KR20010090874A - 인간 전립선 세포계를 사용한 암치료법 - Google Patents
인간 전립선 세포계를 사용한 암치료법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 인간의 전립선암 치료용 동종면역요법 약제로서 사용하기 위해 고안된 세포계의 특이 결합으로 이루어진 제품에 관한 것이다. 지금까지의 세포-기재 암 백신에 대한 연구는 하나의 공통된 특성, 즉 환자의 종양에 존재하는 항원을 공유하는 몇몇 TSAs 및/또는 TAAs를 최소한 함유하는 세포를 사용하는 것이다. 모든 경우에, 종양 세포는 오직 종양 세포가 적당한 TSAs 및/또는 TAAs를 함유하고, 세포의 조직 기원은 환자의 종양 부위에 매치되는 것을 전제로 하여 출발점으로서 사용된다. 본 발명의 제 1면은 동종 세포 암 백신의 기초로서 불멸화된 정상, 비-악성 세포를 사용하는 것이다. 정상 세포는 TSAs 또는 상당한 농도의 TAAs를 갖지 않기 때문에 정상 세포가 항-암 백신으로 작용한다는 것은 놀랍다. 예를 들면, 전립선 암의 경우, 백신은 전립선으로부터 유도된 하나의 불멸화된 정상 세포계 또는 다른 불멸화된 정상세포계들의 결합을 기초로 할 수 있다. 세포계는 포유동물 또는 인간에게 사용하기 전에, 복제부전을 확실히 하기 위해 50 내지 300 Gy에서 감마조사를 사용하여 치사적으로 조사된다.
Description
암세포는 정상적인, 암에 걸리지 않은 세포에 비해 정성 및 정량적, 공간적 및 일시적으로 많은 돌연변이를 함유하며, 이들 일부는, 병변세포가 성장 및 전이하는 특정 기간에 숙주의 면역 시스템에 의해 병적인 것으로 인식될 수 있다. 이와 같은 점은 숙주 면역 시스템의 힘을 이용하여 이것이 암세포를 공격하도록 함으로써 최소한 생명을 위협하지 않는 정도로 이상세포를 제거하는 면역요법을 개발하려는 세계적인 연구 활동을 무수히 일으켰다(Maraveyas, A. & Dalgleish, A.G. 1997,시토킨 네트워크의 역할에서의 백신 디자인에 대한 고체 종양의 활성면역요법, Ed. Gregoriadis et al., Plenum Press, NewYork, 129-145쪽; Morton, D.L. 및Ravindranath, M.H. 1996종양 면역학에서 흑종백신에 관한 현개념-면역요법 및 암 백신, ed. Dalgleish, A.G. 및 Browning, M., 캠브리지 대학 출판사, 241-268쪽. 더욱 상세한 것을 위해서는 이들 출판물의 다른 논문을 참조).
암 면역요법을 탐구하기 위한 많은 연구가 있어 왔고 이들은 다음의 다섯가지 분야로 분류될 수 있다.
비-특이 면역요법
비-특이적으로 면역 시스템을 자극시키기 위한 노력은 William Coley(Coley, W.B., 1894 '에리시필스(erisipeals) 및 바실루스 프로디고서스(Bacillus prodigosus)의 독소를 갖는 수술 불가능한 악성종양의 치료' Trans. Am. Surg. Assoc. 12:183)의 선구적 작업까지 한 세기를 거슬러간다. 비록 성공은 몇몇 경우(예를 들면, 방광암 치료용 BCG, 흑종 및 신장암 치료용 IL-2로 한정되지만, 비-특이 면역조정이 대부분의 암을 치료하는데 충분하다는 것을 증명할 수는 없다는 것이 잘 알려져 있다. 비-특이 면역-자극제는 일반적으로 면역반응의 상태를 강화시킬 수 있는 반면, 표적화능 및 또한 여러가지 메카니즘을 갖는 종양병변을 처리하기 위한 예민 및 면역학적 경계를 회피하고, 침범당하지 않게 하며 파멸하기 위한 유연성이 부족하다.
항체 및 단일클론성 항체
항체, 특히 단일클론성 항체 형태의 수동 면역요법은 항암제로서 중요한 연구 및 개발 주제이다. 원래는 그들의 특이성 때문에 매직 탄환(magic bullet)으로 불리우는 단일클론성 항체는 항체 자신에 대한 면역반응(그로 인한 그들의 활성이폐지됨) 및 혈액용기로 인한 병변에의 접근에 대한 항체의 무능력을 포함한 여러 원인 때문에 암 면역요법 분야에서 기대 만큼 생존하는데 실패한다. 현재까지 세개의 제품 즉,Panorex(글락소-윌컴사),Rituxan(IDEC/제넨텍/호프만 라 로쉐) 및Herceptin(제넨텍/호프만 라 로쉐)이 인간에게 사용하도록 약학적으로 등록되어 있으며, 현재 연구 및 개발중인 50개의 기타 프로젝트들이 있다. 항체들은 의태(면역학적 의미에서) 암항원에 나타나는 항-유전형 항체를 사용한 활성 면역요법에도 적용될 수 있다. 비록 개념은 우아하지만, 항체-기재 접근법의 효용은 궁극적으로 포유동물이나 인간의 환자의 암세포의 서브셋이 특정 항체에 의해 인식되는 항원을 돌연변이시키고 상실하며, 그것에 의해 더 이상 항체로 처리할 수 없는 암세포 개체군의 생장을 일으킬 수 있는 '면역학적 탈출' 현상에 의해 제한된다는 것이 증명될 것이다.
서브유니트 백신
전염성 질병 및 기타 분야용 백신에 대한 경험으로부터, 많은 연구인들은 암 세포와 배타적으로 또는 선택적으로 결합되는 항원, 즉 종양특이항원(TSA) 또는 종양결합항원(TAA)을 확인하고 이런 항원들 또는 이들의 단편을 특이활성 면역요법의 기초로서 사용하기 위한 탐구를 해왔다.
TAA 또는 TSA 범주에 속하는 것으로부터 유도된 단백질 또는 펩타이드를 확인하는 수 많은 방법이 있다. 예를 들면, 미분 디스플레이법(differential display techniques)을 이용하는 것이 가능하며, 이 방법에 의해 병변에서 배타적으로 또는 선택적으로 발현되는 RNA를 확인하기 위해 종양 조직과 이웃 정상 조직간의 RNA 발현을 비교하는 것이 가능하다. RNA 서열화는 특정 시간에 특정 조직에서 발현되는 몇몇 TAA 및 TSA를 확인하지만, 정해진 시간에서 TAA 또는 TSA를 확인하는 것은, 시간에 걸친 병변에서의 항원성 프로파일의 충분한 반영을 제공하지 못하며, 오직 병변의 "스냅"만을 나타내는 접근상의 잠재적 결함을 갖는다. 유사하게, cDNA의 세포독성 T 임파구(CTL) 클로닝 및 종양 조직의 발현-클로닝의 결합은, 특히 흑종에서 많은 TAA 및 TSA를 확인할 수 있게 한다. 접근법은 미분 디스플레이법과 같은 고유의 결점을 갖는데, 그것은 오직 하나의 TAA 또는 TSA의 확인이 임상적으로 적절한 항원 프로파일에 대해 알맞는 설명을 제공하지 않는다는 것이다.
50 개를 넘는 이와 같은 서브유니트 백신 접근법이 다양한 암을 치료하기 위해 개발 중에 있으나, 아직 인간에 대한 약물제품으로 승인을 받은 것은 없다. 상기의 항체-기재 접근과 유사한 방법으로, 서브유니트 백신은 면역학적 탈출 현상에 의해 역시 제한될 수 있다.
유전자 치료법
인간 개체에 대한 유전자 요법 시도의 대부분은 암치료 분야에 관한 것이며, 이중 상당한 부분은 환자의 면역 반응을 개시하고 증폭하도록 고안하고 있다. 상업적으로 개발된 것 중 현저한 것은, 인간 종양용으로 바이칼(Vical)사에 의해 개발되고 있는, 알로벡틴(Allovectin)-7과 루벡틴(Leuvectin), 전립선암 치료용으로 칼로이돈(Calydon)사에서 개발중인 CN706, 및 StressGen 사의 흑종 및 폐암 치료용 스트레스 단백질 유전자치료법이다. 현재, 이들 및 상업적 및 연구적으로 개발 중인 많은 기타 '면역-유전자 치료법'이 궁극적으로 성공한 시험이라고 판단하기에는너무 이르지만, 이들 접근의 상업적 효용성은 지난 10년보다 더 중요할 것이라는 것이 광범위하게 받아들여지고 있다.
세포-기재 백신
종양은 다음과 같은 여러 방법으로 면역 시스템을 방해하는 현저한 능력을 가진다. 잠재 표적 단백질 발현의 하향조절(downregualtion); 잠재 표적 단백질의 변성; 수용체 및 기타 단백질의 표면 발현의 하향조절; MHC 류 Ⅰ및 Ⅱ 발현의 하향조절에 의한 TAA 또는 TSA 팹티드의 직접 표현 불허; 면역성 결여를 일으키는 T-세포의 불완전 자극을 야기하는 보조자극 분자의 하향조절; 면역계에 미끼로 작용하도록 선택적, 비-표현 막 일부의 쉐딩(shedding); 면역계의 면역성을 결여시키는 선택막 일부의 쉐딩; 억제 분자의 분비; T-세포의 치사 유도; 및 기타 많은 방법. 명백한 것은, 신체내 종양의 면역학적 이형성 및 가소성이 유사하게 이형성을 표현하는 면역요법적 전략에 의해 어느정도 매치되어야 한다는 것이다. 암 면역요법으로서 전체 암세포, 또는 암세포 기원 유도체를 사용하는 것은, 바이러스성 질병에 대한 백신으로서 완전 비활성화된 또는 약화된 바이러스를 사용하는 것과 유사하게 고려될 수 있다. 잠재적 이점은
(a) 전세포는 상기와 같이 병변의 항원과 매치하기에 충분한 이형성의 항원성 프로파일을 제공하는, 넓은 범위의 항원을 함유한다.
(b) (즉, 복합 항원을 함유하는)다가이고, 면역학적 탈출의 위험이 감소된다 (암세포가 이들 항원 모두를 상실할 확률은 희박함).; 및
(c) 세포-기재 백신이, 아직 확인되어야 하는 TSAs및 TAAs을 포함한다; 그렇지 않다면, 현재 확인 안된 항원이 상대적으로 소수인 공지의 TSAs/TAAs보다 임상적으로 더 적당할 수 있는 가능성이 있다.
세포-기재 백신은 두가지 범주에 속한다. 첫째는, 자가이식 세포를 기초로, 환자에게서 생검을 분리하고, 인비트로에서 종양 세포를 배양시키고, 트란스펙션 및/또는 다른 수단으로 세포를 변형시키고, 세포를 조사(irradiation)하여 복제-부전시킨 다음, 세포를 다시 동일 환자에게 백신으로 접종하는 것을 포함한다. 비록 이 접근이 지난 10 년 동안 주목을 받아왔지만, 개별적으로 제조되는 이 치료법은 몇가지 이유로 인해 본질적으로 비실용적이라는 것이 명백하다. 이 방법은 많은 시간을 필요로 하고(종종 백신의 임상 1회 분량을 제조하는데 걸리는 시간이 환자의 예상 수명을 초과한다), 고가이며, '주문'제품으로서 표준화된 제품을 명기하는 것이 불가능하다(제품이 아닌, 방법만이 표준화 가능하며 그러므로 최적화 및 품질조절이 가능하다). 그 밖에, 자가이식 백신을 제조하기 위해 사용되는 종양 생검은, 이것을 어느정도 독특하게 만드는 성장특성, 상호작용 및 주변 조직과의 전달을 가질 것이다. 이것은 면역요법에서 자가이식 세포를 사용하는데 잠재적으로 중요한 결점을 암시한다: 초기 세포를 제공하는 생검은 당시 주변환경에서 종양의 면역학적 스냅을 나타내며, 이것은 질병 전체 진행에 걸쳐 주어질 수 있는 일관된 활성을 갖는 백신의 시간에 걸친 면역대표로서는 불충분할 것이다.
세포-기재 백신의 두번째 타입 및 본 발명의 주제는 유전적으로(및 면역학적으로) 환자에게 맞지 않는 동종 세포를 사용하는 것이다. 동종 세포는 자가이식 세포와 같이 다가인 동일한 장점으로 이익을 본다. 추가로, 동종 세포 백신은 인비트로에서 무한히 배양될 수 있는 불멸세포계를 기초로 할 수 있으므로, 본 접근은 자가이식 접근의 시간 및 비용상의 결점을 겪지 않는다. 유사하게, 동종 접근은 질병의 단계, 병변의 위치 및 잠재적 내성에 의한 개개의 질병 프로파일을 다른 치료법에 매치시킬 수 있는 세포 타입들의 결합물을 사용하는 기회를 제공한다.
세포-기재 암 백신의 사용에 관한 많은 보고서가 있다(예를 들면, Dranoff, G. et al. WO 93/06867; Gansbacher, P. WO 94/18995; Jaffee, E.M. et al. WO 97/24132; Mitchell, M.S. WO 90/03183; Morton, D.M. et al. WO 91/06866 을 참조). 이들 연구는 면역요법 항원으로서 암세포를 사용하는 기본 공정으로부터, GM-CSF, IL-2, 인터페론 또는 기타 면역학적-활성 분자를 생산하기 위한 세포의 트란스펙트까지의 일련의 변이 및 자살유전자의 사용을 포함한다. 그룹은 환자의 하프로타입(haplotype)에 HLA-매치 또는 부분적으로 매치되는 동종 세포계 및 흑종분야에서 환자의 하프로타입에 맞지 않고 또한 GM-CSF로 트란스펙트된 동종 전립선 세포계에 맞지 않는 동종 세포계를 사용한다.
본 발명은 암에 걸린 포유동물 또는 인간의 면역 시스템이 종양병변에 대해 공격을 취하도록 유도함으로써 (인간을 포함한) 포유동물의 1차, 변형 및 잔류 암을 치료하는 약제에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 전세포, 유도체 및 그들의 일부를, 백신 보조액 및/또는 기타 보조인자와 함께 또는 없이 사용하는 것에 관한 것이다. 더욱 특별하게는, 본 발명은 치료전략의 기본을 형성하는 전세포와 유도체 및 그들 일부의 특정 결합물의 사용을 기재한다.
도 1a 및 1b는 환자 112, 307 및 406의 T-세포 증식 데이타를 나타내는 도면이다.
도 2a 및 2b는 환자 115, 304 및 402의 혈청의 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타내는 도면이다.
도 3a 내지 3f는 환자 112, 305 및 402의 혈청의 항체 역가를 나타낸다.
도 4a 및 4b는 환자 110, 303 및 404의 PSA 데이타를 나타낸다.
도 5는 정상 흑혈구로 면역화된 C57마이스의 생존곡선을 나타낸다.
본 발명은 포유동물 및 인간의 암을 치료하기 위한 동종 면역요법 약제로서 사용되도록 고안된 세포계 또는 세포계들로 이루어진 제품에 관한 것이다.
현재까지의 세포-기재 암 백신에 대한 연구는 공통적인 특징, 즉 환자의 종양에 존재하는 항원에 공유되는 적어도 몇몇의 TSAs 및/또는 TAAs를 함유하는 세포를 사용하는 것이다. 각 경우에 있어서, 종양 세포는 관련 있는 TSAs 또는 TAAs를 함유할 것이라는 전제하에 출발점으로서 이용되며, 세포의 조직 기원은 환자의 종양 부위와 매치된다.
본 발명의 제 1면은 불멸화된, 정상의, 비-독성세포를 동종 세포 암 백신의 기초로 사용하는 것이다. 정상 세포는 TSAs 또는 적절한 농도의 TAAs를 갖지 않고, 그러므로 본 명세서에 기재된 것과 같은 정상세포는 항-암 백신으로서 효과적이다. 접근법은 일반적이며, 치료되어져야 할 종양과 동일한 특정조직으로부터 유도된 불멸 정상세포를 사용함으로써 어떠한 포유동물의 조직에도 매치될 수 있다. 불멸화된 정상세포는 계통분류학을 사용하여 당업자들에 의해 제조될 수 있거나 또는 ATCC 또는 ECACC와 같은 세포은행으로부터 얻을 수 있거나, 또는 본 분야의 여러 연구그룹으로부터 이용가능하다.
예를 들면, 전립선 암 백신은 Rhim, J.S. 및 Kung, H-F., 1997 Critical Rewiews in Oncogenesis 8(4): 305-328에서 검토되고 인용되거나, 또는 PNT1A(ECZCC Ref. No:95012614), PNT2(ECACC Ref. No:95012613) 또는 PZ-HPV-7(ATCC No.:CRL-2221)에서 선택된 방법을 사용하여 제조될 수 있는 전립선으로부터 유도된 불멸화된 정상 세포 하나 또는 다양한 불멸화된 정상세포의 결합물을 기초로 할 수 있다.
본 발명의 다른 면은 일차 또는 변성 전립선암 생검으로부터 유도된 하나, 두개 또는 세개의 다른 세포계와 함께 하나 이상의 불멸화된 정상세포계(들)의 결합에 의한 TSAs 및/또는 TAAs의 첨가이다.
모든 알맞는 세포계는 대규모 세포 배양 중 우수한 성장 및/또는 정량조절 및 증식생산을 허용하기 위한 충분한 특징을 나타낸다.
세포계는 이들의 확실한 복제부전을 위해 50 내지 300 Gy에서 감마선을 사용하여 방사선으로 치사량으로 조사된다.
상기의 세포계 및 결합은, 면역요법 약제로 사용하기 위해 운송 및 저장을 위해 냉동되어야 하며, 따라서 본 발명의 또 다른 면은 냉동보호액으로 제제화된 상기 세포들의 결합이다. 적당한 냉동보호액은 10-30 % v/v 글리세롤 수용액, 5-20 % v/v 디메틸술폭사이드 또는 5-20 % v/v 인간 혈청알부민을 포함할 수 있으나 이것으로 한정되는 것은 아니며, 단일 냉동보호액으로서 또는 결합물로서 사용될 수 있다.
본 발명의 추가의 구현예는, BCG 또는 M. Vaccae, 파상풍톡소이드, 디프테리아톡소이드, 보데텔라 파상풍, 인터로킨(interleukin)2, 인터로킨 12, 인터로킨 4, 인터로킨 7, 완전 프로인트 보조액, 불완전 프로인트 보조액 또는 기타 공지의 비특이 약제와 같은 비-특이 면역자극제를 갖는 세포계 결합을 사용하는 것이다. 장점은 세포계 결합이 그들의 하프로타입 미스매치를 통해 면역강화를 위해 첨가되며 그들의 특이 기원의 이형성의 결과로서 TAA 및 TSA의 다혈증에 대해 면역 반응을 표적하는 반면, 일반 면역 자극제는 일반적으로 강화된 면역상태를 생성한다는 것이다.
본 발명은 다음의 실시예 및 도면을 참조로 하여 기재될 것이다.
실시예 1
세포의 성장, 조사, 제제화 및 저장
정상 전립선 조직으로부터 유도된 불멸화된 세포계, 즉 PNT2를 2 mM L-글루타민과 배아 송아지 혈청(FCS) 5%가 추가된 RPMI 1640 배지 중에서 회전병배양으로 증식시킨 다음, 액체 질소 원료 중에서 회수하였다. T175 정적 플라스크에서 팽창시키고 세포를 회전병 당 세포 1-20 x 107로 성장 표면적 850 cm2으로 회전병에 심었다.
일차 전립선 조직에서 유도된 불멸 세포계, 즉 NIH1542-CP3TX를 보바인 뇌하수체제제 추출물 25 ㎍/㎖, 표피성장 인자 5 ng/㎖, L-글루타민 2 mM, HEPES 완충용액 10 mM, 배아 송아지 혈청(FCS) 5%(이하, "변형된 KSFM"으로 칭함)이 추가된 KSFM 배지중에서 회전병배양으로 증식시키고, 액체질소 원료중에서 회수하였다. T175 정적 플라스크에서 팽창시키고 세포를 회전병 당 세포 2-5 x 107을 증식표면적 1,700 cm2으로 회전병에 심었다.
또한, 두개의 이차 유도된 세포계, 즉 모두 ATCC 로부터 얻은 LnCap 및 Du145를 사용하였다. LnCap는 FCS 10% 및 L-글루타민 2 mM이 추가된 RPMI 배지 중의 큰 표면적 정적 플라스크에서 증식시켰고, 용기당 세포 1-10 x 106으로 심은 다음, 합류점 근처까지 증식시켰다. Du-145는 정적 플라스크에서 냉동 원료로부터 팽창시킨 후, 병당 세포 1-20 x 107로 850 cm2의 회전병에 심고, FCS 10 % 및 L-글루타민 2 mM에서 합류점까지 성장시켰다. 모든 세포계를 1 x 노말 농도의 트립신을 사용하여 수확하였다. DMEM에서 대량 세정 후, 세포를 농도 5-40 x 106세포/㎖로 재-현탁시키고 Co60소스를 사용하여 50-300 Gy에서 조사하였다. 그 다음, 세포를 DMSO 10 %, 인산염 완충살린 중의 인간 혈청 알부민 8%로 이루어진 냉동보호액 중에서 제제화하고, 사용할 때까지 액체 질소에서 세포농도 5-150 x 106세포/㎖로 냉동시킨다.
접종
호르몬 요법으로 치료하기 힘든, 혈청 PSA 수치 30 ng/㎖를 기준으로 전립선암 환자들을 선택하였다. 임상시험을 실시하기 위해 윤리적 허용 및 MCA(영국 Medicines Control Agency)허가를 얻었다.
세개의 접종 예정표 중 하나는 다음과 같았다.
| 투여된 세포계 | |||
| 투여 | 시도 A | 시도 B | 시도 C |
| 1,2 및 3 | PNT2 | Du145 | LnCap |
| 4 및 그 이후 | PNT2/Du145/NIH1542 | PNT2/Du145/LnCap | PNT2/NIH1542/LnCap |
세포를 환자에게 주사하기 전에 수조 37 ℃에서 천천히 가온시키고 미코박테리아 보조액과 혼합하였다. 접종은 네 개의 접종부위에서 피내에서 임파선 베이진으로 서서히 흘러나가도록 이루어졌다. 최소 투여간격은 2 주 였고, 대부분의 투여는 4 주 간격으로 이루어졌다. 첫번째 투여 전에, 및 이후의 몇몇 투여 전에, 환자들을 상기 접종 예정표에 리스트된 4개의 세포계에 대한 지연형 과민증(DTH)에 대해 시험하였다(모든 시험은 보조액 없이 0.8 x 106세포를 포함한다).
면역학적 반응 분석
(a)T-세포 증식 반응
왁진 주사가 접종 세포계로부터 유도된 항원을 인식하는 T-세포 개체군의 특이 팽창을 일으키는지를 결정하기 위해, 본 발명자들은 T-세포에 대한 증식 조사 및 전립선 세포계의 용해질에 의한 자극을 실시하였다. 진료소를 찾은 각 방문자들의 전혈을 추출하여 하기의 증식 조사를 기초로 BrdU(브로모디옥시우리딘) 중에서 사용하였다.
환자 BrdU 증식법
시약
RPMI 라이프 테크놀러지스, 페이즐리 스코들랜드
BrdU 시그마 케미칼 사, 풀, 도어셋
PharMlyse 35221E 파민겐, 옥스포드, 영국
시토픽스(Cytofix)/
시토펌(Cytoperm) 2090KZ "
Perm/세정완충액(x100) 2091KZ "
FICT 항-BrdU/Dnase 340649 벡톤 딕킨슨
PerCP 항-CD3 347344 "
Pe 항-CD4 30155X 파민겐
Pe 항-CD8 30325X "
FITC mu-lgG1 349041 벡톤 딕킨슨
PerCP lgG1 349044 "
PE lgG1 340013 "
방법
1) 혈액 1 ml를 RPMI 9 ml + L-gln 2 mM + PS + 2-Me 50 μM로 희석한다. 혈청은 첨가하지 않는다. 37 ℃에서 철야방치한다.
2) 다음날 아침, 희석시킨 혈액을 48-웰 플레이트의 웰로 450 ㎕ 부분표본시키고, 자극 용해질 50 ㎕를 첨가하였다. 용해질은 종양 세포(2 x 106세포 등가/ml)를 액체 질소중에서 냉동-해동시켜 제조한 다음, 필요할 때까지 부분표본 냉동으로 저장한다.
3) 세포를 37 ℃에서 5 일간 배양한다.
4) 제 5일 저녁에 50 ㎕의 BrdU @30 ㎍/ml를 첨가한다.
5) 각 시료 100 ㎕를 96-웰 둥근바닥 플레이트에 부분표본 시킨다.
6) 플레이트를 회전시키고 상등액은 버린다.
7)Pharmlyse100 ㎕를 사용하여 5분 동안 실온에서 적세포를 용해시킨다.
8) 시토픽스 50 ㎕로 두번 세정한다.
9) 회전시키고 가볍게 쳐서 상등액을 제거한다.
10) 실온에서 10분 동안 100 ㎕ Perm-세정수를 침투시킨다.
11) 최대 Perm-세정수 부피까지 보정 희석된 항체를 포함하는 항체 혼합물 30 ㎕를 첨가한다.
12) 암실에서 실온에서 30분 동안 배양한다.
13) 한번 세정하고 2% 파라포름알데히드 100 ㎕로 재현탁한다.
14) 이것을 분석을 위해 준비된 클러스터 튜브중의 FACSFlow 400 ㎕에 첨가한다.
15) FACScan으로 분석하고 3000 게이트된 씨디3 이벤트(3000 gated CD3 events)에서 저장한다.
자극용 6-웰 플레이트
| Nil | ConA | 1542 | LnCap | Du145 | Pnt2 | |
| PBL1 | ||||||
| PBL2 | ||||||
| PBL3 | ||||||
| PBL4 | ||||||
| PBL5 | ||||||
| PBL6 |
항체 염색용 96-웰 플레이트
| PBL1 | PBL2 | PBL3 | PBL4 | PBL5 | PBL6 | ||||||
| Nil A | 15 D | Nil A | 15 D | Nil A | 15 D | Nil A | 15 D | Nil A | 15 D | Nil A | 15 D |
| Nil D | 15 E | Nil D | 15 E | Nil D | 15 E | Nil D | 15 E | Nil D | 15 E | Nil D | 15 E |
| Nil E | Ln D | Nil E | Ln D | Nil E | Ln D | Nil E | Ln D | Nil E | Ln D | Nil E | Ln D |
| Con D | Ln E | Con D | Ln E | Con D | Ln E | Con D | Ln E | Con D | Ln E | Con D | Ln E |
| Con E | Du D | Con E | Du D | Con E | Du D | Con E | Du D | Con E | Du D | Con E | Du D |
| Du E | Du E | Du E | Du E | Du E | Du E | ||||||
| Pn D | Pn D | Pn D | Pn D | Pn D | Pn D | ||||||
| Pn E | Pn E | Pn E | Pn E | Pn E | Pn E |
설명:
A: lgG1-FITC(5 ㎕) lgG1-PE(5㎕) lgG1-PerCP(5 ㎕)
15 ㎕ MoAb+15 ㎕
D: BrdU-FITC(5 ㎕) CD4-PE(5 ㎕) CD3-PerCP(5 ㎕)
15 ㎕ MoAb+15 ㎕
E: BrdU-FITC(5 ㎕) CD8-PE(5 ㎕) CD3-PerCP(5 ㎕)
15 ㎕ MoAb+15 ㎕
15: NIH1542-CP3TX
Ln: LnCap
D: Du145
Pn: PNT2
Con: ConA 렉틴(양성 제어)
Nil: 자극 없음
증식 조사 결과를 도 1에 나타내었다. 여기서 CD4 또는 CD8 양성 T-세포에 대한 증식 인덱스를 여러가지 세포 용해질에 대해 플롯을 작성하였고, 증식 인덱스는 증식된 T-세포의 비율을 용해질이 없는 대조로 나누어 얻었다.
환자 번호 112 및 307 및 406에 대한 결과를 나타내었다. 4 개의 세포 용해질, 즉 NIH1542, LnCap, DU-145 및 PNT-2의 결과를 나타내었다. 전체적으로, 처치 환자의 50%는 적어도 하나의 세포계에 특이 증식반응을 얻었다.
(b)
환자의 혈청을 이용한 웨스턴 블롯(Western Blot)
웨스톤 블롯 분석을 위해 유사한 양의 단백질을 변성 SDS PAGE 겔에 놓을 수 있도록 표준화된 세포 용해질을 다수의 전립선 세포계로 준비하였다. 각 블롯에 분자량 표지, 및 NIH1542, LnCap, Du-145 및 PNT-2의 세포 용해질로부터 얻은 동일량의 단백질을 놓았다. 그 다음, 블롯을 접종 전, 및 접종 16주 후(4 내지 6회 투여)로부터 얻은 환자의 혈청으로 조사하였다.
방법
a)시료 제조(전립선 종양계)
ㆍ세포 펠렛을 PBS 중에서 3번 세정한다.
ㆍ용혈 완충용액 1 x 107세포/ml로 재현탁한다.
ㆍ액체 질소/물 욕조중에서 급속 냉동 해동 용해를 5회 반복시킨다.
ㆍ세포 부스러기를 제거하기 위해 1500 rpm에서 5 분동안 원심분리한다.
ㆍ막오염물질을 제거하기 위해 20,000 rpm에서 30 분간 초원심분리한다.
ㆍ200 ㎕로 부분표본하고 -80 ℃에서 저장한다.
b)전기영동법
ㆍ용해질을 래밀리(Laemelli) 시료 완충용액과 1: 1로 혼합하고 5분간 가열한다.
ㆍ시료 20 ㎍을 4-20 % 경사 겔 웰에 장전한다.
ㆍ겔을 200 V에서 35분 동안 Bjerrum 및 샤퍼-낼슨(Schafer-Neilson)트란스퍼 완충용액(SDS)중 작동시킨다.
c)웨스턴 전이
ㆍ겔, 니트로셀룰로스 막 및 블로팅 페이퍼를 전이 완충용액중에서 15분간 평형시킨다.
ㆍ반-건식 전기영동 전이 셀의 양극에 겔-니트로셀룰로스를 샌드위치 배열한다: 블로팅 페이퍼 2장, 니트로셀룰로스 막, 겔, 블로팅 페이퍼 2장
ㆍ음극을 적용하고 25 V에서 90 분동안 작동한다.
d) 단백질의 면역학적 검출
ㆍ니트로셀룰로스 막을 PBS/0.05% Tween 20 중의 5% Marvel로 4 ℃ 에서 철야로 블록한다.
ㆍ막을 PBS/0.05% Tween 20 중에서 두번 헹구고, 20분 동안 및 5 분 동안 두번 실온에서 진탕 플랫폼에서 세정한다.
ㆍ막을 진탕 플랫폼에서 투명화된 환자의 플라즈마의 1:20 희석액 중에서 실온에서 120분 동안 배양한다.
ㆍ상기와 같이 세정하고 추가로 5 분동안 최종 세정한다.
ㆍ막을 비오틴 항-인간 lgG 또는 lgM의 1: 250 희석액 중에서 진탕 플랫폼 위에서 실온에서 90분 동안 배양한다.
ㆍ상기와 같이 세정하고 추가로 5 분동안 최종 세정한다.
ㆍ막을 스트렙타비딘-호스라디쉬 퍼옥시다제(streptavidin-horserasdish peroxidase) 컨쥬게이트 1:1000 희석액 중에서 진탕 플랫폼 위에서 실온에서 60분 동안 배양한다.
ㆍ상기와 같이 세정한다.
ㆍ색 전개를 허용하기 위해 막을 디아미노벤지딘 퍼옥시다제 기질 중에서 5 분 동안 배양하고, 막을 물로 헹굼으로써 반응을 정지시킨다.
환자 112, 305 및 402에 대한 도 3의 결과는 16 주 기간 이상의 접종(4 내지 6회 투여)이 세포계 용해질에 대한 항체 역가 및 (DTH 시험과 다른)본 접종안에 받아들여지지 않은 용해질에 대한 교차 반응성을 증가시킬 수 있다는 것을 분명히 나타낸다.
(c)항체 역가 결정
ELISA 플레이트를 표준화된 세포계 용해질로 코팅하고 접종한 환자의 혈청에 대해 희석 연구를 실시하여 항체 역가를 결정하였다.
항-용해질 lgG를 갖는 ELISA용 방법
1. 플레이트를 용해질(@10 ㎍/ml) 50 ㎕/웰로 다음과 같이 희석하여 코팅한다.
용해질 단백질 농도 코팅농도 양/ml 5 ml중의 양/㎕
PNT2 2.5 mg/ml 10 ㎍/ml 3.89 ㎕ 19.4 ㎕
1542 4.8 mg/ml 10 ㎍/ml 2.07 ㎕ 10.3 ㎕
Du145 2.4 mg/ml 10 ㎍/ml 4.17 ㎕ 20.8 ㎕
LnCap 2.4 mg/ml 10 ㎍/ml 4.12 ㎕ 20.6 ㎕
2. 뚜겅을 덮고 철야로 4 ℃에서 배양한다.
3. PBS-Tween으로 2번 세정한다. 종이 타월로 두드려 건조시킨다.
4. PBS/10% FCS(100 ㎕/웰)로 블록한다.
5. 뚜겅을 덮고 실온에서 1시간(최소)동안 배양시킨다.
6. PBS-Tween으로 두번 세정한다.
7. 2-8 열에 PBS-10% FCS 100 ㎕를 첨가한다.
8. 1 열에 플라즈마 시료 200 ㎕를 첨가하고(PBS-10%FCS 100 중 1로 희석, 즉 플라즈마 10 ㎕를 PBS-10% FCS 990 ㎕에 첨가) 연속 100 ㎕ 희석액을 하기와 같이 내려놓는다. 기저 웰로부터 여분 100 ㎕를 버린다. 뚜껑을 덮고 냉장고에서 철야 배양한다.
9. 비오티닐화된 항체를 희석한다(Pharmingen;lgG 34162D). 최종농도 1 mg/ml (10 mls 중 20 ml)
10. 뚜껑을 덮고 실온에서 45 분동안 배양한다.
11. 상기와 같이 6번 세정한다.
12. 스트랩타비딘-HRP(Pharmingen, 13047E 0; 희석 1:1000(즉, 10 ml ->10 mls)를 희석한다,
13. 100 ml/웰을 첨가한다.
14. 실온에서 30분 동안 배양한다.
15. 8번 세정한다.
16. 100 ml 기질/웰을 첨가한다. 실온에서 10-80 분 전개한다.
17. 1M H2SO4100 ml를 첨가하여 색 반응을 중지시킨다.
18. A 405 nm에서 OD를 읽는다.
환자 112, 305 및 402에 대해 도 3에 나타낸 결과는 기준(0), 4주, 8주 및 16주에서의 항체 역가를 나타낸다. 데이타는 적어도 4회의 접종 후, 환자들은 세포계 용해질에 대한 항체역가 및 (DTH 투여를 제외한)본 발명의 접종 안에 받아들여지지 않은 세포계에 대한 교차-반응성이 증가했음을 나타낸다.
(d)PSA 수치 평가
백신을 수여받은 환자의 PSA 수치를 정기적으로 사용되는 임상키트를 사용하여, 실험하면서 접종 과정을 통해 기록하였다. 환자 110, 303 및 404에 대한 PSA 수치를 도 4에 나타내었고(수직축은 ng/ml 단위의 혈청 PSA이고, 수평층은 시간이며, 첫번째 시간점은 접종 프로그램의 개시를 나타낸다), PSA 수치는 하락 또는 부분적인 안정을 나타내는데, 이 환자군에서는 일반적으로는 종종 지수적으로 계속 상승한다. 환자 110의 결과는, 비록 PSA 수치가 방사선 요법 전에 상당히 떨어졌지만, 어느정도 골격통증을 경감시키기 위한 방사선 요법 처리에 의해 혼동된다.
실시예 2 :쥐의 흑종 보호 모델에서의 정상 흑혈구의 사용
공격 투여로서 B16.F10을 사용한 쥐 흑종의 접종 보호모델에 정상 흑혈구 세포계를 사용하였다. C57 마이스에 PBS, 5x 106조사된 K1735 동종 흑종세포 또는 5x 106조사된 Melan P1 자가이식 정상 흑혈구 세포를 Day-14 및 -7에 두번 접종을 제공하였다. Day 0에 1x 104B16.F10 세포로 공격하고, Day 10으로부터 매 3일 종양부피를 측정하였다. 종양 크기를 최대 면적을 가로질러 측정하고 종양이 1.5 x 1.5 cm까지 자라면 동물을 희생시켰다. 도 5는 Melan1P 세포의 접종이 이와 같은 특히 공격적인 쥐의 종양에 대해 어느정도 수준의 보호를 제공하는 것을 나타낸다.
Claims (23)
- 하나의 세포계는 정상조직으로부터 유도되고 다른 두개의 세포계는 종양조직으로부터 유도된 세개의 인간 전립선 세포계로 이루어진 전립선암 치료용 면역요법 약제.
- 하나의 세포계는 일차 종양으로부터 유도되고 다른 두개의 세포계는 두개의 다른 종양조직으로부터 유도된 세개의 인간 전립선 종양 세포계로 이루어진 전립선암 치료용 면역요법 약제.
- 세개의 세포계가 하나, 두개 또는 세개의 정상 조직(들)로부터 유도된 세개의 인간 전립선 세포계로 이루어진 전립선암 치료용 면역요법 약제.
- 두개의 세포계는 정상 조직으로부터 유도되고 나머지 세포계는 종양 부위로부터 유도된 세개의 인간 전립선 세포계로 이루어진 전립선암 치료용 면역요법 약제.
- 제 1항, 제 3항 및 제 4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 정상조직으로부터 유도된 세포계가 PNT1A(ECACC 참조번호: 95012614) 또는 PNT2(ECACC 참조번호: 95012613)로부터 선택되는 면역요법 약제.
- 제 1항, 제 2항 및 제 4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 종양조직(들)으로부터 유도된 세포계(들)가 NIH1519-CPTX, NIH1532-CP2TX, NIH1535-CP1TX, NIH1542-CP3TX, CA-HPV-10, LnCap, DU145 또는 PC3로부터 선택되는 면역요법 약제.
- 세개의 세포계, 즉 PNT2, NIH1542-CP3TX 및 DU145로 이루어진 전립선암 치료용 면역요법 약제.
- 세개의 세포계, 즉 PNT2, NIH1542-CP3TX 및 LnCap로 이루어진 전립선암 치료용 면역요법 약제.
- 세개의 세포계, 즉 PNT2, DU145 및 LnCap로 이루어진 전립선암 치료용 면역요법 약제.
- 제 1항 내지 제 9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 종양세포계가 50 내지 300 Gy에서 조사되는 면역요법 약제.
- 제 1항 내지 제 9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 종양세포계가 100 내지 150 Gy에서 조사되는 면역요법 약제.
- BCG 또는 M.Vaccae, 파상풍 톡소이드, 디프테리아 톡소이드, 보데텔라 백일해, 인터로킨 2, 인터로킨 12, 인터로킨 4, 인터로킨 7, 완전 프로인트 보조액, 불완전 프로인트 보조액 또는 기타 비-특이 보조액과 같은 미코박테리아 제제로부터 선택되는 백신 보조액과 결합된 제 1항 내지 제 11항 중 어느 하나의 항의 면역요법 약제로 이루어진 면역원성 조성물.
- BCG 또는 M.Vaccae와 같은 미코박테리아 제제로부터 선택되는 백신 보조액과 결합된 제 1항 내지 제 11항 중 어느 하나의 항의 면역요법 약제로 이루어진 면역원성 조성물.
- 제 1항 내지 제 13항 중 어느 하나의 항에 있어서, 세포가 단일 또는 결합 냉동보호액으로서, 글리세롤 수용액 10 내지 30 % v/v, 디메틸술폭사이드 5 내지 20 % v/v 또는 인간 혈청알부민 5 내지 20 % w/v를 포함하는, 그러나 이것으로 한정되지는 않는, 냉동보호액으로 제제화되는 면역요법 약제 또는 조성물.
- 제 1항 내지 제 13항 중 어느 하나의 항에 있어서, 세포가 디메틸술폭사이드 5-20 % v/v 및 인간 혈청알부민 5-20 % w/v를 결합된 상태로 포함하는 냉동보호액으로 제제화되는 면역요법 약제 또는 조성물.
- 제 1항 내지 제 15항 중 어느 하나의 항에 있어서, 면역 T-세포의 활성화를특징으로 하는 환자의 면역 반응을 유도하는 면역요법 약제 또는 조성물.
- 제 1항 내지 제 15항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항체 생산 유도를 특징으로 하는 환자의 면역 반응을 유도하는 면역요법 약제 또는 조성물.
- 제 1항 내지 제 15항 중 어느 하나의 항에 있어서, 전립선암 환자의 혈청 PSA 수치의 상승율 또는 하강율의 감소를 유도하는 면역요법 약제 또는 조성물.
- 제 1항 내지 제 18항 중 어느 하나의 항에 있어서, 피내 투여되는 면역요법약제 또는 조성물.
- 제 1항 내지 제 18항 중 어느 하나의 항에 있어서, 전립선내 투여되는 면역요법 약제 또는 조성물.
- 생리적으로 허용가능한 부형제, 보조액 또는 전달제와 함께 상기 항 중 어느 하나의 항의 약제를 포함하거나 또는 이루어진 전립선암 치료용 면역요법 백신 조성물.
- 상기 항 중 어느 하나의 항에 따른 약제 또는 조성물을 적당한 제형으로 1회 이상 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 전립선암의 예방 및 치료방법.
- 인간 전립선암의 치료용 약물 제조에 사용되는 제 1항 내지 제 11항 중 어느 하나의 항에 따른 약제.
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