PL201016B1

PL201016B1 - Czynniki immunoterapeutyczne do leczenia raka prostaty, immunogenna kompozycja, kompozycja szczepionki immunoterapeutycznej do leczenia raka prostaty i zastosowanie czynnika immunoterapeutycznego

Info

Publication number: PL201016B1
Application number: PL348828A
Authority: PL
Inventors: Angus George Dalgleish; Peter Michael Smith; Andrew Derek Sutton; Anthony Ian Walker
Original assignee: Onyvax Ltd
Priority date: 1998-12-10
Filing date: 1999-12-09
Publication date: 2009-02-27
Also published as: MXPA01005816A; ES2249046T3; JP2012021028A; WO2000033869A2; US20120164099A1; DE69927286D1; DE69927286T2; GB9827104D0; AU763485B2; KR20010090874A; NO327044B1; NZ512004A; EP1137422B1; HUP0104568A2; IL143296A; US6972128B1; US8034360B2; ZA200104164B; CZ20012032A3; NO20012634D0

Abstract

1. Czynnik immunoterapeutyczny do leczenia raka prostaty, znamienny tym, ze zawiera trzy ludzkie linie komórek prostaty, z których jedna pochodzi z prawid lowej tkanki, a dwie inne linie pocho- dz a z tkanek nowotworowych. 2. Czynnik immunoterapeutyczny wed lug zastrz. 1, znamienny tym, ze linie pochodz ace z pra- wid lowej tkanki s a wybrane z PNT1A (ECACC Nr ref. 95012614) i PNT2 (ECACC Nr ref. 95012613). 3. Czynnik immunoterapeutyczny wed lug zastrz. 1, znamienny tym, ze linia (linie) pochodz a- ca(e) z tkanki nowotworowej jest/s a wybrana(e) z NIH1519-CPTX, NIH1532-CPT2TX, NIH1535- -CP1TX, NIH1542-CP3TX, CA-HPV-10, LnCap, DU145 i PC3. 4. Czynnik immunoterapeutyczny do leczenia raka prostaty, wed lug zastrz. 1, znamienny tym, ze zawiera trzy linie komórkowe, a mianowicie PNT2, NIH1542-CP3TX i DU145. 5. Czynnik immunoterapeutyczny do leczenia raka prostaty, wed lug zastrz. 1, znamienny tym, ze zawiera trzy linie komórkowe, a mianowicie PNT2, NIH1542-CP3TX i LnCap. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są czynniki immunoterapeutyczne do leczenia raka prostaty, immunogenna kompozycja, kompozycja szczepionki immunoterapeutycznej do leczenia raka prostaty i zastosowanie czynnika immunoterapeutycznego. Niniejszy wynalazek dotyczy czynników do leczenia pierwotnych, przerzutowych i resztkowych raków u ssaków (w tym u ludzi) przez indukcję układu odpornościowego ssaka lub człowieka dotkniętego rakiem, aby wywołać atak na uszkodzenie nowotworowe. W szczególności wynalazek dotyczy stosowania całych komórek z lub bez adiuwantów szczepionkowych i/lub innych czynników dodatkowych.

Wiadomo, że komórki rakowe zawierają liczne mutacje, ilościowe i jakościowe, przestrzenne i czasowe, względem swoich prawidłowych, nierakowych odpowiedników i że w niektórych okresach w czasie wzrostu komórek rakowych i ich rozprzestrzeniania, część z nich jest rozpoznawana przez układ odpornościowy gospodarza jako nieprawidłowe. Doprowadziło to do licznych wysiłków badawczych na całym świecie zmierzających do opracowania immunoterapii, które zaprzęgają siłę układu odpornościowego gospodarza i kierują go do ataku na komórki rakowe, w ten sposób eliminując takie wadliwe komórki przynajmniej do poziomu, który nie stanowi zagrożenia dla życia (przegląd w Maraveyas, A. i Dalgleish, A.G. 1977 Active immunotherapy for solid tumours in vaccine design w The Role of Cytokine Networks, red. Gregoriadis i wsp., Plenum Press, New York str. 129-145; Morton D.L. i Ravindranath, M.H. 1996 Current concepts concerning melanoma vaccines in Tumor Immunology - Iimmunotherapy and Cancer Vaccines red. Dagleish, A.G. i Browning M. Cambridge University Press str. 241-268, (Dla dalszych szczegółów zobacz też inne prace w tych publikacjach).

Przyjęto liczne podejścia w poszukiwaniu immunoterapii nowotworów, i można je sklasyfikować w pię ciu kategoriach:

Niespecyficzna immunoterapia

Próby stymulacji układu odpornościowego w sposób niespecyficzny sięgają wstecz ponad wiek do pionierskich prac Williama Coleya (Coley W.B., 1894 Treatment of inoperable malignant tumours with toxins of erisipelas and Bacillus prodigosus. Trans. Am. Surg. Assoc. 12: 183). Choć uzyskano powodzenie w ograniczonej liczbie przypadków (np. BCG do leczenia raka pęcherza moczowego, IL-2 do leczenia czerniaka i raka nerki), przyznaje się szeroko, że jest mało prawdopodobne, że niespecyficzna immunomodulacja będzie wystarczająca do leczenia większości nowotworów. Podczas gdy niespecyficzne stymulatory układu odpornościowego mogą doprowadzić do ogólnego zwiększonego stanu odpowiedzi immunologicznej, brak im zdolności adresowania i również swoistości by reagować uszkodzeniami rakowymi, które mają wiele mechanizmów i plastyczności by się ewakuować, być opornymi i zwalczać nadzór immunologiczny.

Przeciwciała i przeciwciała monoklonalne

Immunoterapia bierna w postaci przeciwciał i w szczególności przeciwciał monoklonalnych była przedmiotem poważnych badań i opracowań jako czynnika przeciwnowotworowego. Początkowo okrzyczane jako magiczne kule ze względu na ich niesłychaną czułość, przeciwciała monoklonalne nie spełniły oczekiwań w dziedzinie immunoterapii nowotworów z szeregu przyczyn, w tym, odpowiedzi immunologicznych na same przeciwciała (w ten sposób niszcząc ich aktywność) i niezdolności przeciwciała do dostania się do uszkodzenia przez naczynia krwionośne. Dotychczas zarejestrowano trzy produkty jako farmaceutyki do stosowania u ludzi, a mianowicie Panorex (Glaxo-Wellcome), Rituxan (IDEC/Genentech/Hoffman la Roche) i Herceptin (Genentech/Hoffman la Roche) z ponad 50 innymi projektami w stadiach badań i rozwoju. Przeciwciała mogą być też stosowane w aktywnej immunoterapii wykorzystującej przeciwciała antyidiotypowe, które jak się okazało naśladują (w znaczeniu immunologicznym) antygeny rakowe. Choć koncepcja ta jest elegancka, użyteczność podejść opartych na przeciwciałach może w końcu okazać się ograniczona przez zjawisko „ucieczki immunologicznej”, gdzie podzbiór komórek rakowych u osobnika ludzkiego lub ssaka mutuje się i traci antygen rozpoznawany przez konkretne przeciwciało i w ten sposób może prowadzić do wyrastania populacji komórek rakowych, których nie można już leczyć tym przeciwciałem.

Szczepionki podjednostkowe

W oparciu o doś wiadczenia ze szczepionkami na choroby zakaź ne i w innych dziedzinach, wielu naukowców starało się zidentyfikować antygeny, które są wyłącznie lub preferencyjne związane z komórkami rakowymi, a mianowicie antygeny specyficzne w stosunku do guzów (tumour specific antigens -TSA) lub antygeny związane z guzami (tumour associated antigens -TAA) i zastosować takie antygeny lub ich frakcje jako podstawę do specyficznej aktywnej immunoterapii.

PL 201 016 B1

Istnieją liczne sposoby identyfikacji białek lub pochodzących od nich peptydów, które należą do kategorii TAA lub TSA. Na przykład, możliwe jest stosowanie technik różnicowej prezentacji, gdzie porównuje się ekspresję RNA między tkanką guza i przyległą prawidłową tkanką w celu zidentyfikowania RNA, które są wyłącznie lub preferencyjnie wyrażane w uszkodzeniu. Przy pomocy sekwencjonowania RNA zidentyfikowano kilka TAA i TSA, które są wyrażane w tej specyficznej tkance w tym specyficznym momencie, ale niedociągnięcie tego podejścia polega właśnie na tym, że identyfikacja TAA lub TSA przedstawia tylko „fotografię” uszkodzenia w danym momencie, co może nie stanowić odpowiedniego odbicia profilu antygenowego uszkodzenia w czasie. Podobnie kombinacja klonowania cytotoksycznych limfocytów T (CTL) i klonowania ekspresyjnego cDNA z tkanki nowotworowej doprowadziła do identyfikacji wielu TAA i TSA, szczególnie dla czerniaka. To podejście cierpi na tę samą wewnętrzną słabość jak techniki różnicowej prezentacji, że identyfikacja jednego lub więcej TAA lub TSA może nie dostarczyć odpowiedniej reprezentacji klinicznie istotnego profilu antygenów.

Obecnie w trakcie opracowywania znajduje się ponad pięćdziesiąt takich szczepionek podjednostkowych do leczenia szerokiego zakresu raków, choć żadna jeszcze nie uzyskała zezwolenia na sprzedaż jako produkt farmaceutyczny do stosowania u ludzi. W podobny sposób do opisanego powyżej dla podejść opartych na przeciwciałach szczepionki podjednostkowe mogą być też ograniczone przez zjawisko ucieczki immunologicznej.

Terapia genowa

Większość prób terapii genowej u ludzi przeprowadzono w dziedzinie leczenia nowotworów i znaczna część z nich była zaprojektowana by wywoływać i/lub podwyższać odpowiedzi immunologiczne pacjentów. Na szczególną uwagę spośród preparatów handlowych zasługują Allovectin-7 i Leuvectin, opracowane przez Vical Inc dla wielu ludzkich guzów, CN706 opracowana przez Calydon Inc. do leczenia raka prostaty i terapia genem białka stresu SressGen Inc dla czerniaka i raka płuc. Obecnie jest za wcześnie, by stwierdzić, czy te i wiele innych immunogennych terapii opracowanych przez jednostki handlowe lub akademickie w końcu okażą się skuteczne, ale jest szeroko przyjęte, że zastosowanie handlowe tych podejść może być odległe o ponad dziesięć lat.

Szczepionki oparte na komórkach

Guzy mają niezwykłą zdolność do przeciwdziałania układowi immunologicznemu różnymi sposobami obejmującymi obniżenie ekspresji potencjalnych docelowych białek, mutację potencjalnych docelowych białek, obniżenie powierzchniowej ekspresji receptorów i innych białek, obniżenie ekspresji MHC klasy I i II, w ten sposób uniemożliwiając bezpośrednią prezentację peptydów TAA lub TSA; obniżenie poziomu kostymulujących cząsteczek prowadzące do niepełnej stymulacji limfocytów T, co prowadzi do anergii; zrzucanie wybranych, niereprezentatywnych części błony, aby działały jako przynęty dla układu immunologicznego, zrzucanie wybranych części błony w celu anergizacji układu immunologicznego, sekrecję hamujących cząsteczek, indukcję śmierci limfocytów T i wiele innych sposobów. Jest jasne, że immunologiczna heterogenność i plastyczność guzów w organizmie będzie w jakimś stopniu musiała być dopasowana do stopnia strategii immunologicznych o podobnej heterogenności. Zastosowanie całych komórek rakowych, lub ich surowych pochodnych, jako immunoterapii raka może być postrzegane jako analogiczne do stosowania całych inaktywowanych lub atenuowanych wirusów jako szczepionek przeciwko chorobom wirusowym. Potencjalne korzyści to:

(a) całe komórki zawierają szeroki zakres antygenów, dostarczając profilu antygenowego o dostatecznej heterogenności, aby dostosować się do uszkodzeń, jak opisano powyżej;

(b) są multiwalentne (tzn. zawierają wiele antygenów), co obniża ryzyko ucieczki immunologicznej (prawdopodobieństwo, że komórki rakowe „stracą” wszystkie z tych antygenów jest odległe) i (c) szczepionki oparte na komórkach obejmują TSA i TAA, które jeszcze nie zostały zidentyfikowane jako takie i jest możliwe, że obecnie niezidentyfikowane antygeny będą bardziej odpowiednie klinicznie niż stosunkowo mała liczba znanych TSA/TAA.

Szczepionki oparte na komórkach dzielą się na dwie kategorie. Pierwsza, oparta na komórkach autologicznych, obejmuje pobranie biopsji od pacjenta, hodowlę komórek guza in vitro, modyfikację komórek przez transfekcję i/lub innymi sposobami, napromienienie komórek, by uczynić je niezdolnymi do replikacji i następnie wstrzyknięcie komórek z powrotem temu samemu pacjentowi jako szczepionkę. Chociaż to podejście cieszy się dużym zainteresowaniem w ciągu ostatniej dekady, staje się coraz bardziej oczywiste, że ta indywidualnie dopasowana terapia jest zasadniczo niepraktyczna z kilku przyczyn. Podejście jest czasochłonne (często czas wymagany do produkcji klinicznych dawek szczepionki przekracza oczekiwany czas życia pacjenta), kosztowne, i jako produkt „zamawiany” nie jest możliwe określenie standaryzowanego produktu (tylko procedura, nie produkt może być standary4

PL 201 016 B1 zowana, a więc optymalizowana i poddana kontroli jakości). Co więcej, biopsja guza stosowana do przygotowania szczepionki autologicznej będzie miała pewne cechy wzrostowe, interakcje i komunikowanie z otaczającą tkanką, która czyni ją w pewien sposób unikalną. To dotyczy potencjalnej wady stosowania autologicznych komórek do immunoterapii: biopsja, która dostarcza pierwotnych komórek stanowi immunologiczne zdjęcie guza, w tym środowisku, w tym momencie, a to może być niewystarczające jako immunologiczna reprezentacja w czasie w celu uzyskania szczepionki z utrzymującą się aktywnością, która może być podawana w czasie całego przebiegu choroby.

W drugim typie szczepionki opartej na komórkach, która jest przedmiotem niniejszego wynalazku używa się komórek allogenicznych, które mają być genetycznie (a więc immunologicznie) niedopasowane do pacjentów. Allogeniczne komórki korzystają z tych samych zalet multiwalencji jak komórki autologiczne. Dodatkowo, ponieważ komórki allogeniczne mogą być oparte na unieśmiertelnionych liniach komórkowych, które można hodować w nieskończoność in vitro, zatem podejście to nie ma wady podejść autologicznych długotrwałego czasu produkcji i kosztów. Podobnie podejście allogeniczne oferuje możliwość stosowania kombinacji typów komórek, które mogą być dopasowane do profilu choroby danej osoby pod względem stadium choroby, lokalizacji uszkodzenia i potencjalnej oporności na inne terapie.

Istnieją liczne opublikowane raporty o użyteczności szczepionek rakowych opartych na komórkach (zobacz na przykład Dranoff, G. i wsp. WO 93/06867; Gansbacher, P. WO 94/18995; Jaffee, E.M. i wsp. WO 97/24132; Mitchell, M.S. WO 90/03183; Morton, D.M. i wsp. WO 91/06866). Badania te obejmują zakres wariantów podstawowej procedury stosowania komórek rakowych jako antygenu do immunoterapii, do transfekcji komórek do wytwarzania GM-CSF, IL-2, interferonów lub innych immunologicznie czynnych cząsteczek i stosowanie genów „samobójców”. Naukowcy stosowali allogeniczne linie komórkowe, które są dopasowane lub częściowo dopasowane pod względem HLA do haplotypu pacjentów i także linie komórek allogenicznych, które są niedopasowane do haplotypu pacjentów w dziedzinie czerniaka i także niedopasowane allogeniczne linie komórek prostaty transfekowane GM-CSF.

Ujawniony tu wynalazek dotyczy czynnika immunoterapeutycznego do leczenia raka prostaty, który zawiera trzy ludzkie linie komórek prostaty, z których jedna pochodzi z prawidłowej tkanki, a dwie inne linie pochodzą z tkanek nowotworowych.

Korzystnie linie pochodzące z prawidłowej tkanki są wybrane z PNT1A (ECACC Nr ref. 95012614) i PNT2 (ECACC Nr ref. 95012613), a linia (linie) pochodząca(e) z tkanki nowotworowej jest/są wybrana(e) z NIH1519-CPTX, NIH1532-CPT2TX, NIH1535-CP1TX, NIH1542-CP3TX, CAHPV-10, LnCap, DU145 i PC3.

Korzystny czynnik immunoterapeutyczny zawiera trzy linie komórkowe, a mianowicie PNT2, NIH1542-CP3TX i DU145, lub PNT2, NIH1542-CP3TX i LnCap, lub PNT2, DU145 i LnCap.

W zakres wynalazku wchodzi też czynnik immunoterapeutyczny do leczenia raka prostaty, który zawiera trzy ludzkie linie komórek prostaty, z których jedna pochodzi z tkanki pierwotnego nowotworu, a dwie inne pochodzą z dwóch róż nych tkanek nowotworowych.

Korzystnie czynnik ten obejmuje linię (linie) pochodzącą(e) z tkanki nowotworowej, która(e) jest/są wybrana(e) z NIH1519-CPTX, NIH1532-CPT2TX, NIH1535-CP1TX, NIH1542-CP3TX, CA-HPV-10, LnCap, DU145 i PC3.

Wynalazek dotyczy też czynnika immunoterapeutycznego, który zawiera trzy ludzkie linie komórek prostaty, które pochodzą z jednej, dwóch lub trzech prawidłowych tkanek.

Korzystnie linie pochodzące z prawidłowej tkanki są wybrane z PNT1A (ECACC Nr ref. 95012614) i PNT2 (ECACC Nr ref. 95012613).

Ponadto wynalazek dotyczy czynnika immunoterapeutycznego do leczenia raka prostaty zawierającego trzy ludzkie linie komórek prostaty, z których dwie pochodzą z prawidłowej tkanki, a pozostała linia komórkowa pochodzi z miejsca guza.

Korzystnie linie pochodzące z prawidłowej tkanki są wybrane z PNT1A (ECACC Nr ref. 95012614) i PNT2 (ECACC Nr ref. 95012613), a linia (linie) pochodząca(e) z tkanki nowotworowej jest/są wybrana(e) z NIH1519-CPTX, NIH1532-CPT2TX, NIH1535-CP1TX, NIH1542-CP3TX, CA-HPV-10, LnCap, DU145 i PC3.

Korzystnie linie komórkowe nowotworowe we wszystkich czynnikach według wynalazku, które je zawierają, były napromieniane przy 50 do 3000 do 150 Gy, korzystnie przy 100 do 150 Gy.

Korzystnie komórki we wszystkich czynnikach są sformułowane z roztworem środka kriokonserwującego obejmującego, ale nie wyłącznie, 10-30% obj./obj. wodnego roztworu glicerolu, 5-20%

PL 201 016 B1 obj./obj. sulfotlenku dimetylu lub 5-20% wag./obj. ludzkiej albuminy surowiczej jako pojedynczych środków kriokonserwujących albo w kombinacji, lub komórki są sformułowane z roztworem środka kriokonserwującego obejmującego kombinację 5-20% obj./obj. sulfotlenku dimetylu i 5-20% wag./obj. ludzkiej albuminy surowiczej. Korzystnie czynniki te indukują odpowiedź immunologiczną u pacjentów charakteryzującą się aktywacją limfocytów odpornościowych T lub indukcją produkcji przeciwciał. Korzystnie czynniki są w postaci do podawania przez skórę, lub w postaci do podawania do prostaty.

W zakres wynalazku wchodzi ponadto immunogenna kompozycja, która zawiera czynnik immunoterapeutyczny według wynalazku sprzężony z adiuwantem szczepionkowych wybranym z preparatów mykobakteryjnych, takich jak BCG lub M. Vaccae, toksoidu tężca, toksoidu dyfterytu, Bordetella pertussis, interleukiny 2, interleukiny 12, interleukiny 4, interleukiny 7, całkowitego adiuwanta Freunda, niecałkowitego adiuwanta Freunda lub innych niespecyficzne czynników adiuwantowych.

Korzystnie adiuwant szczepionkowy jest wybrany z preparatów mykobakteryjnych, takich jak BCG lub M. Vaccae.

Korzystnie komórki w immunogennej kompozycji wg wynalazku są sformułowane z roztworem środka kriokonserwującego obejmującego, ale nie wyłącznie, 10-30% obj./obj. wodnego roztworu glicerolu, 5-20% obj./obj. sulfotlenku dimetylu lub 5-20% wag./obj. ludzkiej albuminy surowiczej jako pojedynczych środków kriokonserwujących albo w kombinacji, lub komórki są sformułowane z roztworem środka kriokonserwującego obejmującego kombinację 5-20% obj./obj. sulfotlenku dimetylu i 5-20% wag./obj. ludzkiej albuminy surowiczej.

Korzystnie immunogenna kompozycja indukuje odpowiedź immunologiczną u pacjentów charakteryzującą się aktywacją komórek odpornościowych T lub korzystnie immunologiczna kompozycja jest w postaci do podawania przez skórę, lub w postaci do podawania do prostaty.

Wynalazek ponadto dotyczy kompozycji szczepionki immunoterapeutycznej do leczenia raka prostaty, która zawiera lub składa się z czynnika według wynalazku razem z fizjologicznie dopuszczalną zaróbką, adiuwantem lub nośnikiem.

W zakres wynalazku wchodzi też zastosowanie czynnika według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia raka prostaty u ludzi.

Dotychczas wszystkie badania szczepionek przeciwrakowych opartych na komórkach mają jedną wspólną cechę, a mianowicie, zamiar stosowania komórek, które zawierają przynajmniej niektóre TSA i/lub TAA, które są wspólne dla antygenów obecnych w guzach pacjenta. W każdym przypadku komórki guza są stosowane jako punkt wyjścia w oparciu o założenie, że tylko komórki guza będą zawierały odpowiednie TSA lub TAA i pochodzenie tkankowe komórki jest dopasowywane do miejsca guza u pacjentów.

Pierwotnym aspektem wynalazku jest stosowanie unieśmiertelnionych prawidłowych niezłośliwych komórek jako podstawy allogenicznej szczepionki przeciw rakowi. Prawidłowe komórki nie posiadają TSA lub odpowiednich stężeń TAA i zatem nieoczekiwane jest, że prawidłowe komórki, jak tu opisane, są skuteczne jako szczepionki przeciwrakowe. Podejście jest ogólne i może być dopasowane do dowolnego guza ssaka przez zastosowanie unieśmiertelnionych prawidłowych komórek pochodzących z tej samej tkanki jak guz, który ma być leczony. Unieśmiertelnione prawidłowe komórki mogą być przygotowane przez specjalistów przy użyciu opublikowanych metodologii, lub mogą być uzyskane z banków komórek, takich jak ATCC lub ECACC, lub są dostępne od kilku grup badawczych w tej dziedzinie.

Dla raka prostaty, na przykład, szczepionka może być oparta na jednej lub kombinacji różnych unieśmiertelnionych prawidłowych linii komórkowych wyprowadzonych z prostaty, które mogą być przygotowane przy użyciu metod opisanych i cytowanych w Rhim, J.S. i Kung, H.F. 1997 Critical Reviews in Oncogenesis 8(4): 305-328 lub wybranych z PNT1A (ECACC Nr ref. 95012614), PNT2 (ECACC Nr ref. 95012613) lub PZ-HPV-7 (ATCC Numer CRL-2221).

Dalszym aspektem wynalazku jest dodanie TSA i/lub TAA przez kombinację jednej lub więcej unieśmiertelnionych prawidłowych linii komórkowych z jedną, dwiema lub trzema różnymi liniami komórkowymi pochodzącymi z biopsji raków pierwotnych lub przerzutów.

Wszystkie odpowiednie linie komórkowe będą wykazywały dobry wzrost w hodowli komórkowej na dużą skalę i wystarczającą charakteryzację, by pozwolić na kontrolę jakości i powtarzalną produkcję.

Linie komórkowe są napromieniane śmiertelnie promieniowaniem gamma przy 50-300 Gy aby zapewnić, że nie są zdolne do replikacji przed użyciem u ssaka lub człowieka.

Linie komórkowe i kombinacje podane powyżej, aby były przydatne jako czynniki immunoterapeutyczne, muszą być zamrożone by umożliwić ich transport i przechowywanie, tak więc dalszym

PL 201 016 B1 aspektem wynalazku jest dowolna kombinacja komórek opisanych powyżej sformułowana z roztworem środka kriokonserwującego. Środki kriokonserwujące obejmują, ale nie wyłącznie 10-30% obj./obj. wodny roztwór glicerolu, 5-20% obj./obj. sulfotlenek dimetylu lub 5-20% wag./obj. ludzką albuminę surowiczą do stosowania albo jako pojedynczy środek krioochronny albo w kombinacji.

Dalszym wykonaniem wynalazku jest stosowanie linii komórkowej w połączeniu z niespecyficznymi stymulatorami immunologicznymi takimi jak BCG lub M. Vaccae, toksoid tężca, toksoid dyfterytu, Bordetella pertussis, interleukina 2, interleukina 12, interleukina 4, interleukina 7, całkowity adiuwant Freunda, niecałkowity adiuwant Freunda lub inne niespecyficzne czynniki znane w dziedzinie. Zaletą jest, że ogólne stymulatory immunologiczne tworzą ogólnie wzmożony stan immunologiczny, podczas gdy kombinacje linii komórkowych zarówno poprawiają wzmożenie immunologiczne przez niedopasowanie haplotypu i adresują odpowiedź immunologiczną na szereg TAA i TSA w wyniku heterogenności ich specyficznego pochodzenia.

Wynalazek będzie obecnie zilustrowany przez odniesienie do następujących przykładów i Figur, w których:

Na Figurze 1 przedstawiono dane proliferacji limfocytów T dla pacjentów 112, 307 i 406;

Na Figurze 2 przedstawiono analizę typu Western surowicy od pacjentów 115, 304 i 402;

Na Figurze 3 przedstawiono miana przeciwciał surowicy od pacjentów 112, 305 i 402.

Na Figurze 4 przedstawiono dane PSA dla pacjentów 110, 303 i 404 i

Na Figurze 5 przedstawiono krzywe przeżycia dla myszy C57 immunizowanych prawidłowymi melanocytami.

P r z y k ł a d 1

Wzrost, napromienienie, formułowanie i przechowywanie komórek

Unieśmiertelnioną linię komórkową wyprowadzoną z prawidłowej tkanki prostaty, a mianowicie PNT2, hodowano w walcowatej butelce w podłożu RPMI 1640 uzupełnionym 2 mM L-glutaminą i 5% płodową surowicą cielęcą (FCS) po odzyskaniu z zamrożonej w ciekłym azocie hodowli. Po namnożeniu w statycznych kolbach T175 komórki wysiewano do walcowatych butelek z powierzchnią do wzrostu 850 cm² przy 1-20 x 10⁷ komórek na butelkę.

Unieśmiertelnioną linię komórkową pochodzącą z pierwotnej tkanki prostaty, a mianowicie

NIH1542-CP3TX, hodowano w walcowatej butelce w podłożach KSFM uzupełnionych 25 μg/ml wyciągu z przysadki bydlęcej, 5 ng/ml nabłonkowego czynnika wzrostu, 2 mM L-glutaminą, 10 mM buforem HEPES i 5% płodową surowicą cielęcą (FCS) (dalej określanych jako „zmodyfikowane KSFM”) po odzyskaniu z zamrożonej w ciekłym azocie hodowli. Po namnożeniu w statycznych kolbach T175 komórki zaszczepiano do butelek do rolera z powierzchnią do wzrostu 1700 cm² przy 2-5 x 10⁷ komórek na butelkę do rolera.

Stosowano także dwie wtórne wyprowadzone linie komórkowe, a mianowicie LnCap i Du145, obie uzyskane z ATCC. LnCap hodowano w kolbach statycznych o dużej powierzchni w podłożach RPMI uzupełnionych 10% FCS i 2 mM L-glutaminą po zaszczepieniu przy 1-10x10⁶ komórek na kolbę i następnie hodowano prawie do konfluencji. Du-145 rozhodowywano z zamrożonych hodowli w kolbach statycznych, a następnie zaszczepiano do 850 cm² butelek do rolera przy 1-20 x 10⁷ komórek/butelkę i hodowano do konfluencji w podłożu DMEM zawierającym 10% FCS i 2 mM L-glutaminę. Wszystkie linie komórkowe zbierano stosując trypsynę w stężeniu 1 x normalnym. Po starannym płukaniu w DMEM komórki ponownie zawieszano w stężeniu 5-40 x 10⁶ komórek/ml i napromienione przy 50-300 Gy stosując źródło Co⁶⁰. Po napromienieniu komórki formułowano w roztworze do kriokonserwacji złożonym z 10% DMSO, 8% ludzkiej albuminy surowiczej w buforowanej fosforanem soli fizjologicznej i zamrażano w ciekłym azocie przy stężeniu komórek 5-150 x 10⁶ komórek/ml do momentu użycia.

Szczepienia

Wybrano pacjentów chorych na raka prostaty jako opornych na terapię hormonalną z poziomem PSA w surowicy przynajmniej 30 ng/ml. Wystąpiono o zezwolenie etyczne i MCA (UK Medicines Control Agency - Brytyjska Agenda Kontroli Leków) do przeprowadzenia tej próby i uzyskano je.

Dla każdej wersji próby zastosowano jeden z trzech schematów szczepienia:

	Podane linie komórkowe
Dawka	Wersja próby A	Wersja próby B	Wersja próby C
1, 2 i 3	PNT2	Du145	Ln Cap
4 i dalsze	PNT2/Du145/NIH154 2	PNT2/Du145/LnCap	PNT2/NIH1542/LnCap

PL 201 016 B1

Komórki podgrzewano delikatnie w łaźni wodnej w 37°C i mieszano z adiuwantem mykobakteryjnym przed wstrzyknięciem pacjentom. Wstrzyknięcia podawano doskórnie w czterech miejscach wstrzykiwania w basenach odprowadzających węzłów chłonnych. Minimalny odstęp między dawkami wynosił dwa tygodnie, a większość dawek podawano w odstępach czterech tygodni. Przed pierwszą dawką i przed niektórymi dalszymi dawkami, pacjentów badano na nadwrażliwość typu opóźnionego (DTH) w stosunku do czterech linii komórkowych wymienianych w schemacie szczepień powyżej (we wszystkich testach stosowano 0,8 x 10⁶ komórek bez adiuwanta).

Analiza odpowiedzi immunologicznej (a) Odpowiedzi proliferacyjne limfocytów T

W celu określenia czy szczepienie powodowało specyficzne rozszerzenie populacji komórek T, które rozpoznają antygeny pochodzące z linii komórkowych użytych do szczepionek, przeprowadziliśmy oznaczenie proliferacji limfocytów T po stymulacji lizatami linii komórkowych prostaty. Przy każdej wizycie w klinice pobierano pełną krew i stosowano w oznaczeniu proliferacji opartym na BrDU (bromodeoksyurydyna) jak opisano poniżej.

Metoda BrDU badania proliferacji u pacjentów

Reagenty

RPMI	Life Technologies, Paisley, Szkocja.
BrDU		Sigma Chemical Co., Poole, Dorset
PharMlyse 35221E	Phamingen, Oxford UK
Cytofix/Cytoperm 2090KZ
Perm/Wash buffer (x10)	2091KZ
FITC Anty-BrDU/Dnase	340649	Becton Dickinson
PerCP Anty-CD	3347344
Pe Anty-CD4	30155X	Pharmingen
Pe Anty-CD8	30325X
FITC mu IgGl	34901	Becton Dickinson
PerCP IgGl	349044
PE IgGl	340013

Metoda

1. Rozcieńczyć 1 ml krwi 9 ml RPMI + 2 mM L-gln + PS + 50 μ M 2-Me. Nie dodawa ć surowicy. Pozostawić na noc w 37°C.

2. Następnego ranka rozporcjować 450 μΐ rozcieńczonej krwi do studzienek w 48-studzienkowej płytce i dodać 50 μl lizatu stymulatora. Lizat przyrządza się przez zamrożenie i rozmrożenie komórek guza (2 x 10⁶ równoważników komórek/ml) x 3 w ciekłym azocie i następnie przechowanie ich w ciekłym azocie, aż będą potrzebne.

3. Hodować komórki w 37°C przez 5 dni.

4. Wieczorem dnia 5 dodać 50 μl BrdU @ 30 μg/ml

5. Rozporcjować 100 μl każdej próbki do 90-studzienkowej płytki o okrągłym dnie.

6. Odwirować płytkę i odrzucić supernatant.

7. Zlizować czerwone krwinki stosując 100 μl Pharmlyse przez 5 minut w temperaturze pokojowej.

8. Przepłukać x 2 50 μl Cytofix.

9. Odwirować i odrzucić supernatant poprzez strzepnięcie.

10. Permeabilizować 100 μl Perm wash buffer przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

11. Dodać 30 μl mieszaniny przeciwciał zawierającej przeciwciała w odpowiednim rozcieńczeniu doprowadzone do objętości Perm wash.

12. Inkubować 30 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.

13. Przemywać 1 x i zawieszać w 100 μl 2% paraformaldehydu.

14. Dodać do tego 400 μl FACSFlow w tubkach typu klaster gotowych do analizy.

15. Analizować na FACScan, przechowując 3000 bramkowanych wydarzeń CD3.

PL 201 016 B1

6-studzienkowa płytka do stymulacji

	Nil	ConA	1542	LnCap	Du145	Pnt2
PBL 1
PBL 2
PBL 3
PBL 4
PBL 5
PBL 6

96-studzienkowa płytka do barwienia przeciwciał

PB

L 1

PB

L 2

PB

L 3

PB

L 4

PB

L 5

PB

L 6

Nil

15

D

Nil

15

D

Nil

15

D

Nil

15

D

Nil

15

D

Nil

15

D

A

Nil

15

E

Nil

15

E

Nil

15

E

Nil

15

E

Nil

15

E

Nil

15

E

D

Nil

Ln

D

Nil

Ln

D

Nil

Ln

D

Nil

Ln

D

Nil

Ln

D

Nil

Ln

D

E

Con

Ln

E

Con

Ln

E

Con

Ln

E

Con

Ln

E

Con

Ln

E

Con

Ln

E

D

Con

Du

D

Con

Du

D

Con

Du

D

Con

Du

D

Con

Du

D

Con

Du

D

E

Du

E

Du

E

Du

E

Du

E

Du

E

Du

E

Pn

D

Pn

D

Pn

D

Pn

D

Pn

D

Pn

D

Pn

E

Pn

E

Pn

E

Pn

E

Pn

E

Pn

E

Opis:

A:

D

E:

IgG1-FITC (5 μ l)	IgG1-Pe (5 μ!)	IgG1-PerCP (5 μ!)
15 μ! MoAb + 15 μ!
BrdU-FITC (5 μί)	CD4-PE (5 μ^	CD3-PerCP (5 μ!)
15 μ! MoAb + 15 μί
BrdU-FITC (5 μθ 15 μ! MoAb + 15 μί 15:	CD8-PE (5 μ^ NIH1542-CP3TX	CD3-PerCP (5 μ!)

Ln: LnCap

D: Du145

Pn: PNT2

Con: ConA lektyna (kontrola dodatnia) Nil: brak stymulacji

Wyniki oznaczeń proliferacji przedstawiono na Figurze 1, gdzie indeks proliferacji dla CD4- albo CD8- dodatnich limfocytów T wykreślono wobec różnych lizatów komórek. Indeks proliferacji jest wyprowadzony przez podzielenie procentu proliferujących komórek T przez kontrolę bez lizatu.

Wyniki przedstawiono dla pacjentów numer 112, 307 i 406. Wyniki przedstawiono dla czterech lizatów komórkowych, a mianowicie NIH1542, LnCap, DU-145 i PNT-2. Ogólnie 50% leczonych pacjentów ma specyficzną odpowiedź proliferacyjną na przynajmniej jedną z linii komórkowych.

(b) Analiza typu Western z surowicami pacjentów

Przygotowano standaryzowane lizaty komórkowe dla kilku linii komórkowych prostaty, aby umożliwić nałożenie podobnych ilości białka na żel SDS PAGE w celu analizy typu Western. Na każdy żel nałożono markery masy cząsteczkowej i równe ilości białka pochodzącego z lizatów komórek

PL 201 016 B1

NIH1542, LnCap, DU-145 i PNT-2. Filtr następnie badano za pomocą surowicy od pacjentów przed szczepieniem i po 16 tygodniach szczepienia (cztery do sześciu dawek).

Metoda

a) Przygotowanie próbek (linie komórek prostaty)

- Przepłukać osad komórek 3 razy w PBS

- Zawiesić ponownie przy 1 x 10⁷ komórek/ml w buforze do lizy

- Przepuś cić przez 5 cykli szybkiej lizy przez zamraż anie i rozmraż anie w ką pieli ciekł y azot/woda

- Wirować przy 1500 obr./min. przez 5 minut, aby usunąć resztki komórek

- Ultrawirować przy 20000 obr./min., aby usunąć zanieczyszczenia bł oną

- Rozporcjować po 200 μΐ i przechowywać w - 80°C

b) Elektroforeza w żelu

- Lizaty zmieszane 1:1 z buforem do próbek Laemelli'ego i gotowane przez 5 minut

- 20 μg próbek nałożyć w kieszonki żelu gradientowego 4-20%

- Żele puszczać w buforze do transferu Bjerrum i Schafer-Nielson (z SDS) przy 200 V przez 35 minut.

c) Transfer typu Western

- Zrównoważyć żel, błony nitrocelulozowe i bibułę filtracyjną w buforze do transferu przez minut

- Ułożyć sandwicz żel-nitroceluloza na anodzie komórki do przenoszenia półsuchego: 2 arkusze bibuły, błona nitrocelulozowa, żel, 2 arkusze bibuły

- Przyłożyć katodę i puścić przy 25 V przez 90 minut

d) Immunologiczna detekcja białek

- Blokować błony nitrocelulozowe przez noc w 4°C za pomocą 5% Marvel w PBS/0/0,5% Tween 20

- Przepłukać błony dwa razy w PBS/0,05% Tween 20, następnie płukać 20 minut 12 x 5 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsanej platformie

- Inkubować błony w 1:20 rozcieńczeniu klarowanego osocza pacjentów przez 120 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsanej platformie

- Przepłukać jak powyżej z dodatkowym płukaniem końcowym przez 5 minut

- Inkubować błony w rozcieńczeniu 1:250 biotynylowanej anty-ludzkiej IgG lub IgM przez 90 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsanej platformie

- Płukać jak powyżej z dodatkowym płukaniem końcowym przez 5 minut

- Inkubować błony w rozcieńczeniu 1:1000 koniugatu streptawidyna-peroksydaza z chrzanu przez 60 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsanej platformie

- Płukać jak powyżej

- Inkubować błony w substracie diaminobenzydynowym dla peroksydazy przez 5 minut, by pozwolić na rozwój barwy, zahamować reakcje przez przepłukanie błony wodą.

Wyniki na Figurze 3 dla pacjentów 112, 305 i 402 jasno wykazują, że szczepienie przez okres tygodni (cztery do sześciu dawek) może spowodować wzrost miana przeciwciał przeciwko lizatom linii komórkowych i także reaktywności krzyżowej przeciwko lizatom nie uzyskanym w tym schemacie szczepienia (inne niż testowanie DTH).

(c) Określenie miana przeciwciał

Miana przeciwciał określano przez powlekanie płytek ELISA standaryzowanymi lizatami linii komórkowych i przeprowadzenie badań nad rozcieńczeniami surowicy od zaszczepionych pacjentów.

Metoda do ELISA z IgG przeciwko lizatowi

1. Powlec płytki po 50 μl/studzienkę lizatu (@ 10 μg/ml) stosując następujące rozcieńczenia:

Lizat	Stęż. Białka	Stęż.	ilość/ml	ilość w 5 ml μl
PNT2	2,5 mg/ml	10 μg/ml	3,89 μί	19,4 μ
1542	4,8 mg/ml	10 μg/ml	2,07 μl	10,3 μl
Du145	2,4 mg/ml	10 μg/ml	4,17 μl	20,8 μl
LnCap	2,4 mg/ml	10 μg/ml	4,12 μl	20,6 μ

2. Przykryć i preinkubować przez noc w 4°C

3. Przepłukać x 2 PBS-Tween. Umieścić płytkę na ręcznikach papierowych w celu wyschnięcia.

4. Blokować PBS/10% FCS (100 μl/studzienkę)

5. Przykryć i inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 1 godzinę (minimum)

PL 201 016 B1

6. Przepłukać x 2 PBS-Tween.

7. Dodać 100 μΐ PBS-10% FCS do rzędów 2-8.

8. Dodać 200 μΐ próbki osocza (rozcieńczone 1 do 100 w PBS - 10% FCS tj. 10 ml osocza dodanego do 900 μl PBS-10% FCS) do rzędu 1 i robić seryjne rozcieńczenia 100 μl w dół płytki jak poniżej. Odrzucić dodatkowe 100 μl z dolnej studzienki. Przykryć i inkubować w lodówce przez noc.

9. Rozcieńczyć biotynylowane przeciwciało (Pharmingen, IgG 34162D) tzn. końcowe stężenie 1 mg/ml (tzn. 20 ml w 10 ml).

10. Przykryć i inkubować w RT przez 45 minut

11. Płukać x 6 jak powyżej

12. Rozcieńczyć streptawidynę - HRP (Pharmagen 13047E 0; rozcieńczyć 1:1000 (tzn. z 10 ml do >10 ml).

13. Dodać 100 ml/studzienkę.

14. Inkubować 30 min w RT.

15. Płukać x 8.

16. Dodać 100 ml substratu/studzienkę. Pozostawić do rozwinięcia na 10-80 min w RT.

17. Zahamować reakcję barwną przez dodanie 100 ml H2SO4.

18. Odczytać OD przy 405 nm.

Wyniki na Figurze 3 dla pacjentów 112, 305 i 402 wykazują miana przeciwciał jako linię podstawową (0), po 4 tygodniach, 8 tygodniach i 16 tygodniach. Dane wykazują, że po szczepieniu przynajmniej czterema dawkami pacjenci mogą wykazywać przyrost miana przeciwciał przeciwko lizatom linii komórkowych i także reakcję krzyżową przeciwko liniom komórkowym nie dostawanym w tym schemacie szczepienia (z wyjątkiem jako dawki DTH).

(d) Ocena poziomów PSA

Poziomy PSA u pacjentów otrzymujących szczepionkę zapisywano przy przystąpieniu do próby i w czasie szczepienia stosując rutynowo stosowane zestawy kliniczne. Wartości PSA dla pacjentów 110, 303 i 404 przedstawiono na Figurze 4 (oś pionowa to PSA w surowicy w ng/ml, oś pozioma to czas, z pierwszym punktem czasowym reprezentującym początek programu szczepień) i widoczny jest spadek lub częściowa stabilizacja wartości PSA, która normalnie u pacjentów tej grupy nadal rośnie, często eksponencjalnie. Wynik dla pacjenta 110 jest nieco zatarty przez radioterapię w celu zmniejszenia bólów kości, choć poziom PSA spadł przed radioterapią.

P r z y k ł a d 2. Zastosowanie normalnego melanocytu w mysim modelu ochrony przed czerniakiem

Użyto normalną komórkę melanocytu w modelu mysiego czerniaka z ochroną przez szczepionkę stosując B16. F10 jako dawkę prowokującą. Myszy C57 otrzymały dwa szczepienia, albo PBS, 5 x 10⁶ napromienionych alogenicznych komórek K1735 albo 5 x 10⁶ napromienionych autologicznych normalnych komórek melanocytów Melan P1 w dniach -14 i -7. W dniu 0 przeprowadzono prowokacją 1 x 10⁴ komórek B16.F10 i mierzono objętość guza co trzy dni od dnia 10. Zwierzęta zabijano gdy guz wyrósł do 1,5 cm x 1,5 cm na maksymalnych wymiarach guza. Figura 5 pokazuje, że szczepienie komórkami Melan 1P daje pewien poziom ochrony przed tym szczególnie agresywnym guzem mysim.

Claims

1. Czynnik immunoterapeutyczny do leczenia raka prostaty, znamienny tym, że zawiera trzy ludzkie linie komórek prostaty, z których jedna pochodzi z prawidłowej tkanki, a dwie inne linie pochodzą z tkanek nowotworowych.

2. Czynnik immunoterapeutyczny według zastrz. 1, znamienny tym, że linie pochodzące z prawidłowej tkanki są wybrane z PNT1A (ECACC Nr ref. 95012614) i PNT2 (ECACC Nr ref. 95012613).

3. Czynnik immunoterapeutyczny według zastrz. 1, znamienny tym, że linia (linie) pochodząca(e) z tkanki nowotworowej jest/są wybrana(e) z NIH1519-CPTX, NIH1532-CPT2TX, NIH1535-CP1TX, NIH1542-CP3TX, CA-HPV-10, LnCap, DU145 i PC3.

4. Czynnik immunoterapeutyczny do leczenia raka prostaty, według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera trzy linie komórkowe, a mianowicie PNT2, NIH1542-CP3TX i DU145.

5. Czynnik immunoterapeutyczny do leczenia raka prostaty, według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera trzy linie komórkowe, a mianowicie PNT2, NIH1542-CP3TX i LnCap.

PL 201 016 B1

6. Czynnik immunoterapeutyczny do leczenia raka prostaty według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera trzy linie komórkowe, a mianowicie PNT2, DU145 i LnCap.

7. Czynnik immunoterapeutyczny według zastrz. 1 albo 4, albo 5, albo 6, znamienny tym, że linie komórkowe nowotworowe były napromieniane przy 50 do 300 Gy.

8. Czynnik immunoterapeutyczny według zastrz. 7, znamienny tym, że linie komórkowe nowotworowe były napromieniane przy 100 do 150 Gy.

9. Czynnik immunoterapeutyczny wedł ug zastrz. 1 albo 4, albo 5, albo 6, znamienny tym, ż e komórki są sformułowane z roztworem środka kriokonserwującego obejmującego, ale nie wyłącznie, 10-30% obj./obj. wodnego roztworu glicerolu, 5-20% obj./obj. sulfotlenku dimetylu i 5-20% wag./obj. ludzkiej albuminy surowiczej jako pojedynczych środków kriokonserwujących albo w kombinacji.

10. Czynnik immunoterapeutyczny według zastrz. 1 albo 4 albo 5 albo 6, znamienny tym, że komórki są sformułowane z roztworem środka kriokonserwującego obejmującego, ale nie wyłącznie, kombinację 5-20% obj./obj. sulfotlenku dimetylu i 5-20% wag./obj. ludzkiej albuminy surowiczej.

11. Czynnik terapeutyczny według zastrz. 1 albo 4, albo 5, albo 6, znamienny tym, że indukuje odpowiedź immunologiczną u pacjentów charakteryzującą się aktywacją odpornościowych limfocytów T.

12. Czynnik immunoterapeutyczny według zastrz. 1 albo 4, albo 5, albo 6, znamienny tym, że indukuje odpowiedź immunologiczną u pacjentów charakteryzującą się indukcją produkcji przeciwciał.

13. Czynnik immunoterapeutyczny według zastrz. 1 albo 4, albo 5, albo 6, znamienny tym, że jest w postaci do podawania przez skórę.

14. Czynnik immunoterapeutyczny według zastrz. 1 albo 4, albo 5, albo 6, znamienny tym, że jest w postaci do podawania do prostaty.

15. Czynnik immunoterapeutyczny do leczenia raka prostaty, znamienny tym, że zawiera trzy ludzkie linie komórek prostaty, z których jedna pochodzi z tkanki pierwotnego nowotworu, a dwie inne pochodzą z dwóch różnych tkanek nowotworowych.

16. Czynnik immunoterapeutyczny według zastrz. 15, znamienny tym, że linia (linie) pochodząca(e) z tkanki nowotworowej jest/są wybrana(e) z NIH1519-CPTX, NIH1532-CPT2TX, NIH1535-CP1TX, NIH1542-CP3TX, CA-HPV-10, LnCap, DU145 i PC3.

17. Czynnik immunoterapeutyczny według zastrz. 15, znamienny tym, że linie komórkowe nowotworowe były napromieniowane przy 50 do 300 Gy.

18. Czynnik immunoterapeutyczny według zastrz. 17, znamienny tym, że linie komórkowe nowotworowe były napromieniowane przy 100 do 150 Gy.

19. Czynnik immunoterapeutyczny według zastrz. 15, znamienny tym, że komórki są sformułowane z roztworem środka kriokonserwującego obejmującego, ale nie wyłącznie, 10-30% obj./obj. wodnego roztworu glicerolu, 5-20% obj./obj. sulfotlenku dimetylu lub 5-20% wag./obj. ludzkiej albuminy surowiczej jako pojedynczych środków kriokonserwujących albo w kombinacji.

20. Czynnik immunoterapeutyczny według zastrz. 15, znamienny tym, że komórki są sformułowane z roztworem środka kriokonserwującego obejmującego kombinację 5-20% obj./obj. sulfotlenku dimetylu i 5-20% wag./obj. ludzkiej albuminy surowiczej.

21. Czynnik terapeutyczny według zastrz. 15, znamienny tym, że indukuje odpowiedź immunologiczną u pacjentów charakteryzującą się aktywacją limfocytów odpornościowych T.

22. Czynnik immunoterapeutyczny według zastrz. 15, znamienny tym, że indukuje odpowiedź immunologiczną u pacjentów charakteryzującą się indukcją produkcji przeciwciał.

23. Czynnik immunoterapeutyczny według zastrz. 15, znamienny tym, że jest w postaci do podawania przez skórę.

24. Czynnik immunoterapeutyczny według zastrz. 15, znamienny tym, że jest w postaci do podawania do prostaty.

25. Czynnik immunoterapeutyczny do leczenia raka prostaty, znamienny tym, że zawiera trzy ludzkie linie komórek prostaty, które pochodzą z jednej, dwóch lub trzech prawidłowych tkanek.

26. Czynnik immunoterapeutyczny według zastrz. 25, znamienny tym, że linie pochodzące z prawidł owej tkanki są wybrane z PNT1A (ECACC Nr ref. 95012614) i PNT2 (ECACC Nr ref. 95012613).

27. Czynnik immunoterapeutyczny według zastrz. 25, znamienny tym, że komórki są sformułowane z roztworem środka kriokonserwującego obejmującego, ale nie wyłącznie, 10-30% obj./obj. wodnego roztworu glicerolu, 5-20% obj./obj. sulfotlenku dimetylu lub 5-20% wag./obj. ludzkiej albuminy surowiczej jako pojedynczych środków kriokonserwujących albo w kombinacji.

PL 201 016 B1

28. Czynnik immunoterapeutyczny według zastrz. 25, znamienny tym, że komórki są sformułowane z roztworem środka kriokonserwującego obejmującego kombinację 5-20% obj./obj. sulfotlenku dimetylu i 5-20% wag./obj. ludzkiej albuminy surowiczej.

29. Czynnik terapeutyczny według zastrz. 25, znamienny tym, że indukuje odpowiedź immunologiczną u pacjentów charakteryzującą się aktywacją limfocytów odpornościowych T.

30. Czynnik immunoterapeutyczny według zastrz. 25, znamienny tym, że indukuje odpowiedź immunologiczną u pacjentów charakteryzującą się indukcją produkcji przeciwciał.

31. Czynnik immunoterapeutyczny według zastrz. 25, znamienny tym, że jest w postaci do podawania przez skórę.

32. Czynnik immunoterapeutyczny według zastrz. 25, znamienny tym, że jest w postaci do podawania do prostaty.

33. Czynnik immunoterapeutyczny do leczenia raka prostaty, znamienny tym, że zawiera trzy ludzkie linie komórek prostaty, z których dwie pochodzą z prawidłowej tkanki, a pozostała linia komórkowa pochodzi z miejsca guza.

34. Czynnik immunoterapeutyczny według zastrz. 33, znamienny tym, że linie pochodzące z prawidł owej tkanki są wybrane z PNT1A (ECACC Nr ref. 95012614) i PNT2 (ECACC Nr ref. 95012613).

35. Czynnik immunoterapeutyczny według zastrz. 33, znamienny tym, że linia (linie) pochodząca(e) z tkanki nowotworowej jest/są wybrana(e) z NIH1519-CPTX, NIH1532-CPT2TX, NIH1535-CP1TX, NIH1542-CP3TX, CA-HPV-10, LnCap, DU145 i PC3.

36. Czynnik immunoterapeutyczny według zastrz. 33, znamienny tym, że linie komórkowe nowotworowe były napromieniane przy 50 do 300 Gy.

37. Czynnik immunoterapeutyczny według zastrz. 36, znamienny tym, że linie komórkowe nowotworowe były napromieniane przy 100 do 150 Gy.

38. Czynnik immunoterapeutyczny według zastrz. 33, znamienny tym, że komórki są sformułowane z roztworem środka kriokonserwującego obejmującego, ale nie wyłącznie, 10-30% obj./obj. wodnego roztworu glicerolu, 5-20% obj./obj. sulfotlenku dimetylu lub 5-20% wag./obj. ludzkiej albuminy surowiczej jako pojedynczych środków kriokonserwujących albo w kombinacji.

39. Czynnik immunoterapeutyczny według zastrz. 33, znamienny tym, że komórki są sformułowane z roztworem środka kriokonserwującego obejmującego kombinację 5-20% obj./obj. sulfotlenku dimetylu i 5-20% wag./obj. ludzkiej albuminy surowiczej.

40. Czynnik terapeutyczny według zastrz. 33, znamienny tym, że indukuje odpowiedź immunologiczną u pacjentów charakteryzującą się aktywacją limfocytów odpornościowych T.

41. Czynnik immunoterapeutyczny według zastrz. 33, znamienny tym, że indukuje odpowiedź immunologiczną u pacjentów charakteryzującą się indukcją produkcji przeciwciał.

42. Czynnik immunoterapeutyczny według zastrz. 33, znamienny tym, że jest w postaci do podawania przez skórę.

43. Czynnik immunoterapeutyczny według zastrz. 33, znamienny tym, że jest w postaci do podawania do prostaty.

44. Immunogenna kompozycja, znamienna tym, że zawiera czynnik immunoterapeutyczny określony w zastrz. 1 lub 15 lub 25 lub 33 w kombinacji z adiuwantem szczepionkowym wybranym spośród preparatów mykobakteryjnych, takich jak BCG lub M. Vaccae, toksoidu tężca, toksoidu dyfterytu, Bordetella pertussis, interleukiny 2, interleukiny 12, interleukiny 4, interleukiny 7, całkowitego adiuwanta Freunda, niecałkowitego adiuwanta Freunda lub innych niespecyficznych czynników adiuwantowych.

45. Immunogenna kompozycja według zastrz. 44, znamienna tym, że adiuwant szczepionki jest wybrany z preparatów mykobakteryjnych, takich jak BCG lub M. Vaccae.

46. Immunogenna kompozycja według zastrz. 44, znamienna tym, że komórki są sformułowane z roztworem środka kriokonserwującego obejmującego, ale nie wyłącznie, 10-30% obj./obj. wodnego roztworu glicerolu, 5-20% obj./obj. sulfotlenku dimetylu lub 5-20% wag./obj. ludzkiej albuminy surowiczej jako pojedynczych środków kriokonserwujących albo w kombinacji.

47. Immunogenna kompozycja według zastrz. 44, znamienna tym, że komórki są sformułowane z roztworem środka kriokonserwującego obejmującego kombinację 5-20% obj./obj. sulfotlenku dimetylu i 5-20% wag./obj. ludzkiej albuminy surowiczej.

48. Immunogenna kompozycja według zastrz. 44, znamienna tym, że indukuje odpowiedź immunologiczną u pacjentów charakteryzującą się aktywacją komórek odpornościowych T.

PL 201 016 B1

49. Immunogenna kompozycja według zastrz. 44, znamienna tym, że indukuje odpowiedź immunologiczną u pacjentów charakteryzującą się indukcją produkcji przeciwciał.

50. Immunogenna kompozycja według zastrz. 44, znamienna tym, że jest w postaci do podawania przez skórę.

51. Immunogenna kompozycja według zastrz. 44, znamienna tym, że jest w postaci do podawania do prostaty.

52. Kompozycja szczepionki immunoterapeutycznej do leczenia raka prostaty, znamienna tym, że zawiera lub składa się z czynnika określonego w zastrz. 1 lub 15 lub 25 lub 33 razem z fizjologicznie dopuszczalną zaróbką, adiuwantem lub nośnikiem.

53. Zastosowanie czynnika immunoterapeutycznego określonego w zastrz. 1 lub 15 lub 25 lub 33 do wytwarzania leku do leczenia raka prostaty u ludzi.