KR20010112934A

KR20010112934A - 신규한 단백질, 그를 코드하는 유전자 및 그들의 이용법

Info

Publication number: KR20010112934A
Application number: KR1020017012597A
Authority: KR
Inventors: 샤시켄; 아오키요시코; 니시요시스케
Original assignee: 미즈노 마사루; 니뽄 다바코 산교 가부시키가이샤
Priority date: 1999-04-01
Filing date: 2000-03-31
Publication date: 2001-12-22
Also published as: KR100810824B1; US7285389B1; EP1174503A4; US20080050386A1; EP1174503A1; AU3457600A; WO2000060075A1; CA2365397A1

Abstract

본 발명은, G-CSF 유도항체를 인식하는 항원을 코드하는 유전자로서,

(a) 서열목록의 서열번호2에 기재된 아미노산을 갖는 단백질;

(b) 서열목록의 서열번호2에 있어서 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환, 부가 또는 삽입된 아미노산 서열을 가지며, 또한 과립구 콜로니 자극인자 유도 활성을 갖는 항체 또는 그 단편(fragment)과 결합성을 갖는 단백질; 또는

(c) 서열목록의 서열번호2에 기재된 아미노산 서열과 적어도 50%이상의 상동성을 갖고, 또한 과립구 콜로니 자극인자 유도 활성을 갖는 항체 또는 그 단편과 결합성을 갖는 단백질을 코드하는 유전자를 제공한다.

Description

신규한 단백질, 그를 코드하는 유전자 및 그들의 이용법{NOVEL PROTEINS, GENE ENCODING THE SAME AND METHOD OF UTILIZATION THEREOF}

과립구 콜로니 자극인자(granulocyte colony-stimulating factor: G-CSF)는, 분자량이 약 18,000 내지 22,000이고, 사람의 경우 174개(드물게 178개), 마우즈에서는 178개의 아미노산으로 구성되어 있다. 혈액성분의 백혈구의 일종인 호중구의 분화증식을 유도하는 당단백질이다.

G-CSF는, 성숙 호중구의 생존의 연장이나 기능의 항진작용을 가지지만, 에리트로포이에틴에 의한 적아구, 인터루킨3에 의한 아구(芽球) 콜로니의 형성도 증강시킨다. 이러한 G-CSF를 생산시키는 세포로서는, 마크로파아지, 스트로마 세포, 단구(單球), T림프구, 섬유아세포, 혈관내피세포 등을 들 수 있다.

G-CSF를 약제로서 투여하는 것은, 항암제의 부작용으로서의 호중구 감소증이나 골수 이식후의 호중구 감소증의 치료 및 재생불량성 빈혈의 치료에 효과를 보이고 있다. 그러나, 투여시에 있어서는, 혈중 안정성이 낮기 때문에 자주 투여할 필요가 있고, 그렇더라도 정맥투여에 한정되어 있기 때문에 환자, 의사 쌍방에 고통과 부담을 강요하여 왔다. 더욱이, G-CSF는 약제로서 투여하면, 부작용으로서 골통(骨痛)을 일으키는 것으로 보고되어 있다. 또한, G-CSF를 생산하는 세포로서의 마크로파아지나 스트로마 세포를 직접 투여하는 것은, 세포이기 때문에 각 종 단백질이나 다양한 물질을 함유하고 있기 때문에 생각지 않은 부작용을 일으킬 가능성이 있으므로, 그러한 치료는 행하여지고 있지 않다.

상기와 같이, G-CSF 자체를 투여하는 것에 의하여 호중구를 분화시키는 방법으로는, 부작용으로서 골통을 야기시킬뿐만 아니라, 자주 투여할 필요가 있어, 환자 및 의사 모두에 고통과 부담을 강요하여 왔기 때문에, 다른 치료방법의 개발이 강하게 요망되고 있지만, 아직 확립되어 있지 않다.

그래서, 본 발명자들은, G-CSF 자체를 투여하는 것은 아니고, G-CSF를 생산하는 호중구를 분화증식시키는 것을 의도하여, 이전에, G-CSF 유도항체를 제공하는 것에 성공하였다(출원번호 특원평9-266591(평성9년(1997) 9월 30일), 공개번호 특개평11-106400(평성11년(1999) 4월 20일)).

그렇지만, G-CSF 유도항체가 인식하는 항원에 관하여는 지금까지 해명되어 있지 않았다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제의 하나는, G-CSF 유도항체를 인식하는 항원을 특정하는 것이다. 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는, G-CSF 유도항체를 인식하는 항원을 코드하는 유전자를 클로닝하여, 동정하는 것이다.

본 발명은, 과립구 콜로니 자극인자 유도 활성을 갖는 항체와 반응성을 갖는 단백질, 그를 코드하는 유전자 및 그들의 이용법에 관한 것이다.

본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 연구한 결과, G-CSF 유도능을 가지는 모노클로날 항체를 프로우브로서 사용하여, 마크로파아지 세포 유래의 cDNA 라이브러리를 이뮤노클로닝한 결과, 3개의 양성 클론의 단리에 성공하고, 더 나아가 그 염기 서열을 결정함으로써 본 발명을 제공하게 되었다. 더욱이, 본 발명자들은, 인간형의 항원 유전자의 염기 서열을 결정하였다.

즉, 본 발명에 의하면, (a) 서열목록의 서열번호2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질; (b) 서열목록의 서열번호2에 있어서 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환, 부가 또는 삽입된 아미노산 서열을 가지며, 또한 과립구 콜로니 자극인자 유도 활성을 갖는 항체 또는 그 단편과 결합성을 갖는 단백질; 또는 (c) 서열목록의 서열번호2에 기재된 아미노산 서열과 적어도 50%이상의 상동성을 가지며, 또한 과립구 콜로니 자극인자 유도 활성을 갖는 항체 또는 그 단편과 결합성을 갖는 단백질:을 코드하는 유전자가 제공된다.

또한, 본 발명에 의하면, (a) 서열목록의 서열번호4에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질; (b) 서열목록의 서열번호4에 있어서 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환, 부가 또는 삽입된 아미노산 서열을 가지며, 또한 과립구 콜로니 자극인자 유도 활성을 갖는 항체 또는 그 단편과 결합성을 갖는 단백질; 또는 (c) 서열목록의 서열번호4에 기재된 아미노산 서열과 적어도 50%이상의 상동성을 가지며, 또한 과립구 콜로니 자극인자 유도 활성을 갖는 항체 또는 그 단편과 결합성을 갖는 단백질:을 코드하는 유전자가 제공된다.

더욱이, 본 발명에 의하면 (a) 서열목록의 서열번호1에 기재된 염기 서열; (b) 서열목록의 서열번호1에 있어서 1 또는 수개의 염기가 결실, 치환, 부가 또는삽입된 염기 서열을 가지며, 또한 과립구 콜로니 자극인자 유도 활성을 갖는 항체 또는 그 단편과 결합성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열; 또는 (c) 서열목록의 서열번호1에 기재된 염기 서열을 갖는 DNA와 엄격한 조건하에서 혼성화하며, 또한 과립구 콜로니 자극인자 유도 활성을 갖는 항체 또는 그 단편과 결합성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열;을 갖는 유전자가 제공된다.

또한, 본 발명에 의하면 (a) 서열목록의 서열번호3에 기재된 염기 서열; (b) 서열목록의 서열번호3에 있어서 1 또는 수개의 염기가 결실, 치환, 부가 또는 삽입된 염기 서열을 가지며, 또한 과립구 콜로니 자극인자 유도 활성을 갖는 항체 또는 그 단편과 결합성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열; 또는 (c) 서열목록의 서열번호3에 기재된 염기 서열을 갖는 DNA와 엄격한 조건하에서 혼성화하며, 또한 과립구 콜로니 자극인자 유도 활성을 갖는 항체 또는 그 단편과 결합성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열;을 갖는 유전자가 제공된다.

상기에 있어서, 과립구 콜로니 자극인자 유도 활성을 갖는 항체는, 예컨대, 기탁번호 FERM BP-6103인 하이브리도마가 생산하는 모노클로날 항체이다.

본 발명의 유전자는 예컨대, 마우스 또는 인간 유래의 유전자이다.

더욱이 본 발명에 의하면, (1) 서열목록의 서열번호1에 기재된 염기 서열에 있어서 제519번째로부터 제736번째의 염기 서열, 제666번째로부터 제689번째의 염기 서열, 제381번째로부터 제403번째의 염기 서열 또는 제709번째로부터 제727번째의 염기 서열; (2) 상기(1)에 기재된 염기 서열에 있어서 1 또는 수개의 염기가 결실, 치환, 부가 또는 삽입된 염기 서열; 또는 (3) 상기(1)에 기재된 염기 서열의어느 하나와 적어도 80%의 상동성을 갖는 염기 서열: 중의 어느 하나를 함유하는 DNA 단편이 제공된다.

더욱이 본 발명에 의하면, (1) 서열목록의 서열번호1에 기재된 염기 서열에 있어서 제519번째로부터 제736번째의 염기 서열, 제666번째로부터 제689번째의 염기 서열, 제381번째로부터 제403번째의 염기 서열 또는 제709번째로부터 제727번째의 염기 서열; (2) 상기(1)에 기재된 염기 서열에 있어서 1 또는 수개의 염기가 결실, 치환, 부가 또는 삽입된 염기 서열; 또는 (3) 상기(1)에 기재된 염기 서열의 어느 하나와 적어도 80%의 상동성을 갖는 염기 서열: 중의 어느 하나를 함유하고, 과립구 콜로니 자극인자 유도 활성을 갖는 항체 또는 그 단편과 결합성을 갖는 단백질을 코드하는 유전자가 제공된다.

또한, 본 발명에 의하면, 하기의 어느 하나의 단백질: (a) 서열목록의 서열번호2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질; (b) 서열목록의 서열번호2에 있어서 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환, 부가 또는 삽입된 아미노산 서열을 가지며, 또한 과립구 콜로니 자극인자 유도 활성을 갖는 항체 또는 그 단편과 결합성을 갖는 단백질; (c) 서열목록의 서열번호2에 기재된 아미노산 서열과 적어도 50%이상의 상동성을 가지며, 또한 과립구 콜로니 자극인자 유도 활성을 갖는 항체 또는 그 단편과 결합성을 갖는 단백질; 또는 (d) 서열목록의 서열번호1에 기재된 염기 서열을 갖는 DNA와 엄격한(stringent) 조건하에서 혼성화하는 DNA에 의해 코드되며, 또한 과립구 콜로니 자극인자 유도 활성을 갖는 항체 또는 그 단편과 결합성을 갖는 단백질이 제공된다.

또한, 본 발명에 의하면, 하기의 어느 하나의 단백질: (a) 서열목록의 서열번호4에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질; (b) 서열목록의 서열번호4에 있어서 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환, 부가 또는 삽입된 아미노산 서열을 가지며, 또한 과립구 콜로니 자극인자 유도 활성을 갖는 항체 또는 그 단편과 결합성을 갖는 단백질; (c) 서열목록의 서열번호4에 기재된 아미노산 서열과 적어도 50%이상의 상동성을 가지며, 또한 과립구 콜로니 자극인자 유도 활성을 갖는 항체 또는 그 단편과 결합성을 갖는 단백질; 또는 (d) 서열목록의 서열번호3에 기재된 염기 서열을 갖는 DNA와 엄격한 조건하에서 혼성화하는 DNA에 의해 코드되며, 또한 과립구 콜로니 자극인자 유도 활성을 갖는 항체 또는 그 단편과 결합성을 갖는 단백질이 제공된다.

본 발명의 단백질은 바람직하기로는 포유동물, 특히 바람직하기로는, 마우스 또는 인간 유래의 단백질이다.

더욱이 본 발명에 의하면, (1) 서열목록의 서열번호2에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 제1번째로부터 제91번째의 아미노산 서열, 제50번째로부터 제146번째의 아미노산 서열, 제1번째로부터 제78번째의 아미노산 서열, 제200번째로부터 제241번째의 아미노산 서열, 제172번째로부터 제241번째의 아미노산 서열, 제103번째로부터 제150번째의 아미노산 서열, 제169번째로부터 제241번째의 아미노산 서열: (2) 상기(1)에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환, 부가 또는 삽입된 아미노산 서열; 또는 (3) 상기(1)에 기재된 아미노산 서열의 어느 하나와 적어도 70%의 상동성을 갖는 아미노산 서열: 중의 어느 하나를 포함하는 단백질이 제공된다.

더욱이 본 발명에 의하면, (1) 서열목록의 서열번호2에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 제1번째로부터 제91번째의 아미노산 서열, 제50번째로부터 제146번째의 아미노산 서열, 제1번째로부터 제78번째의 아미노산 서열, 제200번째로부터 제241번째의 아미노산 서열, 제172번째로부터 제241번째의 아미노산 서열, 제103번째로부터 제150번째의 아미노산 서열, 제169번째로부터 제241번째의 아미노산 서열: (2) 상기(1)에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환, 부가 또는 삽입된 아미노산 서열: 또는 (3) 상기(1)에 기재된 아미노산 서열의 어느 하나와 적어도 70%의 상동성을 갖는 아미노산 서열: 중의 어느 하나를 함유하고, 또한 과립구 콜로니 자극인자 유도 활성을 갖는 항체 또는 그 단편과 결합성을 갖는 단백질이 제공된다.

더욱이 본 발명에 의하면, 상기한 본 발명의 단백질에 대한 항체 또는 그 단편이 제공된다. 항체는 바람직하기로는 모노클로날 항체이고, 특히 바람직하기로는 인간형 모노클로날 항체 또는 인간 모노클로날 항체이다.

더욱이 본 발명에 의하면, 본 발명의 유전자 또는 DNA 단편을 함유하는 재조합 벡터가 제공된다.

더욱이 본 발명에 의하면, 본 발명의 유전자 또는 DNA 단편을 함유하는 재조합 벡터를 포함하는 형질전환체가 제공된다.

더욱이 본 발명에 의하면, 상기한 본 발명의 단백질을 갖는 과립구 콜로니 자극인자의 생산을 유도할 수가 있는 물질의 수용체가 제공된다.

더욱이 본 발명에 의하면, 본 발명의 단백질을 이용한 유용한 물질(예컨대, 해당 단백질에 대한 아고니스트, 안타고니스트)의 탐색방법 및 그 탐색방법에 의해 얻어진 물질 및 수용체에 결합할 수 있는 유용한 물질(예컨대, 해당 수용체에 대한 아고니스트, 안타고니스트)가 제공된다.

더욱이 본 발명에 의하면, 본 발명의 유전자, DNA 단편, 단백질(단백질의 단편을 포함한다), 항체(그 단편을 포함한다), 수용체, 물질을 포함하는 의약 조성물(특히, 감염증 또는 호중구감소증의 진단, 예방 또는 치료를 위한 의약 조성물), 그것들을 사용한 치료방법이 제공된다.

이하에 있어서, 본 발명의 실시태양 및 실시방법에 관해서 상세히 설명한다. 본 발명에 앞서, 본 발명자들은, 마크로파아지 자체를 면역하여 항체를 취득하여, 얻어진 항체 중에서 G-CSF를 유도하는 항체의 단리에 성공하였다(특원평9-266591; 이 명세서에 기재된 내용은 모두 인용에 의해 본 명세서 중에 포함되어지는 것으로 한다). 본 발명의 유전자는, 이 항체를 프로우브로서 사용하고 마우스 마크로파아지 유래의 cDNA 라이브러리를 탐색함으로써 단리되어진 것이고, 본 발명의 유전자에 의해 코드되는 단백질은, 과립구 콜로니 자극인자 유도 활성을 갖는 항체 또는 그 단편과 결합성을 갖는 것을 특징으로 한다.

(과립구 콜로니 자극인자 유도 활성을 갖는 항체 또는 그 단편)

우선, 본 명세서에서 말하는「과립구 콜로니 자극인자 유도 활성을 갖는 항체 또는 그 단편」(본 명세서 중 이하에 있어서, 「본 발명에서 사용되는 항체」라고도 한다)에 관하여, 그 입수방법 등에 관하여 설명한다.

본 발명자들은, 우선, 마우스 마크로파아지 세포주를 면역원으로서 MRL/1pr 마우스(자기면역질환마우스)에 투여하여, 모노클로날 항체의 단리를 하였다. 이어서, 얻어진 모노클로날 항체를, 면역원 세포인 마우스 마크로파아지 세포주에 작용시켜, 상기 항체의 면역원 세포에 주는 영향을 검토한 결과, 얻어진 항체의 하나가 면역원 세포주인 마우스 마크로파아지 세포주로부터 농도 의존적으로 G-CSF 를 생산하게 하는 특성을 갖는 것을 발견하였다(이 항체를 생산하는 하이브리도마는 국제기탁번호 FERM BP-6103로서 기탁되어 있다).

본 명세서 중에서「모노클로날 항체」란, 마크로파아지 세포주에 반응성을 갖는 모노클로날 항체이고, 구체적으로는, G-CSF를 생산하게 하는 작용을 갖는 모노클로날 항체이다.

본 발명에서 사용되는 항체는, 마크로파아지 세포주에 실질적으로 결합한다고 하는 특성을 갖는다. 본 발명에서 사용되는 항체에는, 상기 성질을 갖는 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체가 같이 포함된다. 또한, 「모노클로날 항체」에는, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE로 이루어지는 어느 하나의 면역글로불린에 속하는 모노클로날 항체도 포함하고, 적절하게는, IgG 또는 IgM 면역글로불린 클라스 모노클로날 항체이다.

또한, 마크로파아지 세포주는, 예컨대, 자연발생의 백혈병 세포로부터 제조하거나, 백혈병 바이러스에 의한 형질전환으로부터 제조할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 항체는 통상의 방법(예컨대, 문헌「 속생화학실험강좌5, 면역생화학연구법, 일본생화학회편: 동경화학동인발행, 등」에 기재된 방법)에 따라서 취득할 수가 있다.

본 발명에서 사용하는 모노클로날 항체는, 소위 세포융합에 의해서 제조되는 하이브리도마(융합세포)로부터 제조할 수가 있다. 즉, 항체 생산 세포와 골수종계 세포로부터 융합 하이브리도마를 형성시키고, 해당 하이브리도마를 클론화하여, 마크로파아지 세포주의 전부 또는 일부를 항원으로서, 그에 대한 특이적 친화성을 나타내는 항체를 생산하는 클론을 선택함으로써 제조된다. 그 조작은 면역항원으로서 마크로파아지 세포주의 전부 또는 일부를 사용하는 이외에, 종래 기지의 수단을 사용할 수 있다.

면역항원은, 예컨대 마크로파아지 세포주 그 자체를 사용하거나, 마크로파아지 세포주의 막 분획 또는 용해 추출액의 전부 또는 일부를 갖는 (폴리)펩티드의 용액 또는 예컨대 완전 프로인트 어주반트를 혼화하여 제조된다. 면역의 대상으로서 사용되는 동물로서는, 마우스, 랫트, 몰모트, 햄스터 또는 토끼 등의 포유동물, 바람직하기로는 마우스 또는 랫트, 보다 바람직하기로는 마우스가 예시된다. 면역은, 이들 포유동물의 피하 내, 근육 내, 정맥 내, 풋트 패드 내, 또는 복강 내에 1 내지 수회 주사하므로써 행하여진다.

통상, 첫회 면역으로부터 약 1∼2주간 마다 1∼4회 면역을 하고, 더 나아가 약 1∼4주간 후에 최종면역을 하여, 최종면역으로부터 약 3∼5일 후에 면역접종된 동물로부터 항체 생산 세포가 채취된다.

본 발명에서 사용되는 모노클로날 항체에는, 「국제기탁번호 FERM BP-6103」의 하이브리도마가 생산하는 모노클로날 항체(3-4H7 항체) 또는 그 단편 또는 상기 항체와 실질적으로 동일의 성상을 갖는 항체가 포함된다. 「3-4H7 항체」는, 세포로부터의 G-CSF 생산 유도능을 갖는다.

본 발명에서 사용되는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마는, 공지의 방법으로 제조할 수 있다. 공지의 방법으로서는, 예컨대, 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마의 제조에는, 케라 및 밀스타인 등의 방법(Nature, Vol. 256, pp.495∼497, 1975) 및 그에 준하는 수식방법을 들 수 있다. 즉, 모노클로날 항체는, 전술한 바와 같이 면역접종된 동물로부터 취득되는 비장, 림프절, 골수 또는 편도 등, 바람직하기로는 비장에 포함되는 항체 생산 세포와, 바람직하기로는 동종의 마우스, 랫트, 몰모트, 햄스터, 토끼 또는 인간 등의 포유동물, 보다 바람직하기로는 마우스, 랫트 또는 인간의 골수종 세포(미엘로마)와의 융합에 의해 얻어지는 융합세포(하이브리도마)를 배양하므로써 제조된다. 배양은, 인 비트로 또는 마우스, 랫트, 몰모트, 햄스터 또는 토끼 등의 포유동물, 바람직하기로는 마우스 또는 랫트, 보다 바람직하기로는 마우스의 복수중 등에서의 인 비보에서 행할 수 있으며, 항체는 각각 상기 배양 상청, 또는 포유동물의 복수로부터 취득할 수 있다.

세포융합에 사용되는 골수종계 세포로서는, 예컨대 마우스 유래의 미엘로마 「P3/X63-AG8」, 「P3/NSI/1-Ag4-1」,「P3/X63-Ag8. U1」,「SP2/0-Ag14」,「PAI」,「FO」또는「BW5147」, 랫트 유래의 미엘로마 「210RCY3-Ag1. 2. 3」, 인간 유래의 미엘로마「U-266AR1」,「GM1500-6TG-4A1-2」,「UC729-6」,「CEM-AGR」,「D1R11」또는「CEM-T15」등을 들 수 있다.

본 발명에서 사용되는 모노클로날 항체를 생산하는 융합세포 클론의 탐색은, 융합세포를, 예컨대 마이크로타이터 플레이트 속에서 배양하여, 증식이 보이는 웰의 배양 상청의 항원에 대한 반응성을, 예컨대, 플로우사이토메트리, RIA나 ELISA 등의 효소항체법에 의해서 측정하므로써 행할 수 있다.

기본배지로서는, 예컨대, Ham′F12 배지, MCDB153 배지 또는 저칼슘 MEM 배지 등의 저칼슘 배지, MCDB104 배지, MEM 배지, DMEM 배지, RPMI1640 배지, ASF104 배지, RD 배지 등의 고칼슘 배지 등을 들 수 있다. 상기 기본배지에는, 목적에 따라, 예컨대, 혈청, 호르몬 사이토카인 및/또는 각 종의 무기 또는 유기물질 등을 함유시킬 수 있다. 모노클로날 항체의 단리, 정제는 상기한 배양 상청 또는 복수를 포화 황산암모늄, 유글로불린 침전법, 카프로인산법, 카프릴산법, 이온교환크로마토그래피(DEAE 또는 DE52 등), 항면역글로불린 칼럼 또는 프로틴A 또는 프로틴G 컬럼 등의 친화성 칼럼 크로마토그래피에 부가하는 것, 소수 크로마토그래피에 부가하는 것 등에 의해 행할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 모노클로날 항체는, 상기한 제조방법에 한정되는 것은 아니고, 어떠한 방법으로 얻어진 것이어도 좋다. 또한, 통상「모노클로날 항체」는, 면역접종을 행하는 포유동물의 종류에 의해 각각 다른 구조의 당쇄를 갖지만, 본 발명에서 사용되는「모노클로날 항체」는 상기 당쇄의 구조차이에 의해 한정되는 것이 아니고, 모든 포유동물 유래의 모노클로날 항체도 포함하는 것이다. 파아지 디스플레이에서 만들어지는 모노클로날 항체, 더욱이, 예컨대 인간 면역글로불린 유전자를 재조합하므로써, 인간형 항체를 생산하도록 유전자공학적으로 제작된 트랜스제닉 마우스를 사용하여 얻어지는 인간형 모노클로날 항체, 또는, 유전자 재조합 기술에 의해, 어떤 포유동물 유래의 모노클로날 항체의 정상영역(Fc 영역)을 인간 모노클로날 항체의 Fc 영역으로 재조합한 키메라 모노클로날 항체, 더 나아가 항원과 상보적으로 직접 결합할 수 있는 상보성결정부위(CDR: complementarity- determining residue) 이외, 전영역을 인간 모노클로날 항체의 대응영역과 재조합한 인간화 모노클로날 항체도 본 발명에서 사용되는「모노클로날 항체」에 포함된다.

또한, 본 발명에 있어서는「항체의 단편」을 사용하더라도 좋으며, 여기서 말하는 「항체의 단편」이란, 적어도 하나의 가변영역을 함유하는 항체 단편을 의미하고, 특원평9-266591에서 말하는「항체의 일부」와 같은 의미이다. 구체적으로는 Fv, F(ab′)2, Fab′또는 Fab를 가리킨다. 여기서, 「F(ab′)2」및「Fab′」란, 면역글로불린(모노클로날 항체)을 단백질 분해효소인 펩신 또는 파파인 등으로 처리하므로써 제조되며, 힌지영역 중의 2개의 H쇄 사이에 존재하는 디설파이드(disulfide) 결합의 전후에서 소화되어 생성되는 항체 단편을 의미한다. 예컨대, IgG를 파파인으로 처리하면, 힌지영역 중의 2개의 H쇄 사이에 존재하는 디설파이드 결합의 상류에서 절단되어 VL(L쇄 가변영역)과 CL(L쇄 정상영역)로 이루어지는 L쇄, 및 VH(H쇄 가변영역)과 CHγ1(H쇄 정상영역 중의 γ1영역)로 이루어지는 H쇄 단편이 C말단 영역에서 디설파이드 결합에 의해 결합한 상동인 2개의 항체 단편을 제조할 수가 있다. 이들 2개의 상동인 항체 단편을 각각 Fab′라고 한다.또한, IgG를 펩신으로 처리하면, 힌지영역 중의 2개의 H쇄 사이에 존재하는 디설파이드 결합의 하류에서 절단되어 상기 2개의 Fab′가 힌지영역에서 이어진 것보다 약간 큰 항체 단편을 제조할 수가 있다. 이 항체 단편을 F(ab′)2라고 한다.

본 발명의 유전자에 의해 코드되는 단백질은, 상기 상술한 바와 같은 과립구 콜로니 자극인자 유도 활성을 갖는 항체 또는 그 단편과 결합성을 갖는 것을 특징으로 한다. 본 명세서 중에서 말하는「결합성」이란, 단백질과 항체 사이의 통상의 결합성을 의미하며, 관용적인 면역학적분석법(예컨대, 면역침강법, ELISA법, 면역플롯팅법 등)을 사용하여 측정할 수 있다.

(본 발명의 유전자)

본 발명은, 서열목록의 서열번호1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 그것과 상동성을 갖는 단백질을 코드하는 유전자를 제공한다. 본 발명은 또한, 서열목록의 서열번호1에 기재된 염기 서열 또는 그것과 상동성을 갖는 염기 서열을 갖는 유전자를 제공한다.

본 발명의 유전자의 종류는 특별히 한정되지 않고, 천연 유래의 DNA, 재조합 DNA, 화학합성 DNA 중 어느 것이어도 좋으며, 또한 게놈 DNA 클론, cDNA 클론 중 어느 것이어도 좋다.

본 발명의 유전자는 전형적으로는, 서열목록의 서열번호1에 기재된 염기 서열을 갖지만, 이것은 본 발명의 일례를 나타내는 것에 지나지 않는 하기의 실시예에서 얻어진 클론(MMR19)의 염기 서열이다. 천연의 유전자의 중에는 그것을 생산하는 생물종의 품종의 차이나, 생태계의 차이에 기인하는 소수의 변이나 매우 비슷한 이소자임의 존재에 기인하는 소수의 변이가 존재하는 것은 당업자에 주지이다. 따라서, 본 발명의 유전자는, 서열목록의 서열번호1에 기재된 염기 서열을 갖는 유전자만에 한정되는 것은 아니고, 본 명세서에 기재된 특징을 갖는 단백질을 코드하는 모든 유전자를 포함한다.

특히, 본 명세서에 의해 본 발명의 단백질의 아미노산 서열 및 그것을 코드하는 DNA 서열이 개시되면, 이 서열 또는 그 일부를 이용하여, 혼성화나 PCR과 같은 유전자공학의 기본적 수법을 사용하여, 다른 생물종으로부터 같은 생리활성을 갖는 단백질을 코드하는 유전자를 용이하게 단리할 수 있다. 이와 같은 경우, 그와 같은 유전자도 본 발명의 범위에 포함된다.

상동유전자의 탐색을 위하여 사용하는 혼성화의 조건은 특별히 한정되지 않으며, 목적의 상동유전자와 프로우브의 상동성의 정도 등에 의해 당업자이면 적당히 선택할 수가 있지만, 일반적으로는 엄격한 조건이 바람직하고, 예컨대, 6×SSC[0.9M의 NaCl, 0.09M의 소듐시트레이트(pH7.0)], 5×덴하르트(Denhart′s) 용액[1000mL 중에 1g 피콜, 1g 폴리비닐피롤리돈, 1g BSA], 0.5% SDS, 25℃∼68℃(예컨대 37℃, 42℃ 또는 68℃); 또는 0∼50% 포름아미드, 6×SSC, 0.5% SDS, 25∼68℃(예컨대 37℃, 42℃ 또는 68℃) 등의 혼성화 조건을 사용하는 것을 생각할 수 있다. 포름아미드 농도, 덴하르트 용액 농도, 염 농도 및 온도 등의 혼성화 조건을 적절히 설정함으로써 어떤 일정한 상동성 이상의 상동성을 갖는 염기 서열을 포함하는 DNA를 클로닝할 수 있는 것은 당업자에 주지이고, 이와 같이 하여 클로닝된 상동유전자는 모두 본 발명의 범위 중에 포함된다.

상기한 바와 같이 혼성화를 사용하여 클로닝되는 상동유전자는, 서열목록의 서열번호1에 기재된 염기 서열에 대하여 적어도 70%이상, 바람직하기로는 80%이상, 보다 바람직하기로는 90%이상, 특히 바람직하기로는 95%이상, 가장 바람직하기로는 98%이상의 상동성을 갖는다.

(본 발명의 단백질)

본 발명은, 서열목록의 서열번호1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 그것과 상동성을 갖는 단백질을 제공한다.

본 발명의 서열번호1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질은, 그것을 코드하는 유전자를 적당한 발현 벡터에 재조합하고, 그것을 적당한 숙주에게 형질전환하여 재조합 단백질을 발현시키므로써 얻을 수 있다. 그렇지만, 본 발명의 단백질은, 본 명세서에 기재된 특징을 갖는 한, 그 기원, 제법 등은 한정되지 않으며, 천연산의 단백질, 유전자공학적수법에 의한 재조합 DNA에서 발현시킨 단백질, 또는 화학합성 단백질 중의 어느 것이어도 좋다.

본 발명의 단백질은 전형적으로는, 서열목록의 서열번호1에 기재된 241개의 아미노산 서열을 갖는다. 그러나, 천연의 단백질 중에는 그것을 생산하는 생물종의 품종의 차이나, 생태형의 차이에 의한 유전자의 변이, 또는 아주 비슷한 이소자임의 존재 등에 기인하여 1 내지 복수개의 아미노산 변이를 갖는 변이단백질이 존재하는 것은 주지이다. 또한, 여기서 말하는「아미노산 변이」란, 1이상의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가 등을 의미한다. 본 발명의 단백질은, 클로닝된유전자의 염기 서열로부터의 추측에 근거하여, 서열번호1에 기재된 아미노산 서열을 갖지만, 그 서열을 갖는 단백질만에 한정되는 것은 아니고, 본 명세서 중에 기재된 특성을 갖는 한 모든 상동단백질을 포함하는 것이 의도된다. 상동성은 적어도 50%이상, 바람직하기로는 60%이상, 보다 바람직하기로는 70%이상, 더욱 바람직하기로는 80%이상, 더욱 바람직하기로는 90%이상, 특히 바람직하기로는 95%이상, 가장 바람직하기로는 98%이상이다.

일반적으로, 같은 성질을 갖는 아미노산끼리의 치환(예컨대, 소수성 아미노산끼리의 치환, 친수성 아미노산끼리의 치환, 산성 아미노산끼리의 치환 또는 염기성 아미노산끼리의 치환)을 도입한 경우, 얻어지는 변이 단백질은 원래의 단백질과 같은 성질을 갖는 것이 많다. 유전자재조합 기술을 사용하여, 이와 같은 소망의 변이를 갖는 재조합 단백질을 제작하는 수법은 당업자에 주지이고, 이와 같은 변이 단백질도 본 발명의 범위에 포함된다.

본 명세서의 이하의 실시예로서는 본 발명의 일례를 나타내는 것으로서, 마우스 마크로파아지 유래의 cDNA의 클로닝이 표시되어 있다. 본 명세서 중에 개시된 단백질의 아미노산 서열 및 그것을 코드하는 유전자의 서열(마우스 유래) 또는 그 일부를 이용하고, 혼성화 또는 PCR 등의 유전자공학적수법을 사용하여, 다른 기원등으로부터 같은 생리활성을 갖는 단백질을 코드하는 유전자를 단리하는 것은 당업자의 통상의 지식의 범위 내의 것이고, 그와 같이 하여 단리되어진 유전자에 의해 코드되는 단백질도 본 발명의 범위에 포함된다.

(인간형의 유전자 및 단백질)

예컨대, 본 발명의 유전자 및 단백질에 관하여 인간 유래의 호몰로그(homolog)를 얻기 위한 방법의 일례로서는, 이하의 방법을 들 수 있다.

인간 마크로파아지계 세포주(THP-1, U937, HL-60)로부터, 구아니디움티오시아네이트/페놀클로로포름 1단계 추출법(라보매뉴얼 유전자공학, 제3판, 제83∼84페이지, 1996)에 의해서, 전(全)RNA를 추출하고, 올리고(dT) 셀룰로즈 컬럼을 사용하여 정제하여, 폴리A⁺RNA를 얻는다. 역전사효소(MMLV-RTase)와 DNA 폴리머라제를 사용하여 이중가닥 cDNA를 합성한다. 이 이중가닥 cDNA를 사용하고, Gubler- Hoffmann의 방법(Gubler, U. 및 Hoffmann, B., J.: Gene, 25: 263∼269, 1983)에 따라, λZAPII 파아지벡터를 사용하여 cDNA 라이브러리를 구축한다. 본 명세서에 개시한 마우스 cDNA(MMR19 클론)의 염기 서열(서열번호1) 중에서 인간과 높은 상동성을 갖는 영역(예컨대, 인간과 91%의 상동성이 인정된 서열번호1 중의 172번째로부터 241번째의 영역) 내의 서열을 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 인간 마크로파아지 세포의 cDNA 라이브러리를 주형으로서 증폭시킨 DNA 서열을 프로우브로서, 또는 이 영역(예컨대, 서열번호1 중의 172번째로부터 241번째의 영역)을 직접 프로우브로서 사용하여, 인간 마크로파아지 세포의 cDNA 라이브러리를 탐색함으로써 목적 단백질의 전장을 코드하는 cDNA를 단리한다. 프라이머 워킹(Primer Walking)법에 의하여, cDNA의 염기 서열을 해석한다. 목적 단백질의 전장을 코드하는 것이 확인된 cDNA를 바큘로바이러스에 도입시켜, 단백질로 발현시키고, 친화성칼럼에 의하여 단백질을 정제하므로써 인간형 호몰로그 단백질을 얻을 수 있다.

상기한 바와 같이, 본 발명은, 서열번호1에 기재된 염기 서열 또는 서열번호2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 유전자와 단백질, 및 이들과 상동성을 갖는 유전자와 단백질에 관한 것이다. 본 발명에 의하여 제공되는 서열번호1에 기재된 염기 서열 및 서열번호2에 기재된 아미노산 서열과 상동성을 갖는 서열은, 다른 생물 중에도 존재하는지 아닌지를 탐색한 결과, 인간의 EST(expressed sequence tag) 중에 본 발명의 유전자와 상동성이 높은 것이 존재하는 것이 확인되었다(이하의 실시예3을 참조). 따라서, 이와 같은 본 발명의 염기 서열과 높은 상동성을 갖는 인간 유래의 EST를 프로우브로서 사용하여 인간 유래의 유전자 라이브러리(cDNA 라이브러리 등)를 탐색하는 것에 의하여서도, 인간 유래의 호몰로그 유전자를 단리할 수 있는 것은 자명하다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 서열번호1에 기재된 염기 서열의 일부분(즉, DNA 단편)이, 인간에 있어서 높은 상동성을 가지고 보존되어 있는 것이 데이터베이스 검색의 결과, 분명하게 되었다. 이와 같은 DNA 단편은, 상기한 바와 같은 인간 유래의 호몰로그 유전자를 탐색할 때의 프로우브로서 사용되고, 본 발명의 일측면을 형성한다. 그와 같은 DNA 단편으로서는, 서열목록의 서열번호1에 기재된 염기 서열에 있어서 제519번째로부터 제736번째의 염기 서열, 제666번째로부터 제689번째의 염기 서열, 제381번째로부터 제403번째의 염기 서열 또는 제709번째로부터 제727번째의 염기 서열 중의 어느 하나를 포함하는 DNA 단편을 들 수 있으나, 더 나아가 이들 중의 어느 하나에 있어서 1 또는 수개의 염기가 결실, 치환, 부가 또는 삽입된 염기 서열; 또는 이들 중 어느 하나와 적어도 80%, 바람직하기로는 85%이상, 보다 바람직하기로는 90%이상, 더욱 바람직하기로는 95%이상, 가장 바람직하기로는 98%이상의 상동성을 갖는 염기 서열을 포함하는 DNA 단편도 본 발명의 범위 내이다.

또한, 본 발명의 서열번호2에 기재된 아미노산 서열의 일부분이, 인간에 있어서도 높은 상동성을 가지며 보존되어 있는 것이 데이타베이스 검색의 결과, 분명하게 되었다. 이와 같은 본 발명의 단백질의 일부로 이루어지는 단백질 단편은, 본 발명의 단백질과 같이, G-CSF 유도활성을 갖는 항체의 분석 또는 단리를 위한 시약으로서 유용하고, 또한 본 발명의 단백질과 같이, 의약으로서도 유용할 가능성이 있으며, 본 발명의 일측면을 형성한다.

이와 같은 단백질로서는, 서열목록의 서열번호2에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 제1번째로부터 제91번째의 아미노산 서열, 제50번째로부터 제146번째의 아미노산 서열, 제1번째로부터 제78번째의 아미노산 서열, 제200번째로부터 제241번째의 아미노산 서열, 제172번째로부터 제241번째의 아미노산 서열, 제103번째로부터 제150번째의 아미노산 서열, 제169번째로부터 제241번째의 아미노산 서열 중의 어느 하나를 포함하는 단백질을 들 수 있으며, 더 나아가 이들의 어느 하나에 있어서 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환, 부가 또는 삽입된 아미노산 서열; 또는 이들의 어느 하나와 적어도 70%, 바람직하기로는 80%이상, 보다 바람직하기로는 85%이상, 더욱 바람직하기로는 90%이상, 더욱 바람직하기로는 95%이상, 가장 바람직하기로는 98%이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열 중의 어느 하나를 포함하는 단백질도 본 발명의 범위 내이다.

본 발명자들은, 상기한 바와 유사한 방법에 의해, 인간형의 항원 유전자의 염기 서열을 결정하였다(이하의 실시예4를 참조). 따라서, 본 발명은, 서열목록의 서열번호3에 기재된 염기 서열 또는 그것과 상동성을 갖는 염기 서열을 갖는 유전자를 제공한다. 본 발명은 또한, 서열목록의 서열번호4에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 그것과 상동성을 갖는 단백질을 제공한다. 여기서 말하는 상동성의 의미, 즉, 본 발명의 범위가, 서열번호3에 기재된 염기 서열을 갖는 유전자 또는 서열번호4에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질에 한정되지 않는 것은, 본 명세서 「본발명의 유전자」또는 「본 발명의 단백질」의 항에서 설명한 대로이다.

(본 발명의 항체)

본 발명은, 상기한 본 발명의 단백질에 대한 항체(본 명세서 중 이하에 있어서, 「본 발명의 모노클로날 항체」라고도 한다)를 제공한다. 이하, 본 발명의 항체의 실시태양 및 입수방법에 관하여 상세하게 설명한다.

본 발명의 항체는 폴리클로날 항체이어도 모노클로날 항체이어도 좋으며, 모노클로날 항체의 경우에는 키메라 항체이어도 좋으며, 특히 마우즈/인간 키메라 항체가 바람직하다. 「모노클로날 항체」에는, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE로 이루어지는 어느 하나의 면역글로불린 클라스에 속하는 모노클로날 항체를 포함하며, 적당하기로는 IgG 또는 IgM 면역글로불린 클라스 모노클로날 항체이다.

항원으로 되는 본 발명의 단백질은, 그것을 코드하는 유전자를 적당한 발현 벡터에 재조합하여, 그것을 적당한 숙주에 형질전환시켜서 재조합 단백질을 발현시키므로써 얻을 수 있다. 또한, 면역 항원으로서, 예컨대, 마크로파아지 세포주 그자체, 마크로파아지 세포주의 막 분획을 이용할 수 있다.

본 발명의 폴리클로날 항체(항혈청) 또는 모노클로날 항체 등의 항체는 통상의 방법(예컨대, 문헌 「속생화학실험강좌5, 면역생화학연구법, 일본생화학회편: 동경화학동인발행, 등」에 기재된 방법)에 따라 취득할 수 있다.

즉, 예컨대, 항원을 필요에 따라 프로인트 어주반트(Freund's Aduvand)와 함께, 포유동물, 바람직하기로는 마우즈, 랫트, 햄스터, 몰모트, 토끼, 개, 고양이, 돼지, 염소, 말 또는 독수리, 바람직하기로는 마우즈, 랫트, 햄스터, 몰모트 또는 토끼에 면역한다. 폴리클로날 항체는, 상기 면역접종된 동물로부터 얻어진 혈청으로부터 취득할 수 있다. 또한, 모노클로날 항체는, 상기 면역접종된 동물로부터 얻어진 상기 항체 생산세포와 자기항체 생산능이 없는 골수종계 세포(미엘로마 세포)로부터 하이브리도마를 제조하고, 상기 하이브리도마를 클론화하여, 포유동물의 면역에 사용한 항원에 대하여 특이적인 친화성을 나타내는 모노클로날 항체를 생산하는 클론을 선택함으로써 제조할 수 있다.

모노클로날 항체는, 구체적으로는 이하와 같이 하여 제조될 수 있다. 즉, 본 발명의 단백질 또는 본 발명의 단백질을 발현하고 있는 세포 등을 면역원으로서 이용하여, 필요에 따라서 프로인트 어주반트(Freund's Aduvand)와 함께, 마우스, 랫트, 햄스터, 몰모트 또는 토끼, 바람직하기로는 마우스, 랫트 또는 햄스터(이들 동물에는 인간 항체 생산 트랜스제닉 마우스와 같은 다른 동물 유래의 항체를 생산하도록 제작된 트랜스제닉 동물이 포함된다)의 피하 내, 근육 내, 정맥 내, 풋트 패드 내 또는 복강 내에 1 내지 수회 주사하거나, 또는 이식함으로써 면역접종을 시킨다. 통상, 최초 면역으로부터 약 1 내지 14일 마다에 1 내지 4회 면역을 행하고, 최종 면역으로부터 약 1 내지 5일 후에 면역접종된 상기 포유동물로부터 항체 생산세포가 얻어진다.

본 발명의 모노클로날 항체는, 소위 세포융합에 의해서 제조되는 하이브리도마(융합세포)로부터 제조할 수 있다.

모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마는, 공지의 방법으로 제조할 수 있다. 공지의 방법으로서는, 케라 및 밀스타인의 방법(Nature, Vo1. 256, pp.495∼497, 1975) 및 그것에 준하는 수식방법을 들 수 있다. 즉, 본 발명의 모노클로날 항체는, 상기한 바와 같이 면역접종된 동물로부터 취득되는 비장, 림프절, 골수 또는 편도 등, 바람직하기로는 비장에 포함되는 항체 생산 세포와, 바람직하기로는 동종의 마우스, 랫트, 몰모트, 햄스터, 토끼 또는 인간 등의 포유동물, 보다 바람직하기로는 마우스, 랫트 또는 인간 유래의 골수종계 세포(미엘로마)와의 융합에 의해 얻어지는 융합세포(하이브리도마)를 배양하므로써 제조된다.

세포융합에 사용되는 골수종계(미엘로마) 세포로서는, 예컨대 마우스 유래 미엘로마 「P3/X63-AG8」,「P3/NSI/1-Ag4-1」,「P3/X63-Ag8.U1」,「SP2/0-Ag14」,「X63, 653」,「PAI」,「FO」또는「BW5147」, 랫트 유래 미엘로마 「210RCY3-Ag1. 2. 3」, 인간 유래 미엘로마「U-266AR1」,「GM1500-6TG-A1-2」,「UC729-6」, 「CEM-AGR」,「D1R11」또는「CEM-T15」등을 들 수 있다.

본 발명의 모노클로날 항체를 생산하는 융합세포 클론의 탐색은, 융합세포를, 예컨대 마이크로타이터 플레이트 속에서 배양하여, 증식을 보인 웰의 배양 상청의 항원에 대한 반응성을, 예컨대, 플로우 사이토메트리, RIA나 ELISA 등에 의해서 측정하므로써 행할 수 있다.

하이브리도마로부터의 모노클로날 항체의 제조는, 하이브리도마를 인 비트로, 또는 마우스, 랫트, 몰모트, 햄스터 또는 토끼 등, 바람직하기로는 마우스 또는 랫트, 보다 바람직하기로는 마우스의 복수 중 등에서의 인 비보에서 행하여, 얻어지는 배양 상청, 또는 포유동물의 복수로부터 단리함으로써 행할 수 있다. 인 비트로에서 배양하는 경우에는, 배양하는 세포 종의 특성, 시험연구의 목적 및 배양방법 등의 각각의 조건에 맞추어서, 하이브리도마를 증식, 유지 및 보존시켜, 배양 상청 중에 모노클로날 항체를 생산시키기 위하여 이용되는 것과 같은 기지의 배양배지 또는 기지의 기본배지로부터 유도제조되는 전영양배지를 이용하여 실시할 수 있다.

기본배지로서는, 예컨대, Ham' F12 배지, MCDB153 배지 또는 저칼슘 MEM 배지 등의 저칼슘 배지, MCDB104 배지, MEM 배지, DMEM 배지, RPMI1640 배지, ASF104 배지, RD 배지 등의 고칼슘 배지 등을 들 수 있다. 상기 기본배지에는, 목적에 따라서, 예컨대, 혈청, 호르몬사이토카인 및/또는 각종의 무기 또는 유기물질 등을 함유시킬 수 있다. 모노클로날 항체의 단리, 정제는 상기한 배양 상청 또는 복수를 포화 황산 암모늄, 유글로불린 침전법, 카프로인산법, 이온교환크로마토그래피(DEAE 또는 DE52 등), 항면역글로불린 칼럼 또는 프로틴A 또는 프로틴G 칼럼 등의 친화성 칼럼 크로마토그래피에 부가하는 것, 소수 크로마토그래피에 부가하는 것에 의하여 행할 수 있다.

본 발명에 있어서, 「키메라 항체」란, 유전자 공학으로 제작되는 모노클로날 항체로서, 구체적으로는, 예컨대, 그 가변영역이 마우스 면역글로불린 유래의 가변영역이고, 또한 그 정상영역이 인간 면역글로불린 유래의 정상영역인 것을 특징으로 하는 마우스/인간 키메라 모노클로날 항체 등의 키메라 모노클로날 항체를 의미한다. 인간 면역글로불린 유래의 정상영역은, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE 등의 이소타입에 의하여 각각 고유의 아미노산 서열을 가지나, 본 발명의 재조합 모노클로날 항체의 정상영역은 어느 이소타입에 속하는 인간 면역글로불린의 정상영역이어도 좋다. 바람직하기로는, 인간 IgG의 정상영역이다. 본 발명의 키메라 모노클로날 항체는, 예컨대, 이하와 같이 하여 제조될 수 있다. 그러나, 그러한 제조방법에 한정되지 않는 것은 말할 필요도 없다.

예컨대, 마우스/인간 키메라 모노클로날 항체는, 실험의학(임시증간호) 제1.6권, 제10호, 1988년 및 특공평3-73280호 공보 등을 참조하여 제작할 수 있다.

즉, 마우스 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마로부터 단리된 상기 모노클로날 항체를 코드하는 DNA로부터 얻은 활성명 V_H유전자(H쇄 가변영역을 코드하는 재배열된 VDJ 유전자)의 하류에 인간 면역글로불린을 코드하는 DNA에서 얻은 C_H유전자(H쇄 정상영역을 코드하는 C 유전자)를, 또한 상기 하이브리도마로부터 단리된 마우스 모노클로날 항체를 코드하는 DNA로부터 얻은 활성인 V_L유전자(L쇄 가변영역을 코드하는 재배열된 V_J유전자)의 하류에 인간 면역글로불린을 코드하는 DNA에서 얻은 C_L유전자(L쇄 정상영역을 코드하는 C 유전자)를, 각각 발현가능하도록 배열하여 1개 또는 각각의 발현벡터에 삽입하여, 상기 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환하고, 상기 형질전환세포를 배양하므로써 제작할 수 있다.

구체적으로는, 우선, 마우스 모노클로날 항체 생산 하이브리도마로부터 통상의 방법에 의해 DNA를 추출한 후, 상기 DNA를 적절한 제한효소(예컨대 EcoRI, H indIII 등)을 사용하여 소화하여, 전기영동에 걸어(예컨대, 0.7% 아가로즈겔 사용) 서던플롯법을 행한다. 영동한 겔을 예컨대 에티디움브로마이드 등으로 염색하여, 사진 촬영 후, 마커의 위치를 표시하고, 겔을 2회 수세하고, 0.25M의 HCl 용액에 15분 담근다. 다음으로, 0.4N의 NaOH 용액에 10분간 담그고, 그 동안에 천천히 진탕한다. 통상의 방법에 의하여, 필터에 옮기고, 4시간 후 필터를 회수하여 2×SSC에서 2회 세정한다. 필터를 충분히 건조한 후, 베이킹(75℃, 3시간)을 행한다. 베이킹 종료 후, 상기 필터를 0.1×SSC/0.1% SDS 용액에 넣고, 65℃에서 30분 동안 처리한다. 다음으로, 3×SSC/0.1% SDS 용액에 담근다. 얻어진 필터를 전혼성화액과 같이 비닐 자루에 넣는다. 65℃에서 3∼4시간 처리한다.

다음으로, 이 속에³²P 표지된 프로우브 DNA 및 혼성화액을 넣어, 65℃에서 12시간 정도 반응시킨다. 혼성화 종료 후, 적절한 염농도, 반응온도 및 시간(예컨대, 2×SSC, 0.1% SDS용액, 실온, 10분간)에 근거하여, 필터를 세척한다. 상기 필터를 비닐 자루에 넣고, 2×SSC를 소량 가하여, 밀봉하고, 오토라디오그래피를 행한다. 상기 서던블롯법에 의해, 마우스 모노클로날 항체의 H쇄 및 L쇄를 각각 코드하는 재배열된 VDJ 유전자 및 VJ 유전자를 동정한다. 동정된 DNA 단편을 포함하는 영역을 자당밀도구배 원심으로써 분획하여, 파아지 벡터(예컨대, charon4A, cha ron28, λEMBL3, λEMBL4 등)에 재조합하여, 상기 파아지 벡터로 대장균(예컨대, LE392, NM539 등)을 형질전환시켜, 게노믹 라이브러리를 제작한다. 그 게노믹 라이브러리를 적당한 프로우브(H쇄 J유전자, L쇄(κ) J유전자 등)를 사용하여, 예컨대 벤톤데이비스법(사이언스(Science), 제196권, 제180∼제182페이지(1977))에 따라서, 플라크 혼성화를 하여 재배열된 VDJ 유전자 또는 VJ 유전자를 각각 포함하는 적극적 클론을 얻는다. 얻어진 클론의 제한효소지도를 작성하고, 염기 서열을 결정하여, 목적으로 하는 재배열된 V_H(VDJ) 유전자 또는 V_L(VJ) 유전자를 포함하는 유전자가 얻어지고 있다는 것을 확인한다.

한편, 키메라화에 사용되는 인간 C_H유전자 및 인간 C_L유전자를 별도로 단리한다. 예컨대, 인간 IgG1과의 키메라 항체를 제작하는 경우에는, C_H유전자인 Cγ1유전자와 C_L유전자인 Cκ유전자를 단리한다. 이들 유전자는 마우스 면역글로불린 유전자와 인간 면역글로불린 유전자의 염기 서열의 높은 상동성을 이용하여 인간 Cγ1유전자 및 인간 Cκ 유전자에 상당하는 마우스 Cγ1유전자 및 마우스 Cκ 유전자를 프로우브로서 사용하여, 인간 게놈 라이브러리로부터 단리함으로써 얻을 수 있다.

구체적으로는, 예컨대, 클론 Ig146(프로시딩스 내셔날 아카데미 오브 사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 제75권, 제4709∼제4713페이지(1978))으로부터의 3kb의 HindIII-Bam HI 단편과 클론 MEP10(프로시딩스 내셔날 아카데미 오브 사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 제78권, 제474∼제478페이지(1981))으로부터의 6.8kb의 EcoRI 단편을 프로우브로서 사용하여, 인간의 λCharon4A의 HaeIII-AluI 게노믹 라이브러리(셀(Cell), 제15권, 제1157∼1174페이지(1978)) 중에서 인간 κ유전자를 포함하고, 인핸서 영역을 가지고 있는 DNA 단편을 단리한다. 또한, 인간 Cγ1유전자는, 예컨대, 인간 태아 간세포 DNA를 HindIII로 절단하고, 아가로즈겔 전기영동으로 분획한 후, 5.9kb의 밴드를 λ788에 삽입하여, 상기한 프로우브를 사용하여 단리한다.

이렇게 하여 얻어진 마우스 V_H유전자와 마우스 V_L유전자, 및 인간 C_H유전자와 마우스 C_L유전자를 사용하여, 프로모터 영역 및 인핸서 영역 등을 고려하여 마우스 V_H유전자의 하류에 인간 C_H유전자를, 또한 마우스 V_L유전자의 하류에 인간 C_H유전자를, 적절한 제한효소 및 DNA 리가제를 사용하여, 예컨대, pSV2gpt 또는 pSV2neo 등의 발현벡터에 통상의 방법에 따라서 재조합한다. 이때, 마우스 V_H유전자/인간 C_H유전자와 마우스 V_L유전자/인간 C_L유전자의 키메라 유전자는, 하나의 발현벡터에 동시에 배치되어도 좋고, 각각 별개의 발현벡터에 배치할 수도 있다.

이렇게 하여 제작한 키메라 유전자 삽입 발현벡터를, 예컨대 P3X63ㆍAG8ㆍ653 세포 또는 SP210 세포라고 하는, 스스로는 항체를 생산하지 않는 골수종계 세포에 플로토플라스트 융합법, DEAE-덱스트란법, 인산칼슘법 또는 전기천공법에 의하여 도입한다. 형질전환세포는, 발현 벡터에 도입된 약품내성유전자에대응하는 약물 함유 배지 중에서의 배양에 의해 선별하여, 목적으로 하는 키메라 모노클로날 항체 생산 세포를 얻는다. 이렇게 하여 선별된 항체 생산 세포의 배양 상청 중에서 목적으로 하는 키메라 모노클로날 항체를 얻는다.

본 발명에 있어서의「인간형 항체(CDR-grafted 항체)」는, 유전자공학적으로 제작되는 모노클로날 항체이고, 구체적으로는 예컨대, 그 초가변영역의 상보성 결정영역의 일부 또는 전부가 마우스 모노클로날 항체에서 유래하는 초가변영역의 상보성 결정영역이고, 그 가변영역의 틀영역이 인간 면역글로불린 유래의 가변영역의 틀영역이고, 또한 그 정상영역이 인간 면역글로불린 영역인 것을 특징으로 하는 인간형 모노클로날 항체를 의미한다.

여기서, 초가변영역의 상보성 결정영역이란, 항체의 가변영역 중의 초가변영역에 존재하여, 항원과 상보적으로 직접 결합하는 부위인 3개의 영역(CDR: complementarity-determining region; CDR1, CDR2, CDR3)을 가리키며, 또한 가변영역의 틀영역이란, 상기 3개의 상보성 결정영역의 전후에 개재하는 비교적 보존된 4개의 영역(Framework; FR1, FR2, FR3, FR4)을 가리킨다. 바꾸어 말하면, 예컨대 마우스 모노클로날 항체의 초가변영역의 상보성 결정영역의 일부 또는 전부 이외의 모든 영역이, 인간 면역글로불린의 대응영역과 치환된 모노클로날 항체를 의미한다. 인간 면역글로불린의 대응영역 유래의 정상영역은, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE 등의 이소타입에 의해 각각 고유의 아미노산 서열을 갖지만, 본 발명에 있어서의 인간형 모노클로날 항체의 정상영역은 어느 쪽의 이소타입에 속하는 인간 면역글로불린의 정상영역이더라도 좋다. 바람직하기로는, 인간 IgG의 정상영역이다. 또한,인간 면역글로불린 유래의 가변영역의 틀영역에 관해서도 한정되는 것이 아니다.

본 발명에 있어서의 인간형 모노클로날 항체는, 예컨대 하기와 같이 하여 제조할 수가 있다. 그렇지만, 그와 같은 제조방법에 한정되는 것이 아닌 것은 말할 필요도 없다. 예컨대, 마우스 모노클로날 항체에서 유래하는 재조합 인간형 모노클로날 항체는, 특표평4-506458호 공보 및 특개평62-296890호 공보 등을 참조하여, 유전자공학적으로 제작할 수가 있다. 즉, 마우스 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마로부터, 적어도 1개의 마우스 H쇄 CDR 유전자와 상기 마우스 H쇄 CDR 유전자에 대응하는 적어도 1개의 마우스 L쇄 CDR 유전자를 단리하고, 또한 인간 면역글로불린 유전자로부터 상기 마우스 H쇄 CDR에 대응하는 인간 H쇄 CDR 이외의 전영역을 코드하는 인간 H쇄 유전자와, 전마우스 L쇄 CDR에 대응하는 인간 L쇄 CDR 이외의 전영역을 코드하는 인간 L유전자를 단리한다.

단리된 상기 마우스 H쇄 CDR 유전자와 상기 인간 H쇄 유전자를 발현가능하도록 적당한 발현벡터에 도입하고, 동일하게 상기 마우스 H쇄 CDR 유전자와 상기 인간 L쇄 유전자를 발현가능하도록 적당한 또 다른 1개의 발현벡터에 도입한다. 또는, 상기 마우스 H쇄 CDR 유전자/인간 H쇄 유전자와 마우스 인간 L쇄 CDR유전자/인간 L쇄 유전자를 동일한 발현벡터에 발현가능하도록 도입할 수도 있다. 이렇게 하여 제작된 발현벡터로 숙주세포를 형질전환시키므로써 인간형 모노클로날 항체 생산 형질전환세포를 얻고, 상기 형질전환세포를 배양하므로써 배양 상청 중에서 목적으로 하는 인간형 모노클로날 항체를 얻는다.

본 발명에 있어서의「인간 항체」란, 면역글로불린을 구성하는 H쇄의 가변영역 및 H쇄의 정상영역 및 L쇄의 가변영역 및 L쇄의 정상영역을 포함하는 모든 영역이 인간 면역글로불린을 코드하는 유전자로부터 유래하는 면역글로불린이다. 인간 항체는, 통상의 방법에 따라서, 예컨대 적어도 인간 면역글로불린 유전자를 마우스등의 인간 이외의 포유동물의 유전자좌 중에 재조합하므로써 제작된 트랜스제닉 동물을, 항원 또는 면역접종하는 것에 의해, 상기한 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체를 제조하는 방법과 동일하게 제조할 수 있다.

예컨대, 인간 항체를 생산하는 트랜스제닉 마우스는, 네이쳐 지네틱스(Nature Genetics), 제7권, 제13∼21페이지, 1994년; 특표평4-504365호 공보; 국제출원공개 WO94/25585호 공보; 닛께이 사이언스, 6월호, 제40∼50페이지, 1995년; 네이쳐(Nature), 제368권, 제856∼859페이지, 1994년 및 특표평6-500233호 공보에 기재된 방법에 따라서 제작할 수 있다.

본 발명에 있어서「항체의 일부」란, 적어도 하나의 가변영역을 함유하는 항체 단편을 의미하고, 상기한 본 발명에 있어서의 항체, 바람직하기로는 모노클로날 항체의 일부분의 영역을 의미하며, 구체적으로는 Fv, F(ab′)2, Fab′또는 Fab를 가리킨다. 여기서, 「F(ab′)2」및 Fab′」이란, 면역글로불린(모노클로날 항체)을 단백질 분해효소인 펩신 또는 파파인 등으로 처리함으로써 제조되며, 힌지영역 중의 2개의 H쇄 사이에 존재하는 디설파이드 결합의 전후로 소화되어 생성되는 항체 단편을 의미한다. 예컨대, IgG를 파파인으로 처리하면 , 힌지영역 중의 2개의 H쇄 사이에 존재하는 디설파이드 결합의 상류에서 절단되어 VL(L쇄 가변영역)과 CL(L쇄정상영역)로 이루어지는 L쇄, 및 VH(H쇄 가변영역)와 CHγ1(H쇄 정상영역 중의 γ1영역)로 이루어지는 H쇄 단편이 C말단영역에서 디설파이드 결합에 의해 결합한 상동인 2개의 항체 단편을 제조할 수가 있다. 이들 2개의 상동인 항체 단편을 각각 Fab′라 한다. 또한, IgG을 펩신으로 처리하면, 힌지영역 중의 2개의 H쇄 사이에 존재하는 디설파이드 결합의 하류에서 절단되어 상기 2개의 Fab′가 힌지영역으로 이어진 것보다 약간 큰 항체 단편을 제조할 수가 있다. 이 항체 단편을 F(ab′)2라고 한다.

(재조합 벡터 및 형질전환체)

본 발명은 또한, 본 발명의 유전자 또는 DNA 단편을 함유하는 재조합 벡터를 제공한다.

재조합 벡터는, 간편하게는 당업계에서 입수가능한 재조합용 벡터(예컨대, 플라스미드 DNA 등)에 소망의 유전자를 통상의 방법에 의해 연결함으로써 제조할 수가 있다. 사용되는 벡터의 구체예로서는, 대장균 유래의 플라스미드로서는, 예컨대, pBluescript, pUC18, pUC19, pBR322 등이 예시될 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

소망의 단백질을 생산할 목적에 있어서는, 특히, 발현벡터가 유용하다. 발현벡터의 종류는, 원핵세포 및/또는 진핵세포의 각종의 숙주세포 속에서 소망의 유전자를 발현하여, 소망의 단백질을 생산하는 기능을 갖는 것이면 특별히 한정되지 않으나, 예컨대, 대장균용 발현벡터로서, PQE-30, pQE-60, pMAL-C2, pMAL-p2, pSE420 등이 바람직하고, 효모용 발현벡터로서 pYES2(사카로마이세스 속), pPIC3. 5K,pPIC9K, pAO815(이상 피치아 속), 곤충용 발현벡터로서 pBacPAK8/9, pBK283, pVL1392, pBlueBac4. 5등이 바람직하다.

플라스미드 등의 벡터에 본 발명의 유전자의 DNA 단편을 재조합하는 방법으로서는, 예컨대, 「Sambrook, J. 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, (second edition), Cold Spring Harbor Laboratory, 1. 53(1989)」에 기재된 방법 등을 들 수 있다. 간편하게는, 시판되는 라이케이션 키트(예컨대, 다까라주 제조 등)을 사용할 수 있다. 이렇게 하여 얻어지는 재조합 벡터(예컨대, 재조합 플라스미드)는, 이하에 기재하는 것과 같은 방법으로 숙주세포에 도입할 수가 있다.

본 발명의 재조합 벡터를 숙주세포에 도입(형질전환 또는 형질이입)하는 방법으로서는, 종래 공지의 방법을 사용하여 행할 수 있으며, 예컨대, 「Sambrook, J. 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, (second edition), Cold Spring Harbor Laboratory, 1. 74(1989)」에 기재된 염화칼슘법 또는 염화칼슘/ 염화루비듐법, 전기천공법, 전기주입법, PEG 등의 화학적인 처리에 의한 방법, 유전자총 등을 사용하는 방법 등을 들 수 있다. 또는, 예컨대, 숙주세포가 세균(E.coli,Bacillus subtilis등)의 경우는, 예컨대 Cohen 등의 방법[Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 69, 2110(1972)], 프로토플라스트법[Mol. Gen. Genet., 168, 111(1979)]이나 캄피턴트법[J. Mo1. Bio1., 56. 209(1971)]에 의하여, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 경우는, 예컨대 Hinnen 등의 방법[Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 75, 1927(1978)]이나 리튬법[J. Bacteriol., 153, 163(1983)]에 의하여, 식물세포의 경우는, 예컨대리프디스크법[Science, 227, 129(1985)], 전기천공법[Nature, 319, 791(1986)]에 의하여, 동물세포의 경우는, 예컨대 Graham의 방법[Virology, 52, 456(1973)], 곤충세포의 경우는, 예컨대 Summers 등의 방법[Mol. Cell. Biol., 3, 2156-2165(1983)]에 의하여 각각 형질전환할 수 있다.

형질전환체를 작성할 때에 사용하는 숙주세포로서는, 본 발명의 재조합 벡터에 적합하고, 형질전환될 수 있는 것이면 특별히 제한은 없고, 본 발명의 기술분야에서 통상 사용되는 천연의 세포, 또는 인공적으로 수립된 재조합 세포 등 여러가지의 세포를 사용할 수 있다. 예컨대, 세균(에셰리키아 속균, 바실러스 속균) 등의 원핵세포, 효모(사카로마이세스 속, 피치아 속 등) 등의 단세포성 숙주를 포함하는 하등 진핵성 세포, 누에 등의 고등진핵성 세포 등을 들 수 있다. 숙주세포는, 대장균, 효모, 곤충세포 등이 바람직하고, 구체적으로는, 대장균(M15, JM109, BL21 등), 효모(INVSc1(사카로마이세스 속), GS115, KM71(이상 피치아 속) 등), 곤충세포(BmN4, 누에유충 등) 등이 예시될 수 있다. 또한, 동물세포로서는 마우스 유래, 아프리카산 발톱개구리 유래, 랫트 유래, 햄스터 유래, 원숭이 유래 또는 인간 유래의 세포 또는 그들의 세포로부터 수립한 배양세포주 등이 예시될 수 있다.

숙주세포로서 세균, 특히 대장균을 사용하는 경우, 일반적으로 발현벡터는 적어도, 프로모터/오퍼레이터(operator)영역, 개시코돈, 소망의 단백질을 코드하는 유전자, 종지코돈, 터미네이터(terminator) 및 복제가능단위로 구성된다. 숙주세포로서 효모, 식물세포, 동물세포 또는 곤충세포를 사용하는 경우에는, 일반적으로 발현벡터는 적어도, 프로모터, 개시코돈, 소망의 단백질을 코드하는 유전자, 종지코돈, 터미네이터를 포함하고 있는 것이 바람직하다. 또한 시그날 펩티드를 코드하는 DNA, 인핸서 서열, 소망의 유전자의 5′측 및 3′측의 비번역영역, 선택마커 영역 또는 복제가능단위 등을 적당하게 포함하고 있어도 좋다.

본 발명의 벡터에 있어서, 적당한 개시코돈으로서는, 메티오닌 코돈(ATG)이 예시될 수 있다. 또한, 종지코돈으로서는, 상용의 종지코돈(예컨대, TAG, TGA, TAA 등)이 예시될 수 있다.

복제가능단위란, 숙주세포 속에서 그 전DNA 서열을 복제할 수가 있는 능력을 갖는 DNA를 의미하며, 천연의 플라스미드, 인공적으로 수식된 플라스미드(천연의 플라스미드로부터 제조된 플라스미드) 및 합성 플라스미드 등이 포함된다. 적당한 플라스미드로서는,E.coli에서는 플라스미드 pQE30, pET 또는 pCAL 또는 그들의 인공적 수식물(pQE30, pET 또는 pCAL을 적당한 제한효소로 처리하여 얻어지는 DNA 단편)이, 효모에서는 플라스미드 pYES2 또는 pPIC9K가, 또한 곤충세포에서는 플라스미드 pBacPAK8/9 등을 들 수 있다.

인핸서 서열, 터미네이터 서열에 관하여는, 예컨대, 각각 SV40에 유래하는 것 등, 당업자에 있어서 통상 사용되는 것을 사용할 수 있다. 선택마커로서는, 통상 사용되는 것을 통상의 방법에 의해 사용할 수 있다. 예컨대 테트라사이클린, 암피실린 또는 카나마이신 또는 네오마이신, 하이그로마이신, 스펙티노마이신 또는 클로람페니콜 등의 항생 물질의 내성유전자 등이 예시될 수 있다.

발현벡터는, 적어도, 상기한 프로모터, 개시코돈, 소망의 단백질을 코드하는 유전자, 종지코돈, 및 터미네이터 영역을 연속적이고 또한 환상에 적당한 복제가능단위에 연결함으로써 제조될 수 있다. 또한 이때, 필요에 따라 제한효소로의 소화나 T4 DNA 리가제를 사용하는 라이게이션 등의 통상의 방법에 의해 적당한 DNA 단편(예컨대, 링커, 다른 제한효소부위 등)을 사용할 수 있다.

(수용체, 탐색방법, 신규물질)

본 발명의 유전자가 코드하는 단백질은 G-CSF 유도자극의 입구에서 작용하고 있는 것으로 생각된다(즉, 본 발명은 이하의 이론에 의해 구속되는 것은 아니지만, 하나의 가능성으로서는, 마크로파아지 세포의 표층에 존재하는 본 발명의 단백질에 외부에서의 리간드가 결합하여, 그것에 의하여 생긴 시그날(signal)이 세포 내에 전달됨으로써 해당 마크로파아지가 G-CSF를 방출하도록 된다고 하는 모델을 생각할 수 있다). 따라서, 본 발명의 단백질은, 과립구 콜로니 자극인자의 유도인자의 수용체 또는 그 일부일 수 있다. 여기서 말하는「수용체의 일부」란, 수용체를 구성하는 서브유닛의 하나인 경우, 당쇄 등으로 수식되어 있는 경우를 포함한다. 이 수용체는, 예컨대 기탁번호 FERM BP-6103인 하이브리도마가 생산하는 모노클로날 항체 또는 그 단편과 같이, 과립구 콜로니 자극인자의 생산을 유도할 수가 있는 물질과 결합성(친화성이라고도 한다)을 가지며, 또한, 마크로파아지를 포함하는 과립구 콜로니 자극인자를 생산할 수 있는 세포의 세포막에 존재하는 것으로 생각된다. 본 발명은 이와 같은 수용체를 제공한다.

또한, 본 발명은 더욱이, 본 발명의 단백질을 사용하는 것을 특징으로 하며, 유용한 물질의 탐색방법을 제공한다. 이와 같은 탐색방법은, 문제의 물질과 본 발명의 단백질 또는 상기 수용체와의 결합성을 측정하는 것, 문제의 물질이 상기 수용체를 매개한 효과(예컨대, 마크로파아지로부터의 G-CSF의 생산, 적당한 형질전환세포로부터의 마커로되는 물질의 생산)를 측정하는 것, 또는 문제의 물질의 구조(예컨대, 문제의 물질이 단백질인 때에는, 그 아미노산 서열)와 본 발명의 단백질의 구조(예컨대, 아미노산 서열)를 비교하는 것을 포함한다.

탐색에 이용되는 본 발명의 단백질은, 바람직하기로는 (a) 서열목록의 서열번호4에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질; (b) 서열목록의 서열번호4에 있어서 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환, 부가 또는 삽입된 아미노산 서열을 가지며, 또한 과립구 콜로니 자극인자 유도 활성을 갖는 항체 또는 그 단편과 결합성을 갖는 단백질; (c) 서열목록의 서열번호4에 기재된 아미노산 서열과 적어도 50%이상(바람직하기로는 60%이상, 보다 바람직하기로는 70%이상, 더욱 바람직하기로는 80%이상, 더욱 바람직하기로는 90%이상, 특히 바람직하기로는 94%이상, 가장 바람직하기로는 98%이상)의 상동성을 가지며, 또한 과립구 콜로니 자극인자 유도 활성을 갖는 항체 또는 그 단편과 결합성을 갖는 단백질 또는; (d) 서열목록의 서열번호3에 기재된 염기 서열을 갖는 DNA와 엄격한 조건하에서 혼성화하는 DNA에 의해 코드되며, 또한 과립구 콜로니 자극인자 유도 활성을 갖는 항체 또는 그 단편과 결합성을 갖는 단백질이다.

보다 구체적인 탐색방법의 일례로서, 다음과 같은 것을 생각할 수 있다: G-CSF 프로모터 유전자, 그 하류의 루시페라제, β-갈락토시다제, 그린 플로렌센스 프로틴(GFP), β-락타마제 또는 클로람페니콜 아세틸 트랜스페라제(CAT) 등의 마커단백질을 코드하는 유전자, 및 더 하류의 테트라사이클린, 암피실린, 카나마이신, 네오마이신, 하이그로마이신 또는 스펙티노마이신 등의 약제에 대한 약제 저항성유전자를 삽입한 벡터를 구축한다. 이 벡터를, 본 발명의 단백질을 포함하는 수용체를 갖는 세포(예컨대 마크로파아지 세포주, 바람직하기로는 인간 유래 마크로파아지 세포주)에 도입한다. 얻어진 세포를 약제를 포함하는 배지로 처리하여, 콜로니를 형성한 세포군을 선발한다. 또한, 마커 단백질을 발현하고 있는 클론을 선택한다. 또한, 마커단백질의 발현이 실제의 G-CSF mRNA의 발현을 반영하고 있는 것을 확인하여 둔다. 이렇게 하여 얻어진 형질전환 세포주를 여러가지의 물질로 처리한다. 그리고 마커 단백질 발현을 유도한 물질을 탐색한다.

탐색에 의해 얻어지는 유용한 물질은 (a) 수용체와 결합성을 가지며, 결합의 결과, 수용체에 변화를 가져와 수용체를 통해 세포 내에 정보를 전달하고, 그리하여 과립구 콜로니 자극인자의 생산을 유도할 수 있는 물질(아고니스트 또는 작용약이라고도 한다); (b) 수용체와 결합성을 가지며, 결합의 결과, 과립구 콜로니 자극인자의 생산을 유도할 수 있는 물질이 수용체와 결합하는 것을 저해하고, 또한 과립구 콜로니 자극인자의 생산을 유도하지 않는 물질(안타고니스트 또는 차단약이라고도 한다); 및 (c) 수용체와 결합성을 가지며, 결합의 결과, 과립구 콜로니 자극인자의 생산을 유도할 수 있는 물질이 수용체와 결합하는 것을 저해하고, 또한 과립구 콜로니 자극인자의 생산을 저해하는 물질(인버스 아고니스트 또는 역효능제라고도 한다)을 포함한다.

이와 같은 물질은 신규한 것이다. 따라서, 본 발명은, 상기 방법에 의해 얻어진, (a) 수용체와 결합성을 가지며, 결합의 결과, 수용체에 변화를 가져와, 수용체를 통해 세포내에 정보를 전달하고, 그리하여 과립구 콜로니 자극인자의 생산을유도할 수 있는 물질; (b) 수용체와 결합성을 가지며, 결합의 결과, 과립구 콜로니 자극인자의 생산을 유도할 수 있는 물질이 수용체와 결합하는 것을 저해하고, 또한 과립구 콜로니 자극인자의 생산을 유도하지 않는 물질; 또는 (c) 수용체와 결합성을 가지며, 결합의 결과, 과립구 콜로니 자극인자의 생산을 유도할 수가 있는 물질이 수용체와 결합하는 것을 저해하고, 또한 과립구 콜로니 자극인자의 생산을 저해하는 물질도 제공한다. 또한, 본 발명은 더욱이, 상기 수용체와 결합성을 가지며: (a) 결합의 결과, 수용체에 변화를 가져와, 수용체를 통해 세포내에 정보를 전달하고, 그리하여 과립구 콜로니 자극인자의 생산을 유도할 수 있는 물질; (b) 결합의 결과, 과립구 콜로니 자극인자의 생산을 유도할 수 있는 물질이 수용체와 결합하는 것을 저해하고, 또한 과립구 콜로니 자극인자의 생산을 유도하지 않는 물질; 또는 (c) 결합의 결과, 과립구 콜로니 자극인자의 생산을 유도할 수 있는 물질이 수용체와 결합하는 것을 저해하고, 또한 과립구 콜로니 자극인자의 생산을 저해하는 물질도 제공한다. 이하, 이들 물질을「본 발명의 물질」이라고도 한다.

본 발명의 물질의 예로서는, 본 발명의 항체, 그 단편, 또는 다른 저분자 화합물이고: 과립구 콜로니 자극인자의 생산을 유도하는 작용을 갖는 것; 과립구 콜로니 자극인자의 생산을 유도할 수 있는 물질이 수용체와 결합하는 것을 저해하는 작용을 갖는 것; 또는 과립구 콜로니 자극인자의 생산을 유도할 수 있는 물질이 수용체와 결합하는 것을 저해하고, 또한 과립구 콜로니 자극인자의 생산을 저해하는 작용을 갖는 것이 있다.

상기 수용체와의 결합성(또는 결합의 저해성)은, 문제가 되는 물질이 항체인경우는, 예컨대, 항체와 결합한 마크로파아지 세포주를 플로우 사이토메트리나 ELISA법 등을 사용하여 해석하는 등의 방법에 의해, 측정할 수 있다.

과립구 콜로니 자극인자 생산의 유도작용(또는 저해작용)은, 특개평11-106400에 기재된 방법에 의해 결정될 수 있다. 그 개략을 이하에 기재한다,

피카진 인핸서 벡터2(와코준야쿠코교(주) 사제)의 XhoI 부위로부터 NcoI 부위에 걸쳐서 G-CSF 프로모터 유전자를 삽입하고, 그 하류에 G-CSF 유전자 대신에 루시페라제 유전자를 결합시키고, 또한 SV40의 하류의 SalI 부위에 pMC1Neo Poly A에서 잘라낸 네오마이신 저항성 유전자를 삽입한 PicaGCSFneo 벡터를 구축한다. 이 벡터를 RAW264.7 세포에 전기천공법을 사용하여 도입한다. 얻어진 세포를 제넥신을 포함하는 배지로 처리하여, 콜로니를 형성한 세포군을 선발한다. 제넥신 저항성 클론으로부터 더 나아가, 루시페라제 활성을 나타내는 클론을 선택한다. 또한, 루시페라제 활성이 실제의 G-CSF mRNA의 발현을 반영하고 있는 것을,³²P 표지 마우스 G-CSF의 cDNA를 프로우브로서, 노던블롯 해석에 의하여 확인하여 둔다. 이렇게 하여 얻어진 형질전환 마크로파아지 세포주를, 96웰 마이크로 플레이트에 웰 당 5×10⁴개씩 넣고, 37℃에서 24시간 배양하며, 필요에 따라 미리 얻어놓은 아고니스트, 안타고니스트로 처리한 후, 문제의 물질을 0, 3.75, 7.5, 15, 30 및/또는 60㎍/ml 정도의 농도로 첨가한다. 또한, 37℃에 18시간 배양한 후, 루시페라제 활성을 측정한다.

(의약으로서의 본 발명의 유전자 등의 이용)

본 발명의 유전자는, 예컨대, 혈액 성분의 백혈구의 일종인 호중구가 관여하는 질환(예컨대, 호중구감소증 등)의 진단, 예방 및 치료(유전자치료 등) 등에 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 단백질 또는 그 부분 펩티드, 항체 또는 그 단편, 수용체, 또는 물질(이하, 이들을 정리하여「본 발명의 단백질 등」이라고도 한다)이, 혈액 또는 골수 중의 호중구의 수를 조정하는 의약이 될 수 있다. 즉, 본 발명의 유전자 및 단백질 등은, 항암제의 부작용으로서의 호중구감소증이나 골수이식 후의 호중구감소증의 치료 및 재생불량성 빈혈의 진단, 예방 및 치료 등을 위하여 사용할 수 있다.

본 발명의 단백질 등은 통상, 전신 또는 국소적으로, 일반적으로는 비경구 형으로 투여할 수 있다. 비경구 투여의 중에서도 특히 바람직하기로는 정맥 내 투여이다.

본 발명의 유전자는, 생체 내 또는 생체 밖에서 세포에 유전자를 도입하는 소위 유전자치료의 형태로 전신 또는 국소적으로 투여할 수 있다. 유전자 도입은, 예컨대 바이오테크놀로지 매뉴얼 UP 시리즈, 유전자치료의 기초 기술, 島田隆, 齊藤泉, 小澤敬也編: 羊土社발행, 1996년에 기재된 방법에 따라서 행할 수 있다. 생체 밖에서 세포에 도입하는 경우에는, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 수반 바이러스(AAV) 벡터, 양이온 리포좀, HVJ-리포좀을 사용하는 방법, 인산칼슘법, DEAE 덱스트란법 등을 사용할 수 있다. 또한, 생체 내에서 유전자를 도입하는 경우에는, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 수반 바이러스(AAV) 벡터, 양이온 리포좀, HVJ-리포좀을 이용하는 방법을 들 수 있다.

투여 양은 년령, 성별, 체중, 증상, 치료효과, 투여방법, 처리시간, 투여하는 물질(단백질 또는 유전자의 종류) 등에 의하여 다르나, 성인 일인당, 1회 1㎍ 내지 100g의 범위, 바람직하기로는 10㎍ 내지 1000mg의 범위에서, 1일 1회 내지 복수회 비경구 투여할 수 있을 것이다. 투여량은 각각의 조건에 따라 변동하기 때문에, 상기 투여량보다 적은 양으로 충분한 경우도 있고, 또한 상기의 범위를 넘는 투여량을 필요로 하는 경우도 있다. 본 발명에 의한 비경구 투여를 위한 주사제로서는, 무균의 수성 또는 비수성의 용액제, 현탁제, 유탁제 등이 포함된다. 수성 또는 비수성의 용액제, 현탁제로서는, 하나 또는 그 이상의 활성물질이 적어도 하나의 불활성인 희석제로서 혼합된다. 수성의 희석제로서는, 예컨대 주사용 증류수 및 생리 식염수 등을 들 수 있다. 비수성의 희석제로서는, 예컨대 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물유, 에탄올과 같은 알콜류 등을 들 수 있다.

이와 같은 조성물은, 또한 방부제, 습윤제, 유화제, 분산제, 안정화제(예컨대 아르기닌, 아스파라긴산 등)와 같은 보조제를 함유하고 있어도 좋다.

이들은 박테리아 보류 필터를 통한 여과, 살균제의 배합 또는 조사에 의하여 무균화된다. 이들은 또한 무균의 고체 조성물을 예컨대 동결건조 등에 의하여 제조하고, 사용전에 무균의 주사용 증류수 또는 다른 용매에 용해하여 사용할 수 있다.

비경구 투여를 위한 다른 조성물로서는, 하나 또는 그 이상의 활성물질을 함유하고, 통상의 방법에 의하여 처방되는 외용액제, 장내 투여를 위한 좌제 및 패서리 등이 포함된다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 보다 상세하게 설명하나, 본 발명이 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예1 : 마크로파아지 세포주로부터 모노클로날 항체를 인식하는 항원 유전자의 클로닝

(1) 마크로파아지 세포(RAW264. 7)로부터의 폴리 A⁺RNA의 제조

2×10⁸개의 마우스 마크로파아지 세포(RAW264. 7)로부터, 구아니듐 티오시아네이트/페놀클로로포름 1단계추출법(라보매뉴얼 유전자공학, 제3판, 제83∼84페이지, 1996)에 의해서, 약 0.3mg의 전RNA를 제조하였다. 이것을 더욱 올리고(dT) 셀룰로즈 컬럼을 사용하여 정제하여, 5㎍의 폴리 A⁺RNA를 얻었다.

(2) 폴리 A⁺RNA로부터의 이중가닥 cDNA의 합성

상기 (1)에서 얻은 폴리 A⁺RNA(5㎍), 역전사효소(MMLV-RTase; STRATAGENE 사제; 70units), dNTPs(0.6mM)를 포함하는 반응액(50㎕)을 37℃에서 60분 동안 배양함으로써, 제1쇄(first strand) cDNA를 합성하였다. 또한, 상기 반응액(45㎕), DNA 폴리머라제(STRATAGENE 사제; 100units), dNTPs(0.3mM)를 포함하는 반응액을, 16℃에서 150분 동안 배양함으로써 제2쇄(second strand)를 합성하여, 이중가닥 cDNA(8㎍)를 얻었다.

(3) cDNA 라이브러리의 구축

Gubler-Hoffmann의 방법(Gubler, U. 및 Hoffmann, B., J. : Gene, 25: 263-269, 1983)에 따라, Pfu DNA 폴리머라제를 사용하여, 상기 (2)에서 합성된 이중가닥 cDNA를 평활말단화하여, T4 DNA 리가제에 의하여 어댑터(adapter)를 연결하였다. 구체적으로는, 상기 (2)에서 얻은 이중가닥 cDNA(DNA양 8㎍; 200㎕), Pfu DNA폴리머라제(5units)를 포함하는 반응액(전량 225㎕)을 72℃에서 30분 동안 배양하였다.

어댑터를 연결한 DNA를 제한효소 XhoI으로 말단을 절단하고, 겔 컬럼에 의해 0.5kbp이상의 길이의 cDNA를 분획하였다. 이 cDNA를 통상의 방법에 의해 T4 DNA 리가제에 의하여 λZAPII 파아지 벡터(Stratagene 사)에 재조합하고, 파아지 입자 내에 패키징하였다. 파아지의 역가를 측정한 결과, 이 cDNA 라이브러리는 1.2×10⁶개의 독립한 클론을 포함하는 것이 확인되었다. 얻어진 파아지 라이브러리를 대장균(XL1-Blue MRF′)에 감염, 증식시키고, 3.4×10⁹pfu/ml가 될 때까지 증식시켰다.

(4) 과립구 콜로니 자극인자의 유도능을 가지는 항체와 결합성을 갖는 단백질을 코드하는 유전자의 탐색

상기 (3)에서 구축한 cDNA 라이브러리에 대하여, 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF)의 유도능을 가지는 모노클로날 항체(기탁번호 FERM BP-6103인 하이브리도마가 생산하는 것; 특원평9-266591호 명세서에 기재)를 프로우브로 하여 면역탐색을 하였다. 구체적 순서는 이하와 같다. 파아지 cDNA 라이브러리를 대장균(XL1-B1ue MRF′)에 감염시켜, 지름 150mm의 플레이트에 접종하였다. 42℃에서 4시간 배양하고, 지름 0.5mm 정도의 플라크가 될 때까지 방치하였다. 10mM의 IPTG(이소프로필 티오-β-갈락토시드)에 담가 건조시켜 둔 니크로셀룰로즈 막을 올려두고, 37℃로 바꾸어 3시간 보온하였다. 니트로셀룰로즈 막을 벗기고, 5%의 탈지유(skim milk)를 포함하는 TBS-T(20mM 트리스 염산, pH7.6, 0.1% Tween20)를 사용하여, 실온에서 진탕하면서 1시간 배양하여, 막을 브로킹하였다. 그 후, TBS-T에서 2분 동안 가볍게 막을 린스하고(2회 반복한다), 실온에서 15분 동안(1회), 5분 동안(2회) 각각 버퍼에 담가, 세정하였다. 1% BSA(bovine serum albumin)을 포함하는 TBS로 1.6㎍/ml가 될 때까지 항체(기탁번호 FERM BP-6103인 하이브리도마가 생산하는 것)를 희석하였다. 희석된 1차 항체용액 중에서, 니트로셀룰로즈 막을 실온에서 진탕하면서, 1시간 배양하여, 항체와 반응시켰다. 상기의 세정조건과 동일하게 하여, 니트로셀룰로즈 막을 세정하였다. 1% BSA를 함유하는 TBS에 의해, 알칼리 포스파타제 표지 이차항체(ZYMED)를 0.6㎍/ml이 될 때까지 희석하였다. 희석된 이차항체 용액 중에서, 니트로셀룰로즈 막을 실온에서 진탕하면서 1시간 배양하여, 항체와 반응시켰다. 다시, 상기의 세정조건과 동일하게 하여, 니트로셀룰로즈 막을 충분히 세정하고, 마지막에 TBS 속에서 5분 세정하였다. 100mM의 트리스염산(pH9.5), 100mM의 NaCl 및 5mM의 MgCl₂의 완충액 중에 1ml씩 NBT 용액(니트로블루 테트라졸리움 50mg/ml in 70% 디메틸포름아미드)과 BCIP 용액(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴포스페이트 50mg/ml in 디메틸포름아미드)을 가하고 나서, 니트로셀룰로즈 막을 담갔다.암소(暗所)에서 30분 동안 반응시키고, 막을 물로 세척하여 건조시켰다. 건조 후, 니트로셀룰로즈 막 상에서 양성반응을 나타낸 플라크를 원래의 플레이트로부터 취하였다.

그 결과, 일차탐색에서는 7×10⁵개의 파아지로부터 22개의 항체결합 양성 플라크를 얻었다. 양성 플라크를 포함하는 플라크 집단을 회수하여, 증폭 후, 약 1000개의 파아지로부터 상기와 같은 조작으로 이차, 삼차, 사차 탐색을 행한 결과, 3개의 양성클론(MMR10, MMR17 및 MMR19)이 단리되었다.

(5) 유전자의 염기 서열의 결정

상기 (4)에서 얻은 3개의 양성클론(MMR10, MMR17 및 MMR19)에 관하여, 통상의 방법에 따른 In Vivo Excision에 의해서, λZAPII 파아지 벡터로부터 삽입 DNA를 잘라내고, pBluescript SK(-) Phagemid로 변환시켜, 서브클로닝하였다. 서브클로닝한 클론은 대장균(SOLR) 속에서 대량으로 증식하여 약 20㎍의 플라스미드 DNA를 얻었다. Primer Walking 법에 의해서, 이들의 DNA의 염기 서열을 해석하였다.

염기 서열의 해석의 결과로부터, MMR19 클론은 단백질의 오픈-리딩-프레임을 포함하는 840bp의 완전장의 cDNA의 염기 서열을 갖는 것이 판명되었다. MMR19 클론의 염기 서열을 서열목록의 서열번호1에 기재한다.

(6) cDNA 클론의 염기 서열로부터 추정되는 단백질의 일차구조

상기 (5)에서 해석한 유전자의 염기 서열로부터 추정되는 단백질(MMR-CAM)의 일차구조(서열목록의 서열번호1 및 2에 기재)는, 241개의 아미노산으로 구성되고,아미노산 서열로부터 추정되는 분자는 약 27kDa이었다. MMR-CAM은, 1군데의 막관통형 영역을 갖는 I형 막 당단백질이고, 세포외 부분은 107개, 막관통 부분은 23개, 세포내 부분은 111개의 아미노산으로 이루어지는 것으로 추정된다. 상동성 검색의 결과, 본 발명의 단백질과 구조상 유사한 분자는 특별히 확인되지 않아, 본 발명의 단백질은 기존의 패밀리에는 속하지 않은 것으로 생각된다. 또한, 세포외 영역에는, O형 당쇄에 풍부한 수식을 받는 부분이 존재하였다. 세포내 영역에는, 프로틴키나제C나 타이로신 키나제 등의 인산화 부위가 존재하여, 이들 당쇄와 인산화 부위는, 시그날 전달에 지극히 중요한 역할을 맡고 있는 것으로 생각된다.

실시예2 : 본 발명의 단백질(MMR-CAM)의 발현

실시예1(4)에서 얻은 클론(MMR19)을 통상의 방법에 따라서, 발현벡터(λZAPII) 중에 삽입하여, 대장균(XL1-Blue)에 형질전환하여, 형질전환체를 구축하였다. 형질전환된 대장균을 배양하고, 배양 상청을 도트플롯하여, 상기 (3)에 사용한 것과 같은 모노클로날 항체(기탁번호 FERM BP-6103인 하이브리도마가 생산하는 것)를 프로우브로서 반응시킨 결과, 배양 상청 중에 이 모노클로날 항체와 결합하는 단백질이 존재하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예3 : 데이터베이스 검색에 의한 마우스 유래의 단백질과 다른 상동 단백질과의 비교

실시예1에서 결정된 서열번호1에 기재된 염기 서열 및 아미노산 서열에 관하여, 데이타베이스검색(DNA DATA BANK of JAPAN(DDBJ), 일본 DNA data bank: 문부성ㆍ국립유전학연구소ㆍ생명정보연구센터)에 의해, 인간에 있어서의 상동 유전자의유무를 아미노산 레벨 및 DNA 레벨의 양쪽에서 검색하였다. 얻어진 결과를 이하의 표1 및 표2에 나타낸다. 이 결과에 의하면, 본 발명의 유전자가 인간에 있어서도 높은 상동성을 보이는 동시에 보존되어 있는 것이 시사된다.

표1: 아미노산 레벨의 상동성

서열목록1에 기재된 아미노산서열에 있어서의 위치	인간 호몰로그에 있어서 상동성
제1번째로부터 제91번째	83/91(91%)
제50번째로부터 제146번째	83/97(85%)
제1번째로부터 제78번째	70/78(89%)
제200번째로부터 제241번째	40/42(95%)
제172번째로부터 제241번째	67/70(95%)
제103번째로부터 제150번째	46/48(95%)
제169번째로부터 제241번째	58/73(79%)

표2: DNA 레벨에서의 상동성

서열목록1에 기재된 염기서열에 있어서의 위치	인간 호몰로그에 있어서 상동성
제519번째로부터 제736번째	189/218(86%)
제666번째로부터 제689번째	23/24(95%)
제381번째로부터 제403번째	22/23(95%)
제709번째로부터 제727번째	19/19(100%)

실시예4 : 항원 유전자의 인간형 호몰로그의 클로닝

Guanidium Thiocyanate/Phenol Chloroform Extraction의 방법에 따라, 인간 Normal Brain Tissue에서 Total RNA를 추출하여, Oligo(dT)-셀룰로즈에 의해 Poly(A)⁺RNA를 정제하였다. 역전사효소(MMLV-RTase)와 DNA 폴리머라제를 사용하여, Poly(A)⁺RNA로부터 cDNAs를 합성하였다. 마우스 항원 유전자(MMR19) 서열 중에서 4번째로부터 22번째의 센스 프라이머(CCATGTCTGGCTGTCAAGC), 714번째로부터 724번째에 대한 안티센스 프라이머(CCATTTTCTCCAACTGGGAGC)를 작성하고, 이들 프라이머를 사용하여, 인간 Normal Brain Tissue의 cDNAs를 주형으로서 PCR 반응을 행하였다. 그 결과, 마우스 항원 유전자(MMR19)의 인간형 호몰로그의 부분 cDNA가 얻어졌다. 다음으로, 인간형 호몰로그 부분 cDNA의 특이적 프라이머(GSP)와 어댑터 프라이머를 사용하여, 3′RACE 법과 5′RACE 법을 행하였다. 얻어진 3′RACE 단편으로부터 안티센스 프라이머(GTCAGAAGAGATTCAGGGTGACC) 및 5′RACE의 단편으로부터 센스 프라이머(AAGCCGTG CGGAGATTGGAGG)를 작성하여, LD-PCR를 한 결과, Open Reading Fra me을 포함하는 인간형 호몰로그의 전장 cDNA가 얻어졌다. Primer Walking 법에 의해서, cDNA의 924bp 염기 서열이 밝혀지게 되었다. 얻어진 염기 서열을 서열목록의 서열번호3에 기재한다. 인간형 호몰로그 cDNA의 염기 서열(924bp)은, 마우스 항원 유전자 cDNA(840bp)의 염기 서열과 84.8% 상동(924개의 염기 중, 712개의 염기가 일치)이었다.

얻어진 유전자의 염기 서열로부터 추정되는 단백질의 일차구조는, 242개의 아미노산으로 구성되는 서열번호3 및 4에 나타낸 것이다. 추정된 아미노산 서열은, 마우스의 그것과, 93.8%상동(242개의 잔기 중, 226개의 잔기가 일치)이었다. 이 단백질도 또한, 1군데의 막관통형 영역을 갖는 I형 막 당단백질인 것으로 추정된다.

본 발명의 유전자, 그것이 코드하는 단백질(상기 유전자의 단편 및 상기 단백질의 단편을 포함한다), 항체(그 단편을 포함한다), 수용체 및 물질은 신규한 것이고 의약용도로서 유용하다.

또한, 본 발명의 유전자, 그것이 코드하는 단백질(상기 유전자의 단편 및 상기 단백질의 단편을 포함한다), 항체(그 단편을 포함한다), 수용체는, 과립구 콜로니 자극인자의 유도능을 갖는 물질 등(예컨대, 모노클로날 항체, 단백질, 그외의 저분자물질 등)을 탐색할 때의 분석시약으로서도 유용하다.

또한, 본 발명의 유전자의 단편은, 다른 생물 유래의 호몰로그 유전자를 탐색할 때의 프로우브로서도 유용하다.

Claims

(a) 서열목록의 서열번호2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질;

(b) 서열목록의 서열번호2에 있어서 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환, 부가 또는 삽입된 아미노산 서열을 가지며, 또한 과립구 콜로니 자극인자 유도 활성을 갖는 항체 또는 그 단편과 결합성을 갖는 단백질; 또는

(c) 서열목록의 서열번호2에 기재된 아미노산 서열과 적어도 50%이상의 상동성을 가지며, 또한 과립구 콜로니 자극인자 유도 활성을 갖는 항체 또는 그 단편과 결합성을 갖는 단백질:을 코드하는 유전자.
(a) 서열목록의 서열번호1에 기재된 염기 서열;

(b) 서열목록의 서열번호1에 있어서 1 또는 수개의 염기가 결실, 치환, 부가 또는 삽입된 염기 서열을 가지며, 또한 과립구 콜로니 자극인자 유도 활성을 갖는 항체 또는 그 단편과 결합성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열; 또는

(c) 서열목록의 서열번호1에 기재된 염기 서열을 갖는 DNA와 엄격한 조건하에서 혼성화하며, 또한 과립구 콜로니 자극인자 유도 활성을 갖는 항체 또는 그 단편과 결합성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열:을 갖는 유전자.
(a) 서열목록의 서열번호4에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질;

(b) 서열목록의 서열번호4에 있어서 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환,부가 또는 삽입된 아미노산 서열을 가지며, 또한 과립구 콜로니 자극인자 유도 활성을 갖는 항체 또는 그 단편과 결합성을 갖는 단백질; 또는

(c) 서열목록의 서열번호4에 기재된 아미노산 서열과 적어도 50%이상의 상동성을 가지며, 또한 과립구 콜로니 자극인자 유도 활성을 갖는 항체 또는 그 단편과 결합성을 갖는 단백질:을 코드하는 유전자.
(a) 서열목록의 서열번호3에 기재된 염기 서열;

(b) 서열목록의 서열번호3에 있어서 1 또는 수개의 염기가 결실, 치환, 부가 또는 삽입된 염기 서열을 가지며, 또한 과립구 콜로니 자극인자 유도 활성을 갖는 항체 또는 그 단편과 결합성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열; 또는

(c) 서열목록의 서열번호3에 기재된 염기 서열을 갖는 DNA와 엄격한 조건하에서 혼성화하며, 또한 과립구 콜로니 자극인자 유도 활성을 갖는 항체 또는 그 단편과 결합성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열:을 갖는 유전자.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 과립구 콜로니 자극인자 유도 활성을 갖는 항체가 기탁번호 FERM BP-6103을 갖는 하이브리도마가 생산하는 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 유전자.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 마우스 또는 인간 유래의 유전자인 것을 특징으로 하는 유전자.
(1) 서열목록의 서열번호1에 기재된 염기 서열에 있어서 제519번째로부터 제736번째의 염기 서열, 제666번째로부터 제689번째의 염기 서열, 제381번째로부터 제403번째의 염기 서열 또는 제709번째로부터 제727번째의 염기 서열;

(2) 상기 (1)에 기재된 염기 서열에 있어서 1 또는 수개의 염기가 결실, 치환, 부가 또는 삽입된 염기 서열; 또는

(3) 상기 (1)에 기재된 염기 서열의 어느 하나와 적어도 80%의 상동성을 갖는 염기 서열: 중의 어느 하나를 포함하는 DNA 단편.
(1) 서열목록의 서열번호1에 기재된 염기 서열에 있어서 제519번째로부터 제736번째의 염기 서열, 제666번째로부터 제689번째의 염기 서열, 제381번째로부터 제403번째의 염기 서열 또는 제709번째로부터 제727번째의 염기 서열;

(2) 상기 (1)에 기재된 염기 서열에 있어서 1 또는 수개의 염기가 결실, 치환, 부가 또는 삽입된 염기 서열; 또는

(3) 상기 (1)에 기재된 염기 서열의 어느 하나와 적어도 80%의 상동성을 갖는 염기 서열: 중의 어느 하나를 함유하고, 과립구 콜로니 자극인자 유도 활성을 갖는 항체 또는 그 단편과 결합성을 갖는 단백질을 코드하는 유전자.
하기의 어느 하나의 단백질:

(a) 서열목록의 서열번호2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질;

(b) 서열목록의 서열번호2에 있어서 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환, 부가 또는 삽입된 아미노산 서열을 가지며, 또한 과립구 콜로니 자극인자 유도 활성을 갖는 항체 또는 그 단편과 결합성을 갖는 단백질;

(c) 서열목록의 서열번호2에 기재된 아미노산 서열과 적어도 50%이상의 상동성을 가지며, 또한 과립구 콜로니 자극인자 유도 활성을 갖는 항체 또는 그 단편과 결합성을 갖는 단백질; 또는

(d) 서열목록의 서열번호1에 기재된 염기 서열을 갖는 DNA와 엄격한 조건하에서 혼성화하는 DNA에 의해 코드되며, 또한 과립구 콜로니 자극인자 유도 활성을 갖는 항체 또는 그 단편과 결합성을 갖는 단백질.
하기의 어느 하나의 단백질:

(a) 서열목록의 서열번호4에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질;

(b) 서열목록의 서열번호4에 있어서 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환, 부가 또는 삽입된 아미노산 서열을 가지며, 또한 과립구 콜로니 자극인자 유도 활성을 갖는 항체 또는 그 단편과 결합성을 갖는 단백질;

(c) 서열목록의 서열번호4에 기재된 아미노산 서열과 적어도 50%이상의 상동성을 가지며, 또한 과립구 콜로니 자극인자 유도 활성을 갖는 항체 또는 그 단편과 결합성을 갖는 단백질; 또는

(d) 서열목록의 서열번호3에 기재된 염기 서열을 갖는 DNA와 엄격한 조건하에서 혼성화하는 DNA에 의해 코드되며, 또한 과립구 콜로니 자극인자 유도 활성을갖는 항체 또는 그 단편과 결합성을 갖는 단백질.
제9항 또는 제10항에 있어서, 과립구 콜로니 자극인자 유도 활성을 갖는 항체가 기탁번호 FERM BP-6103인 하이브리도마가 생산하는 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 단백질.
제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 마우스 또는 인간을 포함하는 포유동물 유래의 단백질인 것을 특징으로 하는 단백질.
(1) 서열목록의 서열번호2에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 제1번째로부터 제91번째의 아미노산 서열, 제50번째로부터 제146번째의 아미노산 서열, 제1번째로부터 제78번째의 아미노산 서열, 제200번째로부터 제241번째의 아미노산 서열, 제172번째로부터 제241번째의 아미노산 서열, 제103번째로부터 제150번째의 아미노산 서열, 제169번째로부터 제241번째의 아미노산 서열;

(2) 상기 (1)에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환, 부가 또는 삽입된 아미노산 서열; 또는

(3) 상기 (1)에 기재된 아미노산 서열의 어느 하나와 적어도 70%의 상동성을 갖는 아미노산 서열:중의 어느 하나를 포함하는 단백질.
(1) 서열목록의 서열번호2에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 제1번째로부터제91번째의 아미노산 서열, 제50번째로부터 제146번째의 아미노산 서열, 제1번째로부터 제78번째의 아미노산 서열, 제200번째로부터 제241번째의 아미노산 서열, 제172번째로부터 제241번째의 아미노산 서열, 제103번째로부터 제150번째의 아미노산 서열, 제169번째로부터 제241번째의 아미노산 서열;

(2) 상기 (1)에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환, 부가 또는 삽입된 아미노산 서열; 또는

(3) 상기 (1)에 기재된 아미노산 서열의 어느 하나와 적어도 70%의 상동성을 갖는 아미노산 서열: 중의 어느 하나를 함유하고, 또한 과립구 콜로니 자극인자 유도 활성을 갖는 항체 또는 그 단편과 결합성을 갖는 단백질.
제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 기재된 단백질에 대한 항체 또는 그 단편.
제15항에 있어서, 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 단편.
제16항에 있어서, 인간형 모노클로날 항체 또는 인간 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 단편.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 유전자 또는 DNA 단편을 함유하는재조합 벡터.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 유전자 또는 DNA 단편을 함유하는 재조합 벡터를 포함하는 형질전환체.
기탁번호 FERM BP-6103인 하이브리도마가 생산하는 모노클로날 항체 또는 그 단편을 포함하는 과립구 콜로니 자극인자의 생산을 유도할 수 있는 물질의 수용체로서, 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 기재된 단백질을 가지며, 또한 마크로파아지를 포함하는 과립구 콜로니 자극인자를 생산할 수 있는 세포에 존재하는 수용체.
물질과 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 기재된 단백질 또는 제20항에 기재된 수용체와의 결합성을 측정하는 것, 물질의 제20항에 기재된 수용체를 매개하는 효과를 측정하는 것, 또는 물질의 구조와 본 발명의 단백질의 구조를 비교하는 것을 포함하는, 이하의 어느 하나의 물질의 탐색방법:

(a) 제20항 기재된 수용체와 결합성을 가지며, 결합의 결과, 수용체에 변화를 가져와, 수용체를 통해 세포내에 정보를 전달하고, 그리하여 과립구 콜로니 자극인자의 생산을 유도할 수 있는 물질;

(b) 제20항에 기재된 수용체와 결합성을 가지며, 결합의 결과, 과립구 콜로니 자극인자의 생산을 유도할 수 있는 물질이 수용체와 결합하는 것을 저해하고,또한 과립구 콜로니 자극인자의 생산을 유도하지 않는 물질; 또는

(c) 제20항에 기재된 수용체와 결합성을 가지며, 결합의 결과, 과립구 콜로니 자극인자의 생산을 유도할 수 있는 물질이 수용체와 결합하는 것을 저해하고, 또한 과립구 콜로니 자극인자의 생산을 저해하는 물질.
제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 기재된 단백질 또는 제20항에 기재된 수용체와의 결합성을 측정하는 것, 또는 제20항에 기재된 수용체를 매개하는 효과를 측정하는 것을 특징으로 하는 탐색방법에 의해 얻어진 이하의 어느 하나의 물질:

(a) 제20항에 기재된 수용체와 결합성을 가지며, 결합의 결과, 수용체에 변화를 가져와, 수용체를 통해 세포내에 정보를 전달하고, 그리하여 과립구 콜로니 자극인자의 생산을 유도할 수 있는 물질;

(b) 제20항에 기재된 수용체와 결합성을 가지며, 결합의 결과, 과립구 콜로니 자극인자의 생산을 유도할 수 있는 물질이 수용체와 결합하는 것을 저해하고, 또한 과립구 콜로니 자극인자의 생산을 유도하지 않는 물질; 또는

(c) 제20항에 기재된 수용체와 결합성을 가지며, 결합의 결과, 과립구 콜로니 자극인자의 생산을 유도할 수 있는 물질이 수용체와 결합하는 것을 저해하고, 또한 과립구 콜로니 자극인자의 생산을 저해하는 물질.
제20항에 기재된 수용체와 결합성을 갖는, 하기의 어느 하나의 물질:

(a) 결합의 결과, 수용체에 변화를 가져와, 수용체를 통해 세포내에 정보를전달하고, 그리하여 과립구 콜로니 자극인자의 생산을 유도할 수 있는 물질;

(b) 결합의 결과, 과립구 콜로니 자극인자의 생산을 유도할 수 있는 물질이 수용체와 결합하는 것을 저해하고, 또한 과립구 콜로니 자극인자의 생산을 유도하지 않는 물질; 또는

(c) 결합의 결과, 과립구 콜로니 자극인자의 생산을 유도할 수 있는 물질이 수용체와 결합하는 것을 저해하고, 또한 과립구 콜로니 자극인자의 생산을 저해하는 물질.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 유전자 또는 DNA단편, 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 기재된 단백질, 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 단편, 제20항에 기재된 수용체, 또는 제22항 또는 제23항에 기재된 물질을 포함하는 의약 조성물.
제24항에 있어서, 감염증 또는 호중구감소증을 포함하는 G-CSF와 관련된 질환 또는 상태의 진단, 예방 또는 치료를 위한 것임을 특징으로 하는 의약 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 유전자 또는 DNA단편, 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 기재된 단백질, 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 단편, 제20항에 기재된 수용체, 또는 제22항 또는 제23항에 기재된 물질을 사용하는, 감염증 또는 호중구감소증을 포함하는 G-CSF와 관련된 질환또는 상태의 진단, 예방 또는 치료방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 유전자 또는 DNA단편, 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 기재된 단백질, 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 단편, 제20항에 기재된 수용체, 또는 제22항 또는 제23항에 기재된 물질의, 감염증 또는 호중구감소증을 포함하는 G-CSF와 관련된 질환 또는 상태의 진단, 예방 또는 치료를 위한 사용.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 유전자 또는 DNA단편, 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 기재된 단백질, 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 단편, 제20항에 기재된 수용체, 또는 제22항 또는 제23항에 기재된 물질의, 감염증 또는 호중구감소증을 포함하는 G-CSF와 관련된 질환 또는 상태의 진단, 예방 또는 치료용 의약의 제조에의 사용.