은자루동충하초 액체종균을 접종하였다. 이때, 상기 액체종균이 곡류배지 위에 골고루 퍼져서 그 표면을 뒤덮을 정도로 접종시키고 접종할 때에 잡균의 혼입을 방지하기 위해 무균실에서 행하였다.

제 6 공정: 붉은자루동충하초의 배양 및 자실체 생산

상기 제 5 공정에서 붉은자루동충하초 액체종균을 배양배지에 접종시킨 배지를 통상의 배양실로 옮기고, 배양이 끝나면 자실체 형성실로 옮겨 자실체를 생산하였다. 이때, 상기 붉은자루동충하초의 액체종균은 배양일수가 경과함에 따라 새로운 균사를 뻗어 배양배지의 표면으로부터 배양배지의 내부로 침투해 들어갔다. 이러한 현상은 상기 배양배지의 배양용기를 투명 또는 반투명한 용기로 선택하여 쉽게 관찰할 수 있었으며 배양할 때 배양 온도는 24℃전후로 일정하게 유지시켰고 형광등을 켜서 광을 일정하게 유지시켰다. 즉, 붉은자루동충하초 액체종균을 접종한 배지를 습도 70 ∼ 80%, 온도 24℃내외, 형광등을 켜서 광을 유지시킬 수 있는 배양실에서 10 ∼ 15일 동안 배양시켰다. 이때, 자실체 형성에 적합한 온도를 구명하고자 20℃와 25℃의 항온기내에서 자실체의 인공생산을 유도한 시험에서 균사의 초기 생장은 24℃에서 우수하였으나, 일단 자좌가 형성되기 시작하면 20℃에서의 자좌 형성속도가 빨라지며 자낭각을 생산하는 성숙한 자실체를 형성하였다. 24℃에서는 자실체의 생산보다는 표면균사의 생장이 왕성하여 자실체의 생장이 저해 받으며 형성된 자실체 또한 자낭각을 생산하지 않는 불완전한 형태의 것이었다. 그러므로 자실체 형성 적정 온도는 20℃가 적합한 것으로 밝혀졌다.

결과적으로 현미와 누에번데기 작은 조각을 넣고 접종하면 균사가 배지표면에 생장되기까지는 10 ∼ 15일이 소요되며, 일단 생장된 균사는 초기에 흰색을 띠다가 점차 균사전반에 걸쳐 붉은색을 띠는 부분이 발달하였다. 이때는 배양실 온도를 20℃, 습도 80 ∼ 90%, 빛의 밝기 100 ∼ 500L로 유지하여 주고 15 ∼ 18일이 지나면 번데기의 표면에 짙은 노란색을 띠는 돌기모양의 균사 덩어리가 형성되기 시작하면 자좌가 발생이 시작하였다. 자좌의 발달은 초기에 길이 신장을 하며 자좌의 상단부가 곤봉형태로 두터워지면서 이 부분에서 자낭각을 형성하였다. 자낭각을 생산하기까지는 30 ∼ 40일이 소요되며, 자낭각이 성숙하여 외형상 완전한 형태의 자실체를 형성하기까지는 50 ∼ 65일이 소요되었다.

상기와 같이 생산된 붉은자루동충하초는 용기를 벗겨서 자실체 부분만 취하여 건조시켰다.

본 발명 붉은자루동충하초 자실체 생산방법을 도 1에 순서적으로 기재하였다.

이상, 상기 실시예를 통하여 설명한 바와 같이, 본 발명은 붉은자루동충하초 균을 탄소원, 질소원 및 물을 함유하는 배양액에서 배양하여 잡균의 오염없이 활력이 우수한 액체종균을 제조하는 뛰어난 효과가 있고 상기 제조한 액체종균을 곡립과 누에번데기 작은 조각을 함유하는 배지에서 배지의 표면에 자실체가 완전히 덮히도록 생육시켜 붉은자루동충하초를 대량으로 생산하는 뛰어난 효과가 있으므로붉은자루동충하초 자실체 재배 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (5)

1. (a) 붉은자루동충하초의 균사체를 평판배지에서 배양하는 공정; (b) 상기 (a)공정에서 평판 배양한 균사체를 탄소원 2 ∼ 7%(w/v), 질소원 0.1 ∼ 1.0%(w/v), KH₂PO₄0 ∼ 0.15%(w/v), MgSO₄ㆍ7H₂O 0 ∼ 0.15%(w/v) 및 나머지 증류수를 함유하는 배양액에 22 ∼ 30℃, 80∼200rpm에서 7 ∼ 10일간 진탕 배양시켜 배양하는 공정; (c) 상기 (b)공정에서 배양한 접종원을 (b) 공정에서 사용한 동일한 배양액에 배양액 : 배양접종원의 비가 20 ∼ 200:1의 비율로 접종하여 22 ∼ 28℃, 제균된 공기 0.1 ∼ 1.0 vvm의 양으로 5 ∼ 12일간 통기 배양하여 액체종균을 제조하는 공정; (d) 곡립과 누에번데기가 함유된 배양배지에 상기 (c)에서 제조한 액체종균을 배지 위에 골고루 퍼져서 그 표면을 뒤덮도록 무균실에서 접종시키는 공정; (e) 상기 (d) 공정에서 액체종균을 접종한 배지를 24℃ 온도에서 배양하여 균사를 생장시킨 후 20℃ 온도에서 자실체를 형성시켜 생장시킴을 특징으로 하는 붉은자루동충하초 자실체의 생산방법.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 붉은자루동충하초 균주는 감자한천배지와 누에번데기 분말을 혼합한 배지에서 자좌 형성일, 자낭각 형성일, 자좌 성숙일, 자실체 길이, 자실체 건중량을 측정하여 순수 분리함을 특징으로 붉은자루동충하초 자실체의생산방법.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 (b) 공정에서 탄소원은 황백당, 글루코스, 갈락토스, 락토스, 말토스, 덱스트로스, 프락토스 중 어느 하나이며 질소원은 대부분, 펩톤, 효모즙, 소디움나이트레이트 중 어느 하나임을 특징으로 하는 붉은자루동충하초 자실체의 생산방법.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 (d) 공정에서 곡립과 누에번데기의 함유비율은 3:2 ∼ 4:1의 범위임을 특징으로 하는 붉은자루동충하초 자실체의 생산방법.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 (d) 공정에서 곡립이 현미, 보리, 밀, 옥수수, 콩, 율무 또는 수수임을 특징으로 하는 붉은자루동충하초 자실체의 생산방법.